KR100592693B1 - 항생제 민감성 시험방법 및 시험 키트 - Google Patents
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Abstract
본원에는 세균 세포의 성장 특징에 있어서 외부 조건의 효과를 검정하기 위한 시험관내 시험시 아데닐레이트 키나제에 대한 검정의 용도가 기재되어 있다. 이러한 시험에는 특히, 항생제 또는 생물성장 억제제에 대한 세균의 민감성을 검정하기 위한 시험, 및 상기 세균의 성장기와 건강 여부를 평가하기 위한 시험이 포함된다. 이들 시험을 수행하는 방법 및 이를 수행하기 위한 키트가 또한 본원에 기재되고 청구되어 있다.
항생제 민감성 시험방법, 아데닐레이트 키나제, 항생제 민감성 시험 키트
Description
본 발명은 세균의 성장 특징의 시험방법, 특히 특정한 항생제 또는 생물성장 억제제(biostatic agent)에 대한 민감성(sensitivity)의 시험방법 뿐만 아니라 이러한 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
항생제 내성을 지닌 세균의 심각한 문제가 증가하고 있다. 특정 세균 균주의 항생제 내성을 측정하는 현재의 방법은 시간이 많이 소요된다. 이는 먼저 순수한 배양물 중에서 해당 유기체를 분리해야 함을 요구한다. 이어서, 상기 세균의 "론(lawn)"을 제조한 다음 이를 일정 세트의 항생제의 존재하에서 성장시킨다. 특정한 항생제 주위의 성장 억제 영역은 상기 세균이 이에 감수성이라는 것을 나타낸다(상기 억제 영역의 크기는 감수성 정도를 나타낸다). 항생제의 존재하에서 성장이 억제되지 않았다는 것은 내성이 있음을 나타낸다. 이러한 공정을 완료하는데에는 2일 이상이 소요되는데, 이는 특히 감염된 개체의 최적의 치료 섭생이 이들 시험의 결과로 측정될 수 있는 임상 상태하에서는 전혀 이상적이지 못하다.
비교적 신속하게, 예를 들면, 수 시간 내에 항생제 내성 또는 감수성 여부를 평가해주는 시험방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.
아데닐레이트 키나제를 측정함으로써 미생물을 검출하는 검정법이, 예를 들면, 국제특허출원 제PCT/GB94/00118호 및 제PCT/GB94/01513호로부터 공지되어 있 다. 아데닐레이트 키나제는 ADP의 존재하에서 다음에 나타낸 ATP 생성 반응을 촉매하는, 살아있는 모든 세포 내의 필수 효소이다:
2ADP ⇔ ATP + AMP
이러한 검정에서는, ADP를 시험 중인 샘플에, 바람직하게는 마그네슘 이온의 존재하에 시약으로서 가한다. 이어서, 상기 언급된 아데닐레이트 키나제 반응의 결과로써 생성된 ATP는, 예를 들면, 개똥벌레 생물발광 현상을 사용하여 검출할 수 있다. 이를 위하여, 루시페린/루시퍼라제 배합물과 같은 시약을 일반적으로 단기간의 배양 기간, 예를 들면, 약 5분 후에 상기 혼합물에 가하고, 이로써 생성된 발광성 시그날을 모니터한다.
상기 검정의 민감성은 단지 아데닐레이트 키나제의 배경 수준과 사용된 시약의 순도로서만 제한된다. 예를 들면, 모델 시스템으로서 이. 콜라이를 사용하여, 후술되는 도 1에 예시된 바와 같이 5분 배양 검정에서 100개 미만의 세포로부터의 아데닐레이트 키나제 활성을 측정한다. 상기 도면을 만들기 위해 사용된 시험에서는, 샘플 용적이 200㎕이다.
본 출원인은 아데닐레이트 키나제가 생물량(biomass)의 민감성 마커로서 사용될 수 있고 상기 언급된 검정 기술을 세균 세포의 성장 특징에 관한 보다 상세한 정보를 제공해주는 연구에 활용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명은 세균 세포의 성장 특징에 대한 외부 조건의 효과를 알아보기 위한 시험관내 시험에 있어서의 아데닐레이트 키나제에 대한 검정의 용도를 제공한다.
이러한 아데닐레이트 키나제 검정은 세균 성장과 억제의 많은 국면을 연구하는데 있어서 신속하고도 민감성있는 방법을 제공해준다. 본 발명을 이용하여 연구될 수 있는 외부 조건의 종류는 다양하다. 예를 들면, 상기 아데닐레이트 키나제 검정은 특정한 항생제 또는 생정지 시약에 대한 특정 세균 균주 또는 혼합 배양물의 민감성을 측정하기 위한 방법에 사용될 수 있거나, 항생제 또는 생정지 특성을 알아보기 위해 시약을 스크리닝하는데 사용하도록 상기 방법을 변형시킬 수 있다. 또한, 세포 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량과 총 세포내 및 세포외 함량과의 비교 결과가 세포 배양물의 성장 상태와 건강 여부를 나타내므로 아데닐레이트 키나제 검정을 이용하여 이들 특성들을 평가할 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다.
본 시험의 구성 형태는 진행되고 있는 연구의 특성; 이용 가능한 세균 샘플의 유형; 샘플의 특성; 특히 해당 세포에 대해 용해성 효과를 나타내는지 비-용해성 효과를 나타내는지를 시험해야 하는, 존재하는 모든 시약을 고려할 것이다. 각종 형태의 이들 시험이 다음에 보다 상세히 기재될 것이다.
그러나, 특히 본 발명은 시험 물질에 대한 특정 세균의 민감성을 측정하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 시약을 함유하는 배양물로부터 세균의 용균에 의해 방출된 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계; 및 이 결과를, 시약의 첨가에 앞서 상기 배양물의 유사한 아데닐레이트 키나제 검정 및/또는 상이한 시점에서 동일한 배양물로부터의 용균된 세균의 유사한 아데닐레이트 키나제 검정 및/또는 상기 시약을 함유하지 않은 유사한 배양물로부터의 용균된 세균의 유사한 아데닐레이트 키나제 검정으로부터 수득된 결과와 비교하는 단계를 포함한다.
시험된 시약은 공지된 항생제 또는 생물성장 억제제가거나, 또는 항생제로서 앞서 공지된 바가 없는 신규한 화합물 또는 시약일 수 있기 때문에 상기 시험은 스크리닝 프로그램의 일부를 형성한다.
몇몇 시약, 예를 들면, 페니실린(예: 앰피실린 및 아목시실린)과 같은 β-락탐 항생제 등의 항생제가 배양물에서 세균의 용균을 유발시킬 것이다. 그러나, 이러한 것이 발생되지 않은 경우에는, 상기 검정을 수행하기에 앞서 세균을 용균시키는 것이 필요할 수 있다. 이는 용균제를 사용한 처리를 포함한 당해 분야에 인식되어 온 각종 기술 뿐만 아니라 세균을 자기장 또는 전기장 처리하거나, 또는 초음파 처리하는 것과 같은 물리적 방법에 의해서 수행할 수 있다.
세균을 용균시키는 제제로는 세제 및 효소(예: 용균소)가 있다. 그러나, 이들은 비-특이적이고 샘플 내에 존재하는 살아있는 모든 물질로부터 AK를 방출할 것이다. 이는 샘플이 순수한 배양물을 포함하는 경우에 적합할 수 있다. 그러나, 연구 중인 세균이 혼합 배양물의 한 성분인 경우에는, 다른 방법이 적용될 수 있다. 혼합 샘플 중의 표적 세포로부터의 특이적 측정 방법은, 예를 들면, 1) 관심있는 세포가 오염성 미생물로부터 분리되도록 이들 세포를 특이적으로 포획한 다음 비-특이적 아데닐레이트 키나제 측정을 수행하거나, 2) 단지 표적 세포 만을 용균시키는 방법을 사용하여 이들로부터 아데닐레이트 키나제만을 측정하거나, 또는 3) 이들 방법을 조합함으로써 달성할 수 있다.
표적 세균 세포로부터만의 아데닐레이트 키나제(상기 2)는 조사중인 특정한 세균, 예를 들면, 표적 세균에 대해 특이적이고 이러한 세균을 용균시키는 박테리오파아지(bacteriophage)에 특이적인 용해제를 사용하여 방출시킬 수 있다. 이들 박테리오파아지는 세포를 용해시키고 아데닐레이트 키나제를 포함한 세포내 성분을 외부 배지 내로 방출시키면서, 세균을 감염시키는 바이러스이다. 이러한 방출은 일반적으로 감염된지 약 30 내지 60분 후에 일어난다. 40분이 소요되는 검정에서는 이러한 방법을 사용하여 500개 미만의 세포를 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
파아지는 순수한 배양물 또는 혼합 배양물에서 동등하게 표적 세포를 잘 감염시킬 수 있다. 특정 샘플로부터 화학적으로 추출될 수 있는 아데닐레이트 키나제의 양을 파아지 감염된지 일정 시간 후에 방출된 양과 비교함으로써, 표적 세포의 존재 또는 부재를 측정할 수 있고 이들 성장에 대한 시험 물질의 효과를 측정할 수 있다.
박테리오파아지를 재생시켜 용균을 유발시키기 위해서는, 숙주 세포가 대수성장기의 성장 상태이여야만 한다. 예를 들면, 제균제(bacteriostatic agent) 또는 항생제의 존재로 인해 성장이 억제되는 경우에는, 세포를 성장시키고 상기 박테리오파아지에 의해 용균시킬 수 없을 것이다. 이를 다음에 예시되는 바와 같은 본 발명의 추가의 양태에 대한 기준으로 이용할 수 있다.
또 다른 한편 또는 부가적으로, 표적 세균 세포를 혼합 배양물에서 증균시키고/시키거나 이로부터 분리시키는 예비처리 단계를 상기 혼합 배양물에 적용할 수 있다. 이러한 단계는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 특정한 세균에 특이적인 항체 또는 이의 결합성 단편을 사용하여 고체 표면, 예를 들면, 비이 드, 미세역가 플레이트, 필터 막 또는 칼럼 상에 이들 세포를 고정화시키는 면역포획 기술(immunocapture technique)을 사용하여 분리 공정을 수행할 수 있다. 특히 바람직한 고체 표면으로서 자기 비이드가 제공될 수 있다. 경우에 따라 자기 분리 기술을 사용하여 비이드를 분리시키면, 다음에 예시되는 바와 같이 표적 세균이 실질적으로 분리된다. 전형적으로, 고체 지지체로서 자기 비이드를 사용하여, 총 약 30분의 검정 시간을 이용하여 1000개 미만의 세포를 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 기타 물질을 또한 고체 지지체로서 사용할 수 있다.
선별 성장 배지를 사용함으로써 추가의 특이성을 획득할 수 있다. 이는 면역포획 검정이나 박테리오파아지에 의한 감염 이전에, 건강한 성장 배양물을 확립하기 위하여 증균 단계에 사용할 수 있다. 부가적으로, 박테리오파아지 감염 과정 내내 선별 배지를 사용할 수 있다.
이러한 배지는 종종 과량의 표적 세균 내에 과도하게 존재할 수도 있는 비-표적 유기체에 의한 과성장을 최소화할 것이다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명은 특정한 항생제 또는 제균제에 대한 민감성을 알아보기 위해 세균을 시험하는데 사용하도록 변형시킬 수 있다.
페니실린과 같은 β-락탐 등의 항생제는 세포벽 합성을 파괴시킴으로써 세포의 통합성을 상실시켜 복제 과정 동안에 세포가 용균되도록 작용한다. 이는 해당 세균이 활성적으로 성장하고 있는 경우라면, 항생제에 노출된지 약 10 내지 15분 후에 비교적 신속하게 일어난다.
클로람페니콜과 같은 기타 항생제는 세포 용균을 유발시키지 않지만 생물성장 억제제와 같이 다른 방식으로 세포 성장을 억제시킨다. 사용시는 어떠한 특정한 제제의 작용 양상도 대체로 잘 인식되고 있다. 본 발명은 이들 제제 중의 어떠한 것에 대한 세균의 민감성을 시험하는데 사용하도록 변형시킬 수 있다.
본 발명의 특정한 양태는 용균성 항생제에 대한 특정 세균의 민감성을 측정하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은 상기 세균을, 예를 들면, 면역포획 단계를 사용하여 기타 미생물 종으로부터 분리하는 단계(i); 상기 세균 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하는 단계(ii); 상기 용균성 항생제를 상기 배양물에 가하고 상기 항생제가 자체의 용균성 효과를 발휘하기에 충분한 시간 동안 이를 배양하는 단계(iii); 및 상기 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하여 용균이 일어나는지의 여부를 평가하는 단계(iv)를 포함한다.
이러한 시험에서는, 민감성 세균이 항생제 첨가 직후, 일반적으로 약 15분 이내에 이러한 항생제에 의해 용균될 것이다. 따라서, 배양물의 유리된 아데닐레이트 키나제 함량은 항생제를 첨가한 다음에 상당히 증가되는데, 이는 세균 세포가 파괴되면서 세포내 아데닐레이트 키나제의 방출이 일어나기 때문이다. 아데닐레이트 키나제 수준을 최적으로 측정하는 시점은 항생제를 첨가하기 직전이 될 것이며, 또한 항생제를 첨가한지 15분 이상이 지난 후일 것이다. 내성 세균 배양물의 유리 아데닐레이트 키나제 함량은 상당히 일정한 상태를 유지될 것이다. 따라서, 정상적으로 존재하는 경우에만, 저 수준의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량이 앞서 설명된 바와 같이 측정될 것이며, 이는 건강하게 성장하는 세포에 대해서는 대략적으로 일정한 상태로 유지될 것이다. 이러한 방법을 사용하여, 대략 40분 기간 내에 항생제 민감성을 평가할 수 있다.
이러한 방법에 사용된 세균 배양물은 앞서 논의된 바와 같이 상기 세균이 선호하는 선별 성장 배지를 포함할 수 있는데, 이는 이러한 배지가 오염으로 인한 어떠한 가(false) 양성 결과도 최소화할 것이기 때문이다.
한편, 본 발명의 또 다른 양태는 비-용해성 항생제 또는 생물성장 억제제에 대한 특정 세균의 민감성을 측정하는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 상기 세균을, 예를 들면, 면역포획 기술을 사용하여 기타 미생물 종으로부터 분리하는 단계(i); 상기 세균 배양물을 상기 비-용균성 항생제 또는 생물성장 억제제와 임의로 이러한 세균이 선호하는 선별 성장 배지의 존재하에서 배양하는 단계(ii) 및 일정한 시간 간격으로 샘플을 제거함으로써 상기 배양 기간에 걸쳐 배양물의 총 아데닐레이트 키나제 함량이 증가하였는지 또는 감소하였는지를 측정하고, 상기 세균을 이들 샘플에서 용균시키며, 상기 샘플에서 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계(iii)를 포함한다.
이러한 경우, 일정 시간에 걸쳐, 예를 들면, 약 1시간에 걸쳐 화학적 용균을 수행한 후에 수득될 수 있는 아데닐레이트 키나제의 양은 상기 세균이 상기 항생제에 감수성인 경우에는 대략적으로 일정할 것이다. 이는 상기 세균이 상기 항생제의 존재하에서 성장할 수 없기 때문이다. 그러나, 내성 세균의 경우에는, 이들이 지속적으로 성장하므로, 아데닐레이트 키나제의 수준이 시간에 따라 꾸준히 증가할 것이다.
따라서, 용균성이든 비-용균성이든지 간에 어떠한 특정 항생제에 대한 순수한 배양물의 민감성은 상기 단계 I의 방법을 이용하여 신속하게 측정할 수 있다.
본 발명의 기타 양태는 분리되거나 순수한 세균 배양물의 사용을 필요로 하지 않는다. 특히 본 발명은 항생제 또는 생물성장 억제제에 대한 세균의 민감성 측정방법을 추가로 제공하는데, 이러한 방법은
상기 세균 배양물의 제1 샘플, 상기 항생제의 존재하의 제2 샘플, 상기 표적 세균을 특이적으로 용균시킬 박테리오파아지의 존재하의 제3 샘플 및 상기 박테리오파아지와 항생제 둘다의 존재하의 제4 샘플을 배양하는 단계(a);
배양 후 상기 제1 샘플 내지 제4 샘플 각각의 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하는 단계(b) 및
아데닐레이트 키나제 검정 결과와 항생제 또는 생물성장 억제제의 작용 양상을 기준으로 하여 상기 세균의 민감성 또는 내성을 측정하는 단계(c)를 포함한다.
세균은 항생제 효과에 민감성이 되도록 하기 위해서 활성적으로 성장해야만 하기 때문에, 선별 배지를 초기 증균 단계에 사용할 수 있다. 이는 약 1시간 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 시간 후, 상기 표적 세포를 경우에 따라, 신선한 선별 배지 내로 면역포획에 의해 농축시킬 수 있다. 표적 세포에 대한 항생제의 첨가 효과는 박테리오파아지 매개된 용균와 함께 아데닐레이트 키나제 측정을 이용하여 측정할 수 있다.
박테리오파아지가 재생되기 위해서는, 숙주 세포가 대수성장기의 성장 상태이여야만 한다. 성장이, 예를 들면, 항생제의 존재로 인하여 억제되는 경우에는, 상기 파아지가 복제될 수 없으므로, 숙주 세포는 용균될 수 없을 것이다. 아데닐레이트 키나제 검정을 박테리오파아지와 함께 사용하여, 세균의 항생제 민감성을 3시간 이내에 측정할 수 있다. 상기 파아지에 의한 감염이나 항생제에 대한 노출 이전에 세포가 건강하게 성장하도록 하기 위해서는 추가의 시간이 필요하다. 관련된 항생제의 작용 양상에 따라서 두 가지 유형의 시험 결과가 가능하다.
수득된 결과는 도 4에 요약되어 있으며, 여기서 "-"는 세포외 아데닐레이트 키나제 만의 검출와 일치하는 결과를 나타내고, "+"는 성장을 나타내지 않는 현 샘플의 세포내 및 세포외 아데닐레이트 키나제 검출와 일치하는 적절한 양성 결과를 나타내며, "++"는 성장하는 배양물의 용균와 일치하는 상승 수준의 아데닐레이트 키나제의 검출을 나타낸다.
도 4로부터 명백한 바와 같이, 이들 일련의 시험을 사용하여 수득된 결과의 양상은 감수성 세균과 내성 세균을 즉시 구별할 수 있게 해주는데, 단 해당 제제의 작용 유형(용균성인지 아니면 비-용균성인지)을 이해하여야 한다. 다음에 제시된 실시예에 보다 상세히 설명되는 바와 같이 각종 시약과 세균 간의 상호작용 결과로써 상이한 효과가 창출된다.
특정 세포 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량과 총 세포내 및 세포외 함량과의 비교 결과는 상기 세포 배양물의 성장 상태와 건강 상태를 나타내주는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태는
세균 배양물의 제1 샘플을 용균성 시약에 적용시켜 이러한 세균 세포를 용균시키는 단계(a);
상기 제1 샘플 및 또한 용균제에 노출시키지 않은 상기 배양물의 제2 샘플에서 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계(b) 및
상기 제1 및 제2 배양물로부터 수득된 결과를 비교하고 이러한 배양물의 성장기를 평가하는 단계(c)를 포함하는, 상기 세균 배양물의 성장기의 측정방법을 제공한다.
건강한 대수성장기 배양물은 세포외 아데닐레이트 키나제 수준이 비교적 낮고(총 아데닐레이트 키나제의 약 1%) 세포외 아데닐레이트 키나제의 비율은 대수성장기 전반에 걸쳐 비교적 일정한 상태를 유지하고 배양물이 정지기에 접근함에 따라 증가하게 된다. 정지기 배양물은 배양물 배지 중의 총 아데닐레이트 키나제의 1/3 정도의 많은 양을 가질 수 있다. 따라서, 아데닐레이트 키나제를 사용하여, 세포의 건강 여부 뿐만 아니라 이들의 수를 신속하게 측정할 수 있다.
이러한 방법을 사용하여, 예를 들면, 발효 공정 또는 세균 생성물이 요구되는 기타 공정에서, 예를 들면, 최적의 성장이 요구되는 경우에 특정한 세포 배양물이 잘 성장하고 있다는 것을 확인할 수 있다. 또 다른 한편, 약 또는 정지기 배양물이 본 시험에 사용되어지기 때문에 가 양성 결과를 피하도록 항생제 또는 제균성 화합물에 대해 스크리닝하는 경우에 세포가 강하게 성장하고 있는지를 확인하는 것이 필요할 수 있다. 더욱이, 상기 방법을 사용하여, 특정한 모든 배양물의 성장에 영향을 미치는 환경학적 요인, 예를 들면, 온도 또는 배양 배지가 무엇인지를 측정할 수 있다.
각 경우에 있어서, 아데닐레이트 키나제 함량은 배양물의 샘플을 제거하고, 예를 들면, 국제 특허 출원 제PCT/GB94/00118호 및 제PCT/GB94/01513호에 기재된 바와 같이 아데닐레이트 키나제 검정을 수행함으로써 평가할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 시험용 키트를 제공한다. 이러한 시험용 키트는 특정한 검정이 수행될 수 있도록 하는 적합한 성분을 함유할 것이다. 예를 들어, 항생제 민감성 시험용 키트의 경우에는, 예를 들면, 동결 건조된 상태 또는 기타 보존 상태의 항생제 범위를 포함할 수 있다. 이는 또한, 아데닐레이트 키나제를 특정 샘플로부터 추출하기 위한 시약, 예를 들면, 세제 또는 기타 화학적 용균제 뿐만 아니라 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는데 필요한 시약, 예를 들면, 루시페린/루시퍼라제 등을 포함할 수 있다. 또한, 혼합된 세균 배양물을 시험해야 하는 상황에 사용하기 위해서는, 상기 키트가, 또한 동결 건조된 박테리오파아지와 같은 보존 상태의 적합한 박테리오파아지를 함유할 수 있다. 부가적으로, 당해 키트는 적합한 선별 성장 배지를 포함할 수 있다. 상기 시약들은 다중-웰 플레이트와 같은 적합한 반응 용기로 공급될 수 있다.
이제 본 발명은 수반되는 도면을 참조로 한 예를 통하여 특정하게 기재될 것이다.
도 1은 이. 콜라이(E. coli) 세포로부터 아데닐레이트 키나제 활성을 측정하기 위한 실험 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 순수한 배양물에서 및 3.5 x 105 바실러스 서브틸리스 바르 니거(Bacillus subtilis var niger) 성장 세포의 존재하에서 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)에 대한 자기 비이드 면역포획 검정 결과를 도시한 것이다: 여기서, 
는 비이드에 의해 포획된 세포로부터의 아데닐레이트 키나제 활성을 나타내고; 
는 샘플 중의 잔류 세포로부터의 아데닐레이트 키나제 활성을 나타낸다(즉, 좌측 그래프에는 포획되지 않은 살모넬라 세포로부터의 활성이 제시되어 있고 우측 그래프에는 이들 + 비-특이적 세포로부터의 활성이 제시되어 있다).
도 3은 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 세포 배양물로부터의 파아지 매개된 아데닐레이트 키나제 방출의 시간 과정을 연구하는 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 한 양태를 이용하여 수득할 수 있는 항생제 시험 결과를 요약한 다이아그램이다.
도 5는 항생제 내성을 알아보기 위해 세균 샘플을 시험하기 위한 검정 플레이트를 도시한 다이아그램이다.
도 6은 이. 콜라이 10243의 앰피실린-민감성 및 내성 배양물을 이용하여 앰피실린 1리터당 50mg의 파아지 10359의 효과를 도시한 것이며, 여기서 
는 앰피실린 및 파아지 10359의 존재하에 민감성 이. 콜라이 10243을 이용한 결과를 나타내고, 
는 용균제를 전혀 사용하지 않은 결과를 나타내며, 
는 앰피실린과 파아지의 존재하에서 내성 이. 콜라이 10243을 이용한 결과를 나타낸다.
도 7은 이. 콜라이 10243의 배양물에 대한 클로람페니콜(34mg/l) 및 파아지 10359의 효과를 도시한 것이고, 여기서 
는 파아지 만을 나타내고, 
는 파아지 10359 및 클로람페니콜을 나타내며, 
는 클로람페니콜 만을 나타내고 ◇은 파아지나 콜로람페니콜이 전혀 없음을 나타낸다.
실시예 1
특정 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량과 총 아데닐레이트 키나제 함량의 비교
예를 들면, 한 양태에서는, 세균 세포의 샘플을 제1 샘플과 제2 샘플로 나눈다. 이러한 세균 세포의 제1 샘플을 마그네슘 이온의 존재하에서 ADP 및 세제를 함유하는 용액과 혼합한다. 이는 상기 샘플 내에 존재하는 모든 세포로부터 아데닐레이트 키나제를 추출하므로, ATP 생성 반응이 일어나도록 한다. 이러한 반응을 요구되는 시간, 예를 들면, 5분 동안 진행시킨 후, 생물발광성 시약을 가하고 이로써 생성된 빛을 광도계에서 측정한다. 이러한 방식으로 수행된 검정은 이 것이 세포외이든 세포내이든지 간에 특정 샘플 중의 아데닐레이트 키나제의 총 양을 측정해준다.
제2 샘플을 세제의 부재하에 상기와 유사한 검정에 적용시켜, 세포외 아데닐레이트 키나제 만이 측정되도록 한다.
실시예 2
표적 세포를 혼합 현탁액으로부터 분리하기 위한 면역포획의 이용
순수한 샘플로부터 및 또한 3.5 x 105 바실러스 서브틸리스 바르 니거(BG) 성장 세포를 함유하는 샘플로부터 살모넬라 티피무륨에 대한 면역포획 검정을 수행한다. 면역포획 검정은 총 용적 300㎕에서 수행한다. 에스. 티피무륨 특이적 항체로 피복된 자기 마이크로비이드로의 면역포획 단계는 10분이 소요된다. 고정화된 비이드를 세척하여 결합되지 않은 입자를 제거하고, 비-특이적 용균 단계를 수행하여 결합된 물질로부터 아데닐레이트 키나제를 방출시킨다. 5분의 아데닐레이트 키나제 검정을 이용하여 이를 검출한다.
그 결과가 도 2에 도시되어 있다. 이 도 2의 그래프는 표적 세포의 약 70%가 현탁액으로부터 선별적으로 제거될 수 있으며 오염 물질(BG 세포)의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 3
파아지 매개된 용균의 이용
에스케리챠 콜라이 세포(이들 중 일부는 이. 콜라이 특이적 박테리오파아지로 감염되었다) 배양물로부터의 아데닐레이트 키나제 방출의 경과 시간을 연구하였다. 이. 콜라이 특이적 박테리오파아지로 감염시킨 배양물로부터 일정한 시간 간격으로 100㎕ 샘플(각각 350개 정도의 세포를 함유한다)을 꺼낸 다음, 이를 대상으로 하여 40분 후에 세포외 아데닐레이트 키나제 활성에 대해 검정한다. 그 결과가 도 3에 도시되어 있으며, 여기서 
는 감염된 배양물을 나타내고, 
은 감염되지 않은 대조군을 나타낸다.
이들 결과로부터, 이러한 방법을 사용하여 500개 미만의 세포를 검출할 수 있다는 것이 명백해진다.
실시예 4
항생제 민감성 검정 - 용균성 항생제
샘플 세포(이는 혼합 배양물이거나 순수한 배양물일 수 있음)를 2 분획으로 나누고 하나를 박테리오파아지로 감염시킨다. 이어서, 이들 분획 각각을 추가로 2 분획으로 나누고, 이중 하나는 항생제에 노출시키고 다른 하나는 처리하지 않고 둔다. 일정 시간 내에 생성된 세포외 아데닐레이트 키나제의 상대 수준은 표적 세포에 대한 항생제와 박테리오파아지 둘다의 효과를 나타낸다. 실제로 달성된 시험 결과가 표 1에 예시되어 있다.
이 결과는 본 시험이 정확하게 작용하였다는 것을 보증하기 위한 상기 세포 및 대조군의 항생제 내성 상태 둘다를 나타낸다.
| (1)항생제 부재, 파아지 부재 저 수준의 세포외 아데닐레이트 키나제만이 방출됨(용균이 일어나지 않음) | (2)항생제 존재, 파아지 부재 항생제로 인한 용균을 통하여 아데닐레이트 키나제가 방출됨 |
| (3)항생제 부재, 파아지 존재 파아지에 의해 야기된 용균을 통하여 아데닐레이트 키나제가 방출됨 | (4)항생제 존재, 파아지 존재 항생제와 파아지로 인한 용균을 통하여 아데닐레이트 키나제가 방출됨. 수준은 (3) 보다 낮은데, 이는 세포 성장 저하와 파아지 복제의 억제 때문이다 |
내성 세균
| (1)항생제 부재, 파아지 부재 저 수준의 세포외 아데닐레이트 키나제만이 방출됨(용균이 일어나지 않음) | (2)항생제 존재, 파아지 부재 저 수준의 세포외 아데닐레이트 키나제만이 방출됨. (1)과 동일함 (용균이 일어나지 않음) |
| (3)항생제 부재, 파아지 존재 파아지에 의해 야기된 용균을 통하여 아데닐레이트 키나제가 방출됨 | (4)항생제 존재, 파아지 존재 파아지로 인한 용균을 통하여 아데닐레이트 키나제가 방출됨. (3)과 동일함 |
실시예 5
항생제 민감성 검정: 비-용균성 항생제 또는 생물성장 억제제
세포 용균을 유발시키지는 않지만 다른 방식으로 세포 성장을 억제시키는 항생제(및 세균 세포 성장을 억제시키는 기타 화학물질, 예를 들면, 생물성장 억제제)에 대한 세균의 민감성을 또한, 유사한 방법으로 신속하게 측정할 수 있다.
비-용균성 항생제에 대한 혼합 배양물 중의 세균의 민감성 시험은 용해를 유발시키는 항생제에 대한 민감성을 알아보기 위한 시험과 동일한 방식으로 수행될 것이다. 그러나, 상기 세균은 박테리오파아지 감염을 허용하도록 활성적으로 성장해야만 하기 때문에, 항생제에 대한 민감성은 처리된 샘플에서의 파아지 매개된 용균 결핍으로써 나타낸다.
관찰된 결과가 표 2에 요약되어 있다.
실시예 6
항생제 내성에 대해 시험하기 위한 시험 키트
적합한 시험용 키트는 전형적으로 도 5에 예시된 바와 같은 수의 웰로 형성되는 플라스틱 플레이트일 수 있는 샘플 용기를 포함한다. 각 웰에 보유될 수 있는 액체의 총 용량은 대략 0.5ml일 수 있다. 상기 플레이트를 적합하게 예비-제조하여 특정한 웰이 항생제 및/또는 박테리오파아지, 및 또한 임의의 선별 성장 배지의 적당히 동결 건조된(또는 보존된) 제제를 함유하도록 한다.
도 5에 도시된 바와 같은 플레이트에서는, 각 가로 방향의 4개 웰이 특정한 항생제에 대한 내성을 시험하는데 사용하도록 고안되었기 때문에, 이러한 플레이트 를 사용하여 3개 항생제를 동시에 시험할 수 있다.
실제 사용에서는, 순수한 배양물일 수 있는 시험용 샘플 약 0.2ml 용량, 면역포획에 의해 증균된 제제, 경우에 따라 선별 배지로부터의 샘플 또는 순수한 샘플을 각 웰에 가한다. 예를 들면, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 아데닐레이트 키나제 활성을 측정하는 시약을 가할 수 있다. 이들은 아데닐레이트 키나제의 존재하에서 비색계 시그날을 생성시키는 시약일 수 있거나, 또는 더욱 바람직하게는, 생물발광성 시그날을 생성시키는 시약일 수 있다.
특히 ADP 및 마그네슘 이온의 공급원을 가한지 5분 후에 루시페린 및 루시퍼라제를 가한다. 빛 방사는 튜브에 옮긴 다음 튜브 광도계에서 측정함으로써 특정 시간에 1개 웰에서 측정하거나, 또는 바람직하게는 상기 플레이트를 플레이트 광도계에서 자동적으로 검정하거나 CCD 카메라 시스템을 사용하여 전체적으로 영상화한다.
실시예 7
배양물 성장에 대한 용균성 및 비-용균성 항생제의 효과 비교
이. 콜라이 배양물 성장에 대한 용균성(앰피실린) 및 비-용균성(클로람페니콜) 항생제의 효과를 검사한다.
앰피실린 내성을 암호화하는 플라스미드(pUC18)를 이. 콜라이 10243의 순수한 배양물 내로 도입하여 파아지 숙주 특이성을 변형시키지 않으면서 내성을 유도한다. 이러한 플라스미드를 수반하는 것이 이의 성장 속도나 파아지 10359에 의한 감염을 변형시키지 않았다는 사실을 입증하기 위해 상기 내성 균주를 또한 시험하였고, 이는 성장과 감염에 관해 민감성 균주와 동일한 것으로 여겨진다.
이. 콜라이 박테리오파아지 10359와 용균성(앰피실린) 또는 비-용균성(클로람페니콜) 항생제의 존재하에서 민감성(형질전환되지 않음) 세균과 내성 세균으로부터 방출된 아데닐레이트 키나제를 비교한다.
이. 콜라이 10243의 내성 균주와 민감성 균주 모두의 대수성장기 배양물을 T0에서 105 파아지 10359 및 T5에서 50㎍/ml 앰피실린으로 감염시킨다. 앰피실린으로 인한 세포 용균이 민감성 균주에서는 T10에서 명백하고 T20에서 상당한 수준으로 나타나는데, 이때 박테리오파아지로 인해 어떠한 용균 효과도 차단된다. 내성 균주는 상기 항생제에 의해 영향을 받지 않지만, 20분 후에 파아지 감염으로 인한 용균을 나타내나, 이것이 상당한 단위 T40은 아니다. 이 결과가 도 6에 도시되어 있다. 이는 앰피실린과 파아지의 존재하에서 40분 간만 배양한 후에 앰피실린에 대한 이. 콜라이 10243의 배양물의 민감성을 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
이. 콜라이 10243의 대수성장기 배양물을 파아지 10359 및/또는 클로람페니콜(34㎍/ml)의 존재하에서 80분에 걸쳐 배양하고, 앞서와 같이 아데닐레이트 키나제에 대해 검정한다. 그 결과가 도 7에 도시되어 있다.
배양물을 박테리오파아지와 클로람페니콜 둘다와 함께 배양한 경우에, 클로람페니콜 단독으로 배양한 경우와 비교해서 보다 큰 세포 용균이 나타난 것으로 입증되었다. 클로람페니콜이 용균성 항생제가 아니라해도, 세포 용균이 배양 기간 과정에 걸쳐 나타났는데, 이는 아마도 세포가 사멸되기 때문일 것이다. 파아지 매개된 용균은 상기 항생제를 함유하는 배양물에서 상당히 낮았는데, 이는 상기 세균이 잘 성장하지 않아서 파아지가 복제 주기를 완성하지 못했기 때문이다.
앰피실린 내성 돌연변이체를 사용하여 수득된 결과에 따르면, 클로람페니콜 내성 돌연변이체는 상기 항생제의 존재 및 부재 둘다에서 동일하게 행동하는 것으로 예상된다. 따라서, 60분 배양 후, 배경 발광성 증가도는 특정 배양물이 클로람페니콜에 대해 민감성인지 아닌지를 나타낼 것이다.
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- 항생제 화합물, 생물성장 억제(biostatic) 화합물, 항생제 성질을 갖는 것으로 의심되는 화합물 및 생물성장 억제 성질을 갖는 것으로 의심되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시약을 함유하는 배양물로부터의 세균의 용균에 의해 방출된 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계 및검정 결과를, 상기 시약 첨가 이전의 배양물의 유사한 아데닐레이트 키나제 검정으로부터 수득한 결과 및/또는 상기 시약을 함유하지 않은 유사한 배양물로부터의 용균된 세균의 유사한 아데닐레이트 키나제 검정으로부터 수득한 결과와 비교하는 단계를 포함하는, 항생제 화합물, 생물성장 억제 화합물, 항생제 성질을 갖는 것으로 의심되는 화합물 및 생물성장 억제 성질을 갖는 것으로 의심되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시약에 대한 세균의 민감성 측정방법.
- 제4항에 있어서, 세균을 화학적 용균제를 사용하여 용균시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 용균제가 특정한 세균에 대해 특이적인 방법.
- 제6항에 있어서, 용균제가 특정한 세균의 속, 종 또는 균주를 감염시키고 용균시키는 박테리오파아지인 방법.
- 제4항에 있어서, 세균을 효소를 사용하여 용균시키는 방법.
- 제8항에 있어서, 효소가 박테리오라이신인 방법.
- 제4항에 있어서, 배양물 중의 임의의 다른 비-표적 세균을 실질적으로 제거하기 위해, 세균을 먼저 분리 단계에 적용시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 분리 단계가 면역포획 방법(immunocapture method)에 의해 수행되는 방법.
- 제11항에 있어서, 세균을, 표적 세균에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이 고정화된 고체 표면에서 농축시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 배양물이, 세균이 특이적으로 선호하는 성장 배지를 추가로 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 세균을 다른 미생물 종으로부터 분리하는 단계(i), 단계(i)의 세균 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하는 단계(ii), 용균성 항생제를 배양물에 가하고 이를 항생제가 자체의 용균 효과를 발휘하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계(iii) 및 배양물의 세포외 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하여 용균되었는지의 여부를 평가하는 단계(iv)를 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 단계(ⅰ)에서, 세균을 면역포획 기술을 사용하여 분리하는 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 세균 배양물이, 세균이 선택적으로 선호하는 선별 성장 배지를 포함하는 방법.
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- 세균 배양물의 제1 샘플, 항생제 또는 생물성장 억제제의 존재하의 제2 샘플, 표적 세균을 특이적으로 용균시킬 박테리오파아지의 존재하의 제3 샘플 및 이러한 박테리오파아지와 항생제 또는 생물성장 억제제 모두의 존재하의 제4 샘플을 배양하는 단계(a);배양 단계(a) 이후 제1 샘플 내지 제4 샘플 각각의 아데닐레이트 키나제 함량을 측정하는 단계(b) 및아데닐레이트 키나제 검정 결과와 항생제 또는 생물성장 억제제의 작용 유형을 기준으로 하여, 상기 세균의 민감성 또는 내성을 측정하는 단계(c)를 포함하는, 상기 항생제 또는 생물성장 억제제에 대한 상기 세균의 민감성 측정방법.
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- 제21항에 있어서, 배양물내 세균의 농도가 면역포획 공정에 의해 단계(a) 이전에 증가되는 방법.
- 제21항 또는 제23항에 있어서, 샘플이 다른 미생물 종에 우선하여 당해 세균이 성장하도록 하는 선별 성장 배지를 추가로 포함하는 방법.
- 세균 배양물의 제1 샘플을 용균 시약에 적용시켜 배양물내 세균 세포가 용균되도록 하는 단계(a);단계(a)의 제1 샘플에서 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계(b);용균제에 노출시키지 않은 세균 배양물의 제2 샘플에서 아데닐레이트 키나제에 대해 검정하는 단계(c); 및단계(b) 및 단계(c)의 상기 제1 샘플 및 제2 샘플로부터 수득한 결과를 비교하여 배양물의 성장기를 평가하는 단계(d)를 포함하는, 세균 배양물의 성장기 측정방법.
- 제25항에 있어서, 단계(c)에서, 제2 샘플내 아데닐레이트 키나제 수준이 제1 샘플내에서 발견되는 수준의 1% 정도임을 나타내는 결과가 건강한 대수성장기 배양물의 지표이고, 1% 초과의 수준이 정지기로의 진행의 지표인 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 용균제가 세제 또는 특정 표적 세균 세포를 특이적으로 감염시키고 용균시키는 박테리오파아지를 포함하는 방법.
- ADP, 마그네슘 이온 공급원, 루시페린 및 루시퍼라제, 및 하나 이상의 용균성 및/또는 비-용균성 항생제 또는 생물성장 억제제를 포함하는, 제4항 내지 제15항, 제21항, 제23항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따라 시약에 대한 세균의 민감성을 시험하기 위한 시험 키트.
- 제28항에 있어서, 용균제를 추가로 포함하는 시험 키트.
- 제28항에 있어서, 항생제 또는 생물성장 억제제가 동결 건조된 시험 키트.
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- 제29항에 있어서, 용균제가 화학적 용균제를 포함하는 시험 키트.
- 제29항에 있어서, 용균제가 특정 표적 세균 세포에 특이적인 박테리오파아지를 포함하는 시험 키트.
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JPH04370100A (ja) * | 1991-06-19 | 1992-12-22 | Mercian Corp | 微生物の薬剤感受性試験法 |
| WO1996002666A1 (en) * | 1994-07-13 | 1996-02-01 | The Secretary Of State For Defence | Capture assays |
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| CZ309429B6 (cs) * | 2020-03-31 | 2023-01-04 | MB PHARMA s.r.o | Lyofilizovaná testovací sada ke stanovení antimikrobiální biologické účinnosti fágových přípravků na bakterii Staphylococcus aureus |
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