JPH04370100A - 微生物の薬剤感受性試験法 - Google Patents
微生物の薬剤感受性試験法Info
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- JPH04370100A JPH04370100A JP17337391A JP17337391A JPH04370100A JP H04370100 A JPH04370100 A JP H04370100A JP 17337391 A JP17337391 A JP 17337391A JP 17337391 A JP17337391 A JP 17337391A JP H04370100 A JPH04370100 A JP H04370100A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗菌化学療法における
微生物の抗生物質などの薬剤に対する感受性試験法に関
するものである。
微生物の抗生物質などの薬剤に対する感受性試験法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】抗菌化学療法における薬剤感受性試験の
最大の目的は、感染症の治療に有効な抗菌剤を短時間で
正確に選択することにある。すなわち、正確に検出した
原因菌にどの薬剤が抗菌作用を示すか、またどの程度の
抗菌力があるかを測定することであり、正確さと同時に
迅速性が要求される。一方、分離された細菌の薬剤感受
性の成績から、各菌種の感受性パターンの推移を知るた
めの疫学的調査にも応用されている。
最大の目的は、感染症の治療に有効な抗菌剤を短時間で
正確に選択することにある。すなわち、正確に検出した
原因菌にどの薬剤が抗菌作用を示すか、またどの程度の
抗菌力があるかを測定することであり、正確さと同時に
迅速性が要求される。一方、分離された細菌の薬剤感受
性の成績から、各菌種の感受性パターンの推移を知るた
めの疫学的調査にも応用されている。
【０００３】現在用いられている薬剤感受性測定法は拡
散法と希釈法に大別される。拡散法としては迅速性、簡
便性を目標にした薬剤含有ディスクを用いるディスク法
が広く使用されている。
散法と希釈法に大別される。拡散法としては迅速性、簡
便性を目標にした薬剤含有ディスクを用いるディスク法
が広く使用されている。
【０００４】ディスク法は細菌の薬剤感受性を調べる方
法のうちで、もっとも簡便化されたものであり、現在、
国内では感受性ディスクとしては昭和ディスク（１濃度
ディスク法）、トリディスク（３濃度ディスク法）、セ
ンシディスク、ＫＢ（Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ ）ディ
スク（１濃度ディスク法）などが用いられている。この
方法は、ディスクに含まれた薬剤が培地の水分で溶解さ
れ、菌を接種した寒天培地中に拡散する性質を利用して
いる。薬剤はディスクの真下の寒天層から始まり、周囲
に向かって拡散される。このため、培地中に薬剤の濃度
勾配ができ、当然、ディスクに近い培地中の薬剤濃度は
濃く、遠い場所は薄くなる。培地平板上に接種した菌の
薬剤に対する感受性の差により、ディスクの周辺に菌の
発育が認められない阻止円が形成される。
法のうちで、もっとも簡便化されたものであり、現在、
国内では感受性ディスクとしては昭和ディスク（１濃度
ディスク法）、トリディスク（３濃度ディスク法）、セ
ンシディスク、ＫＢ（Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ ）ディ
スク（１濃度ディスク法）などが用いられている。この
方法は、ディスクに含まれた薬剤が培地の水分で溶解さ
れ、菌を接種した寒天培地中に拡散する性質を利用して
いる。薬剤はディスクの真下の寒天層から始まり、周囲
に向かって拡散される。このため、培地中に薬剤の濃度
勾配ができ、当然、ディスクに近い培地中の薬剤濃度は
濃く、遠い場所は薄くなる。培地平板上に接種した菌の
薬剤に対する感受性の差により、ディスクの周辺に菌の
発育が認められない阻止円が形成される。
【０００５】具体例としては、感受性ディスク用培地（
Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ 培地を基本とする）を滅
菌シャーレに分注、平板培地とし、その上に被検菌を均
等に塗布し、薬剤含有ディスクを無菌的に平板上にのせ
、３５〜３７℃で約１６〜２０時間培養し、菌の発育が
阻止されてできる阻止円の直径を測定し、その大きさに
より感受性（Ｓ）、中間（Ｉ）、耐性（Ｒ）と判定し評
価するものである。
Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ 培地を基本とする）を滅
菌シャーレに分注、平板培地とし、その上に被検菌を均
等に塗布し、薬剤含有ディスクを無菌的に平板上にのせ
、３５〜３７℃で約１６〜２０時間培養し、菌の発育が
阻止されてできる阻止円の直径を測定し、その大きさに
より感受性（Ｓ）、中間（Ｉ）、耐性（Ｒ）と判定し評
価するものである。
【０００６】希釈法には寒天平板希釈法と液体培地希釈
法とがあり、いずれも定量的に最小発育阻止濃度（Ｍｉ
ｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）を求めるものである。 １．寒天平板希釈法 感受性測定用培地としてＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ
培地を基礎とした半合成培地（ＭＨ培地）を使用する。 力価の明らかな薬剤を秤量し、滅菌蒸留水等で溶解する
。薬剤の２倍希釈系列を作り、ＭＨ培地の温度が６０℃
くらいの時に、薬液と培地をシャーレの中で混ぜ合わせ
、薬剤含有寒天平板を作成する。この平板上に被検菌の
一夜培養液またはその希釈液を一定量塗沫接種する。３
７℃で１８〜２０時間培養した後、発育の有無を測定し
、対照培地と比較して増殖が完全に阻止された最小濃度
をＭＩＣとして評価する。
法とがあり、いずれも定量的に最小発育阻止濃度（Ｍｉ
ｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）を求めるものである。 １．寒天平板希釈法 感受性測定用培地としてＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ
培地を基礎とした半合成培地（ＭＨ培地）を使用する。 力価の明らかな薬剤を秤量し、滅菌蒸留水等で溶解する
。薬剤の２倍希釈系列を作り、ＭＨ培地の温度が６０℃
くらいの時に、薬液と培地をシャーレの中で混ぜ合わせ
、薬剤含有寒天平板を作成する。この平板上に被検菌の
一夜培養液またはその希釈液を一定量塗沫接種する。３
７℃で１８〜２０時間培養した後、発育の有無を測定し
、対照培地と比較して増殖が完全に阻止された最小濃度
をＭＩＣとして評価する。
【０００７】２．液体培地希釈法
液体培地によって薬剤を希釈し、被検菌を接種、その菌
に対するＭＩＣを求める方法である。一般的な方法は、
９６穴マイクロタイタープレートに感受性測定用培地（
ＣＳＭＨ培地）で希釈した薬液を無菌的に分注し、そこ
に被検菌の一夜培養液またはその希釈液を一定量接種し
たものを３５±１℃で１８〜２４時間培養し、対照に用
いた薬剤不含有培地での発育を確認した後、菌の発育が
肉眼的に認められないウェルの、最小の薬剤濃度を以て
ＭＩＣとして評価する。
に対するＭＩＣを求める方法である。一般的な方法は、
９６穴マイクロタイタープレートに感受性測定用培地（
ＣＳＭＨ培地）で希釈した薬液を無菌的に分注し、そこ
に被検菌の一夜培養液またはその希釈液を一定量接種し
たものを３５±１℃で１８〜２４時間培養し、対照に用
いた薬剤不含有培地での発育を確認した後、菌の発育が
肉眼的に認められないウェルの、最小の薬剤濃度を以て
ＭＩＣとして評価する。
【０００８】これら現行の方法は、全て微生物細胞の増
殖を直接観察して判定するものである。つまり、微生物
細胞の増殖をどの程度阻害し、細胞数をどの程度減少さ
せることができるか観察して“感受性”として判定する
ものであり、結果を得るまでに約１日程度の日数を要す
る。従って、被検菌の培養時間も含めると、検査の依頼
を受けてから、少なくとも約２日以上経過しなければ結
果を知ることが出来ない。
殖を直接観察して判定するものである。つまり、微生物
細胞の増殖をどの程度阻害し、細胞数をどの程度減少さ
せることができるか観察して“感受性”として判定する
ものであり、結果を得るまでに約１日程度の日数を要す
る。従って、被検菌の培養時間も含めると、検査の依頼
を受けてから、少なくとも約２日以上経過しなければ結
果を知ることが出来ない。
【０００９】これら現行法の改善策としては、例えば、
より簡便で正確に操作でできるようにしたもの（例えば
、細菌の培養槽に薬剤含有培地を充填し、被検菌の培養
後に細菌の発育の指標となる基質を添加して一定時間反
応させた容器を転倒させて、その基質や基質分解生成物
に対する指示薬または発色剤を含有する反応剤に浸漬せ
しめて、細菌の発育の有無を色調の変化で検出する方法
：特開昭６１−９６９９９号公報等）や、臨床検査での
実用においてＭＩＣ（最小阻止濃度）とＭＢＣ（最小殺
菌濃度）の両方が自動的に求められるように改善したも
の（例えば、一連のウェルを有する培養ブロックを用い
て、自動的に２倍希釈系列をつくり、被検試料を自動接
種し、培養しながら各ウェルについて光散乱強度を測定
してＭＩＣを求め、必要なウェルに対し抗菌剤不活性剤
を加えて同じく光散乱強度を測定してＭＢＣを求める自
動化法：特開昭６２−２５９９８号公報等）等が提案さ
れているが、未だに判定に要する時間を数時間程度にま
で短縮できるような技術は知られていない。
より簡便で正確に操作でできるようにしたもの（例えば
、細菌の培養槽に薬剤含有培地を充填し、被検菌の培養
後に細菌の発育の指標となる基質を添加して一定時間反
応させた容器を転倒させて、その基質や基質分解生成物
に対する指示薬または発色剤を含有する反応剤に浸漬せ
しめて、細菌の発育の有無を色調の変化で検出する方法
：特開昭６１−９６９９９号公報等）や、臨床検査での
実用においてＭＩＣ（最小阻止濃度）とＭＢＣ（最小殺
菌濃度）の両方が自動的に求められるように改善したも
の（例えば、一連のウェルを有する培養ブロックを用い
て、自動的に２倍希釈系列をつくり、被検試料を自動接
種し、培養しながら各ウェルについて光散乱強度を測定
してＭＩＣを求め、必要なウェルに対し抗菌剤不活性剤
を加えて同じく光散乱強度を測定してＭＢＣを求める自
動化法：特開昭６２−２５９９８号公報等）等が提案さ
れているが、未だに判定に要する時間を数時間程度にま
で短縮できるような技術は知られていない。
【００１０】一方、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は細
胞体内に存在するヌクレオチドの１種であり、数多くの
エネルギー代謝に関与して、エネルギーの獲得および利
用に重要な役割を果たす化合物である。ＡＴＰは、嫌気
的代謝における解糖や発酵、あるいは好気的代謝におけ
る酸化的リン酸化反応などによって生産されることが知
られている。
胞体内に存在するヌクレオチドの１種であり、数多くの
エネルギー代謝に関与して、エネルギーの獲得および利
用に重要な役割を果たす化合物である。ＡＴＰは、嫌気
的代謝における解糖や発酵、あるいは好気的代謝におけ
る酸化的リン酸化反応などによって生産されることが知
られている。
【００１１】微生物細胞のＡＴＰ量は主に生物発光測定
法により測定できることが知られている。例えば、特公
昭６２−４１２０ 号公報には、ホタル由来のルシフェ
リン−ルシフェラーゼ系を用いる発光測定法において、
特定の界面活性剤を含有させると体細胞と微生物細胞の
混合物から選択的に微生物のＡＴＰ量を、細胞壁や細胞
膜を破壊することなく測定できることが記載されている
が、これら公知の微生物のＡＴＰ量測定方法を薬剤感受
性の判定に応用する技術は知られておらず、また微生物
のＡＴＰ量と薬剤感受性との相関性を示唆する文献もな
い。
法により測定できることが知られている。例えば、特公
昭６２−４１２０ 号公報には、ホタル由来のルシフェ
リン−ルシフェラーゼ系を用いる発光測定法において、
特定の界面活性剤を含有させると体細胞と微生物細胞の
混合物から選択的に微生物のＡＴＰ量を、細胞壁や細胞
膜を破壊することなく測定できることが記載されている
が、これら公知の微生物のＡＴＰ量測定方法を薬剤感受
性の判定に応用する技術は知られておらず、また微生物
のＡＴＰ量と薬剤感受性との相関性を示唆する文献もな
い。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明が解決
しようとする課題は、微生物のＡＴＰ量を測定して、判
定までに少なくとも約１日の時間を要している現行法に
よる薬剤感受性試験法よりも、短時間で実施できる手段
を提供することにある。
しようとする課題は、微生物のＡＴＰ量を測定して、判
定までに少なくとも約１日の時間を要している現行法に
よる薬剤感受性試験法よりも、短時間で実施できる手段
を提供することにある。
【００１３】
【発明を解決するための手段】本発明者らは、活性微生
物中のＡＴＰ量の増減が、その微生物の生育・増殖状況
と相関することに着目し、抗生物質などの薬剤を添加し
た培地に被検菌を接種して培養した後、ＡＴＰ量をルシ
フェリン−ルシフェラーゼ系を利用して測定すると、現
行法に比べて著しく短い時間で薬剤感受性が判定できる
ことを見出し、本発明を完成した。
物中のＡＴＰ量の増減が、その微生物の生育・増殖状況
と相関することに着目し、抗生物質などの薬剤を添加し
た培地に被検菌を接種して培養した後、ＡＴＰ量をルシ
フェリン−ルシフェラーゼ系を利用して測定すると、現
行法に比べて著しく短い時間で薬剤感受性が判定できる
ことを見出し、本発明を完成した。
【００１４】すなわち、本発明は薬剤を所定濃度に含有
する培地に、被検微生物を無菌的に接種し培養した後、
微生物菌体細胞中のＡＴＰ量を測定し、このＡＴＰ量を
培養開始時の対照のＡＴＰ量と比較することを特徴とす
る微生物の薬剤感受性試験法を提供したものである。
する培地に、被検微生物を無菌的に接種し培養した後、
微生物菌体細胞中のＡＴＰ量を測定し、このＡＴＰ量を
培養開始時の対照のＡＴＰ量と比較することを特徴とす
る微生物の薬剤感受性試験法を提供したものである。
【００１５】ＡＴＰは、活性微生物細胞中で嫌気的代謝
における解糖や発酵、あるいは好気的代謝における酸化
的リン酸化反応などによって生産されるものであり、細
胞中のＡＴＰ量は、活性微生物細胞では増殖に伴い増加
し、抗生物質等の薬剤で不活性化あるいは死活化された
細胞ではＡＴＰの生産は止まり、あるいは細胞内で消費
されて減少していく。従って、薬剤を添加した培地に被
検菌を接種し培養した時のＡＴＰ量を、薬剤を添加しな
い培地に同一濃度で接種した被検菌の培養開始直後に測
定したＡＴＰ量と比較すれば、その薬剤の対象微生物へ
の抗菌活性の程度（感受性）を知ることができる。
における解糖や発酵、あるいは好気的代謝における酸化
的リン酸化反応などによって生産されるものであり、細
胞中のＡＴＰ量は、活性微生物細胞では増殖に伴い増加
し、抗生物質等の薬剤で不活性化あるいは死活化された
細胞ではＡＴＰの生産は止まり、あるいは細胞内で消費
されて減少していく。従って、薬剤を添加した培地に被
検菌を接種し培養した時のＡＴＰ量を、薬剤を添加しな
い培地に同一濃度で接種した被検菌の培養開始直後に測
定したＡＴＰ量と比較すれば、その薬剤の対象微生物へ
の抗菌活性の程度（感受性）を知ることができる。
【００１６】本発明では、被検菌体のＡＴＰ量の測定は
、具体的にはルシフェリン（発光素）−ルシフェラーゼ
（発光酵素）系を用い、その発光量を測定することによ
り行なうことができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ
系としては、発光にＡＴＰを必要とする系であればいか
なるものも利用可能である。例えば、ホタル、ウミホタ
ル、ラチア、発光ミミズ、ウミシイタケなど公知の系に
由来するものが利用できるが、これらのうち好ましいの
はホタルおよびクローニングを行なった微生物由来のも
のである。
、具体的にはルシフェリン（発光素）−ルシフェラーゼ
（発光酵素）系を用い、その発光量を測定することによ
り行なうことができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ
系としては、発光にＡＴＰを必要とする系であればいか
なるものも利用可能である。例えば、ホタル、ウミホタ
ル、ラチア、発光ミミズ、ウミシイタケなど公知の系に
由来するものが利用できるが、これらのうち好ましいの
はホタルおよびクローニングを行なった微生物由来のも
のである。
【００１７】ルシフェリン−ルシフェラーゼ系を利用し
てＡＴＰの発光量をカウントする試薬キットおよび発光
量を評価（カウント）する装置は市販されており、本発
明方法を実施するに際してはこのような市販のキットお
よび装置を利用して被検菌体のＡＴＰ量を測定すること
ができる。具体的には、予め常法により被検菌を培地に
培養しておき、これを所定濃度に希釈してそのＡＴＰ発
光量をルシフェリン−ルシフェラーゼ系を用いて測定し
、その値を対照値とする。
てＡＴＰの発光量をカウントする試薬キットおよび発光
量を評価（カウント）する装置は市販されており、本発
明方法を実施するに際してはこのような市販のキットお
よび装置を利用して被検菌体のＡＴＰ量を測定すること
ができる。具体的には、予め常法により被検菌を培地に
培養しておき、これを所定濃度に希釈してそのＡＴＰ発
光量をルシフェリン−ルシフェラーゼ系を用いて測定し
、その値を対照値とする。
【００１８】一方、評価試験に供する薬剤を所定濃度に
調整した薬剤含有測定用培地を、マイクロタイタープレ
ートに所定量ずつ分注する。ついで、前培養した上記被
検菌液を生理食塩水などで所定濃度（１０４ ＣＦＵ／
ｗｅｌｌ〜２×１０６ ＣＦＵ／ｍｌ）に希釈し、前記
薬剤含有測定用培地の各ウェルに１００μｌについて５
μｌの割合で無菌的に接種する。このプレートを３５〜
３７℃で所定時間（３〜５時間）培養後、ＡＴＰ放出剤
を添加しＡＴＰを抽出した後、ルシフェリン−ルシフェ
ラーゼを所定量添加し、その発光量を測定する。この測
定値を前記対照の値と比較して、ＡＴＰ量の減少が顕著
なものを感受性、ＡＴＰ量の減少が少ないか、変化しな
いものを中間、ＡＴＰ量の増加するものを耐性として判
定する。
調整した薬剤含有測定用培地を、マイクロタイタープレ
ートに所定量ずつ分注する。ついで、前培養した上記被
検菌液を生理食塩水などで所定濃度（１０４ ＣＦＵ／
ｗｅｌｌ〜２×１０６ ＣＦＵ／ｍｌ）に希釈し、前記
薬剤含有測定用培地の各ウェルに１００μｌについて５
μｌの割合で無菌的に接種する。このプレートを３５〜
３７℃で所定時間（３〜５時間）培養後、ＡＴＰ放出剤
を添加しＡＴＰを抽出した後、ルシフェリン−ルシフェ
ラーゼを所定量添加し、その発光量を測定する。この測
定値を前記対照の値と比較して、ＡＴＰ量の減少が顕著
なものを感受性、ＡＴＰ量の減少が少ないか、変化しな
いものを中間、ＡＴＰ量の増加するものを耐性として判
定する。
【００１９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、従来、判定まで
に少なくとも約１日の培養時間を要し、肉眼観察あるい
は吸光度の測定などにより行なわれていた薬剤感受性試
験を、３〜５の短時間で、しかも発光量を機械的にカウ
ントして容易に実施することができる。
に少なくとも約１日の培養時間を要し、肉眼観察あるい
は吸光度の測定などにより行なわれていた薬剤感受性試
験を、３〜５の短時間で、しかも発光量を機械的にカウ
ントして容易に実施することができる。
【００２０】また、従来法、例えば、吸光度を測定して
判定する方法などでは生菌だけでなく死菌も測定しまう
ため測定データに誤差を含むが、本発明の方法では、原
理的に生菌のＡＴＰを測定するので薬剤感受性試験の精
度が高いという特徴がある。従って、本発明の方法は感
染症治療だけではなく、薬剤の抗菌活性試験を必要とす
る分野において大きなメリットをもたらすものである。
判定する方法などでは生菌だけでなく死菌も測定しまう
ため測定データに誤差を含むが、本発明の方法では、原
理的に生菌のＡＴＰを測定するので薬剤感受性試験の精
度が高いという特徴がある。従って、本発明の方法は感
染症治療だけではなく、薬剤の抗菌活性試験を必要とす
る分野において大きなメリットをもたらすものである。
【００２１】
【実施例】以下、本発明の方法と従来法との相関性を示
す試験について説明する。 被検菌の前培養 本試験においては、ＡＴＰ量を測定する被検菌とし
て Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＩＨＪ株を
使用した。この被検菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＮＩＨＪ株）の一白金耳量を下記組成の前培養
液培地５ｍｌに無菌的に接種し、３５℃、２０時間静置
培養した。
す試験について説明する。 被検菌の前培養 本試験においては、ＡＴＰ量を測定する被検菌とし
て Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＩＨＪ株を
使用した。この被検菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＮＩＨＪ株）の一白金耳量を下記組成の前培養
液培地５ｍｌに無菌的に接種し、３５℃、２０時間静置
培養した。
【００２２】
前培養用培地（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔ
ｈ ）牛肉注出液 ３００ ｇカザ
ミノ酸 １７．５ ｇでんぷん
１．５ ｇ精製水
１０００ ｍｌｐＨ ７．２〜７
．４ （２５℃：滅菌後）
ｈ ）牛肉注出液 ３００ ｇカザ
ミノ酸 １７．５ ｇでんぷん
１．５ ｇ精製水
１０００ ｍｌｐＨ ７．２〜７
．４ （２５℃：滅菌後）
【００２３】ＡＴＰ量測定に
よる感受性試験法 測定用培地として下記の組成の培
地を使用した。 測定用培地（Ｃａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐ
ｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒ
ｏｔｈ ） 牛肉抽出液
３００ ｇ カザミ
ノ酸 １７．５ ｇ
でんぷん
１．５ ｇ 精製水
１０００ ｍｌ
ｐＨ ７．２〜７．４ （２５℃：滅菌後）
Ｃａイオン＊ ５
０ｍｇ／ｌ Ｍｇイオン＊
２５ｍｇ／ｌ ＊
滅菌後無菌的に添加した。
よる感受性試験法 測定用培地として下記の組成の培
地を使用した。 測定用培地（Ｃａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐ
ｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒ
ｏｔｈ ） 牛肉抽出液
３００ ｇ カザミ
ノ酸 １７．５ ｇ
でんぷん
１．５ ｇ 精製水
１０００ ｍｌ
ｐＨ ７．２〜７．４ （２５℃：滅菌後）
Ｃａイオン＊ ５
０ｍｇ／ｌ Ｍｇイオン＊
２５ｍｇ／ｌ ＊
滅菌後無菌的に添加した。
【００２４】上記測定用培地に、下記表１に示す試験の
対象となる各種抗生物質を所定の濃度に調整した抗生物
質含有測定用培地を、９６穴マイクロタイタープレート
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製：白色）に、１ウェルあたり１
００±１０μｌずつ分注した。対象抗生物質名と試験濃
度のほか現行法（液体培地希釈法）により予め求めたＭ
ＩＣをも表１に示す。なお、試験濃度としては、ＭＩＣ
を含む範囲の２点を選択した。
対象となる各種抗生物質を所定の濃度に調整した抗生物
質含有測定用培地を、９６穴マイクロタイタープレート
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製：白色）に、１ウェルあたり１
００±１０μｌずつ分注した。対象抗生物質名と試験濃
度のほか現行法（液体培地希釈法）により予め求めたＭ
ＩＣをも表１に示す。なお、試験濃度としては、ＭＩＣ
を含む範囲の２点を選択した。
【００２５】
【表１】
【００２６】次に、前培養した上記被検菌液（２×１０
８ ＣＦＵ／ｍｌ）を生理食塩水で１００倍に希釈し、
マイクロタイタープレートの各ウェルに５μｌずつ無菌
的に接種した（１０４ ＣＦＵ／ｗｅｌｌ）。このプレ
ートを３５℃で４時間培養後、ＡＴＰ放出剤（商品名：
ＰＩＣＯＥＸ Ｂ；パッカードジャパン社製）を１００
μｌを添加しＡＴＰを抽出した後、ホタル由来のルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ（商品名：Ｐｙｃｏｚｙｍｅ；
パッカードジャパン社製）４０μｌを加えた。Ｌｕｍｉ
ｎｏｓ ＣＴ−９０００ （中央科学工業株式会社製）
を用い、電圧１０５０ Ｖ、積算時間 １．０秒で発光
量を測定した。被検菌液（２×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）
を生理食塩水で１００倍に希釈した５μｌについて、同
じくＡＴＰ放出剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼを加
え、発光量を測定し、ブランク値（対照）とした。測定
結果を表２および図１に示す。
８ ＣＦＵ／ｍｌ）を生理食塩水で１００倍に希釈し、
マイクロタイタープレートの各ウェルに５μｌずつ無菌
的に接種した（１０４ ＣＦＵ／ｗｅｌｌ）。このプレ
ートを３５℃で４時間培養後、ＡＴＰ放出剤（商品名：
ＰＩＣＯＥＸ Ｂ；パッカードジャパン社製）を１００
μｌを添加しＡＴＰを抽出した後、ホタル由来のルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ（商品名：Ｐｙｃｏｚｙｍｅ；
パッカードジャパン社製）４０μｌを加えた。Ｌｕｍｉ
ｎｏｓ ＣＴ−９０００ （中央科学工業株式会社製）
を用い、電圧１０５０ Ｖ、積算時間 １．０秒で発光
量を測定した。被検菌液（２×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ）
を生理食塩水で１００倍に希釈した５μｌについて、同
じくＡＴＰ放出剤、ルシフェリン−ルシフェラーゼを加
え、発光量を測定し、ブランク値（対照）とした。測定
結果を表２および図１に示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】現行法による感受性試験法 比較試験と
して、現行の液体培地希釈法を用いて上記と同じ薬剤お
よび濃度について抗菌活性を調べた。現在臨床検査で用
いられている栄研科学株式会社製フローズンプレート栄
研タイプ１に、上記ＡＴＰ測定法で用いた生理食塩水で
希釈した被検菌液を、同様に５μｌずつフローズンプレ
ートの各ウェルに無菌的に接種した（１０４ ＣＦＵ／
ｗｅｌｌ）。３５℃で培養し、培養後０時間、４時間、
２０時間経過後の各ウェルの濁度を６３０ｎｍの吸光度
で測定した。薬剤無添加の対照のデータと共に測定結果
を表３に、また２０時間経過後の結果を図２に示す。
して、現行の液体培地希釈法を用いて上記と同じ薬剤お
よび濃度について抗菌活性を調べた。現在臨床検査で用
いられている栄研科学株式会社製フローズンプレート栄
研タイプ１に、上記ＡＴＰ測定法で用いた生理食塩水で
希釈した被検菌液を、同様に５μｌずつフローズンプレ
ートの各ウェルに無菌的に接種した（１０４ ＣＦＵ／
ｗｅｌｌ）。３５℃で培養し、培養後０時間、４時間、
２０時間経過後の各ウェルの濁度を６３０ｎｍの吸光度
で測定した。薬剤無添加の対照のデータと共に測定結果
を表３に、また２０時間経過後の結果を図２に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【考察】微生物の増殖の有無を吸光度の変化で判定する
現行法では、培養４時間までは吸光度の変化は殆ど認め
られず、２０時間後の吸光度を測定して判定している。 現行法による２０時間後の吸光度の変化と、本発明法に
よる培養４時間後のＡＴＰ量の増減は図１および図２に
示すとおりであり、本発明法（図１）では約４時間で現
行法（図２）と相関性のある結果が得られることがわか
る。すなわち、本試験では４時間培養後のＡＴＰ量の発
光量を測定してＡＴＰ量の減少が顕著なものを感受性、
ＡＴＰ量が増加するものや減少の少ないものを耐性とし
て、薬剤の微生物に対する感受性を判定できることがわ
かる。
現行法では、培養４時間までは吸光度の変化は殆ど認め
られず、２０時間後の吸光度を測定して判定している。 現行法による２０時間後の吸光度の変化と、本発明法に
よる培養４時間後のＡＴＰ量の増減は図１および図２に
示すとおりであり、本発明法（図１）では約４時間で現
行法（図２）と相関性のある結果が得られることがわか
る。すなわち、本試験では４時間培養後のＡＴＰ量の発
光量を測定してＡＴＰ量の減少が顕著なものを感受性、
ＡＴＰ量が増加するものや減少の少ないものを耐性とし
て、薬剤の微生物に対する感受性を判定できることがわ
かる。
【図１】本発明法による４時間後のＡＴＰ量測定結果を
示す棒グラフである。
示す棒グラフである。
【図２】現行法による２０時間後の吸光度による薬剤感
受性試験の結果を示す棒グラフである。
受性試験の結果を示す棒グラフである。
Claims (5)
- 【請求項１】 薬剤を所定濃度に含有する培地に、被
検微生物を無菌的に接種し培養した後、微生物菌体細胞
中のＡＴＰ量を測定し、このＡＴＰ量を培養開始時の対
照のＡＴＰ量と比較することを特徴とする微生物の薬剤
感受性試験法。 - 【請求項２】 ルシフェリン−ルシフェラーゼ系を用
いてＡＴＰ量を測定する請求項１に記載の微生物の薬剤
感受性試験法。 - 【請求項３】 ルシフェリン−ルシフェラーゼ系がホ
タルおよびクローニングを行なった微生物由来の系から
選択される請求項２に記載の微生物の薬剤感受性試験法
。 - 【請求項４】 薬剤を所定濃度に含有する測定用培地
をマイクロタイタープレートに分注した後、生理食塩水
で所定濃度に希釈した被検微生物を無菌的に接種し、３
５〜３７℃で３〜５時間培養後、ＡＴＰ放出剤を添加し
、ルシフェリン−ルシフェラーゼを加えて発光量を測定
する請求項１乃至３のいずれかの項に記載の微生物の薬
剤感受性試験法。 - 【請求項５】 薬剤が抗生物質である請求項１乃至４
のいずれかの項に記載の薬剤感受性試験法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17337391A JPH04370100A (ja) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | 微生物の薬剤感受性試験法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17337391A JPH04370100A (ja) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | 微生物の薬剤感受性試験法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04370100A true JPH04370100A (ja) | 1992-12-22 |
Family
ID=15959191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17337391A Pending JPH04370100A (ja) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | 微生物の薬剤感受性試験法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04370100A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0844309A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-27 | Kikkoman Corporation | Method and kit for testing microbial drug sensitivity, and method and kit for measuring minimum inhibitory concentration for microorganisms |
| WO1999037799A1 (en) * | 1998-01-21 | 1999-07-29 | The Secretary Of State For Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| KR100592693B1 (ko) * | 1998-01-21 | 2006-06-23 | 더 세크러터리 오브 스테이트 포 디펜스 | 항생제 민감성 시험방법 및 시험 키트 |
-
1991
- 1991-06-19 JP JP17337391A patent/JPH04370100A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0844309A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-27 | Kikkoman Corporation | Method and kit for testing microbial drug sensitivity, and method and kit for measuring minimum inhibitory concentration for microorganisms |
| WO1999037799A1 (en) * | 1998-01-21 | 1999-07-29 | The Secretary Of State For Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| GB2348702A (en) * | 1998-01-21 | 2000-10-11 | Secr Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| GB2348702B (en) * | 1998-01-21 | 2003-04-02 | Secr Defence | Antibiotic sensitivity testing |
| US6861230B1 (en) | 1998-01-21 | 2005-03-01 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Antibiotic sensitivity testing |
| KR100592693B1 (ko) * | 1998-01-21 | 2006-06-23 | 더 세크러터리 오브 스테이트 포 디펜스 | 항생제 민감성 시험방법 및 시험 키트 |
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