[go: up one dir, main page]

HU225068B1 - Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh - Google Patents

Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh Download PDF

Info

Publication number
HU225068B1
HU225068B1 HU9002814A HU9002814A HU225068B1 HU 225068 B1 HU225068 B1 HU 225068B1 HU 9002814 A HU9002814 A HU 9002814A HU 9002814 A HU9002814 A HU 9002814A HU 225068 B1 HU225068 B1 HU 225068B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hcv
polyprotein
polypeptide
sequence
clone
Prior art date
Application number
HU9002814A
Other languages
English (en)
Inventor
Qui-Lim Choo
Michael Houghton
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27406397&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU225068(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of HU225068B1 publication Critical patent/HU225068B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • C07K16/109—Hepatitis C virus; Hepatitis G virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(57) Kivonat
A találmány tárgya eljárás a hepatitis C vírus (HCV) poliproteinből származó, legalább 10 aminosavból álló egybefüggő szekvenciát tartalmazó polipeptid előállítására. Továbbá az ily módon előállított polipeptidet tartalmazó immunoassay kit, valamint ezen polipeptid ellen ható antitestek kimutatására szolgáló immunoassay módszer.
A találmány tárgya továbbá a HCV-genom-szekvenciát vagy annak komplementerét tartalmazó polinukleotid előállítására, a megfelelő vektor és gazdasejt előállítására.
HU 225 068 Β1
A leírás terjedelme 72 oldal (ezen belül 41 lap ábra)
HU 225 068 Β1
A találmány tárgyát olyan anyagok és módszerek képezik, melyek a Non-A és Non-B hepatitis vírus (NANB) fertőzése terjedésének kézben tartására irányulnak. Még specifikusabban, olyan polinukleotidokkal kapcsolatos, melyek egy, az NANBV etiológiai anyagának genomjából származtak, a hepatitis C vírusból (HCV), olyan polipeptidekkel, melyek ezekben vannak kódolva, és antitestekkel, melyek a polipeptidekhez irányulnak. A reagensek a HCV és fertőzésének szkrínelésére használhatók. Ezenkívül védőanyagként is alkalmazhatók a betegséggel szemben.
A Non-A és Non-B hepatitis (NANBH) egy, a feltételezések szerint vírus által indukált átvihető betegségcsalád, mely megkülönböztethető a vírussal kapcsolatos májbetegségek más formáitól. A következő ismert hepatitisvírusok tartoznak ezek közé: hepatitis A vírus (HAV), hepatitis B vírus (HBV), delta hepatitis vírus (HCV), cytomegalovírus (CMV) vagy az Epstein-Barr-vírus (EBV). Az NANBV-t először a vérátömlesztést kapott egyéneknél azonosították. Emberről csimpánzra való átvitele, majd csimpánzokon való sorozatos átoltása azt bizonyítja, hogy az NANBH egy átvihető fertőző anyagnak vagy anyagoknak az eredménye.
Járványtan! adatok azt sugallják, hogy az NANBH-nak 3 fajtája lehetséges: a vízeredetű epidémiás típus, a vérrel vagy injekciós tűvel kapcsolatos típus és a szórványosan előforduló (közösségben szerzett) forma. Azonban az NANBH-t okozó anyagoknak a száma nem ismert.
Az NANBH klinikai diagnózisát és azonosítását először más vírusmarkerek kizárásával végezték. Az NANBV feltételes antigénjeinek és antitestjeinek detektálásához a következő módszereket alkalmazták: agargél-diffúzió, ellenimmunoelektroforézis, immunofluoreszcens mikroszkópia, immunoelektronmikroszkópia, radioimmunovizsgálatok, enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA). Azonban ezen vizsgálatok egyike sem bizonyult elegendően érzékenynek, specifikusnak vagy reprodukálhatónak az NANBH diagnosztikai tesztként való alkalmazására.
Korábban sem világosság, sem megegyezés nem volt az NANBH anyagaival kapcsolatos antigén-antitest rendszer azonosságát vagy specifitását illetően. Ez részben annak volt köszönhető, hogy az egyének HBV-vel fertőződtek először, vagy a HBV-NANBV közösen fertőzte meg őket, és a HBV-vel kapcsolatos oldható és szemcsés antigén ismert komplexitása miatt, és amiatt, hogy a HBV DNS integrálódott a májsejtek genomjába. Lehetséges, hogy az NANBH-t több mint egy fertőző anyag okozza, és hogy az NANBH rosszul diagnosztizált. Ezenkívül nem tiszta, hogy az NANBH-betegek szérumában a szerológiai vizsgálatok mit detektálnak. Lehetségesnek tartják, hogy az agargél-diffúzió és az ellenimmunoelektroforézis-vizsgálatok a szérumalkotók között alkalmanként előforduló autoimmun válaszokat vagy a nemspecifikus fehérje interakciókat detektálják, és hogy ezek nem képviselik a specifikus NANBV antigén-antitest reakciókat. Az immunofluoreszcens, ELISA és radioimmunovizsgálatok valószínűleg az NANBH-betegek és más máj-, vagy nem májbetegségben szenvedő betegek szérumában gyakran előforduló reumaszerű faktoranyagok alacsony szintjét detektálják. Az észlelt reagensek között lehetnek olyanok, melyek a gazda által meghatározott citoplazmaantigéneknek adnak antitestet.
Számos NANBV-jelölt létezik. Lásd például a következő szerzők áttekintő közleményeit: Prince (1983), Feinstone és Hoofnagle (1984), Overby (1985, 1986, 1987) és Iwarson (1987). De nincs arra bizonyíték, hogy ezen jelöltek valamelyike is az NANBH etiológiai anyagát reprezentálná.
Jelentős az NANBV és az NANBV-vel fertőzött vér vagy vérkészítmények hordozóinak szkrínelésére és azonosítására használható módszerek érzékenysége és specifikussága iránti igény. A vérátömlesztést kapott betegek mintegy 10%-a vérátömlesztés utáni hepatitist (PTH) kap, és ezen esetek 90%-ban az NANBH-t jelentik. A legfőbb probléma ezzel a betegséggel kapcsolatban a krónikus májkárosodás gyakori terjedése (25-55%). A beteggondozás, akárcsak az NANBH vérrel vagy vérkészítményekkel való, vagy szoros személyi érintkezéssel való terjesztésének megelőzése igényt tart a megbízható szkrínelésre, diagnosztikai és prognosztikai eszközökre, melyekkel az NANBV-vel kapcsolatos nukleinsavakat, antigéneket és antitesteket detektálni lehet. Továbbá szükség van hatékony vakcinákra és immunoterápiás, terápiás anyagokra, melyek segítségével a betegség megelőzhető és/vagy gyógyítható.
Felfedeztünk egy új vírust, a hepatitis C vírust (HCV), mely a véreredetű NANBH (BB-NANBH) fő etiológiai ágensének bizonyult. A kezdeti munkálatok magukban foglalták a HCV-prototípus-izolátum részleges genomszekvenciáját, CDC/HCV1 (HCV1-nek is nevezett), az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban (1989. máj. 31-én közölt) és a PCT WO 89/04669 számú (1989. jún. 1-jén publikált) közzétételi iratban lettek ismertetve. Ezen szabadalmi bejelentések, akárcsak az egyéb vonatkozó nemzeti szabadalmi bejelentések közlése a vonatkozó irodalmi utalások között szerepelnek. Ezek a bejelentések többek között megmutatják a HCV-szekvencia és HCV-polipeptidek klónozásának és expresszálásának rekombináns DNS módszerét, a HCV immunodiagnosztikai technikáit, az ECV próba diagnosztikai technikáit, az anti-HCV antitestet, az új HCV-szekvenciák izolálási módszereit, beleértve az új HCV-izolátumok szekvenciáit is.
A jelen találmány részben azokon az új HCV-szekvenciákon és polipeptideken alapul, melyeket nem közöltünk az EP 0318,216 vagy a PCT WO 89/04669 számú közleményekben. A találmány vonatkozik ezen új szekvenciák és polipeptidek többek között immundiagnosztikumokban, próbadiagnosztikumokban, HCV elleni antitesttermelésben, PCR-technológiában és a rekombináns DNS technológiában való alkalmazására. A találmány vonatkozik továbbá olyan új immunovizsgálatokra is, melyek az itt közölt HCV-polipeptidek immunogenicitásán alapulnak. Az itt figyelmet érdemlő tárgynak, melyet például az EP 0318,216 számú közleményben leírt technikák alkalmazásával fejlesztettünk, olyan
HU 225 068 Β1 korábbi keletkezési ideje van, mely megelőzi az említett publikációt vagy annak bármilyen másolatát. így a találmány új ismereteket és módszereket nyújt, melyek hasznosak HCV-antigén- és -antitestminták szkrínelésére és a HCV-fertőzés kezelésére.
Ezek szerint tehát a találmány egy rekombináns polinukleotidra vonatkozik, mely egy HCV cDNS-ből származó szekvenciából áll, mely esetben a HCV cDNS a következő kiónokban található: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59á klón, vagy 84á klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, pi14á klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón, vagy ahol a HCV cDNS olyan szekvenciában található, melyet a következő nukleotidszámokkal jelölünk: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig a 17. ábra szerint.
A találmány továbbá vonatkozik egy, a HCV cDNS-ben kódolt epitópból álló tisztított polipeptidre, ahol a HCV cDNS olyan szekvenciában található, melyet a következő nukleotidszámokkal jelölünk: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig a 17. ábra szerint.
A találmány egy olyan immunogén polipeptidre is vonatkozik, melyet egy rekombináns expressziós vektorral transzformált sejt termel. Ezen vektor a HCV cDNS-ből származó DNS ORF-jéből áll, ahol a HCV cDNS olyan szekvenciából áll, ahol a HCV cDNS szekvencia a következő kiónokból származik: CA279a klón, vagy CA74a klón, vagy 13i klón, vagy CA290a klón, vagy 33C klón, vagy 40b klón, vagy 33b klón, vagy 25c klón, vagy 14c klón, vagy 8f klón, vagy 33f klón, vagy 33g klón, vagy 39c klón vagy 15e klón. Az ORF működőképesen kapcsolódik a kívánt gazdával kompatibilis kontrollszekvenciához.
A találmány vonatkozik egy olyan peptidre is, mely egy HCV-epitópból áll, ahol a peptid a következő formulával jellemezhető:
AAx-AAy ahol x és y a 17. ábrán bemutatott aminosavak számát jelöli, és ahol a peptidet a következő csoportokból szelektáltuk: AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA45-AA65, AA65-AA75, AA80-AA90, AA99-AA120 AA95-AA110,
AA105-AA120,
AA155-AA170,
AA220-AA240,
AA290-AA330,
AA310-AA330,
AA405-AA495,
AA415-AA425,
AA450-AA500,
AA475-AA495,
AA515-AA550,
AA575-AA605,
AA600-AA625,
AA645-AA680,
AA700-AA750,
AA750-AA800,
AA850-AA875,
AA850-AA900,
AA100-AA150,
AA190-AA210,
AA245-AA265,
AA290-AA305,
AA350-AA400,
AA400-AA450,
AA425-AA435,
AA440-AA460,
AA500-AA550,
AA550-AA600,
AA585-AA600,
AA635-AA665,
AA700-AA750,
AA725-AA775,
AA800-AA815,
AA800-AA850,
AA920-AA945,
AA150-AA200,
AA200-AA250,
AA250-AA300,
AA300-AA350,
AA380-AA395,
AA405-AA415,
AA437-AA582,
AA460-AA470,
AA511-AA690,
AA550-AA625,
AA600-AA650,
AA650-AA700,
AA700-AA725,
AA770-AA790,
AA825-AA850,
AA920-AA990,
AA940-AA965,
AA970-AA990, AA950-AA1000, AA1000-AA1060, AA1000-AA1025, AA1000-AA1050, AA1025-AA1040, AA1040-AA1055, AA1075-AA1175, AA1050-AA1200, AA1070-AA1100, AA1100-AA1130, AA1140-AA1165,
AA1192-AA1457, AA1195-AA1250, AA1200-AA1225, AA1225-AA1250, AA1250-AA1300, AA1260-AA1310, AA1260-AA1280, AA1266-AA1428, AA1300-AA1350, AA1290-AA1310, AA1310-AA1340, AA1345-AA1403, AA1345-AA1365, AA1350-AA1400, AA1365-AA1380,
AA1380-AA1405, AA1400-AA1450, AA1450-AA1500, AA1460-AA1475, AA1475-AA1515, AA1475-AA1500, AA1500-AA1550, AA1500-AA1515, AA1515-AA1550, AA1550-AA1600, AA1545-AA1560, AA1569-AA1931, AA1570-AA1590, AA1595-AA1610, AA1590-AA1650,
AA1610-AA1645, AA1650-AA1690, AA1685-AA1770, AA1689-AA1805, AA1690-AA1720, AA1694-AA1735, AA1720-AA1745, AA1745-AA1770, AA1750-AA1800, AA1775-AA1810, AA1795-AA1850, AA1850-AA1900, AA1900-AA1950, AA1900-AA1920, AA1916-AA2021,
AA1920-AA1940, AA1949-AA2124, AA1950-AA2000, AA1950-AA1985, AA1980-AA2000, AA2000-AA2050, AA2005-AA2025, AA2020-AA2045, AA2045-AA2100, AA2045-AA2070, AA2054-AA2223, AA2070-AA2100, AA2100-AA2150, AA2150-AA2200, AA2200-AA2250,
AA2200-AA2325, AA2250-AA2330, AA2255-AA2270, AA2265-AA2280, AA2280-AA2290, AA2287-AA2385, AA2300-AA2350, AA2290-AA2310, AA2310-AA2330, AA2330-AA2350, AA2350-AA2400, AA2348-AA2464, AA2345-AA2415, AA2345-AA2375, AA2370-AA2410,
AA2371-AA2502, AA2400-AA2450, AA2400-AA2425, AA2415-AA2450, AA2445-AA2500, AA2445-AA2475, AA2470-AA2490, AA2500-AA2550, AA2505-AA2540, AA2535-AA2560, AA2550-AA2600, AA2560-AA2580, AA2600-AA2650, AA2605-AA2620, AA2620-AA2650,
AA2640-AA2660, AA2650-AA2700, AA2655-AA2670, AA2670-AA2700, AA2700-AA2750, AA2740-AA2760, AA2750-AA2800, AA2755-AA2780, AA2780-AA2830, AA2785-AA2810, AA2796-AA2886, AA2810-AA2825, AA2800-AA2850, AA2850-AA2900, AA2850-AA2865,
AA2885-AA2905, AA2900-AA2950, AA2910-AA2930, AA2925-AA2950, AA2945-végződés (C’-terminális végződés).
A találmány vonatkozik egy, a HCV cDNS-ben kódolt epitópra irányuló monoklonális antitestre, ahol a
HCV cDNS a 17. ábrán szereplő, a következő nukleotidszámokkal jelölt szekvenciában fordul elő: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig, vagy a szekvencia a következő kiónokban található: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy
167b klón, vagy pi14a klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón.
A találmány vonatkozik egy HCV cDNS-ben kódolt epitópból álló polipeptidre irányuló tisztított poliklonális antitestkészítményre, ahol a HCV cDNS a következő nukleotidszámokkal jelölt szekvenciában fordul elő: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig (17. ábra), vagy a szekvencia a következő kiónokban szerepel: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy
CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14a klón, vagy
HU 225 068 Β1
CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón.
A találmány vonatkozik egy HCV-polinukleotid-próbára, ahol a próba a következő nukleotidszámokkal jelölt HCV cDNS szekvenciából származó HCV-szekvenciából áll: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig (17. ábra), vagy a HCV cDNS szekvencia komplementeréből.
A találmány vonatkozik egy HCV-ből származó polinukleotidok jelenlétére irányuló minta vizsgálati kitre. A kit 8 vagy annál több nukleotidból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó polinukleotidpróbából áll, ahol a nukleotidszekvencia a következő nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú HCV cDNS-ből származik: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig (17. ábra), ahol a polinukleotidpróba megfelelő tartóban van.
A találmány vonatkozik egy, a HCV-antigén jelenlétére irányuló minta vizsgálati kitre, mely olyan antitestből áll, mely immunológiailag reagál a HCV-antigénnel, ahol az antigén a következő nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú HCV cDNS-ben kódolt epitópot tartalmaz: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig (17. ábra), vagy ahol a HCV cDNS a következő kiónokban szerepel: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14a klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón.
A találmány továbbá vonatkozik egy, a HCV-antitest jelenlétére irányuló minta vizsgálati kitre, mely egy, a következő nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú HCV cDNS-ben kódolt HCV-epitópot tartalmazó antigénhatású polipeptidet tartalmaz: -319-től 1348-ig vagy 8659-től 8866-ig (17. ábra), vagy a következő kiónokban szerepel: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14a klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón.
A találmány vonatkozik egy, a HCV-antitest jelenlétére irányuló minta vizsgálati kitre, amely a következő kiónokban levő HCV cDNS-ből expresszálódó antigénhatású polipeptidből áll: CA279a klón, vagy CA74a klón, vagy 13i klón, vagy CA290a klón, vagy 33C klón, vagy 40b klón, vagy 33b klón, vagy 25c klón, 14c klón, vagy 8f klón, vagy 33f klón, vagy 33g klón, vagy 39c klón vagy 15e klón, és ahol az antigénhatású poiipeptid megfelelő tartóban van.
A találmány továbbá vonatkozik egy mintában előforduló HCV-nukleinsavak detektálására alkalmas módszerre is, amely a következőkből áll:
a) a HCV-polinukleotid-próbával reagáló mintában levő nukleinsavakból, ahol a próba a -319-1348 vagy a 8659-8866 (17. ábra) nukleotidszámokkal jelölt szekvenciában levő HCV cDNS szekvenciából származó HCV-szekvenciából áll, és ahol a reakció olyan körülmények között folyik, mely lehetővé teszi, hogy a próba és a mintából származó HCV-nukleinsav között polinukleotidduplex képződjék, és
b) az a) lépésben keletkezett, a próbát tartalmazó polinukleotidduplex detektálásából.
A találmány továbbá vonatkozik egy HCV-antigén detektálására alkalmas immunovizsgálatra, mely a következőkből áll:
a) a HCV-antigént feltehetően tartalmazó minta a HCV cDNS-ben kódolt HCV-epitópra irányuló antitesttel való inkubálásából, ahol a HCV cDNS a -319-1348 vagy a 8659-8866 (17. ábra) nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú, vagy a szekvencia a következő kiónokban szerepel: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14a klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón; az inkubálás olyan körülmények között folyik, mely lehetővé teszi az antigén-antitest komplex képződését, és
b) az a) lépésben képződött antitestet tartalmazó antigén-antitest komplex detektálásából.
A találmány vonatkozik a HCV-antigénre irányuló antitestek kimutatására alkalmas immunovizsgálatra, mely a következőkből áll:
a) a HCV elleni antitestet feltételezetten tartalmazó minta HCV cDNS-ben kódolt epitópot tartalmazó antigén polipeptiddel való inkubálásából, ahol a HCV cDNS a -319-1348 vagy a 8659-8866 (17. ábra) nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú, vagy a szekvencia a következő kiónokban van: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14a klón, vagy CA216a klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón; az inkubálás olyan körülmények között folyik, mely lehetőséget ad az antigén-antitest komplex képződésére, és
b) az a) lépésben képződött, az antigén polipeptidet tartalmazó antigén-antitest komplex detektálásából.
A találmány továbbá vonatkozik egy, a HCV-fertőzés kezelésére alkalmas vakcinára, mely a HCV cDNS-ben kódolt HCV-epitópot tartalmazó immunogén polipeptidből áll, ahol a HCV cDNS a 319-1348 vagy a 8659-8866 nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú (17. ábra), vagy ahol a szekvencia a következő kiónokban fordul elő: 13i klón, vagy 26j klón, vagy 59a klón, vagy 84a klón, vagy CA156e klón, vagy 167b klón, vagy pi14 klón, vagy CA216 klón, vagy CA290a klón, vagy ag30a klón, vagy 205a klón, vagy 18g klón vagy 16jh klón, és ahol az immunogén poiipeptid a gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyagban gyógyszertanilag hatásos mennyiségben van jelen.
A találmány vonatkozik a HCV elleni antitest előállításának módszerére, mely azt jelenti, hogy egy HCV cDNS-ben kódolt HCV-epitópot tartalmazó izolált immunogén polipeptidet alkalmaznak egy egyén esetén, ahol a HCV cDNS a 319-1348 vagy a 8659-8866 nukleotidszámokkal jelölt szekvenciájú (17. ábra), vagy ahol a szekvencia a következő kiónokban szerepelő szekvenciájú: CA279a klón, vagy CA74a klón, vagy 13i klón, vagy CA290a klón, vagy 33C klón, vagy 40b klón, vagy 33b klón, vagy 25c klón, vagy 14c klón, vagy 8f klón, vagy 35f klón, vagy 33g klón, vagy 39c klón vagy 15e klón, és ahol az immunogén poiipeptid a gyógy4
HU 225 068 Β1 szerészetileg elfogadható kötőanyagban gyógyszertanilag hatásos dózisban van jelen.
A találmány vonatkozik egy, a HCV cDNS-ből származó antiszensz polinukleotidra, ahol a HCV cDNS az, amelyik a 17. ábrán látható.
A találmány továbbá vonatkozik a C100-3 tisztított fúziós polipeptid előállításának módszerére, ami a következőkből áll:
a) a C100-3 polipeptidet tartalmazó nyers sejtlizátum beszerzéséből,
b) a nyers sejtlizátum olyan mennyiségű acetonnal való kezeléséből, mely a polipeptid kicsapódását okozza,
c) a kicsapott anyag izolálásából és oldásából,
d) a C100-3 polipeptid anioncserés kromatográfiával történő izolálásából,
e) a d) lépésben nyert polipeptid (C100-3) gélszűréssel történő további izolálásából.
A következőkben megadjuk a találmányhoz mellékelt ábrák leírását.
1. ábra: a 12f kiónban levő HCV cDNS szekvenciát mutatja, és az itt kódolt aminosavakat.
2. ábra: a k9-1 kiónban levő HCV cDNS szekvenciát és az itt kódolt aminosavakat mutatja·
3. ábra: a 15e klón szekvenciáját mutatja, és az itt kódolt aminosavakat.
4. ábra: a 13i kiónban szereplő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját, az itt kódolt aminosavakat mutatja, és azokat a szekvenciákat, melyek átfedésben vannak a 12f klónnal.
5. ábra: a 26j kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját, az itt kódolt aminosavakat és a 13i klónnal átfedésben levő szekvenciákat mutatja.
6. ábra: a CA59a kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját és az itt kódolt aminosavakat mutatja, továbbá azokat a szekvenciákat, melyek átfedésben vannak a 26j és K9-1 klónokkal.
7. ábra: a CA84a kiónban szereplő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját, az itt kódolt aminosavakat és a CA59a klónnal átfedést mutató szekvenciákat szemlélteti.
8. ábra: a CA156e kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját, az itt kódolt aminosavakat mutatja, és azokat a szekvenciákat, melyek átfedésben vannak a CA84a klónnal.
9. ábra: a CA167b kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját mutatja, az itt kódolt aminosavakat és azokat a szekvenciákat, melyek átfedésben vannak a CA156e klónnal.
10. ábra: a CA216a kiónban szereplő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját mutatja, az itt kódolt aminosavakat és a CA167b klónnal való átfedést.
11. ábra: a CA290a kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját és az itt kódolt aminosavakat mutatja, és a CA216a klónnal való átfedést.
12. ábra: az ag30a kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját és a CA290a klónnal való átfedést szemlélteti.
13. ábra: a CA205a kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját és a CA290a kiónban levő HCV cDNS szekvenciával való átfedést mutatja.
14. ábra: a 18g kiónban szereplő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját mutatja, és az ag30a kiónban levő HCV cDNS szekvenciával való átfedést.
15. ábra: a 16jh kiónban levő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját, az itt kódolt aminosavakat mutatja, és a 15e kiónban levő HCV cDNS szekvenciával átfedést mutató nukleotidokat.
16. ábra: a pi14a, CA167b, CA156e, CA84a,
CA59a, K9-1, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 82, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g és a 15e klónokból származó HCV cDNS ORF-jét mutatja.
17. ábra: a fent leírt klónokból származó összeállt
HCV cDNS szekvencia értelmes szálát és az EPO Pub. No. 318,216-ban közölt összeállt HCV cDNS szekvenciáját mutatja. A szekvencia a következő klónokból származik: b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (k9-1-nek is nevezett), 26j, 13i, 12f, 14i, 11 b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a és a 16jh. Az ábrán a szekvencia felett levő három vessző a feltételezett iniciátor metioninkodont jelöli. Az ábra szemlélteti a HCV cDNS-ben kódolt feltételezett poliprotein aminosavszekvenciáját is.
18. ábra: az antigén-térképezési vizsgálatokban használt immunológiai telep szkrínelési módszer diagramját mutatja.
19. ábra: a HCV és a West Nile vírusban kódolt poliproteinek hidrofobicitási profiljait szemlélteti.
20. ábra: a feltételezett HCV-poliprotein hidrofilicitási/hidrofobicitási profilját és antigénindexét vázolja.
21. ábra: a HCV-ben és Flavivírusokban levő konzervált kolineáris peptideket mutatja.
A leírásban az alábbi, részletesen magyarázott kifejezéseket használjuk.
Hepatitis C vírus:
az e területen dolgozók ezt a fogalmat az NANBH egykor ismeretlen etiológiai anyagának tartották fenn. Ennek megfelelően, ahogy a találmányban
HU 225 068 Β1 használjuk, a „hepatitis C vírus (HCV) az NANBH előidéző anyagára vonatkozik, ezzel a névvel korábban az NANBV és/vagy BB-NANBV-t jelölték. A találmányban a HCV, NANBV és BB-NANBV fogalmakat felcserélhetően használjuk. A terminológia kiterjesztésének következtében a HCV által okozott betegséget, melyet korábban NANBH hepatitisnek neveztek (NANBH), hepatitis C-nek hívjuk. A találmányban az NANBH és a hepatitis C fogalmakat felcserélhetően használjuk.
HCV:
a fogalom a találmány szerinti használatban olyan vírusfajt jelöl, melynek patogén törzsei NANBH-t okoznak, és gyengített törzsek és hibás zavaró részecskék származnak belőle. Ahogy az a későbbiekben látható, a HCV genomja RNS-ből áll. Ismeretes, hogy az RNS-tartalmú vírusokban relatíve magas a spontán mutációs ráta, például a közlemények szerint 10-3, 10-4 nagyságrendű a beépült nukleotidokra vonatkoztatva (Fields és Knipe, 1986). Ezért a későbbiekben leírt HCV-fajon belül számos olyan törzs létezik, melyek lehetnek virulensek vagy avirulensek. A későbbiekben leírt összetételek és módszerek lehetővé teszik a HCV-törzsek vagy izolátumok szaporítását, azonosítását, detektálását és izolálását. Továbbá a találmány lehetővé teszi a különböző törzsek elleni diagnosztikumok és vakcinák elkészítését, akár az antivirális anyagok szkrínelési folyamataiban használható összetételek és módszerek gyógyszertani célú felhasználását, olyan anyagokat, melyek például gátolják a HCV replikációját.
Az itt nyújtott információ, bár a prototípustörzsről vagy HCV-izolátumról szereztük, melyet a továbbiakban CDC/HCV1-nek (HCV1-nek is hívott) jelölünk, elegendő egy vírusrendszertannal foglalkozó számára arra, hogy a fajba tartozó többi törzset azonosítsa. Az itt nyújtott információ alátámasztja azt a sejtést, miszerint a HCV egy Flavi-szerű vírus. A Flavivírus-részecskék morfológiája és összetétele ismert és Briton közleményében tárgyalt (1986). Általánosságban a morfológiát tekintve a Flavivírusok egy kettős lipidréteggel körülvett központi nukleokapszidot tartalmaznak. A virionok gömb alakúak és kb. 40-50 nm átmérőjűek. Magjuk átmérője kb. 25-30 nm. A virionburok külső felszínén 5-10 nm hosszú nyúlványok vannak, melyek kb. 2 nm átmérőjű gombocskákban végződnek.
Azt vártuk, hogy a különböző törzsek vagy HCV-izolátumok a prototípusizolátumhoz, a HCV1-hez képest eltéréseket tartalmaznak az aminosavakban és a nukleinsavakban. Arra számítottunk, hogy sok izolátum sok homológiát (több mint 40%-ot például) mutat az aminosavszekvenciában a HCV1-gyel összevetve. De lehet találni ennél kisebb homológiájú HCV-izolátumokat is. Ezeket az izolátumokat számos kritérium szerint lehetne jellemezni, például ilyenek szerint: egy megközelítőleg 9000-12 000 nukleotidot tartalmazó ORF, mely egy olyan poliproteint kódol, mely méretben hasonló a
HCV1-ben találhatóval; a kódolt poliprotein hasonló hidrofobicitású és antigéntulajdonságú, mint a HCV1-ben kódolt; és egy, a HCV1-ben konzervált kolineáris peptidszekvencia jelenléte alapján. Továbbá a genom pozitív szálú RNS legyen.
A HCV kódol legalább egy olyan epitópot, mely immunológiailag azonosítható egy olyan HCV-genomban levő epitóppal, melyből az itt leírt cDNS-ek származnak; előnyösen az epitóp tartalmaz egy itt leírt aminosavszekvenciát. Az epitóp jellegzetes a HCV-t tekintve, ha más ismert Flavivírusokkal hasonlítjuk össze. Jellegzetességét úgy határozhatjuk meg, hogy immunológiailag reagál a HCV elleni antitestekkel, míg más Flavivírus fajok antitestjeivel szemben hiányzik ez az immunológiai aktivitása. A tudomány számára ismeretesek az immunológiai aktivitás meghatározásának módszerei, ilyenek például a radioimmunológiai vizsgálat, az ELISA módszer, a hemagglutináció, és számos példát nyújtunk a vizsgálatra alkalmas technikákból.
A fentieken túl a következő nukleinsavhomológiai és aminosavhomológiai paraméterek alkalmazhatók egyesével vagy együttesen a törzsek vagy izolátumok HCV-ként való azonosításában. Mivel a HCV-törzsek és izolátumok fejlődéstanilag kapcsolatban állnak, azt vártuk, hogy nukleotidszinten a genomok teljes homológiája talán 40% körül, vagy még nagyobb lesz, talán 60%, vagy nagyobb, vagy még valószínűbb, hogy 80%, vagy ennél nagyobb; és továbbá azt, hogy lesz legalább 13 nukleotidból álló hasonló szomszédos szekvencia. A feltételezett HCV-törzsek genomszekvenciája és a CDC/HCV1 cDNS szekvencia közötti hasonlóságot a tudományban ismert technikák segítségével lehet meghatározni. Például meghatározható a feltételezett HCV-ből származó polinukleotidszekvencia és a HCV cDNS szekvencia(ák) információinak közvetlen összehasonlításával. Továbbá meghatározhatók a polinukleotidok hibridizációjával is, melyet olyan körülmények között végzünk, hogy stabil duplexek képződjenek a homológ régiók között (például azok, melyeket az S1-gyel való emésztés előtt kívánunk használni), ezt követően egyszálú specifikus nukleáz(ok)kal végzünk emésztést, majd az emésztett fragmentek méretét határozzuk meg.
A HCV-törzsek vagy izolátumok fejlődéstörténeti rokonsága miatt a feltételezett HCV-törzsek vagy izolátumok azonosíthatók polipeptidszinten levő homológiájuk alapján. Általában a HCV-törzsek vagy izolátumok esetében 40%-osnál nagyobb homológiára számítunk, esetleg 70%-osnál nagyobbra, és még valószínűbb, hogy 80%-nál is nagyobb homológiára, és néhány még a 90%-nál nagyobb homológiát is eléri polipeptidszinten. Az aminosavszekvencia homológiájának meghatározási technikája ismert a tudomány számára. Például az aminosavszekvencia közvetlenül meghatározható, és az itt nyújtott szekvenciával összevethető. Hasonlóképpen a feltételezett HCV-genom anyagának nukleotidszekvenciája is meghatározható (általában a
HU 225 068 Β1 cDNS közbenső termékein keresztül), az itt kódolt aminosavszekvencia meghatározható, és a hasonló régiók összevethetők.
Valamiből származó polinukleotid:
ahogy a tanulmányban alkalmazzuk, egy egybefüggő szekvenciából „származó” polinukleotid olyan polinukleotidszekvenciát jelöl, mely legalább 6 nukleotidból álló szekvenciából áll, előnyösen legalább 8 nukleotidból, még előnyösebben legalább 10-12 nukleotidból, még előnyösebben legalább 15-20 nukleotidból, mely az egybefüggő nukleotidszekvencia régiójához hasonló. A „hasonló” azt jelenti, hogy homológ vagy komplementer a jelölt szekvenciával. Előnyösen a régió szekvenciája, melyből a polinukleotid származik, homológ vagy komplementer egy HCV-genomra sajátosan jellemző szekvenciával. Azt, hogy egy szekvencia sajátosan jellemző-e a HCV-genomra, vagy sem, a témában jártas szakemberek által ismert technikákkal meghatározható. Például a szekvencia összehasonlítható az adatbankokban levő szekvenciákkal, például a Génbankban levőkkel, abból a célból, hogy meghatározzuk, a szekvencia jelen van-e a nem fertőzött gazdában vagy más szervezetekben. A szekvencia összehasonlítható más víruságensek ismert szekvenciáival, melyek közé tartoznak azok, melyek ismert hepatitisindukálók, például: HAV, HBV, HDV és más a Flaviviridae-be tartozó vírusok. A származtatott szekvencia más szekvenciákkal való hasonlósága vagy eltérése meghatározható a megfelelő szigorú feltételek mellett elvégzett hibridizációval is. A nukleinsavszekvenciák komplementaritásának meghatározására szolgáló hibridizációs technikák ismertek, és a későbbiek során kerülnek részletezésre. Lásd például Maniatis et al. (1982) közleményét. Továbbá a hibridizáció során keletkezett kettős szálú polinukleotidok hibás párosítása ismert technikákkal meghatározható. Ezen technikák közé tartozik például az olyan nukleázzal történő emésztés, mint amilyen az S1, mely specifikusan emészti a kettős szálú polinukleotidok egyszálú régióit. Az olyan régiók, melyekből tipikus DNS-szekvenciák „származtathatók”, tartalmaznak - de nem korlátozódnak csupán - például olyan régiókat, melyek specifikus epitópokat kódolnak, akárcsak nem átírt vagy nem transziáit régiókat.
A származtatott polinukleotid nem származik szükségszerűen fizikailag a mutatott nukleotidszekvenciából, hanem bármilyen más módon előállítható, például kémiai szintézissel, vagy DNS-replikációval, vagy reverz transzkripcióval vagy transzkripcióval. Továbbá az egybefüggő szekvenciához hasonló szekvenciájú régiók kombinációi úgy módosíthatóak a tudomány számára ismert módokon, hogy az a tervezett felhasználásnak megfelelő legyen.
Hasonlóképpen, egy egybefüggő nukleinsavszekvenciából „származó” polipeptid vagy aminosavszekvencia olyan polipeptidet jelöl, mely aminosavszekvenciája azonos a szekvenciában kódolt polipeptidével vagy annak egy részletével, ahol a részlet legalább 3-5 aminosavból áll, előnyösebben legalább 8-10 aminosavból, még előnyösebben legalább 11-15 aminosavból, vagy amely immunológiailag azonosítható a szekvenciában kódolt polipeptiddel.
A rekombináns vagy származtatott polipeptid nem szükségszerűen egy egybefüggő nukleinsavszekvenciáról transzlálódik, például az itt leírt HCV cDNS szekvenciáról, vagy egy-egy HCV-genomról; bármely más módon is előállítható, például kémiai szintézissel, vagy egy rekombináns expressziós rendszer expressziójával vagy mutált HCV-ből történő izolálással. A rekombináns vagy származtatott polipeptid egy vagy több analóg aminosavat vagy nem természetes aminosavat tartalmazhat szekvenciájában. Aminosavanalógok egy szekvenciába való inzertálása ismert a tudomány e területén. Ez magában foglalhat egy vagy több elnevezést is, melyek ismeretesek az e területen jártas szakemberek számára.
Rekombináns polinukleotid:
a fogalom a találmány szerinti használatban egy genom, cDNS, félszintetikus vagy szintetikus eredetű polinukleotidot jelöl, mely annak származása vagy manipulációja alapján 1. nem áll kapcsolatban azzal a polinukleotiddal vagy annak egy részével, mellyel a természetben kapcsolódik, 2. egy más polinukleotidhoz kötődik, mint amelyhez a természetben kötődik, vagy 3. nem fordul elő a természetben.
Polinukleotid:
a fogalom a találmány szerinti használatban egy bármilyen hosszúságú nukleotid polimer formáját jelöli, legyen az akár ribonukleotid vagy dezoxiribonukleotid. Ez a fogalom csupán a molekula elsődleges szerkezetére vonatkozik. így a fogalom vonatkozik a két- vagy egyszálú DNS-re, akárcsak a kétvagy egyszálú RNS-re. Vonatkozik ismert modifikációkra, mint például a tudományban ismert olyan elnevezésűekre, mint a metiláció, „védősapkák”, a természetben előforduló egy vagy több nukleotid analógokkal való helyettesítése, nukleotidok közötti modifikációk, mint például a töltés nélküli kötések (például metil-foszfonátok, foszfotriészterek, foszfoamidátok, karbamátok stb.), töltéssel rendelkező kötések (például foszforotioátok, foszforoditioátok stb.), a kinyúló részeket tartalmazók, mint például a fehérjék (ideértve például a nukleázokat, toxinokat, antitesteket, jelpeptideket, a poli-L-lizint stb.), interkalátorokkal rendelkezők (például akridin, pszoralen stb.), a kelátképzők (például fémek, radioaktív fémek, bór, oxidatív fémek stb.), az alkilálókat tartalmazók, a módosított kötéseket tartalmazók (például alfa anomer nukleinsavak stb.), akárcsak a polinukleotidok nem módosított formái.
Tisztított víruspolinukleotid:
a meghatározás olyan HCV-genomot vagy fragmentumot jelöl, mely alapjában véve mentes az olyan polipeptidektől, melyekkel a víruspolinukleotid természetes körülmények között kapcsolódik. Például kevesebb mint kb. 50%-ot, előnyösen ke7
HU 225 068 Β1 vesebb mint kb. 70%-ot, és még előnyösebben kevesebb mint 90%-ot tartalmaz. A víruspolinukleotidok vírusrészecskéktől való megtisztításának technikái ismertek, idetartoznak például a részecske szétdarabolása kaotropikus anyaggal, a polinukleotid(ok) és polipeptidek ioncserés kromatográfiával, affinitáskromatográfiával történő frakcionált kivonása és elkülönítése és a denzitásuknak megfelelő szedimentáció.
Tisztított víruspolipeptid:
a meghatározás olyan HCV-polipeptidet vagy fragmentumot jelöl, mely alapjában véve mentes olyan sejtalkotóktól, melyekkel a víruspolipeptid természetes körülmények között kapcsolatban áll, például kevesebb mint kb. 50%-ot, előnyösen kevesebb mint 70%-ot és még előnyösebben kevesebb mint 90%-ot tartalmaz. A víruspolipeptidek tisztítási eljárásai ismeretesek, és ezen technikákra példákat a későbbiekben ismertetünk.
Rekombináns gazdasejtek, gazdasejtek, sejtek, sejtvonalak, sejttenyészetek stb.:
ezek és az ehhez hasonló egysejtű entitásként tenyésztett mikroorganizmusokat vagy magasabb rendű eukarióta sejtvonalakat jelölő fogalmak olyan sejtekre vonatkoznak, melyeket rekombináns vektor vagy más transzfer DNS recipienseiként lehet használni, vagy használnak, és melyek tartalmazzák az eredeti transzfektált sejtek utódait. Érthető, hogy az egyetlen szülői sejtből származó utódsejtek nem szükségszerűen teljesen azonosak morfológiailag, vagy a genom vagy a teljes DNS összetételében az eredeti szülői sejttel, a természetesen bekövetkező, véletlenszerű vagy a szándékos mutáció eredményeként.
Replikon:
bármilyen genetikai elemet jelöl ez a fogalom. Például egy plazmid, egy kromoszóma, egy vírus, kozmid stb., mely a sejten belüli polinukleotidreplikáció autonóm egységeként viselkedik, például képes saját ellenőrzése alatt szaporodni.
Vektor:
a meghatározás olyan replikont jelöl, melyben egy másik polinukleotidszegment kapcsolódik úgy, hogy előidézi a kapcsolt szegment replikációját és/vagy expresszióját.
Kontrollszekvencia:
a meghatározás olyan polinukleotidszekvenciákra vonatkozik, melyek azon kódolószekvenciák expressziójához szükségesek, amelyekhez ligáltak. Az ilyen kontrollszekvenciák tulajdonságai a gazdaszervezettől függően különböznek; prokariótákban az ilyen kontrollszekvenciák általában promotereket, riboszómás kötőhelyeket és terminátorokat tartalmaznak; eukariótákban általában az ilyen kontrollszekvenciák promotereket, terminátorokat és néhány esetben erősítőszekvenciákat tartalmaznak. A „kontrollszekvencia” fogalma hivatott tartalmazni minimálisan mindazokat a komponenseket, melyek jelenléte szükséges az expresszióhoz, és tartalmazhat olyan további komponenseket is, melyek jelenléte előnyös, például a vezetőszekvenciák.
Működőképesen kapcsolt:
a meghatározás egy juxtapozícióra utal, melyben az így jellemzett komponensek olyan kapcsolatban vannak, amely lehetővé teszi számukra, hogy a kívánt módon funkcionáljanak. Az a kontrollszekvencia, mely „működőképesen kapcsolódik” egy kódolószekvenciához, oly módon ligáit, hogy a kódolószekvencia expressziója olyan körülmények között valósul meg, mely kompatibilis a kontrollszekvenciával.
Nyitott leolvasási keret (ORF):
a fogalom egy polinukleotidszekvencia polipeptideket kódoló régióját jelenti; ez a régió a kódolószekvencia egy részét vagy a teljes kódolószekvenciát képviselheti.
Kódolószekvencia:
a fogalom egy polinukleotidszekvenciára vonatkozik, mely átíródik mRNS-sé, és/vagy polipeptiddé transzlálódik, ha megfelelő szabályozószekvenciák ellenőrzése alá kerül. A kódolószekvencia kereteit az 5’-végen egy transzlációs startkodon, a 3'-végen egy transzlációs stopkodon határolja. Egy kódolószekvencia állhat mRNS-ből, cDNS-ből és rekombináns polinukleotidszekvenciákból, de nem korlátozódik csupán ezekre.
Immunológiailag azonosítható:
a meghatározás olyan epitóp(ok) és polipeptid(ek) jelenlétére vonatkozik, melyek jelen vannak a kijelölt polipeptid(ek)ben is, rendszerint HCV-proteinekben. Az immunológiai azonosság antitestkötődéssel és/vagy kötési kompetícióval határozható meg; ezek a technikák ismertek a tudományban általánosan képzett szakemberek számára, és a későbbiekben bemutatásra kerülnek.
Epitóp:
a találmány szerinti használatban egy polipeptid antigénhatású determinánsára vonatkozik; az epitóp 3 olyan aminosavból áll, melyek térbeli konfigurációja az epitópra jellemző, általában egy epitóp legalább 5 ilyen aminosavból áll, még gyakrabban legalább 8-10 ilyen aminosavból. Az aminosavak térbeli konformációjának meghatározási módszerei ismertek, ilyenek a röntgenkrisztallográfia és a kétdimenziójú nukleáris mágneses rezonancia.
Immunológiailag aktív:
a fogalom szerint egy polipeptid immunológiailag akkor reagál egy antitesttel, amikor kötődik hozzá, annak következtében, hogy az antitest felismeri a specifikus epitópot, melyet a polipeptid tartalmaz. Az immunológiai aktivitás antitestkötődéssel határozható meg, még részletesebben az antitestkötődés kinetikájával és/vagy kötődési kompetícióval, ha kompetitorként használunk egy ismert polipeptid(ek)et, mely(ek) a célzott antitest elleni epitópot tartalmazzá(k). A meghatározási technikái annak, hogy egy polipeptid immunológiailag aktív-e egy antitesttel szemben, ismertek a tudomány számára.
HU 225 068 Β1
Immunogén polipeptid;
a találmány szerinti használatban az immunogén polipeptid olyan polipeptid, mely celluláris és/vagy humorális választ vált ki, akár egymagában, akár egy hordozóhoz kötve, adjuváns jelenlétében vagy hiányában.
Polipeptid:
a meghatározás aminosavak polimerjére vonatkozik, és nem a termék egy specifikus hosszúságára; így peptidek, oligopeptidek és proteinek egyaránt a polipeptid definíciójába tartoznak. Ez a meghatározás nem vonatkozik vagy zárja ki a polipeptid expresszió utáni modifikációit, például a glikozilációkat, acetilációkat, foszforilációkat és az ehhez hasonlókat. A meghatározás magában foglal például egy vagy több aminosavanalógot tartalmazó polipeptidet (például nem természetes aminosavakat stb.), helyettesített kötésekkel rendelkező polipeptideket, akárcsak más ismert modifikációkat, legyenek ezek természetesen előfordulók vagy nem természetesen előfordulók.
T ranszformáció:
a találmány szerinti használatban egy exogén polinukleotid gazdasejtbe való inzertációját jelenti, függetlenül attól, hogy az inzertációhoz milyen módszert használunk, például direkt felvételt, transzdukciót, f-párosítást vagy elektroporációt. Az exogén polinukleotid nem integrált vektorként tartható fenn, például plazmidként, vagy más megoldásként a gazda genomjába integrálható.
Kezelés:
a találmány szerinti használatban jelentése profilaxis és/vagy terápia.
Egyén, egyed:
a találmány szerinti használatban az „egyén, egyed” gerincesekre vonatkozó meghatározás, ezek közül is főként az emlősfajok tagjaira. Idetartoznak a háziállatok, sportállatok, főemlősök, ideértve az embert is, bár nem korlátozódik csupán ezekre.
Értelmes szál (sense strand):
a találmány szerinti használatban nukleinsavak „értelmes szála” olyan szekvenciából áll, mely szekvencia homológ az mRNS szekvenciájával. Az „anti-sense strand olyan szekvenciából áll, mely komplementere az értelmes szál szekvenciájának.
Pozitív szálú genom:
a találmány szerinti használatban a meghatározás olyan vírusgenomot jelöl, mely álljon akár RNS-ből vagy DNS-ből, egyszálú és víruspolipeptid(ek)et kódol. A pozitív szálú RNS-vírusokra példa a Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae és a Caliciviridae. Idetartoznak a Flaviviridae fajok is, melyeket korábban Togaviridae-ként osztályoztak. Lásd Fields és Knipe (1986) munkáját.
Antitesttartalmú testalkotók:
a találmány szerinti használatban a meghatározás az egyén testének olyan összetevőjére vonatkozik, mely a kérdéses antitest forrása. Antitesttartalmú testalkotók ismertek a tudomány számára; ezek közé tartoznak, de nem korlátozódnak csupán a következőkre: plazma, szérum, gerincfolyadék, nyiroknedv, a légzőszervek, emésztőcsatorna és az urogenitális rendszer külső részei, könny, nyál, tej, fehérvérsejtek, myelomák.
Tisztított HCV:
a találmány szerinti használatban a meghatározás olyan HCV-készítményre vonatkozik, mely olyan sejtalkotókból került izolálásra, mellyel a vírus normális körülmények között kapcsolatban van, és olyan más vírusokból, melyek jelen lehetnek a fertőzött szövetben. A tudományban jártas szakemberek számára ismertek a vírusizolálás technikái, ilyenek például a centrifugálás és affinitáskromatográfia; a tisztított HCV készítésének módszere a későbbiekben kerül leírásra.
HCV-részecskék:
a találmány szerinti használatban a meghatározás vonatkozik a teljes virionra, akárcsak a virion képzésében részt vevő köztes részecskékre. A HCV-részecskék általában egy vagy több, a HCV-nukleinsavakhoz kapcsolódó HCV-fehérjével rendelkeznek.
Próba:
a találmány szerinti használatban a meghatározás olyan polinukleotidra vonatkozik, mely hibrid szerkezetet létesít a célzott terület szekvenciájával, annak következtében, hogy a próba legalább egy szekvenciája komplementer a célzott terület egy szekvenciájával. A próba azonban nem tartalmaz olyan szekvenciát, mely komplementer a polimeráz-láncreakció beindításához használt szekvenciával(kkal).
Célzott terület:
a találmány szerinti használatban a meghatározás a nukleinsav olyan régiójára vonatkozik, melyet ki szándékozunk bővíteni és/vagy detektálni.
Vírus RNS:
a találmány szerinti használatban a meghatározás, melybe a HCV RNS is beletartozik, a vírusgenomból származó RNS-re vonatkozik, ennek fragmentjeire, transzkriptjeire és az ebből származó mutáns szekvenciákra.
Biológiai minta:
a találmány szerinti használatban a meghatározás egy egyedből izolált szövet- vagy folyadékmintára utal, melybe beletartoznak a következők - bár nem korlátozódnak csupán ezekre -: plazma, szérum, gerincfolyadék, nyiroknedv, a bőr, a légzőszerv, az emésztőcsatorna és az urogenitális rendszer külső részei, a könny, a nyál, tej, vérsejtek, tumorok, szervek és in vitro sejttenyészetek alkotóinak mintái (ideértve, de nem csupán a következőkre korlátozódva például a sejttenyésztő tápközegben való sejtszaporodás eredményeként megváltozott tápközeg, a feltételezhetően vírusfertőzött sejtek, a rekombínáns sejtek és a sejtkomponensek).
A következőkben megadjuk a találmány ismertetését.
A jelen találmányban, hacsak ezt külön nem jelöltük, a tudomány területén ismert hagyományos mole9
HU 225 068 Β1 kuláris biológiai, mikrobiológiai, rekombináns DNS és immunológiai technikákat alkalmaztuk. Ezen technikák részletes leírása megtalálható az irodalomban. Lásd például a következő műveket: Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonukleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (E. D. Hames ans S. J. Higgins eds. 1984); Animál Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); The Series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vector fór Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively), Mayer and Walker eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N. Y.), Handbook of Experimental Immunology, Volumes I—IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986). Az összes korábban és az ezután említett szabadalom, szabadalmi alkalmazás és a közlemények a referenciában vannak feltüntetve.
A jelen találmány hasznos anyagait és eljárásait egy, a nukleotidszekvenciák családjának ellátása tette lehetővé, melyet a HCV cDNS szekvenciákat tartalmazó cDNS-könyvtárakból izoláltunk. Ezek a cDNSkönyvtárak HCV-vel fertőzött csimpánz plazmájában jelen levő nukleinsavszekvenciákból származtak. Ezen könyvtárak egyikének, a „c” könyvtárnak (ATCC No. 40 394) a felépítéséről az EP 0318 216 számú szabadalmi leírásban számoltunk be. Az itt közölt HCV cDNS-t tartalmazó kiónok közül számosat a „c” könyvtárból nyertünk. Bár a találmányban közölt kiónok közül másokat más HCV cDNS könyvtárakból nyertünk, a „c” könyvtárban levő szekvenciákat tartalmazó kiónok jelenlétét bizonyítottuk. Ahogy az EP 0318 216 számú szabadalmi leírásban közzétettük, a „c” könyvtárból izolált HCV cDNS szekvenciák családja nem humán vagy csimpánzeredetűek, és nem mutatnak jelentős homológiát a HBV-genomban levő szekvenciákkal.
Az itt leírt HCV cDNS-ek elérhetősége lehetővé tette olyan polinukleotidpróbák létrehozását, melyek hasznos reagensek a biológiai mintákban levő - ideértve az adott vért is - víruseredetű polinukleotidok detektálásában. Például a szekvenciákból 8-10 nukleotidból álló DNS-oligomerek szintetizálhatok, vagy nagyobbak, melyek hibridizációs próbákként alkalmazhatók a HCV RNS jelenlétének detektálására például adott vérben, olyan alanyok szérumában, melyek feltételezetten tartalmazzák a vírust, vagy sejttenyészetrendszerekben, ahol a vírus replikálódik. Továbbá a cDNS-szekvencia lehetőséget nyújt arra, hogy HCV-specifikus polipeptideket szerkesszünk és termeljünk, melyek diagnosztikai reagensekként használhatók a HCV-fertőzés alatt termelt antitestek jelenlétének kimutatására. A cDNS-ekből származtatott tisztított polipeptidek elleni antitestek szintén használhatók a biológiai mintákban levő vírusantigének detektálására. Ilyen minták az adott vérminták, NANBH-betegek szérumai és a HCV-replikációhoz használt szövettenyésztési rendszerek. Továbbá az itt közölt immunogén polipeptidek, melyek a 17. ábrán látható HCV cDNS ORF-jének (nyitott leolvasási keret) egy részében kódoltak, szintén használhatók a HCV-re történő szkrínelésre, diagnózisra és kezelésre és olyan antitestek képzésére, melyek ilyen célokra használhatók.
Továbbá az itt leírt új cDNS-szekvenciák lehetővé teszik a HCV-genom további jellemzését. Az ezen szekvenciákból származó polinukleotidpróbák és primerek használhatók a cDNS-könyvtárakban jelen levő szekvenciák kibővítéséhez és/vagy a cDNS-könyvtárak további átfedő cDNS-szekvenciákra való szkríneléséhez, mely viszont további átfedő szekvenciák nyeréséhez használható. Ahogy a későbbiekben és az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban jeleztük, a HCV-genom olyan RNS-nek tűnik, mely elsősorban egy nagy poliproteint kódoló nagy ORF-ből (nyílt leolvasási keret) áll.
Az itt nyújtott HCV cDNS szekvenciák, az ezen szekvenciákból származtatott polipeptidek, az itt leírt immunogén polipeptidek, akárcsak ezen polipeptidek ellen irányuló antitestek, szintén használhatók a véreredetű NABV (BB-NANBV) ágens(ek) izolálásához és azonosításához. Például a cDNS-ek származtatott polipeptidekben levő HCV-epitópok ellen irányuló antitestek olyan, a vírus izolálására használható eljárásokban alkalmazhatók, melyek az affinitáskromatográfiára épülnek. Másik lehetőség, az antitestek a más technikákkal izolált vírusrészecskék azonosítására használhatók. A vírusantigének és az izolált vírusrészecskékben levő genomanyagok a későbbiekben így tovább jellemezhetők.
Továbbá a későbbiekben adott információ lehetőséget nyújt további HCV-törzsek vagy izolátumok azonosítására. A további HCV-törzsek vagy izolátumok izolálása és jellemzése megvalósítható olyan testalkotókból való nukleinsavak izolálásával, melyek tartalmazzák a vírusrészecskéket és/vagy a vírus RNS-t, a későbbiekben leírt HCV cDNS próbákra alapozott polinukleotidpróbák használatával, a cDNS-könyvtárak létrehozásával, a könyvtárak a későbbiekben leírt HCV cDNS szekvenciákat tartalmazó kiónokra való szkrínelésével és az új izolátumokból származó HCV cDNS-ek későbbiekben leírt cDNS-ekkel való összehasonlításával. Az ezekben vagy a vírusgenomban kódolt polipeptidek vizsgálhatók immunológiai keresztreakciókra a fent leírt polipeptidek és antitestek használatával. Azok a törzsek vagy izolátumok, melyek megfelelnek a HCV-paramétereknek - ahogy azok korábban a Meghatározás című részben szerepelnek -, könnyen azonosíthatók. A HCV-törzsek azonosításának más módszerei egyértelműek lesznek a tudományban jártas szakemberek számára a találmányban nyújtott információk alapján.
HU 225 068 Β1
A HCV cDNS szekvenciák izolálása
A későbbiekben leírt új HCV cDNS szekvenciák kiterjesztik az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban közölt HCV-genomra a cDNS szekvenciáját. A b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a és a CA59a kiónokban jelen levő szekvenciák a közölt szekvenciáktól a szintézis irányával ellentétes irányban (upstream) helyezkednek el, és ha összeszerkesztjük őket, az összetett HCV cDNS szekvencia következő számú nukleotidjait eredményezik: -319-1348. (A nukleotid előtti negatív jel a nukleotidszintézis irányával ellentétes irányban levő távolságát jelöli attól a nukleotidtól, mely a feltételezett kezdő MET kodont kezdi.) A b5a és a 16jh kiónokban levő szekvenciák a közölt szekvenciától a szintézis irányával egyező irányban (downstream) helyezkednek el, és az összetett szekvencia 8659-8866 számokkal jelölt nukleotidjait eredményezi. Az összetett HCV cDNS szekvencia, mely tartalmazza a korábban említett kiónokban levő szekvenciákat, a 17. ábrán látható.
Az itt bemutatott új HCV cDNS-eket számos HCV cDNS könyvtárból izoláltuk, többek között a Iambda-gt11-ben jelen levő „c” könyvtárból (ATCC No. 40 394). A HCV cDNS könyvtárakat olyan csimpánz összegyűjtött szérumából állítottuk össze, mely krónikusan HCV-vel fertőzött volt, és magas vírustiterű volt, legalább 106 csimpánz fertőző dózis/ml (CID/ml). Az összegyűjtött szérumot vírusrészecskék izolálására használtuk; az ezen részecskékből izolált nukleinsavakat a cDNS-könyvtárak megszerkesztésében templátként használtuk a vírusgenomhoz. A feltételezett HCV-részecskék izolálásának és a „c” HCV cDNS könyvtár megszerkesztésének eljárását az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban tettük közzé. A HCV cDNS könyvtárak megszerkesztésének más módszerei ismertek a tudomány e területén, ezek közül néhányat a Példák című részben a későbbiekben közlünk. A szekvenciákat, melyek az ismert HCV cDNS szekvencia 5’- és 3’-régiójából származtak, szintetikus polinukleotidpróbákat használva a könyvtárak szkrínelésével izoláltuk. A cDNS-szekvenciák visszanyerésének módszere főképpen történelmi szempontból érdekes. A kapott szekvenciákat (és ezek komplementereit) a találmányban adjuk meg; a szekvenciákat vagy ezek bármely részét szintetikus módszerekkel készíthetjük el, vagy a szintetikus módszereket kombinálhatjuk a részszekvenciák visszanyerésének olyan módszereivel, melyek hasonlóak a jelen találmányban leírtakhoz.
Víruspolipeptidek és fragmentumok készítése
A HCV cDNS szekvenciák vagy a belőlük származó nukleotidszekvenciák (a szekvenciák szegmenjeit és modifikációit is beleértve) hozzáférhetősége lehetővé teszi expressziós vektorok létrehozását, melyek a szálak valamelyikében kódolt polipeptidek antigenikusan aktív régióit kódolják. Ezek az antigenikusan aktív régiók vagy a köpeny-, vagy a burokantigénekből, vagy a magantigénekből származhatnak, vagy olyan antigénekből, melyek nem szerkezeti antigének, ideértve például a polinukleotidkötő fehérjéket, polinukleotidpolimeráz(oka)t és más olyan vírusfehérjéket, melyek a vírusrészecskék replikációjához és/vagy összeállásához szükségesek. A kívánt polipeptideket kódoló fragmentumokat hagyományos restrikciós emésztést vagy szintetikus módszereket használva nyerjük a cDNS-klónokból, és olyan vektorokba ligáljuk őket, melyek például olyan fúziós szekvenciák részeit tartalmazhatják, mint a beta-galaktozidáz vagy szuperoxid-dizmutáz (SÓD), előnyösen SÓD. Az olyan módszereket és vektorokat, melyek olyan polipeptidek termeléséhez hasznosak, melyek a SÓD fúziós szekvenciáit tartalmazzák, a 0196056 számú, 1986. október 1-jén megjelent európai közzétételi iratban ismertették. Későbbiekben a Példák című részben írjuk le a számos HCV-klónban kódolt, a SÓD és HCV-polipeptidek fúziós polipeptidjeinek expressziójához való vektorokat. A bármelyik értelmes szálban nyílt leolvasási keretet tartalmazó HCV cDNS kívánt részeit rekombináns polipeptidként nyerhetjük ki, érett vagy fúziós fehérjeként, vagy másik lehetőségként a cDNS-ben kódolt polipeptidet kémiai szintézissel állíthatjuk elő.
A kívánt polipeptideket kódoló DNS akár fuzionált, akár érett formában, és akár tartalmazza a szekréciót lehetővé tevő szignálszekvenciát, akár nem, ligálható olyan expressziós vektorokba, melyek bármely alkalmas gazdának megfelelnek. Jelenleg mind az eukarióta, mind a prokarióta gazdarendszereket alkalmazzák a rekombináns polipeptidek előállításához, és néhány gyakoribb kontrollrendszer és gazdasejtvonal összegzését a későbbiekben adjuk meg. A polipeptidet ezután a roncsolt sejtekből vagy a tápközegből izoláljuk, és a felhasználási célnak megfelelő mértékig tisztítjuk. A tisztítást ismert technikákkal végezhetjük, ilyenek például a frakcionált extrakció, a sóval történő frakcionálás, az ioncserélő gyantán végzett kromatográfia, az affinitáskromatográfia, a centrifugálás és a hasonlók. Lásd például a Methods in Enzymology című könyvet, melyben számos fehérjetisztítási módszer szerepel. Az ilyen polipeptidek diagnosztikumokként használhatók, vagy azokból, melyek semlegesítő antitestek képzését idézik elő, vakcinák készíthetők. Az ezen polipeptidekkel szemben termelt antitestek szintén diagnosztikumokként használhatók, vagy passzív immunterápiára. Továbbá mint azt a későbbiekben tárgyaljuk, az ezen polipeptidek elleni antitestek a HCV-részecskék izolálására és azonosítására használhatók.
Antigén polipeptidek készítése és hordozóval való kapcsolása
Egy polipeptid antigénrégiója általában viszonylag kicsi - leggyakrabban 8-10 aminosav hosszú, vagy ennél is rövidebb. Az 5 aminosavból álló fragmentek már jellemezhetnek egy antigénterületet. Ezek a szegmentek megfelelhetnek a HCV-antigén régióinak. Ennek megfelelően a HCV cDNS-eit alapul véve a HCV-polipeptidek rövid szegmentjeit kódoló DNS-ek rekombinánsan kifejezhetők akár fúziós fehérjékként, akár izolált polipeptidekként. Továbbá a rövid aminosavszekvenciák kényelmesen előállíthatok kémiai szintézissel. Bizonyos esetekben, amikor a szintetizált polipeptid
HU 225 068 Β1 megfelelően konfigurált ahhoz, hogy jó epitópot adjon, de túl kicsi ahhoz, hogy immunogén hatású legyen, a polipeptid egy alkalmas hordozóhoz köthető.
Az ilyen kötések nyerésére számos technika ismert, ideértve az N-szukcinimidil-3-(2-piridi!-tio)-propionát (SFDP) és szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1-karboxilát (SMCC) alkalmazásával létrehozott diszulfidkötéseket. A vegyszerek a Pierce Companytól (Rockford, Illinois) származnak. (Ha a peptidből hiányzik a szulfhidrilcsoport, ezt egy ciszteinmaradék hozzáadásával biztosíthatjuk.) Ezek a reagensek diszulfidkötést létesítenek maguk és a peptid-ciszteinmaradék között az egyik proteinen, és amidkötést az epszilon-aminon keresztül a lizinen, vagy más szabad aminocsoporttal másokon. Számos ilyen diszulfid/amid képző anyagot ismerünk. Lásd például az Immun. Rév. (1982) 62:185 számát. Más kétfunkciójú párosító ágens a diszulfidkötés helyett inkább tioétert képez. A tioéterképző anyagok közül számos beszerezhető a kereskedelemben, idetartoznak a 6-maleimidokapronsav, 2bróm-ecetsav, 2-jód-ecetsav, 4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1-karboxilsav reaktív észterei és számos hasonló. A karboxilcsoportok aktiválhatok, ha szukcinimiddel vagy 1-hidroxil-2-nitro-4-szulfonsavval vagy Na-sóval vegyítjük őket. Az antigének összekapcsolásához használt további módszerek rotavírus/„kötőfehérje” rendszert alkalmaznak, mely az EP 0259,149 számú közzétételi iratban került leírásra, melyet a jelen találmány referenciarészében megadtunk. Az előző listát nem szántuk kimerítőnek, a megnevezett vegyületek módozatai természetesen használhatók.
Bármely hordozó használható, ha önmagában nem indukálja a gazdára káros antitest termelését. A megfelelő hordozók általában nagy, lassan lebomló makromolekulák, mint például a fehérjék; poliszacharidok, mint például a latex funkcionalizált szefaróz, agaróz, cellulóz, cellulózgyöngyök és a hasonlók; polimer aminosavak, mint például a poliglutaminsav, polilizin és hasonlók; aminosavpolimerek; és inaktív vírusrészecskék. Különösen alkalmas proteinszubsztrátok: a szérumalbuminok, a kulcs alakú tapadó kagyló (keyhole limpet) hemocianinja, immunoglobulinmolekulák, tiroglobulin, ovalbumin, tetanusz-toxid és más e területen jártas szakember számára ismert fehérjék.
A teljes hosszúságú vírusproteinen túl a legalább egy vírusepitópot kódoló csonka HCV-aminosavszekvenciákat tartalmazó polipeptidek is megfelelő immunológiai reagensek. Például az ilyen csonka szekvenciákból álló polipeptidek reagensként alkalmazhatók egy immunológiai vizsgálatban. Ezek a polipeptidek az antiszérum- vagy vakcina-előállítás összetevőinek antigénalegység-jelöltjei is. Míg ezek a csonka szekvenciák a natív vírusprotein számos ismert kezelésével előállíthatok, általában jobban kedvelt a HCV-szekvenciákból álló polipeptidek szintetikus vagy rekombináns úton való előállítása. Ezen csonka HCV-szekvenciákat tartalmazó polipeptidek HCV-szekvenciákból (egy vagy több epitóp, érintkező vagy nem érintkező) teljesen előállíthatok, vagy HCV-szekvenciákból és egy fúziós fehérjében levő heterológ szekvenciákból állíthatók össze. A használható heterológ szekvenciák közé tartoznak olyan szekvenciák, melyek biztosítják a szekréciót a rekombináns gazdából, erősítik a HCV-epitóp(ok) immunológiai aktivitását, vagy elősegítik a polipeptid kötődését egy immunológiai vizsgálat anyagához vagy egy vakcinahordozóhoz. Lásd az EP 116,201 számú, U.S. 4,722,840 számú, EP 259,149 számú, U.S. 4.629,783 számú szabadalmi leírásokat, melyeket a találmány referenciarészében közöltünk.
A csonka HCV-szekvenciákat tartalmazó polipeptid mérete széles keretek között változik, a minimális méret olyan szekvencia, mely elegendő méretű ahhoz, hogy egy HCV-epitópot biztosítson, míg a maximális méret nem kritikus. A kényelem kedvéért a maximális méret általában nem sokkal nagyobb, mint amekkora a kívánt HCV-epitópok biztosításához szükséges, és a heterológ szekvencia funkcióját már képes ellátni. Általánosan a csonka HCV-aminosavszekvencia kb. 5-kb. 100 aminosav hosszúságú. Még gyakrabban azonban a HCV-szekvencia maximum kb. 50 aminosav hosszúságú lesz, előnyösen maximálisan kb. 30 aminosavból áll. Általában kívánatos olyan HCV-szekvenciákat szelektálni, melyek legalább 10, 12 vagy 15 aminosavból, maximum kb. 20, 25 aminosavból állnak.
Az epitópokból álló csonka HCV-aminosavszekvenciák számos módon azonosíthatók. Például a teljes vírusprotein-szekvencia szkrínelhető úgy, hogy egy sor olyan rövid polipeptidet készítünk, melyek együtt kiadják a teljes proteinszekvenciát. A HCV-poliprotein-régiók antigénszkrínelésére később adunk példát. Továbbá például egy 100 tagú polipeptiddel kezdve rutinmunka lenne a kívánt aktivitást mutató epitópok jelenlétére való szkrínelés, majd tovább haladva tesztelni lehetne az azonosított 100 tagú polipeptiden levő kisebb és az átfedő fragmenteket, hogy a kérdéses epitópot feltérképezzük. Az ilyen polipeptidek immunológiai vizsgálati módszerekkel való tesztelése ismert a tudomány számára. Ismeretes, hogyan kell a proteinszekvencia komputeres vizsgálatát elvégezni, ha potenciális epitópot szándékozunk azonosítani, majd a szkríneléshez az azonosított régiót tartalmazó oligopeptideket előállítani. A HCV-aminosavszekvencia ilyen komputeres analízisét a 20. ábra mutatja, ahol a hidrofil/hidrofób tulajdonságot az antigénindex fölött jelöltük. Az aminosavak számozása a kezdő MET (1. pozíció) kodonnál indul, ahogy azt a 17. ábra mutatja. A tudományban jártas szakemberek helyesen ítélik meg, hogy az antigenitás ilyen komputeres analízise nem mindig olyan epitópot azonosít, mely valójában létezik is, és helytelenül azonosíthat egy fehérjerégiót, mintha epitópot tartalmazna.
A későbbiekben írunk le olyan példákat a használható HCV-aminosavszekvenciákról, melyeket olyan expressziós vektorokból fejeztünk ki, amelyek tartalmazzák a következő kiónokat: 5-1-1, 81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, CA167b. Más használható HCV-aminosavszekvenciákat - ahogy itt leírtuk, a későbbiekben adunk meg. Meg kell érteni, hogy ezek a polipeptidek nem szükségszerűen pontosan térképez12
HU 225 068 Β1 nek fel egy epitópot, és hogy tartalmazhatnak nem immunogén HCV-szekvenciát is. A szekvencia ezen nem immunogén részeit a fent leírtak szerint határozhatjuk meg hagyományos technikákat használva, a leírt szekvenciákból kiemelve. A további csonka HCV-aminosavszekvenciák, melyek egy epitópból állnak vagy immunogének, a fent leírtak szerint azonosíthatók. A következő szekvenciákat az aminosavszámok (például AAn) alapján adtuk meg, ahol n az aminosav száma, ahogy az a 17. ábrán is látható:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177 AA1-AA10; AA5-AA20; AA20-AA25; AA35-AA45 AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75
AA80-AA90;
AA105-AA120
AA155-AA170
AA220-AA240
AA290-AA330
AA310-AA330
AA405-AA495
AA415-AA425
AA450-AA500
AA475-AA495
AA515-AA550
AA575-AA605
AA600-AA625
AA645-AA680
AA700-AA750
AA750-AA800
AA850-AA875
AA850-AA900
AA99-AA120;
AA100-AA150
AA190-AA210
AA245-AA265
AA290-AA305
AA350-AA400
AA400-AA450
AA435-AA435
AA440-AA460
AA500-AA550
AA550-AA600
AA585-AA600
AA635-AA665
AA700-AA750
AA725-AA775
AA800-AA815
AA800-AA850
AA920-AA945
AA95-AA110
AA150-AA200
AA200-AA250
AA250-AA300
AA300-AA350
AA380-AA395
AA405-AA415
AA437-AA582
AA460-AA470
AA511-AA690
AA550-AA625
AA600-AA650
AA650-AA700
AA700-AA725
AA770-AA790
AA825-AA850
AA920-AA990
AA940-AA965
AA970-AA990; AA950-AA1000; AA1000-AA1060
AA1000-AA1025 AA1040-AA1055 AA1070-AA1100 AA1192-AA1457 AA1225-AA1250 AA1260-AA1280 AA1290-AA1310 AA1345-AA1365 AA1380-AA1405 AA1460-AA1475 AA1500-AA1550 AA1550-AA1600 AA1570-AA1590 AA1610—AA1645 AA1689-AA1805 AA1720-AA1745 AA1775-AA1810 AA1900-AA1950 AA1920-AA1940 AA1950-AA1985 AA2005-AA2025 AA2045-AA2070 AA2100-AA2150 AA2200-AA2325 AA2265-AA2280 AA2300-AA2350 AA2330-AA2350 AA2345-AA2415
AA1000-AA1050 AA1075-AA1175 AA1100-AA1130 AA1195-AA1250 AA1250-AA1300 AA1266-AA1428 AA1310-AA1340 AA1350-AA1400 AA1400-AA1450 AA1475-AA1515 AA1500-AA1515 AA1545-AA1560 AA1595-AA1610 AA1650-AA1690 AA1690-AA1720 AA1745—AA1770 AA1795-AA1850 AA1900-AA1920 AA1949-AA2124 AA1980-AA2000 AA2020-AA2045 AA2054-AA2223 AA2150-AA2200 AA2250-AA2330 AA2280-AA2290 AA2290-AA2310 AA2350-AA2400 AA2345-AA2375
AA1025-AA1040 AA1050-AA1200 AA1140-AA1165 AA1200-AA1225 AA1260-AA1310 AA1300-AA1350 AA1345-AA1405 AA1365-AA1380 AA1450-AA1500 AA1475-AA1500 AA1515-AA1550 AA1569-AA1931 AA1590-AA1650 AA1685—AA1770 AA1694-AA1735 AA1750-AA1800 AA1850-AA1900 AA1916-AA2021 AA1950-AA2000 AA2000-AA2050 AA2045-AA2100 AA2070-AA2100 AA2200-AA2250 AA2255-AA2270 AA2287-AA2385 AA2310-AA2330 AA2348-AA2464 AA2370-AA2410
AA2371-AA2502; AA2400-AA2450; AA2400-AA2425; AA24I5-AA2450; AA2445-AA2500; AA2445-AA2475; AA2470-AA2490; AA2500-AA2550; AA2505-AA2540; AA2535-AA2560; AA2550-AA2600; AA2560-AA2580;
AA2600-AA2650; AA2605-AA2620; AA2620-AA2650;
AA2640-AA2660; AA2650-AA2700; AA2655-AA2670; AA2670-AA2700; AA2700-AA2750; AA2740-AA2760; AA2750-AA2800; AA2755-AA2780; AA2780-AA2830; AA2785-AA2810; AA2796-AA2886; AA2810-AA2825;
AA2800-AA2850; AA2850-AA2900; AA2850-AA2860; AA2885-AA2905; AA2900-AA2950; AA2910-AA2930; AA2925-AA2950; AA2945-end (C' vég).
A fenti HCV-aminosavszekvenciákat mint diszkrét peptideket állíthatjuk elő, vagy egy nagyobb polipeptid15 be építhetjük be, és a találmányban leírtak szerint használhatók. További csonka HCV-szekvenciákat tartalmazó polipeptideket a példákban adtunk meg.
A feltételezett HCV-poliproteinek és Flavivírusok megfigyelt kapcsolata néhány, a HCV nem szerkezeti (NS) fehérjéinek feltételezett doménjeire ad becslési lehetőséget. Az egyes NS fehérjék feltételezett Flavivírus prekurzor poliproteinjeiben való elhelyezkedése egészen jól ismert. Továbbá ezek egybeesnek a poliproteinek hidrofobitási profiljában megfigyelt erős ingadozásokkal.
Megállapítottuk, hogy a Flavivírusok NS5-je a virionpolimerázt kódolja, valamint azt, hogy az NS1 megegyezik az állatokban hatásos vakcinának bizonyult komplementer fixációs antigénnel. Nemrégiben kimutattuk, hogy a Flavivírus proteáz funkció az NS3-ban található. A HCV és a Flavivírusok között megfigyelt hasonlóságnak köszönhetően - a későbbiekben írjuk le - következtetéseket lehet levonni a megfelelő proteindomének körülbelüli elhelyezkedésére és a HCV-poliproteinben levő funkcióira. Az ezen doméneket tartalmazó polipeptidek számos rekombináns gazdasejtben, például baktériumok, élesztőgombák, rovarok és gerincesek sejtjeiben való expressziója fontos immunológiai reagensek létrehozását kellene eredményezze, melyek diagnózisokhoz, detektáláshoz és vakcinákhoz lennének használhatók.
Bár az itt leírt HCV-izolátum feltételezett poliproteinjeinek nem szerkezeti fehérjerégiói és a Flavivírusok között bizonyos hasonlóság látszik, kevésbé hasonlóak az N-terminus felé elhelyezkedő feltételezett szerkezeti régiókban. Ezen a területen nagy szekven45 ciabeli eltérés mutatkozik, továbbá a két régió hidrofób profilja is kevés hasonlóságot mutat. Ez az „eltérés” a HCV feltételezett NS1 doménjének N-terminális régiójában kezdődik, és a feltételezett N-terminusig tart. Azonban még így is lehetséges a feltételezett nukleo50 kapszid (N-terminális alapdomén) és az E (általában hidrofób) domének HCV-poliproteinen belüli körülbelüli elhelyezkedésének becslése. A Példák című részben a becsléseket a HCV-poliprotein hidrofób profiljában megfigyelt változásokra és a Flavivírus proteinek elhe55 lyezkedésének és jellemzőjének ismeretére alapoztuk. Ezen becslések alapján lehetővé válik a HCV-poliproteinek azon körülbelüli régióinak azonosítása, melyek hasznos immunológiai reagenseknek felelhetnek meg. Például a Flavivírusok E és NS1 proteinjei védővakci60 nákként hatékonynak ismeretesek. Ezek a régiók,
HU 225 068 Β1 akárcsak néhány, mely antigénhatásúnak mutatkozott az itt leírt HCV-izolátumokban, például azok, melyek a feltételezett NS3, C és NS5 stb.-n belül vannak, diagnosztikai reagensekként szerepelhetnének. Továbbá a vírusban kódolt enzimek elhelyezkedése és expressziója lehetővé teszi a vírus elleni enziminhibitorok becslését, például inhibitorok, melyek az enzimaktivitást gátolják annak következtében, hogy magával az enzimmel lépnek kapcsolatba, vagy olyan anyagok, melyek megakadályozzák az enzim expresszióját (például antiszensz RNS, vagy más drogok, melyek megakadályozzák az expressziót).
HCV-epitópot tartalmazó hibrid részecske immunogének előállítása
A HCV-epitópok immunogenitása fokozható, ha emlős- vagy élesztőgomba-rendszerben készítjük őket, melyek fuzionáltak vagy összekapcsolódtak részecskeképző fehérjékkel, mint például a hepatitis B felületi antigénnel kapcsolódtak. Azok a szerkezetek, melyekben az NANBV-epitóp közvetlenül kötődik a részecskeképző fehérjét kódoló szekvenciával, hibrideket képeznek, melyek az epitópot figyelembe véve immunogén tulajdonságúak. Továbbá az összes elkészített vektor a HBV-re specifikus epitópokat foglal magában, melyek immunogenitása különböző mértékű, mint például a pre-S-peptid. így a HCV-szekvenciákat magában foglaló részecskeképző fehérjéből létrehozott részecskék immunogén tulajdonságúak a HCV-t és HBV-t figyelembe véve.
A hepatitis felületi antigén (HBSAg), úgy tűnik, részecskéket képez és részecskékhez kötődik az S. cerevisiae-ben [Valenzuela et al. (1982)], akárcsak például emlőssejtekben [Valenzuela et al. (1984)]. Az ilyen részecskék képzése, úgy tűnik, fokozza a monomer alegységek immunogenitását. A szerkezetek magukban foglalhatják a felszínközeli (pre-S) régió 55 aminosavából álló HBSAg immunodomináns epitópot [Neurath et al. (1984)]. Az élesztőgombában expresszálható pre-S-HBSAg részecskék szerkezeteiről az EP 174,444 számú szabadalmi leírásban (1986. márc. 19-én jelent meg) írtunk, az élesztőgombában való expresszáláshoz a heterológ vírusszekvenciákat tartalmazó hibrideket az EP 175.261 számú szabadalmi leírásban írtuk le (1986. márc. 26-án jelent meg). Ezek a szerkezetek emlőssejtekben is expresszálhatók, mint például a kínai hörcsög ovarium sejtjeiben (CHO) egy SV40-dihidrofolát-reduktáz vektort használva [Michelle et al. (1984)].
Továbbá a részecskeképző fehérjét kódoló szekvencia részei helyettesíthetők egy HCV-epitópot kódoló kodonokkal. Ebben a helyettesítésben azokat a régiókat, melyek nem szükségesek az egységek egyesítésének közvetítésében, hogy élesztőgombában vagy emlősökben immunogén részecskék keletkezzenek, kihagyhatjuk, így kimaradnak további HBV antigénhatású helyek a HCV-epitóppal való versengésből.
Vakcinakészités
Vakcinákat HCV cDNS-ből származó egy vagy több immunogén polipeptidből lehet készíteni, ideértve a Példák című részben leírt cDNS-szekvenciákat is. A HCV és Flavivírusok között megfigyelt homológia információt nyújt azokra a polipeptidekre vonatkozóan, melyek vakcinaként a leghatásosabbak lehetnek, akárcsak a genom azon régióiról, melyekben ezek kódoltak. A Flavivírus genomjának általános szerkezetét Rice et al. tárgyalják (1986). A Flavivírus genom RNS-t az egyetlen vírusspecifikus RNS-fajnak vélik, ez a - a C, az M és az E - vírus szerkezeti fehérjévé transzlálódik, akárcsak két nagy - az NS4 és NS5 - nem szerkezeti fehérjévé és kisebb nem szerkezeti fehérjék egész komplex sorozatává. Ismeretes, hogy a Flavivírus fő neutralizáló epitópjai az E (burok=envelope) fehérjében helyezkednek el (Roehrig, 1986). így a vakcinák a HCV E epitópokat tartalmazó rekombináns polipeptidekből állhatnak. Ezek a polipeptidek expresszálhatók baktériumokban, élesztőgombákban vagy emlőssejtekben, vagy víruskészítményekből izolálhatok. Az is előre látható, hogy más szerkezeti fehérjék is tartalmazhatnak epitópokat, melyek védőhatású HCV elleni antitestek termelését idézhetik elő. így az E, C és M epitópokat tartalmazó polipeptidek, akár külön, akár kombinációkban, HCV-vakcinákban használhatók.
A fentieken túl kimutatták, hogy az NS1-gyel (nem szerkezeti fehérje 1) történő immunizálás a sárgaláz ellen is védelmet ad [Schlesinger et al. (1986)]. Ez még akkor is igaz, ha az immunizálás nem váltja ki a neutralizáló antitestek termelését. így kiváltképpen mivel ez a fehérje, úgy tűnik, erősen konzervált a Flavivírusok körében, úgy tűnik, hogy a HCV NS1 védőhatású lesz a HCV-fertőzéssel szemben is. Továbbá úgy látszik, hogy a nem szerkezeti fehérjék védelmet nyújthatnak a víruspatogenitással szemben, még akkor is, ha nem váltják ki a neutralizáló antitestek termelését. A HCV ORF-ek különböző régióit adó klónozott HCV cDNS-ekből expresszált polipeptidek immunogenitását véve alapul, a Példák című részben nyújtott információk becsléseket tesznek lehetővé vakcinákban való felhasználásukat illetően.
A fentieket figyelembe véve a HCV elleni sokoldalú vakcinák egy vagy több szerkezeti fehérjéből származó egy vagy több epitópból és/vagy egy vagy több nem szerkezeti fehérjéből származó egy vagy több epitópból állhatnak. Ezek a vakcinák például rekombináns HCV-polipeptidekből és/vagy virionokból izolált polipeptidekből állhatnak. Bizonyos esetekben a vakcinákat úgy tervezik, hogy egy vagy több, a következőkben felsorolt HCV-proteinekből vagy a belőlük származó alegységantigénekből álljanak: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4, NS5. Különösen kedveltek azok a vakcinák, melyek E és/vagy NS1-ből, vagy ezek alegységeiből állnak.
A témában jártas szakember számára ismeretes az olyan vakcina előállítása, mely aktív alkotórészként immunogén polipeptide(ke)t tartalmaz. Leggyakrabban ezek a vakcinák beinjekciózható állapotban készülnek, vagy folyékony oldatokként vagy szuszpenziókként; a szilárd halmazállapotúak alkalmasak az oldatkészítésre vagy a felszuszpendálásra; beinjekciózás előtti folyadékot is lehet készíteni. A készítmény lehet
HU 225 068 Β1 emulgeált vagy liposzómákba zárt fehérje. Az aktív immunogén hatású alkotórész gyakran gyógyszerészetileg elfogadható és az aktív alkotórésszel összeegyeztethető kötőanyagokkal kevert. Megfelelő kötőanyagok például a víz, sóoldat, dextróz, glicerin, etanol vagy ehhez hasonlók és ezek kombinációi. Továbbá, ha kívánatos, a vakcina tartalmazhat kisebb mennyiségű segédanyagokat, mint például nedvesítő- vagy emulgeálóágenseket, pH-pufferáló anyagokat és/vagy hatássegítő szereket, melyek a vakcina hatékonyságát erősítik. A hatásserkentő szerekre példa - de nem korlátozódik csupán ezekre alumínium-hidroxid, N-acetilmurmil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetilnor-muramil-L-alanil-D-izoglutamin (CGP, 11637, norMDP-ként nevezett), N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-foszforil-oxi)-etil-amin (CGP 19835A, MTP-PE-ként nevezett) és RIBI, mely baktériumokból kivont három összetevőt tartalmaz: monofoszforil lipid A, trehalóz-dimikolát és sejtfalvázat (MPL+TDM+CWS) 2%-os squalene/Tween 80 emulzióban (squalene=C30 szénhidrogén, mely 6 izoprén egységből áll, a koleszterolbioszintézis köztes terméke). A hatásserkentő szer hatékonyságát úgy határozhatjuk meg, ha mérjük az immunogén polipeptid ellen irányuló antitestek mennyiségét, mely polipeptid tartalmazza a különböző erősítőszerekből álló vakcinában beadott ezen polipeptidből származó HCV-antigén-hatású szekvenciát.
A vakcinákat hagyományosan parenterálisan alkalmazzák, injekciók révén, például szubkután vagy intramuszkulárisan. További készítmények, melyek más módon való alkalmazást tesznek lehetővé, magukban foglalják a végbélkúpokat és néhány esetben a szájon át szedhető készítményeket. Végbélkúpokhoz a hagyományos kötő- és hordozóanyagok lehetnek például a polialkilénglikolok vagy trigliceridek; az ilyen végbélkúpok olyan keverékekből állhatnak, melyek az aktív alkotórészt 0,5%—10%, előnyösebben 1-2%-ban tartalmazzák. A szájon át szedhető készítmények olyan hagyományos alkalmazású kötőanyagokat tartalmazhatnak, mint a gyógyszerészeti tisztaságú mannit, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, nátrium-szacharin, cellulóz, magnézium-karbonát és hasonlók. Ezek az alkotórészek oldatok, szuszpenziók, tabletták, pirulák, kapszulák, lassan kiszabaduló készítmények vagy porok alakjában léteznek, és aktív alkotórészt 10-95%ban, előnyösen 25-70%-ban tartalmaznak.
A vakcinákhoz a fehérjéket neutrális vagy só alakjában formulázzák. A gyógyszerészetileg elfogadható sók magukban foglalják a savhozzáadású sókat (a peptid szabad aminosavaival képzett) és azokat, melyeket szervetlen savakkal hozunk létre, mint például a hidroklóros vagy foszforossav, vagy olyan szerves savakkal, mint az ecetsav, oxálsav, borostyánkősav, maleinsav és a hasonlók. A szabad karboxilcsoportokkal előállított sók származhatnak szervetlen bázisokból, mint például a nátrium-, kálium-, ammónium-, kalciumés vas-hidroxidok, és olyan szerves bázisokból, mint az izopropil-amin, trimetil-amin, 2-etil-amino-etanol, hisztidin, novokain és a hasonlók.
A vakcinák adagolása és alkalmazása
A vakcinák adagolása oly módon történik, hogy az megfelelő az adagolt készítménynek, és olyan mennyiségben, mely profilaktikusan és/vagy terápiásán hatékony. Az alkalmazandó mennyiség, mely általában 5-250 mikrogramm antigén per adag mennyiséget jelent, a kezelendő alanytól, az alany immunrendszerének antitestszintetizáló kapacitásától és a kívánt védettség mértékétől függ. Az alkalmazni kívánt aktív alkotórészek pontos mennyisége az alkalmazó elbírálásától függhet és egyénenként változhat.
A vakcina adagolása egyszeri dózisadagolásban vagy többszörös dózisadagolásban történhet. A többszörös dózisadagolás olyan, melyben az első vakcinás kezelés 1-10 különálló dózist jelenthet, melyet több egymást követő időintervallumban történő dózisadagolás követ, hogy a kívánt immunválaszt fenntartsák és megerősítsék. Például 1-4 hónap után következik a második dózis, és ha szükséges, további dózis(ok) néhány hónap elteltével. A dózisadagolást legalább részben az egyén igényei szerint határozzák meg, és az alkalmazó ítéletétől függ.
Továbbá az immunogén hatású HCV-antigén(ek)et tartalmazó vakcinák együttesen alkalmazhatók más immunregulációs anyagokkal, például immunoglobulinokkal.
HCV-epitópok elleni antitestek készítése
A fent leírt módon készített immunogén polipeptidek mind poliklonális, mind monoklonális antitestek termelésére használatosak. Ha poliklonális antitest előállítása a cél, egy szelektált emlőst (például egeret, nyulat, kecskét, lovat stb.) immunizálnak a HCV-epitópo(ka)t hordozó immunogén polipeptiddel. Az immunizált állatokból a szérumot összegyűjtik és ismert eljárások szerint kezelik. Ha egy HCV-epitóp elleni poliklonális antitesteket tartalmazó szérum más antigének elleni antitesteket is tartalmaz, a poliklonális antitestek immunoaffinitási kromatográfiával tisztíthatok. A poliklonális antiszérum előállítási és feldolgozási technikái ismertek, lásd például Mayer és Walker (1987) munkáját.
Másik megoldásként, poliklonális antitestek izolálhatok olyan emlősből, melyet korábban HCV-vel fertőztek. Az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban található egy példa a fertőzött egyedből vett szérumból származó HCV-epitópok elleni antitestek tisztítási módszerére, mely az affinitáskromatográfián alapul, és SÓD fúziós polipeptidet és egy cDNS 5-1-1 kiónban kódolt polipeptidet használ.
A HCV-epitópok ellen irányuló monoklonális antitestek szintén könnyen előállíthatok a témában jártas szakemberek számára. Jól ismert a hibridómákkal készített monoklonális antitest előállítás általános módszertana. Folyamatos antitesttermelő sejtvonalakat lehet előállítani sejtfúzióval és más olyan technikákkal, mint például a B-limfociták onkogén hatású DNS-sel történő direkt transzformációjával vagy Epstein-Barr-vírussal való transzfekció révén. Lásd például M. Schreier et al. (1980); Hammerling et al. (1981); Kennett et al. (1980) munkáit; valamint a következő számú szabadalmi leírá15
HU 225 068 Β1 sokat: U.S. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890. A HCV-epitópok ellen készített monoklonális antitestek paneljeit számos tulajdonságra lehet szkrínelni, például izotípusra, epitópaffinitásra stb.
A HCV-epitópok ellen irányuló akár monoklonális, akár poliklonális antitestek különösen használhatóak diagnózisokban, és a neutralizálók a passzív immunoterápiában. Különösen a monoklonális antitestek antiidiotípusú antitestek termelésének kiváltására használhatók.
Az antiidiotípusú antitestek olyan immunoglobulinok, melyek a fertőző ágens antigénjének egy „belső image-ét hordozzák, mely ellen a védekezést tervezik. Lásd például Nisonoff, A., et al. (1981) és Dreesman et al. (1985) munkáit.
Az antiidiotípusú antitestek termelésére ismertek a technikák. Lásd például Grzych (1985), MacNamara et al. (1984) és Uytdehaag et al. (1985) munkáit. Ezek az antiidiotípusú antitestek az NANBH kezelésére és/vagy diagnózisára használhatók, akárcsak a HCV-antigének immunogén régióinak tisztázására.
A témában átlagosan jártas szakember felismerné azt is, hogy számos, a HCV-epitópok ellen irányuló antitesttípus termelhető. Ahogy a találmányban alkalmazzuk, az „antitest” olyan polipeptidre vagy polipeptidek csoportjára vonatkozik, melyek legalább egy antitestkötési hellyel rendelkeznek. Az „antitestkötési hely vagy „kötődőmén” az antitestmolekula(ák) változó doménjeinek összecsavarodása révén keletkezik, hogy 3 dimenziós kötési helyek jöjjenek létre egy belső felületi alakkal és töltéseloszlással, melyek komplementerek egy antigénepitóp tulajdonságaival. Ez teszi lehetővé az antigénnel való immunológiai reakciót. Az antitestkötési hely kialakulhat nehéz és/vagy könnyű láncú doménből (VH és VL, megfelelően), mely hiperváltozékony hurkokat képez, melyek elősegítik az antigénkötés létrejöttét. Az „antitest fogalma magában foglalja például a gerincesek antitestjeit, a hibrid antitesteket, a kimer antitesteket, a megváltozott antitesteket, az univalens antitesteket, a FAB-proteineket és az egyes doménű antitesteket.
Az „egyes doménű antitest” (dAb) olyan antitest, mely egy olyan VH doménből áll, mely immunológiailag reagál egy kijelölt antigénnel. A dAb nem tartalmaz VL domént, de tartalmazhat más olyan antigénkötő doméneket, melyek antitestekben való létezése ismert, például a kappa és a lambda doméneket. A tudomány számára ismertek a dAb-előállítás módszerei. Lásd például Ward et al. (1989) munkáját.
Az antitestek szintén állhatnak VH és VL doménekből, akárcsak más ismert antigénkötő doménekből. Az ilyen típusú antigénekre példák és ezek előállítási módszerei ismertek (lásd például U.S. Patent No. 4,816,467, mely a referenciában megtalálható), és a következőket foglalják magukban. Például a „gerincesek antitestjei” fogalom olyan antitestekre vonatkozik, melyek ezek tetramerjei vagy aggregátumai, könnyű és nehéz láncokból állnak, és általában Y konfigurációvá aggregálódnak. Lehet kovalens kötés a láncok között, de hiányozhat is. A gerincesek antitestjeiben egy kiemelt antitest összes láncának aminosavszekvenciája homológ azokkal a láncokkal, melyet egy limfocita által termelt antitestben találtak. Ez a limfocita termeli azt az antitestet in situ vagy in vitro (például hibridómákban). A gerincesek antitestjei tipikusan natív antitesteket foglalnak magukban, például tisztított poliklonális antitesteket és monoklonális antitesteket. Az ezen antitestek előállítására szolgáló módszerekre példákat később mutatunk be.
A „hibrid antitestek” olyan antitestek, melyekben egy nehéz és könnyű láncból álló pár homológ az első antitestben találhatóval, míg a második nehéz és könnyű láncból álló pár egy eltérő második antitestben levővel homológ. Tipikusan e két pár mindegyike különböző epitópokat fog kötni, külön-külön eltérő antigéneken. Ez a „kétvegyértékűség” tulajdonságát eredményezi, azaz két antigén szimultán kötésének képességét. Az ilyen hibridek kimer láncok használatával is kialakíthatók, ahogy azt korábban említettük.
A „kiméra antitestek” olyan antitestek, melyekben a nehéz és/vagy könnyű láncok fúziós proteinek. Tipikusan a láncok konstans doménje egy meghatározott fajból és/vagy osztályból származik, és a változó domének egy másikból. Magában foglal olyan bármely antitestet is, melyben akár csak a nehéz vagy a könnyű láncok, vagy mindkettő olyan szekvenciák kombinációjából tevődik össze, melyek másolatai a különböző forrásokból származó antitestek szekvenciáinak, függetlenül attól, hogy ezek a források eltérő osztályokból vagy fajokból származnak-e, valamint, hogy a fúziós pont a változó/konstans határán van-e, vagy sem. így lehetőség van olyan antitestek előállítására, melyekben sem a konstans, sem a változó régiók nem másolnak ismert antitestszekvenciákat. így azután lehetőség van például olyan antitestek létrehozására, melyek változó régiójának nagyobb specifikus affinitása van egy meghatározott antigénre, vagy melyek konstans régiója előidézhet fokozott komplementfixációt, vagy egy meghatározott konstans régió tulajdonságában lehet fejlesztéseket létrehozni.
Másik példa a „megváltozott antitestek” példája, mely olyan antitestekre vonatkozik, melyekben a gerincesek antitestjében természetesen előforduló aminosavszekvencia megváltozott. Rekombináns DNS technikákat alkalmazva az antitesteket újra lehet szerkeszteni, hogy a kívánt tulajdonságokat elérjük. A lehetséges variációk száma rengeteg, egy vagy több aminosav változtatásától a régió teljes újraszerkesztéséig, például a konstans régióig terjedhet. A konstans régióban történő változások általában azt a célt szolgálják, hogy elérjük a kívánt sejtfolyamat-tulajdonságokat, azaz a komplementfixálásban változásokat, membránokkal való interakciókat, és más effektor funkciókat. A változó régióban bekövetkező változásokat az antigénkötő tulajdonságok megváltoztatása céljából lehet elvégezni. Az antitest olyan célból is létrehozható, hogy segítse a molekula vagy anyagok specifikus szállítását egy specifikus sejthez vagy szöveti területhez. A kívánt változtatásokat a molekuláris biológiában ismert tech16
HU 225 068 Β1 nikákkal lehet elvégezni, például rekombináns technikával, helyirányított mutagenezissel stb.
Egy másik példa az „univalens antitestek” példája, mely olyan aggregátumokból áll, ahol a nehéz láncú/könnyű láncú dimer egy második nehéz lánc Fc (azaz konstans) régiójához kötődik. Az ilyen típusú antitest elkerüli az antigénmutációt. Lásd például Glennie et al. (1982) munkáját.
Az antitestek definíciójába tartoznak az antitestek „Fab”-fragmentumai is. A „Fab” régió a nehéz és könnyű láncok azon részeire vonatkozik, melyek durván megegyeznek vagy analógok azokkal a szekvenciákkal, melyek a nehéz és könnyű láncok ágainak részeiből állnak, és melyekről kimutatták, hogy egy megjelölt antigénnel immunológiai kötést hoznak létre, de amelyekből hiányzik az effektor Fc rész. A „Fab magában foglalja egy nehéz és egy könnyű lánc aggregátumait (általában „Fab”-ként ismert), akárcsak a 2H és 2L láncokat tartalmazó tetramereket [F(ab)2-ként jelölt], melyek képesek a kijelölt antigénnel vagy antigéncsaláddal szelektíven reagálni. A „Fab” antitesteket alegységekre lehet osztani, melyek analógok a fent leírtakkal, azaz „gerinces Fab”, „hibrid Fab”, „kimer Fab” és „megváltozott Fab”. Az antitestek „Fab”-fragmentjeinek előállítására szolgáló módszerek ismertek, idetartoznak például a proteolízis és a rekombináns technikákkal való szintézis.
Diagnosztikai oligonukleotidpróbák és kitek
Az izolált HCV cDNS-einek leírt részeit véve alapul, megközelítően 8 vagy több nukleotidból álló oligomereket lehet előállítani, akár kimetszéssel, akár szintetikus úton, melyek hibridizálnak a HCV-genommal, és melyek a víruságensek azonosításában, a vírusgenom(ok) további jellemzésében és beteg egyedekben a vírus(ok) detektálásában használhatók. A HCV-polinukleotidok (természetes vagy származtatott) próbái olyan hosszúságúak, melyek lehetővé teszik a jellemző vírusszekvenciák hibridizációval történő detektálását. Míg a 6-8 nukleotid már munkaképes hosszúságú, kedveltebbek a 10-12 nukleotidból álló szekvenciák, és a kb. 20 nukleotidból álló tűnik optimálisnak. Előnyösen ezek a szekvenciák olyan régiókból származnak, melyek nem rendelkeznek heterogenitással. Ezek a próbák rutinmódszerek alkalmazásával előállíthatok, ideértve az automatizált oligonukleotid szintetikus módszert. A használható próbák között vannak például olyanok, melyek az itt leírt új izolálású klónokból származnak, vagy a korábban említett cDNS-könyvtárak próbálásában használható különböző oligomerek. A HCV-genom bármely jellemző részéhez egy komplementer kielégítő lehet. A próbaként való alkalmazáshoz a teljes komplementaritás a kívánatos, bár ez nem feltétlenül szükséges; ha a fragmentum hosszúsága nő.
Az ilyen próbák diagnosztikumokként való használatához a vizsgálandó biológiai mintákat, mint például a vért vagy szérumot kezelni lehet, ha ez kívánatos, hogy a bennük levő nukleinsavakat kivonjuk. A mintából származó kinyert nukleinsavat gélelektroforézisnek vagy más méreten alapuló szeparációs technikának vethetjük alá, vagy a nukleinsavminta pontszűrésnek vethető alá a méretszeparáció elhagyásával. Ezután a próbákat jelöljük. Megfelelő jelölések és a próbák jelölésének módszerei ismertek, idetartoznak például a nicktranszlációval beültetett radioaktív nyomjelzők vagy a kinázolás, biotin, fluoreszcens próbák és a kemilumineszcens próbák. A mintákból kivont nukleinsavakat ezután megfelelő szigorúságú hibridizációs feltételek mellett a jelölt próbákkal kezeljük, és a próbákat tartalmazó polinukleotidduplexeket detektáljuk.
A próbák úgy is készíthetők, hogy teljesen komplementerek a HCV-genommal. Ezért általában az igen szigorú feltételek biztosítása a kívánatos ahhoz, hogy elkerüljük a hamis pozitívokat. Azonban a nagyon szigorú feltételek csak olyan esetekben alkalmazandók, ha a próbák komplementerek olyan vírusgenommal, mely nem mutat heterogenitást. A hibridizáció szigorúságát számos tényező határozza meg a hibridizáció és a mosási eljárás során. Ilyenek a hőmérséklet, az ionerősség, az időtartam és a formamidkoncentráció. Ezeket a tényezőket például Maniatis, T. (1982) munkája foglalja össze.
Általában azt várjuk, hogy a HCV-genom-szekvenciák relatíve alacsony szinten lesznek jelen a fertőzött egyed szérumában; megközelítően 102—103 csimpánz fertőző dózis (CID/ml) mennyiségben. Ez a szint megkívánja, hogy kiegészítő technikákat használjunk a hibridizációs eljárásban. Az ilyen technikák ismertek a tudomány számára. Például az Enzo Biochemical Corporation „BioBridge” rendszer terminális dezoxinukleotid-transzferázt használ, hogy a módosítás nélküli 3-poli-dT farkakat a DNS-próbához adja. A poli-dT farkú próbát a cél-nukleotidszekvenciához hibridizálják, majd egy biotinmódosított poli-A-hoz. A PCT 84/03520 alkalmazás és az EPA 124221 számú szabadalom egy olyan DNS-hibridizációs eljárást ír le, melyben: (1) analitot anneál (kettős szálú nukleinsavak rekonstruálása egyes szálból) egy egyszálú DNS-próbához, amely komplementer egy enzimjelölt oligonukleotiddal; és (2) a farokkal ellátott duplex hibridizálódik egy enzimjelölt oligonukleotidhoz. Az EPA 204510 számú szabadalom leír egy olyan DNS-hibridizációs eljárást, melyben analit DNS-t hoznak össze egy farokkal (mint például a poli-dT farokkal) rendelkező próbával, egy segítő szállal, melynek olyan szekvenciája van, amely hibridizálódik a próba farkához, mint például a poli-A szekvencia, és amely képes kötni számos jelölt szálat. A különösen kívánatos technika először magában foglalja a cél-HCV-szekvenciák szérumban való kb. 10 000-szeres kibővítését, például kb. 106 szekvencia/ml mennyiségre. Ezt követi például a polimerázláncreakciós (PCR) technika, melyet Saiki et al. (1986), Mullis (U.S. 4,683,195 számú) és Mullis et al. (U.S. 4,683,202 számú szabadalmi leírásokban) írtak le. A kibővített szekvenciá(ka)t ezután olyan hibridizációs eljárásokkal lehet detektálni, melyek az EP 317,077 számú szabadalmi leírásban kerültek ismertetésre (1989. máj. 24-én közzétett). Ezek a hibridizációs eljárások, melyek a szekvenciákat 10®/ml szinten kellene hogy kimutassák, olyan nukleinsavmultime17
HU 225 068 Β1 reket alkalmaznak, melyek egyszálú analit nukleinsavhoz kötődnek, és melyek számos egyszálú jelölt oligonukleotidhoz is kötődnek. Egy megfelelő oldatfázisú szendvicseljárás, mely a jelölt nukleotidpróbákkal használható, és a próbák előállításának módszerei az 1987. jún. 16-án közölt EP 225,807 számú szabadalmi leírásban került ismertetésre.
A próbákat diagnosztikai kitekbe lehet csomagolni. A diagnosztikai kit tartalmazza a próba-DNS-t, mely lehet jelölt vagy nem jelölt, és a kitben szeparált tartóban vannak a jelölő alkotórészek. A kit tartalmazhat más megfelelően csomagolt reagenst vagy anyagot, melyekre szükség van az adott hibridizációs folyamatok elvégzéséhez, például standardokat vagy a teszt elvégzéséhez instrukciókat.
Immunoassay és diagnosztikai kitek
Mind az olyan polipeptidek, melyek a HCV-antitesteket tartalmazó szérummal immunológiailag reagálnak, például azok, melyeket a Példák című részben a későbbiekben leírt antigénszkrínelési módszerrel detektáltak, mind azok, melyek a Példák című részben leírt izolált kiónokból származnak vagy azokban kódoltak, és ezek összetevői és az ezekben a polipeptidekben levő HCV-specifikus epitópok ellen termelt antitestek alkalmazhatók az immunovizsgálatban a HCV-antitestek jelenlétének detektálására, vagy a biológiai mintákban a vírus és/vagy a vírusantigének jelenlétének kimutatására. Az immunovizsgálat elvégzése számos variációt foglalhat magában, melyek közül jó néhány ismert. Például az immunovizsgálat alkalmazhat egy vírusepitópot, vagy használhatja az ezen forrásokból származó vírusepitópok kombinációit; ezek az epitópok származhatnak ugyanabból vagy más víruspolipeptidekből, és lehetnek az elkülönült rekombináns vagy természetes polipeptidekben, vagy együtt ugyanabban a rekombináns polipeptidben. Alkalmazhat például egy vírusepitóp ellen irányuló monoklonális antitestet, egy vírusantigén epitópja ellen irányuló monoklonális antitestek kombinációit, különböző vírusantigének epitópja ellen irányuló monoklonális antitesteket, ugyanazon vírusantigén ellen irányuló poliklonális antitesteket vagy különböző vírusantigének ellen irányuló poliklonális antitesteket. A protokoll alapulhat például kompetíción, vagy direkt reakción vagy szendvics típusú vizsgálaton. A protokoll például alkalmazhat szilárd támasztékot, vagy végezhető immunoprecipitációval. A legtöbb eljárásban alkalmaznak jelölt antitestet vagy polipeptidet; a jelölőanyagok lehetnek például fluoreszcens, kemilumineszcens, radioaktív anyagok vagy festékmolekulák. Ismertek olyan eljárások, melyek kiegészítik a próbák szignáljait; ilyenek azok a vizsgálatok, melyek biotint, avidint alkalmaznak, és enzimjeiéit és médiáit immunovizsgálatokat, mint például az ELISA módszert.
Feltételezett poliproteinek néhány antigénrégióját feltérképezték és azonosították a poliprotein részeit kódoló HCV cDNS-ek bakteriális expressziós termékének antigenitását szkrínelve. Lásd a Példák című részt. A HCV más antigénhatású régióit a más expressziós rendszerekben levő HCV cDNS-ek részeinek expressziójával lehet detektálni. Ezek az expressziós rendszerek magukban foglalják az élesztőgomba-rendszereket és a rovarokból és gerincesekből származó sejtes rendszereket. Továbbá tanulmányok, melyek felfedik az antigenitási indexet és a hidrofobitási/hidrofilitási profilt, felfedik egy régió feltételezett antigenitásával kapcsolatos információkat.
A HCV cDNS-ek expressziójával végrehajtott antigén feltérképezésére irányuló vizsgálatok azt mutatták, hogy számos klón, mely tartalmazza ezeket a cDNS-eket, olyan polipeptideket expresszált, melyek immunológiailag aktívak voltak az NANBH-val fertőzött egyedekből származó szérummal szemben. Nem volt egyetlen poiipeptid sem, mely immunológiailag aktív lett volna az összes szérummal. Ezen polipeptidek közül 5 erősen immunogén volt, ami abban nyilvánult meg, hogy az ezen polipeptidekben levő HCV-epitópok elleni antitesteket számos különböző beteg szérumában detektálták, bár a detektálásban! átfedés nem volt teljes. így a különböző kiónokban kódolt polipeptidek immunogenitási eredményei alapján az javasolható, hogy az eredményes detektálási rendszerek tartalmazzák az epitóppanelek használatát. A panelben levő epitópok beépíthetők egy vagy több polipeptidbe.
Az immunodiagnózisra alkalmas kitek, melyek tartalmazzák a megfelelő jelölt reagenst, úgy készülnek, hogy becsomagolják a megfelelő anyagokat, beleértve a találmány a HCV-epitópokat vagy a HCV-epitópok ellen irányuló antitesteket tartalmazó polipeptidjeit megfelelő tartókba, együtt a fennmaradó reagensekkel és a vizsgálat elvégzéséhez szükséges anyagokkal és a megfelelő vizsgálati instrukciókkal.
A HCV-genom, virionok és víruságensek további jellemzése a vírusgenomhoz való cDNS-ből származó próbák alkalmazásával A Példák című részben leírt újonnan izolált kiónokban levő HCV cDNS szekvenciáról szóló információk felhasználhatók a HCV-genom szekvenciájára vonatkozó további információk szerzésére és a HCV-ágensek azonosítására és izolálására, így segítséget adnak annak jellemzésében, beleértve a genom tulajdonságát, a vírusrészecskék szerkezetét és az antigének természetét, melyekből áll. így viszont az információ további polinukleotidpróbákat, a HCV-genomból származó polipeptideket és a HCV-epitópok ellen irányuló antitesteket eredményez, melyek hasznosak lehetnek az NANBH-t okozó HCV diagnózisában és/vagy kezelésében.
A fent említett kiónok cDNS-szekvenciájáról szóló információk hasznosak a további cDNS-szekvenciák izolálására szolgáló próbák megszerkesztésében. Ezek a szekvenciák az eddig nem azonosított HCV-genom-régiókból származnak, melyekből a kiónokban levő cDNS-ek származnak. Ezeket itt és az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban ismertettük. Például a megközelítően 8 vagy több, előnyösen 20 vagy több nukleotidból álló, a 17. ábrán bemutatott összetett HCV cDNS szekvencia 5’- vagy 3’-terminusai18
HU 225 068 Β1 hoz közel levő régiókból származó szekvenciát tartalmazó jelölt próba a HCV cDNS könyvtárakból való átfedő cDNS-szekvenciák izolálására használható. Másik lehetőség, a genomszegmentek jellemzése a tisztított HCV-részekből izolált vírusgenomból végezhető el. A HCV-részecskék tisztításának módszereit és a tisztítási eljárás alatti detektálásuk módszereit a későbbiekben adjuk meg. A vírusrészecskékből történő polinukleotidgenomok izolálásának eljárási módszere ismert a tudomány számára, egy alkalmazható eljárás leírása az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban található. Az izolált genomi szegmentek ezután klónozhatok és szekvenálhatók. Erre a technikára egy példát, mely a klónozandó szekvenciák kibővítését használja, a későbbiekben adunk, és ez a 16jh kiónt eredményezi.
A cDNS-könyvtárak létrehozásának módszerei ismeretesek, és az előzőkben és a későbbiekben is tárgyalásra kerültek, illetve kerülnek; a Iambda-gt11-ben történő HCV cDNS könyvtárak létrehozásának módszerét az EPO Pub No. 318,216 számú szabadalom tárgyalja. Azonban a cDNS-könyvtárak, melyek a nukleinsavpróbákkal való szkrínelésre alkalmasak, létrehozhatók más, a tudomány számára ismert vektorokban is, például a Iambda-gt10-ben [Huynh et al. (1985)].
A HCV elleni antivirális anyagokra való szkrínelés
A sejttenyészetek és állati modellrendszerek HCV-re való elérhetősége lehetővé teszi a HCV-replikációt gátló vírus elleni ágensekre történő szkrínelést, különösen az olyan anyagokra történő szkrínelést, melyek előnyösen engedik a sejtnövekedést és -szaporodást, míg a vírusreplikációt gátolják. Ezek a szkrínelési módszerek ismertek a témában jártas szakemberek számára. Általában a vírus elleni anyagot különböző koncentrációban teszteljük, a sejttenyészetben való vírusreplikációra kifejtett hatására - mely sejttenyészet a vírus replikációját segíti elő -, majd állati modellrendszerben a vírus fertőzésének vagy patogenitásának gátlására (és a toxicitás alacsony szintjére).
A HCV-antigének és HCV-polinukleotidok detektálására szolgáló itt leírt módszerek és összeállítások hasznosak a vírus elleni anyagok szkrínelésében abban, hogy egy másik lehetőséget és talán egy érzékenyebb módszert adnak az anyagok vírusreplikációra kifejtett hatásainak detektálásában, mint a sejttárolási módszer vagy az ID50-vizsgálat. Például az itt leírt HCV-polinukleotid-próbák a sejttenyészetben termelt vírusnukleinsav mennyiségének becslésére használhatók. Ezt követheti például a fertőzött sejt nukleinsavak jelölt HCV-polinukleotid-próbával való hibridizációja vagy kompetíciós hibridizációja. Például a HCV elleni antitestek a sejttenyészetekben lévő HCV-antigén(ek) azonosítására vagy mennyiségi becslésére használhatók az itt leírt immunvizsgálatot használva. Továbbá mivel kívánatos lehet a fertőzött sejttenyészetekben levő HCV-antigének mennyiségi meghatározása kompetíciós vizsgálattal, az itt leírt HCV cDNS-ekben kódolt polipeptidek hasznosak ezekben a kompetíciós vizsgálatokban. Általában a HCV cDNS-ből származó rekombináns HCV-polipeptid jelölve kellene legyen, és ezen jelölt polipeptid egy HCV-polipeptidhez való kötődésének gátlását a sejttenyészetrendszerben való antigéntermelés következtében figyelemmel kellene kísérni. Továbbá ezek a technikák különösen hasznosak olyan esetekben, ahol a HCV replikálódhat a sejtvonalban anélkül, hogy a sejt pusztulását okozná.
A vírus elleni ágensek, melyek hatékonyságukra tesztelhetők ezen módszerekkel, ismertek, és magukban foglalják például azokat az ágenseket, melyek kapcsolatba lépnek olyan virionkomponensekkel és/vagy sejtkomponensekkel, melyek szükségesek a vírus kötődéséhez és/vagy replikációjához. A tipikus vírus elleni anyagok közé tartoznak például a virionpolimeráz és/vagy proteáz(ok) inhibitorai, melyek szükségesek a prekurzor polipeptidek hasításához. Más vírus elleni ágensek közé olyan ágensek tartoznak, melyek nukleinsavakkal reagálnak azért, hogy megelőzzék a vírus replikációját, például ilyenek az antiszensz polinukleotidok stb.
Az antiszensz polinukleotidmolekulák egy olyan komplementer nukleotidszekvenciából állnak, melyek lehetővé teszik számukra, hogy hibridizáljanak különösen a genom kijelölt régióival vagy az RNS-ekkel. Az antiszensz polinukleotidok magukban foglalhatnak például olyan molekulákat, melyek blokkolni fogják a proteintranszlációt az mRNS-hez való kötődés révén, vagy olyan molekulákat, melyek a transzkriptáz révén akadályozzák meg a vírus RNS replikációját. Magukban foglalhatnak olyan molekulákat is, melyek olyan ágenseket hordoznak (nem kovalens kötéssel csatolt vagy kovalensen csatolt), melyek a vírus RNS inaktivitását okozzák például a vírus RNS-en való szakadások révén. Kötődhetnek olyan sejtpolinukleotidokhoz, melyek erősítik és/vagy szükségesek a vírusfertőzéshez, a replikációs képességhez vagy a krónikussághoz.
A HCV-eredetű RNS-ekhez hibridizálandó antiszensz molekulák az itt nyújtott HCV cDNS-ek szekvenciainformációira alapozva szerkeszthetők meg. A vírus elleni ágensek a HCV elleni antiszensz polinukleotidokra alapozva szerkeszthetők meg úgy, hogy nagy specifitással kötődjenek, megnövekedett oldékonyság jellemezze őket, stabilak legyenek, és kicsi legyen a toxicitásuk. Ezután specializált rendszerekben szállíthatók például liposzómákban vagy génterápiával. Továbbá tartalmazhatnak analógokat, csatolt proteineket és a bázisok között helyettesített vagy változtatott kötéseket stb.
Más típusú drogok olyan polinukleotidokra alapozhatok, melyek a HCV-genom fontos szabályozórégióit másolják, és melyek terápiás hatásúak lehetnek a vírus fertőzőképességért vagy replikációért felelős rendszer kulcsalkotóival való interakcióinak következtében.
Általános módszerek
A vírusból való genom kinyerésének, a cDNSkönyvtár készítésének és próbával való vizsgálatának, kiónok szekvenálásának, expressziós vektorok létrehozásának, sejtek transzformálásának, olyan immunológiai vizsgálatok elvégzésének, mint például a radioim19
HU 225 068 Β1 munovizsgálat és az ELISA vizsgálat, sejtek tenyészetben való szaporításának és az ehhez hasonlók általános technikái ismertek, és laboratóriumi kézikönyvek szerezhetők be, melyek ezen technikák leírásait tartalmazzák. Azonban egy általános vezetőként bemutatunk a következőkben néhány jelenleg elérhető forrást az ilyen eljárásokról és anyagokról, melyekre ezen eljárások elvégzéséhez szükség van.
Mind prokarióta, mind eukarióta gazdasejtek használhatók a kívánt kódolószekvenciák expressziójához, ha olyan megfelelő szabályozószekvenciákat használunk, melyek kompatíbilisak a kijelölt gazdával. A prokarióta gazdák közül az E. coli a leggyakrabban alkalmazott. A prokarióták expressziós kontrollszekvenciái tartalmaznak promotereket, tetszés szerint tartalmazva operátorrészeket és riboszómás kötőhelyeket. A prokarióta gazdákkal kompatibilis transzfer vektorok általában például a pBR322-ből származnak, egy, az ampicillin- és a tetraciklinrezisztenciát biztosító operonokat tartalmazó plazmidból és a különböző pUC vektorokból, melyek szintén tartalmaznak olyan szekvenciákat, melyek antibiotikumrezisztens markereket hordoznak. Ezek a markerek szelekcióval történő sikeres transzformánsok nyerésére használhatók. Az általában alkalmazott prokarióta szabályozószekvenciák magukban foglalják a béta-laktamázt (penicillinázt) és a laktóz promoter rendszereket [Chang et al. (1977)], a triptofán (trp) promoter rendszert [Goeddel et al. (1950)], a lambda-eredetű PL promotert és a N gén riboszóma kötési helyet [Shimatake et al. (1981)] és a hibrid tac promotert [De Boer et al. (1983)], mely a trp és lac UV5 promoterek szekvenciáiból származnak. Az előbb említett rendszerek különösen kompatíbilisak az E. colival; ha kívánatos, más prokarióta gazdák, mint például Bacillus vagy Pseudomonas törzsek is használhatók hasonló kontrollszekvenciákkal.
Az eukarióta gazdák közé tartoznak a tenyészrendszerekben levő élesztőgomba- és emlőssejtek. A Saccharomyces cerevisiae és a Saccharomyces carlsbergensis a leggyakrabban alkalmazott élesztőgomba gazdák és kényelmes fonalasgomba gazdák. Az élesztőgomba-kompatibilis vektorok olyan markereket hordoznak, melyek lehetővé teszik sikeres transzformánsok szelekcióját, prototrófiát adva az auxotróf mutánsoknak, vagy nehézfémekkel szembeni rezisztenciát a vad törzseknek. Az élesztőgomba-kompatibilis vektorok felhasználhatják a replikáció 2 mikron eredetét [Broach etal. (1983)], aCEN3ésARS1 kombinációit, vagy más olyan eszközöket a replikáció biztosításához, mint például olyan szekvenciákat, melyek egy megfelelő fragmens gazdasejt genomjába való beépülését fogják eredményezni. Az élesztőgomba-vektorok szabályozószekvenciái ismertek, és tartalmaznak a glikolitikus enzimek szintéziséhez promotereket [Hess et al. (1968)], [Holland et al. (1978)], ideértve a 3-foszfoglicerát-kináz promoterjét [Hitzeman (1980)]. Terminátorok is idetartozhatnak, mint például azok, melyek az enolázgénből származnak [Holland (1981)]. Különösen használható kontrollrendszerek azok, melyek tartalmazzák a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH)-promotert vagy az alkohol-dehidrogenáz (ADH)-szabályozópromotert, a GAPDH-ból származó terminátorokat, és ha szekréció elérése kívánatos, az élesztőgomba alfa-faktorából származó vezetőszekvenciát. Továbbá a működőképesen kapcsolt transzkripciós regulációs régió és a transzkripciós iniciális régiók olyanok lehetnek, hogy nem természetesen csatoltak a vad típusú szervezetben. Ezeket a rendszereket részletesen leírva a következő szabadalmi leírásokban találhatjuk meg: EP 0120,551, 1984. okt. 3-án jelent meg, EP 0116,201, 1984. aug. 22-én jelent meg, és EP 0164,556, 1985. dec. 18-án jelent meg. Ezek mindegyikét engedélyezték a jelen találmány jogosultjának, és ezek a referenciarészben megtalálhatók.
Az expresszióhoz való emlőssejtvonalak, mint gazdák elérhetők és ismertek, és tartalmaznak sok olyan folyamatos termelésű sejtvonalat, melyek az American Type Culture Collection (ATCC)-től szerezhetők be. Ezek közé tartoznak a HeLa-sejtek, a kínai hörcsög ovárium sejtek (CHO), a hörcsög újszülött vese sejtek (BHK) és számos más sejtvonal. Emlőssejtek megfelelő promoterei szintén ismertek, idetartoznak az olyan víruspromoterek, mint azok, amelyek a Simian Vírus 40-ből (SV40) [Fiers (1978)], a Rous-szarkóma-vírusból (RSV), az adenovírusból (ADV) és a szarvasmarha papilloma vírusból (BPV) valók. Az emlőssejtek szintén igényelhetnek terminátorszekvenciákat és poli-A adalék szekvenciákat; olyan erősítőszekvenciák, melyek növelik az expressziót, szintén idetartozhatnak, és szekvenciák, melyek a gén kibővülését okozzák, szintén kívánatosak lehetnek. Ezek a szekvenciák ismertek a tudományban. Vektorok, melyek alkalmasak az emlőssejtekben való replikációra, magukban foglalhatják a vírusreplikonokat, vagy az olyan szekvenciákat, melyek biztosítják a megfelelő NANBV-epitópokat kódoló szekvenciák integrálását a gazdagenomba.
A transzformáció bármely ismert módszerrel elvégezhető a polinukleotidok gazdasejtbe való bejuttatására, ideértve például a polinukleotid vírusba való csomagolását, majd a gazdasejt vírussal való transzdukálását és a polinukleotid direkt felvételét. Az alkalmazott transzformációs eljárás függ a transzformálandó gazdától. Például az E. coli gazdasejtek BB-NANBV szekvenciákat tartalmazó Iambda-gt11-gyel való transzformációját a későbbiekben a Példák című részben tárgyaljuk. A direkt felvétellel történő bakteriális transzformációhoz általában kalcium- vagy rubídium-kloriddal való kezelést alkalmazunk [Cohen (1972); Maniatis (1982)]. A direkt felvételen alapuló élesztőgomba-transzformáció Hinnen et al. (1978) módszerét alkalmazva végezhető el. A direkt felvételen alapuló emlőstranszformáció Graham és Van dér Eb (1978) kalcium-foszfátos precipitációs módszerének alkalmazásával végezhető el, vagy ennek számos ismert változatával.
A vektor létrehozása olyan technikákat alkalmaz, melyek ismertek a tudomány e területén. A helyspecifikus DNS-hasítás megfelelő restrikciós enzimmel való kezeléssel történik olyan körülmények között, melyet általában a kereskedelemben kapható enzimek gyártó20
HU 225 068 Β1 ja ad meg. Általában 1 mikrogramm plazmid vagy DNS-szekvencia hasítása 1 egység enzimmel történik kb. 20 mikroliter pufferoldatban 1-2 óra 37 °C hőmérsékleten való inkubáció alatt. A restrikciós enzimmel való inkubáció után a fehérjét fenollal/kloroformmal való extrakcióval távolítjuk el, és a DNS-t etanolos kicsapással nyerjük ki. A hasított fragmenteket szeparálhatjuk poliakrilamid- vagy agarózgél-elektroforézises technikákat használva, a Methods in Enzymology (1980) 65:499-560 oldalakon leírt általános eljárásoknak megfelelően.
A ragadós végű hasadó fragmentumok tompa végűek lehetnek E. coli DNS-polimeráz l-et (Klenow) alkalmazva a keverékben levő megfelelő dezoxinukleotid-trifoszfatáz (dNTPs) jelenlétében. Az S1 nukleázzal való kezelés szintén alkalmazható, mely bármely egyszálú DNS-részecske hidrolízisét eredményezi.
A ligálás standard puffer és hőmérsékleti feltételek alkalmazásával, T4 DNS-ligáz és ATP használatával végezhető el; a ragadós végek ligálásához kevesebb ATP-re és ligázra van szükség, mint a tompa végekéhez. Ha vektorfragmenteket használunk a ligációs keverék részeként, a vektorfragmentet gyakran bakteriális alkalikus foszfatázzal (BAP) vagy borjú emésztőcsatorna alkalikus foszfatázzal kezeljük, hogy az 5’-foszfátot eltávolítsuk, és így kivédjük a vektor újraligálását. Másik megoldásként a nem kívánt fragmentumok restrikciós enzimes emésztését alkalmazhatjuk a ligálás elkerülése végett.
A ligációs keveréket megfelelő klónozógazdába transzformáljuk, például E. coliba, és a sikeres transzformánsokat szelektáljuk például antibiotikumrezisztencia alapján, és szkríneljük a helyes szerkezetükre.
Szintetikus oligonukleotidok készíthetők automatizált oligonukleotidszintetizáló használatával, ahogy azt Warner (1984) leírja. Ha kívánt, a szintetikus szálak 32P-ral jelölhetők, 32P-ATP jelenlétében használt polinukleotid-kinázzal történő kezeléssel, standard körülményeket biztosítva a reakció számára.
A DNS-szekvenciák, beleértve a cDNS-könyvtárakból izoláltakat, ismert technikákkal módosíthatók, ideértve például a helyirányított mutagenezist, ahogy azt Zoller (1982) leírja. Röviden, a módosítandó DNS-t egyszálú szekvenciaként fágba csomagoljuk, és kétszálú DNS-sé konvertáljuk DNS-polimerázzal, primerként egy szintetikus oligonukleotidot használva, mely komplementer a módosítandó DNS részéhez, és melynek megvan a kívánt módosítása a saját szekvenciájában. A kapott kétszálú DNS egy gazdabaktériumban levő fágba transzformálható. A transzformált baktérium tenyészeteit, melyek tartalmazzák a fág minden szálának replikációját, agarra szélesztjük, hogy tarfoltokat kapjunk. Elméletileg az új tarfoltok 50%-a a mutált szekvenciát tartalmazó fágot tartalmazza, a maradék 50% az eredeti szekvenciát. A tarfoltok replikátjait jelölt szintetikus próbákhoz hibridizáljuk olyan hőmérsékleti körülmények között, melyek lehetővé teszik a jó szállal való hibridizációt, a módosítás nélküli szekvenciával valót azonban nem. A hibridizációval azonosított szekvenciákat visszanyerjük és klónozzuk.
A DNS-könyvtárakat tesztelhetjük Grunstein és Hogness (1975) eljárását alkalmazva. Röviden, ebben az eljárásban a próbának alávetendő DNS-t nitro-cellulóz-szűrőn immobilizáljuk, denaturáljuk és előhibridizáljuk 0-50% formamidot, 0,75 M NaCI-ot, 75 mM Na-citrátot, 0,02% (w/v) marhaszérum-albumint, poli(vinil-pirrolidon)-t és Ficollt, 50 nM Na-foszfátot (pH 6,5), 0,1% SDS-t és 100 mikrogramm/ml hordozó denaturált DNS-t tartalmazó pufferrel. A pufferben levő formamid %-os mennyisége, akárcsak az előhibridizáció és az ezt követő hibridizációs lépések idő- és hőmérsékleti körülményei az eljárás kívánt szigorúságától függenek. Az oligomerpróbákhoz, melyek kevésbé szigorú feltételeket igényelnek, általában alacsonyabb formamid%-ot és alacsonyabb hőmérsékletet, valamint hosszabb hibridizációs időt használunk. Az olyan 30^10-nél több nukleotidot tartalmazó próbákhoz, mint például melyek a cDNS-ből vagy genomszekvenciákból származnak, általában magasabb hőmérsékletet (kb. 40-42 °C) és magasabb %-ot (például 50% formamidot) alkalmaznak. Az előhibridizációt követően 5’-32P-jelölt oligonukleotidpróbát adunk a pufferhez, és a szűrőket ebben a keverékben inkubáljuk hibridizációs körülmények között. Mosás után a kezelt szűrőket autoradiográfiának vetjük alá, hogy kimutassuk a hibridizált próba elhelyezkedését; az eredeti agarlemezen való azonos elhelyezkedésű DNS-t a kívánt DNS forrásaként használjuk.
A vektor rutinlétrehozásához a ligációs keveréket az E. coli HB101 törzsébe transzformáljuk, vagy más megfelelő gazdába, és a sikeres transzformánsokat antibiotikumrezisztencia vagy más markerek alapján szelektáljuk. A transzformánsokból származó plazmidokat Clewell et al. (1969) módszere alapján készítjük, ezt általában klóramfenikolos dúsítás követi [Clewell (1972)]. A DNS-t izoláljuk és analizáljuk, rendszerint restrikciós enzim analízissel és/vagy szekvenálással. A szekvenálást Sangen et al. (1977) didezoximódszerével végezhetjük, ahogy később Messing et al. (1981) leírta, vagy Maxam et al. (1980) módszerével. A sávkompresszióval kapcsolatos problémákat, melyeket néha a GC-ben gazdag régiókban figyeltek meg, megoldották a Barr et al. (1986) szerinti T-deazoguanozin használatával.
Az enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálatot (ELISA) az antigén vagy antitest koncentrációinak mérésére lehet felhasználni. A módszer azon alapul, hogy egy enzim hozzákötődik egy antigénhez vagy antitesthez, és mennyiségi jelként használja a kötött enzim aktivitását. Az antitest méréséhez az ismert antigént szilárd fázishoz rögzítjük (például mikrolemezre vagy műanyag csészébe), a tesztszérum hígításaival inkubáljuk, mossuk, enzimmel jelölt antiimmunoglobulinnal inkubáljuk, és ismét mossuk. A jelölésre alkalmas enzimek ismertek, idetartozik például a torma-peroxidáz. A szilárd fázishoz kötött enzim aktivitását specifikus szubsztrát hozzáadásával mérjük, és kolorimetriásan meghatározzuk a termék képződését vagy a szubsztrát fogyását. A kötött enzim aktivitása a kötött antitest mennyiségének közvetlen következménye.
HU 225 068 Β1
Az antigén méréséhez egy ismert specifikus antitestet rögzítünk szilárd fázishoz, az antigént tartalmazó tesztanyagot hozzáadjuk, inkubálás után a szilárd fázist mossuk, és egy második enzimjelölt antitestet adunk hozzá. Mosás után szubsztrátot adunk ehhez, és az enzim aktivitását kolimetriásan becsüljük, és az antigén koncentrációjához viszonyítjuk.
A továbbiakban példákkal szemléltetjük a találmányt, melyeket csupán illusztrációs célból adunk meg, és nem a jelen találmány körének korlátozására. A jelen leírás fényében számos, a szabadalmi igénypontokon belül található kifejezés nyilvánvaló lesz a területen jártas szakember számára.
Példák
A 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e és CA167b átfedő HCV cDNS kiónok izolálása és szekvenciája A 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e és CA167b kiónokat a Iambda-gt11 könyvtárból izoláltuk, mely HCV cDNS-t tartalmaz (ATCC No. 40 394). Az eljárás leírása az EP 318,216 számú (1989. máj. 31-én jelent meg) szabadalmi leírásban és a WO 89/04669 számú nemzetközi közzétételi iratban (1989. jún. 1-jén jelent meg) található. A könyvtár szkrínelését a későbbiekben leírt próbákkal végeztük, a Huynh (1985) munkájában leírt módszert alkalmazva. A megfelelő próbákkal megjelenő pozitív kiónok gyakorisága kb. 1 az 50 000-ben.
A 13i klón izolálását a 12f klón szekvenciájából származó szintetikus próba alkalmazásával végeztük el. A próba szekvenciája a következő volt:
5’ GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3’.
A 26j klón izolálását a K9-1 klón 5’-régiójából származó próba alkalmazásával végeztük. A próba szekvenciája:
5’ TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3’.
A 12f és k9-1 (K9-1-nek is nevezett) kiónok izolálási eljárását az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban ismertettük, és szekvenciájukat az 1. és 2. ábrán mutatjuk be. A 13i és 26j kiónok HCV cDNS szekvenciái a 4. és 5. ábrán láthatók. Láthatók a bennük kódolt aminosavak és a 13i klón 12f klónnal való átfedése, valamint a 26j klón 13i klónnal való átfedése is. Ezen kiónok szekvenciái igazolják a k9-1 klón szekvenciáját. A k9-1 kiónt egy eltérő HCV cDNS könyvtárból izoláltuk (lásd az EP 0318 216 számú szabadalmi leírást).
A CA59a kiónt a 26j klón 5’-régiójának szekvenciájára alapozott próba használatával izoláltuk. A próba szekvenciája:
5’ CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CCA 3’.
A CA59a klón szekvenciájából származó próbát a CA84a klón izolálásához használtuk. Az ehhez az izoláláshoz használt próba szekvenciája a következő:
5’ AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTC GCC 3’.
A CA156e kiónt a CA84a klón szekvenciájából származó próba alkalmazásával izoláltuk. A próba szekvenciája:
5’ ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3’.
A CA167b kiónt a CA156e klón szekvenciájából származó próbát használva izoláltuk. A próba szekvenciája:
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3’.
A CA59a, CA84a, CA156e és CA167b kiónokban levő HCV cDNS-ek nukleotidszekvenciáit a 6., 7., 8. és
9. ábra mutatja. Az ezen kiónokban kódolt aminosavakat, valamint az idevonatkozó kiónok szekvenciáival való átfedést is mutatják az ábrák.
A „pi” HCV cDNS könyvtár létrehozása
Egy HCV cDNS könyvtárat, a „pi” könyvtárat ugyanabból a fertőző csimpánz plazma tételből hoztuk létre, melyet a Iambda-gt11 HCV cDNS könyvtár létrehozásához is használtunk (ATCC No. 40 394), melynek leírása az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban található, és melyhez lényegében ugyanazokat a technikákat használtuk. Azonban a „pi” könyvtár megalkotásához egy primer extenziós módszert alkalmaztunk, melyben a reverz transzkriptáz primerje a CA59a klón szekvenciájára alapult. A primer szekvenciája a következő volt:
5’ GGT GAC GTG GGT TTC 3’.
A pi14a klón izolálása és szekvenciája
A fent leírt „pi” HCV cDNS könyvtár szkrínelése a CA167b klón izolálásához használt próbával történt (lásd fent), és a pi14a kiónt eredményezte. A klón kb. 800 cDNS bázispárt tartalmaz, melyek átfedésben vannak a CA167b, CA156e, CA84a és CA59a klónokkal, melyeket a Iambda-gt11 HCV cDNS könyvtárból (ATCC No. 40 394) izoláltunk. Továbbá a pi14a tartalmaz kb. 250 DNS bázispárt, melyek a CA167b kiónban levő HCV cDNS-től upstream helyezkednek el.
A CA216a, CA290a és ag30a kiónok izolálása és szekvenciája
A CA167b klón szekvenciájára alapozva egy szintetikus próbát készítettünk, melynek szekvenciája a következő:
5’ GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'.
A fenti próbákat a Iambda-gt11 könyvtár (ATCC No. 40 394) szkríneléséhez használtuk, mely a CA216a kiónt eredményezte, melynek HCV-szekvenciáit a
10. ábra mutatja.
Egy másik próbát a CA216a klón szekvenciájára alapozva készítettünk, melynek szekvenciája:
5’ TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'.
A Iambda-gt11 könyvtárat (ATCC No. 40 394) szkrínelve ezzel a próbával a CA290a kiónt nyertük, az ebben levő HCV-szekvenciákat a 11. ábra mutatja.
Egy párhuzamos eljárással egy primer extenziós cDNS-könyvtárat készítettünk ugyanabból a fertőzött plazmából kivont nukleinsavat használva, melyet az eredeti fent leírt Iambda-gt11 cDNS-könyvtárhoz hasz22
HU 225 068 Β1 náltunk. A használt prímért a CA216a és CA290a kiónok szekvenciáira alapoztuk:
5’ GAA GCC GCA CGT AAG 3’.
A cDNS-könyvtárat a pi14a és k9-1 kiónok izolálásában használt könyvtárak esetében alkalmazott módszerekhez hasonló módszerek segítségével készítettük. Az ezen könyvtár szkríneléséhez használt próbát a CA290a klón szekvenciájára alapoztuk:
5’ CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA3'.
Az ag30a kiónt a fenti próba alkalmazásával az új könyvtárból izoláltuk, mely a HCV-szekvencia kb. 670 bázispárját tartalmazza. Lásd a 12. ábrát. A szekvencia egy része átfedi a CA216a és CA290a kiónok HCV-szekvenciáját. Az ag30a szekvenciájából mintegy 300 bázispár azonban a CA290a klón szekvenciájától upstream helyezkedik el. A nem átfedő szekvencia egy startkodont (*) és stopkodonokat mutat, melyek a HCV ORF startját jelölhetik. A 12. ábrán jelöltünk feltételezett kis kódolt peptideket (#), melyek szerepet játszhatnak a transzláció szabályozásában, akárcsak a feltételezett polipeptid feltételezett első aminosavát és a bennük kódolt downstream fekvő aminosavakat.
A CA205a klón izolálása és szekvenciája
A CA205a kiónt az eredeti Iambda-gt11 könyvtárból (ATCC No. 40 394) izoláltuk a CA290a klón HCV-szekvenciájából származó szintetikus próba alkalmazásával (11. ábra). A próba szekvenciája a következő volt:
5’ TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3’.
A CA205a kiónban levő HCV cDNS szekvenciája, amit a 13. ábra mutat, átfedésben van az ag30a és a CA290a kiónok cDNS-szekvenciáival. A CA290a klón szekvenciájával való átfedést a szekvencia feletti pontozott vonal mutatja (az ábrán láthatók az ebben a fragmentumban kódolt feltételezett aminosavak is).
Ahogy azt a CA290a és az ag30a kiónokban levő HCV cDNS szekvenciákban megfigyeltük, a feltételezett HCV-poliprotein, úgy tűnik, az ATG startkodonnál kezdődik; a HCV-szekvenciák mindkét kiónban tartalmaznak „in-frame’-et, folyamatos kettős stopkodont (TGATAG) 42 nukleotiddal ettől az ATG-től upstream irányban. A HCV ORF úgy tűnik, hogy ezek után a stopkodonok után kezdődik, és legalább 8907 nukleotid a kiterjedése (lásd a 17. ábrán mutatott összetett HCV cDNS-t).
A 18a klón izolálása és szekvenciája
Az ag 30a klón (lásd a 12. ábrát) szekvenciájára és az eredeti Iambda-gt11 könyvtárból (ATCC No. 40 394) származó átfedő kiónra, a CA230a-ra alapozva egy szintetikus próbát készítettünk, melynek szekvenciája a következő:
5’ CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3’.
Az eredeti Iambda-gt11 HCV cDNS könyvtár próbával való szkrínelése a 18g kiónt eredményezte, melynek a HCV cDNS szekvenciáját a 14. ábra mutatja. Az ábrán látható az ag30a klónnal való átfedés is, valamint a HCV cDNS-ben kódolt feltételezett polipeptidek is.
A 18g (C18 vagy 18g) kiónban levő cDNS átfedésben van a fent leírt ag30a és CA205a kiónok cDNS-ével. A C18g klón szekvenciája is tartalmazza az ag30a kiónban megfigyelt dupla stopkodonrégiót. A stopkodontól upstream irányban levő polinukleotidrégió feltehetően a HCV-genom 5’-régiójának részét reprezentálja, mely rövid ORF-eket tartalmazhat, és mely a tisztított HCV-genom közvetlen szekvenálásával igazolható. Ezek a feltételezett kis kódolt peptidek szabályozó szerepet játszhatnak a transzlációban. A C18g klón által képviselt régiótól upstream irányban levő HCV-genom régiója szekvenciaanalízis céljából izolálható, alapjában véve az EPO Pub. No. 318,216 számú szabadalomban a 12f kiónban levő HCV cDNS szekvenciájától upstream irányban levő cDNS-szekvenciák izolálására leírt technika alkalmazásával. Alapjában véve a reverz transzkriptáz kis szintetikus oligonukleotidprimerjeit, melyek a C18g szekvenciáján alapulnak, szintetizáljuk, és a HCV-genom RNS-ben levő azonos szekvenciákhoz szoktuk kötni. A primer szekvenciák közelebb esnek a C18g klón 5’-termináljához, de elegendően downstream irányban ahhoz, hogy lehetővé tegyék a primer szekvenciáktól upstream irányban levő próbaszekvenciák megszerkesztését. A prímeléshez és a klónozáshoz ismert standardmódszereket használunk. A nyert cDNS-könyvtárakat a prímelési helyektől (ahogy a C18g értelmezett szekvenciájából levezettük) az upstream irányban levő szekvenciákkal szkríneljük. A HCV-genom RNS-t NANBH-ban szenvedő egyedek plazma- vagy májmintáiból nyerjük. Mivel úgy tűnik, a HCV egy Flavi-szerű vírus, a genom 5’-terminusa védősapka- („cap”) szerkezettel módosítható. Ismert, hogy a Flavivírus genomok 5’-terminális „cap”-struktúrákat tartalmaznak [Sárgalázvírus, Rice et al. (1988); Dengue vírus, Hahn et al. (1988); Japan Encephalitis Vírus (1987)].
A béta HCV cDNS könyvtárból származó kiónok izolálása és szekvenciája
A HCV-genom 3’-terminális régióját képviselő cDNS-t tartalmazó kiónokat az eredeti fertőző csimpánz plazma alapból létrehozott cDNS-könyvtárból izoláltuk, melyet a HCV cDNS Iambda-gt11 könyvtár (ATCC No. 40 394) létrehozásához használtunk, és mely az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban került leírásra. A cDNS-könyvtár létrehozásának céljából a plazmából kivont RNS-t poli(rA) polimerázt használva poli-rA farokkal láttuk el, és cDNS-t szintetizáltunk oligo(dT)12_18-at használva a reverz transzkriptáz primerjeként. A nyert RNS.cDNS hibridet RNS-áz H-val emésztettük, és kétszálú HCV cDNS-sé konvertáltuk. A nyert HCV cDNS-t a Iambda-gt10-be klónoztuk lényegében a Huynh (1985) által leírt technikát alkalmazva, melynek eredménye a béta (vagy b) HCV cDNS könyvtár. Az alkalmazott eljárás a következő volt.
A plazma egy részét (12 ml) proteáz H-val kezeltük, és 0,05 M Tris-HCI-dal telített fenol (pH 7,5), 0,05% (vív) beta-merkapto-etanol, 0,1% (w/v) hidroxi-kinolon, 1 mM EDTA azonos térfogataival extraháltuk. A kapott vizes fá23
HU 225 068 Β1 zist újra extraháltuk a fenolos keverékkel, ezt követte 3 extrahálás egy:egy arányú keverékkel, mely fenolt és kloroform:izoamil-alkoholt (24:1) tartalmazott, ezt a kloroform és izoamil-alkohol 1:1 arányú keverékével végzett 2 extrahálás követte. A vizes fázis NaCI-tartalmának 5 200 mM-ra való kiegészítését követően a vizes fázisban levő aminosavakat egy éjszakán át mínusz 20 °C hőmérsékleten 2,5 térfogat hideg abszolút etanollal kicsapattuk.
A csapadékot centrifugálással (10 000 rpm, 40 perc) összegyűjtöttük, 20 mM NaCI-ot tartalmazó 70%-os eta- 10 nollal, majd 100%-os hideg etanollal mostuk, és 5 percig deszikkátorban szárítottuk és vízben feloldottuk.
A csimpánz fertőző plazma anyagából izolált nukleinsavakat poli-rA farokkal láttuk el poli-A polimerázt használva, humán placenta ribonukleáz inhibitor 15 (HPRI) (az Amersham Corp.-től vásároltuk) jelenlétében, MS2 RNS-t használva hordozóként. A 2 ml plazmában levő nukleinsavval egyenlő mennyiségű izolált nukleinsavakat olyan oldatban inkubáltuk, mely TMN-t [50 mM Tris-HCI, pH 7,9, 10 mM MgCI2, 250 mM NaCI, 20 2,5 mM MnCI2, 2 mM ditiotreitol (DTT)], 40 mikroM alfa-(32P) ATP-t, 20 egység HPRI-t (Amersham Corp.) és kb. 9-10 egység RN-áz-mentes poli-A polimerázt (BRL) tartalmazott. Az inkubálást 10 percig 37 °C hőmérsékleten végeztük, a reakciót EDTA-val (végkoncentráció- 25 ja kb. 250 nM) állítottuk le. Az oldatot fenol-kloroform egyenlő mennyiségeivel, majd kloroform egyenlő mennyiségével extraháltuk, a nukleinsavakat egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten 200 mM NaCI jelenlétében 2,5 térfogat etanollal csapattuk ki. 30
A b5a klón izolálása
A béta HCV cDNS könyvtárat hibridizálással szkríneltük szintetikus próbát alkalmazva, melynek szekvenciája a 15e klón HCV cDNS szekvenciájára alapult. 35 A 15e klón izolálását az EP 0318,216 számú szabadalmi leírás ismerteti, és szekvenciáját a 3. ábra mutatja.
A szintetikus próba szekvenciája:
5’ ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'. 40
A könyvtár szkrínelése a beta-5a (b5a) kiónt eredményezte, mely megközelítően 1000 bázispárból álló HCV cDNS régiót tartalmaz. A cDNS 5’-régiója átfedésben van a 35f, 19g, 26g és a 15e klónokkal (ezeket a kiónokat korábban írtuk le). A 3’-terminális poli-A szekvencia és a 3’-szekvencia közötti régió, mely átfedi a 15e kiónt, megközelítően 200 bázispárból áll. Ez a klón lehetővé teszi a HCV-genom 3’-terminális szekvenciarégiójának azonosítását.
A b5a klón szekvenciája a 16jh kiónban (később írjuk le) levő HCV cDNS szekvencián belül van. Továbbá a szekvencia jelen van az eredeti Iambda-gt11 könyvtárból (ATCC No. 40 394) izolált CC34a kiónban is. (Az eredeti Iambda-gt11 könyvtárra itt mint a „C könyvtárra hivatkozunk.)
A HCV-genom 3’-régiójának PCR-rel való kibővítésével előállított kiónok izolálása és szekvenciái
Összetett cDNS-klónokat hoztunk létre, melyek a HCV-genom 3’-régiójából származó nukleotidszekvenciákat tartalmazták. Ezt úgy hoztuk létre, hogy a genom célrégióját bővítettük polimeráz-láncreakciós technikát alkalmazva, melyet Saiki et al. (1986) és Saiki et al. (1988) írtak le, melyet a későbbiekben leírt módon módosítottak. A kibővített HCV RNS-t az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban leírt HCV cDNS lambda-gt11 könyvtár (ATCC No. 40 394) létrehozásához használt eredeti fertőző csimpánz plazma alapból nyertük. A HCV RNS izolálása a korábbiakban leírtak alapján történt. Az izolált RNS-t a 3’-végen ATP farokkal láttuk el, E. coli poli-A polimerázt használva Sippel (1973) leírását alkalmazva, azzal az eltéréssel, hogy a csimpánzszérumból izolált nukleinsavakat kicseréltük a nukleinsavszubsztrátra. A farokkal ellátott RNS-t ezután reverz transzkriptáltuk cDNS-sé, reverz transzkriptáz alkalmazásával, oligo-dT primer adaptert használva, lényegében a Han (1987) munkájában leírtak alapján, azzal az eltéréssel, hogy a primer adapter komponensei és szekvenciája a következő volt:
Minta
AATTC
Notl
GCGGCCGC
SP6 Promoter
CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA
Primer
Tl5
A kapott cDNS-eket PCR-rel való bővítésnek vetettük alá 2 prímért használva:
Primer
JH32 (30 tagú) JH11 (20 tagú)
Szekvencia
ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
A JH32 primer 20 nukleotidból álló szekvenciát tartalmaz, mely a cDNS-ben a célrégió 5’-végéhez hibridizálható, egy becsült 66 °C hőmérsékletű Tm-rnel.
A JH11 az oligo-dT primer adapter egy részéből szár- 55 mázott; így ez specifikus a cDNS 3’-végéhez, egy 64 °C hőmérsékletű Tm-rnel. Mindkét prímért úgy szerkesztettük meg, hogy az 5’-végen a Notl restrikciós enzimet felismerő hellyel rendelkezzen, a későbbi bővített HCV cDNS klónozásában való használathoz. 60
A PCR reakciót úgy végeztük, hogy a cDNS-t és a primereket 100 mikroliter reakcióelegyben szuszpendáltuk, mely 4 dezoxinukleotid-trifoszfátot, puffersókat, fémionokat és egy, a Perkin-Elmer Cetus PCR kitben (N801-0043 vagy N801-0055) levő Thermus aquaticusból izolált termostabil polimerázt (Taq polimeráz) tartalmazott. A PCR reakció 35 cikluson keresztül egy Perkin-Elmer Cetus DNS thermal cyclerben zajlott le. Minden ciklus egy 1,5 perces 94 °C hő24
HU 225 068 Β1 mérsékleten végzett denaturációs lépésből állt, egy 60 °C hőmérsékleten 2 percig tartó anneáló (kétszálú nukleinsav létrehozása egyszálúból) lépésből és egy 72 °C hőmérsékleten 3 percig tartó primer extenziós lépésből. A PCR-termékeket a Southern-féle gélfilter kombinációs nukleinsav hibridizálási technikának (Southern biot analysis) vetettük alá egy 30 nukleotidból álló próbát, a JH34-et használva, melynek szekvenciája a 15e klón 3’-terminális régiójának szekvenciájára alapult. A JH34 szekvenciája:
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3’.
A HCV cDNS próbával detektált PCR-termékek mérete kb. 50-kb. 400 bázispárig terjedt.
A bővített HCV cDNS-ek klónozása céljából a PCR-termékeket Notl-gyel hasítottuk, és poliakrilamid-gélelektroforézissel méret szerint szelektáltuk. A 300 bázispárnál nagyobb DNS-eket a pUC18S Notl helyére klónoztuk. A pUC18S vektort úgy hoztuk létre, hogy magában foglal egy Notl polikötőt, mely a pUC18 EcoRI és Sáli helyei közé van klónozva. A kiónokat HCV cDNS-re szkríneltük a JH34 próbát használva. Számos pozitív kiónt nyertünk és szekvenáltunk. Az ezen kiónok egyikében, a 16jh kiónban levő HCV cDNS ismert nukleotidszekvenciáját és az ebben kódolt aminosavat a 15. ábra mutatja. Az ábra mutatja a 16jh kiónban levő HCV cDNS szekvenciájában detektált nukleotidheterogenitást ezen régió más klónjával összevetve.
Összeszerkesztett HCV cDNS szekvenciák
HCV cDNS szekvenciát szerkesztettünk össze egy sor a fent leírt különböző HCV cDNS könyvtárakból származó átfedésben levő klónokból. Ebben a szekvenciában a b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a és CA59a klónokból nyert összeszerkesztett HCV cDNS szekvencia a 16. ábrán látható, az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban ismertetett összeszerkesztett HCV cDNS szekvenciától upstream irányban található. A b5a és 16jh klónokból nyert összetett HCV cDNS szekvencia az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban ismertetett összetett HCV cDNS szekvenciától downstream irányban található. A 17. ábra a fent leírt klónokból származó összetett HCV cDNS szekvenciát és az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban közölt összetett HCV cDNS szekvenciát mutatja. A szekvencia a következő klónokból származik: b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (k9-1-nek is hívott), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 31, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a és 16jh. Az ábrán a szekvencia feletti 3 vonal a feltételezett metioninkodon helyzetét jelöli.
A b114a kiónt a b5a klónnál fent leírt klónozási eljárással nyertük, azzal az eltéréssel, hogy a próba a fent leírt 18g klón detektálásához használt szintetikus próba volt. A b114a klón átfedést mutat a 18g, ag30a és a CA205a klónokkal, azzal az eltéréssel, hogy a b114a klón 2 extra nukleotidot tartalmaz a 18g kiónban levő szekvenciától upstream irányban (azaz az 5’ CA-tól). Ezt a két extra nukleotidot a 17. ábrán mutatott HCV-genom magában foglalja.
Meg kell említeni, hogy bár számos fent leírt kiónt az eredeti HCV cDNS Iambda-gt11 C könyvtártól (ATCC No. 40 394) eltérő könyvtárakból nyertünk, ezek a kiónok tartalmaznak az eredeti könyvtárban levő HCV cDNS szekvenciákkal átfedést mutató HCV cDNS szekvenciákat. így lényegében az összes HCV-szekvencia származtatható az első HCV cDNS-klón (5-1-1) izolálásához használt eredeti lambda-gt11 C könyvtárból (ATCC No. 40 394). Az 5-1-1 klón izolálását az EP 318,216 számú szabadalmi leírás ismerteti.
A C100-3 fúziós polipeptid tisztítása (Alternatív módszer)
A C100-3 (HCV c100-3-nak vagy c100-3-nak is nevezett) fúziós polipeptid, szuperoxid-dizmutázból (SÓD) áll az N-terminusnál, és egy „in-frame” C100 HCV-polipeptidből a C-terminusnál. A polipeptid élesztőgombában való expressziójával történő előállítását és az extrahált gazda-élesztőgombasejtek oldhatatlan frakcióinak frakcionált extrakcióját az EP 0318,216 számú szabadalmi leírás írja le. A fúziós polipeptid előállításának egy más módszerét az alábbiakban adjuk meg. Ebben a módszerben az antigént a nyers sejtlizátumból acetonnal csapatjuk ki; az acetonnal kicsapatott antigént ezután ioncserés kromatográfiának vetjük alá, majd a továbbiakban gélfiltrációval tisztítjuk.
A C100-3 (HCV C100-3) fúziós polipeptidet a pAB24C100-3-mal (ATCC No. 67 976) transzformált JSC308 élesztőgombatörzsben (ATCC No. 20 879) expresszáljuk, a transzformált élesztőgombát olyan körülmények között szaporítjuk, mely lehetővé teszi az expresszálást (1 % glükózt tartalmazó YEP-n való szaporodással) (lásd az EPO Pub No. 318,216 számú szabadalmat). A sejtlizátum a sejtek A pufferben (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 ml, PMSF) való szuszpendálásával készül. A sejtek feltárását Dynomill-típusú homogenizátorban vagy ehhez hasonló készülékben üveggyöngyös darálással végezzük. A sejtfeltárás mértékét mikroszkópos sejtszámlálással, fázisoptikával végezzük. A feltárt sejtek sötétek, míg az életképesek világos színűek. A feltárt sejtek százalékos arányát meghatározzuk.
Amikor a feltárt sejtek aránya eléri a 90%-ot, vagy még ennél is nagyobb, a feltárt sejteket centrifugálással választjuk el az üveggyöngyöktől, és az üveggyöngyöket A pufferrel mossuk. A mosadék és a homogenizátum elegyítése után a lizátum oldhatatlan anyagát centrifugálással nyerjük. Az üledék anyagát az oldható fehérjék eltávolítása céljából B puffer (50 mM gíicin, pH 12,0, 1 mM DTT, 500 mM NaCI) szuszpenziójával mossuk, majd C pufferrel (50 mM glicin, pH 10,0,1 mM DTT). Az oldhatatlan anyagot centrifugálással nyerjük vissza, és SDS-t tartalmazó C puffer szuszpenziójában oldjuk. Az extraktum oldatát beta-merkapto-etanol jelenlétében melegíthetjük, és ultraszűréssel koncentrálhatjuk. Az
HU 225 068 Β1 extraktumban levő HCV c100-3-at hideg acetonnal csapatjuk ki. Szükség esetén a csapadék mínusz 15 °C hőmérsékleten vagy ennek közelében tárolható.
Az ioncserés kromatográfiát megelőzően az acetonnal kicsapatott anyagot centrifugálással kinyerjük, és nitrogén alatt száríthatjuk. A csapadékot D pufferben (50 mM glicin, pH 10,0, 1 mM DTT, 7 M urea) szuszpendáljuk és centrifugáljuk az oldhatatlan anyagok ülepítése céljából. A felülúszót anioncserés oszlopra helyezzük, melyet előzőleg D pufferrel ekvilibráltunk. A frakciókat összegyűjtjük és UV-abszorbanciával analizáljuk, vagy SDS poliakrilamid-géleken gélelektroforézist végzünk. A HCV C100-3 polipeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.
A HCV C100-3 polipeptid gélszűréssel történő tisztításához az ioncserés oszlopról összegyűjtött frakciókat beta-merkapto-etanol és SDS jelenlétében melegítjük, és az eluátumot ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrátumot gélfiItrációs oszlopra helyezzük, melyet előzőleg E pufferrel (20 mM Tris-HCI, pH 7,0, 1 mM DTT, 0,1% SDS) ekvilibráltunk. Az eluált frakciókban a HCV C100-3 és a szennyeződések jelenlétét poliakrilamid-géleken gélelektroforézissel határoztuk meg SDS jelenlétében, és a polipeptidek láthatóvá tételével. A tiszta HCV c100-3-at tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A HCV c100-3-ban gazdag frakciókat további tisztítás céljából ismételten gélfiltrációs eljárásnak vethetjük alá. Ha a szemcsés anyagok eltávolítása szükséges, a HCV c100-3-at tartalmazó anyagot 0,22 mikronos szűrőn szűrhetjük.
A HCV cDNS-ben kódolt polipeptidek expressziója és antigenitása
Az E. coliban expresszált polipeptidek
A számos HCV cDNS-ben kódolt polipeptidet, melyek a HCV-genom ORF-jét adják, az E. coliban expresszáltuk és antigenitásukra teszteltük a különböző NANBH-ban szenvedő egyedektől nyert szérumot használva. A klónozott HCV cDNS-eket tartalmazó expressziós vektorokat a pSODcf1-ből hoztuk létre [Steimer et al. (1986)]. Hogy biztosak legyünk abban, hogy egy korrekt leolvasási keretet nyerünk, 3 külön expressziós vektort, a pcf1AB-t, a pcf1CD-t és apcf1EF-et készítettük úgy, hogy valamelyik kötőt, az AB-t, a CD-t és az EF-et ligáltuk egy, a pSODcfl vektor EcoRI és BamHl-gyel való teljes emésztésével nyert BamHI-EcoRI fragmenthez, melyet egy alkalikus foszfatázzal való kezelés követett. A kötőket 6 oligomerből készítettük, az A, B, C, D, E és az F-ből. Minden oligomert ATP jelenlétében kináz enzimmel való kezeléssel foszforiláltunk, mielőtt komplementer oligomerjeikhez anneáltuk volna őket. A szintetikus kötők szekvenciája a következő volt:
Név DNS-szekvencia (5'-től a 3' felé)
A GATC CTG AAT TCC TGA TAA
B GAC TTA AGG ACT ATT TTA A
C GATC CGA ATT CTG TGA TAA
D GCT TAA GAC ACT ATT TTA A
B GATC CTG GAA TTC TGA TAA
F GAC CTT AAG ACT ATT TTA A
A 3 kötő közül mindegyik rombolja az eredeti EcoRI helyet, és a kötőn belül hoz létre egy új EcoRI helyet, de egy másik leolvasási kereten belül. Ennélfogva az expressziós vektorokba való inzertáláskor a kiónokból izolált HCV cDNS EcoRI fragmentek 3 különböző leolvasási kereten belül voltak.
A kijelölt Iambda-gt11 kiónokban levő HCV cDNS fragmentumokat az EcoRI-gyel való emésztéssel hasítottuk; minden egyes fragmentumot a pcf1AB-be, a pcf1CD-be és a pcf1EF-be inzertáltuk. Ezután ezeket az expressziós szerkezeteket a D1210 E. coli sejtekbe transzformáltuk, a transzformánsokat klónoztuk, és az egyes klónokból való rekombináns baktériumokat a fúziós polipeptidek expresszálására indukáltuk, a baktériumok IPTG jelenlétében való szaporításával.
Az említett HCV cDNS-ek expressziós termékeit antigenitásukra teszteltük a telepek közvetlen immunológiai szkrínelésével, a Helfman et al. (1983) munkájában leírt módszer módosított változatát alkalmazva. Röviden, ahogy az a 18. ábrán is látható, a baktériumokat ampicillinlemezekre rétegezett nitro-cellulóz-szűrőre szélesztettük úgy, hogy megközelítően 1000 telep jusson egy szűrőre. A telepekkel replikaszélesztést végeztünk nitro-cellulóz-lemezeken, és a replikákat újra növesztettük egy éjszakán át 2 mM IPTG és ampicillin jelenlétében. A baktériumtelepeket a nitro-cellulóz-szűrők 15-20 percig történő CHCI3-gőzzel telített légkörben való szuszpendálásával lizáltuk. Ezután a szűrőket 100 mm-es 10 ml 50 mM Tris-HCI-ot, pH 7,5, 150 mM NaCI-ot, 5 mM MgCI2-ot, 3% (w/v) BSA-t, 40 mikrogr./ml lizozimet és 0,1 mikrogr./ml DN-ázt tartalmazó Petri-csészébe helyeztük. A Petri-csészéket óvatosan legalább 8 órán keresztül szobahőmérsékleten rázattuk. A szűrőket TBST-ben (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,005% Tween 20) öblítettük. Inkubáció után a sejtmaradványt öblítettük, és 10% birkaszérumot tartalmazó TBS-ben (TBST Tween nélkül) inkubáltuk 1 órán keresztül. A szűrőket ezután NANBH-s egyedekből származó TBS-ben előkezelt szérummal inkubáltuk. Az egyedek közé tartoztak a következők: 3 csimpánz, 8 krónikus NANBH-s beteg, akiknek széruma pozitív volt a HCV C100-3 (C100-nak is nevezett) polipeptid (az EP 318,216 számú szabadalmi leírásban és korábban leírt) elleni antitesteket figyelembe véve; 8 krónikus NANBH-s beteg, akiknek széruma negatív volt az anti-C100 antitestekre; egy lábadozó beteg, akinek széruma negatív volt az anti-C100 antitestekre; és 6 beteg, akik közösségben szerzett NANBH-val voltak fertőzöttek, ideértve egyet, akinek a széruma erősen pozitív volt az anti-C100 antitesteket figyelembe véve, és egyet, akinek a széruma éppen csak pozitív volt. A TBS-ben hígított szérumot hSOD-dal való preabszorpcióval előkezeltük. A szűrők szérumokkal való inkubációja legalább 2 óráig tartott. Inkubálás után a szűrőket kétszer 30 percig TBST-vel mostuk. Az expresszált fehérjék jelölését, melyekhez a szérumban levő antitestek kötődtek, 2 órán keresztül 125l-dal jelölt birka antihumán antitesttel való inkubálással végeztük. Mosás után a szűrőket kétszer 30 percig TBST-vel mostuk, szárítottuk és autoradiografáltuk.
HU 225 068 Β1
Számos klón (lásd később) olyan polipeptideket expresszált, melyek olyan HCV-epitópokat tartalmaztak, melyek immunológiailag aktívak voltak az NANBH-ban szenvedő betegekből származó szérummal. A polipeptidek közül 5 erősen immunogén volt abban, hogy az ezen polipeptidekben levő HCV-epitópok elleni antitesteket különböző betegek szérumában detektáltuk. Az ezen polipeptideket kódoló kiónok és a polipeptid elhelyezkedése a feltételezett HCV-poliproteinekben (ahol az aminosavszám a feltételezett iniciátorkodonnal kezdődik) a következő: 5-1-1 klón, aminosavak 1694-1735; C100 klón, aminosavak 1569-1931; 33c klón, aminosavak 1192-1457; CA279a klón, aminosavak 1-84; CA290a klón, aminosavak 9-177. A feltételezett HCV-poliproteineken belüli immunogén polipeptidek elhelyezkedését a következőkben mutatjuk.
Az NANBH-s betegek szérumával bizonyítottan aktív polipeptideket kódoló kiónok
Klón A HCV-poliproteinen belüli elhelyezkedés (az aminosavszám a feltételezett kezdő metioninkodonnal indul)
CA279a 1-84
CA74a 437-582
13i 511-690
CA290a 9-177
33c 1192-1457
40b 1266-1428
5-1-1 1694-1735
81 1689-1805
33b 1916-2021
25c 1949-2124
14c 2054-2223
8f 2200-3325
33f 2287-2385
33g 2348-2464
39c 2371-2502
15e 2796-2886
C100 1569-1931
A különböző vizsgált kiónokban kódolt polipeptidek immunogenitásával kapcsolatos eredmények alapján a detektálás hatékony, és az immunizációs rendszerek tartalmazhatnak HCV polipeptid/epitóp paneleket.
A HCV-epitópok expresszálása élesztőgombában
Három különböző élesztőgomba expressziós vektort készítettünk, melyek lehetővé teszik a HCV cDNS három különböző olvasási keretbe való inzertációját. Az egyik vektor, a pAB24C100-3 leírása az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban található. A későbbi vizsgálatokban az antigenitás feltérképezésének E. coli expressziós termékeket használó vizsgálatában a C100 HCV cDNS-sel helyettesítettük a korábban felsorolt klónokból származó HCV cDNS-t. A többi vektor létrehozásában a fenti E. colivá] végzett vizsgálatokban leírt adaptert a következő adapterok egyikével helyettesítjük.
Adaptor 1
ATT TTG AAT TCC TAA TGA G
AC TTA AGG ATT ACT CAG CT
Adaptor 2
AAT TTG GAA TTC TAA TGA G
AC CTT AAG ATT ACT CAG CT
Az inzertéit HCV cDNS-t a vektorokkal transzformáit élesztőgombában expresszáljuk a C100-3 fúziós polipeptid expresszálásához, a fent leírt expressziós körülményeket használva. A nyert polipeptideket az NANBH-s betegek szérumát használva szkríneljük, melyet korábban az E. coliban expresszált HCV cDNS-ekben kódolt immunogén polipeptidek szkrínelésénél írtunk le.
A HCV-poliproteinek hidrofób profiljainak összehasonlítása a West Nile vírus poliproteinjével és a Dengue vírus NS1-gyel
Egy HCV-poliprotein-szegment hidrofobitási profilját összehasonlítottuk egy tipikus Flavivíruséval, a West Nile víruséval. A West Nile vírus poliproteinjének polipeptidszekvenciáját a vírus nem szerkezeti fehérjéit kódoló ismert polinukleotidszekvenciákból vezettük le. A HCV-poliprotein-szekvenciát az átfedő cDNS-klónok szekvenciájából származtattuk. A profilokat egy olyan antigénprogram alkalmazásával határoztuk meg, mely egy 7 aminosav szélességű ablakot használ (a kérdéses aminosavat és 3-3 maradékot a két oldalon) az adott aminosavmaradék átlaghidrofobitásának jelzésére. A paraméterek, melyek megadják az egyes aminosavmaradékok reaktív hidrofilitását, Kyte és Doolittle munkájából (1982) származnak. A 19. ábra a két poliprotein hidrofób profilját mutatja, a West Nile vírus nem szerkezeti fehérjéinek megfelelő területeket, az ns1-ns5 területeket az ábrán jelöltük. Amint az az ábrán is látható, általános hasonlóság van a HCV poliproteinjének és a West Nile vírus poliproteinjének profiljai között.
A 16. ábrán bemutatott HCV cDNS 5’-régiójában kódolt aminosavak szekvenciáját összehasonlítottuk a későbbiekben leírt Dengue vírus egyik törzsének megfelelő régiójával, a területek hidrofilitását és hidrofobitását figyelembe véve (adatot nem mutatunk). Ez az összehasonlítás azt mutatja, hogy a HCV-ből és a Dengue vírusból származó polipeptideknek, melyek ebben a régióban kódoltak, mely megfelel az NS1-et kódoló régiónak (vagy annak egy részének), hasonló a hidrofób/hidrofil profiljuk.
A hidrofobitási profilban levő hasonlóság a HCV és Dengue Flavivírusok aminosavszekvenciáiban korábban azonosított homológiákkal együttesen (lásd az EP 218,316 számú szabadalmat) azt sugallják, hogy a HCV a Flavivírus család ezen tagjaival rokonságban áll.
A HCV ORF-en belül kódolt feltételezett polipeptidek jellemzése
A 17. ábrán bemutatott HCV cDNS értelmes szálának szekvenciáját az EP 0318,216 számú szabadalmi leírásban és a korábban leírt különböző kiónokban levő átfedő HCV cDNS-ekből származtatjuk. Származtatható abból a szekvenciából, melyet a HCV-genom tartalmaz, elsősorban egy hosszú, folyamatos ORF-ből,
HU 225 068 Β1 mely egy poliproteint kódol. A szekvenciában az 1. számú nukleotid megfelel a kezdő MET kodon első nukleotidjának; a negatív számok azt jelentik, hogy a nukleotidok az 5’-irányban upstream ilyen távolságban helyezkednek el, míg a pozitív számok azt jelzik, hogy a nukleotidok ilyen távolságban vannak downstream a 3’-irányban. Az összetett szekvencia a HCV cDNS értelmes szálát mutatja.
A HCV cDNS értelmes szálának szekvenciájából származtatott feltételezett HCV-poliprotein aminosavszekvenciáját is a 17. ábra mutatja, ahol az 1. pozíció a feltételezett kezdő metioninnal indul.
A kódolt HCV-poliprotein lehetséges proteindoménjei, akárcsak a körülbelüli határok, a következők (a zárójelen belüli azonosított polipeptidek azok, melyek a Flavivírus doménben kódoltak):
Feltételezett dómén Körülbelüli határ (aminosavszámok)
„C” (nukleokapszidfehérje) 1-120
„E [virionburok-fehérjé(k)
és lehetséges mátrix-
(M) fehérjé(k)] 120-400
„NS1” (komplementfixációs
antigén) 400-660
„NS2” (ismeretlen funkció) 660-1050
„NS3” (proteáz ?) 1050-1640
„NS4” (ismeretlen funkció) 1640-2000
„NS5” (polimeráz) 2000-?, végig
Említésre méltó azonban, hogy a hidrofilitási profilok (a későbbiekben írjuk le) alapján a HCV különbözik a Flavivírus modelltől, különösen az NS1-től upstream irányban levő terület tekintetében. Továbbá a jelölt határok nem szándékoznak erős demarkációkat mutatni a feltételezett polipeptidek között.
Továbbá a 17. ábrán mutatott szekvenciából következtethető, hogy ott 4 kis ORF, melyek ATG-t tartalmaznak, a nagy poliprotein feltételezett kezdő MET kodonjától upstream irányban fekszik. Ezen ORF-ek ATG-je a következő számú nukleotidoknál található: -310,-257,-246 és -127.
A polipeptid hidrofil és antigénprofilja
Komputeres analízissel határoztuk meg a 16. ábrán látható HCV cDNS szekvenciában kódolt feltételezett poliprotein hidrofilitási/hidrofobitási profilját és az antigénindexét. A hidrofilitási/hidrofobitási program a fent leírt volt. Az antigénindexet olyan komputerprogramból nyertük, mely a következő kritériumokra épül: 1. felszíni valószínűség; 2. az alfa-helicitás becslése két különböző módszerrel; 3. a beta-sík területek becslése két különböző módszerrel; 4. az U-fordulatok becslése két különböző módszerrel; 5. hidrofilitás/hidrofobitás; és rugalmasság. A profilok vázlatait a komputeres analízis alapján készítettük el, és a 20. ábra mutatja be. A hidrofilitási profilban az abszcissza fölötti elhajlás a hidrofilitást jelzi, és az ez alatti a hidrofobitást. Egy polipeptidterület antigéntulajdonságának valószínűsége feltételezések szerint általában nő, ha a hidrofil és/vagy antigénprofilban az abszcisszától felfelé irányuló elhajlás van. Azonban említésre méltó, hogy ezek a profilok nem feltétlenül jelzik egy polipeptid immunogenitásának erősségét.
A HCV-ben és Flavivírusokban levő kolineáris peptidek azonosítása
A HCV cDNS értelmes szálában kódolt feltételezett poliprotein aminosavszekvenciáját összehasonlítottuk számos, a Flavivírusokat képviselő fajok ismert aminosavszekvenciájával. Az összehasonlítás azt mutatja, hogy a homológia enyhe, de azoknak a területeknek köszönhetően, melyekben ezt találtuk, feltehetően szignifikáns. A konzervált kolineáris régiókat a 21. ábrán mutatjuk be. A szekvenciák alatt felsorolt aminosavszámok a feltételezett HCV-poliproteinben (lásd a 17. ábrát) levő számokat képviselik.
Ezen konzervált, ismétlődő részek elhelyezkedése hasonló a Flavivírusokban és a HCV-ben, és maga után vonja, hogy valamilyen hasonlóság van a HCV és ezen Flavivírus ágensek között.
A következő felsorolt anyagok letétben vannak a Budapesti Egyezmény és az American Type Culture Collection (ATCC) között kötött szerződés értelmében, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, és a következő hivatkozási számokat kapták:
Lambda-gt11 HCV ATCC szám A deponálás ideje
cDNS könyvtár 40 394 1987. december 1.
81 klón 40 388 1987. november 17.
91 klón 40 389 1987. november 17.
1-2 klón 40 390 1987. november 17.
5-1-1 klón 40 391 1987. november 18.
12f klón 40 514 1988. november 10.
35f klón 40 511 1988. november 10.
15e klón 40 513 1988. november 10.
K9-1 klón 40 512 1988. november 10.
JSC 308 20 879 1988. május 5.
pS356 67 683 1988. április 29.
Továbbá a következő deponálásokat 1989. május 11-én végeztük:
Törzs Kötök ATCC szám
D1210 (Cf1 /5-1-1) EF 67 967
D1210 (Cf1/81) EF 67 968
D1210 (Cf1/CA74a) EF 67 969
D1210 (Cf1/35f) AB 67 970
D1210 (Cf1/279a) EF 67 971
D1210 (CÍ1/C36) CD 67 972
D1210 (Cf1/13i) AB 67 973
D1210 (Cf1/C33b) EF 67 974
D1210 (Cf1/CA290a) AB 67 975
HB101 (AB24/C100 3R) 67 976
A D1210 jelű törzs következő származékait 1989.
május 3-án deponáltuk:
Törzsszármazék ATCC szám
pCF1CS/C8f 67 956
pCF1AB/C12f 67 952
pCF1EF/14c 67 949
pCF1EF/15e 67 954
pCF1AB/C25c 67 958
pCF1EF/C33c 67 953
pCF1EF/C33f 67 050
HU 225 068 Β1
Törzsszármazék ATCC szám pCF1CD/33g 67 951 pCF1CD/C39c 67 955 pCF1EF/C40b 67 957 pCF1EF/CA167b 67 959
A következő törzseket 1989. május 12-én deponáltuk:
Törzs ATCC szám
Lambda-gt11 40 603
Lambda-gt10 40 602
D1210(C40b) 67 980
D1210 (M16) 67 981
Ezen bejelentésnek, mint egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésnek az engedélyezése és kiadása alapján ezen deponálások hozzáférhetőségi korlátozásai visszavonhatatlanul megszűnnek; a kijelölt deponálásokhoz való hozzáférhetőség elérhető lesz a fentnevezett függő bejelentés engedélyezése után egy olyan személy számára, akit a Comissioner határoz meg, hogy jogosult erre a 37 CFR 1.14 és a 35 USC 1.22 alapján. Továbbá a jelölt letétek fenntartási ideje a deponálástól számított 30 (harminc) év, vagy az utolsó igényléstől számított 5 (öt) év, vagy az USA szabadalom alkalmazhatóságának ideje, amely ennél hosszabb. A találmányban említett deponált anyagok csupán a kényelmet szolgálják, és nem várjuk el, hogy a jelen találmányt a leírtak szerint alkalmazzák, továbbá ezen anyagokat a referencia tartalmazza.
Ipari alkalmazás
A találmánynak az itt leírtak alapján számos ipari alkalmazása van, melyek közül néhány a következő. A HCV cDNS-ek olyan próbák megszerkesztéséhez használhatók, melyek a minták HCV-nukleinsavainak detektálására szolgálnak. A cDNS-ekből származó próbák például a kémiai szintetikus reakciókban részt vevő HCV-nukleinsavak detektálására szolgálhatnak. Használhatók szkrínelési programokban vírus elleni ágensek szkrínelésére, az ágensek sejttenyészetrendszerekben és állati modellrendszerekben való vírusreplikációt gátló hatásának detektálására. A HCV-polinukleotid-próbák használhatók a vírusnukleinsavak emberben való detektálására, így az emberi HCV-fertőzések diagnózisának alapjául szolgálhatnak.
A fentieken túl, az itt közölt cDNS-ek információt és eszközt nyújtanak a HCV-epitópokat tartalmazó polipeptidek szintetizálásához. Ezek a polipeptidek használhatók a HCV-antigének elleni antitestek detektálásában. A HCV-fertőzés HCV-epitópokat tartalmazó rekombináns polipeptidekre alapozott immunológiai vizsgálatait a találmányban leírjuk, és kereskedelmi használatba vételre alkalmas lesz a HCV-indukált NANBH diagnózisában, a vérbankdonorok HCV okozta fertőző hepatitisének szkrínelésében és a fertőzött vérdonoroktól származó fertőzött vér detektálásában. A vírusantigének szintén használhatók lesznek az állati modellrendszerekben való vírus elleni ágensek hatékonyságának felmérésében. Továbbá az itt leírt HCV cDNS-ekből származó polipeptidek alkalmazhatók lesznek a HCV-fertőzés kezelésére szolgáló vakcinaként.
A HCV cDNS-ekből származó polipeptidek, a fent leírt alkalmazásokon túl, használhatók a HCV elleni antitest termelésében. így használhatók a HCV elleni vakcinákban. Azonban a HCV-polipeptidekkel való immunizálás eredményeként termelt antitestek is hasznosak a mintákban levő vírusantigének jelenlétének kimutatásában. így használhatók a kémiai szintézisek során HCV-polipeptidek vizsgálatában. A HCV elleni antitestek alkalmazhatók a vírusellenes ágensek hatékonyságának felmérésében szkrínelési programokban, ahol ezeket az ágenseket szövettenyészeti rendszerekben tesztelik. Passzív immunoterápiára is használhatók, és a HCV által okozott NANBH diagnózisához, melynek során lehetőség nyílik a vírusantigén(ek) detektálására mind a vérdonorokban, mind a recipiensekben. A HCV elleni antitestek másik fontos alkalmazása az affinitáskromatográfiával kapcsolatos, mely módszert a vírusok és víruspolipeptidek tisztításában alkalmazunk. A tisztított vírus- és víruspolipeptid-készítmények a vakcinákban alkalmazhatók. Azonban a tisztított vírus is használható olyan sejttenyészetrendszerek kifejlesztésére, melyekben a HCV replikálódik.
Az értelmetlen (antiszensz) polinukleotidok a vírusreplikáció inhibitoraként használhatók.
A kényelem kedvéért a HCV elleni antitestek és a HCV-polipeptidek, akár természetesek, akár rekombinánsak, kitekbe csomagolhatok.

Claims (16)

1 GGGGCCTGCTACTCCATAGAACCACTGGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTCCATGGC CCCCGGACGATGAGGTATCTTGGTGACCTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAGGTACCG
LeuSerAlaPheSerLeuHisSerTyrSerProGlyGlulleAsnArgValAlaAlaCys 61 CTCAGCGCATTTTCACTCCACAGTTACTCTCCAGGTGAAATTAATAGGGTGGCCGCATGC
GAGTCGCGTAAAAGTGAGGTGTCAATGAGAGGTCCACTTTAATTATCCCACCGGCGTACG
Gly*
G
LeuArgLysLeuGlyValProProLeuArgAlaTrpArgHisArgAlaArgSerValArg 121 CTCAGAAAACTTGGGGTACCGCCCTTGCGAGCTTGGAGACACCGGGCCCGGAGCGTCCGC
GAGTCTTTTGAACCCCATGGCGGGAACGCTCGAACCTCTGTGGCCCGGGCCTCGCAGGCG
AlaArgLeuLeuAlaArgGlyGlyArgAlaAlalleCysGlyLysTyrLeuPheAsnTrp 181 GCTAGGCTTCTGGCCAGAGGAGGCAGGGCTGCCATATGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGG
CGATCCGAAGACCGGTCTCCTCCGTCCCGACGGTATACACCGTTCATGGAGAAGTTGACC
AlaValArgThrLysLeuLys 241 GCAGTAAGAACAAAGCTCAAAC
CGTCATTCTTGTTTCGAGTTTG * - nuHeotíd heterogenitás
1 CTCCACCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCC GAGGTGGTACTTAGTGAGGGGACACTCCTTGATGACAGAAGTGCGTCTTTCGCAGATCGG #MetSerValValGlnProProGlyProProLeuProGlyGluProAM
MetAlaLeuValOP
61 ATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGT TACCGCAATCATACTCACAGCACGTCGGAGGTCCTGGGGGGGAGGGCCCTCTCGGTATCA
121 GGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATC CCAGACGCCTTGGCCACTCATGTGGCCTTAACGGTCCTGCTGGCCCAGGAAAGAACCTAG ----------------átfedés ag30a-vaI-------------------------#MetProGlyAspLeuGlyValProProGlnAspCysAM
181 AACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGT TTGGGCGAGTTACGGACCTCTAAACCCGCACGGGGGCGTTCTGACGATCGGCTCATCACA
OP AM GlyAlaCysGluCysProGlyArgSer
241 TGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGT ACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCCACGAACGCTCACGGGGCCCTCCA
ArgArg
301 CTCGTAGA GAGCATCT * - hosszú-HCV ORF kezdete # - putatív kis kódolt pe.ptíde k ('melyek transzédációs regulációs szerepet játszanak)
1. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 k9-1 DNS transzláció
GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly
CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG
GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC
ProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrPro
GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC
CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG
ProLysProCysGlylleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCysPheThr
CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA
GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT
ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly
CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG
GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC
GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe
GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT
CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA
GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal
TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG
AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC
IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro
TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC
AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG
AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAsp
CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG
GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC
TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrlleAsnTyrThrllePheLysIleArg
ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACTATATTTAAAATCA
TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGATATAAATTTTAGT
MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu
GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAGCACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG
CCTACATGCACCCTCCCCAGCTCGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC
ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr
AACGTTGCGATCTGGAAGATAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA
TTGCAACGCTAGACCTTCTATCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT
GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle
CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTGCCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA
GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGACGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT
HisLeuHisGlnAsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAla
TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG
AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC
SerTrpAlalleLysTrpGluTyrValYalLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg
CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTCCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC
GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAGGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG
1. Eljárás egy polipeptid előállítására, amely lényegében izolált alakban van, és amely a hepatitis C vírus (HCV) poliproteinből származó, legalább 10 egybefüggő aminosavból álló egybefüggő szekvenciát tartalmaz, ahol az egybefüggő szekvencia egy HCV-poliprotein 1-449. számú aminosavain belül található, ahol a HCV a következőkkel jellemezhető:
- egy pozitív szálú RNS-genom;
- a szóban forgó genom egy poliproteint kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz; és
- a szóban forgó kódolt poliprotein teljes egésze legalább 40%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat polimerizáljuk, és izoláljuk a polipeptidet.
2-2. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
GlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLauThrArgAspProThrThrProLeuAlaArgAla 1 CGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGC
GCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCG
AlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnllelleMetPhe 61 TGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTT
ACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAA
AlaProThrLeuTrpAlaArgMetXleLeuMetThrHisPhePheSerValLeuIleAla 121 TGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGC
ACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCG
ArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAlaCysTyrSerlleGlu 181 CAGGGACCAGCTTG AACAGGCCCTCG ATTGCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAG A
GTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCT
P roLeuAspLeuP roProI le I leGlnArgLeu 241 ACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC TGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
2-1. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
VaLCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATG ATGCTACTCATATCCC AAGCGGAAGCGGCTTTGGAGA
CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTTCGCCGAAACCTCT
LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG
TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC
PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATCTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGG AGCGGTCTACACCT
ACAAGAAGACGAAACGTACCATAGACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA
TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC agatgccctacaccggagaggaggacgaggacaaccgcaacggggtcgcccgcatgcgcg
AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTAA
ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGATT
LeuSerProTyrTyrLysArgTyrlleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC
GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG
ThrArgValGluAlaGlhLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC
ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG
AspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLys 1261 GCGACGCTGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA
CGCTGCGACAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT
LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAla 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAG
TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTC
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 70%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
3. ábra
26JDNS transzláció
LeuPheTyrHisHisLysPheAsnSerSerGlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArg 1 GCTTTTCTATCACCACAAGTTCAACTCTTCAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCG
CGAAAAGATAGTGGTGTTCAAGTTGAGAAGTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGC
ProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGlyProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyPro 61 ACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGGGCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCC
TGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCCCGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGG
AspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrProProLysProCysGlylleValProAlaLys 121 CGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACCCCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAA
GCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGGGGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTT
SerValCysGlyProValTyrCysPheThrProSerProValValVal 181 GAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCACTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGG
CTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGTGAGGGTCGGGGCACCACCACCC
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 80%-os homológiát mutat a
HU 225 068 Β1 teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
4. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
CA59a DNS transzláció
LeuValMetAlaGlnLeuLeuArglleProGlnAlalleLeuAspMetlleAlaGlyAla 1 TTGGTAATGGCTCAGCTGCTCCGGATCCCACAAGCCATCTTGGACATGATCGCTGGTGCT
AACCATTACCGAGTCGACGAGGCCTAGGGTGTTCGGTAGAACCTGTACTAGCGACCACGA
HisTrpGlyValLeuAlaGlylleAlaTyrPheSerMetValGlyAsnTrpAlaLysVal 61 CACTGGGGAGTCCTGGCGGGCATAGCGTATTTCTCCATGGTGGGGAACTGGGCGAAGGTC
GTGACCCCTCAGGACCGCCCGTATCGCATAAAGAGGTACCACCCCTTGACCCGCTTCCAG
LeuValValLeuLeuLeuPheAla'GlyValAspAlaGluThrHisValThrGlyGlySer 121 CTGGTAGTGCTGCTGCÍATTTGCCGGCGTCG ACGCGGAAACCCACGTCACCGGGGGAAGT
GACCATCACGACGACGATAAACGGCCGCAGCTGCGCCTTTGGGTGCAGTGGCCCCCTTCA
AlaGlyHisThrValSerGlyPheValSerLeuLeuAlaProGlyAlaLysGlnAsnVal 181 GCCGGCCACACTGTGTCTGGATTTGTTAGCCTCCTCGCACCAGGCGCCAAGCAGAACGTC
CGGCCGGTGTGACACAGACCTAAACAATCGGAGGAGCGTGGTCCGCGGTTCGTCTTGCAG
GlnLeuIleAsnThrAsnGlySerTrpHisLeuAsnSerThrAlaLeuAsnCysAsnAsp 241 CAGCTG ATCAAC ACCAAC.GGCAGTTGGCACCTCAATAGCACGGCCCTG AACTGCAATG AT
GTCGACTAGTTGTGGTTGCCGTCAACCGTGGAGTTATCGTGCCGGGACTTGACGTTACTA
SerLeuAsnThrGlyTrpLeuAlaGlyLeuPheTyrHisHisLysPheAsnSerSerGly 301 AGCCTCAACACCGGCTGGTTGGCAGGGCTTTTCTATCACCACAAGTTCAACTCTTCAGGC
TCGGAGTTGTGGCCGACCAACCGTCCCGAAAAGATAGTGGTGTTCAAGTTGAGAAGTCCG
------átfedés 2 6-j-vei-----------------átfedés K9-l-qyel-------CysProGluArgLeuAlaSerCysArgPro
361 TGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCC ACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGG
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 90%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
5. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
13í DNS transzláció
ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly 1 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCTACCTACAGCTGGG gagggtcggggcaccaccacccttgctggctgtccagcccgcgcggatggatgtcgaccc
GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe 61 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT
CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA
GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal 121 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG
AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC
IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro 181 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC
AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG
AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpLeuThrProArgCysLeuValAsp 241 CGGACGCCACATACTCTC.GGTGCGGCTCCGGTCCCTGGCTCACACCCAGGTGCCTGGTCG
GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCGAGTGTGGGTCCACGGACCAGC
TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrlleAsnTyrThrllePheLysIleArg 3 01 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA
TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT
MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 361 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAGCACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG
CCTACATGCACCCTCCCCAGCTCGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC
---------------átfedés 12 f-el -------------------------ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr
421 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT
GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeu 481 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTGCCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA
GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGACGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT
5. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polipeptid egybefüggő szekvenciája egy HCV-poliprotein 1-84. vagy 9-177. számú aminosavain belül található.
6. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció CA84a DNS-el
GlnGlyCysAsnCysSerlleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpAsp 1 CGCAAGGTTGCAATTGCTCTATCTATCCCGGCCATATAACGGGTCACCGCATGGCATGGG
GCGTTCCAACGTTAACGAGATAGATAGGGCCGGTATATTGCCCAGTGGCGTACCGTACCC
MetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMetAlaGlnLeuLeuArgllePro 61 ATATGATGATGAACTGGTCCCCTACGACGGCGTTGGTAATGGCTCAGCTGCTCCGGATCC
TATACTACTACTTGACCAGGGGATGCTGCCGCAACCATTACCGAGTCGACGAGGCCTAGG
GlnAlalleLeuAspMetlleAlaGlyAlaHisTrpGlyValLeuAlaGlylleAlaTyr 121 CACAAGCCATCTTGGACATGATCGCTGGTGCTCACTGGGGAGTCCTGGCGGGCATAGCGT
GTGTTCGGTAGAACCTGTACTAGCGACCACGAGTGACCCCTCAGGACCGCCCGTATCGCA
------------átted és CA5 9 - cél —-------------------------PheSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuValValLeuLeuLeuPheAlaGlyVal 181 ATTTCTCCATGGTGGGGAACTGGGCGAAGGTCCTGGTAGTGCTGCTGCTATTTGCCGGCG
TAAAGAGGTACCACCCCTTGACCCGCTTCCAGGACCATCACGACGACGATAAACGGCCGC
AspAlaGluThrHisValThrGly 2 41 TCGACGCGGAAACCCACGTCACCGGGG
AGCTGCGCCTTTGGGTGCAGTGGCCCC
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polipeptid egybefüggő szekvenciája a 4., 11., 12. vagy 17. ábra szerinti szekvenciákon belül található.
7. ábra transzláció CA156e DNS-et
CysTrpValAlaMetThrProThrValAlaThrArgAspGlyLysLeuProAlaThrGln 1 GTGTTGGGTGGCGATGACCCCTACGGTGGCCACCAGGGATGGCAAACTCCCCGCGACGCA
CACAACCCACCGCTACTGGGGATGCCACCGGTGGTCCCTACCGTTTGAGGGGCGCTGCGT
LeuArgArgHisIleAspLeuLeuValGlySerAlaThrLeuCysSerAlaLeuTyrVal 61 GCTTCGACGTCACATCGATCTGCTTGTCGGGAGCGCCACCCTCTGTTCGGCCCTCTACGT
CGAAGCTGCAGTGTAGCTAGACGAACAGCCCTCGCGGTGGGAGACAAGCCGGGAGATGCA
GlyAspLeuCysGlySerValPheLeuValGlyGlnLeuPheThrPheSerProArgArg 121 GGGGGACCTATGCGGGTCTGTCTTTCTTGTCGGCCAACTGTTCACCTTCTCTCCCAGGCG
CCCCCTGGATACGCCCAGACAGAAAGAACAGCCGGTTGACAAGTGGAAGAGAGGGTCCGC
HisTrpThrThrGlnGlyCysAsnCysSerlleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArg 181 CCACTGG ACG ACGCAAGGTTGCAATTGCTCTATCTATCCCGGCCATATAACGGGTCACCG
GGTGACCTGCTGCGTTCCAACGTTAACGAGATAGATAGGGCCGGTATATTGCCCAGTGGC
--------------------átfedés CA84a-vaL---------------------Me.tAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValValAlaGlnLeu
241 CATGGCATGGGATATGATGATGAACTGGTCCCCTACGACGGCGTTGGTAGTGGCTCAGCT GTACCGTACCCTATACTACTACTTGACCAGGGGATGCTGCCGCAACCATCACCGAGTCGA
LeuArglleProGlnAla 301 GCTCCGGATCCCACAAGCC CGAGGCCTAGGGTGTTCGG
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polipeptid egybefüggő szekvenciája legalább 15 aminosavból áll.
8. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció CA167b-vel
SerThrGlyLeuTyrHisValThrAsnAspCysProAsnSerSerlleValTyrGluAla 1 CTCCACGGGGCTTTACCACGTCACCAATGATTGCCCTAACTCGAGTATTGTGTACGAGGC
GAGGTGCCCCGAAATGGTGCAGTGGTTACTAACGGGATTGAGCTCATAACACATGCTCCG
AlaAspAlalleLeuHisThrProGlyCysValProCysValArgGluGlyAsnAlaSer 61 GGCCGATGCCATCCTGCACACTCCGGGGTGCGTCCCTTGCGTTCCTGAGGGCAACGCCTC
CCGGCTACGGTAGGACGTGTGAGGCCCCACGCAGGGAACGCAAGCACTCCCGTTGCGGAG
ArgCysTrpValAlaMetThrProThrValAlaThrArgAspGlyLysLeuProAlaThr 121 GAGGTGTTGGGTGGCGATGACCCCTACGGTGGCCACCAGGGATGGCAAACTCCCCGCGAC
CTCCACAACCCACCGCTACTGGGGATGCCACCGGTGGTCCCTACCGTTTGAGGGGCGCTG
------------------átfedés CA156-tál --------------------GlnLeuArgArgHisIleAspLeuLeuValGlySerAlaThrLeuCysSerAlaLeuTyr
181 GCAGCTTCGACGTCACATCG ATCTGCTTGTCGGG AGCGCTACCCTCTGTTCGGCCCTCTA CGTCGAAGCTGCAGTGTAGCTAGACGAACAGCCCTCGCGATGGGAGACAAGCCGGGAGAT
ValGlyAspLeuCysGlySerValPheLeu 241 CGTGGGGGACTTGTGCGGGTCTGTCTTTCTTG
GCACCCCCTGAACACGCCCAGACAGAAAGAAC
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polipeptid egybefüggő szekvenciája AAx-AAy képletű, ahol is x és y a 17. ábra szerinti következő aminosavszámokat jelenti: AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA45-AA65,
AA80-AA90,
AA105-AA120,
AA155-AA170,
AA220-AA240,
AA290-AA330,
AA310-AA330,
AA405-AA495,
AA415-AA425,
AA437-AA582.
AA99-AA120,
AA100-AA150,
AA190-AA210,
AA245-AA265,
AA290-AA305,
AA350-AA400,
AA400-AA450,
AA425-AA435,
AA95-AA110,
AA150-AA200,
AA200-AA250,
AA250-AA300,
AA300-AA350,
AA380-AA395,
AA405-AA415,
AA440-AA460,
9. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció ssCA216a DNS-el
ArgArgArgSerArgAsnLeuGlyLysValIleAspThrLeuThrCysGlyPheAlaAsp 1 CCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACGTGCGGCTTCGCCG
GGGCCGCATCCAGCGCGTTAAACCCATTCCAGTAGCTATGGGAATGCACGCCGAAGCGGC
LeuMetGlyTyrlleProLeuValGlyAlaProLeuGlyGlyAlaAlaArgAlaLeuAla 61 ACCTCATGGGGTACATACCGCTCGTCGGCGCCCCTCTTGGAGGCGCTGCCAGGGCCCTGG
TGGAGTACCCCATGTATGGCGAGCAGCCGCGGGGAGAACCTCCGCGACGGTCCCGGGACC
HisGlyValArgValLeuGluAspGlyValAsnTyrAlaThrGlyAsnLeuProGlyCys 121 CGCATGGCGTCCGGGTTCTGGAAGACGGCGTGAACTATGCAACAGGGAACCTTCCTGGTT
GCGTACCGCAGGCCCAAGACCTTCTGCCGCACTTGATACGTTGTCCCTTGGAAGGACCAA
SerPheSerllePheLeuLeuAlaLeuLeuSerCysLeuThrValProAlaSerAlaTyr 181 GCTCTTTCTCTATCTTCCTTCTGGCCCTGCTCTCTTGCTTGACTGTGCCCGCTTCGGCCT
CGAGAAAGAGATAGAAGGAAGACCGGGACGAGAGAACGAACTGACACGGGCGAAGCCGGA
GlnValArgAsnSerThrGlyLeuTyrHisYalThrAsnAspCysProAsnSerSerlle 241 ACCAAGTGCGCAACTCCACGGGGCTTTACCACGTCACCAATGATTGCCCTAACTCGAGTA
TGGTTCACGCGTTGAGGTGCCCCGAAATGGTGCAGTGGTTACTAACGGGATTGAGCTCAT
---------------------átfedés CAl67’tel ------------------ValTyrGluAlaAlaAspAlalleLeuHisThrProGlyCysValProCysValArgGlu
301 TTGTGTACGAAGCGGCCGATGCCATCCTGCACACTCCGGGGTGCGTCCCTTGCGTTCGTG AACACATGCTTCGCCGGCTACGGTAGGACGTGTGAGGCCCCACGCAGGGAACGCAAGCAC
GlyAsnAlaSerArgCysTrpValAlaMetThrProThrValAla 361 AGGGCAACGCCTCGAGGTGTTGGGTGGCGATGACCCCTACGGTGGCC TCCCGTTGCGGAGCTCCACAACCCACCGCTACTGGGGATGCCACCGG
9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polipeptid immunológiailag reagál az anti-HCV antitestekkel.
10. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció ssCA290á DNS-sel
LysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArgProGlnAspValLysPheProGlyGlyGly 1 AAAAAAAAAACAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGTGGCG ttttttttttgtttgcattgtggttggcagcgggtgtcctgcagttcaagggcccaccgc
GlnlleValGlyGlyValTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAla 61 GTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCG
CAGTCTAGCAACCACCTCAAATGAACAACGGCGCGTCCCCGGGATCTAACCCACACGCGC
ThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAla 121 CGACGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGTAGACGCCAGCCTATCCCCAAGG
GCTGCTCTTTCTGAAGGCTCGCCAGCGTTGGAGCTCCATCTGCGGTCGGATAGGGGTTCC
ArgArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyrGlyAsn 181 CTCGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCA
GAGCAGCCGGGCTCCCGTCCTGGACCCGAGTCGGGCCCATGGGAACCGGGGAGATACCGT
GluGlyCysGlyTrpAlaGlyTrpLeuLeuSerProArgGlySerArgProSerTrpGly 241 ATGAGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTCTCCCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGG
TACTCCCGACGCCCACCCGCCCTACCGAGGACAGAGGGGCACCGAGAGCCGGATCGACCC
ProThrAspProArgArgArgSerArgAsnLeuGlyLysValIleAspThrLeuThrCys 301 GCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACGT
CGGGGTGTCTGGGGGCCGCATCCAGCGCGTTAAACCCATTCCAGTAGCTATGGGAATGCA ΰΙγΡίιβΑΐαΑβρΕβαΜ^ΰΙγΤγΠΙβΡΓΟΙιβυνβΙΰΙγΑίαΡΓοΏβίΑΰΙγΰΙγΑΐΗΑΐΒ 361 GCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATACCGCTCGTCGGCGCCCCTCTTGGAGGCGCTG
CGCCGAAGCGGCTGGAGTACCCCATGTATGGCGAGCAGCCGCGGGGAGAACCTCCGCGAC
------------------------átfedés CA2t6.a->/al------------------ArgAlaLeuAlaHisGlyValArgValLeuGluAspGlyValAsnTyrAlaThrGlyAsn
421 CCAGGGCCCTGGCGCATGGCGTCCGGGTTCTGGAAGACGGCGTGAACTATGCAACAGGGA GGTCCCGGGACCGCGTACCGCAGGCCCAAGACCTTCTGCCGCACTTGATACGTTGTCCCT
LeuProGlyCysSerPheSerThrPhe 481 ACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTACCTTC TGGAAGGACCAACGAGAAAGAGATGGAAG
10 - a szóban forgó kódolt poliprotein teljes egésze legalább 40%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy
10. Eljárás egy szilárd hordozóhoz kötött polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polipeptidet szilárd hordozóhoz kötjük.
11. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 trans'zí'ácfó ag30a DNS-el #MetSerValValGlnProProGlyProProLeu #MetAlaLeuValOP
CGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCC
GCGTCTTTCGCAGATCGGTACCGCAATCATACTCACAGCACGTCGGAGGTCCTGGGGGGG
ProGlyGluProAM
TCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGAC
AGGGCCCTCTCGGTATCACCAGACGCCTTGGCCACTCATGTGGCCTTAACGGTCCTGCTG #MetProGlyAspLeuGlyValProProGlnAsp
CGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGA
GCCCAGGAAAGAACCTAGTTGGGCGAGTTACGGACCTCTAAACCCGCACGGGGGCGTTCT
OP AM GlyAlaCys
CysAM *
CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT
GACGATCGGCTCATCACAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCCACGAA
GluCysProGlyArgSerArgArgProCysThrMetSerThrAsnProLysProGlnLys
GCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAA
CGCTCACGGGGCCCTCCAGAGCATCTGGCACGTGGTACTCGTGCTTAGGATTTGGAGTTT
LysAsnLysArgAsnThrAsnArgArgProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGln
AAAAAAACAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGTC tttttttgtttgcattgtggttggcagcgggtgtcctgcagttcaagggcccaccgccag
IleValGlyGlyValTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThr
AGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGA
TCTAGCAACCACCTCAAATGAACAACGGCGCGTCCCCGGGATCTAACCCACACGCGCGCT
ArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArg
CGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGTAGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTC
GCTCTTTCTGAAGGCTCGCCAGCGTTGGAGCTCCATCTGCAGTCGGATAGGGGTTCCGAG
ArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGlu
------------------------ átfedés CA290a-val---------------GTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATG
CAGCCGGGCTCCCGTCCTGGACCCGAGTCGGGCCCATGGGAACCGGGGAGATACCGTTAC
GlyCysGlyTrpAlaGlyTrpLeuLeuSerProArgGlySerArgProSerTrpGlyPro
AGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTCTCCCCGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCC
TCCCGACGCCCACCCGCCCTACCGAGGACAGAGGGGCACCGAGAGCCGGATCGACCCCGG
ThrAspProArgArgArgSerArgAsnLeuGlyLysValIleAspThrLeuThrCysGly
11. Immunoassay kit, amely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet egy megfelelő tárolóban és a vizsgálathoz szükséges szokásos egyéb anyagokat tartalmazza egy vagy több megfelelő tárolóban.
12-2. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció CA 205a DNS-el
ValLeuGlyArgGluArgProCysGlyThrAlaOP AM GlyAlaCysGluCysProGly 1 GTCTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGG
CAGAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCCACGAACGCTCACGGGGCCC
ArgSerArgArgProCysThrMetSerThrAsnProLysProGlnArgLysThrLysArg 61 AGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGT
TCCAGAGCATCTGGCACGTGGTACTCGTGCTTAGGATTTGGAGTTTCTTTTTGGTTTGCA
AsnThrAsnArgArgProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnlleValGlyGly 121 AACACCAACCGTCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGTCAGATCGTTGGTGGA
TTGTGGTTGGCAGCGGGTGTCCTGCAGTTCAAGGGCCCACCGCCAGTCTAGCAACCACCT
ValiyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSer 181 GTTTACTTGTTGCCGCGCAGGGGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAAAGACTTCC
CAAATGAACAACGGCGCGTCCCCGGGATCTAACCCACACGCGCGCTGCTCTTTCTGAAGG
GluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGly 241 GAGCGGTCGCAACCTCGAGGTAGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTCGTCGGCCCGAGGGC
CTCGCCAGCGTTGGAGCTCCATCTGCAGTCGGATAGGGGTTCCGAGCAGCCGGGCTCCCG
ArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGluGlyCys 301 AGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCG
TCCTGGACCCGAGTCGGGCCCATGGGAACCGGGGAGATACCGTTACTCCCGACGC * - putativ iniciátor metionin kodon
12-1. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
601 CCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACGTGCG GGTGTCTGGGGGCCGCATCCAGCGCGTTAAACCCATTCCAGTAGCTATGGGAATGCACGC
Phe
661 GCTTC CGAAG * - hosszú HCV ORF kezdete
I “ nagy HCV poliprotein putativ első aminosava# = putativ kis kódolt peptidek ('melyek trarszedációs regulációs szerepet játszhatnak)
12. Immunoassay módszer hepatitis C vírus (HCV) polipeptid ellen ható antitestek kimutatására, melynek során
a) egy, az anti-HCV antitestekkel szemben immunológiailag reaktív első polipeptidet bocsátunk rendelkezésre, amely tulajdonságot egy HCV-poliprotein 1-149. aminosavain belül található legalább 10 egybefüggő aminosavból álló HCV-antigén-szekvenciát tartalmazó második polipeptiddel való kötődésben mutatott kompetícióval határoztunk meg,
b) az első polipeptidet egy biológiai mintával inkubáljuk az antitest-polipeptid komplex képződését lehetővé tevő körülmények között; és
c) kimutatunk bármely antitest/polipeptid komple5 xet, amely tartalmazza az említett polipeptidet, ahol a
HCV az következőkkel jellemezhető:
- egy pozitív szálú RNS-genom;
- a szóban forgó genom egy poliproteint kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz; és
13. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 transzláció 1¾ DNS-el
IProProOP #SerThrMetAsnHisSerProValArgAsnTyrCysLeuHisAlaGluSerValAM. Pro #LeuHisHisGluSerLeuProCysGluGluLeuLeuSerSerArgArgLysArgLeuAla
13. A 12. igénypont szerinti immunoassay, ahol az említett poliprotein legalább 70%-os homológiát mutat
20 a teljes poliproteinhez, amely szelektálva lett (i) a 17. ábrán bemutatott poliproteinből; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC)
25 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
14. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.. C07K 14/18 t ra rBzlá c i ó 16 jh DN S - se!
------átfedés 15e-vei ------------------------------GlyAlaCysTyrSerlleGluProLeuAspLeuProProIlelleGlnArgLeuHisGly
14. A 12. igénypont szerinti immunoassay, ahol az említett poliprotein legalább 80%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely szelektálva lett (i) a 17. ábrán bemutatott poliproteinből; vagy (ii) egy vírus30 izolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
15. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18 pill4a~15e DNS kombinált ORF
...................................... I6-I (pi14a/CAl6 7 b/CAl5 6 e/CA 84 a/CA5 9 a/K 9-1/12 f/14 i/1lb/7 f/7 e/ 8h/3 3c/40b/3 7b/3 5/36/81/3 2/3 3b/25c/l4c/8 f/33 f/3 3g/3 9c/ 35f/19g/26g & 15e)
ArgSerArgAsnLeuGlyLysValIleAspThrLeuThrCysGlyPheAlaAspLeuMet
AGGTCGCGCAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACGTGCGGCTTCGCCGACCTCATG
TCCAGCGCGTTAAACCCATTCCAGTAGCTATGGGAATGCACGCCGAAGCGGCTGGAGTAC
GlyTyrlleProLeuValGlyAlaProLeuGlyGlyAlaAlaArgAlaLeuAlaHisGly
GGGTACATACCGCTCGTCGGCGCCCCTCTTGGAGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCGCATGGC
CCCATGTATGGCGAGCAGCCGCGGGGAGAACCTCCGCGACGGTCCCGGGACCGCGTACCG
ValArgValLeuGluAspGlyValAsnTyrAlaThrGlyAsnLeuProGlyCysSerPhe
GTCCGGGTTCTGGAAGACGGCGTGAACTATGCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTCTTTC
CAGGCCCAAGACCTTCTGCCGCACTTGATACGTTGTCCCTTGGAAGGACCAACGAGAÁAG
SerllePheLeuLeuAlaLeuLeuSerCysLeuThrValProAlaSerAlaTyrGlnVal TCTATCTTCCTTCTGGCCCTGCTCTCTTGCTTGACTGTGCCCGCTTCGGCCTACCAAGTG AGATAGAAGGAAGACCGGGACGAGAGAACGAACTGACACGGGCGAAGCCGGATGGTTCAC
ArgAsnSerThrGlyLeuTyrHisValThrAsnAspCysProAsnSerSerlleValTyr
CGCAACTCCACGGGGCTTTACCACGTCACCAATGATTGCCCTAACTCGAGTATTGTGTAC
GCGTTGAGGTGCCCCGAAATGGTGCAGTGGTTACTAACGGGATTGAGCTCATAACACATG
GluAlaAlaAspAlalleLeuHisThrProGlyCysValProCysValArgGluGlyAsn
GAGGCGGCCGATGCCATCCTGCACACTCCGGGGTGCGTCCCTTGCGTTCGTGAGGGCAAC
CTCCGCCGGCTACGGTAGGACGTGTGAGGCCCCACGCAGGGAACGCAAGCACTCCCGTTG
AlaSerArgCysTrpValAlaMetThrProThrValAlaThrArgAspGlytysLeuPro
GCCTCGAGGTGTTGGGTGGCGATGACCCCTACGGTGGCCACCAGGGATGGCAAACTCCCC
CGGAGCTCCACAACCCACCGCTACTGGGGATGCCACCGGTGGTCCCTACCGTTTGAGGGG
AlaThrGlnLeuArgArgHisIleAspLeuLeuValGlySerAlaThrLeuCysSerAla
GCGACGCAGCTTCGACGTCACATCGATCTGCTTGTCGGGAGCGCCACCCTCTGTTCGGCC
CGCTGCGTCGAAGCTGCAGTGTAGCTAGACGAACAGCCCTCGCGGTGGGAGACAAGCCGG
LeuTyrValGlyAspLeuCysGlySerValPheLeuValGlyGlnLeuPheThrPheSer
CTCTACGTGGGGGACCTATGCGGGTCTGTCTTTCTTGTCGGCCAACTGTTCACCTTCTCT
GAGATGCACCCCCTGGATACGCCCAGACAGAAAGAACAGCCGGTTGACAAGTGGAAGAGA
ProArgArgHisTrpThrThxGlnGlyCysAsnCysSerlleTyrProGlyHisIleThr
CCCAGGCGCCACTGGACGACGCAAGGTTGCAATTGCTCTATCTATCCCGGCCATATAACG
GGGTCCGCGGTGACCTGCTGCGTTCCAACGTTAACGAGATAGATAGGGCCGGTATATTGC
GlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMet
GGTCACCGCATGGCATGGGATATGATGATGAACTGGTCCCCTACGACGGCGTTGGTAATG
CCAGTGGCGTACCGTACCCTATACTACTACTTGACCAGGGGATGCTGCCGCAACCATTAC
AlaGlnLeuLeuArglleProGlnAlalleLeuAspMetlleAlaGlyAlaHisTrpGly
GCTCAGCTGCTCCGGATCCCACAAGCCATCTTGGACATGATCGCTGGTGCTCACTGGGGA
CGAGTCGACGAGGCCTAGGGTGTTCGGTAGAACCTGTACTAGCGACCACGAGTGACCCCT
ValLeuAlaGlylleAlaTyrPheSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuValVal
GTCCTGGCGGGCATAGCGTATTTCTCCATGGTGGGGAACTGGGCGAAGGTCCTGGTAGTG
CAGGACCGCCCGTATCGCATAAAGAGGTACCACCCCTTGACCCGCTTCCAGGACCATCAC
LeuLeuLeuPheAlaGlyValAspAlaGluThrHisValThrGlyGlySerAlaGlyHis
CTGCTGCTATTTGCCGGCGTCGACGCGGAAACCCACGTCACCGGGGGAAGTGCCGGCCAC
GACGACGATAAACGGCCGCAGCTGCGCCTTTGGGTGCAGTGGCCCCCTTCACGGCCGGTG
16-1. ábra
HU 225 068 B1
Int. Cl.: C07K 14/18
ThrYalSerGlyPheValSerLeuLeuAlaProGlyAlaLysGlnAsnValGlnLeuIle
ACTGTGTCTGGATTTGTTAGCCTCCTCGCACCAGGCGCCAAGCAGAACGTCCAGCTGATC
TGACACAGACCTAAACAATCGGAGGAGCGTGGTCCGCGGTTCGTCTTGCAGGTCGACTAG
AsnThrAsnGlySerTrpHisLeuAsnSerThrAlaLeuAsnCysAsnAspSerLeuAsn
AACACCAACGGCAGTTGGCACCTCAATAGCACGGCCCTGAACTGCAATGATAGCCTCAAC
TTGTGGTTGCCGTCAACCGTGGAGTTATCGTGCCGGGACTTGACGTTACTATCGGAGTTG
ThrGlyTrpLeuAlaGlyLeuPheTyrHisHisLysPheAsnSerSerGlyCysProGlu
ACCGGCTGGTTGGCAGGGCTTTTCTATCACCACAAGTTCAACTCTTCAGGCTGTCCTGAG
TGGCCGACCAACCGTCCCGAAAAGATAGTGGTGTTCAAGTTGAGAAGTCCGACAGGACTC
ArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGlyProIleSerTyr
AGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGGGCCCTATCAGTTAT
TCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCCCGGGATAGTCAATA
AlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrProProLysProCys
GCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACCCCCCAAAACCTTGC
CGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGGGGGGTTTTGGAACG
GlylleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCysPheThrProSerProVal
GGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCACTCCCAGCCCCGTG
CCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGTGAGGGTCGGGGCAC
ValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGlyGluAsnAspThr
GTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGGGTGAAAATGATACG
CACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCCCACTTTTACTATGC
AspValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPheGlyCysThrTrp
GACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGTTCGGTTGTACCTGG
CTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCAAGCCAACATGGACC
MetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysValIleGlyGlyAla
ATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTGTCATCGGAGGGGCG
TACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACACAGTAGCCTCCCCGC
GlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisProAspAlaThrTyr
GGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATCCGGACGCCACATAC
CCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAGGCCTGCGGTGTATG
SerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAspTyrProTyrArg
TCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCGACTACCCGTATAGG
AGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGCTGATGGGCATATCC
LeuTrpHisTyrProCysThrlleAsnTyrThrllePheLysIleArgMetTyrValGly
CTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGA
GAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCT
GlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGluArgCysAspLeu
GGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTG
CCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGAC
GluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThrGlnTrpGlnVal
GAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTC
CTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAG
LeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIleHisLeuHisGln
CTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAG
GAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTC
AsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAlaSerTrpAlalle
AACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATT
TTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAA
Ly sTrpG luTy rVa lValLeuLeuPheLeuLeuLeuAl aAspAl aArgValCy s S e rCy s AAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGC
15. A 12. igénypont szerinti immunoassay, ahol az
35 említett poliprotein legalább 90%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely szelektálva lett (i) a 17. ábrán bemutatott poliproteinből; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az
40 American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
16. A 12-15. igénypontok bármelyike szerinti immunoassay, ahol az aminosavak a 17. ábra szerinti poliprotein 1-449. számú aminosavaiból lettek kivá45 lasztva.
17. A 12-16. igénypontok bármelyike szerinti immunoassay, ahol az említett első polipeptid egy olyan HCV-antigén-szekvenciát tartalmaz, amely a 17. ábra szerinti poliprotein 1-449. számú aminosavaiból áll.
50
18. A 12-17. igénypontok bármelyike szerinti immunoassay, ahol a biológiai minta emberi vér, szérum vagy plazma.
19. Eljárás polinukleotid előállítására, amely lényegében izolált alakban van, és amely a HCV-ge55 nom-szekvenciáí vagy annak komplementerét tartalmazza, amely szelektíven hibridizálható a HCV-genom -319-1348 tartományában található nukleotidhoz vagy annak komplementeréhez, ahol a HCV a következőkkel jellemezhető:
60 - egy pozitív szálú RNS-genom;
HU 225 068 Β1
- a szóban forgó genom egy poliproteint kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz; és
- a szóban forgó kódolt poliprotein teljes egésze legalább 40%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat polimerizáljuk, és izoláljuk a polipeptidet.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 70%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
21. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 80%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
22. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a szóban forgó poliprotein legalább 90%-os homológiát mutat a teljes poliproteinhez, amely (i) a 17. ábrán bemutatott poliprotein; vagy (ii) egy vírusizolátum poliproteinje, amelynek genomjából készített cDNS-ek egy lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
23. A 19-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polinukleotidban a HCV-genom-szekvencia vagy komplementere a HCV -319-től a 1348-ig vagy a -319-től a -1-ig terjedő nukleotidtartományban található.
24. A 19-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol polinukleotidban a HCV-genom-szekvencia vagy komplementere a 11., 12. vagy 17. ábrán található szekvenciák közül választható ki.
25. A 19-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polinukleotid DNS.
26. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a polinukleotid egy próba vagy egy primer a DNS-szintézishez.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, ahol a polinukleotid egy jelzett próba.
28. Biológiai minták analízisére alkalmas kit HCV-polinukleotidok kimutatására, amely a 18-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polinukleotidot és a vizsgálathoz szükséges szokásos egyéb anyagokat tartalmazza megfelelő tartályban.
29. Eljárás HCV-nukleinsavak in vitro kimutatására egy mintában oly módon, hogy
a) a 19-27. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotidot alkalmazzuk,
b) az említett polinukleotidot olyan körülmények között reagáltatjuk az említett mintával, hogy a polinukleotidduplexek szelektív képződését biztosítsuk az említett polinukleotid és bármely HCV-nukleinsav vagy HCV cDNS között az említett mintában, és
c) az említett polinukleotidot tartalmazó bármely polinukleotidduplexet kimutatjuk.
30. Eljárás egy HCV-polinukleotid egy mintában való alkalmazására, melynek során
a) a HVC polinukleotidot egy DNS-polimeráz és legalább egy 19-27. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotid felhasználásával amplifikáljuk; és
b) az alkalmazott polinukleotidot kimutatjuk.
31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett minta emberi vér, szérum vagy plazma.
32. Eljárás rekombináns vektor előállítására, amely az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet kódoló valamely polinukleotidszekvenciát tartalmazza, ahol az említett, polipeptidet kódoló szekvencia működőképesen kapcsolódik a polipeptid expresszálására képes kontrollszekvenciához.
33. Eljárás a 32. igénypont szerinti vektor előállítására, ahol az említett polinukleotid egy DNS.
34. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a 32. vagy 33. igénypont szerinti vektorral transzformáljuk.
35. Eljárás egy HCV-polipeptid készítésére, ahol a 34. igénypont szerint előállított gazdasejtet olyan körülmények között inkubáljuk, amelyek lehetővé teszik az említett, a polipeptidet kódoló szekvencia expresszálását, és kinyerjük a polipeptidet.
36. Eljárás egy HCV-polipeptid készítésére, melynek során az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet kémiai úton szintetizáljuk.
37. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, melynek során
a) a 19-25. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotidot, vagy
b) az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet, és
c) egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot összekeverünk.
38. Eljárás a 32. vagy 33. igénypont szerint előállított vektorral transzformált gazdasejt előállítására, melynek során
a) transzformálásra képes gazdasejtet,
b) egy rekombináns vektort alkalmazunk,
c) az a)-t és a b)-t inkubáljuk a gazdasejt vektorral történő transzformálásának biztosítására szolgáló körülmények között.
39. Eljárás rekombináns vektor előállítására, melynek során
a) a 19-27. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns polinukleotiddal transzformált gazdasejtet alkalmazzuk,
b) a gazdasejtből izoláljuk az említett polinukleotidot.
40. Eljárás egy polinukleotidpróba előállítására, melynek során a 19-27. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotidot kémiai úton szintetizáljuk.
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
12f DNS transzláció
IlePheLysIleArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsn 1 CCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCA
GGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGT
TrpThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeu 61 ACTGGACGCGGGGCG AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGT
TGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCA
LeuLeuThrThrThrGlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeu 121 TACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCT
ATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGA
SerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyVal 181 TGTCC ACCGGCCTC ATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGT ACGGGG
ACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCC
GlySerSerlleAlaSerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeu 241 TGGGGTC AAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTC
ACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAG
LeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGlu 301 TGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGG
ACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCC
AlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeu 361 AGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTC
TCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAG
Val
421 TTGTATC AACATAG
15 lambda gt-11 cDNS-könyvtárban az American Type Culture Collectionnél (ATCC) 40 394 letéti számon lettek elhelyezve.
16-2. ábra
HU 225 068 Β1
Int. Cl.: C07K 14/18
TTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACG
LeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeu
TTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTT
AACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAA
AsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuValPhePheCysPhe
AATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTT
TTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAA
AlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPheTyrGlyMetTrp GCATGG TATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGG TCTACACCTTCTACGGG ATGTGG CGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACC
ProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluVal
CCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTG
GGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCAC
AlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyr
GCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATAT
CGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATA
TyrLysArgTyrlleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeuThrkrgValGlu
TACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAA
ATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTT
AlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArgAspAlaValIle
GCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATC
CGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAG
LeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLysLeuLeuLeuAla
TTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCC
HU9002814A 1989-03-17 1990-03-15 Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh HU225068B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32533889A 1989-03-17 1989-03-17
US34133489A 1989-04-20 1989-04-20
US35500289A 1989-05-18 1989-05-18
PCT/US1990/001348 WO1990011089A1 (en) 1989-03-17 1990-03-15 Nanbv diagnostics and vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU225068B1 true HU225068B1 (en) 2006-05-29

Family

ID=27406397

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU902814A HUT54896A (en) 1989-03-17 1990-03-15 Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv
HU9002814A HU225068B1 (en) 1989-03-17 1990-03-15 Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
HU95P/P00746P HU211981A9 (en) 1989-03-17 1995-07-03 Nanbv-diagnostics and vaccine

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU902814A HUT54896A (en) 1989-03-17 1990-03-15 Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00746P HU211981A9 (en) 1989-03-17 1995-07-03 Nanbv-diagnostics and vaccine

Country Status (19)

Country Link
EP (3) EP1034785A3 (hu)
JP (13) JP2656995B2 (hu)
KR (2) KR0185373B1 (hu)
AT (1) ATE286979T1 (hu)
AU (3) AU666767B2 (hu)
CA (1) CA2012482C (hu)
DE (3) DE388232T1 (hu)
DK (1) DK0388232T3 (hu)
ES (2) ES2228297T1 (hu)
FI (3) FI106211B (hu)
GR (1) GR910300016T1 (hu)
HU (3) HUT54896A (hu)
IE (2) IE20060608A1 (hu)
IL (1) IL93764A (hu)
MY (1) MY110260A (hu)
NO (1) NO303941B1 (hu)
PT (1) PT93480B (hu)
UA (1) UA50829C2 (hu)
WO (1) WO1990011089A1 (hu)

Families Citing this family (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523215A (en) * 1985-03-28 1996-06-04 Chiron Corporation Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US6861212B1 (en) 1987-11-18 2005-03-01 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
US5714596A (en) * 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
US5712088A (en) * 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
KR0185373B1 (ko) * 1989-03-17 1999-05-01 로버트 피. 블랙버언 Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
DK0398748T3 (da) * 1989-05-18 2002-03-18 Chiron Corp NANBV-diagnostika: polynukleotider anvendelige til screening for hepatitis C virus
EP0416725A3 (en) * 1989-07-14 1991-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blood-borne non-a, non-b hepatitis specific protein, dna encoding it, and process for its production
WO1991004262A1 (en) * 1989-09-15 1991-04-04 National Institute Of Health Of Japan New hcv isolates
US5372928A (en) * 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
AU642942B2 (en) 1989-12-18 1993-11-04 Wellcome Foundation Limited, The Viral agent
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
US5308750A (en) * 1989-12-22 1994-05-03 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to putative HCV E2/NS1 proteins and methods for using same
CA2032907C (en) * 1989-12-22 2002-05-14 Richard R. Lesniewski Hepatitis c assay
EP0435229A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-03 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. DNA of non-A, non-B hepatitis virus gene, its clone and use thereof
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5747239A (en) * 1990-02-16 1998-05-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and preventions thereof as vaccines
US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
US5582968A (en) * 1990-02-16 1996-12-10 United Biomedical, Inc. Branched hybrid and cluster peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
KR100206150B1 (ko) † 1990-04-04 1999-07-01 로버트 피. 블랙버언 항-에이치씨브이 항체에 대한 면역분석용 씨형 간염 바이러스(에이치디브이)항원의 조합체
ATE270326T1 (de) * 1990-04-04 2004-07-15 Chiron Corp Protease von hepatitis-c-virus
AU7679491A (en) * 1990-04-04 1991-10-30 Protos, Inc. Hepatitis c virus protease inhibitors
ES2152922T3 (es) * 1990-04-06 2001-02-16 Genelabs Tech Inc Epitopos del virus de la hepatitis c.
CA2044296A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-13 Hiroaki Okamoto Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus
JP3050395B2 (ja) * 1990-06-12 2000-06-12 国立感染症研究所長 Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法
EP0933426A1 (en) * 1990-06-25 1999-08-04 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University Non-a, non-b hepatitis virus genomic cdna fragments and antigen polypeptides
US5747339A (en) 1990-06-25 1998-05-05 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide
FI913068A (fi) * 1990-06-25 1991-12-26 Univ Osaka Res Found Non-a-, non-b-hepatitisviruspartiklar.
US5620843A (en) * 1990-06-30 1997-04-15 Akzo Nobel N.V. Non-A non-B sequences
EP0468657A3 (en) * 1990-07-09 1992-02-05 Tonen Corporation Non-a non b hepatitis-specific antigen and its use in hepatitus diagnosis
ATE150086T1 (de) * 1990-07-11 1997-03-15 Shionogi & Co Cdns-sequenz und detektion des hepatitis c-virus
CA2047792C (en) * 1990-07-26 2002-07-02 Chang Y. Wang Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines
JP2714255B2 (ja) * 1990-08-10 1998-02-16 カイロン コーポレイション Ｎａｎｂｖ診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド
JP3114731B2 (ja) * 1990-08-14 2000-12-04 国立感染症研究所長 Ｃ型肝炎ウイルス抗体検出用ペプチド抗原及びその使用方法
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
US6172189B1 (en) * 1990-08-24 2001-01-09 Abbott Laboratories Hepatitis C assay utilizing recombinant antigens
KR930702365A (ko) * 1990-08-25 1993-09-08 존 더블유. 아담슨 비-a형, 비-b형 간염 바이러스 항원, 진단 방법 및 백신
US7863008B2 (en) 1990-08-25 2011-01-04 Bioprocess Pty Ltd. Method for detecting NANBV associated seroconversion
DE69106998T2 (de) * 1990-10-05 1995-05-24 Akzo Nobel Nv Mit Antikörper gegen Hepatitis-Virus non-A, non-B immunochemisch reagierende Peptide.
DK0770679T4 (da) * 1990-11-03 2010-05-10 Siemens Healthcare Diagnostics HCV-specifikke peptider, sammensætninger dertil og anvendelse deraf
US5753430A (en) * 1990-11-07 1998-05-19 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to hepatitis C virus and method for using same
AU662503B2 (en) * 1990-11-07 1995-09-07 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to hepatitis C virus and method for using same
ES2314334T3 (es) * 1990-11-08 2009-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Asialoglicoproteinas del virus de la hepatitis c.
EP0485209A1 (en) * 1990-11-08 1992-05-13 Immuno Japan Inc. Non A, non B hepatitis virus related antigen, antibody detection systems, polynucleotides and polypeptides
EP0842947B2 (en) * 1990-11-08 2009-03-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Hepatitis C virus asialoglycoproteins
US6274148B1 (en) 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
JP2945759B2 (ja) 1990-11-08 1999-09-06 カイロン コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質
EP0516859A1 (en) * 1990-11-29 1992-12-09 Toray Industries, Inc. Non-a non-b hepatitis virus antigen protein
CA2056646A1 (en) * 1990-11-29 1992-05-30 Shunji Mishiro Non-a, non-b hepatitis related nucleic acids, antigens, antibodies and their detection reagents
DK0754704T3 (da) * 1990-12-14 2000-04-03 Innogenetics Nv Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer mod hepatitis c-virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE4041304A1 (de) * 1990-12-21 1992-06-25 Mikrogen Molekularbiol Entw Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
KR930703361A (ko) * 1991-01-31 1993-11-29 찰스 엠. 브룩 추정의 c형 간염 바이러스(hcv) 외막 영역에 대한 모노클로날 항체 및 이의 사용 방법
DE69200512T2 (de) * 1991-03-01 1995-03-09 Akzo Nv Mit Antikörper gegen Hepatitis non-A, non-B-Virus immunochemische reaktive Peptide.
ES2098511T3 (es) * 1991-03-26 1997-05-01 Dade Int Inc Procedimiento de diagnosis de hepatitis no-a no-b.
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
EP0510952A1 (en) * 1991-04-26 1992-10-28 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus
US6190864B1 (en) 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
PL169880B1 (pl) * 1991-05-08 1996-09-30 Chiron Corp Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia watroby C PL PL PL
FR2677372B1 (fr) 1991-06-06 1994-11-10 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques.
BR9206131A (pt) * 1991-06-10 1995-05-02 Lucky Ltd Hepatite C: diagnóstico e vacinas
CA2070952A1 (en) * 1991-06-11 1992-12-12 Makoto Seki Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
JP3350729B2 (ja) * 1991-06-13 2002-11-25 デイド、ベーリング、インコーポレイテッド 非ａ非ｂ肝炎のためのイムノアッセイ
JP3516681B2 (ja) * 1991-06-24 2004-04-05 カイロン コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド
IT1249685B (it) * 1991-07-19 1995-03-09 Sorin Biomedica Spa Medoto per la rivelazione di anticorpi contro il virus dell'epatite c e corredi per la sua realizzazione
IT1249684B (it) * 1991-07-19 1995-03-09 Sorin Biomedica Spa Epitopi della proteina env del virus dell'epatite c.
CA2116026C (en) * 1991-08-21 2004-11-23 Suresh M. Desai Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens to c-100 region
WO1993004084A1 (en) * 1991-08-21 1993-03-04 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to putative hcv ns5 proteins and methos for using same
EP0600000A4 (en) * 1991-08-21 1995-03-01 Abbott Lab HEPATITIS C DETECTION TEST USING RECOMBINANT ANTIGENS OF THE NS5 REGION.
AU2513592A (en) * 1991-08-21 1993-03-16 Abbott Laboratories Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens to ns1
ES2198514T3 (es) * 1991-08-27 2004-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c.
EP0532258A2 (en) * 1991-09-09 1993-03-17 Immuno Japan Inc. Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes
ATE228564T1 (de) * 1991-09-13 2002-12-15 Chiron Corp Zusammensetzung aus mehreren immunreaktiven hepatitis-c-virus-polypeptiden
ATE191792T1 (de) † 1991-09-16 2000-04-15 Abbott Lab Verfahren zur detektion von hepatitis c
WO1993006488A1 (en) * 1991-09-16 1993-04-01 Genelabs Technologies, Inc. Peptide based hepatitis c virus immunoassays
ZA927243B (en) * 1991-10-07 1994-01-26 Akzo Nv Non-A, Non-B peptides
JP3158177B2 (ja) * 1991-10-08 2001-04-23 国立感染症研究所長 Ｃ型肝炎診断薬
ZA927837B (en) * 1991-10-15 1994-03-11 Akzo Nv Monoclonal antibodiesto hepatitis C virus
AU3063992A (en) * 1991-11-07 1993-06-07 Dade International Inc. Epitope mapping ot the c33c region of hcv
JP3688290B2 (ja) * 1991-11-21 2005-08-24 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス検査
WO1993011158A2 (en) * 1991-12-06 1993-06-10 Akzo Nobel N.V. Non-a, non-b peptides
US5811246A (en) * 1991-12-17 1998-09-22 The Research Foundation Of State University Of New York Process for immobilization onto the surfaces of ELISA plates of a compound carrier complex and for immunization
JP3439209B2 (ja) * 1992-01-31 2003-08-25 アボツト・ラボラトリーズ Ｈｃｖ蛋白のための哺乳動物発現システム
US6667387B1 (en) 1996-09-30 2003-12-23 N.V. Innogenetics S.A. HCV core peptides
US6709828B1 (en) 1992-03-06 2004-03-23 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them
EP0589004B2 (en) 1992-03-06 2004-05-06 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes of hcv
US5866139A (en) * 1992-06-04 1999-02-02 Institut Pasteur Nucleotide and peptide sequences of a hepatitis C virus isolate, diagnostic and therapeutic applications
JPH05344899A (ja) * 1992-06-11 1993-12-27 Kokuritsu Yobou Eisei Kenkyusho Ｃ型肝炎ウイルス外被タンパク質の産生法
UA39944C2 (uk) 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
KR100317509B1 (ko) 1992-07-16 2002-02-20 야스모토 토루 C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
JPH06311885A (ja) * 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
DE69330372T2 (de) * 1992-09-10 2002-03-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN FüR DIE BEHANDLUNG VON MIT HEPATITIS C VIREN ASSOZIIERTEN KRANKHEITEN
US6423489B1 (en) * 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
US5922857A (en) * 1992-09-28 1999-07-13 Chiron Corporation Methods and compositions for controlling translation of HCV proteins
ES2256837T3 (es) * 1992-09-28 2006-07-16 Chiron Corporation Procedimientos y composiciones para el control de la traduccion de las proteinas del vch.
AU5142393A (en) * 1992-09-29 1994-04-26 Cedars-Sinai Medical Center One step rna and combined one step rna and dna polymerase chain reaction for detection of rare rna or rna and dna
JPH06153959A (ja) * 1992-10-16 1994-06-03 Evernew Biotec Inc Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
AU6769594A (en) * 1993-04-22 1994-11-08 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis c virus immunodiagnostic antigens and antibodies
KR100330278B1 (ko) 1993-05-10 2002-08-19 카이론 코포레이션 간염c바이러스의타이핑방법및사용시약
EP1421951A3 (en) 1993-05-12 2005-10-05 Chiron Corporation Conserved motif of hepatitis C virus E2/NS1 region
US5610009A (en) * 1994-01-28 1997-03-11 Abbott Laboratories Mammalian expression systems for hepatitis C virus envelope genes
US5709995A (en) 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US6511812B1 (en) 1994-05-09 2003-01-28 Abbott Laboratories Method and test kit for use in improving immunoassay specificity
WO1995030902A1 (en) * 1994-05-09 1995-11-16 Abbott Laboratories Method and reagents useful for improving immunoassay specificity
EP0759979A4 (en) * 1994-05-10 1999-10-20 Gen Hospital Corp ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS
JP3217600B2 (ja) 1994-07-12 2001-10-09 株式会社先端生命科学研究所 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ
DK0773957T3 (da) 1994-07-29 2005-10-24 Chiron Corp Udskilt hepatitis C-virus-E1/E2-kompleks opnået fra C-terminalt trunkerede E1- og E2-polypeptider
WO1996004301A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Chiron Corporation Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same
PT721505E (pt) * 1994-07-29 2002-10-31 Innogenetics Nv Proteinas do envelope do virus da hepatite c purificadas para utilizacao em diagnostico e terapeutica
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
US6235888B1 (en) 1994-10-05 2001-05-22 The General Hospital Corporation Hepatitis C virus vaccine
EP0804584B2 (en) 1994-10-21 2008-07-09 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotype 7 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
DE69617396T2 (de) * 1995-01-16 2002-09-05 Northern Sydney Area Health Service, St. Leonards T-Zellen beeinflussende Peptide
KR970010787A (ko) * 1995-08-14 1997-03-27 성재갑 B형 간염 바이러스 표면항원과 c형 간염 바이러스 외피 단백질의 융합 단백질 및 이를 포함하는 혼합 백신
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
GB9517926D0 (en) 1995-09-01 1995-11-01 Biocine Spa Binding protein
US5837442A (en) 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
US5851759A (en) * 1996-04-19 1998-12-22 Chiron Corporation Heteroduplex tracking assay (HTA) for genotyping HCV
IT1284635B1 (it) * 1996-04-24 1998-05-21 Clonit Spa Metodo per la rivelazione di acidi nucleici amplificati e kit per il suo uso.
JP3715027B2 (ja) 1996-05-07 2005-11-09 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
FR2760458B1 (fr) 1997-03-05 1999-04-23 Bio Merieux Peptide structural antigenique, composes antigenique et immunogene et utilisations dans la detection, la prevention et le traitement d'une infection par le vhc
WO1998050556A2 (en) 1997-05-06 1998-11-12 Chiron Corporation Intracellular production of hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides
DE69841322D1 (de) 1997-10-06 2010-01-07 Novartis Vaccines & Diagnostic Hepatitis c rezeptorprotein cd81
EP1154793B1 (en) 1999-02-26 2010-09-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of bioadhesives and adjuvants for the mucosal delivery of antigens
US8206749B1 (en) 1999-02-26 2012-06-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
US7196066B1 (en) 1999-11-03 2007-03-27 Powderject Vaccines, Inc. DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens
GB9927320D0 (en) * 1999-11-18 2000-01-12 Chiron Spa Exosome separation
JP4837229B2 (ja) 2000-06-15 2011-12-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ
EP1178116A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-06 Hybrigenics S.A. Sid nucleic acids and polypeptides selected from a pathogenic strain of hepatitis C virus and applications thereof
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
AU9215101A (en) 2000-08-17 2002-02-25 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
JP4608210B2 (ja) 2001-05-31 2011-01-12 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド キメラアルファウイルスレプリコン粒子
US7196183B2 (en) 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US7049060B2 (en) * 2001-11-05 2006-05-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV anti-core monoclonal antibodies
AU2003215316A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
US7598421B2 (en) 2002-05-08 2009-10-06 Ucl Biomedica Plc Materials for the delivery of biologically-active material to cells
FR2839555B1 (fr) 2002-05-10 2007-07-27 Bio Rad Pasteur Procede de detection simultanee d'un antigene et d'un anticorps d'un microorganisme infectieux
FR2839722A1 (fr) 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
ATE410693T1 (de) 2002-09-09 2008-10-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Hcv-test
US7927840B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
US7115374B2 (en) 2002-10-16 2006-10-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting West Nile virus
EP2263687B1 (en) 2002-12-27 2015-03-25 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions containing phospholipid
US7695725B2 (en) 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
PT1592441E (pt) 2003-02-06 2012-05-21 Aduro Biotech Listeria atenuada relativamente à entrada em células não patogénicas, vacinas compreendendo a listeria e métodos para sua utilização
KR101173871B1 (ko) 2003-02-06 2012-08-16 앤저 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 변형된 독립생존 미생물, 백신 조성물 및 그것의 사용방법
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
ES2596753T3 (es) 2003-08-29 2017-01-11 Fujirebio Europe N.V. Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo
WO2006070028A1 (es) * 2004-12-23 2006-07-06 Berthet Francois Xavier Composiciones y procedimientos para detectar infección patógena
US7842289B2 (en) 2003-12-24 2010-11-30 Aduro Biotech Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
EP2612679A1 (en) 2004-07-29 2013-07-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
JP5070055B2 (ja) 2004-08-27 2012-11-07 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 改変タンパク分解性切断部位を有するｈｃｖ多エピトープ融合抗原およびその使用
PL1797112T3 (pl) * 2004-09-29 2011-04-29 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitory wirusa zapalenia wątroby typu C
CA2618429A1 (en) 2005-05-25 2007-03-22 Tripep Ab A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene
WO2008114622A1 (ja) 2007-03-20 2008-09-25 Terumo Kabushiki Kaisha 酸化発色化合物またはその塩およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具
US8071561B2 (en) 2007-08-16 2011-12-06 Chrontech Pharma Ab Immunogen platform
JP2011506334A (ja) 2007-12-07 2011-03-03 ノバルティス アーゲー 免疫応答を誘導するための組成物
WO2009130588A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
KR20110027695A (ko) 2008-05-19 2011-03-16 아두로 바이오테크 Ｐｒｆａ＊ 돌연변이 리스테리아를 포함하는 조성물 및 그것의 사용방법
WO2010103017A2 (en) 2009-03-09 2010-09-16 William Henry Hapten-carrier conjugates with bacterial toxins having a signal peptide as carrier and their use in immunogenic compositions
EP2451475A2 (en) 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
EP3449910A1 (en) 2010-07-06 2019-03-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Cationic oil-in-water emulsions
RU2606846C2 (ru) 2011-07-06 2017-01-10 Новартис Аг Эмульсии типа "масло в воде", которые содержат нуклеиновые кислоты
US9636410B2 (en) 2011-07-06 2017-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Cationic oil-in-water emulsions
AU2012322704B2 (en) 2011-10-11 2017-09-07 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic RNA molecules
EP2994754B1 (en) * 2013-05-10 2018-07-25 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Compositions and methods for simultaneous detection of hcv antigen/antibody
RU2568872C1 (ru) * 2014-10-15 2015-11-20 Игорь Геннадьевич Сивов Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с
AU2014412513B2 (en) 2014-11-27 2021-04-08 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Devices and methods for detecting norovirus on surfaces
DK3274478T3 (da) 2015-03-27 2020-11-23 Ortho Clinical Diagnostics K K Hcv-ns4a/modificerede ns3-polypeptider og anvendelser deraf
US20200377606A1 (en) 2016-04-18 2020-12-03 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4542016A (en) * 1981-03-27 1985-09-17 Institut Merieux Non-a non-b hepatitis surface antigen useful for the preparation of vaccines and methods of use
US4702909A (en) * 1982-05-05 1987-10-27 Louisiana State University A & M Non-A, non-B hepatitis antigen, antigen compositions, vaccine and diagnostic reagent
US4870026A (en) * 1982-09-16 1989-09-26 The General Hospital Corporation Non-A, non-B. hepatitis, virus, methods of identification purification, characterization, diagnosis and immunization
US5032511A (en) * 1987-03-31 1991-07-16 Mitsubishi Kasei Corporation DNA fragments coding for antigens specific to non-A non-B hepatitis, expression vectors containing said DNA fragments, transformants and process for producing said antigens
AU624105B2 (en) * 1987-11-18 1992-06-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nanbv diagnostics and vaccines
HU220204B (hu) * 1987-11-18 2001-11-28 Chiron Corp. HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet
WO1989012641A1 (en) * 1988-06-17 1989-12-28 Genelabs Incorporated Enterically transmitted non-a/non-b hepatitis viral agent
EP0423239A4 (en) * 1988-07-06 1992-05-20 Genelabs Incorporated Post-transfusion, non-a, non-b hepatitis virus and antigens
JP2696116B2 (ja) * 1988-09-30 1998-01-14 財団法人阪大微生物病研究会 非ａ非ｂ肝炎患者の血清と抗原抗体反応するペプチド、及び該ペプチドをコードするｄｎａ
KR0185373B1 (ko) * 1989-03-17 1999-05-01 로버트 피. 블랙버언 Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용

Also Published As

Publication number Publication date
DE388232T1 (de) 1991-05-02
AU4750693A (en) 1993-12-16
CA2012482C (en) 2004-11-23
JPH10295389A (ja) 1998-11-10
PT93480A (pt) 1990-11-07
IL93764A (en) 2003-12-10
JPH04504715A (ja) 1992-08-20
CA2012482A1 (en) 1990-09-17
JP2009275046A (ja) 2009-11-26
EP1034785A2 (en) 2000-09-13
JP2656995B2 (ja) 1997-09-24
AU5278390A (en) 1990-10-22
EP0388232B1 (en) 2005-01-12
KR0167125B1 (en) 1999-05-01
ATE286979T1 (de) 2005-01-15
HU211981A9 (en) 1996-01-29
IE20060608A1 (en) 2006-09-20
IE20060607A1 (en) 2006-09-20
EP0388232A1 (en) 1990-09-19
FI106211B (fi) 2000-12-15
KR920700045A (ko) 1992-02-19
JP2006111632A (ja) 2006-04-27
JPH10309197A (ja) 1998-11-24
EP1034785A3 (en) 2004-06-02
EP1394255A3 (en) 2004-06-02
AU666767B2 (en) 1996-02-22
NO904712D0 (no) 1990-10-30
DE69034182D1 (de) 2005-03-03
ES2020152A4 (es) 1991-08-01
WO1990011089A1 (en) 1990-10-04
JPH09215497A (ja) 1997-08-19
JP2007332148A (ja) 2007-12-27
EP0388232B9 (en) 2005-10-26
AU666766B2 (en) 1996-02-22
FI20002014A (fi) 2000-09-13
UA50829C2 (uk) 2002-11-15
DK0388232T3 (da) 2005-02-07
FI107610B (fi) 2001-09-14
ES2228297T1 (es) 2005-04-16
PT93480B (pt) 1997-07-31
JPH07145194A (ja) 1995-06-06
JP2693908B2 (ja) 1997-12-24
JP2009292819A (ja) 2009-12-17
EP1394255A2 (en) 2004-03-03
FI20002013A (fi) 2000-09-13
HUT54896A (en) 1991-04-29
FI905591A0 (fi) 1990-11-12
FI107619B (fi) 2001-09-14
JPH07101986A (ja) 1995-04-18
JP2809987B2 (ja) 1998-10-15
JP3171792B2 (ja) 2001-06-04
DE03016585T1 (de) 2005-03-31
ES2020152T3 (es) 2005-07-16
MY110260A (en) 1998-03-31
NO303941B1 (no) 1998-09-28
JP2007254475A (ja) 2007-10-04
AU4750493A (en) 1994-01-20
AU640920B2 (en) 1993-09-09
AU4750593A (en) 1993-12-16
KR0185373B1 (ko) 1999-05-01
ES2020152T4 (es) 2006-11-16
IL93764A0 (en) 1990-12-23
AU666576B2 (en) 1996-02-15
GR910300016T1 (en) 1991-11-15
NO904712L (no) 1990-10-30
HU902814D0 (en) 1991-03-28
JP2000039434A (ja) 2000-02-08
JP2006169233A (ja) 2006-06-29
DE69034182T2 (de) 2005-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU225068B1 (en) Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
CA2065287C (en) New hcv isolates
HU216017B (hu) Eljárás HCV-1 polipeptidek, HCV-1 polinukleotidok, rekombináns vektorok és gazdasejtek, valamint immunesszé kit, hepatitis C vírusfertőzés elleni vakcinák, a fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok előállítására, és immunvizsgálati és vírustenyészt
KR100187483B1 (ko) Hcv 폴리뉴클레오티드 및 그 사용
AU640920C (en) Nanbv diagnostics and vaccines
FI105046B (fi) Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, rekombinanttivektori ja isäntäsolu
IL143675A (en) Polynucleotide capable of hybridizing to a complement of a genomic sequence of hepatitis c virus, polynucleotide probe comprising said polynucleotide and methods using said probe
CA2483289A1 (en) Hepatitis c diagnostics and vaccines
LV10306B (en) Nanbv diagnostics and vaccines
IE84606B1 (en) NANBV diagnostics and vaccines