HU216017B

HU216017B - Eljárás HCV-1 polipeptidek, HCV-1 polinukleotidok, rekombináns vektorok és gazdasejtek, valamint immunesszé kit, hepatitis C vírusfertőzés elleni vakcinák, a fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok előállítására, és immunvizsgálati és vírustenyészt

Info

Publication number: HU216017B
Application number: HU388/89A
Authority: HU
Inventors: Qui-Lim Choo; Michael Houghton; George Kuo
Original assignee: Chiron Corp.
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1999-04-28
Also published as: ES2012739T5; CN1249433A; EP0318216A1; JPH09173079A; JP2008007508A; JP3171793B2; KR19980701583A; LV10726A; JP2662358B2; JPH0581600B1; ES2012739A4; JP2662351B2; JPH06128290A; CN1074422C; JP2007197456A; JP2006117681A; CN1035679A; NO892931L; CN100397082C; JPH09184844A

Abstract

A találmány egyik tárgyát hepatitis C–1 vírűsból (HCV–1) származócDNS-szekvenciacsalád előállítására irányűló eljárás képezi. Ezek aszekvenciák őlyan antigéneket kódőlnak, amelyek imműnőló iailagreagálnak a C hepatitisben szenvedő egyénekben jelen lévőantitestekkel. A HCV–1 cDNS-szekvenciák alkalmasak őlyan HCV–1pőlinűkleőtid vizsgálóminták tervezésére és őlyan HCV–1 pőlipeptidekszintézisére, amelyek imműnesszében alkalmazhatók. Ezek az eljárásőkűgyancsak a t lálmány tárgyát képezik. Ezenkívül ezek a cDNS-szekvenciák alkalmasak őlyan imműnőgén pőlipeptidek találmány szerintiszintéziséhez, amelyek HCV–1 fertőzések megelőző és/vagy terápiáskezeléséhez vak inaként alkalmazhatók. A találmány szerint előállítőttreagensek lehetővé teszik HCV–1 ágensnek vagy ágenseknek aszapőrítását szövettenyésztő rendszerekben. ŕ

Description

A találmány egyik tárgyát hepatitis C-l vírusból (HCV-1) származó cDNS-szekvenciacsalád előállítására irányuló eljárás képezi. Ezek a szekvenciák olyan antigéneket kódolnak, amelyek immunológiailag reagálnak a C hepatitisben szenvedő egyénekben jelen lévő antitestekkel.

A HCV-1 cDNS-szekvenciák alkalmasak olyan HCV-1 polinukleotid vizsgálóminták tervezésére és olyan HCV-1 polipeptidek szintézisére, amelyek immunesszében alkalmazhatók. Ezek az eljárások ugyancsak a találmány tárgyát képezik. Ezenkívül ezek a cDNS-szekvenciák alkalmasak olyan immunogén polipeptidek találmány szerinti szintéziséhez, amelyek HCV-1 fertőzések megelőző és/vagy terápiás kezeléséhez vakcinaként alkalmazhatók.

A találmány szerint előállított reagensek lehetővé teszik HCV-1 ágensnek vagy ágenseknek a szaporítását szövettenyésztő rendszerekben.

A leírás terjedelme 124 oldal (ezen belül 63 lap ábra)

HU 216 017 B

A találmány egyik tárgyát hepatitis C-l vírusból (HCV—1) származó cDNS-szekvenciacsalád előállítására irányuló eljárás képezi. Ezek a szekvenciák olyan antigéneket kódolnak, amelyek immunológiailag reagálnak a C hepatitisben szenvedő egyénekben jelen lévő antitestekkel.

A találmány szerint előállított reagensek lehetővé teszik HCV-1 ágensek szaporítását szövettenyésztő rendszerekben.

A találmány olyan anyagokra és eljárásokra vonatkozik, amelyek a nem A, nem B hepatitisvírus (NANBV) elterjedésének meghatározására és kezelésére alkalmasak. Pontosabban, a találmány diagnosztikus DNS-fragmentumokra, diagnosztikus fehérjékre, diagnosztikus antitestekre, valamint védőantigénekre és a NANB-hepatitis etiológiai kialakítója, vagyis a hepatitis C vírus elleni antitestekre vonatkozik.

Az alábbiakban ismertetjük azokat az irodalmi helyeket, amelyekre hivatkozni fogunk.

Barr és munkatársai: Biotechniques, 4,428 (1986);

Botstein: Gene, 8, 17 (1979);

Brinton M. A.: a „THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE” című kiadványban (sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötetszerkesztők: Schlesinger és Schlesinger, kiadó: Plenum Press), 327-374. oldal (1986);

Broach: A „Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces” című kiadványban, 1. kötet, 445. oldal; Cold Spring Harbor Press (1981);

Broach és munkatársai: Meth. Enz., 101, 307 (1983);

Chang és munkatársai: Natúré, 198, 105 (1977);

Chirgwín és munkatársai: Biochemistry, 18, 5294 (1979);

Chomczynski és Sacchi: Analytical Biochemistry, 162,156(1987);

Clewell és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 62, 1159(1969);

Clewell: J. Bacteriol., 110, 667 (1972);

Cohen (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972);

Cousens és munkatársai: Gene, 61, 265 (1987);

De Boer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 292,128 (1983);

Dreesman és munkatársai: J. Infect. Disease, 151, 761 (1985);

Feinstone S. M. és Hoofnagle J. H.: New Engl. J. Med., 377, 185 (1984);

Fields és Knipe: FUNDAMENTAL VIROLOGY (kiadó: Raven Press, New York) (1986);

Fiers és munkatársai: Natúré, 273, 113 (1978);

Gerety R. J. és munkatársai: a VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE című kiadványban (szerkesztők: Vyas Β. N., Dienstag J. L. és Hoofnagle J.

M., kiadó: Grune and Stratton Inc. 23-47. oldal (1984);

Goeddel és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 8, 4057 (1980);

Graham és Van dér Eb: Virology, 52, 546 (1978);

Grunstein és Hogness: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 3961 (1975);

Grych és munkatársai: Natúré, 316, 74 (1985);

Gubler és Hoffman: Gene, 25, 263 (1983);

Hammerling és munkatársai: „MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS”;

Hess és munkatársai: J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968);

Hinnen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929(1978);

Hitzeman és munkatársai: J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980);

Holland és munkatársai: Biochemistry, 77, 4900 (1978);

Holland: J. Bioi. Chem., 256,1385 (1981);

Houghton és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 9, 247 (1981);

Hunyh Τ. V. és munkatársai: a „DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH” című kiadványban (szerkesztő: Glover D., kiadó: IRL Press, Oxford, Egyesült Királyság), 49-78. oldal;

Immun. Rév., 62, 185 (1982);

Iwarson: Brisith Medical J., 295, 946 (1987);

Kennett és munkatársai: „MONOCLONAL ANTIBODIES” (1980);

Laemmli: Natúré, 227, 680 (1970);

Lee és munkatársai: Science, 239, 1288 (1988);

Maniatis T. és munkatársai: „MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL” (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) (1982);

Mayer és Walker szerkesztésében: „IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY” (Academic Press, London) (1987);

Maxam és munkatársai: Methods in Enzymology, 65,499 (1980);

MacNamara és munkatársai: Science, 226, 1325 (1984);

Messing és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 9, 309 (1981);

Messing: Methods in Enzymology, 707, 20-37 (1983);

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press);

Michelle és munkatársai: Int. Symposium on Viral Hepatitis;

Monath: a „THE VIRUSES: THE TÓGAVIRIDAE AND FLAVOVIRIDAE” című kiadványban (sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötetszerkesztők: Schlesinger és Schlesinger, kiadó: Plenum Press), 375440. oldal (1986);

Nagahuma és munkatársai: Anal. Biochem., 141, 74(1984);

Neurath és munkatársai: Science, 224, 392 (1984);

HU 216 017 Β

Nisonoff és munkatársai: Clin. Immunoi. Immunopathol., 21, 397-406 (1981);

Overby L. R.: Curr. Hepatol., 5,49 (1985);

Overby L. R.: Curr. Hepatol., 6, 65 (1986);

Overby L. R.: Curr. Hepatol., 7, 35 (1987);

Peleg: Natúré, 221, 193 (1969);

Pfefferkom és Shapiro: A „COMPREHENSIVE VIROLOGY” című sorozat 2. kötetében (szerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kiadó: Plenum, New York), 171-230. oldal (1974);

Prince A. M.: Annu. Rév. Microbiol., 37, 217 (1983);

Rice és munkatársai: a „THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVOVIRIDAE” című kiadványban (sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötetszerkesztők: Schlesinger és Schlesinger, kiadó: Plenum Press), 279-328. oldal (1986);

Roehrig: a „THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVOVIRIDAE” című kiadványban (sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötetszerkesztők: Schlesinger és Schlesinger, kiadó: Plenum Press) (1986);

Sadler és munkatársai: Gene, 8, 279 (1980);

Saiki és munkatársai: Natúré, 324, 163 (1986);

Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977);

Schlesinger és munkatársai: J. Virol., 60,1153 (1986);

Schreier M. és munkatársai: „HYBRIDOMA TECHNIQUES” (1980);

Scopes: „PROTEIN PUFIRICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE”, II. kiadás (Springer Verlag, New York) (1984);

Shimatake és munkatársai: Natúré, 292, 128 (1981);

Steimerés munkatársai: J. Virol., 58, 9 (1986);

Stollar: a „TOGAVIRUSES” című kiadványban (szerkesztő: Schlesinger R. W., kiadó: Academic Press, New York), 584-622. oldal (1980);

Taylor és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta, 442, 324(1976);

Towbin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76,4350(1979);

Tsu és Herzenberg: a „SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY” című kiadványban (kiadó: Freeman W. H. és társa), 373-390. oldal (1980);

Vytdehaag és munkatársai: J. Immunoi., 134, 1225 (1985);

Valenzuela P. és munkatársai: J. Natúré, 298, 344 (1982);

Valenzuela P. és munkatársai: a „HEPATITIS B” című kiadványban (szerkesztők: Millman J. és munkatársai, kiadó: Plenum Press), 225-236. oldal (1984);

Warner: DNA, 3,401 (1984);

Wu és Grossman: Methods in Enzymology, 154. kötet, „RECOMBINANT DNA”, „E” rész (1987);

Wu: Methods in Enzymology, 155. kötet, „RECOMBINANT DNA”, „F” rész (1987);

Zoller: Nucleic Acids Rés., 10, 6487 (1982).

Idézett szabadalmi leírások:

4,341,761;

4,399,121;

4,427,783;

4,444,887;

4,466,917;

4,472,500;

4,491,632;

4,493,890 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások.

A C-l hepatitis átvihető betegség vagy betegségek csoportja, amelyekről úgy vélik, hogy vírusok által indukált betegségek, és amelyek megkülönböztethetők a vírusokkal kapcsolatos májbetegségek más formáitól, ide értve az ismert hepatitisvírusok, azaz a hepatitis A vírus (HAV), hepatitis B vírus (HBV) és delta-hepatitisvírus által okozott betegségeket, valamint a citomegalovírus (CMV) vagy Epstein-Barr-vírus (EBV) által indukált hepatitist. A HCV-l-t először transzfüziót kapott egyénekben azonosították. Az átvitel emberből csimpánzba és a sorozatos átvitel csimpánzokban bizonyítékokat szolgáltatott arra, hogy a HCV -1 valamilyen átvihető fertőző ágensnek vagy ágenseknek tulajdonítható. A HCV-l-ért felelős átvihető ágenst azonban eddig még nem azonosították, és a sok ágens, amely ezt a betegséget okozhatja, ismeretlen.

Járványtani megfigyelések azt sugallják, hogy a HCV- 1-nek három típusa van: a víz eredetű járványos típus, a vérrel vagy tűvel társult típus, és a szórványosan előforduló (közösségben szerzett) típus. Az ágensek sokasága azonban, amelyek a HCV-l-t okozhatják, még ismeretlen.

A klinikai diagnózist és azonosítást elsődlegesen más vírusmarkerek kizárásával hajtják végre. Az alkalmazott eljárások között, amelyek a vélt antigének és antitestek kimutatására szolgálnak, találhatjuk az agargél-diffuziót, az ellen-immunelektroforézist, immunfluoreszcens mikroszkópiát, immunelektron-mikroszkópiát, radioimmunesszét, és az enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatot. Ezeknek a vizsgálatoknak egyike sem bizonyult azonban kielégítően érzékenynek, fajlagosnak és reprodukálhatónak, hogy diagnosztikus vizsgálatként alkalmazhassuk a HCV - 1-hez.

Mindeddig tehát sem teljes tisztázás, sem megegyezés nincs az ágensekkel kapcsolatos antigén-antitest rendszerek azonosítását vagy fajlagosságát illetően. Ez, legalábbis részben, a HBV-vel való előzetes vagy együttes fertőzésnek tulajdonítható az egyénekben, valamint a HBV-vel társult oldható és szilárd antigének ismert komplex voltának, továbbá a HBV DNS integrálódásának a májsejtek genomjába. Ezenkívül az is lehetséges, hogy a HCV-l-t egynél több fertőző ágens okozza, és az is lehetséges, hogy rosszul diagnosztizálják. Nem világos az sem, mit mutatnak ki a szerológiai vizsgálatok a HCV-1-ben szenvedő betegek szérumában. Arra a következtetésre jutottak, hogy az agargéldiffüziós és ellen-immunelektroforézises vizsgálatok kimutatnak olyan autoimmun válaszokat vagy nem fajlagos fehéije-kölcsönhatásokat is, amelyek néha fellépnek szérumminták között, és arra, hogy ezek nem képviselnek fajlagos NANBH antigén-antitest reakciókat. Az immun-fluoreszcenciás, enzimmel kapcsolt immun3

HU 216 017 Β szorbens és radioimmun vizsgálatok, úgy tűnik, kimutatják a reumatoidfaktor-szerű anyagok alacsony szintjét is, amely anyagok gyakran jelen vannak a HCV-1ben szenvedő betegek szérumában, valamint más májés nemmáj-betegségekben szenvedő betegek szérumában. A kimutatott reaktivitások közül néhány képviselhet gazdaszervezet által meghatározott citoplazmás antigének elleni antitesteket is.

Számos jelölt van, amely HCV-1 okozójaként szóba jöhet. Lásd például Prince (1983), Feinstone és Hoofnagle (1984) és Overby (1985, 1986, 1987) összefoglaló közleményeit, és Iwarson (1987) közleményét. Nincs azonban bizonyíték arra, hogy ezeknek a jelölteknek bármelyike képviselné a HCV-1 etiológiai ágensét.

Jelentős az igény arra, hogy legyen érzékeny, fajlagos módszer HCV-1 hordozók és fertőzött vérvagy vérkészítmények átvizsgálására és azonosítására. A transzfuzió utáni hepatitis (PTH) a transzfüziót kapott betegeknek mintegy 10%-ánál fordul elő, és ezeknek az eseteknek 90%-ában is a HCV-1 játssza a szerepet. Ebben a betegségben a fő gond a gyakori továbbfejlődés krónikus májkárosodássá (25-55%).

A betegekről való gondoskodás, valamint az átvitel megelőzése (vérrel és vértermékekkel, vagy szorosabb személyi kontaktussal) megfelelő diagnosztikus és prognosztikus eszközöket igényel HCV-1 nukleinsavak, antigének és antitestek kimutatására. Ezenkívül igény van hatásos vakcinákra és immunterápiás szerekre a betegség megelőzésére és/vagy kezelésére.

Az alábbiakban részletesebben leírjuk a találmányt.

A jelen találmány a hepatitis C-l vírusnak (HCV-1) az izolálásával és jellemzésével foglalkozik. Pontosabban a találmány HCV-genomrészek cDNSreplikáinak családját szolgáltatja. Ezeket a cDNS-replikákat olyan technikákkal izoláljuk, amelyek magukban foglalják betegekből kapott szérummal fertőzött szövetben lévő, szilárd ágensből alkotott cDNS-könyvtárból való kifejezési termékek átvizsgálásának új lépését, hogy kimutassuk az eddig nem izolált és nem jellemzett víruságens genomjából származó, újonnan szintetizált antigéneket, valamint olyan termékeket termelő kiónok kiválasztásának új lépését, amely termék csak a fertőzött egyénekből való szérumokkal reagál immunológiailag a nem fertőzött egyénekhez viszonyítva.

A HCV-1 genomja természetével kapcsolatos tanulmányok, amelyek a HCV-1 cDNS-ből származó vizsgálómintákat, valamint a HCV-1 cDNS-en belül lévő szekvenciainformációt alkalmazzák, azt sugallják, hogy a HCV-1 Flavivírus vagy Flaviszerű vírus.

A HCV-1-ből származó cDNS-szekvenciák részei alkalmasak vizsgálómintaként, hogy diagnosztizáljuk a vírus jelenlétét mintákban, és izoláljuk a vírus természetben előforduló variánsait. Ezek a cDNS-ek a HCV-1 genomon vagy genomokon belül kódolt HCV-1 antigének, polipeptidek szekvenciáját is rendelkezésre bocsátják, és lehetővé teszik olyan polipeptidek termelését, amelyek standardként vagy reagensként alkalmazhatók diagnosztikus vizsgálatokban, és/vagy alkalmazhatók vakcinák komponenseként. Az ezen a polipeptidszekvencián belül található HCV-1 epitópok ellen irányuló mind monoklonális, mind poliklonális antitestek szintén hasznosak diagnosztikus vizsgálóanyagként, terápiás ágensekként, vírusellenes szerek átvizsgálására, és olyan ágensek izolálására, amelyekből ezek a cDNS-ek származnak. Ezenkívül az ezekből a cDNS-ekből származó vizsgálóminták alkalmazásával lehetséges a HCV-1 genom más részeit izolálni és szekvenciaelemzésnek alávetni, így további vizsgálómintákat és polipeptideket létrehozni, amelyek alkalmazhatók a diagnózisban, és/vagy mind megelőző, mind terápiás kezelésében.

Következésképpen a polinukleotidok előállításával kapcsolatban a találmány tárgya az alábbi: tisztított HCV-1 polinukleotid; rekombináns HCV-1 polinukleotid; valamely HCV-1 genomból vagy HCV-1 cDNS-ből származó szekvenciát tartalmazó rekombináns polinukleotid; a HCV-1 valamely epitópját kódoló rekombináns polinukleotid; a fenti rekombináns polinukleotid bármelyikét tartalmazó rekombináns vektor; ezeknek a vektoroknak bármelyikével transzformált gazdasejt előállítására irányuló eljárás.

A találmány további tárgyai: eljárás a rekombináns kifejezőrendszerrel transzformált sejt által termelt polipeptid előállítására.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns HCV-1 polipeptid előállítására.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá eljárás valamely HCV-1 antigén epitóp ellen irányuló antitestek előállítására.

A jelen találmány még további tárgya valamely polinukleotidvizsgáló minta HCV- 1-hez.

A jelen találmány olyan tárgyai, amelyek lehetővé teszik vizsgálókészletek összeállítását, az alábbiak: analizálóminták HCV-1-ből származó polinukleotidok jelenlétének kimutatására; ezek 8 vagy több, a HCV-1ből származó nukleotidszekvenciából állnak megfelelő tartályban; analizálóminták valamely HCV-1 antigén jelenlétének kimutatására, ezek valamely, a kimutatandó HCV-1 antigén ellen irányuló antitestet tartalmaznak megfelelő tartályban; analizálóminták valamely HCV-1 antigén ellen irányuló antitestek jelenlétének kimutatására, ezek a HCV-1 antigénben jelen lévő valamely HCV-1 epitópot tartalmazó polipeptidből állnak, megfelelő tartályban.

A jelen találmány további tárgyai: eljárás valamely HCV-1 epitópot tartalmazó polipeptid előállítására valamely szilárd szubsztrátumhoz kötve.

A jelen találmány még további tárgyai: eljárás valamely HCV-1 epitópot tartalmazó polipeptid előállítására, amely eljárás egy HCV-1 epitópot tartalmazó polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó, valamely kifejezővektorral transzformált gazdasejtek inkubálásából áll, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az említett polipeptid kifejeződését.

A jelen találmány magában foglal immunesszéket is. Ezek egyike valamely HCV-antigén kimutatására irányul, és a mintának, amelyről feltételezhető, hogy HCV-1 antigént tartalmaz, inkubálásából áll olyan vizsgáló antitestmintával, amely a kimutatandó HCV-1 an4

HU 216 017 Β tigén ellen irányul, az inkubálást olyan körülmények között végezve, mely lehetővé teszi egy antigén-antitest komplex képződését.

A jelen találmány tárgya HCV-1 fertőzés elleni vakcinák előállítása is, amelyek egy HCV-1 epitópot tartalmazó immunogén peptidből állnak.

A jelen találmány további tárgya HCV-vel fertőzött sejteken növekvő szövettenyészetek előállítása is.

A jelen találmány még további tárgya eljárás HCV-1 elleni antitestek előállítására.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. A „HCV” jelölés a következőkben a HCV-1-re vonatkozik.

Az 1. ábra a HCV cDNS beiktatás kettős szálú nukleotidszekvenciáját mutatja be az 5-1-1. kiónban, valamint az ebben kódolt polipeptid vélt aminosavszekvenciáját.

A 2. ábra az átfedő HCV cDNS-szekvenciák homológiáit mutatjabe az 5-1-1., 81., 1-2. és 91. kiónokban.

A 3. ábra a 81., 1-2. és 91. átfedőklónokból származó összetett szekvenciát mutatja be, valamint az ebben kódolt aminosavszekvenciát.

A 4. ábra a HCV cDNS-beiktatás kettős szálú nukleotidszekvenciáját mutatja be a 81. kiónban, valamint az ebben kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját.

Az 5. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 36. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 81. klón NANBV cDNS-ét, és a 36. kiónon belül kódolt polipeptidszekvenciát.

A 6. ábra a HCV cDNS-ek kombinált ORF-jét mutatja be a 36. és 81. kiónban, valamint az ebben kódolt polipeptidet.

A 7. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 32. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 81. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 8. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 35. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 36. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 9. ábra HCV cDNS-ek kombinált ORF-jét mutatja be a 35., 36., 81. és 32. kiónokban, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 10. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 37b. ki ónban, a szegmenst, amely átfedi a 35. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

All. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 33b. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 32. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 12. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 40b, kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 37b. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 13. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 25c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 33b. kiónt, és az ebben kódolt polipeptidet.

A 14. ábra annak az ORF-nek a nukleotidszekvenciáját és a benne lévő polipeptidszekvenciát mutatja be, amely ORF kiterjed a HCV cDNS-ekig a 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b. és 25c. kiónokban.

A 15. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 33c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 40b. és 33c. kiónokat, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 16. ábra a 8h. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciát mutatja be, a szegmenst, amely átfedi a 33c. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 17. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 7e. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 8h. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 18. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 14c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 25c. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 19. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 8f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 14c. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 20. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 33f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 8f. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 21. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 33g. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 33.f kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 22. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 7f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a 7e. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 23. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 1 lb. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a 7f. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 24. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a Ili. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a 1 lb. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 25. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 39c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a 33g. kiónban, és az ebben kódolt aminosavszekvenciát.

A 26. ábra egy összetett HCV cDNS-szekvenciát mutat be, amely a 14i., 11b., 7f., 7e., 8h., 33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8f„ 33f. és 33g. kiónokban lévő közös cDNS-ekből származik, továbbá bemutatja a származék szekvenciában lévő kiterjesztett ORF-ben kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját.

A 27. ábra a HCV cDNS-t mutatja be a 12f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 14i. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 28. ábra a HCV cDNS-t mutatja be a 35f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 39c. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 29. ábra a HCV cDNS-szekvenciát mutatja be a 19g. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 35f. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 30. ábra a 26g. klón szekvenciáját mutatja be, a szegmenst, amely átfedi a 19g. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 31. ábra a 15e. klón szekvenciáját mutatja be, azt a szegmenst, amely átfedi a 26g. kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat.

A 32. ábra egy összetett cDNS-t mutat be, amely a 12.f-15e. kiónok egyesítéséből származik 5’—>3’ irányban; ez bemutatja a folyamatos ORF-ben kódolt aminosavakat is.

A 33. ábra az SOD-NANB₅__M fúziós fehérje BB-NANB-vel, HAV-val és HBV-vel fertőzött csimpánzokból származó csimpánzszérummal végzett Westem-foltelemzésének fényképe.

A 34. ábra az SOD-NABs.j.] fúziós fehérje NANBV-vel, HAV-val és HBV-vel fertőzött emberekből és kontrollemberekből származó szérumokkal végzett Westem-foltelemzésének fényképe.

A 35. ábra a pAB24 vektor jelentősebb vonásait bemutató térkép.

A 36. ábra a C100-3 fúziós polipeptid karboxiterminális feltételezett aminosavszekvenciáját mutatja be, valamint az ezt kódoló nukleotidszekvenciát.

A 37a. ábra Coomassie kékkel festett poliakrilamid gél fényképe, amely az élesztőben kifejezett C100-3-at azonosítja.

A 37b. ábra a C100-3-nak egy NANBV-vel fertőzött emberből származó szérummal végzett Westemfoltelemzését mutatja.

A 38. ábra BB-NANBV-vel fertőzött csimpánz májából izolált RNS Northem-foltjának autoradiogramját mutatja be, ahol ezt a 81. klón BB-NANBV cDNSsel vizsgáljuk.

A 39. ábra az RN-áz A-val vagy DN-áz I-gyel kezelt, és a 81. klón BB-NANBV cDNS-ével vizsgált NANBV-nukleinsav autoradiogramját mutatja be.

A 40. ábra fertőzött plazmából anti-NANB₅__bl-gyel befogott NANBV-részecskékből extrahált, és a 81. ki ónból való ³²P-jelzett NANBV cDNS-sel vizsgált nukleinsavak autoradiogramját mutatja be.

A 41. ábra NANBV-nukleinsavakból izolált, és a 81. kiónban lévő NANBV cDNS-ből származó ³²P-jelzett plusz és mínusz szálú DNS-vizsgálómintákkal vizsgált szűrők autoradiogramját mutatja be.

A 42. ábra a homológiát mutatja be HCV cDNS-ben kódolt polipeptid és a Dengue flavivírusból származó NS-fehéije között.

A 43. ábra a HCV-fertőzés eloszlásának hisztogramja véletlenszerű mintákból, amint ezt ELISA-átvizsgálással határozzuk meg.

A 44. ábra HCV-fertőzés eloszlásának hisztogramja véletlenszerű mintákból, immunoglobulin-enzim konjugátum két konfigurációját alkalmazva ELISA-vizsgálatban.

A 45. ábra Flavivírusok NSl-ében lévő megőrzött szekvenciából származó primer keverék szekvenciáit mutatja be.

A 46. ábra a k9-l kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciát mutatja be, a szegmenst, amely átfedi a 26. ábrán lévő cDNS-t, és bemutatja az ebben kódolt aminosavakat.

A 47. ábra annak a HCV cDNS-nek a szekvenciáját mutatja be, amely a k9-l.-15e. kiónok egyesítésével keletkezik 5’—>3’ irányban; ez bemutatja a folyamatos ORF-ben kódolt aminosavakat is.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány kivitelezésének módozatait.

Meghatározások

A „hepatitis C vírus” kifejezést a szakterületen dolgozó szakemberek az NANBH (nem A-nem B hepatitis) eddig ismeretlen ágensének tartották fenn. Következésképpen ahogy itt használjuk, a „hepatitis C vírus” (HCV) olyan ágensre utal, amely az NANBH okozója, és amelyet korábban NANBV-nek és/vagy

BB-NANBV-nek neveztek. A HCV, NANBV és BB-NANBV kifejezéseket itt egymásra bármikor kicserélhetően alkalmazzuk. Ennek a terminológiának a kiterjesztéseként a HCV által okozott betegséget, amelyet korábban NANB-hepatitisnek (NANBH) neveztek, hepatitis C-nek nevezzük. Az NANBH és hepatitis C kifejezéseket egymásra bármikor kicserélhetően alkalmazzuk.

A „HCV” kifejezés, amint itt alkalmazzuk, olyan vírusfajt jelent, amely NANBH-t okoz, valamint jelenti ennek legyengített törzsét, vagy az ezekből származó tökéletlen interferáló részecskéket. Amint alább bemutatjuk, a HCV-genom RNS-ből áll. Ismeretes, hogy az RNS-tartalmú vírusok viszonylag magas arányban rendelkeznek spontán mutációval, vagyis az irodalom szerint 10 ³—10 ⁴ nagyságrendben nukleotidonként [Fields és Knipe (1986)]. Ennek következtében ezek összetett törzsek az alább leírt HCV-fajon belül. Az itt leírt kompozíciók és eljárások lehetővé teszik a különböző rokon törzsek szaporítását, azonosítását, kimutatását és izolálását. Ezen túl ezek lehetővé teszik diagnosztikumok és vakcinák előállítását különböző törzsekhez, és hasznosítást nyerhetnek farmakológiai alkalmazású vírusellenes ágensekhez szolgáló átvizsgáló módszerekben, amenynyiben ezek gátolják a HCV replikációját.

Az itt nyújtott információ, bár a HCV egy törzséből származik, amelyet ezután CDC/HCV 1-nek nevezünk, elegendő ahhoz, hogy egy vírustaxonómusnak lehetővé tegye más olyan törzsek azonosítását, amelyek ebbe a fajba esnek. Amint itt leírjuk, felfedeztük, hogy a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus. A Flavivírus-részecskék morfológiája és összetétele ismert, ezt Brinton (1986) közleménye tárgyalja. Általában a morfológiát tekintve a Flavivírusok egy központi nukleokapszidot tartalmaznak egy lipid-kettősréteggel körülvéve. A virionok gömb alakúak, és mintegy 40-50 nm átmérőjűek. Belsejük mintegy 25-30 nm átmérőjű. A virionburkolat külső felülete mentén nyúlványok vannak, amelyek mintegy 5-10 nm hosszúak, a végükön mintegy 2 nm átmérőjű gömbökkel.

A HCV olyan epitopot kódol, amely immunológiailag azonosítható a HCV-genomban kódolt epitóppal, amely genomból az itt leírt cDNS származik; az epitóp előnyösen egy itt leírt cDNS-ben kódolódik. Az epitóp egyedi HCV-re, amikor már ismert Flavivírusokkal hasonlítjuk össze. Az epitóp egyediségét HCV-vel való immunológiai reaktivitásával és más Flavivírus fajokkal való immunológiai reaktivitás hiányával határozhatjuk meg. Az immunológiai reaktivitás meghatározásához való módszerek a szakterületen ismertek, ilyenek például a radioimmunesszé, az ELISA-vizsgálat, a hemagglutináció, és itt a vizsgálatokhoz alkalmas technikákra számos példát adunk majd.

A fentieken kívül az alábbi paraméterek alkalmazhatók együtt vagy külön, hogy egy törzset HCV-nek azonosítsunk. Mivel a HCV-törzsek fejlődéstani szempontból rokonok, várható, hogy a genomok általános homológiája nukleotidszinten 40% vagy nagyobb, előnyösen 60% vagy nagyobb, még előnyösebben 80% vagy nagyobb; ezenkívül vannak legalább mintegy

HU 216 017 Β nukleotidból álló megfelelő összefüggő szekvenciák. A megegyezést a vélt HCV-törzs genomszekvencia és a CDC/CH1 HCV cDNS-szekvencia között olyan technikákkal határozhatjuk meg, amelyek a szakterületen ismertek. így például ezt meg lehet határozni a vélt HCV-szekvenciából való polinukleotidszekvencia információja és az itt leírt HCV cDNS-szekvencia vagy szekvenciák közvetlen összehasonlításával. Ezt például meg lehet határozni a polinukleotidok hibridizálásával is olyan körülmények között, amelyek stabil duplexek képződését teszik lehetővé homológ területek között (például olyan körülmények között, amelyeket S[ emésztés előtt alkalmazhatunk), ezt követi az emésztés egyedi szálakra fajlagos nukleázzal vagy nukleázokkal, ezt pedig az emésztett fragmentumok méretmeghatározása követi.

A HCV törzseinek fejlődéstani rokonsága miatt a vélt HCV-törzsek azonosíthatók homológiájukkal polipeptidszinten. A HCV-törzsek általában több, mint mintegy 40%-ban homológok, előnyösen több, mint mintegy 60%-ban homológok, és még előnyösebben több, mint 80%-ban homológok polipeptidszinten. A technikák az aminosavszekvencia-homológia meghatározására a szakterületen ismertek. így például az aminosavszekvenciát meghatározhatjuk közvetlenül, és összehasonlíthatjuk az itt szolgáltatott aminosavszekvenciával. Meghatározhatjuk például a feltételezett HCV-genom anyagának nukleotidszekvenciáját is (általában valamely cDNS köztes termék révén); az ebben kódolt aminosavszekvenciát meghatározhatjuk, és a megfelelő területeket összehasonlíthatjuk.

Amint itt használjuk, egy megnevezett szekvenciából „származó” polinukleotidok, például a HCV cDNSek, különösen azok, amelyek az 1 -32. ábrákon vannak leírva, vagy egy HCV-genomból „származó” polinukleotidok olyan polinukleotidszekvenciákra vonatkoznak, amelyek legalább mintegy 6 nukleotidból, előnyösen legalább mintegy 8 nukleotidból, még előnyösebben 10-12 nukleotidból, és még előnyösebben 15-20 nukleotidból állnak, amelyek megfelelnek a megnevezett nukleotidszekvenciának, vagyis homológok vagy komplementerek azzal. Annak a területnek a szekvenciája, amelyből a polinukleotid származik, előnyösen egy olyan szekvenciával homológ vagy komplementer, amely egyedi egy HCV-genomban. Ez a szekvencia akár egyedi a HCV-genomban, akár nem, olyan technikákkal határozható meg, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. így például a szekvenciát össze lehet hasonlítani adatbankokban, például a Genebankban lévő szekvenciákkal, hogy meghatározzuk, vajon ez jelen van-e nem fertőzött gazdaszervezetekben vagy más organizmusokban. A szekvenciát összehasonlíthatjuk más víruságensek ismert szekvenciáival is, beleértve azokat a vírusokat, amelyekről ismert, hogy hepatitist idéznek elő (például HAV, HBV és HDV) és a Flaviviridae más tagjaival. A származék szekvencia megegyezését vagy meg nem egyezését más szekvenciákkal hibridizálással is meghatározhatjuk, alkalmas szigorúságú körülmények között. A nukleinsavszekvenciák komplementer voltának meghatározására szolgáló hibridizációs technikák a szakterületen ismertek, ezeket a későbbiekben tárgyaljuk [lásd még ezzel kapcsolatban Maniatis és munkatársai (1982) munkáját]. Ezenkívül hibridizálással képzett duplex polinukleotidok hibás illesztését is meghatározhatjuk ismert technikákkal, ide értve például valamely nukleázzal, például SÍ-gyei végzett emésztést, amely nukleáz fajlagosan emészti az egyszálú területeket duplex polinukleotidokban. Azok a területek, amelyekből tipikus DNS-szekvenciák „származhatnak”, lehetnek például olyan területek (de nemcsak ezekre korlátozódnak), amelyek speciális epitópokat, valamint át nem írt és/vagy nem transzlatált területeket kódolnak.

A származék polinukleotidok nem szükségszerűen fizikailag származnak a bemutatott nukleotidszekvenciából, hanem keletkezhetnek bármilyen módon, beleértve például a kémiai szintézist, vagy DNS-replikációt, vagy reverz transzkripciót, vagy olyan transzkripciót, amely a bázisok szekvenciája által nyújtott információn alapul, ahol a bázisok abban a területben vannak, amelyből a polinukleotid származik. Ezenkívül a nevezett szekvencia területeinek megfelelő területek kombinációi módosíthatók is úgy, amint ez a szakterületen ismert, hogy ezek egybevágjanak a szándékolt alkalmazással.

Hasonlóképpen egy megnevezett nukleinsavszekvenciából, például az 1-32. ábrákban lévő szekvenciákból „származó polipeptid vagy aminosavszekvencia, vagy egy HCV-genomból „származó” szekvencia egy polipeptidre vonatkozik, amelynek olyan aminosavszekvenciája van, amely azonos a nevezett szekvenciában, vagy annak egy részében kódolt polipeptid szekvenciájával, ahol a nevezett rész legalább 3-5 aminosavból, előnyösen 8-10 aminosavból, még előnyösebben 11-15 aminosavból áll, vagy amely immunológiailag azonosítható a nevezett szekvenciában kódolt polipeptiddel.

Egy rekombináns vagy származék polipeptid nem szükségszerűen egy megnevezett nukleinsavból, például az 1-26. ábrákban látható szekvenciákból, vagy egy HCV-genomból fordítódik át; ez kialakítható bármilyen más módon is, ide értve a kémiai szintézist, vagy egy rekombináns kifejezőrendszer kifejezését, vagy az izolálást mutáns HCV-ből.

A „rekombináns polinukleotid” kifejezést, amint itt használjuk, genom, cDNS, félszintetikus vagy szintetikus eredetű polinukleotidra szánjuk, amely eredetét vagy a műveleteket tekintve: (1) nincs összekötve annak a polinukleotidnak egészével vagy részével, amellyel ez a természetben össze van kötve vagy könyvtárat képez, és/vagy (2) össze van kapcsolva olyan polinukleotiddal, amely különbözik azoktól, amelyekkel ez a természetben össze van kapcsolva.

A „polinukleotid” kifejezés, ahogyan itt használjuk, nukleotidok bármilyen hosszúságú polimer formájára vonatkozik, amely nukleotidok lehetnek ribonukleotidok vagy dezoxi-ribonukleotidok. Ez a meghatározás a molekulának csak a primer szerkezetére utal. így ez a kifejezés magában foglalja az egyszálú és kettős szálú DNSeket, valamint az egyszálú és kettős szálú RNS-eket. Ez magában foglalja a polinukleotidok például metilezéssel

HU 216 017 Β és/vagy helyettesítéssel módosított formáit, és nem módosított formáit.

Az „egy cDNS-nek megfelelő szekvenciát tartalmazó HCV” kifejezés, ahogyan itt használjuk, azt jelenti, hogy a HCV olyan polinukleotidszekvenciát tartalmaz, amely homológ vagy komplementer egy, a nevezett DNS-ben lévő szekvenciához; a homológia vagy komplementer jelleg mértéke a cDNS-hez mintegy 50% vagy nagyobb, előnyösen legalább mintegy 70%, még előnyösebben legalább mintegy 90%. A szekvenciák, amelyek megfelelnek, legalább mintegy 70 nukleotid, előnyösen legalább mintegy 80 nukleotid, még előnyösebben legalább mintegy 90 nukleotid hosszúságúak. A megegyezést a HCV-szekvencia és a cDNS között a szakterületen ismert technikákkal határozhatjuk meg, ide értve például a szekvenciaelemzésnek alávetett anyag közvetlen összehasonlítását a leírt cDNS-ekkel, vagy a hibridizálást és az emésztést egyedi szálra fajlagos nukleázokkal, amelyet az emésztett fragmentumok méret szerinti meghatározása követ.

A „tisztított vírus polinukleotid” kifejezés egy HCVgenomra vagy fragmentumára vonatkozik, amely lényegében idegen anyagoktól mentes, azaz több, mint mintegy 50%-át, előnyösen több, mint mintegy 70%-át, és még előnyösebben több, mint mintegy 90%-át nem tartalmazza azoknak a polipeptideknek, amellyel a vírus polipeptid a természetben társul. A technikák a vírus polinukleotidok tisztítására a többi vírusrészecskéktől a szakterületen ismert, ide tartoznak például a részecskék szétzúzása valamely kaotrop szenei és a polinukleotid vagy polinukleotidok és a polipeptidek elkülönítése ioncserélő kromatográfiával, affmitáskromatográfiával és sűrűség szerinti ülepítéssel.

A „tisztított vírus polipeptid” kifejezés olyan HCVpolipeptidre vagy fragmentumára vonatkozik, amely lényegében tiszta, vagyis azoknak a celluláris komponenseknek, amelyekkel a viruspolipeptid a természetben össze van kapcsolva, több, mint mintegy 50%-át, előnyösen több, mint mintegy 70%-át, és még előnyösebben több, mint mintegy 90%-át nem tartalmazza. A vírus polipeptidek tisztítására szolgáló technikák a szakterületen ismertek, és ezekre a technikákra a későbbiekben adunk példákat.

A „rekombináns gazdasejtek”, „gazdasejtek”, „sejtek”, „sejtvonalak”, „sejttenyészetek” és más hasonló kifejezések, amelyeket mikroorganizmusok, magasabb rendű eukarióta sejtvonalak jelölésére alkalmazunk, olyan sejtekre vonatkoznak, amelyek alkalmazhatók, vagy amelyeket már alkalmaztak rekombináns vektorok vagy más transzfer DNS-ek befogadójaként, és magukban foglalják a fertőzött eredeti sejt utódait. Meg lehet érteni, hogy egy egyedi szülősejt utódja nem szükségszerűen tökéletesen azonos morfológiailag vagy a genom- vagy a teljes DNS-kiegészítésben, mint az eredeti szülő, a véletlenszerű vagy szándékos mutáció miatt. A szülősejtnek azok között az utódai között, amelyek megfelelően hasonlóak az adott tulajdonsággal jellemezhető szülőhöz (ilyen tulajdonság például egy kívánt peptidet kódoló nukleotid jelenléte) találjuk azokat az utódokat, amelyek ennek a definíciónak megfelelnek, és a fenti kifejezéshez illenek.

„Replikon” bármilyen genetikai elem, például plazmid, kromoszóma, vírus, amely polinukleotidreplikáció autonóm egységeként viselkedik valamely sejten belül, vagyis replikációra képes saját szabályozása alatt.

A „vektor” olyan replikon, amelyhez más polinukleotidszegmensek is vannak rögzítve úgy, hogy végrehajtódjék a rögzített szegmensek replikációja és kifejeződése.

A „szabályozószekvencia” kifejezés olyan polinukleotidszekvenciákra vonatkozik, amelyek szükségesek azon kódolószekvenciák kifejeződésének véghezviteléhez, amelyekhez ligáivá vannak. Az ilyen szabályozószekvenciák természete különbözik a gazdaszervezettől függően; prokariótákban az ilyen szabályozószekvenciák között találjuk általában a promotort, riboszomális kötőhelyet és terminátorokat; eukariótákban az ilyen szabályozószekvenciák között találjuk általában a promotorokat, terminátorokat és bizonyos esetekben a fokozókat. A „szabályozószekvenciák” kifejezés szándékunk szerint magában foglal minimumként minden olyan komponenst, amelynek jelenléte szükséges a kifejezéshez, továbbá magában foglalhat további komponenseket is, amelyek jelenléte előnyös, például vezetőszekvenciákat.

A „működőképesen összekapcsolt” kifejezés olyan egymásmellettiségre vonatkozik, ahol az így leírt komponensek olyan kapcsolatban vannak, amely lehetővé teszi, hogy ezek kívánt módon működjenek. Egy szabályozószekvencia „működőképesen összekapcsolva” egy kódolószekvenciával úgy van ligáivá, hogy a kódolószekvencia kifejeződését érjük el olyan körülmények között, amelyek elősegítik a szabályozószekvencia működését.

A „kódolószekvencia” olyan polinukleotidszekvencia, amely átíródik mRNS-sé és/vagy transzlatálódik valamely polipeptiddé, amikor megfelelő szabályozószekvenciák szabályozása alá helyezzük. A kódolószekvencia határait a transzlációs start kodon határozza meg az 5'-terminálisnál és a transzlációs stop kodon a 3'-terminálisnál. Egy kódolószekvencia magában foglalhat mRNS-, cDNS- és rekombináns polinukleotidszekvenciákat, de a lehetőségek nemcsak ezekre korlátozódnak.

Az „immunológiailag azonosítható” valamivel vagy valamiként kifejezés olyan epitóp vagy epitópok és polipeptid vagy polipeptidek jelenlétére utal, amelyek jelen vannak a megnevezett polipeptidben vagy polipeptidekben, általában HCV-fehéijékben, és egyediek abban. Az immunológiai azonosságot antitestkötéssel és/vagy a kötésben való versengéssel határozhatjuk meg; ezek a technikák ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak; ezeket a későbbiekben be is mutatjuk. Az epitóp egyediségét számítógépes kutatással is meghatározhatjuk ismert adatbankokból, például a Genebankból, a polinukleotidszekvenciákból, amelyek az epitópot kódolják, és az aminosavszekvencia-összehasonlításokból már ismert fehérjékkel.

Ahogyan itt alkalmazzuk, az „epitóp” kifejezés egy polipeptid antigéndeterminánsára utal; egy epitóp állhat

HU 216 017 Β aminosavból olyan térbeli konformációban, amely egyedi az epitópra nézve, általában azonban egy epitóp legalább 5 ilyen aminosavból áll, de legáltalánosabban 8-10 ilyen aminosavból áll. Az aminosavak térbeli konformációjának meghatározására szolgáló módszerek ismeretesek a szakirodalomban, ezek között találjuk például a röntgensugár-krisztallográfiát és a kétdimenziós magmágneses rezonanciát.

Egy polipeptid akkor „immunológiailag reaktív” egy antitesttel, amikor egy antitesthez kötődik amiatt, hogy az antitest felismeri azt a fajlagos epitópot, amelyet a polipeptid tartalmaz. Az immunológiai reaktivitást antitestkötéssel határozhatjuk meg, pontosabban az antitestkötés kinetikájával és/vagy egy kötésben való versengéssel, versengő anyagként valamely ismert polipeptidet alkalmazva, amely tartalmaz egy olyan epitópot, amely ellen az antitest irányul. Az a technika, amely annak meghatározására szolgál, vajon egy polipeptid immunológiailag reaktív-e egy antitesttel, a szakterületen ismert.

Ahogyan itt használjuk, a „HCV-epitópot tartalmazó immunogén polipeptid” kifejezés természetben előforduló HCV-polipeptideket vagy ezek fragmentumait foglalja magában, valamint más úton, például kémiai szintézissel előállított polipeptideket vagy rekombináns organizmusban kifejezett polipeptideket.

A „polipeptid” kifejezés aminosavmolekula-láncokra vonatkozik, és nem utal a termék adott hosszára; így a polipeptid definícióba beletartoznak a peptidek, oligopeptidek és fehérjék egyaránt. Ez a kifejezés nem utal a polipeptid kifejeződés utáni módosításaira, például a glikozilezésre, acetilezésre, foszforilezésre stb. sem.

A „transzformálás” kifejezés, ahogyan itt használjuk, egy exogén polinukleotid beiktatására utal valamely gazdaszervezetbe, tekintet nélkül a beiktatáshoz alkalmazott módszerre; ez a módszer lehet például közvetlen felvétel, transzdukció vagy f-párosodás. Az exogén polinukleotidot fenntarthatjuk nem integrált vektorként, például plazmidként, de lehet integrálódva is a gazdaszervezet genomba.

A „kezelés” kifejezés, amint itt alkalmazzuk, megelőzésre vagy terápiára utal.

Az „egyén” kifejezés, ahogyan itt használjuk, gerincesekre, elsősorban az emlősfajok tagjaira vonatkozik; ebbe a kifejezésbe értendők a háziállatok, sportcélú állatok, főemlősök és az ember is, de a kifejezés nemcsak ezekre korlátozódik.

Ahogyan itt használjuk, egy nukleinsav „plusz szála” azt a szekvenciát tartalmazza, amely a polipeptidet kódolja.

A „mínusz szál” olyan szekvenciát tartalmaz, amely a „plusz szál” szekvenciával komplementer.

Amint itt alkalmazzuk, egy vírus „pozitív szálú genom”-ja olyan, amelyben a genom, akár RNS, akár DNS, egyszálú, és valamely polipeptidet vagy polipeptideket kódol. Pozitív szálú RNS-vírusokra példák a Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae és Caliciviridae. Ide tartozik a Falviviridae is, amelyet korábban a Togaviridae-hoz osztályoztak [lásd Fields és Knipe (1986)].

Ahogyan itt használjuk, az „antitestet tartalmazó testkomponens” kifejezés egy egyén testének olyan komponensére utal, amely a szóban forgó antitest forrása. Antitestet tartalmazó testkomponensek ismeretesek a szakterületen, ezek között találjuk például a plazmát, gerincfolyadékot, nyirokfolyadékot, a légző-, bél-, húgyés ivarszervi traktus külső részeit, nyálat, könnyet, tejet, fehérvérsejteket és mielómákat, de nemcsak ezekre korlátozódnak.

Ahogyan itt használjuk, a „tisztított HCV” kifejezés olyan készítményre utal, amelyet elkülönítettünk azoktól a sejtalkotórészektől, amelyekkel a vírus normálisan egyesítve van, és azoktól a más típusú vírusoktól, amelyek jelen lehetnek a fertőzött szövetben. A vírusok izolálására szolgáló technikák ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak, ilyen például a centrifugálás és affinitáskromatográfia; tisztított HÍV előállítására szolgáló eljárásokat ismertetünk a későbbiekben.

A jelen találmány gyakorlati megvalósításához, hacsak másképpen nem jelezzük, a molekuláris biológia, mikrobiológia, rekombináns DNS-technika és immunológia hagyományos technikáit alkalmazzuk, amely technikák belül vannak a szakterületen való általános jártasság keretein. Az ilyen technikákat az irodalomban részletesen elmagyarázzák. Lásd például Maniatis, Fritsch és Sambrook: MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING I. és II. kötet (szerkesztő: Glover D. N.) (1985); OLIGONUCLEOTIDE SYTNHESIS (szerkesztő: Gait M. J.) (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (szerkesztők: Hames B. D. és Higgins S. J.) (1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (szerkesztők: Hames B. D. és Higgins S. J.) (1984); ANIMAL CELL CULTURE (szerkesztő: Freshney R. I.) (1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); Perbal B.: A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); a „METHODS IN ENZYMOLOGY” című sorozat (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FÓR MAMMALIAN CELLS (szerkesztők: Miller J. H. és Calos Μ. P.) (Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); Methods in Enzymology 154. kötet (szerkesztők: Wu és Grossman); Methods in Enzymology 155. kötet (szerkesztő: Wu); IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (szerkesztők: Mayer és Walker (Academic Press, London, 1987); Scopes: PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE 2. kiadás (Springer Verlag, New York, 1987); HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, I-IV. kötet (szerkesztők: Weir D. M. és Blackwell C. C.) (1986).

Minden szabadalmi leírás, közzétett szabadalmi bejelentés és közlemény, amelyet eddig említettünk vagy ezután említünk, referenciaként épül be a jelen bejelentésbe.

A jelen találmány alkalmas anyagai és eljárásai szorosan homológ nukleotidszekvenciák családjának elkészítését teszik lehetővé, amely szekvenciákat HCV-vel fertőzött csimpánzok plazmájában jelen lévő nukleinsavszekvenciákból származó cDNS-könyvtárból izolá9 lünk. A nukleotidszekvenciáknak ez a családja nem emberi és nem csimpánz eredetű, mivel ez nem hibridizál sem humán, sem csimpánz genom DNS-sel nem fertőzött egyének esetében, mivel a szekvenciák ezen családjának nukleotidjai csak HCV-vel fertőzött csimpánzok májában és plazmájában vannak jelen, és mivel ez a szekvencia nincs jelen a Genebankban. Ezenkívül ezeknek a szekvenciáknak a családja nem mutat szignifikáns homológiát azokhoz a szekvenciákhoz, amelyeket a HBV-genom tartalmaz.

A család egyik tagjának a szekvenciája, amely az 5-1-1. kiónon belül található, egy folytonos nyitott leolvasókerettel (ORF) bír, amely egy mintegy 50 aminosavas polipeptidet kódol. A HCV-vel fertőzött emberekből kapott szérumok tartalmaznak olyan antitesteket, amelyek ehhez a polipeptidhez kötődnek, míg a nem fertőzött emberekből származó szérumok nem tartalmaznak antitesteket erre a polipeptidre. Végül, bár a nem fertőzött csimpánzokból származó szérum nem tartalmaz antitesteket erre a polipeptidre, az antitestek indukálódnak csimpánzokban akut NANBH-fertőzést követően. Ezenkívül antitestek erre a polipeptidre nem mutathatók ki HAV-val és HBV-vel fertőzött csimpánzokban és emberekben. Ezen kritériumok alapján a szekvencia cDNS egy vírusszekvenciában, ahol a vírus az NANBH okozója, vagy azzal van összekapcsolva; ezt a cDNS-szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be. Amint a későbbiekben majd tárgyaljuk, az 5-1-1.-ben lévő cDNS-szekvencia annyiban különbözik a többi izolált cDNS-szekvenciájától, hogy 28 többlet bázispárt tartalmaz.

A cDNS-család más azonosított tagjainak egy összetett képződményét, amelyet úgy izoláltunk, hogy az 5-1-1. kiónban lévő cDNS egy fragmentumával ekvivalens szintetikus szekvenciát alkalmaztunk vizsgálómintaként, a 3. ábrában mutatjuk be. A cDNS-család egyik tagját, amelyet a 81. kiónban lévő cDNS-ből származó szintetikus szekvenciát alkalmazva izoláltunk, az

5. ábrán mutatjuk be, és ennek a szekvenciának a 81. klón szekvenciájával való összetett képződményét a

6. ábrán mutatjuk be. A cDNS-család más tagjait, ide értve azokat, amelyek a 12f., 14i., 11b., 7f., 7e., 8h., 33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b„ 25c., 14c., 8f., 33f., 33g., 39c., 35f., 19g. és 15e. kiónokban jelen vannak, egy későbbi fejezetben írjuk le. Az ezekben a kiónokban lévő cDNS-ek egy összetett képződményét íijuk le egy későbbi fejezetben, és mutatjuk be a 32. ábrán. Az összetett cDNS azt mutatja, hogy ez egy folyamatos ORF-et tartalmaz, így egy poliproteint kódol. Ez az adat egybevág azzal a véleménnyel, amelyet a későbbiekben tárgyalunk, hogy a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus.

A cDNS ezen családjának, amelyeket az 1-32. ábrákon mutatunk be (ide értve a határértékeket is), hozzáférhetősége lehetővé teszi DNS-vizsgálóminták és polipeptidek előállítását, amelyek alkalmazhatók a HCV-fertőzésnek tulajdonítható NANBH diagnosztizálásában, és a véradók, az adott vér és vérkészítmények átvizsgálására fertőzöttségre. így például a szekvenciák alapján mintegy 8-10 nukleotidos DNS-oligomereket lehet szintetizálni, vagy nagyobbakat, amelyek alkalmazhatók hibridizációs vizsgálómintaként a vírusgenom jelenlétének kimutatására például olyan egyének szérumában, amelyekről feltételezhető, hogy befogadták a vírust, vagy az adott vér átvizsgálására a vírus jelenlétére. A cDNS-szekvenciák családja lehetővé teszi a HCV-fajlagos polipeptidek tervezését és előállítását, amely polipeptidek diagnosztikus reagensként alkalmazhatók NANBH során kialakuló antitestek jelenlétének kimutatására. A cDNS-ekből származó tisztított polipeptidek elleni antitesteket is alkalmazhatjuk vírusantigének kimutatására fertőzött egyénekben és vérben.

Ezeknek a cDNS-szekvenciáknak az ismerete lehetővé teszi olyan polipeptidek tervezését és előállítását is, amelyek vakcinaként alkalmazhatók HCV ellen, és lehetővé teszi antitestek előállítását is, amelyek viszont a betegség elleni védelemre és/vagy a HCV-vel fertőzött egyének gyógyítására alkalmasak.

Ezenkívül a cDNS-szekvenciák családja lehetővé teszi a HCV-genom további jellemzését.

Az ezekből a szekvenciákból származó polinukleotid vizsgálómintákat alkalmazhatjuk cDNS-könyvtárak átvizsgálására további átfedő cDNS-szekvenciákra, amelyeket viszont további átfedőszekvenciák megszerzésére alkalmazhatunk. Hacsak a genom nincs szegmensekre osztva, és a szegmensek nélkülözik a közös szekvenciákat, ezt a technikát alkalmazhatjuk a teljes genom szekvenciájának összegyűjtésére. Ha azonban a genom szegmensekre van osztva, a genom további szegmenseit a lambda-gt 11 szerológiai átvizsgálóeljárás ismétlésével kaphatjuk meg, amely eljárást az itt leírt cDNS-klónok izolálására alkalmazzuk vagy egy másik módszer szerint a genom izolálásával kaphatjuk meg tisztított HCV-részecskékből.

A cDNS-szekvenciák családja és az ezekből a szekvenciákból származó polipeptidek, valamint az ezek ellen a polipeptidek ellen irányuló antitestek alkalmazhatók a BB-NANBV-ágens vagy -ágensek izolálásában és azonosításában is. így például a cDNS-ekből származó polipeptidekben lévő HCV-epitópok ellen irányuló antitesteket alkalmazhatjuk olyan folyamatokban, amelyek affinitáskromatográfián alapulnak, hogy a vírust izoláljuk. Egy másik eljárás szerint az antitesteket alkalmazhatjuk más technikákkal izolált vírurészecskék azonosítására. A vírusantigéneket és a genomanyagot az izolált vírusrészecskéken belül azután tovább jellemezhetjük.

A HCV-genom vagy genomok további szekvenciaelemzéséből, valamint a HCV-antigének további jellemzéséből, és a genom jellemzéséből kapott információk lehetővé teszik további vizsgálóminták, polipeptidek és antitestek tervezését és szintézisét, amelyeket lehet alkalmazni NANBH által indukált HCV diagnózisához, megelőzéséhez és terápiájához, valamint átvizsgáláshoz fertőzött vérre, és vérszármazék jellegű termékekre.

A HCV-hez való vizsgálóminták, beleértve az antigéneket és antitesteket, valamint az abból a genomból, amelyből a cDNS-ek családja származik, származó polinukleotidok hozzáférhetősége lehetővé teszi olyan szövettenyésztő rendszerek kifejlesztését is, amelyek jelentős alkalmazást nyerhetnek a HCV biológiájának tisztázásában. Ez viszont új kezelési menetrend kifejleszté10

HU 216 017 Β séhez vezethet, amely olyan vírusellenes anyagokon alapul, amelyek gátolják a HCV replikációját vagy a HCV által előidézett fertőzést.

Az NANBH-hoz tartozó etiológiai ágens azonosítására és izolálására alkalmazott eljárás új, és alkalmazható olyan, eddig nem jellemzett ágensek azonosítására és/vagy izolálására, amelyek egy genomot tartalmaznak, és amelyek különféle betegségekkel társulnak, beleértve azokat a betegségeket, amelyeket vírusok, viroidok, baktériumok, gombák és paraziták okoznak. Ebben a módszerben cDNS-könyvtárat alakítunk ki egy fertőzött egyénből származó fertőzött szövetben jelenlévő nukleinsavakból. A könyvtárat egy olyan vektorban alkotjuk meg, amely lehetővé teszi a cDNS-ben kódolt polipeptidek kifejeződését. A vektort, amely az etiológiai ágens polipeptidjének immunológiailag reaktív fragmentumát fejezi ki, tartalmazó gazdasejtek kiónjait a könyvtár kifejezési termékeinek immunológiai átvizsgálásával választjuk ki, az átvizsgálást a feltételezett ágenssel előzőleg fertőzött másik egyénből vett, antitestet tartalmazó testkomponenssel végezve. Az immunológiai átvizsgálótechnika lépései közt találjuk a cDNS-t tartalmazó vektorok kifejezési termékeinek kölcsönhatásba léptetését egy második fertőzött egyén antitestet tartalmazó testkomponensével, és a kifejezési termék(ek) és a második fertőzött egyén antitestjei közötti antitest-antigén komplexek keletkezésének kimutatását. Az izolált kiónokat további immunológiai átvizsgálásnak vetjük alá kifejezési terméküket kölcsönhatásba hozva más, feltételezett ágenssel fertőzött és a feltételezett ágenssel nem fertőzött kontrollegyének antitestet tartalmazó testkomponenseivel, és a fertőzött egyénekből származó antitestekkel kialakuló antigénantitest komplexek képződését kimutatva; és izoláljuk azokat a cDNS-tartalmú vektorokat, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, amelyek immunológiailag reagálnak fertőzött egyénekből és az ágenssel fertőzésre gyanús egyénekből kapott antitestekkel, de nem reagálnak a kontrollegyénekkel. A cDNS-könyvtár megalkotásához alkalmazott fertőzött egyéneknek és az immunológiai átvizsgáláshoz alkalmazott egyéneknek nem kell azonos fajba tartozniuk.

Az ennek az eljárásnak az eredményeképpen izolált cDNS-ek, ezek kifejezési termékei, és a kifejezési termékek ellen irányuló antitestek hasznosak az etiológiai ágens jellemzésében és/vagy kinyerésében. Amint a későbbiekben részletesen leírjuk, ezt az eljárást sikeresen alkalmazzuk a HCV-genomból származó cDNS-ek családjának izolálására.

A cDNS-szekvencia előállítása

Krónikus HCV-fertőzésben szenvedő és a vírus magas titerét [vagyis legalább 10⁶ csimpánz fertőző dózis/ml (CID/ml)] tartalmazó csimpánzból összegyűjtött szérumot alkalmazunk vírusrészecskék izolálására; az ezekből a részecskékből izolált nukleinsavakat alkalmazzuk templátként a vírusgenomra vonatkozó cDNSkönyvtár megalkotásában. A vélt HCV-részecskék izolálására és a lambda-gt 11-ben a cDNS-könyvtár megalkotására szolgáló munkameneteket egy későbbi fejezetben tárgyaljuk. A lambda-gtll olyan vektor, amelyet speciálisan arra fejlesztettek ki, hogy beiktatott cDNS-eket fejezzen ki béta-galaktozidázzal képzett fúziós polipeptidként, és nagyszámú rekombináns fágot vizsgáljon át meghatározott antigén ellen kialakított fajlagos antiszérumokkal. A mintegy 200 bázispár átlagos méretű cDNS-t tartalmazó cDNS-készletből kialakított lambda-gtll cDNS-könyvtárat átvizsgáljuk olyan kódolt epitópokra, amelyek fajlagosan képesek kötődni olyan betegekből eredő szérumokkal, akiknél előzőleg NANB-hepatitist tapasztaltak [Huynh T. V. és munkatársai (1985)]. Mintegy 10⁶ fágot vizsgálunk át, és 5 pozitív fágot azonosítunk, tisztítunk, majd átvizsgáljuk kötési fajlagosságra olyan szérumokhoz, amelyek más, a HCV-ágenssel előzőleg fertőzött emberekből és csimpánzokból származnak. A fágok egyike, az 5-1-1. kötődik a 8 megvizsgált humán szérum közül 5-höz. Ez a kötés, úgy tűnik, szelektív azokból a betegekből származó szérumokra nézve, akik előzőleg NANB-hepatitisfertőzésen estek át, mivel 7 normális véradó széruma nem mutat ilyen kötést.

Az 5-1-1. rekombináns fágban a cDNS szekvenciáját meghatározzuk, amint ezt az 1. ábrában bemutatjuk. Az ezzel a klónozott cDNS-sel kódolt polipeptidet, amely azonos transzlációs keretben van, mint a fúziós polipeptid N-terminális béta-galaktozidáz része, a nukleotidszekvencia fölött mutatjuk be. Ez a transzlációs ORF tehát olyan epitópot kódol, amelyet NANB-hepatitisfertőzésben szenvedő betegekből származó szérumok fajlagosan felismernek.

A cDNS hozzáférhetősége az 5-1-1. rekombináns fágban lehetővé teszi más kiónok izolálását, amelyek a cDNS további szegmenseit és/vagy alternatív szegmenseit tartalmazzák a vírusgenomhoz viszonyítva. A fentebb leírt lambda-gtll cDNS-könyvtárat átvizsgáljuk egy olyan szintetikus polinukleotidot alkalmazva, amely a klónozott 5-1-1. cDNS-szekvenciájából származik. Ez az átvizsgálás három további kiónt termel, amelyeket 81., 1-2. és 91. klónként azonosítunk; az ezekben a kiónokban lévő cDNS-eket szekvenciaelemzésnek vetjük alá. A homológiákat a négy független klón között a 2. ábrán mutatjuk be, ahol a homológiákat függőleges vonalakkal jelezzük. Azokat a nukleotidszekvenciákat, amelyek egyediként vannak jelen az 5-1-1., 81. és 91. kiónokban, kis betűkkel jelöljük.

Az 5-1-1., 81., 1-2. és 91. kiónokban lévő rekombináns fágokban jelen lévő klónozott cDNS-ek nagymértékben homológok, és csak két területben különböznek. Először a 67. számú nukleotid az 1-2. kiónban timidin-, míg a további három klón citidingyököt tartalmaz ezen a helyen. Ez a helyettesítés azonban nem változtatja meg a kódolt aminosav természetét.

A második különbség a kiónok között az, hogy az 5-1-1. klón 28 bázispárt tartalmaz 5’-terminálisán, amely a többi kiónban nincs jelen. A többletszekvencia lehet egy 5’-terminális klónozási „tennék”; 5’-terminális klónozási termékek gyakran figyelhetők meg a cDNSeljárások termékeiben.

A 81. kiónban lévő HCV cDNS 5'-területéből és 3'-területéből származó szintetikus szekvenciákat alkalmazunk a lambda-gtll NANBV cDNS-könyvtárból

HU 216 017 Β való olyan cDNS-ek átvizsgálására és izolálására, amelyek átfedik a 81. klón cDNS-t. Az így létrejövő cDNSek szekvenciáit, amely cDNS-ek a 36., illetve 32. kiónban vannak, az 5., illetve 7. ábrán mutatjuk be.

Hasonlóképpen a 36. klón 5’-területén alapuló szintetikus polinukleotidot alkalmazunk a lambda-gtll NANBV cDNS-könyvtárból származó cDNS-ek átvizsgálására és izolálására, amely cDNS-ek átfedik a 36. klón cDNS-t. Egy rekombináns fágot tartalmazó cDNS tisztított kiónját, amely hibridizál a szintetikus polinukleotid vizsgálómintához, 35. klónnak nevezzük, és az ezen a kiónon belül található NANBV cDNS-szekvenciát a 8. ábrán mutatjuk be.

Átfedő cDNS-szekvenciák izolálásának ezt a technikáját alkalmazva további felfelé és lefelé lévő cDNSszekvenciákat tartalmazó kiónokat kapunk. Ezeknek a kiónoknak az izolálását a későbbiekben írjuk le.

Az izolált kiónokon belül kódolt HCV cDNS-ek nukleotidszekvenciájának elemzése azt mutatja, hogy az összetett cDNS egy hosszú, folyamatos ORF-et tartalmaz. A 26. ábra mutatja be az ezekből a klónokból összetett cDNS szekvenciáját az ebben kódolt vélt HVC-polipeptiddel együtt.

Az eljárás leírása a cDNS-szekvenciák újrakinyerésére jórészt csak történeti érdekességű. Az így létrejövő szekvenciákat (és komplementereiket) megadjuk itt, és ezeket a szekvenciákat vagy bármely részüket szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő, vagy szintetikus eljárásokat kombinálva részleges szekvenciák kinyerésével, hasonló eljárásokat alkalmazva, mint amelyeket leírtunk.

A HCV cDNS-könyvtárból az 5-1-1., 81., 1-2. és 91. kiónokból replikáit lambda-gtll törzseket az American Type Culture Collectionnál (ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852) deponáltuk a Budapesti Szerződés feltételei szerint; ezek az alábbi letéti

számot kapták:
lambda-gtll	ATCC	A letét napja
HCV cDNS-könyvtár	40 394	1987. december 1.
81. klón	40388	1987. november 17.
91. klón	40389	1987. november 17.
1-2. klón	40390	1987. november 17
5-1-1. klón	40391	1987. november 18

A jelzett deponált törzseket harminc (30) éves időtartamon át fenn kell tartani a deponálás időtartamától számítva vagy öt (5) évig a deponált törzsre való legutolsó igényléstől számítva, vagy az amerikai egyesült államokbeli szabadalom alkalmazható élettartamáig attól függően, melyik hosszabb. Ezek a deponált törzsek és más itt említett deponált törzsek csak a könynyebb alkalmazást szolgálják, és nem feltétlenül szükségesek a jelen találmány gyakorlatba vételéhez az itt mellékelt leírás alapján. Az összes deponált anyagban lévő HCV cDNS-szekvenciák referenciaként épülnek be a jelen bejelentésbe.

A fenti leírás, amelyben a genomot „sétáltatjuk” átfedő cDNS-szekvenciákat izolálva a HCV lambda-gtl 1 könyvtárból, olyan eljárást nyújt, amellyel a teljes HCV-genomnak megfelelő cDNS-ek izolálhatok. Az itt megadott információk alapján más, ezeknek a cDNS-eknek az izolálására szolgáló eljárások nyilvánvalók azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ezek közül a módszerek közül néhányat leírunk a későbbiekben.

Víruspolipeptidek és fragmentumaik előállítása

A cDNS-szekvenciák hozzáférhetősége, akár azoké, amelyek az 1-32. ábrákon lévő cDNS-szekvenciák alkalmazásával izolálunk, amint ezt később leírjuk, akár az ezeken az ábrákon lévő cDNS-szekvenciáké, lehetővé teszi a bármelyik szálban kódolt polipeptid antigénszempontból aktív területét kódoló kifejező vektorok megalkotását. Ezek az antigénszempontból aktív területek származhatnak a burkoló- vagy „burok”-antigénekből, vagy a belső antigénekből, ide értve például a polinukleotidkötő fehéijéket, polinukleotid polimerázt vagy polimerázokat, és más olyan vírusfehérjéket, amelyek szükségesek a vírusrészecskék replikációjához és/vagy összeállításához. A kívánt polipeptideket kódoló fragmentumok a cDNS-klónokból származnak hagyományos restrikciós emésztést vagy szintetikus eljárásokat alkalmazva, és olyan vektorokba vannak ligáivá, amelyek tartalmazhatják például fúziós szekvenciák részeit; ilyen fúziós szekvenciák lehetnek például a béta-galaktozidáz vagy szuperoxid-diszmutáz (SÓD), előnyösebb a SÓD. Azok az eljárások és vektorok, amelyek olyan polipeptidek előállítására alkalmasak, amelyek SÓD fúziós szekvenciáit tartalmazzák, a 0,196,056 számú európai szabadalmi közzétételi iratban vannak leírva; ez 1986. október 1-jén lett közzétéve. SÓD- és HCV-polipeptidek fúziós polipeptidjeit, vagyis az NANB₅._M-et, NANB_gl-et és C100-3-at - amelyek HCV cDNS-ek összetett termékében kódolódnak - kódoló vektorokat a továbbiakban írjuk le. Egy nyitott leolvasókeretet tartalmazó HCV cDNS bármilyen kívánt részét, bármelyik „értelmes” szálban, megkaphatjuk rekombináns polipeptidként, úgymint érett vagy fúziós fehérjét; egy másik módszer szerint a cDNS-ben kódolt polipeptidet kémiai szintézissel kaphatjuk meg.

A kívánt polipeptidet kódoló DNS-t, akár fúziós vagy érett formában van, akár tartalmaz egy szignálszekvenciát a kiválasztás lehetővé tételére, akár nem, ligálhatjuk bármilyen megfelelő gazdaszervezethez alkalmas kifejezővektorba. Mind eukarióta-, mind prokarióta-rendszereket alkalmaznak jelenleg rekombináns polipeptidek képzésére, és több közös szabályozó rendszer és gazdasejtvonal összefoglalása van megadva a későbbiekben. A polipeptidet azután a lizált sejtekből vagy a tenyészközegből izoláljuk, és addig a mértékig tisztítjuk, amely szándékolt felhasználásához szükséges. A tisztítás a szakterületen ismert technikákkal lehetséges, például sófrakcionálással, ioncserélő gyantán végzett kromatografálással, affinitáskromatográfiával, centrifugálással és hasonlókkal. A Methods in Enzymology című sorozat számos módszert közöl fehérjék tisztítására. Az ilyen polipeptidek alkalmazhatók diagnosztikumként, vagy azokat, amelyek semlegesítőantitesteket idéznek elő, vakcinákká szerelhetjük ki. Az ezek ellen a polipeptidek elleni antitesteket is alkalmazhatjuk diagnosztikumként, vagy passzív immunterápiához. Ezenkívül, amint ezt később leírjuk, az ezen polipepti12 dek elleni antitestek alkalmasak HVC-részecskék izolálására és azonosítására.

A HCV-antigéneket izolálhatjuk HCV-virionokból is. A virionokat növeszthetjük HCV-vel fertőzött sejtekben szövettenyészetben, vagy valamely fertőzött gazdaszervezetben.

Antigénpolipeptidek előállítása és konjugálása hordozóval

Valamely polipeptid antigénterülete általában viszonylag kicsiny - tipikusan 8-10 aminosav hosszúságú, vagy rövidebb. Akár 5 aminosavból álló fragmentumok is jellemezhetnek már egy antigénterületet. Következésképpen a HCV cDNS-ét alkalmazva alapként a HCV-polipeptidek rövid szegmenseit kódoló DNS-eket fejezhetünk ki akár fúziós fehérjeként, akár izolált polipeptidként. Ezenkívül rövid aminosavszekvenciákat könnyen megkaphatunk kémiai szintézissel. Azokban a példákban, ahol a szintetizált polipeptid korrekt konfigurációjú úgy, hogy a korrekt epitópot nyújtja, de túl kicsi ahhoz, hogy immunogén legyen, a polipeptidet megfelelő hordozóhoz kapcsolhatjuk.

Sok olyan technika ismeretes a szakterületen, amellyel ilyen kapcsolások elvégezhetők, ide értve a diszulfidkötések képzését N-szukcinimidil-3-(2-piridiltio)-propionátot (SPDP) és szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-l-karboxilátot (SMCC) alkalmazva, amelyek a Pierce Company (Rockford, Illinois) termékei (ha a pepiidben nincs szulfhidrilcsoport, ezt egy ciszteingyök hozzáadásával lehet biztosítani). Ezek a reagensek diszulfidkötést alakítanak ki maguk és a peptid ciszteingyökök között az egyik fehérjén, és amidkötést alakítanak ki egy lizinen lévő epszilon-amino-csoporttal, vagy más szabad aminocsoporttal a másik fehérjén. Sokféle ilyen diszulfid/amid képző ágens ismeretes. Ezzel kapcsolatban lásd például Immun. Rév., 62, 185 (1982). Más bifunkcionális kapcsolóágensek diszulfídkötések helyett tio-étert képeznek. Ezek közül a tio-éter-képző ágensek közül sok kapható a kereskedelmi forgalomban, ide tartoznak a 6-maleimido-kapronsav, 2-bróm-ecetsav, 2-jód-ecetsav, 4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1 -karbonsav reaktív észterei, és hasonlók. A karboxilcsoportokat úgy aktiválhatjuk, hogy kombináljuk ezeket szukcinimiddel vagy l-hidroxi-2-nitro-4-szulfonsav nátriumsóval. A fentebb leírt lista nem meríti ki az összes lehetőségeket, és természetesen a nevezett vegyületek módosulatait is alkalmazhatjuk.

Bármilyen hordozót alkalmazhatunk, amely önmagában nem váltja ki a gazdaszervezetre káros antitestek képződését. A megfelelő hordozók tipikusan nagy, lassan metabolizáló makromolekulák, például fehérjék, poliszacharidok, például latexfunkcionalizált Sepharose, agaróz, cellulózgyöngyök és hasonlók; polimer aminosavak, például poliglutaminsav, polilizin és hasonlók, aminosavkopolimerek és inaktív vírusrészecskék, lásd például a következő fejezetet. Különösen hasznos fehérjeszubsztrátumok a szérumalbuminok, Keyhole-Limpet-hemicianin, immunglobulin-molekulák, tiroglobulin, ovalbumin, tetanusz toxoid és más fehérjék; mindezek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak.

HCV-epitöpokat tartalmazó hibrid részecskeimmunogének előállítása

A HCV-epitópjainak immunogén voltát fokozhatjuk úgy is, hogy emlős- vagy élesztőrendszerekben állítjuk elő ezeket részecskeképző fehérjékkel fuzionálva vagy összekapcsolva, például hepatitis B felületi antigénnel összekapcsolva. Azok a konstrukciók, ahol az NANBVepitóp közvetlenül van összekapcsolva a részecskeképző fehérjét kódolószekvenciával, olyan hibrideket képeznek, amelyek immunogének a HCV-epitóp tekintetében. Ezenkívül az összes előállított vektor olyan epitopokat foglal magában, amelyek HBV-re fajlagosak, és az immunogenicitás különböző fokozataival bírnak, ilyen például a pre-S peptid. így azok a részecskék, amelyek HCV-szekvenciákat magukban foglaló részecskeképző fehérjékből vannak megalkotva, immunogének a HCV-t és a HBV-t illetően.

A hepatitis felületi antigénről (HBSAg) kimutatták, hogy képezhető, és részecskékbe állítható össze S. cerevisiae-ban [Valenzuela és munkatársai (1982)], valamint például emlőssejtekben [Valenzuela P. és munkatársai (1984)]. Az ilyen részecskék keletkezéséről kimutatták, hogy fokozzák a monomer alegység immunogén voltát. A konstrukciók magukban foglalhatják a HBSAg immundomináns epitópját is, ez az előfelületi (pre-S) terület 55 aminosavát foglalja magában [Neurath és munkatársai (1984)]. Az élesztőben kifejezhető pre-S HBSAg-részecskéket a 174,444 számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti; a heterológ vírusszekvenciákat magában foglaló hibrideket élesztő kifejezéshez a 175,261 számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti. Mindkét bejelentést a jelen találmány bejelentői tették, ezek a jelen bejelentésbe referenciaként épülnek be. Ezek a konstrukciók kifejezhetők emlőssejtekben is, például kínaihörcsögpetefészek-(CHO) sejtekben, SV40-dihidrofolát reduktáz vektort alkalmazva [Michaelis és munkatársai (1984)].

Ezenkívül a részecskeképző fehérjét kódolószekvencia részeit helyettesíteni lehet valamely HCV-epitópot kódoló kodonokkal. Ebben a helyettesítésben azok a területek, amelyek nem szükségesek az egységek aggregációjának közvetítésében, hogy immunogén részecskék keletkezzenek élesztőkben vagy emlősökben, kiiktathatók, így kiküszöbölhetők további HBV-antigén helyek a HCV-epitóppal való versengésből.

Vakcinák előállítása

Vakcinákat állíthatunk elő HCV cDNS-ből származó, valamint az 1 -32. ábrákon lévő cDNS-szekvenciákból származó, vagy olyan HCV-genomból származó immunogén polipeptidből vagy polipeptidekből, amelyek a genomnak megfelelnek. A megfigyelt homológia a HCV és a Flavivírusok között információt nyújt azokat a polipeptideket illetően, amelyek valószínűleg leghatékonyabbak vakcinaként, valamint a genom azon területeit illetően, amelyekben ezek kódolódnak. A Flavivírusgenom általános szerkezetét Rice és munkatársai tárgyalják (1986). A Flavivírusgenom-RNS-ről úgy véljük, hogy csak vírusspecifíkus mRNS-fajta, és három vírus szerkezeti fehérjévé, vagyis a C-, M- és E-fehérjékké, valamint két nagy, nem szerkezeti fehérjék

HU 216 017 Β komplex sorozatává transzlatálódik. Ismeretes, hogy a Flavivírushoz tartozó nagyobb semlegesítőepitóp, az E (burkolati) fehérjében tartózkodik [Roehrig (1986)]. A megfelelő HCV E-gén és polipeptidkódoló terület kikövetkeztethető a Flavivírushoz való homológia alapján. így a vakcinák olyan rekombináns polipeptidekből állhatnak, amelyek a HCV E-epitópjait tartalmazzák. Ezek a polipeptidek kifejeződhetnek baktériumokban, élesztőben vagy emlőssejtekben, vagy más módszer szerint izolálhatok víruskészítményekből. Az is előre jelezhető, hogy a további szerkezeti fehéijék szintén tartalmazhatnak olyan epitópokat, amelyek védőhatású anti-HCV-antitesteket alakítanak ki. így az E-, C- és M-epitópokat tartalmazó polipeptidek szintén alkalmazhatók a HCV-vakcinákban, akár egyedül, akár kombinációban.

A fentieken kívül kimutatták, hogy az immunizálás NSl-gyel (1. számú nem szerkezeti fehéije) védelmet eredményez a sárgaláz ellen [Schlesinger és munkatársai (1986)]. Ez valóban igaz, bár az immunizálás nem alakít ki semlegesítőantitesteket. így különösen azért, mert ez a fehérje, úgy tűnik, nagymértékben megőrzött a Flavivírusok között, valószínű, hogy a HCV NS1 szintén védőhatású a HCV-fertőzés ellen. Sőt ez azt is mutatja, hogy nem szerkezeti fehérjék is nyújthatnak védelmet víruspatogenitás ellen, még akkor is, ha ezek nem idézik elő semlegesítőantitestek kialakulását.

A fentiekre tekintettel HCV elleni multivalens vakcinák tartalmazhatnak egy vagy több szerkezeti fehérjét és/vagy egy vagy több nem szerkezeti fehérjét. Ezek a vakcinák állhatnak például rekombináns HCV-polipeptidekből és/vagy a virionokból izolált polipeptidekből. Ezenkívül lehetséges inaktivált HCV-t is alkalmazni vakcinákban; az inaktiválás történhet víruslizátumok előállításával vagy más, a szakterületen ismert módon, amely a Flavivirusok inaktiválását idézi elő; ilyen lehet például a kezelés szerves oldószerekkel vagy detergensekkel, vagy kezelés formalinnal. Ezenkívül vakcinákat készíthetünk gyengített HCV-törzsekből is. A legyengített HCV-törzsek előállítását a későbbiekben íijuk le.

Ismeretes, hogy bizonyos fehéijék a Flavivírusokban nagymértékben megőrzött területeket tartalmaznak, így bizonyos immunológiai keresztreaktivitás várható a HCV- és más Flavivirusok között. Lehetséges, hogy a Flavivirusok és HCV közt osztozó epitópok váltanak ki védőantitesteket az ezen patogén ágensek által okozott egy vagy több rendellenesség ellen. Ezért lehetséges ezen ismeret alapján többcélú vakcinákat tervezni.

Olyan vakcinák előállítása, amely aktív alkotórészként immunogén polipeptidet vagy polipeptideket tartalmaz, ismeretes azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az ilyen vakcinák tipikusan injektálható vakcinaként készülnek, vagy folyékony oldatokként, vagy szuszpenziókként; készíthetők olyan szilárd formák is, amelyek injektálás előtt alakíthatók át oldatokká vagy szuszpenziókká. A készítmény lehet emulgeált formában is, vagy a fehérje lehet liposzómákba burkolva. Az aktív immunogén alkotórészek gyakran össze vannak keverve kötőanyagokkal, amelyek gyógyászatilag elfogadhatók, és összeférhetők az aktív alkotórésszel. Megfelelő kötőanyagok például a víz, fiziológiás sóoldat, glükóz, glicerin, etanol vagy hasonlók, és ezek kombinációi. Ezenkívül, ha szükséges, a vakcina tartalmazhat kis mennyiségben kiegészítő anyagokat, például nedvesítő- vagy emulgeálószereket, pH-pufferoló ágenseket és/vagy olyan adjuvánsokat, amelyek fokozzák a vakcina hatékonyságát. Hatékony adjuvánsokra példák lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az alumíniumhidroxid, N-acetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamin (trh-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-izoglutamin (GGP 11 637, amelyet nor-MDP-nek is neveznek), N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2(1 ’ -2 ’ -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-foszforil-oxi)etil-amin (CGP 19 835A, amelyet MTP-PE-nek is neveznek) és RIBI, amely három komponensből áll, baktériumokból extrahálva: monofoszforil lipid A-ból, trehalóz dimikolátból és sejtfalvázból (MPL+TDM+CWS) 2% szkvalén/Tween 80 emulzióban. Egy adjuváns hatékonyságát úgy határozhatjuk meg, hogy méijük egy HCV-antigén szekvenciát tartalmazó immunogén polipeptid ellen irányuló antitestek mennyiségét, ahol ez ezen polipeptid olyan vakcinákban való beadásának eredménye, amely a különböző adjuvánsokat is tartalmazza.

A vakcinákat alkalmasan parenterálisan, injekció formájában adjuk be, például szubkután vagy intramuszkulárisan. A további kiszerelések között, amelyek alkalmasak a beadás más módjaihoz, találjuk a végbélkúpokat és bizonyos esetekben az orális kiszereléseket. A végbélkúpoknál a hagyományos kötőanyagok és hordozók között találjuk például a polialkiénglikolokat vagy a triglicerideket; az ilyen végbélkúpokat olyan keverékből alakíthatjuk ki, amelyben az aktív alkotórész 0,5-10% közti tartományban, előnyösen az 1-2% közötti tartományban van. Az orális kiszereléseknél alkalmazhatjuk a normálisan használt segédanyagokat, például gyógyászati minőségű mannitot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, szacharin-nátriumot, cellulózt, magnézium-karbonátot és hasonlókat. Ezek a kompozíciók oldatok, szuszpenziók, tabletták, pirulák, kapszulák, hosszan tartó kibocsátású kiszerelések vagy porok formáját vehetik fel, és 10-95%, előnyösen 25-70% aktív alkotórészt tartalmaznak.

A fehérjéket a vakcinákban semleges vagy só formájában szerelhetjük ki. A gyógyszerészetileg elfogadható sók között találjuk a savaddíciós sókat (amelyek a peptid szabad aminosavaival képződnek), azokat, amelyek szervetlen savakkal képződnek, ilyenek például a sósav vagy foszforsav, és azokat, amelyek szerves savakkal képződnek, ilyenek például az oxálsav, borkősav, maleinsav stb. A szabad karboxilcsoporttal képzett sók származhatnak szervetlen bázisokból, például nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- vagy vas(III)-hidroxidokból és szerves bázisokból, példád izopropilaminból, trimetil-aminból, 2-etil-amino-etanolból, hisztidinből, prokainból stb.

A vakcinák adagolása és beadása

A vakcinákat olyan módon adjuk be, hogy ez illeszkedjék a dózis kiszereléséhez, és olyan mennyiségben, amely profilaktikusan és/vagy terápiásán hatékony.

A beadandó mennyiség, amely általában 5 mikrogramm és 250 mikrogramm antigén között van adagonként, függ a kezelendő egyéntől, az egyének immunrendszerének kapacitásától antitestek szintetizálására, és a kívánt védelem mértékétől. A beadandó, szükséges aktív alkotórész pontos mennyisége függ a gyakorló orvos megítélésétől, és egyénenként változó.

A vakcinát be lehet adni egyedi dóziskezelési menetben, vagy előnyösen többszörös dóziskezelési menetben. Egy többszörös dóziskezelési menet például olyan, amelyben a vakcinálás első menete 1-10 külön dózisban történik, ezt követik második dózisként ettől eltérő dózisok az ez utáni időközökben, amelyek az immunválasz fenntartásához vagy újraélesztéséhez szükségesek, például 1 -4 hónapon át, és ha szükséges, következhetnek még további dózisok több hónap után is. Az adagolási munkamenetet - legalábbis részben - meghatározhatják az egyéni szükségletek, és függenek a gyakorló orvos megítélésétől.

Ezenkívül az immunogén HCV-antigént vagy -antigéneket tartalmazó vakcinát beadhatjuk más immunszabályozó ágensekkel, például immunglobulinokkal együtt is.

HCV-epitópok elleni antitestek előállítása

A fentebb leírtak szerint előállított immunogén polipeptideket alkalmazhatjuk mind poliklonális, mind monoklonális antitestek előállítására. Ha poliklonális antitesteket kívánunk, egy kiválasztott emlőst (például egeret, nyulat, kecskét, lovat stb.) immunizálunk valamely, HCV-epitópot vagy -epitópokat hordozó immunogén polipeptiddel. Az immunizált állatból a szérumokat összegyűjtjük, és ismert eljárások szerint kezeljük. Ha egy HCV-epitóp elleni poliklonális antitesteket tartalmazó szérum más antigén elleni antitesteket tartalmaz, a poliklonális antitesteket immun-affinitáskromatográfiával tisztíthatjuk. A poliklonális antiszérumok tisztítására és feldolgozására szolgáló technikák a szakterületen ismertek, lásd például Mager és Walker munkáját (1987).

Egy másik módszer szerint poliklonális antitesteket izolálhatunk olyan emlősből, amelyet előzőleg HCVvel fertőztünk. Egy későbbi fejezetben adunk példát HCV-epitópok elleni antitestek tisztítására fertőzött egyénekből származó szérumból, az eljárás affinitáskromatográfián alapul, és SOD-füziós polipeptidet és egy, az 5-1-1. cDNS-klónon belül kódolt polipeptidet hasznosít.

HCV-epitópok ellen irányuló monoklonális antitesteket bárki, aki a szakterületen járatos, könnyen készíthet. Az általános módszertan monoklonális antitestek előállítására hibridómákkal jól ismert. Nem pusztulóvá tett, antitesttermelő sejtvonalakat alakíthatunk ki sejtfúzióval vagy más technikákkal, például B limfociták közvetlen transzformálásával onkogén DNS-sel, vagy Epstein-Barr-vírussal végzett átfertőzéssel [lásd például Schreier M. és munkatársai (1980); Haemmerling és munkatársai (1981); Kennett és munkatársai (1980); a 4,341,761,4,399,121,4,427,783, 4,444,887,4,466,917, 4,472,500, 4,491,632 és 4,493,890 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások]. HCVepitópok ellen termelt monoklonális antitestek paneljeit különböző tulajdonságokra vizsgálhatjuk át (például izotípus, epitópaffinitás stb.).

Mind a monoklonális, mind a poliklonális antitestek, amelyek HCV-epitópok ellen irányulnak, különösen hasznosak a diagnózisban, és azok, amelyek semlegesítenek, hasznosak a passzív immunterápiában is. A monoklonális antitesteket különösen előnyösen alkalmazhatjuk antiidiotípus antitestek kiváltására.

Az antiidiotípusos antitestek olyan immunglobulinok, amelyek a fertőző ágens, amely ellen a védelem irányul, antigénjének „belső kép”-ét hordozzák [lásd például Nisonoff A. és munkatársai (1981) és Dreesman és munkatársai (1985)].

Az antiidiotípusos antitestek kiváltásának technikái jól ismertek a szakterületen [lásd például Grzych (1985); MacNamara és munkatársai (1984) és Uytdehaag és munkatársai (1985)]. Ezek az antiidiotípusos antitestek alkalmasak lehetnek NANBH kezelésére, valamint HCV-antigének immunogén területei megvilágítására.

Diagnosztikus oligonukleotid vizsgálóminták és készletek

Alapként az izolált HCV bemutatott részleteit alkalmazva, ide értve azokat, amelyeket az 1-32. ábrákon mutatunk be, mintegy 8 vagy több nukleotidból álló oligomereket állítunk elő vagy kimetszéssel, vagy szintézissel, amely oligomerek hibridizálnak a HCVgenommal, és alkalmasak a víruságens vagy -ágensek azonosítására, a vírusgenom vagy -genomok további jellemzésére, valamint a vírus vagy vírusok kimutatására beteg egyénekben. Ezek a HCV-polinukleotidokhoz szolgáló vizsgálóminták (természetesek vagy származékok) olyan hosszúságúak, hogy hibridizálással lehetséges legyen egy egyedi vírusszekvencia kimutatása. 6-8 nukleotid már munkába fogható hosszúság, 10-12 nukleotid előnyös, és mintegy 20 nukleotid tűnik optimálisnak. Ezek a szekvenciák előnyösen olyan területekből származnak, amelyek nélkülözik a heterogén jelleget. Ezeket a vizsgálómintákat rutin módszereket alkalmazva állíthatjuk elő, ide értve az automatizált oligonukleotidszintézis eljárásait. Az alkalmas vizsgálóminták között találjuk például az 5-1-1. kiónt, valamint több, itt ismertetett kiónt, továbbá különböző oligomereket, amelyek cDNS-könyvtárak átvizsgálására alkalmasak, ilyeneket a későbbiekben ismertetünk. A komplementaritás a HCV-genom bármely egyedi részére megfelelő lehet. Vizsgálómintaként való alkalmazáshoz teljes komplementaritás kívánatos, bár ez szükségtelen is lehet, amikor a fragmentum hossza megnövekszik.

Abból a célból, hogy az ilyen vizsgálómintákat diagnosztikumként alkalmazhassuk, az analizálandó biológiai mintát, például vért vagy szérumot kezeljük, ha kívánatos, hogy extraháljuk a bennük lévő nukleinsavakat. A mintából származó nukleinsavakat gélelektroforézisnek vagy más méret szerinti elkülönítésnek vetjük alá; egy másik módszer szerint a nukleinsavakat foltként feljuttathatjuk méret szerinti elkülönítés nélkül. A vizsgálómintákat azután jelzéssel látjuk el. A megfelelő jelzések és az eljárások a vizsgálóminták jelzésére ismeretesek a szakterületen, ezek között találjuk például a radioaktív jelzést, amelyet hézag- (nick) transzlációval vagy kinázos kezeléssel vezetünk be, a biotint, a fluoreszcens vizsgálómintákat és a kemilumineszcens vizsgálómintákat. A mintából kivont nukleinsavakat azután megfelelő szigorúságú hibridizációs körülmények között kezeljük a jelzett vizsgálómintával.

A vizsgálómintákat teljesen komplementerként készíthetjük el a HCV-genomhoz. Ennek megfelelően általában nagy szigorúsági feltételek kívánatosak abból a célból, hogy kizárjuk a hibás pozitív eredményeket. A nagy szigorúságú feltételeket azonban csak akkor alkalmazzuk, ha a vizsgálóminták a vírusgenomnak azon területeivel komplementerek, amelyből hiányzik a heterogenitás. A hibridizálás szigorúságát egy sor tényező határozza meg a hibridizálás során és a mosási munkafolyamat során, beleértve a hőmérsékletet, ionerősséget, időtartamot és formamidkoncentrációt. Ezeket a tényezőket például Maniatis T. (1982) körvonalazza.

Általában várható, hogy a HCV-genom szekvenciák a fertőzött egyének szérumában viszonylag alacsony szinten vannak jelen; ez mintegy ΙΟ²—10³ szekvencia/ml. Ez a szint szükségessé teheti, hogy sokszorozási technikákat alkalmazzunk a hibridizációs vizsgálatokban. Az ilyen technikák a szakterületen ismertek. így például az Enzo Biochemical Corporation „Bio-Bridge” rendszere terminális dezoxinukleotid transzferázt alkalmaz, hogy nem módosított 3’-poli-dT-farkakat adjon egy DNS-vizsgálómintához. A poli-dT-farokkal ellátott vizsgálóminta hibridizál a cél-nukleotidszekvenciához, majd egy biotinnal módosított poli-A-hoz. A 124221 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés olyan DNS-hibridizációs vizsgálatot ír le, amelyben: (1) az elemzendő anyagot egy olyan egyszálú DNS-vizsgálómintához kötik, amely komplementer egy enzimmel jelzett oligonukleotiddal; és (2) az így létrejövő, farokkal ellátott duplexet egy enzimmel jelzett oligonukleotidhoz hibridizálják. A 204510 számú európai szabadalmi bejelentés olyan DNS-hibridizációs vizsgálatot ír le, amelyben a vizsgálandó DNS-t egy olyan vizsgálómintával hozzuk érintkezésbe, amelynek farka, például poli-dT farka és egy sokszorozószála van, amelynek olyan szekvenciája van, amely hibridizál a vizsgálóminta farkához, például poli-A-szekvencia, és amely képes a jelzett szálak többségéhez kötődni. Egy különösen alkalmas technika először magában foglalhatja a cél HCV-szekvenciák sokszorozását a szérumban mintegy 10000-szeresre, vagyis mintegy 10⁶ szekvencia/ml-re. Ez kivihető például Saiki és munkatársai technikájával (1986). A sokszorozott szekvenciákat azután hibridizálási vizsgálatot alkalmazva mutathatjuk ki. Ez a hibridizációs vizsgálat, amely kimutathatja a szekvenciákat 10⁶/ml szinten, olyan nukleinsav-multimereket alkalmaz, amelyek egy egyszálú vizsgálandó nukleinsavhoz kötődnek, és amelyek kötődnek egyszálú jelzett oligonukleotidok sokaságához is. Egy megfelelő oldatfázisú szendvicsvizsgálat, amelyet alkalmazhatunk a jelzett polinukleotid vizsgálómintákkal, és eljárások az ilyen vizsgálóminták előállítására a 225 807 számú európai szabadalmi közzétételi iratban vannak leírva; ezt a bejelentést is a jelen bejelentés bejelentői nyújtották be, és ez ebbe a bejelentésbe referenciaként épül be.

A vizsgálóminták diagnosztikus készletekbe lehetnek csomagolva. A diagnosztikus készletek tartalmazhatják a vizsgálóminta DNS-t, amely jelezve lehet; egy másik eljárás szerint a vizsgálóminta DNS jelzetlen, és a jelzéshez szükséges alkotórészek a készletben találhatók. A készlet tartalmazhat más alkalmasan becsomagolt reagenseket és anyagokat is, amelyek a szóban forgó hibridizációs munkamenethez szükségesek, például standardok, valamint útmutatások a vizsgálat kivitelezésére.

Immunesszé és diagnosztikus készletek

Mindkét polipeptid, amely immunológiailag reagál a HCV-antitesteket tartalmazó szérummal, például azokkal az antitestekkel, amelyek a továbbiakban leírt klónokból származnak, vagy azon belül kódolódnak, vagy ezek származékaival és azokkal az antitestekkel, amelyek az ezekben a polipeptidekben lévő HCV-fajlagos epitópok ellen alakulnak ki, alkalmazható immunesszékben HCV-antitestek jelenlétének kimutatására, vagy a vírus és/vagy vírusantigének kimutatására biológiai mintákban is, ide értve a vér- vagy szérummintákat. Az immunesszék tervezésében sokféle változat érvényesülhet, ezek a szakterületen jól ismertek. így például alkalmazhatunk egy vírusantigént, például egy olyan polipeptidet, amely a későbbiekben leírt HCV cDNS-t tartalmazó kiónok bármelyikéből származó polipeptid, vagy abból a HCV-genomból származó polipeptid, amely genomból a cDNS ezekben a kiónokban származik; egy másik módszer szerint az immunesszé az ezekből a forrásokból származó vírusantigének kombinációját alkalmazhatja. Lehet alkalmazni például olyan monoklonális antitestet, amely egy vírusepitóp vagy -epitópok ellen irányul; egy vírusantigén ellen irányuló monoklonális antitestek kombinációját; azonos vírusantigén ellen irányuló poliklonális antitesteket, vagy eltérő vírusantigének ellen irányuló poliklonális antitesteket. A munkamenet alapulhat például versengésen, vagy közvetlen reakción vagy szendvics típusú vizsgálatokon. A munkamenetek alkalmazhatnak például szilárd rögzítőanyagokat is vagy végezhető a vizsgálat immunkicsapással is. A legtöbb vizsgálat magában foglalja jelzett antitest vagy polipeptid alkalmazását; a jelzés lehet például fluoreszcens, kemilumineszcens, radioaktív, vagy festékmolekula. Ismeretesek olyan vizsgálatok is, amelyekben a vizsgálómintából származó szignálok sokszorozva vannak, ilyenekre példák azok a vizsgálatok, amelyek biotint vagy avidint alkalmaznak, valamint az enzimjelzett és enzimközvetített immunesszék, mint például az ELISA-vizsgálatok.

A HCV Flavivírusmodellje lehetővé teszi a becsléseket a diagnosztikus epitópok valószínű elhelyezkedését illetően a virion szerkezeti fehérjéknél. A C-, pre-Més E-tartományok valószínűleg mind tartalmaznak vírus antigének kimutatására jelentős potenciállal bíró epitópokat, amelyek elsősorban diagnózis céljára szolgálhatnak. Hasonlóképpen a nem szerkezeti fehérjék tartományainál is elvárható, hogy tartalmazzanak fontos diagnosztikus epitópokat (például N55, amely egy vélt polimerázt kódol, és NS1, amely egy vélt komplement16

HU 216 017 Β kötő antigént kódol). Azok a rekombináns polipeptidek vagy víruspolipeptidek, amelyek epitópokat foglalnak magukban ezekből a fajlagos tartományokból, alkalmasak lehetnek vírusantitestek kimutatására véradók vagy fertőzött betegek vérében.

Ezenkívül az E- és/vagy M-fehérjék ellen irányuló antitesteket alkalmazhatjuk vírusantigének kimutatására szolgáló immunesszékben olyan betegeknél, akik HCV által okozott NANBH-ban szenvednek, vagy véradóknál a fertőzés kimutatására. Ezenkívül ezek az antitestek különösen hasznosak akut fázisban lévő donorok és betegek kimutatására.

Olyan készleteket, amelyek immundiagnózishoz alkalmasak, és tartalmazzák a megfelelő jelzett reagenseket, konstruálhatunk a megfelelő anyagok megfelelő csomagolásával megfelelő tárolóedényekbe, beleértve a jelen találmány szerinti polipeptideket, amelyek HCVepitópokat tartalmaznak, vagy olyan antitesteket, amelyek HCV-epitópok ellen irányulnak, a további reagensekkel és anyagokkal együtt, amelyek a vizsgálat kivitelezéséhez szükségesek, valamint a vizsgálati instrukciók megfelelő leírásával együtt.

A HCV-genom, virionok és vírusantigének további jellemzése a virusgenomhoz tartozó cDNS-böl származó vizsgálómintákat alkalmazva

A HCV cDNS-szekvencia információkat, amelyek a későbbiekben ismertetett kiónokban és az 1-32. ábrákon találhatók, alkalmazhatjuk további információk gyűjtésére a HCV-genom szekvenciájával kapcsolatban, valamint a HCV-ágens azonosításához és izolálásához, így ezek segítséget nyújthatnak a jellemzéshez, beleértve a genom természetét, a vírusrészecskék szerkezetét, és azoknak az antigéneknek a szerkezetét, amelyekből ezek össze vannak állítva. Ezek az információk viszont további polinukleotid vizsgálómintákhoz, HCV-genomból származó polipeptidekhez és HCV-epitópok ellen irányuló olyan antitestekhez vezethetnek, amelyek alkalmasak lehetnek a HCV által okozott NANBH diagnózisához és/vagy kezeléséhez.

A fentebb említett kiónokban lévő cDNS-szekvencia információk alkalmasak vizsgálóminták tervezésére további cDNS-szekvenciák izolálására, amelyek annak a HCV-genomnak vagy genomoknak még nem definiált területeiből származnak, amelyekből a kiónokban lévő cDNS-ek származnak. így például mintegy 8 vagy több nukleotidot, előnyösen 20 vagy több nukleotidot, amelyek az 1., 3., 6., 9., 14. és 32. ábrákon bemutatott HCV cDNS-szekvenciák családjának 5’-terminálisához vagy 3'-terminálisához közeli területből származnak, tartalmazó szekvenciát tartalmazó jelzett vizsgálómintákat alkalmazhatunk átfedő cDNS-szekvenciák izolálására HCV cDNS-könyvtárakból. Ezek a szekvenciák, amelyek a cDNS-eket átfedik a fentebb említett kiónokban, de amelyek olyan szekvenciákat is tartalmaznak, amelyek azokból a genomterületekből erednek, amelyekből cDNS-ek a fentebb említett ki ónokban nem származnak, alkalmazhatók ezután vizsgálóminták szintéziséhez más, olyan átfedőfragmentumok izolálásához, amelyek nem szükségszerűen fedik át a kiónokban lévő cDNS-eket. Hacsak a HCV-genom nincs szegmentálva, és a szegmensekből hiányoznak a közös szekvenciák, lehetséges a teljes vírusgenom vagy -genomok szekvencia-elemzése a vírusgenomból vagy -genomokból származó átfedő cDNS-ek izolálásának technikáját alkalmazva. Bár ez nem valószínű, ha a genom olyan szegmensekből álló genom, amelyekből hiányoznak a közös szekvenciák, a genom szekvenciáját úgy határozhatjuk meg, hogy lambda-gt 11 HCV cDNS-könyvtárat szerológiai módszerekkel vizsgáljuk át, amint ezt az 5-1-1. klón izolálásánál alkalmazzuk, a cDNS-izolátumokat szekvenciaelemzésnek vetjük alá, és az izolált cDNS-eket alkalmazzuk átfedőfragmentumok izolálására azt a technikát alkalmazva, amelyet a kiónok izolálására és szekvenciaelemzésére írunk le. Az izolált genomszekvenciákat azután klónozhatjuk, és szekvenciájukat elemezhetjük. így az itt nyújtott információval lehet a HCV-genomot vagy -genomokat klónozni, és szekvenciájukat elemezni természetüktől függetlenül.

A cDNS-könyvtárak megalkotásának eljárásai ismeretesek a szakterületen, ezeket tárgyaltuk a korábbiakban is, és tárgyaljuk a későbbiekben is (lásd például a HCV cDNS-könyvtárak megalkotására szolgáló egyik eljárást). A cDNS-könyvtárak azonban, amelyek alkalmasak nukleinsav vizsgálóminták átvizsgálására, megalkothatok más, a szakterületen ismert vektorokban is, például lambda-gt 10-ben [Huynh és munkatársai (1985)]. Az 1-32. ábrákon lévő cDNS-ekből származó, vizsgálómintákkal kimutatott, és az ezekből a cDNS-ekből származó polinukleotidokból szintetizált vizsgálómintákból eredő HCV-eredetű cDNS-t a kiónból izolálhatjuk az izolált polinukleotid emésztésével megfelelő restrikciós enzimmel vagy enzimekkel, majd szekvencia-elemzésnek vethetjük alá. A továbbiakban módszereket ismertetünk azoknak a HCV cDNS-eknek az izolálására és szekvenciaelemzésére alkalmazott technikákkal kapcsolatban, amelyek átfednek HCV cDNS-t az 5-1-1. kiónban; azoknak a HCV cDNS-eknek az izolálására és szekvenciaelemzésére alkalmazott technikákkal kapcsolatban, amelyek átfednek HCV cDNS-t a 81. kiónban; és egy olyan klón izolálásával és szekvenciaelemzésével kapcsolatban, amely egy másik olyan kiónt (36. klón) fed át, amely a 81. kiónt fedi át.

Az ezekből az átfedő HCV cDNS-ekből eredő szekvenciainformációk alkalmasak a vírusgenomon vagy -genomokon belül a homológia és heterogenitás területeinek meghatározására, amelyek jelezhetik a genom különböző törzseinek jelenlétét, és/vagy a hiányos részecskék populációjának jelenlétét. Ez alkalmas hibridizációs vizsgálóminták tervezésére is HCV- vagy HCV-antigének, vagy HCV-nukleinsavak kimutatására biológiai mintákban, és a HCV izolálása során (amelyet később tárgyalunk). Ezenkívül az átfedő cDNS-eket alkalmazhatjuk kifejezővektorok megalkotására olyan HCV-genomból vagy -genomokból származó polipeptidekhez, amely genomok az 5-1-1., 36., 81., 91. és 1-2. kiónokban, és más kiónokban kódolt polipeptideket is kódolnak. Az ezeknek a HCV-epitópokat tartalmazó polipeptideknek megalkotására szolgáló technikák, valamint az ezeken belül található HCV-epitópok ellen irányuló antitestekhez szolgáló technikák, valamint ezek alkalmazá17

HU 216 017 Β sai analógok azzal, amelyet az 5-1-1., 32., 35., 36., 1-2., 81. és 91. ki ónokon belül található NANBV cDNS-szekvenciákból származó polipeptideknél leírunk, és a korábbiakban tárgyaltunk, vagy a későbbiekben tárgyalunk.

Az 5-1-1., 32., 35., 36., 81., 91., 1-2. és más kiónokban található cDNS-szekvenciáján belül kódolva vannak olyan epitópot tartalmazó antigének, amelyek egyedinek tűnnek HCV-re; vagyis azok az antitestek, amelyek ezek ellen az antigének ellen irányulnak, hiányoznak azokból az egyénekből, amelyek HAV-val vagy HBV-vel vannak fertőzve, valamint azokból az egyénekből, akik nincsenek HCV-vel fertőzve (lásd a szerológiai adatokat). Sőt ezen cDNS-ek szekvencia-információjának összehasonlítása a HAV-, HBV-, HDVszekvenciákkal és a Genebankban lévő szekvenciákkal azt is jelzi, hogy csak minimális homológia létezik ezek között a cDNS-ek és a fenti forrásokból származó polinukleotidszekvenciák között. így a jelen kiónok cDNSein belül kódolt antigének ellen irányuló antitestek alkalmazhatók fertőzött egyénekből izolált BB-NANBV-részecskék izolálására. Ezenkívül ezek alkalmasak az NABH-ágensek izolálására is.

HCV-részecskéket izolálhatunk BB-NANBV-vel fertőzött egyének szérumaiból vagy sejttenyészetekből a szakterületen ismert bármely eljárással, ide számítva például a méretelkülönítésen alapuló technikákat, például az ülepítési vagy kizárásos eljárásokat, vagy a sűrűségen alapuló technikákat, például az ultracentrifugálást sűrűséggradiensben vagy a kicsapást bizonyos szerekkel, például polietilénglikollal, vagy a kromatográfiát különböző anyagokon, például anion- vagy kationcserélő anyagokon, és olyan anyagokon, amelyek hidrofobicitás alapján kötnek, valamint affinitásoszlopokon. Az izolálási eljárás során a HCV jelenlétét az extrahált genom hibridizációs elemzésével mutathatjuk ki, olyan vizsgálómintákat alkalmazva, amelyek a fentebb leírt HCV cDNS-ekből származnak, vagy immunesszével, vizsgálómintaként olyan antitesteket alkalmazva, amelyek az 1-32. ábrákon bemutatott cDNS-szekvenciák családján belül kódolt HCV-antigének ellen irányulnak, vagy amelyek a fentebb tárgyalt átfedő HCV cDNS-szekvenciákon belül kódolt HCV-antigének ellen irányulnak. Az antitestek lehetnek monoklonálisok vagy poliklonálisok, és kívánatos lehet az antitestek megtisztítása felhasználásuk előtt. Az 5-1-1. kiónon belül kódolt antigén vagy antigének ellen irányuló poliklonális antitestek tisztítási munkamenetét a következőkben írjuk le; analóg tisztítási eljárásokat alkalmazhatunk más HCV-antigének ellen irányuló antitestekhez.

Az 1-32. példákban bemutatott, cDNS-ek családján belül kódolt HCV-antigének ellen, valamint az átfedő HCV cDNS-eken belül kódolt antigének ellen irányuló antitestek, amelyek szilárd támasztóanyaghoz vannak rögzítve, alkalmasak a HCV izolálásához immunaffinitás-kromatográfiával. Az immunaffinitás-kromatográfiához szolgáló technikák ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak, ide értve az antitestek rögzítését szilárd támasztóanyagra úgy, hogy megtartsák immunszelektív aktivitásukat; ezek a technikák lehetnek olyanok, amelyekben az antitestek adszorbeálva vannak a támasztóanyagra (lásd például Kurstak és munkatársai: ΕΝΖΥΜΕ IMMUNDIAGNOSIS, 31-37. oldal), valamint olyanok, amelyekben az antitestek kovalensen vannak kötve a támasztóanyaghoz. Általában ezek a technikák hasonlóak azokhoz a technikákhoz, amelyeket antigének kovalens kapcsolásához alkalmaznak szilárd támasztóanyaghoz; a bifunkcionális kapcsolóágensekben azonban térközbiztosító (spacer) csoportok is lehetnek jelen, hogy az antitest antigén kötőhelye hozzáférhető maradjon.

A tisztítási munkamenet során a HCV jelenlétét nukleinsavhibridizálással mutathatjuk ki és/vagy igazolhatjuk, vizsgálómintaként az 1-32. ábrákon bemutatott HCV cDNS-szekvenciák családjából származó, valamint a fentebb leírt átfedő HCV cDNS-szekvenciákból származó polinukleotidokat alkalmazva. Ebben az esetben a frakciókat olyan körülmények között kezeljük, amelyek a vírusrészecskék szétzúzását idézik elő, például detergensekkel keltáképző szerek jelenlétében, és a vírusnukleinsavak jelenlétét a hibridizációs technikával határozzuk meg. Annak további igazolását, hogy az izolált részecskék azok az ágensek, amelyek HCV-t indukálnak, megkaphatjuk csimpánzok fertőzésével az izolált vírusrészecskékkel, amelyet annak meghatározása követ, vajon az NANBH tünetei a fertőzésből erednek-e.

A tisztított készítményekből való vírusrészecskéket azután tovább jellemezhetjük. A genom nukleinsavat tisztítjuk. RN-ázra való érzékenysége és DN-áz I-re való érzéketlensége alapján úgy tűnik, hogy a vírus RNS genomból áll. Az összefonódottságot és kör alakba szervezettséget vagy kör alakba nem szervezettséget olyan technikákkal határozhatjuk meg, amelyek a szakterületen ismertek, ilyenek például ennek megjelenítése elektronmikroszkópiával, ennek vándorlása sűrűséggradiensben, és ennek ülepedési jellemzői. A befogott HCV-genom hibridizálása alapján a HCV cDNS-ek negatív szálaihoz úgy tűnik, hogy a HCV egy pozitív szálú RNS genomból állhat. Ezek olyan technikák, amelyeket például a METHODS IN ENZYMOLOGY című sorozatban ismertetnek. Ezenkívül a tisztított nukleinsavakat klónozhatjuk, és szekvenciájukat elemezhetjük ismert technikákkal, ide értve a reverz transzkripciót, mivel a genomanyag RNS [lásd például Maniatis (1982) és Glover (1985)]. A vírusrészecskékből származó nukleinsavakat alkalmazva lehetséges a teljes genom szekvenciaelemzése, akár szegmentálva van, akár nincs.

A 14i.—39c. kombinált kiónok (lásd 26. ábra) folyamatos ORF-jein belül kódolt polipeptid homológiájának vizsgálata azt mutatja, hogy a HCV-polipeptid homológiaterületeket tartalmaz a Flavivírusok megőrzött területeiben lévő megfelelő fehérjékkel. Ez a felfedezés nagyon fontos következményekkel jár. Először ez a bizonyíték azokkal az eredményekkel együtt, amelyek azt mutatják, hogy a HCV pozitív szálú genomot tartalmaz, amelynek mérete mintegy 10000 nukleotid, egybevág azzal a sejtéssel, hogy a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus. A Flavivírus-virionok és genomjaik viszonylag következetes szerkezettel és szerveződéssel bírnak, amelyek ismertek [lásd Rice és munkatársai (1980) és

HU 216 017 Β

Brinton Μ. A. (1988)]. így a C-, pre-M/M és E-polipeptideket kódoló struktúrgének a genom 5'-terminálisában helyezkedhetnek el a 14i. kióntól fölfelé. Ezenkívül az összehasonlítást alkalmazva más Flavivírusokkal, előre jelezhetjük az ezeket a fehéijéket kódolószekvenciák pontos elhelyezkedését.

A 141. kiónban lévő szekvenciáktól fölfelé lévő szekvenciák izolálását sokféle módon végezhetjük, amelyek az itt megadott információk alapján nyilvánvalóak azok számára, akik a szakterületen jártasak. így például a genom-„sétáltatási” technikát alkalmazhatjuk további szekvenciák izolálására, amelyek 5'-irányban vannak a 14i. kiónban lévő szekvenciáktól, de amelyek átfedik ezt a kiónt; ez viszont további szekvenciák izolálásához vezet. Ezt a technikát a későbbiekben bőségesen demonstráljuk. Ismeretes például az is, hogy a Flavivírusoknak vannak megőrzött epitópjaik, és megőrzött nukleinsavszekvenciák területeivel is rendelkeznek. A megőrzött szekvenciákat tartalmazó polinukleotidokat olyan vizsgálómintaként alkalmazhatjuk, amelyek a HCV-genomhoz kötődnek, így lehetővé válik ezek izolálása. Ezenkívül ezeket a megőrzött szekvenciákat azokkal együtt, amelyek a 22. ábrán bemutatott HCV cDNS-ből származnak, alkalmazhatjuk primerek tervezésére olyan rendszerekben való felhasználásra, amelyek sokszorozzák a 141. kiónban lévő szekvenciáktól fölfelé lévő genomszekvenciákat, a polimerázláncreakció-technológiát alkalmazva. Erre a későbbiekben adunk példát.

A HCV szerkezetét is meghatározhatjuk, és komponenseiket izolálhatjuk. A morfológiát és méretét meghatározhatjuk például elektronmikroszkópiával. A fajlagos víruspolipeptid-antigének, például a burkolati vagy „boríték”-antigének vagy belül lévő antigének, mint például nukleinsavkötő fehérjék, belső (mag) antigének és polinukleotid polimerázok azonosítása és elhelyezkedése szintén meghatározható például azt meghatározva, vajon az antigének nagyobb vagy kisebb víruskomponensekként vannak-e jelen, vagy olyan antitesteket alkalmazva vizsgálómintaként, amelyek az izolált cDNS-eken belül kódolt fajlagos antigének ellen irányulnak. Ez az információ hasznos vakcinák tervezésében, így például előnyös, ha külső antigén található egy vakcinakészítményben. Multivalens vakcinák tartalmazhatnak egy szerkezeti fehérjét, például E-fehérjét kódoló genomból származó polipeptidet, valamint a genom egy másik részéből való polipeptidet, például valamely szerkezeti vagy nem szerkezeti polipeptidet.

Sejttenyésztő rendszerek és állatimodell-rendszerek HCV replikációjához

Az a feltételezés, hogy a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus információkat nyújt a HCV növesztésének eljárásaira is. A „Flaviszerű” kifejezés azt jelenti, hogy a vírus jelentős mennyiségű homológiát mutat a Flavivírusok ismert megőrzött területeivel, és hogy a genomok többsége egy egyedi ORF. A Flavivírusok tenyésztésére szolgáló eljárások ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak [lásd például Brinton (1986) és Stollar V. (1980) összefoglaló munkáit]. Általában a HCV tenyésztéséhez megfelelő sejtek és sejtvonalak között találjuk azokat, amelyekről ismert, hogy elősegítik a Flavivírusok replikációját, ilyenek például az alábbiak: majomvese-sejtvonalak (például MK₂, VERŐ), sertésvese-sejtvonalak (például PS), hörcsögújszülöttvese-sejtvonalak (például BHK), rágcsáló makrofág sejtvonalak (például P388D1, MK1, Mml), humán makrofág sejtvonalak (például U-397), humán perifériás vérleukociták, humán tapadó monociták, hepatociták vagy hepatocita-sejtvonalak (például HUH7, HEPG2), embriók vagy embrionális sejtek (például csirkeembrió-fibroblasztok), vagy gerinctelenekből származó sejtvonalak, elsősorban rovarokból származó sejtvonalak (például Drosophila sejtvonalak), vagy még előnyösebben ízeltlábúakból származó sejtvonalak, például szúnyog (A. albopictus, Aedes aegypti, Cutex tritaeniorhynchus) sejtvonalak, vagy kullancs- (például RML-14 Dermacentor parumapertus) sejtvonalak.

Lehetséges primer hepatocitákat tenyészteni, majd HCV-vel fertőzni, vagy egy másik módszer szerint a hepatocitatenyészetek származhatnak a fertőzött egyének (például emberek vagy csimpánzok) májából. Az utóbbi eset olyan sejtekre példa, amelyek in vivő vannak fertőzve, és in vitro passzálva. Ezenkívül különböző nem pusztulóvá tételi eljárásokat is alkalmazhatunk, hogy olyan sejtvonalakat kapjunk, amelyek hepatocitatenyészetekből származnak. így például primer májtenyészeteket (a hepatocita populáció dúsítása előtt és után) fuzionálhatunk különféle sejtekkel, hogy fenntartsuk a stabilitást. így például tenyészeteket fertőzhetünk transzformáló vírusokkal, vagy fertőzhetünk transzformáló génekkel abból a célból, hogy állandó vagy félig állandó sejtvonalakat kapjunk. Ezenkívül például májtenyészetekben lévő sejteket fuzionálhatunk, hogy megalapozott sejtvonalakat kapjunk (például HepG2). A sejtfúzió eljárásai ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak, ezek között találjuk például fúziós ágensek, például polietilénglikol, Sendai-vírus és Epstein-Barr-vírus alkalmazását.

Amint fentebb tárgyaltuk, a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus. Ennek megfelelően valószínű, hogy a sejtvonalak HCV-fertőzését olyan technikákkal valósíthatjuk meg, amelyek a szakterületen ismertek Flavivírusokkal való sejtfertőzésre. Ezek között találjuk például a sejtek inkubálását víruskészítményekkel olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a vírus belépését a sejtbe. Ezenkívül lehet vírustermelést előidézni a sejtek transzformálásával izolált víruspolinukleotidokkal. Ismeretes, hogy a Togavírus és Flavivírus RNSek fertőzőek sokféle gerinces sejtvonalban [Pfefferkom és Shapiro (1974)], és szúnyogsejtvonalban [Peleg (1969)]. Az eljárások szövettenyészet sejtjeinek fertőzésére RNS-duplexekkel, pozitív szálú RNS-ekkel és DNS-ekkel (ide értve a cDNS-eket is) ismeretesek a szakterületen, ezek között találjuk például azokat a technikákat, amelyek elektroporációt alkalmaznak, vagy azokat, amelyek kicsapást tartalmaznak DEAEdextránnal vagy kalcium-foszfáttal. A HCV RNS bőséges forrását kaphatjuk meg a komplett genomnak megfelelő HCV cDNS in vitro átírásainak kivitelezésével. Az átfertőzés ezzel az anyaggal vagy klónozott HCV

HU 216 017 Β cDNS-sel virális replikációt és a vírus in vitro szaporítását eredményezheti.

A tenyésztett sejteken kívül állatimodell-rendszereket is alkalmazhatunk vírusreplikációhoz; azok az állati rendszerek, amelyekben a Flavivírusok tenyésznek, ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak [lásd például Monath összefoglaló munkáját (1986)]. így a HCV-replikáció nem csupán csimpánzokban mehet végbe, hanem például selyemmajomban és szopós egerekben is.

Vírusellenes ágensek átvizsgálása HCV-re

A sejttenyészetek és állatimodell-rendszerek hozzáférhetősége HCV-re lehetővé teszi olyan vírusellenes szerek átvizsgálását is, amelyek gátolják a HCV-replikációt, és főleg olyan szerek átvizsgálását, amelyek előnyösen lehetővé teszik a sejtnövekedést és -sokszorozódást, miközben gátolják a vírusreplikációt. Ezek az átvizsgálási módszerek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen járatosak. Általában a vírusellenes szereket különböző koncentrációkban vizsgáljuk egyrészt a vírusreplikáció megelőzésére kifejtett hatásukra sejttenyésztő rendszerekben, amelyek elősegítik a vírusreplikációt, majd a fertőzőképesség és a víruspatogenitás (és az alacsony szintű toxicitás) gátlására állatimodell-rendszerekben.

Az itt HCV-antigének és HCV-polinukleotidok kimutatására nyújtott eljárások és kompozíciók alkalmasak vírusellenes szerek átvizsgálására is, amennyiben ezek egy másik és talán érzékenyebb eszközt nyújtanak az ágens hatásának kimutatására a vírusreplikációra, mint a sejttarfoltvizsgálat és az ID₅₀-vizsgálat. így például az itt leírt HCV-polinukleotid vizsgálóminták alkalmazhatók egy sejttenyészetben termelt vírus nukleinsav mennyiségének mérésére. Ezt például a fertőzött sejt nukleinsavak hibridizálásával vagy versengő hibridizálásával hajthatjuk végre egy jelzett HCV-polinukleotid vizsgálómintával. így például anti-HCV-antitesteket alkalmazhatunk HCV-antigén vagy -antigének azonosítására sejttenyészetekben az itt leírt immunesszét alkalmazva. Ezenkívül, mivel kívánatos lehet HCV-antigének mennyiségének mérése fertőzött sejtekben versengő vizsgálattal, az itt leírt HCV cDNS-eken belül kódolt polipeptidek alkalmasak ezekben a versengő vizsgálatokban. Általában a HCV cDNS-ből származó rekombináns HCV-polipeptid jelezve lehet, és ezen jelzett polipeptid egy HCV-polipeptidhez való kötésének gátlását, amely a sejttenyésztő rendszerben termelt antigénnek tulajdonítható, követhetjük. Ezenkívül ezek a technikák különösen hasznosak azokban az esetekben, ahol a HCV-képes lehet replikálódni egy sejtvonalban anélkül, hogy a sejt pusztulását okozná.

Általános módszerek

A genomnak a vírusból való kivonásában, egy cDNS-könyvtár előállításában és átvizsgálásában, kiónok szekvenciaelemzésében, kifejező vektorok megalkotásában, sejtek transzformálásában, immunológiai vizsgálatok, például radioimmunesszé és ELISA-vizsgálatok kivitelezésében, sejtek tenyészetben való növesztésében stb. alkalmazott általános technikák ismeretesek a szakterületen, és számos laboratóriumi kézikönyv áll rendelkezésre, amely ezeket a technikákat leírja. Általános vezérfonalként azonban az alábbiakban ismertetünk néhány forrást, amely az ilyen munkamenetekhez rendelkezésre áll, és bizonyos anyagokat, amelyek ezek kivitelezéséhez alkalmazhatók.

Gazdaszervezetek és kifejező szabályozószekvenciák

Mind prokarióta, mind eukarióta gazdasejteket alkalmazhatunk kívánt kódolószekvenciák kifejeződéséhez, amikor megfelelő szabályozószekvenciákat, amelyek összeférhetők a tervezett gazdaszervezettel, alkalmazunk. A prokarióta gazdaszervezetek közül az E. colit alkalmazzuk a leggyakrabban. A prokariótákhoz alkalmazott kifejezést szabályozószekvenciák között találjuk a promotorokat, amelyek kívánt esetben operátorrészeket tartalmaznak, és riboszómakötő helyeket. A prokarióta gazdaszervezetekkel összeférhető transzfer vektorok általában például a pBR322-ből származnak, amely ampicillin- és tetraciklinrezisztenciát átadó operonokat tartalmazó plazmid, vagy a pUC-vektorokból származnak, amelyek szintén tartalmaznak antibiotikum rezisztencia markereket átadó szekvenciákat. Ezeket a markereket alkalmazhatjuk a sikeres transzformánsok kinyerésére szelekció révén. Az általánosan alkalmazott prokarióta szabályozószekvenciák között találjuk a béta-laktamáz (penicillináz) és laktózpromotor-rendszereket [Chang és munkatársai (1977)], a triptofán (trp) promotor rendszert [Goeddel és munkatársai (1980)], a lambda eredetű P_L-promotort és N-gén riboszómakötő helyet [Shimatake és munkatársai (1981)] és a hibrid tac promotort [De Boer és munkatársai (1983)], amely a trp és lac UVS-promotorok szekvenciáiból származik. A felsorolt rendszerek különösen összeférhetők E. colival; ha szükséges, más prokarióta gazdaszervezeteket is alkalmazhatunk, például Bacillus vagy Pseudomonas törzseket, megfelelő szabályozószekvenciákkal.

Az eukarióta gazdaszervezetek magukban foglalják az élesztőket és emlőssejteket tenyésztőrendszerekben. A Saccharomyces cerevisiae és a Saccharomyces carlsbergensis a leggyakrabban alkalmazott élesztő-gazdaszervezetek és alkalmas gomba-gazdaszervezetek. Az élesztővel összeférhető vektorok alkalmazhatják a 2 mikronos replikációs origót [Broach és munkatársai (1983)], a CEN3 és ARS1 kombinációját, vagy más olyan eszközöket, amelyek replikációt biztosítanak, például olyan szekvenciákat, amelyek egy megfelelő fragmentum beépülését eredményezik a gazdasejt genomba. Az élesztővektorokhoz való szabályozóvektorok ismeretesek a szakterületen, ezek közé tartoznak a glikolitikus enzimek szintéziséhez tartozó promotorok [Hess és munkatársai (1968); Holland és munkatársai (1978)], közöttük a 3foszfoglicerát kináz [Hitzeman (1980)]. Terminátorok is értendők ide, például azok, amelyek az enolázgénből származnak [Holland (1981)]. Különösen alkalmas kontrollrendszerek azok, amelyek a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) promotort vagy alkohol dehidrogenáz (ADH) szabályozható promotort tartalmaznak; terminátorokat, amelyek szintén a GAPDH-ból származnak, és ha kiválasztás kívánatos, vezetőszekvenciákat élesztő alfa-faktorból. Ezenkívül az átírásszabályozó te20

HU 216 017 Β rület és az átírás-beindító terület, amelyek működőképesen kapcsolódnak, olyanok lehetnek, amelyek a természetben nem kapcsolódnak össze vad típusú mikroorganizmusokban. Ilyen rendszereket ír le részletesen a 120,511 számú európai szabadalmi közzétételi irat, az EPO 116,201 számú európai szabadalmi közzétételi irat és az EPO 164,556 számú európai szabadalmi közzétételi irat; ezeket mind a jelen találmány bejelentői jelentették be, és a jelen bejelentésbe referenciaként épülnek be.

A kifejezéshez gazdaszervezetként rendelkezésre álló emlőssejtvonalak ismeretesek a szakterületen, ezek között találunk sok nem pusztulóvá tett sejtvonalat, amelyek az American Type Culture Collectionnál (ATCC) rendelkezésre állnak, ilyenek a HeLa sejtek, kínaihörcsögpetefészek- (CHO) sejtek, újszülötthörcsögvese- (BHK) sejtek, és egy sor más sejtvonal. Az emlőssejtekhez való alkalmas promotorok a szakterületen szintén ismeretesek, ezek között találunk víruspromotorokat, például a Simian Vírus 40-ből (SV40) [Fiers (1978)], Rous-szarkómavírusból (RSV), adenovírusból (ADV) és szarvasmarhapapillómavírusból (BPV) való promotorokat. Az emlőssejtek igényelhetnek terminátorszekvenciákat és poli-A hozzátett szekvenciákat; fokozószekvenciák, amelyek növelik a kifejeződést, szintén lehetnek bennük, továbbá kívánatosak lehetnek olyan szekvenciák is, amelyek a gén sokszorozását idézik elő. Ezek a szekvenciák a szakterületen ismeretesek. Az emlőssejtekben való replikációhoz alkalmas vektorok között lehetnek vírusreplikonok vagy olyan szekvenciák, amelyek biztosítják az NANBV-epitópokat kódoló megfelelő szekvenciák integrálását a gazdaszervezet genomba.

Transzformálások

A transzformálás történhet bármely ismert eljárással, amely polinukleotidok bevezetésére szolgál valamely gazdasejtbe; ilyen eljárások például a polinukleotid „becsomagolása” valamely vírusba és valamely gazdasejt átfertőzése a vírussal, vagy a polinukleotid közvetlen felvétele. Az alkalmazott transzformálási munkamenet fiigg a transzformálandó gazdaszervezettől. így például az E. coli gazdasejtek transzformálását a BB-NANBV-szekvenciákat tartalmazó lambda-gtl 1-gyel a példák között tárgyaljuk. A baktériumok transzformálása közvetlen felvétellel általában kalcium- vagy rubídium-kloriddal végzett kezelést tartalmaz [Cohen (1972); Maniatis (1982)]. Az élesztők transzformálása közvetlen felvétellel kivitelezhető Hinnen és munkatársai (1978) eljárásával.

Az emlőssejtek transzformálását közvetlen felvétellel Graham és Van dér Eb (1978) kalcium-foszfátos kicsapási eljárásával végezhetjük, vagy ennek különböző ismert módosításaival.

Vektoralkotás

A vektorok megalkotása olyan technikákat alkalmaz, amelyek a szakterületen ismertek. A helyspecifikus DNS-hasítást a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett kezeléssel hajtjuk végre olyan körülmények között, amelyet ezen kereskedelmi forgalomban kapható enzimek gyártói általában előírnak. Általában mintegy 1 mikrogramm plazmidot vagy DNS-szekvenciát hasítunk 1 egység enzimmel mintegy 20 mikroliter pufferoldatban 1-2 órás inkubálási idő alatt 37 °C hőmérsékleten. A restrikciós enzimmel végzett inkubálás után a fehéijét fenol/kloroformos extrahálással eltávolítjuk, és a kinyert DNS-t etanollal kicsapjuk. A hasított fragmentumokat poliakrilamid- vagy agarózgél-elektroforézist alkalmazva elkülönítjük, az alábbi irodalmi helyen található általános eljárás szerint: Methods in Enzymology, 65,499-560 (1980).

A tapadós végű hasítási fragmentumokat tompa végűvé tehetjük E. coli DNS polimeráz I-et (Klenow) alkalmazva a keverékben lévő megfelelő dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) jelenlétében. Alkalmazhatjuk a kezelést SÍ nukleázzal, amely mindenféle egyszálú DNS-rész hidrolízisét eredményezi.

A ligálást standard puffereket és hőmérsékleti körülményeket használva és T4 DNS-ligázt, valamint ATP-t alkalmazva hajtjuk végre; a tapadósvég-ligálások kevesebb ATP-t és kevesebb ligázt igényelnek, mint a tompavég-ligálások. Amikor a ligálási keverék részeként vektorfragmentumokat alkalmazunk, a vektorfragmentumot gyakran kezeljük bakteriális alkálikus foszfatázzal (BAP) vagy borjúbél alkálikus foszfatázzal, hogy eltávolítsuk az 5’-foszfátot, és így megakadályozzuk a vektor újraligálását; egy másik eljárás szerint a nem kívánt fragmentumok restrikciós enzimes emésztését alkalmazhatjuk a ligálás megakadályozására.

A ligálási keveréket megfelelő klónozó gazdaszervezetbe, például E. coliba transzformáljuk, és sikeres transzformánsokat szelektálunk például antibiotikumrezisztencia alapján, és ezeket a korrekt konstrukcióra átvizsgáljuk.

Kívánt DNS-szekvenciák megalkotása

Szintetikus oligonukleotidokat állíthatunk elő automatizált oligonukleotidszintetizáló berendezést alkalmazva, amint ezt Warner (1984) leírja. Ha szükséges, a szintetikus szálakat jelezhetjük ³²P-vel polinukleotid kinázzal végzett kezeléssel ³²P-ATP jelenlétében, a reakcióhoz standard körülményeket alkalmazva

A DNS-szekvenciákat, beleértve a cDNS-könyvtárakból izolált szekvenciákat is, ismert technikákkal módosíthatjuk, beleértve például a helyre irányuló mutagenezist, amint ezt Zoller leírja (1982). Röviden: a módosítandó DNS-t fágba burkoljuk egyszálas szekvenciaként, és kettős szálú DNS-sé alakítjuk DNS polimerázzal, primerként olyan szintetikus oligonukleotidot alkalmazva, amely a DNS módosítandó részével komplementer, és rendelkezik a kívánt módosítással saját szekvenciájába beépítve. Az így létrejövő kettős szálú DNS-t fágsegítő gazdabaktériumba transzformáljuk. A transzformált baktériumok tenyészeteit, amelyek a fág egyes szálainak replikáit tartalmazzák, agarat szélesztjük, hogy tarfoltokat kapjunk. Elméletileg az új tarfoltok 50%-a olyan fágot tartalmaz, amely a mutált szekvenciával bír, és a további 50% az eredeti szekvenciával bír. A tarfoltok replikáit jelzett szintetikus vizsgálómintákhoz hibridizáljuk olyan hőmérsékleten és olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a hibridizálást a korrekt szállal, de nem teszik lehetővé a nem módosított szekvenciával. Azokat a szekvenciákat, amelyeket hibridizálással azonosítunk, kinyeijük, és klónozzuk.

HU 216 017 Β

Hibridizálás vizsgálmintával A DNS-könyvtárakat átvizsgálhatjuk Gruenstein és

Hogness (1975) munkamenetét alkalmazva. Röviden ismertetve, ebben az eljárásban az átvizsgálandó DNS-t nitro-cellulóz-szűrőkön immobilizáljuk, denaturáljuk, és előhibridizáljuk olyan pufferrel, amely 0-50% formamidot, 0,75 mol/1 NaCl-t, 75 mmol/1 Na-citrátot, 0,02-0,02% (tömeg/térfogat) szarvasmarha-szérumalbumint, polivinil-pirrolidont és Ficollt, 50 mmol/1 Na-foszfátot (pH 6,5), 0,1% SDS-t (nátrium-lauril-szulfát) és 100 mikrogramm/ml hordozó denaturált DNS-t tartalmaz. A formamid százaléka a pufferben, valamint az előhibridizálási, majd hibridizálási lépések időbeli és hőmérsékleti feltételei a kívánt szigorúságtól függnek. Azoknál az oligomer vizsgálómintáknál, amelyek alacsonyabb szigorúsági feltételeket igényelnek, általában kisebb százalékban alkalmazunk formamidot, és rövidebb hibridizációs időt és alacsonyabb hőmérsékletet alkalmazunk. Azoknál a hibridizációs mintáknál, amelyek több, mint 30 vagy 40 nukleotidot tartalmaznak, például azoknál, amelyek cDNS- vagy genomszekvenciákból származnak, általában magasabb hőmérsékletet, például mintegy 40-42 °C-t alkalmazunk, és magasabb arányban alkalmazunk formamidot, például 50%-ban. Az előhibridizálást követően 5’-³²P-vel jelzett oligonukleotid vizsgálómintát adunk a pufferhez, és a szűrőket ebben a keverékben inkubáljuk hibridizációs körülmények között. Mosás után a kezelt szűrőket autoradiográfiának vetjük alá, hogy kimutassuk a hibridizált vizsgálóminta elhelyezkedését; az eredeti agarlemezen megfelelő elhelyezkedésben lévő DNS-t alkalmazzuk a kívánt DNS forrásaként.

A konstrukció igazolása és szekvenciaelemzés Rutinszerűen készített vektorkonstrukcióknál a ligációs keveréket E. coli HB101 törzsbe vagy más alkalmas gazdaszervezetbe transzformáljuk, és antibiotikumrezisztenciával vagy más markerekkel a sikeres transzformánsokat szelektáljuk. A transzformánsokból azután plazmidokat állítunk elő Clewell és munkatársai eljárásával (1969), általában klóramfenikolos sokszorozást követően [Clewell (1972)]. A DNS-t izoláljuk, és elemezzük általában restrikciós enzimes elemzéssel és/vagy szekvenciaelemzéssel. A szekvenciaelemzés történhet Sanger és munkatársai didezoxieljárásával (1977), amint ezt Messing is leírta (1981) vagy Maxam és munkatársai eljárásával (1980). A kötésösszecsúszással kapcsolatos gondokat, amelyek néha megfigyelhetők GC-ben gazdag területekben, T-dezoxi-guanozin alkalmazásával küszöböljük ki Barr és munkatársai szerint (1986).

Enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatok Az enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatot (ELISA) alkalmazhatjuk vagy az antigén vagy az antitest koncentrációjának meghatározására. Ez az eljárás egy enzim hozzákapcsolásától függ vagy egy antigénhez, vagy egy antitesthez, és a kötött enzim aktivitását alkalmazza mennyiségi jelként. Abból a célból, hogy az antitestet mérjük, az ismert antigént szilárd fázishoz rögzítjük (például mikrolemezhez vagy műanyag edényhez), inkubáljuk a vizsgált szérum hígításaival, mossuk, inkubáljuk egy enzimmel jelzett antiimmunglobulinnal, és ismét mossuk. Azok az enzimek, amelyek a jelzéshez alkalmasak, a szakterületen ismertek, ide tartozik például a torma peroxidáz. A szilárd fázishoz kötött enzimaktivitást a fajlagos szubsztrátum hozzáadásával és a termékképződés vagy szubsztrátumfelhasználás kolorimetriás meghatározásával mérjük. A kötött enzimaktivitás a kötött antitest mennyiségének közvetlen függvénye.

Abból a célból, hogy antigént méljünk, egy ismert, fajlagos antitestet rögzítünk szilárd fázishoz, az antigént tartalmazó vizsgálandó anyagot hozzáadjuk, inkubálás után a szilárd fázist mossuk, és egy második, enzimmel jelzett antitestet adunk hozzá. Mosás után szubsztrátumot adunk hozzá, és az enzimaktivitást kolorimetriásan megbecsüljük, majd az antigénkoncentrációra vonatkoztatjuk.

Példák

Az alábbiakban példákat adunk meg a jelen találmányra, amelyek csak a bemutatás célját szolgálják, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. A jelen leírás fényében számos kiviteli mód születhet az igénypontok oltalmi körén belül, amelyek nyilvánvalóak azok számára, akik a szakterületen jártasak. Meg lehet ismételni például a következőkben leírt eljárásokat, ha így kívánatos, de nem feltétlenül szükséges, mivel számos technika áll rendelkezésre kívánt nukleotidszekvenciák megalkotásához a jelen találmányban nyújtott információk alapján. A kifejezést a példákban E. coliban valósítjuk meg, azonban más rendszerek is állnak rendelkezésre, amint ezt az előbbiekben részletesebben leírtuk. A genomszerkezetből származó további epitópok is előállíthatók és felhasználhatók antitestek kialakítására, amint ezt a későbbiekben ismertetjük.

HCV cDNS előállítása, izolálása és szekvenciaelemzése

HCV cDNS előállítása

Az NANB-ágens forrása krónikus NANBH-ban szenvedő csimpánzból származó plazmagyűjtemény. A csimpánzokat előzőleg kísérleti úton fertőztük másik, krónikus NANBH-ban szenvedő csimpánzból származó vérrel, ahol viszont ez a másik csimpánz összegyűjtött humán szérumból származó, 8. koncentrációjú faktorú fertőzött törzstenyészetben lévő HCV-vel végzett fertőzés következtében fertőzött. A csimpánzplazma-gyűjteményt több plazmaminta egyesítésével kapjuk, amely minták magas alanin-aminotranszferáz-aktivitás szintekkel bírnak; ez az aktivitás májkárosodás eredménye, amely a HCV-fertőzés során alakul ki. Mivel 1 ml ennek az összegyűjtött szérumnak a 10 ⁶ hígításából i. v. beadva NANBH-t okoz egy másik csimpánzban, ennek CID-értéke legalább 10⁶/ml, azaz ennek igen magas a vírustitere.

A magas titerű plazmagyűjteményből a cDNSkönyvtárat az alábbi módon alakítjuk ki. Először a vírusrészecskéket izoláljuk a plazmából; egy 90 ml-es alikvotot hígítunk 310 ml oldattal, amely 50 mmol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA-t és 100 mmol/1 NaCl-t tartalmaz. A törmeléket 20 percen át 20 °C hőmérsékleten 150000 xg-nél végzett centrifugálással távolítjuk el. Az így létrejövő felülúszóban a vírusrészecskéket centrifugálással üledékbe visszük Beckman SW28 rotorban 28 000 fordulat/percnél 5 órán át 20 °C hőmérsékleten. Abból a célból, hogy a vínisgenomot kiszaba22

HU 216 017 Β dítsuk, a részecskéket összezúzzuk olyan módon, hogy az üledéket 15 ml oldatban, amely 1% nátrium-dodecilszulfátot (SDS), 10 mmol/1 EDTA-t, 10 mmol/1 trisz.HCl-t (pH 7,5), valamint 2 mg/ml proteinázt tartalmaz, szuszpendáljuk, majd 45 °C hőmérsékleten 90 percen át inkubáljuk. A nukleinsavakat úgy izoláljuk, hogy hordozóként 0,8 mikrogramm MS2 bakteriofág RNS-t (ATCC No. 15597—Bl) adunk hozzá, és a keveréket négyszer extraháljuk fenol: kloroform 1:1 elegyével [ahol a fenol 0,5 mol/1 trisz.HCl-t (pH 7,5), 0,1% (térfogat/térfogat) béta-merkapto-etanolt és 0,1% (tömeg/térfogat) hidroxi-kinolont tartalmazó oldattal van telítve], majd kétszer extraháljuk kloroformmal. A vizes fázist 1-butanollal koncentráljuk, majd 2,5 térfogat abszolút etanollal kicsapjuk egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten. A nukleinsavakat centrifugálással nyeljük ki Beckman SW41 rotorban 40000 fordulat/percnél 90 percig 4 °C hőmérsékleten, és olyan vízben oldjuk fel, amelyet előzőleg 0,05% (tömeg/térfogat) dietil-pirokarbonáttal kezeltünk, és autoklávoztunk.

A fenti munkamenettel kapott nukleinsavat (~2 mikrogramm) 17,5 mmol/1 CH₃HgOH-val denaturáljuk; cDNS-t szintetizálunk, templátként ezt a denaturált nukleinsavat alkalmazva, és lambda-gtl 1 fág EcoRI helyébe klónozzuk a Huynh (1985) által leírt eljárásokkal, azzal a kivétellel, hogy random primerek helyettesítik az oligo(dT)12-18-at az első cDNS-szál szintézise során reverz transzkriptázzal [Taylor és munkatársai (1976)]. Az így létrejövő kettős szálú cDNS-eket méret szerint frakcionáljuk Sepharose CL-4B oszlopra; a mintegy 400,300,200 és 100 bázispár átlagméretü eluált anyagot az 1., 2., 3., illetve 4. cDNS-gyűjteményekbe gyűjtjük. A lambda-gtll cDNS-könyvtárat a 3. gyűjteményben lévő cDNS-ből alakítjuk ki.

A 3. gyűjteményből kialakított lambda-gtl 1 cDNSkönyvtárat olyan epitopokra vizsgáljuk át, amelyek fajlagosan kötődnek olyan betegből származó szérumokkal, akik korábban már átestek NANBH-n. Mintegy 10⁶fágot vizsgálunk át betegszérummal Huynh és munkatársai (1985) eljárását alkalmazva, azzal a különbséggel, hogy kötött humán antitestet olyan juh-anti-humán lg antiszérumokkal mutatunk ki, amelyet előzőleg radioaktívan jeleztünk ^l25I-vel. Öt pozitív fágot azonosítunk és

5’-TCC CTT GCT CGA ACT CTT CCA TCT CAT CGA ACT CAG GT-3’

A lambda-gtl 1 könyvtárat ezzel a vizsgálómintával átvizsgáljuk, a Huynh (1985) által leírt eljárást alkalmazva. 50000 kiónonként mintegy 1 hibridizál a vizsgálómintával. Azt a három ki ónt, amely olyan cDNS-eket tartalmaz, amelyek hibridizálnak a szintetikus vizsgálómintával, 81., 1-2. és 91. névvel látjuk el.

Az 5-1-1. kiónban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNSek nukleotidszekvencia-elemzése

A 81., 1-2. és 91. kiónokban jelen lévő három cDNS nukleotidszekvenciáit lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk. Ezeknek a kiónoknak a szekvenciáját az 5-1-1. fágban lévő HCV tisztítunk. Az öt pozitív fágot azután átvizsgáljuk kötési fajlagosságra 8 különböző emberből származó szérumhoz, akik előzőleg fertőzve voltak NANBH-ágenssel; az átvizsgáláshoz ugyanazt az eljárást alkalmazzuk. A fágok közül négy olyan polipeptidet kódol, amely immunológiailag csak egy humán szérummal reagál, vagyis csak egy olyan szérummal, amelyet a fágkönyvtár primer átvizsgálásához alkalmazunk. Az ötödik fág (5-1-1.) olyan polipeptidet kódol, amely a vizsgált 8 szérum közül öttel reagál. Ezenkívül ez a polipeptid nem reagál immunológiailag 7 normális véradó szérumával. Ennélfogva úgy tűnik, hogy az 5-1-1. klón olyan polipeptidet kódol, amelyet fajlagosan immunológiailag felismernek az NANBH-betegekből való szérumok.

A HCVcDNS-szekvenciái a rekombináns 5-1-1. fágban, és az ezen a szekvencián belül kódolt polipeptidszekvenciák

Az 5-1-1. rekombináns fágban lévő cDNS-t szekvenciaelemzésnek vetjük alá Sanger és munkatársai (1977) eljárásával. Az eljárás lényegét ismertetve, a cDNS-t EcoRI-gyel kimetsszük, és méret szerinti frakcionálással, gélelektroforézissel izoláljuk. Az EcoRI restrikciós fragmentumokat az mpl8 és mpl9 M13 vektorokba szubklónozzuk, és szekvenciaelemzésnek vetjük alá Sanger és munkatársai (1977) didezoxi-lánctermincáiós eljárását alkalmazva. A kapott szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be.

Az 1. ábrán kódolt polipeptid, amely a HCV cDNSben kódolódik, ugyanabban a transzlációs keretben van, mint az N-terminális béta-galaktozidáz-rész, amelyhez fuzionálva van. Amint a korábbi fejezetben bemutattuk, az 5-1-1. transzlációs nyitott leolvasókerete (ORF) olyan epitópot vagy epitópokat kódol, amelyeket az NANBHfertőzésben szenvedő betegekből és csimpánzokból való szérumok fajlagosan felismerik.

Az 5-1-1. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS izolálása

Az 5-1-1. kiónban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS-eket kapunk olyan módon, hogy ugyanazt a lambda-gtl 1 könyvtárat, amelyet az előzőekben leírtak szerint alkottunk meg, az 5-1-1. kiónban lévő, az 1. ábrán bemutatott HCV cDNS-szekvenciából származó szintetikus polinukleotiddal átvizsgáljuk. Az átvizsgáláshoz alkalmazott polinukleotid szekvenciája az alábbi:

ACG GTA AGT GCT GAG AGC GGT AGA GGA CTT CCC TGT cDNS-szekvenciához viszonyítva a 2. ábrán mutatjuk be, amely bemutatja a kimutatott HCV-epitópot kódoló szálat, és ahol a homológiákat a nukleotidszekvenciában függőleges vonallal jelöljük a szekvenciák között.

A klónozott HCV cDNS-ek szekvenciái nagymértékben homológok az átfedő területekben (lásd a 2. ábrát). A két területben azonban vannak különbségek. A 67. nukleotid az 1-2. kiónban timidin-, míg a másik három klón citidingyököt tartalmaz ezen a helyen. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy azonos aminosav kódolódik, akár C, akár T foglalja el ezt a helyet.

HU 216 017 Β

A második különbség az, hogy az 5-1-1. klón 28 olyan bázispárt is tartalmaz, amely nincs jelen a másik három kiónban. Ezek a bázispárok az 5-1-1.-ben lévő cDNS-szekvencia rajtjánál fordulnak elő, és ezeket kisbetűkkel jelöljük. A radioimmunesszé-adatok alapján, amelyet később tárgyalunk, lehetséges, hogy egy HCV-epitóp kódolódik ebben a 28 bp-s területben.

Az 5-1-1. 28 bázispárjának hiánya a 81., 1-2. és 91. kiónokból azt is jelentheti, hogy a cDNS ezekben a kiónokban hiányos HCV-genomokból származik; egy másik változat szerint a 28 bp-s terület egy mesterséges terminális képződmény lehet az 5-1-1. kiónban.

A kisbetűs szekvenciák a 81. és 91. kiónok nukleotidszekvenciájában egyszerűen azt jelzik, hogy ezeket a szekvenciákat nem találjuk meg más cDNS-ekben, mivel az ezeket a területeket átfedő cDNS-eket még nem izoláltuk.

5’-CTG TCA GGT ATG ATT

Az eljárás lényegében azonos azzal, amelyet Huynh leírt (1985), azzal a különbséggel, hogy a könyvtárhoz alkalmazott szűrőknek két mosást adunk szigorú körülmények között, vagyis a mosásokat 5xSSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal végezzük 30-30 percig. 50000 kiónból mintegy 1 hibridizálódik ezzel a vizsgálómintával. Egy pozitív rekombináns fágot, amely tartalmazza azt a cDNS-t, amely a szekvenciával hibridizál, izolálunk és tisztítunk. Ezt a fágot 36. kiónnak nevezzük el.

5’-TTT GGC TAG TGG TTA

Egy pozitív rekombináns fágot, amely olyan cDNS-t tartalmaz, amely hibridizál ez utóbbi szekvenciával, izolálunk és tisztítunk, ezt nevezzük 32. kiónnak.

A 36. klánban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciája

A 36. kiónban lévő cDNS nukleotidszekvenciáját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk. Ennek a cDNS-nek a kettős szálú szekvenciáit, ennek a 81. kiónban lévő HCV cDNS-sel átfedő területeit és az ORF által kódolt polipeptidet az 5. ábrán mutatjuk be.

A 36. kiónban lévő ORF azonos transzlációs keretben van, mint a 81. kiónban kódolt HCV-antigén. így kombinálva a 36. és 81. kiónokban lévő ORF-ek olyan polipeptidet kódolnak, amelyet egy nagy HCV-antigén részét képviselik. Ennek a vélt HCV-polipeptidnek és az ezt kódoló kettős szálú DNS-nek, amely a 36. és 81. kiónokban lévő HCV cDNS-ek kombinált ORF-jeiből származik, a szekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be.

A 32. klánban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciája

A 32. kiónban lévő cDNS nukleotidszekvenciáját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt a korábbiakban leírtuk az 5-1-1. szekvenciánál. A szekvenciaadatok azt jelzik, hoogy a 32. rekombináns fágban lévő cDNS két

5’-AAG CCA CCG TGT GCG

000 klónból mintegy 1 hibridizálódik a vizsgálómintával. Azt az izolált, tisztított rekombinánsfágAz 5-1-1., 81., 1-2. és 91. kiónokban lévő átfedő cDNS-ekből származó összetett HCV cDNS-szekvenciát a 3. ábrán mutatjuk be. Ezen az ábrán azonban az 5-1-1. klón egyedi 26 bázispárját elhagyjuk. Az ábra bemutatja az összetett HCV cDNS ORF-jén belül kódolt polipeptid szekvenciáját is.

A 81. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS-ek izolálása

A 81. kiónban lévő cDNS-től felfelé lévő, és azzal átfedő HCV cDNS-szekvenciák izolálását az alábbi módon végezzük. A lambda-gtl 1 cDNS-könyvtárat, amelyet úgy állítottunk elő, amint ezt az előzőekben leírtuk, átvizsgáljuk olyan szintetikus polinukleotid vizsgálómintával, amely a 81. klón 5’-terminális szekvenciájával homológ. A 81. klón szekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi:

GGC TTC CCG GAC -3’

Lefelé lévő cDNS-szekvenciákat, amelyek átfedik a 81. kiónban lévő karboxilvég-szekvenciákat, izolálunk olyan munkamenetet alkalmazva, amely hasonló a felfelé lévő cDNS-szekvenciák izolálásának munkamenetéhez, azzal a különbséggel, hogy olyan szintetikus vizsgálómintát állítunk elő, amely a 81. klón 3’-terminális szekvenciájához homológ. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi:

GGC TGG TGA CAG-3’ különböző forrásból származik. A cDNS egyik fragmentuma a HCV-genomból származó 418 nukleotidból áll; a másik fragmentum az MS2 bakteriofág-genomból származó 172 nukleotidból áll, amelyet előzőleg hordozóként alkalmaztunk a lambda-gtl 1-plazmid cDNS-könyvtár elkészítése során.

A 32. kiónban lévő cDNS szekvenciáját, amely megfelel a HCV-genom szekvenciájának, a 7. ábrán mutatjuk be. Azoknak a szekvenciáknak a tartományát, amelyek átfedik a 81. klón szekvenciáját és az ORF által kódolt polipeptid szekvenciáját, szintén jelöljük az ábrán. Ez a szekvencia egy folyamatos ORF-et tartalmaz, amely azonos transzlációs keretben van, mint a 81. klón által kódolt HCV-antigén.

A 36. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS-ek izolálása

A 36. kiónban lévő cDNS-től felfelé lévő, és azzal átfedő HCV cDNS-szekvenciák izolálását úgy végezzük, amint ezt már leírtuk azoknál a szekvenciáknál, amelyek átfedik a 81. klón cDNS-t, azzal a kivétellel, hogy a szintetikus polinukleotid a 36. klón 5’-területén alapul. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi:

GGG CTC AAG CCC-3’ kiónt, amely tartalmazza azt a cDNS-t, amely ehhez a szekvenciához hibridizál, 35. klónnak nevezzük.

A 35. klánban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciája

A 35. kiónban lévő cDNS nukleotidszekvenciáját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt már leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedő területét a 36. kiónban lévő szekvenciával és az ebben kódolt vélt polipeptidet a 8. ábrán mutatjuk be.

A 35. klón láthatóan egy egyedi, folyamatos ORF-et tartalmaz, amely egy polipeptidet kódol ugyanabban a transzlációs keretben, mint a 36. klón, 81. klón és 32. klón által kódolt polipeptidek. A 9. ábra mutatja be a hosszú, folyamatos ORF-et, amely végigterjed a 35., 36., 81. és 32. kiónokon, és bemutatja az ebben kódolt

5’-CAG GAT GCT GTC TCC

000 klónból mintegy 1 klón hibridizál a vizsgálómintával. A rekombináns fág izolált, tisztított kiónját, amely tartalmazza azt a cDNS-t, amely ehhez a szekvenciához hibridizál, 37. kiónnak nevezzük.

A 37b. klánban lévő HCVnukleotidszekvenciája

A 37b. kiónban lévő cDNS nukleotidszekvenciáját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt a megfelelő fejezetben leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedő területét a 35. kiónban jelen lévő cDNS-sel és az ebben kódolt vélt polipeptidet a 10. ábrán mutatjuk be.

A 35. klón 5’-terminális nukleotidja T, míg a 37b. kiónban az ennek megfelelő nukleotid A. A három független kiónt, amelyeket ennek az eljárásnak a során izoláltunk, amelyben a 37b. kiónt izoláljuk, és amelyet az előző fejezetben írtunk le, szintén szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Az ezekből a klónokból való cDNS-ek szintén A-t tartalmaznak ezen a helyen, így a T 5’-terminális a klónozási munkamenet mester5’-AGT GCA GTG GAT GAA

A cla kiónból való nukleotidszekvenciát alkalmazva egy másik szintetikus nukleotidot szintetizálunk, amely az alábbi szekvenciával bír:

5’-TTC TGA GGC GAC TGC

A cla klón eredetű szekvenciát alkalmazva vizsgálómintaként a lambda-gtl 1 átvizsgálása mintegy 1 pozitív telepet szolgáltat 50000-ből. Egy izolált, tisztított kiónt, amely ezzel a vizsgálómintával hibridizál, 33b. kiónnak nevezünk.

A 33b. klánban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciája

A 33b. kiónban lévő cDNS nukleotidszekvenciáját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedő területét a 32. kiónban lévő cDNS szekvenciájával, és az ebben kódolt polipeptid vélt szerkezetét all. ábrán mutatjuk be.

A 33b. klón láthatóan egy folyamatos ORF-et tartalmaz, amely a 37b., 35., 36., 81. és 82. átfedőkló5’-CAG GAT GCT GTC TCC 5’-TCC TGA GGC GAC TGC vélt HCV-polipeptidet. A kombinált szekvenciát azonos lambda-gtl 1 cDNS-könyvtárból származó más, független cDNS-eket alkalmazva igazoljuk.

A 35. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS-ek izolálása

A 35. kiónban lévő cDNS-től felfelé lévő, és azzal átfedő HCV cDNS-szekvenciák izolálását úgy végezzük, amint ezt a korábbi fejezetben azoknál a szekvenciáknál leírtuk, amelyek átfedik a 36. klón cDNS-t, azzal a kivétellel, hogy a szintetikus polinukleotid a 35. klón 5’-területén alapul. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi:

ACT CAA CGT-3’ séges terméke lehet. Ismeretes, hogy mesterséges termékek gyakran felbukkannak a cDNS-molekulák 5’terminálisánál.

A 37b. klón láthatóan egy folyamatos ORF-et tartalmaz, amely olyan polipeptidet kódol, amely abban az ORF-ben kódolt polipeptid folytatása, amely ORF végigterjed a 35., 36., 81. és 32. átfedőkiónokon.

A 32. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS izolálása

A 32. kióntól lefelé lévő HCV cDNS-szekvenciák izolálását az alábbiak szerint végezzük. Először a cla kiónt izoláljuk olyan szintetikus hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva, amely a 32. kiónban lévő cDNSszekvencia nukleotidszekvenciáján alapul. Az eljárás lényegében az, amelyet a korábbiakban leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a szintetikus vizsgálóminta szekvenciája az alábbi:

GCT GAT AGC CTT-3’

AGT GGA TAA GCT-3’ nokban lévő ORF-ek kiterjesztése. A 33b. kiónban kódolt polipeptid azonos transzlációs keretben van, mint ezeknek az átfedőkiónoknak a kiterjesztett ORF-jében kódolt polipeptid.

A 33b. klánban lévő cDNS-sel és a 37b. klánban lévő cDNS-sel átfedő HCV cDNS-ek izolálása

Abból a célból, hogy olyan HCV cDNS-eket izoláljunk, amelyek átfedik a 37b. és 33b. kiónokban lévő cDNS-eket, az alábbi szintetikus oligonukleotidvizsgáló mintákat, melyek az ezekben a kiónokban lévő cDNS-ekből származnak, alkalmazzuk a lambda-gtl 1 könyvtár átvizsgálására, lényegében a korábbiakban leírt eljárást alkalmazva. Az alkalmazott vizsgálóminták:

ACT CAA CGT C-3’ és

AGT GGA TAA GCT-3’ ezekkel mutatunk ki olyan telepeket, amelyek a 37b., illetve 33b. kiónokban lévő cDNS-eket átfedő HCV cDNS-szekvenciákat tartalmaznak. Mintegy 1 telepet mutatunk ki 50000 telepből az egyes vizsgálómintákkal. Egy olyan kiónt, amely a 37b. kiónban lévő cDNStől felfelé lévő, és ezt átfedő cDNS-t tartalmaz, 40b. kiónnak nevezünk. Egy olyan kiónt, amely a 33b. kiónban lévő cDNS-től lefelé lévő, és ezt átfedő cDNS-t tartalmaz, 25c. kiónnak nevezünk.

A 41b. kiónban és 25c. klánban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciái

A 40b. kiónban és 25c. kiónban lévő cDNS-ek nukleotidszekvenciáit lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk. A 41b. és 25c. szekvenciáit, az átfedőterületeiket a 37b. és 33b. kiónokban lévő cDNS-ekkel és a bennük kódolt vélt polipeptideket a 12. ábrán (40b. klón), illetve a 13. ábrán (25c. klón) mutatjuk be.

A 40b. klón 5’-terminális nukleotidja G. Öt másik független klónból, amelyeket annak a munkamenetnek a során izoláltunk, amellyel a 40b. kiónt izoláltuk, amint ezt az előzőekben leírtuk, származó cDNS-eket szintén szekvenciaelemzésnek vetünk alá. Az ezekből a klónokból való cDNS-ek T-t tartalmaznak ezen a helyen. így a G valószínűleg mesterséges klónozási terméket képvisel.

A 25c. kiónban az 5’-terminális ACT, de a cla kiónban (a szekvenciát nem mutatjuk be) és a 33b. kiónban ennek a területnek a szekvenciája TCA. Ez a különbség szintén képviselhet mesterséges klónozási terméket, akárcsak a 28 többlet 5’-terminális nukleotid az 5-1-1. kiónban.

A 40b. és 25c. kiónok egyaránt nyilvánvalóan olyan ORF-et tartalmaznak, amely az előzőekben szekvenciaelemzett kiónokban lévő folyamatos ORF kiterjesztése. A 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b. és 25c. kiónokon keresztül terjedő ORF nukleotidszekvenciáját, és az ebben kódolt vélt polipeptid aminosavszekvenciáját a 14. ábrán mutatjuk be. Az ábrán a lehetséges mesterséges termékeket elhagyjuk a szekvenciából, helyette a többszörösen átfedő kiónok nem 5’terminális területeinek megfelelő szekvenciáit mutatjuk be.

Összetett HCV cDNS előállítása a 36., 81. és 32. klánokban lévő cDNS-ekből

A Cl00 összetett HCV cDNS-t az alábbiak szerint alkotjuk meg. Először a 36., 81. és 32. kiónokból a cDNS-eket EcoRI-gyel kimetsszük. Az egyes kiónokból a cDNS EcoRI fragmentumát egyenként klónozzuk a pGEM3-blue vektor (Promega Biotec) EcoRI helyébe. Az így létrejövő rekombináns vektorokat, amelyek a 36.,

5’-ATC AGG ACC GGG GTG

A 33c. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját és a 40b. kiónban lévő szekvenciával való átfedést a 15. ábrán mutatjuk be, amely bemutatja az ezen belül kódol aminosavakat is.

5’-AGA GAC AAC CAT GAG

81. és 32. kiónokból való cDNS-eket tartalmazzák, pGEM3-blue/36-nak, pGEM3-blue/81-nek, illetve pGEM3-blue/32-nek nevezzük. A pGEM3-blue/81 megfelelően orientált rekombinánsát Nael-gyel és Narl5 gyei emésztjük, és a nagy (-2850 bp) fragmentumot tisztítjuk, és ligáljuk a pGEM3-blue/36-ból való tisztított kis (-570 bp) Nael/NarI restrikciós fragmentumhoz. A 36. és 81. klónokból való cDNS-eknek ezt az összetett termékét alkalmazzuk további pGEM-blue vektor kiala10 kítására, amely az ezeken a kiónokon belül lévő átfedő cDNS-eken belül lévő folyamatos HCV ORF-et tartalmazza. Ezt az új plazmidot azután PvuII-vel és EcoRIgyel emésztjük, hogy egy mintegy 680 bp-s fragmentumot szabadítsunk ki, amelyet azután a megfelelően ori15 entált pGEM3-blue/32-plazmidból izolált kis (580 bp) PvuII/EcoRI fragmentummal Egálunk, és a 36., 81. és 32. klónokból való összetett cDNS-t az EcoRI-gyel linearizált pSODcfl vektorba ligáljuk, amelyet egy későbbi fejezetben írunk le, és amelyet az 5-1-1. klón kife20 jezésére alkalmazunk baktériumokban. Olyan rekombinánsokat szelektálunk, amelyek az összetett HCV cDNS (C100) -1270 bp-s EcoRI fragmentumát tartalmazzák, és ezekből a plazmidokból a cDNS-t EcoRI-gyel kihasítjuk, és tisztítjuk.

A 14i„ 11b., 7f, 7e„ 8h„ 33c., 14c., 8f, 33f, 33g. és 39c. klánokban lévő HCV cDNS-szekvenciák izolálása és nukleotidszekvenciái

A 14i., 11b., 7f., 7e., 8h., 33c., 14c., 8f., 33f., 33g. és 39c. kiónokban lévő HCV cDNS-eket az átfedő cDNS30 ek HCV cDNS-ek lambda-gtl 1 könyvtárából való izolálásának technikájával izoláljuk, amint ezt már leírtuk. Az alkalmazott technika lényegében az, amelyet az előzőekben leírtunk, azzal a különbséggel, hogy az alkalmazott vizsgálómintákat a kombinált HCV-szekven35 ciák 5’- és 3’-végéből való utolsó izolált kiónok nukleotidszekvenciájából tervezzük. Azoknak a kiónoknak a gyakorisága, amelyek az alább leírt vizsgálómintákkal hibridizálnak, mintegy 1 az 50000-ben mindegyik esetben.

A 14i., 7f„ 7e., 8h„ 33c„ 14c., 8f., 33f., 33g. és 39c. kiónokban lévő HCV cDNS-ek nukleotidszekvenciáit lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előbbiekben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy az ezekből a fágokból kimetszett cDNS-ek helyettesítik az 5-1-1. fágból izolált cDNS-t.

A 33 c. kiónt olyan hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 40b. kiónban lévő nukleotid szekvenciáján alapul. A 40b. klón nukleotidszekvenciáját a 12. ábrán mutatjuk be. A 33c. izolálásához al50 kalmazott vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

AGA ACA ATT ACC ACT-3’

A 84. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 33c. kiónban lévő nukleotidszekvencián alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

GTC CCC GGT GTT C-3’.

HU 216 017 Β

A 8h. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciát és a 33c. kiónban lévő szekvenciával való átfedést, valamint az ebben kódolt aminosavakat aló. ábrán mutatjuk be.

5’-TCG GAC CTT TAC CTG

A 7e. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 8h. kiónnal való átfedést és az ebben kódolt aminosavakat a 17. ábrán mutatjuk be.

A 14c. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 25c. kiónban lévő nukleotidok szekven5’-ACC TTC CCC ATT AAT

A 14c. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 25c. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 18. ábrán mutatjuk be.

5’-TCC ATC TCT CAA GGC

A 8f. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 14c. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 19. ábrán mutatjuk be.

5’-TCC ATG GCT CGC TTC

A 33f. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 8f. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 20. ábrán mutatjuk be.

5’-GCG ACA ATA CGA CAA

A 33g. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 33f. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 21. ábrán mutatjuk be.

5’-AGC AGA CAA GGG GCC

A 7f. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 7e. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 22. ábrán mutatjuk be.

5’-CAC CTA TGT TTA TAA

A 11b. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 7f. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 23. ábrán mutatjuk be.

5’-CTC TGT CAC CAT ATT

A 14i. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 11b. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 24. ábrán mutatjuk be.

5’-CTC GTT GCT ACG TCA

A 7e. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 8h. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

GTC ACG AGG CAC-3 ciáján alapul. A 25c. klón szekvenciáját a 13. ábrán mutatjuk be. A 14c. klón izolálásában alkalmazott vizs10 gálati minta az alábbi szekvenciával bír:

GCC TAC ACC ACG GGC-3’

A 8f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 14c. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

AAC TTG CAC CGC TAA-3’

A 33f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 8f. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

CAC CTC CAA AGT-3’

A 33g. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izo30 láljuk, amely a 33f. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

CAT CCT CTG AGC CCG-3’

A 7f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 7e. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

TCC TAG GGT GCA TAA T-3’

A 1 lb. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 7f. kiónban lévó nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

CCA TCT CAC TCC TCT-3’

A 14i. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 1 lb. kiónban lévő nukleotidok szekvenciá50 ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

ACA AGC GCT ATA TCA-3’

A 39c. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izoláljuk, amely a 33g. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

CCA CAA TTT GGT GTA-3’

A 39c. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáját, a 33g. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 25. ábrán mutatjuk be.

HCV cDNS-t tartalmazó izolált klánokból származó összetett HCV cDNS-szekvenciák

A fentebb leírt izolált kiónokban lévő HCV cDNSszekvenciákat felsorakoztatjuk, hogy egy Összetett HCV cDNS-szekvenciát alkossunk meg. Az izolált ki ónok, amelyek 5’—>3’ irányban felsorakoznak, az alábbiak: 14i„ 7f„ 7e„ 8h„ 33c„ 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8f., 33f., 33g. és 39c.

Egy, az izolált klónokból származó HCV cDNS összetett szekvenciát és az ebben kódolt aminosavakat a 26. ábrán mutatunk be.

Az összetett szekvencia megalkotásában az alábbi szekvenciaheterogenitásokat vesszük figyelembe. A 33c. egy 800 bázispáros HCV cDNS-t tartalmaz, amely átfedi a 40b. és 37c. kiónokban lévő cDNS-eket. A 33c. kiónban, valamint 5 másik átfedőkiónban a 789. nukleotid G. A 37b. kiónban azonban a megfelelő nukleotid A. Ez a szekvenciakülönbség nyilvánvaló heterogenitást alakít ki az ebben kódolt aminosavakban, amely vagy CYS vagy TYR lehet a G, illetve az A esetében. Ez a heterogenitás fontos eltérést jelenthet a fehéije összehajtogatása szempontjából.

A 8h. HCV cDNS-ben lévő 2. nukleotidgyök T. Amint azonban fentebb bemutattuk, a 7e. kiónban a megfelelő gyök A, és A-t találunk 3 másik izolált átfedőkiónban. így a T gyök a 8h. kiónban egy mesterséges klónozási terméket képviselhet. Ennek megfelelően a 26. ábrán a gyököt ebben a helyben A-nak jelöljük.

A 8f. klón HCV cDNS-ében a 3’-terminális nukleotid G. A 33f. kiónban azonban - és még 2 másik átfedőkiónban - a megfelelő szekvencia T. Ennek megfelelően a 26. ábrán a gyököt ebben a helyben T-nek jelöljük.

5’-TGC TTG TGG ATG ATG

A 12f. klón HCV cDNS-szekvenciáját, a 14i. klónnal való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 27. ábrán mutatjuk be.

A 35f. klón, amely a 26. ábrán lévő HCV cDNS-től lefelé lévő cDNS-t tartalmazza, izolálását a 39c. klón5’-AGC AGC GGC GTC AAA

A 35f. klón HCV cDNS-szekvenciáját, a 39c. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 28. ábrán mutatjuk be.

5’-TTC TCG TAT GAT ACC

A 19g. klón HCV cDNS-szekvenciáját, a 35f. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 29. ábrán mutatjuk be.

5’-TGT GTG GCG ACG ACT

A 33f. kiónban a HCV cDNS 3’-terminális szekvenciája TTGC. A 33g. kiónban és még két másik átfedőkiónban azonban ez ATTC. Ennek megfelelően a 26. ábrán a megfelelő területeket ATTC képviseli.

A 33g. kiónban a HCV cDNS 4. nukleotidgyöke T. A 33f. kiónban és még 2 másik átfedőkiónban azonban a megfelelő gyök A. Ennek megfelelően a 26. ábrán a megfelelő gyököt A-nak jelöljük.

A 14i. kiónban lévő 3’-terminális AA, míg a 1 lb.-ben és három másik kiónban a megfelelő dinukleotid TA. Ennek megfelelően a 26. ábrán a TA-gyököt tüntetjük fel.

A további szekvenciaheterogenitások megoldását fentebb tárgyaltuk.

Az összetett HCV cDNS vizsgálata azt jelzi, hogy ez egy nagy ORF-et tartalmaz. Ez azt sugallja, hogy a vírusgenom egy nagy polipeptiddé transzlatálódik, amely feldolgozódik a transzlációval együtt vagy azt követően.

A 12f, 35f, 19g., 26g. és 15e. klánokban lévő HCV cDNS-ek izolálása és nukleotidszekvenciái

A 12f., 35f., 19g., 26g. és 15e. kiónokban lévő HCV cDNS-eket lényegében azzal a technikával izoláljuk, amelyet a megfelelő fejezetben leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálóminták az alább leírtak. A kiónok, amelyek a vizsgálómintákkal hibridizálnak, gyakorisága mintegy 1 az 50 000-ben, mindegyik esetben. A HCV cDNS-ek nukleotidszekvenciáját ezekben a kiónokban lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a jelzett kiónokból való cDNS-ek helyettesítik az 5-1-1. kiónból izolált cDNS-eket.

A 12f. klón, amely a 26. ábrán lévő HCV cDNS-től felfelé lévő cDNS-t tartalmazza, izolálását olyan hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva végezzük, amely a 14i. kiónban lévő nukleotidok szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta szekvenciája az alábbi:

CTC ATA TCC CAA-3’ bán lévő nukleotidok szekvenciáján alapuló hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva hajtjuk végre. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

GAA GGC TAA CTT-3’

A 19g. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 35f. klón 3’szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

TGC TTT GAC TCC-3’

A 26g. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 19g. klón 3’szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

TCG TTA TCT GTG-3’

A 26g. klón HCV cDNS-szekvenciáját, a 19g. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 30. ábrán mutatjuk be.

5’-CAC ACT CCA GTC AAT TCC

A 15e. klón HCV cDNS-szekvenciáját, a 26g. kiónban lévő szekvenciával való átfedését és a benne kódolt aminosavakat a 31. ábrán mutatjuk be.

Az ebben a fejezetben leírt kiónokat az ATCC-nél deponáltuk; ezek az alábbi deponálási számot kapták:

lambda-gtl 1	ATTC- szám	A deponálás dátuma
12f. klón	40 514	1988. november 10.
35f. klón	40 511	1988. november 10.
15e. klón	40 513	1988. november 10.
k9-l. klón	40 512	1988. november 10.

A fentebb leírt, izolált kiónokban lévő HCV cDNSszekvenciákat egymás mellé sorakoztatjuk fel, hogy összetett HCV cDNS-szekvenciát alkossunk meg. Az izolált kiónok, amelyek 5’—>3’ irányban egymás mellett sorakoznak, az alábbiak: 12f., 141., 7f., 7e., 8h., 33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8f., 33f., 33g., 39c., 35f., 19g.,26g. és 15e.

Az izolált klónokból származó összetett HCV cDNS-szekvenciát és a benne kódolt aminosavakat a 32. ábrán mutatjuk be.

Másik eljárás a 12f. klánban lévő HCV cDNS-szekvenciától felfelé lévő cDNS-szekvenciák izolálására

A 32. ábrán lévő legtöbb 5’ HCV-szekvenciára alapozva, amely a 12f. kiónban lévő HCV cDNS-ből származik, reverz transzkriptáz kis szintetikus oligonukleotid primerjeit szintetizáljuk, és alkalmazzuk a HCV-genom RNS-ben lévő megfelelő szekvencia kötésére, hogy beindítsuk a felfelé lévő szekvenciák reverz transzkripcióját. A primer szekvenciák proximálisak a 12f. klón ismert 5’-terminális szekvenciájához, de megfelelően lefelé vannak ahhoz, hogy lehetővé tegyék a primer szekvenciáktól lefelé lévő vizsgálóminta-szekvenciák tervezését. A beindítás és klónozás ismert, standard eljárásait alkalmazzuk. Az így létrejövő cDNS-könyvtárat olyan szekvenciákkal vizsgáljuk át, amelyek a beindítóhelyektől lefelé vannak (amint ez a 12f. kiónban lévő megvilágított szekvenciából következik). A HCV-genom RNS-t NANBH-ban szenvedő csimánzok plazma- vagy májmintáiból nyeljük, vagy NANBH-ban szenvedő emberek hasonló mintáiból.

Másik eljárás farokképzést alkalmazva a HCVgenom 5 '-terminális területéből való szekvenciák izolálására

Abból a célból, hogy a HCV RNS-genom többlet 5’-terminális szekvenciáit izoláljuk, a reverz tamszkripció első menetének cDNS-termékét, amely a templát RNS-sel képez duplexet, oligo C farokkal látjuk el. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a terméket terminális transzferázzal inkubáljuk CTP jelenlétében. A cDNS-szintézis menetét, amely a cDNS első szálának kiegészítését adja, a reverztranszkriptáz-reakcióhoz primerként oligo G-t

A 15e. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgálómintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 26g. klón 3’szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi:

CTA GGC AAC-3’ hasznosítva hajtjuk végre. A genom HCV RNS forrásai azok, amelyeket már az előzőekben leírtunk. A farokképzési eljárást terminális transzferázzal és a reverz transzkriptázos reakciót úgy végezzük, amint azt Maniatis és munkatársai leírták (1982). A cDNS-termékeket azután klónozzuk, átvizsgáljuk, és szekvenciájukat elemezzük.

Másik eljárás farokképzést alkalmazva a HCV-genom 3 '-terminális területéből való szekvenciák izolálására

Ez az eljárás Flavivírus RNS cDNS-einek klónozásához korábban alkalmazott eljárásokon alapul. Ebben az eljárásban az RNS-t denaturálókörülményeknek vetjük alá, hogy eltávolítsuk a szekunder szerkezeteket a 3’-terminálisnál, majd farokkal látjuk el poli-A polimerázzal, szubsztrátumként rATP-t alkalmazva. A poliA farokkal ellátott RNS reverz transzkripcióját reverz transzkriptázzal katalizáljuk, primerként oligo dT-t alkalmazva. A cDNS második szálait szintetizáljuk, a cDNS termékeket klónozzuk, átvizsgáljuk, és szekvenciájukat meghatározzuk.

Nagyobb cDNS-beiktatásokat tartalmazó lambda-gtll HCV cDNS-könyvtárak megalkotása

A lambda-gtl 1 könyvtárak megalkotására és átvizsgálására alkalmazott eljárások lényegében azok, amelyeket az előbbiekben leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a könyvtárat a Sepharose CL-4B oszlopról eluált, nagyobb méretű cDNS-ek gyűjteményéből alakítjuk ki.

HCV cDNS-könyvtárak megalkotása, primerként szintetikus oligomereket alkalmazva

Új HCV cDNS-könyvtárakat állítunk elő az előzőekben leírt fertőző csimpánzplazma-gyűjteményből származó RNS-ből, és ennek a fertőzött állatnak a májából származó poli-A⁺ RNS-frakcióból. A cDNS-t lényegében úgy alkotjuk meg, amint ezt Gubler és Hoffman (1983) leírták, azzal a kivétellel, hogy az első cDNS-szál szintézishez való primerek szintetikus oligomerek, amelyek a fentebb leírt HCV-genom szekvenciáján alapulnak. A 1 lb., illetve 7e. klón szekvenciáján alapuló primerek az alábbiak:

5’-CTG GCT TGA AGA ATC-3’ és

5’-AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC-3’

Az így létrejövő cDNS-eket lambda-bakteriofág vektorokba klónozzuk, és különböző más szintetikus oligomerekkel vizsgáljuk át, amelyek szekvenciái a 32. ábrán lévő HCV-szekvencián alapulnak.

A HCV cDNS-eken belül kódolt polipeptidek kifejezése és a kifejezett termék azonosítása HCV-indukált antigénként

Az 5-1-1. klánban kódolt polipeptid kifejezése

Az 5-1-1. kiónon belül kódolt HCV-polipeptidet szuperoxid-diszmutázzal (SÓD) képzett fúziós polipeptidként fejezzük ki. Ezt az 5-1-1. klón cDNS-beiktatás szubklónozásával hajtjuk végre a pSODcfl kifejezővektorba [Steimer és munkatársai (1986)] az alábbiak szerint.

Először a pSODcfl-ből izolált DNS-t BamHI-gyel és EcoRI-gyel kezeljük. Ennek során egy nagy lineáris DNS-fragmentumot és egy kisméretű, körülbelül 10 nukleotidból álló fragmentumot kapunk. Ezután az alábbi kapcsolót ligáljuk a restrikciós enzimek által létrehozott nagy lineáris DNS-fragmentumba:

5’-GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3’

3’ GA CCT TAA GAC TAT TTT AA-5’

A klónozás után a beiktatást tartalmazó plazmidot izoláljuk.

A beiktatást tartalmazó plazmidot EcoRI-gyel hasítjuk. Az 5-1-1. kiónban lévő HCV cDNS-beiktatást EcoRI-gyel kimetsszük, és ebbe az EcoRI-gyel linearizált plazmid DNS-be ligáljuk. A DNS keverékét alkalmazzuk E. coli D1210 törzs [Sadler és munkatársai, Gene, 8, p. 279 (1980)] transzformálására. Azokat a rekombinánsokat, amelyek az 1. ábrán bemutatott ORFkifejeződésre nézve korrekt orientációban tartalmazzák az 5-1-1. cDNS-t, restrikciós térképezéssel és nukleotidszekvencia-elemzéssel azonosítjuk.

Az egyik kiónból való rekombináns baktériumokat indukálunk, hogy fejezzenek ki SOD-NANB₅__M-polipeptidet a baktériumok növesztésével, IPTG jelenlétében.

A 81. klánban kódolt polipeptid kifejezése

A 81. kiónon belül lévő HCV cDNS-t SOD-NANB₈| fúziós polipeptidként fejezzük ki. Az eljárás ezt fúziós polipeptidet kódoló vektor előállítására analóg azzal, amelyet az SOD-NANB₅.₁.₁-et kódoló vektor megalkotásánál alkalmazunk, azzal a különbséggel, hogy a HCV cDNS forrása a 81. klón, amelyet a leírt módon izolálunk, és amelynél a cDNSszekvenciát a leírt módon határozzuk meg. A 81. kiónban lévő HCV cDNS nukleotidszekvenciáját és az ebben kódolt polipeptid vélt aminosavszekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be.

A 81. kiónban lévő HCV cDNS-beiktatást EcoRIgyel kimetsszük, és a pSODcfl -be ligáljuk, amely tartalmazza a kapcsolót, és amely EcoRI-gyel végzett kezeléssel linearizálva van. A DNS-keveréket alkalmazzuk az E. coli D1210 törzs transzformálására. A 4. ábrán bemutatott ORF kifejeződéséhez megfelelő orientációban lévő 81. HCV cDNS-klónnal bíró rekombinánsokat restrikciós térképezéssel és nukleotidszekvencia-elemzéssel azonosítjuk.

Az egyik kiónból való rekombináns baktériumokat indukáljuk úgy, hogy SOD-NANB₈₁-polipeptid fejeződjék ki, amikor a baktériumokat IPTG jelenlétében növesztjük.

Az 5-1-1. klánon belül kódolt polipeptid, mint HCVvel és NANBH-val társult antigén azonosítása

Az 5-1-1. klón HCV cDNS-én belül kódolt polipeptidet úgy azonosítjuk NANBH-hez társult antigénként, hogy bemutatjuk: az NANBH-val fertőzött csimpánzok és emberek szérumai immunológiailag reagálnak a SOD-NANB₅__bl fúziós polipeptiddel, amely polipeptid szuperoxid-diszmutázt tartalmaz N-terminálisánál és keretben lévő 5-1-1. antigén C-terminálásánál. Ezt Western-foltképzéssel hajtjuk végre [Towbin és munkatársai (1979)] az alábbiak szerint.

A SOD-NANBj.u-polipeptidet kódoló kifejezővektorral transzformált baktériumok egy rekombináns törzsét, amelyet az előzőekben írtunk le, indukáljuk fúziós polipeptid kifejezésére olyan módon, hogy IPTG jelenlétében növesztjük. A teljes baktériumlizátumot elektroforézisnek vetjük alá poliakrilamid géleken SDS jelenlétében Laemmli (1970) szerint. Az elkülönített polipeptideket nitro-cellulóz-szűrőkre viszszük át [Towbin és munkatársai (1979)]. A szűrőket azután vékony csíkokra hasítjuk, és a csíkokat egyenként inkubáljuk különböző csimpánz- és humán szérumokkal. A kötött antitesteket ^l25I-vel jelzett juh-antihumán Ig-vel végzett további inkubálással mutatjuk ki, amint ezt az előzőekben leírtuk.

A Westem-foltképzéshez alkalmazott csimpánzszérumok jellemzését és az eredményeket, amelyeket az autoradiográfiának alávetett csíkok fényképeiben mutatunk be, a 33. ábra szemlélteti. A polipeptideket tartalmazó nitro-cellulóz-csíkokat csimpánzokból származó szérumokkal inkubáljuk, ahol a szérumok akut NANBH- (Hutchinson-törzs) fertőzéseknek (1-16. csíkok), hepatitis A fertőzésnek (17-24. és 26-33. csíkok) és hepatitis B fertőzéseknek (34-44. csíkok) kitett állatokból, különböző időpontokból származnak. A 25. és 45. csíkok pozitív kontrollok, amelyekben az immunfoltokat abból a betegből származó szérummal inkubáljuk, amelyet az 5-1-1. rekombináns klón azonosítására alkalmaztunk a lambda-gtll cDNS-könyvtár eredeti átvizsgálásában.

A 33. ábrán a 25. és 45. kontrollcsíkokban látható csík a SÓD fúziós polipeptid NANB₅_-része elleni antitestek kötését tükrözi. Ezek az antitestek nem mutatnak kötést SOD-ra önmagában, mivel ez negatív kontrollt is jelent ezekben a mintákban, és olyan módon tűnik fel, mint a SOD-NANBj.j.j fúziós polipeptidnél jelentősen gyorsabban vándorló csík.

A 33. ábra 1-16. csíkjai antitestek kötését mutatják be 4 csimpánz szérummintáiban; a szérumokat közvetlenül az NANBH-val végzett fertőzés előtt vesszük, majd egymás után az akut fertőzés során. Amint az ábrából látható, míg azok az antitestek, amelyek immunológiailag reagálnak a SOD-NANB₅__M-polipeptiddel, hiányoznak a fertőző HCV-inokulum beadása előtt vett és a fertőzés korai akut fázisa során vett szérummintákból, addig mind a 4 állat végül is indukál ezen polipeptid elleni cirkuláló antitesteket az akut fázis utolsó részében és az akut fázist követően. A 3. és 4. számú csimpánzok esetében az immunfoltokon megfigyelt további csíkok a gazda-bakteriálisfehéijékhez való háttérkötésnek tulajdoníthatók.

Az NANBH-vel fertőzött csimpánzokból való szérumokkal kapott eredményekkel ellentétben a fúziós polipeptid NANB₅__m része elleni antitestek kifejlődését nem figyeltük meg 4 olyan csimpánznál, amelyek HAV-vel voltak fertőzve vagy 3 olyan csimpánznál, amelyek HBV-vei voltak fertőzve. Ezekben az esetekben az egyetlen kötés a háttérkötés a gazdabakteriális30 fehérjéhez, amely a HCV-vel fertőzött mintákban is előfordul.

A Westem-foltképzéshez alkalmazott humán szérumok jellemzését és az eredményeket, amelyek autoradiográfiának alávetett csíkok fényképein láthatók, a 34. 5 ábrán szemléltetjük. A polipeptideket tartalmazó nitrocellulóz-csíkokat emberekből származó szérumokkal inkubáljuk, ahol szérumok különböző időpontokból származnak a NANBH-val (1-21. csíkok), HAV-val (33-40. csíkok) és HBV-vel (41-49. csíkok) végzett 1( fertőzés során. A 25. és 50. csíkok pozitív kontrollokat jelentenek, amelyekben az immunfoltokat olyan betegből származó szérummal inkubáljuk, akit a lambda-gtl 1 könyvtár eredeti átvizsgálásánál alkalmaztunk, amint ezt fentebb leírtuk. A 22-24. és 26-32. csíkok 1í olyan „nem fertőzött” kontrollokat mutatnak, amelyekben a szérum „normális” véradóktól ered.

Amint a 34. ábrán látható, kilenc NANBH-betegből származó szérum, ide értve a lambda-gtl 1 könyvtár átvizsgálásához alkalmazott szérumot, tartalmazza a fú- 2( ziós polipeptid NANB₅_i.,-része elleni antitesteket. Három, NANBH-ban szenvedő betegből származó szérum nem tartalmazza ezeket az antitesteket. Lehetséges, hogy az anti-NANB 544-antitestek későbbi időpontban fejlődnek csak ki ezekben a betegekben. Az is lehetsé- 25 ges, hogy a reakció hiánya egy, a betegséget előidéző, de eltérő NANBV-ágens következménye, és a nem válaszoló szérumok ilyen ágenst tartalmaznak.

A 34. ábra azt is megmutatja, hogy a HAV-val és HBV-vel fertőzött betegekből származó szérumok nem 30 tartalmaznak anti-NANB₅_j_|-antitesteket, és hogy ezek az antitestek nincsenek jelen a „normális” kontroliokból származó szérumokban sem. Bár az egyik HAV-beteg (36. csík), úgy tűnik, tartalmaz anti-NANBj.,.,-antitesteket, lehetséges, hogy ez a beteg előzőleg HCV-vel is 35 volt fertőzve, mivel az egybeesés NANBH-val nagyon nagy, és mivel ez gyakran csak szubklinikai jellegű.

Ezek a szerológiai tanulmányok azt jelzik, hogy az 5-1-1. kiónban lévő cDNS olyan epitopokat kódol, amelyeket BB-NANBV-vel fertőzött betegekből és állatok- 40

5’-AAT TTG GGA ATT CCA TAA AC CCT TAA GGT ATT

Az EcoRI hely lehetővé teszi olyan heterológ szék- 45 venciák beiktatását, amely — amikor a kazettát tartalmazó vektorból kifejeződik - olyan polipeptidet termel, amely szuperoxid-diszmutázhoz van fuzionálva az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazó oligopeptid kapcsoló útján: 50

-asn-leu-gly-ile-arg-.

A pS356 egyik mintáját 1988. ápirlis 29-én deponáltuk a Budapesti Szerződés feltételei között az American Type Culture Collection-nál (ATCC 12301, Rockville, Maryland 20 853), ahol ez az ATCC 67 683 deponálási számot kapta. Ez a deponált törzs kizárólag a kényelmesebb megoldást szolgálja, és nem feltétlenül szükséges a jelen találmány gyakorlati megvalósításában a jelen leírás alapján. A deponált törzsek a jelen bejelentésbe referenciaként épülnek be.

ból kapott szérumok fajlagosan felismernek. Ezenkívül, úgy tűnik, a cDNS nem a főemlősgenomból származik. Egy, az 5-1 -1. klónból vagy 81. klónból készített hibridizáló vizsgálóminta nem hibridizál nem fertőzött egyénekből származó kontroll humán és csimpánzgenom DNS Southern-foltjaival olyan körülmények között, ahol egyedi, egymásolatú gének kimutathatók. Ezek a vizsgálóminták nem hibridizálnak kontroll szarvasmarhagenom DNS Southem-foltjaihoz sem.

A 36., 81. és 32. klánokban lévő HCV cDNS-ek összetett termékeiben kódolt polipeptidek kifejezése

A HCV-polipeptidet, amely a 36., 81. és 32. kiónokon keresztül teijedő ORF-ben kódolódik, SOD-zal képzett fúziós polipeptidként fejezzük ki. Ezt a C100 összetett cDNS beiktatásával hajtjuk végre a humán szuperoxid-diszmutáz-gént tartalmazó kifejezőkazettában, majd a kifejezőkazetta beiktatásával valamely kifejezővektorba, és a polipeptid kifejezésével élesztőben.

A 36., 81. és 32. kiónokból származó összetett Cl00 cDNS-t tartalmazó kifejezőkazettát úgy alkotjuk meg, hogy a -1270 bp-s EcoRI fragmentumot beiktatjuk a pS3-56 (vagy más néven pS356) vektor EcoRI helyébe, így alakítva ki a pS3-56_cl00 plazmidot. A C100 megalkotását az előbbiekben írtuk le.

A pS3-56 vektor, amely pBR322 származék, olyan kifejezőkazettát tartalmaz, amely az ADH2/GAPDH hibrid élesztőpromotorból áll a humán szuperoxid-diszmutáz-géntől fölfelé, és egy GAPDH transzkripciós terminátorból lefelé. Egy hasonló kazettát, amely ezeket a szabályozóelemeket tartalmazza, valamint a szuperoxid-diszmutáz-gént írnak le Cousens és munkatársai (1987) és a 196,056 számú európai szabadalmi közzétételi irat, amelynek bejelentői közösek a jelen találmány bejelentőivel. A pS3-56 kazetta azonban különbözik Cousens és munkatársai (1987) kazettájától, amennyiben a heterológ proinzulingén és az immunglobulin-„illesztés” ki van iktatva, és annyiban, hogy a szuperoxiddiszmutáz glu_I54-ét olyan adaptorszekvencia követi, amely egy EcoRI helyet tartalmaz. Az adaptor szekvenciája az alábbi:

TGA G

ACT CAG CT-3’

Miután olyan rekombinánsokat izoláltunk, amelyek korrekt orientációban tartalmazzák a C100 cDNS-t, a Cl00 cDNS-t tartalmazó kifejezőkazettát kimetsszük BamHI-gyel a pS3-56_cl00-ból, és egy -3400 bp-s fragmentumot, amely a kazettát tartalmazza, izolálunk és tisztítunk. Ezt a fragmentumot azután a pAB24 élesztővektor BamHl helyébe iktatjuk.

A pAB24, amelynek jelentősebb vonásait a 35. ábrán mutatjuk be, élesztő „ingázó” vektor, amely tartalmazza a replikációhoz a teljes 2 mikronos szekvenciát [Broach (1981)], és tartalmaz pBR322 szekvenciákat. Ez tartalmazza az Yep24 plazmidból [Botstein és munkatársai (1979)] származó élesztő URA3 gént, és a pCl/1 plazmidból származó élesztő LEU^2d gént (116,201 számú európai szabadalmi közzétételi irat). A pAB24 plaz60 midot úgy alkotjuk meg, hogy az Yep24-et EcoRI-gyel

HU 216 017 Β emésztjük, és a vektort újraligáljuk, hogy eltávolítsuk a részleges 2 mikronos szekvenciákat. Az így létrejött plazmidot, az YEP24deltaRI-t Clal-gyel végzett emésztéssel linearizáljuk, és ligáljuk a komplett 2 mikronos plazmiddal, amelyet előzőleg Clal-gyel linearizáltunk. Az így létrejött plazmidot, a pCBou-t azután Xbal-gyel emésztjük, és a 8605 bp-s vektorfragmentumot gélen izoláljuk. Ezt az izolált Xbal fragmentumot a pC 1/1 -bői izolált LEU^2d gént tartalmazó 4460 bp-s Xbal fragmentummal ligáljuk; a LEU^2d gén orientációja ugyanabban az irányban van, mint az URA3 gén. A kifejeződés baiktatása a pBR322 szekvencia egyedi BamHl helyén van, így megszakítva a tetraciklin iránti baktérium rezisztenciát szolgáló gént.

A pAB24C100-3 rekombináns plazmidot, amely tartalmazza az SOD-CIOO kifejező kazettát, JSC 308 élesztőtörzsbe, valamint más élesztőtörzsekbe transzformáljuk. A sejteket úgy transzformáljuk, amint ezt Hinnen és munkatársai (1978) leírták; és ureaszelektív lemezekre szélesztjük. Egyedi telepeket izolálunk leuszelektív tápközegekre, és telítettségig növesztjük. A tenyészetet SOD-CIOO polipeptid (amelyet C100-3-nak is neveznek) kifejezésére indukáljuk, 1% glükózt tartalmazó YEP-ben növesztve.

A JSC 308 törzs MAT+, leu2, ura3(del), DM15(GAP/ADR1) genotípusú, az ADRI lókusznál integrálva. A JSC 308-ban a pozitív aktivátorgén-termék, az ADRI, túlkifejezése hiperderepressziót eredményez (az ADRI vad típusú kontrolihoz viszonyítva), és a kifejezett heterológ fehérjék jelentősen magasabb kitermeléseit eredményezi, amikor az ilyen fehérjéket ADH2 U AS szabályozórendszer révén szintetizáljuk. A JSC 308 egyik mintáját az ATCC-nél a Budapesti Szerződés feltételei szerint helyeztük letétbe, ahol ez az ATCC 20 879 számot kapta.

A pAB24C100-3-ban kódolt komplett C100-3 fúziós polipeptid tartalmazza a humán SÓD 154 aminosavát az aminoterminálisnál, az EcoRI helyet tartalmazó szintetikus adaptorból származó 5 aminosavat, a C100 cDNS-ből származó 363 aminosavgyököt és az MS2 nukleotidszekvenciából származó 5 karboxiterminális aminosavat a 32. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciával érintkezve. Ezen polipeptid karboxiterminálisának vélt aminosavszekvenciáját, amely az SÓD utolsó előtti Ala gyökénél kezdődik, a 36. ábrán mutatjuk be; a polipeptidnek ezt a részét kódoló nukleotidszekvenciát szintén bemutatjuk.

A C100-on belül kódolt polipeptid azonosítása NANBH-val társult antigénként

A pAB24100-3 plazmidból a JSC 308 élesztőtörzsben kifejezett C100-3 fúziós polipeptidet jellemezzük méret szerint, és a C100-on belül kódolt polipeptidet NANBH-val társult antigénként azonosítjuk immunológiai reaktivitásuk alapján krónikus NANBH-ban szenvedő ember szérumával.

A Cl00-3 polipeptidet, amelyet úgy fejezünk ki, amint ezt a korábbiakban leírtuk, az alábbiak szerint elemezzük. Élesztő JSC 308 sejteket transzformálunk pAB24-gyel vagy pAB24C100-3-mal, és úgy indukáljuk, hogy a heterológ plazmid kifejezze a kódolt polipeptidet. Az 1 ml tenyészetben (OD_{650 nm} —20) lévő indukált élesztősejteket 10000 fordulat/perccel 1 percen át végzett centrifugálással üledékbe visszük, és lizáljuk élénken forgatva Vortex készüléken 2 térfogat oldat és 1 térfogat üveggyöngy (0,2 millimikron átmérő) jelenlétében. Az oldat 50 mmol/1 trísz.HCl-t (ph 8,0), 1 mmol/1 EDTA-t, 1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) és 1 mikrogramm/ml pepsztatint tartalmaz. A lizátumban lévő oldhatatlan anyagot, amely magában foglalja a Cl00-3 polipeptidet, centrifugálással (10000 fordulat/perc, 5 perc) összegyűjtjük, és feloldjuk 5 percig forralva Laemmli SDS mintapufferrel [lásd Laemmli (1970)]. Az indukált élesztőtenyészet 0,3 mlnyi mennyiségével ekvivalens mennyiségű polipeptidet elektroforézisnek vetünk alá 10%-os poliakrilamid gélen SDS jelenlétében [Laemmli (1970)]. Fehérjestandardokat elektroforetizálunk a géleken ezekkel együtt. A kifejezett polipeptideket tartalmazó géleket vagy Coomassie brilliantkékkel festjük, vagy „Westení’-foltképzésnek vetjük alá, krónikus NANBH-ban szenvedő betegből kapott szérumot alkalmazva, hogy meghatározzuk a pAB24-ből és pAB24C100-3-ból kifejezett polipeptidek immunológiai reaktivitását.

Az eredményeket a 37. ábrán mutatjuk be. A 37a. ábrán a polipeptideket Coomassie brilliantkékkel festjük. A pAB24-gyel transzformált JSC 308-ból és a pAB24C100-3-mal transzformált JSC két különböző telepéből való oldhatatlan polipeptideket az 1. csíkban (pAB24), illetve a 2. és 3. csíkban mutatjuk be. A 2. és 3. csíkok összehasonlítása az 1. vonallal egy -54000 dalion molekulatömegnek megfelelő indukált polipeptidet mutat, amely a pAB24C100-3-mal transzformált JSC 308ból származik; ez a PAB24-gyel transzformált JSC 308ban nem indukálódik. Ezt a polipeptidet nyíllal jelöljük.

A 37b. ábra a pAB24-gyel (1. csík) vagy pAB24C100-3-mal (2. csík) transzformált JSC 308ban kifejezett oldhatatlan polipeptidek Westem-foltjainak eredményeit mutatja be. A pAB24-ből kifejezett polipeptidek immunológiailag nem reaktívak egy NANBH-ban szenvedő emberből való szérummal. Amint a nyíl jelzi, a pABC24100-3-mal transzformált JSC 308 egy olyan -54 000 dalton molekulatömegü polipeptidet fejez ki, amely viszont immunológiailag reagál a humán NANBH-szérummal. A további immunológiailag reaktív polipeptidek a 2. vonalban lehetnek ennek a -54 000 daltonos polipeptidnek bomlási vagy aggregálódási termékei.

A Cl 00-3 fúziós polipeptid tisztítása

A C100-3 fúziós polipeptidet, amely az N-terminálisánál SOD-t tartalmaz és C-terminálisánál azonos keretben Cl00 HCV-polipeptidet, tisztítjuk az extrahált gazda-élesztősejtek, amelyekben a polipeptid kifejeződik, oldhatatlan frakciójának differenciálextrakciójával.

A C100-3 fúziós polipeptidet a pAB24C100-3mal transzformált JSC 308 élesztőtörzsben fejezzük ki, amint ezt a IV.B.4. fejezetben kifejtjük. Az élesztősejteket azután homogenizálással lizáljuk, a lizátumban lévő oldhatatlan anyagot pH 12,0-nál extraháljuk, és a maradék oldhatatlan frakcióban lévő C100-3-at SDS-t tartalmazó pufferben szolubilizáljuk.

HU 216 017 Β

Az élesztőlizátumot lényegében úgy állítjuk elő, amint ezt Nagahuma és munkatársai (1984) leírják. Olyan élesztősejt-szuszpenziót állítunk elő, amelyben 33% (térfogat/térfogat) sejtet szuszpendálunk olyan oldatban („A” puffer), amely 20 mmol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 ditiotreitolt és 1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmaz. A szuszpenzió (15 ml) egy alikvotját összekeverjük azonos térfogatú üveggyönggyel (0,45-0,50 mm átmérő), és a keveréket Vortex berendezésben [Super Mixer (Láb Line Instruments, Inc.)] csúcssebességnél 8 percig forgatjuk. A homogenizátumokat és az üveggyöngyöket elkülönítjük, és az üveggyöngyöket háromszor mossuk azonos térfogat „A” pufferben, mint az eredeti betöltött sejtek térfogata. A mosóoldatok és a homogenizátum egyesítése után a lizátumban lévő oldhatatlan anyagot a homogenizátum 7000xg-nél, 15 percen át 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálásával, az üledéknek az eredetileg betöltött sejtek kétszeres térfogatával azonos térfogatú „A” pufferben való újraszuszpendálásával, és az így kapott anyagnak 7000xg-nél 15 percen át végzett centrifugálásával kapjuk meg. Ezt a mosási munkamenetet háromszor ismételjük.

A lizátumból az oldhatatlan anyagot pH 12,0-nál extraháljuk az alábbiak szerint. Az üledéket olyan pufferben szuszpendáljuk amely 0,5 mol/1 NaCl-t és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmaz, ahol a szuszpendáló térfogat az eredetileg betöltött sejtek 1,8-szorosa. A szuszpenzió pH-ját beállítjuk 0,2 térfogat 0,4 mol/l-es Nafoszfát-puffer (pH 12,0) hozzáadásával. Összekeverés után a szuszpenziót 7000xg-nél centrifugáljuk 15 percig 4 °C hőmérsékleten, és a felülúszót eltávolítjuk. Az extrahálást kétszer megismételjük. Az extrahált üledéket mossuk olyan módon, hogy szuszpendáljuk ezeket 0,5 mol/1 NaCl-t és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldatban az eredeti betöltött sejtek kétszeres térfogatának megfelelő szuszpendáló térfogatot alkalmazva, ezt pedig centrifugálás követi 7000xg-nél 15 percen át 4 °C hőmérsékleten.

Az extrahált üledékben lévő C100-3 polipeptidet SDS-sel végzett kezeléssel szolubilizáljuk. Az üledéket az eredeti betöltött térfogat 0,9-szeres térfogatával azonos mennyiségű „A” pufferben szuszpendáljuk, és 0,1 térfogat 2%-os SDS-t adunk hozzá. Miután a szuszpenziót összekevertük, 7000xg-nél centrifugáljuk 15 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az így létrejött üledéket még háromszor extraháljuk SDS-sel. Az így létrejövő felülúszókat, amelyek Cl00-3-at tartalmaznak, összegyűjtjük.

Ez a munkamenet a C100-3-at több, mint tízszeresen tisztítja az élesztőhomogenizátum oldhatatlan frakciójából, és a polipeptid kinyerése 50%-nál több.

A fúziós polipeptid tisztított készítményét poliakrilamidgél-elektroforézissel elemezzük Laemmli (1970) szerint. E szerint az elemzés szerint a polipeptid 80%nál nagyobb tisztaságú, és látszólagos molekulatömege ~54 000 dalton.

RNS kimutatása fertőzött egyénekben, amely RNS hibridizál a HCV cDNS-hez

NANBH-ban szenvedő csimpánz májában lévő RNS azonosítása, amely RNS HCVcDNS-sel hibridizál

NANBH-ban szenvedő csimpánz májából származó RNS-ben az alábbiak szerint mutatunk ki olyan RNSfajtát, amely Northern-foltképzéssel hibridizál a 81. kiónon belül lévő HCV cDNS-hez.

Annak a csimpánznak, amelyből a nagy titerű plazma származik, a májából biopsziával mintát veszünk, és ebből RNS-t izolálunk azt a technikát alkalmazva, amelyet Maniatis és munkatársai (1982) írtak le a teljes RNS izolálására emlőssejtekből, és ezek elkülönítésére poliA+ és poli-A frakciókra. Ezeket az RNS-frakciókat elektroforézisnek vetjük alá formaldehid/agaróz gélen [1% (tömeg/térfogat)], és nitro-cellulózra visszük át [Maniatis és munkatársai (1982)]. A nitro-cellulózszűrőket a 81. klónból való radioaktívan jelzett HCV cDNS-sel hibridizáljuk (lásd a 4. ábrát a beiktatás nukleotidszekvenciájával kapcsolatban). Abból a célból, hogy radioaktív vizsgálómintát állítsunk elő, a 81. klónból izolált HCV cDNS-beiktatást radioaktívan jelezzük ³²P-vel hézag(nick) transzláció segítségével DNS-polimeráz I-et alkalmazva [Maniatis és munkatársai (1982)]. A hibridizálást 18 órán át végezzük 42 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 10% (tömeg/térfogat) dextrán-szulfátot, 50% (tömeg/térfogat) ionmentesített formamidot, 750 mmol/1 NaCl-t, 75 mmol/1 Na-citrátot, 20 mmol/1 Na₂HPO₄-et (pH 6,5) 0,1% SDS-t, 0,02% (tömeg/térfogat) szarvasmarha-szérumai bumint (BSA), 0,02% (tömeg/térfogat) Ficoll-400-at, 0,02% (tömeg/térfogat) poli(vinil-pirrolidon)-t, 100 mikrogramm/ml lazacsperma DNS-t (amelyet előzőleg ultrahangos kezeléssel nyírtunk és denaturáltunk) és 10⁶ CPM/ml hézag- (nick) transzlatált cDNSvizsgálómintát tartalmaz.

Az átvizsgált szűrő autoradiogramját a 38. ábrán mutatjuk be. Az 1. csík tartalmazza a ³²P-vel jelzett restrikciósfragmentum-markereket. A 2-4. csíkok tartalmazzák a csimpánzmáj RNS-eket az alábbiak szerint: a 2. csík 30 mikrogramm teljes RNS-t tartalmaz; a

3. csík 30 mikrogramm poli-A RNS-t tartalmaz; és a

4. csík 20 mikrogramm poli-A⁺ RNS-t tartalmaz. Amint a 38. ábrán látható, az NANBH-ban szenvedő csimpánz mája rokon poli-A+ RNS-molekulák heterogén populációját tartalmazza, amelyek a HCV cDNSvizsgálómintához hibridizálnak, és amelyek, úgy tűnik, mintegy 5000 nukleotid és mintegy 11 000 nukleotid közti méretűek. Ez az RNS, amely a HCV cDNS-sel hibridizál, a vírusgenomokat és/vagy a vírusgenom fajlagos átiratait képviselheti.

Az alábbiakban leírt kísérlet egybevág azzal a feltételezéssel, hogy a HCV egy RNS-genomot tartalmaz.

HCV eredetű RNS azonosítása fertőzött egyedek szérumában

Nagy titerű csimpánz NANBH-plazmából izolált részecskékből nukleinsavakat extrahálunk, amint ezt az előzőekben leírtuk. Az izolált nukleinsavakból alikvotokat (1 ml eredeti plazmának megfelelőket) újraszuszpendálunk 20 mikroliter olyan oldatban, amely 50 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA-t és 16 mikrogramm/ml oldható élesztő RNS-t tartalmaz. A mintákat denaturáljuk 5 perces forralással, amelyet

HU 216 017 Β azonnal fagyasztás követ, majd RN-áz A-val [5 mikroliter, amely 0,1 mg/ml RN-áz A-t, 25 mmol/1 EDTA-t és 40 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5) tartalmaz] vagy DN-áz I-gyel [5 mikroliter, amely 10 mmol/1 MgCl₂-t és 25 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5) tartalmazó oldatban 1 egység DN-áz I-et tartalmaz] kezeljük; a kontrollmintákat enzim nélkül inkubáljuk. Az inkubálást követően 230 mikroliter jéghideg 2xSSC-t, amely még 2 mikrogramm oldható élesztő RNS-t is tartalmaz, adunk hozzá, és a mintákat nitro-cellulózszűrőn szűrjük. A szűrőket a 81. kiónból való cDNS vizsgálómintákkal hibridizáljuk, amely vizsgálómintákat előzőleg ³²P-vei jeleztünk hézag- (nick) transzláció segítségével. A 39. ábra a szűrő autoradiogramját mutatja be. A hibridizációs jelzéssel kimutathatók a DN-ázzal kezelt és kontrollmintákban (2., illetve 1. csíkok), de nem mutathatók ki az RN-ázzal kezelt mintában (3. csík). így mivel az RN-áz kezelés elroncsolja a részecskékből izolált nukleinsavakat, és a DN-áz I kezelésnek nincs hatása, ez a bizonyíték erősen sugallja, hogy a HCV-genom RNS-ből áll.

HCV nukleinsavszekvenciákból származó amplifikált HCV nukleinsavszekvenciák kimutatása NANBH-ban szenvedő csimpánzokból való máj- és plazmamintákban

NANBH-ban szenvedő csimpánzok és kontrolicsimpánzok májában és plazmájában jelen lévő HCVnukleinsavakat amplifikálunk, lényegében azt a polimeráz láncreakciós technikát (PCR) alkalmazva, amelyet Saihi és munkatársai (1986) leírtak. A primer oligonukleotidok a 81. kiónban vagy 36. és 37. kiónban lévő HCV cDNS-ből származnak. Az amplifikált szekvenciákat gélelektroforézissel és Southem-foltképzéssel mutatjuk ki, vizsgálómintaként a megfelelő cDNS oligomert alkalmazva abból a területből való szekvenciával, amely a két primer között van, de a két prímért nem foglalja magában.

Az amplifikációs módszerrel vizsgálandó HCVszekvenciákat tartalmazó RNS-mintákat három, NANBH-ban szenvedő csimpánz és két kontrollcsimpánz májbiopsziás mintájából izoláljuk. Az RNS-frakció izolálását az előbbiekben leírt guanidium-tiocianátos eljárással végezzük.

Az RNS mintáit, amelyet az amplifikációs módszerek amplifikálni szándékozunk, izoláljuk két, NANBH-ban szenvedő csimpánz plazmájából, és egy kontrollcsimpánz plazmájából, valamint kontrollcsimpánzokból származó plazmák gyűjteményéből. Az egyik fertőzött csimpánznak 10⁶, vagy nagyobb a CID/ml értéke, és a másiknak 10⁵, vagy nagyobb a CID/ml értéke.

A nukleinsavakat a plazmából az alábbiak szerint vonjuk ki. Vagy 0,1 ml vagy 0,01 ml plazmát hígítunk 1,0 ml végső térfogatra TENB/K proteináz/SDS oldattal [0,05 mol/1 trisz.HCl (pH 8,0), 0,001 mol/1 EDTA, 0,1 mol/1 NaCl, 1 mg/ml K-proteináz és 0,5% SDS], amely még 10 mikrogramm/ml poliadenilsavat is tartalmaz, és inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 60 percig. Ez után a K-proteináz emésztés után az így létrejövő plazmafrakciókat fehérjementesítjük TE-vel [10,0 mmol/1 trisz.HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA] telített fenollal végzett extrahálással. A fenolos fázist centrifugálással elkülönítjük, és újból extraháljuk 0,1% SDS-t is tartalmazó TENB-vel. Az egyes extrakciókból így kapott vizes fázisokat egyesítjük, és kétszer extraháljuk azonos térfogatú keverékkel, amely fenolt, kloroformot és izoamil-alkoholt tartalmaz (1:1, illetve 99:2 arányban), majd kétszer extraháljuk azonos térfogatú másik keverékkel, amely kloroformot és izoamil-alkoholt tartalmaz (99:1 térfogatarányban). A centrifugálással végzett fáziselkülönítést követően a vizes fázist végső koncentrációként 0,2 mólossá tesszük Na-acetátra, és a nukleinsavakat két térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A kicsapott nukleinsavakat SW 41 rotorban 38K-nál 60 percen át 4 °C hőmérsékleten végzett ultracentrifugálással kinyeijük.

A fentieken kívül a magas titerű csimpánzplazmát és az összegyűjtött kontrollplazmát egy másik eljárás szerint 5 mikrogramm poli-A hordozóval extraháljuk Chomczyzski és Sacchi (1987) eljárása szerint. Ez az eljárás savas guanidium-tiocianátos extrahálást alkalmaz. Az RNS-t 10000 fordulat/percnél, Eppendorf mikrocentrifugában 10 percig 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással nyeljük ki.

Két esetben a cDNS szintézise előtt a PCR-reakcióban a K-proteináz (SDS) fenolos eljárással plazmából extrahált nukleinsavakat tovább tisztítjuk „S és S” Elutip-R oszlopokhoz való kötéssel, és erről leoldással. Az eljárást a gyártók előírásait követve hajtjuk végre („S és S”: Schleicher & Schüll GmbH, Einbeut, Németország).

A PCR-reakcióban templátként alkalmazott cDNS-ek a fentebb leírtak szerint készített nukleinsavakból készülnek (vagy teljes nukleinsavak, vagy RNS-ek). Az etanolos kicsapást követően a kicsapott nukleinsavakat szárítjuk, és újból szuszpendáljuk DEPC-vel kezelt desztillált vízben. A nukleinsavakban lévő szekunder szerkezeteket 65 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett kezeléssel szétzúzzuk, és a mintákat jégen azonnal lehűtjük. CDNS-t szintetizálunk 1-3 mikrogramm, májból eredő teljes csimpánz RNS-t alkalmazva, vagy 10-100 mikroliter plazmából extrahált nukleinsavakból (vagy RNS-ből). A szintézis reverz transzkriptázt alkalmaz, és 25 mikroliter reakció-térfogatban megy végbe, a gyártó (BRL) által pontosított munkamenetet alkalmazva. A cDNS-szintézisben szolgáló primerek azok, amelyeket a fentebb leírt PCR-reakcióban is alkalmazunk. A cDNS-szintézishez alkalmazott összes reakciókeverék 23 egység RN-áz inhibitort tartalmaz [RNASIN (Fisher/Promega)]. A cDNS-szintézist követően a reakciókeverékeket vízzel hígítjuk, 10 percig forraljuk, és jégen gyorsan lehűtjük.

A PCR-reakciókat lényegében úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt a gyártók (Cetus, Perkin-Elmer) útmutatói leírják, azzal a különbséggel, hogy 1 mikrogramm RN-áz A-t adunk hozzá. A reakciót 100 mikroliter végső térfogatban hajtjuk végre. A PCR-t 35 ciklusban hajtjuk végre, 37 °C, 72 °C és 94 °C menetrendet alkalmazva.

A primerek a cDNS-szintézishez és a PCR-reakciókhoz vagy a 81., vagy a 36., vagy a 37b. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciákból származnak. (A 81., 36. és 37b. kiónok HCV cDNS-szekvenciáit a 4., 5., illetve 10. ábrán mutatjuk be). A 81. kiónból származó két 16-mer primer szekvenciája az alábbi:

5’-CAA TCA TAC CTG ACA G-3’ és

5’-GAT AAC CTC TGC CTG A-3’

A 36. klónból származó primer szekvenciája az alábbi:

5’-GCA TGT CAT GAT GTA T-3’

A 37b. kiónból származó primer szekvenciája az alábbi:

5’-ACA ATA CGT GTG TCA C-3’

A PCR-reakciókban a primer párok vagy a 81. klónból származó két 16-merből, vagy a 36. kiónból származó 16-merből és a 37b. klónból származó 16merből állnak.

A PCR-reakcíótermékeket a termékek alkálikus gélelektroforézissel végzett elkülönítésével elemezzük, ahol az elkülönítést Southern-foltképzés követi, majd az amplifikált HCV cDNS-szekvenciákat kimutatjuk HCV cDNS olyan területéből származó, ³²P jelzett belső oligonukleotidvizsgáló mintával, amely terület nem fedi át a prímért. A PCR-reakciókeverékeket fenol/kloroformmal extraháljuk, és a nukleinsavakat a vizes fázisból sóval és etanollal kicsapjuk. A kicsapott nukleinsavakat centrifugálással összegyűjtjük, és desztillált vízben feloldjuk. A minták alikvotjait elektroforézisnek vetjük alá 1,8%-os agarózgéleken. 60, 108 és 161 nukleotid hosszúságú egyszálú DNS-eket molekulatömeg-markerként együtt elektroforetizálunk a géleken. Elektroforézis után a gélen lévő DNS-eket átvisszük „Biorad Zeta Probe” papírra. Az előhibridizálást, hibridizálást és a mosási körülményeket a gyártó (Biorad) útmutatásai szerint alakíthatjuk ki.

Az amplifikált HCV cDNS-szekvenciák hibridizációs kimutatásához alkalmazott vizsgálóminták az alábbiak. Amikor a PCR-primerek párja a 81. klónból származik, a vizsgálóminta olyan szekvenciának megfelelő 108-mer, amely szekvencia a két primer szekvenciája közti területen helyezkedik el. Amikor a PCR-primerek párja a 36. és 37b. klónokból származik, a vizsgálóminta a 35. klónból származó, hézag(nick) transzlatált HCV cDNS-beiktatás. A primerek a 37b. klón beiktatás 155-170. nukleotidjaiból és a 36. klón beiktatás 206-268. nukleotidjaiból származnak. A 35. kiónban lévő HCV cDNS-beiktatás 3’-vége átfedi a 37b. kiónban lévő 207—269. nukleotidokat (vesd össze az 5., 8. és 10. ábrákat). így a 35. kiónban lévő cDNS-beiktatás átfogja a 36. és 37b. eredetű primerek szekvenciája közti terület egy részét, és alkalmas vizsgálómintaként azokhoz az amplifikált szekvenciákhoz, amelyek ezeket a primereket magukban foglalják.

A májmintákból származó RNS elemzését a fenti munkamenet szerint végezzük mind a primerek, mind a vizsgálóminták készletét alkalmazva. Az NANBH-ban szenvedő három csimpánz májából való RNS pozitív hibridizációs eredményeket mutat a várt méretű (161 és 586 nukleotid a 81,-nél, illetve 36. és 37b.-nél) amplifikált szekvenciákra, míg a kontrollcsimpánzok negatív hibridizációs eredményeket mutatnak. Ugyanezeket az eredményeket érjük el akkor is, amikor a kísérletet háromszor megismételjük.

A plazmából való nukleinsavak és RNS elemzéséhez szintén a fenti munkamenetet alkalmazzuk, a 81. klónból származó primereket és vizsgálómintát alkalmazva. A plazmák az alábbiak: két, NANBH-ban szenvedő csimpánzból való plazma, egy kontrollcsimpánzból való plazma, és kontrollcsimpánzból összegyűjtött plazma. Mindkét NANBH-plazma olyan nukleinsavakat/RNS-eket tartalmaz, amelyek pozitív eredményeket adnak a PCR-amplifíkációs vizsgálatban, míg mindkét kontrollplazma negatív eredményeket nyújt.

Radioimmunesszé HCV-antitestek kimutatására fertőzött egyénekből való szérumokban

Szilárd fázisú radioimmunesszét fejlesztünk ki HCV-antigének ellen antitestek kimutatására, Tsu és Herzenberg (1980) közleménye alapján. Mikrotitrálólemezeket (Immulon 2, Removawell csíkok) burkolunk be HCV-epitópokat tartalmazó tisztított polipeptidekkel. A burkolt lemezeket vagy humánszérummintákkal inkubáljuk, amelyekről feltételezhető, hogy HCV-epitópok elleni antitesteket tartalmaznak, vagy megfelelő kontrollokkal inkubáljuk. Az inkubálás során az antitest, ha van jelen, immunológiailag kötődik a szilárd fázisú antigénhez. A nem kötött anyag eltávolítása és a mikrotitrálólemezek mosása után humán antitest-NANBV-antigén komplexeket mutatunk ki ¹²⁵Ivel jelzett jun-anti-humán immunglobulinnal végzett inkubálással. A nem kötött jelzett antitestet leszívással eltávolítjuk, és a lemezeket mossuk. A radioaktivitást az egyes üregekben mérjük; a kötött humán anti-HCVantitest mennyisége arányos az üregben lévő radioaktivitással.

A SOD-NANB₅_;.i fúziós polipeptid tisztítása

A SOD-NANBj.j.! fúziós polipeptidet, amelyet rekombináns baktériumokban fejezünk ki, amint ezt az előbbiekben leírtuk, a rekombináns E. coliból a sejtextraktumok karbamiddal végzett differenciálextrakciójával tisztítjuk, amelyet anion- vagy kationcserélő oszlopon végzett kromatográfia követ az alábbiak szerint.

liter tenyészetből való fagyasztott sejteket újraszuszpendálunk 10 ml 20%-os (tömeg/térfogat) szacharózoldatban, amely 0,01 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0) tartalmaz, és 0,4 ml 0,5 mol/l-es EDTA-oldatot (pH 8,0) adunk hozzá. 5 perces állás után 0 °C hőmérsékleten a keveréket 4000xg-nél 10 percig centrifugáljuk. Az így létrejövő üledéket 10 ml 25%-os (tömeg/térfogat) szacharózban szuszpendáljuk, amely 0,05 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) és 1 mikrogramm/ml pepsztatin A-t is tartalmaz, majd 0,5 ml lizozimot (10 mg/ml) adunk hozzá, és 0 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáljuk. 10 ml 1% (térfogat/térfogat) Triton X-100 hozzáadása után, amely 0,05 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0) és 1 mmol/1

HU 216 017 Β

EDTA-t tartalmazó oldatban van, a keveréket további 10 percen át inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten, alkalmanként rázogatva. Az így létrejövő viszkózus oldatot homogenizáljuk olyan módon, hogy hatszor átnyomjuk steril, 20. kaliberű injekciós fecskendőn, és centrifugál- 5 juk 13 OOOxg-nél 25 percen át. Az üledékbe vitt anyagot 5 ml 0,01 mol/literes trisz.HCl-ben (pH 8,0) szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 4000xg-nél centrifugáljuk 10 percen át. Az üledéket, amely SOD-NANB₅_|_] fúziós fehéqét tartalmaz, feloldjuk 5 ml 6 mol/l-es karba- 10 midban, amely 0,02 mol/1 trisz.HCl-t (pH 8,0) és 1 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó oldatban („A” puffer) van, és ezt „A” pufferrel kiegyensúlyozott Q-Sepharose Fást Flow oszlopra tápláljuk. A polipeptideket „A” pufferben lévő 0,0-0,3 mol/1 NaCl lineáris gradienssel eluáljuk. Az eluálás után a frakciókat poliakrilamidgélelektroforézissel elemezzük SDS jelenlétében, hogy meghatározzuk SÓD-NANB₅._M-tartalmukat. Az ezt a polipeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és dializáljuk 0,02 mol/1 nátrium-foszfát-puffert (pH 6,0) és 1 mmol ditiotreitolt tartalmazó oldatban („B” puffer) lévő 6 mmol/1 karbamiddal szemben. A dializált mintát „B” pufferrel kiegyensúlyozott S-Sepharose Fást Flow oszlopra tápláljuk, és a polipeptideket „B” pufferben lévő 0,0-0,3 mol/1 NaCl lineáris gradiensével eluáljuk.

A frakciókat poliakrilamidgél-elektroforézissel elemezzük SOD-NANB5.].) jelenlétére, és a megfelelő frakciókat összegyűjtjük.

A SOD-NANB₅_[_i-polipeptid végső készítményét elektroforézissel megvizsgáljuk poliakrilamid gélen SDS jelenlétében. E szerint az elemzés szerint a készítmény tisztasága 80%-nál több.

A SÓD—NANB _s! fúziós polipeptid tisztítása

A SOD-NANB₈₁ fúziós polipeptidet, amelyet rekombináns baktériumokban fejezünk ki, amint ezt az előbbiekben leírtuk, a rekombináns E. coliból a sejtextraktumok karbamiddal végzett differenciálextrakciójával tisztítjuk, amelyet anion- vagy kationcserélő oszlopon végzett kromatográfia követ, azt a munkamenetet alkalmazva, amelyet a SOD-NANB₅-_W fúziós polipeptid izolálásánál leírtunk.

A SOD-NANB_8l-polipeptid végső készítményét elektroforézissel megvizsgáljuk poliakrilamid gélen SDS jelenlétében. E szerint az elemzés szerint a készítmény tisztasága 50%-nál több.

HCV-epitópok elleni antitestek kimutatása szilárd fázisú radioimmunesszével betegből, akikről azt diagnosztizálták, hogy NANBH-ban szenvednek, származó szérummintát elemzünk radioimmunesszével (RIA), hogy meghatározzuk, a SOD-NANB₅_i., és SOD-NANB₈₁ fúziós polipeptidekben jelen lévő HCV-epitópok elleni antitestek kimutathatók-e.

Mikrotitrálólemezeket burkolunk be olyan SOD-NANB₅._M-gyel vagy SOD-NANB₈₁-gyel, amelyet részlegesen megtisztítottunk az előző fejezetekben leírtak szerint. A vizsgálatokat az alábbiak szerint hajtjuk végre.

0,1-0,5 mikrogramm SOD-NNABj.^-et vagy SOD-NANB₈₁-et tartalmazó 100 mikroliteres alikvotokat, amelyek 0,125 mol/l-es Na-borát-puffert (pH 8,3) és 0,075 mol/1 NaCl-t tartalmazó oldatban (BBS) vannak, adunk egy mikrotitrálólemez (Dynatech Im15 mulon 2, Removawell csíkok) egyes üregeihez. A lemezt 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át nedves kamrában, amely után a fehérjeoldatot eltávolítjuk, és az üreget háromszor mossuk 0,02% Triton Χ-100-at tartalmazó BBS-sel (BBST). Abból a cél20 ból, hogy megelőzzük a nem fajlagos kötéseket, az üregeket szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) burkoljuk BBS-ben lévő BSA 5 mg/ml-es oldatából 100 pl hozzáadásával, amelyet 1 órás inkubálás követ szobahőmérsékleten; ez után az inkubálás után a 25 BSA-oldatot eltávolítjuk. A burkolt üregekben lévő polipeptideket reagáltatjuk szérummal olyan módon, hogy 1:100 arányban 0,01 mol/1 Na-foszfát-puffert (pH 7,2) és 0,15 mol/1 NaCl-t tartalmazó oldattal (PBS) - amely még 10 mg/ml BSA-t is tartalmaz 30 hígított szérummintából 100 mikrolitert adunk hozzá, és a szérumot tartalmazó üregeket 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Inkubálás után a szérummintákat leszívatással eltávolítjuk, és az üregeket ötször mossuk BBST-vel. A fúziós polipeptidekhez kö35 tött anti-NANB₅__M és anti-NANB₈₁-et a ^l25I-vel jelzett F’(ab)₂ juh-anti-humán IgG kötésével határozzuk meg a beburkolt üregekhez. A jelzett vizsgálóminta 100 mikroliteres alikvotjait (fajlagos aktivitás 5-20 mikrocurie/mikrogramm) hozzáadjuk az egyes 40 üregekhez, és a lemezeket 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, ezt követi a fölösleges vizsgálóminta eltávolítása leszívatással, és 5 mosás BBST-vel. Az egyes üregekben kötött radioaktivitás mennyiségét olyan számlálóban (counter) mérjük, amely gammasu45 gárzást mutat ki.

Az anti-NANB₅_|_| és anti-NANB_sl kimutatásának eredményeit NANBH-ban szenvedő egyénekben az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Anti-5-1-1. és anti-81. kimutatása NANB, HAV és HBV hepatitises betegek szérumaiban

Beteg-referenciaszám	Diagnózis	S/N Anti-5-1-1.	Anti-81.
1.28'	Krónikus NANB, ÍVD²	0,77	4,20
Krónikus NANB, ÍVD	1,14	5,14
Krónikus NANB, ÍVD	2,11	4,05

HU 0216 017 Β

1. táblázat (folytatás)

Bctcg-rcfcrcnciaszám	Diagnózis	S/N Anti-5-1-1.	Anti-81.
2.29'	AVH³, NANB, szórványos	1,09	1,05
Krónikus, NANB	33,09	11,39
Krónikus, NANB	36,22	13,67
3.30'	AVH, NANB, ÍVD	1,90	1,54
Krónikus NANB, ÍVD	34,17	30,28
Krónikus NANB, ÍVD	32,45	30,84
4.31'	Krónikus NANB, PT⁴	16,09	8,05
5.32'	Késői AVH NANB, ÍVD	0,69	0,94
Késői AVH NANB, ÍVD	0,73	0,68
6.33'	AVH, NANB, ÍVD	1,66	1,96
AVH, NANB, ÍVD	1,53	0,56
7.34'	Krónikus NANB, PT	34,40	7,55
Krónikus NANB, PT	45,55	13,11
Krónikus NANB, PT	41,58	13,45
Krónikus NANB, PT	44,20	15,48
8.35'	AVH, NANB, ÍVD	31,92	31,95
Most „gyógyult” NANB, AVH	6,87	4,45
9.36	Késői AVH NANB PT	11,84	5,79
10.37	AVH NANB, ÍVD	6,52	1,33
11.38	Késői AVN NANB, PT	39,44	39,18
12.39	Krónikus NANB, PT	42,22	37,54
13.40	AVH, NANB, PT	1,35	1,17
14.41	Krónikus NANB, PT	0,35	0,28
15.42	AVH, NANB, ÍVD	6,25	2,34
16.43	Krónikus NANB, PT	0,74	0,61
17.44	AVH, NANB, PT	5,40	1,83
18.45	Krónikus, NANB, PT	0,52	0,32
19.46	AVH, NANB	23,35	4,45
20.47	AVH, „A” típus	1,60	1,35
21.48	AVH, ,A” típus	1,30	0,66
22.49	AVH, ,A” típus	1,44	0,74
23.50	Jelenleg gyógyult AVH, ,A” típus	0,48	0,56
24.51	AVH, ,A” típus	0,68	0,64
Gyógyult AVH, „A” típus	0,80	0,65
25.52	Most gyógyult AVH, ,A” típus	1,38	1,04
Most gyógyult AVH, ,A” típus	0,80	0,65
26.53	AVH,, A” típus	1,85	1,16
Most gyógyult AVH, „A” típus	1,02	0,88
27.54	AVH, ,A” típus	1,35	0,74
28.55	Késői AVH, HBV	0,58	0,55

1. táblázat (folytatás)

Beteg-referenciaszám	Diagnózis	S/N Anti-5-1-1.	Anti-81.
29.56	Krónikus HBV	0,84	1,06
30.57	Késői AVH, HBV	3,20	1,60
31.58	Krónikus HBV	0,47	0,46
32.59'	AVH, HBV	0,73	0,60
Gyógyult AVH, HBV	0,43	0,44
33.60'	AVH, HBV	1,06	0,92
Gyógyult AVH, HBV	0,75	0,68
34.61'	AVH, HBV	1,66	0,61
Gyógyult AVH, HBV	0,63	0,36
35.62'	AVH, HBV	1,02	0,73
Gyógyult AVH, HBV	0,41	0,42
36.63'	AVH, HBV	1,24	1,31
Gyógyult AVH, HBV	1,55	0,45
37.64'	AVH, HBV	0,82	0,79
Gyógyult AVH, HBV	0,53	0,37
38.65'	AVH, HBV	0,95	0,92
Gyógyult AVH, HBV	0,70	0,50
39.66'	AVH, HBV	1,03	0,68
Gyógyult AVH, HBV	1,71	1,39

¹ Szérum-sorozatminták, amelyek ezekből a betegekből rendelkezésre állnak ² IVD=Intravénás gyógyszeralkalmazók ³ AVH=Akut vírushepatitis ⁴ PT=Transzfuzió után

Amint az 1. táblázatból látható, a 32 szérum közül, amelyek NANBH-ban szenvedő betegnek diagnosztizált betegekből származnak, 19 pozitív a SOD-NANBj.,.,ben és SOD-NANB₈₁-ben jelen lévő HCV-epitópok ellen irányuló antitestek szempontjából.

Azok a szérumminták azonban, amelyek pozitívak, immunológiailag nem egyformán reaktívak SOD-NANB₅₁_ _rgyel és SOD-NANB₈₁-gyel. Az 1. számú betegből való szérumminták pozitívak SOD-NANB₈₁-re, de SOD-NANB₅_|.i-re nem. A 10., 15. és 17. számú betegekből származó szérumminták pozitívak SOD-NANB₅.i.|-re, de SOD-NANB₈₁-re nem. A 3., 8.,

11. és 12. betegekből származó szérumminták egyformán reagálnak mindkét fúziós polipeptiddel, míg a 2., 4.,

7. és 9. betegekből származó szérumminták 2-3-szor erősebb reakciót mutatnak SOD-NANB₅-i_|-hcz, mint SOD-NANB₈₁-hez. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az ΝΑΝΒ₅.].ι és NANB₈₁ legalább 3 különböző epitópot tartalmaznak, azaz lehetséges, hogy az egyes polipeptidek legalább 1 egyedi epitópot tartalmaznak, és hogy a két polipeptid legalább 1 polipeptiden osztozik.

A szilárd fázisú RIA fajlagossága NANBH-ra

A szilárd fázisú RIA-vizsgálatok fajlagosságát NANBH-ra úgy vizsgáljuk, hogy a vizsgálatot elvégez- 60 zük HAV-val vagy HBV-vel fertőzött egyének szérumán, és kontrollegyének szérumán. A részlegesen tisztított SOD-NANBj.j.j-et és SOD-NANB₈₁-et alkalmazó 40 vizsgálatokat lényegében úgy hajtjuk végre, amint ezt egy korábbi fejezetben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a szérum olyan betegekből való, akikről előzőleg diagnosztizáltak, hogy HAV-ban vagy HBV-ben szenvednek vagy olyan egyénekből való, akik vérbankban vér45 adók. A HAV-val és HBV-vel fertőzött betegekből való szérumokhoz tartozó eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A RIA-vizsgálatot 11 HAV-val fertőzött betegszérummintát és 20 HBV-vel fertőzött betegszérummintát alkalmazva hajtjuk végre. Amint az 1. táblázatban 50 bemutatjuk, ezeknek a szérumoknak egyike sem alakít ki pozitív immunológiai reakciót a BB-NANBV-epitópokat tartalmazó fúziós polipeptidekkel.

Az NANB₅.|.|-antigént tartalmazó RIA-vizsgálatokat kontroliegyénekből való szérum immunológiai reak55 tivitásának meghatározására alkalmazzuk. A normális véradó-populációból kapott 230 szérummintából csak 2 adott pozitív eredményt a RIA-vizsgálatban (adatokat nem mutatunk be). Lehetséges, hogy az a két véradó, akikből ezek a szérumminták származnak, korábban ki volt téve HCV-nek.

HU 216 017 Β

AzNANB₅_i_j reaktivitása az NANBH-fertőzés során Az anti-NANB_SM-antitestek jelenlétét 2 beteg és csimpánz NANBH-fertőzésének menete során követjük RIA-vizsgálatot alkalmazva. Ezenkívül a RIA-vizsgálatot arra is alkalmazzuk, hogy meghatározzuk az antiNANB5.].! jelenlétét vagy hiányát a HAV- és HBV-fertőzés menete során fertőzött csimpánzokban.

Az eredmények, amelyeket a 2. táblázatban mutatunk be, azt mutatják, hogy csimpánzoknál és embereknél anti-NANBj.j.pantitesteket mutatunk ki az NANBH-fertőzés akut fázisának beindulását követően. 5 Nem mutatunk ki anti-NANB₅_i_|-antitesteket HAV-val vagy HBV-vel fertőzött csimpánzokból való szérummintákban. így ezek az anti-NANBj.j.i-antitestek szolgálnak markerként a HCV-vel fertőzött egyénekhez.

2. táblázat

Szérumkonverzió hepatitisbetegekből és csimpánzokból való egymás utáni szérummintákban, 5-1-1. antigént alkalmazva

Beteg/csimpánz	A minta dátuma (nap) (0=az inokulálás napja)	Hepatitisvírus	Anti-5-1-1. (S/N)	Alt (mu/ml)
29. beteg	-p*	NANB	1,09	1180
T+180		33,89	425
T+280		36,22	-
30. beteg	T	NANB	1,90	1830
T+307		34,17	290
T+799		32,45	276
1. csimpánz	0	NANB	0,87	9
76		0,93	71
118		23,67	19
154		32,41	-
2. csimpánz	0	NANB	1,00	5
21		1,08	52
73		4,64	13
138		25,01	-
3. csimpánz	0	NANB	1,08	8
43		1,44	205
53		1,82	14
159		11,87	6
4. csimpánz	-3	NANB	1,12	11
55		1,25	132
83		6,60	-
140		17,51	-
5. csimpánz	0	HAV	1,12	4
25		1,25	147
40		6,60	18
268		17,51	5
6. csimpánz	-8	HAV	0,85	-
15		-	106
41		0,81	10
129		1,33	-
7. csimpánz	0	HAV	1,17	7
22		1,60	83
115		1,55	5
139		1,60

2. táblázat (folytatás)

Bctcg/csimpánz	A minta dátuma (nap) (0=az inokulálás napja)	Hepatitisvírus	Anti-5-1-1. (S/N)	Alt (mu/ml)
8. csimpánz	0	HAV	0,77	15
26		1,98	130
74		1,77	8
205		1,27	5
9. csimpánz	-290	HBV	1,74	-
379		9,29	9
435		2,77	6
10. csimpánz	0	HBV	2,35	8
111-118 (gyűjtemény)		2,74	96-155 (gyűjtemény)
205		2,05	9
240		1,78	13
11. csimpánz	0	HBV	1,82	11
28-56 (gyűjtemény)		1,26	8-100 (gyűjtemény)
169		-	9
223		0,52	10

* =a kezdeti mintavétel napja

NANEf-j.i elleni poliklonális szérumantitestek tisztítása A SOD-NANB₅.[.[-polipeptid fajlagos immunoló- 30 giai reaktivitása alapján az NANBH-ban szenvedő betegekből való szérummintákban lévő antitestekkel eljárást fejlesztünk ki olyan szérum-antitestek tisztítására, amelyek immunológiailag reagálnak az NANB_s.,.|-ben lévő epitóppal vagy epitópokkal. Ez az eljárás affinitáskromatográfiát használ. Tisztított SOD-NANBj.]., polipeptidet oldhatatlan hordozóanyaghoz rögzítünk; a rögzítés olyan, hogy az immobilizált polipeptid megőrzi affinitását az NANB₅__m elleni antitesthez. A szérummintában lévő antitestek abszorbeálódnak a mátrixhoz kötött polipeptidhez. A mosás után, amelynek az a célja, hogy eltávolítsuk a nem fajlagosan kötött anyagokat és nem kötött anyagokat, a kötött antitesteket kiszabadítjuk a kötött SOD-HCV-polipeptidből a pH megváltoztatásával és/vagy kaotrop reagensekkel, például karbamiddal.

Kötött SOD-NANBj.i^-et tartalmazó membránokat készítünk az alábbiak szerint. Nitro-cellulóz-membránt (2,1 cm-es Sartorius, 0,2 mikron pórusmérettel) mosunk háromszor 3 percig BBS-sel. A SOD-NANB₅.|.| a membránhoz kötődik a tisztított készítmény inkubálá- 50 sával BBS-ben szobahőmérsékleten 2 órán át; egy másik eljárás szerint ezt 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A nem kötött antigént tartalmazó oldatot eltávolítjuk, és a szűrőt háromszor mossuk BBS-sel, mosásonként 3 percig. A membránon megmaradó aktív helyeket BSA-val blokkoljuk 5 mg/ml BSA-oldattal 30 percen át végzett inkubálással. A fölösleges BSA-t a membrán mosásával távolítjuk el, BBS-sel ötször és desztillált vízzel háromszor mosva. A vírusantigént és BSA-t tartalmazó membránt azután 0,05 mol/1 glicinhidrokloridot (pH 2,5) és 0,10 mol/1 NaCl-t tartalmazó oldattal (GlyHCl) 15 percig kezeljük, majd három percig mossuk PBS-sel.

Poliklonális anti-NANBj.,.[-antitesteket izolálunk olyan módon, hogy a fúziós polipeptidet tartalmazó membránokat inkubáljuk NANB-vel fertőzött egyének35 bői származó szérummal 2 órán át. Az inkubálás után a szűrőket mossuk ötször BBS-sel és kétszer desztillált vízzel. A kötött antitesteket azután az egyes szűrőkről eluáljuk ötször GlyHCl-lel, elucióként 3-3 percig. Az eluátumok pH-ját 8-ra állítjuk be, az egyes eluátumokat 40 2,0 mol/l-es trisz.HCl-t (pH 8,0) tartalmazó kémcsőben gyűjtve. Az anti-NANB₅_[.,-antitest kinyerése affinitáskromatográfia után mintegy 50%.

A kötött vírusantigént tartalmazó nitro-cellulózmembránokat többször felhasználhatjuk észrevehető 45 csökkenés nélkül a kötési kapacitásban. Abból a célból, hogy a membránt újból alkalmazzuk, miután az antitesteket eluáltuk, a membránokat háromszor három percig mossuk BBS-sel. Ezeket azután BBS-ben tároljuk 4 °C hőmérsékleten.

HCV-részecskék befogása fertőzött plazmából, tisztított humán poliklonális anti-HCV-antitesteket alkalmazva; a befogott részecskékben lévő nukleinsavak hibridizálása HCV cDNS-hez

A HCV-részecskék befogása fertőzött plazmából, 55 humán poliklonális anti-HCV-antitesteket alkalmazva

Egy NANBH-ban szenvedő csimpánz fertőzött plazmájában jelen lévő fehéije-nukleinsav komplexeket izolálunk, olyan tisztított humán poliklonális anti-HCV-antitesteket alkalmazva, amelyek polisztirolgyöngyökhöz 60 vannak kötve.

HU 216 017 Β

Poliklonális anti-NANB₅_]_[-antitesteket tisztítunk egy NANBH-ban szenvedő ember szérumából, az 5-1-1. kiónban kódolt SOD-HCV-polipeptidet alkalmazva. A tisztítási eljárást a korábbiakban leírtuk.

A tisztított anti-NANBj.,.!-antitesteket polisztirolgyöngyökhöz ['/₄” (-0,64 cm) átmérő, tükörfényes felület, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois] kötjük szobahőmérsékleten inkubálva egy éjszakán át 1 ml antitesttel [1 mikrogramm/ml boráttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatban (pH 8,5)]. Az egy éjszakán át végzett inkubálást követően a gyöngyöket mossuk egyszer TBST-vel [50 mmol/1 trisz.HCl (pH 8,0), 150 mmol/1 NaCl, 0,05% (térfogat/térfogat) Tween 20], majd olyan, foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS), amely 10 mg/ml BSA-t is tartalmaz.

Kontrollgyöngyöket készítünk azonos módon, azzal a kivétellel, hogy a tisztított anti-NANB₅.|.[-antitesteket teljes humán immunglobulinnal helyettesítjük.

A HCV befogását NANBH-val fertőzött csimpánzplazmából a gyöngyökhöz kötött anti-NANB₅.₁.₁-et alkalmazva a következőképpen hajtjuk végre. Egy NANBH-val fertőzött csimpánzból való plazmát alkalmazunk, amelyet az előzőekben már leírtunk. Az NANBV-vel fertőzött csimpánzplazma egy alikvotját (1 ml) inkubáljuk 3 órán át 37 °C hőmérsékleten 55 gyönggyel, amelyek vagy anti-NANBj.^-antitestekkel, vagy kontroli-immunglobulinokkal vannak bevonva. A gyöngyöket háromszor mossuk TBST-vel.

Nukleinsavak hibridizálása a befogott részecskékben NANBV-cDNS-hez

Az anti-NANBj.ij-gyel befogott részecskékből kibocsátott nukleinsavkomponenseket a 81. kiónból származó HCV cDNS-hez hibridizáljuk.

HCV-részecskéket fogunk be NANBH-val fertőzött csimpánzplazmából, amint ezt az előzőekben leírtuk. Abból a célból, hogy a részecskékből a nukleinsavakat kiszabadítsuk, a mosott gyöngyöket 60 percig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 0,2 ml/gyöngy oldattal, amely 1 mg/ml K-proteinázt, 10 mmol/1 trisz.HCl-t (pH 7,5), 10 mmol/1 EDTA-t, 0,25% (tömeg/térfogat) SDS-t, 10 mikrogramm/ml oldható élesztő RNS-t tartalmaz, és a felülúszó oldatot eltávolítjuk. A felülúszót fenollal és kloroformmal extraháljuk, és a nukleinsavakat etanollal kicsapjuk egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten. A nukleinsavcsapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk, és feloldjuk 50 mmol/1 Hepes-ben (pH 7,5). Az oldható nukleinsavak párhuzamos alikvotjait az anti-NANB₅_|_!-antitestekkel burkolt gyöngyökből kapott mintákból és a teljes humán immunglobulint tartalmazó kontrollgyöngyökből kapott mintákból nitro-cellulózszűrőkre szüljük. A szűrőket ³²P-vel jelzett, hézag(nick) transzlatált, a 81. kiónban lévő tisztított HCV cDNS-fragmentumból készített vizsgálómintával hibridizáljuk. Az eljárást a vizsgálóminta előállítására és a hibridizálásra az előzőekben leírtuk.

Egy vizsgálómintával vizsgált, az anti-NANB₅.|.|-antitesteket tartalmazó gyöngyökkel befogott részecskékből származó nukleinsavakat tartalmazó szűrő autoradiogramját a 40. ábrán mutatjuk be. Az anti-NANB₅.[_[-antitestek (A,, A₂) alkalmazásával kapott kivonat tiszta hibridizálój eleket ad a kontroll-antitestkivonathoz (A₃, A₄) és a kontroll élesztő RNS-hez (B_b B₂) viszonyítva. 1 pg, 5 pg és 10 pg tisztított 81. klón cDNS-fragmentumot tartalmazó standardokat is mutatunk be a C1 -3-ban.

Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy az NANBH-plazmából anti-NANB₅.i_₁-antitestekkel befogott részecskék olyan nukleinsavakat tartalmaznak, amelyek hibridizálnak a 81. kiónban lévő HCV cDNS-sel, és így további bizonyítékot mutatnak arra nézve, hogy az ezekben a kiónokban lévő cDNS-ek az NANBH-hoz tartozó etiológiai ágensből származnak.

C100—3 immunológiai reaktivitása tisztított antiNANB ^-antitestekkel

A C100-3 fúziós polipeptid immunológiai reaktivitását anti-NANB₅.,.[-antitestekkel radioimmunesszével határozzuk meg, amelyben az antigéneket, amelyek szilárd fázishoz vannak kötve, tisztított anti-NANB₅.[.[gyel hozzuk össze, és az antigén-antitest komplexet ^l25Ivel jelzett juh-anti-humán antitestekkel mutatjuk ki. A Cl00-3 polipeptid immunológiai reaktivitását összehasonlítjuk a SOD-NANB₅_[.[-antigén reaktivitásával.

A Cl00-3 fúziós polipeptidet úgy szintetizáljuk és tisztítjuk, amint ezt az előzőekben leírtuk. A SOD-NANB₅.[.[ fúziós polipeptidet úgy szintetizáljuk és tisztítjuk, amint ezt az előzőekben leírtuk. A tisztított anti-NANB₅.[.[-antitesteket úgy kapjuk meg, amint ezt az előbbiekben leírtuk.

Különböző mennyiségű tisztított antigén 0,125 mol/1 Na-borát-puffert (pH 8,3) és 0,075 mol/1 NaCl-t tartalmazó oldatban (BBS) lévő 100 mikroliteres alikvotjait adjuk egy mikrotitrálólemez (Dynatech Immulon 2, Removawell csíkok) egyes üregeibe. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk nedves kamrában, amely után a fehéijeoldatot eltávolítjuk, és az üregeket háromszor mossuk 0,02% Triton Χ-100-at tartalmazó BBS-sel (BBST). Abból a célból, hogy megakadályozzuk a nem fajlagos kötést, az üregeket BSA-val burkoljuk BSA 5 mg/ml-es, BBS-ben lévő 100 mikroliteres oldatának hozzáadásával, amelyet inkubálás követ szobahőmérsékleten 1 órán át, amely után a BSA-oldat fölöslegét eltávolítjuk. A burkolt üregekben lévő polipeptideket tisztított anti-NANB₅.[.,-antitestekkel reagáltatjuk 1 mikrogramm antitest/üreg hozzáadásával, és a minták 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálásával. Inkubálás után a fölösleges oldatot leszívással eltávolítjuk, és az üregeket ötször mossuk BBST-vel. A fúziós polipeptidekhez kötött anti-NANB₅.].[-et a ¹²⁵I-vel jelzett F’(ab)₂juh-anti-humán IgG kötésével határozzuk meg a burkolt üregekhez. A jelzett vizsgálóminta (fajlagos aktivitás: 5-20 mikrocurie/mikrogramm) 100 mikroliteres alikvotjait adjuk az egyes üregekhez, és a lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át, ezt követi a fölösleges vizsgálóminta eltávolítása leszívással és 5 mosás BBST-vel. Az egyes üregekben kötött radioaktivitás mennyiségét olyan számlálóban (counter) számláljuk, amely gammasugárzást mutat ki.

A C100 immunológiai reaktivitásának eredményeit, tisztított anti-NANB₅.|.|-gyel összehasonlítva az NANB₅_[_i reaktivitásával, a tisztított antitestekkel, a 3. táblázatban mutatjuk be.

HU 216 017 Β

3. táblázat

C100-3 immunológiai reaktivitása összehasonlítva NANB₅_[.[-reaktivitással, immunesszével mérve

AG (ng)	RIA (cpm/esszé)
400	320	240	160	60	0
NANBs.,.,	7332	6732	4954	4050	3051	57
000-3	7450	6985	5920	5593	4096	67

A 3. táblázat eredményei azt mutatják, hogy az antiNANB₅.[.[ felismer egy epitópot a C100-3 polipeptid C100 részében. így az NANB₅_[_[ és a C100 osztozik közös epitópon vagy epitópokon. Az eredmények azt sugallják, hogy az ezt az NANBV-epitópot vagy epitó- 15 pokat kódoló cDNS-szekvencia olyan, amely jelen van mind az 5-1-1., mind a 81. kiónban.

A HCVjellemzése

A HCV-genom elágazottságánakjellemzése

A HCV-genomot elágazottságát illetően úgy jelle- 20 mezzük, hogy izoláljuk az anti-NANBj.,.[-antitesttel burkolt polisztirolgyöngyökön befogott részecskékből a nukleinsavfrakciót, és meghatározzuk, vajon az izolált nukleinsav a HCV cDNS plusz és/vagy mínusz szálával hibridizál. 25

A részecskéket HCV-vei fertőzött csimpánzplazmából fogjuk be immun-tisztított anti-NANB₅.j.[-antitesttel burkolt polisztirolgyöngyöket alkalmazva. A részecskék nukleinsavkomponensét kiszabadítjuk, és 3 ml nagy titerű plazmával ekvivalens izolált genom nukleinsav 30 alikvotokat viszünk fel foltként nitro-cellulóz-szűrőkre. Kontrollként 81. klónból (2 pikogramm) származó denaturált HCV cDNS alikvotjait is fel visszük ugyanazokra a szűrőkre. A szűrőket HCV cDNS-ből klónozott egyszálú DNS plusz vagy mínusz szálainak ³²P-vel jelzett ke- 35 verékével vizsgáljuk át; a cDNS-eket a 40b., 81. és 25c. klónokból metsszük ki.

Az egyszálú vizsgálómintákat a HCV cDNS-ek EcoRI-gyel végzett kimetszésével kapjuk meg a 91.,

40b. és 25c. klónokból, majd a cDNS-fragmentumok 40 M13 vektorokba, pontosabban mpl8 és mpl9 vektorokba [Messing (1983)] való klónozásával. Az M13 kiónokat szekvenciaelemzésnek vetjük alá, hogy meghatározzuk, vajon ez a HCV cDNS-ekből származó DNS plusz vagy mínusz szálát tartalmazza. A szekvencia- 45 elemzést Sanger és munkatársai didezoxi-láncterminációs eljárásával (1977) végezzük.

A befogott részecskékből izolált HCV-genom alikvotjait tartalmazó párhuzamos szűrők egyes készleteit a HCV cDNS-ekből származó plusz vagy mínusz szálú 50 vizsgálómintákkal hibridizáljuk. A 41. ábra mutatja be a NANBV genomnak a 81., 40b. és 25c. klónokból származó vizsgálóminták keverékével végzett átvizsgálásával kapott autoradiogramokat. Ezt a keveréket használjuk arra a célra, hogy növeljük a hibridizációs vizsgálat 55 érzékenységét. Az I. panelban lévő mintákat a pluszszálvizsgálóminta keverékével hibridizáljuk. A II. panelban lévő mintákat a mínuszszál-vizsgálóminta keverékével hibridizáljuk. A minták összeállítását az immunfoltvizsgálat paneljeiben a 4. táblázatban mutatjuk be. 60

4. tablazat

sor	A	B
1	HCV-genom	*
2	-	*
3	*	81. cDNS
4	*	81. cDNS

* le nem írt minta

Amint a 41. ábra eredményeiből látható, csak a mínusz szál DNS-vizsgálóminta hibridizál az izolált HCV-genommal. Ez az eredmény, azzal az eredménnyel együtt, amely azt mutatja, hogy a genom érzékeny RN-ázra, de nem érzékeny DN-ázra, azt sugallja, hogy az NANBV genomja pozitív szálú RNS.

Ezek az adatok és más laboratóriumok adatai a feltételezett NANBV-k fizikokémiai tulajdonságait illetően egybevágnak azzal a lehetőséggel, hogy a HCV a Flavivirodae tagja. Az a lehetőség sincs azonban kizárva, hogy a HCV a víruságensek új családját képviseli.

Szekvenciák kimutatása befogott részecskékben, amelyek PCR-rel amplifikálva a 81. klánból származó HCV cDNS-hez hibridizálnak

A befogott részecskékben lévő RNS-t úgy kapjuk meg, amint ezt az előzőekben leírtuk. Azokhoz a szekvenciákhoz, amelyek a 81. klónból származó HCV cDNS-hez hibridizálnak, az elemzést a PCR-amplifikációs eljárást alkalmazva hajtjuk végre, amint ezt a korábbiakban leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a hibridizációs vizsgálóminta a 81. klón cDNS-szekvenciából származó, kinázzal kezelt oligonukleotid. Az eredmények azt mutatják, hogy az amplifíkált szekvenciák hibridizálnak a 81. klón eredetű HCV cDNS-vizsgálómintával.

Homológia a Dengue Flavivírus (MNWWVD1) nem szerkezeti fehérjéje és a 14i.-39c. klánok egyesített ORF-je által kódolt HCV-polipeptidek között

A 14i.-39c. kiónok kombinált HCV cDNS-ei egy folyamatos ORF-et tartalmaznak, amint ezt a 26. ábrán bemutatjuk. Az ebben kódolt polipeptidet szekvenciahomológiára elemezzük a Dengue Flavivírusban (MNWWVD1) lévő nem szerkezeti polipeptid vagy polipeptidek területével. Az elemzés a Daghoff-fehéije adatbázisokat alkalmazza, és számítógéppel végezzük. Ezeket az eredményeket a 42. ábrán mutatjuk be, ahol a (:) jel pontos homológiát jelent, és a (.) jel konzervatív helyettesítést jelez a szekvenciákban; a szaggatott vonalak a szekvenciába beiktatott térközöket jelzik, hogy a legnagyobb homológiát érjük el. Amint az ábrából látha42 tó, jelentős homológia van a HCV cDNS-ben kódolt szekvencia és a Dengue-vírus nem szerkezeti polipeptidje vagy polipeptidjei között. A 42. ábrán bemutatott homológián kívül a cDNS 3’-vége felé lévő területben kódolt polipeptidszegmens elemzése szintén mutat olyan szekvenciákat, amelyek homológok a Dengue-polimerázban lévő szekvenciákhoz. Ennek következménye az a felfedezés, hogy a hiteles Gly-Asp-Asp (GDD) szekvencia, amelyről úgy gondoljuk, hogy nélkülözhetetlen az RNS-fuggő RNS-polimerázokban, megtalálható a HCV cDNS-ben kódolt polipeptidben, olyan elhelyezkedésben, amely egybevág a Dengue 2 vírusban lévő elhelyezkedéssel (adatokat nem mutatunk be).

A HCV-DNS nem mutatható ki az NANBH-val fertőzött szövetekben

Kétféle tanulmány nyújt olyan eredményeket, amelyek azt sugallják, hogy HCV-DNS nem mutatható ki NANBH-ban szenvedő egyének szöveteiben. Ezek az eredmények azokkal az eredményekkel együtt, amelyeket a megfelelő korábbi fejezetekben leírtunk, annak bizonyítékát adják, hogy a HCV nem DNS-tartalmú vírus, és ennek replikálódása nem foglal magában cDNS-t.

Southern-foltképzési munkamenet

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon az NANBH-val fertőzött csimpánzmáj tartalmaz-e HCV-DNS-t (vagy HCV cDNS-t), az ebből a forrásból izolált DNS restrikciós enzimes fragmentumait Southem-foltképzésnek vetjük alá, és a foltokat ³²P-vel jelzett HCV cDNS-sel vizsgáljuk át. Az eredmények azt mutatják, hogy a jelzett HCV cDNS nem hibridizál a fertőzött csimpánzmájból való, foltra vitt DNS-sel. Ezzel ellentétben egy pozitív kontroliban a béta-interferon jelzett vizsgálómintája erősen hibridizál restrikciós enzimmel emésztett humán méhlepény eredetű DNS Southem-foltjaihoz. Ezeket a rendszereket arra tervezzük, hogy kimutassuk annak a génnek egyedi másolatát, amely a jelzett vizsgálómintával kimutatandó.

DNS-t izolálunk két, NANBH-ban szenvedő csimpánz májából. Kontroll DNS-eket izolálunk nem fertőzött csimpánz májából és humán méhlepényből. Ez az eljárás DNS kivonásához lényegében azonos azzal, amelyet Maniatis és munkatársai leírtak (1982), és a DNS-mintákat RN-ázzal kezeljük az izolálási munkamenet során.

Az egyes DNS-mintákat vagy EcoRI-gyel, Mbolgyel vagy HincII-vel (12 mikrogramm) kezeljük, a gyártók útmutatásai szerint. Az emésztett DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 1%-os semleges agarózgéleken, Southem-foltokat képezünk nitrocellulózon, és a foltra vitt anyagot hibridizáljuk a megfelelő hézag- (nick) transzlatált vizsgálóminta cDNS-sel (3 -10⁶ cpm/ml hibridizációs keverék). A fertőzött csimpánzmájból és normál májból való DNS hibridizál a 36. és 81. klónokból való, ³²P-vel jelzett HCV cDNS-sel; a humán méhlepényből származó DNS hibridizál a béta-interferon-génből való, ³²P-vel jelzett DNS-sel. A hibridizálás után a foltokat szigorú körülmények között mossuk, azaz olyan oldattal, amely 0,lxSSC-t és 0,1% SDS-t tartalmaz, 65 °C hőmérsékleten.

A béta-interferon-gén DNS-t úgy állítjuk elő, amint ezt Houghton és munkatársai leírják (1981).

Amplifikáció a PCR-technikával

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon a HCV-DNS kimutatható-e NANBH-ban szenvedő csimpánzok májában, a szövetekből DNS-t izolálunk, és a PCR-amplifikációs kimutatási technikának vetjük alá a 81. klónból való HCV cDNS-ből származó primereket és vizsgáló polinukleotidmintákat alkalmazva. A negatív kontrollok nem fertőzött HepG2 szövettenyészet-sejtekből és valószínűleg nem fertőzött humán méhlepényből izolált DNS-minták. A pozitív kontrollok negatív kontroll DNS-ek olyan mintái, amelyekhez a 81. kiónból való HCV cDNS-beiktatás ismert, viszonylag kis menynyiségét adjuk hozzá.

Ezenkívül abból a célból, hogy igazoljuk: az azonos, NANBH-ban szenvedő csimpánzok májából izolált RNS-frakciók tartalmaznak a HCV-cDNS vizsgálómintával komplementer szekvenciákat, a PCR-amplifikációs kimutatási rendszert alkalmazzuk az izolált RNS-mintákra is.

Ezekben a tanulmányokban a DNS-t azzal a munkamenettel izoláljuk, amelyet a korábbiakban leírtunk, és az RNS-t lényegében úgy extraháljuk, amint ezt Chirgwín és munkatársai (1981) leírtak.

A DNS mintáit két fertőzött csimpánz májából, nem fertőzött HepG2 sejtekből és humán méhlepényből izoláljuk. 1-1 mikrogrammot emésztünk az egyes DNS-ekből HindlII-mai a gyártó útmutatója szerint. Az emésztett mintákat PCR-amplifikációnak vetjük alá, és az amplifikált HCV cDNS-t lényegében úgy mutatjuk ki, amint ezt az előzőekben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a reverz transzkriptázos lépést elhagyjuk. A PCR-vizsgálóminták és primerek a 81. klón HCV cDNS-ből valók, ezeket a IV.C.3. fejezetben íijuk le. A kibővítés előtt a pozitív kontrollokat, az egyes DNS-ek 1 mikrogrammos mintáit „kihegyezzük”, a 81. klónból izolált HCV cDNS-beiktatás 250 molekulájának hozzáadásával.

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon vannak-e jelen HCV-szekvenciák az NANBH-ban szenvedő csimpánzok májából izolált RNS-ben, 0,4 mikrogramm teljes RNS-t tartalmazó mintákat amplifíkációs munkamenetnek vetjük alá lényegében úgy, ahogyan ezt a korábbiakban leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a fordított transzkriptázt elhagyjuk néhány negatív kontrollként szolgáló mintából. A PCR-primerek és vizsgálóminták azok, amelyek a 81. klón HCV cDNS-ből valók, amint ezt korábban leírtuk.

Az eredmények azt mutatják, hogy a HCV cDNS vizsgálómintákkal komplementer amplifikált szekvenciák nem mutathatók ki a fertőzött csimpánzmájból való DNS-ekben, és nem mutathatók ki a negatív kontrollokban sem. Ezzel ellentétben, amikor azokat a mintákat, amelyek magukban foglalják a fertőzött csimpánzmájból való DNS-t, a sokszorozás előtt a HCV cDNS-sel „rögzítjük”, a 81. klón szekvenciákat az összes pozitívkontroll-mintában kimutatjuk. Ezenkívül az RNS-tanulmányokban az amplifikált 81. klón HCV cDNS-szekvenciákat csak akkor mutatjuk ki, amikor reverz transzkriptázt alkalmazunk, erősen sugallva, hogy az eredmények nem valamilyen DNS-szennyeződés következményei.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az NANBHban szenvedő csimpánzokból való hepatociták nem tartalmaznak HCV DNS-t, vagy csak ki nem mutatható szinten tartalmaznak. A „rögzítési” tanulmány alapján, ha HCV DNS egyáltalán van jelen, ez sokkal alacsonyabb szinten van, mint 0,06 kópia/hepatocita. Ezzel elleniében HCV-szekvenciák az ugyanabból a májmintából való teljes RNS-ben könnyen kimutathatók a PCRtechnikával.

ELISA-meghatározás HCV-fertőzésre, vizsgálóantigénként HCV Cl 00—3-at alkalmazva

Az összes mintát a HCV C100-3 ELISA-t alkalmazva vizsgáljuk meg. Ez a vizsgálat a HCV C100-3 antigént (amelyet úgy szintetizálunk és tisztítunk, amint ezt az előzőekben leírtuk), és az egér monoklonális anti-humán IgG torma-peroxidáz (HRP) konjugátumát alkalmazza (gyártó: Ortho Co., Raritan, N. Y. AEÁ).

A HCV Cl00-3 antigénnel burkolt lemezeket az alábbiak szerint állítjuk elő. Burkolópuffert [50 mmol/1 nátrium-borát (pH 9,0), 21 ml/lemez, BSA-t (25 mikrogramm/ml) és C100-3-at (2,50 mikrogramm/ml)] tartalmazó oldatot készítünk közvetlenül a Removawell Immulon I lemezekhez (Dynatech Corp.) való hozzáadás előtt. 5 perces keverés után 0,2 ml/üreg oldatot adunk a lemezekhez, lefedjük, és 2 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, amely után az oldatot leszívással eltávolítjuk. Az üregeket egyszer mossuk 400 mikroliter mosópufferrel [100 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 7,4), 140 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1% (tömeg/térfogat) kazein, 1% (tömeg/térfogat) Triton X-100, 0,01% (tömeg/térfogat) timerozál]. A mosóoldat eltávolítása után 200 mikroliter/üreg „burkolás utáni” oldatot [10 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 7,2), 150 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1% (tömeg/térfogat) kazein és 2 mmol/1 fenil-metilszulfonil-fluorid (PMSF)] adunk hozzá, a lemezeket szorosan lezárjuk, hogy az elpárolgást megakadályozzuk, és szobahőmérsékleten állni hagyjuk 30 percig. Az üregeket azután leszívjuk, hogy az oldatot eltávolítsuk, és szárazra liofílezzük egy éjszakán át anélkül, hogy az közben felmelegedne. Az így készített lemezeket 2-8 °C hőmérsékleten leforrasztott alumíniumdobozban tárolhatjuk.

Abból a célból, hogy az ELISA-meghatározást végrehajtsuk, 20 mikroliter szérummintát vagy kontrollmintát adunk egy olyan üreghez, amely 200 mikroliter mintahígítót [100 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 7,4), 500 mmol/1 nátrium-klorid, 1 mmol/1 EDTA, 0,1% (tömeg/térfogat) kazein, 0,015% (tömeg/térfogat) timerozál, 1% (tömeg/térfogat) Triton X-100,100 mikrogramm/ml élesztőkivonat] tartalmaz. A lemezeket leforrasztjuk, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, ezután az oldatot leszívással eltávolítjuk, és az üregeket 400 mikroliter mosópuferrel [foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat (PBS), amely 0,05% Tween 20-at tartalmaz] mossuk. A mosott üregeket 200 mikroliter egér-antihumán IgG-HRP konjugátummal kezeljük, amely „Ortho” konjugátum hígítóban van [10 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 7,2), 150 mmol/1 nátrium-klorid, 50% (térfogat/térfogat) boíjúembrió-szérum, 1% (térfogat/térfogat) hővel kezelt lószérum, 1 mmol/1 K₃Fe(CN)₆,0,05% (tömeg/térfogat) Tween 20, 0,02% (tömeg/térfogat) timerozál], A kezelést 1 órán át végezzük 37 °C hőmérsékleten, az oldatot leszívással eltávolítjuk, az üregeket mosópufferrel mossuk, amelyet szintén leszívással távolítunk el. Abból a célból, hogy meghatározzuk a kötött enzimkonjugátum mennyiségét, 200 mikroliter szubsztrátumoldatot (10 mg o-fenilén-diamin-dihidroklorid, 5 ml kifejlesztőoldatban) adunk hozzá. A kifejlesztőoldat 50 mmol/1 nátrium-citrátot (pH 5,1-re beállítva foszforsavval) és 0,6 mikroliter/ml 30%-os H₂O₂-t tartalmaz. A szubsztrátumoldatot tartalmazó lemezeket sötétben inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten, a reakciót 50 mikroliter/ml 4 n kénsav hozzáadásával leállítjuk, és az optikai sűrűségeket méijük.

A későbbiekben bemutatott példák azt mutatják, hogy az ELISA-átvizsgálásra szolgáló mikrotitrálólemezek, amelyek a HCV Cl00-3 antigént alkalmazzák, nagyfokú fajlagossággal bírnak, amint ezt a reaktivitás mintegy 1%-os kiindulási sebessége bizonyítja, míg a véletlenszerűen kiválasztott donoroknál ez a sebesség ismételten is csak 0,5%. Ez a vizsgálat képes immunválasz felismerésére mind a fertőzés akut fázisa után, mind a betegség krónikus fázisa során. Ezenkívül a vizsgálat képes kimutatni néhány mintát, amelyek az NANBH-ra vonatkozó más, kiegészítő vizsgálatokban pontszám szerint negatívak; ezek a minták vagy olyan egyénekből származnak, akik kórelőzményében NANBH szerepelhetett, vagy olyan donorokból, akik valamilyen módon NANBH-átvitelben érintettek.

A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk:

ALT	alanin-aminotranszferáz
Anti-HBc	antitest HBc ellen
Anti-HBsAg	antitest HBsAg ellen
HBc	hepatitis B belső antigén
ABsAg	hepatitis B felületi antigén
IgG	immunglobulin G
IgM	immunglobulin M
NE/1	nemzetközi egység/liter
NA	nem áll rendelkezésre
NT	nem vizsgáltuk
N	mintaméret
Neg	negatív
OD	optikai sűrűség
Pos	pozitív
S/CO	szignál/határérték
SD	standard eltérés
X	átlag
WNL	normális határokon belül

HCV-fertözés véletlenszerű véradók populációjában

1056 mintából (friss szérumok) álló csoportot, amely véletlenszerűen kiválasztott véradóktól származik, kapunk az Irwin Memóriái Blood Banktól (San Francisco, Kalifornia). Az ezekből a mintákból kapott vizsgálati eredményeket hisztogramban összegezzük, amely bemutatja az OD-értékek eloszlását (43. ábra). Amint a 43. ábrából látható, 4 mintaleolvasás >3 értéket mutat, 1 mintaleolvaás 1 és 3 értékek között van, 5 mintaleolvasás 0,4 és 1 értékek között van, stb. 1046 mintaleolvasás <0,4 értéket mutat, amelyen belül ezek több, mint 90%-a <0,1 leolvasást mutat.

HU 216 017 Β mazva. Az 5. táblázat bemutatja az ALT és anti-HBdstátust is az egyes ismételten reaktív mintáknál. Különösen érdekes az a tény, hogy mind az öt ismételten reaktív minta negatív mindkét, NANBH-ra vonatkozó kiegészítő vizsgálat szerint, míg a HCV ELISA-vizsgálatban pontszám szerint pozitív.

A reaktív véletlenszerű minták eredményeit az 5. táblázat mutatja be. Az átlag+5 standarddeviáció-értékkel egyenértékű határértéket alkalmazva az 1056 mintából 10 (0,95%) az, amely kezdetben reaktív. Ezek közül 5 minta (0,47) mutatkozik ismétléskor reaktívnak, amikor ezeket másodszor is megvizsgáljuk ELISA-t alkal5. táblázat

Reaktív véletlenszerű minták eredménye N=1015 x=0,049*

SD= ±0,074

Határérték: X+5SD=0,419 (0,400+negatív kontroll)

Minták	Kezdetben reaktív minták, OD	Ismételten reaktív minták, OD	ALT** (NE/L)	Anti-HBc*** (OD)
4227	0,462	0,084	NA	NA
6292	0,569	0,294	NA	NA
6188	0,699	0,326	NA	NA
6157	0,735	0,187	NA	NA
6277	0,883	0,152	NA	NA
6397	1,567	1,392	30,14	1,433
6019	>3,000	>3,000	46,48	1,057
6651	>3,000	>3,000	48,53	1,343
6669	>3,000	>3,000	60,53	1,165
4003	>3,000	3,000	WNL****	negatív
	10/1056=0,95%	5/1056=0,47%

* Azokat a mintákat, amelyek leolvasása > 1,5 értéket képvisel, nem számítjuk be az átlagba és az SD-be ** ALT >68 NE/L a normális határok felett van *** Anti-HBc <0,535 (versengő vizsgálat) értéket tekintjük pozitívnak **** WNL: a normális határokon belül

Csimpánzszérumminták csimpánzból szérummintákat vizsgálunk át a HCV Cl00-3 ELISA-val. Ezek közül a csimpánzok közül 4 NANBH-val van fertőzve a Vffl. faktor szennyezett tételével (valószínűleg Hutchinson-törzs). Kontrollként négy másik csimpánzot megfertőzünk HAV-val, és három másikat HBV-vel. A fertőzés után különböző időpontokban szérummintákat veszünk.

Az eredmények, amelyeket a 6. táblázatban foglalunk össze, kimutatható antitest-szerokonverzióra utalnak mindegyik csimpánzban, amely az NANBH Hutchinsontörzsével van fertőzve. A fertőzés akut fázisát követően (amelyet az ALT szintén jelentős növekedésével, majd ezt követően normál szintre visszaesésével bizonyítunk) a HCV C100-3 elleni antitestek kimutathatóvá válnak a 4 NANBH-val fertőzött csimpánz közül 4-nek a széru40 mában. Ezekről a mintákról előzőleg kimutattuk, hogy Westem-elemzés alapján pozitívak, és RIA alapján is pozitívak. Ezzel ellentétben a kontrollcsimpánzok, amelyeket előzőleg HAV-val vagy HBV-vel fertőztünk, egyike sem mutatja reaktivitás bizonyítékát ELISA-val.

6. táblázat

Csimpánzszérumminták

	OD	S/CO	Inokulálás dátuma	Vérvétel dátuma	ALT (NE/L)	Transzfüzió
Negatív kontroll	0,001
Pozitív kontroll	1,504
Határérték	0,401
1. csimpánz	-0,007	0,00	05/24/84	05/24/84	9	NANB
	0,003	0,01		08/07/84	71
	>3,000	>7,48		09/18/84	19
	>3,000	>7,48			10/24/84	-

HU 0216 017 Β

6. táblázat (folytatás)

	OD	s/co	Inokulálás dátuma	Vérvétel dátuma	ALT (NE/L)	Transzfíizió
2. csimpánz	-	-	06/07/84	-	-	NANB
	-0,003	0,00		05/31/84	5
	-0,005	0,00		06/28/84	52
	0,945	2,36		08/20/84	13
	>3,000	>7,48		10/24/84	-
3. csimpánz	0,005	0,01	03/14/85	03/14/85	8	NANB
	0,017	0,04		04/26/85	205
	0,006	0,01		05/06/85	14
	1,010	2,52		08/20/85	6
4. csimpánz	-0,006	0,00	03/11/85	03/11/85	11	NANB
	0,003	0,01		05/09/85	132
	0,523	1,31		06/06/85	-
	1,574	3,93		08/01/85	-
5. csimpánz	-0,006	0,00	11/21/80	11/21/80	4	HAV
	0,001	0,00		12/16/80	147
	0,003	0,01		12/30/80	18
	0,006	0,01		07/29-08/21/81	5
6. csimpánz	-	-	05/25/82	-	-	HAV
	-0,005	0,00		05/17/82	-
	0,001	0,00		06/10/82	106
	-0,004	0,00		07/06/82	10
	0,290	0,77		10/01/82	-
7. csimpánz	-0,008	0,00	05/25/82	05/25/82	7	HAV
	-0,004	0,00		06/17/82	83
	-0,006	0,00		09/16/82	5
	0,005	0,01		10/09/82	-
8. csimpánz	-0,007	0,00	11/21/80	11/21/80	15	HAV
	0,000	0,00		12/16/80	130
	0,004	0,01		02/03/81	8
	0,000	0,00		06/03-06/10/81	4,5
9. csimpánz	-	-	07/24/80	-	-	HBV
	0,019	0,05		08/22-10/10/79	-
	-	-		03/11/81	37
	0,015	0,04		07/01-08/05/81	9
	0,008	0,02		10/01/81	6
10. csimpánz	-	-	05/12/82	-	-	HBV
	0,011	0,03		04/21-05/12/82	9
	0,015	0,04		09/01-09/08/82	126
	0,008	0,02		12/02/82	9
	0,010	0,02		01/06/83	13

6. táblázat (folytatás)

	OD	S/CO	Inokulálás dátuma	Vérvétel dátuma	ALT (NE/L)	Transzfúzió
11. csimpánz	-	-	05/12/82	-	-	HBV
	0,000	0,00		01/06-05/12/82	11
	-	-		06/23/82	100
	-0,003	0,00		06/09-07/07/82	-
	-0,003	0,00		10/28/82	9
	-0,003	0,00		12/20/82	10

1. panel: Bizonyítottan fertőzött szérumok krónikus humán NANBH-hordozókból

Egy kódolt panel 22 egyedi mintából áll, mindegyik párhuzamosan, összesen 44 mintával. A minták krónikus NANBH-hordozókból, véradók fertőző szérumaiból és akut fázisú NANBH-betegek fertőző szérumaiból való bizonyítottan fertőzött szérumok. Ezenkívül a minták között vannak nagymértékben bizonyítottan negatív kontrollok és más betegség eredetű kontrollok. A panel minősítőpanelként alkalmazható feltételezett NANBH kimutatására.

A teljes panelt kétszer vizsgáljuk át ELISA-vizsgálattal. A pontozásos értékelés eredményeit a 7. táblázatban mutatjuk be. Bár ez a táblázat a párhuzamos eredmények csak egyik sorozatának eredményeiről számol be, ugyanezeket az eredményeket kapjuk a párhuzamos minták mindegyikénél.

Amint a 7. táblázatban látható, 6 szérum, amely csimpánzmodellben fertőzőnek bizonyult, erősen pozitív. A hetedik fertőző szérum egy akut NANBH-esethez tartozó mintának felel meg, és nem reaktív ELISA-vizsgálatban. Egy vizsgálatba bevont véradó normális ALTszintekkel és vitatható eredményekkel a csimpánztanulmányokban nem reaktív ebben a vizsgálatban. Három másik sorozatminta egy akut NANBH-ban szenvedő egyénből szintén nem reaktív. Az összes minta, amely a nagymértékben bizonyítottan negatív kontrollokból ered, és amelyeket olyan véradókból kaptunk, akik legalább 10 véradáson mentek át hepatitisgyanú nélkül, szintén nem reaktívak ELISA-ban. Végül négy olyan mintát vizsgálunk, amelyet korábban pozitívnak ítéltek meg mások által kifejlesztett NANBH-pontozásos vizsgálatban, de ezek az eredmények nem bizonyíthatók. Ezt a négy mintát a HCV ELISA-vizsgálattal negatívnak ítéljük.

7. táblázat 1. panel

Panel	1. eredmény	2. eredmény
1. Bizonyított fertőzés csimpánzátvitellel
A. Krónikus NANB: Tx után
JF	+	+

Panel	1. eredmény	2. eredmény
EB	+	+
PEG	+	+
B. Fertőzésre gyanús véradók emelt ALT-vel
BC	+	+
JJ	+	+
BB	+	+
C. Akut NANB, Tx után
WH	-	-
2. Bizonytalan fertőzés csimpánzátvitellel
A. Fertőzésre gyanús véradó normál ALT-vel
CC	-	-
3. Akut NANB, Tx után
JL 1 hét	-	-
JL 2 hét	-	-
JL 3 hét	-	-
4. Más betegségkontrollok
A. Primer epecirrhózis
EK	-	-
B. Alkoholos hepatitis gyógyulás közben
HB	-	-
5. Bizonyítottan negatív kontrollok
DH	-	-
DC	-	-
LV	-	-
ML	-	-
AH	-	-
6. Lehetségesnek vélt NANB-„antigének”
JS-80-OIT-O (Ishida)	-	-
Asterix (Trepo)	-	-
Zurtz (Amold)	-	-
Becassdine (Trepo)	-	-

2. panel, donor/befogadó NABH

A kódolt panel NANBH-val társult transzfuzió 10 bizonyított donorrecipiens esetéből áll, összesen 188 mintából. Az egyes esetek néhány vagy az összes véradó mintáiból állnak a befogadó számára, és sorozatmintákból állnak a befogadóból (3., 6. és 12. hónap múlva, kivéve a transzfüziótól számítva). Ide értendők olyan minták is, amelyeket elővérvétellel a befogadótól a transzfuzió előtt kapunk.

Az eredmények, amelyeket a 8. táblázatban mutatunk be, azt mutatják, hogy az ELISA kimutatja az antitest-szerokonverziót a transzfűzióval társult NANBH 10 esetéből 9-ben. A 4. esetből a minták (ahol szerokonverzió nem mutatható ki) következetesen gyengén reagálnak az ELISA-vizsgálatban. A 10 befogadóminta közül kettő reaktív 3 hónappal a transzfuzió után. 6 hónap múlva 8 befogadóminta reaktív, és a 12. hónapban, a 4. eset kivételével az öszszes minták reaktívak. Ezenkívül legalább egy antitest pozitív donort találunk a 10 eset közül 7-ben, és a 10. esetben két pozitív donor van. A 10. esetben a befogadó elővérvételi mintája is pozitív HCV-antitestekre.

Az ebből a befogadóból vett egyhónapos vér lecsökken a reaktivitási szint határértékére, míg a 4. és 10. hónapos vérmintákban ez már pozitív szintre emelkedik. Általában a 0,4 S/CO értéket tekintjük pozitívnak. így ez az eset az egyén korábbi fertőzöttségét képviseli HCV-vei.

Az ALT- és HBc-státuszt az összes reaktív, vagyis pozitív mintáknál a 9. táblázatban foglaljuk össze. Amint a táblázatban látható, a 8 donormintából 1 negatív a kiegészítő markerek alapján és reaktív a HCV-anti15 test ELISA-ban. Másrészt a befogadóminták (amelyeket 12 hónapig követünk a transzíüzió után) vagy emelt ALT-szinttel, vagy pozitív anti-HBc-vel, vagy mindkettővel bírnak.

8. táblázat

Donor/befogadó NANB-panel Altér H. donor/befogadó NANB-panelja

BEFOGADÓ
Eset	Donor	Elővérvétel	3 hónap	6 hónap	12 hónap
OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO
1.	-	-	0,032	0,07	0,112	0,26	>3,000	>6,96	>3,000	>6,96
2.	-	-	0,059	0,14	0,050	0,12	1,681	3,90	>3,000	>6,96
3.	0,403	0,94	0,049	0,11	0,057	0,13	>3,000	>6,96	>3,000	>6,96
4.	-	-	0,065	0,15	0,073	0,17	0,067	0,16	0,217	0,50
5.	>3,000	>6,96	0,034	0,08	0,096	0,22	>3,000	>6,96	>3,000	>6,96
6.	>3,000	>6,96	0,056	0,13	1,475	3,44	>3,000	>6,96	>3,000	>6,96
7.	>3,000	>6,96	0,034	0,08	0,056	0,13	>3,000	>6,96	>3,000	>6,96
8.	>3,000	>6,96	0,061	0,14	0,078	0,10	2,262	5,28	>3,000	>6,96
9.	>3,000	>6,96	0,080	0,19	0,127	0,37	0,065	0,13	>3,000	>6,96
10.	>3,000 >3,000	>6,96 >6,96	>3,000	>6,96	0,317*	0,74	3,000**	>6,96	>3,000***	>6,96

* 1 hónap, ** 4 hónap, *** 10 hónap

9. táblázat

ALT- és HBc-státusz a reaktív mintáknál az 1. panelban

Minták	Anti-ALT*	HBc**
Véradók
3. eset	normál	negatív
5. eset	emelt	pozitív
6. eset	emelt	pozitív
7. eset	nem áll rendelkezésre	negatív
8. eset	normál	pozitív
9. eset	emelt	nem áll rendelkezésre
10. eset	normál	pozitív
10. eset	normál	pozitív

9. táblázat (folytatás)

Minták		Anti-ALT*	HBc**
Befogadók
1. eset	6 hónap 12 hónap	emelt emelt	pozitív nem vizsgáltuk
2. eset	6 hónap 12 hónap	emelt emelt	negatív nem vizsgáltuk
3. eset	6 hónap 12 hónap	normál emelt	nem vizsgáltuk* nem vizsgáltuk*
5. eset	6 hónap 12 hónap	emelt emelt	nem vizsgáltuk nem vizsgáltuk
6. eset	3 hónap 6 hónap 12 hónap	emelt emelt emelt	negatív negatív nem vizsgáltuk
7. eset	6 hónap 12 hónap	emelt emelt	negatív negatív
8. eset	6 hónap 12 hónap	normál emelt	pozitív nem vizsgáltuk
9. eset	12 hónap	emelt	nem vizsgáltuk
10. eset	4 hónap 10 hónap	emelt emelt	nem vizsgáltuk

* ALT >45 NE L van a normális határok felett ** Anti-HBe <50% (versengő vizsgálat) értéket tekintjük pozitívnak ’·· Az elő-véreztetési és 3 hónapos minták negatívak HBc-re

HCV-fertőzés megállapítása nagy kockázati csoportból való mintákból

Nagy kockázati csoportból való mintákat vizsgálunk ELISA-t alkalmazva, hogy meghatározzuk a reaktivitást HCV C100-3 antigénnél. Az eredményeket a 10. táblázatban mutatjuk be.

Amint a táblázatban látható, a legnagyobb reaktivitású mintákat a hemofíliásoktól kapjuk (76%). Ezenkívül az emelt ALT-szintű és anti-HBc-re pozitív egyénekből származó minták 51%-át reaktívnak ítéljük, ez olyan érték, amely egybevág ebben a csoportban a klinikai adatokból és NANBH-gyakoriságból várt adatokkal. A HCV elleni antitest előfordulása nagyobb azoknál a véradóknál is, akik csak emelt ALT-szinttel bírnak, azoknál a véradóknál is, akik csak hepatitis B belső antigén elleni antitestekre pozitívak, és azoknál a véradóknál is, akiket a magas ALT-szinttől vagy anti-belső antigén antitesttől eltérő okokból utasítottak vissza, ha ezeket a véletlenszerű önkéntes véradókkal hasonlítjuk össze.

10. táblázat

NANBH nagykockázaticsoport-minták

Csoport	Eloszlás	% reaktív
N	N	OD
Emelt ALT	35	3	>3,000	11,4%
1	0,728
Anti-HBe	24	5	>3,000	20,8%
Emelt ALT, Anti-HBe	33	12	>3,000	51,5%
1	2,768
1	2,234
1	0,939
1	0,951
1	0,906

HU 216 017 Β

10. táblázat (folytatás)

Csoport	Eloszlás	% reaktív
N	N	OD
Elutasított véradók	25	5	>3,000	20,0%
Véradók valamilyen hepatitiselőzménnyel 1 1 1	150 0,837 0,837 0,469	19	>3,000	14,7%
Hemofíliások 1 1 1 1 1 1 1	30 2,568 2,483 2,000 1,979 1,495 1,209 0,819	31	>3,000	76,0%

Összehasonlító tanulmányok anti-lgG vagy antiIgM monoklonális antitesteket alkalmazva, vagy második antitestként poliklonális antitesteket alkalmazva a HCV C100-3 ELISA-ban

Az ELISA-meghatározás, amely anti-lgG monoklonális konjugátumot alkalmaz, érzékenységét összehasonlítjuk azzal, amelyet vagy anti-IgM monoklonális konjugátumot alkalmazva kapunk, vagy mindkettőt olyan poliklonális antiszérummal helyettesítve kapunk, amelyről leírták, hogy fajlagos mind nehéz, mind könnyű láncokra. Az alábbi tanulmányokat végezzük el.

Sorozatminták szerokonvertálöktól

NANB-szerokonvertálók három esetéből származó sorozatmintákat tanulmányozunk az Ortho Co., Rariton, N. Y. AEÁ cég által gyártott reagensek alkalmazásával a HCV Cl00-3 ELISA-vizsgálatban az enzimkonjugátumban, vagy csak az anti-lgG monoklonális antitestet alkalmazva, vagy ezt anti-IgM monoklonális antitesttel kombinálva alkalmazva, vagy poliklonális antiszérumot alkalmazva (lásd all. táblázatot). Az IgG- és az IgMkonjugátumok koncentrációja körülbelül 0,5-1,0 mg/ml vizsgálatonként 200 μΐ térfogatban.

Az anti-lgG monoklonális antitest-enzim konjugátumot alkalmazva kapott eredményeket a 12. táblázatban mutatjuk be. Az adatok azt mutatják, hogy kezdetben erős reaktivitás mutatkozik az 1., 2. és 3. esetek 1-4., illetve 2-8., illetve 3-5. mintáiban.

Az anti-lgG monoklonális konjugátum és anti-IgMkonjugátum kombinációját alkalmazva kapott eredmé25 nyékét a 13. táblázatban mutatjuk be. Anti-lgG és antiIgM három különböző arányát vizsgáljuk; az anti-lgG 1:10 000 hígítása végig konstans. Az anti-IgM monoklonális konjugátum vizsgált hígítása: 1:80000. Az adatok azt mutatják, hogy - egyezésben a csak anti30 IgG-vel végzett tanulmányokkal - erős kezdeti reaktivitás mutatható ki az 1-4., 2-8. és 3-5. mintákban.

Az ELISA-val kapott eredményeket, anti-lgG monoklonális konjugátumot (1:10000 hígítás) vagy Tago poliklonális konjugátumot (1:80 000 hígítás) vagy

Jackson poliklonális konjugátumot (1:80 000 hígítás) alkalmazva a 14. táblázatban mutatjuk be. A poliklonális konjugátumokat a Jackson Immunoresearch Co. (West Grove, Pe, AEÁ) gyártja. Az adatok azt jelzik, hogy a kezdeti erős reaktivitás az 1 -4., 2-8. és 3-5. mintákban mutatkozik mind a három felállásban; a Tago poliklonális antitestek alakítják ki a legkisebb jeleket.

A fentebb megadott eredmények megmutatják, hogy mind a három felállás mutat ki reaktív mintákat azonos időben a betegség akut fázisa után (amelyet az emelt ALT-szinttel igazolunk). Ezenkívül az eredmények azt is jelzik, hogy a HCV C100-3 ELISA-érzékenysége anti-lgG monoklonális antitest-enzim konjugátumot alkalmazva azonos vagy jobb, mint azok az eredmények, amelyeket az enzimkonjugátumhoz tarto50 zó más vizsgált felállásokat alkalmazva kapunk.

11. táblázat Minták leírása

	Dátum	HBsAg	Anti-HBs	Anti-HBc	ALT	Bilirubin
1. eset
1-1	8/5/81	1,0	91,7	12,9	40,0	-i,o
1-2	9/2/81	1,0	121,0	15,1	274,0	1,4

HU 0216 017 Β

11. táblázat (folytatás)

	Dátum	HBsAg	Anti-HBs	Anti-HBc	ALT	Bilirubin
1-3	10/7/81	1,0	64,0	23,8	261,0	0,9
1-4	11/19/81	l,o	67,3	33,8	75,0	0,9
1-5	12/15/81	1,0	50,5	27,6	71,0	1,0
2. eset
2-1	10/19/81	1,0	1,0	116,2	17,0	-1,0
2-2	11/17/81	1,0	0,8	89,5	46,0	1,1
2-3	12/02/81	1,0	1,2	78,3	63,0	1,4
2-4	12/14/81	1,0	0,9	90,6	152,0	1,4
2-5	12/23/81	1,0	0,8	93,6	624,0	1,7
2-6	1/20/82	1,0	0,8	92,9	66,0	1,5
2-7	2/15/82	1,0	0,8	86,7	70,0	1,3
2-8	3/17/82	1,0	0,9	69,8	24,0	-1,0
2-9	4/21/82	1,0	0,9	67,1	53,0	1,5
2-10	5/19/82	1,0	0,5	74,8	93,0	1,4
2-11	6/14/82	1,0	0,8	82,9	37,0	-1,0
3. eset
3-1	4/7/81	1,0	1,2	88,4	13,0	-1,0
3-2	5/12/81	1,0	1,1	126,2	236,0	0,4
3-3	5/30/81	1,0	0,7	99,9	471,0	0,2
3-4	6/9/81	1,0	1,2	110,8	315,0	0,4
3-5	7/6/81	1,0	1,1	89,9	273,0	0,4
3-6	8/10/81	1,0	1,0	118,2	158,0	0,4
3-7	9/8/81	1,0	1,0	112,3	84,0	0,3
3-8	10/14/81	1,0	0,9	102,5	180,0	0,5
3-9	11/11/81	1,0	1,0	84,6	154,0	0,3

12. táblázat

Anti-IgG monoklonális konjugátumot alkalmazva kapott ELISA-eredmények

Minta	Dátum	ALT	OD	S/CD
Negatív kontroll			0,076
Határérték			0,476
PC (1:128)			1,390
1. eset
1-1	08/05/81	40,0	0,178	0,37
1-2	09/02/81	274,0	0,154	0,32
1-3	10/07/81	261,0	0,129	0,27
1-4	11/19/81	75,0	0,937	1,97
1-5	12/15/81	71,0	>3,000	>6,30
2. eset
2-1	10/19/81	17,0	0,058	0,12
2-2	11/17/81	46,0	0,050	0,11
2-3	12/02/81	63,0	0,047	0,10
2-4	12/14/81	152,0	0,059	0,12

HU 0216 017 Β

12. táblázat (folytatás)

Minta	Dátum	ALT	OD	S/CD
2-5	12/25/81	624,0	0,070	0,15
2-6	01/20/82	66,0	0,051	0,11
2-7	02/15/82	70,0	0,139	0,29
2-8	13/17/82	24,0	1,867	3,92
2-9	04/21/82	53,0	>3,000	>6,30
2-10	05/19/82	95,0	>3,000	>6,30
2-11	06/14/82	37,0	>3,000	>6,30
3. eset
3/1	04/07/81	13,0	0,090	0,19
3/2	05/12/81	236,0	0,064	0,13
3/3	05/30/81	471,0	0,079	0,17
3/4	06/09/81	315,0	0,211	0,44
3/5	07/06/81	273,0	1,707	3,59
3/6	08/10/81	158,0	>3,000	>6,30
3/7	09/08/81	84,0	>3,000	>6,30
3-8	10/14/81	180,0	>3,000	>6,30
3-9	11/11/81	154,0	>3,000	>6,30

13. táblázat

Anti-IgG és anti-IgM monoklonális konjugátumot alkalmazva kapott eredmények

Minta	Dátum	ALT	NANB ELISA-k
Monoklonális antitestek IgG 1:10K IgM l:30K	Monoklonális antitestek IgG 1:10K IgM l:60K	Monoklonális antitestek IgG 1:10 K IgM l:20K
OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO
Negatív kontroll			0,100		0,080	0,079
Határérték PC (1:128)			1,083		1,328	1,197
1. eset
1-1	08/05/81	40	0,173		0,162	0,070
1-2	09/02/81	274	0,194		0,141	0,079
1-3	10/07/81	261	0,162		0,129	0,063
1-4	11/19/81	75	0,812		0,85	0,709
1-5	12/15/81	71	>3,000		>3,000	>3,000
2. eset
2-1	10/19/81	17	0,442		0,045	0,085
2-2	11/17/81	46	0,102		0,029	0,030
2-3	12/02/81	63	0,059		0,036	0,027
2-4	12/14/81	152	0,065		0,041	0,025
2-5	12/23/81	624	0,082		0,033	0,032
2-6	01/20/82	66	0,102		0,042	0,027
2-7	02/15/82	70	0,188		0,068	0,096
2-8	03/17/82	24	1,728		1,668	1,541

HU 0216 017 Β

13. táblázat (folytatás)

Minta	Dátum	ALT	NANB ELISA-k
Monoklonális antitestek IgG 1:10K IgM l:30K	Monoklonális antitestek IgG 1:10 K IgM l:60K	Monoklonális antitestek IgG l:10K IgM l:60K	Monoklonális antitestek IgG 1:10 K IgM l:20K
OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO
2-9	04/21/82	53	>3,000		2,443	>3,000
2-10	05/19/82	95	>3,000		>3,000	>3,000
2-11	06/14/82	37	>3,000		>3,000	>3,000
3. eset
3-1	04/07/81	13	0,193		0,076	0,049
3-2	05/12/81	236	0,201		0,051	0,038
3-3	05/30/81	471	0,132		0,067	0,052
3-4	06/09/81	315	0,175		0,155	0,140
3-5	07/06/81	275	1,335		1,238	1,260
3-6	08/10/81	158	>3,00		>3,000	>3,00
3-7	09/08/81	84	>3,00		>3,000	>3,00
3-8	10/14/81	180	>3,00		>3,000	>3,00
3-9	11/11/81	154	>3,00		>3,000	>3,00

14. táblázat

Minta	Dátum	ALT	NANB-ELISA-k
Monoklonális antitestek	TAGO	JACKSON
1:1K	l:80K	l:80K
OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO
Negatív kontroll			0,076		0,045		0,154
Határérték			0,476		0,545		0,654
PC (1:128)			1,390		0,727		2,154
1. eset
1/1	08/05/81	40	0,178	0,37	0,067	0,12	0,153	0,23
1/2	09/02/81	274	0,154	0,32	0,097	0,18	0,225	0,34
1/3	10/07/81	261	0,129	0,27	0,026	0,05	0,167	0,26
1/4	11/19/81	75	0,937	1,97	0,324	0,60	0,793	1,21
1/5	12/15/81	71	>3,00	>6,30	1,778	3,27	>3,000	>4,59
2. eset
2/1	10/19/81	17	0,058	0,12	0,023	0,04	0,052	0,08
2/2	11/17/81	46	0,050	0,11	0,018	0,03	0,058	0,09
2/3	12/02/81	63	0,047	0,10	0,020	0,04	0,060	0,09
2/4	12/14/81	152	0,059	0,12	0,025	0,05	0,054	0,08
2/5	12/23/81	624	0,070	0,15	0,026	0,05	0,074	0,11
2/6	01/20/82	66	0,051	0,11	0,018	0,03	0,058	0,09
2/7	02/15/82	70	0,139	0,29	0,037	0,07	0,146	0,22

HU 216 017 Β

14. táblázat (folytatás)

Minta	Dátum	ALT	NANB-ELISA-k
Monoklonális antitestek	TAGO	JACKSON
1: 1K	l:80K	l:80K
OD	S/CO	OD	S/CO	OD	S/CO
2/8	03/17/82	24	1,867	3,92	0,355	0,65	1,429	2,19
2/9	04/21/82	53	>3,00	>6,3	0,748	1,37	>3,00	>4,59
2/10	05/19/82	95	>3,00	>6,30	1,025	1,88	>3,00	>4,59
2/11	06/14/82	37	>3,00	>6,30	0,917	1,68	>3,00	>4,59
3. eset
3/1	04/07/81	13	0,090	0,19	0,049	0,09	0,138	0,21
3/2	05/12/81	256	0,064	0,13	0,040	0,07	0,094	0,14
3/3	05/30/81	471	0,079	0,17	0,045	0,08	0,144	0,22
3/4	06/09/81	315	0,211	0,44	0,085	0,16	0,275	0,42
3/5	07/06/81	273	1,707	3,59	0,272	0,50	1,773	2,71
3/6	08/10/81	158	>3,00	>6,30	1,347	2,47	>3,00	>4,59
3/7	09/08/81	84	>3,00	>6,30	2,294	4,21	>3,00	>4,59
3/8	10/14/81	180	>3,00	>6,30	>3,00	>5,50	>3,00	>4,59
3/9	11/11/81	154	>3,00	>6,30	>3,00	>5,50	>3,00	>4,59

Minták véletlenszerűen kiválasztott véradókból

Véletlenszerűen kiválasztott véradókból való mintákat vizsgálunk át HCV-fertőzésre HCV Cl00-3 ELISA-t alkalmazva, amelyben az antitest-enzim konjugátum vagy anti-IgG monoklonális konjugátum, vagy valamilyen poliklonális konjugátum. Az átvizsgált minták teljes száma 1077, illetve 1056 a poliklonális konjugátummal, illetve a monoklonális konjugátummal. Az átvizsgálás eredményeinek összefoglalását a 15. táblázatban mutatjuk be, és a mintaeloszlást hisztogramban mutatjuk be a 44. ábrán.

Az átlag- és a standard eltérés kiszámításánál kizárjuk azokat a mintákat, amelyek 1,5 fölötti jelet adnak, vagyis 1073 OD-értéket alkalmaznak a poliklonális konjugátumot hasznosító kalkulációkban és 1051 ODértéket az anti-IgG monoklonális konjugátum esetében. Amint a 15. táblázatban látható, amikor poliklonális konjugátumot alkalmazunk, az átlag 0,0493-ról 0,0931re csúszik fel, és a standard eltérés 0,074-ről 0,0933-ra növekszik. Ezenkívül az eredmények azt is megmutatják, hogy ha az X+5.SD kritériumot alkalmazzuk abból a célból, hogy meghatározzuk a vizsgálat határértékét, a poliklonális antitest-enzim konjugátum összeállítás az ELISA-vizsgálatban magasabb határértéket igényel. Ez csökkentett vizsgálati fajlagosságot jelez a monoklonális rendszerrel összehasonlítva. Ezenkívül, amint ezt a 44. ábrán lévő hisztogramban ábrázoljuk, az eredmények nagyobb elkülönülése következik be a negatív és pozitív eloszlások között, amikor véletlenszerűen kiválasztott véradókat vizsgálunk át ELISA-val az anti-IgG monoklonális konjugátumot alkalmazva, ha a kereskedelmi forgalomban lévő poliklonális jelzést alkalmazó vizsgálattal hasonlítjuk össze.

15. táblázat

Két ELISA-összehasonlítás összehasonlítása véletlenszerűen kiválasztott véradókból vett minták vizsgálatában

Konjugátum	Poliklonális (Jackson)	Anti-IgG monoklonális
A minták száma	1073	1051
Átlag (x)	0,0931	0,04926
Standard eltérés (SD)	0,0933	0,07427
5.SD	0,4666	0,3714
Határérték (5.SD+x)	0,5501	0,4206

HCV-szerokonverzió NANBH-ban szenvedő betegekben, akik különböző földrajzi helyeken találhatók

Olyan betegekből való szérumokat, akik emelt ALTszintjük alapján NANBH-ra gyanúsak, és akik HAV- és

HBV-vizsgálatokban negatívak, vizsgálunk RIA-t alkalmazva, lényegében úgy, hogy a HCV Cl00-3 antigént alkalmazzuk átvizsgálóantigénként a mikrotitrálólemezekben. Amint a 16. táblázatban bemutatott eredményekben látható, a RIA-vizsgálat pozitív mintákat mutat ki az esetek nagy százalékában.

16. táblázat

Szerokonverzió-gyakoriságok anti-C 100 - 3 -ra különböző országokból származó NABH-betegek között

Ország	Hollandia	Olaszország	Japán
Vizsgáltak száma	5	36	26
Pozitívak száma	3	29	19
Pozitívak %-a	60	80	73

HCVB-szerokonverzió kimutatás „közösségben szerzett ” NANBH-ban szenvedő betegekben

A szérumokat, amelyeket 100 NANBH-ban szenvedő betegből kaptak, akiknél az átvitel útja nem nyilvánvaló (például transzfüziót, intravénás gyógyszerhasználatot, promiszkuitást stb. nem lehet kockázati tényezőként azonosítani) RIA-vizsgálatot alkalmazva vizsgáljuk át, amint ezt az előbbiekben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a HCV Cl00-3 antigént alkalmazzuk a mikrotitrálólemezekhez rögzített vizsgálóantigénként. Az eredmények azt mutatják, hogy 100 szérummintából 55 tartalmaz olyan antitesteket, amely immunológiailag reagál a HCV C100-3 antigénnel.

A fentebb leírt eredmények azt sugallják, hogy a „közösségben szerzett” NANBH-t is előidézi a HCV. Sőt mivel itt kimutatjuk, hogy a HCV a Flavivírussal rokon, amelyek többségét ízeltlábúak viszik át, nagyon valószínű, hogy a HCV-átvitel a „közösségben szerzett” esetekben szintén ízeltlábú-átvitel eredménye.

HCV-antitestek és kiegészítő markerek gyakoriságának összehasonlítása NANBH-átvitelben érintett véradókban

Egy kutatási tanulmányt végzünk, hogy meghatározzuk, vajon az NANBH-pozitivitásra gyanús véradóktól kapott vér befogadói, akikben NANBH fejlődött ki, szerokonvertálódnak-e anti-HCV-antitest pozitívvá. A véradókat átvizsgáljuk a kisegítő marker rendellenességekre, amelyeket jelenleg használnak NANBH-fertőzés markereiként; ezek az emelt ALT5 szintek és anti-belső antigén antitest jelenléte. Ezenkívül a véradókat átvizsgáljuk anti-HCV-antitestek jelenlétére is. Az anti-HCV-antitestek jelenlétének meghatározását radioimmunesszét alkalmazva végezzük. A tanulmány eredményeit a 17. táblázatban ábrázol10 juk, amely az alábbiakat tartalmazza: a beteg száma (1. oszlop); anti-HCV-antitestek jelenléte a beteg szérumában (2. oszlop); a beteg által befogadott véradások száma, ahol az egyes befogadások különböző véradóktól vannak (3. oszlop); anti-HCV-antitestek je15 lenléte a véradó szérumában (4. oszlop); és a véradó kiegészítő rendellenességei (5. oszlop) (NT, vagy azt jelenti, hogy nem vizsgáltuk) (ALT emelt transzaminázt és anti-HBc anti-belső antigén elleni antitestet jelent).

A 17. táblázat eredményei azt demonstrálják, hogy a HCV-antitest vizsgálat pontosabb a fertőzött véradók kimutatásában, mint a kiegészítő marker vizsgálatok. 10 olyan beteg közül, akik NANBH-tüneteket mutatnak, 9-et vizsgálunk pozitívnak az anti-HCV-antitest szerokon verzió val. 11 gyanús donor (a 6. beteg két véradásban részesült két különböző egyéntől, akikről fennáll a gyanú, hogy NANBH-hordozók) közül 9 pozitív anti-HCV-antitestekre és egynek a pozitivitása határértéken van, ennek következtében bizonytalan (az 1. be30 teg donoija). Ezzel ellentétben az emelt ALT-vizsgálatot alkalmazva a 10 véradóból 6-ot negatívnak vizsgálunk, és az anti-belső antigén antitest vizsgálatot alkalmazva a 10 véradóból 5-öt negatívnak vizsgálunk. A legfontosabb következmény azonban az, hogy három esetben (a 8., 9. és 10. betegeknek vért adó véradók) az ALT-vizsgálat és az anti-HBc-vizsgálat következetlen eredményeket ad.

17. táblázat

Anti-HCV-antitestek kifejlődése olyan betegekben, akik feltételezett NANBH-hordozóktól kaptak vért

Beteg	Anti-HCV szerokonverzió a betegben	A véradások/véradók száma	Anti-HCV pozitív véradó	Kiegészítő rendellenességek
ALT	Anti-HB
1	igen	18	bizonytalan	nem	nem
2	igen	18	igen	NT	igen
3	igen	13	igen	nem	nem
4	nem	18	nem	-	-
5	igen	16	igen	igen	igen
6	igen	11	igen (2)	nem igen	nem igen
7	igen	15	igen	NT	nem
8	igen	20	igen	nem	igen
9	igen	5	igen	igen	nem
10	igen	15	igen	nem	igen

* Ugyanaz a donor, mint az anti-NANBV pozitív

Amplifikáciö HCV cDNS-szekvenciák klónozásához a Flavivírusgenom-szekvenciák megőrzött területeiből származó primereket és PCR-technikát alkalmazva

A fentebb bemutatott eredmények, amelyek azt sugallják, hogy a HCV Flavivírus vagy Flaviszerű vírus, lehetővé tesznek egy stratégiát nem jellemzett HCV cDNS klónozásához a PCR-technikát alkalmazva, és olyan primereket alkalmazva, amelyek Flavivírusokban lévő megőrzött aminosavszekvenciákat kódoló területekből származnak. A primerek egyike általában meghatározott HCV-genom szekvenciából származik, és a másik primer, amely egy szekvenciaelemzésnek alá nem vetett HCV-polinukleotid területét szegélyezi, a Flavivírusgenom egy megőrzött területéből származik. A Flavivírusgenomokról ismert, hogy megőrzött szekvenciákat tartalmaznak az NSl-en és az E-polipeptideken belül, amelyek a Flavivírusgenom 5’-területén belül kódolódnak. Az ezeket a területeket kódoló megfelelő szekvenciák a 26. ábrán bemutatott HCV cDNSszekvenciától fölfelé fekszenek. így abból a célból, hogy a HCV-genom ebből a területéből származó szekvenciákat izoláljunk, felfelé lévő primereket tervezünk, amelyek az ezeken a Flavivírus-polipeptideken belül lévő megőrzött szekvenciákból származnak. A lefelé lévő primerek a HCV cDNS ismert részének felfelé lévő végéből származnak.

A kód degenerációja következtében valószínű, hogy lesznek hibás illesztések a Flavivírus vizsgálóminták és a megfelelő HCV-genom szekvenciák között. Ennek megfelelően olyan stratégiát alkalmazunk, amelyet Lee írt le (1988). A Lee-féle munkamenet olyan kevert oligonukleotid primereket alkalmaz, amelyek komplementerek egy aminosavszekvencia reverz transzlációs termékéhez; a szekvenciák a kevert printerekben számításba vesznek minden kodondegenerációt a megőrzött aminosavszekvenciánál.

5’-GAT CTC TAG AGA AAT

A PCR-reakciót, amelyet eredetileg Saiki és munkatársai írtak le (1986), lényegében úgy hajtjuk végre, amint ezt Lee és munkatársai leírták (1988), azzal a kivétellel, hogy a cDNS-hez szolgáló templát olyan RNS, amelyet HCV-vel fertőzött csimpánz májából izoláltunk, vagy HCV-vel fertőzött csimpánzszérumból izolált vírusrészecskékből izoláltunk. Ezenkívül az összeforrasztási körülmények kevésbé szigorúak az amplifikáciö első menetében (0,6 mol/1 NaCl és 25 °C hőmérséklet), mivel a primemek az a része, amely a HCV-szekvenciához forr, csak 9 nukleotid, és nem lehetnek hibás illesztések. Ezenkívül, ha ssc5h34A-t használunk, a további szekvenciák, amelyek nem a HCV-genomból származnak, hajlamosak a primer templáthibrid destabilizálására. Az amplifikáciö első menete után az összeforrasztási körülmények szigorúbbak lehetnek (0,066 mol/1 NaCl és 32-37 °C), mivel az

5’-CCC AGC GGC GTA CGC GCT

GTG TGG CGG TGT TGT TCT

Primer keverékek három készletét alakítjuk ki számos Flavivírusban talált aminosavhomológia alapján, a Flavivírusok közé értve a trópusi náthaláz-2,4 (D-2,4), Japán enkefalitiszvírus (JEV), sárgaláz (YF) és nyugat5 nílusi vírus (WN) vírusait. A legtöbb fölfelé lévő megőrzött szekvenciából származó primer keverék (5 ’-l) a gly-trp-gly aminosavszekvencián alapul, amely része a D-2, JEV, YF és WN E-fehérjéjében megtalálható asp-arg-gly-trp-gly-asp-N megőrzött szekvenciá10 nak. A következő primer keverék (5’-2) az E-fehérjében lefelé lévő konzervált szekvencián, a phe-aspgly-asp-ser-tyr-leu-phe-gly-asp-ser-tyr-leu szekvencián alapul, és a phe-gly-asp-ból ered; a megőrzött szekvencia a D-2-ben, JEV-ben és WN-ben van jelen. A harmadik primer keverék (5’-3) az arg-ser-cys aminosavszekvencián alapul, amely a D-2, D-4, JEV, YF és WN N51 fehétjéjében lévő cys-cys-arg-ser-cys megőrzött szekvencia része. Az egyes primereket, amelyek az 5’-3 keveréket képezik, a

45. ábrán mutatjuk be. A megőrzött területekből származó különböző szekvenciákon kívül az egyes keverékekben lévő egyes primerek egy konstans területet is tartalmaznak az 5’-végnél, amely a HindlII, Mbol és EcoRI restrikciós enzimekhez szolgáló helyeket kó25 dolószekvenciát tartalmaz.

A lefelé lévő primer, az ssc5h20A, az 5h. kiónban lévő nukleotidszekvenciát tartalmazza, amely olyan szekvenciákkal bíró HCV cDNS-t tartalmaz, amelyek átfedik a 14i. és 1 lb. kiónokban lévő szekvenciákat. Az ssc5h20A szekvenciája az alábbi:

5’-GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA-3’ Egy másik prímért is alkalmazhatunk, az ssc5h34A-t.

Ez a primer az 5h. kiónban lévő szekvenciából származik, és ezenkívül olyan nukleotidokat tartalmaz az 5’-végnél, amely restrikciósenzim-helyet alkot, így megkönnyíti a klónozást. Az ssc5h34A szekvenciája az alábbi:

CAA TAT GGT GAC AGA GTC A-3’ amplifíkált szekvenciák most olyan területeket tartalmaznak, amelyek komplementerek a primerekkel, vagy másolatai a printereknek. Ezenkívül az amplifikáciö első 10 ciklusa a Klenow-enzim I-gyel fut, az ehhez az enzimhez alkalmas PCR-körülmények között. Ezeknek a ciklusoknak a teljessé válása után a mintákat extraháljuk, és Taq polimerázzal futtatjuk a készletben leírt útmutatások szerint, amely útmutatások a Cetus/Perkin-Elmer készlethez tartoznak.

A kibővítés után az amplifíkált HCV cDNS-szekvenciákat hibridizálással mutatjuk ki az 5h. klónból származó vizsgálómintát alkalmazva. Ez a vizsgálóminta azokból a szekvenciákból származik, amelyek fölfelé vannak azoktól, amelyeket a primer kinyeréséhez alkalmazunk, és nem fedik át az 5h. klón eredetű primerek szekvenciáit. A vizsgálóminta szekvenciája az alábbi:

GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC

CGT CGG GTT GAT GGC GC 3’

HCV cDNS-könyvtár megalkotása egy fertőző NANBH-ban szenvedő csimpánz májából

HCV cDNS-könyvtárat alkotunk meg annak a csimpánznak a májából, amelyből az előbbiek szerint a HCV cDNS-könyvtárat megalkottuk. A technika a könyvtár megalkotásához hasonló ahhoz, amelyet leírtunk, azzal a különbséggel, hogy az RNS forrása eltérő, és hogy olyan prímért alkalmazunk, amely a 1 lb. kiónban lévő HCV cDNS-szekvenciáján alapul. A primer szekvenciája a következő:

5’-CTG GCT TGA AGA ATC-3’.

A k9-l. klánban lévő HCV cDNS-t és a 11b. klánban lévő cDNS-t átfedő nukleotidszekvencia izolálása

A k9-l. kiónt egy NANBH-val fertőzött csimpánz májából létrehozott HCV cDNS-könyvtárból izoláljuk, amint ezt már leírtuk. A könyvtárat olyan kiónokra vizsgáljuk át, amelyek átfedik a 11b. kiónban lévő szekvenciákat, egy olyan kiónt alkalmazva, amely a 11b. kiónt az 5'-terminálisnál fedi át (Ile. klón). A 11b. klón szekvenciáját a 23. ábrán mutatjuk be. Pozitív kiónokat izolálunk 1:500 000 gyakorisággal. Az egyik izolált kiónt, a k9-l-et további tanulmányozásnak vetjük alá. A k9-l. kiónban lévő HCV cDNS átfedő természetét a 26. ábrán lévő HCV cDNS-szekvencia 5’-végével a klón átvizsgálásával igazoljuk az Alex46 klónnal; ez utóbbi klón olyan 30 bázispáros HCV cDNS-szekvenciát tartalmaz, amely a fentebb leírt 14í. kiónban lévő HCV cDNS 5’-terminálisánál lévő bázispároknak felel meg.

A k9-l. kiónból izolált HCV cDNS nukleotidszekvenciáját a fentebb ismertetett technikákat alkalmazva határozzuk meg. A k9-l. kiónban lévő HCV cDNS szekvenciáját, az átfedést a 26. ábrán lévő HCV cDNSsel, és az ebben kódolt aminosavakat a 46. ábrán mutatjuk be.

A k9-l. kiónban lévő HCV cDNS-szekvencia össze van dolgozva azoknak a kiónoknak a szekvenciáival, amelyeket az előzőekben leírtunk, hogy összetett HCV cDNS-szekvenciát alkossanak meg, ahol a k9-l. szekvencia a 32. ábrán bemutatott szekvenciától fölfelé van elhelyezve. Az összetett HCV cDNS-szekvenciát, amely magában foglalja a k9-l. szekvenciát és a benne kódolt aminosavakat, a 47. ábrán mutatjuk be.

A 47. ábrán bemutatott HCV cDNS 5'-területében kódolt aminosavak szekvenciáját összehasonlítjuk a trópusi náthaláz (Dengue) vírus fentebb leírt törzseinek megfelelő területeivel, a hidrofobitás és hidrofilitás területeinek profilját illetően. Ez az összeállítás azt mutatja, hogy a HCV-ből és Dengue-ből származó polipeptidek, amelyek az NSl-et (vagy egy részét) kódoló területnek felelnek meg, hasonló hidrofób/hidrofil profilnak felelnek meg.

A fentebb nyújtott információ lehetővé teszi a HCVtörzsek azonosítását. A többi HCV-törzsek izolálását és jellemzését úgy hajthatjuk végre, hogy olyan testkomponensekből, amelyek vírusrészecskéket tartalmaznak, a nukleinsavakat izoláljuk, cDNS-könyvtárakat alkotunk meg a fentebb leírt HCV cDNS-vizsgálómintákon alapuló polinukleotidvizsgálómintákat alkalmazva, a könyvtárakat a fentebb leírt HCV cDNS-szekvenciákat tartalmazó kiónokra átvizsgálva, és az új izolátumokból a HCV cDNS-t összehasonlítva a fentebb leírt cDNSekkel. Az ebben vagy a vírusgenomban kódolt polipeptideket immunológiai keresztreaktivitással követhetjük a fentebb leírt polipeptideket és antitesteket alkalmazva. Azok a törzsek, amelyek a HCV paramétereihez illeszkednek, könnyen azonosíthatók. HCV-törzsek azonosítására más eljárások is nyilvánvalóvá válnak a szakember számára, az itt megadott információk alapján.

A találmány az itt leírt különféle kiviteli módjaival számos ipari alkalmazással bír, ezek közül néhányat az alábbiakban ismertetünk. A HCV cDNS-eket alkalmazhatjuk vizsgálóminták tervezéséhez, HCV-nukleinsavak mintákban való kimutatásához. A cDNS-ekből származó mintákat alkalmazhatjuk HCV-nukleinsavak kimutatására például kémiai szintetikus reakciókban. Ezeket alkalmazhatjuk átvizsgálási programokban vírusellenes ágensekhez, hogy meghatározzuk az ágensek hatását vírusreplikáció gátlásában sejttenyésztő rendszerekben és állatimodell-rendszerekben. A HCV-polinukleotid vizsgálóminták alkalmas vírusnukleinsavak kimutatásában is emberekben, és így alapul szolgálhatnak HCV-fertőzés diagnózisához emberekben.

A fentieken kívül az itt ismertetett cDNS-ek információkat és eszközöket nyújtanak HCV epitópjait tartalmazó polipeptidek szintéziséhez. Ezek a polipeptidek alkalmasak HCV-antigének elleni antitestek kimutatására. Egy sor immunesszét írunk le itt HCV-fertőzésre, amelyek HCV-epitópokat tartalmazó rekombináns polipeptideken alapulnak; ezek kereskedelmi alkalmazást nyerhetnek HCV által indukált NANBH diagnózisában, vérbankdonorok átvizsgálásában HCV által előidézett fertőző hepatitisre, és fertőző véradóktól való fertőzött vér kimutatására. A vírusantigének hasznosíthatók vírusellenes szerek hatékonyságának követésére is állatimodell-rendszerekben. Ezenkívül az itt ismertetett HCV cDNS-ekből származó polipeptidek vakcinaként is hasznosíthatók HCV-fertőzések kezelésében.

A HCV cDNS-ekből származó polipeptidek a fentebb ismertetett alkalmazásokon kívül alkalmasak antiHCV-antitestek előidézésére is. így ezeket alkalmazhatjuk anti-HCV-vakcinákként. A HCV-polipeptidekkel való immunizálás eredményeként kialakított antitestek alkalmasak vírusantigének jelenlétének kimutatására is mintákban. így ezeket alkalmazhatjuk HCV-polipeptidek termelésének vizsgálására kémiai rendszerekben. Az anti-HCV-antitesteket alkalmazhatjuk vírusellenes ágensek hatékonyságának követésére is olyan átvizsgálóprogramban, ahol ezeket az ágenseket szövettenyésztő rendszerekben alkalmazhatjuk. Ezeket alkalmazhatjuk passzív immunterápiában is, és a NANBH által okozott HCV diagnosztizálására, lehetővé téve a vírusantigén vagy -antigének kimutatását mind a véradókban, mind a vérbefogadókban. Egy másik fontos alkalmazási terület az anti-HCV-antitestek számára az affinitáskromatográfia vírusok és víruspolipeptidek tisztításához. A tisztított vírus- és víruspolipeptid-készítményeket vakcinákban alkalmazhatjuk. A tisztított vírus azonban alkalmas lehet olyan sejtte57

HU 216 017 Β nyésztő rendszerek kifejlesztésében is, amelyben a HCV-replikálódik.

HCV-vel fertőzött sejteket tartalmazó sejttenyésztő rendszerek sokféle alkalmazást nyerhetnek. Ezeket alkalmazhatjuk HCV viszonylag nagy léptékű termeléséhez, amely normálisan alacsony titerű vírus. Ezek a rendszerek alkalmasak lehetnek a vírus molekuláris biológiájának a tisztázására is, és vírusellenes ágensek kifejlesztéséhez vezethetnek. A sejttenyésztő rendszerek alkalmasak vírusellenes szerek hatékonyságának az átvizsgálására is. Ezenkívül a HCV-t tűrő sejttenyésztő rendszerek alkalmasak HCV legyengített törzseinek előállítására.

Kényelmi szempontokból az anti-HCV-antitesteket és HCV-polipeptideket, akár természetesek, akár rekombináns eredetűek, készletekbe csomagolhatjuk.

A HCV cDNS izolálásához alkalmazott eljárás amely egy egyén fertőzött szöveteiből származó cDNSkönyvtár előállításából áll egy kifejezővektorban, majd olyan kiónok szelektálásából áll, amelyek más fertőzött egyénekből és nem fertőzött egyénekből való antitesttartalmú testkomponensekben lévő antitestekkel immunológiailag reagáló kifejezési termékeket termelnek alkalmazható más, eddig nem jellemzett, betegséggel társult ágensből származó cDNS-ek izolálására, amelyek genomkomponensből állnak. Ez viszont ezeknek az izolálásához és jellemzéséhez vezet, és diagnosztikus reagensekhez és vakcinákhoz ezekhez a más betegséggel társult ágensekhez.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás HCV-1 polinukleotid előállítására, amely HCV-1 polinukleotid olyan egybefüggő nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely képes szelektíven hibridizálódni egy HCV-polinukleotidhoz vagy annak komplementeréhez, azzal jellemezve, hogy (a) egy polimerizáló ágenssel nuldeotidszubsztrátokat polimerizálunk egy HCV-1 polinukleotid előállítására, és (b) izoláljuk a HCV-1 polinukleotidot.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az ATCC No. 40 394 szám alatt letétbe helyezett HCV cDNS által kódolt.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 47. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő szekvencia legalább 10 nukleotidból áll.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő szekvencia legalább 15 nukleotidból áll.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő szekvencia legalább 20 nukleotidból áll.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polinukleotid egy DNS-pollnukleotid.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polinukleotid egy RNS-polinukleotid.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
9. Az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egy szintetikus kémiai eljárás. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
10. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polimerizálóágensként egy polimerázt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerizációt katalízis mellett egy rekombináns gazdasejtben végezzük.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként egy prokariótasejtet alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként egy eukariótasejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
14. Eljárás egy HCV-1 polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-13. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotidot egy olyan polinukleotldhoz ligálunk, amely egy kontrollszekvenciát tartalmaz, és a ligálás következtében a kontrollszekvencia és a HCV-polinukleotid működésképesen egymáshoz kapcsolódik. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként egy expressziós vektort állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
16. Eljárás egy HCV-1 polinukleotiddal transzformáit rekombináns gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-13. igénypontok bármelyike szerint előállított polinukleotidot vagy egy, a 14. vagy 15. igénypont szerint előállított vektort egy gazdasejtbe juttatunk be.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
17. Eljárás HCV-1 polinukleotid vagy vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 16. igénypont szerint előállított gazdasejtet inkubálunk, a belé épített HCV-1 polinukleotid vagy vektor replikálására. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia egy, az ATCC 40 511, 40 512, 40 513 és 40 514 számon letétbe helyezett cDNS-ek csoportjába tartozó HCV cDNS valamelyike által kódolt.

(Elsőbbsége: 1988. 11. 14.)
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 7. vagy 8. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt. (Elsőbbsége: 1988.02.26.)
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 26. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt. (Elsőbbsége: 1988. 10.26.)
21. Eljárás HCV-1 polipeptid előállítására, amely tartalmaz egy HCV-antigén determinánst és egy, legalább 10 aminosavból álló egybefüggő szekvenciát, amelyet egy, az 1. igénypont szerint előállított polinukleotid kódol, azzal jellemezve, hogy (a) aminosavszubsztrátokat polimerizálunk egy polimerizálóágenssel egy olyan polipeptid előállítására, amely tartalmaz egy HCV-1 antigén determinánst és egy, legalább 10 aminosavból álló egybefüggő szekvenciát, amelyet egy HCV -1 polinukleotid kódol, és (b) izoláljuk a polipeptidet.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő HCV-1 nukleotidszekvencia az ATCC 40394 letéti számú HCV cDNS valamelyik szálában található.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 47. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
24. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy szintetikus kémiai módszert alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
25. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy polimerizáló ágensként riboszómát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
26. A 25. igénypont szerinti eljárás egy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a polimerizációt katalízis mellett egy rekombináns gazdasejtben végezzük. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
27. A 21-26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a legalább 10 aminosavból álló egybefüggő szekvenciát egy nem HCV-aminosavszekvenciához fuzionáltatjuk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
28. A 21-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a HCV-antigén determinánst egy, a C100 klón által kódolt HCV-aminosavszekvencia tartalmazza, és ez a klón az alábbi HCV-aminosavszekvenciát kódolja:

Asp-Ala-His-Phe-Leu—Ser-Gln-Thr-Lys-GlnSer-Gly-Glu-Asn-Leu-Pro-Tyr-Leu-Val-AlaTyr-Gln-Ala-Thr-Val-Cys-Ala-Arg-Ala-GlnAla-Pro-Pro-Pro-Ser-Trp-Asp-Gln-Met-TrpLys-Cys-Leu-Ile-Arg-Leu-Lys-Pro-Thr-LeuHis-Gly-Pro-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-Arg-LeuGly-Ala-Val-Gln-Asn-Glu-Ile-Thr-Leu-ThrHis-Pro-Val-Thr-Lys-Tyr-Ile-Met-Thr-CysMet-Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Ile-Thr-Leu-ThrHis-Pro-Val-Thr-Lys-Tyr-Ile-Met-Thr-CysMet-Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-SerThr-Trp-Val-Leu-Val-Gly-Gly—Val-Leu-AlaAla-Leu-Ala-Ala-Tyr-Cys-Leu-Ser-Thr-GlyCys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Val-Val-LeuSer-Gly-Lys-Pro-Ala-Ile-Ile-Pro-Asp-ArgGlu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-Asp-Glu-MetGlu-Glu—Cys-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-IleGlu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Glu-Gln-PheLys-Gln—Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-ThrAla-Ser-Arg-Gln-Ala-Glu-Val-Ile-Ala-ProAla-Val-Gln-Thr-Asn-Trp-Gln—Lys-Leu-GluThr-Phe-Trp-Ala-Lys-His-Met-Trp-Asn-PheIle-Ser-Gly-Ile-Gln-Tyr-Leu-Ala-Gly-LeuSer-Thr-Leu-Pro-Gly-Asn-Pro-Ala-Ile-AlaSer-Leu-Met-Ala-Phe-Thr-Ala-Ala-Val-ThrSer-Pro-Leu-Thr-Thr-Ser-Gln-Thr-Leu-LeuPhe-Asn-Ile-Leu-Gly-Gly-Trp-Val-Ala-AlaGln- Leu- Alá- Ala-Pro- Gly-Alá-Alá- Thr - AlaPhe-Val-Gly—Ala-Gly-Leu-Ala-Gly-Ala-AlaIle-Gly-Ser-Val-Gly-Leu-Gly-Lys-Val—LeuIle-Asp-Ile-Leu-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ala-GlyVal-Ala-Gly-Ala-Leu-Val-Ala-Phe-Lys-IleMet- Ser-Gly- Glu - Val - Pro - Ser- Thr- Glu-AspLeu-Val-Asn-Leu-Leu-Pro-Ala-Ile-Leu-SerPro-Gly-Ala-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-CysAla-Ala-Ile-Leu-Arg-Arg-His-Val-Gly-ProGly-Glu-Gly-Ala-Val-Gln-Trp-Met-Asn-ArgLeu-Ile-Ala-Phe-Ala-Ser-Arg-Glu-Asn-HisVal-Ser-Pro-Val-His-His-Lys-Arg.

(Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
29. A 21-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az ATCC 40511, 40512, 40513 és 40 514 szám alatt letétbe helyezett cDNS-csoportba tartozó HCV cDNS valamelyik szálában található. (Elsőbbsége: 1988. 11. 14.)
30. A 21-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 7. vagy 8. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt.

(Elsőbbsége: 1988.02.26.)
31. A 21-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 26. ábra szerinti HCV cDNS-szekvencia által kódolt.

(Elsőbbsége: 1988. 10.26.)
32. Eljárás szilárd hordozóhoz rögzített HCV-1 polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 21-31. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet szilárd hordozóra viszünk fel.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
33. Eljárás immunesszé kit előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 21-27. vagy 29-32. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet egy megfelelő tartályba viszünk be.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV—1 antigén determinánst a C100 klón által kódolt HCV-aminosavszekvencia tartalmazza, és ez a klón az alábbi HCV-aminosavszekvenciát kódolja :

Asp-Ala-His-Phe-Leu-Ser-Gln-Thr-LysGln-Ser-Gly-Glu-Asn-Leu-Pro-Tyr-Leu-ValAla-Tyr-Gln-Ala-Thr-Val-Cys-Ala-Arg-AlaGln-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Trp-Asp-Gln-MetTrp-Lys-Cys-Leu-Ile-Arg-Leu-Lys-Pro-ThrLeu-His-Gly-Pro-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-ArgLeu-Gly-Ala-Val-Gln-Asn-Glu-Ile-Thr-LeuThr-His-Pro-Val-Thr-Lys-Tyr-Ile-Met-ThrCys-Met-Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Ile-Thr-LeuThr-His-Pro-Val-Thr-Lys-Tyr-Ile-Met-ThrCys-Met-Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-ThrSer-Thr-Trp-Val-Leu-Val-Gly-Gly-Val-LeuAla-Ala-Leu-Ala-Ala-Tyr-Cys-Leu-Ser-ThrGly-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Val-ValLeu-Ser-Gly-Lys-Pro-Ala-Ile-Ile-Pro-AspArg-Glu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-AspGlu-Met—Glu-Glu-Cys — Ser-Gln-His-LeuPro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-AlaGlu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-LeuLeu-Gln-Thr-Ala-Ser-Arg-Gln-Ala-Glu-ValIle-Ala-Pro-Ala-Val-Gln-Thr-Asn-Trp-GlnLys-Leu-Glu-Thr-Phe-Trp-Ala-Lys-His-MetTrp-Asn-Phe-Ile-Ser-Gly-Ile-Gln—Tyr-LeuAla-Gly-Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Gly-Asn-ProAla-Ile-Ala-Ser-Leu-Met-Ala-Phe-Thr-AlaAla-Val — Thr-Ser-Pro-Leu-Thr-Thr-Ser-GlnThr-Leu-Leu-Phe-Asn-Ile-Leu-Gly-Gly-TrpVal-Ala-Ala-Gln-Leu-Ala-Ala-Pro-Gly-AlaAla-Thr-Ala-Phe-Val-Gly-Ala-Gly-Leu-AlaGly-Ala-Ala-Ile-Gly-Ser-Val-Gly-Leu-GlyLys-Val-Leu-Ile-Asp-Ile-Leu-Ala-Gly-TyrGly-Ala-Gly-Val-Ala-Gly-Ala-Leu-Val-AlaPhe-Lys-Ile-Met-Ser-Gly-Glu-Val-Pro-SerThr-Glu-Asp-Leu-Val-Asn-Leu-Leu-Pro-AlaIle-Leu-Ser-Pro-Gly-Ala-Leu-Val-Val-GlyVal-Val-Cys-Ala-Ala-Ile-Leu-Arg-Arg-HisVal-Gly-Pro-Gly-Glu-Gly-Ala-Val-Gln-TrpMet-Asn-Arg-Leu-Ile-Ala-Phe-Ala-Ser-ArgGlu-Asn-His-Val-Ser-Pro-Val-His-His-LysArg.

(Elsőbbsége: 1988.05.06.)
35. Immunesszé HCV-1 elleni antitestek (antiHCV-antitestek) kimutatására, azzal jellemezve, hogy (a) veszünk egy polipeptidet, amely az antiHCV-1 antitest által megköthető antigéndeterminánst tartalmaz, ahol az antigéndetermináns egy, legalább 8 aminosavból álló egybefüggő aminosavszekvenciát tartalmaz, amelyet a HCV-1 kódol, és a polipeptid egy, a 21. igénypont szerint előállított polipeptiddel azonos;

(b) egy biológiai mintát in vitro inkubálunk a polipeptiddel, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik egy antitest-antigén komplex kialakulását; és (c) meghatározzuk, hogy kialakult-e a polipeptidet tartalmazó antitest-antigén komplex.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
36. A 35. igénypont szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy az antigén determináns az ATCC

40 394 számon letétbe helyezett lambda-gtll könyvtárban kódolódik.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
37. A 35. igénypont szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy az antigéndetermináns a 47. ábra szerinti szekvenciában kódolódik.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
38. A 35-37. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kémiai szintézissel állítjuk elő.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
39. A 35-37. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet rekombináns polinukleotidexpresszióval állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
40. A 35-39. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet egy szilárd hordozóhoz rögzítjük.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
41. A 35-40. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy a polipeptid tartalmaz még egy nem HCV-aminosavszekvenciát is, egy, a HCV-1 által kódolt, legalább 8 aminosav hosszúságú, egybefüggő aminosavszekvenciával fuzionáltatva. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
42. A 35-41. igénypontok bármelyike szerinti immunesszé, azzal jellemezve, hogy az antigéndetermináns a C100 kiónban kódolt.

(Elsőbbsége: 1988. 05. 06.)
43. Eljárás HCV-1 elleni vakcina előállítására, amely egy, a 21-23. igénypontok bármelyike szerint előállított immunogén polipeptidet tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy, a 21-23. igénypontok bármelyike szerint előállított immunogén polipeptidet egy gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal keverünk össze.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
44. Eljárás HCV-1 polinukleotidok egy mintában való jelenlétének vagy hiányának kimutatására in vitro polinukleotidhibridizációs módszerrel, azzal jellemezve, hogy (a) a polinukleotidokat tartalmazó mintát egy próbapolinukleotiddal hozzuk érintkezésbe, amely olyan egybefüggő nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely képes egy HCV-polinukleotidhoz vagy annak komplementeréhez szelektíven hibridizálódni, amely próbapolinukleotidot az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítottuk elő; és (b) meghatározzuk, hogy létrejöttek-e a próbapolinukleotidot tartalmazó polinukleotidduplexek. (Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az ATCC 40394 szám alatt letétbe helyezett HCV cDNS egyik szálában található.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
46. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 47. ábra szerinti szekvenciában van kódolva.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
47. A 44-46. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még amplifikációt is végzünk, polimeráz láncreakciós eljárás (PCR) segítségével. (Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
48. Eljárás HCV-1 polinukleotidok PCR-rel való amplifikálására, azzal jellemezve, hogy egy, HCV-polínukleotidokat tartalmazó mintát egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polinukleotidprimerrel hozunk érintkezésbe nukleinsav polimeráz enzim és nukleotidmonomerek jelenlétében a polinukleotidprimer kiterjesztését elősegítő körülmények között.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
49. Eljárás HCV-1 polinukleotidok PCR-rel való amplifikálására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított polinukleotidprimert alkalmazunk, amely egy HCV-polinukleotidhoz vagy komplementeréhez szelektíven hibridizálódó egybefüggő nukleotidszekvenciát tartalmaz, és az eljárást nukleinsav polimeráz enzim és nukleotidmonomerek jelenlétében végezzük a polinukleotidprimer kiteljesztését elősegítő körülmények között.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az ATCC 40 394 szám alatt letétbe helyezett HCV cDNS valamelyik szálában található.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
51. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia a 47. ábra szerinti szekvenciában kódolt.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
52. A 49-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia legalább 10 nukleotidból áll.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
53. A 49-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia legalább 15 nukleotidból áll.

(Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
54. Eljárás anti-HCV-1 antitestek előállítására, amelynek során egy nem humán egyedet egy olyan készítménnyel immunizálunk, amely egy HCV-1 antigént tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal összekeverve, azzal jellemezve, hogy az immunizálást egy, a 21. igénypont szerinti eljárással előállított polipeptiddel végezzük.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
55. Az 54. igénypont szerinti eljárás anti-HCV-antitestek előállítására, amelynek során egy nem humán egyedet egy olyan készítménnyel immunizálunk, amely egy HCV-1 antigént tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal összekeverve, azzal jellemezve, hogy az immunizálást egy, a 22-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polipeptiddel végezzük.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
56. Eljárás HCV-1 antigének jelenlétének vagy hiányának egy mintában immunesszé-módszerrel való kimutatására, azzal jellemezve, hogy (a) a mintát egy, az 54. igénypont szerinti eljárással előállított anti-HCV-1 antitesttel inkubáljuk olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik egy antitestantigén komplex kialakulását; és (b) meghatározzuk, hogy az anti-HCV-1 antitestet tartalmazó antitest-antigén komplex kialakult-e. (Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
57. Eljárás HCV-1 antigén jelenlétének vagy hiányának egy mintában immunesszé-módszerrel való kimutatására, azzal jellemezve, hogy (a) a mintát egy, az 55. igénypont szerinti eljárással előállított anti-HCV -1 antitesttel inkubáljuk, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik egy antitestantigén komplex kialakulását; és (b) meghatározzuk, hogy az anti-HCV-1 antitestet tartalmazó antitest-anti gén komplex kialakult-e. (Elsőbbsége: 1987. 12.30.)
58. Eljárás immunesszé kit előállítására, azzal jellemezve, hogy az 54. igénypont szerinti eljárással előállított anti-HCV-1 antitesteket megfelelő tartályba csomagoljuk.

(Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
59. Eljárás immunesszé kit előállítására, azzal jellemezve, hogy az 55. igénypont szerinti eljárással előállított anti-HCV—1 antitesteket megfelelő tartályba csomagoljuk.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
60. Eljárás egy HCV-1 polipeptidet tartalmazó rekombináns polipeptid szintetizálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított polinukleotidot tartalmazó terméket használunk. (Elsőbbsége: 1987. 11. 18.)
61. Az 59. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti eljárással előállított polinukleotidot használunk.

(Elsőbbsége: 1987. 12,30.)
62. Eljárás HCV-1 tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy HCV-1-gyel fertőzött hepatocitákat veszünk, majd a hepatocitákat in vitro szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
63. A 62. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatocitaként primer sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 30.)
64. A 62. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hepatocitaként sejtvonalat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 12.30.)