HU218108B

HU218108B - Imidazolinon-rezisztens AHAS-mutánsok

Info

Publication number: HU218108B
Application number: HU9202485A
Authority: HU
Inventors: Gabriele Elfriede Dietrich
Original assignee: American Cyanamid Co.
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-30
Publication date: 2000-06-28
Also published as: IL102673A; TW239161B; EP0525384B1; FI923444A; HUT65483A; NO923017L; CZ238592A3; ES2153352T3; KR930002512A; KR100243996B1; MX9204420A; PT525384E; AU4335296A; NO311095B1; DK0525384T3; SK238592A3; EP0525384A2; PL170616B1; JP3523657B2; US5767361A

Abstract

A találmány imidazolinonherbicidekkel szemben specifikusan rezisztensmutáns AHAS-enzimet kódoló egyszikű növényi génekre vonatkozik. Ilyengének például a kukorica-DNS-szekvenciák, amelyek a vad típusú AHAS-enzim 621-es helyzetében aminosavhelyettesítést tartalmazó enzimetkódolnak. A mutáns gént egyéb növényekben herbiciddel szembenirezisztencia kialakítására alkalmazhatjuk, ebből a szempontból atalálmány a fenti gént tartalmazó vektorokra és gazdasejtekre isvonatkozik, amely sejtek és vektorok a transzformálási eljárásbanalkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány az acetohidroxisav-szintetáz enzim (továbbiakban AHAS) új variáns formáit kódoló új DNS-szekvenciákra vonatkozik. Az AHAS-enzim egy kritikus enzim, amelyet számos növény és a mikroorganizmusok széles köre termel. A normális AHAS-funkciót az imidazolinonherbicidek gátolják, azonban a mutáns DNSszekvenciák által kódolt új AHAS-enzimek katalitikusán normálisan funkcionálnak még imidazolinonherbicidek jelenlétében is, ezért az azokat tartalmazó növényeknek vagy mikroorganizmusoknak herbicidek elleni rezisztenciát biztosítanak.

Az új DNS-szekvenciák kukoricából származnak, és a normális AHAS-szekvencia 621-es helyzetben tartalmaznak aminosavszubsztitúciót. Ez a szubsztitúció az AHAS-génszekvenciában teljesen fúnkcióképes enzimet eredményez, azonban az enzimet specifikusan rezisztenssé teszi különféle imidazolinonherbicidek gátlásával szemben. A fenti variáns szekvenciák segítségével különféle haszonnövényekbe imidazolinonherbicid elleni rezisztencia vihető be, ezenkívül ezek a szekvenciák más típusú genetikus transzformációs kísérletekben új, szelektív markerekként is alkalmazhatók.

A herbicidek mezőgazdasági alkalmazása napjainkban igen elterjedt. Noha számos olyan vegyület van, amely hatásosan elpusztítja a gyomokat, nem minden herbicid képes csak a nemkívánatos növények szelektív pusztítására a kultúrnövényekkel szemben úgy, hogy az állatokra nézve nem toxikus. Gyakran be kell érni olyan vegyületekkel, amelyek egyszerűen csak kevésbé toxikusok a kultúrnövényekre nézve, mint a gyomokra. A fenti probléma leküzdésére a mezőgazdasági kutatások fő célpontja a herbicidekkel szemben rezisztens kultúrnövények kifejlesztése lett.

A herbicidrezisztencia kifejlesztésének fő szempontja a herbicid hatáshelyének felderítése, azután az érintett biokémiai útvonal olyan módosítása a kultúrnövényben, amellyel az inhibitor hatást megkerüljük, mialatt a növény megtartja normális biológiai funkcióit. A herbicidek biokémiai hatásmechanizmusának felderítését legkorábban az imidazolinonok, a szulfonil-karbamidok és a triazolo-pirimidinek mint eltérő szerkezetű herbicid vegyületek körében végezték el. Napjainkban már ismeretes, hogy ezek a herbicidek mind a növényi növekedéshez szükséges alapvető enzim, az acetohidroxisav-szintetáz (AHAS, amelyet acetolaktát-szintetáznak vagy ALS-nek is neveznek) működésének megzavarásával gátolják a növény növekedését. [Shaner és munkatársai: Plánt Physiol. 76, 545-546 (1984); és 4 761 373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Az AHAS az izoleucin, leucin és valin aminosavak szintéziséhez szükséges.

Az AHAS-enzim ismert módon magasabb rendű növényekben, valamint számos mikroorganizmusban, például az élesztő Saccharomyces cerevisiae-ben és az enterobaktériumok közül az Escherichia coliban és Salmonella typhimuriumban is jelen van. A normális AHAS termelődésének genetikai alapja a fenti fajok közül számosban már jól ismert. így például mind az E. coliban, mind az S. typhimuriumban az AHAS-nak három izoenzimje létezik, ezek közül kettő érzékeny herbicidekre, míg a harmadik nem. A fenti izoenzimek mindegyike egy nagy és egy kis protein alegységet tartalmaz; és a géntérképen az IlvIH, IlvGM és IlvBN operonokhoz kötődik. Élesztőben az egyetlen AHAS izoenzim az ILv2 fókuszban található. Mindegyik esetben azonosították a szenzitív és rezisztens formákat, és meghatározták a különféle allélek szekvenciáit. [Friden és munkatársai: Nucl. Acid Rés. 13, 3979-3993 (1985); Lawther és munkatársai: PNAS USA 78, 922-928 (1982); Squires és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 811, 5299-5313 (1983); Wek és munkatársai: Nucl. Acis Rés. 13, 4011-4027 (1985); Falco és Dumas: Genetics 109, 21-35 (1985); Falco és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 13,4011-4027(1985)].

Dohányban az AHAS-fúnkciót két, egymással nem összekapcsolódó gén, a SuRA és SuRB kódolja. Alapvető azonosság van a két gén között az érett proteinben, mind az aminosavak, mind a nukleotidok szintjén, noha az N-terminális, feltehetően tranzitrégió lényegesebben különbözik [Lee és munkatársai: EMBO J., 7, 1241-1248 (1988)]. Az Arabidopsis viszont egyetlen AHAS-génnel rendelkezik, amelyet szintén teljes egészében szekvenáltak [Mazur és munkatársai: Plánt Physiol. 85, 1110-1117 (1987)]. A magasabb rendű növények AHAS-génjei szekvenciájának összehasonlítása a szekvencia bizonyos régióinak nagyfokú konzerválására utal, legalább tíz konzervált szekvenciarégió van. Korábban feltételezték, hogy ezek a konzervált régiók kritikusak az enzim funkciója szempontjából, és hogy a funkció megtartása az alapvető szekvencia konzerválásától függ.

Újabban kimutatták (5 013 659 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), hogy a herbicidrezisztenciát mutató mutánsok a fenti konzervált régiók legalább egyikében, vagy többen is legalább egy aminosavmutációt hordoznak. Közelebbről, az AHAS proteinszekvenciában ezeken a specifikus helyeken a vad típusú aminosavak bizonyos aminosavval való szubsztitúciójáról kimutatták, hogy azt a növény tolerálja, és a fenti mutációt tartalmazó növény valóban herbicidrezisztenciát mutat, miközben a katalitikus funkció megmarad. A fenti irodalmi helyen leirt mutációk vagy keresztrezisztenciát kódolnak imidazolinonokra és szulfonil-karbamidokra, vagy specifikus szulfonil-karbamid-rezisztenciát kódolnak, de imidazolinonspecifikus mutációkat nem ismertetnek. Ezek a mutációk a vizsgálatok szerint a dohánynak mind a SuRA, mind a SuRB fókuszaiban végbemennek, hasonló mutációkat kimutattak az Arabidopsisban és élesztőben is.

Imidazolinonspecifikus rezisztenciát máshol is számos növényben kimutattak. A 4 761 373 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban növényekben a herbicidrezisztencia alapjaként általánosan ismertetnek egy megváltozott AHAS-t, és specifikusan ismertetnek bizonyos imidazolinonrezisztens kukoricavonalakat. Haughn és munkatársai [Mól. Gén. Génét. 211, 266-271 (1988)] ismertetik egy hasonló fenotípus megjelenését Arabidopsisban. Sathasivan és munkatársai [Nucl. Acid Rés. 18, 2188 (1990)] felismerték, hogy az imidazolinonspecifikus rezisztencia Arabidopsisban

HU 218 108 Β a normális AHAS-szekvencia 653. helyzetében lévő mutáción alapul. A találmány értelmében izoláltuk az egyszikűekben imidazolinonspecifikus rezisztenciát kódoló gént, és kimutattuk, hogy az egyszikű vad típusú AHAS aminosavszekvencia egyetlen aminosavának szubsztitúciójához kapcsolódik.

A találmány tehát új nukleinsavszekvenciákra vonatkozik, amelyek imidazolinonherbicidekkel szemben nem érzékeny, működőképes egyszikű AHAS-enzimeket kódolnak. A találmány szerinti szekvenciák a kukorica AHAS-szekvenciájának 621. helyzetében lévő szerin aminosavat, vagy egy másik egyszikű szekvenciában az ennek megfelelő helyzetben lévő aminosavat kódoló kodonban tartalmaznak mutációt. Egyéb egyszikűek - például a búza - szintén ismert módon imidazolinon-specifikus mutációkat mutatnak (például az ATCC 40994-97 számú fajták). Kukoricában a vad típusú szekvencia szerint tartalmaz ebben a helyzetben. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint szerin helyett aszparagin van ebben a helyzetben, de a szerint azonos módon helyettesítheti például az aszparaginsav, glutaminsav, glutamin és triptofán is. Annak ellenére, hogy a találmány szerinti szekvenciák eredetileg egyszikűekből származnak, az új szekvenciák bármely típusú növényben alkalmazhatók imidazolinon-rezisztens sejtek előállítására. A fenti eljárások értelmében a kívánt növényi sejteket egy vagy több, találmány szerinti módosított szekvenciával transzformáljuk. A mutagenezist ezenkívül olyan növényi sejtek vagy magok mutánsainak előállítására is alkalmazhatjuk, amelyek imidazolinonnal szemben nem érzékeny AHAS-t kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaznak. Szövettenyészetből izolált mutáns növényi sejtek esetében az imidazolinonnal szemben rezisztens vagy nem érzékeny tulajdonsággal rendelkező növényeket azután regeneráljuk. A találmány ennek megfelelően olyan növényi sejtekre, baktériumsejtekre, gombasejtekre, növényi szövettenyészetekre, felnőtt növényekre és növényi magvakra is vonatkozik, amelyek egy mutáns nukleinsavszekvenciával rendelkeznek, és amelyek imidazolinon-rezisztens, működőképes AHAS-enzimeket expresszálnak.

Az ilyen új, herbicidrezisztens növények a növénytermesztés új módszereit jelentik imidazolinonok jelenlétében. A nem rezisztens növények ültetése helyett a művelendő területeket a találmány szerinti mutáns szekvenciákkal transzformált, vagy a találmány szerinti mutációval előállított rezisztens növényekkel telepíthetjük be, majd a termőterületet szokásos módon imidazolinonherbicidekkel kezelhetjük anélkül, hogy ez a kultúrnövényekben bármiféle károsodást okozna.

A találmány szerinti mutáns nukleinsavak új szelektálható markereket is jelentenek, amelyek transzformációs kísérletekben alkalmazhatók. A rezisztens AHAS-t kódoló nukleinsavszekvenciát egy másik, kívánt génhez kötjük a gazdasejtbe való átvitel előtt, és a teljes konstruktummal transzformáljuk a gazdasejtet. A feltehetőleg transzformált sejteket ezután a herbicid inhibitor mennyiségének jelenlétében tenyésztjük, a túlélő sejtek nagy valószínűséggel sikeresen megszerezték a kívánt másik gént is. Úgy is eljárhatunk, hogy a rezisztens

AHAS-gént a kérdéses génnel egy független plazmidban kotranszformáljuk, így az összes transzformált sejtek mintegy 50%-a várhatólag rendelkezik mind a két génnel.

A leírásban alkalmazott definíciókat az alábbiak szerint értelmezzük. Funkcionális vagy normális AHASenzim az az enzim, amely képes az izoleucin, leucin és valin mint eszenciális aminosav biokémiai szintézisének első lépését katalizálni. Vad típusú AHAS-szekvencia az a szekvencia, amely egy adott faj imidazolinonnal szemben érzékeny tagjában jelen van. Rezisztens növény az a mutáns, de fúnkcionális AHAS-enzimet termelő növény, amely képes elérni az érettséget, hogyha imidazolinon egyébként inhibitor koncentrációjának jelenlétében tenyésztjük. Rezisztens alatt a leírásban a toleráns növényeket értjük, azaz azokat a növényeket, amelyek fenotípusosan reagálnak az imidazolinonra, de ez a reakció nem letális.

A leírás ábráit az alábbiakban ismertetjük röviden.

1. ábra: AHAS-enzim aktivitása 10 napos kukoricamagoncokban (A619 vagy XI12 kukoricavonalak) imazetapir (Pursuit^R, ábra A része) vagy klór-szulfúron (OustR, ábra B része) jelenlétében. Az AHAS-aktivitás herbicidrezisztenciáját az inhibitor távollétében mért AHAS-aktivitás százalékaként fejezzük ki. A kísérletek közötti standard hiba 10%.

2. ábra: EMBL fág genomiális kiónok Southern biot analízise. A 12-1A (W22-ből), 12-7A, 18-8A, 12-11 és 12-17A (XI12-ből) fágokat Xbal-gyel vagy Sall-gyel emésztjük, 1%-os agarózgélen szétválasztjuk, nitrocellulóz-szűrőre visszük és AHAS cDNSfragmenssel mint próbával hibridizáljuk.

3. ábra: XI12, XA17, QJ22, A188 és B73 kukoricavonalakból származó genomiális DNS Southern biot analízise. A DNS-t Xbal-gyel emésztjük, 1%-os agarózgélen szétválasztjuk, nitro-cellulóz-szűrőre visszük, és próbaként AHAS cDNS-fragmenssel hibridizáljuk.

4. ábra: pCD8A plazmid restrikciós térképe. Az

XI 12-ből származó mutáns AHAS-gént 8 kb hosszúságú PstI fragmensként szubklónozzuk pKS(+) vektorba. Az AHAS-gén helyét és orientációját nyíllal jelöljük. A PstI, Xhol, HindlII, Xbal és Clal restrikciós helyeket szimbólumokkal jelöljük.

5. ábra: W22/4-4, B73/10-4 és XI12/8A AHASklónok nemkódoló szálának (A) és a kettős szálú DNS-szekvenciájának (B) nukleotid szekvenáló gél képe a 614-633. aminosavat kódoló régióban. A citozin - > timidin átmenet helyét egy nyíl jelöli.

6. ábra: az XI12/8A mutáns AHAS-gén nukleotidszekvenciája és az abból következtetett aminosavszekvencia.

7. ábra: az XI12/8A, B73/7-4 és W22/1A als2 gének nukleotidszekvenciájának összehasonlí3

HU 218 108 Β tása. (*) jelzi a mutációt okozó báziscserét a 621. helyzetben, (#) a B73/7-4 szekvenciától való eltéréseket és (>) a néma változásokat.

8. ábra: az XI12/8A, B73/7-4 és W22/1A als2 gének aminosavszekvenciáinak összehasonlítása. (*) jelzi a 621. helyzetben lévő mutációt, (#) jelzi a B73/7-4 szekvenciától való eltérést és (>) jelzi a néma mutációkat.

A leírást az alábbiakban részletesen ismertetjük.

A találmány szerinti gén XI12 kukoricavonalból izolálható (amelynek magját az American Type Culture Collectionnél helyeztük letétbe, letéti száma: 75051), és a pXI12/8A plazmidba van beillesztve (amelyet az American Type Culture Collectionnél 68643 számon helyeztünk letétbe). A találmány szerinti gén bármely egyéb, specifikusan imidazolinonherbicidre rezisztens mutánsból is izolálható, például a QJ22 kukoricavonalból (az American Type Culture Collectionnél 40129 számon letétbe helyezve, sejttenyészet formájában) vagy különféle búzanövényekből (amelyek magját az American Type Culture Collectionnél 40994, 40995,40996 és 40997 számon helyeztük letétbe). A genomiális DNS-könyvtárat például EMBL-3 fágban állítjuk elő az imidazolinon-rezisztens mutánsok egyikéből kapott DNS-sel, előnyösen egy olyan mutánssal, amely a rezisztencia jellemzőre nézve homozigóta, és a vad típusú AHAS-szekvencia egészét vagy annak egy részét tartalmazó nukleinsavpróbával szűrjük.

A kukoricában az AHAS-gén két helyen, az alsl és als2 lókuszon [Burr és Burr, Trends in Genetics 7, 5561 (1991)] található; a homológia a két lókusz között nukleotidszinten 95%. Az XI 12-ben a mutáció az als2 lókuszhoz kötődik az 5-ös kromoszómán, míg a nemmutáns gén az alsl lókuszon van a 4-es kromoszómán [Newhouse és munkatársai: Imidazolinone-resistant crops, in The Imidazolinone Herbicides (szerk. Shaner and O’Connor) CRC Press, Boca Raton, FL, nyomdában]. Southern biot analízissel kimutathatók a mutáns als2 gént tartalmazó bizonyos kiónok, és a nemmutáns alsl gént tartalmazó bizonyos kiónok. Mindkét típust szekvenálóvektorokba szubklónozzuk, és didezoxi szekvenáló módszer alkalmazásával szekvenáljuk.

A vad típusú és mutáns AHAS-gének szekvenálása és összehasonlítása eredményeként megállapítható, hogy egyetlen nukleotid különbözik csak a 621. helyzetű aminosavat kódoló kodonban (5. ábra). Közelebbről, a vad típusban szerint kódoló AGT kodon változik a mutáns AHAS-ban aszparagint kódoló ΑΛΤ-re (8. ábra). A mutáns AHAS-gén egyébként hasonló a vad típusú génhez, amely egy 638 aminosavból álló proteint kódol, ezekből az első 40 egy átmeneti peptidet kódol, amely minden bizonnyal a kloroplasztba való in vivő transzport során elhasítódik. Az XI 12-ből származó alsl nem-mutáns gén szekvenciája láthatólag azonos a B73-ból származó alsl génnel.

A találmány szerinti mutáns gének imidazolinonherbicidekkel szembeni rezisztenciát biztosítanak, de szulfonil-karbamid herbicidekkel szembeni rezisztenciát nem. Azok a herbicidek, amelyekkel szemben a találmány szerinti gén rezisztenciát biztosít, például a 4 188 487; 4 201 565; 4 221 586; 4 297 128; 4 554 013; 4 608 079; 4 638 068; 4 747 301; 4 650 514; 4 698 092; 4 701 208; 4 709 036; 4 752 323; 4 722 311 és 4 798 619 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban vannak ismertetve.

Szakember számára magától értetődő, hogy a 6. ábrán ismertetett nukleinsavszekvencia nem az egyetlen olyan szekvencia, amely imidazolinon-specifikus rezisztencia kialakítására alkalmazható. Azok a nukleinsavszekvenciák is a találmány tárgykörébe tartoznak, amelyek egy azonos proteint kódolnak, de amelyekben a genetikus kód degeneráltságának következtében a nukleotidszekvencia eltérő. A találmány azon génekre is vonatkozik, amelyek olyan AHAS szekvenciákat kódolnak, amelyekben a fenti mutáció jelen van, de amelyek egy vagy több néma aminosavcserét is kódolnak a molekula azon részeiben, amelyek nem játszanak szerepet a rezisztenciában vagy katalitikus funkcióban. A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá az egyéb imidazolinonrezisztens egyszikűekből származó génszekvenciák is, amelyek a szekvenciák megfelelő régióiban tartalmaznak mutációt.

így például a találmány tárgykörébe tartoznak azok a változtatások is egy génszekvenciában, amelyek kémiailag ekvivalens aminosavak beépülését eredményezik egy adott helyre, így egy hidrofób aminosav, az alanin kodonja magától értetődően helyettesíthető egy másik hidrofób aminosavat, például glicint kódoló kodonnal, vagy egy még inkább hidrofób aminosavat, például valint, leucint vagy izoleucint kódoló kodonnal. Hasonlóképpen várhatóan biológiailag ekvivalens termékhez vezetnek azok a változtatások is, amelyek egy negatív töltésű maradék másik negatív töltésű maradékkal való helyettesítését eredményezik, például aszparaginsav cseréjét glutaminsavra, vagy egy pozitív töltésű maradék másik pozitív töltésű maradékkal való helyettesítését, például lizin cseréjét argininra. A találmány kiméra génekre is vonatkozik, amelyekben a kukorica AHAS-gén szubsztituált része más fajokból származó normális AHAS-gének változatlan részeivel vannak kombinálva. Ezért a leírásban, ahol tipikusan imidazolinonnal szemben rezisztens kukorica AHAS-gént említünk, ezek alatt értjük úgy a 6. ábra szerinti szekvenciát, mint a fent említett módokon módosított szekvenciákat.

A találmány szerinti izolált AHAS DNS-szekvenciákat a kívánt kultúrnövények transzformálására alkalmazhatjuk, ezáltal azoknak imidazolinonnal szembeni rezisztenciát biztosítunk. A magasabb rendű növények exogén DNS-sel való közvetlen vagy közvetett transzformálására jelenleg számos különféle technika ismert. A találmány tárgykörébe tartoznak mindazok a módszerek, amelyekkel az új szekvencia a gazda genomjába beépíthető úgy, hogy utódjaiban stabilan öröklődik. Az imidazolinonspecifíkus rezisztencia jellemző egyetlen domináns nukleáris génként öröklődik. Az imidazolinonrezisztencia szintje növekedik, ha a gén homozigóta állapotban van jelen, ilyen kukoricanövények például mintegy 1000-szeres rezisztenciaszinttel rendel4

HU 218 108 Β keznek a nemrezisztens növényekhez képest. A jellemzőre nézve heterozigóta növények azonban mintegy 50-500-szoros rezisztenciával rendelkeznek a nemrezisztens növényekhez képest.

A növényi sejtek transzformálását vektorok alkalmazásával végezhetjük. A transzformálás kivitelezésére szokásosan alkalmazott módszer szerint Agrobacterium tumefacienst használunk idegen gén bevezetésére növényi célsejtbe. így például a mutáns AHAS-szekvenciát a Ti-plazmid T-DNS határolószekvenciáit tartalmazó plazmidvektorba inszertáljuk. A plazmidot ezután E. coliba transzformáljuk. Az így kapott törzs, az AHAS-t tartalmazó T-DNS-szekvenciák növényi célkromoszómákba való hatékony bejuttatásához szükséges virulenciaftjnkciókat tartalmazó gyengített Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacterium törzs és egy másik, az AHAS-konstruktum E. coliból Agrobacteriumba való átviteléhez szükséges szekvenciákkal rendelkező plazmidot tartalmazó E. coli törzs között háromszülős párosítást hajtunk végre. A levélkorongok fertőzésére a növények transzformálásához szükséges szekvenciákat tartalmazó rekombináns Agrobacterium törzset alkalmazzuk. A korongokat szelekciós tápközegen neveljük, és a sikeresen transzformált regeneránsokat azonosítjuk. Az így nyert növények rezisztensek a herbicid hatásával szemben, ha annak jelenlétében tenyésztjük azokat. Az exogén DNS bevitelére növényi vírusok is megfelelő eszközt jelenthetnek.

A növényi sejtek direkt felvétele szintén alkalmazható. Jellegzetes módon a célnövény protoplasztjait tenyészetbe helyezzük a beviendő DNS és egy olyan szer jelenlétében, amely elősegíti a protoplasztok általi DNS-felvételt. A fenti célra alkalmazható szerek például a polietilénglikol és a kalcium-foszfát.

A DNS-felvételt elektroporálással is lehet stimulálni. Ezen eljárás szerint egy elektromos pulzus alkalmazásával átmenetileg pórusokat nyitunk a protoplaszt sejtmembránon, és a körülvevő oldatban lévő DNS ezután a pórusokon keresztül bejut a sejtbe. Hasonlóképpen mikroinjektálást is alkalmazhatunk a DNS közvetlen bejuttatására a sejtbe, előnyösen közvetlenül a sejt magjába.

A fent említett módszerek mindegyikében a transzformálás a növényi sejt tenyészetében megy végbe. A transzformálás lejátszódása után a növényi sejtet teljes növénnyé kell regenerálni. A kalluszokból vagy protoplasztokból az érett növény regenerálására vonatkozó módszerek jól ismertek számos különböző faj esetében (lásd például Handbook of Plánt Cell Culture, 1-5. kötet, 1983-1989 McMillan, N.Y.). Ily módon abban az esetben, ha a transzformálás már végbement, szakember kötelező tudásához tartozik az érett növény regenerálása a transzformált növényi sejtekből.

Újabban már ismertek olyan módszerek is, amelyek szerint nem kell szükségszerűen izolált sejteket, és ezután növényregenerálási technikákat alkalmazni a transzformálás elérésére. Ezeket általában ballisztikus vagy részecskegyorsító módszereknek nevezik, amelyekben DNS-sel bevont fémrészecskéket juttatnak be a növényi sejtekbe, vagy puskaportöltettel [Klein és munkatársai: Natúré 327, 70-73 (1987)], vagy elektromos kisüléssel (270 356 számú európai szabadalmi leírás). Ily módon a tenyészetben lévő növényi sejteket vagy növény reprodukálására szolgáló szerveket vagy sejteket - például pollent - stabilan transzformálhatjuk a kérdéses DNS-szekvenciával.

Bizonyos kétszikű és egyszikű növények esetén a transzformálás előnyös módszere a DNS direkt felvétele. így például kukoricában a tenyésztett sejtek sejtfalát egy vagy több sejtfalat emésztő enzimet, például cellulázt, hemicellulázt vagy pektinázt tartalmazó pufferben emésztjük, és ily módon életképes protoplasztokat izolálunk. Az enzimek eltávolítására a protoplasztokat néhányszor mossuk, majd a kérdéses gént tartalmazó plazmid vektorral összekeverjük. A sejteket vagy PEG-lal (például 20%-os PEG 4000), vagy elektroporációval transzformálhatjuk. A protoplasztokat nitro-cellulózszűrőre helyezzük, és táptenyészetként szolgáló beágyazott kukoricasejteket tartalmazó tápközegen tenyésztjük. 2-4 hét múlva a nitro-cellulóz-szűrőn lévő tenyészeteket mintegy 0,32 pmol/liter imidazolinont tartalmazó közegbe helyezzük, és 1 - 2 hónapon keresztül ebben a közegben tartjuk. A növényi sejteket tartalmazó nitro-cellulóz-szűrőket herbicideket és tápanyagsejteket tartalmazó friss közegbe visszük át hetenként. A nem transzformált sejtek növekedése megszűnik, és néhány hét után elpusztulnak.

A találmány szerinti megoldás nyilvánvalóan bármilyen típusú, mind egyszikű, mind kétszikű növény transzformálására alkalmazható. A herbiciddel szembeni rezisztencia transzformálását például az alábbi kultúrnövények esetében végezhetjük: kukorica, búza, rizs, köles, zab, árpa, cirok, napraforgó, édesburgonya, lucerna, cukorrépa, Brassica fajták, paradicsom, bors, szójabab, dohány, dinnye, sütőtök, burgonya, földimogyoró, borsó, gyapot vagy kakaó. Az új szekvenciákat dísznövényfajok, például rózsa, és fafajták, például fenyő és nyárfa transzformálására is alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti új szekvenciák növénygenetikai kutatásokban szelektálható markerként is használhatók. így például a növények transzformálásánál az imidazolinonrezisztenciát kódoló szekvenciákat egy kívánt génhez köthetjük, amelyet imidazonilonnal szemben érzékeny célnövénysejtek transzformálására akarunk alkalmazni. Az imidazolinonrezisztenciát biztosító szekvenciát és a kérdéses gént egyaránt tartalmazó konstruktumot a növényi sejtbe bevisszük, és a növényi sejteket ez után az imidazolinon inhibitor mennyiségének jelenlétében tenyésztjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a kérdéses második gént egy különálló plazmidban kotranszformáljuk a gazdasejtekbe. A kezelést túlélő növényi sejtek feltehetően megszerezték a rezisztenciagént és a kérdéses gént egyaránt, és csak a transzformánsok élik túl a herbiciddel végzett szelekciós eljárást. A sikeres transzformálás megerősítését és a két gén expresszálását a genomiális DNS Southern biot hibridizációjával, PCR-technikával vagy a gének fenotípusos expressziójának megfigyelésével erősíthetjük meg.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal ismertetjük a korlátozás szándéka nélkül.

HU 218 108 Β

1. példa

Teljes növény herbicidrezisztenciájának megerősítése XI12-ben

Az XI12 növényeket 10 napos koruktól a V3 leveles fejlődési szakaszig [4-5 levél, amelyek közül háromnak látható levélhártyája (ligulája) van] kezeljük a herbiciddel. Az imazetapirt 2000, 500, 250, 125 és 62,5 g/ha dózisban alkalmazzuk. A klór-szulfuront 32, 16, 8,4 és 2 g/ha dózisban alkalmazzuk. A növényeket posztemergens módon 400 1/ha permettérfogattal kezeljük. Permetezés után a növényeket üvegházba helyezzük további megfigyelés céljából.

XI12 növények nem reagáltak az imazetapir kezelésre egyetlen koncentrációban sem, azonban nem figyeltünk meg fokozott rezisztenciát klór-szulfuronnal szemben. így az XI12 szelektív rezisztenciát mutat imidazolinonnal szemben a teljes növény szintjén (lásd 1. ábra).

Azt is kimutattuk, hogy az XI 12-ben a rezisztencia egy sejtmagi gén egyetlen domináns alléljeként öröklődik. Heterozigóta rezisztens XI 12-t önbeporoztunk, és a beltenyésztett utódok a sejtmaggén egyetlen domináns alléljére várt 3 rezisztens: 1 érzékeny arányban váltak szét. Ebben a vizsgálatban a szegregálódó magoncokat posztemergens módon halálos dózisú imazetapirral (125 vagy 250 g/ha) permeteztük, a fent ismertetett permetezési eljárás szerint, hogy megállapítsuk a rezisztencia szétválását.

2. példa

AHAS-extrakció

Az XI12 magjait 80 °C nappali/éjszakai hőmérsékleten és 15 órás megvilágítási periódust biztosító üvegházban vetjük a talajba. A növényeket az ültetés után 2 héttel begyűjtjük. Az AHAS extrakciójára a hajtás bazális részét használjuk. 5 g szövetet cseppfolyós nitrogénben elporítunk, majd AHAS vizsgálati pufferben homogenizáljuk, amely 10 ml/1 piruvátot, 5 mmol/1 magnézium-kloridot, 5 mmol/1 EDTA-t, 100 pmol/l FAD-ot (flavin-adenin-dinukleotidot), 1 mmol/1 valint, 1 mmol/1 leucint, 10% glicerint és 10 mmol/1 ciszteint tartalmazó 100 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfátpufferből (pH 7,5) áll. A homogenizátumot 10 000 fordulat/perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáljuk, a felülúszó 3 ml-ét felvisszük egy ekvilibrált BioRad Econo-Desalting oszlopra (10 DG) és 4 ml AHAS vizsgálati pufferrel eluáljuk.

Az AHAS-aktivitást az acetolaktát termék meghatározásával mérjük, miután sav jelenlétében dekarboxilezéssel acetoinná alakítottuk. A standard reakcióelegy az enzimet 100 mmol/1 nátrium-piruvátot, 10 mmol/1 magnézium-kloridot, 1 mmol/1 tiamin-pirofoszfátot, 10 pmol/l FAD-ot és a különböző inhibitorok megfelelő koncentrációit tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-pufferben (pH 7,0) tartalmazza. Ezt az elegyet 37 °C-on 1 -3 órán keresztül inkubáljuk a kísérlettől függően. Az inkubációs periódus végén a reakciót kénsav hozzáadásával állítjuk le, amellyel a reakcióelegyben 0,85% kénsav végkoncentrációt állítunk be. A reakcióterméket 60 °C-on 15 percen keresztül dekarboxilezzük. A képződött acetoint 0,17% kreatinnal és 1,7% l-naftol/4 n nátrium-hidroxiddal végzett inkubálással határozzuk meg. A képződött színes komplex abszorpcióját 520 nm-en mérjük.

A B73, A619 vagy egyéb vad típusú kukoricavonalból származó AHAS-aktivitás erősen érzékeny az imazetapir (PURSUIT^R) általi gátlásra, az I₅₀ koncentráció 1 pmol/1 (lásd 1. ábra). A fenti eredményekkel szemben az XI12 70-80%-os enzimaktivitást mutat még a legmagasabb (100 pmol/1) PURSUITR vagy ARSENAL^R(imazepir) koncentrációknál is, és 70% aktivitást SCEPTERR (imazekin) jelenlétében. Ezek az eredmények százszoros növekedést mutatnak XII2 AHAS-aktivitásának imazetapirral szembeni tűrőképességében az A619-ből származó in vitro AHAS-aktivitással összehasonlítva. A két vonalból származó AHAS-aktivitások érzékenysége szulfonil-karbamidokkal szemben eltérő képet mutat. OUST^R (szulfometuron-metil) 100 nmol/1 koncentrációjának jelenlétében az XI12 AHAS-aktivitása csak 15-20%. Az A619 AHAS-aktivitása OUST^R jelenlétében 5-10% és PURSUITR jelenlétében 15-20% (lásd 1. ábra).

3. példa

X112 AHAS-gének klónozása

Imidazolinonrezisztens kukorica szövettenyészet vonalból származó XI12 mutáns magjait elvetjük; az ezekből kapott növények láthatólag a mutáns AHAS fenotípusra szegregálódnak. Homozigótarezisztens maganyag előállítása céljából az XI12 mutáns növények populációját önbeporozzuk. Három egymást követő tenyésztési szezon során herbicidrezisztencia szempontjából szelektálva, a kapott magok a mutáns AHAS-génre nézve homozigóták. A homozigóta magokat összegyűjtjük s az AHAS-gén izolálására alkalmazott magoncok nevelésére használjuk.

A DNS-t a homozigóta XI12 7 napos elszíntelenedett magoncaiból extraháljuk. 60 g növényi szövetet cseppfolyós nitrogénben porítunk, és 108 ml DNSextrakciós puffer [1,4 mol/1 nátrium-klorid, 2,0% Ctab (hexadecil-trimetil-ammónium-bromid), 100 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 20 mmol/1 EDTA, 2% merkaptoetanol] és 54 ml víz elegyébe átvisszük. 50-60 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk a szuszpenziót, majd azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. A DNS-t azonos mennyiségű precipitációs puffer (1% Ctab, 50 mmol/1 Tris-HCl pH 8,0, 10 mmol/1 EDTA) hozzáadásával kicsapjuk. A genomiális DNS tisztítására nagy fordulatszámú centrifugálást végzünk 6,6 mol/1 céziumkloridban és etidium-bromidban (Ti80 rotor, 50 000 fordulat/perc, 20 °C, 24 óra). A tisztított DNS-t sóval telített butanollal extraháljuk, és 25 órán keresztül dializáljuk 1 liter dialízispufferrel (10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0,1 mmol/1 EDTA, 0,1 mol/1 nátrium-klorid) szemben, háromszori cserével. Az XI12 genomiális DNS koncentrációja spektrofotometriás meghatározás szerint 310 mg/ml. A hozam 0,93 mg.

Az XII2 genomiális DNS-t alkalmazzuk genomiális könyvtár előállítására EMBL-3 fágban. A DNS-t részlegesen emésztjük Mbol-gyel, és a fragmenseket szacharózgradiensen választjuk szét 8 és 22 kb közötti

HU 218 108 Β méretekre az EMBL-3 BamHI helyére való klónozás előtt. 2,1 χ 10⁶ egymástól független kiónt kapunk, majd a könyvtárat egyszer megsokszorozzuk. A könyvtár litere 9 x 10>°pfú/ml.

Az XI12 könyvtár analíziséhez próbák előállítására egy W22 (vad típus) cDNS-könyvtárat lambda-gtl 1ben (forgalmazza a Clontech Inc., CA) szűrünk egy 800 nukleotid hosszúságú BamHI próbával, amelyet Arabidopsis AHAS genomiális klónból izoláltunk. A fágokat 50 000 pfu/15 cm lemez sűrűséggel szélesztjük, nitro-cellulóz-szűrőkre visszük, és 0,2% SDS-t tartalmazó 6 x SSC-vel két órán keresztül előhibridizáljuk, majd az Arabidopsis AHAS-próbával hibridizáljuk 0,2% SDS-t tartalmazó 6 x SSC-ben, 1 éjszakán keresztül. Egy pozitív fágot azonosítunk, amelyet tovább tisztítunk, és egy 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmens szubklónozására használjuk. Az 1,1 kb hosszúságú EcoRI fragmenst pGemA-4-be szubklónozzuk, és próbaként használjuk az XI12 AHAS-gének azonosítására.

Az XI12 genomiális könyvtárat 12 db 15 cm-es lemezre szélesztjük 50 000 pfú/lemez koncentrációban és W22 AHAS cDNS próbával szüljük. A szűrőket 2 órán keresztül előhibridizáljuk, majd 1 éjszakán keresztül hibridizáljuk ChurcH pufferben (0,5 mol/1 nátrium-foszfát, 1 mmol/1 EDTA, 1% BSA, 7% SDS) 65 °C-on, és 65 °C-on mossuk, 0,2% SDS-t tartalmazó 2xSSC-vel, és 0,2% SDS-t tartalmazó 0,3xSSC-vel. Összesen 7,5xl0⁵ megvizsgált telepből 12 pozitív plakkot kapunk, és 5 pozitív kiónt tovább tisztítunk és izolálunk Chisholm [BioTechniques 7, 21-23 (1989)] módszerével. A Southern biot analízis (2. ábra) azt mutatja, hogy a fágklónok két típusú AHAS kiónt képviselnek, az 1. típusú kiónok egy nagy Xbal fragmenst tartalmaznak (>6,5 kb), amely az AHAS cDNS próbával hibridizál, és a 2. típusú kiónok két, 2,7 és 3,7 kb hosszúságú Xbal fragmenst tartalmaznak, amelyek az AHAS cDNS próbával hibridizálnak. Az XI12 DNS genomiális Southern blotja azt bizonyítja, hogy a genomiális DNS emésztésével kapott Xbal fragmensek és az AHAS cDNS próbával való hibridizálással kapott Xbal fragmensek megfelelnek a XI12 fágklónokban azonosított Xbal ffagmenseknek (lásd 3. ábra). A restrikciós emésztés és Southern biot analízis azt is bizonyítja, hogy 5 AHAS-klón közül egy klón képviseli az als2 mutáns gént és 4 képviseli az alsl gént.

Az 5-ös kromoszómán elhelyezkedő mutáns lókusznak (12/8A klón) és a 4-es kromoszómán elhelyezkedő nemmutáns lókusznak (12/17A klón) megfelelő AHAS-géneket szubklónozzuk PstI fragmensként (12/8A klón) vagy Xbal fragmensként (12/17A) a pBluescript II KSml3(+) szekvenáló vektorba (pks+; Stratagene). A 12/17A fágból kapott 2,7 kb és 3,7 kb Xbal fragmensek közül mind a kettő egy teljes AHAS-gén kópiát tartalmaz, amelyeket azonosítottunk. A fragmensek szekvenciáját didezoxiszekvenálással (Pharmacia T7 szekvenálókészlet) határozzuk meg, az AHAS kódolószekvenciájával komplementer primereket alkalmazva.

A DNS extrahálását, a genomiális könyvtár klónozását és a könyvtár szűrővizsgálatát az XI12 genomiális DNS-re ismertetett módszerekkel végezzük. A B73 AHAS-géneket Xbal fragmensként szubklónozzuk a pKS-ι- szekvenálóvektorba és szekvenáljuk. A szekvenciát didezoxiszekvenálással határozzuk meg, az AHAS kódolószekvenciájával komplementer primerek alkalmazásával, az XI12 AHAS-génekre leírtak szerint.

Egy W22 genomiális könyvtárat EMBL3-ban (forgalmazza a Clontech Inc., CA) szűrünk. A fágokat 50 000 pfú/17,8 cm lemez sűrűséggel szélesztjük, nitro-cellulóz-szűrőkre visszük, és a W22 AHAS cDNS próbával hibridizáljuk a fent leírtak szerint (előhibridizálási és hibridizálási körülmények: 6xSSC, 0,5% SDS, 1 xDenhard-féle puffer, 100 mg/ml borjú thymus DNS, 65 °C; mosási körülmények: 3xSSC, 0,2% SDS 2 órán keresztül 65 °C-on és 0,3xSSC, 0,2% SDS 2 órán keresztül). Két pozitív fágot (12/1A és 12/4-4) azonosítunk és tovább tisztítunk.

A 12/1A W22 genomiális kiónt két 0,78 kb hosszúságú (pGemA-4) és 3,0 kb hosszúságú (pGemA-14; Promega) Sáli fragmensként szubklónozzuk a pGemA2 vektorba, és 6,5 kb Xbal fragmensként a pKS+ vektorba (pCD200). A W22 AHAS-gén kódolószálának szekvenciáját a 12-1A fág pGem A-14 és pGem A-4 szubklónjaiból készített beillesztett deléciók didezoxiszekvenálásával határozzuk meg. Ezt a szekvenciát alkalmazzuk az AHAS nemkódoló szálával komplementer oligonukleotidszekvenciák tervezésére. A nem-kódoló szál szekvenciáját a pCD200 klón didezoxiszekvenálásával kapjuk meg a kódolószállal komplementer primerek alkalmazásával. A W22 AHAS-gén szekvenálásának kiegészítése után mindkét DNS-szál primerjeit megtervezzük, és az XI12 és B73 genomiális könyvtárakból izolált AHAS-gének szekvenálására alkalmazzuk.

4. példa

QJ22 AHAS-gének klónozása

Az imidazolinonokkal szemben szelektíven rezisztens QJ22 kukoricavonalban az AHAS-t kódoló gének szekvenciáját szintén meghatározzuk. A QJ22 genomiális könyvtárát egy EMBL3 vektorban készítjük el. 800 000 fágból álló könyvtárat szűrünk egy 850 kb hosszúságú Sall/Clal nukleotidfragmenssel, amelyet a vad típusú W22 kukoricavonalból származó A4 AHASklónból izoláltunk. 5 pozitív fágot kiemelünk, és egy második szűrővizsgálatnak vetünk alá a fág részleges tisztítása céljából. A részlegesen tisztított fágot PCR-rel analizáljuk annak meghatározására, hogy van-e köztük olyan klón, amely a QJ22 alsl gént képviseli. Ezeket a kiónokat 3,7 kb hosszúságú Xbal fragmens formájában azonosítjuk, amely egyetlen génre specifikus Smal helyet tartalmaz 495-ös helyzetben. A második szűrővizsgálat azt jelzi, hogy egyetlen pozitív klón rendelkezik a fenti jellemzőkkel.

A PCR-terméket kereskedelmi forgalomban lévő készlettel (Magic PCR Preps, Promega) tisztítjuk, és a tisztított DNS-t Taq polimerázszekvenáló rendszerrel (fmol, Promega) szekvenáljuk. A QJ22 mutáns AHAS DNS mindkét szálának szekvenciaanalízise mutatja a

HU 218 108 Β

G -> A nukleotidcserét a 621-es aminosavat kódoló kodonban. Ez a mutáció azonos az XI 12-ben látható mutációval, és a szekvencia fennmaradó része az alsl génre jellemző.

A mutáns AHAS-gének szekvenciáját összehasonlítjuk a B73 és W22 vad típusú kukoricavonalakból kapott szekvenciákkal (7. ábra). Az XI12 mutáns gén (XI12/8A) és a QJ22 mutáns gén és a vad típusú gén mindenben megegyezik, kivéve a 621-es helyzetben lévő aminosav változását, melyet egyetlen nukleotid cseréje okoz, mégpedig az AGT cseréje AAT-re (lásd 8. ábrát). Az XI12 mutáns XI12/8A és a vad típusú B73/7-4 gén egy további különbséget is mutat 63-as helyzetben. Ezzel szemben az XI12/17A-ba klónozott nemmutáns XI12 AHAS-gén teljesen homológ a megfelelő B73/10-2-vel, az érett AHAS-proteint kódoló régióban (adatokat nem közölünk).

Az alábbi biológiai anyagokat az American Type Culture Collectionnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857) helyeztük letétbe:

E. coli XLI Blue hordozóplazmid pX12/8A, 1991. július 3-án letétbe helyezve, letéti szám: ATCC 68643 és XI12 kukoricamag 1991. július 16-án letétbe helyezve, letéti szám: ATCC 75051.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Nukleinsavszekvencia, amely egyszikű növényekben funkcionális AHAS-enzimet kódol, azzal jellemezve, hogy az enzim a vad típusú egyszikű AHASenzimhez viszonyítva egyetlen aminosavhelyettesítést tartalmaz, amely a kukorica-AHAS-enzimben 621-es helyzetben, az egyéb egyszikű AHAS-enzimekben az ennek megfelelő helyzetben van, amely aminosavhelyettesítés az enzimnek imidazolinon-speciftkus rezisztenciát biztosít.
2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy az egyszikű növény a kukorica, és a helyettesítés a vad típusú kukorica AHAS-enzim 621-es helyzetében van.
3. A 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy a helyettesített aminosav az aszparagin.
4. Egyszikű növényekben funkcionális AHAS-enzim, azzal jellemezve, hogy a vad típusú egyszikű

AHAS-enzimhez viszonyítva egyetlen aminosavhelyettesítést tartalmaz, amely a kukorica AHAS-enzimben a 621-es helyzetben, az egyéb egyszikű AHAS-enzimekben az ennek megfelelő helyzetben van, amely aminosavhelyettesítés az enzimnek imidazolinon-specifikus rezisztenciát biztosít.
5. A 4. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy az egyszikű növény a kukorica, és a helyettesítés a vad típusú kukorica AHAS-enzim 621-es helyzetében van.
6. Az 5. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a helyettesített aminosav az aszparagin.
7. Transzformálóvektor, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
8. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát vagy egy 7. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az növényi sejt vagy bakteriális sejt.
10. Specifikusan imidazolinonrezisztens transzgenikus érett növény, vagy annak magja vagy pollenje, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
11. Eljárás specifikus imidazolinonrezisztencia kialakítására növényi sejtekben, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtbe egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát viszünk be.
12. Eljárás specifikusan imidazolinonrezisztens transzgenikus növények tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy a géntranszformációs események eredményeként a 4. igénypont szerinti enzimet termelő növényt imidazolinon inhibitorkoncentrációjának jelenlétében tenyésztjük.
13. Eljárás egy kívánt génnel sikeresen transzformáit gazdasejtek szelektálására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtekbe a kívánt gént egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciához kötötten, vagy ahhoz nem kötötten, de egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia jelenlétében transzformáljuk, a sejteket imidazolinon inhibitorkoncentrációjának jelenlétében tenyésztjük, és a túlélő sejteket mint a kívánt gént tartalmazó sejteket azonosítjuk.
14. Nukleinsavszerkezet, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz egy mezőgazdaságilag hasznos jellemzőt kódoló génhez kötve.