DE69231551T2

DE69231551T2 - Imidazolinon resistante AHAS-Mutanten

Info

Publication number: DE69231551T2
Application number: DE69231551T
Authority: DE
Inventors: Gabriele Elfriede Dietrich
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-06-24
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2012-06-25
Also published as: EP0525384A3; ZA925734B; GR3035395T3; IL102673A; JPH05227964A; PT525384E; PL295470A1; AU9046098A; BG61276B1; KR100243996B1; US6444875B1; RO114348B1; IL102673A0; PL170616B1; NO923017D0; CA2074854C; AU2069492A; HUT65483A; TW239161B; EP0525384B1

Description

Diese Erfindung betrifft neue DNA Sequenzen, die für neue Varianten des Enzyms Acetohydroxysäuresynthase (im folgenden AHAS genannt) codieren. AHAS ist ein essentielles Enzym, das von einer Vielzahl von Pflanzen und einem breiten Spektrum von Mikroorganismen produziert wird. Die normale Funktion der AHAS wird von Imidazolinonherbiziden inhibiert. Neue AHAS Enzyme, für die die mutierten DNA Sequenzen codieren, haben sogar in Gegenwart von · Imidazolinonherbiziden eine normale katalytische Funktion und verleihen daher der sie enthaltenden Pflanze oder dem Mikroorganismus Herbizidresistenz.
Die neuen DNA Sequenzen stammen aus Mais und haben eine substituierte Aminosäure an Position 621 der normalen AHAS Sequenz. Diese Substitution in der AHAS Gensequenz ergibt ein vollkommen funktionsfähiges Enzym, aber macht das Enzym spezifisch resistent gegen Inhibition durch eine Reihe von Imidazolinonherbiziden. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzvarianten ist ein Hilfsmittel zur Transformation verschiedener Nutzpflanzen mit Imidazolinonherbizidresistenz, stellt aber auch neue Selektionsmarker für andere genetische Transformationsexperimente zur Verfügung.

Hintergrund der Erfindung

Die Verwendung von Herbiziden in der Landwirtschaft ist heute weit verbreitet. Obwohl es eine große Zahl von verfügbaren Verbindungen gibt, die effektiv Unkraut vertilgen, zielen nicht alle Herbizide selektiv auf die unerwünschten Pflanzen im Vergleich zu den Nutzpflanzen ab und sind ungiftig für Tiere. Oft muss man sich mit Verbindungen zufrieden geben, die für Nutzpflanzen einfach weniger giftig sind als für Unkräuter. Um dieses Problem zu lösen, ist die Entwicklung von herbizidresistenten Nutzpflanzen ein Hauptziel der Agrarforschung geworden.
Ein wichtiger Aspekt für die Entwicklung von Herbizidresistenz ist ein Verständnis biochemischen Schritte der Nutzpflanze, so dass der inhibierende Effekt bei Beibehaltung der normalen biologischen Funktion verhindert wird. Eine der ersten Entdeckungen des biologischen Mechanismus von Herbiziden bezog sich auf eine Gruppe von strukturell nicht verwandten Herbiziden, den Imidazolinonen, den Sulfonylharnstoffen und den Triazolpyrimidinen. Es ist heute bekannt (Shaner et al. Plant Physiol. 76, (1984) 545-546; U. S. Patent Nr. 4,761,373), dass jedes dieser Herbizide das Pflanzenwachstum durch Interaktion mit einem für das Pflanzenwachstum essentiellen Enzym inhibiert, der Acetohydroxysäuresynthase (AHAS, auch Acetolacetatsynthase genannt oder ALS). AHAS wird für die Synthese der Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin benötigt.
Es ist bekannt, dass AHAS in allen höheren Pflanzen und in einer Anzahl von Mikroorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae und den Enterobakterien Escherichia coli und Salmonella typhimurlum vorkommt. Die genetische Grundlage für die Produktion normaler AHAS in einigen dieser Spezies ist auch gut charakterisiert. Zum Beispiel existieren sowohl in E. coli als auch in S. typhimurlum drei AHAS-Isoenzyme; zwei davon sind herbizidsensitiv, das dritte jedoch nicht. Jedes dieser Isoenzyme besitzt eine große und eine kleine Proteinuntereinheit und kartieren zu den IIvIH, IIvGM und IIvBN Operons. In Hefe wurde das einzige AHAS lsoenzym zum ILV2 Locus kartiert. In jedem dieser Fälle wurden sensitive und resistente Formen identifiziert, und Sequenzen der verschiedenen Allele wurden bestimmt (Friden et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985) 3979-3993; Lawther et al., PNAS USA 78 (1982) 922-928; Squires et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983) 5299-5313; Wek et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4011-4027; Falco and Dumas, Genetics 109 (1985) 21-35; Falco et al, Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4011-4027).
In der Tabakpflanze wird AHAS von zwei nicht gekoppelten Genen, SuRA und SuRB, codiert. Es gibt eine beträchtliche Identität zwischen diesen beiden Genen sowohl auf der Ebene der Nukleotide als auch auf der der Aminosäuren im reifen Protein, obwohl es in der N-terminalen Region, vermutlich die Übergangsregion, deutlichere Abweichungen gibt (Lee et al., EMBO J. 7 (1988) 1241-1248).
Andererseits hat Arabidopsis ein einziges AHAS Gen, das auch vollständig sequenziert wurde (Mazur et al., Plant Physiol. 85 (1987) 1110-1117). Der Vergleich von Sequenzen der AHAS Gene in höheren Pflanzen zeigt ein hohes Maß an Konservierung bestimmter Regionen der Sequenz. Genauer gesagt gibt es mindestens zehn sequenzkonservierte Regionen. Es wurde schon früher angenommen, dass diese konservierten Regionen für die Funktion des Enzyms kritisch sind, und dass die Aufrechterhaltung dieser Funktion von beträchtlicher Konservierung der Sequenz abhängt.
Kürzlich wurde berichtet (U. S. Patent Nr. 5,013,659), dass Mutanten, die Herbizidresistenz zeigen, Mutationen mindestens einer Aminosäure in einer oder mehreren dieser konservierten Regionen hatten. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Substitution von Aminosäuren des Wildtyps an diesen spezifischen Stellen der AHAS-Proteinsequenz durch bestimmte Aminosäuren toleriert wird und tatsächlich zu Herbizidresistenz der Pflanze, die diese Mutation besitzt, führt, wobei die katalytische Funktion aufrecht erhalten wird. Die dort beschriebenen Mutationen codieren entweder für überkreuzte Resistenz für Imidazolinone und Sulfonylharnstoffe oder für sulfonylharnstoffspezifische Resistenz; imidazolinonspezifische Mutationen wurden jedoch nicht offengelegt. Es wurde gezeigt, dass diese Mutationen sowohl an den SuRA als auch an den SuRB Genorten vorkommen; ähnliche Mutationen wurden in Arabidopsis und Hefe isoliert.
Über imidazolinonspezifische Resistenz in einer Anzahl von Pflanzen wurde anderswo berichtet. U. S. Patent Nr. 4,761,373 beschrieb allgemein eine veränderte AHAS als Grundlage für Herbizidresistenz in Pflanzen und legte im Besonderen bestimmte imidazolinonresistente Maislinien offen. Haughn et al. (Mol. Gen. Genet. 211 (1988) 266-271) beschrieb das Auftreten eines ähnlichen Phänotyps in Arabidopsis. Sathasivan et al. (Nucl. Acid Res. 18 (1990) 2188) identifizierten die imidazolinonspezifische Resistenz in Arabidopsis als auf einer Mutation an Position 653 der normalen AHAS Sequenz beruhend. Entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde jetzt ein Gen, das für imidazolinonspezifische Resistenz in einer Monokotyle codiert, isoliert und gefunden, dass diese Resistenz mit dem Austausch einer einzigen Aminosäure in der AHAS Aminosäuresequenz der wildtyp Monokotyle assoziiert ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt gemäß Anspruch 1 neue Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung, die für funktionsfähige und gegen Imidazolinonherbizide unempfindliche AHAS Enzyme von Monokotylen codieren. Die betreffenden Sequenzen umfassen eine Mutation im für die Aminosäure Serin an Position 621 der Mais AHAS-Sequenz codierenden Codon oder an der entsprechenden Position in den Sequenzen anderer Monokotylen. Von anderen Monokotylen wie Weizen ist ebenso bekannt, dass sie imidazolinonspezifische Mutationen zeigen (zum Beispiel ATCC Nummern 40994-40997). In Mais hat die Wildtypsequenz ein Serin an dieser Position. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Serin gegen Asparagin ausgetauscht. Alternative Substitutionen für das Serin sind u. a. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glutamin und Tryptophan. Obwohl die beanspruchten Sequenzen ursprünglich aus Monokotylen stammen, sind die neuen Sequenzen für Methoden zur Herstellung imidazolinonresistenter Zellen in jeder Pflanzenart nützlich, wobei diese Methoden das Transformieren einer Zelle einer Zielpflanze mit einer oder mehreren der geänderten Sequenzen dieser Erfindung umfasst. Alternativ wird Mutagenese zur Herstellung von Mutanten in Pflanzenzellen oder Samen benutzt, die eine für eine imidazolinoninsensitive AHAS codierende Nukleinsäuresequenz enthalten. Im Falle von mutierten Pflanzenzellen, die in Gewebekultur isoliert werden, werden die Pflanzen, die das imidazolinonresistente oder -insensitive Merkmal enthalten, dann wiederhergestellt. Die Erfindung umfasst also auch Pflanzenzellen, Bakterienzellen, Pilzzellen, pflanzliche Gewebekulturen, ausgewachsene Pflanzen und Pflanzensamen, die eine mutierte Nukleinsäuresequenz besitzen und die funktionsfähige imidazolinonresistente AHAS Enzyme exprimieren.
Die Verfügbarkeit dieser neuen herbizidresistenten Pflanzen erlaubt neue Methoden des Heranziehens von Nutzpflanzen in Gegenwart von Imidazolinonen. Anstatt nichtresistente Pflanzen heranzuziehen, können Felder mit resistenten Pflanzen bepflanzt werden, die mittels Mutation oder Transformation mit den mutierten Sequenzen dieser Erfindung hergestellt wurden, und die Felder können routinemäßig mit Imidazolinonen ohne Schaden für die Nutzpflanzen behandelt werden.
Die mutierten Nukleinsäuren dieser Erfindung stellen auch neue Selektionsmarker zur Verwendung in Transformationsexperimenten zur Verfügung. Die für eine resistente AHAS codierende Nukleinsäuresequenz wird vor dem Transfer in eine Wirtszelle an ein zweites Gen gekoppelt, und das gesamte Konstrukt in den Wirt tranformiert. Mögliche transformierte Zellen werden dann in der Gegenwart inhibierender Mengen Herbizid in Kultur angezogen. Überlebende Zellen werden mit großer Wahrscheinlichkeit das zweite gewünschte Gen erfolgreich angenommen haben. Alternativ kann das AHAS Gen in einem unabhängigen Plasmid mit dem gewünschten Gen cotransformiert werden, wobei man von ungefähr 50% aller Transformanten erwarten kann, dass sie beide Gene aufgenommen haben.
Die folgenden Definitionen gelten in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen. Ein "funktionsfähiges" oder "normales" AHAS Enzym ist eines, das fähig ist, den ersten Schritt des Syntheseweges der essentiellen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin zu katalysieren. Eine "wildtyp" AHAS-Sequenz ist eine in einem imidazolinonsensitiven Mitglied einer gegebenen Spezies vorkommende Sequenz. Eine "resistente" Pflanze ist eine ein mutiertes aber funktionsfähiges AHAS Enzym produzierende Pflanze, die beim Wachsen in Gegenwart normaler inhibierender Mengen Imidazolinon die Reife erreichen kann. Die Bezeichnung "resistent", wie sie hier verwendet wird, soll auch "tolerante" Pflanzen umfassen, d. h. solche Pflanzen, die phänotypisch nachteilige aber nicht tödliche Reaktionen auf das Imidazolinon zeigen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1: AHAS Enzymaktivität in 10 Tage alten Maiskeimlingen (Maislinie A619 oder XI12) in Gegenwart von Imazethapyr (PursuitTM A) oder Chlorsulfuron (OustTM B). Die herbizidresistente AHAS Aktivität wird als Prozentsatz der AHAS Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors berechnet. Der Standardfehler zwischen Experimenten beträgt 10%.
Fig. 2: Southern Analyse genomischer Klone im Phagen EMBL-3. Phagen 12-1A (von W22), 12-7A, 18-8A, 12-11 und 12-17A (von XI12) werden mit Xbal oder Sall verdaut, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem AHAS cDNA Fragment als Probe hybridisiert.
Fig. 3: Southern Analyse genomischer DNA der Maislinien XI12, XA17, QJ22, A188 und B73. Die DNA wird mit Xbal verdaut, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem AHAS cDNA Fragment als Probe hybridisiert.
Fig. 4: Restriktionskarte des Plasmids pCDBA. Das mutierte AHAS Gen aus XI12 wurde als 8 kb Psfl Fragment in den Vektor pKS(+) subkloniert. Der Ort und die Orientierung des AHAS Gens ist mit einem Pfeil angedeutet. Die Restriktionsstellen von Psfl, XhoI, HindIII, XbaI und ClaI sind durch Symbole bezeichnet.
Fig. 5: Nukleotidsequenziergel des nichtcodierenden Strangs (A) und der doppelsträngigen DNA Sequenz (B) der AHAS Klone W22/4-4, B73110-4 und XI12/8A in der Region der Aminosäuren 614 bis 633. Die Position des Cytosin zu Thymidin Austauschs ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Fig. 6: Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen des mutierten XI12/8A AHAS Gens.
Fig. 7: Nukleotidsequenz-Alignment der XI12/8A, B73/7-4 und W22/1A als2 Gene. (*) kennzeichnet den Basenaustausch, der die Mutation an Position 621 verursacht, (#) Unterschiede von der B73I7-4 Sequenz und (> ) repräsentiert stille Austäusche.
Fig. 8: Aminosäuresequenzen und Alignment der XI12/BA, B73/7-4 und W22/1A als2 Gene. (*) kennzeichnet die Mutation an Position 621, (#) kennzeichnet Unterschiede von der B7317-4 Sequenz, und (> ) kennzeichnet stille Austäusche.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das Gen der vorliegenden Erfindung kann aus der Maislinie XI12 (Samen wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt, Zugangsnummer 75051) isoliert werden und wurde in das Plasmid pXI12/8A (bei der American Type Culture Collection hinterlegt, Zugangsnummer 68643) insertiert. Es ist auch aus jedem spezifisch imidazolinonresistenten Mutanten wie der Maislinie QJ22 (als Zellkultur bei der American Type Culture Collection hinterlegt, Zugangsnummer 40129) oder den verschiedenen Weizenpflanzen (Samen wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt, Zugangsnummern 40994, 40995, 40996 oder 40997) isolierbar. Eine genomische DNA Genbank wird zum Beispiel im Phagen EMBL-3 mit DNA von einem der imidazolinonresistenten Mutanten hergestellt, vorzugsweise von einem für das Resistenzmerkmal homozygoten Mutanten, und wird mit einer die ganze oder einen Teil der wildtyp AHAS Sequenz umfassenden Nukleinsäurenprobe gescreent.
In Mais wird das AHAS Gen an zwei Genorten gefunden, als1 und als2 (Burr and Burr, Trends in Genetics 7 (1991) 55-61); die Homologie zwischen den beiden Genorten beträgt 95% auf der Nukleotidebene. Die Mutation in XI12 kartiert zu Genort als2 auf Chromosom 5, während das nichtmutierte Gen zu Genort als1 auf Chromosom 4 kartiert (Newhouse et al.: Imidazolinone-resistant crops. In: The Imidazolinone Herbizides (Shaner und Shaner, Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, im Druck). Southern Analyse identifiziert einige das mutierte als2 Gen enthaltende Klone und einige, die das nichtmutierte als1 Gen enthalten. Beide Arten werden in Sequenziervektoren subkloniert und mit der Didesoxysequenziermethode sequenziert.
Sequenzieren und Vergleich der wildtyp und mutierten AHAS Gene zeigt einen Unterschied in einem einzigen Nukleotid im Codon, das für die Aminosäure an Position 621 kodiert (Fig. 5). Genauer, das für ein Serin codierende Codon AGT der wildtyp Sequenz ist zu AAT abgeändert, das für ein Asparagin des mutierten AHAS Gens kodiert (Fig. 8). Das mutierte AHAS Gen ist ansonsten dem wildtyp Gen ähnlich und codiert für ein aus 638 Aminosäuren bestehendes Protein, dessen 40 erste Reste ein Übergangspeptid darstellen, von dem man annimmt, dass es in vivo während des Transports in die Chloroplasten abgespalten wird. Die Sequenz des nicht mutierten Gens als1 aus XI12 scheint identisch zum als1 Gen von B73 zu sein.
Die mutierten Gene dieser Erfindung machen gegen Imidazolinonherbizide resistent, jedoch nicht gegen Sulfonylharnstoffherbizide. Die Arten von Herbiziden gegen die resistent gemacht wird, sind zum Beispiel in den U. S. Patenten der folgenden Nummern beschrieben: 4,188,487; 4,201,565; 4,221,586; 4,297,128; 4,554,013; 4,608,079; 4,638,068; 4,747,301; 4,650,514; 4,698,092; 4,701,208; 4,709,036; 4,752,323; 4,772,311 und 4,798,619.
Fachleuten wird klar sein, dass die in Fig. 6 gezeigte Nukleinsäuresequenz nicht die einzige Sequenz ist, die zur Verleihung von imidazolspezifischer Resistenz benutzt werden kann. Auch kommen jene Nukleinsäuresequenzen in Betracht, die für ein identisches Protein codieren, die jedoch wegen der Degenerierung des genetischen Codes eine andere Nukleotidsequenz besitzen. Die Erfindung umfasst ebenso für AHAS-Sequenzen codierende Gene, in denen die genannte Mutation vorhanden ist, die jedoch auch für einen oder mehrere stille Austausche von Aminosäuren in Bereichen des Moleküls codiert, die nicht in die Resistenz oder katalytische Funktion involviert sind. Ebenso sind Gensequenzen von anderen imidazolinonresistenten Monokotylen betroffen, die eine Mutation in der entsprechenden Region der Sequenz haben.
Zum Beispiel kommen Änderungen in der Gensequenz in Betracht, die zur Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einem gegebenen Ort führen. So kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon substituiert sein, das für einen anderen hydrophoben Rest wie Glycin codiert, oder es kann durch einen hydrophoberen Rest wie z. B. Valin, Leucin oder Isoleucin ersetzt sein. Ähnlicherweise kann man erwarten, dass Änderungen, die zum Ersatz eines negativ geladenen Restes gegen einen anderen führen, wie der Ersatz einer Asparaginsäure durch eine Glutaminsäure, genauso ein biologisch äquivalentes Produkt ergeben, wie der Ersatz eines positiv geladenen Restes gegen einen anderen wie etwa Lysin gegen Arginin. Die Erfindung umfasst auch chimäre Gene, in denen der ersetzte Teil des Mais AHAS Gens mit unveränderten Teilen des normalen AHAS Gens von einer anderen Spezies kombiniert ist. Daher wird immer, wenn die Bezeichnung "imidazolinonspezifisch resistentes Mais AHAS Gen" in der Beschreibung und den Ansprüchen benutzt wird, beabsichtigt, dass jede dieser alternativen Ausführungsformen ebenso wie die Sequenz der Fig. 6 abgedeckt sind.
Die isolierten AHAS DNA Sequenzen dieser Erfindung sind zur Transformation von Nutzpflanzen und damit zur Verleihung von Imidazolinonresistenz nützlich. Derzeit existiert eine breite Auswahl von Techniken zur direkten oder indirekten Transformation von höheren Pflanzen mit exogener DNA, und jede Methode mittels derer die neue Sequenz in das Wirtsgenom eingebaut und stabil von den Nachkommen geerbt werden kann, kommt für diese Erfindung in Betracht. Das imidazolinonspezifische Resistenzmerkmal wird als einzelnes dominantes nukleares Gen vererbt. Der Grad der Imidazolinonresistenz wird erhöht, wenn das Gen in einem homozygoten Zustand vorliegt. Solche Maispflanzen haben zum Beispiel einen 1000-fachen höheren Resistenzgrad einer nichtresistenten Pflanze. Für das Merkmal heterozygote Pflanzen haben jedoch ungefähr eine 50-500-fach höhere Resistenz als nichtresistente Pflanzen.
Die Transformation von Pflanzenzellen kann durch die Verwendung von Vektoren vermittelt werden. Eine übliche Methode zur Transformation ist die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens zur Einführung eines fremden Gens in die gewünschte Pflanzenzelle. Zum Beispiel wird die mutierte AHAS Sequenz in einen Plasmidvektor insertiert, der die flankierenden Sequenzen der Ti-Plasmid T-DNA enthält. Das Plasmid wird dann in E. coli transformiert. Ein triparentales Kreuzen zwischen · diesem Stamm, einem Agrobacterium Stamm mit einem entwaffneten Ti-Plasmid, das die zum Transfer der die AHAS enthaltenden T-DNA Sequenzen in das pflanzliche Zielchromosom nötigen Virulenzfunktionen enthält, und einem zweiten E. coli Stamm, der ein Plasmid mit den zur Mobilisierung des Transfers des AHAS Konstruktes von E. coli auf Agrobacterium nötigen Sequenzen enthält, wird durchgeführt. Ein rekombinanter Agrobacterium Stamm, der die zur Transformation von Pflanzen nötigen Sequenzen enthält, wird zur Blattscheibeninfektion benutzt. Die Scheiben werden auf Selektionsmedium herangezogen, und erfolgreich transformierte regenerierte Pflanzen werden identifiziert. Die erhaltenen Pflanzen sind gegenüber den Wirkungen von Herbiziden resistent, wenn sie in deren Gegenwart aufgezogen wurden. Pflanzenviren stellen auch eine Möglichkeit zum Transfer exogener DNA dar.
Die direkte Aufnahme durch Pflanzenzellen kann auch eingesetzt werden. Typischerweise werden Protoplasten der Zielpflanze in Gegenwart der zu transferierenden DNA und eines Mittels, das die Aufnahme von DNA durch Protoplasten fördert, in ein Kulturmedium eingebracht. In dieser Hinsicht nützliche Mittel sind Polyethylenglycol oder Calciumphosphat. Alternativ kann die Aufnahme von DNA durch Elektroporation angeregt werden. Bei dieser Methode wird ein elektrischer Puls zur Öffnung temporärer Poren in der Zellmembran eines Protoplasten benutzt, und DNA der umgebenden Lösung wird durch die Poren in die Zelle geschleust. Ähnlich kann Mikroinjektion benutzt werden, um DNA direkt in eine Zelle zu bringen, vorzugsweise direkt in den Zellkern der Zelle.
Bei jeder der zuvor genannten Techniken erfolgt Transformation einer Pflanzenzelle in Kultur. Nach erfolgter Transformation müssen die Pflanzenzellen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Techniken zur Regeneration reifer Pflanzen aus Kallus oder Protoplastenkultur sind heutzutage für eine große Zahl verschiedener Spezies bekannt (siehe z. B.: Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1-5, 1983-1989, McMillan, N. Y.). Sobald also die Transformation erreicht ist, können reife Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen gemäß dem Stand der Technik regeneriert werden.
Alternative Methoden zur Transformation, für die nicht unbedingt die Verwendung isolierter Zellen und folglich von Techniken zur Pflanzenregeneration nötig sind, sind heute ebenfalls verfügbar. Diese werden gewöhnlich "ballistische" oder "Teilchenbeschleunigungsmethoden" genannt. Bei diesen werden DNA beschichtet Metallpartikel durch Schießpulverladung (Klein et al. Nature 327, 1987, 70-73) oder elektrische Entladung (EPO 270 356) in Pflanzenzellen hinein getrieben. Auf diese Art können Pflanzenzellert in Kultur oder reproduktive Organe von Pflanzen oder Zellen, z. B. Pollen, stabil mit der gewünschten DNA Sequenz transformiert werden.
In bestimmten Dikotylen und Monokotylen ist die direkte Aufnahme von DNA die bevorzugte Transformationsmethode. In Mais zum Beispiel, wird die Zellwand kultivierter Zellen in einem Puffer mit einem oder mehreren zellwandabbauenden Enzymen wie Cellulase, Hemicellulase und Pectinase verdaut, um überlebensfähige Protoplasten zu isolieren. Die Protoplasten werden mehrmals gewaschen, um die Enzyme zu entfernen, und mit einem das Zielgen enthaltenden Plasmidvektor gemischt. Die Zellen können entweder mit PEG (z. B. 20% PEG 4000) oder mittels Elektroporation transformiert werden. Dann werden die Protoplasten auf einen Nitrocellulosefilter gebracht und auf einem Medium mit eingebetteten Maiszellen, die als Fütterkultur wirken, kultiviert. Nach 2-4 Wochen werden die Kulturen auf dem Nitrocellulosefilter in ein Medium, das 0,32 uM des Imidazolinons enthält, gelegt und in diesem Medium 1-2 Monate gehalten. Die Nitrocellulosefilter mit den Pflanzenzellen werden alle zwei Wochen in frisches Medium mit Herbiziden und Nährzellen transferiert. Die nicht transformierten Zellen hören auf zu wachsen und sterben nach einigen Wochen.
Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation von so gut wie jeder Art von Pflanze angewendet werden, sowohl von Monokotylen als auch von Dikotylen. Unter den Nutzpflanzen, für die die Transformation zur Herbizidresistenz in Betracht gezogen wird, sind Mais, Weizen, Reis, Hirse, Hafer, Gerste, Sorghum, Sonnenblumen, Süßkartoffeln, Luzernen, Zuckerrüben, Brassica (Kohl-)Arten, Tomaten, Paprika, Sojabohnen, Tabak, Melonen, Kürbis, Kartoffeln, Erdnüsse, Erbsen, Baumwolle oder Kakao. Die neuen Sequenzen können auch zur Transformation von Zierpflanzen wie Rosen und Hölzern wie Pinien und Pappeln verwendet werden.
Die neuen Sequenzen der Erfindung sind auch als Selektionsmarker in Pflanzengenetikstudien zu gebrauchen. Zum Beispiel könnten für Imidazolinonresistenz codierende Sequenzen mit einem gewünschten Gen, das zur Transformation einer imidazolinonsensitiven Zielpflanze benutzt werden soll, gekoppelt werden. Das sowohl das gewünschte Gen als auch die imidazolinonresistente Sequenz umfassende Konstrukt wird in eine Pflanzenzelle eingeführt, und die Pflanzenzellen werden dann in Gegenwart einer inhibierenden Menge eines Imidazolinons wachsen gelassen. Alternativ kann das zweite gewünschte Gen auf einem getrennten Plasmid in die Wirtszelle cotransformiert werden. Pflanzenzellen, die eine derartige Behandlung überleben, haben vermutlich das Resistenzgen als auch das gewünschte Gen aufgenommen; deshalb überleben nur Transformanten die Selektion mit dem Herbizid. Eine Bestätigung der erfolgreichen Transformation und Expression beider Gene kann durch Southern Hybridisierung genomischer DNA, mittels PCR oder durch Beobachtung phänotypischer Expression der Gene erlangt werden. Die Erfindung wird durch folgende, nicht limitierende Beispiele weiter illustriert.

Beispiele

1. Bestätigung der Herbizidresistenz ganzer Pflanzen in XI12

XI12 Pflanzen werden an 10 Tagen mit Herbiziden bis zum V3 Blattstadium (4-5 Blätter von denen 3 sichtbare Ligulen haben) behandelt. Imazethapyr wird in Mengen von 2000, 500, 250, 125 und 62,5 g/ha angewendet. Chlorsulfuron wird in Mengen von 32, 16, 8, 4 und 2 g/ha angewendet. Die Pflanzen werden mit einem Sprühvolumen von 400 l/ha nach dem Heraustreten behandelt. Nach dem Besprühen werden die Pflanzen zur weiteren Beobachtung ins Gewächshaus gebracht.
XI12 Pflanzen werden von der Behandlung mit Imazethapyr bei allen Mengen nicht beeinflusst; es wird jedoch keine sichtbar erhöhte Resistenz gegen Chlorsulfuron beobachtet. Folglich zeigt XI12 selektive Resistenz gegen das Imidazolinon auf der Ebene der gesamten Pflanze (siehe Fig. 1).
Es wird auch gezeigt, dass die Resistenz in XI12 als einzelnes dominantes Allel eines Kerngens vererbt wird. Heterozygote resistente XI12 werden selbstbefruchtet, und die selbstbefruchteten Nachkommen unterteilen sich in das Verhältnis von 3 resistenten zu 1 nichtresistenten, wie es für ein einzelnes dominantes Allel eines Kerngens erwartet wird. In dieser Studie werden die segregierenden Keimlinge nach dem Heraustreten mit letalen Dosen Imazethapyr (125 oder 250 g/ha) gemäß obigem Sprühprotokoll besprüht, um Aufspaltung für Resistenz zu erhalten.

2. AHAS Extraktion

Samen von XI12 werden in einem Gewächshaus, das auf einer Tag/Nachttemperatur von 27ºC und bei einer 15 stündigen Photoperiode gehalten wird, ausgesät. Die Pflanzen werden 2 Wochen nach dem Pflanzen geerntet. Der untere Teil des Stengels wird für die Extraktion der AHAS benutzt. 5 g des Gewebes werden in flüssigem Stickstoff pulverisiert und dann in AHAS Probenpuffer, der 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) umfasst und der 10 mM Pyruvat, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM EDTA, 100 uM FAD (Flavihadenindinukleotid), 1 mM Valin, 1 mM Leucin, 10% Glycerin und 10 mM Cystein enthält, homogenisiert. Das Homogenisat wird bei 10 000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und 3 ml des Überstandes werden auf eine äquilibrierte Bio-Rad Econo-Entsalzungssäule (10 DG) geladen und mit 4 ml AHAS Probenpuffer eluiert.
Die AHAS Aktivität wird durch Abschätzen des Produktes Acetolactat nach der Überführung durch Decarboxylierung in Gegenwart von Säure in Acetoin gemessen. Standardreaktionsmischungen enthalten das Enzym in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,0), 100 mM Natriumpyruvat, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Thiaminpyrophosphat, 10 uM FAD und geeignete Mengen verschiedener Inhibitoren. Diese Mischung wird, abhängig vom Experiment, 1 bis 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Am Ende dieser Inkubationszeit wird die Reaktion durch Zugabe von H&sub2;SO&sub4; auf eine Endkonzentration von 0,85% gestoppt. Man läßt das Reaktionsprodukt bei 60ºC 15 Minuten lang decarboxylieren. Das gebildete Acetoin wird durch Inkubation mit Creatin (0,17%) und 1-Naphthol (1,7% in 4 N NaOH) bestimmt. Die Absorption des gebildeten Farbkomplexes wird bei 520 nm gemessen.
Die Aktivität der AHAS aus B73, A619 oder anderen wildtyp Maislinien ist hochgradig sensitiv gegenüber Inhibition durch Imazethapyr (PURSUITTM) mit einem 15o Wert von 1 uM (siehe Fig. 1). Im Gegensatz zu dieser Beobachtung zeigt XI12 70-80% Enzymaktivität bei den höchsten Konzentrationen (100 uM) von PURSUITTM oder ARSENALTM (Imazepyr) und ungefähr 70% in Gegenwart von SCEPTERTM (Imäzequin). Dieses Ergebnis zeigt eine 100-fach gestiegene Toleranz der AHAS Aktivität von XI12 gegenüber Imazethapyr im Vergleich zur in vitro AHAS Aktivität von A619. Die Sensitivität der AHAS Aktivität dieser beiden Linien gegenüber Sulfonylharnstoffen ergibt ein anderes Bild. In Gegenwart von 100 uM OUSTTM (Sulfometuron) ist die AHAS Aktivität von XI12 nur 15-20%. Die AHAS Aktivität von A619 in Gegenwart von OUSTTM liegt bei 5-10% und in Gegenwart von PURSUITT"" bei 15-20% (siehe Fig. 1).

3. Klonierung des XI12 AHAS Gens

Von einer imidazolinonresistenten Maislinie in Gewebekultur herrührende Samen des XI12 Mutanten werden gesät. Davon erhaltene Pflanzen scheinen sich nach dem Phänotyp des AHAS Mutanten aufzuspalten. Um homozygotes resistentes Samenmaterial zu erhalten, wird eine Population der mutierten XI12 Pflanzen sebstbefruchtet. Nach der Selektion für Herbizidresistenz in drei aufeinander folgenden Wachstumsperioden sind die Samen für das mutierte AHAS Gen homozygot. Homozygote Samen werden gesammelt und zum Heranziehen von Keimlingen zur AHAS Genisolierung benutzt.
DNA wird aus 7 Tage alten etiolierten Keimlingen einer homozygoten XI12 Linie extrahiert. 60 g Pflanzengewebe werden in flüssigem Stickstoff pulverisiert und in 108 ml DNA Extraktionspuffer (1,4 M NaCl, 2,0% Ctab (Hexadecyltrimethylammoniumbromid), 100 mM Tris-Cl pH 8,0, 20 mM EDTA, 2% Mercaptoethanol) und 54 ml Wasser überführt. Nach der inkubation bei 50-60ºC für 30 Minuten wird die Suspension mit der gleichen Menge Chloroform extrahiert. Die DNA wird durch Zugabe der gleichen Menge Präzipitationspuffer (1% Ctab, 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM EDTA) präzipitiert. Zur Reinigung der genomischen DNA wird eine Ultrazentrifugation in 6,6 M CsCl und Ethidiumbromid durchgeführt (Ti80 Rotor, 50 000 U/min. 20ºC, 24 Stunden). Die gereinigte DNA wird mit salzgesättigtem Butanol extrahiert und für 25 Stunden gegen 3 · 1 Liter Dialysepuffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) dialysiert. Die Konzentration der XI12 genomischen DNA wird spektrophotometrisch zu 310 mg/ml bestimmt. Die Ausbeute beträgt 0.93 mg.
Die genomische DNA aus XI12 wird zur Erstellung einer genomischen Genbank im Phagen EMBL-3 benutzt. Die DNA wird partiell mit Mbol verdaut, und die Fragmente werden in einem Sucrosegradienten aufgetrennt, um einen Größenbereich zwischen 8 und 22 kb vor dem Klonieren in die BamHI Spaltstelle von EMBL-3 zu erhalten. Nachdem 2,1 · 10&sup6; unabhängige Klone erhalten wurden, wird die Genbank einmalig amplifiziert. Der Titer der Genbank wird zu 9 · 10¹&sup0; pfu/ml bestimmt.
Um Proben zur Analyse der XI12 Genbank zu erhalten, wird eine W22 (wildtyp) cDNA Genbank in Lamda gt11 (erworben von Clontech Inc., CA) mit einer 800 nt BamHl Probe, die aus einem genomischen Klon von Arabidopsis AHAS isoliert wurde, gescreent. Die Phagen werden in einer Dichte von 50 000 pfu/15 cm Platte ausplattiert, auf Nitrocellulosefilter übertragen, in 6 · SSC, 0,2% SDS für 2 Stunden prähybridisiert und über Nacht mit der Arabidopsis AHAS Probe in 6 · SSC, 0,2% SDS hybridisiert. Ein positiver Phage wird identifiziert, weiter gereinigt und zum Subklonieren eines 1,1 kb EcoRl Fragmentes benutzt. Das 1,1 kb EcoRl Fragment wird in pGemA-4 subkloniert und als Probe zur Identifizierung des XI12 AHAS Gens benutzt.
Die XI12 genomische Genbank wird auf 12 15 cm Platten ausplattiert (Konzentration von 50 000 pfu/Platte) und mit der W22 AHAS cDNA Probe gescreent. Die Filter werden prähybridisiert (2 Stunden), über Nacht in Church Puffer (0,5 M Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 1% BSA, 7% SDS) bei 65ºC hybridisiert und bei 65ºC in 2 · SSC, 0,2% SDS und 0,3 · SSC, 0,2% SDS gewaschen. 12 positive Plaques werden von einer gescreenten Gesamtzahl von 7,5 · 105 pfu erhalten und 5 positive Klone werden weiter gereinigt und isoliert gemäß Chisholm (BioTechniques 7 (1989), 21-23). Southern Analyse (siehe Fig. 2) zeigte, dass die Phagenklone 2 Typen von AHAS Klonen repräsentierten: Typ-1 Klone enthalten ein großes Xbal Fragment (> 6,5 kb), das mit der AHAS cDNA Probe hybridisiert, und Typ-2 Klone enthalten zwei 2,7 and 3,7 kb Xbal Fragmente, die mit der AHAS cDNA Probe hybridisierten. Genomischer Southern von XI12 DNA zeigte, dass die Xbal Fragmente, die durch Verdau genomischer DNA und durch Hybridisierung mit der AHAS cDNA Probe erhalten wurden, den in den XI12 Phagenklonen identifizierten Xbal Fragmenten entsprechen (siehe Fig. 3). Restriktionsverdau und Southern Analyse zeigen auch, dass einer von den 5 AHAS Klonen die mutierten als2 Gene und vier das als1 Gen repräsentieren.
Die AHAS Gene, die dem auf Chromosom 5 liegenden mutierten Genort (Klon 1218A) und dem nicht mutierten auf Chromosom 4 liegenden Genort (Klon12/17A) entsprechen, werden als PstI Fragment (Klon 1218A) oder als Xbal Fragment (12/17A) in den Sequenziervektor pBluescript II KSm13(+) (pKS+; Stratagene) subkloniert. Beide 2,7 kb und 3,7 kb Xbal Fragmente vom Phagen 12/17A enthalten eine vollständige Kopie von AHAS Genen, die identifiziert werden. Die Sequenz eines jeden wird durch Didesoxysequenzierung (Pharmacia T7 Sequenzierkits) mit Primern, die komplementär zur codierenden Sequenz der AHAS sind, erhalten.
Die Methoden der DNA Extraktion, des Klonierens der genomischen DNA Genbank und des Screenens der Bank sind so wie für die genomische DNA aus XI12 beschrieben. Die B73 AHAS Gene werden in den Sequenziervektor pKS+ als Xbal Fragmente subkloniert und sequenziert. Die Sequenz wird durch Didesoxysequenzieren unter Benutzung von Primern, die zu der AHAS codierenden Sequenz komplementär sind, erhalten, so wie für die S112 AHAS Gene beschrieben.
Eine W22 genomische Genbank in EMBL-3, die von Clontech Inc., CA erworben wurde, wird gescreent. Die Phagen werden in einer Dichte von 50 000 pfu/18 cm Platte ausplattiert, auf Nitrocellulosefilter transferiert und mit der oben beschriebenen W22 AHAS cDNA Probe hybridisiert (Prähybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen: 6 · SSC, 0,5% SDS, 1X Denhards 100 mg/ml Kalbsthymus DNA, 65ºC, Waschbedingungen: 3X x SSC, 0,2% SDS für 2 Stunden bei 65ºC und 0,3 · SSC, 0,2% SDS für 2 Stunden). Zwei positive Phagen (12/1A und 12/4-4) werden identifiziert und weiter gereinigt.
Der W22 genomische Klon 12/1A wird als zwei 0,78 kb (pGemA-4) und 3,0 kb (pGemA-14, Promega) Sall Fragmente in den Vektor pGem-A2 und als 6,5 kb Xbal Fragment in den Vektor pKS+ (pCD200) subkloniert. Die Sequenz des codierenden Stranges des W22 AHAS Gens wird durch Didesoxysequenzieren ineinander geschachtelter Deletionen erhalten, die aus den Subklonen pGem A-14 und pGem A-4 des Phagen 12-1A hergestellt wurden. Diese Sequenz wird zum Design von Oligonukleotiden benutzt, die zum nichtcodierenden Strang der AHAS komplementär sind. Die Sequenz des nichtcodierenden Stranges wird durch Didesoxysequenzierung des Klons pCD200 mit zum codierenden Strang komplementären Primern erhalten. Nach dem Vervollständigen des Sequenzierens des W22 AHAS Gens werden Primer von beiden DNA Strängen entworfen und zum Sequenzieren der aus den genomischen Genbanken von XI12 und B73 isolierten AHAS Gene benutzt.

4. Klonieren der QJ22 AHAS Gene

Die Sequenz des Gens, das in der Maislinie QJ22 für AHAS codiert und das selektiv resistent gegenüber Imidazolinonen ist, wird auch bestimmt. Eine genomische Genbank von QJ22 wird in einem EMBL-3 Vektor hergestellt. Eine Genbank von 800000 Phagen wird mit einem 850 Nukleotide langen Sal/Clal Fragment gescreent, das aus einem AHAS Klon (A-4) isoliert wurde, der von der wildtyp Maislinie W22 herrührt. Fünf positive Phagen werden ausgewählt und einer zweiten Screeningrunde unterworfen, um die Phagen partiell zu reinigen. Die partiell gereinigten Phagen werden mit PCR analysiert, um zu bestimmen, ob irgendwelche Klone das QJ22 als1 Gen repräsentieren. Solche Klone werden als 3,7 kb Xbal Fragment mit einer genspezifischen Smal Spaltstelle an Position 495 identifiziert. Das zweite Screening deutet das Vorliegen eines einzigen positiven Klons mit diesen Eigenschaften an.
Das PCR Produkt wird mit einem kommerziellen Kit (Magic PCR Preps) von Promega gereinigt, und die gereinigte DNA wird mit einem Taq Polymerase Sequenziersystem 'fmol', ebenfalls von Promega, sequenziert. Sequenzanalyse beider Stränge der DNA der AHAS Mutante aus QJ22 zeigt einen Nukleotidaustausch von G zu A im Codon für Aminosäure 621. Diese Mutation ist zu der in XI12 beobachteten identisch, und die übrige Sequenz ist für ein als9 Gen typisch.

Ergebnisse

Die Sequenz des mutierten AHAS Gens wird mit den aus den wildtyp Maislinien B73 und W22 erhaltenen Sequenzen verglichen (siehe Fig. 7). Das mutierte XI12 Gen (XI1218A), das mutierte QJ22 Gen und das wildtyp Gen sind bis auf die Aminosäuresubstitution an Position 621 identisch, verursacht durch einen einzigen Nukleotidaustausch von AGT zu AAT (siehe Fig. 8). Die XI12 Mutante XI12/8A und das wildtyp Gen B73/7-4 haben einen weiteren Unterschied an Position 63.
Andererseits ist das nicht mutierte XI12 AHAS Gen, das in XI12/17A kloniert wurde, vollständig homolog zum entsprechenden B73/10&supmin;² in der für das reife AHAS Protein codierenden Region (Daten nicht gezeigt).

Hinterlegung von biologischen Materialien

Die folgenden biologischen Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857 wie folgt hinterlegt:
E. coli XLI Blue enthaltend das Plasmid pX12/8A, am 3. Juli 1991 hinterlegt, Zugriffsnummer ATCC 68643.
XI12 Maissamen, hinterlegt am 16. Juli 1991, ZugriffsnummerATCC 75051.

Sequenzen

Sequenznummer: 1
Sequenztyp: Nukleotide und Aminosäuren
Sequenzlänge: 1969 Basenpaare und 638 Aminosäuren
Art der Stränge: Einzelstrang
Topologie: linear
Ursprünglicher Herkunftsorganismus: Zea mavs
Eigenschaften: herbizidresistentes AHAS Enzym

Sequenznummer: 2

Sequenztyp: Nukleotide und Aminosäuren
Sequenzlänge: 1969 Basenpaare und 638 Aminosäuren
Art der Stränge: Einzelstrang
Topologie: linear
Ursprünglicher Herkunftsorganismus: Zea mays
Eigenschaften: herbizidresistentes AHAS Enzym

Sequenznummer: 3

Sequenztyp: Nukleotide und Aminosäuren
Sequenzlänge: 1969 Basenpaare und 638 Aminosäuren
Art der Stränge: Einzelstrang
Topologie: linear
Ursprünglicher Herkunftsorganismus: Zea mavs
Eigenschaften: herbizidresistentes AHAS Enzym

Claims

1. Eine Nukleinsäuresequenz einer Monokotyle, die für ein funktionsfähiges AHAS Enzym kodiert, in dem bezüglich eines wildtyp AHAS Enzyms einer Monokotyle eine Substitution einer Aminosäure vorliegt, welche dem Enzym imidazolinonspezifische Resistenz verleiht.

2. Die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1, wobei im funktionsfähigen AHAS Enzym an Position 621 in Mais eine substituierte Aminosäure vorliegt oder die entsprechende Substitution in anderen Monokotylen als Mais.

3. Die Sequenz von Anspruch 2, in der die substituierte Aminosäure Asparagin ist.

4. Ein funktionsfähiges AHAS Enzym einer Monokotyle, in dem bezüglich eines wildtyp AHAS Enzyms einer Monokotyle mindestens eine Substitution einer Aminosäure vorliegt, um dem Enzym imidazolinonspezifische Resistenz zu verleihen.

5. Ein funktionsfähiges AHAS Enzym einer Monokotyle gemäß Anspruch 4, in dem eine einzige Substitution einer Aminosäure vorliegt.

6. Das Enzym von Anspruch 4, wobei die Monokotyle Mais ist, und die Substitution ist an Position 621 des wildtyp AHAS Enzyms aus Mais.

7. Das Enzym von Anspruch 6, wobei die substituierte Aminosäure Asparagin ist.

8. Ein Transformationsvektor, der die Nukleinsäure aus Anspruch 1 umfasst.

9. Eine Wirtszelle, die die Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 oder den Vektor aus Anspruch 8 umfasst.

10. Die Wirtszelle von Anpruch 9, die eine Pflanzen- oder eine Bakterienzelle ist.

11. Eine imidazolinonspezifisch resistente reife Pflanze oder ein Samen oder ein Pollen davon enthaltend die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1.

12. Eine Methode, einer Pflanzenzelle imidazolinonspezifische Resistenz zu verleihen, die es umfasst, die Pflanzenzelle mit der Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 auszustatten.

13. Eine Methode zur Selektion von erfolgreich mit einem gewünschten Gen transformierten Wirtszellen, die es umfasst, die künftige Wirtszelle mit dem gewünschten Gen, das an die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1 gebunden ist, oder ungebunden ist aber in Gegenwart der Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1 vorliegt, auszustatten, die Zellen in Gegenwart einer inhibierenden Menge Imidazolinon wachsen zu lassen und überlebende Zellen als das gewünschte Gen enthaltend zu identifizieren.

14. Ein Nukleinsäurekonstrukt umfassend die Sequenz aus Anspruch 1, die an ein für ein agronomisch nützliches Merkmal codierendes Gen gekoppelt ist.