DE3687682T2

DE3687682T2 - Glyphosat resistente pflanzen.

Info

Publication number: DE3687682T2
Application number: DE8686870110T
Authority: DE
Inventors: Robert Thomas Fraley; Robert Bruce Horsch; Stephen Gary Rogers; Dilip Maganlal Shah
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1985-08-07
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2006-08-07
Also published as: EP0218571A3; JPS6332488A; DK374586D0; AU6091386A; EP0218571A2; EP0218571B1; DK175922B1; US5188642A; CA1313830C; DK374586A; IL79652A0; ATE85360T1; AU590597B2; DE3687682D1; BR1100007A; JP2615013B2; NZ217113A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Gentechnologie, Biochemie und Pflanzenbiologie.
N-Phosphonomethylglycin weist die folgende Struktur auf:
Dieses Molekül ist eine Säure, die sich in wässeriger Lösung unter Bildung von Phytotoxikumanionen dissoziieren kann. Es sind mehrere anionische Formen bekannt. Der hier verwendete Ausdruck "Glyphosat" bezieht sich auf die Säure und ihre Anionen. Eine Glyphosat als aktiven Bestandteil enthaltende Mischung, als Isopropylaminsalz formuliert, wird von Monsanto Company als Herbizid unter dem Markennamen ROUNDUP® verkauft. Zahlreiche andere Salze haben ebenfalls herbizide Eigenschaften, wovon Beispiele im US-Patent 3 799 758 (Franz 1974) und verschiedenen anderen Patenten enthalten sind. Zusammensetzungen, die N-Phosphonomethylglycin und salzbildende Kationen umfassen, die die Löslichkeit des N-Phosphonomethylglycins in Wasser erhöhen, werden bevorzugt.
Fachleute wissen, daß die wissenschaftliche Literatur zahlreiche Dokumente enthält, die verschiedene Wirkungsweisen für die Inhibierung von Pflanzenwachstum durch Glyphosat vorschlagen. Eine vorgeschlagene Weise legt nahe, daß Glyphosat ein 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) genanntes Enzym inhibiert, z. B. Amrhein 1980, Steinrucken 1980, Mousdale 1984 und Rubin 1982 (Bemerkung: eine vollständige Liste von erwähnten Literaturstellen ist später nach den Beispielen enthalten). Angeblich katalysiert das EPSPS-Enzym die Überführung von Shikimat-3-phosphat in 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat, ein Zwischenprodukt im biochemischen Weg zum Erzeugen von drei wesentlichen aromatischen Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan), siehe z. B. Mousdale 1984. Rogers, 1983, berichtet, daß die Überproduktion von EPSPS in E. coli zur Glyphosatresistenz in diesen Zellen beiträgt.
Zumindest ein Forscher hat versucht, glyphosatresistente Bakterienzellen durch Behandeln eines Bakterien-Gens, das ein EPSPS-Enzym codiert, zu erzeugen. Wie im US-Patent 4 535 060 (Comai, übertragen an Calgene, Inc., Einreichungsdatum 5. Jänner 1983) und in Comai 1983 beschrieben, wurde eine Kultur von Salmonella-Bakterien mit einem Mutagen (Ethylmethansulfonat) in Berührung gebracht. Die Bakterien wurden auf Glyphosatresistenz gescreent und es wurde eine relativ resistente Kultur selektioniert. Diese Kultur wurde analysiert und es wurde festgestellt, daß sie eine Mutantenform von EPSPS mit einer substituierten Aminosäure aufweist, wie in Stalker 1985 angegeben. Das US-Patent 4 535 060 legte nahe, daß das Mutanten-EPSPS-Gen in Pflanzenzellen insertiert werden könnte, um glyphosatresistente (Gly®) Pflanzenzellen zu schaffen. Außerdem wurde berichtet, daß glyphosatverträgliche Pflanzenzellen selektioniert werden können, die EPSPS in Anwesenheit niedriger Glyphosatmengen überproduzieren (Nafziger et al., 1984, und Smart et al., 1985). Jedoch demonstrierte keines der Experimente, daß eine solche Methode in differenzierten Pflanzen wirksam wäre.
Nach dem Einreichungsdatum des US-Patentes 4 535 060 wurden Verfahren und Vektoren beschrieben, die zum Insertieren von Fremdgenen in Pflanzenzellen verwendet werden könnten (siehe z. B. Fraley 1983, Herrera-Estrella 1983, Bevan 1983 und PCT-Anmeldungen WO 84/02919 und 02920). In der PCT-Anmeldung WO 84/02913 wurden ebenfalls Verfahren zum Schaffen von chimären Genen mit bakteriellen EPSPS codierenden Sequenzen beschrieben, die durch Regulatorsequenzen reguliert werden, welche von Genen stammen, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Unter Anwendung dieser Vektoren und Methodologie können Bakterien-Gene, wie das oberwähnte Mutanten-Salmonella EPSPS-Gen, manipuliert und in Pflanzenzellen exprimiert werden.
Gegenstand dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zum genetischen Transformieren von Pflanzenzellen vorzusehen, das bewirkt, daß die daraus regenerierten Zellen und Pflanzen auf Glyphosat und die herbiziden Salze hievon resistent werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung beinhaltet einen Klonierungs- oder Expressionsvektor umfassend ein Gen, das 5-Enolpyruvylshikimat- 3-phosphatsynthase (EPSPS)-polypeptid codiert, das beim Exprimieren in einer Pflanzenzelle ein Chloroplast-Transitpeptid enthält, das ermöglicht, daß das Polypeptid oder ein enzymatisch aktiver Teil hievon vom Zytoplasma der Pflanzenzelle in ein Chloroplast in der Pflanzenzelle transportiert wird, und der Pflanzenzelle und daraus regenerierten Pflanzen einen wesentlichen Glyphosatresistenzgrad verleiht.
Die EPSPS codierende Sequenz kann an einen starken Promotor, wie den 355 Promotor von Blumenkohl-Mosaik-Virus, ligasiert werden, um ein chimäres Gen zu schaffen. Solche Gene können in Pflanzentransformationsvektoren insertiert und danach in Pflanzenzellen eingeschleust werden. Es hat sich gezeigt, daß unter Verwendung derartiger Gene transformierte Pflanzenzellen und daraus regenerierte Pflanzen einen wesentlichen Grad an Glyphosatresistenz zeigen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein chimäres Gen enthaltend eine EPSPS codierende Sequenz, einen ein EPSPS codierendes Gen enthaltenden Klonierungs- oder Expressionsvektor, einen Pflanzentransformationsvektor mit darin insertiertem EPSPS codierenden Gen, unter Verwendung eines solchen Vektors transformierte Pflanzenzellen und daraus regenerierte Pflanzen, die einen wesentlichen Grad an Glyphosatresistenz zeigen, und Verfahren zum Erzeugen solcher Pflanzenzellen und solcher Pflanzen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung angewandten Hauptschritte.
Fig. 2 zeigt die Schaffung von Plasmid pMON546, einem Pflanzentransformationsvektor, der ein chimäres CaMV/EPSPS-Gen enthält. Sie zeigt auch die Struktur von pGV3111-SE, einem entwaffneten Ti-Plasmid mit vir-Genen, die helfen, das CaMV/EPSPS-Gen von pMON546 in Pflanzenchromosome zu insertieren.
Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des Chloroplast-Transitpeptids vom Petunien-EPSPS-Gen und Enzym.
Fig. 4 zeigt das Nucleotid, die Aminosäuresequenz und die Restriktionskarte für die cDNA voller Länge von Petunien-EPSPS.
Fig. 5 zeigt die Plasmidkarte für pMON316.
Fig. 6 zeigt die Restriktionskarten für das EPSPS-Gen von Petunie und Arabidopsis.
Fig. 7 zeigt die Plasmidkarte für pMON9721.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das eine Form von EPSPS codiert, die Pflanzenzellen und daraus regenerierten Pflanzen Glyphosatresistenz (Gly®) wirksam verleihen kann. Das EPSPS-Gen codiert ein Polypeptid, das ein Chloroplast-Transitpeptid (CTP) enthält, das ermöglicht, daß das EPSPS-Polypeptid (oder ein aktiver Teil hiervon) in ein Chloroplast innerhalb der Pflanzenzelle transportiert werden kann. Geeignete Pflanzen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Canola, Flachs, Tomate, Zuckerrübe, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Mais, Weizen, Reis und Lattich.
Fachleute auf diesem Gebiet wissen, daß die wissenschaftliche Literatur zahlreiche Dokumente enthält, die feststellen, daß EPSPS-Aktivität (Shikiminsäureweg) sowohl im Chloroplast als auch im Zytoplasma vorhanden ist. Tatsächlich war es vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt, ob die klonierte EPSPS im Zytoplasma oder in Chloroplasten notwendig wäre, um Glyphosatresistenz zu verleihen. Im Gegensatz zu den Lehren des US-Patentes 4 535 060 wurde nun gefunden, daß das EPSPS-Gen ein Chloroplast-Transitpeptid enthalten sollte. Obwohl Chloroplaste DNA enthalten, von der angenommen wird, daß sie in Polypeptiden innerhalb der Chloroplaste exprimiert wird, wird das EPSPS-Polypeptid eher von chromosomaler DNA als Chloroplast-DNA codiert. Das EPSPS-Gen wird in mRNA im Kern transcribiert und die mRNA in ein Vorläuferpolypeptid (CTP/reife EPSPS) im Zytoplasma translatiert. Das Vorläuferpolypeptid (oder ein Teil hiervon) wird in das Chloroplast transportiert.
In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein chimäres Pflanzen-Gen, das
(a) eine Promotorsequenz, die Transcription des EPSPS-Gens in Pflanzenzellen bewirkt,
b) eine codierende Sequenz, die ein Chloroplast-Transitpeptid/ 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase-Fusionspolypeptid
codiert, welches Chloroplast-Transitpeptid ermöglicht, daß das Fusionspolypeptid oder ein enzymatisch aktiver Teil hievon beim Exprimieren in einer Pflanzenzelle in ein Chloroplast der Pflanzenzelle eingeführt wird, und
(c) eine 3'-nicht-translatierte Region, die ein Polyadenylierungssignal codiert, das in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylatnucleotiden an das 3'-Ende der EPSPS m-RNA zu bewirken, wobei der Promotor in bezug auf die codierende Sequenz heterolog ist und ausreichende Expression des Fusionspolypeptids bewirken kann, um der Pflanzenzelle und daraus regenerierten Pflanzen einen wesentlichen Grad an Glyphosatresistenz zu verleihen, umfaßt.
Promotoren, von denen bekannt ist oder gefunden wurde, daß sie Transcription des EPSPS-Gens in Pflanzenzellen bewirken, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können von Pflanzen oder Viren erhalten werden und sind, ohne unbedingt hierauf beschränkt zu sein, die 35S- und 19S-Promotoren von Blumenkohl-Mosaik-Virus und aus Pflanzen- Genen, wie EPSPS-, ssRUBISCO-Genen, isolierte Promotoren und von T-DNA-Genen von Agrobacterium tumefaciens erhaltene Promotoren, wie Nopalin- und Mannopin-Synthase. Der selektionierte besondere Promotor sollte imstande sein, ausreichende Expression zu bewirken, um zu der Produktion einer wirksamen Menge von EPSPS-Polypeptid zu führen, um die Pflanzenzellen und daraus regenerierte Pflanzen praktisch glyphosatresistent zu machen. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, daß die Menge an EPSPS-Polypeptid, die zum Induzieren von Resistenz notwendig ist, mit der Pflanzenart variieren kann. Der benötigte Expressionsgrad kann mit der verwendeten EPSPS codierenden Sequenz variieren. Eine Mutanten-EPSPS kann niedrigere Expression erfordern als eine weniger verträgliche Wildtyp-EPSPS-Sequenz Der CaMV 35S-Promotor ist stärker als der natürliche EPSPS-Promotor in zumindest einigen Pflanzenarten, d. h. er bewirkt die Bildung größerer Mengen mRNA von chimären Genen im Vergleich mit dem natürlichen EPSPS-Promotor. Die hohe Stärke des chimären CaMV 35S/EPSPS-Gens ist bei Verwendung des EPSPS-Gens als Selektionsmarker im Laboratorium von großem Wert. Wenn jedoch ein chimäres Gen zum Transformieren regenerierter Pflanzen für Nahrungsmittelproduktion verwendet wird, kann der Grad der Produktion von EPSPS-Enzym unerwünscht hoch sein, da er Nucleotide, Aminosäuren und Substrate von anderen erwünschten biochemischen Wegen in den Zellen ablenkt. Daher kann es, um ein chimäres Gen mit dem optimalen Expressionsgrad von EPSPS zu schaffen, erwünscht sein, die Stärke des chimären CaMV 35S/EPSPS-Gens zu vermindern. Dies kann durch verschiedene Methoden erfolgen, wie (1) regellose oder sequenzspezifische Mutagenese der Region vor der Transcriptionsstartstelle; (2) Insertion eines Transcriptionsterminators in der 5'-nicht-translatierten Region des Gens; (3) Insertion eines falschen Startcodons vor dem EPSPS-Startcodon; oder (4) Insertion einer codierenden Sequenz mit einem Startcodon und einem Stopcodon vor dem EPSPS-Startcodon, um eine dicistronische codierende Sequenz zu schaffen.
Die in den EPSPS-Genen dieser Erfindung verwendeten Promotoren können, wenn gewünscht, weiter modifiziert werden, um ihre Expressionscharakteristika zu ändern. Beispielsweise kann der CaMV 35S-Promotor mit dem Teil des ssRUBISCO-Gens ligasiert werden, der die Expression von ssRUBISCO in Abwesenheit von Licht hemmt, um einen Promotor zu schaffen, der in Blättern, aber nicht in Wurzeln aktiv ist. Der erhaltene chimäre Promotor kann, wie hier beschrieben, verwendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "CaMV 35S"-Promotor schließt Variationen des CaMV 35S-Promotors ein, z. B. Promotoren, die mittels Ligasierung mit Operatorregionen, regelloser oder gesteuerter Mutagenese und dgl. modifiziert wurden.
Die durch das EPSPS-Gen produzierte RNA enthält auch eine 5'-nicht-translatierte Leadersequenz. Diese Sequenz kann von einem beliebigen Gen stammen und kann spezifisch modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu erhöhen. Die 5'-nichttranslatierten Regionen können von viralen RNAs, anderen geeigneten eukaryontischen Genen oder einer synthetischen Gensequenz stammen. Sie können Teil des 5'-Endes der nicht-translatierten Region der codierenden Sequenz für das EPSPS-Polypeptid sein oder von einem nicht-verwandten Promotor oder einer nichtverwandten codierenden Sequenz stammen, wie oben angegeben.
Das EPSPS-Gen der vorliegenden Erfindung codiert ein CTP/EPSPS-Fusionspolypeptid. Nachdem das CTP/EPSPS-Polypeptid von einem Gen dieser Erfindung von mRNA im Zytoplasma der transformierten Pflanzenzelle translatiert ist, wird angenommen, daß es auf die gleiche Weise wie das natürliche EPSPS-Polypeptid behandelt wird. Die CTP-Leadersequenz bewirkt, daß das Polypeptid in Chloroplaste eingeführt wird, und es wird angenommen, daß die vom pflanzenabgeleiteten EPSPS-Gen codierte CTP-Leadersequenz vom Rest des Polypeptids entfernt wird, so daß im Chloroplast ein aktiver Teil des EPSPS-Polypeptid existiert und im Chloroplast wirksam ist.
Geeignete CTPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können von verschiedenen Quellen erhalten werden. Am meisten bevorzugt wird das CTP vom endogenen EPSPS-Gen der betreffenden zu transformierenden Pflanze erhalten. Alternativ kann man oft ein CTP von einem EPSPS-Gen einer anderen Pflanze verwenden. Obwohl es wenig Homologie zwischen den CTP-Sequenzen des EPSPS-Gens und des ssRUBISCO-Gens gibt (siehe z. B. Broglie (1983)), kann festgestellt werden, daß nicht-homologe CTPs in besonderen Ausführungsformen funktionieren können. Geeignete CTP-Sequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können leicht bestimmt werden, indem die Chloroplastaufnahme eines EPSPS-Polypeptids, das das interessante CTP umfaßt, untersucht wird, wie im nachstehenden Beispiel 18 beschrieben.
Die Sequenz, die ein EPSPS-Polypeptid codiert, kann von zahlreichen Quellen erhalten werden. Geeignete Quellen sind Bakterien, Pilze und Pflanzen. EPSPS codierende Sequenzen von anderen Quellen können unter Verwendung der Petunien-cDNA voller Länge (siehe Fig. 4) oder eines geeigneten Fragments hievon als Hybridisierungssonde erhalten werden, wie in den Beispielen 1 und 14 bis 17 beschrieben.
Alle Peptidstrukturen, die in der folgenden Beschreibung dargestellt sind, sind im herkömmlichen Format gezeigt, in dem die Aminogruppe am N-Terminus links und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts aufscheint. In gleicher Weise ist die Aminosäurenomenklatur für die in Protein gefundenen natürlich vorkommenden Aminosäuren wie folgt Alanin (Ala; A), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Arginin (Arg; R), Cystein (Cys; C), Glutaminsäure (Glu; E), Glutamin (Gln; Q), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; I), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V).
Fachleuten auf dem Gebiet wird klar sein, daß Mutanten- und Variantenformen von EPSPS durch eine Reihe von Verfahren hergestellt werden können. Beispielsweise können Klonierungs- oder Expressionsvektoren mutagenisiert werden, um einen oder mehrere Aminosäurereste in einem EPSPS-Protein zu verändern. Dies kann auf regelloser Basis (z. B. durch Aussetzen der Wirtszellen an mutagene Mittel, wie Röntgenstrahlen, UV-Licht oder verschiedene Chemikalien) oder durch Mittel, die eine exakte voraussagbare Substitution von Basen in einer DNA-Sequenz involvieren, erfolgen. Alternativ kann man eine Mikrobenquelle, wie Bakterien und Pilze, oder eine Pflanzenquelle mit einer Mutanten-EPSPS, die erhöhte Glyphosatresistenz zeigt, selektionieren.
Die 3'-nicht-translatierte Region enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen so wirkt, daß es die Addition von Polyadenylatnucleotiden an das 3'-Ende der EPSPS-mRNA bewirkt. In Fällen, wo die EPSPS-Sequenz von einer Pflanzenquelle stammt, kann man die mit dem besonderen EPSPS-Gen natürlich assoziierte 3'-nicht-translatierte Region verwenden. Beispiele anderer geeigneter 3'-Regionen sind die 3'-transcribierten, nichttranslatierten Regionen enthaltend das Polyadenylierungssignal von Nopalinsynthase (NOS)-Gen des Agrobacterium-tumorinduzierenden (Ti)-Plasmids oder das Conglycinin (7S)-Speicherprotein-Gen.
Das EPSPS-Gen der vorliegenden Erfindung wird in das Genom einer Pflanze durch jede geeignete Methode insertiert. Geeignete Pflanzentransformationsvektoren sind jene, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens stammen, sowie die z. B. in Herrera-Estrella 1983, Bevan 1983, Klee 1985 und EPO-Veröffentlichung 120 516 (Schilperoort et al.) beschriebenen. Außer den von den Ti- oder wurzelinduzierenden (Ri) Plasmiden von Agrobacterium stammenden Pflanzentransformationsvektoren können alternative Methoden zum Insertieren der EPSPS-Gene dieser Erfindung in Pflanzenzellen verwendet werden. Solche Methoden können beispielsweise Liposome, Elektroporation und Chemikalien, die die Aufnahme freier DNA erhöhen, und die Verwendung von Viren oder Pollen als Vektoren involvieren. Wenn gewünscht, kann mehr als ein EPSPS-Gen in die Chromosome einer Pflanze durch Verfahren, wie Wiederholung des Transformations- und Selektionszyklus mehr als einmal, insertiert werden.
EPSPS-Gene, die ein Enzym mit einem funktionellen Chloroplast-Transitpeptid codieren (das vorzugsweise aus dem reifen EPSPS-Polypeptid entfernt wird), sehen ebenfalls verwendbare Selektionsmarker-Gene für Pflanzenzelltransformation vor, wenn transformierte und nicht-transformierte Zellen mit geeigneten Glyphosatkonzentrationen (die routinemäßig für jede Pflanzenart bestimmt werden können) in Berührung gebracht werden. Das verleihbare Glyphosatresistenzmerkmal kann mit bestimmten Pflanzenarten (wie Luzerne, Sojabohne und anderen Hülsenfrüchten) besonders nützlich sein, die unter Verwendung anderer Selektionsmarker-Gene (wie Kanamycin-, Methotrexat- oder Hygromycinresistenz-Genen) keine klare Selektionsfähigkeit zeigen.
Außerdem können glyphosatresistente Pflanzenzellen, die mit EPSPS-Genen transformiert wurden, unter Verwendung von Standardnährmedien, ergänzt mit selektionierten sprosseninduzierenden oder wurzelinduzierenden Hormonen, unter Anwendung der in PCT WO 84/02920 beschriebenen Methoden oder anderer den Fachleuten bekannten Methoden in differenzierte regeneriert werden.
Wie hier verwendet, "verleiht ein EPSPS-Gen einer Pflanzenzelle einen wesentlichen Glyphosatresistenzgrad", wenn eine selektionierbare Fraktion einer Kultur von transformierten Pflanzenzellen eine Glyphosatkonzentration überleben kann, die im wesentlichen alle nicht-transformierten Zellen der gleichen Pflanzenart unter den gleichen Bedingungen abtötet.
Der hier verwendete Ausdruck "Klonierungs- oder Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA- oder RNA-Molekül, das zum Replizieren in einer oder mehreren Arten von Mikrobenzellen imstande ist. Vektoren schließen Plasmide, Cosmide, virale DNA oder RNA, Minichromosome und dgl. ein.
Der hier verwendete Ausdruck "repliziert aus" schließt indirekte Replikation (z. B. Replikation von Zwischenvektoren) sowie Replikation direkt aus Pflanzen-DNA oder mRNA ein. Er schließt auch DNA ein, die unter Verwendung einer Basensequenz synthetisiert wird, die veröffentlicht oder experimentell bestimmt wurde (z. B. durch das Verfahren von Adams, 1983).
Die folgenden Beispiele zeigen weiter verschiedene bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung. Die Fachleute kennen zahlreiche Äquivalente zu den hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen. Solche Äquivalente sollen unter den Umfang der Ansprüche fallen.

BEISPIELE

Beispiel 1: Schaffung von EPSPS-Vektoren

A. Schaffung der MP4-G-Zellinie

Die Ausgangszellinie, MP4-Linie bezeichnet, stammte von einer diploiden Mitchell-Petunie (siehe z. B. Ausubel 1980). Die MP4-Zellen wurden in Murashige und Skoog (MS)-Kulturmedium (Gibco, Grand Island, N.Y.) suspendiert. Der gesamte Transfer beinhaltete das Transferieren von 10 ml Suspensionskultur in 50 ml frisches Medium. Kultivierungszeiträume bis zum nächsten Transfer betrugen 10 bis 14 Tage und basierten auf visuellen Angaben, daß sich die Kultur Sättigung näherte.
Ungefähr 10 ml gesättigte Suspensionskultur (enthaltend etwa 5·10&sup6; Zellen) wurden in 50 ml MS-Medium enthaltend 0,5 mM Glyphosat (Monsanto Agric. Products Co., St. Louis, Missouri) transferiert. Das Natriumsalz von Glyphosat wurde durchwegs in den hier beschriebenen Versuchen verwendet. Der Großteil der Zellen war nicht imstande, in Anwesenheit des Glyphosats zu reproduzieren. Die Zellen, die überlebten (mit weniger als 1% der Ausgangspopulation bestimmt), wurden in 0,5 mM Glyphosat kultiviert und alle 10 bis 14 Tage auf glyphosathaltiges frisches Medium transferiert.
Nach zwei Transfers wurden die überlebenden Zellen in 1,0 mM Glyphosat enthaltendes frisches Medium transferiert. Nach zwei Transfers bei 1,0 mM wurden die überlebenden Zellen der Reihe nach in 2,5 mM Glyphosat, 5,0 mM Glyphosat und 10 mM Glyphosat transferiert.
Danach zeigte sich (durch Southern-Blot), daß die MP4-G-Zellen auf Grund eines "Genamplifikation" genannten genetischen Prozesses (siehe z. B. Schimke, 1982) etwa 15 bis 20 Kopien des EPSPS-Gens aufwiesen. Obwohl während der Replikation jeder Zelle spontane Mutationen aufgetreten sein könnten, gibt es keinen Hinweis, daß irgendeine Mutation oder andere Modifikation des EPSPS-Gens während des Genamplifikationsprozesses erfolgt ist. Der einzige bekannte Unterschied zwischen den MP4- und den MP4-G-Zellen ist, daß die MP4-G-Zellen multiple Kopien eines EPSPS-Gens enthalten und sich möglicherweise andere Gene nahe demselben auf den Chromosomen der Zellen befinden.

B. Reinigung und Sequenzierung von EPSPS-Enzym

Petunienzellen von-der MP4-Zellinie wurden durch Vakuumfiltration geerntet, unter flüssigem N&sub2; gefroren und in einem Waring-Mischer zu einem Pulver gemahlen. Das Pulver wurde in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,8, enthaltend 1 mM EDTA und 7,5% G/V Polyvinylpolypyrrolidon suspendiert. Die Suspension wurde 10 min bei etwa 20 000 g zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Nucleinsäuren wurden vom Überstand durch Zusatz von 0,1 Volumen 1,4%igem Protaminsulfat ausgefällt und verworfen.
Die rohe Proteinsuspension wurde durch fünf aufeinanderfolgende Schritte gereinigt (siehe Mousdale 1984 und Steinrucken 1985), die involvierten: (1) Ammoniumsulfatfällung; (2) Diethylaminoethylzellulose- Ionenaustauschchromatographie; (3) Hydroxyapatitchromatographie; (4) Sieben auf einem Phenylagarosegel und (5) Sieben auf einem Sephacryl S-200-Gel.
Das gereinigte EPSPS-Polypeptid wurde durch Edman-Abbau mit einem Model 470A Protein Sequencer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Anwendung der in Hunkapiller 1983a beschriebenen Verfahren in eine Reihe von einzelnen Aminosäuren abgebaut. Jedes Aminosäurederivat wurde durch Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wie von Hunkapiller 1983b beschrieben, unter Verwendung einer Cyanopropylsäule mit über 22 000 theoretischen Platten (IBM Instruments, Wallingford, CT) analysiert. Eine partielle Aminosäuresequenz für Petunien- EPSPS ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Petunien-EPSPS-Sequenzen Aminosäure: mRNA-Strang komplementärer DNA-Strang: Synthetische DNA-Sonden: Exakte mRNA-Sequenz:

C. Synthese von Sonden

Unter Anwendung des genetischen Codes wurde die in Tabelle 1 angegebene Aminosäuresequenz zum Bestimmen der möglichen DNA-Codons, die zum Codieren für jede angegebene Aminosäure imstande sind, verwendet. Unter Anwendung dieser Information wurden drei verschiedene Sondenmischungen geschaffen und EPSP-1, EPSP-2 und EPSP-3 bezeichnet, wie in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle stellen A, T, U, C und G die Nucleotidbasen Adenin, Thymin, Uracil, Cytosin und Guanin dar. Die Buchstaben P, Q und N sind Variable: N stellt jede der Basen dar, P Purine (A oder G) und Q Pyrimidine (U, T oder C).
Alle Oligonucleotide wurden durch die Methode von Adams 1983 synthetisiert. Wann immer eine unbestimmte Nucleotidstellung (P, Q oder N) erreicht wurde, wurde eine Mischung geeigneter Nucleotide zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Sonden wurden 20 pMol zu einem Zeitpunkt kurz vor Verwendung mit 100 uCi γ-[³²P]-ATP (Amersham) und 10 Einheiten von Polynucleotidkinase in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,1 mM Spermidin markiert. Nach Inkubation während 1 h bei 37ºC wurden die Sonden entweder auf einem 20% Acrylamid, 8 M Harnstoffgel oder durch Leiten über eine 5 ml Säule von Sephadex G25 in 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA wieder gereinigt.

D. Herstellung von mRNA und vorläufiges Testen von Sonden

(a) Poly-A mRNA

Gesamt-RNA wurde aus den MP4 (glyphosatempfindlichen) und MP4-G (glyphosatresistenten)-Zellinien isoliert, wie von Goldberg 1981 beschrieben. Gesamt-RNA wurde durch ein CsCl-Kissen weiter sedimentiert, wie von Depicker 1982 beschrieben. Poly-A mRNA wurde durch Oligo-dT-Zellulosechromatographie selektioniert. Die Ausbeute an Poly-A-RNA betrug 1,1 ug/g MP4-Zellen und 2,5 ug/g MP4-G-Zellen.

(b) Gelbehandlung von RNA

10 ug Poly-A-RNA von der MP4- oder MP4-G-Zellinie wurden mit Ethanol ausgefällt und in 1 · MOPS-Puffer (20 mM Morpholinopropansulfonsäure, pH 7,0, 5 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA, pH 8,0) enthaltend 50% Formamid und 2,2 M Formaldehyd resuspendiert. RNA wurde durch Erhitzen während 10 min auf 65ºC denaturiert. 1/5 Volumen eines Beladungspuffers enthaltend 50% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,4% Bromphenolblau und 0,4% Xylolcyanol wurde dann zugesetzt. RNA wurde auf einem 1,3% Agarosegel enthaltend 1,1 M Formaldehyd fraktioniert, bis das Bromphenolblau fast am Boden war. HaeIII-verdaute ΦX174 DNA, mit ³²P markiert, wurde als Größenstandard verwendet. Die DNA-Marker gaben ungefähre Größen für die RNA-Banden an.

(c) Transfer von RNA auf Nitrozellulose

RNA wurde durch Blotting der Gele über Nacht unter Verwendung von 20X SSC (1X SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) als Transferpuffer auf Nitrozellulose transferiert (Nr. BA85, Schleicher & Schuell, Keene, NH). Nach dem Transfer wurden Filter luftgetrocknet und in einem Vakuumheizschrank 2 bis 3 h bei 80ºC getrocknet.

(d) Vorläufige Hybridisierung mit radioaktiven Sonden

Filter wurden in 6X SSC, 10 · Denhardt-Lösung (1· Denhardt- Lösung ist 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin), 0,5% NP-40 und 200 ug/ml E. coli-Transfer-RNA 4 h bei 50ºC vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde in der frischen Lösung enthaltend 2·10&sup6; cpm/ml EPSP-1- oder EPSP-2-Sonde während 48 h bei 32ºC durchgeführt. Die EPSP-3-Sonde wurde nicht getestet, da sie ein Codon (ATA) enthielt, das im Petuniengenom selten verwendet wird. Die in jedem Fall verwendete Hybridisierungstemperatur (32ºC) lag 10ºC unter der Dissoziationstemperatur (Td), berechnet für das Oligonucleotid mit dem niedrigsten GC-Gehalt in einer Mischung. Die Td der Sonde wurde durch die Formel 2ºC · (A + T) + 4ºC · (G + C) approximiert.

(e) Waschen des Filters

Die Filter wurden zweimal während 15 bis 20 min bei Raumtemperatur in 6X SSC und dann 5 min bei 37ºC unter leichtem Schütteln gewaschen. Die Filter wurden dann in eine Kunststoffolie eingehüllt und 12 bis 14 h bei -70ºC mit zwei Intensivierungssieben autoradiographiert. Dann wurden die Filter wieder 5 min unter leichtem Schütteln bei einer Temperatur gewaschen, die 5ºC höher war als die vorher angewandte. Die Filter wurden wieder 12 bis 14 h autoradiographiert. Die Autoradiogramme zeigten, daß die EPSP-1-Sonde zu einer RNA von ungefähr 1,9 kb in der die Poly-A-RNA von der MP4-G-Zellinie enthaltenden Bahn hybridisierte. Keine Hybridisierung zu dieser RNA wurde in der die Poly-A-RNA von der MP4-Zellinie enthaltenden Bahn nachgewiesen. Dieses Ergebnis wurde einer Überproduktion von EPSPS-mRNA durch die MP4-G-Zellinie zugeschrieben. Die Sonde EPSP-2, die sich von EPSP-1 durch ein einziges Nucleotid unterscheidet, zeigte kaum nachweisbare Hybridisierung zu der 1,9 kb mRNA der MP4-G-Zelllinie, hybridisierte aber stark zu einer 1,0 kb mRNA von beiden Zellinien. Jedoch war die 1,0 kb DNA zum Codieren eines Polypeptids von 50 000 Dalton nicht ausreichend, und es wird angenommen, daß eine der Sequenzen in der EPSP-2-Sonde zu einer völlig anderen Sequenz in der Bibliothek hybridisierte. Diese Ergebnisse ließen vermuten, daß degenerierte Sondenmischung EPSP-1 die korrekte Sequenz für EPSPS enthielt. Diese Mischung wurde in allen folgenden degenerierten Sonden-Hybridisierungsversuchen verwendet.

E. Herstellung von λgt 10 cDNA-Bibliothek

(a) Verwendete Materialien

AMV-reverse Transciptase wurde von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Florida, gekauft; das große Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow Polymerase) stammte von New England Nuclear, Boston, MA; S1 Nuclease und tRNA stammten von Sigma; AcA 34-Säulenbettharz stammte von LKB, Gaithersburg, MD; EcoRI, EcoRI-Methylase und EcoRI-Linker stammten von New England Biolabs, Beverly, MA; RNasin (Ribonucleaseinhibitor) stammte von Promega Biotech, Madison, Wisc., und alle radioaktiven Verbindungen von Amersham, Arlington Hts., IL.
Der λgt10-Vektor (ATCC Nr. 40179) und assoziierte E. coli- Zellinien wurden von Thanh Huynh und Ronald Davis der Stanford University Medical School geliefert (siehe Huynh 1985). Dieser Vektor hat drei wichtige Merkmale: (1) er weist eine einzige EcoRI-Insertionsstelle auf, die die Notwendigkeit der Entfernung eines Mittelteils der DNA von der Phagen-DNA vor Insertieren neuer DNA vermeidet; (2) DNA mit einer Größe von Null bis etwa 8000 Basen kann unter Verwendung dieses Vektors kloniert werden und (3) eine Bibliothek kann unter Verwendung von E. coli MA150-Zellen (ATCC Nr. 53104) zum Entfernen von Klonen, die keine DNA-Inserts aufweisen, behandelt werden.

(b) cDNA-erste Strangsynthese

Poly-A-mRNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1.D.a beschrieben, und in 50 mM Tris (pH 8,5), 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM DTT, 40 mM KCl, 500 uCM d(AGCT)TP, 10 ug/ml dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Primer und 27,5 Einheiten/ml RNasin resuspendiert. In einem 120 ul-Reaktionsvolumen wurden 70 Einheiten reverse Transcriptase pro 5 ug Poly- A-RNA zugesetzt. Ein Reaktionsröhrchen enthielt Q-³²P-dCTP (5 uCi/120 ul Reaktionsmischung), um die Beobachtung der cDNA-Größe und Ausbeute zu ermöglichen und eine erste Strangmarkierung zum Beobachten späterer Reaktionen vorzusehen. Um die mRNA-Sekundärstruktur zu zerstören, wurde mRNA in H&sub2;O 3 h bei 70ºC inkubiert und das Röhrchen auf Eis abgekühlt. Reverse Transciptase wurde zugesetzt und die cDNA-Synthese 60 min bei 42ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 50 mM beendet. Die cDNA-Ausbeute wurde durch TCA-Fällungen von am Beginn der Reaktion und nach 60 min entfernten Proben beobachtet. Nach cDNA- Synthese existierte die cDNA als ein cDNA-RNA-Hybrid. Das cDNA- RNA-Hybrid wurde durch Erhitzen der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1,5 min denaturiert und auf Eis gekühlt.

(c) Zweite Strang-DNA-Synthese

Einsträngige cDNA wurde für zweite Strangsynthese selbstprimen gelassen. Sowohl Klenow-Polymerase als auch reverse Transcriptase wurden zum Überführen von ss cDNA in ds cDNA verwendet. Klenow-Polymerase wird zuerst verwendet, weil angenommen wird, daß ihre 3',5'-Exonuclease-Wiederherstellungsfunktion imstande ist, durch Selbstpriming gebildete nicht-glatte DNA-Enden zu verdauen, und dann diese glatten Enden mit ihrer Polymeraseaktivität ausdehnen kann. Reverse Transcriptase wird zusätzlich zur Klenow-Polymerase verwendet, weil angenommen wird, daß reverse Transcriptase weniger wahrscheinlich vorzeitig aufhört, wenn sie sich einmal an einen Matrizenstrang gebunden hat. Die Klenow-Polymerase-Reaktion erfolgte in einem Endvolumen von 100 ul ausschließlich Enzym. Die Reaktionsmischung enthielt 50 mM HEPES, pH 6,9, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl und jeweils 500 uM dNTP und cDNA. Um die Reaktion einzuleiten, wurden 20 bis 40 Einheiten Klenow-Polymerase (gewöhnlich weniger als 5 ul) zugesetzt und die Röhrchen 5 h bei 15ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von EDTA auf 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit Phenol extrahiert und die Nucleinsäuren wurden ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.
Die reverse Transciptase-Reaktion zum weiteren Verlängern des antikomplementären DNA-Stranges wurde durchgeführt, wie für die Reaktion zum ursprünglichen Synthetisieren von cDNA beschrieben, ausgenommen, daß dT&sub1;&sub0;&submin;&sub1;&sub8;-Primer und RNasin fehlten und in einer 120 ul-Reaktion 32 Einheiten reverse Transcriptase verwendet wurden. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und die Nucleinsäure wurde ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.

(d) S1-Nucleasebehandlung

200 ul 2·S1-Puffer (1·51-Puffer ist 30 mM Natriumacetat, pH 4,4, 250 mM NaCl, 1 mM ZnCl&sub2;), 175 ul H&sub2;O und 525 Einheiten S1-Nuclease wurden den Röhrchen enthaltend 125 ul des Reaktionsproduktes der zweiten Strangsynthese zugesetzt. Die Röhrchen wurden 30 min bei 37ºC inkubiert und die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 50 mM beendet. Die Mischung wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die wässerige Phase wurde mit Äther extrahiert, um restliches Phenol zu entfernen. Die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt und luftgetrocknet.

(e) EcoRI-Methylierungsreaktion

Da die ds cDNAs von einer Vielzahl von mRNAs kopiert wurden, enthielten viele der ds cDNAs wahrscheinlich innere EcoRI- Restriktionsstellen. Es war erwünscht, solche Spaltstellen vor EcoRI-Spaltung zu schützen, um die Verwendung von EcoRI-Linkern mit glatten Enden zu ermöglichen, die danach mit EcoRI gespalten wurden, um an den Termini kohäsive Überhänge zu schaffen.
In einem Versuch, die unerwünschte Spaltung von inneren EcoRI-Stellen zu verhindern, wurde die ds cDNA unter Verwendung von EcoRI-Methylase methyliert. DNA-Pellets wurden in 40 ul 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und 5 mM DTT gelöst. 4 ul 100 uM S-Adenosyl-L-methionin und 2 ul (80 Einheiten) EcoRI-Methylase wurden zugesetzt. Röhrchen wurden 15 min bei 37ºC und dann 10 min bei 70ºC inkubiert, um die Methylase abzutöten.
Es wurde dann entdeckt, daß die im nachstehenden beschriebene Methylierungsreaktion beim Verhindern von EcoRI-Spaltung an einer inneren Sequenz innerhalb der EPSPS codierenden Region nicht erfolgreich war, offensichtlich wegen inaktivem Methylasereagens. Die Spaltung der inneren EcoRI-Sequenz erforderte zusätzliche Schritte zum Isolieren einer cDNA voller Länge, wie im nachstehenden beschrieben. Um diese zusätzlichen Schritte zu vermeiden, wenn eine andere Bibliothek geschaffen wird, sollten die Methylierungsreagentien und Reaktionsbedingungen gleichzeitig auf die cDNA und auf Kontrollfragmente von DNA angewendet werden, und Schutz der Kontrollfragmente sollte durch EcoRI- Verdau bestätigt werden, bevor Verdau an der cDNA durchgeführt wird.

(f) DNA-Polymerase I-Auffüllreaktion

Dem 45 ul cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) enthaltenden Röhrchen wurden 5 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 5 ul 0,2 mM d(ACGT)TP und 10 Einheiten DNA-Polymerase I zugesetzt. Das Röhrchen wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 25 mM beendet. 1 ug ungeschnittene λgt10 DNA wurde als Träger zugesetzt und die Mischung mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die Nucleinsäure in der Mischung wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) ausgefällt. Die Nucleinsäure in der Mischung wurde mit Ethanol ausgefällt, zentrifugiert und getrocknet.

(g) Ligasierung von EcoRI-Linkern an methylierte ds cDNA

Ungefähr 400 pMol EcoRI-Linker (5'CGGAATTCCG3') wurden in 9 ul 20 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT enthaltend 50 uCi α-³²P-ATP (5000 Ci/mMol) und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase gelöst. Die Oligonucleotide wurden 30 min bei 37ºC inkubiert, um sie assoziieren zu lassen, wobei doppelsträngige Linker mit glatten Enden geschaffen wurden. 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und 1 ul 10 mM ATP wurden zugesetzt und weitere 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Linker wurden bei -20ºC gelagert. Das methylierte DNA-Pellet wurde in Röhrchen enthaltend 400 pMol der kinasierten Linker resuspendiert. Die Ligasierung der EcoRI-Linker an die methylierte DNA wurde durch Zusetzen von 1 ul T4-Ligase und Inkubieren der Reaktionsmischung während 2 Tagen bei 12 bis 14ºC durchgeführt.

(h) Verdau mit EcoRI zum Schaffen kohäsiver Termini

Zu 11 ul des Reaktionsproduktes von Beispiel 1.E.(g) wurden 10 ul einer Lösung enthaltend 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4; und 200 mM NaCl zugesetzt. T4 DNA-Ligase wurde durch Inkubation während 10 min bei 70ºC wärmeinaktiviert. 40 Einheiten EcoRI wurden zugesetzt und die Inkubation 3 h bei 37ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 50 mM beendet. Die Probe wurde durch Zentrifugieren geklärt und auf eine AcA 34-Säule aufgebracht.

(i) AcA 34-Säulenchromatographie

Freie Linker (die nicht an ds cDNA ligasierten) wurden von ds cDNA mit angefügten Linkern entfernt, um zu verhindern, daß sie die Insertion der gewünschten ds cDNAs in die Klonierungsvektoren beeinträchtigen. Aca 34-Harz (eine Mischung von Acrylamid und Agarosekügelchen, gewöhnlich zum Klassieren verwendet), vorgequollen in 2 mM Citratpuffer und 0,04% Natriumazid in Wasser, wurden bis zur 1 ml-Marke einer 1 ml Kunststoffspritze, die mit Glaswolle verstopft war, zugesetzt. Die Säule wurde mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA und 400 mM NaCl äquilibriert. Die ds cDNA-Mischungen mit ligasierten Linkern und freien Linkern (ungefähr 45 ul) wurden auf 400 mM NaCl gebracht. 1 ul 0,5% Bromphenolblau-Farbstoff (BPB) wurde zugesetzt und die Probe auf die Säule aufgebracht, die in Äquilibrierungspuffer bei Raumtemperatur laufen gelassen wurde. Zehn 200 ul-Fraktionen wurden gesammelt. Der BPB-Farbstoff eluierte normal aus der Säule im sechsten Röhrchen oder später. Die Röhrchen 1 und 2 wurden vereinigt und als Quelle von ds cDNA zum Klonieren verwendet.

(j) Zusammenbau von λgt10-Klonen

Die ds cDNA wurde mit 1 ug EcoRI-geschnittener λgt10-DNA gemischt, mit Ethanol ausgefällt und zentrifugiert. Nach Waschen des Pellets einmal mit 70% Äthanol wurde das DNA-Pellet luftgetrocknet und in 4,5 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl resuspendiert. Zum Vereinigen und Ligasieren der cDNA-Inserts an den linken und rechten Arm der λgt10-DNA wurde die Mischung 3 min auf 70ºC und dann 15 min auf 50ºC erhitzt. Die Mischung wurde auf Eis abgekühlt und jeweils 0,5 ul 10 mM ATP, 0,1 M DTT und ausreichend T4 DNA-Ligase zum Gewährleisten mindestens 90% Komplettierung wurden zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 14ºC inkubiert, was die Insertion der ds cDNA in die EcoRI-Stelle der λgt10 DNA ermöglichte. Die resultierende DNA wurde in Phagenteilchen in vitro unter Anwendung der von Scherer 1981 beschriebenen Methode gepackt.

(k) Entfernung von Phagen ohne Inserts

Die Insertion einer cDNA in die EcoRI-Stelle von λgt10 resultiert in der Inaktivierung des Cl-Gens. λgt10-Phagen mit inaktivierten Cl-Genen (d. h. mit Inserts) replizieren normal in E. coli MA150-Zellen. Im Gegensatz dazu sind λgt10-Phagen ohne Inserts zum Replizieren im MA150-Stamm von E. coli nicht imstande. Dies sieht ein Verfahren zum Entfernen von λgt10-Klonen, die keine Inserts aufweisen, vor.
Die Phagen in der Bibliothek wurden zuerst in E. coli C600 (M&spplus;R&supmin;)-Zellen repliziert, wodurch die λgt10-DNA modifiziert wurde, um sie vor dem E. coli MA150-Restriktionssystem zu schützen. Eine relativ kleine Zahl von E. coli C600-Zellen wurde infiziert und dann mit einem 20-fachen Überschuß von MA150 (M&spplus;R&spplus;)-Zellen plattiert. Die primäre Infektion erfolgte so in den M&spplus;R&supmin;-Zellen, wo alle Phagen wachsen, es erfolgten jedoch aufeinanderfolgende Replikationsrunden in den MA150-Zellen, die die Replikation von Phagen ohne Inserts verhinderten. Die amplifizierte Phagenbibliothek wurde von den Platten gesammelt und nach Entfernung von Agar und anderen Verunreinigungen durch Zentrifugieren waren die rekombinanten Phagen zur Verwendung in Screeningexperimenten bereit.

F. Screening von cDNA-Bibliothek; Selektion von pMON9531

Ungefähr 6000 Phagen (jede Platte) wurden auf 10·10 cm quadratische Platten von festem NZY-Agar (Maniatis 1982) mit 0,7% Agarose aufgetragen. Eine transluzente Bahn von E. coli MA150-Zellen wuchs auf den Platten. Bereiche, wo die Phagen die E. coli-Zellen infizierten und abtöteten, wurden durch "Plaques" bezeichnete klare Bereiche angezeigt, die gegen die Bahn von Bakterien nach einer Inkubation der Platten bei 37ºC über Nacht sichtbar waren. Sechs Platten wurden auf diese Weise hergestellt. Die Plaques wurden etwa 30 min gegen vorgeschnittene Nitrozellulosefilter gepreßt. Dadurch wurde eine symmetrische Kopie der Plaques gebildet. Um die Phagen-DNA zu fixieren, wurden die Filter 5 min mit 0,5 M NaOH und 2,5 M NaCl behandelt. Die Filter wurden dann nacheinander mit 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5, und 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 2,5 M NaCl zum Neutralisieren des NaOH behandelt. Dann wurden sie zum Entfernen von Bakteriendebris in Chloroform eingeweicht. Danach wurden sie luftgetrocknet und unter einem Vakuum 2 h bei 80ºC gehärtet und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Filter wurden dann mit ³²P-markierter EPSP-1-Sonde (2·10&sup6; cpm/Filter) hybridisiert, wie in Beispiel 1.D(e) beschrieben. Nach 48 h Hybridisierung wurden die Filter in 6X SSC bei Raumtemperatur zweimal während 20 min und dann bei 37ºC während 5 min gewaschen. Diese Wäschen entfernten nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle, während Sondenmoleküle mit der exakten korrespondierenden Sequenz (die zu dieser Zeit unbekannt war) an die Phagen-DNA am Filter gebunden blieb. Die Filter wurden nach der letzten Wäsche durch Autoradiographie analysiert. Nach dem ersten Screeningschritt erschienen sieben positiv hybridisierende Signale als schwarze Flecken auf den Autoradiogrammen. Diese Plaques wurden von den Platten entfernt und auf die frischen Platten mit einer Dichte von 100 bis 200 Plaques/Platte replattiert. Diese Platten wurden unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens gescreent. Vier positiv hybridisierende Phagen wurden selektioniert. DNA wurde von jedem dieser vier- Klone isoliert und mit EcoRI verdaut, um die Größen der cDNA-Inserts zu bestimmen. Der das größte cDNA-Insert, ungefähr 330 bp, enthaltende Klon wurde selektioniert und λE3 bezeichnet. Das cDNA-Insert von λE3 wurde in Plasmid pUC9 (Vieira 1981) insertiert und das resultierende Plasmid wurde pMON9531 bezeichnet.
Um zu bestätigen, daß der pMON9531-Klon die gewünschte EPSPS-Sequenz enthält, wurde das Insert vom pMON9531-Klon durch Verdau mit EcoRI entfernt. Dieses DNA-Fragment wurde dann durch die chemische Abbaumethode von Maxam 1977 sequenziert. Die von der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz entsprach der in Tabelle 1 gezeigten partiellen EPSPS-Aminosäuresequenz.

G. Schaffung von λF7 genomischem DNA-Klon

Um das gesamte EPSPS-Gen zu erhalten, wurde chromosomale DNA von der MP4-G-Zellinie mit BamHI verdaut und in einen Phagenvektor kloniert, um eine Bibliothek zu schaffen, die unter Verwendung der partiellen EPSPS-Sequenz von pMON9531 als Sonde gescreent wurde.

(a) Herstellung von MP4-G chromosomalen DNA-Fragmenten

MG4-G-Zellen wurden gefroren und in einer Reibschale mit zerkleinertem Glas in Anwesenheit von flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die pulverisierten Zellen wurden mit 8 ml/g kaltem Lysepuffer enthaltend 8,0 M Harnstoff, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris- HCl (pH 7,5), 0,02 M EDTA, 2% Sarkosyl und 5% Phenol gemischt. Die Mischung wurde mit einem Glasstab gerührt, um große Klumpen aufzubrechen. Ein gleiches Volumen einer 3:1 Mischung von Phenol und Chloroform enthaltend 5% Isoamylalkohkol wurde zugesetzt. Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde auf eine Endkonzentration von 0,5% zugesetzt. Die Mischung wurde 10 bis 15 min bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform aufgewirbelt. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 6000·g während 15 min getrennt. Die Phenol/Chloroformextraktion wurde wiederholt. Natriumacetat wurde der wässerigen Phase auf eine Endkonzentration von 0,15 M zugesetzt und die DNA mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch- Zentrifugieren gesammelt, in 1·TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst und in einen CsCl-Ethidiumbromidgradienten gegeben. Die DNA wurde durch Durchbohren der Röhrchenseite mit einer 16 Gauge-Nadel gesammelt. Das Ethidiumbromid wurde mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert und die DNA extensiv gegen 1·TE dialysiert. Ungefähr 400 ug DNA wurden aus 12 g Zellen isoliert.
MP4-G chromosomale DNA (10 ug) wurde zur Komplettierung mit 30 Einheiten BamHI in einem Puffer enthaltend 10 mM Tris, pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl während 2 h bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert, gefolgt von Extraktion mit Chloroform, und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA- Fragmente wurden in 2·TE bei einer Konzentration von 0,5 ug/ul suspendiert.

(b) Klonieren von MP4-G chromosomalen DNA-Fragmenten in λMG14

DNA vom Phagen λMG14 (erhalten von Dr. Maynard Olson der Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri) wurde durch die in Maniatis 1982 beschriebene Methode hergestellt. 150 ug DNA wurden zur Komplettierung mit BamHI in einem Puffer enthaltend 10 mM Tris-HCI, pH 7,8, 1 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCI verdaut. Die Komplettierung des Verdaus wurde durch Elektrophorese durch 0,5% Agarosegel geprüft. Die Phagen- DNA wurde dann zweimal mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde in 1·TE bei einer Konzentration von 150 ug/ml resuspendiert. MgCl&sub2; wurde auf 10 mM zugesetzt und 1 h bei 42ºC inkubiert, um die Reassoziierung der kohäsiven Enden von λDNA zu ermöglichen. Die Assoziation wurde durch Agarosegel-Elektrophorese geprüft.
Nach der Assoziierung wurde DNA über einen 38 ml (10 bis 40% G/V) Saccharosegradienten in einem Beckman SW27 Ultrazentrifugenrohr geschichtet. Die Gradientenlösungen wurden in einem Puffer enthaltend 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 5 mM EDTA hergestellt. 75 ug DNA wurden auf jeden Gradienten geladen. Die Proben wurden bei 26 000 UpM 24 h bei 15ºC in einem Beckman SW27 Rotor zentrifugiert. Fraktionen (0,5 ml) wurden vom Oberteil des Zentrifugenrohres gesammelt und durch Gelelektrophorese auf die Anwesenheit von DNA analysiert. Die die assoziierten linken und rechten Arme von λDNA enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben, gegen TE dialysiert und mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNA wurde in TE bei einer Konzentration von 500 ug/ml gelöst.
Die gereinigten Arme der Vektor-DNA und die BamHI-Fragmente von MP4-G DNA wurden bei einem Molverhältnis von 4:1 und 2:1 gemischt und unter Verwendung von TfDNA-Ligase in einem Ligasepuffer enthaltend 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 1 mM ATP ligasiert. Die Ligasierungen wurden über Nacht bei 15ºC durchgeführt. Ligasierung wurde durch Agarosegel-Elektrophorese geprüft. Ligasierte Phagen-DNA enthaltend Inserts von MP4-GDNA wurden in Phagencapside in vitro unter Verwendung von im Handel erhältlichen Packungsextrakten (Promega Biotech, Madison, WI) gepackt. Der gepackte Phage wurde auf 10·10 cm quadratische Platten von NZY-Agar in 0,7% Agarose bei einer Dichte von ungefähr 6000 Plaques pro Platte unter Verwendung von E. coli C600-Zellen plattiert. Nach Inkubation bei 37ºC über Nacht hatten sich die Plaques gebildet und die Platten wurden vom Inkubator entfernt und während mindestens 1 h auf 4ºC abgekühlt. Die Agarplatten wurden 30 min gegen Nitrozellulosefilter gepreßt, um Phagen zu den Filtern zu transferieren, und die Phagen-DNA wurde an den Filtern fixiert, wie oben beschrieben. Jedes Filter wurde 40 h bei 42ºC mit ungefähr 1,0·10&sup6; cpm/ Filter des vom pMON9531-Klons isolierten 330 bp cDNA-Inserts hybridisiert, welcher Klon unter Anwendung des in Maniatis 1982 beschriebenen Verfahrens nick-translatiert worden war. Die spezifische Aktivität der Sonde war 2 bis 3·10&sup8; cpm/ug DNA. Die Hybridisierung wurde in einer Lösung enthaltend 50% Formamid, 5X SSC, 5 · Denhardt-Lösung, 200 ug/ml tRNA und 0,1 SDS durchgeführt. Filter wurden in 1 · SSC, 0,2% SDS bei 50ºC gewaschen und autoradiographiert. Mehrere positive Signale wurden festgestellt und mit Plaques auf der entsprechenden Platte verglichen. Die selektionierten Plaques wurden aufgehoben, in SM-Puffer suspendiert und auf NYZ-Agar plattiert. Der Replikaplatten- Screeningprozeß wurde bei niedrigeren Dichten wiederholt, bis alle Plaques auf den Platten positive Signale zeigten. Ein Isolat wurde für weitere Analyse selektioniert und als der λF7-Phagenklon bezeichnet.

H. Schaffung von pMON9543 und pMON9566

Die DNA von λF7 wurde (separat) mit BamHI, BglII, EcoRI und HindIII verdaut. Die DNA wurde mit einer nick-translatierten EPSPS-Sequenz von pMON9531 in einem Southern-Blottingverfahren hybridisiert. Dies zeigte, daß sich die komplementäre Sequenz von λF7 auf einem 4,8 kb BglII-Fragment befand. Dieses Fragment wurde in Plasmid pUC9 (Vieira 1982) insertiert, repliziert, nick-translatiert und zum Sondieren der Petunien-cDNA-Bibliothek unter Anwendung von Hybridisierungsbedingungen, wie in Beispiel 1.G beschrieben, unter Verwendung von 106 cpm pro Filter verwendet. Ein cDNA-Klon mit einer Sequenz, die sich an die λF7-Sequenz band, wurde identifiziert und pMON9543 bezeichnet.
DNA-Sequenzanalyse (Maxam 1977) zeigte, daß pMON9543 das Stopcodon oder die 3'-nicht-translatierte Region des EPSPS-Gens nicht enthielt. Daher wurde die EPSPS-Sequenz von pMON9543 entfernt, nick-translatiert und als Sonde zum erneuten Screening der cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Klon, der mit der EPSPS-Sequenz hybridisierte, wurde identifiziert und als pMON9556 bezeichnet. DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das Insert in diesem Klon die gesamte 3'-Region des EPSPS-Gens einschließlich eines polyadenylierten Schwanzes enthielt. Das 5'-EcoRI-Ende dieses Inserts paßte zum 3'-EcoRI-Ende des EPSPS-Inserts in pMON9531.
Eine vollständige EPSPS codierende Sequenz wurde durch Ligasieren der EPSPS-Inserts von pMON9531 und pMON9556 geschaffen.

I. Schaffung des pMON546-Vektors mit CaMV 35S/EPSPS-Gen

Das EPSPS-Insert in pMON9531 wurde durch sequenzgerichtete Mutagenese (Zoller et al., 1983) unter Verwendung eines M13- Vektors (Messing 1981 und 1982) modifiziert, um eine BglII- Stelle in der 5'-nicht-translatierten Region des EPSPS-Gens zu schaffen. Die modifizierte EPSPS-Sequenz wurde durch EcoRI- und BglII-Verdau isoliert und in einen Pflanzentransformationsvektor, pMON530, insertiert, um pMON536 zu erhalten, wie in Fig. 2 gezeigt. pMON530, ein Derivat von pMON505, das die 35S-NOS- Kassette trägt, wurde durch Transferieren des 2,3 kb StuI- HindIII-Fragments von pMON316 in pMON526 geschaffen. Plasmid pMON316 (siehe Fig. 5) ist ein Zwischenvektor vom Cointegrationstyp mit einmaligen Spaltstellen für die Restriktionsendonucleasen BglII, ClaI, KpnI, XhoI und EcoRI, die sich zwischen dem 5'-Leader und den NOS-Polyadenylierungssignalen befinden. Die Spaltstellen sehen die Insertion von codierenden Sequenzen vor, die ihre eigenen translationalen Initiierungssignale unmittelbar der CaMV 35S-Transcript-Leadersequenz benachbart tragen. Das 316-Plasmid behält alle Eigenschaften von pMON200 bei einschließlich Spectinomycinresistenz für Selektion in E. coli und A. tumefaciens sowie ein chimäres Kanamycin-Gen (NOS/NPTII/NOS) für Selektion von transformiertem Pflanzengewebe und das Nopalinsynthase-Gen für leichtes Durchmustern von Transformanden und Vererbung in der Nachkommenschaft. Plasmid pMON526 ist ein einfaches Derivat von pMON505, in dem die SmaI- Stelle durch Verdau mit XmaI, Behandlung mit Klenow-Polyinerase und Ligasierung entfernt wurde. Das resultierende Plasmid, pMON530 (Fig. 2), behält die Eigenschaften von pMON505 bei und die 35S-NOS-Expressionskassette enthält nun eine einzige Spaltstelle für SmaI zwischen dem Promotor und den Polyadenylierungssignalen. Das 1,62 kb EcoRI-EcoRI-Fragment von pMON9556 wurde dann in pMON536 insertiert, um pMON546 zu erhalten. Da pMoN530 bereits einen 35S-Promotor von einem Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) nächst der BglII-Stelle enthielt, schuf dies ein chimäres CaMV/EPSPS-Gen in pMON546.
Wie in Fig. 2 gezeigt, enthielt Plasmid pMON546 (1) das CaMV 35S/EPSPS-Gen, (2) ein Selektionsmarker-Gen für Kanamycinresistenz (Kan®), (3) ein Nopalinsynthase (NOS)-Gen als durchmusterbaren Marker und (4) eine rechte T-DNA-Grenze, was effektiv bewirkte, daß das gesamte Plasmid als eine "Transfer-DNA" (T-DNA)-Region von A. tumefaciens-Zellen behandelt wird. Dieses Plasmid wurde in A. tumefaciens-Zellen insertiert, die ein Helferplasmid, pGV3111SE, enthielten. Das Helferplasmid codiert bestimmte Enzyme, die notwendig sind zu bewirken, daß DNA von pMON546 in Pflanzenzellenchromosome insertiert wird. Es enthält auch ein Kanamycinresistenz-Gen, das in Bakterien wirkt.
Eine Kultur von A. tumefaciens enthaltend pMON546 und pGV3111-SE wurde bei American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und erhielt die ATCC-Zuordnungsnummer 53213. Wenn gewünscht, kann jedes dieser Plasmide aus dieser Zellkultur unter Anwendung von Standardmethodologie isoliert werden. Beispielsweise können diese Zellen mit E. coli-Zellen gezüchtet werden, die ein Mobilisierungsplasmid, wie pRK2013 (Ditta 1980), enthalten. Zellen, die Spc/str®, kanS werden, enthalten pMON546, während Zellen, die Kan®, spc/strS werden, pGV3111-SE enthalten.

Beispiel 2: Gly®-Petunienzellen

Blattscheiben mit Durchmessern von 6 mm (1/4 Zoll) wurden von oberflächensterilisierten Petunienblättern genommen. Sie wurden auf MS104-Agarmedium 2 Tage lang kultiviert, um an den Wundoberflächen partielle Zellwandbildung zu fördern. Sie wurden dann in eine Kultur von A. tumefaciens-Zellen, die sowohl pMON546 als auch GV3111-SE enthielten, welche über Nacht in Luria-Brühe bei 28ºC wachsen, getaucht und leicht geschüttelt. Die Zellen wurden von der Bakteriensuspension entfernt, trockengeblottet und mit der Oberseite nach unten auf über "Nähr"-Kulturen von Tabakzellen gegebenes Filterpapier inkubiert, wie in Horsch 1981 beschrieben. Nach 2 oder 3 Tagen wurden die Scheiben in Petrischalen enthaltend MS-Medium mit 500 ug/ml Carbenicillin und 0, 0,1, 0,25 oder 0,5 mM Glyphosat (Natriumsalz), ohne Nährkulturen, transferiert.
Kontrollgewebe wurde unter Verwendung von A. tumefaciens- Zellen enthaltend das Helferplasmid pGV3111-SE und einen anderen Pflanzentransformationsvektor, pMON505, der eine T-DNA-Region mit einem NOS/NPTII/NOS-Kanamycinresistenz-Gen und ein NOS- Selektionsmarker-Gen identisch mit pMON546, aber ohne das CaMV/EPSPS-Gen, enthielt, hergestellt.
Innerhalb von 10 Tagen nach Transfer in das Glyphosat enthaltende Medium erschien an der Peripherie aller Scheiben auf der kein Glyphosat enthaltenden Kontrollplatte aktiv wachsendes Kallusgewebe. Auf Medien, die 0,1 mM Glyphosat enthielten, gab es wenig nachweisbaren Unterschied zwischen den Kontrollscheiben und dem transformierten Gewebe. Bei 0,25 mM Glyphosat gab es sehr wenig Kalluswachstum von Kontrollscheiben, während wesentliches Wachstum von transformiertem Gewebe erfolgte. Bei 0,5 mM Glyphosat gab es kein Kalluswachstum von den Kontrollscheiben, während eine signifikante Zahl von Kalli aus den transformierten Scheiben wuchs. Dies bestätigt, daß das CaMV/EPSPS-Gen den transformierten Zellen Glyphosatresistenz verlieh.

Beispiel 3: Gly®-Tabakzellen

Blattscheiben wurden aus Tabakpflanzen (N. tabacum) herausgeschnitten und, wie oben beschrieben, mit A. tumefaciens-Zellen enthaltend pMON546 (oder pMON505 für Kontrollzellen) und Helferplasmid pGV3111-SE behandelt. Die mit dem CaMV/EPSPS-Gen transformierten Zellen erzeugten wesentliche Mengen von Kallusgewebe auf 0,5 mM Glyphosat, während die Zellen, die dieses Gen nicht enthielten, keinerlei nachweisbares Kallusgewebe erzeugten.

Beispiel 4: Gly®-Sojabohnenzellen

Sterile hypokotyle Stücke von Glycine canescens, eine Sojabohnenart, wurden mit dem A. tumefaciens-Stamm enthaltend das chimäre EPSPS-Gen infiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Nährkulturplatten wurden hergestellt, die ein Medium von 10% des normalen Gehaltes an MS-Salzen (GIBCO), B5-Vitaminen, 3 g/l Saccharose, 2 mg/l Naphthalinessigsäure, 1 mg/l Benzyladenin und 0,5 mM Arginin enthielten. Der pH wurde vor der Behandlung im Autoklaven auf 5,7 eingestellt.
Die infizierten Sojabohnenhypokotyle wurden 2 Tage bei 26ºC inkubiert und in ein ähnliches Medium (ausgenommen, daß die MS-Salze nicht verdünnt waren) zusätzlich enthaltend 500 mg/l Carbenicillin, 100 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin transferiert. Unter diesen Bedingungen war nur transformierter Sojabohnenkallus zum Wachsen imstande.
Kontrollgewebe wurde unter Verwendung von A. tumefaciens- Zellen enthaltend das Helfer-Ti-Plasmid pTiT37-SE und einen Pflanzentransformationsvektor pMON200 hergestellt; siehe Fraley et al., Biotechnology, Bd. 3, 1985, hier beschrieben. Das Cointegrat pTIT37-SE enthielt eine T-DNA-Region mit einem NOS/NPTII/NOS-Kanamycinresistenz-Gen und einem durchmusterbaren NOS-Marker-Gen identisch mit pMON200, aber ohne das caMV 35S/EPSPS/NOS-Gen.
Dieses entwaffnete Ti-Plasmid vom Nopalintyp wurde aus pTIT37 auf analoge Weise wie das von Fraley et al. (1985) beschriebene gebildet, um das pTIB6S3-SE entwaffnete Ti-Plasmid vom Octopintyp zu schaffen. Das allgemeine Verfahren besteht darin, den Großteil der pTiT37 T-DNA durch einen Selektionsmarker und pBR322- und LIH-Segmente von pMON200 zu ersetzen, um eine Homologieregion zur Rekombination mit pMON200 und Derivaten vorzusehen. Dieser Ersatz führt zur Deletion der am weitesten rechts befindlichen ungefähr 80% der T-DNA einschließlich der biosynthetischen Phytohormon-Gene, des Nopalinsynthase-Gens und der rechten Grenze der T-DNA.
Die Quelle der pTiT37-Sequenzen war das von de Framond et al. (Bio/Technology 1: 262, 1983) beschriebene Plasmid MINI-Ti. Dieses Plasmid ist eine herkömmliche Quelle; jedoch könnten diese gleichen Ti-Plasmidsegmente aus dem pTiT37- oder verwandten pTIC58-Plasmid oder aus Subklonen diese Plasmide, die von anderen isoliert wurden als die von Hepburn et al. (J.Mol.Appl. Genetics 2: 211-224, 1983) oder Zahm et al. (Mol Gen Genet 194: 188-194, 1984) beschriebenen, direkt erhalten werden.
Plasmid MINI-Ti ist ein Derivat von pBR325, das die pTIT37 KpnI-Fragmente 13b, 4 und 11 (de Framond et al., 1983) trägt, die den pTiC58 KpnI-Fragmenten 13, 3 und 12 analog sind (Depicker et al., Plasmid 3: 193-211, 1980). Die inneren T-DNA-Sequenzen einschließlich der biosynthetischen Phytohormon-Gene und der rechten Grenze wurden durch Verdau mit HindIII und Religasierung unter Bildung von pMON284 entfernt. Das pMON284-Plasmid enthält eine einzige KpnI-Stelle, die durch Spaltung mit KpnI und Insertion des folgenden synthetischen Binders:
der eine BamHI-Stelle (5'-GGATCC) im Zentrum des Binders enthält, in eine BamHI-Stelle umgewandelt wurde. Ein Plasmid, das diesen Linker enthält, wurde isoliert und pMON293 genannt.
Das pMON293-Plasmid trägt die folgenden pTiT37-Fragmente einander benachbart in invertierter Orientierung in bezug auf ihre Orientierung im Ti-Plasmid und verbunden durch einen BamHI- Linker. Zuerst ist die KpnI-Stelle am rechten Ende des 13b Fragments. Dieses Fragment enthält die linke Grenze der pTIT37-T- DNA. Dann kommt das linke Ende des an den BamHI-Linker gebundenen 13b Fragments. Daran gebunden ist das rechte Ende des KpnI 11-Fragments. Dieses Fragment enthält Ti-Plasmid angeordnet rechts von T-DNA und endet mit einer HindIII-Stelle, die das rechte Ende des pTiC58 HindIII 2-Fragments ist (Depicker et al., 1980). Dieses ist an das pBR325-Derivatplasmid gebunden, das auch mit der KpnI-Stelle am rechten Ende des KpnI 13b-Fragments fusioniert ist.
Um Homologie mit pMON200 und einem Kanamycinresistenz- Selektionsmarker für A. tumefaciens zwischen den pTiT37-Segmenten einzuführen, konstruierten wir Plasmid pMON292. Plasmid pMON292 ist ein Derivat von pMON113, das aus dem an das 1,7 kb BglII (Nucleotid 1617) bis HindIII (Nucleotid 3390, Barker et al., Plant Mol. Biology 2: 335, 1983)-Fragment der Octopintyp-T-DNA von pTiA6 gebundenen 2,6 kb pBR322 PvuII bis HindIII-Fragment besteht. Dieses Segment, LIH bezeichnet, wurde bereits von Fraley et al. (1985) beschrieben. Die BglII-Stelle wurde durch Behandlung mit Klenow-Polymerase vor Ligasierung mit dem pBR322-Segment mit glatten Enden versehen.
Plasmid pMON113 wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow- Polymerase behandelt und an das 1,2 kb AvaII-Fragment von Tn903, Oka et al., J.Mol.Biol. 147: 217 (1981) (601) gebunden, das mit Klenow-Polymerase behandelt, mit synthetischen BamHI-Linkern ligasiert, mit BamHI verdaut und wieder mit Klenow-Polymerase behandelt worden war. Das erhaltene Plasmid, das die Tn903 Kanamycinresistenzdeterminate benachbart dem LIH-Segment trägt, wurde pMON292 genannt.
Die pMON200-Homologieregion und der bakterielle Kanamycinresistenzmarker wurden zwischen den pTiT37-Segmenten durch Mischen von durch Spaltung-mit HindII linearisiertem pMON292 mit zwei von pMON293 stammenden Derivaten: einem 2,5 kb PvuII-BamHI- Fragment und einem 4,5 kb Fragment, isoliert nach Spaltung mit HindIII, Behandlung mit Klenow-Polymerase und Spaltung mit BamHI, insertiert. Das erhaltene Plasmid, pMON313, trägt die folgenden Fragmente in dieser Reihenfolge. Zuerst ist der BamHI- Linker, gefolgt von einem von der rechten Seite des pTiT37 KpnI- Fragments 11 stammenden 4,5 kb KpnI-HindIII-Fragment. Dieses ist an das 750 bp HincII-HindIII-Segment von pBR322 gebunden, gefolgt vom 1,2 kb Tn903-Segment, das Kanamycinresistenz codiert. Darauf folgt das LIH (HindIII-BglII)-Segment und das PvuII- HincII-Segment von pBR322, das den Replikationsursprung trägt. Danach ist ein 2,5 kb PvuII bis KpnI-Fragment vom linken Ende des pTiT37 KpnI 13b-Fragments, das die linke Grenze der T-DNA enthält. Dieses ist schließlich an den Ausgangs-BamHI-Linker gebunden.
Um diese DNA in Agrobacterium einzuschleusen, wurde pMON313 mit BamHI gespalten und mit pRK290 DNA gemischt, die mit BglII gespalten und mit DNA-Ligase behandelt worden war. Ein Derivat von pRK290, das das pMON313 Plasmid trägt, wurde isoliert und pMON318 genannt.
Plasmid pMON318 wurde in Agrobacterium tumefaciens-Stamm A208, der pTIT37 und eine chromosomale Chloramphenicolresistenz trägt, durch bakterielle Standardpaarungsmethoden unter Verwendung von pRK2013 als Helfer eingeschleust. Diese Methode und die nachfolgende Selektion auf Ersatz der T-DNA mit dem in pMON318 enthaltenen manipulierten T-DNA-Segment waren exakt, wie von Fraley et al. (1985) für die Selektion des entwaffneten pTiB6S3-SE-Plasmid vom Octopin-Typ beschrieben.
Das erhaltene entwaffnete pTiT37-SE-Plasmid enthält die vir- Region intakt und behält die linke T-DNA-Grenze und ungefähr 1 kb der T-DNA bei. Von dieser Region der T-DNA wurde nicht berichtet, daß sie ein Transcript codiert (Joos et al., Cell 32: 1057-1067, 1983). Darauf folgt das pBR322-Segment und LIH und dann die Tn903-Kanamycinresistenz. Das Tn903-Segment ist an ein 750 bp Segment von pBR322 gebunden, das an das linke Ende des pTiT37-Analogons des pTiC58 HindIII 2-Fragments gebunden ist (Depicker et al., 1980). Dieses Fragment befindet sich außerhalb des rechten Endes der pTiT37 T-DNA. Das Ergebnis ist, daß mehr als 90% der T-DNA einschließlich der für Wurzelhalsgallen- Krankheitsproduktion verantwortlichen biosynthetischen Phytohormon-Gene und der rechten Grenze vom pTiT37-SE-Plasmid abwesend sind.
Das pTiT37-SE-Plasmid ist in einem Derivat von Stamm A208 enthalten, der für Wachstum in 25 ug/ml Chloramphenicol selektioniert wurde, und dieser Stamm mit dem entwaffneten Plasmid wird A208-SE oder ASE genannt. Der A208-SE-Stamm wird als Rezipient für den pMON200-Zwischenvektor im dreifachen Paarungsverfahren auf exakt die gleiche Weise wie der 3111-SE-Stamm verwendet (Fraley et al., 1985). Dies führt zu einer Cointegrations-Hybrid-T-DNA bestehend aus den folgenden Bestandteilen von links nach rechts: der pTIT37-linken Grenze und ungefähr 1 kb der Sequenz unmittelbar innerhalb der Grenze, dem pBR322 HincII- bis PvuII-Segment, der pTiA6 BglII- bis HindIII LIH-Region, dem pMON200 synthetischen Multilinker, dem NOS/NPTII/NOS-Kanamycinresistenz-Gen für Selektion in Pflanzen, der Tn7 Spectinomycin/Streptomycinresistenzdeterminante, dem Nopalinsynthase-Gen als durchmusterbaren Marker für Pflanzenzellen und der rechten Grenze der pTiT37-T-DNA. Die DNA zwischen den zwei eben beschriebenen Grenzsequenzen und jede andere in die analoge Region von pMON200 und Derivaten insertierte DNA werden während des Transformationsvorganges in Pflanzenzellen transferiert.
Nach 14 bis 17 Tagen wurde Sojabohnenkallus, transformiert mit dem Vektor allein (pMON200-Plasmid) oder mit dem ein chimäres EPSPS-Gen enthaltenden Vektor, in MS-Medium und 0, 0,5 mM oder 1,0 mM Glyphosat enthaltende Petrischalen transferiert.
Innerhalb von 18 bis 20 Tagen nach dem Transfer in die Glyphosat enthaltenden Medien erschien in allen Schalen, die kein Glyphosat enthielten, aktiv wachsendes Kallusgewebe. Auf dem Medium enthaltend 0,5 mM Glyphosat gab es wenig Wachstum in den Kontrollkallus enthaltenden Schalen, d. h. der Kallus enthält den pMON200-Vektor allein, während einige das chimäre EPSPS-Gen, oben in Fig. 2 beschrieben, enthaltende Kalluskolonien eindeutiges Wachstum zeigten. Bei 1,0 mM Glyphosat gab es kein Kalluswachstum aus den Kontrollgeweben und wiederum etwas Wachstum des transformierten Kallus enthaltend das chimäre EPSPS-Gen. Dies bestätigt, daß das CaMV 35S/EPSPS/NOS-Gen auf den Sojabohnenzellen Glyphosatresistenz verlieh.

Beispiel 5: Gly®-Baumwollzellen

Ein Pflanzentransformationsvektor ähnlich pMON546 wird durch das in Beispiel 1 angegebene allgemeine Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die CTP/EPSPS codierende Sequenz von Baumwolle erhalten wird. Baumwollsamen (Kultivator Delta Pine 50) werden unter Verwendung von Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert und in vitro auf einem Basalmedium im Dunkeln keimen gelassen. Nach 2 Wochen werden Hypokotyle und Kotyledone in Stücke geschnitten und mit einem tumorösen Stamm von A. tumefaciens enthaltend den oben beschriebenen Transformationsvektor und das Helferplasmid pGV3111 angeimpft. Nach 3 Tagen Cokultur auf MS-Basalmedium werden die Züchtungen auf das gleiche Medium mit 500 mg/l Carbenicillin transferiert, um die Bakterien abzutöten. Nach 2 bis 4 Wochen wird Tumorgewebe auf das gleiche Medium enthaltend 0,5 mM Glyphosat transferiert.
Kontrollgewebe wurde unter Verwendung von tumorösen A. tumefaciens-Zellen enthaltend das Helferplasmid pGV3111 und pMON200 produziert. Mit dem oben beschriebenen Transformationsvektor transformiertes Gewebe zeigt Glyphosatresistenz durch kontinuierliches Wachstum, während Wachstum von mit pMON200 transformiertem Gewebe (Kontrolle) und nicht-transformiertem Gewebe inhibiert ist.

Beispiel 6: Gly®-Ölsamenrapszellen

Ein Pflanzentransformationsvektor ähnlich pMON546 wird nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die CTP/EPSPS codierende Sequenz von Rapspflanzen, wie Brassica napus (siehe Beispiel 17) erhalten wird.
Die vier terminalen Intervalle von B. napus-Pflanzen (Wachstumskammer in Erde gezogen) werden in Natriumhypochlorit oberflächensterilisiert und in 5 mm Teile geschnitten. Die Oberfläche jedes Stücks wird mit einer flüssigen Übernachtkultur von A. tumefaciens enthaltend den oben beschriebenen Transformationsvektor und das Helferplasmid pTiT37-SE angeimpft und 2 bis 3 Tage auf Nährkulturplatten enthaltend 1/10 MS-Medium mit 1 mg/l BA inkubiert. Die Züchtungen werden dann auf MS-Medium enthaltend 1 mg/l BA, 500 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l Kanamycin transferiert. Nach 3 bis 6 Wochen wird Blattgewebe von transgenen Sprossen, die sich entwickelt haben, auf das gleiche Medium, jedoch mit 0,5 mM Glyphosat anstelle des Kanamycins, transferiert, um auf Verträglichkeit zu testen.
Kontrollgewebe wird unter Verwendung von A. tumefaciens- Zellen enthaltend Helferplasmid pTiT37-SE und Vektor pMON200 hergestellt. Transgenes Gewebe, das EPSPS exprimiert, ist imstande, in Anwesenheit von Glyphosat zu wachsen, während transformierte und nicht-transformierte Kontrollen inhibiert werden.

Beispiel 7: Gly®-Flachszellen

Ein Pflanzentransformationsvektor ähnlich pMON546 wird nach dem in den Beispielen 1 und 14 bis 17 angegebenen Verfahren hergestellt, ausgenommen, daß die CTP/EPSPS codierende Sequenz von Flachs erhalten wird.
Flachssamen werden mit 70% Ethanol und 25% Chlorox oberflächensterilisiert und mit sterilem destillierten Wasser gespült. Die Samen werden auffestes MS-Medium gelegt und im Licht 5 bis 7 Tage keimen gelassen. Die Hypokotyle werden aseptisch entfernt und mit A. tumefaciens-Zellen, die den oben beschriebenen Transformationsvektor und das Helferplasmid pTiB6S3-SE oder pTiT37-SE enthalten, angeimpft und 2 Tage auf MS-Medium enthaltend 1 mg/l Benzylaminopurin, 0,02 mg/l Naphthalinessigsäure und 4% Saccharose cokultivieren gelassen. Die Hypokotyle werden dann auf MS-Medium gegeben, das mit 400 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin ergänzt ist. Nach 2 Wochen sind Selektion auf transformierten Kallus und Sprossen sichtbar. Die ursprüngliche Züchtung beginnt braun zu werden und die zuerst gebildeten nicht-transformierten Sprossen bleichen weiß. Der selektionierte Kallus und die Sprossen sind grün und opinpositiv.
Kontrollgewebe wird unter Verwendung von A. tumefaciens- Zellen enthaltend Helferplasmid pTiB6S3-SE oder pTiT37-SE und Vektor pMON200 hergestellt. Mit dem oben beschriebenen EPSPS-Vektor transformierter selektionierter Kallus zeigt Resistenz auf Glyphosat bei Konzentrationen zwischen 5,0 und 20,0 mM. Kontrollgewebe bleicht und stirbt bei diesen Glypshosatspiegeln ab.

Beispiel 8: Isolierung von Mutanten-EPSPS-Gen aus E. coli.

Zellen von E. coli ATCC 11303 wurden auf Medium A transferiert und bei 37ºC inkubiert.

Medium A

10 · MOPS-Medium 50 ml
50%ige Glucoselösung 2 ml
100 mM Aminomethylphosponat 2 ml
Thiamin (5 mg/ml), pH 7,4 1 ml
100 mM Glyphosat (Natriumsalz) 2 ml
entionisiertes Wasser auf 500 ml
10 · MOPS-Medium: pro 500 ml
1 M MOPS (209,3 g/l, pH 7,4) 200 ml
1 M Tricin (89,6 g/l, pH 7,4) 20 ml
0,01 M FeSO&sub4;·7H&sub2;O (278,01 mg/100 ml) 5 ml
1,9 M NH&sub4;Cl (50,18 g/500 ml) 25 ml
0,276 M K&sub2;SO&sub4; (4,81 g/100 ml) 5 ml
0,5 mM CaCl&sub2;·2H&sub2;0 (7,35 mg/100 ml) 5 ml
0,528 M MgCl&sub2; (10,73 g/100 ml) 5 ml
5 M NaCl (292,2 g/l) 50 ml
0,5% L-Methionin (500 mg/100 ml) 5 ml
Mikronährstoffe* 5 ul
* Mikronährstoffe in 25 ml H&sub2;O
ZnSO&sub4; (2,88 mg/ml) 25 ul
MnCl&sub2; (1,58 mg/ml) 250 ul
CuSO&sub4; (1,6 mg/ml) 25 ul
CoCl&sub2; (7,14 mg/ml) 25 ul
H&sub3;BO&sub3; (2,47 mg/ml) 250 ul
NH&sub4;MO&sub7;O&sub2;&sub4; (3,71 mg/ml) 25 ul
Nach 1 Woche wurde eine Kultur erhalten, die in Anwesenheit hoher Glyphosatkonzentrationen im Wachstumsmedium (10 mM oder höher) wachsen konnte. Analyse der EPSPS-Aktivität in den Extrakten dieser Kultur und Vergleich ihrer Glyphosatempfindlichkeit mit jener von Wildtyp-E.coli zeigte, daß der Mutantenorganismus eine veränderte EPSPS hatte. Die Glyphosatempfindlichkeit von EPSPS von Mutantenzellen war signifikant anders als jene des Wildtyps. Dieses Mutantenbakterium wurde E. coli 11303 SM-1 bezeichnet. Das EPSPS codierende aroA-Gen von diesem Mutantenbakterium wurde wie folgt isoliert.
Isolierung von EPSPS codierendem aroA-Gen aus E. coli 11303 SM-1: Die DNA von diesem Bakterium wurde isoliert (J. Marmur (1961), J.Mol.Biol. 3: 208-218). Southern-Hybridisierung unter Verwendung von E. coli K-12 aroA-Gen (Rogers et al., 1983) als Sonde legte fest, daß das aroA-Gen im Mutantenbakterium auf einem 3,5 kb BglII-HindIII-Fragment war. Dieses Fragment wurde in den Vektor pKC7 kloniert (R.N. Rao & S.G. Rogers (1979), Gene, F. 7-9-82) und das erhaltene Plasmid zur Transformation von E. coli verwendet. Transformierte Kolonien wurden auf ihre Fähigkeit gescreent, unter diesen Bedingungen zu wachsen, und es zeigte sich, daß sie das 3,5 kb BglII-HindIII-Insert durch Hybridisierung mit dem E. coli K-12 aroA-Gen enthielten. Dieser Klon wurde pMON9538 bezeichnet. Ein Ndel-EcoRI-Fragment dieses Inserts, das mehr als 86% des aroA-Gens vom Mutantenbakterium enthielt, wurde in einen Expressionsvektor (pMON6012, ein Derivat des nachstehend beschriebenen pMON6001) kloniert, wobei eine hybride EPSPS codierende Sequenz erzeugt wurde, die die E. coli K-12 aroA codierende Sequenz von E. coli K-12 und 11303 SM-1 trägt. Dieser Klon wurde pMON9540 bezeichnet. Die von diesem hybriden aroA-Gen produzierte EPSPS behielt ihre Glyphosatverträglichkeit bei, was vermuten läßt, daß die EPSPS Glyphosatverträglichkeit verleihende Mutation in 11303 SM-1 sich innerhalb der Aminosäuren 53 bis 427 befand. Das E.coli-Mutanten- EPSPS-Gen wurde in einen Pflanzentransformationsvektor mit und ohne ein Chlorplast-Transitpeptid auf folgende Weise eingeschleust.
Plasmid pMON6001 ist ein Derivat von pBR327 (Soberon et al., 1980), das die von zwei Tandemkopien eines synthetischen PhagenλpL-Promotors exprimierte E.coli K12 EPSPS codierende Sequenz trägt. Plasmid pMON6001 wurde auf folgende Weise konstruiert. Zunächst wurde pMON4 (Rogers et al., 1983) mit ClaI verdaut und das 2,5 kb Fragment in ein pBR327 insertiert, das ebenfalls mit ClaI gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid, pMON8, enthält die EPSPS codierende Sequenz, die in der gleichen Richtung liest wie das β-Lactamase-Gen von pBR327.
Um pMON25, ein Derivat von pMON8 mit einmaligen Restriktionsendonucleasestellen, die der E.coli EPSPS codierenden Sequenz benachbart angeordnet sind, zu konstruieren, wurden die folgenden Schritte durchgeführt. Es wurde ein Deletionsderivat von pMON4 durch Spaltung mit BstEII und Religasierung hergestellt. Dem erhaltenen Plasmid, pMON7, fehlt das 2 kb BstEII- Fragment von pMON4. Danach wurde ein 150 bp Hinfl- bis NdeI- Fragment, das das 5'-Ende des EPSPS offenen Leserahmens codiert, nach Verdau von pMON7 mit NdeI und HinfI und Elektroelution nach elektrophoretischer Trennung auf einem Acrylamidgel isoliert. Dieses Stück wurde an das gereinigte 4,5 kb BamHI-NdeI-Fragment von pMON8 angefügt, das den 3'-Teil der EPSPS codierenden Sequenz und einen synthetischen Linker mit der Sequenz
enthält. Das erhaltene Plasmid pMON25 enthält die EPSPS codierende Sequenz, der einmalige BamHI- und BglII-Stellen, eine synthetische Ribosomenbindungsstelle und einmalige XbaI- und NcoI-Stellen vorangehen, wobei letztere das ATG translationale Initiatorsignal der codierenden Sequenz enthält.
Um pMON6001 zu konstruieren, wurde pMON25 mit BamHI verdaut und mit einem synthetischen DNA-Fragment enthaltend eine partielle Phagen-λpL-Sequenz (Adams und Galluppi, 1986) mit BamHI- klebrigen Enden gemischt:
Das erhaltene Plasmid pMON6001 trägt zwei Kopien der synthetischen Phagen-λpL-Promotorfragmente als direkte Wiederholungen in der BamHI-Stelle von pMON25 in der korrekten Orientierung, um Transcription der EPSPS codierenden Sequenz zu fördern. Das BglII-HindIII-Fragment von pMON6001, das das E. coli K-12 aroA- Gen enthält, wurde in einen pEMBL18+-Vektor insertiert und eine EcoRI-Stelle wurde durch sequenzgerichtete Mutagenese bei aa27 insertiert. Dieser Klon mit der neuen EcoRI-Stelle wurde pMON6530 genannt. Das Ndel-BglII-Fragment (das die neue EcoRI-Stelle einschließt) von pMON6530 wurde in das NdeI-BglII-verdaute pMON9540 kloniert, wobei pMON6531 erhalten wurde.
Plasmid pMON6012 ist ein einfaches Derivat von pMON6001, geschaffen durch Spaltung von pMON6001 mit EcoRI, Behandlung mit dem großen Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase und Ligasierung. Dies ergab pMON6010, das keine EcoRI-Spaltstelle enthält. Plasmid pMON6012 wurde dann durch Verdau von pMON6010 mit PvuII und Insertion eines synthetischen EcoRI-Linkers
in die einzige PvuII-Stelle nahe dem Ende der EPSPS codierenden Sequenz geschaffen.
Das 330 bp EcoRI-Fragment von pMON9531 wurde in M13 mp9 kloniert, wodurch ein neues Plasmid M8017 geschaffen wurde. Sequenzgerichtete Mutagenese wurde durchgeführt, um eine BglII-Stelle in der Leadersequenz unmittelbar 5' vom Chlorplast- Transitpeptid unter Verwendung des Mutageneseprimers
einzuführen. Der erhaltene mutagenisierte Klon wird M13 M8020 bezeichnet. Das BglII-EcoRI-Fragment wurde in BglII-EcoRI-verdautes pMoN530 kloniert, wodurch pMON536 geschaffen wurde. pMON530 ist ein pMON505-Derivat (Horsch & Klee, 1985), das die 35S-NOS-Kassette trägt, geschaffen durch Transferieren des 2,3 kb StuI-HindIII-Fragments von pMON316 in pMON526. Plasmid pMON526 ist ein einfaches Derivat von pMON505, in dem die SmaI-Stelle durch Verdau mit XmaI, Behandlung mit Klenow-Polymerase und Ligasierung entfernt wurde. Das erhaltene Plasmid, pMON530 (Fig. 2), behält die Eigenschaften von pMON505 bei und die 35S-NOS-Expressionskassette enthält nun eine einzige Spaltstelle für SmaI zwischen dem Promotor und Polyadenylierungssignalen. Das EcoRI-Fragment, das das aroA-Gen von pMoN6031 enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von pMON536 kloniert, wodurch pMON542 geschaffen wurde.
Das BglII-EcoRI-Fragment von pMON9540, das die hybride K12-SM1-EPSPS ohne das CTP codiert, wurde in die BglII- und EcoRI- Stellen von pMON530 kloniert, um pMON8078 zu schaffen.
Transformation von Tabakzellen unter Verwendung von pMON542 (Konstrukt mit CTP), wie oben in Beispiel 3 beschrieben, führte zu Glyphosatresistenz. Umgekehrt verlieh Transformation von Tabak mit pMON8078 (Konstrukt ohne CTP) keine Glyphosatresistenz.

Beispiel 9: Gly®-Kartoffelzellen

Kartoffelsprossenspitzen von virusfreiem Russet Burbank werden auf Medien enthaltend MS-Haupt- und Nebensalze, 0,17 g/l Natriumdihydrogenphosphat, 0,4 mg/l Thiaminhydrochlorid, 0,1 g/l Inosit, 3% Saccharose, 1,5 g/l Gelrite® (Kelco, Co.) bei pH 5,6 subkultiviert. Kulturen werden bei 24ºC in einem Lichtzeitraum von 16 h gezüchtet. Sprossen werden ungefähr 3 bis 4 Wochen nach Subkultivierung verwendet. Stengelinternodia werden auf Längen von ungefähr 8 mm geschnitten und der Länge nach aufgeschlitzt, dann wird die geschnittene Oberfläche mit Agrobacterium enthaltend binären Vektor pMON542 und Helferplasmid pTiT37-SE bestrichen, das auf eine LB-Agarplatte aufgestrichen und einige Tage lang gezüchtet worden war. Stengelteile werden mit der geschnittenen Seite nach unten auf die Oberfläche des Mediums enthaltend MS-Salze, organisches MS-Material, 3% Saccharose, 2,25 mg/l BA, 0,1186 mg/l NAA, 10 mg/l GA und 1,5 g/l Gelrite bei pH 5,6 gelegt. Nach 4 Tagen wurden die Stengelzüchtungen auf das gleiche Medium, jedoch mit 500 mg/l Carbenicillin und 0 oder 300 mg/l Kanamycin als Selektionsmittel transferiert. 2 Wochen nach Inokulation werden die Züchtungen auf Medium der gleichen Zusammensetzung, aber ohne NAA, bewegt. Kanamycin in einer Menge von 300 mg/l war ausreichend, um Quellen und Kallusbildung der infizierten Züchtungen zu verhindern, ohne das Gewebe abzutöten. Das transformierte Gewebe erschien als kleine Herauswüchse gewöhnlich am Ende der Züchtung. Transformiertes Gewebe zeigt wesentliche Glyphosatresistenz'

Beispiel 10: Gly®-Sonnenblumenzellen

Die folgenden Verfahren werden angewandt, um transformiertes Sonnenblumengewebe und -sprossen zu erhalten. Tumore werden auf sterile Sonnenblumensämlinge aufgepfropft. Sonnenblumensamen werden mit 40% Chlorox und sterilen destillierten Wasserspülungen oberflächensterilisiert. Die Samen werden auf einem Agarmedium enthaltend B5-Salze, 0,5% Saccharose und 0,8% Agar keimen gelassen. 7 Tage alte Sämlinge werden mit Übernachtkulturen von pTiB6S3-SE tragenden Agrobacteriumstämmen durch Durchmustern des Internodiums oder Durchstoßen des Internodiums mit einer Spritze und unter Verwendung einer anderen Spritze zum Einführen der Bakterien in die Wunde inokuliert. Tumore bilden sich in 2 bis 3 Wochen. Die Tumore werden von den Sämlingen entfernt und unabhängig auf MS-Medium ohne Hormone gezogen. Transformierter Kallus und Sprossen werden auch nach einem anderen Verfahren erhalten. Samen werden oberflächensterilisiert und auf das obige Keimungsmedium gelegt. Das Keimen erfolgt im Licht während 10 Tagen. Hypokotylsegmente, 2 bis 3 mm, werden herausgeschnitten und mit gebildete Konstrukte enthaltenden Agrobacterium-Stämmen inokuliert. Die Hypokotyle werden 2 Tage auf einem Medium enthaltend MS-Saze und Vitamine, 5 g/l KNO&sub3;, 100 mg/l Inosit, 40 mg/l Adeninsulfat, 500 mg/l Casaminosäuren, 1 mg/l NAA, 1 mg/l BA, 0,1 mg/l GA3, 30 mg/l Saccharose und 8 g/l Agar cokultiviert. Nach dem Cokultivieren werden die Hypokotyle auf das gleiche Medium, das aber 300 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin enthält, gegeben. Nach 2 Wochen produzieren die mit das Kanamycinresistenz-Gen enthaltenden Stämmen inokulierte Hypokotyle Kallus und Regenerate auf kanamycinhaltigem Medium, während dies andere Hypokotyle nicht tun.
A. tumefaciens enthaltend binäre Vektoren pMON546 und Helferplasmid pTiB6S3-SE werden zum Produzieren von Tumoren und Kallus und regenerierten Pflanzen verwendet. Die Tumore zeigen Glyphosatverträglichkeit bei Konzentrationen, die Kontrolltumore bleichen und abtöten, welche das Glyphosatresistenz-Gen nicht enthalten. Nichttumoröser Kallus zeigt ebenfalls Verträglichkeit auf Glyphosatkonzentrationen, die Kallus ohne das Glyphosatresistenz-Gen abtöten. Transformierte Sonnenblumenpflanzen zeigen Verträglichkeit auf Glyphosat, das in Konzentrationen versprüht wird, die Wildtyppflanzen abtöten.

Beispiel 11: Gly®-Petunienpflanzen

Transformierte Petunienpflanzen wurden durch Regenerierung aus den transformierten Blattscheiben von Beispiel 2 durch das in Horsch et al., 1985, beschriebene Verfahren erzeugt. Die erhaltenen transformierten Pflanzen enthielten den oben beschriebenen pMON546-Vektor, der den an das Wildtyp-Petunien-EPSPS-Gen fusionierten CaMV 35S-Promotor enthält.
Vier einzelne repräsentative transgene Sämlinge wurden gewählt, gezogen und im nachstehenden Testverfahren zusammen mit vier einzelnen nicht-transformierten (Wildtyp) Petuniensämlingen getestet.
Die Pflanzen wurden in einem Wachstumsmedium in einer Wachstumskammer bei 26ºC mit 12 Stunden Licht pro Tag gezogen. Die Pflanzen wurden wöchentlich mit einem löslichen Düngemittel gedüngt und nach Bedarf bewässert. Die Pflanzen wurden mit einem Herbizid mit gleichmäßiger und reproduzierbarer Abgaberate unter Verwendung einer automatisierten Sprühvorrichtung besprüht.
Die verwendete Glyphosatlösung wurde als Pfund Glyphosat- Säureäquivalente pro Acre (4047 m²), gemischt als das Glyphosatisopropylaminsalz mit einem ionischen oberflächenaktiven Mittel, gemessen.
Vier einzelne Wildtyp (nicht-transformierte)-Petunienpflanzen wurden zur Verwendung als Kontrollpflanzen gewählt. Vier einzelne den pMON546-Vektor enthaltende transformierte Pflanzen wurden durch Kanamycinresistenz selektioniert, wie in Horsch et al., 1985, beschrieben.
Die Kontrollpflanzen und die transformierten Pflanzen wurden mit dem Isopropylaminsalz von Glyphosat bei der in nachstehender Tabelle 2 angegebenen Anwendungskonzentration besprüht; die erhaltenen Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 ebenfalls zusammengefaßt. Tabelle 2 Pflanzenantwort auf Besprühen mit Glyphosat Pflanzenart Glyphosatdosis* visuelles Aussehen Kontrolle 0,4 Pfund/Acre Pflanzen zeigten rasche Chlorose und Bleichen, welkten und starben ab vollständig tot, Pflanzen zeigten sehr rasche Chlorose und Bleichen, welkten und starben ab chimäre EPSPS-Transformanden Wachstum gut, leichte Chlorose in neuen Blätter, die mit normaler Morphologie wachsen, Pflanzen sehen gesund aus und begannen zu blühen * Säreäquivalent
Wie in Tabelle 2 angegeben, wurden die Kontrollpflanzen abgetötet, wenn sie mit 0,4 Pfund/Acre Glyphosat besprüht wurden. Im Gegensatz dazu waren die Petunienpflanzen, die transformiert waren, nach Besprühen mit 0,8 Pfund/Acre gesund und lebensfähig. Die transformierten Pflanzen sind auf Glyphosataussetzen resistenter als nicht-transformierte Kontrollpflanzen.

Beispiel 12: Gly®-Tomatenpflanzen

Transformierte Tomatenpflanzen, Varietät VF36, werden aus sterilen Sämlingen hergestellt, wie im nachstehenden beschrieben.
Sterile Sämlinge von VF36-Tomaten werden auf Wasseragar gezogen. Hypokotyle und Kotyledone werden abgeschnitten und 2 Tage auf MS-Medium enthaltend B5-Vitamine, 30 g/l Saccharose, 1 mg/l Benzyladenin und 0,1 mg/l Indolessigsäure kultiviert. Die Sämlinge werden dann mit dem A. tumefaciens-Vektor enthaltend das in Beispiel 2 beschriebene chimäre EPSPS-Gen infiziert, indem sie etwa 20 Sekunden in eine Kultur von A. tumefaciens enthaltend das chimäre EPSP-Synthasegen, die auf 10% Bakterien/ ml verdünnt worden war, getaucht werden. Züchtungen werden durch Schneiden von Teilen aus den Sämlingen erhalten. Die Züchtungen werden trocken geblottet und, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, inkubiert, ausgenommen, daß das Medium nur 10% Standardkonzentration von MS-Salzen enthält. Nach 2 Tagen Cokultivierung werden die Züchtungen auf Selektionsmedium enthaltend 100 ug/ml Kanamycin transferiert. Transformierte Tomatenpflanzen wachsen aus den Züchtungen. Blätter von diesen Pflanzen werden unter Anwendung eines im nachstehenden beschriebenen Blattkallustests auf Glyphosatresistenz getestet.
Tomatenblattfragmente von Pflanzen, die Vektor allein (pMON200) oder das pMON546 chimäre EPSPS-Gen enthalten, werden auf dem oben beschriebenen Kallusmedium enthaltend 0,5 mM Glyphosat inkubiert. Nach 10 Tagen sind die Kontrollblätter vollständig inhibiert und zeigen keine Anzeichen von Kalluswachstum; die Blätter von mit dem chimären EPSPS-Genvektor transformierten Pflanzen produzierten Kallus.

Beispiel 13: Gly®-Tabakpflanzen

Transformierte Tabakpflanzen (Samsun-Varietät) wurden nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt und gezogen, wobei transformierte Petunienblattscheiben durch transformierte Tabakblattscheiben ersetzt wurden.
Tabakpflanzen wurden unter Anwendung des für Tomatenpflanzen in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens auf Glyphosatresistenz getestet. Tabakblattfragmente von Pflanzen enthaltend den Vektor allein (pMON200) oder das pMON546 chimäre EPSPS-Gen wurden auf Kallusmedium enthaltend 0,5 mM Glyphosat inkubiert.
Nach 10 Tagen waren die Kontrolltabakblätter vollständig inhibiert und zeigten keine Anzeichen von Kalluswachstum; die Blätter von mit dem chimären EPSPS-Gen transformierten Pflanzen zeigten, daß das chimäre Petunien-EPSPS-Gen Tabakpflanzen Glyphosatresistenz verleiht.

Beispiel 14: Isolierung von genomischem Petunien-EPSPS-Klon

Um das gesamte Petunien-EPSPS-Gen zu isolieren, wurde die Bibliothek von genomischer Petunien-DNA konstruiert wie in Beispiel 1-G beschrieben. Kurz gesagt, wurde die chromosomale DNA von der MP4-G-Zellinie mit BamHI verdaut und in einen Phagenvektor, λMG14, kloniert, um eine Bibliothek zu schaffen. Wie in Beispiel 1-G beschrieben, wurde ein Phagenklon λF7 isoliert, der ein 4,8 kb BglII-Fragment enthält, das zum pMON9531 cDNA-Klon komplementär war. Um den Rest des Gens zu isolieren, wurde die genomische Bibliothek unter Verwendung des 1,6 kb cDNA-Inserts von pMON9556 wieder gescreent. Das Plattieren der Bibliothek und die Hybridisierungsverfahren wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1-G beschrieben. Mehrere positive Signale wurden erhalten. Ein Isolat wurde für weitere Analyse selektioniert und als der λF10-Phagenklon bezeichnet.
Die DNA von F10 wurde getrennt mit BamHI, BglII, EcoRI und HindIII verdaut. Die DNA wurde mit nick-translatierten EPSPS- Sequenzen von pMON9531 und pMON9556 in einem Southern-Blottingverfahren nick-translatiert. Dies zeigte, daß die komplementären Sequenzen von λF10 auf 4,8 kb, 2,0 kb und 3,8 kb BglII-Fragmenten waren. DNA-Sequenzanalyse dieser Fragmente zeigt, daß diese drei Fragmente miteinander das gesamte Gen enthalten, das ungefähr 9 kb Petunien-DNA umspannt und durch sieben Introns unterbrochen ist (Fig. 6). Das Promotorfragment des EPSPS-Gens, das im genomischen Klon, λF10, enthalten ist, kann zum Exprimieren der chimären EPSPS-cDNA oder genomischer Sequenzen verwendet werden. Die die Introns enthaltenden Fragmente können auch zum Konstruieren weiterer chimärer EPSPS-Gene verwendet werden, um erhöhte Mengen der mRNA zu erhalten.

Beispiel 15: Isolierung von genomischem Arabidopsis thaliana-Klon

Eine genomische Arabidopsis thaliana-Bank wurde durch Klonieren von größenfraktionierter (15 bis 20 kb) MboI-partiell verdauter DNA in BamHI-geschnittenen λEMBL3 konstruiert. Ungefähr 10 000 Plaques des Phagen von dieser Bibliothek wurden mit einer nick-translatierten Petunien-EPSPS-Sonde (pMON9566) gescreent. Ein stark hybridisierender Plaque, E1, wurde gereinigt. Southern-Blots der EPSPS-Sone zu Phagen-DNA-Verdaus identifizierten zwei Fragmente, die sehr stark hybridisierten. Das erste davon war ein 1,0 kb HindIII-Fragment und das andere war ein 700 bp BamHI-Fragment. Diese beiden Fragmente wurden in pUC119 subkloniert und die DNA-Sequenzen der Inserts bestimmt.
Die Sequenzdaten zeigten, daß der Phage das Arabidopsis- EPSPS-Gen enthielt. Das Enzym ist zum Petunienenzym über den Bereich, für den Sequenz verfügbar war, hoch homolog. Das BamHI- Fragment wurde als Hybridisierungssonde gegen den Phagen und genomische Arabidopsis-DNA zum Identifizieren von für das Klonieren des-gesamten Gens geeigneten Restriktionsendonucleasefragmenten verwendet. Zwei BglII-Fragmente von 6,0 und 3,2 kb wurden vom E1-Phagenklon identifiziert, die zusammen das gesamte EPSPS-Gen enthalten. In Fig. 6 ist die Organisation des Arabidopsis-Klons zusammengefaßt und mit der Organisation des Petunien-EPSPS-Gens verglichen.
Die den Aminoterminus des Proteins codierende DNA befindet sich innerhalb des 6,0 kb BglII-Fragments. Die exakte translationale Startstelle kann durch Vergleich der von der Nucleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der des Petunienenzyms bestimmt werden. Sequenzgerichtete Mutagenese kann dann zum Einführen einer einzigen EcoRI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des translationalen Startcodons verwendet werden. Das gesamte Gen kann dann als ein EcoRI-Fragment isoliert werden. Dieses EcoRI-Fragment kann in den Expressionsvektor, pMON530, insertiert und der erhaltene Vektor zum Überexprimieren des Arabidopsis-EPSPS-Enzyms in Pflanzen verwendet werden.

Beispiel 16: Isolierung von Tomaten-EPSP-cDNA-Klon

Eine cDNA-Bibliothek wurde aus aus reifen Pistillen der Tomate (Lycopersicum esculentum Varietät VF36) isolierter RNA nach den Verfahren von Huynh et al. (DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, D. Glover Herausg., 1985) und Gubler und Hoffman (Gene 25: 263-269, 1985) konstruiert. Die Bibliothek wurde auf E. coli Stamm BNN102 plattiert und es wurden Filterkopien gemacht. Die Filter wurden mit dem 1,9 kb BglII/ClaI-Fragment von pMON9563 hybridisiert, das mit ³²P markiert worden war (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132: 6-13, 1983). Hybridisierende Plaques wurden isoliert und durch das gleiche Verfahren wieder gescreent, um die Anwesenheit von EPSPS-cDNA zu verifizieren. Die Tomaten-EPSPS-cDNA voller Länge war auf zwei EcoRI-Fragmenten von 250 und 1700 bp in einem der cDNA-Klone (P1) vorhanden. Das 250 bp Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pMON9596 bildendem pUC119 kloniert. Das 1700 bp Fragment wurde in pMON9589 bildendes pUC19 kloniert. Das Insert von pMON9596 wurde unter Verwendung eines von Amersham gekauften Didesoxysequenzierkits sequenziert, um zur Erleichterung von Mutagenese die das Startcodon umgebende Sequenz zu bestimmen. Eine BglII-Stelle wurden 13 Basen stromaufwärts vom Translationsstartcodon von pMON9596 durch das Verfahren von Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985) unter Verwendung des chemisch synthetisierten Oligonucleotids
manipuliert. Das Insert des erhaltenen Plasmids, pMON9710, wurde sequenziert, um die korrekte Mutation zu verifizieren. Das 70 bp BglII/EcoRI-Fragment von pMON9710 wurde in pMON316 insertiert, das mit BglII und EcoRI verdaut worden war, wobei pMON9720 geschaffen wurde. Das 1700 bp EcoRI-Fragment von pMON9589 wurde in die EcoRI-Stelle von pMON9720 in der korrekten Orientierung insertiert, um die EPSPS-Codierregion zu rekonstituieren, was in pMON9721 resultiert (siehe Fig. 7).
Dieses Plasmid wurde in A. tumefaciens-Zellen insertiert, die ein Helferplasmid, pGV3111-SE, enthielten. Das Helferplasmid codiert bestimmte Enzyme, die notwendig sind zu bewirken, daß DNA von pMON9721 in Pflanzenzellchromosome insertiert wird. Es enthält auch ein Kanamycinresistenz-Gen, das in Bakterien wirksam ist. pMON9721 enthaltende A. tumefaciens-Zellen werden in Pflanzentransformationsversuchen verwendet, um glyphosatresistente Zellen und Pflanzen zu produzieren, wie oben in Beispiel 12 beschrieben.

Beispiel 17: Isolierung von Brassica napus cDNA-Klon

Gesamt-RNA wurde aus Brassica napus (Züchtung Westar)-Blüten wie folgt isoliert. Blüten wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Nachdem der flüssige Stickstoff verdampft war, wurden Blüten in Extraktionspuffer (1% Tris-Isopropylnaphthalinsulfonsäure, 6% p-Aminosalicylsäure, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM EGTA, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1% SDS und 50 mM 2-Mercaptoethanol) homogenisiert und dann mit einem gleichen Volumen einer 1:1 Mischung von Phenol/Chloroform extrahiert. Die Nucleinsäuren in der wässerigen Phase wurden mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst und die RNA zweimal mit LiCl auf eine Endkonzentration von 2 M ausgefällt. Das End-RNA-Pellet wurde in Wasser gelöst und die RNA mit Ethanol ausgefällt. PolyA-RNA wurde durch olig-dT-Zelulosechromatographie selektioniert. Die Ausbeute an polyA-RNA betrug 1,0 ug/g Blüten.
Die Bibliothek wurde unter Verwendung von polyA-RNA von Brassica napus-Blüten konstruiert und das angewandte Verfahren ist in Beispiel 16 beschrieben. Die Ausbeute in der Bibliothek betrug 90 000 Plaques/3 ug polyA-RNA. Die Bibliothek wurde bei einer Dichte von 5000 Plaques/Platte plattiert. Die Phagen-DNA wurde auf Nitrozellulosefilter transferiert. Die Filter wurden unter geringer Stringenz in 35% Formamid, 5X SSC, 300 ug/ml tRNA und 0,1% SDS bei 37ºC hybridisiert. Das Insert von pMON9556 wurde mit ³²P durch Nicktranslation markiert und der Hybridisierungslösung bei 2·10&sup6; cpm/ml zugesetzt. Die Filter wurden zweimal während jeweils 15 min in 2 · SSC bei Raumtemperatur und einmal bei 37ºC während 30 min gewaschen. Eine Zahl von positiv hybridisierenden Phagen wurde erhalten. Diese Phagen wurden aufgenommen und zweimal bei niedrigeren Plaquedichten wieder gescreent. Die positiv hybridisierenden Phagen wurden selektioniert und jene, die eine volle Länge von B.napus EPSPS cDNA-Klon enthielten, wurden für weitere Analyse gewählt. Der B. napus EPSPS cDNA-Klon voller Länge wurde modifiziert und in einen Pflanzenexpressionsvektor, pMON530, insertiert, um ein chimäres CaMV 35S/B. napus EPSPS-Gen zu schaffen.

Beispiel 18: Petunien-EPSPS-Chloroplastaufnahme erfordert CTP-Sequenz

Ein cDNA-Klon voller Länge von EPSPS von P.hybrida wurde erhalten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Dieser cDNA-Klon enthält 27 Nucleotide des 5'-nicht-translatierten Leaders, 1,5 kb, der für das 72 Aminosäuretransitpeptid plus 444 Aminosäuren des reifen Enzyms codiert, und 0,4 kb der gesamten 3'-Flankiersequenz. Die EPSPS-cDNA voller Länge wurde als ein 2,1 kb BglII- SalI-Fragment in die BamHI/SalI-Stellen des Plasmids pGEM1 kloniert, um Plasmid pMON6140 zu erhalten, und in PGEM2, um pMON6145 zu erhalten. Die EPSPS codierende Region wird vom T7- bzw. SP6-Promotor 5' zu 3' transcribiert.
Plasmid-DNA (pMON6140 und pMON6145) enthaltend die EPSPS-cDNA voller Länge wurde an einer einzigen PvuI-Stelle, die sich in der 3'-nicht-translatierten Region befand, linearisiert. Die linearisierte Plasmid-DNA wurde in vitro (ungeschützt) mit SP6- und T7-Polymerase transcribiert, im wesentlichen wie in Krieg et al., 1984, beschrieben. Der Standardreaktionspuffer enthielt 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiotreitol, 2 mM Spermidin, 80 E RNasin-Ribonucleaseinhibitor, jeweils 0,5 mM ATP, GTP, CTP und UTP in einem Endreaktionsvolumen von 100 ul. Das End-RNA-Pellet wurde in 20 ul sterilem Wasser wieder suspendiert und bei -80ºC gelagert. Eine Standardtranslationsreaktionsmischung enthielt 100 ul nucleasebehandeltes Kaninchenreticulozytenlysat, 5,7 ul einer 19-Aminosäuremischung (minus Methionin) bei jeweils 1 mM, 5,7 ul RNA (Gesamt-RNA-Transcripte stammend von 0,63 ug Plasmid-DNA), 16 ul RNasin (20 E/ul)-Ribonucleaseinhibitor und 58,3 ul [³&sup5;S]Methionin (14 bis 15 mCi/ml). Die in vitro-Translationsreaktion wurde 90 min bei 30ºC ablaufen gelassen. Die Translationsprodukte wurden gefroren bei -80ºC gelagert.
Intakte Chloroplaste wurden aus Lattich (Latuca sativa, Var. longifolia) durch Zentrifugieren in Percoll/Ficoll-Gradienten, wie von Bartlett et al. (1982) modifiziert, isoliert. Das Endpellet von intakten Chloroplasten wurde in 0,5 ml sterilem 330 mM Sorbit in 50 mM Hepes-KOH, pH 7,7, suspendiert, auf Chlorophyll getestet (Arnon, 1949) und auf die Endchlorophyllkonzentration von 4 mg/ml (unter Verwendung von Sorbit/ Hepes) eingestellt. Die Ausbeute an intakten Chloroplasten von einem einzigen Lattichkopf betrug 3 bis 6 mg Chlorophyll. Diese Chloroplaste wurden auf Basis von Phasenkontrast und Transmissionselektronenmikroskopie als homogen angesehen.
Ein typisches 300 ul-Aufnahmeexperiment enthielt 5 mM ATP, 8,3 mM unmarkiertes Methionin, 322 mM Sorbit, 58,3 mM Hepes-KOH (pH 8,0), 50 ul Reticulozytenlysattranslationsprodukte und intakte Chloroplaste von L. sativa (200 ug Chlorophyll). Die Aufnahmemischung wurde bei Raumtemperatur (in 10·75 mm Glasröhrchen) direkt vor einem faseroptischen Leuchtkörper, eingestellt auf maximale Lichtintensität (150 Watt-Birne) leicht geschüttelt. Aliquote Mengen der Aufnahmemischung (50 bis 125 ul) wurden zu verschiedenen Zeiten entfernt und über 100 ul Silikonölgradienten (in 150 ul Polyethylenröhrchen) durch Zentrifugieren während 30 s bei 11 000·g fraktioniert. Unter diesen Bedingungen bilden die intakten Chloroplaste ein Pellet unter der Silikonölschicht und das Inkubationsmedium (das Reticulozytenlysat enthaltend) schwimmt auf der Oberfläche. Nach Zentrifugieren wurden die Silikonölgradienten sofort in Trockeneis gefroren. Das Chloroplastpellet wurde dann in 50 bis 100 ul Lysepuffer (10 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 5 mM &epsi;-Amino-n-capronsäure und 30 ug/ml Aprotinin) wieder suspendiert und 20 min bei 15 000·g zentrifugiert, um die Thylakoidmembranen zu pelletisieren. Der klare Überstand (Stromalproteine) von diesem Spin und eine aliquote Menge des Reticulozytenlysatinkubationsmediums von jedem Aufnahmeexperiment wurden mit einem gleichen Volumen 2X NaDodSO&sub4;-PAGE-Probenpuffer für Elektrophorese (siehe unten) gemischt.
NaDodSO&sub4;-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970) in 12% (G/V) Acrylamidscheibengelen (60·1,5 mm) mit 3% (G/V) Acrylamidstapelgelen (5·1,5 mm) durchgeführt. Die Gele wurden in 30% Methanol und 10% Essigsäure fixiert, unter Vakuum getrocknet und für direkte Autoradiographie mit einem Kodak XAR-5-Röntgenfilm genommen. Quantifizierung von Banden auf dem Röntgenfilm wurde unter Verwendung eines Hoefer GS-300-Abtastdensitometers mit einem Spectra-Physics SP4100 Aufzeichnungs/Comuterintegrator durchgeführt.
Um zu verifizieren, daß Vorläufer-EPSPS (+CTP) aufgenommen und durch Chloroplaste verarbeitet ist, wurden die gesamten [³&sup5;S]-methioninmarkierte Prä-EPSPS enthaltenden Translationsprodukte mit frisch isolierten, intakten Chloroplasten von L. sativa inkubiert. Die Prä-EPSPS (+CTP) wurde rasch in Chloroplaste transloziert und zur reifen EPSPS von Mrα&sup4;&sup8; kDa gespalten. Das NaDodSO&sub4;-PAGE-Autoradiogramm zeigte das Verschwinden der Vorläufer-EPSPS aus dem Inkubationsmedium und das nachfolgende Erscheinen einer niedermolekularen reifen Form in der Chloroplastfraktion. Etwas von der reifen EPSPS war auf Grund von Chloroplastlyse auch im Inkubationsmedium nach 15 min vorhanden. Nachaufnahmebehandlung der Inkubationsmischung mit Trypsin und Chymotrypsin zeigte, daß die Prä-EPSPS im Inkubationsmedium vollständig abgebaut war, während die reife EPSPS in der Chloroplastfraktion voll geschützt war. Diese Ergebnisse zeigen, daß EPSPS über die Chloroplasthülle in einen für Protease unzugänglichen Raum transloziert wurde. Weiterhin zeigte Subfraktionierung von reisolierten Chloroplasten, daß sich die reife EPSPS in der stromalen Fraktion und nicht in der Thylakoidfraktion befand. Basierend auf Nucleotidsequenz beträgt das für die reife P. hybrida EPSPS vorausgesagte Molgewicht 47 790 Dalton. Das in der -reisolierten Chloroplastfraktion befindliche Mr&sup4;&sup8; kDa Polypeptid comigrierte während NaDodSO&sub4;-PAGE mit der gereinigten reifen EPSPS von P. hybrida.
Um zu zeigen, daß das CTP für Aufnahme erforderlich ist, wird das reife Enzym (dem CTP fehlt) nach einem ersten 15 min Aufnahmeexperiment aus dem Chloroplastenstroma isoliert. Eine Mischung von stromalen Proteinen (enthaltend das markierte reife Enzym) wurde mit unmarkiertem Reticulozytenlysat verdünnt und in einem zweiten Aufnahmeexperiment mit intakten Chloroplasten verwendet. Die reife EPSPS (der CTP fehlt) wurde während einer 15 min langen Inkubation nicht in Chloroplasten transloziert oder an die Außenhüllenmembran gebunden. Als Kontrollexperiment haben wir gefunden, daß die Aufnahmerate von Prä-EPSPS in Chloroplaste durch den Zusatz von stromalen Proteinen zur Inkubationsmischung unbeeinflußt blieb. Aus diesen Daten wird geschlossen, daß das CTP von EPSPS zur Aufnahme des Enzyms in Chloroplaste erforderlich ist.

Beispiel 19: CTP von Petunien-EPSPS erleichtert Chloroplastenaufnahme von heterologem Protein

Die folgenden EPSPS-Experimente zeigen, daß CTP ein heterologes Protein zum Stromakompartiment lenken kann. Das 72 Aminosäure-Transitpeptid von EPSPS wurde mit dem reifen ssRUBISCO von Weizen fusioniert. Die reife Weizen-ssRUBISCO-cDNA (Broglie et al., 1983) wurde als ein SphI/PstI-Fragment von ungefähr 0,6 kb erhalten. Dieses SphI/PstI-Fragment enthält die gesamte reife Weizen-ssRUBISCO codierende Region von 128 Aminosäuren (beginnend am N-terminalen Methionin) und 200 bp der 3'-nicht-translatierten Region. Das reife sRUBISCO-cDNA-Fragment wurde hinter dem P. hybrida EPSPS CTP-cDNA-Fragment fusioniert. Diese Fusion erfolgte durch Verbinden eines EcoRI/SpI-Fragments von pMON6242 mit der Weizen-ssRUBISCO-cDNA. Der Konstrukt pMON6242 ist ein Derivat von pMON6140 und enthält P. hybrida-EPSPS mit einer manipulierten Consensus-Spaltstelle für ssRUBISCO. Die Spaltstelle von pMON6140-EPSPS (Ser-Val-Ala-Thr-Ala-Gln/Lys) wurde auf Gly-Gly-Arg-Val-Ser-Cys/Met in pMON6242 geändert. Diese Änderung führt eine SphI-Stelle im Raster ein, die einen CTP-Bruch zwischen ssRUBISCO und EPSPS ermöglicht. Das Konstrukt pMON6242 wurde vorher in pGEM-2 kloniert und es zeigte sich, daß ein chimäres Vorläuferenzym erhalten wird, das in Chloroplaste in vitro transportiert und proteolytisch auf korrekte Weise verarbeitet wird.
Das EcoRI/SphI-Fragment von pMON6242 wurde mit der SphI-Stelle von Weizen-ssRUBISCO fusioniert und in Plasmid pIBI kloniert, wobei pMON6149 erhalten wurde. In vitro-Transcription/Translation von pMON6149 ergab ein einziges Peptid mit dem für das Fusionsprotein vorhergesagten Molgewicht (ungefähr 23 kD). Chloroplastimporttests in vitro zeigten, daß das chimäre Protein in die Stroma transportiert und proteolytisch zu einem Endprodukt von ungefähr 15 kD gespalten wurde (ssRUBISCO hat ein Molgewicht von 15 kD).
Diese Ergebnisse zeigen, daß das EPSPS-CTP allein ausreichend Information verleiht, um ein heterologes Protein zum Chloroplaststroma zu lenken.

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Claims

1. Chimäres Pflanzen-Gen, das

(a) eine Promotorsequenz, die Transcription des EPSPS-Gens in Pflanzenzellen bewirkt,

(b) eine codierende Sequenz, die ein Chloroplast-Transitpeptid/ 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase-Fusionspolypeptid codiert, welches Chloroplast-Transitpeptid ermöglicht, daß das Fusionspolypeptid oder ein enzymatisch aktiver Teil hievon beim Exprimieren in einer Pflanzenzelle in ein Chloroplast der Pflanzenzelle eingeführt wird, und

(c) eine 3'-nicht-translatierte Region, die ein Polyadenylierungssignal codiert, das in Pflanzenzellen wirkt, um die Addition von Polyadenylatnucleotiden an das 3'-Ende der EPSPS m-RNA zu bewirken, wobei der Promotor in bezug auf die codierende Sequenz heterolog ist und ausreichende Expression des Fusionspolypeptids bewirken kann, um der Pflanzenzelle und daraus regenerierten Pflanzen einen wesentlichen Grad an Glyphosatresistenz zu verleihen, umfaßt.

2. Chimäres Gen nach Anspruch 1, in dem die Promotorsequenz eine Pflanzenviruspromotorsequenz ist.

3. Chimäres Gen nach Anspruch 2, in dem die Promotorsequenz eine Promotorsequenz von Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV) ist.

4. Chimäres Gen nach Anspruch 3, in dem die Promotorsequenz die CaMV35S-Promotorsequenz ist.

5. Chimäres Gen nach Anspruch 1, in dem die codierende Sequenz eine mutante 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) codiert.

6. Chimäres Gen nach Anspruch 1, in dem die EPSPS codierende Sequenz eine EPSPS von einem Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen und Pflanzen codiert.

7. Chimäres Gen nach Anspruch 1, in dem das Chloroplast- Transitpeptid von einem Pflanzen-EPSPS-Gen stammt.

8. Klonierungs- oder Expressionsvektor umfassend ein chimäres Pflanzen-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Pflanzentransformationsvektor, der ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

10. Glyphosatresistente Pflanzenzelle umfassend ein chimäres Pflanzen-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

11. Glyphosatresistente Tomatenzelle nach Anspruch 10.

12. Glyphosatresistente Tabakzelle nach Anspruch 10.

13. Glyphosatresistente Ölsamenrapszelle nach Anspruch 10.

14. Glyphosatresistente Flachszelle nach Anspruch 10.

15. Glyphosatresistente Sojabohnenzelle nach Anspruch 10.

16. Glyphosatresistente Sonnenblumenzelle nach Anspruch 10.

17. Glyphosatresistente Zuckerrübenzelle nach Anspruch 10.

18. Glyphosatresistente Luzernezelle nach Anspruch 10.

19. Glyphosatresistente Baumwollzelle nach Anspruch 10.

20. Glyphosatresistente Kartoffelzelle nach Anspruch 10.

21. Glyphosphatresistente Pflanze, die aus einer glyphosatresistenten Pflanzenzelle umfassend das chimäre Pflanzen-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 regeneriert wurde.

22. Glyphosphatresistente Pflanze nach Anspruch 21 ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Raps, Flachs, Tomate, Zuckerrübe, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Mais, Weizen, Reis und Lattich.

23. Glyphosphatresistente Pflanze nach Anspruch 21, die aus einer glyphosatresistenten Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 11 bis 20 regeneriert wurde.

24. Glyphosphatresistente Pflanze nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.

25. Verfahren zum Herstellen einer glyphosatresistenten Pflanzenzelle, das das Transformieren der Pflanzenzelle mit einem Pflanzentransformationsvektor nach Anspruch 9 umfaßt.

26. Verfahren zum Herstellen einer glyphosatresistenten Pflanze, das

(a) das Transformieren einer Pflanzenzelle unter Verwendung eines Agrobacterium-Transformationsvektors umfassend ein chimäres Pflanzen-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und

(b) das Regenerieren einer glyphosatresistenten Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle umfaßt.

27. Verfahren zum Herstellen einer glyphosatresistenten Pflanze nach Anspruch 26, in dem die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.

28. Plasmid pMON546, ATCC-Nr. 53213.