JPH01500400A - 外来宿主における野生型及び変異型グルタミンシンテターゼの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５、植物細胞である、請求の範囲第２３項記載の宿主細胞。

２、特許請求の範囲第１８項記載の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子で形質転換された細胞 を含んでなる植物。

２７、請求の範囲第２５項記載の植物細胞から再生された植物及びその種子。

２８、作動可能に結合した状態で： ａ）　原核細胞複製源、 ｂ）　原核細胞プロモーター、及び Ｃ）　真核細胞グルタミンシンテターゼについてコードするＤＮＡ配列 を有する、原核細胞宿主中で複製可能なプラスミド。

２９、真核細胞グルタミンシンテターゼが植物由来である、請求の範囲第２８項 記載のプラスミド。

３０、　真核細胞グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を有す る原核細胞中で発現可能な組換えＤＮＡ分子で形質転換された原核細胞。

３１、汽核細胞グルタミンシンテターゼが植物由来である、請求の範囲第３０項 記載の原核細胞。

３２、組接えＤＮＡ分子がプラスミドである、請求の範囲第３０項又は第３１項 記載の原核細胞。

３３、非形質転換状態において、自己の機能性グルタミンシンテターゼを産生ず ることができないか又は低下したグルタミンシンテターゼ活性を示す細菌である 、請求の範囲第３０項記載の原核細胞。

３４、　大腸菌である、請求の範囲第３０項〜第３３項のいずれか１項に記載の 原核細胞。

３５、請求の範囲第１０項記載の配列で植物を形質転換しかつ前記配列を発現さ せることを特徴とする除草性ＧＳ阻害剤抵抗性植物の製造方法。

３６、除草性ＧＳ阻害剤感受性植物の選択的制御方法であって、 該植物を植物制御量の上記阻害剤と接触させることからなり、この接触が請求の 範囲第２６項記載の植物をも同時に接触させながら行なわれることを特徴とする 方法。

浄書（内容：こ変更なし］ 明　細　書 外来宿主における野生型及び変異型グルタミンシンテターゼの発現 本出願は、１９８６年９月１５日付出願第９０６．９８４号及び１９８６年３月 １８日付出願第８４０．７４４号の一部継続出願である。

本発明は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現遺伝子配列をもつ細菌又は植物 細胞のような宿主に形質転換させるための組換えＤＮＡ技術の適用に関する。野 生型及びＧＳ阻害剤耐性酵素双方の遺伝子が開示されている。

背景技術の簡単な説明 遺伝学的かつ分子生物学的方法は様々な生化学的問題を解決するために利用され てきており、好結果を与えていた。それらは例えば、系統的アミノ酸置換により タンパク質の触媒活性が高まり又はインデューサー結合作用が変化したものに関 して選択するために利用されてきた〔オホーら、サイエンス、第２２９巻、ｍ３ ８９頁、１９８５年（Ｏｈｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９：３ｇ９ ．１９８５）　；ガージスら、セル、第４１巻、第７４５頁、１９８５年（Ｇａ ｒｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｃｌｌ、４１ニア４５，１９８５）　；ミラーｅエ ヌ、オペロン、編集ミラーら、コールド・スプリング・ハーバ−１１９７８年（ Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎ、、Ｔｈｅ　０ｐｅｒｏｎ、Ｍｌｌｌｅｒ　ｅｔａｌ、Ｅｄｓ 、、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９７ｇ））　ｏ　しかしながら 、一般的に、これらの研究は細菌タンパク質に限定されていた。原核細胞におけ る機能的活性真核細胞タンパク質の発現は、特に遺伝的補足化ｃｇｅｎｅｔｉｃ 　ｅＯｌｐｌｅｌｅｎｔａｔｉ−ｏｎ）が実現可能である場合には、これら技術 の多くを適用することによって、真核細胞タンパク質の構造−機能分析を容易に させるであろう。

タンパク質工学及び構造−機能分析に関して特に重要な酵素は植物由来グルタミ ンシンテターゼ（ＧＳ）である〔ミツリンら、植物の生化学二アミノ酸及び誘導 体、編集ミツリン、第５巻、第１６９頁、アカデミツクプレス、１９８０年（Ｍ ｌｆ’ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｒ　 Ｐｌａｎｔｓ：＾ｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｒｌｖａｔｌｖｅｓ、Ｍ Ｉｆ’ｌｌｎ　Ｅｄ、。

Ｖｏｌ、５．Ｐ、１８９．Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８０））　。Ｇ 　Ｓはグルタミン酸シンターゼと協同して、分子状窒素固定、硝酸還元及び代謝 によるアンモニア同化を行なう。この酵素はキューブ様形態をした８量体であっ て、通常単一のポリペプチドからなる。ＧＳ産生は、遺伝的かつアロステリック 的双方の制御をうけている。

数種の除草剤は植物グルタミンシンテターゼを阻害することによって作用する。

このような化合物の代表例はグルタミン酸類縁体たるホスフィノスリシン（ＰＰ Ｔ）である。しかしながら残念なことに、これら除草剤の多くは、草類はもちろ ん、穀物植物に存在するグルタミンシンテターゼをも阻害するため、ＰＰＴのよ うな化合物の使用には限界があった。

いかなる市販除草剤においても除草選択性が非常に困難であることから、ＰＰＴ のような非選択的除草剤及び他のＧＳ阻害剤に対する耐性を選択された植物に付 与しうるということに多大な関心が集まるようになった。

他の化合物に対するグルタミンシンテターゼ耐性の存在例がある。別のグルタミ ン酸類縁体たるメチオニンスルホキシミノ（ＭＳＯ）はエントウ葉グルタミンシ ンテターゼの混合型競合阻害剤（Ｋ　ｉ　＝０．　１６ｍＭ）であることが知ら れている〔リーズンら、フィトケミストリー、第２１巻、第８５５頁、１９８２ 年（Ｌｅａｓｏｎ　ｅｔａｌ、、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｇ＋１ｓｔｒｙ、２１：８５ ５（１９８２）））　ｏ　ミラーら〔ジャーナル・オブＯバイオロジカルｅケミ ストリー（Ｊｏｕｒｒ＋−ａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｌｅａｌ　Ｃｈｅｍｌｓｔ ｒｙ）　、第２５６巻、第１１３０７頁、１９８１年〕は数種のＭＳＯ耐性サル モネラ（Ｓａｔ■ｏｎｅｌ　ｌａ）変異株の性質について研究した。−例におい ては、明らかに細菌グルタミンシンテターゼをアンモニア結合ドメインで変化さ せてＭＳＯ耐性を付与する突然変異が発生した。更に最近になり、ヤング（Ｙｏ ｕｎｇ）ら（同上、第２５８巻、第１１２６０頁、１９８３年）は、ＭＳＯ存在 下で増殖するマウス３Ｔ６細胞がこの化合物に対する耐性を獲得したことを報告 した。ＭＳＯ耐性細胞はグルタミンシンテターゼについて豊富なｍＲＮＡを有し ており、著者らはこの発見が遺伝子の増幅を意味することを示唆した。サンダー スら、エンボ・ジャーナル、第３巻、第６５頁、１９８４年［５ａｎｄｅｒｓ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｅｍｂｏ　Ｊｏａｒｎａｌ、３：８５（１９８４）］を更に参照 せよ。ミラー、ヤング及びサンダースの研究ではいずれも植物ＧＳに関しては報 告していなかった。

ＰＰＴ耐性アルファルファ細胞は最近報告された〔ニューマーク、ネーチャー、 第３０５巻、第３８３−３８４頁、１９８３年（Ｎｅｗｍａｒｋ、Ｎａｔｕｒｅ 、３０５：３８３−３８４゜１９８３）　）。しかしながら、耐性は発現ＧＳ酵 素に関して特異的構造変異というよりむしろＧＳ遺伝子の増幅に基因していた〔 ダンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド会アプライド・ゲネティクス 、第２巻、第６２１−６３５頁、１９８４年（Ｄｏｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕ ｒｎａｌｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＡｐｐＨｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、２：６２１−８３５．１９８４）］。

したがって、植物グルタミンシンテターゼに関する遺伝子配列を有する細菌株を 開発することが望まれるのである。この株の１つの応用例は商業的又は工業的目 的のためにＧＳ産生量を高めることである。もう１つの応用例は、ＧＳ阻害剤の 作用に対して耐性の生化学的機能性植物グルタミンシンテターゼを産生ずる構造 変異体の開発に関してである。

かかる構造ＧＳ変異体が開発された場合には、その遺伝子はＧＳ阻害剤耐性植物 細胞及び植物を得るために植物細胞及び植物に組込んで形質転換させることがで きる本発明はグルタミンシンテターゼについてコードする配列を含む組換えＤＮ Ａ分子で形質転換された生物に関する。

ＧＳ遺伝子配列には２つの異なるタイプがある。第一のタイプの遺伝子配列（以 下“野生型ＧＳ”）は野生型ＧＳについてコードし、かつアルファルファ等の植 物細胞のような真核細胞ドナーを起源としている。これによってコードされるＧ ＳはＰＰＴのような除草性ＧＳ阻害剤に感受的である。

第二のタイプの遺伝子配列（以下“変異型ＧＳ”）はＧＳの構造変異体について コードし、前記真核細胞又は細菌のような原核細胞からなる原核細胞又は真核細 胞のドナーを起源としている。これによってコードされるＧＳはＰＰＴのような 除草性ＧＳ阻害剤による阻害に耐性的である。

本発明者らは、細菌グルタミンシンテターゼについてコードしえない大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｉｌ）細胞変異体が野生型グルタミンシンテターゼ に関しコードする真核細胞遺伝子配列で形質転換され、かつ酵素がそこで発現さ れうろことを発見した。

これらの大腸菌形質転換体は突然変異誘発法に供することもでき、しかも様々な 構造変異ＧＳ酵素を産生ずるように変えられうる。これら変異ＧＳ遺伝子の中で 数種のものに関する配列も大腸菌宿主を補足し、そこで発現する。更に重要なこ とに、変異遺伝子の配列特徴の把握は、原出所源として使用されたちの以外の別 の真核細胞からか又は原核細胞源からの他の変異ＧＳ遺伝子配列造成のための基 礎をなす。

本発明の一態様は、形質転換前には自己のグルタミンシンテターゼを産生じえな い原核細胞において真核細胞グルタミンシンテターゼを発現させることに関する 。宿主原核細胞株は、野生型原核細胞株と異なり機能性原核細胞グルタミンシン テターゼを産生じえないか又は野生型株の場合よりも低いグルタミンシンテター ゼ活性レベルを有する変異体であることが好ましい。したがって、かかる原核細 胞変異体が本発明に従い形質転換される場合には、変異細菌は機能性グルタミン シンテターゼ産生能を再度獲得し、その結果グルタミン欠乏培地上で増殖しつる ようになる。通常野生型株で産生される機能性物質を使用レベルで産生しうる能 力を変異株が回復することは、補足化として知られている。

このように、本発明では植物野生型ＯＳ遺伝子を細菌転写及び翻訳シグナルと融 合させることができる。この融合は細菌変異体の遺伝的補足化を可能にする。本 発明のこの態様は、植物遺伝子を用いた細菌における補足化の最初の例である。

植物酵素は折りたたまれかつ集合し合って、宿主細胞中で実質上天然のコンホメ ーションをとっている。したがって、本発明によれば、ランダム及び特定部位（ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発法〔ホトスタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、サ イエンス、第２２９巻、第１１９３頁、１９８５年〕並びに細菌遺伝学において 植物酵素の構造−機能研究のために用いうる系を製造することができる。しかも 本発明は、除草剤耐性植物の開発に際して用いられる除草性ＧＳ阻害剤（例えば 、Ｌ−ホスフィノスリシン）耐性グルタミンシンテターゼ遺伝子をもった大腸菌 の直接的選択を可能にする。

本発明のもう１つの態様では、（除草性ＧＳ阻害剤耐性酵素についてコードする ）変異ＯＳ遺伝子配列は植物細胞中で作動する転写プロモーターに作動可能に結 合せしめられた組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）分子中に存在しており、ｒＤＮＡ分 子は植物細胞を形質転換させるために使用される。得られた植物細胞、それから 再生される植物、その継代植物及びそれらの草類は、変異ＧＳ遺伝子を有しかつ 発現するものであればすべて、本発明の一部第１図は、アルファルファ野生型グ ルタミンシンテタ−ゼ発現プラスミドｐＣＧＳ２、並びに中間プラスミドｐＧｓ １００及びｐｔａｃ１２１２の製造法について説明している。

第２図は、ＧＳを産生じえない大腸菌変異体の遺伝子工学的処理アルファルファ 野生型ＧＳ遺伝子による遺伝的補足化について示している。左側のペトリ皿はグ ルタミン補充最小Ｍ９培地を含有しているが（＋ＧＬＮ）、右側の増殖培地はグ ルタミンを含有していない（−ＧＬＮ）。生物Ａは機能性グルタミンシンテター ゼ酵素を産生じえない大腸菌変異株である。したがって、それはグルタミン欠乏 培地上で増殖することができない。

生物Ｂは生物Ａと同一の大腸菌株であるが、但しプラスミドｐＣＧＳ２で形質転 換されている。生物Ａと異なり、生物Ｂはそのグルタミンシンテターゼ産生能の おかげで外から補充されるグルタミンの存否にかかわらず培地上で増殖すること ができる。

第３図は、変性（Ａ）及び非変性ＣＢ）条件下で大腸菌中において発現されるア ルファルファ野生型グルタミンシンテターゼの免疫プロット分析について示して いる。

第４図はｐＣＧＳ３の制限地図を示している。

第５図はｐＣＧＳ４の制限地図を示している。

第６図は、野生型ＧＳの完全ヌクレオチド及びアミノ酸配列、ｐｔａｃ１２の転 写及び翻訳シグナル（−３５、−１０、ＳＤ）、ヘキサヌクレオチド制限部位、 並びに次のようないくつかの構造変異体：即ち正常なＮ末端アミノ酸残基におけ る２〜５番目の５ＬＬＳを欠いたΔＣＧＳＩ　；ＧＳ（ｖａ１２０７）；ＧＳ（ ｓｅｒ２４５）；ＧＳ（ｇｌｎ２４９）；及びΔｐｃＧｓ３１５．２について示 している（グルタミンシンテターゼ活性はΔｐｃｃｓ３１５．２になく、カルボ キシル末端の１６個のアミノ酸残基を欠いている）、ＧＳ（ｓｅｔ２４５）　、 ＧＳ（ａｒｇ２４５）　、ＧＳ（Ｉｙｓ２４５）及びＧ　Ｓ　（Ｉｙｓ３３２） はＰＰＴ耐性変異体である。

アミノ酸に関して標準的略号が用いられている：Ａ。

アラニン；Ｒ，アルギニン；Ｎ、アスパラギン：Ｄ、アスパラギン酸；Ｃ，シス ティン；Ｑ、グルタミン：Ｅ。

グルタミン酸；Ｇ、グリシン；Ｈ，ヒスチジン；！、インロイシン；Ｌ、ロイシ ン；に、リジン；Ｍ、メチオニン；Ｆｌ　フェニルアラニン；Ｐ、プロリン；Ｓ 、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｗ、トリプトファン、　Ｙ、チロシン；Ｖ、バリン 。デオキシリボ核酸に関する標準的略号も用いられている：Ａ、アデニン；Ｇ、 グアニンｉ　Ｕｌ　ウラシル；Ｔ、チミン；Ｃ１シトシン。

′Ｎ４７図は、ＰＰＴに対する野生型及びＰＰＴ耐性ＧＳ酵素の感受性について 示した第３表におけるデータのグラフ図である。

第８図は、アラビドプシス（Ａｒａｂｌｄｏｐｓｌｓ）由来の葉特異性ＧＳｃＤ ＮＡクローンＡｔ　ｃＧｓＬｌの部分的遺伝子配列を示している。

第９図は、葉及び根から単離されたアラビドプシスＲＮＡのノザーンプロット分 析結果を示したものであって、Ａ、アラビドプシス葉特異性ｃＤＮＡクローンＡ ｔｃＧＳＬ１；Ｂ、アラビドプシス根特異性ＣＤＮＡクローンＡｔｃＧＳｒｌ； Ｃ，アラビドプシス根特異性ｃＤＮＡクローンＡｔｃＧＳｒ２のニックトランス レーションされたプローブでプロットされている。

第１０図は、暗所生育、光生育及び緑化アラビドプシス種苗、アラビドプシス葉 、並びに“アルファルファ”、即ち増幅ＧＳ遺伝子をもつアルファルファ組織培 養細胞からのタンパク質抽出物を用いたウェスターンプロット分析結果を示した ものである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルはアルファルファＧＳ及び１２５ 　Ｉ−タンパク質Ａに対する特異的抗血清でプローブ処理される）。

第１１図は、アラビドプシス由来根特異性ＧＳｃＤＮＡクローンＡｔｃＧＳｒｌ の部分的遺伝子配列である。

第１２図は、アラビドプシス由来根特異性ＧＳｃＤＮＡクローンＡｔｃＧＳｒ２ の部分的遺伝子配列である。

好ましい態様の説明 一態様において本発明は、未形質転換時にはグルタミンシンテターゼを産生じえ ないが、本発明による形質転換時には野生型真核細胞、又は変異型真核細胞もし くは原核細胞グルタミンシンテターゼを産生しうる原核細胞に関する。

酵素“グルタミンシンテターゼの定義は機能本位であって、所定の望ましい宿主 、特に細菌又は植物中で機能してグルタミン酸をグルタミンに変えることができ れば、いかなるグルタミンシンテターゼをも含む。したがってその語は、遺伝的 形質転換に関与する特定の植物種由来の酵素のみならず、ＧＳが形質転換された 植物又は細菌細胞中で機能しうるならば他の植物種又は微生物由来のＯＳであっ ても含む。またその語は、ＧＳの機能性部分断片、それらの類縁体又は活性変異 体のように、天然ＧＳの全構造鎖長よりも長いか又は短いいずれのタンパク質又 はポリペプチドも含む。例えば正常な２〜５番目のＮ末端アミノ酸（Ｓ、Ｌ、Ｌ 、Ｓ）を欠くか又は２４９位においてヒスチジン残基の代わりにグルタミン残基 を有するＧＳは、本明細書に示された研究によれば活性な酵素であって、しかも ＰＰＴ阻害に対して感受的である。このような酵素は本明細書において“変異体 ”と呼ばれている。

１ホスフイノスリシン１という語はその生物学的活性型として公知の化合物を意 味する。これはＬ−型でもり。

Ｌ−型であってもよく、更にはＰＰＴ活性を阻害しない他の不活性又は活性化合 物と併用されても又は単独であってもよい。

″原核細胞（生物）”という語は細菌、バクテリオファージ及びウィルスを含む 意味であり、一方“真核細胞（生物）”という語は植物、動物、真菌、酵母及び 寄生虫を含む。

野生型ＧＳ 野生型グルタミンシンテターゼはいかなる真核細胞源からのものであってもよい 。必要なことは、酵素に関する遺伝子配列が発現して、原核細胞中で機能性酵素 を産生ずることのみである。好ましくは、植物グルタミンシンテターゼ遺伝子及 びそれらの発現産物である。特に重要なものは、農業上重要な特定の植物種、特 に除草性ＧＳ阻害剤感受性植物由来のグルタミンシンテターゼ遺伝子である。

上記のような遺伝子構造体による遺伝子操作をうけうるいずれの植物細胞由来の グルタミンシンテターゼに関する野生型遺伝子は、グルタミンシンテターゼを発 現しない原核細胞を形質転換させるために用いることができる。野生型グルタミ ンシンテターゼ遺伝子の供給源として使用しうる双子葉植物としては、様々な種 のポテト〔ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｗ＞）　 ；　）マド〔リコペルシコン会エスクレンッム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓ　Ｉｃｏｎｅ ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）　）　；コシヨウ〔カブシクム・アンヌム（Ｃａｐｓｌｃ ｕ■ａｎｎｕ■■）〕；タバコ〔ニコチアナ中タバクム（Ｎｉｃｏｔｌａｎａ　 ｔａｂａｃｕｍ））　；様々な種のアブラナ、特に葉枝〔ブラシカ・ナブス（Ｂ ｒａｓｓｌｃａ　ｎａｐｕｓ）　）　、様々な豆果類、例えばアルファルファ〔 メディカゴ・サチバ（Ｍｅｄｌｃａｇｏ　５ａｔｉｖａ））　、クローバ−〔ト リホリウム種（Ｔｒｉｆ’ｏｌｉｕｓ　５１）、））　、大豆〔グリシン−７− ／クス（Ｇｌｙ−ｃｉｎｅ■ａＸ）　）　、グランドナツ゛ソ〔アラチス争ヒボ ガエア（Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ）　）　；様々な種の豆類〔ファセ オルス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｓｐ、）、ビシ種（Ｖｉｃｉ　ｓｐ、）　、ビ グナ種（Ｖｉｇｎａ　ｓｐ、））　；エントウ類〔ビスム・サチブム（Ｐｌｓ− ｕｓ　Ｓａｔｉｖｕｍ）　）　；ビート類（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａｖｕｌ ｇａｒｌｓ）　）　、、ニンジン類〔ダウクス・力ロタ（Ｄａｕｅｕｓｃａｒｏ ｔａ）　）及びサツマイモ類〔イボモニア・バタツス（Ｉｐｏａｏｅａ　ｂａｔ ａｔｕｓ））のような根茎穀物類；並びにアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂ ｌｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）のようなその他のものがある。

野生型遺伝子は、根、葉、茎等のようないかなる植物器官からも得ることができ る。Ａ、タリアナにおいて、野生型ＧＳに関する遺伝子としては葉特異的及び根 特異的なものがある。葉特異的遺伝子はそれが光誘導性であることから重要であ り、４４ｋｄ　（キロドルトン）のポリペプチドについてコードしている（例５ 〜８参照）。

これら遺伝子の器官特異性は、それらが器官特異的形質転換及び／又はＰＰＴ耐 性変異ＧＳ遺伝子の発現を可能にすることから、重要である（以下参照）。

野生型グルタミンシンテターゼに関する真核細胞遺伝子は、植物生物の真核細胞 ＤＮＡから直接得られるか、又は真核細胞ｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡを介 して得ることができる。真核細胞グルタミンシンテターゼの単離技術は、参考の ため本明細書に組込まれる１９８６年２月２７日付出願の同時係属米国特許出願 第８３３．１５６号明細書に記載されている。

野生型真核細胞グルタミンシンテターゼについてコードする配列を含んでなる組 換えＤＮＡ分子は、当業者に周知のいずれかの技術を用いて、原核細胞を形質転 換させるために利用される。特に好ましくは、原核細胞形質転換のために、真核 細胞野生型グルタミンシンテターゼコード配列に関するｃＤＮＡを有するプラス ミドの使用である。

融合せしめられ、作動可能に結合せしめられた遺伝子を製造し、かつ細菌中でそ れらを発現させるための方法は公知であり、例えば米国特許第４．３６６．２４ ６号明細書に示されている。そこで記載された遺伝子構造体及び方法は、原核細 胞宿主中におけるグルタミンシンテターゼの発現のために用いることができる。

原核細胞宿主としては、大腸菌、Ｓ、チフィムリウム（Ｓ、チフィムリウム）、 セラチアφマルセッセンス（Ｓｃｒｒａｔｉａ　５ａｒｓｅｓｃｅｎｓ）及びバ チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ１１ｓ）のようなグラム陰 性及びグラム陽性細菌がある。発現用として好ましい細菌宿主は、変異体が得ら れた野生株と異なり自らの機能性原核細胞グルタミンシンテターゼをもはや発現 しえないか、又はグルタミンシンテターゼ活性をより低いレベルでしか産生じな い変異株である。これらの変異株は、突然変異によって、機能性グルタミンシン テターゼ産生能を既に失ってしまたっか、又は野生型もしくは親株よりも低いレ ベルでしかグルタミンシンテターゼを産生じないか、又は活性の消失したグルタ ミンシンテターゼを産生ずる。最も好ましくは、自己の機能性グルタミンシンテ ターゼ産生能を消失した大腸菌変異株である。

一般には、挿入遺伝子断片の効果的転写を促進し、宿主細胞と和合する種から得 られるプロモーター配列を有した発現ベクターが、原核細胞宿主のために使用さ れる。

発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞における表現型選択を可能にさせる 特異的遺伝子のみならず、複製源、プロモーター及びターミネータ−をも有して いる。

形質転換された宿主は、最適の細胞増殖を実現させうろことが当業界で知られて いる手段に従い、発酵かつ培養させることができる。

本発明で使用可能な原核細胞プロモーターの例としては、ｒｅｃＡＳ　ｔｒｐｓ 　１ａｃＳ　ｔａｃ及びバクテリオファージλＰＲもしくはＰ、がある。本発明 で使用可能なプラスミドの例は、マニアティスら、分子クローニング、コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２年［ＭａｎＩａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２　］に掲載されている。

本発明の一面において、イントロンのない完全アルファルファＧＳコード配列は 、ＧＳ核遺伝子のクローン中に存在る５′末端７０ｂｐＧＳコ一ド配列をｃＤＮ Ａ中に存在する３′末端１０００ｂｐＧＳコ一ド配列に結合させることによって 、再組換えされた。得られた構造体ｐＧｓ１００は、５′末端の１４個のみのヌ クレオチドを欠く連続したほぼ完全なＧＳコード領域を有する１、２ｋｂｐＤＮ Ａ断片を得るために、Ｂａ１ＩＩ及び５ｔｕｌで切断された。１．２ｋｂｐＢｇ ｌＩＩ／５ｔｕｌ断片は大腸菌発現ベクターｐｔａｃ１２１２に組込まれてクロ ーニングされたが、このクローンは完全ＧＳコード配列を再生しうるちのであっ て、それを細菌ｔａｃプロモーター及び１ａｃＺリポソ一ム結合部位の下流に位 置させていた。その結果、ＧＳ発現プラスミドｐＣＧＳ２を得た。

本発明は、前記方法に従い修正されたあらゆる細菌、又は例えば溶原ファージを 用いた遺伝物質の導入法のように、当業者に周知である野生型真核細胞グルタミ ンシンテターゼ発現原核細胞を製造するた６のいずれかの他の方法によって修正 されたあらゆる細菌にまで拡張される。

更に詳しくは、本発明の一態様において、ｐｃＧｓ２中に組込まれているような アルファルファ野生型ＧＳ遺伝子の大腸菌中での発現は、ＧＳ欠失（ｇｌｎＡ） 細菌変異体ＦＤＢ２１３の遺伝的補足化によって初めて証明上記真核細胞グルタ ミンシンテターゼで形質転換された原核細胞は、代謝活性を有するにもかかわら ず特にＰＰＴ等の除草性ＧＳ阻害剤のようなグルタミンシンテターゼ阻害剤に耐 性であるグルタミンシンテターゼについてコードする構造変異体の産生用として 特に使用される。更には、グルタミンシンテターゼの商業的生産も実現可能であ る。

“除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤２という語は、所定種の植物細胞のグル タミンシンテターゼ活性を有意に低下させ、その結果として植物細胞中で除草効 果を発揮する、競合型又は非競合型のあらゆる阻害剤を含んだ意味である。ＧＳ 阻害剤の例としては、ホスフィノスリシン、メチオニンスルホキシミン及びその 他のグルタミン酸類縁体である。

自然突然変異は微生物において普遍的に発生するが、突然変異は様々な公知の操 作法によっても高頻度で発生させることができる。例えば、変異体は化学的、放 射線及び組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。

化学的変異誘発剤の例としては、塩基類縁体、脱アミノ化剤、アルキル化剤及び アクリジン誘導体がある。

放射線誘導突然変異は紫外線及びＸ線のような光によって誘発させることができ る。これらの突然変異が生じる主なメカニズムは、組換えによる削除又は複製後 修復を基礎とする。

更に突然変異は、制限エンドヌクレアーゼ又は変異オリゴヌクレオチドでブライ ミングされた（ｐｒｌｍｃｄ）合成物を用いる“特定部位突然変異誘発法”とし て知られた組換えＤＮＡ技術によっても誘発させるとかできる。これら技術の適 用は、大ＤＮＡ断片の削除もしくは挿入、又は特定部位における点変異を行なう 上で特に価値がある。

突然変異を誘発させる方法がどのようなものであったとしても、重要な点は、得 られる変異体が除草性ＧＳ阻害剤に耐性（即ち、それによって阻害されにくい） である機能性グルタミンシンテターゼを産生ずることである。

このように、別の態様において、本発明は、産生されるグルタミンシンテターゼ が例えばホスフィノスリシンのような除草剤の作用に対して野生型グルタミンシ ンテターゼよりも感受性が低いＧＳ変異体に関する。

この態様は、実質的に精製された形の又は外来宿主細胞中における変異ＧＳポリ ペプチドにも拡張される。

変異ＧＳ遺伝子は、あらゆる起源の野生型ＧＳの突然変異によっても得ることが できる。特に重要なものは、菓及び／又は根特異性ＧＳから得られる変異体、特 に光誘導性の葉特異性ＧＳ遺伝子から得られる変異体である。

したがって本発明のこの態様は、変異ＧＳ酵素、好ましくはＰＰＴ阻害に耐性の ＧＳ酵素についてコードする遺伝子配列を提供する。

ＰＰＴ耐性となる具体的な突然変異は（第６図で番号付けされているように、即 ち発現が細菌で生じるか否かに応じて存在したり又は存在しなかったりする最初 のメチオニン残基から始めて）２４５位におけるアミノ酸残基ｇ１ｙから２４５ 位の残基ｓｅｒへの変更であって、これは以後“ＧＳ　（ｓｅ’ｒ２４５）”と 呼ばれる。これは（ｇｌｙ２４５の）ＧＧＴから（ｓｅｒ２４５の）ＡＧＴに対 応コドンを修正することによって実現される。

ＧＳ　（ｓｅｔ２４５）は機能的に活性な酵素であるが、しかしながら通常のＰ ＰＴ阻害濃度では阻害されない。

他のＰＰＴ耐性変異体は、アミノ酸残基ｇｌｙ２４５から例えばａｒｇ２４５（ ＧＳ　（ａ　ｒｇ２４５）’　）及びｃｙｓ２４５（“ＧＳ　（ｃｙｓ２４５） ”　）　への変更によって得られる。

以上のことから、５ｅｒ２４５から別のアミノ酸Ｘへの置換によってＰＰＴ耐性 ＧＳ変異体が得られるであろうと結論付けられる。２４５位にいずれかのアミノ 酸置換残基Ｘを有するＧＳのＰＰＴ耐性変異体は、“ＧＳ（Ｘ２４５）”と表示 される。

２４５位における新しいアミノ酸は中性、酸性又は塩基性、好ましくは中性又は 塩基性である。中性アミノ酸としてはａｌａＳｃｙｓ、、ｉ　ｌｅｑ　Ｉｅｕ、 ｍｅｔｓｐｈｅＳｐｒｏ、ｇ　１　ｎ、　ｓ　ａ　Ｓ　ｎ　ｓ　Ｓ　ｅ　ｒ　Ｓ ｉ　ｈ　ｒ　５ｔｙｒ及びｖａｌがある。塩基性アミノ酸としてはａｒｇ、ｈｉ ｓ、ｔｒｐ及びｌｙｓがある。

別のＰＰＴ耐性変異体は３３２位のアルギニンをリジンで置換することにより得 られ、ＧＳ　（ｌｙｓ３３２）を与える。

上記のように、正常なＮ末端アミノ酸残基２〜５（Ｓ　Ｌ　Ｌ　Ｓ）を欠くか、 又は２４９位においてその位置のｈｉｓの代わりにｇｉｎを有するＧＳ（“ＧＳ （ｇｌｎ２４９）”）は、活性変異体であってかつＰＰＴ感受性である。ＧＳ　 （ｖａ　１２０７）は一部活性な変異体である。したがって、更にｇｌｎ２４９ 変異を有するか及び／又は正常なＮ末端アミノ酸Ｓ、ＬＳＬ。

Ｓを欠＜ＧＳ　（ｓｅｔ２４５）、ＧＳ　（ａｒｇ２４５）、ＧＳ　（ｃｙｓ２ ４５）又はＧＳ　（１ｙｓ３３２）のようなＧＳ　（Ｘ２４５）も本発明のＰＰ Ｔ耐性変異酵素の中に含まれる。

手元にあるこのような知識によれば、合成、組換え又はスプライシング（ｓｐｌ 　Ｉｃｉｎｇ）による遺伝子及び変異ＧＳ遺伝子配列を有する遺伝子及びｒＤＮ Ａ分子を組立てることが可能であり、したがって厳密な意味での“真核細胞”又 は“原核細胞”起源であることをもはや必要としなくなってきている。

変異ＧＳ遺伝子配列を有しかつそれを発現しうる原核細胞宿主が次いで、野生型 真核細胞酵素に関して前記したような方法及び物質から製造される。

耐性植物細胞 第三の態様として、本発明は変異ＧＳ遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子に関する 。これらのｒＤＮＡ分子は、細胞を除草性ＧＳ阻害剤に対して耐性に変えること によって、植物細胞及び植物に除草剤抵抗性を付与する。更に具体的には、本発 明は、変異ＧＳポリペプチドについてコードする遺伝子配列を有するｒＤＮＡ分 子、除草剤抵抗性形質転換植物細胞、及びかかる変異ＧＳを発現する植物にも関 する。

本明細書で用いられる“除草剤抵抗性植物”という語は、除草性ＯＳ阻害剤の通 常の有効量存在下で少なくとも有効に、好ましくは正常に生育かつ成長する植物 として定義される。耐性とは実現可能な最大の抵抗性をいう。

したがって、本明細書で用いられる“除草剤抵抗性”という語は除草剤抵抗性植 物及び除草剤耐性植物を含んだ意味である。除草剤抵抗性植物は、除草剤感受性 植物にとって致死的であるか又はその成長もしくは生育力を損うような除草性Ｇ Ｓ阻害剤の存在下で損失をうけることなく生存しつる。

変異ＧＳ遺伝子を発現しうるちのであれば、いかなる植物細胞及び植物も本発明 に従い形質転換される。これらの植物は、遺伝子工学技術による遺伝子操作をう けることができなければならない。本明細書で用いられる“植物”という語は、 植物細胞、植物原形質体、培養かつ誘導により植物を形成しうる植物組織培養物 、植物カルス、植物塊及び植物もしくは植物部分中での完全な植物細胞を含んで いる。“植物”とは、遺伝子工学技術により形質転換された花粉にも関する。

本発明で使用可能な変異ＧＳに関するコード領域は、形質転換される植物細胞又 は植物に対して同種でも異種であってもよい。しかしながら、得られた植物細胞 中においてＧＳについてコードする遺伝子配列が機能性酵素又はポリペプチドと して発現かつ産生されることが必要である。したがって本発明は変異ＧＳ酵素を 発現する同種ＧＳ遺伝子又は異種ＧＳ遺伝子のうちいずれかを含有した植物にも 関する。しかもＧＳは、別の植物種由来であってもよいし、又は微生物もしくは 哺乳動物のような異なる生物由来でありもよい。

変異ＧＳが植物細胞中に存在しているため、グルタミン／グルタミン酸代謝はＧ Ｓ阻害剤存在下でありも正常に継続しうる。

変異ＧＳ遺伝子についてコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ双方からのＤＮＡ が本発明で使用される。更にＧＳ遺伝子は一部がｃＤＮＡクローンから及び一部 がゲノムクローンから組立てられていてもよい。しかも変異ＯＳ遺伝子について コードするＤＮＡは、様々な植物、微生物及び動物のＧＳ酵素からの各部分を含 んでいてもよい。

本発明のこの態様には様々な側面が含まれている。その側面の１つにおいて、こ の態様は （ａ）　所定の植物細胞中で遺伝子発現した場合にＧＳ活性に関して機能的な変 異ＧＳポリペプチドについてコードする第一の遺伝子配列；及び （ｂ）　ＧＳコード領域のいずれかの側に作動可能に結合せしめられた更に１以 上の遺伝子配列；を有するキメラ遺伝子配列を含んでなる。これらの付加的な遺 伝子配列は植物細胞プロモーター又はターミネータ−の配列を有する。植物調節 配列は宿主細胞に対して異種でも又は同種であってもよい。

キメラ遺伝子配列において使用可能なプロモーターとしては、ｎＯ８，、ｏｃｓ 及びＣａＭＶプロモーターがある。

植物細胞中で作動可能なプロモーターに作動可能に結合せしめられた変異ＧＳ遺 伝子を含んでなるキメラ遺伝子配列は、適切なりローニングベクターに結合せし めることができる。一般に、植物宿主細胞と和合する種から得られる複製及びコ ントロール配列を有するプラスミド又はウィルスベクターが使用される。クロー ニングベクターは典型的には複製源を有すると同時に、表現型選択マーカー、典 型的には抗生物質に対する耐性又は選ばれた除草剤に対する耐性を形質転換宿主 細胞に与えることができる特定遺伝子を有している。形質転換ベクターは、宿主 細胞の形質転換後、これらの表現型マーカーによって選択することができる。

クローニングベクター及びベクターで形質転換された宿主細胞は、典型的にはベ クターの複製数を高めるために本発明で用いられる。複製数が高い場合には、Ｇ Ｓ遺伝子含有ベクターが単離可能となって、例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞 に導入するために用いられる。

ベクター中に組込まれた遺伝物質は、機械的に組換えＤＮＡを導入するため、マ イクロピペットの使用によって直接植物細胞中に微量注入することができる。遺 伝物質は、ポリエチレングリコールの使用によっても植物細胞中に導入すること ができる。これは細胞中に導入された遺伝物質と沈澱複合体を形成する〔パスコ ツスキ−（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら、エンボ・ジャーナル、第３巻、第２７１ ７−２２頁、１９８４年〕。

本発明のもう１つの態様では、ＧＳ遺伝子はエレクトロポレーション法（ｅｌｅ ｃｔｒｏｐｏｒａｔｌｏｎ）によって植物細胞中に導入される〔フロムら、“エ レクトロポレーション法により単子葉及び双子葉植物細胞中に導入された遺伝子 の発現”、プロシーディング・オブ壺ナショナル拳アカデミ−・オブーサイエン スＵＳＡ、第８２巻、第５８２４頁、１９８５年（ＦｒｏＩＩｓ　ｅｔ　ａｌ、 、”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ’　Ｇｅｎｅｓ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　１ｎ ｔｏ　Ｍｏｎｏｃｏｔ　ａｎｄ　Ｄｌｃｏｔ　ＰｌａｎｔＣｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｅ ｌｅｅｔｒＯｐＯｒａｔｉＯｎ、　’　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｌ ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｅｌｅｎｃｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、８２：５ｇ２ ４（１９８５）））　ｏこの技術において、植物原形質体はＧＳ遺伝子構造体含 有プラスミドの存在下でエレクトロポレーション導入される。

高電界強度の電気インパルスが、プラスミドを導入しうるように、可逆的に生体 膜を透過状態に変える。エレクトロポレーション導入された植物原形質体は細胞 壁を再生し、分裂して、植物カルスを形成する。ＧＳ酵素を発現するように形質 転換された植物細胞の選択は、前記表現型マーカーを用いて行なうことができる 。

カリフラワーモザイクウィルス（（ａＭＶ）は、本発明においてＧＳ遺伝子を植 物細胞に導入するためのベクターとして使用可能である〔ホーン（Ｈｏｈｎ）ら 、“植物腫瘍の分子生物学”、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８２年 、第５４９−５６０頁；ホーウェル（Ｈｏｗｅｌｌ）　、米国特許第４，４０７ ．９５６号明細書〕。

完全ＣａＭＶウィルスＤＮＡゲノムは、細菌中で増加しうる組換えＤＮＡ分子を 得るために、親細菌プラスミドに挿入される。クローニング後、組換えプラスミ ドは、ＧＳ遺伝子配列挿入のために組換えプラスミドのウィルス部分において、 ランダムに又は独特な部位で制限酵素により切断される。独特な制限部位をもつ リンカ−たる小オリゴヌクレオチドを挿入してもよい。修正された組換えプラス ミドは再度クローニングされ、そのＧＳ遺伝子配列をリンカ−の独特な制限部位 に組込むことによって更に修正される。次いで組換えプラスミドの修正されたウ ィルス部分は親細菌プラスミドから取出されて、植物細胞又は植物に接種するた めに用いられる。

ＧＳ遺伝子を植物細胞に導入するためのもう１つの方法は、ＧＳ遺伝子で形質転 換されたアグロバクテリウム１ツメフアシエンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒ＋ｕｓ 　ｔｕｍｅｆ’ａｃｉｅｎｓ）で植物細胞を感染させることである。当業界で公 知の適切な条件下において形質転換植物細胞が増殖せしめられ、苗条、根を形成 して、更に植物にまで成長する。ＧＳ遺伝子配列は、例えばアグロバクテリウム ・ツメファシェンスのＴｉプラスミドによって、適切な植物細胞中に導入するこ とができる。Ｔｉプラスミドはアグロバクテリウム・ツメファシェンスでの感染 によって植物細胞中に導入され、植物ゲノム中に安定的に組込まれる。ホーシュ （Ｈｏｒｓｃｈ）ら、“植物における機能性外来遺伝子の遺伝。

サイエンス、第２３３巻、第４９６−４９８頁、１９８４年；フレリー（Ｆｒａ ｌｅｙ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンスＵ、Ｓ、　Ａ、第８０巻、第４８０３頁、１９８３年。

Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の産生のために必要な２つの領域を有している。

これらのうち１つは転移ＤＮＡ　（Ｔ　ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍形成を誘導する 。

もう１つはビルレント（ｖｌｒｕｌｅｎｔ）領域と呼ばれ、腫瘍維持のためでは なく形成のために必要とされる。植物ゲノムに移される転移ＤＮＡ領域は、その 転移能に影響をうけることなく、ＧＳ遺伝子配列の挿入によってサイズ拡大させ ることができる。腫瘍誘発遺伝子がもはや干渉しないようにそれらを削除するこ とによって修正されたＴｉプラスミドは、本発明の遺伝子構造体を適切な植物細 胞中に移すためのベクターとして使用することができる。

アグロバクテリウムで形質転換可能なすべての植物細胞及び形質転換細胞から再 生された植物全体も、転移ＧＳ遺伝子を有する形質転換植物全体を産生させるた めに本発明に従い形質転換させることができる。

アグロバクテリウムで植物細胞を形質転換させるためには、現在下記のような２ つの異なる方法がある：（１）　培養単離された原形質体を存在させたアグロバ クテリウムの同時培養、又は （２）　アグロバクテリウムによる細胞又は組織の形質転換。

方法（１）では、原形質体の培養及び培養原形質体からの植物再生を可能にする 確立された培養系を必要とする。

方法（２）では、（ａ）植物細胞又は組織がアグロバクテリウムにより形質転換 されること、及び（ｂ）形質転換細胞又は組織が植物全体にまで再生されるよう に誘導されることを必要とする。２つの系において、感染させるためには、２種 のプラスミド、即ちＴ−ＤＮＡ含有プラスミド及びｖｉｒプラスミドが必要であ る。いかなる数のＴ−ＤＮＡを有するプラスミドも使用可能である。

ただ一つ必要なことは、２種のプラスミドの各々について独立に選択しうろこと のみである。

植物細胞又は植物の形質転換後、ＧＳ酵素が発現されるようにＴｉプラスミドで 形質転換されたそれらの植物細胞又は植物は適切な表現型マーカーによって選択 することができる。これらの表現型マーカーとしては、格別限定されないが、抗 生物質耐性又は除草剤耐性がある。

他の表現型マーカーも当業界で周知であって、本発明において使用可能である。

再生植物全体を得るために原形質体が単離かつ培養されつるすべての植物は、転 移ＧＳ遺伝子を有する植物全体が再生されるように本発明に従い形質転換させる ことができる。数種の適切な植物としては、例えばフラガリア（Ｐｒａｇａｒｌ ａ）　、ロタス（Ｌｏｔｕｓ）、メジカゴ（Ｍｅｄ　Ｉｃａｇｏ）オノブリチス （Ｏｎｏｂｒｙｃｈｌｓ）　、）リホリウム（Ｔｒｌｒｏｌｌ−ｕｍ）、）リゴ ネラ（Ｔｒｌｇｏｎｅｌｌａ）　、ビグナ（Ｖｉｇｎａ）、シトラスＣＣ１ｔｒ ｕｓ＞　、リナム（Ｌｉｎｕａ）、ゼラニウム（Ｇｅｒ−ａｎｌｕｍ）、マニホ ット（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ダウカス（Ｄａｕｃｕｓ）、アラビドプシス（Ａｒａ ｂｌｄｏｐｓ！ｓ）、ブラツシ力（Ｂｒａｓｓｌｃａ）　、ラファナス（Ｒａｐ ｈａｎｕｓ）　、シナビス（Ｓｌｎａｐｉｓ）、アトロバ（＾ｔｒｏｐａ）　、 カブシカム（Ｃａｐｓｌｃｕｉ）　、ダツラ（Ｄａｔ−ｕｒａ）、ヒオスシアマ ス（Ｉｌｙｏｓｃｙａｍｕｓ）　、リコペルション（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｌｏｎ） 、ニコチアナ（Ｎｉｃｍｔｉａｎａ）、ソラナム（Ｓａｌａｎｕｍ）、ペチュニ ア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇ−ｔｔａｌｉｓ）　、マジョラナ（ Ｍａｊｏｒａｎａ）　、チオホリウム（Ｃｌｏｈｏｒｉｕｍ）、へりアンタス（ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）　、ラフツカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、プロマス（Ｂｒｏｇ ＋ｕｓ）　、アスパラガス（Ａｓｐ−ａｒａｇｕｓ）−アンチリナム（Ａｎｔｉ ｒｒｈｉｎｕｗ）、ヘメロ力リス（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）　、ネメシア（ Ｎｅｍｅｓｉａ）、ベラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｌｕｍ）、バニカム（Ｐ ａｎｉｃｕｍ）、ベニセツム（Ｐｃｎｎｉｓｃｔｕｍ）　、ラヌノウラス（Ｒａ ｎｕｎｏｕｌｕｓ）　、セネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サルピグロシス（Ｓａｌ ｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）　、ククミス（ＣｕｃｕＩｌｉｓ）、ブロワリア（Ｂｒｏ ｗａｌ　ｌ　ｉａ）、グリシン（Ｇ　Ｉ　ｙｃ　Ｉ　ｎｅ）、ロリウム（Ｌｏｌ ｌｕｍ）　、ゼア（Ｚｅａ）、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｓ）　、ツルガム（ Ｓｏｒｇｈｕｍ）及びダツラ（Ｄａｔｕｒａ）属からの種がある。

格別限定されないが、すべての主な穀類作物種、サトウキビ、テンサイ、ワタ、 果樹及び他の木類、豆果類並びに野菜類を含むすべての植物が培養細胞又は組織 から実際に再生されうることが知られている。現在の限られた知識では、これら すべての植物はアグロバクテリウムで形質転換されうるか否かが問題となる。ア グロバクテリウムの天然植物宿主たる種はインビトロで形質転換可能である。単 子葉植物、及び特に穀物類、草類は、アグロバクテリウムの天然宿主ではない。

アグロバクテリウムを用いてそれらを形質転換させる研究は、最近まで成功しな かった。フーイカス・パン・スロッグテレン（Ｈｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏ ｇｔｅｒｅｎ）ら、ネーチャー、第３１１巻、第７６３−７６４頁、１９８４年 。ある種の単子葉植物はアグロバクテリウムで形質転換されうろことが現在量ら かになってきている。現在利用可能になっている新たな実験アプローチを用いた 場合には、穀物類及び草類は形質転換されうる。

アグロバクテリウムで形質転換される他の植物属としては、イボモニア（Ｉ　ｐ ｏｓｏｅａ）、バシフローラ（Ｐａｓｓｌｆｌ−ｏｒａ）、シクラメン（Ｃｙｃ ｌａｍｅｎ）　、マラス（Ｍａｌｕｓ）、プルナス（Ｐｒｕｎｕｓ）　、ローザ （Ｒｏｓａ）　、ルーバス（Ｒｕｂｕｓ）、ポピュラス（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、サ ンタラム（Ｓａｎｔａｌｕｍ）　、アリウム（ＡＩｌｉｕｍ）　、リリウム（Ｌ ｉｌｉｕｍ）　、ナルシサス（Ｎａｒｃｌｓｓｕｓ）、アナナス（Ａｎａｎａｓ ）　、アラキス（Ａｒａｃｈ−ＩＳ）、ファセオラス（Ｐｈａｓｃｏｌｕｓ）及 びビサム（Ｐｌｓｕｍ）がある。

培養原形質体からの植物再生法については、エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、“原形 質体単離及び培養”、植物細胞培養ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒ’　 Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　、第１巻、第１２４−１７６頁（マ クミラン・パブリッシング社（ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ ｏ、）　、ニューヨーク、１９８３年）；エム・アール・デービー（Ｍ、Ｒ，Ｄ ａｖｅｙ）、“植物原形質体の培養及び再生に関する最近の展開”、プロトブラ スツ（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）、１９８３年−レフチャー０プロシーデインゲ ス（Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）、第１９−２９頁（バークハウ ザ−（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）　、バーゼル（Ｂａｓａｌ）、１９８３年）；ピ ー・ジエイ・ゾール（Ｐ。

Ｊ、Ｄａｔｅ）、“穀物類及び他の抵抗性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）穀物類 の原形質体培養及び植物再生”、プロトブラスツ、１９８３年−レフチャ−・プ ロシーディンゲス、第３１−４１頁（バークハウザー、バーゼル、１９８３年） ；及びエッチ・パインディング（Ｈ，Ｂｉｎｄｌｎｇ）、“植物の再生”、プラ ント・プロトブラスッ（Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）。

第２１−３７頁（ＣＲＣブレス、ポカ・ラドン（ＢｏｃａＲａｔｏｎ）、１９８ ５年）に記載されている。

再生法は植物の種母に異なるが、一般的にはＧＳ遺伝子の複製物を有する形質転 換原形質体の懸濁液が最初に調製される。次いで胚形成が、天然胚として成熟し かつ発芽する段階まで、原形質体感濁液から誘導される。培地は通常様々なアミ ノ酸並びにオーキシン及びサイトカィニン類のようなホルモンを含有している。

特にトウモロコシ及びアルファルファのような種の場合には、培地にグルタミン 酸及びプロリンを加えることも有利である。

苗条及び根は通常同時に発生する。効果的再生法であるか否かは、培地、表現型 及び培養層に依存している。これら３種の変動要因が制御されるならば、再生は 十分に再現かつ反復可能である。

形質転換植物細胞から増殖した成熟植物は、近交系植物を産生ずるために自家受 粉せしめられる。近交系植物は変異ＧＳ酵素活性レベルで遺伝子を含有した種子 を産生ずる。これらの種子は、除草性ＧＳ阻害剤抵抗性の植物に成長する。これ ら種子の抵抗性は、例えば除草剤含有土壌中で種子を成長させることによって調 べることができる。又は、形質転換植物の除草剤抵抗性は、植物に除草剤を投与 することによって調べることもできる。

本発明による近文系は除草剤抵抗性Ｉ＼イブリッドを開発するために使用するこ とができる。この方法では、除草剤抵抗性細胞系は、ハイブリッドを産生させる ために、別の除草剤抵抗性細胞系と交配せしめられる。

花、種子、葉、枝、果実等のような再生植物から得られる部分は本発明に含まれ るが、但しこれらの部分は除草剤抵抗性細胞からなっている。再生植物の子孫、 異型及び変異体も本発明の範囲内に含まれる。

ＧＳ遺伝子構造体及び除草剤耐性植物の用途前記のようなＧＳ遺伝子構造体は、 除草剤耐性植物細胞、植物器官、植物組織及び植物の製造に際しての中間体たる ベクター中で使用される。

本発明における除草剤抵抗性植物の重要性は明らかである。除草剤耐性植物は、 農家が除草剤抵抗性作物を栽培し、しかも作物に悪影響を与えることなく畑の草 類を処理することを可能にする。更に、除草剤抵抗性植物は、農家が除草剤で処 理された畑において作物を栽培することを可能ならしめる。これらの除草剤抵抗 性は土壌中にある程度の量の除草剤を含有しており、したがって“除草剤繰越し 現象（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）”がみられる。

本発明は、草類のような除草剤感受性植物を制御量の除草性ＧＳ阻害剤と接触さ せることからなる植物制御方法にも関するが、この場合に接触は感受性植物が本 発明の除草剤抵抗性植物と同時に存在するときに行なわれる。

除草剤抵抗性植物及び除草剤感受性植物の双方が存在する畑又は栽培地における 植物の葉面除草剤処理法であって、双方の植物夕・イブが処理操作時に同時に除 草剤と接触せしめらめる処理法は、本発明に属する方法である。

“除草剤の植物制御量”という語は、機能的に所定植物の成長又は生育に影響を 与えうる除草剤量を意味する。

したがって、その量は成長又は生育を単に遅らせるか又は抑制するにすぎない少 量であってもよいし、又はその量は感受性植物を不可逆に死滅させるに十分な多 量であってもよい。通常大半の双子葉植物及び草類は、０．５〜１．５ｋｇ／ｈ ａの空中散布率で制御される。中子葉植物の場合には、０．５〜約２．０ｋｇ／ ｈｒの空中散布率が通常適用される。除草剤は、当然のことながら、周知のスプ レー法又はスプレッド法によって適切な植物と接触させることができる。

本発明を一般的に記載してきたが、更に完全なる理解は下記具体例を参考にする と得ることができる。これらの例は説明だけの目的で与えられているのであって 、他に指示のない限り限定させるためのものではない。

ｐＧｓ１００中における完全アルファルファｃ　ＤＮＡの造成は、２工程で２種 のｃＤＮＡ制限断片及びゲノムＤＮＡ制限断片をｐＳＰ６５に組込んでクローニ ングすることにより行なった〔メルトンら、ヌクレイツク・アシッド◆リサーチ 、第１２巻、第７０３５頁、１９８４年（ＭｅｌＬｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２ニア０３５．１９８４）コ。

最初にＧＳコード領域の３′末端及び３′非コード領域についてコードする２７ ０ｂｐＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ断片をポリリンカーＢａｍＨＩ及びＥｃ ｏＲ１部位でｐＳＰ６５に組込んでクローニングした。次いてこの構造体をポリ リンカ一部位でＢａｍＨＩ及びＡｃｃＩにより切断し、９５０ｂｐ−Ｎｄｅ　１ ／ＢａｍＨＩ内部ｃＤＮＡ断片及びＧＳコード領域の５′末端についてコードす る３１０ｂｐＡｃｃｌ／ＮｄｅｌゲノムＤＮＡ断片と同時に結合させて、ｐｃｓ 　１００を形成した。

ｐｔａｃ１２１２の造成のために、３１ｂｐ合成オリゴヌクレオチドをｐｔａｃ １２のＰｖｕＩ！部位に組込んでクローニングＩ５た〔アマンら、ジーン、第２ ５巻、第１６７頁、１９８３年（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２５： １６７゜１９８３）　）。オリゴヌクレオチド配列は第１図においてｐｔａｃ１ ２の上に示されている。ｐＣＧＳ２の造成のために、ｐＧｓｌｏｏから分離され た１、２ｋｂｐＢｇｌｎ／５ｔｕｌ断片をｐｔａｃ１２１２のＢａ１ＩＩ及び５ ｔｕｌ部位に組込んでクローニングした。最終構造体の正確度は、ＥｃｏＲＩＳ Ｓａ　１　！、Ｂｇ　Ｉｎ、Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉ　ｓ　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ及び５ｔｕ ｌを用いた制限地図作成と、鎖終結法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　 ｍｅｔｈｏｄ）によるｔａＣプロモーター及びＧＳの５′末端コード領域までの ＤＮＡ配列分析によって確認した〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディ ンゲス争オブ争ナシジナル・アカデミ−・オブ争すイエンスＵＳＡ１第７４巻、 第５４６３頁、１９７７年〕。標準的操作法がすべての造成に際して用いられた 〔アマンら、ジーン、第２５巻、第１６７頁、１９８３年；マニアナイスら、モ レキュラー−り口一二ング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−５ １９８２年〕。プロモーターを有するすべてのベクターを大腸菌Ｗ３１１０１ａ ｃｉ９中で増産させた〔アマンら、ジーン、第２５巻、第１６７頁、１９８３年 〕。

大腸菌中における遺伝子工学処理野生型アルファルファグルタミンシンテターゼ 遺伝子の発現は、グルタミンシンテターゼ欠失（ｇｌｎＡ）細菌変異体の遺伝的 補足化によって初めて証明された〔デブルジンら、モレキュラー・アンド・ジェ ネラル・ゲネティクス、第１８３９、第２８９頁、１９８１年（ｄｅＢｒｕｊ＋ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｔ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ、１８３：２８９．１９８１））　ｏ内在性ＧＳ遺伝子が削除された大腸菌 ＦＤ８２１３を例１で製造されたアルファルファ０３発現プラスミドｐＣＧＳ２ で形質転換させた。親株及びｐＣＧＳ２含有株をグルタミン含有又は非含有Ｍ９ 最小培地（チアミンＨＣＩ及びプロリンで補充されている）上に線状に接種した 。第２図で示されているように、ＦＤＢ２１３親株はグルタミン含有培地（セク ションＡ）でのみ増殖することができるが、ＦＤＢ２１３　（ｐＣＧＳ２）誘導 体は無機物栄養性であって、グルタミン含有又は非含有培地（セクションＢ）で 増殖することができる。このように、アルファルファＧＳは大腸菌中で合成され ているにちがいなく、しかも触媒的に活性な酵素に少なくとも部分的に折りたた まれて集合化しているにちがいない。この結論と一致するように、ＧＳ酵素活性 は半生合成酵素アッセイによるとＦＤ８２１３　（１）ｔａｃ１２１２）又はＦ ＤＢ２１３ではなくＦＤＢ２１３　（ｐＣＧＳ２）において検出された〔マコー マックら、アーチブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス 、第２１８巻、第５６１頁、１９８２年（ＭｃＣｏｒｓａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、 Ａｒｃｈｊ、ｖｅｓ　ｏｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｌｏｐｈｙｓ ｉｃｓ、２１１ｔ：５６１．１９８２）　）。

第２図において、ｐＣＧＳ２中のアルファルファＧＳ遺伝子によるＦＤ８２１３ の補足化は、アルファルファＧＳがタンパク質合成に要するグルタミンの合成を 触媒するためには必要であるもののアンモニア同化の一次経路の一部分としては 必ずしも機能しないような高塩化アンモニウム濃度（１８ｒｎＭ）下で試験され た。細菌グルタミン酸デヒドロゲナーゼは高アンモニウム濃度下でアンモニア同 化を行ないうる。しかしながら、低アンモニウム濃度（５０，５ｍＭ）の又は別 の窒素Ｒ（例えば、Ｌ−アルギニン）を含有する培地においては、アンモニア同 化のためにＯＳ／グルタミン酸シンターゼサイクルを必要とする。これは、ＧＳ の場合と比べてグルタミン酸デヒドロゲナーゼの場合には、アンモニアに対する Ｋｍ値が相対的に高くかつ反応平衡定数が低いことに基因している〔モラ（Ｍｏ ｒａ’）ら編集、グルタミン：代謝、酵素学及び調節、アカデミツクプレス、ニ ューヨーク、１９８０年；マガサニック、アニュアル拳しビュース・オブ・ゲネ ティクス、第１６＠、第１３５頁、１９８２年〕。したがってアルファルファＧ Ｓが大腸菌中でアンモニア同化に関与して機能しうるか否かを調べるために、唯 一の窒素源として低濃度の塩化アンモニウム（０，５ｍＭ及び１．０ｍＭ）又は Ｌ−アルギニン（０，２％）を含有する最小培地中においてＦＤ８２１３　（ｐ ＣＧＳ２）の増殖能が試験された。ＦＤ８２１３　（ｐＣＧＳ２）株は０．５ｍ Ｍ塩化塩化アンモニウム下で増殖することができたが（世代時間は５ｍＭの場合 よりも４倍長い）、０．１ｒｎＭ塩化アンモニウム濃度下又は唯一の窒素源とし てＬ−アルギニンを用いた場合には増殖しえなかった。

これらの結果は、植物酵素によるアンモニアのＫｍｌｉｌｌが細菌酵素の場合と 同等であると仮定した場合に、アンモニアの同化は大腸菌中のアルファルファＯ ８によっては効果的に行なわれないことを示している。

大腸菌におけるアルファルファＧＳ酵素の合成は免疫プロット分析により確認さ れた〔バーネット、アナライティカル・ケミストリー、第１１２巻、第１９５頁 、１９８１年（Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １１２：１９５゜１９８１））、ｐＣＧＳ２含有大腸菌Ｗ　３１１０１ａｃｌｑ をインデューサー（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ））の 存在又は非存在下で増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、溶菌し、変性及 び非変性ゲル上で分別した。

タンパク質抽出物が変性ゲル上で分別される細胞の場合には、１２５ｍＭ）リス ＭＣＩ　（ｐＨ７）　、０．５％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．７Ｍ２−メ ルカプトエタノール含有溶液を添加し、１００℃で５分間加熱することにより溶 菌させた。全細胞タンパク質を、１０９６ポリアクリルアミドＳＤＳゲルｃレム リ（Ｌａｅ＋ｕｌｌ）、ネーチャー（ロンドン）、第２２７巻、第６８０頁、１ ９７０年〕上年季上染色された分子量マーカー〔ベセスダ・リサーチ・ラボラト リーズ（Ｂｃｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　） 及び部分精製アルファルファＧＳ　Ｃダンら、ジャーナルΦオブーモレキュラー ・アンド・アプライド・ゲネティクス、第２巻、第６２１頁、１９８４年〕と一 緒に分別した。タンパク質を電気プロット法によりニトロセルロースに移し、最 初にアルファルファＧＳ抗血清次いでブドウ状球菌タンパク質Ａ−西洋ワサビペ ルオキシダーゼ複合体と一緒にインキュベートし、比色測定アッセイ法により分 析した〔バーネット、アナライティカル・バイオケミストリー、第１１２巻、第 １９５頁、１９８１年；アブラメラスら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ ムノロジー、第１巻、第３９４頁、１９７１年（Ａｖｒａｍｅｒ’ａｓ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｆｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１： ３９４．１９７１）　）　ｏ精製アルファルファグルタミンシンテターゼに対す る抗血清を、ウサギに注射することにより製造した〔ダンら、ジャーナル・オブ ・モレキュラー・アンド・アプライド・ゲネテイクス、第２巻、第６２１頁、１ ９８４年〕。この研究結果は第３（Ａ）図に示されている。第１列は誘導されて いない大腸菌（ｐＣＧＳ２）からの物質を有しており二第２列は事前染色された タンパク質分子量マーカー（ミオシンＨ鎖、２００．０００；ホスホリラーゼＢ 、９７，４００　；牛血清アルブミン、６８，０００；卵白アルブミン、４３． ０００；α−キモトリプシノーゲン、２５．７００；β−ラクトグロブリン、１ ８，４００）を含有し：第３列はＩ　ＰＴＧで誘導された大腸菌（ｐＣＧＳ２） からのタンパク質を含有し；第４列は精製アルファルファＧＳ酵素を含有してい る。単一バンドは、真正のアルファルファＧＳ（第４列）と同時移動する大腸菌 抽出物（第１列及び第３列）の場合にみられる。

タンパク質抽出物が非変性ゲル上で分別される細胞の場合には前記のように増殖 せしめられて回収されたが、高細胞密度下リゾチーム１０ｍｇ／ｍｌによっても 処理された。細胞を超音波で溶菌させ、遠心分離によって清澄化し、細胞溶離物 を天然のままの５％ポリアクリルアミドゲル〔デービス、アナルス拳オブ・ザ・ ニューヨーク、アカデミ−・オブ・サイエンシス、第１２１巻、第４０４頁、１ ９６４年（Ｄａｖｉｓ、Ａｎｎａｌｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ ｅｍｙ　ｏｉ’　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１２１：４０４．ｆ９８４）　）上におい て３　ｍ　Ｍ　Ｌ−ホスフィノスリシン耐性アルファルファ懸濁細胞系〔ダンら 、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ゲネティクス、第２ 巻、第６２１頁、１９８４年〕からの粗抽出物と一緒に分別した。免疫プロット 分析（第３（Ｂ）図）が前記のように行なわれた。

第５列は誘導されていない大腸菌（ｐＣＧＳ２）を含有し一第６列はＩ　ＰＴＧ で誘導された大腸菌（ｐＣＧＳ２）を含有し；第７列はアルファルファからの粗 抽出物を含有し；第８列は変性アルファルファＧＳを含有している。

単一バンドは、植物抽出物の上部バンド（第７列）と同時移動する大腸菌抽出物 （第５列及び第６列）の場合にみられる。

これらの実験結果は、ｐＣＧＳ２がアルファルファＧＳ抗血清と交差反応しかつ 変性及び非変性双方のゲル上のアルファルファＧＳと同時移動する（それぞれ第 ３及び４列、並びに第６及び７列参照）タンパク質の大腸菌中での合成について 指示していることを示している。

大腸菌の未形質転換親株が同様の方法で分析された場合においては、これらのバ ンドは存在しなかった（データ示さず）。

これらの実験結果は、大腸菌（ｐＣＧＳ２）中で検出されるタンパク質の予想さ れたサブユニット分子量及び天然構造が植物ＧＳのものと同一であることも明ら かにしている。ポリアクリルアミドＳＤＳゲル分析によるアルファルファのサブ ユニット分子量（３９，０００）ｌ；！、ＧＳ遺伝子のＤＮＡ配列から予想され た分子量と一致する。大腸菌ＧＳは５５．０００のサブユニット分子量を有して おり〔モラら、グルタミン：代謝酵素学及び調節、アカデミツクプレス、１９８ ０年〕、これらの実験では植物ＧＳに対する抗血清と肉眼上交差反応していない 。

天然ゲル上におけるＧＳの比較的遅い移動性は、真核細胞ＧＳ酵素の公知の８ｆ ｆｉ体４重化構造と一致する（モラら、同上）。ゲル中でのタンパク質分布から 示されるように、大腸菌中の実質上すべての可溶性植物ＧＳ酵素は天然コンホメ ーションをとって存在しているようであり、このことはそれが効果的に折りたた まれて集合化していることを示している。この実験によるもう１つの結論は、単 一のアルファルファＧＳポリペプチド種が触媒活性酵素を形成する上で満足しう るちのであるということである〔ララら、プラント争フィジオロジー、第７６巻 、第１０１９頁、１９８４年（Ｌａｒａ　ｅｔ　ａ！、、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ ｌｏｌ−ｏｇｙ、７［ｉ：１０１９．１９８４）　）。

上記結果は、ｔａＣプロモーターが大腸菌中においてアルファルファＧＳの効果 的合成を指示しうろことを示している。第３図で示されているように、ＧＳタン パク質は抑制条件下であっても検出可能な量で合成されている。同様に、大腸菌 ｇｌｎＡ変異体の補足化のためには抑制された量のアルファルファＧＳのみでよ い（第２図）。ＩＰＴＧによる誘導の結果、全細胞タンパク質の約１９６に相当 するほど３〜５倍も高いレベルでＧＳ合成が行なわれていて（第３図、第１及び ３列、第５及び６列参照）。別の研究では、ｔａｃプロモーターを大腸菌ｍａｌ ＰＱオペロンに結合させた場合にも質的に同様の結果が得られることが示されて いた〔ビダルーインギグリアルジ（Ｖｌｄａ！−１ｎｇｉｇｌｉａｒｄｉ）ら、 ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第５９１９頁、１９８５年〕。これはおそ ら（ｔａｃプロモーターの性質に影響を与えているからであろう。

プラスミドｐＣＧＳ２中にアルファルファＧＳを有している大腸菌株Ｗ３１１０ １ａｃ　Ｉｇ（ｐＣにＳ２）は１９８６年３月１３日付で米国基準培養寄託機関 （Ａｌｅ−ｒ！ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ！ｔｕｒｅ　Ｃｏ！Ｉｅｃｔ１ｏｎ、Ａ ＴＣＣ）　、ロックビル、メリーランド州に寄託され、寄託番号第６７０３１号 が付与された。この大腸菌株は、この生物中においてプラスミドがより長期間に わたって安定であることから、プラスミドｐＣＧＳ２用の寄託宿主として選択さ れた。

最初の突然変異誘発実験は、Ｍ９／ｐｒｏ（プロリン）／１ｈｉ（チアミン）中 で一夜定常期となるまで増殖させ、一部をり、Ｌ−ＰＰＴ１０ｍＭ中で培養する ことにより、大腸菌ＦＤＢ２１３　（ｐＣＧＳ２）を用いて行なった。耐性クロ ーンが観察された；それらを取出し、ＰＰＴ及びＭＳＯに対する耐性に関して試 験したところ、すべてが親株にはなかった両化合物に対する耐性を示した。変異 体を一夜増殖させ、３種を単離し、グルタミンシンテターゼ酵素活性をＰＰＴの 存在下又は非存在下で分析した。しかしながら結果は、耐性様式が３種の変異体 において７〜１０倍のＧＳ過剰産生に基づいているらしいことを示していた。し たがって、これらの最初の実験では構造変異体を生じていなかった。ＧＳ遺伝子 に結合せしめられたβ−ｇａｌ遺伝子を有する修正プラスミドを用いて行なわれ る次の実験では、下記のように実施プラスミドｐＣＧＳ３は、ＥｃｏＲ１部位で の制限化、その部位の補充によるプラント末端形成、再結合及び再形質転換によ って、プラスミドｐＣＧＳ２　（第１図参照）から製造した。したがってｐＣＧ Ｓ３は１個のみのＥｃｏＲ１部位を有しているが、プラスミドのＯｋｂ位におい てＥｃｏＲ１部位を欠いている。これは第４図に示されたプラスミド地図中’　 （ＥｃｏＲＩ）”と表示されている。

このプラスミドは、唯一の５ｔｕＩ部位で制限することにより、ｐＣにＳ３から 造成した。ｐＮＲＣ７４７からのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩ及び Ｄｒａ　Ｉで切断した。ＥｃｏＲＩ末端をプラント化し、次いで断片をｐＣＧＳ ３の５ｔｕ１部位にプラント末端結合させた。大腸菌の形質転換後、（第５図に 示される）右回りの配向性をもつプラスミドｐＣＧＳ４はＩ　ＰＴＧ−Ｘｇａｌ プレート上で青色のコロニーを形成した。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いるこの製造法は、変異体が前記のようにスク リーニングされた場合にＧＳの過剰産生に基因する（即ち、プラスミド複製数及 び／又はｔａｃプロモーター変異体に基因する）ＰＰＴ耐性変異体の大半（９８ ％）を取除くために必要であった。

ｐＣＧＳ４を用いた場合に、ＰＰＴ耐性でかつ″淡青色”（低レベルのβ−ガラ クトシダーゼ）であったコロニーはおそらく過剰産生以外の変異体によるもので あるが、−万ＰＰＴ耐性でかつ“濃青色”　（高レベルのβ−ガラクトシダーゼ ）であったコロニーはおそらく過剰産生によるものであろう。

Ｄ、ＥＭＳによるｐＣＧＳ４の突然変異誘発これはコンロンダ及びミラー、ジャ ーナルφオブ・モレキユラー・バイオロジー、第５２５巻、１９７７年（Ｃｏｎ ｌｏｎｄａ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

５２５（１９７７）　）に従い行なわれた。

大腸菌ＦＤ８２１Ｂ　（ｐＣＧＳ４）を、Ｍ９ＰＴＡ〔ホトシュタイン（Ｂｏｔ ｓｔｅｉｎ）　、デービス（Ｄａｖｌｇ）らによる高等細菌遺伝学（Ａｄｖａｎ ｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｌａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）の中で示されたし一プロリン 、チアミン及びアンピシリン２５μｇ／ｍｌ補充のＭ９）中で一夜増殖させた。

細胞を回転沈降させ、冷緩衝液（ＩＬ中、Ｋ２ＨＰＯ４１０，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ ４４，５ｇ。

（ＮＨ４）２８０４１ｇ及びクエン酸ナトリウムニ水和物０．５ｇ）で２回洗浄 し、半分量の緩衝液中に再懸濁させた。変異誘発物質を加え（ＥＭＳｏ、０７ｍ １１５ｍｌ細胞）、振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。５％の みがこの処理で生存した。突然変異誘発後、細胞を回転沈降させ、緩衝液で２回 洗浄し、同量の緩衝液に再懸濁させた。

Ｅ、Ｌ−ＰＰＴ耐性の選択 約１０８個の（突然変異誘発を生じた）細胞をＬ−ＰＰＴ５ｍＭ含有ＭＱＰＴ上 で培養した。約１５００個のＬ　−ＰＰＴ耐性クローンを得た。これらをＩＬの ＬＢで希釈し、−夜増殖させた。プラスミドＤＮＡを培養物から精製し、アガロ ースゲル電気泳動法によって試験した。ｐＣＧＳ４と一致する単一バンドが観察 された。プラスミドＤＮＡを用いてＦＤ８２１３を形質転換させ、形質転換体を ＬＢａｍｐ及びＭ９ＰＴ　（＋Ｌ　−ＰＰＴ５ｍＭ）プレート上で培養した。形 質転換体の数は両プレート上において同一であった。

Ｆ、Ｌ−ＰＰＴ耐性ＧＳコロニーの同定すべてのプラスミドがＧＳＳ構造異異体 有しているが否かについて調べるために、大腸菌ＦＤＢ２１３を形質転換させ、 ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ及びＬ−ＰＰＴ５ｍＭ含有の上敷き紙をひいたＭ９ＰＴプ レート上で培養した。

大半のコロニーが青色環をもつ濃青色であった。環のない淡青色コロニーが約２ ％の頻度で観察された。２５個の淡青色コロニーを１ｍｌのＭ９ＰＴ＋Ｌ−ＰＰ Ｔ５ｍＭ中で２日間増殖させた。数個のコロニーは他のものよりも良好に増殖し た。培養物をＬＢ５ｍｌで希釈し、−夜増殖させた。すべての培養物を高密度と なるまで増殖させた。これらの培養物（２５種の各培養物の一部はプールした） すべてをＬＢＩＩで希釈し、増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出した。アルファ ルファＧＳ遺伝子ヲ含む約１ｋｂの５ａｉｌ／ＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、ｐ ＣＧＳ３の５ａｉｌ／ＢａｍＨｉ中心鎖断片と結合させた。Ｌ−ＰＰＴ５ｍＭに 耐性の１個のクローンを得た。

Ｇ、突然変異部分を有する遺伝子断片の同定断片交換法によって、ＧＳ遺伝子中 で構造変異部分を有する制限断片を同定した。この方法では、プラスミドｐＣＧ Ｓ３を下記組合せの制限酵素で切断する：Ｓａｌ１−ＮｃｏＩ、Ｎｃｏｌ−Ｅｃ ｏＲｒ、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｍ及びＨｉｎｄＩＩ［−ＢａｍＨＩ　（第１表参 照）。

小さな挿入物をＰＡＧＥ電気泳動によってベクター“中心鎖”から分離し、ベク ター中心鎖を精製した。変異が推定されるｐｃＧｓ４プラスミドを同様に切断し たが、この場合には小さな挿入物をゲル精製した。次いで“突然変異体”挿入物 を野生型“中心鎖“に結合し、大腸菌に組込んで形質転換させ、形質転換体をＰ ＰＴ耐性に関して選択した（第１表参照）。第１表及び第２表は得られた結果を 示している。

結　合　成　分　コロニー数 １、なし　Ｓａ、Ｉ　Ｉ−Ｎｃｏｌ　４１２、　ＰＦｒ’　５ａｔＩ−Ｎｃｏｌ 　５ａｔＩ−Ｎｃｏｌ　２９８　８３、なし　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＩ　２６４、 　ＰＦｒ’　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲＩ　Ｎｃｏｌ−ＥｃｏＲｌ　２９７　８５、な し　ＥｃｏＲｌ−１１１ｎｄｌｌｌ　９８、　ＰＦｒ’　ＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄ ｌｌｌ　ＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ　４００　３００７、なし　Ｈｌｎｄｌｌ ｌ−ＢａｎＨｌ　２８、　ＰＰＴ’　）Ｉｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　Ｈｊ、ｎ ｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　７４　２９、　ＣＣＣ’１）ＣＧＳ３　（１０００＞１ ０００　１００本共有結合で閉環した超コイル状プラスミドＤＮＡ第　２　表 再　培　養 ｐＣＧＳ３１．Ｂ＋＋＋＋ｏ。

Ｍ９＋＋＋　＋　Ｑ　ｇ ｐＣＧＳ３１Ｊ３＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　…ＰＦｒ’　Ｍ９＋＋＋　＋＋＋　 ＋＋＋　…ＥＣｅＲＩ−Ｈ１ｎｄｌｌｌ　ｌＪｌ＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋ ＋ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はＰＰＴ耐性を付与する構造変異部分を有し ている。

Ｈ０含有された特異的残基の同定 アミノ酸残基１９９−２７３を含んでなるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＤＩ断片を配列 決定し、野生型の対応配列と比較した。唯一の変化は７３３位におけるグアニジ ンからアデニンへの置換であり、その結果２４５位においてグリシンからその位 置でのセリンに置換が生じている。

大腸菌ＦＤ８２１３　（１）ＣＧＳ３−８ｅｒ２４５）は１９８７年１月３０日 付でブタペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託されており、寄託番号第６７３０６ 号が付与されている。

例　４ 例３のＡ−Ｆで記載された実験を正確に記載どおりに繰返した。例４のＧ及びＨ を下記結果が得られたこと以外例３と同様に繰返した。

Ｇ、突然変異部分を有する遺伝子断片の同定突然変異を示した本例４における実 験結果は、制限酵素切断部位Ｈｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩ間に含まれるＤＮＡ断片に 関するものであった（突然変異部分がＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位間のＤＮ Ａ断片に存在する例３の場合とは異なる；第１表及び第２表参照）。

Ｈ０含有された特異的残基の同定 アミノ酸残基２７３−３４０を含んでなるＨｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩ断片を配列決 定し、野生型遺伝子の対応配列と比較した。唯一の変化は９９５位におけるグア ニジンからアデニンへの置換であり、その結果３３２位においてアルギニン（Ｒ ）からその位置でのリジン（Ｋ）に置換が生じている。

野生型ＧＳ発現プラスミドｐＣＧＳ３、例３のＰＰＴ耐性変異プラスミドｐＣＧ Ｓ　−Ｓｅ　ｒ２４５又は例４のｐＣＧＳ３−Ｌｙｓ３３２を含有した大腸菌Ｆ ＤＢ２１３の培養物２５ｍ１をＭ９培地中３７℃で一夜増殖させた。細胞を５． ００Ｏｒｐｍ　（５℃）で５分間の遠心分離により回収し、ｐＨ７，５の１０ｍ ＭトリスＨＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭβ−メルカプトエタノール１ｍｌ中に 再懸濁させ、超音波で溶菌させた。溶離物を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、５℃ 、５分間）により清澄化し、通常１００μｍの上澄をＧＳ酵素活性について分析 し、５μｌをタンパク質含有量について分析した。ｐＣＧＳ３−８ｅｒ２４５含 有大腸菌ＦＤＢ２１３由来ＧＳの特異的活性（ＧＳ活性単位／μｇタンパク質） は野生型ｐＣＧＳ３含有大腸菌ＦＤＢ２１３由来ＧＳの特異的活性よりも２．２ 倍であり、ｐＣＧＳ３−Ｌ、ＹＳ３３２含有大腸菌ＦＤＢ２１３由来ＧＳの特異 的活性は１．７倍であった。これら抽出物の各々のＧＳ活性は、０．４μＭ、２ ５μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ１２５０μＭ、２ｍＭ及び２０ｍＭのＰＰＴ 存在下でも測定した。この実験結果は第３表及び第７図に示されている。

第　３　表 ＰＰＴによるＧＳ活性の阻害 ＰＰＴ濃度　ｐＣＧＳ３　ｐＣＧＳ３−８ＥＲ２４５ｐｃＧｓ３−ＬＹＳ３３２ ０１００％　１００％　１００％ ４ｕＭ　１０２％　１０３％　１０３％２５ｕＭ　９５．７％　１０３％　１０ ３％６２．５ｕＭ　８４．０％　９７，３％　１０３％１２５ｕＭ　Ｂ８．０％ 　９１．４％　１００％２５０ｕＭ　４２．７％　８０．６％　９８．５％２ｍ Ｍ　１５．０％　３０．７％　７８．２％２０ｄ　４．３％　５．３％　２３， ８％グアニジニウム／熱ラフエノール法よってアラビドプシス・タリアナ（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｊａｎａ）葉から全ＲＮＡを回収し、オリゴｄＴ セルロースクロマトグラフィーに付した〔マニアテイスら、モレキュラー・クロ ーニング、コールド・スプリング・）１−バー・ラボラトリ−１１９８２１９８ ２年〕Ａライブラリーを、ＲＮアーゼＨ法〔ガブラー（Ｇｕｂ！ｅｙ）ら、ジー ン、第２５巻、第２６３頁、１９８３年〕によって、得られた葉ポリＡ＋ＲＮＡ から造成した。ｃＤＮＡをＥＣ０ＲＩリンカ−によりλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部 位に組込んでクローニングした〔ヤングら、プロシーディンゲス・オブ壷ナショ ナルーアカデミ−・オブ・サイエンス、第８０巻、第１１９４頁、１９８３年〕 。葉特異性アラビドプシスＧＳｃＤＮＡクローンＡｔ　ｃＧｓＬｌをホインら、 ＤＮＡクローニング、実用的アプローチ、編集デー・エム・グローバー、ＩＲＬ ブレス、第１巻、第４９頁、１９８５年（Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮＡ　 ＣＩｏｎｉｎｇ、ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ｃｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇ ｌｏｖｅｒ＋ｌＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１：４９．１９８５）　）の方法に従いこの ライブラリーを免疫スクリーニングすることにより単離したが、その際特異的ポ リクローナル抗体が（前記例２で記したように）アルファルファグルタミンシン テターゼに対して生じた。Ａｔ　ｃＧｓＬｌｃＤＮＡは第８図で示された部分的 ＤＮＡ配列を有している。

Ａｔ　ｃＧｓＬｌをノザンプロット分析における放射性プローブとして使用した 。アラビドプシス葉及び根のポリＡ”　ＲＮＡ　（各列２μｇ）をグリオキサー ルゲル上で電気泳動させ、ナイロンフィルター上にプロットし、ＵＶ架橋結合さ せた〔チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ アカデミー−オブ壷サイエンス、第８１巻、第１９９１頁、１９８４年〕。プロ ット（第９Ａ図）をチャーチら、同上の、条件下ＡｔｃＧＳＬ１由来ニックトラ ンスレーションＥｃｏＲＩ挿入物とハイブリッド形成させた。結果は、ＡｔｃＧ ＳＬＩが葉において優先的に発現せしめられ、それが鎖長約１６００ヌクレオチ ドのｍＲＮＡについてコードするＧＳ特異性ｃＤＮＡであることを示した。

ウェスターンプロット分析〔トービン（Ｔｏｖｂｉｎ）ら、プロシーディング・ オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第７６巻、第４３５０頁、 １９７９年〕では、アラビドプシスの葉特異性ＧＳポリペプチドが光誘導性であ ることを示した。葉及び根のタンパク質（各列５０μｇ）を１０％ＳＤＳポリア クリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース紙上にプロットし、アルフ ァルファＧＳに対する抗体、次いで１２５　Ｉ−プロティンＡでプローブ処理し た〔増幅ＧＳ遺伝子を含有するアルファルファ組織培養細胞からの抽出物（ダン ら、ジャーナル・オブゆモレキュラー・アンドΦアプライド・ゲネティクス、第 ２巻、第６２１頁、１９８４年）は正のコントロール（即ち、この抗血清と特異 的に反応するＧＳポリペプチドを含有していることが知られている）及び分子ｆ ｆ１３９，０００ドルトンのサイズマーカーとしてこのゲル上に含まれている〕 。その結果によると、アラビドプシスが４４．０００ドルトンの葉特異性ＧＳポ リペプチドを含有することを示した。３９，０００ドルトンのＧＳポリペプチド も根及び葉の双方に存在している。暗所中で生育せしめられたアラビドプシス種 苗のウェスターンプロット分析によれば（第１０図）、３９．０００ドルトンの ＯＳポリペプチドのみが検出された。しかしながら、４４，０００ドルトンのＧ Ｓポリペプチドは、光生育植物で観察された量に匹敵する量で、光照射されかつ 緑化された暗所生育種苗においても発現した。

根特異性アラビドプシスＧＳｃＤＮＡクローンＡｔｃＧＳｒｌを抗体スクリーニ ングによって例５で記載されたλｇｔｌｌライブラリーから単離した。このクロ ーンでプローブ処理されるアラビドプシス葉及び根のポリＡ”ＲＮＡのノザンプ ロット分析によれば（第９Ｂ図）、ＡｔＣＧＳｒｌが根において優先的に発現せ しめられ、それが約１，４００のヌクレオチドのｍＲＮＡに対応することを示し た。Ａｔ　ｃＧＳ　ｒ　１は第１１図で示された部分的ＤＮＡ配列を有している 。

根特異性アラビドプシスＧＳｃＤＮＡクローンＡｔＣＧＳｒ２を抗体スクリーニ ングによって例５で記載されたｇｔｌｌライブラリーから単離した。ＡｔｃＧＳ Ｌｌで最初にプローブ処理されたアラビドプシス葉及び根のポリＡ”　ＲＮＡを ノザンプロット分析（第９Ｃ図）により取除き、ＡｔｃＧＳｒ２のニックトラン スレーション挿入物で再プローブ処理した。その結果によれば、ＡｔｃＧＳｒ２ が根において優先的に発現せしめられ、それが約１．４００のヌクレオチドのｍ ＲＮＡに対応していることを示した（葉ＲＮＡの上部バンドはより大きな葉特異 性Ｇ５ｍＲＮＡ及びＡｔ　ｃＧｓＬｌの残留的ハイブリッド形成に基因している ）。Ａｔ　ｃＧＳ　ｒ２は第１２図で示された部分的ＤＮＡ配列を何している。

ｃＤＮＡ、即ち葉のＡｔ　ｃＧｓＬｌ、根のＡｔｃＧＳｒｌ及び根のＡｔｃＧＳ ｒ２に対応するＲＮＡの相対量は、第９図におけるノザンプロット分析時のバン ドの相対的強度及びそのプロットにおける部分Ａ、Ｂ、Ｃの相対的展開時間から おおまかに調べたところによると、それぞれ１５：１：１である。

これらの記載、例及び態様は説明のみの目的であって、様々な修正が本出願の精 神及び範囲内並びに添付された請求の範囲における範囲内で示唆されることが理 解される。

原英文明細書第４５頁抄訳 原英文明細書第３３頁第１４行に記載の微生物寄託機関：アメリカン・タイプや カルチャー・コレクション 住　所：１２３０１、パークローン　ドライブ、ロックビル、メリーランド　２ ０８５２、アメリカ合衆国 寄託日：１９８６年３月１３日 寄託番号：　６７０３１ 微生物の表示：　Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｗ３１１０１ＡＣ１ｑ（ｐＣＧＳ２）原英文明 細書第４６頁抄訳 原英文明細書第３９頁第１０行に記載の微生物寄託機関：アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクシジン 住　所：１２３ＯＬバークローン　ドライブ、ロックビル、メリーランド％　２ ０８５２、アメリカ合衆国 寄託日：１９８７年１月３０日 寄託番号：　６７３０６ 微生物の表示：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＦＤＢ２１３（ｐＣＧＳ２−８ｅｒ２４５）降 口・：ｒ′Ｔ″″：に変更なし） ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ （Ａ）（Ｂ） ０＝ アラし゛ドグ５ス出来ＴＲ７＋ＪｉｆＩＣＤＮＡりＤ−；ＡｔＣＧＳＬｌ詔叶１ 　Ｂ’）＆：列１５１　’ａｃＴにＴＧＧＡＧ　’！’！’ＧＱＡＧＣ丁ＧＡ　 ＣＡＡ（、ＡＴ？ｒＧＧ　ＧＧＣＧＴＧＡＣＡ’！！　’！’！’ＣＪＱＡsＧ Ｃ？ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、　１０ ７５ｒ”）−７”Ｓ　ス由米Ｍ’ｉＷ興ｆｌｃｏＮＡｙｏ−：、ＡｔｃＧｓｒ＋ ｒ＋＊７ｈＭＪごタソ１５１　Ａ？？？ＧＧＧＴＣＧ　（：？ＣＧ？ＴＡ（：Ａ ？　’！’ｌ？ＧＧＡ（ＪＧＧ　ＡＴＣＣＡアラじドブｊス出米預汁異性ｃＤＮ ＡＺ訃ＳＡ↑ｅＧｓｒ２の苦Ｐ亭酌シご夕Ｊ３０１　テ＾αを丁Ｇ？ＴＯＣＧ 手続補正書（方式） 昭和６３年１１月　：８ワハ

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．除草性ＧＳ阻害剤による阻害に対して耐性である変異グルタミンシンテター ゼ（ＧＳ）酵素。
2. ２．２４５位においてグリシンとは別異のアミノ酸を有する、請求の範囲第１項 記載のＧＳ。
3. ３．別異のアミノ酸が中性又は塩基性である、請求の範囲第２項記載のＧＳ。
4. ４．別異のアミノ酸がセリン、アルギニン及びシステインからなる群より選択さ れる、請求の範囲第２項記載のＧＳ。
5. ５．３３２位においてアルギニンの代わりにリシンを有する、請求の範囲第１項 記載のＧＳ。
6. ６．４個の通常存在するＮ末端アミノ酸残基２〜５を更に欠いている、請求の範 囲第２項〜第５項のいずれか１項に記載のＧＳ。
7. ７．下記アミノ酸配列： 【配列があります】（上記配列中、２０７位のＸ１はＧであり、２４５位のＸ２ はグリシンとは別異のアミノ酸を表わし、３３２位のＸ３はアルギニン又はリシ ンである）を有する、請求の範囲第１項記載のＧＳ。
8. ８．第一の正常Ｎ末端アミノ酸残基の前でメチオニン残基を欠いている、請求の 範囲第７項記載のＧＳ。
9. ９．阻害剤がホスフィノスリシンである、請求の範囲第１項記載のＧＳ。
10. １０．除草性ＧＳ阻害剤による阻害に対して耐性である変異ＧＳ酵素についてコ ードする遺伝子配列。
11. １１．通常グリシン２４５についてコードするコドンの箇所において別異のアミ ノ酸についてコードするコドンを有する、請求の範囲第１０項記載の配列。
12. １２．別異のアミノ酸が中性又は塩基性である、請求の範囲第１１項記載の配列 。
13. １３．別異のアミノ酸がｓｅｒ、ａｒｇ又はｃｙｓからなる群より選択される、 請求の範囲第１１項記載の配列。
14. １４．通常アルギニン３３２についてコードするコドンの箇所においてリシンに ついてコードするゴトンを有する、請求の範囲第１０項記載の配列。
15. １５．第一の正常Ｎ末端アミノ酸残基の前にＡＴＧコドンを有する、請求の範囲 第１０項記載の配列。
16. １６．下記配列： 【配列があります】 （上記配列中、Ｘ４はｇｌｙについてコードするトリプレットであり、Ｘ５はグ リシンとは別異のアミノ酸についてコードするトリプレットであり、Ｘ６はアル ギニン又はリシンについてコードするトリプレットである）である、請求の範囲 第１０項記載の配列。
17. １７．阻害剤がホスフィノスリシンである、請求の範囲第１０項記載の配列。
18. １８．請求の範囲第１０項記載の配列を有する組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子。
19. １９．プラスミドである、請求の範囲第１８項記載のｒＤＮＡ分子。
20. ２０．原核細胞宿主中で複製することができ、かつＧＳに関する遺伝子配列と作 動可能に結合した状態で：ａ）原核細胞複製源、及び ｂ）原核細胞ブロモ−ター を更に有する、請求の範囲第１９項記載のプラスミド。
21. ２１．アグロバクテリウム・ッメファシエンスのＴｉプラスミドである、請求の 範囲第１９項記載のプラスミド。
22. ２２．植物細胞中でＧＳ配列を発現しうる転写ブロモーターを該配列と作動可能 に結合した状態で更に有する、請求の範囲第１８項記載のｒＤＮＡ分子。
23. ２３．請求の範囲第１８項記載のｒＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
24. ２４．原核細胞微生物である、請求の範囲第２３項記載の宿主細胞。
25. ２５．植物細胞である、請求の範囲第２３項記載の宿主細胞。
26. ２６．請求の範囲第１８項記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞を含ん でなる植物。
27. ２７．請求の範囲第２５項記載の植物細胞から再生された植物及びその種子。
28. ２８．作動可能に結合した状態で： ａ）原核細胞複製源、 ｂ）原核細胞ブロモ−ター、及び ｃ）真核細胞グルタミンシンテターゼについてコードするＤＮＡ配列 を有する、原核細胞宿主中で複製可能なプラスミド。
29. ２９．真核細胞グルタミンシンテターゼが植物由来である、請求の範囲第２８項 記載のプラスミド。
30. ３０．真核細胞グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を有する 原核細胞中で発現可能な組換えＤＮＡ分子で形質転換された原核細胞。
31. ３１．真核細胞グルタミンシンテターゼが植物由来である、請求の範囲第３０項 記載の原核細胞。
32. ３２．組換えＤＮＡ分子がプラスミドである、請求の範囲第３０項又は第３１項 記載の原核細胞。
33. ３３．非形質転換状態において、自己の機能性グルタミンシンテターゼを産生す ることができないか又は低下したグルタミンシンテターゼ活性を示す細菌である 、請求の範囲第３０項記載の原核細胞。
34. ３４．大腸菌である、請求の範囲第３０項〜第３３項のいずれか１項に記載の原 核細胞。
35. ３５．請求の範囲第１０項記載の配列で植物を形質転換しかつ前記配列を発現さ せることを特徴とする除草性ＧＳ阻害剤抵抗性植物の製造方法。
36. ３６．除草性ＧＳ阻害剤感受性植物の選択的制御方法であって、 該植物を植物制御量の上記阻害剤と接触させることからなり、この接触が請求の 範囲第２６項記載の植物をも同時に接触させながら行なわれることを特徴とする 方法。