DE69033142T2

DE69033142T2 - Ortsspezifische rekombination von dns in pflanzenzellen

Info

Publication number: DE69033142T2
Application number: DE69033142T
Authority: DE
Inventors: Francis Hsu; Joan Odell; Sandra Russell; Brian Sauer
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1990-12-19
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2010-12-20
Also published as: CA2071943A1; ES2134767T3; JPH05502378A; IL96768A; IL96768A0; JP2001112477A; EP0506763B1; AU639059B2; EP0506763A1; JP3253071B2; JP3377508B2; CA2071943C; WO1991009957A1; DE69033142D1; AU6974791A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von ortsspezifischer Rekombination von DNA in Pflanzenzellen und auf die neuen rekombinanten DNA Konstruktionen, die verwendet werden, die lox und cre Komponenten des Rekombinationssystems einzuführen und zu exprimieren, wie auch auf transgene lox und cre enthaltende Pflanzen und ihre Samen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Eine Mannigfaltigkeit von Materialien, Systemen und Organismen sind Gegenstand von Genetic Engineering zum Einführen von Systemen unter Manipulieren von DNA gewesen.
Abremski et al., Cell, 32: 1301-1311 (1983) offenbaren ein ortsspezifisches Rekombinationssystem des Bakteriophagen P1. Das System besteht aus einer als loxP bezeichneten Rekombinatiosstelle und einer als Cre bezeichneten Recombinase. Rekombination zwischen loxP Stellen auf supergeschraubter. Ring mit Einzelstrangbruch oder linearer DNA tritt in der Anwesenheit von Cre auf.
Sauer, Molecular and Cellular Biology. 7: 2087-2096 (1987) offenbart, daß das loxP- cre Rekombinationssystem in der Hefe Saccharomyces cerevisiae funktioniert. Dieses System wurde verwendet, ein Gen herauszuschneiden, das zwischen zwei lox Stellen angeordnet ist, welches in das Hefegenom eingeführt worden ist. Cre wurde aus einem induzierbaren Hefe GAL1 Promotor exprimiert, und dieses cre Gen war auf einem autonom replizierendem Hefevektor angeordnet.
Sauer und Henderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5166-5170 (1988) offenbaren, daß das loxP-cre Rekombinationssytem in einer vorübergehenden Weise in Mauszellen in Gewebekultur funktioniert. Cre wurde aus einem induzierbaren Mausmetallothioneinpromotor exprimiert, wobei das cre Gen auf einem Papillomavirusreplikonhaltigem Vektor angeordnet ist. Es wurde Herausschneiden eines Gens, welches zwischen zwei lox Stellen auf einem Plasmid angeordnet ist, das vorübergehend in die Zellen eingeführt war, oder einer Insertion in ein Gen eines Hepesvirusvektors gezeigt.
Sauer und Henderson, Nucl. Acids Res., 17: 147-161 (1989) offenbaren, daß das loxP- cre Rekombinationssystem in einer stabil transformierten Mausgewebekulturzelllinie funktioniert. Cre, exprimiert aus einem Rous-Sarkomviruspromotor, bewirkte Herausschneiden eines Gens, das zwischen zwei lox Stellen angeordnet ist, die in das Mauszellgenom integriert waren.
Gatz und Quail, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1394-1397 (1988) offenbaren, daß die Expression des bakteriellen tet Repressorproteins in Pflanzenprotoplasten in Kultur in einer vorübergehenden Weise zu Regulation eines CaMV 35S Promotors führt, der tet Operatorsequenzen zu ihm gefügt hat und auch vorübergehend in den Protoplasten vorhanden ist.
Baker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 4844-4848 (1986) offenbaren, daß das Kontrollelement, genannt "Aktivator", das von Mais abstammt, sich selbst herausschneiden kann, nachdem es in das Tabakgenom eingeführt ist. Lassner et al., Mol. Gen. Genet., 218: 25-32 (1989) offenbaren, daß das "Aktivator"-Element in zwei funktionelle Komponenten getrennt werden kann: i) ein Element mit einer großen inneren Deletion, das sich nicht selbst herausschneiden kann, aber herausgeschnitten werden kann durch ii) ein Element mit einer terminalen Deletion, das nicht herausschneiden kann. Diese zwei Komponenten wurden getrennt in Tomatenpflanzen transformiert, durch genetisches Kreuzen zusammengebracht, und es wurde gezeigt, daß dieses zum Herausschneiden der ersten Komponente in einigen Zellen führt. Dieses Experiment zeigt, daß Elemente von einem Pflanzengenom zu Rekombination in heterologen Pflanzenzellen führen können, jedoch sind die DNA Sequenzen, die für Aktivität der Rekombinationsstelle benötigt werden, nicht definiert.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, exogene DNA zu manipulieren, sowie sie einmal der Pflanzenzelle innewohnend ist, um die Fähigkeit zu vergrößern. Eigenschaftsexpression in engineered Pflanzen zu kontrollieren. Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Vielseitigkeit des hier offenbarten Verfahrens zum Herstellen von ortsspezifischer Rekombination von DNA in Pflanzenzellen insofern, als daß das Verfahren geeignet gegenüber einer breiten Vielfalt von Anwendungen ist. Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden offensichtlich bei Bezugnahme auf die Beschreibung der Erfindung hier.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Herstellen ortsspezifischer Rekombination von DNA in Pflanzenzellen. Das Verfahren (1) umfaßt:
(i) Einführen in die Zellen eine erste DNA Sequenz, umfassend eine erste lox Stelle, und eine zweite DNA Sequenz, umfassend eine zweite lox Stelle, und
(i) in Kontaktbringen der lox Stellen mit Cre, wodurch die ortsspezifische Rekombination hergestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine dritte DNA Sequenz, umfassend ein cre Gen, auch in die Zellen eingeführt. Diese dritte DNA Sequenz kann ferner einen Promotor umfassen, der aktiv in Pflanzenzellen ist, und Expression des cre Gens wird durch Richtung des Promotors erzeugt. Ein weiteres Verfahren der gegenwärtigen Erfindung ist auf Verfahren (1) gerichtet, worin die ersten und zweiten DNA Sequenzen in zwei unterschiedliche DNA Moleküle eingeführt werden, und die ortsspezifische Rekombination ist ein reziproker Austausch von DNA Segmenten nächst den lox Stellen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Herausschneiden von exogenen Genen oder DNA Segmenten in transgenen Pflanzen. Dieses Verfahren umfaßt:
1) Einführen in die Zellen eine DNA Sequenz, umfassend eine erste lox Stelle, eine zweite lox Stelle in der gleichen Orientierung wie die erste lox Stelle, und ein Gen oder eine DNA Sequenz dazwischen: und
2) in Kontakt bringen der lox Stellen mit Cre, wodurch das heterologe Gen oder DNA Sequenz herausgeschnitten wird. Das Gen kann ein unerwünschter Marker oder Eigenschaftsgen sein.
Ferner werden hier Pflanzenzellen beansprucht, die mit einer DNA Sequenz, umfassend mindestens eine lox Stelle, oder mit einer cre Codierungsregion transformiert sind. Verschiedene Pflanzen werden zur Verfügung gestellt, die hier beansprucht sind, wie beispielsweise eine Pflanze, die Zellen enthält, die mit einer cre Codierungsregion transformiert sind, vorzugsweise argonomische oder Gartenbauverwendbarkeit haben. Plasmide werden beansprucht, welche mindestens eine lox Stelle, ein vorher ausgewähltes DNA Segment, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Gen, einer Codierungsregion und einer DNA Sequenz, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt, haben. In ähnlicher Weise werden DNA Sequenzen beansprucht, wie beispielsweise die Sequenz, die mindestens eine lox Stelle und ein vorher ausgewähltes DNA Segment umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Gen, einer Codierungsregion und einer DNA Sequenz, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt.
Typische Eigenschaftsgene von Interesse bei der vorliegenden Erfindung umfassen diejenigen, die Enzyme oder andere Proteine codieren, wodurch veränderte Ölzusammensetzung in Samen, veränderte Samenproteinzusammensetzung, veränderte Kohlehydratzusammensetzung in Samen, veränderte Kohlehydratzusammensetzung in der Frucht, veränderte Pollenentwicklungseigenschaften, Herbizidresistenz, Fungizidresistenz, Insektizidresistenz und dergleichen verliehen werden.
Typische Markergene umfassen diejenigen, die Hygromycinresistenz, Kanamycinresistenz, Bleomycinresistenz, Sulfonylharnstoffresistenz, Streptomycinresistenz oder Phosphinothricinresistenz verleihen, oder β-Glucuronidase.
Das Gen kann Zerstörung der Zellen, die es exprimieren, bewirken, wie beispielsweise diejenigen, die eine RNase, Restriktionsendonuclease, Protease, ein Ribozym oder eine Antisinn RNA codieren.
DNA Segmente von Interesse umfassen diejenigen, die Expression eines benachbarten Gens reduzieren oder blockieren, wie beispielsweise eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz oder eine mit ATG Sequenz (en) darin.
Das DNA Segment kann Pflanzengenexpression beeinflussen, einschließlich aber nicht darauf beschränkt, eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz, einen Promotor, eine Regulatornucleotidsequenz, eine Codierungsregion, ein Ribozym und eine Antisinn RNA Sequenz.

KURZE BESCHREIBNG VON FIGUREN

Die Erfindung wird vollständiger geschätzt und verstanden unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren.
Fig. 1 zeigt Karten von Plasmiden, die beim Paaren mit Agrobakterium für Pflanzentransformationen verwendet werden. Restriktionsstellen, die beim Herstellen der Konstruktionen verwendet werden, sind markiert als B: BamHI, C: ClaI, E: EcoRI, H: Hind III, P: PstI, S: Sa1I. X: XbaI.
(A) dieser Figur stellt das Cre/Hpt-A Plasmid dar.
(B) dieser Figur stellt das Cre/Hpt-B Plasmid dar.
(C) dieser Figur stellt das loxP/NptII/Hra Plasmid dar.
Fig. 2 veranschaulicht ortsspezifische Rekombination in loxP Pflanzen, die mit Agrobakterium tumefaciens rücktransformiert sind, das den Cre/Hpt-B Vektor beherbergt.
(A) resultiert aus einem Kallus-Induktions-Assay.
(B) ist eine Karte der lox Region des loxP/NptII/Hra Vektors.
(C) zeigt Southern Blot Analyse von rücktransformierten Pflanzen.
Fig. 3 zeigt Kanamycinresistenz in loxP · Cre Hybriden von homozygoten Eltern.
Fig. 4 zeigt eine Karte des Plasmids pZ4LoxAG, das in das Agrobakterium tumefaciens und dann in Pflanzen eingeführt war.
Fig. 5 zeigt eine Karte des Plasmids pBSCre103, das in Agrobakterium tumefaciens und dann in Pflanzen eingeführt war.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei dem Verfahren der Erfindung unter Verwenden von drei DNA Sequenzen können die ersten und zweiten DNA Sequenzen in die Zellen eingeführt werden, die durch ein vorher ausgewähltes DNA Segment verbunden sind. In einem derartigen Fall können die ersten und zweiten lox Stellen die gleiche Orientierung haben, und die ortsspezifische Rekombination von DNA ist eine Deletion des vorher ausgewählten DNA Segments. Die cre Codierungsregion kann vom Bakteriophagen P1 abstammen, und die ersten und zweiten lox Stellen können loxP oder Derivate davon sein. Das vorher ausgewählte DNA Segment ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Gen, einer Codierungsregion und einer DNA Sequenz, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt. Alternativ kann das Segment ein unerwünschter Marker oder Eigenschaftsgen sein. Die ersten und zweiten lox Stellen können ausgewählt werden, daß sie entgegengesetzte Orientierungen haben, und die ortsspezifische Rekombination kann kann eine Inversion der Nucleotidsequenz des vorher ausgewählten DNA Segments sein. In einem derartigen Fall sind die gleiche Selektion der cre Codierungsregion, lox Stellen und vorher ausgewähltes DNA Segment, wie zuvor verwiesen, bevorzugt. In ähnlicher Weise sind bei dem zuvor genannten Verfahren, wo DNA Sequenzen in zwei unterschiedliche DNA Moleküle eingeführt sind. Selektionen der cre Codierungsregion und lox Stellen, wie vorher verwiesen, auch bevorzugt. Pflanzenzellen der Erfindung können Cre Protein enthalten oder mit einer DNA Sequenz transformiert sein, die mindestens eine lox Stelle umfaßt. In dem zuletzt genannten Fall kann in derartigen Pflanzen die DNA Sequenz zwei lox Stellen und eine cre Codierungsregion umfassen und vorzugsweise agronomische oder Gartenbauverwendbarkeit zeigen. Plasmide gemäß der Erfindung können mindestens eine lox Stelle und eine DNA Sequenz haben, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt. Für diesen Typ von Plasmid kann die DNA Sequenz eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz sein, die von dem kleinen Ribulosebisphosphatcarboxylase-(Rubisco) Untereinheitsgen abstammt. Alternativ ist die DNA Sequenz ein Promotor oder eine Regulatornucleotidsequenz. In dem Plasmid kann die DNA Sequenz ein Selektionsmarker sein. Von besonderem Interesse ist ein Plasmid mit einer cre Codierungsregion und einem Promotor, der aktiv in Pflanzenzellen ist. Bestimmte Plasmide von Interesse umfassen Plasmid Cre/Hpt A (gekennzeichnet durch die Restriktionsenzymkarte, die in Fig. 1A gezeigt ist, oder ein Derivat davon). Cre/Hpt-B (gekennzeichnet durch die Restriktionsenzymkarte, die in Fig. 1B gezeigt ist, oder ein Derivat davon), loxP/NptII/Hra (gekennzeichnet durch die Restriktionsenzymkarte, die in Fig. 1C gezeigt ist, oder ein Derivat davon) und pZ24loxAG (gekennzeichnet durch die Restriktionsenzymkarte, die in Fig. 4 gezeigt ist, oder ein Derivat davon). Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Verfahren der Erfindung bei der Herstellung von samenlosem Produkt.
Wie hier verwendet, ist beabsichtigt, daß der Ausdruck "ortsspezifische Rekombination" die folgenden drei Ereignisse einschließt:
1. Deletion eines vorher ausgewählten DNA Segments, flankiert durch lox Stellen.
2. Inversion der Nucleotidsequenz eines vorher ausgewählten DNA Segments, flankiert durch lox Stellen, und
3. reziproker Austausch von DNA Segmenten nächst zu lox Stellen, die auf unterschiedlichen DNA Molekülen angeordnet sind.
Es ist zu verstehen, daß dieser reziproke Austausch von DNA Segmenten zu einem Integrationsereignis führen kann.
Im Zusammenhang mit dieser Offenbarung soll eine Anzahl von Ausdrücken verwendet werden.
Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf ein Polymer von DNA oder RNA. welches einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, wahlfrei synthetische, nichtnatürliche oder geänderte Nucleotide enthaltend, die fähig zum Einbau in DNA oder RNA Polymere sind.
"DNA Segment" bezieht sich auf ein lineares Fragment von einzel- oder doppelsträngiger Deoxyribonucleinsäure (DNA), welche von irgendeiner Quelle abstammen kann. Der Ausdruck "DNA" in Pflanzenzellen umfaßt alle in Pflanzenzellen vorhandene DNA. Wie hier verwendet, ist beabsichtigt, daß ein Gen ein DNA Segment bedeutet, welches normalerweise von den Fachleuten als ein Gen angesehen wird.
"Codierungsregion" bezieht sich auf ein DNA Segment, welches ein Regulatormolekül oder irgendein Polypeptid codiert.
Der Ausdruck "Regulatormolekül" bezieht sich auf ein Polymer von Ribonucleinsäure (RNA), wie beispielsweise Antisinn RNA oder ein Ribozym, oder ein Polypeptid, welches fähig ist, Expression eines Genprodukts zu vergrößern oder zu inhibieren.
"Genexpression" bezieht sich auf ein Polypeptid, welches aus Transcription. Translation und wahlfrei post-Translationsverarbeiten eines ausgewählten DNA Segments herrührt.
Der Ausdruck "Expression", wie hier verwendet, soll die Translation zu Genprodukt aus einem Gen bedeuten, welches die Sequenz des Genprodukts codiert. Bei der Expression wird eine DNA Kette, die die Sequenz von Genprodukt codiert, zuerst zu einer komplementären RNA transkribiert, welche eine Messenger RNA genannt wird, und dann wird die auf diese Weise transkribierte Messenger RNA in das zuvor genannte Genprodukt translatiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Promotorregion" auf eine DNA Sequenz, üblicherweise stromaufwärts (5') der Codierungssequenz, welche die Expression der Codierungsregion kontrolliert, indem sie die Erkennung für RNA Polymerase und/oder andere Faktoren zur Verfügung stellt, die benötigt werden, daß die Transkription an der korrekten Stelle startet. Ein "Promotorfragment" bildet eine DNA Sequenz, bestehend aus der Promotorregion.
Eine Promotorregion kann ein oder mehrere Regionen einschließen, welche die Wirksamkeit von Transkriptionsinitiierung als Reaktion auf physiologische Bedingungen konrollieren, und eine Transkriptionsinitiationssequenz.
"Gewebespezifische Promotoren", wie hier bezeichnet, sind diejenigen, die Genexpression in erster Linie in spezifischen Geweben wie Wurzeln. Blättern, Stielen. Stempeln. Staubbeuteln. Blumenblättern oder Epidermisschichten steuern.
Transkriptionsstimulatoren. Verstärker oder Aktivatoren können in gewebespezifische Promotoren unter Erzeugen eines Promotors mit einem hohen Aktivitätsspiegel integriert werden, der Gewebespezifität zurückbehält.
"Regulatornucleotidsequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, angeordnet nächst einer Codierungsregion, deren Transkription durch die Regulatornucleotidsequenz in Verbindung mit dem Genexpressionsapparat der Zelle kontrolliert wird. Im allgemeinen ist die Regulatornucleotidsequenz 5' zu der Codierungsregion angeordnet. Ein Promotor kann ein oder mehrere Regulatornucleotidsequenzen umfassen.
"Polyadenylierungsnucleotidsequenz" oder "Polyadenylierungsnucleotidregion" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die üblicherweise 3' zu einer Codierungsregion angeordnet ist, welche die Zugabe von Polyadenylsäure zu der RNA kontrolliert, die aus der Codierungsregion in Verbindung mit dem Genexpressionsapparat der Zelle transkribiert wird.
"DNA Segment, das Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt, kann eine Codierungsregion, einen Promotor, eine Regulatornucleotidsequenz, eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz oder andere DNA Sequenz umfassen, die von den Fachleuten angesehen wird. Genexpression zu beeinflussen.
Wie hier verwendet, bedeutet "Transformation" Verfahren, durch die Zellen/Gewebe/Pflanzen Eigenschaften erlangen, die auf ein Nucleinsäuremolekül codiert sind, das auf die Zelle, Gewebe/Pflanze übertragen worden ist. "Übertragen" bezieht sich auf Verfahren, DNA in Zellen zu übertragen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Mikroinjektion, Permeabilisieren der Zellmembran mit verschiedenen physikalischen (beispielsweise Elektroporation) oder chemischen (beispielsweise Polyethylenglykol. PEG) Behandlungen. Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilbombardement, auch Biolistiken bezeichnet, oder Infektion mit Agrobakterium tumefaciens oder A. rhizogenes. Wie hier verwendet, bedeutet "Transformante" eine Pflanze, welche Eigenschaften erlangt hat, die auf einem Nucleinsäuremolekül codiert sind, das zu Zellen während des als Transformation bekannten Verfahrens übertragen worden ist. Wie hier verwendet, bedeutet "Rücktransformation" Transformation von Zellen/Geweben/Pflanzen, welche in sich selbst Transformanten sind.
Wie hier verwendet, bedeutet "sexuelle Hybridisierung" die Herstellung von Sprößlingen durch Kreuzzüchten von zwei Pflanzen, die genetisch unterschiedlich sind, so wie diejenigen, welche unterschiedliche DNA Sequenzen in ihr Genom integriert haben.
Wie innerhalb "integriert" verwendet, bedeutet, daß die übertragene DNA in das Pflanzengenom inkorporiert ist.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "lox Stelle" eine Nucleotidsequenz, bei der das Genprodukt des cre Gens, hier als Cre bezeichnet, eine ortsspezifische Rekombination katalysieren kann. Die loxP Stelle ist eine 34 Basenpaarnucleotidsequenz, welche aus Bakteriophagen P1 mithilfe von in der Technik bekannten Verfahren isoliert werden kann. Ein Verfahren zum Isolieren einer loxP Stelle aus Bakteriophagen P1 ist von Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 3398 (1982) offenbart. Die loxP Stelle besteht aus 13 Basenpaar invertierten Wiederholungen, getrennt durch eine 8 Basenpaar- Spacerregion. Die Nucleotidsequenzen der invertierten Wiederholungen und der Spacerregion sind folgendermaßen:
ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT.
E.coli, transformiert mit Plasmid loxP/NptII/Hra, welches zwei lox Stellen trägt, eine auf jeder Seite einer Polyadenylierungsnucleotidsequenz, die von einem kleinen Rubisco Tabak-Untereinheitsgen abstammt, ist mit der ATCC unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungsnummer 68177. Diese und andere Hinterlegungen sind der Öffentlichkeit bei der Gewährung eines Patents an den Bevollmächtigten zugänglich. Jedoch sollte es verstanden werden, daß die Verfügbarkeit einer Hinterlegung nicht eine Lizenz bildet, den Gegenstand der Erfindung in Beeinträchtigung der durch Regierungshandlung gewährten Patentrechte zu praktizieren. Die lox Stellen und die dazwischenliegende Region können aus Plasmid loxP/NptII/Hra mit dem Restriktionsenzym HindIII herausgeschnitten werden. Zusätzlich kann ein vorher ausgewähltes DNA Segment in loxP/NptII/Hra an der BamHI Restriktionsenzymstelle durch auf dem Gebiet bekannte Techniken eingefügt werden. Andere geeignete lox Stellen umfassen loxB, loxL und loxR Stellen, welche aus E. coli isolierte Nucleotidsequenzen sind. Diese Sequenzen sind von Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 3398 (1982) offenbart und beschrieben. Lox Stellen können auch durch eine Mannigfaltigkeit von Synthesetechniken hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind. Beispielsweise sind Synthesetechniken zum Herstellen von lox Stellen von Ito et al., Nuc. Acid. Res., 10: 1755 (1982) und Ogilvie et al., Science. 214: 270 (1981) offenbart.
Verfahren zum Einführen einer DNA Sequenz in Pflanzenzellen sind in der Technik bekannt. Nucleinsäuren können allgemein in Pflanzenprotoplasten mit oder ohne die Hilfe von Elektroporation. Polyethylenglykol oder anderen Verfahren, die bekannt sind, Membranpermeabilität zu ändern, eingeführt werden. Nucleinsäurekonstruktionen können auch in Pflanzen unter Verwenden von Vektoren eingeführt werden, die Teil des Ti- oder Ri- Plasmids, einen Pflanzenvirus oder eine autonom replizierende Sequenz enthalten. Nucleinsäurekonstruktionen können auch in Pflanzen durch Mikroinjektion oder durch Hochgeschwindigkeitsmikroprojektile, auch "Teilchenbombardement" oder "Biolistiken" genannt [Sanford. J. C., Tibtech 6: 299 (1988)], direkt in verschiedene Pflanzenteile eingeführt werden. Die bevorzugten Mittel zum Einführen eines Nucleinsäurefragments in Pflanzenzellen umfaßt die Verwendung von A. tumefaciens, enthaltend das Nucleinsäurefragment zwischen T-DNA Grenzen entweder auf einem abgerüsteten Ti-Plasmid (das heißt ein Ti-Plasmid, von dem die Gene für Tumorigenizität gelöscht worden sind) oder in einem binären Vektor in trans zu einem abgerüsteten Ti-Plasmid. Das Agrobakterium kann verwendet werden. Pflanzen durch Animpfung von Gewebeexplantaten wie beispielsweise Stielen, Wurzeln oder Blattscheiben, durch Cokultivierung mit Pflanzenprotoplasten oder durch Animpfung von Samen oder verwundeten Pflanzenteilen zu transformieren.
Der Bereich von Getreidespecies, in den Fremdgene eingebracht werden können, nimmt rasch zu, wenn Gewebekultur- und Transformationsverfahren sich verbessern und wenn selektierbare Marker verfügbar werden. Somit ist diese Erfindung auf einen breiten Bereich von agronomisch oder für den Gartenbau geeignete Pflanzen anwendbar. Das bestimmte Verfahren, das verwendet wird, die DNA Sequenz in eine ausgewählte Pflanzenzelle einzuführen, ist nicht kritisch. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden DNA Sequenzen in Pflanzenzellen durch Co-Kultivierung von Blattscheiben mit A. tumefaciens, im wesentlichen wie von Horsch et al. beschrieben. Science. 227: 1229-1231 (1985), unter Weglassen der Ammenkulturen eingeführt.
Bei dem vorliegenden Verfahren werden die lox Stellen mit Cre in Kontakt gebracht, wodurch die ortsspezifische Rekombination erzeugt wird. Bei einer Ausführungsform wird Cre oder cre Messenger RNA in die Zellen direkt durch Mikroinjektion, Biolistiken oder anderes Protein- oder RNA Einführungsverfahren eingeführt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die cre Codierungsregion in die Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines Promotors eingeführt, der aktiv in Pflanzenzellen ist. Geeignete Regulatornucleotidsequenzen sind in der Technik bekannt. Der Promotor, welcher bei einer ausgewählten Pflanzenzelle verwendet wird, ist nichtkritisch gegenüber dem Verfahren der Erfindung. Eine Teilliste von geeigneten Promotoren umfassen den 35S Promotor von Blumenkohl-Mosaikvirus, beschrieben von Odell et al., Nature, 313: 810-812 (1985), den Promotor von dem Nopalinsynthasegen von A. tumefaciens, beschrieben von Depicker et al., J. of Mol. Appl. Genet., 1: 561-573 (1982), den Promotor von einem kleinen Rulbisco-Untereinheitsgen, beschrieben von Mazur und Chui, Nucleic Acids Research 13: 2373-2386 (1985), den 1' oder 2' Promotor von der TR-DNA von A, tumefaciens, beschrieben von Velten et al., EMBO J. 12: 2723-2730 (1984), den Promotor eines Chlorophyll a/b Bindungsproteingens, beschrieben von Dunsmuir et al., J. Mol. Appl. Genet. 2: 285-300 (1983), den Promotor eines Sojabohnensamenlagerproteingens, beschrieben von Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8560-8564 (1986) und den Promotor von dem Weizen EM Gen, beschrieben von Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988). Cre kann durch die Pflanze allgemein in allen Zellen bei allen Entwicklungsstufen exprimiert werden, oder Expression von cre kann spezifischer durch die Verwendung von Promotoren oder Regulatornucleotidsequenzen mit beschränkten Expressionseigenschaften kontrolliert werden. Cre kann in einer gewebespezifischen Weise, beispielsweise nur in Wurzeln. Blättern oder bestimmten Blütenteilen exprimiert werden. Cre kann in einer entwicklungsmäßig spezifischen Zeitperiode exprimiert werden, beispielsweise nur während Samenbildung oder während reproduktiver Zellbildung. Cre Expression kann auch unter die Kontrolle eines Promotors gebracht werden, der durch Anwendung eines Induktors reguliert werden kann. In diesem Fall ist cre Expression verschwunden oder sehr gering, bis der externe Induktor angewendet wird. Es sind Promotoren, die aktiv in Pflanzenzellen sind, beschrieben worden, die durch Wärmeschock [Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 (1986)], Ethylen [Broglie et al., Plant Cell 1: 599-607 (1989)]. Auxin [Hagan und Guilfoyle, Mol. Cell. Biol. 5: 1197-1203 (1985)], Abscisinsäure [Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988)]. Salicylsäure (EPO 332104A2 und EPO 337532A1) und substituierte Benzolsulfonamidsicherer (WO 90/11361) induzierbar sind. Kontrolle von cre Expression durch den Sicherer-induzierbaren (safener-inducible) Promotor 2-2 oder dessen Derivate erlaubt, daß die Expression nur angestellt wird, wenn die induzierende Chemikalie angewendet wird und nicht als Reaktion auf Umwelt- oder phytohormonale Stimuli. Somit kann cre Expression zu irgendeiner gewünschten Zeit in dem Pflanzenlebenszyklus initiiert werden. Vorzugsweise ist die Regulatornucleotidsequenz ein 35S Promotor oder ein 2-2 Promotor.
Das Genprodukt der cre Codierungsregion ist eine Rekombinase, hier als "Cre" bezeichnet, welche ortsspezifische Rekombination von DNA an lox Stellen bewirkt. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "cre Codierungsregion" eine Nucleotidsequenz, die für ein Genprodukt codiert, welches ortsspezifische Rekombination von DNA in Pflanzenzellen an lox Stellen bewirkt. Eine cre Codierungsregion kann aus Bakteriophagen P1 mithilfe von in der Technik bekannten Verfahren isoliert werden. Ein Verfahren zum Isolieren einer cre Codierungsregion von Bakteriophagen P1 ist von Abremski et al., Cell, 32: 1301-1311 (1983) offenbart. Die natürlich vorkommende cre Codierungsregion kann durch Mutation unter Herstellen von Cre Proteinen mit geänderten Eigenschaften, wie von Wierzbicki et al., J. Mol. Biol., 195: 785-794 (1987) beschrieben, geändert werden. Diese geänderten Cre Proteine behalten ihre Identitäten als Cre.
E. coli, transformiert mit Plasmid Cre/Hpt-A, und E. coli, transformiert mit Plasmid Cre/Hpt-B, wobei beide eine cre Codierungsregion tragen, isoliert aus Bakteriophagen P1 und einem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S Promotor, sind mit der ATCC hinterlegt worden und tragen Hintelegungsnummern ATCC 68176 bzw. ATCC 68175. Die cre Codierungsregion kann aus Plasmid Cre/Hpt-B mit den Restriktionsenzymen KpnI und Sa1I isoliert werden.
In einer Ausführungsform werden die ersten, zweiten und wahlweise dritten DNA Sequenzen in eine Pflanze durch Transformation entweder in einer Stufe oder in zwei oder drei aufeinanderfolgenden Stufen eingeführt. Alternativ werden die ersten und zweiten DNA Sequenzen in eine Pflanze und die dritte DNA Sequenz in eine unterschiedliche Pflanze eingeführt. Die zwei Pflanzen werden dann sexuell unter Erzeugen von Nachkommenschaft mit allen drei DNA Sequenzen hybridisiert. In einer anderen Ausführungsform werden die ersten, zweiten und dritten DNA Sequenzen jeweils getrennt in eine Pflanze eingeführt, und die drei werden durch sexuelle Hybridisierung zusammengebracht.
Am bevorzugtesten ist das Plasmid zum Einbringen einer DNA Sequenz, umfassend einen Promotor und eine cre Codierungsregion, Cre/Hpt-A oder Cre/Hpt-1B, und das Plasmid zum Einbringen einer DNA Sequenz, umfassend eine lox Stelle, ist loxP/NptII/Hra oder Derivate davon, welche ein vorher ausgewähltes DNA Segment anders als oder zusätzlich zu der kleinen Rubisco Untereinheits-Polyadenylierungsnucleotidsequenz tragen, die zwischen den ersten und zweiten lox Stellen angeordnet ist. Diese Plasmide können von Fachleuten oder, wie in dieser Anmeldung gelehrt, verwendet werden, cre oder lox tragende Pflanzen zu erzeugen. Eine Cre Pflanze und eine lox Pflanze können sexuell hybridisiert werden, wodurch Hybridnachkommenschaftspflanzen erzeugt werden, die eine cre Codierungsregion und lox Stellen enthalten.
Weil die lox Stelle eine asymmetrische Nucleotidsequenz ist, können die lox Stellen auf dem gleichen DNA Molekül die gleiche oder entgegengesetzte Orientierung im Hinblick zueinander haben. Rekombination zwischen lox Stellen in der gleichen Orientierung führt zu einer Deletion des DNA Segments, das zwischen den zwei lox Stellen angeordnet ist, und einer Verbindung zwischen den sich ergebenden Enden des ursprünglichen DNA Moleküls. Das gelöschte DNA Segment bildet ein zirkuläres Molekül von DNA. Das ursprüngliche DNA Molekül und das sich ergebende zirkuläre Molekül enthalten jeweils eine einzelne lox Stelle.
Rekombination zwischen lox Stellen in entgegengesetzten Orientierungen auf dem gleichen DNA Molekül führt zu einer Inversion der Nucleotidsequenz des DNA Segments, das zwischen den zwei lox Stellen angeordnet ist. Zusätzlich kann reziproker Austausch von DNA Segmenten nächst zu lox Stellen, die auf zwei unterschiedlichen DNA Molekülen angeordnet sind, auftreten. Alle diese Rekombinationsereignisse werden durch das Produkt der cre Codierungsregion katalysiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die ersten und zweiten DNA Sequenzen in Pflanzenzellen eingeführt, verbunden durch ein vorher ausgewähltes DNA Segment. Das Segment kann ein Gen sein oder irgendeine andere Sequenz von Deoxyribonucleotiden von homologem, heterologem oder synthetischem Ursprung. Vorzugsweise ist das vorher ausgewählte DNA Segment ein Gen für ein Strukturprotein, ein Enzym oder ein Regulatormolekül, oder eine DNA Sequenz, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt, wie beispielsweise eine Regulatornucleotidsequenz, ein Promotor oder eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz. Wenn die ersten und zweiten lox Stellen die gleiche Orientierung haben, erzeugt Kontakt mit Cre eine Deletion des vorher ausgewählten DNA Segments. Wenn die ersten und zweiten lox Stellen entgegengesetzte Orientierung haben, erzeugt Kontakt mit Cre eine Inversion ("Flipping") der Nucleotidsequenz des vorher ausgewählten DNA Segments.
Ein Versuch wurde gemacht, die Aktivierung von Genexpression unter Verwenden des Umkehrmodus des loxP-cre Systems zu zeigen. Eine Konstruktion wurde gemacht, in der die Codierungs- und Polyadenylierungsregionen von einem sulfonylharnstoffresistenten ALS Gen zwischen zwei synthetische loxP Stellen gesetzt wurden, die in umgekehrter Orientierung relativ zueinander waren. Dieses loxP gebundene Fragment wurde in umgekehrter Orientierung zu dem 35S Promotor gebracht, so daß er nicht exprimiert werden würde. Das gesamte unterbrochene Gen wurde in einen binären Vektor gebracht, welcher einen Kanamycinresistenzselektionsmarker einschloß, in A. tumefaciens eingebracht und dann in Tabakpflanzen. Wie erwartet, waren kanamycinresistente Transformanten nicht gegenüber Chlorsulfuron (einem Sulfonylharnstoff) resistent, was keine Expression der umgekehrten Codierungsregion zeigte. Gewebe wurde von ausgewählten Transformanten genommen und unter Verwenden von Agrobakterium, welches -/Hpt oder Cre/Hpt-B enthielt, rücktransformiert (Beispiel 4). Hygromycin ausgewählte Pflanzen, die Cre erhielten, behielten ihre Sensitivität gegenüber Chlorsulfuron, was anzeigte, daß das sulfonylharnstoffresistente ALS Gen nicht aktiviert wurde. Das ALS Gen wurde nicht aktiviert, weil das lox-P gebundene Fragment sich nicht in den Pflanzen umkehrte (flip). Dieses wurde bestimmt, indem Pflanzen DNA auf Southern Blots analysiert wurde: es wurde eine Bande, die die ursprüngliche lox Konstruktion darstellte, nachgewiesen, aber es wurde keine Bande, die das umgekehrte loxP- gebundene Fragment darstellte, nachgewiesen. Es wurde dann gezeigt, daß das loxP gebundene Fragment unfähig war, sich in einer in vitro Reaktion unter Verwenden von gereinigtem Cre umzukehren. Somit mangelte es dieser besonderen lox Konstruktion in einem noch unbestimmten Aspekt. Es wird vollständig vorhergesagt, daß, wenn das loxP-gebundene Fragment fähig war, sich in der in vitro Reaktion umzukehren, es sich in Pflanzen umkehren würde, die Cre enthielten, und das ALS Gen würde aktiviert sein.

VERWENDBARKEIT

Die Erfindung erlaubt die ortsspezifische Rekombination von DNA an den Punkten der eingeführten lox Stellen in einer der folgenden Weisen:
(a) Deletion des DNA Segments, das von lox Stellen flankiert ist (Excision);
(b) Inversion der Nucleotidsequenz des DNA Segments, flankiert von lox Stellen (Flipping) oder
(c) reziproker Austausch von DNA Segmenten nächst lox Stellen, die auf unterschiedlichen Molekülen angeordnet sind (Austausch)
Modus (a), Excision, tritt auf, wenn die lox Stellen in ähnlicher Orientierung auf dem gleichen DNA Molekül sind. Ein Beispiel dieses Ereignisses besteht darin, die Entfernung von unerwünschten Markergenen zu erlauben, wie beispielsweise denjenigen, die Antibiotikaresistenz oder Herbizidresistenz in transgenen Pflanzen verleihen. Entfernung des Markers würde auch die Verwendung des gleichen Markers in einer zweiten Transformation der transgenen Pflanze gestatten. Auch ein Eigenschaftsgen, das unerwünscht in einem spezifischen Gewebe oder bei einer bestimmten Entwicklungszeit ist, kann herausgeschnitten werden. Auch eine DNA Sequenz, die Expression eines Gens beeinflußt, kann herausgeschnitten werden, was zu einer erhöhten oder verringerten Expression des Gens führt. Ein Fachmann wird erkennen, das das Umgekehrte der Excision (d. h. Integration) auch durchgeführt werden kann.
Modus (b), Umkehren, tritt auf, wenn die lox Stellen in reverser Orientierung auf dem gleichen DNA Molekül sind. Dieses Ereignis kann neue Verfahren der cre-regulierten Genexpression liefern. Genexpression kann eingeschaltet werden, indem die Richtung einer Promotor- oder Regulatornucleotidsequenz von einer inaktiven zu einer aktiven Orientierung im Hinblick auf eine Codierungsregion geändert wird. Auch wird Ändern der Orientierung einer Codierungsregion im Hinblick auf einen Promotor deren Expression ändern. Andere Wege, um Expression eines Gens abzuschalten, umfassen Umkehren (flipping) einer Antisinn RNA oder Ribozyms von einer inaktiven zu einer aktiven Orientierung.
Modus (c), Austausch, kann geeignete Mittel für rekombinante Änderungen von Pflanzen DNA zur Verfügung stellen.
Eine Anwendung der gegenwärtigen Erfindung besteht im Kontrollieren von männlicher Fruchtbarkeit in einem Verfahren zum Herstellen von Hybridgetreiden. Hybridisierung eines Getreides umfaßt das Kreuzen von zwei unterschiedlichen Linien unter Herstellen von Hybridsamen, aus dem die Getreidepflanzen gezüchtet werden. Hybridgetreide sind insofern überlegen, als daß mehr der gewünschten Eigenschaften in die Produktionspflanzen eingebracht werden können. Beispielsweise können Eigenschaftszüge wie Ölgehalt. Herbizidresistenz, Krankheitsresistenz, Anpassungsvermögen an Umweltbedingungen und dergleichen in Sprößlingen hybridisiert werden, so daß die zuletzt Genannten mit den wünschenswertesten Eigenschaften ihrer Eltern bekleidet sind. Zusätzlich kann Nachkommenschaft aus einer Hybridkreuzung neue Qualitäten besitzen, die aus der Kombination der zwei Elterntypen herrühren, wie beispielsweise Ausbeutevergrößerung, resultierend aus dem Phänomen, welches als Heterosis bekannt ist. Kontrollierte Kreuzbefruchtung unter Herstellung von Hybridsamen ist kommerziell schwierig zu erzielen gewesen aufgrund der in Wettbewerb stehenden Selbstbefruchtung, welche in den meisten Getreidepflanzen auftritt.
Gegenwärtig wird Hybridsamenherstellung mithilfe eines der folgenden Mittel durchgeführt: (a) mechanisches Entfernen oder Bedecken der männlicher Organe zum Verhindern von Selbstbefruchtung, gefolgt von Aussetzen der männlich unfähig gemachten Pflanzen Pflanzen mit männlichen Organen, die die für Kreuzen gewünschte(n) Eigenschaft(en) enthalten. (b) genetisches Züchten männlich-steriler Pflanzen in der Anwesenheit von Pflanzen mit fruchtbaren männlichen Organen, die die Eigenschaft enthalten, die für Kreuzen gewünscht wird, oder (c) Behandeln von Pflanzen mit chemischen Hybridisierungsmitteln (CHA), die selektiv männliche Organe sterilisieren, gefolgt von Aussetzen der männlich unfähig gemachten Pflanzen Pflanzen mit fruchtbaren männlichen Organen, die die Eigenschaft enthalten, die für Kreuzen gewünscht wird. Einige Nachteile gegenüber jedem dieser Verfahren umfassen: (a) Anwendbarkeit auf nur einige wenige Getreide wie beispielsweise Mais, wo die männlichen und weiblichen Organe gut getrennt sind; und es ist arbeitsintensiv und teuer; (b) genetisch männlich sterile Linien sind mühsam zu erhalten, was Kreuzungen mit Wiederherstellungslinien erforderlich macht: (c) alle CHAs zeigen einigen Grad von allgemeiner Phytotoxizität und weiblicher Befruchtungsreduzierung. Auch zeigen CHAs oft unterschiedliche Grade von Wirksamkeit gegenüber unterschiedlichen Getreidespecies oder sogar gegenüber unterschiedlichen Mannigfaltigkeiten innerhalb der gleichen Art.
Ein neuer molekularer genetischer Approach, Getreideproduktion zu hybridisieren, der auf einen breiten Bereich von Getreiden anwendbar ist und genetische männliche Sterilität umfaßt, ist durch Pflanzengenetiksysteme entwickelt worden. Wie in EPA 89- 344029 beschrieben, umfaßt dieses System die Einführung eines Zellzerstörungsgens, das nur in dem Tapetalgewebe von Staubbeuteln exprimiert wird, wodurch der sich entwickelnde Pollen zerstört wird. Die sich ergebenden genetisch männlich sterilen Pflanzen dienen als die weiblichen Elternteile in der Kreuzung unter Herstellen von Hybridsamen. Dieses System könnte hoch wirksam und wünschenswert sein. Jedoch ist ein Nachteil, daß, weil das männlich sterile Elternteil heterozygot in Bezug auf das Sterilitätsgen ist, welches als eine dominante Eigenschaft wirkt, nur 50% der aus dem Hybridsamen gezüchteten Pflanzen fruchtbar sind, der Rest behält das Sterilitätsgen bei. Diese Situation führt zu vermindertem Pollenschuppen in dem Produktionsgebiet, welches zu vermindertem Samensatz und Ausbeute führen kann. Zugabe von loxP-cre Technologie zu diesem Hybridschema erlaubt Wiederherstellung von Fruchtbarkeit bei einem viel höheren Prozentsatz von Pflanzen in dem Produktionsgebiet wie auch Eliminierung des Zellzerstörungsgens. Plazieren des männlichen Sterilitätsgens zwischen loxP Stellen erlaubt ihm, im Anschluß an Einführung von Cre in das Hybrid aus dem männlichen Elternteil gelöscht zu werden.
Eine weitere Anwendung der gegenwärtigen Erfindung besteht in Herstellen von samenlosem Erzeugnis. Samenlos ist wünschenswert im Verbrauchserzeugnis für Zweckmäßigkeit und Geschmack. Gegenwärtig wird "samenlose" Wassermelone" verkauft, die tatsächlich etwas entwickelten Samen und eine große Anzahl von unreifem Samen enthält, der in Größe bis zu derjenigen von vollständig reifem Samen variiert. Zum Herstellen dieser Wassermelonen wird zuerst eine Hybridkreuzung zwischen einem tetraploiden mütterlichen Elternteil und einem diploiden Bestäuber gemacht. Der sich ergebende triploide Samen erzeugt selbstunfruchtbare Pflanzen, die mit einem diploiden Bestäuber unter Herstellen von samenloser Frucht gekreuzt werden [H. Kihara. Proc. Soc. Hort. Sci., 58: 217-230. (1951)]. Dieses Produktionsschema leidet an den folgenden Problemen: (1) Erzeugen einer tetraploiden Pflanze, welche durch ein Chromosomenverdopplungsverfahren vollendet wird, ist schwierig. Auch muß die Anzahl von Samen pro Frucht auf dieser tetraploiden Pflanze gering sein, weil dieses eine positive Korrelation mit der Samenzahl in dem Endprodukt hat [C. F. Andrus. Production of Seedless Watermelons, USDA Tech. Bull. Nr. 1425 (1971)]. (ii) Gutes Kombinieren der Fähigkeit des diploiden Bestäubers und der tetraploiden Pflanze ist schwierig zu erzielen [W. R. Henderson. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 102: 293-297 (1977)]. (iii) Die triploiden Samen sind sehr viel geringwertiger gegenüber regulären diploiden Samen in Bezug auf Kraft und Keimbildungsfähigkeit [D. N. Maynard. Hort. Sci., 24: 603-604 (1989)]. Diese Probleme zusammen mit unvollständiger Samenlosigkeit in dem Endprodukt machen die Entwicklung von samenloser Wassermelone langsam und schwierig. Dieser auf Polyploidie basierende Approach gegenüber Samenlosigkeit ist nur in denjenigen wenigen Species möglich, wo tetraploide und diploide Pflanzen lebensfähig sind.
Ein molekularer genetischer Approch gegenüber Samenlosigkeit, umfassend loxP-cre, ist sehr viel effizienter, was zu einem zuverlässigeren samenloser Produkt führt und nicht Änderungen in der Polyploidie einschließt. Somit ist er allgemeiner auf einen breiteren Bereich von Species anwendbar. Ein lox/polyA-inaktiviertes Zellzerstörungsgen, reguliert durch einen samenspezifischen Promotor, wird in eine Pflanze eingeführt. Wenn diese Pflanze mit einer Pflanze gekreuzt wird, die Cre exprimiert, wird das Zerstörungsgen aktiviert und in dem Samen exprimiert, wodurch Samenentwicklung zerstört wird. Die Gewißheit von Endospermversagen (erzeugt durch das Zellzerstörungsgenprodukt), was zu der Abtrei bung des gesamten Samens führt, ist sehr hoch. In den meisten Dikotyledonen liefert das Endosperm die für frühe Embryoentwicklung benötigten Nährmittel. Endospermabtreibung führt unweigerlich zu Samenabtreibung [R. A. Brink und D. C. Cooper. Bot. Rev. 8: 423-541 (1947)].
Der verwendete samenspezifische Promotor wird aus der Gruppe aus bekannten Promotoren ausgewählt, um Expression in dem Embryo und/oder dem Endosperm des sich entwickelnden Samen, am wünschenswertesten in dem Endosperm zu steuern. Beispiele von samenspezifischen Promotoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die Promotoren von Samenlagerproteinen. Die Samenlagerproteine werden streng reguliert, wobei sie beinahe exklusiv in Samen in einer hoch gewebespezifischen und stufenspezifischen Weise exprimiert werden [Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221 (1984); Goldberg et al., Cell 56: 149-160 (1989)]. Auch unterschiedliche Samenlagerproteine können bei unterschiedlichen Stufen von Samenentwicklung und in unterschiedlichen Teilen des Samens exprimiert werden.
Es gibt zahlreiche Beispiele von samenspezifischer Expression von Samenlagerproteingenen in transgenen zweikeimblättrigen Pflanzen. Diese umfassen Gene aus zweikeimblättrigen Pflanzen für Bohnen-β-Phaseolin [Sengupta-Goplalan et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 82: 3320-3324 (1985) und Hoffman et al., Plant Mol. Biol. 11: 717-729 (1988)]. Bohnenlectin [Voelker et al., EMBO J. 6: 3571-3577 (1987)], Sojabohnenlectin [Ocamuro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8240-8344 (1986)]. Sojabohnenkunitztrypsininhibitor [Perez-Grau und Goldberg Plant Cell 1: 1095-1109 (1989)]. Sojabohnen-β-Conglycinin [Beachy et al., EMBO J 4: 3047-3053 (1985). Barker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 458-462 (1988), Chen et al.,. EMBO J 7: 297-; 302 (1988). Chen et al., Dev. Genet. 10: 112-122 (1989), Naito et al., Plant Mol. Biol. 11: 683-695 (1988)], Erbsenvicillin [Higgins et al., Plant Mol. Biol. 11: 109-123 (1988)]. Erbsenconvicillin (Newbigin et al., Planta 180: 461 (1990)], Erbsenlegumin [Shirsat et al., Mol. Gen. Genetics 215: 326 (1989)]. Rapssamennapin [Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75: 685-694 (1988)] wie auch Gene von einkeimblättrigen Pflanzen wie beispielsweise Mais 15-kd zein [Hoffman et al., EMBO J. 6: 3213-3221 (1987)]. Gersten-β-Hordein [Marris et al., Plant Mol. Biol. 10: 359-366 (1988)] und Weizenglutenin [Colot et al., EMBO J 6: 3559-3564 (1987)]. Darüberhinaus enthalten Promotoren von samenspezifischen Genen, die operabel an heterologe Codierungsregionen in chimären Genkonstruktionen gekoppelt sind, auch ihr temporales und räumliches Expressionsmuster in transgenen Pflanzen bei. Derartige Beispiele umfassen Arabidopsis thaliana 25 Samenlagerproteingenpromotor, wodurch Enkephalinpeptide in Arabidopsis und Brassica napus Samen [Vandekerckhove et al., Bio/Technology 7: 929-932 (1989)] exprimiert werden, Bohnenlectin- und Bohnen-β-Phaseolin- Promotoren, wodurch Luciferase exprimiert wird [Riggs et al., Plant Sci. 63: 47-57 (1989)] und Weizengluteninpromotoren, wodurch Chloramphenicolacetyltransferase exprimiert wird [Colot et al., EMBO J. 6: 3559-3564 (1987)]. Promotoren, die früh hoch in Endospermentwicklung exprimiert werden, sind in dieser Anmeldung äußerst wirksam. Von besonderem Interesse ist der Promotor aus der a' Untereinheit des Sojabohnen β- Conglyciningens [Walling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2123-2127 (1986)], welches früh in der Samenentwicklung in dem Endosperm und dem Embryo exprimiert wird.
Das verwendete Zellzerstörungsgen wird ausgewählt aus einer Gruppe von Genen, die Produkte codieren, die normales Funktionieren von Zellen zerstören. Es gibt viele Proteine, die toxisch gegenüber Zellen sind, wenn in einer unnatürlichen Situation exprimiert. Beispiele umfassen die Gene für das Restriktionsenzym EcoRI [Barnes und Rine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1354-1358 (1985)], Diphtherie Toxin A [Yamaizurni et al., Cell 15: 245- 250 (1987)], Streptavidin [Sano und Cantor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 142-146 (1990)] und Barnase [Paddon und Hartley, Gene 53: 11-19 (1987)]. Am bevorzugtesten für dieses System ist die Codierungsregion von Barnase, von der gezeigt worden ist, daß sie hoch wirksam beim Zerstören der Funktion von Pflanzenzellen ist (EPA 89-344029).
Ein hoch wünschenswertes samenloses System ist eines, in dem vollständig fruchtbarer F1 Samen sich entwickelt, der in Pflanzen gezüchtet werden kann, die nur samenlose Frucht erzeugen. Dieses System ist ökonomisch insofern günstig, als daß für jede Kreuzbestäubung eine große Anzahl von samenlosen Früchten resultiert: die Anzahl von F1 Samen aus einer Kreuzung X die Anzahl von Früchten, hergestellt auf einer F1 Pflanze. Auch in dieses Schema eingefügt sind die Vorteile des Züchtens eines Hybridgetreides, einschließlich des Kombinierens wertvollerer Eigenschaften und Hybridkraft. Dieses wird in der gleichen Weise durchgeführt, wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme jedoch, daß das lox/polyA-inaktivierte Zerstörungsgen aus einem Samenüberzugs-spezifischen Promotor exprimiert wird. Der Samenüberzug ist das Auswachsen des Integuments, eines streng maternalen Gewebes. Deshalb umfaßt die Hybridkreuzung, die das lox/polyA inaktivierte Zerstörungsgen mit dem cre Gen zusammenbringt, nicht dieses Samenüberzugsgewebe. Der Samenüberzug des F1 Samen hat entweder lox oder cre, abhängig davon, welches als das weibliche Elternteil verwendet wird, und somit entwickelt sich F1 Samen normal. Nachdem der F1 Samen eine Frucht tragende F1 Pflanze bewirkt, erben alle vegetativen Zellen (einschließlich Samenüberzugszellen) sowohl lox wie cre aus dem Embryo. Somit hat der Samenüberzug der F1 Pflanze ein aktiviertes Zellzerstörungsgen.
Der Samenüberzug ist ein wesentliches Gewebe für Samenentwicklung und Lebensfähigkeit. Wenn der Samenüberzug vollständig gereift ist, dient der Samenüberzug als eine Schutzschicht gegenüber inneren Teilen des Samens. Während Samenentwicklung ist der Samenüberzug ein wesentliches. Nährmittel einführendes Gewebe für den sich entwickelnden Embryo. Der Samen ist nährstoffmäßig "parasitisch" zu der Mutterpflanze. Alle für Samenwachstum notwendigen Rohmaterialien müssen eingeführt werden. In Samen von zweikeimblättrigen Pflanzen tritt das vaskuläre Gewebe in den Samen durch den Funikulus und dann Anastomose in das Samenüberzugsgewebe. Es gibt keine Vaskulärgewebeverbindung oder Plasmodesmenverbindung zwischen dem Samenüberzug und dem Embryo. Deshalb müssen alle gelösten Nährmittelstoffe, die in den sich entwickelnden Samen geliefert werden, innerhalb des Samenüberzugs entladen werden und sich dann durch Diffusion zu dem Embryo bewegen. Es sind Techniken entwickelt worden, die Nährmittelzusammensetzung in dem Samenüberzug zu studieren [Hsu et al., Plant Physiol. 75: 181 (1984); Thorne & Rainbird, Plant Physiol. 72: 268 (1983); Patrick. J. Plant Physiol. 115: 297 (1984); Wolswinkel & Ammerlaan, J. Exp. Bot. 36: 359 (1985)] und auch die detaillierten zellulären Mechanismen von Entladen von gelöstem Stoff [Offler & Patrick. Aust. J. Plant Physiol. 11: 79 (1984); Patrick, Physiol. Plant 78: 298 (1990)]. Es ist offensichtlich, daß die Zerstörung dieses wesentlichen Nährmittel-Trichter-bildenden Gewebes Samenabtreibung verursacht.

BEISPIELE

ORTSSPEZIFISCHE REKOMBINATION IN PFLANZEN

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Molekulartechniken

Verfahren zum Kultivieren von Bakterien, Herstellen von DNA und Manipulieren von DNA waren, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] beschrieben, sofern nicht anders angegeben. Restriktionsenzyme und andere Enzyme, die in DNA Manipulationen verwendet wurden, wurden aus New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA, USA), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) oder Bethesda Research Laboratory (Gaithersburg, MD, USA) erhalten und wurden im wesentlichen gemäß den Spezifikationen des Herstellers verwendet.

ISOLIERUNG UND ANALYSE VON PFLANZEN RNA UND DNA

Sowohl RNA wie DNA wurden aus den gleichen Blattproben extrahiert, indem Verfahren für Extraktion von jedem kombiniert wurden. Ein bis fünf Gramm Blattgewebe wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und gemahlen. Gefrorenes Gewebe wurde zu 15 ml Extraktionspuffer hinzugegeben [100 mM Trizma Hydrochlorid (Tris) pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 200 ug/ml Proteinase K] und 10 Minuten lang bei 65ºC erhitzt. Fünf ml 5 M Kaliumacetat wurden hinzugegeben, und die Proben wurden 20 Min auf Eis gesetzt. Die Proben wurden bei 25K · g 20 Min lang versponnen, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Käsetuch in eine Röhre gegossen, die 1 ml 5 M Natriumacetat und 10 ml Isopropanol enthielt. Die Röhren wurden über Nacht bei -20ºC belassen. Die RNA/DNA wurde mittels Zentrifugation bei 20 K · g 15 Min pelletisiert. Die Pellets wurden in 10 ml Wasser resuspendiert, und ein gleiches Volumen 4 M Lithiumchlorid wurde hinzugegeben. Die Lösungen wurden 1-2 Stunden auf Eis gesetzt, dann 20 Minuten bei 20 K · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt, und ein gleiches Volumen von Isopropanol wurde hinzugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei -20ºC wurde die DNA pelletisiert und in einer Lösung von 10 mM Tris mit 1 mM EDTA pH 8,0 (TE) resuspendiert. Die Proben wurden mit einem gleichen Volumen von Tris pH 8,0 gepuffertem Phenol extrahiert und durch Hinzufügen von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen Ethanol gefällt. Für Southern Blot Analyse wurde die DNA mit einem Restriktionsenzym verdaut, und die sich ergebenden Fragmente wurden mittels Gelelektrophorese getrennt, auf Zeta-Probe Filter (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) übertragen und mit Nicktranslatierten Sonden hybridisiert.
Das Lithiumchloridpellet wurde in einer Hälfte des Ursprungsvolumens von Wasser resuspendiert, ein gleiches Volumen von Lithiumchlorid wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde eine zusätzliche Stunde auf Eis gesetzt. Die RNA wurde mittels Zentrifugation pelletisiert, in Wasser resuspendiert, mit gepuffertem Phenol extrahiert und mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumen Ethanol gefällt. Für Nothern Blot Analyse wurde die RNA mittels Gelelektrophorese in Formaldehyd, wie von Rave et al., Nucl. Acids Res. 6: 3559-3569 (1979) beschrieben, getrennt, auf Zeta-Probe Filter übertragen und an Nicktranslatierten Sonden hybridisiert.

ERZEUGUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN

Die Cointegrations- und binären Ti Plasmide, die das chimäre cre Gen enthielten, und diejenigen, die loxP Stellen enthielten, wurden in Tabak mittels Blattscheibentransformation und in Arabidopsis mittels Wurzeltransformation, wie in Beispiel 8 beschrieben, eingeführt. Aseptische Standardtechniken für die Manipulation von sterilen Medien und sterilen Pflanzen/Bakterienkulturen wurden verfolgt, einschließlich der Verwendung einer Laminarfließhaube für alle Transfers. Mittel für Medien für Tabak sind in Tabelle 2 gegeben. Eingetopfte Tabakpflanzen für Blattscheibeninfektionen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet, die für einen 14 h, 24ºC Tag-, 10 h 20ºC Nachtzyklus mit annähernd 80% relativer Feuchtigkeit unter gemischten kalt weiß fluoreszierenden und weißglühenden Lichtern gehalten wurde. Tabakblattscheibeninfektionen wurden im wesentlichen mithilfe des Verfahrens von Horsch et al., Science 227, 1229-1231 (1985) durchgeführt, wobei Ammenkulturen weggelassen wurden.
Gesunde junge Blätter, nicht vollständig ausgebreitet und annähernd 3-5 Zoll an Länge, wurden von annähernd 4-6 Wochen alten Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum var. Xanthi) geerntet. Die Blätter wurden durch Eintauchen in eine Lösung, welche 10% herkömmliche Bleiche und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, oberflächensterilisiert. Nach 20 Minuten Sterilisation mit wechselndem Mischen wurden die Blätter aufeinanderfolgend dreimal in steriles entionisiertes Wasser zum gründlichen Spülen der Blätter übertragen, und dann sanft unter Entfernen von überschüssigem Wasser geschüttelt. Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden aus ganzen Blättern unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt.
Kulturen von Agrobakteriumzellen, enthaltend die binären oder Cointegrationsplasmide, wurden in 5 ml YEB oder YEP Brühe (Tabelle 1 und Tabelle 8) mit den geeigneten Antibiotika gezüchtet. Kulturen wurden annähernd 17-20 Stunden in 18 mm Glaskulturröhren in einem bei 28ºC gehaltenen New Brunswick Plattformschüttler geschüttelt. Blattscheiben wurden angeimpft, indem sie mehrere Minuten in 20 ml einer 1 : 20 Verdünnung der Über-Nacht-Agrobakteriumkultur getaucht wurden.
Nach Animpfung wurden die Blattscheiben in Petrischalen gebracht, die .1N1B Agarmedium enthielten (Tabelle 2). Die Schalen wurden mit Parafilm verschlossen und unter gemischten fluoreszierenden und "Gro und Sho" Pflanzenlichtern (General Electric) 2-3 Tage in einem Kulturraum, der bei annähernd 25ºC gehalten wurde, inkubiert.
Um die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien und in Bezug auf das Wachstum von transformierten Tabakzellen auszuwählen, wurden die Blattscheiben in frisches .1N1B Medium übertragen, welches 500 mg/l Cefotaxim und entweder 10-30 mg/l Hygromycin, am bevorzugtesten 30 mg/l Hygromycin, 20-50 ppb Chlorsulfuron, am bevorzugtesten 25 ppb Chlorsulfuron, oder 100-300 mg/l Kanamycin, am bevorzugtesten 100 mg/l Kanamycin enthielt. Cefotaxim wurde als eine gefrorene 200 mg/ml Stammlösung gehalten und aseptisch (filtersterilisiert durch ein 0,45 gin Filter) nach Auoklavieren zu den Medien hinzugegeben. Eine frische Stammlösung von Hygromycin, Chlorsulfuron oder Kanamycin wurde für jede Verwendung hergestellt und wurde in die autoklavierten Medien filtersterilisiert.
Blattscheiben wurden unter der zuvor beschriebenen Wachstumsbedingung 2-3 Wochen inkubiert und dann in frische Medien der gleichen Zusammensetzung oder zu MX&supmin; mit den geeigneten Antibiotika übertragen.
Annähernd 3-4 Wochen später wurden Sprößlinge, die sich auf Medium entwickelten, das entweder Hygromycin. Chlorsulfuron oder Kanamycin enthielt, mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium (Tabelle 2), welches 200-500 mg/l Cefotaxim, am bevorzugtesten 250 mg/l Cefotaxim, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10-30 mg/l Hygromycin, am bevorzugtesten 30 mg/l Hygromycin, oder 20-30 ppb Chlorsulfuron, am bevorzugtesten 25 ppb Chlorsulfuron enthielt, plattiert. Wurzelbildung wurde in drei Wochen aufgezeichnet.
Blätter wurden aus den gewurzelten, herausgeschnittenen Sprößlingen entfernt, um den Spiegel der Resistenz gegenüber Hygromycin, Chlorsulfuron oder Kanamycin in einem Kallusinduktionsassay auf selektiven Medien zu bestimmen. Um Kallusbildung zu induzieren, wurden Blätter herausgeschnitten, und Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt und auf Kallusinduktionsmedium (Tabelle 2), welches entweder 20-50 mg/l Hygromycin, am bevorzugtesten 30 mg/l Hygromycin. 5-25 ppb Chlorsulfuron, am bevorzugtesten 25 ppb Chlorsulfuron, oder 50-100 mg/l Kanamycin, am bevorzugtesten 100 mg/l Kanamycin enthielt, plattiert. Kalluswachstum auf selektiven und nicht selektiven Medien wurde in 3 Wochen aufgezeichnet.

TABELLE 1

AGROBAKTERIUMWACHSTUMSMEDIEN

YEB MEDIUM pro Liter
Bacto-Rindfleisch-Extrakt 5,0 g
Bacto-Hefe-Extrakt 1,0 g
Pepton 5,0 g
Sucrose 5,0 g
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5 g
Agar (wahlfrei) 15,0 g
pH 7,2
MIN A mit Sucroseplatten pro Liter
Wasser 948 ml
Agar 15 g
Mische und autoklaviere min A Salze: 40 ml
200 ml: K&sub2;HPO&sub4; 52,5 g
KH&sub2;PO&sub4; 22,5 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5g
NaCitrat 2H&sub2;O 2,5 g
20% MgSO&sub4;7H&sub2;O 1 ml
1% Thiaminhydrochlorid 0,5 ml
20% Sucrose 10 ml

TABELLE 2

TABAKGEWEBEKULTURMEDIEN

Kallusinduktionsmedium
pro Liter
Murashige's Minimalmedium von organischen Stoffen GIBCO #510-1118 (enthält 3% Sucrose) 1 Packung
100X Vitaminergänzung: 10 ml
10 mg/l Thiamin
50 mg/l Pyridoxin
50 mg/l Nicotinsäure
1 mg/ml Naphthalinessigsäure 1 ml
(NAA) Stammlösung
1 mg/ml 6-Benzylaminopurin
(BAP) Stammlösung 0,2 ml
Agar 8,0 g
pH 5,8

SPRÖßLINGSINDUKTIONSMEDIUM (.1N1B)

pro Liter
Murashige's Minimalmedium von organischen Stoffen GIBCO #510-1118 (enthält 3% Sucrose)
1 Packung
100X Vitaminergänzung: 10 ml
10 mg/l Thiamin
50 mg/l Pyridoxin
50 mg/l Nicotinsäure
1 mg/ml NAA (Naphthalinessigsäure) Stammlösung 0,1 ml
1 mg/ml BAP Stammlösung 1,0 ml
Agar 8,0 g
pH 5,8

WURZELINDUKTIONSMEDIUM (MX&supmin;)

pro Liter
Murashige's Minimalmedium aus organischen Stoffen GIBCO #510-1118 (enthält 3% Sucrose) 1 Packung
100X Vitaminergänzung: 10 ml
10 mg/l Thiamin
50 mg/l Pyridoxin
50 mg/l Nicotinsäure
Agar 8,0 g
PH 5,8

A. KONSTRUKTION VON PLASMIDEN FÜR INTEGRATION UND EXPRESSION DER cre CODIERUNGSREGION IN PFLANZENZELLEN

BEISPIEL 1

Das Ausgangsmaterial für Konstruktion von Cre/Hpt-A war das Plasmid pK35CAT, welches in Lin et al., Plant Physiology, 84: 856-861 (1987) beschrieben ist und unter dem ATCC hinterlegt worden ist und die Hinterlegungsnummer 68174 trägt. Dieses Plasmid enthält einen CaMV 35S Promotor (35S/P), der Expression der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) Codierungsregion steuert und ist gefolgt von einer Nopalin-Synthase-(NOS) Gen Polyadenylierungsnucleotidsequenz (NOS 3'). pK35CAT stammte von pK35K ab, welches seinerseits von pKNK abstammte, pKNK ist mit der ATCC hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungsnummer 67284, pKNK ist ein auf pBR322 basierender Vektor, welcher ein Neomycinphosphotransferase II (NptII) Promotorfragment, ein Nopalinsynthase (NOS) Promotorfragment, die Codierungsregion von NptII und die Polyadenylierungsregion von dem NOS Gen enthält. Eine Karte dieses Plasmids ist in Lin et al., Plant Physiol. 84: 856-861 (1987) gezeigt. Das 320 bp ClaI-Bg1II Fragment in pKNK, das den NptII Promotor enthält, wurde als ein HindIII-Bg1II Fragment aus dem NptII Gen des Transposons Tn5, beschrieben von Beck et al., Gene 19: 327-336 (1982) erhalten. Die HindIII Stelle wurde zu einer ClaI Stelle durch Linkerhinzugabe umgewandelt. Das NptII Promotorfragment ist gefolgt von einem 296 bp Sau3A-PstI NOS Promotor (NOS/P) Fragment, entsprechend Nucleotiden -263 bis +33 im Hinblick auf die Transkriptionsstartstelle des NOS Gens, beschrieben von Depicker et al., J. Appl. Genet. 1: 561-574 (1982). Die PstI Stelle an dem 3' Ende wurde an dem Translationsinitiationscodon des NOS Gens erzeugt. Das NOS/P ist gefolgt von einer 998 bp HindIII-BamHI Sequenz, enthaltend die NptII Codierungsregion, erhalten aus dem Transposon Tn5 [Beck et al., Gene 19: 327-336 (1982)] durch die Erzeugung von HindIII und BamHI Stellen an Nucleotiden 1540 bzw. 2518. Die NptII Codierungsregion wird dann gefolgt von einem 702 bp BamHI-ClaI Fragment, enthaltend das 3' Ende des Nopalinsynthasegens, einschließend Nucleotide 848 bis 1550 [Depicker et al., J. Appl. Genet. 1: 561-574 (1982)]. Das Verbleibende von pKNK besteht aus pBR322 Sequenzen von 29 bis 4361.
pKNK wurde zu pK35K umgewandelt, indem die NptII und NOS Promotoren entfernt wurden und sie durch einen CaMV 35S Promotor ersetzt wurden. Das EcoRI-HindIII 35S Promotorfragment ist das gleiche wie dasjenige, das in pUC35K enthalten ist, welches mit der ATCC hinterlegt worden ist und die Hinterlegungsnummer 67285 trägt. Das 35S Promotorfragment wurde folgendermaßen hergestellt und wie in Odell et al., Nature 313: 810-813 (1985) beschrieben, mit Ausnahme jedoch, daß das 3'Ende des Fragments CaMV Sequenzen bis +21 im Hinblick auf die Transkriptionsstartstelle einschließt. Ein 1,15 kb Bg1II Segment des CaMV Genoms, enthaltend die Region zwischen -941 und +208 relativ zu der 35S Transkriptionsstartstelle, wurde in der BamHI Stelle des Plasmids pUC13 kloniert. Dieses Plasmid wurde an der Sa1I Stelle in dem Polylinker, angeordnet 3' zu dem CaMV Fragment, linearisiert, und das 3' Ende des Fragments wurde durch Verdauung mit Nuclease Ba131 gekürzt. Im Anschluß an die Zugabe von HindIII Linkem wurde die Plasmid DNA rückzirkularisiert. Aus Nucleotidsequenzanalyse der isolierten Klone wurde ein 3' Deletionsfragment mit dem bei +21 angeordneten HindIII Linker ausgewählt. Um pK35K zu erzeugen, wurde dieses 35S Promotorfragment als ein EcoRI-HindIII Fragment isoliert, wobei die EcoRI Stelle von dem Polylinker von pUC13 kam, und an pKNK ligasiert, das mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, wobei die EcoRI Stelle 5' zu der ClaI Stelle in pBR322 liegt.
pK35K wurde zu pK35CAT umgewandelt, indem die INptII Codierungsregion herausfallen gelassen wurde und sie durch die Codierungsregion von Chloramphenicol- Acetyltransferase (CAT) ersetzt wurde, wie kartiert und beschrieben in Lin et al., Plant Physiol. 84: 856-861 (1987). Die CAT Codierungsregion wurde als ein 975 bp Sau3A Fragment aus pBR325 erhalten. Die Enden wurden ausgefüllt, und das Fragment wurde in eine ausgefüllte Sa1I Stelle von pGEM2 ligasiert. Ein Klon, pGCAT9, wurde ausgewählt, der die Insertion so orientiert enthält, daß die HindIII und BamHI Stellen des Polylinkers 5' bzw. 3' zu der CAT Codierungsregion angeordnet sind. Die CAT Codierungsregion wurde aus diesem Klon durch HindIII und BamHI Verdauung isoliert und in HindIII und BamHI verdautes pK35K ligasiert. Die sich ergebende Konstruktion, pK35CAT genannt, enthält auch das NOS 3' Fragment, welches unverändert in der Umwandlung von pKNK zu pK35K verbleibt und letztendlich zu pK35CAT.
Das gesamte cre Gen wurde ursprünglich aus dem Genom von Bakteriophage P1 auf einem EcoRI Fragment erhalten, wie von Sternberg und Hamilton, J. Mol. Biol. 150: 467-486 (1981) beschrieben. Die cre Codierungsregion wurde als ein XhoI-EcoRI Fragment in Plasmid pRH103Δ6 hergestellt, wie von Sternberg et al., J. Mol. Biol. 187: 197-212 (1986) beschrieben. Die XhoI Stelle wurde als ein Linker folgend Ba131 Deletion der Sequenz 5' zu der cre Codierungsregion hinzugegeben, was zu dem Ersatz der XhoI Stelle annähernd 50 bp 5' zu der Translationsinitiierung ATG führte. Die EcoRI Stelle wurde als ein Linker folgend Ba131 Deletion der Sequenz 3' zu der cre Codierungsregion hinzugefügt, was zu dem Ersatz der EcoRI Stelle annähernd 100 bp 3' zu dem Translationsstopcodon führte. Die 3' EcoRI Stelle wurde dann durch eine Sa1I Stelle, erzeugend pBS7, ersetzt, wie in Sauer, Mol. and Cell. Biol. 7: 2087-2096 (1987) beschrieben, so daß die cre Codierungsregion als ein XhoI-Sa1I Fragment isoliert werden konnte. Dieses cre Codierungsfragment ist das Gleiche, wie dasjenige, das in Plasmid pBS39 vorhanden ist, welches mit der ATCC hinterlegt worden ist und die Hinterlegungsnummer 53255 trägt. Das XhoI-Sa1I cre Codierungsregionsfragment wurde isoliert, HindIII Linker wurden zu den Enden hinzugegeben, und es wurde mit HindIII verdautem pK35CAT ligasiert, wobei pK35CreCAT erzeugt wurde. Dieses Plasmid enthält ein chimäres 35S/P-cre-CAT-NOS 3' Gen.
Um Cre/Hpt-A zu konstruieren, wurde pK35CAT mit BamHI verdaut, das Ende wurde teilweise mit dGTP und dATP gemäß dem Verfahren von Hung und Wensink, Nucl. Acids Res. 12: 1863-1874 (1984) gefüllt, und dann wurde es mit HindIII unter Entfernen der CAT Codierungsregion verdaut. Das HindIII-Sa1I DNA Fragment, enthaltend die cre Codierungsregion, wurde aus pK35CreCAT isoliert, dessen Konstruktion in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, und die Sa1I Stelle wurde teilweise mit dCTP und dTTP während ihrer Herstellung gefüllt. Das cre Codierungsregionsfragment wurde dann in den hergestellten Vektor ligasiert, der von pK35CAT abstammt, wobei das Plasmid pK35 Cre erzeugt wurde, welches ein chimäres 35S Promotor-cre Codierungsregions-NOS 3' Gen enthält.

BEISPIEL 2

Als nächstes wurde ein ClaI-Sa1I Fragment, enthaltend ein chimäres NOS/P-Hpt- NOS 3' Gen (Hpt = Hygromycinphosphotransferase) und das NptI Gen (Neomycinphosphotransferase I) aus pAGS122 isoliert, welches analog zu pAGS120 ist, das in von den Elzen et al., Plant Molecular Biology, 5: 299-302 (1985) beschrieben ist. Ein Sa1I Linker wurde zu dem ClaI Ende des Fragments hinzugefügt, und es wurde in Sa1I verdautes pK35Cre ligasiert, wobei das Plasmid Cre/Hpt-A erzeugt wurde, welches in Fig. 1A dargestellt ist.
Die Boxen zeigen die chimären 35S/P-cre-NOS 3' und NOS/P-Hpt-NOS 3' chimären Gene. Die Pfeile zeigen die durch diese chimären Gene exprimierten Transkripte. Das NptI Gen stammt von Tn903 ab. Diese Gene sind in einen pBR322 Vektor eingefügt.

BEISPIEL 3

Das Ausgangsmaterial für die Konstruktion von Cre/Hpt-B war das Plasmid pDH51, das von Pietrzak et al., Nucleic Acids Research. 14: 5857-5868 (1986) beschrieben war. Dieses Plasmid enthält einen CaMV 35S Promotor, einschließend Sequenzen zwischen 6909 und 7437 des CaMV Genoms, und eine CaMV Polyadenylierungsnucleotidsequenz, einschließend Sequenzen zwischen 7439 und 7632, getrennt durch mehrere Restriktionsenzymstellen, einschließend XbaI. Das CaMV Promotorfragment in pDH51 wurde hergestellt, indem ein EcoRI Linker 5' zu der NcoI Stelle bei 6909 des CaMV Genoms gegeben wurde und ein KpnI Linker bei der HphI Stelle bei 7437. Das Polyadenylierungsregionsfragment wurde hergestellt, indem ein SphI Linker an der HphI Stelle bei 7439 hinzugegeben wurde und ein HindIII Linker folgend KpnI, SstI und EcoRI Stellen, die auf Position 7632 während einer Klonierungsstufe in pUC18 hinzugegeben worden waren. Beide dieser Fragmente wurden in pUC18 kloniert, wobei die an ihren Enden angeordneten Restriktionsstellen unter Erzeugen von pDH51 verwendet wurden. In dem sich ergebenden Plasmid sind EcoRI Stellen auf jedem Ende außerhalb des CaMV Promotors und 3' Region angeordnet. pDH51 wurde mit XbaI verdaut, und die Enden wurden teilweise mit dCTP und dTTP gefüllt. Das HindIII DNA Fragment, welches die cre Codierungsregion enthielt, wurde aus pk35CreCAT isoliert, und die Enden wurden teilweise mit dATP und dGTP gefüllt, dann in den hergestellten pDH51 Vektor ligasiert. Um ein Plasmid mit dem HindIII cre Fragment in der richtigen Orientierung für Expression zu identifizieren, wurde eine Sa1I Verdauung durchgeführt. Das gewünschte Plamid wurde mit Sa1I verdaut, weil die Sa1I Stelle an dem 3' Ende des cre Fragments benachbart zu der Sa1I Stelle an dem 5' Ende der CaMV 3' Region ist. Eine BamHI Verdauung bestätigte die korrekte Orientierung: ein 430 bp Fragment zwischen der BamHI Stelle an dem 3' Ende der 35S/P Region und eine BamHI Stelle innerhalb der cre Codierungsregion waren vorhanden. Das sich ergebende pDH51Cre Plasmid enthält ein chimäres 35S Promotor-cre- Codierungsregions-CaMV 3' Gen.

BEISPIEL 4

Als nächstes wurde das gesamte chimäre Gen in pJJ2644 kloniert, welches ein binärer Vektor für Agrobakterium tumefaciens Transformation ist, der ein chimäres 1'/P- Hpt-NOS 3' Gen, ein Tetracyclinresistenzgen, einen breiten Wirtsbereichsursprung von Replikation und t-DNA Grenzen trägt. pJJ2644 ist mit der ATCC hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungsnummer 68178 und wurde wie folgt konstruiert. Das breite Wirtsbereichsplasmid pRK290, das von Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347- 7351 (1980) beschrieben war, diente als der Grundvektor. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI geschnitten, die Enden gefüllt, und es wurde an ein endstellengefülltes EcoRI-HindIII Fragment, isoliert aus pAGS111 unter Erzeugen von pJJ1881 ligasiert. Das Fragment aus pAGS111 enthält die linken und rechten Grenzfragmente aus der Agrobakterium tumefaciens T-DNA, angeordnet auf jeder Seite eines chimären NptII Gens, und dessen Konstruktion ist in von den Elzen et al., Plant Molec. Biol. 5: 149-154 (1985) beschrieben. Das ClaI-BamHI chimäre NptII Genfragment wurde durch das ClaI-BamHI Fragment aus pBR322 ersetzt, wodurch eine HindIII Stelle hinzugegeben wurde. Um pJJ2501 zu erzeugen, wurde ein HindIII-ClaI Fragment hinzugegeben, das ein chimäres 1'/P-Hpt-NOS 3' Gen enthält, bestehend aus dem 1' Promotor, beschrieben von Velten et al., EMBO J. 12: 2723-2730 (1984), der Hpt Codierungsregion, beschrieben von von den Elzen et al., Plant Molec. Biol., 5: 299-302 (1985), aus der die ATG Sequenz, gerade 5' zu dem Translationsinitiations ATG angeordnet, entfernt worden war, und der NOS 3' Region. Als nächstes wurde die XhoI Stelle, außerhalb der T-DNA Grenzen angeordnet, gelöscht. Zwischen die BamHI und HpaI Stellen, 3' zu dem chimären Hpt Gen angeordnet, wurde ein Linker, einschließend Stellen für BamHI, XbaI, HindIII, XhoI, EcoRI und HpaI hinzugefügt, wodurch pJJ2644 erzeugt wurde.
Dieser Vektor wurde mit HindIII verdaut und an das HindIII gekoppelte EcoRI Fragment aus pDH51Cre, enthaltend das chimäre cre Gen, ligasiert. Das sich ergebende Plasmid ist Cre/Hpt-B, welches in Fig. 1B gezeigt ist. Die Boxen stellen die chimären 35S/P-cre-CaMV 3' und 1'/P-Hpt-NOS 3' Gene dar. Die linken und rechten T-DNA Grenzen sind als gefüllte Boxen markiert. Die Schrägstriche zeigen nicht dargestellte Sequenzen des binären Vektors PJJ2644, welcher ein Tetracyclinresistenzgen (tet) einschließt.
Ein als eine Kontrolle verwendetes Plasmid wird -/Hpt-B genannt und ist der pJJ2644 Vektor mit keinem hinzugefügten chimären cre Gen.

B. KONSTRUKTION VON PLASMIDEN, ENTHALTEND DIE lox STELLE FÜR INTEGRATION UND ANALYSE IN PFLANZENZELLEN

BEISPIEL 5

Das Ausgangsmaterial für Konstruktion von loxP/NptII/Hra war das Plasmid pBS69, enthaltend zwei loxP Stellen, welches von Sauer und Henderson. Nucleic Acids Research. 17: 147-161 (1989) beschrieben ist. Die lox P Stelle wurde ursprünglich aus dem Bakteriophagen P1 Genom auf einem BamHI Fragment, kloniert in pBR322, wie von Abremski et al., Cell 32: 1301-1311 (1983) beschrieben, erhalten. Diese Referenz beschreibt auch Konstruktion eines 80 bp EcoRI-HindIII Fragments, enthaltend loxP, hergestellt durch Hinzugeben eines EcoRI Linkers zu der Bc1I Stelle und eines HindIII Linkers zu der PvuII Stelle, angeordnet auf jeder Seite von loxP. Ein 50 bp BamHI-XhoI Fragment, welches loxP enthält, wurde durch Löschen aus der Bc1I Stelle mit Ba131 und Hinzugeben eines BamHI Linkers 10 bp aus loxP und Löschen aus der PvuII Stelle und Hinzufügen eines XhoI Linkers 6bp aus loxP hergestellt. Das 80 bp EcoRI-HindIII Fragment, welches loxP enthält, wurde zwischen die EcoRI und HindIII Stellen in dem pBR322 Plasmid ligasiert, welches das 50 bp loxP Fragment enthält, was zu dem Plasmid pRH42 führt, das zwei loxP Stellen, die in der gleichen Richtung orientiert sind, hat. Ein Derivat dieses Plasmids, das pRH43 genannt wird, welches das NptII Gen von Tn5 zwischen den loxP Stellen hat, wird auch beschrieben. Ein Derivat von pRH43, welches pRH499 genannt wird, das das Leu2 Gen von Hefe zwischen den loxP Stellen hat, wird beschrieben und eine Karte in Sauer, Mol. und Cell. Biol. 7: 2087- 2096 (1987) gezeigt. Wie in dieser Referenz beschrieben, wurde die zu der 80 bp lox Stelle benachbarte HindIII Stelle unter Erzeugen von pBS30 gelöscht. pBS30 trägt das gleiche EcoRI-XhoI Fragment, welches zwei direkt orientierte loxP Stellen enthält, das in pBS44 vorhanden ist, welches mit der ATCC hinterlegt worden ist und Hinterlegungsnummer 53254 trägt. Wie in Sauer und Henderson [Nucl. Acids Res. 17: 147-161 (1989)] beschrieben, wurde pBS69 aus pBS30 erzeugt, indem das 80 bp HindIII-Sa1I Fragment, welches die loxP Stelle enthält, durch das 50 bp HindIII-XhoI Fragment, welches die lox P Stelle enthält, ersetzt wurde. Dieses wurde getan, um extra Sequenz in dem 80 bp Fragment zu entfernen, welches ATG Translationsinitiationscodons enthielt. Somit hat pBS69 zwei direkt orientierte 50 bp loxP enthaltende Fragmente, umgebend ein Hefe Leu2 Gen.
Teil des Leu2 Gens wurde entfernt, wobei die EcoRI Stelle, angeordnet in dem Leu2 Gen, und die BamHI Stelle, benachbart zu einer loxP Stelle, verwendet wurden, und durch eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz (polyA), welche von dem kleinen Tabak Rubisco Untereinheitsgen abstammte, beschrieben von Mazur und Chui [Nucleic Acids Research. 13: 2373-2386 (1985)], ersetzt wurde. Diese Referenz beschreibt das Klonieren und Sequenzieren dieses Gens. Das BamHI-XbaI Fragment, welches die Sequenzregion zwischen 1905 und 2289 enthält, wurde isoliert, wobei die XbaI Stelle während dessen Herstellung ausgefüllt wurde, pBS69 wurde mit EcoRI verdaut, das Ende ausgefüllt, dann mit BamHI verdaut. Die Ligasierung dieser zwei DNAs führte zu dem Plasmid pBS69polyA.

BEISPIEL 6

Als nächstes wurde ein XhoI-HindIII Fragment, welches die loxP-polyA-loxP Region enthielt, isoliert, und ein HindIII Linker wurde zu dem XhoI Ende hinzugegeben. Dieses Fragment wurde in HindIII verdautes pKNK ligasiert. Die Konstruktion von pKNK war in Beipiel 1 beschrieben, und es enthält den NOS Promotor, verbunden mit der NptII Codierungsregion durch eine HindIII Stelle, was zu einem chimären Gen führt, welches Pflanzenzellen Kanamycinresistenz verleiht. Die Orientierung der loxP-polyA-loxP HindIII Insertion wurde durch Verdauung mit BamHI bestimmt. Das Plasmid mit dem eingefügten HindIII Fragment, so daß die polyA Stelle die gleiche Orientierung wie die NOS/P und die NptII Codierungsregion hat, wurde pKNKloxA genannt. Es wurde angenommen, daß die Polyadenylierungsnucleotidsequenz, die zwischen der NOS/P und NptII Codierungsregion angeordnet ist. Herstellung eines wesentlichen NptII Transkripts blockieren würde, wodurch verursacht würde, daß transformierte Zellen ihre Kanamycinempfindlichkeit zurückbehalten würden.
Als nächstes wurde ein PstI Fragment, das das Hra (sulfonylharnstoff-resistente Acetolacetatsynthase) Gen enthält, welches von pALS032BV abstammt, das von Lee et al. beschrieben ist [EMBO J. 7: 1241-1248 (1988)], und auch ein HindIII Fragment mit einem Streptomycin/Spectinomycin Widerstandsgen enthält, das von dem R100.1 Plasmid abstammt und von Prentki und Krisch. Gene. 29: 303-313 (1984) beschrieben ist, hinzugegeben. Dieses Fragment wurde konstruiert, indem Sa1I Linker zu den HindIII Enden des isolierten strep/spec Fragments hinzugegeben wurden und es in die Sa1I Stelle benachbart zu dem Hra Gen in pALS032BV ligasiert wurde. Das PstI Fragment wurde dann isoliert, die Enden ausgefüllt, und es wurde in Sa1I verdautes und gefülltes pKNKIoxA ligasiert. Das sich ergebende Plasmid, welches loxP/NptII/Hra genannt wird, ist in Fig. 1C gezeigt.
In Fig. 1C zeigen die offenen Boxen das chimäre NOS/P-NptII-NOS 3' Gen, das zwischen dem Promotor und der Codierungsregion durch eine kleine Rubisco Untereinheitsgenpolyadenylierungsregion unterbrochen ist, gezeigt als die gestrichelte Box, welche von zwei loxP Stellen umgeben ist, dargestellt durch Pfeile, die zeigen, daß die loxP Stellen in der gleichen Orientierung sind. Das Sternchen markiert die. Polyadenylierungsstelle. Das Plasmid umfaßt das sulfonylharnstoff-resistente ALS Gen, genannt Hra, und den Streptomycin und Spectinomycinresistenzmarker, eingefügt in einen pBR322 Vektor. Die Orientierung der PstI Insertion wurde nicht bestimmt.

C. TRANSFORMATION VON TABAK MIT DER cre CODIERUNGSREGION

Das chimäre 35S/P-Cre-NOS 3' Gen, beschrieben in Beispielen 1 und 2, wurde in Tabak durch Agrobakterium tumefaciens Infektion von Tabakblattscheiben eingeführt. Primäre Transformanten wurden analysiert, wodurch das Vorhandensein der cre Codierungsregion und Expression der cre mRNA in Tabakzellen wie auch Expression des gekoppelten Hpt Gens gezeigt wurde, welches Hygromycinresistenz verleiht.
Das Plasmid Cre/Hpt-A wurde in A. tumefaciens mithilfe eines Verfahrens übertragen, das ein drei-Wege-Paaren umfaßt, das im wesentlichen war, wie von Fraley et al. beschrieben [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 4803-4807 (1983)], mit Ausnahme der folgenden Punkte.
Cre/Hpt-A wurde in den Agrobakterienstamm GV 3850 gepaart, der von Zambryski et al. [J. of Mol. and Appl. Genetics. 1: 361-370 (1982)] beschrieben war. Kolonien von dem Cre/Hpt-A Paaren wurden auf LB Platten ausgewählt, welche 100 pg/ml Rifampicin und 25 ug/ml Kanamycin enthielten. Ausgewählte Kolonien wurden als Cointegrate des Cre/Hpt-A Plasmids in das Ti Plasmid mittels Southern Blot Analysen bestätigt.
Aseptische Standardtechniken für die Manipulation von sterilen Medien und sterile Pflanzen/Bakterienkulturen wurden verfolgt, einschließlich der Verwendung eines Laminarfließabzugs für alle Transfers. Eingetopfte Tabakpflanzen für Blattscheibeninfektionen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet, die für einen 14 h, 24ºC Tag, 10 h, 20ºC Nachtzyklus mit annähernd 80% relativer Feuchtigkeit unter gemischten kalt weiß fluoreszierenden und weißglühenden Lichtern gehalten wurde. Tabakblattscheibeninfektion wurde im wesentlichen mithilfe des Verfahrens von Hosch et al. [Science 227, 1229-1231 (1985)], wobei Ammenkulturen weggelassen wurden, wie im nachfolgenden beschrieben, durchgeführt.
Gesunde junge Tabakblätter wurden geerntet, oberflächensterilisiert und gespült, wie in Materials and Methods beschrieben. Blattscheiben. 8 mm an Durchmesser, wurden aus ganzen Blättern unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt.
Blattscheiben wurden beimpft, indem sie für mehrere Minuten in 20 ml einer 1 : 20 Verdünnung der Über-Nacht-Kultur von Agrobakterium eingetaucht wurden, welche das Cointegrate Cre/Hpt-A Ti Plasmid beherbergte. Die Kultur wurde gestartet, indem 5 ml YEB Brühe (Tabelle 1) mit einer einzelnen Bakterienkultur beimpft wurden. Die Kultur wurde annähernd 17-20 Stunden in 18 mm Glaskulturröhren in einem New Brunswick Plattformschüttler, der bei 28ºC gehalten wurde, gezüchtet.
Nach Animpfung wurden die Blattscheiben auf .1N1B Agarmedium (Tabelle 2) in Petrischalen gebracht, welche dann mit Parafilm veschlossen wurden. Die Petrischalen wurden unter gemischtem fluoreszierenden und "Gro und Sho" Pflanzenlichtern (General Electric) 2-3 Tage in einem Kulturraum, der bei annähernd 25ºC gehalten wurde, inkubiert.
Um die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien und für das Wachstum von transformierten Tabakzellen auszuwählen, wurden die Blattscheiben in frisches .1N1B Medium übertragen, welches 500 mg/l Cefotaxim und 10-20 mg/l Hygromycin enthielt.
Cefotaxim wurde als eine gefrorene 200 mg/ml Stammlösung gehalten und zu den Medien nach Autoklavieren aseptisch (filtersterilisiert durch ein 0,45 um Filter) hinzugegeben. Eine frische Hygromycinstammlösung (20 mg/ml) wurde für jede Verwendung hergestellt und wurde in die autoklavierten Medien filtersterilisiert. Blattscheiben wurden unter den zuvor beschriebenen Wachstumsbedingungen 3 Wochen lang inkubiert und dann in frische Medien der gleichen Zusammensetzung übertragen.
Annähernd 1 Monat später wurden Sprößlinge, die sich auf hygromycinhaltigem Medium entwickelten, mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 200 mg/l Cefotaxim und 10 mg/l Hygromycin enthielt. Wurzelbildung wurde in drei Wochen aufgezeichnet.
Blätter wurden von den gewurzelten herausgeschnittenen Sprößlingen entfernt. Spiegel der Resistenz gegenüber Hygromycin in einem Kallusinduktionsassay auf selektiven Medien zu bestimmen. Um Kallusbildung zu induzieren, wurden Blätter herausgeschnitten, und es wurden Blattscheiben. 8 mm an Durchmesser, unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt und auf Kallusinduktionsmedium gepflanzt, welches 20 und 50 mg/l Hygromycin enthielt. Kalluswachstum auf selektiven und nicht selektiven Medien wurde in drei Wochen aufgezeichnet.
Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß Transformation von Tabak mit Agrobakterium erzielt worden war, welches das Cre/Hpt-A Ti Plasmid beherbergte, basierend auf Herstellung von hygromycinresistentem Kallus. Alle zehn getesteten Transformanten waren gegenüber Hygromycin resistent. Primäre Transformanten wurden durch Molekulartechniken analysiert, das Vorhandensein der cre mRNA Seciuenzen zu verifizieren. Es wurden sieben unabhängige, mit Cre/Hpt-A transformierte Tabakpflanzen im Hinblick auf Expression des chimären cre Gens durch Nothern Blots, wie in Materials and Methods beschrieben, untersucht. Die Sonde, die verwendet wurde, an den Filter zu hybridisieren, enthaltend die aus jeder Pflanze hergestellte RNA, war ein BamHI-ClaI DNA Fragment, das aus dem pK35K oder pKNK Plasmid isoliert war, welche beide in Beipiel 1 beschrieben sind. Dieses Fragment enthält die NOS Polyadenylierungsnucleotidsequenz, welche eine Region von nicht translatierter transkribierter Sequenz einschließt. Weil sowohl die 35S/P-Cre-NOS 3' wie NOS/P-Hpt-NOS 3' Gene Homologie gegenüber dieser Sonde haben, wird das Transkript aus jedem Gen in diesem Experiment nachgewiesen. Das erwartete 2,0 kb Transkript aus dem cre Gen und das erwartete 1,5 kb Transkript aus dem Hpt Gen wurden auf dem Nothern Filter nachgewiesen. Alle untersuchten Pflanzen, mit Ausnahme von einer, erzeugten einen nachweisbaren Spiegel von Cre Transkript, welcher das Vorhandensein und Expression des chimären cre Gens in den Pflanzenzellen anzeigte.
Pflanzen, welche Hygromycinresistenz zeigten, wurden auf Erde übertragen und bis zur Reife in einer Wachstumskammer, wie zuvor beschrieben, gezüchtet. Individuelle Blütenstände wurden mit Beuteln bedeckt, Selbstbefruchtung ohne Kreuzbestäubung zu erlauben. Reife Samen wurden geerntet, und Nachkommenschaftstests wurden durchgeführt, die Vererbung der eingeführten Cre/Hpt DNA zu bestimmen. Vererbung wurde kontrolliert, indem die Hygromycinresistenzeigenschaft verfolgt wurde.
Samen wurde 30 Minuten in 10% herkömmlicher Bleiche und 1% SDS mit wechselndem Mischen oberflächensterilisiert, 3-5 mal mit sterilem entionisiertem Wasser gespült, getrocknet und auf MX&supmin; Medium in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 mg/l Hygromycin gepflanzt. Empfindliche Samen keimten, aber entwickelten sich nicht weiter. Ein Segregationsverhältnis von 3 beständiger Nachkommenschaft zu einer empfindlichen zeigte das Vorhandensein einer einzelnen Integrationsstelle des Hygromycinresistenzgens in das Genom der Transformante, welches dann stabil durch ihre Nachkommenschaft geerbt wurde. Dieses wurde in sieben von acht unabhängigen untersuchten Transformanten gesehen. Die achte Transformante zeigte ein Verhältnis, welches größer als 3 : 1 war, was das Vorhandensein von mehr als einer Integrationsstelle anzeigte. TABELLE 3 KALLUSWACHSTUM AUF HYGROMYCIN
¹Gewicht in Gramm ist der Durchschnitt von Ergebnissen aus zwei Kallusinduktionsassays, die mit der gleichen Transformante durchgeführt wurden.

D. HERSTELLUNG VON PFLANZENZELLEN UND PFLANZEN MIT ZWEI IN DAS GENOM INTEGRIERTEN loxP STELLEN

Die in Beispielen 5 und 6 beschriebene loxP-polyA-loxP DNA Sequenz wurde in Tabak durch Agrobakterium tumefaciens Infektion von Tabakblattscheiben, wie in Materials and Methods beschrieben, eingeführt. Primäre Transformanten wurden analysiert, das Vorhandensein der loxP-polyA DNA Sequenz in den Tabakzellen wie auch Expression des gekoppelten Hra Gens zu zeigen, welches Chlorsulfuronresistenz verleiht.
Das Plasmid loxP/NptII/Hra wurde in A. tumefaciens mithilfe eines Verfahrens übertragen, das ein Drei-Wege-Paaren umfaßt, das im wesentlicher war, wie von Fraley et al. beschrieben [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80. 4803-4807 (1983)], mit Ausnahme der folgenden Punkte. LoxP/NptII/Hra wurde in Agrobakteriumstamm GV3850 gepaart, der von Zambryski et al. beschrieben war [J. of Mol. and Appl. Genetics, 1: 361-370 (1982)]. Kolonien aus dem loxP/NptII/Hra Paaren wurden auf 100 ug/ml Rifampicin und 100 ug/ml von jeweils Spectinomycin und Streptomycin selektiert. Selektierte Kolonien wurden als Cointegrate des loxP/NptII/Hra Plasmids in das Ti Plasmid mittels Southern Blot Analysen bestätigt.
Tabakblattscheiben wurden erhalten, mit A. tumefaciens beimpft, welches das Cointegrate loxP/NptII/Hra Plasmid beherbergte und auf .1N1B inkubiert, wie in Materials and Methods beschrieben.
Um die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien und in Bezug auf Wachstum von transformierten Tabakzellen zu selektieren, wurden die Blattscheiben auf frisches .1N1B Medium übertragen, welches 500 mg/l Cefotaxim und 20-200 ppb Chlorsulfuron enthielt.
Cefotaxim wurde als eine gefrorene 200 mg/ml Stammlösung gehalten und aseptisch (filtersterilisiert durch ein 0,45 um Filter) zu den Medien nach Autoklavieren gefügt. Eine frische Chlorsulfuronstammlösung wurde für jede Verwendung hergestellt, indem zuerst eine 0,2 mg/ml Lösung in 0,01 N NH&sub4;OH hergestellt wurde, welche dann 1 : 10 mit entionisiertem Wasser verdünnt und in die autoklavierten Medien filtersterilisiert wurde. Blattscheiben wurden unter den zuvor beschriebenen Wachstumsbedingungen 3 Wochen inkubiert und dann in frische Medien der gleichen Zusammensetzung übertragen.
Annähernd 1 Monat später wurden Sprößlinge, die sich auf dem Medium entwickelten, welches 20-50 ppb Chlorsulfuron enthielt, mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gepflanzt, das 200 mg/l Cefotaxim und 20 mg/l Chlorsulfuron enthielt. Wurzelbildung wurde in 3 Wochen aufgezeichnet.
Blätter wurden aus den gewurzelten herausgeschnittenen Sprößlingen entfernt, Spiegel von Resistenz gegenüber Chlorsulfuron und Kanamycin in einem Kallusinduktionsassay auf selektiven Medien zu bestimmen. Um Kallusbildung zu induzieren, wurden Blätter herausgeschnitten und Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden hergestellt, wobei ein steriler Papierlocher verwendet wurde, und auf Kallusinduktionsmedium, welches 5, 10 oder 20 ppb Chlorsulfuron enthielt, und auf Kallusinduktionsmedium, welches 100 mg/l Kanamycin enthielt, gepflanzt. Kalluswachstum auf selektiven und nicht selektiven Medien wurde bei 3 Wochen protokolliert. Einundzwanzig unabhängige untersuchte Transformanten waren gegenüber Chlorsulfuron resistent. Alle außer einer behielten Empfindlichkeit gegenüber Kanamycin.
Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß Transformation von Tabak mit dem Agrobakterium erzielt worden war, welches das loxP/NptII/Hra Ti Plasmid beherbergte, basierend auf der Herstellung von chlorsulfuronresistentem Kallus. Weil die Zellen im allgemeinen kanamycinempfindlich verbleiben, schlagen diese Daten auch vor, daß kein lebensfähiges Transcript, welches die NptII Sequenz enthält, hergestellt wird. Neun unabhängige mit loxP/NptII/Hra transformierte Tabakpflanzen wurden im Hinblick auf das Vorhandensein der loxP-polyA DNA Region mittels Southern Blots, wie in Materials and Methods beschrieben, untersucht. Die Sonde, die verwendet wurde, an den Filter zu hybridisieren, enthaltend aus jeder Pflanze hergestellte BamHI verdaute DNA, war ein HindIII-BamHI DNA Fragment, das aus dem pK35K Plasmid isoliert war. Dieses Fragment enthält die Codierungsregion für NptII und ist in dem Diagramm in Fig. 2B gezeigt. In DNA von jeder der neun untersuchten loxP Pflanzen wurde das 2,4 kb BamHI Fragment, welches die Polyadenylierungsnucleotidsequenz und eine loxP Stelle enthält, wie in dem Diagramm in Fig. 2B gezeigt, nachgewiesen, wie in Fig. 2C, Bahnen 1 und 6 gezeigt. Keine der loxP Pflanzen hatte das in Fig. 2B gezeigte 5,7 kb Fragment, was anzeigte, daß kein Herausschneiden in diesen primären Transformanten nachgewiesen werden konnte.
In Fig. 2B sind Abstände zwischen den BamHI Stellen und zwischen den loxP Stellen in der ursprünglichen Konfiguration oben gezeigt. Unten ist eine Karte der erwarteten Konfiguration unter Verfolgen der Rekombination zwischen loxP Stellen mit dem Verlust einer BamHI Stelle und resultierender Änderung in dem Abstand zwischen verbleibenden BamHI Stellen gezeigt. Die 2,4 kb und 5,7 kb Fragmente, die in Fettdruck markiert sind, sind diejenigen, die durch die Sonde nachgewiesen wurden, gezeigt als eine schachbrettartige Box.
Pflanzen, die Chlorsulfuronresistenz zeigen, wurden auf Erde übertragen und bis zur Reife in einer Wachstumskammer, wie zuvor beschrieben, gezüchtet. Individuelle Blütenstände wurden mit Beuteln bedeckt. Selbstbefruchtung ohne Kreuzbestäubung zu erlauben. Reife Samen wurden geerntet, und Nachkommenschaftstests wurden durchgeführt, die Vererbung der eingefügten DNA Fragmente zu bestimmen. Vererbung wurde durch Verfolgen der gekoppelten Chlorsulfuronresistenzeigenschaft kontrolliert.
Samen wurde 30 Minuten, wie zuvor beschrieben, oberflächensterilisiert, getrocknet und auf MX&supmin; Medium in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Chlorsulfuron oder Kanamycin gepflanzt. Kanamycin wurde verwendet, die Stabilität des inaktivierten NptII Gens zu untersuchen. Empfindliche Samen keimten, aber entwickelten sich nicht weiter. Ein Segregationsverhältnis von 3 gegenüber Chlorsulfuron resistenten Nachkommenschaften zu 1 empfindlichen zeigte das Vorhandensein einer einzelnen Integrationsstelle des Hra Gens in dem Genom der Transformante, welches dann stabil durch ihre Nachkommenschaft geerbt wurde. Dieses wurde in 6 von 20 unabhängigen untersuchten Transformanten gesehen. Höhere Verhältnisse von resistenter zu empfindlicher Nachkommenschaft, gezeigt von 14 von 20 der Transformanten, zeigten Insertionen bei mehrfachen Positionen in dem Genom an. Beispielsweise zeigt ein 15/1 Verhältnis das Vorhandensein von Insertionen an zwei nicht gekoppelten Loci, und ein 255/1 Verhältnis zeigt Insertionen an vier nicht gekoppelten Loci in den Transformanten. TABELLE 4 KALLUSWACHSTUM AUF CHLORSULFURON UND KANAMYCIN

E. RÜCKTRANSFORMATION VON loxP PFLANZEN MIT DER cre CODIERUNGSREGION

Das binäre Vektorplasmid Cre/Hpt-B, in Beispiel 4 beschrieben, wurde in transgene Tabakpflanzen, welche zwei loxP Stellen schon in dem Genom integriert haben, durch A. tumefaciens Infektion von Tabakblattscheiben aus loxP primären Transformanten eingeführt. Rücktransformierte Pflanzen wurden analysiert, ortsspezifische Rekombination an den loxP Stellen zu zeigen.
Die in Materials and Methods beschriebenen Verfahren wurden verfolgt, mit der Ausnahme, daß gesunde Blätter aus transgenen loxP Tabakpflanzen, die in Magenta GA7 Kesseln (Magenta Corp., Chicago, IL. USA) wuchsen, geerntet wurden. Diese Pflanzen wurden wie in Sektion D hergestellt. Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden aus diesen sterilen Blättern unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt. Um in Bezug auf das Wachstum von transformierten Tabakzellen zu selektieren und die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien, wurde eine Gruppe von Blattscheiben auf frisches .1N1B Medium übertragen, welches 10-20 mg/l Hygromycin und 500 mg/l Cefotaxim enthielt. Um in Bezug auf ortsspezifische Rekombination bei den loxP Stellen in transformierten Tabakzellen auszuwählen und die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien, wurde eine weitere Gruppe von Blattscheiben auf frisches .1N1B Medium übertragen, welches 100 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Cefotaxim enthielt. Cefotaxim wurde als eine gefrorene 200 mg/ml Stammlösung gehalten und aseptisch (filtersterilisiert durch ein 0,45 um Filter) zu den Medien nach Autoklavieren hinzugegeben. Frische Hygromycinstammlösung (20 mg/ml) und Kanamycinstammlösung (50 mg/l) wurde für jede Verwendung hergestellt und wurde in die autoklavierten Medien filtersterilisiert. Blattscheiben wurden unter der zuvor beschriebenen Wachstumsbedingung 3 Wochen inkubiert und dann in frische Medien der gleichen Zusammensetzung übertragen.
Annähernd 1 Monat später wurden Sprößlinge, die sich auf hygromycinhaltigem Medium entwickelten, mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 200 mg/l Cefotaxim und 10 mg/l Hygromycin in Magenta GA7 Kesseln enthielt. Sprößlinge, die sich auf kanamycinhaltigem Medium entwickelten, wurden mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 200 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin in Magenta Kesseln enthielt.
Blätter wurden aus den gewurzelten, herausgeschnittenen Sprößlingen entfernt. Resistenzspiegel gegenüber Hygromycin und Kanamycin in einem Kallusinduktionsassay auf selektiven Medien zu bestimmen. Um Kallusbildung zu induzieren, wurden Blätter herausgeschnitten, und Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt und auf Kallusinduktionsmedium gepflanzt, enthaltend 30 mg/l Hygromycin und auf 50 mg/l Kanamycin. Kalluswachstum wurde bei 3 Wochen registriert.
Die in Fig. 2A gezeigten Ergebnisse zeigen, daß Cre-vermittelte ortsspezifische Rekombination der loxP Stellen in dem Tabakgenom erzielt worden ist unter Verfolgen von Rücktransformation der loxP Pflanzen mit dem Agrobakterium, das das Cre/Hpt- B Plasmid beherbergt, basierend auf der Herstellung von kanamycinresistentem Kallus. Rekombination, welche zu dem Herausschneiden der polyA Stelle führte, die zwischen der NOS/P und NptII Codierungsregion angeordnet ist, ermöglichte Herstellung eines lebensfähigen NptII Transkripts, welches zu Kanamycinresistenz gegenüber den Zellen beiträgt. Nur Blattscheiben von loxP Pflanzen, rücktransformiert mit dem Cre/Hpt-B Vektor, bildeten Kallus auf kanamycinhaltigem Medium. Pflanzen aus der Transformation von Widtyptabak, mit entweder -/Hpt-B oder mit Cre/Hpt-B, waren alle kanamycinempfindlich. Drei loxP Rücktransformanten aus der -/Hpt-B Animpfung waren auch kanamycinempfindlich.
In Fig. 2A zeigt jeder Balken das Gesamtgewicht der fünf Blattscheiben, die auf Kallusinduktionsmedium (Tabelle 2) gezüchtet worden sind, welches 50 mg/l Kanamycin enthält. Gewicht umfaßt dasjenige der ursprünglichen Blattscheiben, welches für Gewichte bis zu 0,4 g gilt. Scheiben wurden von Hygromycin selektierten Pflanzen genommen, was aus der Rücktransformation von loxP Pflanzen resultierte: L1 und L2 oder nicht transformierte Tabakpflanzen: WT, mit entweder dem cre Gen: Cre/Hpt-B Vektor (d. h. L1*C/H oder L2*C/H) oder ohne das cre Gen: -/Hpt-B Vektor (d. h. L1*-/H oder L2*-/H). Alle Pflanzen zeigten Wachstum auf Hygromycin.
Pflanzen, die aus Rücktransformation von loxP Pflanzengewebe mit Cre/Hpt-B resultierten, wurden mittels Southern Blots unter Nachweisen von Rekombination analysiert. Die gleiche NptII Fragmentsonde, beschrieben in Abschnitt D, wurde an Filter hybridisiert, die BamHI verdaute DNA enthielten, isoliert aus Rücktransformanten. Von den fünf analysierten loxP*Cre Rücktransformantenpflanzen DNAs behielt eine das 2,4 kb Fragment, das in loxP primären Transformanten nachgewiesen war, und in den anderen vier wurde ein neues 5,7 kb Fragment nachgewiesen, wie in Fig. 2C Bahnen 4, 8, 9 und 10 gezeigt. In dieser Figur enthalten die Bahnen annähernd 10 ug BamHI verdaute DNA aus den gleichen in (A) beschriebenen Pflanzen in der gleichen Reihenfolge, mit der Ausnahme, daß Bahnen 1 und 6 zusätzliche Proben aus den ursprünglichen L1 bzw. L2 Pflanzen enthalten. Positionen der 2,4 kb und 5,7 kb Banden, nachgewiesen mit der NptII Sonde, wie in (b) beschrieben, sind markiert. Das Fehlen des 2,4 kb Fragments und das Vorhandensein des 5,7 kb Fragments in diesen Rücktransformanten zeigte, daß Rekombination zwischen den zwei loxP Stellen, wie im Diagramm in Fig. 28 gezeigt, aufgetreten war: Herausschneiden führt zu dem Verlust einer zwischen den zwei loxP Stellen angeordneten BamHI Stelle, so daß der Abstand zwischen benachbarten BamHI Stellen sich vergrößert. Die eine loxP*Cre Rücktransformante, die das 2,4 kb Fragment behielt, wie in Fig. 2C Bahn 2 gezeigt, behielt auch Empfindlichkeit gegenüber Kanamycin, wie in Fig. 2A gezeigt, was Konsistenz zwischen der Southern Blot Analyse und der phänotypischen Reaktion zeigte. DNAs aus zwei Kontroll loxP Pflanzen, rücktransformiert mit -/Hpt, enthielten das 2,4 kb nicht rekombinierte Fragment, wie in Fig. 2C Bahnen 3 und 7 gezeigt, was angab, daß Rekombination abhängig von dem Vorhandensein von Cre ist. Die Wildtypkontrollpflanze zeigte keine Hybridisierung gegenüber der Sonde, wie in Fig. 2C Bahn 5 gezeigt.

F. GENETISCHE KREUZUNGEN VON HETEROZYGOTEN loxP und Cre PFLANZEN

Ein Verfahren, das verwendet wurde, Excisionsrekombination herzustellen, war, die Cre Rekombinase genetisch mit der loxP-polyA-loxP DNA Sequenz zu vereinigen, welche in das Pflanzengenom integriert ist, durch sexuelle Hybridisierung von loxP und Cre Pflanzen. In diesem Beispiel wurden primäre mittels Tabakblattscheibentransformation erhaltene Transformanten, wie in Abschnitten C und D beschrieben, verwendet.
Primäre Transformanten wurden auf Erde übertragen und in einer Wachstumskammer gezüchtet, die für einen 14 h, 24ºC Tag. 10 h, 20ºC Nachtzyklus mit annähernd 80% relativer Feuchtigkeit unter gemischten kalt weiß fluoreszierenden und weißglühenden Lichtern gehalten wurde. Pflanzen wurden bis zur Reife gezüchtet, und Handbestäubungen wurden unter Verwenden einer leichten Modifikation des Verfahrens von Wernsman. E. A. und D. F. Matzinger [Hybridization of Crop Plants W. R. Fehr und H. H. Hadley, Herausgeber, Seiten 657-668 (1980)] durchgeführt. Kurz gesagt, Blüten von Cre Pflanzen wurden am Tag vor Blühperiode ausgewählt; die Blumenkrone wurde longitudinal gespalten, die Staubbeutel wurden entfernt, und die Narbe wurde mit Pollen von Blüten aus loxP Pflanzen bestäubt, denen man ermöglichte, entweder auf der Pflanze oder über Nacht in einem Wasserbecher Anthesis durchzuführen (zu anthesieren). Um kontaminierenden Pollen daran zu hindern, die Narbe zu erreichen, wurde ein 4 cm langer Cocktailrührer, ein Ende verstopft mit modellierendem Ton, über die Narbe und Griffel gleiten gelassen und am Platz durch die Blumenkrone gehalten. Jede Blüte wurde markiert. Kapseln wurden bis zur Reife wachsen gelassen und dann geerntet.
Die vier loxP Pflanzen, die in den Kreuzungen zwischen heterozygoten Elternteilen verwendet wurden, hatten Segregationsverhältnisse, die das Vorhandensein von drei oder mehreren unabhängigen Loci vorschlugen. Alle verwendeten Cre Pflanzen hatten Segregationsverhältnisse, die Insertion des cre Gens an nur einem genetischen Locus anzeigen. Weil sowohl die loxP wie Cre Elternteile heterozygot waren, konnte der Samen, hergestellt aus Handbestäubungen von loxP Pollen, auf die Narben der entmannten Blüten aus Cre Pflanzen keine, beide oder entweder eine der fremden DNA Insertionen tragen. Deshalb wurden Samen, die aus Kreuzbestäubungen stammten, im Hinblick auf das Vorhandensein der zwei Markergene gescreent und dann in Bezug auf Kanamycinresistenz untersucht: eine Erscheinung von ortsspezifischer Rekombination. Um nur diejenige Nachkommenschaft aus Kreuzbestäubungen zu identifizieren, die beide Marker trug, wurden 100 bis 150 Samen aus jeder Kreuzung zuerst auf Chlorsulfuron in einem Keimungsassay gescreent. Dann wurden Sprößlingsschnitte von Keimlingen, die beständig gegenüber Chlorsulfuron waren, im Hinblick auf Wurzelbildung in hygromycinhaltigem Medium untersucht. Samen von selbstgekreuzten Cre und loxP Pflanzen wurden als Kontrollen bei jeder Stufe verwendet. Cre · Cre Samen erzeugte nur gebleichte Sprößlinge auf Chlorsulfuron, was Herbizidempfindlichkeit anzeigte. Keiner der loxP · loxP Sprößlinge wurzelte auf Hygromycin.
Ausgewählte Sprößlinge, die beständig gegenüber beiden Verbindungen waren, wurden zusammen mit Kontrollen im Hinblick auf Kanamycinresistenz unter Verwenden eines Kalluswachstumsassays getestet. Insgesamt 83 von 90 Sprößlingen (92%) aus 8 Kreuzungen, welche sechs unterschiedliche Cre und vier unterschiedliche loxP Elternteile umfaßten, wurden als resistent gegenüber Kanamycin befunden.
Tabelle 5 zeigt die Anzahl von Sprößlingen, die kanamycinresistent für jede Kreuzung waren. Bei sechs dieser Kreuzungen waren alle untersuchten Pflanzen kanamycinresistent (53/53). Nachkommenschaft aus zwei Kreuzungen ergab etwa 80% kanamycinresistente Nachkommenschaft (20/24 und 10/13). Alle der 63 untersuchten Sprößlinge aus Selbstkreuzungen der loxP und Cre Pflanzen waren empfindlich gegenüber Kanamycin. TABELLE 5 ANZAHL VON KANAMYCINRESISTENTER NACHKOMMENSCHAFT AUS KREUZUNGEN ZWISCHEN HETEROZYGOTEN Cre und loxP ELTERNTEILEN
a L3-L6 sind unabhängige heterozygote loxP Transformanten, verwendet als das Pollenelternteil
b C1-C6 sind unterschiedliche heterozygote Cre Transformanten, verwendet als das weibliche Elternteil.
c Anzahl von Nachkommenschaft, welche Kanamycinresistenz/Anzahl von getesteter Nachkommenschaft zeigt. Resistenz wurde definiert als ≥ 0,5 g Kalluswachstum in mindestens 2 der 3 getesteten Blätter. Scheiben wurden von Blättern von den distalen, mittleren und nächsten Teilen der Pflanze genommen, Resistenz über die Pflanze zu untersuchen.
Kanamycinresistente Pflanzen, die aus genetischen Kreuzungen von heterozygoten loxP Pflanzen und Cre Pflanzen resultierten, wurden mittels Southern Blots unter Nachweisen von Rekombination untersucht. Die gleiche in Abschnitt D beschriebene NptII Fragmentsonde wurde an Filter hybridisiert, die BamHI verdaute DNA, isoliert aus der Nachkommenschaft von loxP und Cre Pflanzen, enthielten. Von den sechs analysierten Nachkommenschafts DNAs, die von vier unterschiedlichen Kreuzungen einschließt ich zwei loxP Pflanzen und vier Cre Pflanzen abstammten, enthielten alle das 5,7 kb Fragment und nicht das 2,4 kb Fragment. DNA von Nachkommenschaft, die Kontrollen waren, resultierend aus der Selbstung von loxP Pflanzen, behalten das 2,4 kb Fragment, was zeigt, daß Cre für Rekombination benötigt wird. Eine weitere Sonde wurde verwendet, um zu verifizieren, daß die zwischen den zwei loxP Stellen angeordnete DNA in der Nachkommenschaft von Kreuzungen herausgeschnitten war. Das BamHI-XbaI Fragment, welches die Polyadenylierungsnucleotidsequenzregion eines kleinen Rubisco Tabakuntereinheitsgens enthält, das in Beispiel 5 beschrieben und in Fig. 1C graphisch dargestellt ist, wurde markiert und an die gleichen Filter nach Waschen unter Entfernen der ersten Sonde hybridisiert. Die DNA von Nachkommenschaft von selbstbestäubten loxP Pflanzen enthielt das 2,4 kb Fragment, was das Vorhandensein der PolyA Sequenz anzeigt, wohingegen die DNAs von Nachkommenschaft von Cre und loxP Pflanzenkreuzungen keine Hybridisierung gegenüber dieser Sonde zeigten, was bestätigte, daß Herausschneiden aufgetreten war.
Deshalb zeigen sowohl der phänotypische wie molekulare Beweis, daß Cre vermittelte ortsspezifische Rekombination in diesen Hybridtabakkeimlingen aufgetreten ist, und die phänotypischen Daten schlagen vor, daß Rekombination in 80% bis 100% der Nachkommenschaft aufgetreten ist.

G. ORTSSPEZIFISCHE REKOMBINATION IN PFLANZENZELLEN UNTER VERFOLGEN GENETISCHER KREUZUNGEN VON HOMOZYGOTEN loxP und Cre PFLANZEN

Ein verwendetes Verfahren zum Herstellen von Excisionsrekombination war, genetisch die Cre Rekombinase mit dem loxP-polyA-loxP DNA Fragment, welches in das Pflanzengenom integriert ist, durch sexuelle Hybridisierung von homozygoten loxP und Cre Pflanzen zu vereinigen. Kreuzungsbestäubung unter Verwenden von homozygoten Eltern gewährleistet das Vorhandensein sowohl von loxP wie cre DNA Insertionen in jeder Nachkommenschaft. Pflanzen, die homozygot in Bezug auf das Markergen sind, das an loxP- polyA-loxP gekoppelt ist, und Pflanzen, die homozygot in Bezug auf das Markergen sind, das an cre gekoppelt ist, wurden identifiziert und verwendet, ortsspezifische Rekombination zwischen zwei loxP Stellen herzustellen.
Neun transgene Tabakpflanzen, welche das Hpt Markergen und cre integriert an einem einzelnen Locus hatten, wie durch eine 3 : 1 Segregation der Hygromycinresistenz in einem Samenkeimungsassay gemessen, wurden für weitere Kreuzungen gewählt. R1 Samen wurden auf MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 20-50 mg/l Hygromycin enthielt, um im Hinblick auf Pflanzen zu selektieren, welche das übertragene Hygromycinresistenzgen enthielten. Keimlinge, welche fähig waren, sich auf dem hygromycinhaltigem Medium zu entwickeln, wurden auf Erde übertragen, und es wurde ihnen ermöglicht, bis zur Reife in der Wachstumskammer zu wachsen, welche für einen 14 h. 24ºC Tag-, 10 h, 20ºC Nachtzyklus mit annähernd 80% relativer Feuchtigkeit unter gemischten kalten weißen fluoreszierenden und weißglühenden Lichtern gehalten wurde. Beutel wurden auf einzelne Blütenstände gesetzt, um Selbstbefruchtung zu gestatten. Samen (R2) von verschiedenen Pflanzen (R1), abstammend von einzelnen Transformanten (R0), wurden gesammelt und Segregationsanalyse ausgesetzt, indem auf MX&supmin; Medium, enthaltend 50 mg/l Hygromycin, plattiert wurde. Von R1 Pflanzen, welche heterozygot waren, würde erwartet werden, daß sie hygromycinresistente Nachkommenschaft mit einem Verhältnis von 3 : 1 herstellten. Andererseits würden R1 Pflanzen, welche homozygot waren, 100% hygromycinresistente Nachkommenschaft nach Selbstbefruchtung ergeben. Unter Verwenden dieses Verfahrens wurden homozygote Samenvorräte von jeder der gewählten Transformanten identifiziert.
Fünf transgene Tabakpflanzen, welche das resistente ALS Markergen und loxP- polyA-loxP integriert an einem einzelnen Locus hatten, wie durch eine 3 : 1 Segregation von Chlorsulfuronresistenz in einem Samenkeimungsassay gemessen, wurden für weitere Kreuzungen gewählt. R1 Samen wurde auf MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 100-300 mg/l Chlorsulfuron enthielt, um im Hinblick auf Pflanzen auszuwählen, welche die übertragenen Chlorsulfuronresistenzgene enthielten. Keimlinge, welche fähig waren, sich auf dem chlorsulfuronhaltigen Medium zu entwickeln, wurden auf Erde übertragen, und man ließ sie bis zur Reife in der Wachstumskammer unter den zuvor beschriebenen Bedingungen wachsen. Wie zuvor angegeben, wurden Beutel auf einzelne Blütenstände gelegt, um Selbstbefruchtung zu gestatten. Samen (R2) von verschiedenen Pflanzen (R1), die von einzelnen Transformanten (R0) abstammten, wurden gesammmelt und Segregationsanalyse durch Plattieren auf MX&supmin; Medium ausgesetzt, welches 300 mg/l Chlorsulfuron enthielt. Man würde von R1 Pflanzen, welche heterozygot waren, erwarten, daß sie chlorsulfuronbeständige Nachkommenschaft mit einem Verhältnis von 3 : 1 erzeugten. Andererseits würden R1 Pflanzen, welche homozygot waren, 100% chlorsulfuronresistente Nachkommenschaft nach Selbstbefruchtung ergeben. Unter Verwenden dieses Verfahrens wurden homozygote Samenvorräte von jeder der gewählten Transformanten identifiziert.
Pollen von einer homozygoten Cre Pflanze wie auch aus einer WT Pflanze wurden verwendet, drei homozygote loxP Pflanzen zu bestäuben, wobei jede von einer unabhängigen primären Transformante abstammte. Um zu gewährleisten, daß die Hybridsamen beide Marker trugen, wurden Samen aus loxP · Cre Kreuzungen auf Chlorsulfuron und Hygromycin gekeimt, getrennt und vereinigt. Alle gekeimten Sprößlinge brachten echte Blätter und Wurzeln, was 100% Resistenz gegenüber beiden Selektionen anzeigte. Wie erwartet, waren die Nachkommenschaften einer loxP · WT Kreuzung alle chlorsulfuronresistent aber hygromycinempfindlich.
Hybrid loxP · Cre Samen aus den gleichen zuvor untersuchten Vorräten wurden gekeimt und auf MX&supmin; Medium gezüchtet (Tabelle 2). Gewebe von den ersten bis dritten Blättern wurde in Bezug auf Wachstum auf Kanamycin in einem Kallusinduktionsassay bei 25 Tagen nach Imbibition untersucht, und Gewebe von den vierten bis sechsten Blättern wurde bei 40 Tagen nach Imbibition untersucht. Das Gesamtgewicht der Blattscheiben nach drei Wochen von Kalluswachstum ist in Fig. 3 gezeigt. Alle untersuchten sieben loxP · WT Kontrollnachkommenschaften waren gegenüber Kanamycin empfindlich. Die meisten der 28 Nachkommenschaften aus den homozygoten loxP · Cre Kreuzungen waren kanamycinresistent. In zwei Kreuzungen war 100% der Nachkommenschaft kanamycinresistent in mindestens 5 von 6 getesteten Blättern (8/8 bzw. 4/4). Vierzehn aus 16 Nachkommenschaften in einer anderen Kreuzung waren resistent gegenüber Kanamycin in mindestens vier von sechs getesteten Blättern. Die zwei Pflanzen, welche kanamycinempfindlich erschienen, erzeugten mehr Kallus als es die Kontrollen taten, aber zeigten nicht das Ausmaß von Kalluswachstum, das mit Resistenz verbunden ist (Fig. 3).
In Fig. 3. C7, L7 und L8 sind einzelne locushomozygote Pflanzen, die von C3, L1 und L2 primären Transformanten abstammmten. L9 ist eine homozygote loxP Pflanze, abstammend von einer primären Transformante, die nicht in vorhergehenden Experimenten verwendet war. Jeder Balken stellt das Gewicht von vier Blattscheiben von einem einzelnen Sproß, eine aus jedem der ersten zwei Blätter und zwei Scheiben aus dem dritten Blatt, nach Inkubation auf Kallusinduktionsmedium (Tabelle 2) für drei Wochen dar. Etwa 0,2 g wird von den ursprünglichen Blattscheiben beigetragen. Die Sternchen markieren zwei Nachkommenschaften, die Kanamycinempfindlichkeit zeigen.
Um die Anzahl von Hybridnachkommenschaften zu bestimmen, in der ortsspezifische Rekombination aufgetreten war, wurden die ersten, zweiten und dritten Blätter aus 94 Sprößlingen von einer Kreuzung auf Kanamycinresistenz untersucht. Einundsiebzig von den 94 Sprößlingen waren in allen drei untersuchten Blättern kanamycinresistent, was angab, daß Rekombination früh in der Entwicklung in 75% der Nachkommenschaft aufgetreten war. Jedoch scheint Rekombination auch später in der Entwicklung aufgetreten zu sein, insofern, als daß 90% der Sprößlinge (85/94) Resistenz in dem dritten Blatt zeigte. Um das Vorkommen von spontaner Kanamycinresistenz einzuschätzen, wurden 14 selbstgekreuzte loxP und 13 selbstgekreuzte Cre Sprößlinge und 16 loxP · WT Nachkommenschaften in einem Callusinduktionsassay getestet: keine war resistent. Dieses bestätigt, daß die loxP Konstruktion stabil durch Meiose ist, selbst wenn die Pflanze, die es trägt, sexuell hybridisiert wird.

H. DELETION EINES SULFONYLHARNSTOFF-RESISTENTEN ACETOLACETATSYNTHASE (ALS) MARKERS VON TRANSGENEM TABAK UNTER VERWENDEN DES loxP-cre SYSTEMS

BEISPIEL 7

Ein Sulfonylharnstoff-(SU)Resistenzmarkergen wurde aus transgenen Tabakpflanzen eliminiert, wobei das chimäre 35S/P-GUS (GUS = β-GLUCURONIDASE) Gen in dem Genom belassen wurde. Ein Plasmid wurde konstruiert, welches ein SU-resistentes ALS Gen angeordnet zwischen direkt orientierten loxP Stellen enthielt. Der Vektor pTZ19R (Pharmacia. Inc.. Piscataway. New Jersey) wurde mit HindIII verdaut, und ein synthetischer Oligonucleotidlinker mit einem nicht funktionellen HindIII Ende und XhoI, Sa1I, HindIII und Asp718 Stellen wurde hinzugegeben. Dieses Plasmid wurde mit HindIII verdaut und mit dem HindIII Fragment von pKNKloxA, beschrieben in Beipiel 6, das direkt orientierte loxP Stellen an jedem Ende hat, ligasiert, wodurch pTZlox2 erzeugt wurde. Das sich ergebende Plasmid wurde mit XbaI verdaut, wobei diese Stelle zwischen den lox Stellen angeordnet ist, und ein XbaI Fragment, welches ein chimäres SU-resistentes ALS Gen enthält, wurde hinzugegeben. Dieses chimäre SU-resistente ALS Gen ist als ein XbaI Fragment in einem pTZ Vektor, genannt pMHP35, vorhanden. Es enthält das CaMV 35S Promotor/Cab22L Bg1II-NcoI Fragment, das von Harpster et al. beschrieben wird [Mol. Gen. Genet. 212: 182-190 (1988)] und die Arabidopsis ALS Codierungs- und 3'Regionen, beschrieben von Mazur et al. [Plant Physiol. 85: 1110-1117 (1987)], das mutiert war, so daß es eine SU-resistente Form von ALS codiert. Die Mutationen, eingeführt durch stellengesteuerte Mutagenese, sind diejenigen, die in dem Tabak SU-resistenten Hra Gen, beschrieben von Lee et al. [EMBO J. 5: 1241-1248 (1988)] vorhanden sind. Das sich ergebende Plasmid, in dem das SU-resistente ALS Gen zwischen loxP Stellen ist, wurde pTZlox2FA genannt. Als nächstes wurde das gesamte lox- ALS-lox Fragment isoliert, folgend Sa1I und Asp718 Verdauung, und in den binären Vektor pZS94 kloniert, der mit den gleichen Enzymen unter Erzeugen von pZ4loxA verdaut worden war.
pZS94 enthält den Replikationsursprung und Ampicillinresistenzgen aus pBR322 für die Beibehaltung und Selektion in E. coli. Es enthält die Replikations- und Stabilitätsregionen des Pseudomonas aeruginosa Plasmids pVS1, beschrieben von Itoh et al. [Plasmid 11: 206-220 (1984)], welche für Replikation und Beibehaltung des Plasmids in Agrobakterium benötigt werden. Auch enthalten sind ein T-DNA linkes Grenzfragment des Octopin Ti Plasmids pTiA6 und ein rechtes Grenzfragment, welches von TiAch5 abstammt, beschrieben von von den Elzen et al. [Plant Molec. Biol. 5: 149-154 (1985)]. Zwischen diesen Grenzen sind ein LacZ Gen und die nur einmal vorhandenen Restriktionsstellen HindIII, Sa1I, BamHI, SmaI, Asp718 und EcoRI. abstammend von pUC18. pZ4loxA wurde mit Sa1I verdaut, und ein Sa1I Fragment, welches ein chimäres 35S/P-GUS Gen enthielt, wurde hinzugegeben. Dieses chimäre GUS Gen enthält das zuvor beschriebene 35S Promotor/Cab22L Fragment, die von Clonetech verfügbare GUS Codierungsregion und die in Beispiel 1 beschriebene Nos 3' Region. Das sich ergebende Plasmid wurde pZ4loxAG genannt und ist in Fig. 4 gezeigt.
In Fig. 4 enthält der pZS94 binäre Vektor ein chimäres 35S/P-ALS Gen, das durch direkt orientierte loxP Stellen gebunden ist, und ein chimäres 35S/P-GUS-Nos 3'Gen. Die loxP Stellen sind durch Pfeilköpfe angegeben.
pZ4loxAG wurde in A. tumefaciens LBA4404 durch direkte DNA Aufnahme unter Verfolgen des in Plant Molecular Biology Manual [SB Gelvin et al., Herausgeber Kluwer Academic Press PMAN-A3/7 (1988) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Das Vorhandensein des binären Vektors in Agrobakteriumkolonien, ausgewählt auf minA Medium mt't Sucrose (siehe Tabelle 1), welches 100 ug/ml Carbenicillin enthält, wurde durch Restriktionsverdauungen von miniprep DNA verifiziert. Der sich ergebende Agrobakteriumstamm wurde verwendet, Tabaktransformanten zu erhalten, wie in Materials and Methods beschrieben, wobei Resistenz bis 25 ppb Chlorsulfuron für die Selektion von Transformanten, wie im nachfolgenden beschrieben, verwendet wurde.
Blattscheiben wurden beimpft, indem sie mehrere Minuten in 20 ml einer 1 : 20 Verdünnung der Über-Nacht-Kultur von Agrobakterium getaucht wurden. Die Kultur wurde gestartet, indem 5 ml YEP Medium (Tabelle 8), welches 100 mg/l Carbenicillin enthielt, mit einer einzigen Bakterienkultur beimpft wurde. Die Kultur wurde annähernd 17-20 Stunden in einer Glaskulturröhre in einem New Brunswickplattformschüttler, der bei 28ºC gehalten wurde, gezüchtet.
Nach Animpfung wurden die Blattscheiben in Petrischalen gebracht, die .1N1B Agarmedium enthielten (Tabelle 2) und mit Parafilm verschlossen. Die Petrischalen wurden unter gemischten fluoreszierenden und "Gro und Sho" Pflanzenlichtern (General Electric) 2-3 Tage in einem bei annähernd 25ºC gehaltenen Kulturraum inkubiert.
Um die Blattscheiben von Agrobakterium zu befreien und in Bezug auf Wachstum von transformierten Tabakzellen auszuwählen, wurden die Blattscheiben auf frisches .1N1B Medium übertragen, welches 500 mg/l Cefotaxim und 25 ppb Chlorsulfuron enthielt. Cefotaxim wird als eine gefrorene 200 mg/ml Stammlösung gehalten und aseptisch (filtersterilisiert durch ein 0,45 um Filter) zu den Medien nach Autoklavieren gefügt. Eine gefrorene Chlorsulfuronstammlösung wurde hergestellt, indem zuerst eine 0,2 mg/ml Lösung in 0,01 N NH&sub4;OH Lösung hergestellt wurde, welche dann 1 : 10 mit entionisiertem Wasser verdünnt und in die autoklavierten Medien filtersterilisiert wurde. Blattscheiben wurden unter der zuvor beschriebenen Wachstumsbedingung 18 Tage inkubiert und dann in frische Medien der gleichen Zusammensetzung übertragen.
Fünfzehn Tage später wurden Sprößlinge, die sich auf Medium entwickelten, welches 25 ppb Chlorsulfuron enthielt, mit einem sterilen Skalpel herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gepflanzt, welches 500 mg/l Cefotaxim und 25 ppb Chlorsulfuron enthielt. Wurzelbildung wurde in 2 Wochen aufgezeichnet.
Integration einer intakten GUS/loxP/Hra DNA Sequenz in dem Pflanzengenom wurde durch einen Kallusinduktionsassay für Chlorsulfuronresistenz und einen GUS Enzymaktivitätsassay verifiziert. Ein Blattstück, annähernd 0,2 cm² an Größe, wurde aus jedem der verschiedenen ausgewählten gewurzelten, herausgeschnittenen Sprößlingen zum Testen in Bezug auf GUS Aktivität entfernt. Vorhandensein von GUS Aktivität wurde bestimmt, indem jedes Blattstück in einer Lösung (Tabelle 6) zerkleinert wurde, welche 1 mg/ml X-Gluc (5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-Gulcuronid) enthielt, und die Gewebe 1-16 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden. Die Bildung eines blauen Niederschlags zeigte das Vorhandensein von GUS Aktivität.

TABELLE 6

LÖSUNG FÜR X-Gluc

Stammlösungen Volumen (ml)
0,2 M NaPO&sub4; Puffer, pH 7,0 25,0
(0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;: 62 ml
0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;: 38 ml)
entionisiertes Wasser 24,0
0,1 M K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] 0,25
0,1 M K&sub4;[Fe(CN)&sub6; . 3H&sub2;O 0,25
1,0 M Na&sub2;EDTA 0,50
Blätter von fünf ausgewählten Pflanzen, welche GUS Aktivität zeigten, wurden aus den gewurzelten, herausgeschnittenen Sprößlingen entfernt, Resistenzspiegel gegenüber Chlorsulfuron in einem Kallusinduktionsassay auf selektiven Medien zu bestimmen. Um Kallusbildung zu initiieren, wurden Blätter herausgeschnitten, und 10 Blattscheiben, 8 mm an Durchmesser, wurden unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt und wurden auf Kallusinduktionsmedium plattiert, welches 25 ppb Chlorsulfuron und 250 ug/l Cefotaxim enthielt. Wildtyp wurde als eine Kontrolle verwendet. Blattscheiben und der hinzugefügte Kallus wurden gewogen; alle fünf Transformanten zeigten Resistenz gegenüber Chlorsulfuron, wie in Tabelle 7 dargestellt.
Um in Bezug auf Excision des ALS Markergens zu testen, wurden die fünf chlorsulfuronresistenten unabhängigen Transformanten, die GUS Aktivität zeigten, rücktransformiert, wodurch das cre Gen, wie folgt, eingeführt wurde. Es wurden gesunde Blätter aus diesen fünf transgenen Tabakpflanzen und einer Wildtyppflanze, die in Magenta GA7 Kesseln (Magenta Corp., Chicago, IL, USA) wuchs, geerntet. Blattscheiben wurden aus diesen sterilen Blättern unter Verwenden eines sterilen Papierlochers hergestellt, mit Agrobakterium beimpft, welches entweder das -/Hpt oder das Cre/Hpt-B Plasmid (Beipiel 4) beherbergte, drei Tage auf .1N1B inkubiert, auf .1N1B Medium gebracht, welches 500 mg/l Cefotaxim und 30 mg/l Hygromycin enthielt, und 2 Wochen inkubiert. Blattscheiben wurden dann auf frisches Medium der gleichen Zusammensetzung für zwei Wochen übertragen, dann auf MX&supmin; Medium, welches 500 mg/l Cefotaxim und 30 mg/l Hygromycin enthielt, für Sprößlingsbildung übertragen. Als Sprößlinge erschienen, wurden sie aus der Blattscheibe herausgeschnitten und in MX&supmin; Medium gebracht, welches 500 mg/l Cefotaxim und 30 mg/l Hygromycin enthielt. Sprößlinge wurden aus unterschiedlichen Blattscheiben genommen, wodurch gewährleistet wurde, daß sie aus unabhängigen Transformationsereignissen resultierten. Sprößlinge, welche wurzelten, wurden im Hinblick auf GUS Aktivität untersucht, wobei X-Gluc, wie zuvor beschrieben, verwendet wurde. Dreiundsechzig getestete Sprößlinge hatten GUS Enzymaktivität, wohingegen drei nicht GUS Aktivität zeigten. Die Eltern pZ4loxAG Pflanze dieser drei Rücktransformanten scheint in Bezug auf GUS Expression chimär zu sein.
Blattscheiben wurden aus jeder Pflanze genommen und in einem Kallusinduktionsassay, wie zuvor beschrieben, getestet. Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Einundneunzig Prozent aller Pflanzen, die aus Rücktransformation mit -/Hpt resultierten, verblieben, wie erwartet, chlorsulfuronresistent, weil die Cre Rekombinase nicht eingeführt war. Fünfundneunzig Prozent der Pflanzen, die aus Rücktransformation von pZ4LoxAG Pflanzen mit Cre/Hpt-B resultierten, zeigten Empfindlichkeit gegenüber Chlorsulfuron; nur zwei von 38 Pflanzen verblieben chlorsulfuronresistent. Diese Daten zeigen, daß das sulfonylharnstoff-resistente ALS Gen nicht länger in einer Mehrheit jener Pflanzen funktioniert, welche die cre Codierungsregion erhielten, was vorschlägt, daß es durch cre-vermittelte Rekombination an loxP Stellen herausgeschnitten worden ist.
Um zu verifizieren, daß Excision aufgetreten ist, wurde aus Rücktransformanten hergestellte DNA auf Southern Blots analysiert. Die DNA wurde mit EcoRI vor Gelelektrophorese verdaut und auf Filter übertragen. Ein aus dem 35S Promotor bestehendes DNA Fragment wurde hergestellt, radioaktiv markiert, und auf die geblottete Pflanzen DNA hybridisiert. Eine 6 kb Bande wurde in Rücktransformanten nachgewiesen, die nicht cre erhielten. Diese Bande stellt ein DNA Fragment dar, das sich von einer EcoRI Stelle, die 3' zu der GUS Codierungsregion angeordnet ist, zu einer EcoRI Stelle erstreckt, die in der ALS Codierungsregion (siehe Fig. 4) angeordnet ist. Es umfaßt die GUS Codierungsregion, den 35S Promotor, der Expression von GUS reguliert, den 35S Promotor, der Expression von ALS reguliert, und einen Teil der ALS Codierungsregion. Eine 3,2 kb Bande wurde in DNA aus Pflanzen nachgewiesen, die cre erhielten. Diese Bande stellt ein DNA Fragment dar, das sich von der EcoRI Stelle, die 3' zu der GUS Codierungsregion angeordnet ist, zu einer EcoRI Stelle, die gerade außerhalb der distalen loxP Stelle angeordnet ist, erstreckt. Es umfaßt die GUS Codierungsregion und den GUS Expression regulierenden 35S Promotor. Die Verschiebung der nachgewiesenen Fragmentgröße von 6 kb zu 3,2 kb verifiziert die Excision des DNA Segments, das zwischen den loxP Stellen angeordnet ist, einschließend die ALS Codierungsregion und den 35S Promotors, der deren Expression reguliert. TABELLE 7 ANZAHL VON CHLORSULFURONRESISTENTEN UND EMPFINDLICHEN¹ PFLANZEN, GEWONNEN NACH RÜCKTRANSFORMATION MIT -/Hpt UND Cre/Hpt-B, WIE DURCH EINEN KALLUSINDUKTIONSASSAY BESTIMMT
¹ Resistent ist definiert als Durchschnittsgewicht pro Blattscheibe ≥ 1,0 g, und empfindlich ist definiert als Durchschnittsgewicht pro Blattscheibe ≤ 0,2 g
² Eine dieser Transformanten war resistent in einem Experiment und empfindlich in einem anderen Experiment

BEISPIEL 8

DELETION EINES SU-RESISTENTEN ALS MARKERGENS AUS TRANSGENER ARABIDOPSIS UNTER VERWENDEN DES loxP-cre SYSTEMS

Ein Sulfonylharnstoff-(SU) Resistenzmarkergen wurde aus transgenen Arabidopsispflanzen eliminiert, wobei das chimäre 35S/P-GUS Gen in dem Genom belassen wurde. Plasmidkonstruktion und Transformation von Agrobakterium sind in Beispiel 7 beschrieben.
Aseptische Standardtechniken für die Manipulation von sterilen Medien und sterilen Pflanzen/Bakterienkulturen werden verfolgt, einschließlich der Verwendung einer Laminarfließhaube für alle Transfers. Zusammensetzungen der Kulturmedien sind in Tabelle 8 aufgelistet. Sofern nicht anders angegeben, wurden 25 · 100 mm Petriplatten, verschlossen Laminarfließhaube für alle Transfers. Zusammensetzungen der Kulturmedien sind in Tabelle 8 aufgelistet. Sofern nicht anders angegeben, wurden 25 · 100 mm Petriplatten, verschlossen mit Filterband (Carolina Biological Supply Co., Burlington, NC), für Pflanzengewebekulturen verwendet. Inkubation von Pflanzengewebekulturen war bei 23ºC unter konstanter Beleuchtung mit gemischten fluoreszierenden und "Gro und Sho" Pflanzenlichtern (General Electric), sofern nicht anders angegeben.
Die Quelle von Explantaten waren in vitro gezüchtete Wurzeln von Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, geographische Art Wassilewshija. Samen wurden 10 Min in einer Lösung von 50% kommerzieller Bleiche mit 0,1% SDS sterilisiert, drei- bis fünfmal mit sterilem Wasser gespült, gründlich auf sterilem Filterpapier getrocknet, und dann wurden 2-3 Samen in 50 ml flüssigem Gamborg's B5 Medium (Gibco #560-1153) in 250 ml Belco Kolben ausgesäht. Die Kolben wurden bedeckt, auf eine Umlaufschüttelmaschine mit 70-80 Upm gesetzt und 3-4 Wochen inkubiert.
Vor der Animpfung mit Agrobakterium wurden Wurzelgewebe auf Kallusinduktionsmedium (MSKig. infra) kultiviert. Wurzeln wurden geerntet, indem die Wurzelmasse aus dem Belcokolben entfent wurde, sie in eine Petrischale gebracht wurde, und unter Verwenden einer Zange kleine Bündel von Wurzeln aus der Wurzelmasse gezogen wurden, und sie auf MSKig Medium gesetzt wurden. Petrischalen wurden mit Filterband verschlossen und vier Tage lang inkubiert.
Kulturen von Agrobakteriumzellen, die das binäre Plasmid pZ4loxAG enthielten wie zuvor beschrieben, wurden in 5 ml YEP Medium gezüchtet, welches 100 mg/l Carbenicillin enthielt. Kulturen von Agrobakteriumzellen, die das binäre Plasmid Cre/Hpt-B (Beispiel 3) enthielten, wurden in 5 ml YEP Medium gezüchtet, welches 5 mg/l Tetracyclin enthielt. Die Kulturen wurden annähernd 17-20 Stunden in Glaskulturröhren in einem bei 28ºC gehaltenen New Brunswick Plattformschüttler (225 Upm) gezüchtet. Vorkultivierte Wurzeln wurden in 0,5 cm Segmente geschnitten und in einen 100 um Filter gebracht, hergestellt aus einem Tri- Pour Becher (VWR Scientific, San Francisco, CA USA) und Drahtgewebe, welcher in eine Petrischale gesetzt wird. Wurzelsegmente wurden mehrere Minuten in 30-50 ml einer 1 : 20 Verdünnung der Über-Nacht Agrobakteriumkultur unter periodischem sanften Mischen beimpft. Angeimpfte Wurzeln wurden auf steriles Filterpapier unter Abziehen des meisten der Flüssigkeit übertragen. Kleine Bündel von Wurzeln, bestehend aus mehreren Wurzelsegmenten, wurden auf MSKig Medium, enthaltend 100 uM Acetosyringone (3',5'-Dimethoxy-4'- hydroxyaceto-phenon. Aldrich Chemical Co., Milwaukee. WI, USA) gebracht. Petriplatten wurden mit Parafilm oder Filterband verschlossen und zwei bis drei Tage inkubiert.
Nach Infektion wurden Wurzelsegmente gespült und auf Sprößlingsinduktionsmedium mit Antibiotika, wie im nachfolgenden detailliert beschrieben, übertragen. Wurzelbündel wurden in eine 100-um Filtereinheit (zuvor beschrieben) gebracht und mit 30-50 ml flüssigem MSKig Medium gespült. Das Filter wurde heftig in der Lösung geschüttelt, um zu helfen, das Agrobakterium zu entfernen, auf eine saubere Petrischale übertragen und erneut gespült. Wurzeln wurden auf ein steriles Filterpapier geblottet, und Bündel von Wurzeln wurden auf MSg (infra) Medium gebracht, welches 500 mg/l Vancomycin und entweder 25 ppb Chlorsulfuron (pZ4loxAG) oder 15 mg/l Hygromycin (Cre/Hpt und -/Hpt) enthielt. Platten wurden mit Filterband verschlossen und 12 bis 14 Tage lang inkubiert.
Grüne Knötchen und kleine Wurzelorgananlagen wurden bei etwa 2-3 Wochen sichtbar. Die Explantate wurden entweder intakt belassen oder wurden in zahlreiche Stücke zerbrochen und auf GM Medium gebracht, welches 200-300 mg/l Vancomycin und entweder 25 ppb Chlorsulfuron (pZ4loxAG) oder 10 mg/l Hygromycin (Gre/Hpt und -/Hpt) für weitere Wurzelentwicklung enthielt. Platten wurden entweder mit zwei Stücken Band oder mit Filterband verschlossen. Als sie sich entwickelten, wurden einzelne Sprößlinge aus dem Kallus isoliert und wurden auf MSRg Medium gebracht, welches 100 mg/l Vancomycin und entweder 25 ppb Chlorsulfuron (pZ4loxAG) oder 10 mg/l Hygromycin (Cre/Hpt und -/Hpt) enthielt. Platten wurden, wie zuvor beschrieben, verschlossen und sieben bis 10 Tage lang inkubiert. Sprößlinge wurden dann auf GM Medium übertragen, welches 100-200 mg/l Vancomycin in 25 · 100 Petrischalen oder Magenta G7 Kessel enthielt. Viele primäre Transformanten (T1), welche auf einzelne Container übertragen wurden, setzten Saat (T2).
T2 wurde aus ausgewählten vermeintlichen Transformanten geerntet und auf GM Medium gesäht, welches entweder 25 ppb Chlorsulfuron (pZ4loxAG) oder 10-30 mg/l Hygromycin (Cre/Hpt und -/Hpt) enthielt. Platten wurden 2 oder mehrere Tage bei 4ºC kalt behandelt und dann 10 bis 20 Tage bei 23ºC unter konstanter Beleuchtung, wie zuvor beschrieben, inkubiert. Keimlinge wurden als resistent (grüne, echte Blätter entwickelten sich) und empfindlich (es entwickelten sich keine echten Blätter) markiert.
Ausgewählte chlorsulfuron- oder hygromycinresistente T2 Keimlinge wurden auf Erde transplantiert und wurden bis zur Reife bei 23ºC Tageszeit (14 Stunden), 18ºC Nachtzeit (10 Stunden) bei 65-80% relativer Feuchtigkeit gezüchtet.
Genetische Kreuzungen der Cre/Hpt-B Pflanzen (hygromycinresistent) und pZ4loxAG Pflanzen (chlorsulfuronresistent) wurden durchgeführt, und der sich ergebenden Saat gestattet, zu reifen. Saat wurde gesammelt, sterilisiert, auf GM (Tabelle 8) plattiert, welches 30 mg/l Hygromycin enthielt, und Gewebe aus den Sprößlingen im Hinblick auf GUS Aktivität mit X-gluc, wie zuvor beschrieben, getestet. Jenen Sprößlinge, die sowohl Hygromycinresistenz wie GUS Aktivität zeigten (was anzeigte, daß sie sowohl das cre Gen wie die loxP Konstruktion erhielten), wurde gestattet, zu wachsen, bis Stengelgewebe für einen Kallusinduktionsassay erhalten werden konnte. Stengelgewebe wurden aus ausgewählten Transformanten erhalten und auf MSKig Medium mit und ohne 25 mg/l Chlorsulfuron gebracht. Kalluswachstum wurde in drei Wochen aufgezeichnet. Man ließ pZ4LoXAG Pflanzen sich selbst bestäuben, Samen wurde gesammelt, sterilisiert, auf GM plattiert, welches 25 ppb Chlorsulfuron enthielt, und als Kontrollen verwendet (siehe Tabelle 9 für Ergebnisse). Empfindlichkeit gegenüber Chlorsulfuron in der Mehrheit von GUS positiven Keimlingen, welche aus Kreuzungen zwischen Cre/Hpt-B und pZ4LoxAG Pflanzen resultieren, zeigt, daß in diesen Keimlingen das SU-resistente ALS Markergen nicht länger funktionierte, was vorschlug, daß es durch Cre-vermittelte Rekombination zwischen loxP Stellen herausgeschnitten worden ist.
Chlorsulfuronempfindliche Pflanzen wurden in Erde gesetzt, und man ließ sie reifen. T3 Samen wird gesammelt, sterilisiert und auf GM Medium mit oder ohne 30 mg/l Hygromycin oder 25-100 ppb Chlorsulfurom keimen gelassen. Platten wurden mit Filterband verschlossen, 2 oder mehrere Tage bei 4ºC kalt behandelt und dann 10 bis 20 Tage bei 23ºC unter konstanter Beleuchtung, wie zuvor beschrieben, inkubiert. Keimlinge wurden als resistent und empfindlich markiert, und die Ergebnisse aufgezeichnet. Repräsentative Keimlinge werden in Bezug auf GUS Empfindlichkeit gescreent. Einige Keimlinge zeigen GUS Aktivität, sind aber nicht gegenüber Chlorsulfuron resistent, was anzeigt, daß das SU resistente ALS Markergen nicht länger funktioniert, was vorschlägt, daß es durch Cre- vermittelte Rekombination zwischen lox P Stellen herausgeschnitten worden ist.
Um zu verifizieren, daß Excision aufgetreten ist, wird aus diesen Pflanzen hergestellte DNA auf Southern Blots analysiert. Die DNA wird mit EcoRI vor Gelelektrophorese verdaut und auf Filter übertragen. Ein DNA Fragment, welches aus dem 25S Promotor besteht, wird hergestellt, radioaktiv markiert und an die geblottete Pflanzen DNA hybridisiert. Eine 6 kb Bande wird in Rücktransformanten nachgewiesen, die nicht cre erhielten. Diese Bande zeigt ein DNA Fragment, das sich von einer EcoRI Stelle, angeordnet 3' zu der GUS Codierungsregion, bis zu einer EcoRI Stelle erstreckt, welche in der ALS Codierungsregion angeordnet ist (siehe Fig. 4). Es umfaßt die GUS Codierungsregion, den 35S Promotor, der Expression von GUS reguliert, den 35S Promotor, der Expression von ALS reguliert, und einen Teil der ALS Codierungsregion. Eine 3,2 kb Bande wird in DNA aus Pflanzen nachgewiesen, die cre erhielten. Diese Bande zeigt ein DNA Fragment, das sich von der EcoRI Stelle, die 3' zu der GUS Codierungsregion angeordnet ist, bis zu einer EcoRI Stelle erstreckt, die gerade außerhalb der distalen loxP Stelle angeordnet ist. Es umfaßt die GUS Codierungsregion und den 35S Promotor, der GUS Expression reguliert. Die Verschiebung der nachgewiesenen Fragmentgröße von 6 kb zu 3,2 kb verifiziert die Excision des DNA Fragments, das zwischen den loxP Stellen angeordnet ist, einschließend die ALS Codierungsregion und den 35S Promotor, der deren Expression reguliert.

TABELLE 8

MEDIUMZUSAMMENSETZUNG

YEP MEDIUM PRO LITER
Bacto Pepton 10,0 g
Bacto Hefeextrakt 10,0 g
NaCl 5,0 g
Agar (wahlfrei) 15,0 g
pH 7,0

GRUNDMEDIUM

1 pkg Murashige und Skoog Minimal Organics Medium ohne Sucrose (Gibco #510 oder Sigma M6899)
10 ml Vitaminergänzung
0,05% MES 0,5 g/l
0,8% Agar 8 g/l
pH 5,8

VITAMINERGANZUNG 100X Stammlösung

10 mg/l hiamin
50 mg/l Pyridoxin
50 mg/l Nikotinsäure
GM = Keimungsmedium
Grundmedium
1% Sucrose 10 g/l
MSKig = Kallusinduktionsmedium
Grundmedium
2% Glucose 20 g/l
0,5 mg/l 2,4-D 2,3 uM
0,3 mg/l Kinetin 1,4 uM
5 mg/l IAA 28,5 uM
MSg = Keimlingsinduktionsmedium
Grundmedium
2% Glucose 20 g/l
0,15 mg/l Indol-3-Essigsäure 0,86 uM
(IAA)
5,0 mg/l N&sup6; - (Δ&sub2; Isopentenyl)-Adenin 2iP 24,6 uM
MSRg = Keimlingsinduktionsmedium
Grundmedium
2% Glucose 20 g/l
12 mg/l Indol-3-Buttersäure 58,8 uM
(IBA)
0,1 mg/l Kinetin 0,46 uM TABELLE 9 ERGEBNISSE VON ASSAYS VON KEIMLINGEN, WELCHE AUS KREUZUNGEN ZWISCHEN pZ4loxAG und Cre/Hpt-B ARABIDOPSISPFLANZEN RESULTIEREN

BEISPIEL 9

EXPRESSION VON Cre AUS DEM CHEMISCH REGULIERTEN KORNPROMOTOR In2-2

Cre Expression wurde unter Kontrolle des In2-2 Promotors gebracht, der durch N-(Aminocarbonyl)-2-chlorbenzolsulfonamid induziert wird, indem das chimäre Gen konstruiert wird: In2-2/P-cre-Nos 3'. Das Ausgangsmaterial für die Konstruktion war das Plasmid Cre/Hpt-A, welches in Beispielen 1 und 2 beschrieben war. Cre/Hpt-A wurde mit HindIII und Sa1I verdaut, und das DNA Fragment, das die cre Codierungsregion und das Nos 3' enthielt, wurde isoliert. Dieses HindIII-Sa1I Fragment wurde in den Vektor Bluescript SK (+) (Stratagene. Katalog #212205) subkloniert, der mit HindIII und Sa1I verdaut worden war und entphosphoryliert, was das als pBSCre bezeichnete Plasmid ergab.
Die Zugabe des In2-2 Promotors zu pBSCre wurde durchgeführt, indem Plasmide HPH 463 dam(-) und 2-2(3,9) verwendet wurden, welche in WO 90/11361 beschrieben worden sind. Das Plasmid 2-2(3,9) ist ein pUC18 Plasmid, welches ein 3,9 kb Sa1I Fragment enthält, das von dem genomischen Klon abstammt, der das 2-2 Gen enthält. Das 3,9 kb Fragment umfaßt 3,6 kb Promotorsequenz, die 5' der Translationsstartstelle angeordnet ist, und 180 bp der Codierungsregion für das 2-2 Protein. Das Plasmid pHPH 463 dam(-) ist ein Bluescript S/K(+) Plasmid, welches einen chimären Promotor enthält, der 136 bp des 2-2 Promotors, verbunden mit dem 5' nicht translatierten Leader aus der Maisalkoholdehydrogenase (ADH) 1-15 Allele aufweist [Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 3983-4000 (1984)], wobei eine NcoI Stelle an dem Translationsstartcodon eingefügt ist. HPH 463 dam(-) wurde mit ClaI verdaut, und die sich ergebenden 5' Überhänge wurden mit Klenow aufgefüllt. Die sich ergebende DNA wurde dann mit XbaI verdaut, und das ClaI glatte-XbaI Fragment, enthaltend den 3' Teil des 2-2 Promotors und Mais ADH Leader wurde isoliert. Das Plasmid pBSCre wurde mit HindIII verdaut, und die sich ergebenden 5' Überhänge wurden mit Klenow glatt gemacht. Diese pBSCre DNA wurde dann bis zur Vollständigkeit mit XbaI verdaut (angeordnet in dem Polylinker) und unter Verwenden vor Kalbsdarmphosphatase entphosphoryliert. Das von HPH463 dam (-)abstammende ClaI glatte Xba I Fragment und der entphosphorylierte pBSCre Vektor wurden dann zusammen unter Erhalten des als pBSCre101 bezeichneten Plasmids ligasiert. Diese Konstruktion enthält eine cre Codierungsregion unter der Transkriptionskontrolle eines modifizierten 2-2 Promotors, der eine 5' nicht translatierte Leadersequenz aus dem Mais ADH Gen einschließt.
Als nächstes wurde der 5' distale Teil des In 2-2 Promotors zu pBSCre101 hinzugegeben. Das zuvor beschriebene Plasmid 2-2(3,9) wurde zur Vollständigkeit mit XbaI und AatII verdaut, und ein Fragment, enthaltend 1,2 kb des 2-2 Promotors, wurde isoliert. Das Plasmid pBSCre101 wurde mit XbaI und AatII verdaut, entphosphoryliert und an das XbaI- AatII Fragment von 2-2(3,9) ligasiert. Die sich ergebende Konstruktion wurde mit pBSCre102 bezeichnet.
Als nächstes wurde pBSCre102 mit XbaI und XhoI verdaut, und das Fragment, das das gesamte In2-2/P-cre-Nos 3' chimäre Gen enthielt, wurde an pJJ2644 ligasiert, das mit XbaI und XhoI verdaut worden war und entphosphoryliert, was zu pBS103 führte. pJJ2644 war in Beispiel 4 beschrieben. pBSCre103, in Fig. 5 gezeigt, wurde in A. tumefaciens transformiert, und der sich ergebende Stamm verwendet. Tabaktransformanten, wie in Materials and Methods beschrieben, zu erhalten; 30 mg/l Hygromycin wurden für Selektion verwendet, und Blattscheiben wurden alle zwei bis drei Wochen auf frisches Medium gebracht.
Unabhängige primäre Transformanten wurden in Magentaboxen gezüchtet, und junge Blätter wurden geerntet und in flüssigem Stickstoff gefroren. Eine Woche nach der anfänglichen Ernte wurden Sprößlingsspitzen geerntet und in 15-ml Falconröhren, gefüllt mit 0,5X Hoagland's Lösung (Tabelle 11), welche 200 mg/l N-(Aminocarbonyl)-2- chlorbenzolsulfonamid enthielt, gebracht. Man ließ die Pflanzen Induktor für annähernd 24 Stunden aufnehmen. Die induzierten Sprößlinge wurden dann geerntet, in -flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80ºC gelagert.
Gesamt RNA wurde aus beiden Probensätzen, wie von Colbert et al. beschrieben [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2248-2252 (1983)], geerntet. Replikat RNA Proben aus beiden nicht induzierten und induzierten transformierten Pflanzen wurden auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit nick-translatiertem pBSCre sondiert. Sechsundzwanzig primäre Transformanten hatten wenig bis keine cre mRNA in dem nicht induzierten Zustand und ein starkes cre mRNA Hybridisierungssignal nach Behandlung mit N- (Aminocarbonyl)-2-chlorbenzolsulfonamid. Dieses Ergebnis zeigt, daß Expression des cre Gens erfolgreich reguliert wurde, wenn unter Kontrolle des In2-2 Promotors.

TABELLE 10

0,5X HOAGLAND'S NÄHRMITTELLÖSUNG
1,0 mM Ammoniumphosphat, einbasisch
4,0 mM Kaliumnitrat
4,0 mM Calciumnitrat
2,0 mM Magnesiumsulfat
1,0 mM Ammoniumnitrat
5,0 ppb Sequestren
9,2 pH Manganchlorid
46,0 pH Borsäure
0,77 pH Zinksulfat
0,32 pH Kupfersulfat
0,11 pH Molybdänsäure

BEISPIEL 10

CHEMISCHE REGULIERUNG VON loxP-cre VERMITTELTER REKOMBINATION

Transformanten, welche das In2-2/P-cre-Nos 3' Gen enthielten, das Induktion durch N-(Aminocarbonyl)-2-chlorbenzolsulfonamid entsprach, in Beipiel 9 beschrieben, wurden, wie in Abschnitt F beschrieben, mit den homozygoten loxP Pflanzen gekreuzt, die in Abschnitt G beschrieben wurden. Der sich ergebende Samen wird auf Hygromycin gekeimt, um jene Nachkommenschaft auszuwählen, die das cre Gen erhielt. Jede Nachkommenschaft erhielt die loxP Konstruktion aus dem homozygoten Elternteil. Blattscheiben werden aus ausgewählter Nachkommenschaft genommen und zu Kallus auf Kanamycinmedium, wie zuvor beschrieben, induziert. Mangel an Kallusbildung zeigt, daß die lox Konstruktion, in der das Kanamycinresistenzgen nichtfunktionell aufgrund der loxP-polyA-loxP Fragmentinsertion ist, intakt verbleibt, und daß keine Rekombination aufgetreten ist. Cre Expression wird auch in Nachkommenschaft durch Behandeln mit N-(Aminocarbonyl)-2-chlorbenzolsulfonamid oder verwandten induzierenden Chemikalien durch Sprühen, durch Abschneiden der Keimlingsspitze oder eines Blattes und Ermöglichen der Aufnahme durch das Vaskulärsystem oder durch Plazieren von Gewebeexplantaten auf induktorhaltigem Medium induziert. Im Anschluß an Induktion werden Blattscheiben erneut in Bezug auf Kalluswachstum auf Kanamycin untersucht. Wachstum dieses Gewebes zeigt, daß Cre-vermittelte Rekombination an den loxP Stellen das polyA Fragment herausschneidet und Funktion des Kanamycinresistenzgens wiederherstellt. Somit tritt Rekombination nur auf, nachdem die induzierende Chemikalie auf Pflanzen angewendet wird, die das In2-2/P-cre-Nos 3' Gen und eine loxP Konstruktion enthalten.

BEISPIEL 11

WIEDERHERSTELLUNG VON FRUCHTBARKEIT IN EINEM MOLEKULAR-GENETIK-APPROACH ZU HYBRIDSAMENHERSTELLUNG

Ein chimäres Antheren-Promotorzellzerstörungsgen (A/P-CD), welches männliche Sterilität verursacht, wird aus dem Genom der Hybridpflanze gelöscht, was zur Fruchtbarkeitswiederherstellung führt. Das verwendete A/P-CD Gen besteht aus dem TA29 Promotor, der Barnase Codierungsregion und dem NOS 3' Ende, wie in EPA 89-344029 beschrieben. Ein binärer Vektor wird konstruiert, daß er aus dem A/P-CD Gen, flankiert durch direkt wiederholte loxP Stellen, und einem chimären NptII Gen als einem Kanamycinresistenzselektionsmarker zwischen den linken und rechten T-DNA Grenzsequenzen besteht. Ein Diagramm der T-DNA des binären Vektors ist im nachfolgenden gezeigt:
Dieses Plasmid. Lox/AD genannt, wird in A. tumefaciens LBA4404 übertragen, und der sich ergebende Stamm wird verwendet. Tabaktransformanten, wie zuvor beschrieben, zu erhalten. Die sich ergebenden Transformanten, die Lox/AD enthalten, werden bis zur Reife gezüchtet und in Bezug auf männliche Sterilität getestet, welche korrekte Expression des A/P-CD Gens anzeigt. Männliche sterile Lox/AD Pflanzen werden als diejenigen identifiziert, die keinen Samen bei Selbstbestäubung herstellen und/oder keinen Pollen herstellen. Diese Pflanzen werden mit Pollen von homozygoten 35S/P-Cre Pflanzen, erhalten in Abschnitt C. befruchtet, und Samen wird, wie zuvor beschrieben, geerntet. Samen werden sterilisiert und auf MX-Medium in der Anwesenheit von Kanamycin gepflanzt. Keimlinge, welche resistent gegenüber Kanamycin sind, und deshalb die Lox/AD Konstruktion erhalten haben, werden bis zur Reife gezüchtet und im Hinblick auf männliche Fruchtbarkeit untersucht. Wiederherstellung von Fruchtbarkeit wird identifiziert durch die Fähigkeit, Pollen zu entwickeln und Samen bei Selbstbestäubung herzustellen. Fruchtbarkeitswiederherstellung zeigt, daß das A/P-CD Gen aufgrund der Wechselwirkung von Cre Protein mit den loxP Stellen gelöscht wird.

BEISPIEL 12

Cre-lox VERMITTELTE ZERSTÖRUNG VON F1 SAMENENTWICKLUNG

F1 Samenentwicklung wird abgetrieben, indem ein Samenzerstörungsgen unter Verwenden des loxP-Cre Systems aktiviert wird. Eine Komponente eines Samenzerstörungsgens ist ein Promotor, der nur in dem Samen exprimiert wird. Dieser Typ von Promotor kann von einem Gen abstammen, dessen Expression natürlich mit dem Embryo und/oder Endosperm verbunden ist. Wünschenswerte Promotoren, die zu verwenden sind, stammen von der Embryoexprimierten β-Untereinheit von Phaseolin (β-Ph) oder von der a' Untereinheit von β- Conglycinin von Sojabohne (a'-β-CG) ab, welche früh in der Samenentwicklung in dem Endosperm und Embryo hoch exprimiert wird. Diese zwei Gene sind von Doyle et al. [J. Biol. Chem., 261: 9228-9238 (1986)] beschrieben.
Eine zweite Komponente des Samenzerstörungsgens ist eine Codierungsregion, welche ein Protein erzeugt, das normale Zellfunktionen zerstört. Ein Beispiel ist die Codierungsregion für Barnase, die von Bacillus amyloliquefaciens abstammt, welche kloniert und von Hartley charakterisiert worden ist [J. Mol. Biol. 202: 913-915 (1988)] und in EPA 89-344029 verwendet worden ist. Die dritte Komponente ist eine Polyadenylierungssignalsequenzregion, welche von dem 3' Ende von höchstens irgendeinem Gen abstammen kann, das funktionell in Pflanzenzellen ist. In diesem Beispiel verwenden wir die 3' Region von dem Bohnenphaseolingen [Chee et al., Gene 41: 457 (1986)]. Das Samenzerstörungsgen wird in einer inaktiven Form durch Plazieren eines loxP-polyA-loxP DNA Fragments zwischen die Promotor- und Codierungsregion, wie für das NOS/P-NptII Gen in Beispiel 5 beschrieben, hergestellt. Inaktive und aktive (Kontrolle) chimäre Gene, welche entweder den β-Ph oder den a'-β-CG Promotor, die Barnasecodierungsregion (bar) und die Phaseolin 3' Region (Ph3') enthalten, werden folgendermaßen hergestellt.
Plasmide, enthaltend den β-Ph Promotor und Ph 3' oder den a'-β-CG Promotor und Ph 3', genannt pUC18pvPpvS und pUC18gmPpvS, wurden von Dr. Jerry Slightom, the Upjohn Company erhalten. Die Promotor- und 3' Regionen, die in diesen zwei Plasmiden enthalten sind, wurden aus den von Doyle et al. beschriebenen Genen synthetisiert [J. Biol. Chem., 261: 9228-9238 (1986)], wobei das von Saiki et al. beschriebene Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR) verwendet wurde [Science, 239: 487-491 (1987)]. Während des PCR Verfahrens wurde eine NcoI Stelle an dem Translationsstart ATG und 5' zu der Ph3' Sequenz durch Einfügen der NcoI Restriktionsstellenerkennungssequenz in die entsprechenden synthetischen Oligonucleotidprimer hinzugegeben. Eine HindIII Stelle wurde in ähnlicher Weise an dem 5' Ende der Promotorfragmente hinzugegeben. Die synthetischen Promotor- und 3'Regionsfragmente wurden an den eingefügten NcoI Stellen verbunden und in die HindIII Stelle von pUC18 ligasiert (eine HindIII Stelle tritt natürlicherweise an dem Ende des Ph 3' Fragments auf). Die sich ergebenden Plasmide, pUC18pvPpvS und pUC18gmPpvS, wurden jeweils mit EcoRI und Sa1I verdaut, die Enden wurden unter Verwenden des Klenowenzyms aufgefüllt und unter Löschen der zwischen EcoRI und Sa1I angeordneten Polylinkerstellen religasiert. Die sich ergebenden Plasmide wurden als CW104 bzw. CW105 bezeichnet. Jedes dieser Plasmide wurde dann mit NcoI und einem synthetischen Oligonucleotid mit Restriktionsstellen verdaut: NcoI, SmaI, KpnI, XbaI und unvollständiges NcoI wurde hinzugegeben. Die sich ergebenden Plasmide wurden CW108 und CW109 genannt.
Weil das Barnaseenzym lethal gegenüber Zellen ist, wird ein Inhibitor von Barnase, genannt Barstar, in den gleichen Zellen exprimiert. Das pMT420 Plasmid, enthaltend die Barstar- und Barnasegene, isoliert aus Bacillus amyloliquefaciens, wurde von Dr. Robert Hartley, NIH erhalten. Diese Gene sind von Hartley [J. Mol. Biol. 202: 913- 915 (1988)] beschrieben. Das Barstargen wurde aus pMT420 als ein PstI-HindIII Fragment isoliert und in PstI (eine nur einmal vorhandene PstI Polylinkerstelle ist nach der HindIII Stelle an dem 3' Ende des Ph 3' Fragments angeordnet) und HindIII verdautes CW108 ligasiert. Ein Plasmid, das den HindIII β-Ph Promotor und Ph 3' Fragment behält und das Barstargen enthält, wurde identifiziert und als 108B bezeichnet. Das NcoI-PstI Fragment, das Ph 3' und Barstar enthält, wurde isoliert und an NcoI und PstI verdautes CW109 ligasiert, wodurch 109B erzeugt wurde.
Das vollständige Barnaseprotein umfaßt eine in Ausscheidung verwickelte Prä- Sequenz, eine in Falten verwickelte Pro-Sequenz und die reife Proteinsequenz, die die Enzymaktivität enthält. Wir schlagen vor, daß Expression von nur dem reifen Protein äußerst wirksam beim Zerstören von Pflanzenzellen ist. Obwohl EPA 89-344029 Verwendung von Barnase als einem Pflanzenzellzerstörungsprotein macht, offenbart es nicht Details in Bezug auf die Konstruktion eines Barnasegens für Expression in Pflanzenzellen. Keine Information ist in Bezug auf den Teil der Barnasecodierungsregion gegeben, der exprimiert wird.
Um ein DNA Fragment herzustellen, welches die Codierungsregion für das reife Barnaseprotein (bar) enthält, wurde Bacillus amyloliquefaciens DIVA als eine Matrize für das von Saiki et al. beschriebene PCR Verfahren verwendet [Science 239: 487-491 (1987)]. Synthetische Primer wurden hergestellt, die eine NcoI Stelle, einschließlich eines in- Raster Translationsstart ATG, an dem 5' Ende der Codierungsregion des reifen Proteins und eine XbaI Stelle folgend dem Translationsstopcodon hinzufügen. Das verstärkte DNA Fragment wurde mit NcoI und XbaI verdaut und an NcoI und XbaI verdautes 105B unter Erzeugen von 108BB ligasiert, welches dann eine aktive Form des Samenzerstörungsgens enthält. In ähnlicher Weise wird 109BB konstruiert.
Um inaktive Formen des Samenzerstörungsgens herzustellen, wurde zuerst die NcoI Stelle an dem 3' Ende des Promotorfragments von CW108 und CW109, zuvor beschrieben, durch Verdauen jedes Plasmids mit NcoI und Behandeln mit 51 Nuclease entfernt. S1 behandeltes CW108 wurde rückligasiert, ein Plasmid, dem die NcoI Stelle fehlte, wurde durch Restriktionskartieren und DNA Sequenzieren identifiziert und 108N benannt. S1 behandeltes CW109 wurde mit SmaI (die Stelle ist benachbart zu der NcoI Stelle) verdaut und rückligasiert. Ein Plasmid, dem die NcoI Stelle fehlte, wurde durch Restriktionskartieren und DNA Sequenzieren identifiziert und 109N1 genannt. 109N1 wurde mit Asp 718 und XbaI verdaut, und ein synthetischer Oligonucleotidlinker mit den Orten Asp 718, XhoI, NcoI und XbaI wurde hinzugegeben. Das sich ergebende Plasmid. 109N1X genannt, wurde mit XhoI und NcoI verdaut, und ein XhoI-NcoI loxP-polyA-loxP DNA Fragment wurde hinzugegeben. Dieses Fragment wurde aus p69ssN, einem Derivat von pBS69polyA, welches in Beispiel 5 beschrieben war, hergestellt. Um p69ssN herzustellen, wurde pBS69polyA an der HindIII Stelle, die außerhalb von einer loxP Stelle angeordnet ist, verdaut, die Enden wurden aufgefüllt, und NcoI Linker wurden hinzugegeben. 109N1X, enthaltend das loxP-polyA-loxP Fragment, wurde 109lox2 genannt. Dieses Plasmid wird mit NcoI und PstI verdaut, und das NcoI-PstI Fragment, hergestellt aus 109BB, enthaltend bar. Ph 3', und Barstar wird unter Erzeugen von 109lox2BB hinzugegeben. Dieses Plasmid enthält ein inaktives Samenzerstörungsgen. 108 N wird mit Asp718 und PstI verdaut, und das aus 1098lox2BB hergestellte Asp718-PstI Fragment wird hinzugegeben. Das sich ergebende Plasmid wird 108lox2BB genannt und enthält ein inaktives Samenzerstörungsgen.
Die inaktiven und aktiven Zellzerstörungsgene werden jedes bewegt in einen binären Vektor mit einem NptII Gen innerhalb der Grenzen und einem Barstargen hinzugegeben außerhalb der T-DNA Grenzen. Die sich ergebenden Plasmide werden pZ108lox2BB, pZ109lox2BB, pZ108BB und pZ109BB genannt. Diese Plasmide werden in ein abgerüstetes (disarmed) A. tumefaciens übertragen, und die sich ergebenden Stämme werden verwendet, Transformanten, wie zuvor beschrieben, zu erhalten.
Expression der cre Codierungsregion ist entweder mit dem gleichen entwickelnd kontrollierten Promotor oder mit dem hoch aktiven 35S Promotor wirksamer. Die cre Codierungsregion wurde unter Kontrolle der gleichen Samenpromotoren gesetzt, die für die Zerstörungsgene verwendet wurden, wodurch chimäre SP-cre-Ph 3' Gene hergestellt wurden: 108 Cre und 109 Cre. Diese Gene wurden in binäre Vektoren zwischen den T-DNA Grenzen zusammen mit einem chimären Sulfonylharnstoffresistenzselektionsmarkergen kloniert, wodurch pZ108 Cre und pZ109Cre Plasmide erzeugt wurden. Diese Plasmide werden in ein abgerüstetes (disarmed) A. tumefaciens übertragen, und die sich ergebenden Stämme werden verwendet, Tabak- oder Arabidopsistransformanten, wie zuvor beschrieben, zu erhalten. Homozygote Einzellocuspflanzen stammen von primären Transformanten, wie zuvor beschrieben, ab.
Homozygote mit pZ108lox2BB oder pZ109lox2BB transformierte Pflanzen werden mit homozygoten Pflanzen, welche pZ108 Cre oder pZ109Cre enthalten, und mit den homozygoten Cre Pflanzen, die in Abschnitt C oder Beispiel 9 beschrieben sind, gekreuzt. Samenschalen oder -hülsen werden im Hinblick auf das Fehlen von Samen geprüft, was anzeigt, daß das Samenzerstörungsgen durch das loxP-cre System aktiviert wird.

BEISPIEL 13

Cre-lox VERMITTELTE ZERSTÖRUNG VON F2 SAMENENTWICKLUNG

F1 Samenentwicklung ist normal, und F2 Samenentwicklung wird abgetrieben, indem ein Samenhüllzerstörungsgen unter Verwenden des loxP-cre Systems aktiviert wird. Ein Samenhüllzerstörungsgen wird hergestellt, bestehend aus der zuvor beschriebenen reifen Barnasecodierungsregion und einer Promotorregion, isoliert aus einem samenhüllspezifischen Gen. Ein samenhüll-spezifisches Gen wird unter Verwenden der folgenden Stufen isoliert. Samenhüllen werden aus unreifen Wassermelonensamen zerschnitten, und zelluläre Gesamt RNA wurde hergestellt unter Verwenden des Guanidiumisothiocyanatextraktionsverfahrens von Stratagene, gefolgt von LiCL Fällung, wie von Ausubel et al. beschrieben [Current Protokols in Molecular Biology 481-483 (1987)]. Gesamt RNA von Blättern wurde unter Verwenden des von Baker et al. beschriebenen Verfahrens isoliert [Biotechniques 9(3), 268-272 (1990)]. Als nächstes wurde eine polyadenylierte (polyA+) RNA Fraktion durch zwei Runden von Affinitätschromatographie auf oligo(dT)-Cellulosespinsäulen von Pharmacia unter Verfolgen des Verfahrens des Herstellers hergestellt. Eine cDNA Bibliothek, hergestellt zu dieser polyA+ RNA Herstellung, wurde von Stratagene erhalten. Duplikatfilter, hergestellt aus Platten der Bibliothek, oder Duplikateinkerbungsblots, welche DNA enthalten, hergestellt aus jedem einzelnen cDNA Klon, hergestellt gemäß Conkling et al. [Plant Physiol. 93. 1203-1211 (1990)], wurden differentiell unter Verwenden von ³²P-markierten cDNA Sonden gescreent, die aus der Samenhüll polyA+ RNA oder aus Blatt polyA+ RNA gemäß Sargent hergestellt worden sind [Guide to Molecular Cloning Techniques. Berger und Kimmel, Herausgeber 423-432 (1987)]. Klone wurden identifiziert, die nur an die Samenhüllsonde hybridisierten. Die klonierten cDNA Sequenzen werden verifiziert, als von samenspezifischen RNAs abstammend, indem sie verwendet werden, einen Nothern Blot zu sondieren, wie in BioRad's Protokoll beschrieben, hergestellt mit RNAs, die aus unterschiedlichen Pflanzengeweben gemacht wurden. Eine samenspezifische cDNA wird verwendet, eine Genombibliothek zu sondieren, die aus Wassermelonen DNA hergestellt wurde, hergestellt mit einem Kit von NEN und unter Verwenden des eingeschlossenen Protokolls, und das Gen, das die samenspezifische RNA codiert, dargestellt durch die cDNA, wird identifiziert. Der Genomklon wird kartiert, das gewünschte Gen anzuordnen. Das 5' Ende des Transkripts wird durch Primerextensionsexperimente angeordnet, wie in Ausubel et al. beschrieben [Current Protocols in Molecular Biology 481-483 (1987)]. Die Promotorregion, die etwa 1 Kilobase der Sequenz stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle einschließt, wird als ein DNA Fragment hergestellt. Dieser Samenhüllpromotor wird an die Barnasecodierungsregion ligasiert, gefolgt von der Phaseolin 3' Region, wie in dem zuvor angegebenen Beispiel 13 beschrieben, wodurch das SCP-bar-Ph 3' genannte chimäre Gen erzeugt wird.
Dieses chimäre Samenhüllzerstörungsgen wird in eine inaktive Form gebracht, indem ein loxP-polyA-loxP DNA Fragment zwischen die Promotor- und Codierungsregion, wie für das NOS/P-NptII Gen in Beispiel 5 beschrieben, hinzugefügt wird. Das inaktive SCP-lox- bar-Ph 3' Gen wird in einen binären Vektor zwischen die T-DNA Grenzen zusammen mit einem chimären Kanamycinresistenzselektionsmarkergen kloniert. Ein Diagramm der T-DNA des binären Vektors ist im nachfolgenden gezeigt:
Dieses Plasmid, genannt lox/SCPB/NptII, wird in ein abgerüstetes A. tumefaciens übertragen, und der sich ergebende Stamm wird verwendet, Tabak- oder Arabidopsistransformanten, wie zuvor beschrieben, zu erhalten.
Expression der cre Codierungsregion ist wirksamer, entweder mit dem gleichen entwickelnd kontrollierten Promotor oder mit dem hoch aktiven 35S Promotor. Die cre Codierungsregion wird unter Kontrolle des gleichen Samenhüllpromotors gebracht, der für das Zerstörungsgen verwendet wird, wodurch ein chimäres SCP-cre-Ph 3' Gen hergestellt wird. Dieses Gen wird in einen binären Vektor zwischen die T-DNA Grenzen zusammen mit einem chimären Sulfonylharnstoffresistenzselektionsmarkergen unterErzeugen des SCPCre/ALS Plasmids kloniert. Dieses Plasmid wird in ein abgerüstetes A. tumefaciens übertragen, und der sich ergebende Stamm wird verwendet. Tabak- oder Arabidopsistransformanten, wie zuvor beschrieben, zu erhalten.
Primäre Transformanten, enthaltend lox/SCPB/NptII, werden mit- primären Transformanten gekreuzt, welche SCPCre/ALS enthalten, und mit den homozygoten Cre Pflanzen (enthaltend das chimäre 35S-Cre Gen), beschrieben in Abschnitt G und Beispiel 8. Weil die primären Transformanten heterozygot sind, konnte der aus ihren Kreuzungen hergestellte Samen keine, beide oder eine von beiden der Fremd-DNA Insertionen tragen. Deshalb wird Nachkommenschaft im Hinblick auf das Vorhandensein der zwei Markergene. ALS und NptII, gescreent, indem man Samen auf Medium keimen läßt, welches sowohl Chlorsulfuron wie Kanamycin enthält. Resistente Nachkommenschaft, die sowohl das inaktive Samenhüllzerstörungsgen wie das chimäre cre Gen trägt, wird bis zur Reife gezüchtet und selbstbestäubt. Samenschalen werden im Hinblick auf das Fehlen von Samen gezüchtet, was anzeigt, daß das Samenhüllzerstörungsgen durch das loxP-cre System aktiviert wird, wodurch die Herstellung von F2 Samen zerstört wird.
In Kreuzungen von lox/SCPB/NptII Pflanzen mit den homozygoten 35S-Cre-Pflanzen erhält alle Nachkommenschaft das chimäre Cre Gen, somit ist nur die Kanamycinselektion notwendig. Nachkommenschaft zu identifizieren, die auch das Samenhüllzerstörungsgen enthält. Ausgewählte Pflanzen werden bis zur Reife gezüchtet und selbstbestäubt. Samenhülsen werden in Bezug auf das Fehlen von Samen überprüft, was angibt, daß das Samenhüllzerstörungsgen aktiviert ist und wirksam beim Zerstören der Herstellung von F2 Samen ist.
Homozygote Linien von lox/SCPB/NptII und von SCPCre/ALS Pflanzen werden, wie zuvor beschrieben, erhalten und gekreuzt. Samenhülsen werden in Bezug auf Samenherstellung untersucht, und Samenlebensfähigkeit wird in Keimungsassays getestet. Das Vorhandensein von lebensfähigem Samen zeigt, daß das inaktive Samenhüllzerstörungsgen seinen inaktiven Zustand in der Samenhülle des sich entwickelnden F1 Samens, wie vorhergesagt, behält. Nachkommenschaft wird bis zur Reife gezüchtet und selbstbestäubt. Samenhüllen werden im Hinblick auf das Fehlen von Samen geprüft, was anzeigt, daß das Samenhüllzerstörungsgen aktiviert und wirksam beim Zerstören der F2 Samenherstellung ist. Homozygote lox/SCPB/NptII Pflanzen werden mit homozygoten 35S-Cre Pflanzen gekreuzt, und die Herstellung von lebensfähigem F1 Samen wird getestet. Nachkommenschaft wird bis zur Reife gezüchtet, selbstbestäubt, und das Fehlen von F2 Samen wird beobachtet.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von ortsspezifischer Rekombination von DNA in Pflanzenzellen, aufweisend:

(i) Einführen in die Zellen eine erste DNA Sequenz, aufweisend eine erste lox Stelle, und eine zweite DNA Sequenz aufweisend eine zweite lox Stelle, und

ii) in Kontaktbringen der lox Stellen mit Cre, wodurch die ortsspezifische Rekombination hergestellt wird.

2. Verfahren, wie in Anspruch 1 definiert, wobei eine dritte DNA Sequenz, aufweisend eine cre Codierungsregion, auch in die Zellen eingeführt wird.

3. Verfahren, wie in Anspruch 2 definiert, wobei die dritte DNA Sequenz einen Promotor aufweist, der aktiv in Pflanzenzellen ist, und Expression des cre Gens wird durch Richtung des Promotors hergestellt.

4. Verfahren, wie in Anspruch 3 definiert, wobei die ersten und zweiten DNA Sequenzen in die Zellen eingeführt werden, die durch ein vorher ausgewähltes DNA Segment verbunden sind.

5. Verfahren, wie in Anspruch 4 definiert, wobei die ersten und zweiten lox Stellen die gleiche Orientierung haben, und die ortsspezifische Rekombination von DNA eine Deletion des vorher ausgewählten DNA Segments ist.

6. Verfahren, wie in Anspruch 4 definiert, wobei die ersten und zweiten lox Stellen entgegengesetzte Orientierungen haben, und die ortsspezifische Rekombination eine Inversion der Nucleotidsequenz des vorher ausgewählten DNA Segments ist.

7. Verfahren, wie in Anspruch 4 oder Anspruch 5 definiert, wobei das vorher ausgewählte DNA Segment aus der Gruppe bestehend aus einem Gen, einer Codierungsregion und einer DNA Sequenz ausgewählt wird, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt.

8. Verfahren, wie in Anspruch 5 definiert, wobei das vorher ausgewählte DNA Segment ein unerwünschter Marker oder Eigenschaftsgen ist.

9. Verfahren, wie in Anspruch 1 definiert, wobei die ersten und zweiten DNA Sequenzen in zwei unterschiedliche DNA Moleküle eingeführt werden, und die ortsspezifische Rekombination ein reziproker Austausch von DNA Segmenten nächst den lox Stellen ißt.

10. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 2 bis 9 definiert, wobei die cre Codierungsregion vom Bakteriophagen P1 abstammt.

11. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, wobei die ersten und zweiten lox Stellen loxP oder Derivate davon sind, die fähig sind, ortsspezifische Rekombination zu erzielen.

12. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, wobei die ersten und zweiten lox Stellen loxP sind.

13. Verfahren zum Ausschneiden exogener Gene oder DNA Segmente in transgenen Pflanzen, aufweisend:

(i) Einführen in die Zellen eine DNA Sequenz, aufweisend eine erste lox Stelle, eine zweite lox Stelle in der gleichen Orientierung wie die erste lox Stelle, und ein Gen oder eine DNA Sequenz dazwischen, und

(ii) in Kontakt bringen der lox Stellen mit Cre, wodurch das heterologe Gen oder DNA Sequenz herausgeschnitten wird.

14. Verfahren wie in Anspruch 13 definiert, wobei das Gen ein unerwünschter Marker oder Eigenschaftsgen ist.

15. Pflanzenzelle, transformiert mit einer DNA Sequenz, aufweisend mindestens eine lox Stelle.

16. Pflanzenzelle, enthaltend Cre Protein.

17. Pflanzenzelle, transformiert mit einer Cre Codierungsregion.

18. DNA Sequenz, aufweisend mindestens eine lox Stelle und ein DNA Segment, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem pflanzenspezifischen Gen, einer pflanzenspezifischen Codierungsregion und einer DNA Sequenz, die Genexpression in Pflanzenzellen beeinflußt, ausgewählt aus einem Promotor, einer Regulatornucleotidsequenz, einer Polyadenylierungsnucleotidsequenz, einem Ribozym und einer Antisinn RNA.

19. Pflanzenzelle, enthaltend eine DNA Sequenz, aufweisend mindestens eine lox Stelle und ein DNA Segment, das Pflanzengenexpression beeinflußt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem spezifischen Gen, einer spezifischen Codierungsregion und einer DNA Sequenz, die Genexpression in pflanzenzellen beeinflußt.

20. DNA Sequenz, aufweisend eine cre Codierungsregion, operabel an einen Promotor gekopppelt, der aktiv in Pflanzenzellen ist.

21. Plasmid, aufweisend die Sequenz nach Anspruch 18 oder Anspruch 19.

22. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, wobei die DNA Sequenz eine Polyadenylierungsnucleotidsequenz, abstammend von dem kleinen Rubisco-Untereinheitsgen ist.

23. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, wobei die DNA Sequenz ein Selektionsmarker ist.

24. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, wobei die DNA Sequenz ein Promotor ist.

25. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, wobei die DNA Sequenz eine Regulatornucleotidsequenz ist.

26. Plasmid, aufweisend die Sequenz von Anspruch 20.

27. Plasmid, wie in Anspruch 26 definiert, wobei der Promotor der CaMV 35 S Promotor ist, gekennzeichnet durch die in Fig. 1A gezeigte Restriktionsenzymkarte.

28. Plasmid, wie in Anspruch 26 definiert, wobei der Promotor der CaMV 35 S Promotor ist, gekennzeichnet durch die in Fig. 1B gezeigte Restriktionsenzymkarte.

29. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, gekennzeichnet durch die in Fig. 1C gezeigte Restriktionsenzymkarte.

30. Plasmid, wie in Anspruch 21 definiert, gekennzeichnet durch die in Fig. 4 gezeigte Restriktionsenzymkarte.

31. Verfahren nach Anspruch 1 für die Herstellung von samenloser Pflanze, hergestellt durch ortsspezifische Rekombination, aufweisend:

(i) Einführen in die Zellen eine erste DNA Sequenz, aufweisend ein Zellspaltungsgen und einen samenspezifischen Promotor und mit einer DNA Sequenz, aufweisend eine erste und zweite lox Stelle dazwischen, und

(ii) Kreuzen der Pflanze mit einem Pflanze exprimierenden cre, wodurch das Spaltungsgen durch ortsspezifische Rekombination aktiviert und in dem Samen exprimiert wird, wodurch Samenentwicklung gestört wird.