HU203788B

HU203788B - Process for producing 1-lysine with fermentation

Info

Publication number: HU203788B
Application number: HU89525A
Authority: HU
Inventors: Toshihiko Hirao; Tetsuo Nakano; Tomoki Azuma; Toshihide Nakanishi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1988-02-03
Filing date: 1989-02-02
Publication date: 1991-09-30
Also published as: JP2578463B2; CN1037927A; EP0327945A3; HUT50216A; KR890013190A; EP0327945A2; KR920007402B1; JPH01199589A; MX173009B

Description

A találmány tárgya eljárás L-lizin előállítására fermentálással.

Az L-lizinnek sokféle alkalmazási módja ismeretes az állati takarmányok, gyógyszerek, élelmiszerek, stb. területén.

Mind ez ideig az L-lizin előállítása olyan eljárások segítségével történt, melyek a glutaminsavat termelő, coryneform mikroorganizmusok számos különböző tápanyagigényes, gyógyszerekkel szemben ellenálló, illetve gyógyszerekre érzékeny - törzseit használják fel. Ismeretes továbbá olyan eljárás is, melynek során antibiotikum-rezisztens törzseket alkalmaznak (3 687 810 számú amerikai szabadalmi leírás), valamint egy, a Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusok által termelt antibakteriális anyagokkal szemben ellenálló törzseket felhasználó eljárás is (169 497/84 számú publikált, de nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés).

Nem ismerünk azonban olyan közleményt, mely az iturinnal rokon anyagokkal szemben rezisztenciát mu- 20 tató törzsekről számolna be. A Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusok által termelt antibakteriális anyagokkal szemben ellenálló törzseket felhasználó eljárás - melyet az említett 169 497/84 számú publikált, de nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés 25 tárgyal -, célja nem az, hogy fokozza a lizint termelő mikroorganizmusok által előállított lizin mennyiségét, hanem az, hogy megakadályozza a lizint termelő mikroorganizmusok szaporodásának - a Bacillus törzshöz (genus) tartozó mikroorganizmusokkal történt szeny- 30 nyeződés miatt bekövetkező - gátlását.

Olyan eljárás kifejlesztése vált tehát szükségessé, melynek segítségével alacsony, ipari áron állítható elő L-lizin.

A találmány szerzői kiterjedt kutatásokat végeztek 35 olyan eljárás kidolgozására, melynek során biztosítható az L-lizin előállítása fermentálással, annak érdekében, hogy lehetővé váljék az L-lizin alacsony, ipari árának elérése. A szerzők vizsgálataik során azt tapasztalták, hogy az L-lizint termelő mikroorganizmusok produkti- 40 vitása fokozható oly módon, hogy a coryneform, glutaminsavat termelő mikroorganizmusokban rezisztenciát alakítunk ki az iturinnal rokon anyagokkal szemben.

A találmány értelmében az L-lizin előállítására szolgáló eljárás során az iturinnal rokon anyagokkal szem- 45 ben ellenálló és L-lizin termelésére képes, glutaimsavtermelő Corynebacterium glutamicum mikroorganizmust megfelelő táptalajon tenyésztjük, az L-lizint öszszegytfjtjük a tenyészetben, majd onnan kinyerjük.

Iturinnal rokon anyagon a továbbiakban valamely, a 50 Bacillus genus mikroorganizmusai által előállított antibiotikumot értünk, amilyen például az iturin A, az iturin C, a mycesubtilin, a bacillomycin, illetve ezek keveréke [Biochim. Biophys. Acta 552, 558-562 (1979), Biochim. Biophys. Acta 684,207-211 (1982)]. 55

A találmány során alkalmazott mutáns törzsek eredeti (kiindulási) baktériumtörzsként bármely, L-lizin előállítására képes, glutaminsav-termelő coryneform mikroorganizmusok közé tartozó baktériumtörzs felhasználható. Előnyösen alkalmazható a Corynebacteri- 60 um glutamicum H-3149 (FERM BP-158) és a Corynebacterium glutamicum H-4412 (FERM BP-1069).

Az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzsek oly módon állíthatók elő, hogy a fent említett, eredeti baktériumtörzset 250 pg/ml N-metilN’-nitro-nitrosó-guanidinnal kezeljük 30 ‘C hőmérsékleten, 30 percen keresztül, majd izoláljuk a minimális agar-táptalajlemezeken - melyek olyan koncentrá-cióban tartalmazzák az iturinnal rokon anyagokat, hogy az eredeti törzsek nem képesek elszaporodni - kitenyésztő törzseket Ezt követően oly módon állíthatjuk elő a találmány szerinti mutáns törzseket hogy a fentiek szerint nyert, az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzseket tenyésztjük, és összehasonlítjuk az egyes törzsek L-lizintermelő képességét, majd ezeket a törzseket választjuk ki a találmány szerinti felhasználás céljára, melyeknek a legmegfelelőbb az Llizinelőállítási képességük.

A fent említett eredeti baktériumtörzseket, valamint a belőlük előállított, az iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló mutáns törzsek (az iturin A és az iturin C 1:1 tömegarányú keveréke) az alábbi tulajdonságokkal jellemezhetőek:

Eredeti törzs: Corynebacterium glutamicum (Ά-3149) (FERM BP-158), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben és 6-aza-uracillal szemben mutat rezisztenciát.

Mutáns törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4933), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, 6aza-uracillal szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, valamint iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló.

Eredeti törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4412), (FERM BP-1069), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, 6-aza-uracillal szemben és β-nafto-kinolinnal szemben mutat rezisztenciát.

Mutáns törzs: Corynebacterium glutamicum (H-4934), mely S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben, rifampicinnel szemben, streptomycinnel szemben, 6-aza-uracillal szemben, β-nafto-kinolinnal szemben, valamint iturinnal szemben rezisztens.

Az ily módon előállított, iturinnal rokon anyagokkal szemben rezisztens, mutáns Corynebacterium glutamicum H-4934 törzset 1988. január 14-én letétbe helyeztük a Fermentációs Kutató Intézet Ipari Tudományos és Technológiai Kirendeltségén (FRI - Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciense and Technology, Japan) Japánban, FERM BP-1655 letéti számmal.

Az 1. Táblázat a fent említett törzsek szaporodásának mértékét mutatja, minimál agar-táptalajlemezen történő, 24 órás tenyésztés esetén (glükóz: 10 g/1, ammónium-klorid: 1 g/1, kaibamid: 2 g/1, KH₂PO₄: 1 g/1, K₂HPO₄: 3 g/1, MgCl₂-2H₂O: 10 mg/1, ZnSO₄«2H₂O: 0,4 g/1, FeSO₄*7H₂O: 10 mg/1, MnSO₄«4H₂O: 1 mg/1, CuSO₄«5H₂O: 1 mg/1, (ΝΗ₄)₆Μο₇Ο₂₄·4Η₂Ο: 1 mg/1,

-2HU 203788 Β d-biotin: 50 gg/l, agar 20 g/1, pH-7,2). A táptalaj 200 pg/ml iturint tartalmaz (az iturin A és az iturin C, 1:1 tömegarányú keverékét).

1. Táblázat

Iturin (Mg/ml)	H-3149	H-4412	H-4933	H-4934
0	++	++	++	++
200	-	-	++	++

++ megfelelő szaporodás - nincs szaporodás

A találmány céljára előnyös mikroorganizmusok tenyésztése során általában alkalmazhatók azok a táptalajok, amelyeket az aminosavak fermentálással történő előállítása során használnak. Ennek megfe-lelóen, bármely szintetikus vagy természetes táptalaj alkalmas erre a célra, amennyiben kellő mennyiségben tartalmazza a következő, a mikroorganizmusok által asszimilálható anyagokat: szénforrások, nitrogénfonások, anorganikus sók, növekedési faktorok, stb.

Szénforrásként különböző szacharidok, például glükóz, fruktóz, szacharóz, melasz, keményítő-hidrolizátum, stb., továbbá szerves savak, mint például ecetsav, fumársav, citromsav, stb., valamint alkoholok, például etanol, glicerol, mannóz, stb. használ- hatók.

Nitrogénforrásként ammóniát, különböző szervetlen vagy szerves savak ammóniumsóit, például ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot, ammónium-acetátot, ammónium-foszfátot, stb., aminokat, egyéb nitrogéntartalmú vegyületeket, peptonokat, húskivonatokat, gabonaszemek áztatófolyadékát, kazein-hidrolizátumot, szójabab-takarmánypogácsa hidrolizátumát, különböző fermentációs sejteket és emésztési termékeiket használhatjuk.

Anorganikus vegyietekként a kálium-dihidrogénfoszfátot, a dikálium-hidrogén-foszfátot, a magnéziumfoszfátot, a nátrium-kloridot, a ferro-szulfátot, a mangán-szulfátot, a réz-szulfátot, a kalcium-karbonátot, stb. alkalmazhatjuk.

A fentieken kívül különböző vitaminokat, például biotint, tiamint, nikotinsavat, β-alanint, pantoténsavat, stb., aminosavakat, például leucint, valint, aszparaginsavat, glutaminsavat, stb., valamint különböző antibiotikumokat is - például streptomycint, stb. - adhatunk a tenyészethez, szükség esetén.

A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, például oly módon, hogy az állandó rázás közben törtéTenyésztőközeg (pH-7,2)

Glükóz 40 g/1

Pepton 20 g/1

Élesztőkivonat 5 g/1

Karbamid 3 g/1

ΚΗ₂ΡΟ₄ 13 g/1 k₂hpo< 03 g/1

MgSO4»2H₂O 03 g/1

Biotin 50 pg/1 nik, vagy úgy, hogy a rázás mellett levegőátfúvatást alkalmazunk folyadékba merített tenyészetben, 20 és 40 ’C közötti tenyésztési hőmérsékleten, előnyösen 25-38 ’C-on. A táptalaj pH-ja 5 és 9 között, előnyösen a semleges pH közelében tartandó. A táptalaj pH-jának beállítását kálium-karbonát, szervetlen vagy szerves savak, lúgoldatok, ammónia- vagy pH-puffer-oldatok segítségével végezzük.

Általában 1-7 napig tartó tenyésztési időszakot követően a baktériumtenyészetben L-lizin termelődik és halmozódik fel.

A tenyésztés végeztével a csapadékokat - például a sejteket - eltávolítjuk a tenyészetből és kinyerjük belőle az L-lizint, ioncsere-kezelés, koncentrálás, kisózás, izoelektormos pontprecipitáció, stb. egy időben történő alkalmazásával.

A továbbiakban a találmány szerinti eljárást példáink segítségével ismertetjük.

1. példa

Corynebacterium glutamicum Η-3149-et, Η-4412-t, Η-4933-at, vagy Η-4934-et oltottunk be az alábbi tenyésztőközeg 20 ml-ét tartalmazó, 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba, majd a tenyésztést rázás közben (220 ford/perc) végeztük, 30 ’C hőmérsékleten, 24 órán keresztül. Ezt követően a kapott tenyészet 2 ml-ét olyan, 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba oltottuk be, mely az alábbi, a lizin előállítására szolgáló közeg 20 ml-ét tártál-. mazta, majd rázás közben (220 ford/perc), 30 ’C hőmér30 sékleten, 72 órán keresztül végeztük a tenyésztést. A tenyésztés befejeztével kolorimetriás eljárás segítségével, savas réz-ninhidrin felhasználásával mértük a keletkezett l-lizin mennyiségét Megállapítottuk, hogy a tenyészetben a keletkezett L-lizin mennyisége 44 mg/ml,

52 mg/ml, 53 mg/ml, illetve 54 mg/ml volt sósavban kifejezve. Ezt követően a Η-4933-as törzs esetében kapott tenyészet 1000 ml-ét centrifugáltuk, majd az így nyert felülúszót kénsav segítségével 13 pH-ra állítottuk be, s eztuán Diaion SK-18 típusú (H* típus, a Mitsubishi Kaséi

Corporation terméke), igen savas kationcserélő gyantaoszlopon futtattuk keresztül, az L-lizin adszorbeálása céljából. Ezt követően az oszlopot vízzel átmostuk, majd az L-lizin frakciók összegyűjtése céljából - 2N vizes ammóniaoldattal eluáltuk. Az így összegyűjtött frakciókat koncentráltuk és ezt a koncentrált oldatot 2,0 pH-ra állítottuk be sósav segítségével, majd hűtés közben etanolt adtunk hozzá, miáltal az oldatból L-lizin-hidroklorid kristályosodott ki. A keletkezett kristály mennyisége 42 g volt

L-lizin előállításához használt táptalaj (pH-7,2) „Blackstrap” mela$z(glükózban kifejezve) 100 g/1

KH2PO4 03 g/1

Ammónium-szulfát 40 g/1

MgSO4«2H₂O 03 g/1

Karbamid 3 g/1

Kalcium-karbonát 10 g/1

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás L-lizin előállítására, azzal jellemezve, hogy iturinnal rokon anyagokkal szemben ellenálló, L-lizin termelésére képes, Corynebacterium glutamicum mik- 5 roorganizmust táptalajon tenyésztünk, az L-lizint összegyűjtjük a tenyészetben, majd ismert módon kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Corynebacterium glutamicum H-4934 (FERM BP-1655) törzset tenyésztünk.