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ES2980119T3 - Composiciones limpiadoras que contienen dispersinas II - Google Patents

Composiciones limpiadoras que contienen dispersinas II Download PDF

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ES2980119T3
ES2980119T3 ES18799475T ES18799475T ES2980119T3 ES 2980119 T3 ES2980119 T3 ES 2980119T3 ES 18799475 T ES18799475 T ES 18799475T ES 18799475 T ES18799475 T ES 18799475T ES 2980119 T3 ES2980119 T3 ES 2980119T3
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ES
Spain
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seq
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polypeptide
amount
polypeptides
Prior art date
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Active
Application number
ES18799475T
Other languages
English (en)
Inventor
Susanne Wieland
Stefan Karsten
Thomas Weber
Regina Stehr
Marianne Schmeling
Michael Dreja
Mirko Weide
Christian Oehlenschlaeger
Dorotea Raventos Segura
Rebecca Vejborg
Henrik Geertz-Hansen
Lilian Baltsen
Jesper Salomon
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Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones limpiadoras específicas que comprenden polipéptidos que tienen actividad hexosaminidasa. La invención se refiere además al uso de dichas composiciones así como a métodos de uso de dichas composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones limpiadoras que contienen dispersinas II
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones limpiadoras específicas que comprenden polipéptidos con actividad de hexosaminidasa en las que el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, así como motivos conservados específicos. La invención se refiere, además, a la utilización de dichas composiciones, así como a un método de limpieza de un elemento, en el que el elemento se expone a dicha composición limpiadora.
Descripción de la técnica relacionada
Entre los polipéptidos con actividad de hexoaminidasa se incluyen dispersinas tales como la dispersina B (DspB), que son p-N-acetilglucosaminidasas pertenecientes a la familia de la glucósido hidrolasa 20 (GH20). La dispersina B es producida por el patógeno periodontalAggregatibacter actinomycetemcomitans,una bacteria oral gram-negativa. La dispersina B es una p-hexosaminidasa que hidroliza específicamente los enlaces p-1,6-glucosídicos de los polímeros de acetilglucosamina, p. ej., presentes en losbiofilms.La dispersina B contiene tres residuos ácidos altamente conservados: un ácido aspártico en el residuo 183 (D183), un ácido glutámico en el residuo 184 (E184) y un ácido glutámico en el residuo 332 (E332). Se han observadobiofilmsunidos a diversas superficies, incluyendo dispositivos médicos, tales como implantes. El documento n.° WO04061117 A2 (Kane Biotech INC) describe la utilización de composiciones que comprenden DspB para reducir losbiofilmscausados por bacterias productoras de poli-N-acetilglucosamina y Kane et al. han descrito la utilización de composiciones para la reducción de losbiofilmssobre los dispositivos médicos y para el cuidado de heridas. Losbiofilmstambién pueden estar presentes sobre prendas de lavandería, tales como tejidos, otras superficies duras, tales como utensilios de limpieza, lavavajillas y lavadoras, en donde pueden causar malos olores, que resultan difíciles de eliminar y pueden persistir incluso después del lavado. La presente invención proporciona enzimas adecuados para la utilización en composiciones limpiadoras, p. ej., detergentes, y para la limpieza profunda de prendas de lavandería, así como para procedimientos de limpieza.
Descripción resumida de la invención
La presente invención y sus realizaciones preferentes resultarán evidentes a partir del juego adjunto de reivindicaciones.
Descripción general de la lista de secuencias
La SEC ID n.° 1 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SWISSPROT:Q6GYA5 deActinobacillus pleuropneumoniae.
La SEC ID n.° 2 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SWISSPROT:G4AQA6 deAggregatibacter actinomycetemcomitans.
La SEC ID n.° 3 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SWISSPROT:A6VMN2 deActinobacillus succinogenes.
La SEC ID n.° 4 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SWISSPROT:G4CNH0 deNeisseria wadsworthii.
La SEC ID n.° 5 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SEC ID n.° 9 deActinobacillus capsulatus.
La SEC ID n.° 6 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SEC ID n.° 10 deTerribacillus goriensis.
La SEC ID n.° 7 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SEC ID n.° 11 deTerribacillus saccharophilus.
La SEC ID n.° 8 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SEC ID n.° 12 deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 9 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 13 deActinobacillus capsulatus.
La SEC ID n.° 10 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 14 deTerribacillus goriensis.
La SEC ID n.° 11 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 15 deTerribacillus saccharophilus.La SEC ID n.° 12 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 16 deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 13 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deActinobacillus capsulatus.
La SEC ID n.° 14 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deTerribacillus goriensis.
La SEC ID n.° 15 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deTerribacillus saccharophilus.La SEC ID n.° 16 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 17 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 13 deActinobacillus capsulatus.
La SEC ID n.° 18 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 14 deTerribacillus goriensis.
La SEC ID n.° 19 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 15 deTerribacillus saccharophilus.
LaSEC ID n.° 20 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 16 deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 21 es la secuencia conservada [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H.
La SEC ID n.° 22 es el motivo II conservado NYN[AS]Y[SY]LY.
La SEC ID n.° 23 es la señal de secreción deBacillus clausiiMKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA.
La SEC ID n.° 24 es la etiqueta de His HHHHHHPR.
La SEC ID n.° 25 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 29 deCurtobacterium flaccumfaciens.
La SEC ID n.° 26 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 30 deCurtobacterium luteum.
La SEC ID n.° 27 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 31 deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 28 es la secuencia de aminoácidos derivada de SEC ID n.° 32 deCurtobacterium sp. Leaf154.
La SEC ID n.° 29 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deCurtobacterium flaccumfaciens.
La SEC ID n.° 30 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deCurtobacterium luteum.
La SEC ID n.° 31 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 32 es el ADN codificante del polipéptido de longitud completa deCurtobacterium sp. Leaf154.
La SEC ID n.° 33 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 25 deCurtobacterium flaccumfaciens.La SEC ID n.° 34 es el polipéptido maduro n.° 26 deCurtobacterium luteum.
La SEC ID n.° 35 es el polipéptido maduro n.° 27 deCurtobacterium oceanosedimentum.La SEC ID n.° 36 es el polipéptido maduro de SEC ID n.° 28 deCurtobacterium Leaf154.
La SEC ID n.° 37 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de SEC ID n.° 25 deCurtobacterium flaccumfaciens.
La SEC ID n° 38 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de SEC ID n.° 26 deCurtobacterium luteum.La SEC ID n.° 39 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de GH20 de SEC ID n.° 27 deCurtobacterium oceanosedimentum.
La SEC ID n.° 40 es la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de SEC ID n.° 28 deCurtobacterium Leaf154.
La SEC ID n.° 41 es el motivo polipeptídico GXDE.
La SEC ID n.° 42 es el motivo polipeptídico ARAYYPV.
La SEC ID n.° 43 es el motivo polipeptídico AWNDGID.
La SEC ID n.° 44 es el motivo polipeptídico DDQNVGI.
La SEC ID n.° 45 es el motivo polipeptídico DPRIH.
La SEC ID n.° 46 es el motivo polipeptídico [EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN]
Definiciones
Dispersina: el término «dispersina» y la abreviatura «Dsp» se refieren a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, EC 3.2.1, que cataliza la hidrólisis de los enlaces p-1,6-glucosídicos de polímeros N-acetilglucosamina (poli-N-acetilglucosamina) que se encuentran en, p. ej.,biofilms.
Hexosaminidasa: el término «hexosaminidasas» se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa (hexosaminidasas) e incluye EC 3.2.1, p. ej., que cataliza la hidrólisis de los polímeros de N-acetil-D-hexosamina o N-acetil-glucosamina presentes en, p. ej., losbiofilms.El término incluye dispersinas e incluye polipéptidos que presentan actividad de N-acetilglucosaminidasa y actividad de p-N-acetilglucosaminidasa. La expresión «polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa» puede utilizarse intercambiablemente con el término hexosaminidasas y de manera similar la expresión «polipéptido que presenta actividad de p-N-acetilglucosaminidasa» puede utilizarse intercambiablemente con el término p-N-acetilglucosaminidasas. Para los fines de la presente invención, la actividad de hexosaminidasa se determina de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ensayo 1 o 2. En un aspecto, los polipéptidos utilizados en las composiciones de la presente invención presentan por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
Variante alélica: la expresión «variante alélica» se refiere a dos o más formas alternativas cualesquiera de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente mediante mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que presentan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Biofilm:cualquier grupo de microorganismos puede producirse unbiofilmen el que las células se adhieren entre sí o se adhieren a una superficie, tal como un textil, pieza de vajilla o superficie dura u otro tipo de superficie. Dichas células adherentes frecuentemente están incluidas dentro de una matriz autoproducida de sustancia polimérica extracelular (SPE). La SPE debiofilmes un conglomerado polimérico generalmente compuesto de ADN extracelular, proteínas y polisacáridos. Losbiofilmspueden formarse sobre superficies vivas o no vivas. Las células microbianas que crecen en unbiofilmson fisiológicamente diferentes de las células planctónicas del mismo organismo, que, en contraste, son unicelulares y pueden flotar o nadar en un medio líquido. Las bacterias que viven en unbiofilmpresentan propiedades significativamente diferentes de las bacterias planctónicas de la misma especie, ya que el medio denso y protegido de la película les permite cooperar e interactuar de diversas maneras. Un beneficio de este medio para los microorganismos es la resistencia incrementada a detergentes y antibióticos, ya que la matriz extracelular densa y la capa externa de células protegen el interior de la comunidad. Sobre las prendas de lavandería y las superficies duras pueden encontrarse bacterias productoras debiofilmde las especies siguientes:Acinetobacter sp., Aeromicrobium sp., Brevundimonas sp., Microbacterium sp Micrococcus luteus, Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, Stenotrophomonas sp., Enterobacter sp., Xanthomonas sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Burkholderia sp.,Stenotrophomonas sp., Variovorax sp., Escherichia sp., Ralstonia sp., Achromobacter sp., Luteibacter sp., Citrobacter sp., Xanthomonadaceae sp., Halomonas sp., Bordetella sp., Lysobacter sp., Serratia sp., Escherichia sp., Aggregatibacter sp., Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Mycobacterium sp., Neisseria gonorrheae, H. influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuniandEnterococcus faecalis,así como los hongosCandida albicans, Aspergillus flavus, Fusarium solaniyCryptococcus neoformans.En un aspecto, la cepa que comprende el componentebiofilm,p. ej., poli-N-acetilglucosamina, esBrevundimonassp. En un aspecto, la cepa que comprende el componente debiofilm,p. ej., poli-N-acetilglucosamina, esPseudomonas alcaliphilaoPseudomonas fluorescens.En un aspecto, la cepa que comprende el componente debiofilm,p. ej., poli-N-acetilglucosamina, esStaphylococcus aureus.
Dominio catalítico: la expresión «dominio catalítico» se refiere a la región de un enzima que contiene la maquinaria catalítica del enzima.
ADNc: el término «ADNc» se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm procesada y madura que se ha obtenido de una célula eucariótica o procariótica. El ADNc carece de secuencias de intrón que puedan estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito inicial de ARN primario es un precursor del ARNm que es procesado en una serie de etapas, incluyendo el corte y empalme, antes de aparecer como ARNm procesado maduro.
Secuencia codificante: la expresión «secuencia codificante» se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que se inicia con un codón de inicio, tal como ATG, GTG o TTG, y finaliza con un codón de parada, tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
Secuencias de control: la expresión «secuencias de control» se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido codificante de un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o foránea (es decir, de un gen diferente) respecto al polinucleótido codificante del polipéptido o nativas o foráneas una respecto a otra. Entre dichas secuencias de control se incluyen, aunque sin limitación, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido de señal y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con conectores para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido codificante de un polipéptido.
Limpieza profunda: la expresión «limpieza profunda» se refiere a la reducción o eliminación de componentes de unbiofilm,tal como SPE o partes de la misma, polisacáridos, poli-N-acetilglucosamina (PNAG), proteínas, ADN, componentes del suelo u otros presentes en elbiofilm.
Ingrediente complementario de limpieza/detergente: el ingrediente complementario de limpieza, p. ej., detergente, es diferente de la hexosaminidasas de la presente invención. La naturaleza precisa de estos componentes complementarios adicionales y niveles de incorporación de los mismos, dependerá de la forma física de la composición y de la naturaleza de la operación para la que se va a utilizar. Entre los materiales complementarios adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los componentes indicados posteriormente, tales como tensioactivos, mejoradores, adyuvantes de floculación, agentes quelantes, inhibidores de transferencia de colorantes, enzimas, estabilizadores de enzimas, inhibidores de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueo, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes poliméricos, agentes de eliminación de tierra arcillosa/anti-redeposición, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de tejidos, portadores, hidrotropos, mejoradores y co-mejoradores, agentes de teñido de tejidos, agentes antiespumantes, dispersantes, adyuvantes de procesamiento, agentes amargantes y/o pigmentos
Composición limpiadora y/o detergente: las expresiones «composición limpiadora» y «composición detergente» se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a composiciones que encuentran utilidad en la eliminación de compuestos no deseados de los elementos que deben limpiarse, tales como textiles o superficies duras. La composición detergente puede utilizarse para, p. ej., limpiar textiles tanto para la limpieza doméstica como la industrial. Las expresiones comprenden cualesquiera materiales/compuestos seleccionados para el tipo particular de composición limpiadora deseada y la forma del producto (p. ej., composiciones líquidas, de gel, en polvo, granuladas, en pasta o en spray) e incluye, aunque sin limitación, composiciones detergentes (p. ej., detergentes de lavandería líquidos y/o sólidos y detergentes de tejidos finos, suavizantes de tejidos, suavizantes de tejidos (tratamiento de acabado de tejidos), y pretratamiento eliminador de manchas de textiles y lavandería). Además, el término incluye también detergentes lavavajillas manual y automático y detergentes limpiadores para superficies duras. Además de contener el enzima indicado en la presente memoria, la formulación de detergente puede contener uno o más enzimas adicionales (tales como proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasas, xiloglucanasas, pectinasas, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxigenasas, catalasas y mananasas, o cualquier mezcla de las mismas) y/o ingredientes complementarios de detergente, tales como tensioactivos, mejoradores, queladores o agentes quelantes, sistema de blanqueo o componentes de blanqueador, polímeros, acondicionadores de tejidos, reforzadores de espuma, supresores de espumas, tintes, perfume, inhibidores de deslustre, abrillantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de suelo, agentes anticorrosión, inhibidores o estabilizantes enzimáticos, activadores enzimáticos, una o más transferasas, enzimas hidrolíticos, oxidorreductasas, agentes azuladores y colorantes fluorescentes, antioxidantes y solubilizadores.
Beneficio de detergencia enzimática: la expresión «beneficio de detergencia enzimática» se define en la presente memoria como el efecto ventajoso que puede añadirse un enzima a un detergente en comparación con el mismo detergente sin el enzima. Son beneficios importantes de detergencia que pueden ser proporcionados por los enzimas, la eliminación de manchas con muy poca o ninguna suciedad visibles después del lavado y/o limpieza; prevención o reducción de la redeposición de suciedad liberada durante el procedimiento de lavado (un efecto que también se denomina «antirredeposición»); recuperación total o parcial de la blancura de los tejidos que originalmente eran blancos, pero que tras el uso y lavado repetidos han adquirido una apariencia grisácea o amarillenta (un efecto que también se denominada «blanqueamiento»). Los beneficios en el cuidado textil, los cuales no están directamente relacionados con la eliminación catalítica de manchas o la prevención de la redeposición de suciedad, también son importantes para los beneficios de detergencia de los enzimas. Son ejemplos de dichos beneficios de cuidado textil, la prevención o la reducción de la transferencia de colorantes de un tejido a otro, o de una parte del mismo tejido (un efecto que también se ha denominado «inhibición de la transferencia de colorantes» o «antiretroteñido»); la eliminación de fibras sobresalientes o rotas de la superficie del tejido para reducir la tendencia a formarse bolitas de pelusa o para eliminar las bolitas o pelusa ya existente (un efecto que también se denomina antibolitas); la mejora de la suavidad del tejido; la clarificación del color del tejido y la eliminación de suciedades particuladas que están atrapadas en las fibras del tejido o prenda.
Expresión: el término «expresión» incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, incluyendo, aunque sin limitación, la transcripción, la modificación post-transcripcional, la traducción, la modificación posttraduccional y la secreción.
Vector de expresión: la expresión «vector de expresión» se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido codificante de un polipéptido y que está operablemente ligado a secuencias de control que controlan su expresión.
Fragmento: el término «fragmento» se refiere a un polipéptido que presenta uno o más (p. ej., varios) aminoácidos ausentes del extremo aminoterminal y/o carboxiloterminal de un polipéptido o dominio maduro, en el que el fragmento presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 350 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 105 a 454 de SEC ID n.° 20), por lo menos 355 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 454 de SEC ID n.° 20), por lo menos 360 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 459 de SEC ID n.° 20) o por lo menos 450 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 5 a 454 de SEC ID n.° 20) o por lo menos 450 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 450 de SEC ID n.° 20). En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 300 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 300 de SEC ID n.° 33), por lo menos 350 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 350 de SEC ID n.° 33), por lo menos 340 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 349 de SEC ID n.° 33) o por lo menos 400 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 5 a 404 de SEC ID n.° 33) o por lo menos 440 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 440 de SEC ID n.° 33). En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 300 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 300 de SEC ID n.° 34), por lo menos 350 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 350 de SEC ID n.° 34), por lo menos 340 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 349 de SEC ID n.° 34) o por lo menos 400 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 5 a 404 de SEC ID n.° 34) o por lo menos 440 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 440 de SEC ID n.° 34). En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 350 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 105 a 454 de SEC ID n.° 35), por lo menos 355 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 454 de SEC ID n.° 35), por lo menos 360 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 459 de SEC ID n.° 35) o por lo menos 450 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 5 a 454 de SEC ID n.° 35) o por lo menos 450 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 450 de SEC ID n.° 35). En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 300 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 300 de SEC ID n.° 34), por lo menos 290 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 290 de SEC ID n.° 34), por lo menos 275 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 100 a 284 de SEC ID n.° 34) o por lo menos 270 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 5 a 274 de SEC ID n.° 34) o por lo menos 260 residuos aminoácidos (p. ej., los aminoácidos 1 a 260 de SEC ID n.° 34).
Célula huésped: la expresión «célula huésped» se refiere a cualquier tipo celular que sea susceptible a la transformación, transfección, transducción o similar con un constructo o vector de expresión de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión «célula huésped» comprende cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.
Aislado: el término «aislado» significa una sustancia en una forma o medio en que no ocurre en la naturaleza. Entre los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas se incluyen: (1) cualquier sustancia no existente naturalmente, (2) cualquier sustancia, incluyendo, aunque sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se ha separado por lo menos parcialmente respecto de uno o más, o la totalidad, de los constituyentes presentes normalmente con los que está asociado en la naturaleza, (3) cualquier sustancia modificada artificialmente respecto a esa sustancia tal como se encuentra naturalmente, o (4) cualquier sustancia modificada mediante incremento de la cantidad de la sustancia respecto a otros componentes con los que se encuentra asociada naturalmente (p. ej., la producción recombinante en una célula huésped; múltiples copias de un gen codificante de la sustancia, y la utilización de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen codificante de la sustancia).
Rendimiento mejorado de lavado: la expresión «rendimiento mejorado de lavado» se define en la presente memoria como un enzima que muestra un rendimiento de lavado incrementado en una composición de detergente respecto al rendimiento de lavado de la misma composición de detergente sin el enzima, p. ej., mediante eliminación incrementada de las manchas o menor redeposición. La expresión «rendimiento de lavado mejorado» incluye el rendimiento de lavado en lavandería.
Lavandería: el término «lavandería» se refiere tanto a la lavandería doméstica como a la lavandería industrial y se refiere al procedimiento de tratamiento de textiles con una solución que contiene una composición limpiadora o detergente de la presente invención. El procedimiento de lavandería puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando una lavadora doméstica o industrial, o puede llevarse a cabo a mano.
Malos olores: la expresión «malos olores» se refiere a olores que no se desean en las prendas limpias. La prenda limpia debe presentar un olor fresco y limpio, sin malos olores adheridos a la prenda. Un ejemplo de mal olor son compuestos con un olor desagradable, que puede ser producido por microorganismos. Otro ejemplo de olores desagradables puede ser el olor a sudor u olor corporal adherido a una prenda que ha estado en contacto con el ser humano o animal. Otro ejemplo de mal olor puede ser el olor de especias, que se engancha a las prendas, por ejemplo de curry u otras especias exóticas de olor fuerte.
Polipéptido maduro: la expresión «polipéptido maduro» se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualesquiera modificaciones post-traduccionales, tales como el procesamiento N-terminal, el truncado C-terminal, la glucosilación, la fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 27 a 378 de SEC ID n.° 9 y los aminoácidos 1 a 26 de SEC ID n.° 9 constituyen un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC iD n.° 17. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 26 a 349 de la SEC ID n.° 19 y los aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID n.° 10 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 18. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 42 a 365 de la SEC ID n.° 11 y los aminoácidos 1 a 41 de la SEC ID n.° 11 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 19. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 25 a 485 de la SEC ID n.° 12 y los aminoácidos 1 a 24 de la SEC ID n.° 12 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 20. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 42 a 486 de la SEC ID n.° 25 y los aminoácidos 1 a 41 de la SEC ID n.° 25 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 33. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 42 a 486 de la SEC ID n.° 26 y los aminoácidos 1 a 41 de la SEC ID n.° 26 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 34. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 24 a 481 de la SEC ID n.° 27 y los aminoácidos 1 a 23 de la SEC ID n.° 27 son un péptido de señal. En un aspecto, el polipéptido maduro es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 35. En otro aspecto, el polipéptido maduro consiste esencialmente en los aminoácidos 26 a 475 de la SEC ID n.° 28 y los aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID n.° 28 son un péptido de señal.
Es conocido de la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduro diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleótido. También es conocido que diferentes células huésped procesan los polipéptidos de manera diferente, y de esta manera, una célula huésped que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (p.ej., con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula huésped que expresa el mismo polinucleótido.
Secuencia codificante de polipéptido maduro: la expresión «secuencia codificante de polipéptido maduro» se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste esencialmente en los nucleótidos 73 a 1455 de la SEC ID n.° 16 o la secuencia de ADNc del mismo y los nucleótidos 1 a 72 de la SEC ID n.° 16 son el péptido de señal. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste esencialmente en los nucleótidos 124 a 1458 de la SEC ID n.° 29 o la secuencia de ADNc del mismo y los nucleótidos 1 a 123 de la SEC ID n.° 29 son el péptido de señal. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste esencialmente en los nucleótidos 124 a 1458 de la SEC ID n.° 30 o la secuencia de ADNc del mismo y los nucleótidos 1 a 123 de la SEC ID n.° 30 son el péptido de señal. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste esencialmente en los nucleótidos 70 a 1443 de la SEC ID n.° 31 o la secuencia de ADNc del mismo y los nucleótidos 1 a 69 de la SEC ID n.° 31 son el péptido de señal. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro consiste esencialmente en los nucleótidos 76 a 1425 de la SEC ID n.° 32 o la secuencia de ADNc del mismo y los nucleótidos 1 a 75 de la SEC ID n.° 32 son el péptido de señal.
Constructo de ácidos nucleicos: la expresión «constructos de ácidos nucleicos» se refiere a una molécula de ácidos nucleicos, de cadena sencilla o de doble cadena, que se aísla de un gen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no existiría de otro modo en la naturaleza o que es sintética y/o que comprende una o más secuencias de control.
Operablemente ligada: la expresión «operablemente ligada» se refiere a una configuración en la que se introduce una secuencia de control en una posición adecuada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
Identidad de secuencias: el grado de relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencia de nucleótidos se describe mediante el parámetro «identidad de secuencias».
Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implemente en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados con: penalización de hueco abierto de 10, penalización de extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). Se utiliza el resultado de Needle etiquetado como «identidad más larga» (obtenida utilizando la opción «-nobrief») como el porcentaje de identidad y se calcula del modo siguiente:
(Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineación - Número total de huecos alineados)
Condiciones de astringencia: las diferentes condiciones de astringencia se definen del modo siguiente.
La expresión «condiciones de muy baja astringencia» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 25 %, siguiendo procedimientos de transferencia southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,8X SSC, SDS al 0,2 % a 55 °C.
La expresión «condiciones de baja astringencia» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 25 %, siguiendo procedimientos de transferencia southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,8X SSC, SDS al 0,2 % a 60 °C.
La expresión «condiciones de astringencia intermedia» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos de transferencia southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,8X SSC, SDS al 0,2 % a 65 °C.
La expresión «condiciones de astringencia intermedia-alta» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos de transferencia southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,8X SSC, SDS al 0,2 % a 70 °C.
La expresión «condiciones de astringencia alta» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 50 %, siguiendo procedimientos de transferencia southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,4X SSC, SDS al 0,2 % a 70 °C.
La expresión «condiciones de astringencia muy alta» se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 50 %, siguiendo procedimientos de transferencia Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada vez durante 15 minutos utilizando 0,4X SSC, SDS al 0,2 % a 75 °C.
Subsecuencia: El término «subsecuencia» se refiere a un polinucleótido que presenta uno o más (p. ej., varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante de polipéptido maduro; en el que la subsecuencia codifica un fragmento que presenta actividad de hexosaminidasa.
Polipéptido sustancialmente puro: La expresión «polipéptido sustancialmente puro» se refiere a una preparación que contiene como máximo 10 %, como máximo 8 %, como máximo 6 %, como máximo 5 %, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 %, como máximo 1 % y como máximo 0,5 % en peso de otro material polipéptido con el que está asociado nativa o recombinantemente. Preferentemente, el polipéptido puro por lo menos al 92 %, p. ej., por lo menos al 94 %, por lo menos al 95 %, por lo menos al 96 %, por lo menos al 97 %, por lo menos al 98 %, por lo menos al 99 %, por lo menos al 99,5 % y al 100 % en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Los polipéptido de la presente invención preferentemente se encuentran en una forma sustancialmente pura. Lo anterior puede conseguir, por ejemplo, mediante la preparación del polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o mediante métodos de purificación clásica.
Variante: El término «variante» se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, de uno o más (varios) residuos aminoácidos en una o más (es decir, varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición, y una inserción significa la adición de 1, 2, 3, 4, 5, etc. aminoácidos contiguos y que siguen inmediatamente al aminoácido que ocupa la posición.
En un aspecto, una variante de hexosaminidasa puede comprender entre 1 y 5, entre 1 y 10, entre 1 y 15, entre 1 y 20, entre 1 y 25, entre 1 y 30, entre 1 y 35, entre 1 y 40, entre 1 y 45, o entre 1 y 50, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 alteraciones y que presenta por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa de la hexosaminidasa parental, tal como SEC ID n.° 20.
En un aspecto, una variante de hexosaminidasa puede comprender entre 1 y 5, entre 1 y 10, entre 1 y 15, entre 1 y 20, entre 1 y 25, entre 1 y 30, entre 1 y 35, entre 1 y 40, entre 1 y 45, o entre 1 y 50, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 alteraciones y que presenta por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa de la hexosaminidasa parental, tal como SEC ID n.° 33.
En un aspecto, una variante de hexosaminidasa puede comprender entre 1 y 5, entre 1 y 10, entre 1 y 15, entre 1 y 20, entre 1 y 25, entre 1 y 30, entre 1 y 35, entre 1 y 40, entre 1 y 45, o entre 1 y 50, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 alteraciones y que presenta por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa de la hexosaminidasa parental, tal como SEC ID n.° 34.
En un aspecto, una variante de hexosaminidasa puede comprender entre 1 y 5, entre 1 y 10, entre 1 y 15, entre 1 y 20, entre 1 y 25, entre 1 y 30, entre 1 y 35, entre 1 y 40, entre 1 y 45, o entre 1 y 50, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 alteraciones y que presenta por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa de la hexosaminidasa parental, tal como SEC ID n.° 35.
Nomenclatura
Para los fines de la presente invención, la nomenclatura [IV] o [I/V] significa que el aminoácido en esta posición puede ser isoleucina (Ile, I) o valina (Val, V). De manera similar, la nomenclatura [LVI] y [L/V/I] significa que el aminoácido en esta posición puede ser una leucina (Leu, L), valina (Val, V) o isoleucina (Ile, I), etc. para otras combinaciones tales como las indicadas en la presente memoria. A menos que se limite de otro modo adicionalmente, el aminoácido X se define de manera que puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos naturales.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a composiciones tal como se definen en la presente memoria que comprenden polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de PNAG (poli-N-acetilglucosamina). La materia orgánica, tal como unbiofilm,produce SPE (sustancias poliméricas extracelulares), que con frecuencia comprenden polisacáridos, tales como PNAG. Por lo tanto, los polipéptidos descritos en la presente memoria resultan eficaces para prevenir, reducir y eliminar componentes orgánicos, tales como PNAG. La materia orgánica, tal como unbiofilm,asociada a procedimientos de limpieza, p. ej., en textiles, tales como la lavandería, es un reto importante, ya que puede estar asociada a problemas relevantes para el consumidor, tales como, p. ej., malos olores y redeposición. Se han realizado varios intentos para resolver diversos aspectos de los problemas relacionados con elbiofilmen la lavandería, muchos de los cuales están relacionados con la eliminación de los malos olores. El documento n.° WO2014/087011 describe la utilización de una desoxirribonucleasa (ADNasa) y otros enzimas para reducir los malos olores en la lavandería y/o textiles; el documento n.° WO99/09143 describe la utilización de una o más oxidorreductasas en combinación con un mediador para la reducción de los malos olores, y el documento n.° WO2012/112718 describe un método para inhibir la producción de malos olores en la lavandería causados por bacterias, mediante la utilización de diversas cepas deBacillus.La presente invención se refiere a la limpieza, p. ej., composiciones detergentes que comprenden polipéptidos, preferentemente que presentan un dominio catalítico Gluco_hidro_20 según define PFAM (PF00728, Pfam, versión 31.0 Finn (2016). Nucleic Acids Research, Database Issue 44: D279-D285) opcionalmente en el que el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7 con el programa de software hmmbuild, realizando la búsqueda utilizando el programa de software hmmscan con los parámetros por defecto y en el que el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Según la presente invención, el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41). El motivo GXDE (SEC ID n.° 41) está situado en las posiciones correspondientes a las posiciones 275 a 278 enCurtobacterium luteum(SEC ID n.° 34). Los residuos D y E son los residuos catalíticos clave de las hexosaminidasas (posiciones 277 a 278 en SEC ID n.° 34).
La invención se refiere a composiciones, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) o GXDE (SEC ID n.° 41), en donde los polipéptidos presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de p-N-acetilglucosamininidasa, tal como actividad de PNAG. En un aspecto particular, el polipéptido se obtiene del géneroCurtobacterium.Preferentemente, los polipéptidos pertenecen al clado ARAY, que comprende polipéptidos de origen bacteriano, que presentan actividad de PNAG. Los polipéptidos del clado comprenden el motivo de ejemplo ARAYYPV (SEC ID n.° 42), correspondiente a las posiciones 124 a 130 de SEC ID n.° 34, donde R en la posición 125 en SEC ID n.° 34 es parte del sitio activo. Otro motivo que puede estar comprendido en los polipéptidos<del clado ARAY es AWNDGID>(sEc<ID n.° 439, correspondiente a 306 a 312 en SEC ID n.° 34. Un motivo adicional>que puede estar comprendido en los polipéptidos del clado ARAY es DDQNVGI (SEC ID n.° 44), correspondiente a los aminoácidos 154 a 160 en SEC ID n.° 34. Un motivo adicional que puede estar comprendido en los polipéptidos del clado ARAY es DPRIH (SEC ID n.° 45), correspondiente a los aminoácidos 320 a 324 en SEC ID n.° 34.
Un aspecto de la invención se refiere a composiciones tal como se define en la presente memoria que comprenden polipéptidos que comprenden el motivo o motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC<ID n.° 22) y/o GXDE (SEC ID n.° 41). El polipéptido puede comprender, además, el motivo o motivos>ArAyYPV<(SEC>ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde los polipéptidos presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de p-N-acetilglucosamininidasa, tal como actividad de PNAG.
En la figura 1 se muestra una alineación de los polipéptidos descritos en la presente memoria y comprendidos en el clado. En la figura 2 se muestra un árbol filogenético del clado ARAY.
Se dan a conocer, además, métodos de limpieza/lavandería y métodos para la limpieza profunda de un elemento, tal como una superficie dura o un textil, y la utilización de una composición tal como se define en las reivindicaciones. En particular, los polipéptidos que comprenden uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, tales como el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41) y que presentan actividad de hexosaminidasa resultan útiles en métodos de lavandería para la limpieza profunda de los elementos que se están lavando. Los inventores han encontrado inesperadamente que polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa y que comprenden uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda tal como se ha descrito anteriormente, p. ej., polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H, NYN[AS]Y[SY]LY o GXDE, resultan particularmente útiles para la limpieza profunda de lavandería y superficies duras. La dispersina B (DspB), que pertenece a la familia de GH20, es conocida por sus propiedades de eliminación y reducción de PNAG, p. ej. el documento n.° WO200406117 describe composiciones que comprenden DspB. La composición puede incluir un detergente, que puede ser aniónico, catiónico o no iónico. Sin embargo, no hay ninguna indicación en la técnica de la utilización de DspB en procedimientos de limpieza tales como lavandería o en composiciones detergentes que comprenden, p. ej., mejoradores y/o blanqueadores. Para resultar útiles en procedimientos de limpieza, los enzimas necesitan realizar su acción en los detergentes bajo las condiciones de procedimientos de limpieza tales como la lavandería, que incluyen la estabilidad en la presencia de componentes detergentes, tales como componentes tensioactivos, mejoradores y blanqueadores. Los componentes de un detergente pueden afectar significativamente al rendimiento de enzimas tales como DspB. La presente solicitud de se refiere a otro grupo de dispersinas, las cuales son distinguibles de la dispersina B. Los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa comprenden uno o la totalidad de los motivos [V]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) o GXDE (SEC ID n.° 41), preferentemente se obtienen deCurtobacteriumy preferentemente están comprendidos en el clado ARAY. El clado ARAY comprende polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45). Los inventores inesperadamente muestran que los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa y que comprenden uno o más dominios catalíticos, y opcionalmente uno o más de los motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y/o uno o más de los motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde el dominio catalítico GH20 preferentemente proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda tal como se ha indicado anteriormente, resultan útiles para la reducción y/o eliminación de la materia orgánica, p. ej., SPE y/o PNAG asociados a la limpieza, p. ej., sobre textiles o en lavadoras.
Por ejemplo, el polipéptido de SEC ID n.° 8 comprende un dominio catalítico Gluco_hidro_20 y proporciona una puntuación domT de 282 al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov preparado tal como se describe posteriormente, muestra actividad de hexosaminidasa (ver el ensayo 1 y, p. ej., la Tabla 2 del Ejemplo 4) y una capacidad de limpieza profunda en la presencia de detergente (ver la Tabla 3 del Ejemplo 5).
Composición limpiadoras que comprenden polipéptidos con actividad de hexosaminidasa
En un aspecto, la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7 con el programa de software hmmbuild, en donde la búsqueda se realiza utilizando el programa de software hmmscan con los parámetros por defecto.
La teoría subyacente al perfil de modelo oculto de Markov (HMM, por sus siglas en inglés) descrita en Durbin et al. (Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998) y en Krogh et al. (1994 J. Mol. Biol. 235:1501- 1531), incorporando ambas en la presente memoria como referencias, es la caracterización de un conjunto de proteínas basándose en la probabilidad de ocurrencia de cada aminoácido en cada posición en la alineación de las proteínas del conjunto.
Un dominio GH20 se define de la manera siguiente. Las SEC ID n° 1 a 7, que son secuencias parciales de las entradas de Uniprot o de las secuencias polipeptídicas dadas a conocer en la presente memoria, tal como se explica en el apartado de «vista general de la lista de secuencias», se alinean utilizando el programa de software MUSCLE v3.8.31 con los parámetros por defecto. Utilizando dicha alineación, se construye un modelo oculto de Markov (HMM) para el dominio GH20 como una extensión de la definición de dominio GH20 del estado de la técnica. El HMM se construye utilizando el programa de software «hmmbuild» del paquete HMMER 3.1b2 (febrero de 2015) (http://hmmer.org/) y el software se invoca utilizando los parámetros por defecto.
Se define un dominio GH20 para corresponderse con el HMM anteriormente mencionado utilizando el programa de software «hmmscan» del paquete HMMER 3.1b2 (febrero de 2015) (http://hmmer.org/) utilizando los parámetros por defecto en el caso de que la puntuación domT sea de 150 o superior. En una realización preferente, la puntuación domT es de 160 o superior, preferentemente de 180 o superior, más preferentemente de 190 o superior, todavía más preferentemente de 200 o superior, o lo más preferentemente, de 250 o superior.
El perfil de HMM del dominio GH20 tal como se ha generado utilizando las SEC ID n.° 1 a 7 siguiendo el procedimiento anterior se proporciona en el Ejemplo 1. El perfil HMM puede copiarse en un archivo de texto que seguidamente se carga en el programa de software «hmmscan» para que puedan someterse a ensayo otros polipéptidos para averiguar si el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20.
De manera similar, el perfil HMM del domino Gluco_hydro_20 se ha generado con Pfam (PF00728, http://pfam.xfam.org/family/PF00728) utilizando hmmbuild y parámetros especificados (http://pfam.xfam.org/family/PF00728#tabview=tab6). El perfil HMM puede obtenerse de Pfam (http://pfam.xfam.org/family/PF00728) y copiarse en un archivo de texto que seguidamente se carga en el programa de software «hmmscan» para que puedan someterse a ensayo otros polipéptidos para averiguar si el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20. En algunos aspectos, la invención se refiere a una composición limpiadora que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el dominio catalítico Gluco_hidro_20 comprende uno o más motivos seleccionados del motivo I: [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) o uno o más motivos II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22).
Algunos aspectos de la invención se refieren a la utilización en un procedimiento de limpieza de una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende un dominio catalítico GH20 que presenta una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov preparado utilizando las SEC ID n.° 1 a 7 utilizando el programa de software hmmbuild tal como se ha indicado anteriormente, preferentemente que comprende uno o más motivos seleccionados de motivo I:
[IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) y/o uno o más motivos II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones detergentes tal como se definen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que comprende un dominio catalítico GH20 que presenta una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov preparado utilizando las SEC ID n.° 1 a 7 utilizando el programa de software hmmbuild tal como se ha indicado anteriormente, preferentemente que comprende uno o más motivos seleccionados de motivo I:
[IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) y/o uno o más motivos II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Un aspecto de la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7, incluyendo la utilización del programa de software hmmbuild, en donde la búsqueda se realiza utilizando el programa de software hmmscan con los parámetros por defecto.
En un aspecto preferente, el polipéptido presenta actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa. El polipéptido presenta actividad de hexosaminadasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o de 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35. Un aspecto se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7, incluyendo la utilización del programa de software hmmbuild, llevando a cabo la búsqueda mediante la utilización del programa de software hmmscan con los parámetros por defecto, en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o de 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
Los polipéptidos comprenden el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41).
Un aspecto de la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41).
Los polipéptidos presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa.
Un aspecto de la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41).
El polipéptido presenta actividad de hexosaminadasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o de 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
La invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41),
en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC iD n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
El polipéptido preferentemente comprende, además, uno o más de los motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45).
Un aspecto de la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, en donde el polipéptido comprende, además, uno o más de los motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45).
Un aspecto de la invención se refiere a una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende, además, uno o más de los motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45),
en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC iD n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
La cantidad de polipéptido puede estar comprendida en el intervalo de 0,00004 a 100 ppm, tal como en el intervalo de 0,00008 a 50 ppm, en el intervalo de 0,00001 a 20, en el intervalo de 0,0002 a 20 ppm, en el intervalo de 0,0001 a 50 ppm, en el intervalo de 0,0002 a 50, en el intervalo de 0,0004 a 50, en el intervalo de 0,0008 a 50, en el intervalo de 0,001 a 50 ppm, 0,01 a 50 ppm, preferentemente de 0,0001 a 50 ppm, más preferentemente de 0,0002 a 20 ppm, más preferentemente de 0,0002 a 10 ppm, más preferentemente de 0,001 a 10 ppm, y lo más preferentemente, de 0,002 a 10 ppm. La hexosaminidasas puede encontrarse en una cantidad correspondiente a por lo menos 0,00001 ppm, tal como de por lo menos 0,00002 ppm, de por lo menos 0,0001 ppm, de por lo menos 0,0002 ppm, de por lo menos 0,0005 ppm, de por lo menos 0,001 ppm, de por lo menos 0,002 ppm, de por lo menos 0,005 ppm, de por lo menos 0,01 ppm o de por lo menos 0,02 ppm. La composición puede comprender por lo menos 0,00008 %, preferentemente por lo menos 0,00001 %, 0,00002 %, 0,0001 %, 0,0002 %, 0,001 %, 0,002 %, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,008 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % o 1,0 % de hexosaminidasa.
Las composiciones limpiadoras, tal como se definen en la presente memoria, comprenden uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41).
Algún aspecto de la invención se refiere a composiciones detergentes, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden: a) un polipéptido que comprende un dominio catalítico Gluco_hidro_20, preferentemente que comprende uno o ambos motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) o NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), en donde el polipéptido se selecciona de polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2, SEC ID n.° 3, SEC ID n.° 4, SEC ID n.° 5, SEC ID n.° 6, SEC ID n.° 7, SEC ID n.° 8, SEC ID n.° 37, SEC ID n.° 38, SEC ID n.° 39, SEC ID n.° 40 y polipéptidos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 60 %, p. ej., 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a los mismos, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa, y b) por lo menos un agente limpiador, tal como un tensioactivo, preferentemente por lo menos un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en tensioactivos aniónicos, no iónicos y/o catiónicos.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la utilización en un procedimiento de limpieza de una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende la SEC ID n.° 20 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones detergentes, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 20 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la utilización en un procedimiento de limpieza de una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende la SEC ID n.° 33 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones detergentes, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 33 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la utilización en un procedimiento de limpieza de una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende la SEC ID n.° 34 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones detergentes, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 34 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algunos aspectos de la invención se refieren a la utilización en un procedimiento de limpieza de una composición limpiadora, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende la SEC ID n.° 35 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algunos aspectos de la invención se refieren a composiciones detergentes, tal como se definen en la presente memoria, que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 35 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a la misma, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,01 ppm de polipéptido de enzima activo, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7, incluyendo la utilización del programa de software hmmbuild, en donde la búsqueda se realiza utilizando el programa de software hmmscan con los parámetros por defecto, que opcionalmente comprende uno o más motivos seleccionados del motivo I: [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) o uno o más motivos II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22).
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,0001 ppm de polipéptido de enzima activo, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos GH20, en donde el dominio catalítico GH20 proporciona una puntuación domT de 150 o superior al realizar una búsqueda utilizando un perfil de modelo oculto de Markov utilizando las SEC ID n.° 1 a 7, incluyendo la utilización del programa de software hmmbuild, en el que la búsqueda se realiza utilizando el programa de software hmmscan con parámetros por defecto, en donde el polipéptido opcionalmente comprende uno o ambos motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21) o NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), en donde el polipéptido se selecciona de polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2, SEC ID n.° 3, SEC ID n.° 4, SEC ID n.° 5, SEC ID n.° 6, SEC ID n.° 7, SEC ID n.° 8, SEC ID n.° 37, SEC ID n.° 38, SEC ID n.° 39, SEC ID n.° 40 y polipéptidos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 60 %, p. ej., 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto a los mismos, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,01 ppm de polipéptido de enzima activo que comprende SEC ID n.° 20 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto al mismo, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,0001 ppm de polipéptido de enzima activo que comprende SEC ID n.° 20 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al mismo, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,01 ppm de polipéptido de enzima activo que comprende SEC ID n.° 33 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al mismo, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,01 ppm de polipéptido de enzima activo que comprende SEC ID n.° 34 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al mismo, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa. Algún aspecto de la invención se refiere a una composición detergente, tal como se define en la presente memoria, que comprende por lo menos 0,01 ppm de polipéptido de enzima activo que comprende SEC ID n.° 35 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al mismo, en donde el polipéptido presenta actividad de hexosaminidasa.
Todas las composiciones descritas en la presente memoria pueden comprender tensioactivos, preferentemente, si no se indica lo contrario, entre una proporción de entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 50 % en peso, de entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 40 % en peso, de entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 30 % en peso, de entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 20 % en peso, de entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 10 % en peso de tensioactivos. «Aproximadamente», tal como se utiliza en la presente memoria en relación con un valor numérico, se refiere a dicho valor ±10 %, preferentemente ±5 %. «Aproximadamente 5%en peso» significa, de esta manera, entre 4,5%y 5,5%en peso, preferentemente entre 4,75 % y 5,25 % en peso. A menos que se indique lo contrario, el tensioactivo puede seleccionarse generalmente de tensioactivos no iónicos, aniónicos y/o anfotéricos. En general, resultan preferentes los tensioactivos estables frente al blanqueo. Los tensioactivos aniónicos preferentes son los tensioactivos sulfato, y en particular los sulfatos de éter alquílico, especialmente los sulfatos de éter alquílico C9-C i5, preferentemente los etoxilatos o etoxilatos/propoxilatos mixtos, tales como aquellos con 1 a 30 OE (óxidos de etileno), etoxilato de alcohol primario C2-C15, tal como aquellos con 1 a 30 unidades de OE, sulfatos de éster C8-C16 y sulfatos de éster C10-C14, tales como los sulfatos de éster monododecílico. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos aniónicos se incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS, por sus siglas en inglés), en particular sulfonatos de alquilbenceno C12-C13, isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanosulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, sulfatos de alquilo (AS, por sus siglas en inglés), tales como dodecilsulfato sódico (SDS), sulfatos de alcohol graso (FAS, por sus siglas en inglés), sulfatos de alcohol primario (PAS, por sus siglas en inglés), etersulfatos de alcohol (Ae S, AEOS o FES, también conocidos como etoxisulfatos de alcohol o sulfatos de éter de alcohol graso, alcanosulfonatos secundarios (SAS, por sus siglas en inglés), sulfonatos de parafina (PS, por sus siglas en inglés), sulfonatos de éster, ésteres de glicerol de ácido graso sulfonado, ésteres metílicos de alfa-sulfoácidos grasos (alfa-SFMe o SES, por sus siglas en inglés), incluyendo sulfonato de éster metílico (MES, por sus siglas en inglés), ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil-succínico (DTSA, por sus siglas en inglés), derivados de ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres de ácido sulfosuccínico o sal de ácidos grasos (jabón), y combinaciones de los mismos. Los tensioactivos aniónicos preferentemente se añaden al detergente en la forma de sales. Los cationes adecuados en dichas sales son iones de metal alcalino, tales como sales de sodio, potasio y litio, y sales de amonio, por ejemplo (2 -hidroxietil)amonio, bis(2 -hidroxetil)amonio y tris(2 -hidroxietil)amonio. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos no iónicos se incluyen etoxilatos de alcohol (Ae 0 AEO), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos propoxilados (PFA, por sus siglas en inglés), ésteres alquílicos de ácido graso alcoxilado, tales como ésteres alquílicos de ácido graso etoxilado y/o propoxilado, etoxilatos de alquilfenol (APE, por sus siglas en inglés), etoxilatos de nonilfenol (NPE, por sus siglas en inglés), alquilpoliglucósido (a Pg , por sus siglas en inglés), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graso (FAM, por sus siglas en inglés), dietanolamidas de ácido graso (FADA, por sus siglas en inglés), monoetanolamidas de ácido graso etoxiladas (EFAM, por sus siglas en inglés), monoetanolamidas de ácido graso propoxiladas (PFAM, por sus siglas en inglés), amidas de ácidos grasos alquilados polihidroxilados o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamidas de ácido graso, FAGA, por sus siglas en inglés), así como productos disponibles bajo los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos. Entre los tensioactivos no iónicos disponibles comercialmente se incluyen las gamas Plurafac ™, Lutensol™ y Pluronic™ de BASF, la serie Dehypon™ de Cognis y la serie Genapol™ de Clariant.
En diversas realizaciones, dicho tensioactivo preferentemente comprende por lo menos un sulfato de éter alquílico.
Los sulfatos de éter alquílico preferentes son los de fórmula (I):
R1-O-(AO)n-SO3- X+ (I).
En la fórmula (I) R1 representa un grupo alquilo sustituido o no sustituido lineal o ramificado, preferentemente un grupo alquilo no sustituido lineal, más preferentemente una fracción de alcohol graso. Las fracciones R1 preferentes se seleccionan del grupo que consiste en las fracciones decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo y eicosilo, y mezclas de las mismas, en donde resultan preferentes aquellos grupos con un número par de átomos de carbono. Las fracciones R1 particularmente preferentes se derivan de alcoholes grasos C10-C18, tales como los derivados de alcoholes de aceite de coco, aceites de alcoholes grasos de sebo, alcohol laurílico, miristílico, cetílico o estearílico o de oxoalcoholes C10-C20.
AO representa un grupo de óxido de etileno (OE) u óxido de propileno (OP), preferentemente un grupo óxido de etileno. El índice «n» representa un número entero entre 1 y 50, preferentemente entre 1 y 20, y más preferentemente, entre 1 y 10. Resulta particularmente preferente que «n» sea 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8. X representa un catión monovalente o la n-ésima parte de un catión n-valente; resultan preferentes los cationes de metal alcalino, específicamente Na+ y K+; lo más preferentemente, Na+. Pueden seleccionarse cationes X+ adicionales de entre NH4+, % Zn2+,% Mg2+,% Ca2+,% Mn2+, y combinaciones de los mismos.
En diversas realizaciones preferentes, las composiciones detergentes comprenden un sulfato de éter alquílico seleccionado de sulfatos de éter de alcohol graso de fórmula (II):
en la que k=9 a 19, y n=1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Los sulfatos de éter de alcohol graso C10-16 con 1 a 7 OE (k=9 a 15, n=1 a 7), tal como los sulfatos de éter de alcohol graso C12-14 con 1 a 3, particularmente 2 OE (k=11 a 13, n=1 a 3 o 2), más particularmente, las sales de sodio de los mismos. Una realización específica de los mismos es la sal sódica de sulfato de éter laurílico con 2 OE. El nivel de etoxilación es un valor medio y puede ser, para un compuesto específico, un número entero o un número fraccionario.
En diversas realizaciones, el tensioactivo comprende por lo menos un sulfonato de alquilbenceno. Dicho sulfonato de alquilbenceno puede estar presente alternativamente al sulfato de éter alquílico anteriormente indicado o, preferentemente, además del mismo.
Entre los sulfonatos de alquilbenceno de ejemplo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sulfonatos de alquilbenceno lineales y ramificados, preferentemente sulfonatos de alquilbenceno lineales. Son compuestos ejemplares aquellos de fórmula (NI):
en la que R' y R" son, independientemente, H o alquilo y combinados comprenden 9 a 19, preferentemente 9 a 15, y más preferentemente 9 a 13 átomos de carbono. Resultan particularmente preferentes los sulfonatos de dodecil- y tridecilbenceno, en particular las sales sódicas de los mismos.
Adicional o alternativamente, las composiciones de la invención pueden comprender, además, uno o más tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos no iónicos preferentes son aquellos de fórmula (IV):
R2-O-(AO)m-H (IV),
en la que R2 representa una fracción alquilo sustituida o no sustituida, lineal o ramificada; OA representa un óxido de etileno (OE) o un óxido de propileno (OP) y «m» es un número entero entre 1 y 50.
En la fórmula (IV), R2 representa un grupo alquilo sustituido o no sustituido, lineal o ramificado, preferentemente un grupo alquilo no sustituido lineal, más preferentemente un grupo de alcohol graso. Los grupos preferentes son R2 seleccionados de entre los grupos decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo y eicosilo, y combinaciones de los mismos, en donde resultan preferentes aquellos grupos con un número par de átomos de carbono. Las fracciones R2 particularmente preferentes se derivan de alcoholes grasos C i2-C i8, tales como alcohol de aceite de coco, alcohol de aceite de sebo, alcohol laurílico, miristílico, cetílico o estearílico o de oxoalcoholes C10-C20.
OA representa un grupo de óxido de etileno (OE) o de óxido de propileno (OP), preferentemente un grupo óxido de etileno. El índice «n» representa un número entero entre 1 y 50, preferentemente entre 1 y 20, y más preferentemente, entre 1 y 6. Particularmente preferentemente, m es 1,2, 3, 4 o 5, lo más preferentemente 3 a 5, ya que los grados más altos de etoxilación pueden influir negativamente sobre la viscosidad y la estabilidad.
En diversas realizaciones preferentes, las composiciones detergentes comprenden un éter alquílico seleccionado de éteres de alcohol graso de fórmula (V):
en la que k=11 a 19, y m =1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Resultan preferentes los alcoholes grasos C12-18 con 1 a 6 OE (k=11 a 17, m=1 a 5 en la fórmula (V)). Resultan más preferentes los alcoholes C12-14que presentan 1 a 5 OE, lo más<preferentemente éteres alquílicos C12-14 con 3 a 5 OE, en particular éter laurílico con 5>Oe.
Las composiciones detergentes pueden incluir, además, otros tensioactivos no iónicos, tales como glucósidos de alquilo de fórmula general RO(G)x, en la que R es un radical alifático lineal primario o ramificado con 2-metilo que contiene 8 a 22, y preferentemente 12 a 18, átomos de carbono, y G representa una unidad de glucosa. El grado de oligomerización x, que indica la distribución de monoglucósidos y oligoglucósidos, es un número entre 1 y 10 y preferentemente es un número entre 1,2 y 1,4.
En diversas realizaciones, la composición comprende por lo menos dos tensioactivos aniónicos, p. ej., por lo menos un sulfato de éter alquílico y preferentemente por lo menos un sulfonato de alquilbenceno, y opcionalmente un éter alquílico.
Los tensioactivos anfotéricos adecuados comprenden betaínas. Las betaínas preferentes son las alquilbetaínas, las alquilamidobetaínas, las imidazolinio betaínas, las sulfobetaínas (INCI sultaínas) y las fosfobetaínas. Son ejemplos de betaínas y sulfobetaínas adecuadas los compuestos siguientes (con denominación INCI): betaínas de amidopropilo de almendra, betaínas de amidopropilo de albaricoque, betaínas de amidopropilo de aguacate, betaínas de amidopropilo de fruta de babassú, betaínas de behenamidaidopropilo, betaínas de behenilo, betaínas, betaínas de canolaidopropilo, idopropil betaínas caprílicas/capramo, carnitinas, betaínas de cetilo, betaínas de cocamidoetilo, betaínas de cocamidopropilo, betaínas de cocamidopropil hidroxisultaínas, cocobetaínas, coco-hidroxisultaínas, betaínas de coco/oleamidopropilo, coco-sultaínas, betaínas de decilo, glicinatos de oleíl-dihidroxietilo, dihidroxietilglicinatos de soja, estearilglicinatos de dihidroxietilo, dihidroxietilglicinatos de sebo, propil-PG-betaínas de dimeticona, hidroxisultaínas de erucamidopropilo, betaínas de sebo hidrogenado, betaínas de isostearamidopropilo, betaínas de lauramidopropilo, betaínas de laurilo, hidroxisultaína de laurilo, sultaínas de laurilo, betaínas de amidopropilo de leche, betaínas de amidopropilo de visón, betaínas de miristamidopropilo, betaínas de miristilo, betaínas de oleamidopropilo, hidroxisultaína de oleamidopropilo, betaína de oleílo, betaínas de amidopropilo de oliva, betaínas de amidopropilo de palma, betaínas de palmitamidopropilo, carnitina de palmitoílo, betaínas de nuez de amidopropilo de palma, acetoxipropilbetaína de politetrafluoroetileno, betaína de ricinolamidopropilo, betaínas de sesamidopropilo, betaínas de amidopropilo de sojoa, betaínas de estearamidopropilo, betaínas de estearilo, betaínas de amidopropilo de sebo, hidroxisultaína de amidopropilo de sebo, betaína de sebo, dihidroxietilbetaínas de sebo, betaínas de undecilenamidopropilo y betaínas de germamidopropilo de trigo. Una betaína preferente es, por ejemplo, la cocamidopropilbetaína (cocoamidopropilbetaína). Las betaínas resultan particularmente preferentes para composiciones de lavavajillas, lo más preferentemente, composiciones detergentes lavavajillas a mano.
Entre los tensioactivos adecuados adicionales se incluyen los óxidos de amina. Entre los óxidos de amina adecuados de acuerdo con la invención se incluyen óxidos de alquilamina, en particular, óxidos de alquildimetilamina, óxidos de alquilamidoamina y óxidos de alcoxialquilamina. Son ejemplos de óxidos de amina adecuados los compuestos siguientes (con denominación INCI): óxidos de amidopropilamina de almendra, óxidos de amidopropilamina de fruta de babassú, óxidos de behenamina, óxidos de cocamidopropilamina, óxidos de cocamidopropilamina, óxidos de cocamina, óxidos de coco-morfolina, óxidos de decilamina, óxidos de deciltetradecilamina, óxidos de diaminopirimidina, óxidos de dihidroxietil-alcoxi C8-10-propilaminas, óxidos de dihidroxietil-alcoxi Cg-11-propilaminas, óxidos de dihidroxietil-alcoxi C i2-i5-propilaminas, óxidos de dihidroxietilcocamina, óxidos de dihidroxietil-lauramina, óxidos de dihidroxietil-estearaminas, óxidos de didhidroxietil-amina de sebo, óxidos de amina hidrogenada de nuez de palma, óxidos de amina de sebo hidrogenada, óxidos de hidroxietilhidroxipropil-alcoxi C i2-i5-propilaminas, óxidos de isoestearmidopropilaminas, óxidos de isoestearamidopropil-morfolina, óxidos de lauramidopropilamina, óxidos de lauramina, óxidos de metilmorfolina, óxidos de amidopropilamina de leche, óxidos de amidopropilamina de visón, óxidos de idopropilamina de miristamina, óxidos de miristamina, óxidos de miristil/cetilaminas, óxidos de oleamidopropilamina, óxidos de oleamina, óxidos de amidopropilamina de oliva, óxidos de palmitamidopropilamina, óxidos de palmitamina, óxidos de PEG-3 lauramina, fosfatos de óxidos de dihidroxetilcocamina potasio, óxidos de trisfosfonometilamina potasio, óxidos de sesamidopropilamina, óxidos de amidopropilamina de soja, óxidos de estearamidopropilamina, óxidos de estearaminas, óxidos de amidopropilamina de sebo, óxidos de amina de sebo, óxidos de undecilenamidopropilamina y óxidos de amidopropilamina de germen de trigo. Un óxido de amina preferente es, por ejemplo, óxidos de cocamidopropilamina (óxido de cocoamidopropilamina).
Para las aplicaciones de lavavajillas automático, preferentemente se utilizan tensioactivos no iónicos de baja producción de espuma, en particular tensioactivos no iónicos de baja producción de espuma alcoxilados, especialmente, etoxilados. Con particular preferencia los detergentes lavavajillas automáticos contienen tensioactivos no iónicos del grupo de los alcoholes alcoxilados. Se proporciona preferencia particular a los tensioactivos no iónicos que presentan un punto de fusión superior a la temperatura ambiente. Los tensioactivos no iónicos presentan un punto de fusión superior a 20 °C, preferentemente superior a 25 °C, más preferentemente de entre 25 °C y 60 °C, y especialmente de entre 26,6 °C y 43,3 °C resultan particularmente preferentes. Los tensioactivos utilizados preferentemente son aquellos de los grupos de tensioactivos no iónicos alcoxilados, en particular alcoholes primarios etoxilados y mezclas de dichos tensioactivos con tensioactivos estructuralmente más complejos, tales como los tensioactivos polioxipropileno/polioxietileno/polioxipropileno (OP/OE/OP). Dichos tensioactivos no iónicos (OP/OE/OP) también se caracterizan por un buen control de la producción de espuma. Los tensioactivos no iónicos particularmente preferentes son aquellos que contienen unidades alternantes de óxido de etileno y diferentes unidades de óxido de alquileno. Entre ellos, a su vez, resultan preferentes los bloques OE-OA-OE-OA, con uno a diez grupos OE u OA antes de seguir con un bloque del otro grupo. Son tensioactivos no iónicos de ejemplos los que presentan un grupo alquilo Cg con 1 a 4 unidades de óxido de etileno seguido de 1 a 4 unidades de óxido de propileno, seguidas de 1 a 4 unidades de óxido de etileno seguido de 1 a 4 unidades de óxido de propileno. Se proporciona particular preferencia a los tensioactivos no iónicos poli(oxialquilados) con caperuza terminal, en los que la caperuza terminal es un radical hidrocarburo alifático o aromático, saturado o insaturado, lineal o ramificado, R, que presenta 1 a 30 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden comprender, además, grupos hidroxilo. El grupo de dichos tensioactivos no iónicos incluye, por ejemplo, el alcohol graso C4-22 (OE)10-50-2-hidroxialquil éteres, en particular también alcohol graso C8-12 (OE)22-2-hidroxidecil éteres y los alcohol graso C4-22 (OE)40-80-2-hidroxialquil éteres.
La composición, tal como se define en la presente memoria, puede comprender, si no se indica lo contrario, entre 0 % y 65 % en peso, por ejemplo entre aproximadamente 1 % en peso y aproximadamente 65 % en peso, entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 50 % en peso, preferentemente entre aproximadamente 40 % y aproximadamente 65 % en peso, tal como entre 50 % y 65 % en peso, particularmente entre aproximadamente 20 % en peso y aproximadamente 65 % en peso, particularmente entre 10 % en peso y 50 % en peso de por lo menos un constructor.
Generalmente, y en caso de que no se indique lo contrario, el constructor puede seleccionarse preferentemente de entre citrato, carbonato, silicato, aluminosilicato (zeolita) y combinaciones de los mismos. Entre los mejoradores adecuados se incluyen, además, fosfonatos, polifosfonatos, bicarbonatos, boratos y, además, policarboxilatos. Los mejoradores de citrato, p. ej., ácido cítrico y sales solubles del mismo (particularmente sales sódicas) resultan mejoradores orgánicos solubles en agua particularmente adecuados. Pueden utilizarse citratos en combinación con zeolita, silicatos como los tipos BRITESIL, y/o agentes mejoradores de silicato laminados. El constructor y/o coconstructor pueden ser cualquier agente quelante que forme complejos solubles en agua con Ca y Mg. Puede utilizarse cualquier constructor y/o co-constructor conocido de la técnica para el uso en detergentes limpiadores. Entre los ejemplos no limitativos de mejoradores se incluyen zeolitas, en particular la zeolita A, P o X; carbonatos, tales como carbonato sódico; silicatos solubles, tales como metasilicato sódico, silicatos laminados (p. ej., SKS-6 de Hoechst) y (carboximetil)inulina (CMI) y combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos no limitativos adicionales se incluyen aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y ácido alquil- o alquenilsuccínico. Entre los ejemplos específicos adicionales se incluyen ácido 2,2',2"-nitrilotriacético (NTA, por sus siglas en inglés), ácido etilendiamintetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilendiamín-N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metilglicina-N,N-diacético (MGDA), ácido glutámico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietán-1,1-difosfónico, ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspártico-ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiónico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N-(sulfometil)aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)-aspártico (SEAS), ácido N-(sulfometilglutámico (<s>M<g>L), ácido N-(2-sulfoetil)-glutámico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido serín-N,N-diacético (SEDA), ácido isoserín-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanín-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido N,N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N,N-diacético (SLDA), ácido taurín-N,N-diacético (TUDA) y N'-(2-hidroxietil)etilendiamín-N,N,N'-triacético (HEDTA), dietanolglicina (DEG), y combinaciones y sales de los mismos. Entre los fosfonatos adecuados para la utilización en la presente memoria se incluyen ácido 1-hidroxietán-1,1-difosfónico (HEDP), ácido etilendiamintetrakis(metilenfosfónico) (EDTMPA), ácido dietilentriaminpentakis (metilenfosfónico) (DTMPA, DTPMPA o DTPMP), ácido nitrilotris (metilenfosfónico) (ATMP o NTMP), ácido 2-fosfonobután-1,2,4-tricarboxílico (PBTC), ácido hexametilendiamintetrakis(metilenfosfónico) (HDTMP). Resultan particularmente preferentes HEDP y DTPMP.
Son silicatos adecuados, los silicatos sódicos laminados cristalinos de la fórmula general NaMSixO2+1*yH2O, en la que M es sodio o H, «x» es un número entre 1,9 y 4, e «y» es un número entre 0 y 20, y «x» es preferentemente 2, 3 o 4. Dichos silicatos se dan a conocer, por ejemplo, en el documento n.° EP-A-0164514. Resultan preferentes los silicatos en los que M es sodio y es 2 o 3. Resultan particularmente preferentes disilicato p- y 5-sodio, Na2Si2O5*yH2O.
Aunque no resultan preferentes, las composiciones pueden comprender, además, fosfatos, difosfatos (pirofosfatos) y/o trifosfatos, tales como trifosfato sódico (STP o STPP).
Si no se indique lo contrario, la composición puede contener, además, entre aproximadamente 0 % y 50% en peso, tal como entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 30% de un comejorador de detergencia. La composición de detergente puede incluir un comejorador solo o en combinación con un mejorador, por ejemplo, un mejorador de zeolita. Entre los ejemplos no limitativos de comejoradores se incluyen homopolímeros de poliacrilatos o copolímeros de los mismos, tales como poli(ácido acrílico) (PAA, por sus siglas en inglés) o copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA, por sus siglas en inglés) o ácido poliaspártico. Se describen mejoradores de ejemplo y/o comejoradores adicionales en, p. ej., los documentos n.°WO 09/102854 y n.° US 5977053.
Resultan preferentes como comejoradores los polímeros solubles en agua que contienen acrilato, tales como las sales de metal alcalino de ácido poliacrílico o ácido polimetacrílico, por ejemplo los que presentan un peso molecular Mw comprendido en el intervalo de 600 a 750.000 g/mol, según se determina mediante cromatografía de permeación en gel (CPG), de acuerdo con la norma DIN 55672-1:2007-08, con THF como un eluyente.
Son polímeros preferentes los poliacrilatos con un peso molecular, Mw, de 1.000 a 15.000 g/mol, más preferentes son, debido a su solubilidad, los poliacrilatos de cadena corta con un peso molecular, Mw, de 1.000 a 10.000 g/mol; lo más preferentemente, de 1.000 a 5.000 g/mol.
Los acrilatos preferentes para la utilización en la presente invención son las sales de metal alcalino de ácido acrílico, preferentemente las sales sódicas, en particular aquellas con pesos moleculares comprendidos en el intervalo de 1.000 a 10.000 g/mol, o de 1.000 a 5.000 g/mol. Los acrilatos adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo bajo el nombre comercial de Acusol®, de Dow Chemical. También resultan adecuados los copolímeros de acrilatos, en particular los de ácido acrílico y ácido metacrílico, y de ácido acrílico, ácido metacrílico y ácido maleico.
En realizaciones preferentes, las composiciones de la invención comprenden un sulfopolímero, preferentemente un copolímero que comprende un sulfonato/ácido sulfónico etilénicamente insaturado como un comonómero. Resultan particularmente adecuados los monómeros de ácidos alilsulfónicos, tales como ácido aliloxibencenosulfónico y ácido metalilsulfónico. Son monómeros que contienen grupo ácido sulfónico particularmente preferentes, ácido 1-acrilamidopropanosulfónico-'1acido 2-acrilamido-2-propanosulfónico, ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico, ácido 2-metacrilamido-2-metil-1-propanosulfónico, ácido 3- metacrilamido-2-hidroxi-propanosulfónico , ácido alilsulfónico , ácido metalilsulfónico , ácido aliloxibencenosulfónico , ácido metaliloxibenzolsulfónico, ácido 2-hidroxi-3- (2propeniloxi)propanosulfónico , ácido 2-metil-2-propenilsulfónico , ácido estirenosulfónico , ácido vinilsulfónico, 3-sulfopropilo, 3-sulfopropilo, sulfometacrilamida, sulfometilmetacrilamida y mezclas de dichos ácidos o sus sales solubles en agua.
Los sulfopolímeros son preferentemente copolímeros de los monómeros anteriormente indicados con ácidos carboxílicos insaturados. Resultan especialmente preferentes los ácidos carboxílicos insaturados ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido etacrílico, ácido cloroacrílico, ácido alfa-cianoacrílico, ácido crotónico, ácido alfa-fenilacrílico, ácido maleico, anhídrido maleico, ácido fumárico, ácido itacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico, ácido sórbico, ácido cinámico o mezclas de los mismos. También son evidentemente utilizables los ácidos dicarboxílicos insaturados. Resultan preferentes los copolímeros con acrilatos, en particular con ácido acrílico y ácido metacrílico, y ácido acrílico, ácido metacrílico y ácido maleico.
Dichos polímeros están, por ejemplo, disponibles comercialmente bajo los nombres comerciales Acusol ®590 o Acusol® 588 de Dow Chemical.
En un aspecto de la invención, las composiciones limpiadoras de la invención comprenden un polipéptido tal como se define en la presente memoria y por lo menos un sulfopolímero, tal como se ha definido anteriormente. Dichas composiciones son preferentemente composiciones lavavajillas.
En una realizaicón preferente, el mejorador es un mejorador no basado en fósforo, tal como ácido cítrico y/o ácido metilglicín-N,N-diacético (MGDA, por sus siglas en inglés) y/o ácido glutámico-N-N-diacético (GLDA, por sus siglas en inglés) y/o sales de los mismos. Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden contener, si no se indica lo contrario, entre aproximadamente 1 % en peso y aproximadamente 40 % en peso, preferentemente entre aproximadamente 0,5 % en peso y aproximadamente 30 % en peso, preferentemente entre aproximadamente 0,1 % en peso y aproximadamente 10 % en peso, de 0 % a 30 % en peso, tal como entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 20 %, tal como entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 10 %, tal como entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 5 %, tal como entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 30 %, tal como entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 10 % o tal como entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 20 % en peso (% p) de un sistema blanqueador. Puede utilizarse cualquier sistema blanqueador que comprenda componentes conocidos de la técnica para el uso en detergentes limpiadores. Entre los componentes adecuados del sistema blanqueador se incluyen fuentes de peróxido de hidrógeno, fuentes de perácidos y catalizadores o reforzadores de blanqueo.
Son fuentes adecuadas de peróxido de hidrógeno, las persales inorgánicas, incluyendo sales de metal alcalino, tales como percarbonato sódico y perboratos sódicos (habitualmente mono- o tetrahidrato) y peróxido de hidrógeno-urea (1/1). Los perácidos pueden (a) incorporarse directamente como perácidos preformados o (b) formarsein situen la solución de lavado del peróxido de hidrógeno y un activado de blanqueo (perhidrólisis) o (c) formarsein situen la solución de lavado a partir de peróxido de hidrógeno y una perhidrolasa y un sustrato adecuado para esta última, p. ej., un éster.
a) Entre los perácidos preformados adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ácidos peroxicarboxílicos, tales como ácido peroxibenzoico y sus derivados de anillo sustituido, ácido peroxi-a-naftoico, ácido peroxiftálico, ácido peroxiláurico, ácido peroxiesteárico, ácido £-ftalimidoperoxicaproico [ácido ftalimidoperoxihexanoico (PAP, por sus siglas en inglés)] y ácido o-carboxibenzamido peroxicaproico; ácidos diperoxidicarboxílicos alifáticos y aromáticos, tales como ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxiazelaico, ácido diperoxisebácico, ácido diperoxibrasílico, ácido 2-decildiperoxibutanodioico y ácido diperoxiftálico, isoftálico y tereftálico; ácidos perimídicos; ácido peroximonosulfúrico; ácido peroxidisulfúrico; ácido peroxifosfórico; ácido peroxisilícico, y mezclas de compuestos. Se entiende que los perácidos mencionados pueden añadirse mejor, en algunos casos, en forma de sales adecuadas, tales como sales de metal alcalino (p. ej., Oxone®) o sales de metal alcalinotérreo. b) Entre los activadores de blanqueo adecuados se incluyen los pertenecientes a la clase de ésteres, amidas, imidas, nitrilos o anhídridos y, en su caso, sales de los mismos. Son ejemplos adecuados, tetraacetiletilendiamina (TAED, por sus siglas en inglés), 4-[(3,5,5-trimetilhexanoíl)oxi]benceno-1-sulfonato sódico (ISONOBS, por sus siglas en inglés), 4-(dodecanoiloxi)benceno-1-sulfonato sódico (LOBS, por sus siglas en inglés), 4-(decanoiloxi)benceno-1-sulfonato sódico, ácido 4-(decanoiloxi)benzoico (DOBA, por sus siglas en inglés), 4-(nonanoiloxi)benceno-1-sulfonato sódico (NOBS), y/o los dados a conocer en el documento n.° WO98/17767. Una familia particular de activadores de blanqueo de interés se ha dado a conocer en el documento n.° EP624154 y resulta particularmente preferente en ese familia, el citrato de acetiltrietilo (ATC, por sus siglas en inglés). El ATC o un triglicérido de cadena corta como la triacetina presenta la ventaja de que son medioambientalmente respetuosos. Además, el citrato de acetiltrietilo y la triacetina presentan una buena estabilidad hidrolítica en el producto con el almacenamiento y son activadores de blanqueamiento eficientes. Finalmente, el ATC es multifuncional, ya que el citrato liberado en la reacción de perhidrólisis puede funcionar como un constructor.
El sistema blanqueador puede incluir, además, un catalizador o reforzador de blanqueamiento.
Entre algunos ejemplos no limitativos de catalizadores de blanqueo que pueden utilizarse en las composiciones de la presente invención se incluyen catalizadores de oxalato de manganeso, acetato de manganeso, manganesocolágeno, cobalto-amina y triazaciclononano de manganeso (MnTACN); resultan particularmente preferentes los complejos de manganeso con 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazacidononano (Me3-TACN) o 1,2,4,7-tetrametil-1,4,7-triazaciclononano (Me4-TACN), en particular Me3-TACN, tal como el complejo de manganeso dinuclear [(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2, y [2,2',2"-nitrilotris(etano-1,2-diilazanililidén-KN-metanililidén)trifenolato-K3O]manganeso (III). Los catalizadores de blanqueo también pueden ser otros compuestos de metal, tales como complejos de hierro o cobalto.
En algunas realizaciones, en las que se incluye una fuente de un perácido, puede utilizarse un catalizador de blanqueo orgánico o reforzador de blanqueo, que presente una de las fórmulas siguientes:
(i)
(ii)
(iii) y mezclas de los mismos, en los que cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 24 carbonos o un grupo de alquilo lineal que contiene entre 11 y 24 carbonos, preferentemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 18 carbonos o un grupo de alquilo lineal que contiene entre 11 y 18 carbonos, más preferentemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo.
Se describen otros sistemas de blanqueo de ejemplo, p. ej., en los documentos n.° WO2007/087258, n.° WO2007/087244, n.° WO2007/087259, n.° EP1867708 (vitamina K) y documento n.° WO2007/087242. Los fotoblanqueadores adecuados pueden ser, por ejemplo, ftalocianinas de zinc o aluminio sulfonados.
En un aspecto preferente, el polipéptido utilizado en las composiciones de la invención comprende la secuencia de aminoácidos con SEC ID n.° 20 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 95 %, respecto a SEC ID n.° 20.
En un aspecto preferente, el polipéptido utilizado en las composiciones de la invención comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 20 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a SEC ID n.° 20.
En un aspecto preferente, el polipéptido utilizado en las composiciones de la invención comprende la secuencia de aminoácidos con SEC ID n.° 33 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94%, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a SEC ID n.° 33.
En un aspecto preferente, el polipéptido utilizado en las composiciones de la invención comprende la secuencia de aminoácidos con SEC ID n.° 34 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a SEC ID n.° 34.
En un aspecto preferente, el polipéptido utilizado en las composiciones de la invención comprende la secuencia de aminoácidos con SEC ID n.° 35 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a SEC ID n.° 35.
La composición de la invención comprende los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o p-N-acetilglucosaminidasa, puede utilizarse para reducir y/o eliminar componentes de unbiofilm,p. ej., SPE y/o PNAG sobre elementos tales como superficies duras, textiles y/o tela. La materia orgánica, tal como unbiofilm,puede desarrollarse sobre superficies tales como textiles cuando hay microorganismos presentes sobre el elemento. La materia orgánica puede ser pegajosa y puede adherirse suciedad a la materia orgánica, que puede resultar difícil de eliminar. Un aspecto de la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se ha descrito anteriormente para la limpieza profunda de un elemento, en donde el elemento es un textil.
Un aspecto de la invención se refiere a la utilización de una composición, tal como se describe en la presente memoria, que comprende un polipéptido, que presenta actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20 y en donde el polipéptido comprende el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o el motivo conservado III GXDE (SEC ID n.° 41).
Un aspecto de la invención se refiere a la utilización de una composición, tal como se describe en la presente memoria, que comprende un polipéptido, que presenta actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende, además, uno o más motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43) o DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45).
Un aspecto se refiere a la utilización de una composición, tal como se describe en la presente memoria, que comprende un polipéptido, que presenta actividad de hexosaminidasa, preferentemente actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o p-N-acetilglucosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20, en donde el polipéptido comprende uno o más de los motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY<(SEC ID n.° 22), GXDE>(SeC<ID n.° 41), y comprende, además, uno o más de los motivos ARAYYpV (SEC i>D<n.° 42),>AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45),
(i) para prevenir, reducir o eliminar la pegajosidad del elemento,
(ii) para pretratar las manchas sobre el elemento,
(iii) para prevenir, reducir o eliminar la redeposición de suciedad durante un ciclo de lavado,
(iv) para prevenir, reducir o eliminar la adherencia de la suciedad en el elemento,
(v) para mantener o mejorar la blancura del elemento,
(vi) para prevenir, reducir o eliminar los malos olores del elemento, en donde el elemento es un textil.
El polipéptido utilizado en las composiciones de la invención preferentemente presentan una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o 100 % respecto al polipéptido mostrado en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
La presente invención se refiere a la utilización de una composición, tal como se describe en la presente memoria, que comprende uno o más polipéptidos que comprenden el dominio catalítico Gluco_hidro_20 y que presenta actividad de hexosaminidasa para la limpieza profunda de un elemento, en donde el polipéptido es un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al polipéptido que comprende SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35, y en donde el elemento es un textil. En un aspecto de la invención, la composición que comprende un polipéptido que comprende el dominio catalítico Gluco_hidro_20 que presenta actividad de hexosaminidasa se utiliza para prevenir, reducir o eliminar la pegajosidad de un elemento, en donde el polipéptido es un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al polipéptido que comprende SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35. El polipéptido que comprende el dominio catalítico Gluco_hidro_20 que presenta actividad de hexosaminidasa puede utilizarse adicionalmente para pretratar manchas sobre textiles, tales como un textil.
Además, la invención se refiere a la utilización de una composición, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende el dominio catalítico Gluco_hidro_20 que presenta actividad de hexosaminidasa, p. ej., un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o<100 % respecto al polipéptido que comprende SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33,>SeC<ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 para>prevenir, reducir o eliminar la redeposición de suciedad durante un ciclo de lavado. En el caso de que se utilice el polipéptido en, por ejemplo, la lavandería de textiles, el polipéptido dificulta la deposición de suciedad presente en la solución de lavado sobre el textil.
Además, la invención se refiere a la utilización de una composición, tal como se define en la presente memoria, que comprende el polipéptido dominio catalítico Gluco_hidro_20 que presenta actividad de hexosaminidasa, p. ej., un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98 % o 100 % respecto al polipéptido que comprende SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 para prevenir, reducir o eliminar la adherencia de suciedad a un elemento. En una realización, el elemento es textil. En el caso de que la suciedad no se adhiera al elemento, el elemento presentará una apariencia más limpia. De esta manera, la invención se refiere, además, a la utilización de una composición, tal como se define en la presente memoria, que comprende un polipéptido que comprende un dominio catalítico Gluco_hidro_20, p. ej., un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 %, 95 %, 98%o 100%respecto al polipéptido que comprende SECI D n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 que presenta actividad de hexosaminidasa para mantener o mejorar la blancura de un elemento.
En el caso de que se utilicen elementos como camisetas o ropa deportiva, se exponen a bacterias del cuerpo del usuario y del resto del medio en el que se utilizan, dichas bacterias pueden formar materia orgánica, tal como SPE (sustancias poliméricas extracelulares), que comprenden PNAG. La materia orgánica puede provocar malos olores en el elemento incluso después de lavar el elemento. Los polipéptidos de la invención presentan actividad de hexosaminidasa, p. ej., actividad de PNAG y, de esta manera, resultan eficaces en la prevención, reducción o eliminación de componentes orgánicos, tales como PNAG y SPE que comprende PNAG. Por lo tanto, la presente invención se refiere, además, a la eliminación o reducción de malos olores en textiles. Los malos olores pueden estar presentes en textiles recién lavados que todavía están húmedos. O los malos olores pueden estar presentes en textiles recién lavados que seguidamente se han secado. Los malos olores también pueden estar presentes sobre textiles, que han sido almacenados durante cierto tiempo después del lavado. La presente invención se refiere a la reducción o eliminación de malos olores, tales como E-2-nonenal de textiles húmedos o secos.
La composición limpiadora según la invención puede comprender, además, uno o más componentes adicionales, tales como un ingrediente limpiador o un adyuvante detergente; el ingrediente adyuvante detergente pueden ser tensioactivos y mejoradores y/o quelantes, tales como los indicados anteriormente. Entre los ingredientes adyuvantes también pueden encontrarse cualquiera de los siguientes: adyuvante de floculación, inhibidores de transferencia de colorantes, enzimas, estabilizadores de enzimas, inhibidores de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueo, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación de tierra arcillosa/antirredeposición, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de tejidos, portadores, hidrotropos, mejoradores y comejoradores, agentes de teñido de tejidos, agentes antiespumantes, dispersantes, adyuvantes de procesamiento, agentes amargantes y/o pigmentos
En diversas realizaciones, la invención se refiere a composiciones limpiadoras que comprenden los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa, tal como se describe en la presente memoria, y uno o más cualesquiera de un ingrediente adyuvante seleccionado de agentes amargantes y solventes orgánicos, tales como glicerol y 1,2-propanodiol.
En una realización, el ingrediente adyuvante detergente es un mejorador o un agente de eliminación de tierra arcillosa/antirredeposición.
En una realización, el ingrediente adyuvante detergente es un enzima. El enzima o enzimas pueden seleccionarse del grupo que consiste en proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, carbohidrasas, celulasas, pectinasas, mananasas, arabinasas, galactanasas, xilanasas y oxidasas.
Además de los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa que comprenden SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % a los mismos, la composición limpiadora de la invención puede comprender, además, celulasas. Entre las celulasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre las celulasas adecuadas se incluyen celulasas de los génerosBacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej.,las celulasas fúngicas producidas a partir deHumicola insolens, Myceliophthora thermophilayFusarium oxysporumdadas a conocer en los documentos n.° US 4.435.307, n.° US 5.648.263, n.° US 5.691.178, n.° US 5.776.757 y n.°WO 89/09259.
Son celulasas especialmente adecuadas, las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios de cuidado del color. Se describen ejemplos de dichas celulasas en los documentos n.° EP 0495 257, n.° EP 0 531 372, n.° WO 96/11262, n.° WO 96/29397 y n.° WO 98/08940. Otros ejemplos son polipéptidos celulasas, tales como las descritas en los documentos n.° WO 94/07998, n.° EP 0531 315, n.° US 5.457.046, n.° US 5.686.593, n.° US 5.763.254, n.° WO 95/24471, n.° WO 98/12307 y n.° PCT/DK98/00299.
Son ejemplos de celulasas que muestran actividad de endo-beta-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) aquellos que se describen en el documento n.° WO02/099091.
Entre otros ejemplos de celulasas se incluyen la familia de 45 celulasas descritas en el documento n.° WO96/29397, y especialmente los polipéptidos de las mismas que presentan sustitución, inserción y/o deleción en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones siguientes en SEC ID n.° 8 del documento n.° WO 02/099091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21,25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200 y/o 20, preferentemente seleccionados de P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H o Q146 R.
Entre las celulasas disponibles comercialmente se incluyen Celluzyme™, Celluclean y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Además de los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa que comprenden SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % a los mismos, la composición limpiadora de la invención puede comprender, además, proteasas. Entre las proteasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano, fúngico, vegetal, vírico o animal, p. ej., de origen vegetal o microbiano. Resulta preferente el origen microbiano. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serina-proteasa o una metaloproteasa. Una serinaproteasa puede ser, por ejemplo, de la familia S1, tal como tripsina, o de la familia S8, tal como la subtilisina. Una proteasa metaloproteasa puede ser, por ejemplo, una termolisina de, p. ej., la familia M4 u otra metaloproteasa, tal como las de las familias M5, M7 o M8.
El término «subtilasas» se refiere a un subgrupo de serina-proteasas según Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serina-proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizadas porque presentan una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas pueden dividirse en 6 subdivisiones: la familia de la subtilisina, la familia de la termitasa, la familia de la proteinasa K, la familia de la peptidasa lantibiótica, la familia de la kexina y la familia de la pirolisina.
Son ejemplos de subtilasas las derivadas deBacillus,tales comoBacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilusyBacillus gibsoniidescritos en los documentos n.° US7262042 y n.° WO09/021867, ysubtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147ysubtilisina 168,descritos en el documento n.° WO89/06279 y la proteasa PD138 descrita en el documento n.° WO93/18140. Otras proteasas útiles pueden ser las descritas en los documentos n.° WO92/175177, n.° WO01/016285, n.° WO02/026024 y n.° WO02/016547. Son ejemplos de proteasas de tipo tripsina, la tripsina (p.ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa deFusariumdescrita en los documentos n.° WO89/06270, n.° WO94/25583 y n.° WO05/040372, y las proteasas de quimiotripsina derivadas deCellumonasdescritas en los documentos n.° WO05/052161 y n.° WO05/052146.
Una proteasa preferente adicional es la proteasa alcalina deBacillus lentusDSM 5483, tal como se describe en, por ejemplo, el documento n.° WO95/23221, y variantes de la misma, que se describen en los documentos n.° WO92/21760, n.° WO95/23221, n.° EP1921147y n.° EP1921148.
Son ejemplos de metaloproteasas las metaloproteasas neutras descritas en el documento n.° WO07/044993 (Genencor Int.) tales como las derivadas deBacillus amyloliquefaciens.
Son ejemplos de proteasas útiles las variantes descritas en: los documentos n.° WO92/19729, n.° WO96/034946, n.° WO98/20115, n.° WO98/20116, n.° WO99/011768, n.° WO01/44452, n.° WO03/006602, n.° WO04/03186, n.° WO04/041979, n.° WO07/006305, n.° WO11/036263, n.° WO11/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las posiciones siguientes: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 42, 55, 59, 60, 66, 74, 85, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 116, 118, 121, 126, 127, 128, 154, 156, 157, 158, 161, 164, 176, 179, 182, 185, 188, 189, 193, 198, 199, 200, 203, 206, 211, 212, 216, 218, 226, 229, 230, 239, 246, 255, 256, 268 y 269, respecto a la SEC ID n.° 1 del documento n.° WO 2016/001449, en el que las posiciones corresponden a las posiciones de la proteasa deBacillus lentusmostrada en SEC ID n.° 1 del documento n.° WO 2016/001449. Más preferentemente, las variantes de subtilasa pueden comprender una o más de las mutaciones: S3T, V4I, S9R, S9E, A15T, S24G, S24R, K27R, N42R, S55P, G59E, G59D, N60D, N60E, V66A, N74D, N85S, N85R, , G96S, G96A, S97G, S97D, S97A, S97SD, S99E, S99D, S99G, S99M, S99N, S99R, S99H, S101A, V102I, V102Y, V102N, S104A, G116V, G116R, H118D, H118N, N120S, S126L, P127Q, S128A, S154D, A156E, G157D, G157P, S158E, Y161A, R164S, Q176E, N179E, S182E, Q185N, A188P, G189E, V193M, N198D, V199I, Y203W, S206G, L211Q, L211D, N212D, N212S, M216S, A226V, K229L, Q230H, Q239R, N246K, N255W, N255D, N255E, L256E, L256D T268A o R269H. Las variantes de proteasa son preferentemente variantes de la proteasa deBacillus lentus(Savinase®) mostrada en SEC ID n.° 1 del documento n.°WO 2016/001449, la proteasas deBacillus amylolichenifaciens(BPN') mostrada en SEC ID n.° 2 del documento n.° WO2016/001449. Las variantes de proteasa preferentemente presentan una identidad de secuencia de por lo<menos 80 % respecto a SEC ID n.° 1 o>SeC<ID n.° 2 del documento n.°WO 2016/001449.>
Una variante de proteasa que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones<171, 173, 175, 179 o 180 de>SeC<ID n.° 1 del documento n.° WO2004/067737, en el que la variante de proteasa>presenta una identidad de secuencia de por lo menos 75 %, aunque menos de 100 % respecto a SEC ID n.° 1 del documento n.° WO2004/067737.
Entre los enzimas proteasa disponibles comercialmente adecuados se incluyen los comercializados bajo los nombres comerciales Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Blaze®, Blaze Evity®100T, Blaze Evity®125T, Blaze Evity®150T, Neutrase®, Everlase®y Esperase® (Novozymes A/S); los comercializados bajo el nombre comercial Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Excellenz P1000™, Excellenz P1250™, Eraser®, Preferenz P100™, Purafect Prime®, Preferenz P110™, Effectenz P1000™, Purafect®™, Effectenz P1050™, Purafect Ox®™, Effectenz P2000™, Purafast®, Properase®, Opticlean®y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP (secuencia mostrada en la figura 29 del documento n.° US5352604) y las variantes de los mismos (Henkel AG) y KAP (subtilisina deBacillus alkalophilus)de Kao.
Además de los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa que comprenden SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % a los mismos, la composición limpiadora de la invención puede comprender, además, lipasas y cutinasas que incluye las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre los ejemplos se incluyen la lipasa deThermomyces,p. ej., la deT. lanuginosus(previamente denominadaHumicola lanuginosa)tal como se describe en los documentos n.° EP258068 y n.° EP305216, la cutinasa deHumicola,p. ej.,H. insolens("documento n.° WO96/13580), la lipasa de cepas dePseudomonas(algunas de estas ahora se han renombrado comoBurkholderia),p.ej., P. alcaligenes o P.pseudoalcaligenes(documento n.° EP218272), P.cepacia(documento n.° EP331376),P. sp.cepa SD705 (documentos n.° WO95/06720 y n.° WO96/27002),P. wisconsinensis(documento n.° WO96/12012), lipasas deStreptomycesde tipo GD<s>L (documento n.° WO10/065455), la cutinasa deMagnaporthe grisea(documento n.° WO10/107560), la cutinasa dePseudomonas mendocina(documento n.° US5.389.536), la lipasa deThermobifida fusca(documento n.°WO11/084412), la lipasa deGeobacillus stearothermophilus(documento n.° WO11/084417), la lipasa deBacillus subtilis(documento n.° WO11/084599) y la lipasa deStreptomyces griseus(documento n.° WO11/150157) y S.pristinaespiralis(documento n.° WO12/137147). Otros ejemplos son polipéptidos lipasas tales como las indicadas en los documentos n.° EP407225, n.° WO92/05249, n.° WO94/01541, n.° WO94/25578, n.° WO95/14783, n.° WO95/30744, n.° WO95/35381, n.° WO95/22615, n.° WO96/00292, n.° WO97/04079, n.° WO97/07202, n.° WO00/34450, n.° WO00/60063, n.° WO01/92502, n.° WO07/87508 y n.° WO09/109500. Entre los productos de lipasa comercial preferentes se incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente de Gist-Brocades). Todavía otros ejemplos son lipasas en ocasiones denominadas aciltransferasas o perhidrolasas, p. ej., aciltransferasas con homología respecto a la lipasa A deCandida antarctica(documento n.° WO10/111143), aciltransferasa deMycobacterium smegmatis(documento n.° WO05/56782), perhidrolasas de la familia CE 7 (documento n.°WO09/67279) y polipéptidos de la perhidrolasa deM. smegmatis,en particular la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (documento n.° WO10/100028).
Además de los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa que comprenden SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % a los mismos, la composición limpiadora de la invención puede comprender, además, amilasas que pueden utilizarse junto con un polipéptido de la invención. La amilasa puede ser una alfa-amilasa o una glucoamilasa y puede ser de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre las amilasas se incluyen, por ejemplo, las alfa-amilasas obtenidas deBacillus,p. ej., una cepa especial deBacillus licheniformis,descrita en mayor detalle en el documento n.° GB 1.296.839. Entre las amilasas adecuadas se incluyen amilasas que presentan SEC ID n.° 3 en el documento n.° WO 95/10603 o polipéptidos que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 3 de los mismos. Los polipéptidos preferentes se describen en los documentos n.° WO 94/02597, n.° WO 94/18314, n.° WO 97/43424 y SEC ID n.° 4 del documento n.° WO 99/019467, tal como polipéptidos con sustituciones en una o más de las posiciones siguientes: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444. Entre las amilasas adecuadas se incluyen amilasas que presentan SEC ID n.° 6 en el documento n.°WO 02/010355 o polipéptidos de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 6. Los polipéptidos preferentes de SEC ID n.° 6 son aquellos que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182 y una sustitución en la posición 193. Otras amilasa que resultan adecuadas son las alfa-amilasas híbridas que comprenden los residuos 1 a 33 de la alfa-amilasa derivada de B.amyloliquefaciensmostrada en SEC ID n.° del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36 a 483 de la alfa-amilasa de B.licheniformismostrada en SEC ID n.° 4 del documento n.° WO 2006/066594 o polipéptidos que presenta una identidad de secuencia de 90 % respecto a las mismas. Los polipéptidos preferentes de dicha alfa-amilasa híbrida son aquellos que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 y Q264. Los polipéptidos más preferentes de la alfa-amilasa híbrida que comprende los residuos 1a 33 de la alfa-amilasa derivada de B.amyloliquefaciensmostrada en SEC ID n.° 6 del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36 a 483 de SEC ID n.° son aquellos que presentan las sustituciones:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; o G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
Son amilasas adicionales que resultan adecuadas las amilasas que presentan SEC ID n.° 6 del documento n.° WO 99/019467 o los polipéptidos de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 6. Los polipéptidos preferentes de SEC ID n.° 6 son aquellos que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 y K269. Son amilasas particularmente preferentes las que presentan una deleción en las posiciones R181 y G182, o en las posiciones H183 y G184.
Son amilasas adicionales que pueden utilizarse aquellas que presentan SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 3, SEC ID n.° 2 o SEC ID n.° 7 del documento n.° WO 96/023873 o polipéptidos de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2,SeC iDn.° 3 o SEC ID n.° 7. Los polipéptidos preferentes de SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2, SEC ID n.° 3 o SEC ID n.° 7 son aquellos que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 y 476. Los polipéptidos más preferentes son aquellos que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182, o en las posiciones 183 y 184. Los polipéptidos amilasa más preferentes de SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2 o SEC ID n.° 7 son aquellos que presentan una deleción en las posiciones 183 y 184 y una sustitución en una o más de las posiciones 140, 195, 206, 243, 260, 304 y 476. Otras amilasas que pueden utilizarse son amilasas que presentansEcID n.° 2 del documento n.° WO 08/153815, SEC ID n.° 10 del documento n.° WO 01/66712 o polipéptidos de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 2 del documento n.° WO 08/153815 o de 90 % respecto a SEC ID n.° 10 del documento n.°WO 01/66712. Los polipéptidos preferentes de SEC ID n.° 10 del documento n.° WO 01/66712 son aquellos que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 y 264. Son amilasas adecuadas adicionales las amilasas que presentan SEC ID n.° 2 del documento n.°WO 09/061380 o polipéptidos que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 2 de las mismas. Son polipéptidos preferentes de SEC ID n.° 2 aquellos que presentan un truncado del extremo C-terminal y/o una sustitución, una deleción o una inserción en una de las posiciones siguientes: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 y G475. Son polipéptidos más preferentes de SEC ID n.° 2 aquellos que presentan una sustitución en una o más de las posiciones siguientes: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E y G475K y/o una deleción en la posición R180 y/o S181 o de T182 y/o G183. Los polipéptidos amilasa más preferentes desEcID n.° 2 son aquellos que presentan las sustituciones siguientes:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K,
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K, o S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K en los que los polipéptidos están truncados en el extremo C-terminal y opcionalmente comprenden, además, una sustitución en la posición 243 y/o una deleción en la posición 180 y/o en la posición 181.
Son amilasas adecuadas adicionales las alfa-amilasas que presentan SEC ID n.° 12 del documento n.° WO 99/66712 o una variante que presenta una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 12. Los polipéptidos amilasa preferentes son aquellos que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes de SEC ID n.° 12 del documento n.° WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Entre las amilasas preferentes particulares se incluyen polipéptidos que presentan una deleción de D183 y G184 y que presentan las sustituciones R118K, N195F,r320Ky R458K, y una variante que adicionalmente presenta sustituciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 y A339; resulta más preferente una variante que adicionalmente presenta sustituciones en la totalidad de dichas posiciones.
Otros ejemplos son polipéptidos amilasa tales como los indicados en los documentos n.° WO2011/098531, n.° WO2013/001078 y n.° WO2013/001087. Son amilasas disponibles comercialmente, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X y BAN™ (de Novozymesa/s)y Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase y Preferenz S100 (de Genencor International Inc./DuPont).
Además de los polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa que comprenden SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto a los mismos, la composición limpiadora de la invención puede comprender, además, peroxidasas/oxidasas, incluyendo las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre los ejemplos de peroxidasas útiles se incluyen las peroxidasas deCoprinus, p.ej.,de C.cinereus,y los polipéptidos de las mismas tales como las descritas en los documentos n.°WO 93/24618, n.° WO 95/10602y n.°WO 98/15257. Entre las peroxidasas disponibles comercialmente se incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).
Las composiciones limpiadoras de la invención pueden contener además, si no se indica lo contrario, 0 % a 10 % en peso, tal como 0,5 % a 5 %, 2 % a 5 %, 0,5 % a 2 % o 0,2 % a 1 % de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido de la técnica para el uso en detergentes. El polímero puede funcionar como un comejorador tal como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar propiedades antirredeposición, de protección de las fibras, de desprendimiento de la suciedad, de inhibición de la transferencia de tintes, de limpieza de grasas y/o antiespumantes. Algunos polímeros puede presentar más de una de las propiedades anteriormente mencionadas y/o más de uno de los motivos mencionados posteriormente. Entre los polímeros de ejemplo se incluyen (carboximetil)celulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol u óxido de polietileno (PEG), polietilenimina etoxilada, carboximetilinulina (CMI) y policarboxilatos, tales como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico, CMC modificado hidrofóbicamente (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos, copolímeros de tereftalato de polietileno y poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridín-N-óxido) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Entre los polímeros de ejemplo adicionales se incluyen policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y etoxisulfato de dicuaternio. Se dan a conocer otros polímeros de ejemplos en, p. ej., el documento n.° WO 2006/130575. También se encuentran contempladas sales de los polímeros anteriormente mencionados.
Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir, además, agentes matizantes de tejidos, tales como tintes o pigmentos, que al formularse en composiciones de detergente, pueden depositarse sobre un tejido al poner dicho tejido en contacto con una solución de lavado que comprende dichas composiciones de detergente, alterando de esta manera el tinte de dicho tejido mediante absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten por lo menos una cierta cantidad de luz visible si se someten a luz ultravioleta. En contraste, los agentes matizantes de tejidos alteran el tinte de una superficie, ya que absorben por lo menos una parte del espectro de luz visible. Entre los agentes matizantes de tejidos adecuados se incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y pueden incluir también pigmentos. Entre los tintes adecuados se incluyen los tintes de molécula pequeña y los tintes poliméricos. Entre los tintes de molécula pequeña adecuados se incluyen los tintes de molécula pequeña seleccionados del grupo que consiste en tintes dentro de las clasificaciones de Índice de color (I.C.) de Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet y Basic Red, o mezclas de los mismos, por ejemplo tal como se describe en los documentos n.° WO2005/03274, n.° WO2005/03275, n.° WO2005/03276 y n.° EP1876226 (incorporados en la presente memoria como referencia). La composición de detergente preferentemente comprende entre aproximadamente 0,00003 % en peso y aproximadamente 0,2 % en peso, entre aproximadamente 0,00008 % en peso y aproximadamente 0,05 % en peso, o incluso entre aproximadamente 0,0001 % en peso y aproximadamente 0,04 % en peso de agente matizante de tejidos. La composición puede comprender entre 0,0001 % en peso y 0,2 % en peso de agente matizante de tejidos; esto puede resultar especialmente preferente cuando la composición se encuentra en la forma de una bolsa de dosis unitaria. Los agentes matizantes de tejidos adecuados también se dan a conocer en, p. ej., los documentos n.° WO 2007/087257 y n.° WO2007/087243.
La composición limpiadora puede contener 0 % a 10 % en peso, por ejemplo 0 % a 5 % en peso, tal como entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 5 %, o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 % de un hidrótropo. Puede utilizarse cualquier hidrótrotopo conocido de la técnica para el uso en detergentes. Entre los ejemplos no limitativos de hidrótropos se incluyen bencenosulfonato sódico, p-toluenosulfonato sódico (STS), xilenosulfonato sódico (SXS), cumeno-sulfonato sódico (SCS), cimeno-sulfonato sódico, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoléteres, hidroxinaftoato sódico, hidroxinaftalensulfonato sódico, etilhexilsulfato sódico y combinaciones de los mismos.
Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden contener, además, dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Entre los materiales orgánicos solubles en agua adecuados se incluyen ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los que el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Se describen dispersantes adecuados en, por ejemplo, Powdered Detergents, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc.
Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Entre los agentes inhibidores de la transferencia de tintes poliméricos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polímeros polivinilpirrolidona, polímeros N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas de los mismos. Cuando están presentes en una composición de la invención, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes a niveles de entre aproximadamente 0,0001 % y aproximadamente 10 %, de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 5 %, o incluso de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 3 % en peso de la composición.
Las composiciones de detergente de la presente invención pueden contener, además, componentes adicionales que pueden tintar artículos que se están lavando, tales como agente blanqueador fluorescente o abrillantadores ópticos. En caso de estar presente, el abrillantador preferentemente se encuentra a un nivel de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 0,5 %. Puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para el uso en una composición de detergente de lavandería en la composición de lavandería de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes más comúnmente utilizados son los pertenecientes a las clases de derivados del ácido diaminoestilbén-sulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados bisfenilo-diestirilo. Entre los ejemplos del tipo derivado de ácido diaminoestilbén-sulfónico de agentes blanqueadores fluorescentes se incluyen las sales sódicas de: 4,4'-bis[(4-anilino-6-dietanolamino-s-triazín-2-il)amino]estilbén-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis[(4,6-dianilino-s-triazín-2-il)amino]estilbén-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis{4-anilino-6-[metil(2-hidroxietil)amino]-s-triazín-2-ilamino}estilbén-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis(4-fenil-1,2,3-triazol-2-il)estilbén-2,2'-disulfonato y 5-(2H-nafto[1,2-d][1,2,3]triazol-2-il)-2-[(E)-2-fenilvinil]bencenosulfonato sódico. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferentes son Tinopal DMS y Tinopal CBS, disponibles de BASF. Tinopal DMS es la sal disódica del disulfonato de 4,4'-bis-[(4-anilino-6-morfolino-s-triazín-2-il)amino]estilbén-2,2'-disulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica de 2,2'-[bifenil-s-4,4-di(2,1-etenediil)]dibenceno-1-sulfonato. También resulta preferente Parawhite KX disponible comercialmente, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India. Entre otros fluorescentes adecuados para el uso en la invención se incluyen las 1,3-diarilpirazolinas y las 7-alquilaminocoumarinas.
Entre los niveles de abrillantador fluorescente adecuado se incluyen niveles más bajos, de aproximadamente 0,01 % a 0,05 %, de aproximadamente 0,1 % o incluso de aproximadamente 0,2 % en peso y niveles más altos, de 0,5 % o incluso de 0,75 % en peso.
Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir, además, uno o más polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad, que ayudan a eliminar la suciedad de los tejidos, tales como el algodón y los tejidos a base de poliéster, en particular la eliminación de manchas hidrofóbicas en tejidos a base de poliéster. Los polímeros facilitadores del desprendimiento de suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros a base de tereftalato no niónicos o aniónicos, polivinil-caprolactamos y copolímeros relacionados, copolímeros de injertación de vinilo, poliamidas de poliéster; ver, por ejemplo, el capítulo 7 en la obra Powdered Detergents, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad son los polímeros desgrasantes alcoxilados anfifílicos que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina tal como se describe en detalle en el documento n.° 2009/087523 (incorporada en la presente memoria como referencia). Además, los copolímeros injertados aleatorios son polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad adecuados. Se describen copolímeros injertados en mayor detalle en los documentos n.°WO 2007/138054, WO 2006/108856 y n.°WO 2006/113314 (incorporados como referencia en la presente memoria). Otros polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad son estructuras polisacáridas sustituidas, especialmente estructuras celulósicas, tales como derivados de celulosa modificada, tales como los descritos en el documento n.° EP 1867808 o en el documento n.°WO 2003/040279 (ambos incorporados en la presente memoria como referencias). Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de los mismos. Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de las mismas.
Las composiciones limpiadoras de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes antirredeposición, tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (CMC), poli(alcohol vinílico) (PVA), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros basados en celulosa descritos en el aparato sobre polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad también podrían funcionar como agentes antirredeposición.
La composición limpiadora de la invención puede contener, además, uno o más materiales auxiliares alternativos o adicionales. Entre otros materiales auxiliares adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes antiencogimiento, agentes antiarruga, bactericidas, ligantes, portadores, tintes, estabilizantes de enzimas, suavizantes de tejidos, rellenos, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de espuma, solventes y estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastificadores de la estructura.
La composición limpiadora de la invención puede presentar cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que presenta uno o más compartimientos, tal como 2 o más, preferentemente 2, 3, 4 o 5 compartimientos, unos polvos regulares o compactos, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado.
Las bolsas pueden configurarse como de compartimiento único o multicompartimiento. Puede ser de cualquier forma y material que resulte adecuado para contener la composición, p. ej., sin permitir la salida de la composición de la bolsa antes del contacto con agua. La bolsa está hecha de película soluble en agua que encierra un volumen interior. Dicho volumen interior puede dividirse en compartimientos de la bolsa. Las películas preferentes son materiales poliméricos, preferentemente polímeros que se conforman como una película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados de los mismos preferentes son poliacrilatos seleccionados y copolímeros de acrilato solubles en agua, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos, lo más preferentemente copolímeros de alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Preferentemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo PVA, es de por lo menos aproximadamente 60 %. El peso molecular medio preferente habitualmente es de entre aproximadamente 20.000 y aproximadamente 150.000. Las películas también pueden ser de composiciones de mezcla que comprenden mezclas de polímero hidrolíticamente degradables y solubles en agua, tales como poliláctido y alcohol polivinílico (conocido con la referencia comercial M8630, tal como es comercializado por MonoSol LLC, Indiana, EE. UU.) más plastificadores como el glicerol, etilenglicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos. Las bolsas pueden comprender una composición limpiadora de lavandería sólida o componentes parciales y/o una composición limpiadora líquida o componentes parciales separados por la película soluble en agua. El compartimiento para componentes líquidos puede presentar una composición diferente que los compartimientos que contienen sólidos: documento n.° US2009/0011970 A1.
Los ingredientes limpiadores y detergentes pueden estar separados físicamente unos de otros por compartimientos en bolsas solubles en agua o en diferentes capas de tabletas. De esta manera, pueden evitarse las interacciones negativas entre componentes durante el almacenamiento. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimientos también puede dar lugar a una ralentización de la disolución de componentes seleccionados en la solución de lavado.
Un detergente líquido o en gel que no se presente en forma de dosis unitaria puede ser acuoso, conteniendo normalmente por lo menos 20 % en peso y hasta 95 % de agua, tal como hasta aproximadamente 70 % de agua, hasta aproximadamente 65 % de agua, hasta aproximadamente 55 % de agua, hasta aproximadamente 45 % de agua o hasta aproximadamente 35 % de agua. Pueden incluirse en un líquido acuoso o gel otros tipos de líquidos, incluyendo, aunque sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles. Un detergente líquido acuoso o en gel puede contener entre 0 % y 30 % de solvente orgánico.
La presente invención se refiere, además, a métodos de utilización de las composiciones dadas a conocer en la presente memoria en la lavandería de textiles y tejidos, tales como el lavado doméstico de ropa y el lavado industrial de ropa.
La invención se refiere, además, a métodos de utilización de las composiciones dadas a conocer en la presente memoria en la limpieza de superficies duras, tales como suelos, mesas, paredes, techos, etc., así como superficies de objetos duros, tales como coches (lavado de coches) y platos (lavaplatos).
El procedimiento de limpieza o el procedimiento de cuidado textil puede ser, por ejemplo, un procedimiento de lavandería, un procedimiento de lavavajillas o de limpieza de superficies duras, tales como baldosas de baño, suelos, superficies de mesas, desagües, fregaderos y lavabos. Los procedimientos de lavandería pueden ser, por ejemplo, de lavandería doméstica, aunque también pueden ser de lavandería industrial. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la lavandería de tejidos y/o prendas en el que el procedimiento comprende tratar tejidos con una solución de lavado que contiene una composición detergente de la invención. El procedimiento de limpieza o el procedimiento de cuidado textil puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un procedimiento de lavado a máquina o en un procedimiento de lavado manual. La solución de lavado puede ser, por ejemplo, una solución de lavado acuoso que contiene una composición detergente.
En los últimos años ha habido un creciente interés en la sustitución de componentes derivados de petroquímicos en los detergentes por componentes biológicos renovables, tales como enzimas y polipéptidos, sin comprometer el rendimiento de lavado. Cuando cambian los componentes de las composiciones de detergentes, se requieren nuevas actividades enzimáticas o nuevos enzimas con propiedades alternativas y/o mejoradas en comparación con los enzimas de detergente utilizados habitualmente, tales como proteasas, lipasas y amilasas, para conseguir un rendimiento de lavado similar o mejorado en comparación con las composiciones detergentes tradicionales.
Los polipéptidos que comprenden el dominio catalítico Gluco_hidro_20, de esta manera, resultan particularmente útiles en la composición, tal como composiciones detergentes, que comprenden ingredientes limpiadores, y los polipéptidos pueden utilizarse preferentemente en procedimientos de limpieza, tales como el lavado de ropa y vajillas.
Nuevas hexosaminidasas
En la presente memoria se da a conocer un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20 y uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41). Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto al polipéptido de SEC ID n.° 20,
(b) un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto al polipéptido de SEC ID n.° 33,
(c) un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto al polipéptido de SEC ID n.° 34,
(d) un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto al polipéptido de SEC ID n.° 35,
(e) una variante del polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35, en donde la variante presenta actividad de hexosaminidasa y comprende una o más sustituciones de aminoácido, y/o una o más deleciones de aminoácido, y/o una o más inserciones de aminoácido o cualquier combinación de los mismos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 posiciones,
(f) un polipéptido que comprende el polipéptido de (a) a (e) y una etiqueta de Hi N-terminal y/o C-terminal y/o etiqueta HQ,
(g) un polipéptido que comprende el polipéptido de (a) a (e) y una extensión N-terminal y/o C-terminal de entre 1 y 10 aminoácidos,
(h) un fragmento del polipéptido de (a) a (e) que presenta actividad de hexosaminidasa y que presenta por lo menos 90 % de la longitud del polipéptido maduro,
(i) un polipéptido que comprende uno o más de los motivos [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEQ ID NO 21), NYN[<a>S]Y[<s>Y]LY (SEC ID n.° 22) y/o GXDE (SEC ID n.° 41), y que opcionalmente comprende, además, uno o más motivos ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o DPRIH (SEC ID n.° 45), y
(j) polipéptido que presenta actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa.
El polipéptido preferentemente presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o 100 % respecto al polipéptido mostrado en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, s Ec ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 5 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 5.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 6 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 6.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 7 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 7.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 8 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 8.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEQ ID NO 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 37 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99%o 100%respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 37.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 38 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 38.
Un aspecto se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el polipéptido comprende uno o más dominios [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22), GXDE (SEC ID n.° 41) y en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 39 o comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 75 %, tal como de por lo menos 80 %, tal como de por lo menos 85 %, tal como de por lo menos 86 %, tal como de por lo menos 87 %, tal como de por lo menos 88 %, tal como de por lo menos 89 %, tal como de por lo menos 90 %, tal como de por lo menos 91 %,, tal como de por lo menos 92 %, tal como de por lo menos 93 %, tal como de por lo menos 94 %, tal como de por lo menos 95 %, tal como de por lo menos 96 %, tal como de por lo menos 97 %, tal como de por lo menos 98 %, tal como de por lo menos 99 % o 100 % respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 39.
En algunos aspectos de la invención, los polipéptidos utilizados en las composiciones de la invención, p. ej., los polipéptidos que presentan una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 80 % o tal como de por lo menos 90 % respecto a los polipéptidos maduros de SEC ID n.° 12 o respecto al polipéptido maduro con SEC ID n.° 20 presentan actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y, en algún aspecto, la actividad de hexosaminidasa es actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y el polipéptido de la invención son p-N-acetilglucosaminidasas.
En algunos aspectos de la invención, los polipéptidos, p. ej. los polipéptidos que presentan una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 80 % o tal como de por lo menos 90 % respecto a los polipéptidos maduros de SEC ID n.° 25 o respecto al polipéptido maduro con SEC ID n.° 33 presentan actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y, en algún aspecto, la actividad de hexosaminidasa es actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y el polipéptido de la invención son p-N-acetilglucosaminidasas.
En algunos aspectos de la invención, los polipéptidos, p. ej. los polipéptidos que presentan una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 80 % o tal como de por lo menos 90 % respecto a los polipéptidos maduros de SEC ID n.° 26 o respecto al polipéptido maduro con SEC ID n.° 34 presentan actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y, en algún aspecto, la actividad de hexosaminidasa es actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y el polipéptido de la invención son p-N-acetilglucosaminidasas.
En algunos aspectos de la invención, los polipéptidos, p. ej. los polipéptidos que presentan una identidad de secuencias de por lo menos 60 %, tal como de por lo menos 70 %, tal como de por lo menos 80 % o tal como de por lo menos 90 % respecto a los polipéptidos maduros de SEC ID n.° 27 o respecto al polipéptido maduro con SEC ID n.° 35 presentan actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y, en algún aspecto, la actividad de hexosaminidasa es actividad de p-N-acetilglucosaminidasa y el polipéptido de la invención son p-N-acetilglucosaminidasas.
La exposición se refiere, además, a un polipéptido que comprende uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y GXDE (SEC ID n.° 41), y opcionalmente comprende, además, uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) y DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia respecto al polipéptido maduro mostrado en SEC ID n.° 20 de por lo menos 80 %, p.ej., de por lo menos 85 %, de por lo menos 86 %, de por lo menos 87 %, de por lo menos 88 %, de por lo menos 89 %, de por lo menos 90 %, de por lo menos 91 %, de por lo menos 92 %, de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 %, o 100 % y que presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren hasta en 49 aminoácidos, p. ej., entre 1 y 49 aminoácidos, tal como 1-45, 1-40,1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 aminoácidos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.° 20. En una realización, se ha aislado el polipéptido. En una realización, el polipéptido presenta por lo menos 70 %, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.° 20.
La exposición se refiere, además, a un polipéptido que comprende uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y GXDE (SEC ID n.° 41), y opcionalmente comprende, además, uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) y DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia respecto al polipéptido maduro mostrado en SEC ID n.° 33 de por lo menos 80 %, p.ej., de por lo menos 85 %, de por lo menos 86 %, de por lo menos 87 %, de por lo menos 88 %, de por lo menos 89 %, de por lo menos 90 %, de por lo menos 91 %, de por lo menos 92 %, de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 %, o 100 % y que presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren hasta en 49 aminoácidos, p. ej., entre 1 y 49 aminoácidos, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 aminoácidos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.° 33. En una realización, se ha aislado el polipéptido. En una realización, el polipéptido presenta por lo menos 70 %, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.° 33.
La exposición se refiere, además, a un polipéptido que comprende uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y GXDE (SEC ID n.° 41), y opcionalmente comprende, además, uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) y DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia respecto al polipéptido maduro mostrado en SEC ID n.° 34 de por lo menos 80 %, p.ej., de por lo menos 85 %, de por lo menos 86 %, de por lo menos 87 %, de por lo menos 88 %, de por lo menos 89 %, de por lo menos 90 %, de por lo menos 91 %, de por lo menos 92 %, de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 %, o 100 % y que presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren hasta en 49 aminoácidos, p. ej., entre 1 y 49 aminoácidos, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 aminoácidos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.° 34. En una realización, se ha aislado el polipéptido. En una realización, el polipéptido presenta por lo menos 70 %, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.° 34.
La exposición se refiere, además, a un polipéptido que comprende uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21), NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y GXDE (SEC ID n.° 41), y opcionalmente comprende, además, uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en ARAYYPV (SEC ID n.° 42), AWNDGID (SEC ID n.° 43), DDQNVGI (SEC ID n.° 44) y DPRIH (SEC ID n.° 45), en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencia respecto al polipéptido maduro mostrado en SEC ID n.° 35 de por lo menos 80 %, p.ej., de por lo menos 85 %, de por lo menos 86 %, de por lo menos 87 %, de por lo menos 88 %, de por lo menos 89 %, de por lo menos 90 %, de por lo menos 91 %, de por lo menos 92 %, de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 %, o 100 % y que presenta actividad de hexosaminidasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren hasta en 49 aminoácidos, p. ej., entre 1 y 49 aminoácidos, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 aminoácidos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID n.° 35. En una realización, se ha aislado el polipéptido. En una realización, el polipéptido presenta por lo menos 70 %, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro de SEC ID n.° 35.
Un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 20 o una variante alélica de la misma; comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 20 y una etiqueta de His N-terminal y/o C-terminal y/o una etiqueta HQ; o es un fragmento de las mismas que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el fragmento comprende por lo menos 300 aminoácidos, tal como por lo menos 320 aminoácidos, por lo menos 350 aminoácidos, por lo menos 400 aminoácidos, por lo menos 410 aminoácidos, por lo menos 420 aminoácidos, por lo menos 430 aminoácidos, por lo menos 440 aminoácidos, por lo menos 450 aminoácidos o por lo menos 460 aminoácidos.
Un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 33 o una variante alélica de la misma; comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 33 y una etiqueta de His N-terminal y/o C-terminal y/o una etiqueta HQ; o es un fragmento de las mismas que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el fragmento comprende por lo menos 300 aminoácidos, tal como por lo menos 320 aminoácidos, por lo menos 350 aminoácidos, por lo menos 400 aminoácidos, por lo menos 410 aminoácidos, por lo menos 420 aminoácidos, por lo menos 430 aminoácidos, por lo menos 440 aminoácidos, por lo menos 450 aminoácidos o por lo menos 460 aminoácidos.
Un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 34 o una variante alélica de la misma; comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 34 y una etiqueta de His N-terminal y/o C-terminal y/o una etiqueta HQ; o es un fragmento de las mismas que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el fragmento comprende por lo menos 300 aminoácidos, tal como por lo menos 320 aminoácidos, por lo menos 350 aminoácidos, por lo menos 400 aminoácidos, por lo menos 410 aminoácidos, por lo menos 420 aminoácidos, por lo menos 430 aminoácidos, por lo menos 440 aminoácidos, por lo menos 450 aminoácidos o por lo menos 460 aminoácidos.
Un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 35 o una variante alélica de la misma; comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 35 y una etiqueta de His N-terminal y/o C-terminal y/o una etiqueta HQ; o es un fragmento de las mismas que presenta actividad de hexosaminidasa, en donde el fragmento comprende por lo menos 300 aminoácidos, tal como por lo menos 320 aminoácidos, por lo menos 350 aminoácidos, por lo menos 400 aminoácidos, por lo menos 410 aminoácidos, por lo menos 420 aminoácidos, por lo menos 430 aminoácidos, por lo menos 440 aminoácidos, por lo menos 450 aminoácidos o por lo menos 460 aminoácidos.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 16, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). En una realización, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 16 o la secuencia de ADNc del mismo de por lo menos 80 %, p. ej., de por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, o 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 29, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). En una realización, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 29 o la secuencia de ADNc del mismo de por lo menos 80 %, p. ej., de por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, o 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 30, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). En una realización, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 30 o la secuencia de ADNc del mismo de por lo menos 80 %, p. ej., de por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, o 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 31, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). En una realización, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 31 o la secuencia de ADNc del mismo de por lo menos 80 %, p. ej., de por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, o 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 32, (ii) la secuencia de ADNc del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). En una realización, se ha aislado el polipéptido.
El polinucleótido de SEC ID n.° 16, SEC ID n.° 29, SEC ID n.° 30, SEC ID n.° 31, SEC ID n.° 32 o una subsecuencia de los mismos, así como el polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 o un fragmento de los mismos para diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar polipéptidos codificantes de ADN con actividad de hexosaminidasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos de la técnica. Dichas sondas pueden utilizarse para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern, a fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, aunque deberían ser de por lo menos 15, p. ej., de por lo menos 25, por lo menos 35 o por lo menos 70 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la sonda de ácidos nucleicos presenta una longitud mínima de 100 nucleótidos, p. ej., de por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 400 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos 700 nucleótidos, por lo menos 800 nucleótidos, o por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Pueden utilizarse tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas normalmente se marcan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). Dichas sondas se encuentran comprendidas en la presente invención.
Una biblioteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de dichas otras cepas puede cribarse para ADN que se hibride con las sondas indicadas anteriormente y codifique para un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa. Puede separarse el ADN genómico u otro ADN respecto de dichas otras cepas mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede transferirse e inmovilizarse sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que se hibride con SEC ID n.° 16, 29, 30, 31 o 32, o una subsecuencia de la misma, el material portador se utiliza en una transferencia southern.
Para los fines del a presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se hibrida con una sonda de ácidos nucleicos marcada correspondiente a (i) SEC ID n.° 16, SEC ID n.° 29, SEC ID n.° 30, SEC ID n.° 31, SEC ID n.° 32; (ii) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35; (iii) el complemento de longitud completa de la misma, o (iv) una subsecuencia del mismo, bajo condiciones de astringencia muy baja o muy alta. Las moléculas a las que se hibrida la sonda de ácidos nucleicos bajo dichas condiciones pueden detectare utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido de la técnica.
La presente exposición se refiere a polinucleótidos codificantes de un polipéptido o un domino catalítico, tal como se describen en la presente memoria. En una realización, se ha aislado el polinucleótido codificante del polipéptido o dominio catalítico.
Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido son conocidas de la técnica y entre ellas se incluye el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una combinación de ellas. La clonación de los polinucleótidos a partir de ADN genómico puede llevarse a cabo, p. ej., mediante utilización de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o cribado con anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos de ADN clonados que presentan elementos estructurales compartidos. Ver, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), la transcripción activada por ligación (LAT, por sus siglas en inglés) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA, por sus siglas en inglés). Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa deCurtobacterium,o un organismo relacionado y, de esta manera, por ejemplo, puede ser una variante alélica o específica de la región codificante de polipéptido del polinucleótido. La modificación de un polinucleótido codificante de un polipéptido de la presente invención puede resultar necesaria para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión «sustancialmente similar» al polipéptido se refiere a formas no naturales del polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición tal como se describe en la presente memoria que comprende un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 16 de por lo menos 60 %, p. ej., de por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99%o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 29 de por lo menos 60 %, p. ej., de por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición tal como se describe en la presente memoria que comprende un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 30 de por lo menos 60 %, p. ej., de por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 31 de por lo menos 60 %, p. ej., de por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 32 de por lo menos 60 %, p. ej., de por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 33 de por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 34 de por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencias respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 35 de por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente exposición se refiere a un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID n.° 32 o la secuencia de ADNc del mismo de por lo menos 80 %, p. ej., de por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, o de 100 %. En una realización adicional, se ha aislado el polipéptido.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones tal como se describen en la presente memoria que comprenden variantes del polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 que comprenden una sustitución, y/o deleción y/o inserción en una o más (p. ej., varias) posiciones. En una realización, el número de posiciones que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, y/o una o más deleciones de aminoácidos, y/o una o más inserciones de aminoácido, o cualquier combinación de las mismas, en la SEC ID n.° 20 es no superior a 49, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49. En otra realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácido, y/o una o más deleciones de aminoácido y/o una o más inserciones de aminoácido, o cualquier combinación de las mismas, en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 es de entre 1 y 45, tal como de 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 posiciones. En una realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácido, y/o una o más deleciones de aminoácido y/o una o más inserciones de aminoácido, o cualquier combinación de las mismas, en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 es no superior a 10, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra realización, el número de sustituciones y/o deleciones y/o inserciones en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 es no superior a 10, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización adicional, el número de sustituciones en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 es no superior a 10, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización adicional, el número de sustituciones conservadoras en SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 es no superior a 10, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, la variante presenta por lo menos 70 %, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos 100 % de la actividad de hexosaminidasa de la molécula parental, p. ej., en comparación con SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
Los cambios de aminoácido en el polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35 descritos anteriormente pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al pliegue y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, normalmente de 1 a 30 aminoácidos, pequeñas extensiones amino- o carboxiloterminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un péptido conector pequeño, de hasta 20 a 25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación mediante la modificación de la carga neta u otra función, tal como un segmento polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Los ejemplos de sustituciones conservadoras están comprendidos en grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica son conocidas de la técnica y se describen en, por ejemplo, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, en: The Proteins, Academic Press, New York. Son sustituciones habituales Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio o la mutagénesis por escaneo de alaninas (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo para actividad de hexosaminidasa para identificar los residuos aminoácidos que resultan críticos para la actividad de la molécula. Ver también Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo del enzima u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcaje de fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos putativos de sitio de contacto. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, f Eb S Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de la alineación con un polipéptido relacionado.
Pueden realizarse sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reorganización (en inglés, «shuffling»), seguido de un procedimiento relevante de cribado, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53 57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documento n.° W<o>95/17413 o documento n.° WO 95/22625. Entre otros métodos que pueden utilizarse se incluyen PCR con tendencia a errores, exposición fágica (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente US n.° 5.223.409; documento n.°WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Los métodos de mutagénesis/reorganización pueden combinarse con métodos de cribado automatizado de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados clonados que expresan las células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse a partir de las células huésped y secuenciarse rápidamente utilizando métodos estándares de la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de los residuos aminoácidos individuales en un polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se ha fusionado en el extremo N-terminal o C-terminal de una región de otro polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el que se ha fusionado otro polipéptido en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de la presente invención. Se produce un polipéptido de fusión mediante la fusión de un polinucleótido codificante de otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen la ligación de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos, de manera que se encuentren en el mismo marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del mismo promotor o promotores y terminador. También pueden construirse polipéptidos de fusión utilizando tecnología de inteínas, en la que se crean polipéptidos de fusión después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión puede comprender, además, un sitio de corte entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, se corta el sitio, liberando los dos polipéptidos. Entre los ejemplos de sitios de corte se incluyen, aunque sin limitación, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503 y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248 y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Fuentes de polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa
Puede obtenerse un polipéptido que presente actividad de hexosaminidasa a partir de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, la expresión «obtenido de» tal como se utiliza en la presente memoria sobre una fuente dada significará que el polipéptido codificante por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la que se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente dada se secreta extracelularmente.
El polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano. En un aspecto, el polipéptido es uno que presenta actividad de hexosaminidasa procedente de una bacteria de la claseActinobacteria,tal como del ordenMicrococcales,o de la familiaMicrobacteriaceae,o del géneroCurtobacteriumo de la especieCurtobacterium oceanosedimentum, Curtobacterium flaccumfaciens, Curtobacterium luteumo
Curtobacterium sp. Leaf154
Se entenderá que para las especies anteriormente indicadas, la invención comprende tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, con independencia del nombre de la especie por la que son conocidos. El experto en la materia reconocerá fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.
Las cepas de dichas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
El polipéptido puede identificarse y obtenerse a partir de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., suelo, compostajes, agua, etc.) o de muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (p. ej., suelo, compostajes, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de los hábitats naturales son bien conocidas de la técnica. A continuación, puede obtenerse un polinucleótido codificante del polipéptido mediante el cribado de manera similar de una biblioteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o de una muestra mixta de ADN. Una vez se ha detectado el polinucleótido codificante del polipéptido utilizando la sonda o sondas, puede aislarse el polinucleótido o clonarse, mediante la utilización de técnicas que son conocidas por el experto ordinario en la materia (ver, p. ej., Sambrook et al., 1989,supra).
Polinucleótidos
La presente exposición se refiere, además, a polinucleótidos codificantes de un polipéptido, tal como se describe en la presente memoria. En una realización, se ha aislado el polinucleótido codificante del polipéptido de la presente invención.
Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido son conocidas de la técnica y entre ellas se incluye el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una combinación de ellas. La clonación de los polinucleótidos a partir de ADN genómico puede llevarse a cabo, p. ej., mediante utilización de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o cribado con anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos de ADN clonados que presentan elementos estructurales compartidos. Ver, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), la transcripción activada por ligación (LAT, por sus siglas en inglés) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA, por sus siglas en inglés). Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa deTrichophaea,o una cepa deTrichoderma,o un organismo relacionado y, de esta manera, por ejemplo, puede ser una variante alélica o específica de la región codificante de polipéptido del polinucleótido.
La modificación de un polinucleótido codificante de un polipéptido de la presente invención puede resultar necesaria para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión «sustancialmente similar» al polipéptido se refiere a formas no naturales del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en algún modo introducido artificialmente respecto al polipéptido aislado de su fuente nativa, p. ej., variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, óptimo de pH o similar. Las variantes pueden construirse basándose en el polinucleótido presentado como la secuencia codificante del polipéptido maduro, de SEC ID n.° 20, o la secuencia de ADNc del mismo, p. ej., una subsecuencia del mismo, y/o mediante introducción de sustituciones de nucleótidos que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codones del organismo huésped pretendido para la producción del enzima, o mediante introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia diferente de aminoácidos. Para una descripción general de las sustituciones de nucleótidos, ver, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Constructos de ácidos nucleicos
La presente exposición se refiere, además, a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
El polinucleótido puede manipularse en una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede resultar deseable o necesaria según el vector de expresión. Las técnicas para modificar los polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas de la técnica.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que resulta reconocido por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido codificante de un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes codificantes de polipéptidos extracelulares o intracelulares, homólogos o heterólogos respecto a la célula huésped.
Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped bacteriana, los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa deBacillus amyloliquefaciens (amyQ),el gen de alfa-amilasa deBacillus licheniformis (amyL),el gen de penicilinasa deBacillus licheniformis (penP),el gen de amilasa maltogénica deBacillus stearothermophilus (amyM),el gen de levansucrasa deBacillus subtilis (sacB),los genesxylAyxylBdeBacillus subtilis,el gencrylIIAdeBacillus thuringiensis(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology l3 : 97-107), el operónlacdeE. coli,el promotortrcde E.coli(Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa deStreptomyces coelicolor (dagA)y el gen procariótico de la betalactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotortac(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94, y en Sambrooket al.,1989,supra.Se dan a conocer ejemplos de promotores en tándem en el documento n.° WO 99/43835.
Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos del a presente invención en una célula huésped de hongo filamentoso, los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa deAspergillus nidulans,la alfa-amilasa neutra deAspergillus niger,la alfa-amilasa estable frente a ácidos deAspergillus niger, Aspergillus nigero la glucoamilasa deAspergillus awamori (glaA),la amilasa TAKA deAspergillus oryzae,la proteasa alcalina deAspergillus oryzae,la triosa fosfato isomerasa deAspergillus oryzae,la proteasa de tipo tripsina deFusarium oxysporum(documento n.° WO 96/00787), la amiloglucosidasa deFusarium venenatum(documento n.° WO 00/56900),Fusarium venenatumDaria (documento n.° WO 00/56900),Fusarium venenatumQuinn (documento n.° WO 00/56900), la lipasa deRhizomucor miehei,la proteinasa aspártica deRhizomucor miehei,beta-glucosidasa deTrichoderma reesei,la celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei,la celobiohidrolasa II deTrichoderma reesei,la endoglucanasa I deTrichoderma reesei,la endoglucanasa II deTrichoderma reesei,la endoglucanasa III deTrichoderma reesei,la endoglucanasa V deTrichoderma reesei,la xilanasa I deTrichoderma reesei,la xilanasa II deTrichoderma reesei,la xilanasa III deTrichoderma reesei,la betaxilosidasa deTrichoderma reeseiy el factor de elongación traduccional deTrichoderma reesei,así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra deAspergillusen el que el líder no traducido se ha sustituido por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasadeAspergillus;entre los ejemplos no limitativos se incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra deAspergillus nigeren el que se ha sustituido el líder no traducido por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa deAspergillus nidulanso deAspergillus oryzae),y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. Se describen otros promotores en la patente U.S. n.° 6.011.147.
En un huésped levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes de la enolasa deSaccharomyces cerevisiae(ENO-1), de la galactoquinasa deSaccharomyces cerevisiae(GAL1), de la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae(ADH1, ADH2/GAP), de la triosa fosfato isomerasa deSaccharomyces cerevisiae(TPI), de la metalotioneína deSaccharomyces cerevisiae(CUP1) y de la 3-fosfoglicerato quinasa deSaccharomyces cerevisiae.Se describen otros promotores útiles para las células huésped de levadura en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por la célula huésped para terminar la transcripción. El terminador está operablemente ligado al extremo 3' del polinucleótido codificante del polipéptido. En la presente invención puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.
Los terminadores preferentes para las células huésped bacterianas se obtienen de los genes para la proteasa alcalina deBacillus clausii (aprH),de la alfa-amilasa deBacillus licheniformis (amyL)y del ARN ribosómico deEscherichia coli (rrnB).
Los terminadores preferentes para las células huésped de hongo filamentoso se obtienen de los genes de la acetamidasaAspergillus nidulans,de la antranilato sintasa deAspergillus nidulans,de la glucoamilasa deAspergillus niger,de la alfa-glucosidasa deAspergillus niger,de la TAKA amilasa deAspergillus oryzae,de la proteasa de tipo tripsina deFusarium oxysporum,de la beta-glucosidasa deTrichoderma reesei,de la celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei,de la celobiohidrolasa II deTrichoderma reesei,de la endoglucanasa I deTrichoderma reesei,de la endoglucanasa II deTrichoderma reesei,de la endoglucanasa III deTrichoderma reesei,de la endoglucanasa V deTrichoderma reesei,de la xilanasa I deTrichoderma reesei,de la xilanasa IIdeTrichoderma reesei,de la xilanasa III deTrichoderma reesei,de la beta-xilosidasa deTrichoderma reeseiy factor de elongación de traducción deTrichoderma reesei.
Los terminadores preferentes para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para la enolasa deSaccharomyces cerevisiae,la citocromo C deSaccharomyces cerevisiae(CYC1) y la gliceraldeído-3-fosfato deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae.Se describen otros terminadores útiles para las células huésped de levadura en Romanoset al.,1992,supra.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora del ARNm situada cadena abajo de un promotor y cadena arriba de la secuencia codificante de un gen, que incrementa la expresión del gen.
Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas de un gencryIIIA deBacillus thuringiensis(documento n.° WO 94/25612) y del gen SP82 deBacillus subtilis(Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465 3471).
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que resulta importante para la traducción por la célula huésped. El líder está operablemente ligado al extremo 5' del polinucleótido codificante del polipéptido. Puede utilizarse cualquier líder que sea funcional en la célula huésped.
Los líderes preferentes para las células huésped de hongo filamentoso se obtiene del os genes para la TAK amilasa deAspergillus oryzaey de la triosa fosfato isomerasa deAspergillus nidulans.
Se obtienen líderes adecuados para células huésped de levadura de los genes para la enolasa deSaccharomyces cerevisiae(ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa deSaccharomyces cerevisiae,factor alfa deSaccharomyces cerevisiaey alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa deSaccharomyces cerevisiae(ADH2/GAP).
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operablemente ligada al extremo 3'-terminal del polinucleótido y, una vez transcrita, es reconocida por la célula huésped como señal para añadir residuos poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.
Las secuencias de poliadenilación preferentes para las células huésped de hongo filamentoso se obtienen de los genes para la antranilato sintasa deAspergillus nidulans,la glucoamilasa deAspergillus niger,la alfa-glucosidasa deAspergillus niger,la TAKA amilasa deAspergillus oryzaey la proteasa de tipo tripsina deFusarium oxysporum.
Se describen secuencias de poliadenilación útiles para las células huésped de levadura en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido de señal que codifique un péptido de señal unido al extremo N-terminal de un polipéptido y que dirige el polipéptido a la ruta secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante de péptido de señal naturalmente unida en el mismo marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de péptido de señal que sea foránea a la secuencia codificante. Puede resultar necesaria una secuencia codificante de péptido de señal foránea en donde la secuencia codificante no contenga naturalmente una secuencia codificante de péptido de señal. Alternativamente, una secuencia codificante de péptido de señal foránea puede simplemente sustituir la secuencia codificante de péptido de señal natural con el fin de potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante de péptido de señal que dirija el polipéptido expresado a la ruta secretora de una célula huésped.
Las secuencias codificantes de péptido de señal eficaces para las células huésped bacterianas son las secuencias codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica deBacillusNCIB 11837, subtilisina deBacillus licheniformis,beta-lactamasa deBacillus licheniformis,alfa-amilasa deBacillus stearothermophilus,proteasas neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM)yprsAdeBacillus subtilis.Se describen péptidos de señal adicionales en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias codificantes de péptido de señal eficaces para las células huésped de hongo filamentoso son las secuencias codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes para la amilasa neutra deAspergillus nigerneutral amylase, la glucoamilasa deAspergillus niger,la TAKA amilasa deAspergillus oryzae,la celulasa deHumicola insolens,la endoglucanasa V deHumicola insolens,la lipasa deHumicola lanuginosay la aspártico proteinasa deRhizomucor miehei.
Se obtienen péptidos de señal para células huésped de levadura a partir de los genes para el factor alfa deSaccharomyces cerevisiaey la invertasa deSaccharomyces cerevisiae.Se describen otros terminadores útiles para las células huésped de levadura en Romanoset al.,1992,supra.
La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifique un propéptido situado en el extremo N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como proenzima o propolipéptido (o zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo mediante corte catalítico o autocatalítico del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido puede obtenerse a partir de los genes para la proteasa alcalina deBacillus subtilis (aprE),para la proteasa neutra deBacillus subtilis (nprT),para la lacasa deMyceliophthora thermophila(documento n.° WO 95/33836), la aspártico proteinasa deRhizomucor mieheiy el factor alfa deSaccharomyces cerevisiae.
En el caso de que estén presentes ambas secuencias, de péptido de señal y de propéptido, la secuencia del propéptido se sitúa contigua al extremo N-terminal del polipéptido y la secuencia del péptido de señal se sitúa contigua al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.
También puede resultar deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión del polipéptido respecto al crecimiento de la célula huésped. Son ejemplos de secuencias reguladoras aquellas que causan la expresión del gen que debe activarse o desactivarse en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Entre las secuencias reguladoras en sistemas procarióticos se incluyen los sistemas de operadorlac, tacytrp.En levaduras, puede utilizarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, puede utilizarse el promotor glucoamilasa deAspergillus niger,el promotor TAKA alfa-amilasa deAspergillus oryzaey el promotor de glucoamilasa deAspergillus oryzae,el promotor de celobiohidrolasa I deTrichoderma reeseiy el promotor de celobiohidrolasa II deTrichoderma reesei.Son otros ejemplos de secuencias reguladoras aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, entre dichas secuencias reguladoras se incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en la presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido codificante del polipéptido estaría operablemente ligado a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
La presente exposición se refiere, además, a vectores de expresión recombinante que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido codificante del polipéptido en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse mediante la inserción del polinucleótido o un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Durante la generación del vector de expresión, se ubica la secuencia codificante en el vector de manera que la secuencia codificante esté operablemente ligada a las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puedan producir la expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que debe introducirse el vector. El vector puede ser un plásmido circular lineal o cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe en forma de una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualesquiera medios para garantizar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, al ser introducido en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado.
Además, puede utilizarse un único vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que va a introducirse en el genoma de la célula huésped, o un trasposón.
El vector preferentemente contiene uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de las células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona una resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxotrofía, y similares.
Son ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos, los genesdaldeBacillus licheniformisoBacillus subtilis,o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, tales como ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina. Entre los marcadores adecuados para las células huésped de levaduras se incluyen, aunque sin limitación, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Entre los marcadores seleccionables para la utilización en una célula huésped de hongo filamentoso se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, adeA (fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa),adeB(fosforibosil-aminoimidazol sintasa),amdS(acetamidasa),argB(ornitina carbamoíltransferasa),bar(fosfinotricina acetiltransferasa),hph(higromicina fosfotransferasa),niaD(nitrato reductasa),pyrG(orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) ytrpC(antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Resultan preferentes para el uso en una célula deAspergillus,los genesamdSypyrGdeAspergillus nidulansoAspergillus oryzaey el genbardeStreptomyces hygroscopicus.Resultan preferentes para el uso en una célula deTrichoderma,los genesadeA, adeB, amdS, hphypyrG.
El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable dual, tal como se describe en el documento n.°WO 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable dual es un sistema de marcador seleccionable dualhph-tk.
El vector preferentemente contiene uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula de manera independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido codificante del polipéptido o en cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una o más ubicaciones precisas en el cromosoma o cromosomas. Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, y 800 a 10.000 pares de bases, que presentan un grado elevado de identidad de secuencias con la secuencia diana correspondiente a fin de incrementar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga de la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender, además, un origen de replicación que permita al vector replicarse autónomamente en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie en la replicación autónoma que funcione en la célula. La expresión «origen de replicación» o «replicador de plásmido» se refiere a un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
Son ejemplos de orígenes de replicación bacterianos, los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184, que permiten la replicación enE. coli,y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMI31, que permiten la replicación enBacillus.
Son ejemplos de orígenes de replicación para la utilización en una célula huésped de levadura, el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
Son ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso, AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175, documento n .°w O 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos dados a conocer en el documento n.° WO 00/24883.
Puede insertarse más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped con el fin de incrementar la producción de un polipéptido. Puede obtenerse un incremento del número de copias del polinucleótido mediante la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y de esta manera también copias adicionales del polinucleótido, puedan seleccionarse mediante el cultivo de las células en la presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos indicados anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos por el experto en la materia (ver, p. ej., Sambrook et al., 1989,supra).
Células huésped
La presente exposición se refiere, además, a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido tal como se describe en la presente memoria operablemente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de manera que el constructo o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, tal como se ha descrito anteriormente. La expresión «célula huésped» comprende cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran medida dependerá del gen codificante del polipéptido y de su procedencia.
La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, p. ej., un procariota o un eucariota.
La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Entre las bacterias grampositivas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas,Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, StreptococcusyStreptomyces.Entre las bacterias gram-negativas se incluyen, aunque sin limitación,Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, SalmonellayUreaplasma.
La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula deBacillus,incluyendo, aunque sin limitación, células deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilisyBacillus thuringiensis.
La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula deStreptococcus,incluyendo, aunque sin limitación, células deStreptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis,andStreptococcus equisubsp.Zooepidemicus.
La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula deStreptomyces,incluyendo, aunque sin limitación, células deStreptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseusyStreptomyces lividans.
La introducción de ADN en una célula deBacilluspuede llevarse a cabo mediante transformación de protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformación de células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula deE. colicell puede llevarse a cabo mediante transformación de protoplasto (ver, p. ej., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (ver, p. ej., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula deStreptomycespuede llevarse a cabo mediante transformación de protoplasto, electroporación (ver, p. ej., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (ver, p. ej., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583 3585) o transducción (ver, p. ej., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula dePseudomonaspuede llevarse a cabo mediante electroporación (ver, p. ej., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (ver, p. ej., Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula deStreptococcuspuede llevarse a cabo mediante competencia natural (ver, p. ej., Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplasto (ver, p. ej., Catt y Jollick, 1991, Microbios68: 189-207), electroporación (ver, p. ej., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), o conjugación (ver, p. ej., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, puede utilizarse cualquier método conocido de la técnica para la introducción de ADN en una célula huésped.
La célula huésped también puede ser una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, insecto, vegetal o fúngica.
La célula huésped puede ser una célula fúngica. El término «hongos» tal como se utiliza en la presente memoria incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (tal como se definen en Hawksworth et al., en: Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. El término «levadura» tal como se utiliza en la presente memoria incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente al grupo de los hongos imperfectos (Blastomicetos). Debido a que la clasificación de las levaduras podría cambiar en el futuro, para los fines de la presente invención, se definirá levadura tal como se describen en la obraBiology and ActivitiesofYeast(Skinner, Passmore y Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.° 9, 1980).
La célula de levadura puede ser una célula deCandida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces,o Yarrowia, tal como una célula deKluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformisoYarrowia lipolytica.
La célula huésped fúngica puede ser una célula de hongo filamentoso. La expresión «hongos filamentosos» incluye todas las formas filamentosas de las subdivsiones Eumycota y Oomycota (según la definición de Hawksworthet al.,1995,supra).Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared miceliar compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante elongación de hifas y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo de levaduras tales comoSaccharomyces cerevisiaees por gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono es fermentativo.
La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula deAcremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, TrametesoTrichoderma.
Por ejemplo, la célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula deAspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reeseioTrichoderma viride.
Las células fúngicas pueden transformarse mediante un procedimiento que implique la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocidaper se.Se describen procedimientos adecuados para la transformación de las células huésped deAspergillusyTrichodermaen el documento n.° EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 y en Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Se describen métodos adecuados para transformar las especies deFusariumen Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y en el documento n.° WO 96/00787. Las levaduras pueden transformarse utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en: Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163 y en Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción
La presente exposición se refiere, además, a métodos de producción de un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprende: (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones que lleven a la producción del polipéptido, y opcionalmente, (b) recuperar el polipéptido. En un aspecto, la célula es una célula deCurtobacterium.En otro aspecto, la célula es una célula deCurtobacterium oceanosedimentum, Curtobacterium flaccumfaciens, Curtobacterium luteumoCurtobacterium Leaf154.
La presente exposición se refiere, además, a métodos de producción de un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprenden: (a) cultivar una célula huésped recombinante de la presente invención bajo condiciones que lleven a la producción del polipéptido, y opcionalmente, (b) recuperar el polipéptido.
Una realización se refiere a un método para producir el polipéptido seleccionado de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 20, Se C ID n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35, o un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto a las mismas, que comprende cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones que lleven a la producción del polipéptido, p. ej., que comprende además la recuperación del polipéptido.
Una realización se refiere a un método para producir un polipéptido que presenta actividad de hexosaminidasa, que comprende cultivar la célula huésped bajo condiciones que lleven a la producción del polipéptido.
Las células huésped se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, las células pueden cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación, o mediante fermentación a escala pequeña o a gran escala (incluyendo fermentaciones continua, por lotes, alimentada por lotes o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten la expresión y/o aislamiento del polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos de la técnica. Se encuentran disponibles medios adecuados de proveedores comerciales, o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es secretado al medio nutriente, el polipéptido puede recuperarse directamente a partir del medio. En el caso de que el polipéptido no sea secretado, puede recuperarse a partir de lisados celulares.
El polipéptido puede detectarse utilizando métodos conocidos de la técnica que son específicos para los polipéptidos. Entre estos métodos de detección se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la utilización de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
El polipéptido puede recuperarse utilizando métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales, incluyendo, aunque sin limitación, la recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. En un aspecto, se recupera un caldo de fermentación que comprende el polipéptido.
El polipéptido puede purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) con el fin de obtener polipéptidos sustancialmente puros.
En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino que por el contrario se utiliza una célula huésped de la presente invención que expresa el polipéptido como una fuente del polipéptido.
Formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares
La presente exposición se refiere, además, a una formulación de caldo de fermentación o a una composición celular que comprende un polipéptido tal como se da a conocer en la presente memoria. El producto de caldo de fermentación comprende, además, ingredientes adicionales utilizados en el procedimiento de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo, las células huésped que contienen el gen codificante del polipéptido de la presente invención que se utilizan para producir el polipéptido de interés), residuos celulares, biomasa, medio de fermentación y/o productos de fermentación. En algunas realizaciones, la composición es un caldo completo con células muertas, que contiene uno o más ácidos orgánicos, células muertas y/o residuos celulares, y medio de cultivo.
La expresión «caldo de fermentación» tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación producida mediante fermentación celular que se somete a una recuperación y/o purificación mínima o nula. Por ejemplo, se producen caldos de fermentación al cultivar cultivos microbianos hasta la saturación, incubarse bajo condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas (p. ej., la expresión de enzimas por las células huésped) y la secreción al medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener un contenido no fraccionado o fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Normalmente, el caldo de fermentación está no fraccionado y comprende el medio de cultivo agotado y residuos celulares presentes después de la eliminación de las células microbianas (p. ej., las células de hongo filamentoso), p. ej., mediante centrifugación. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo celular agotado, enzimas extracelulares y células microbianas viables y/o no viables.
En una realización, la formulación de caldo de fermentación y las composiciones celulares comprenden un primer componente orgánico que comprende por lo menos un ácido orgánico de 1 a 5 carbonos, y/o una sal del mismo y un segundo componente ácido orgánico que comprende un ácido orgánico de 6 o más carbonos y/o una sal del mismo. En una realización específica, el primer componente ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal de los mismos, o una mezcla de dos o más de los anteriormente indicados, y el segundo componente ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal de los mismos, o una mezcla de dos o más de los anteriormente indicados.
En un aspecto, la composición contiene uno o más ácidos orgánicos, y opcionalmente contiene, además, células muertas y/o residuos celulares. En una realización, las células muertas y/o residuos celulares son eliminados de un caldo completo con células muertas a fin de proporcionar una composición que esté libre de estos componentes.
Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares pueden comprender, además, un conservante y/o agente antimicrobiano (p. ej., bacteriostático), incluyendo, aunque sin limitación, sorbitol, cloruro sódico, sorbato potásico y otros conocidos de la técnica.
El caldo completo con células muertas o composición puede contener el contenido no fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Normalmente, el caldo completo o composición con células muertas contiene el medio de cultivo agotado y residuos celulares presentes después del crecimiento de las células microbianas (p. ej., células de hongo filamentoso) hasta la saturación, incubado bajo condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas. En algunas realizaciones, el caldo completo o composición con células muertas contiene el medio de cultivo agotado, enzimas extracelulares y células fúngicas filamentosas muertas. En algunas realizaciones, las células microbianas presentes en el caldo completo o composición con células muertas puede permeabilizarse y/o lisarse utilizando métodos conocidos de la técnica.
Un caldo completo o composición celular tal como se describe en la presente memoria normalmente es un líquido, aunque puede contener componentes insolubles, tales como células muertas, residuos celulares, componentes del medio de cultivo y/o uno o más enzimas insolubles. En algunas realizaciones, los componentes insolubles pueden eliminarse para proporcionar una composición líquida clarificada.
Las formulaciones de caldo completo y las composiciones celulares de la presente invención pueden producirse mediante un método descrito en el documento n.° WO 90/15861 o en el documento n.° WO 2010/096673.
Debe entenderse que cada limitación numérica superior proporcionada a lo largo de toda la presente especificación incluye una limitación numérica inferior, como si dichas limitaciones numéricas inferiores se hubiesen indicado expresamente en la presente memoria. Cada limitación numérica mínima proporcionada a lo largo de toda la presente especificación incluirá una limitación numérica superior, como si dichas limitaciones numéricas superiores se hubiesen indicado expresamente en la presente memoria. Cada intervalo numérico proporcionado a lo largo de toda la presente especificación incluirá un intervalo numérico más estrecho que se encuentra comprendido dentro de dicho intervalo numérico más amplio, como si dichos intervalos numéricos más estrechos se hubiesen indicado expresamente en la presente memoria.
Ensayos
Ensayos de lavado
Sistema de lavado de modelo Mini Launder-O-Meter (MiniLOM)
MiniLOM es un sistema de minilavado en el que los lavados se llevan a cabo en probetas de 50 ml situadas en un rotador Stuart. Cada tubo simula una pequeña lavadora y durante cada experimento, cada uno contenía una solución de un sistema específico de detergente/enzima para el ensayo junto con tejidos sucios y no sucios en los que se sometía a ensayo. Se aplicó estrés mecánico mediante rotación (normalmente a 20 rpm) y la temperatura se controló mediante la introducción de un rotador en una cámara/sala de calentamiento.
Ensayo de lavado de Terg-O-timeter (TOM)
El Tergo-To-Meter (TOM) es un sistema de lavado modelo de escala intermedia que puede aplicarse para someter a ensayo 12 condiciones de lavado diferentes simultáneamente. TOM es básicamente un baño de agua termostatizado de gran tamaño con hasta 12 vasos metálicos abiertos sumergidos en el mismo. Cada vaso constituye una pequeña lavadora de carga superior, y durante un experimento, cada una de ellas contiene una solución de un sistema específico de detergente/enzima y los tejidos sucios y no sucios en los que se analiza su rendimiento. El estrés mecánico se aplica mediante un brazo de agitación giratoria, que agita el líquido dentro de cada vaso. Debido a que los vasos TOM no disponen de tapa, es posible extraer muestras durante el experimento TOM y analizarlas para obtener información en línea durante el lavado.
El sistema de lavado de modelo TOM se utiliza principalmente en ensayos a escala intermedia de detergentes y enzimas bajo condiciones de lavado de EE. UU. o de Latinoamérica/Asia-Pacífico (LA/AP). En un experimento TOM, pueden modificarse factores como la relación balasto a suciedad y la relación de tejidos a solución de lavado. Por lo tanto, TOM proporciona el vínculo entre los experimentos a pequeña escala, tales como AMSA y minilavado, y los experimentos más intensivos a escala completa en lavadoras de carga superior. Equipos: Baño de agua con 12 vasos de acero y 1 brazo rotatorio por vaso con capacidad para 500 o 1200 ml de solución de detergente. Intervalos de temperatura de 5 °C a 80 °C. El baño de agua debe llenarse con agua desionizada. La velocidad de rotación puede configurarse entre 70 y 120 rpm. Se fija la temperatura en el Terg-O-Tometer y se inicia la rotación en el baño de agua. Espera hasta que la temperatura se ajuste (tolerancia: /-0,5 °C). Todos los vasos deben estar limpios y sin trazas de materiales de ensayo anteriores. La solución de lavado con la cantidad deseada de detergente, temperatura y dureza del agua se prepara en un cubo. Se deja que el detergente se disuelva durante la agitación con imán durante 10 min. La solución de lavado se utilizará en 30 a 60 min después de la preparación. Se añadieron 800 ml de solución de lavado a un vaso TOM. La solución de lavado se somete a agitación a 120 rpm y opcionalmente se añade uno o más enzimas al vaso. Se espolvorean los tejidos en el vaso y después la carga de balasto. La medición del tiempo se inicia tras añadir los tejidos y balasto al vaso. Se lavan los tejidos durante 20 minutos y a continuación se termina la agitación. La carga de lavado seguidamente se transfiere del vaso TOM a un tamiz y se enjuaga con agua corriente fría. Los tejidos sucios se separan de la carga de balasto. Los tejidos sucios se transfieren a un vaso de 5 l con agua corriente fría bajo un flujo de agua durante 5 minutos. La carga de balasto se reserva por separado para la inactivación siguiente. Se escurre suavemente el agua de los tejidos a mano y se colocan sobre una bandeja cubierta de papel. Se coloca otro papel sobre los tejidos. Se deja que los tejidos se sequen durante la noche antes de analizarlos, mediante medición de la intensidad del color utilizando un Color Eye tal como se describe en la presente memoria.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.
Ensayo
Ensayo 1: ensayo de la actividad de hexosaminidasa.
Se determinó la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro con SEC ID n.° 20 utilizando 4-nitrofenil-N-acetilp-D-glucosaminida (Sigma-Aldrich) como sustrato. La reacción enzimática se llevó a cabo por triplicado en una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos (Thermo Scientific) bajo las condiciones siguientes: tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 50 mM, pH 6, 4-nitrofenil N-acetil-p-D-glucosaminida 1,5 mg/ml y 20 |jg/ml de muestra purificada d enzima en un volumen de reacción total de 100 |jl. Se sometieron a ensayo en paralelo muestras de blanco sin enzima. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 °C en un Thermomixer Comfort (Eppendorf). Tras 10 minutos de incubación, se añadieron 5 j l de NaOH 1 M a cada mezcla de reacción para detener la reacción enzimática. La absorbancia se leyó a 405 nm utilizando un lector de placas POLARstar Omega (BMG LABTECH) para estimar la formación de ion 4-nitrofenolato liberado debido a la hidrólisis enzimática del sustrato de 4-nitrofenil-N-acetilp-D-glucosaminida.
Los resultados se resumen en las tablas a continuación: La Tabla 1 muestra la absorbancia media a 405 nm para cada reacción llevada a cabo por triplicado. Se observar que la absorbancia es más alta para la reacción llevada a cabo con SEC ID n.° 20 que con blanco sin enzima, lo que demuestra que SEC ID n.° 20 muestra actividad de hexosaminidasa.
Tabla 1. Actividad de hexosaminidasa de SEC ID n° 20
Ensayo 2: ensayo de la actividad de hexosaminidasa.
Se determinó la actividad de hexosaminidasa del polipéptido maduro con SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 y SEC ID n.° 36 (no según la presente invención) utilizando 4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-glucosaminida (Sigma-Aldrich) como sustrato. La reacción enzimática se llevó a cabo por triplicado en una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos (Thermo Scientific) bajo las condiciones siguientes: tampón de ácido 3-morfolinopropán-1-sulfónico 20 mM, pH 7, 5-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-glucosamiida 5 mM y muestra purificada de enzima 20 nM en un volumen de reacción total de 200 jl. Se sometieron a ensayo en paralelo muestras de blanco sin enzima. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, 20 °C a 25 °C. La cinética de reacción se seguió inmediatamente después de la mezcla del enzima y el sustrato utilizando un lector de placas SpectraMax M2e. La longitud de onda de excitación se fijó en 368 nm y la lectura de la emisión fluorescente se llevó a cabo a 448 nm. Se realizó un seguimiento de la reacción durante 30 min a intervalos de 60 s. Se utilizó el incremento en la señal de fluorescencia para estimar la formación de ion 4-metilumbeliferilo debido a la hidrólisis enzimática del sustrato 4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-glucosaminida. Los resultados se resumen en la tabla a continuación: La tabla muestra la velocidad inicial media de reacción medida como unidades de fluorescencia relativa por minuto (URF/min) utilizando la excitación a 368 nm y la emisión de fluorescencia a 448 nm para cada reacción realizada por triplicado. Se observa que la velocidad de reacción inicial es más alta para la reacción llevada a cabo con SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 y SEC ID n.° 36 (no según la presente invención) en comparación con el blanco sin enzima, lo que demuestra que Se C ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 y SEC ID n.° 36 (no según la presente invención) muestran actividad de hexosaminidasa.
Tabla 2. Actividad de hexosaminidasa de SEC ID n.° 20, SEC ID n.° 33, SEC ID n.° 34, SEC ID n.° 35 y SEC ID n.° 36 (no según la presente invención). A Velocidad inicial de reacción (URF/min) = (Velocidad inicial de reacciónmuestra - Velocidad inicial de reacciónblanco)
Ejemplos
Ejemplo 1
El ADN codificante de la hexosaminidasa Gluco_hidro_20 que presenta el polipéptido comprendido en SEC ID n.° 12, n.° 25, n.° 26 y n.° 27 se aisló a partir de las cepas bacterianasCurtobacterium oceanosedimentum; Curtobacterium flaccumfaciens; Curtobacterium luteum, Curtobacterium oceanosedimentum,respectivamente, aisladas a partir de muestras de suelo ambiental recogidas en EE. UU. y Alemania (ver la Tabla 2). Se aisló ADN cromosómico de las cepas deCurtobacterium spcon el minikit de ADN en sangre QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemania) y se sometió a secuenciación del genoma completo utilizando tecnología de Illumina. Se analizó la secuencia del genoma para secuencias de proteína que presentaban dominios de glucosilhidrolasa. Se identificaron cuatro genes Gluco_hidro_20 y las secuencias correspondientes (SEC ID n.° 16, 29, 30 y 31) en las cepas deCurtobacterium sp.El gen Gluco_hidro_20 y secuencia correspondiente (SEC ID n.° 32) codificante de la hexosaminidasa Gluco_hidro_20 que presenta la secuencia polipeptídica SEC ID n.° 28 se encontraron en la base de datos pública de la cepa donanteCurtobacteriumsp. Leaf154 (cepa DSM102595, origen: Suiza. Se obtuvo el ADN sintético con codones optimizados codificante de la secuencia peptídica madura de las hexosaminidasas Gluco_hidro_20 de la compañía Geneart (SEC ID n.° 20, 33, 34, 35 y 36).
Tabla 3:
Ejemplo 2: clonación y expresión de hexosaminidasas Gluco_hidro_20
Los genes sintéticos con codones optimizados codificantes de las secuencias del péptido maduro de la hexosaminidasa con SEC ID n.° 20, 33, 35 y 36 se insertaron en un vector de expresiónBacillustal como se describe en el documento n.° WO12/025577. Brevemente, se clonó el ADN codificante del péptido maduro del gen de hexosaminidasa Gluco_hidro_20 en el mismo marco que una señal de secreción deBacillus clausii(BcSP; con la secuencia de aminoácidos siguiente: MKKPLGKIVAS<t>A<l>LISVAFSSSIASA (SEC ID n.° 23). Se sustituyó BcSP por la señal de secreción nativa en el gen. Cadena abajo de la secuencia de BcSP, se introdujo una secuencia de etiqueta de afinidad para facilitar el procedimiento de purificación (etiqueta His, con la secuencia de aminoácidos siguiente: HHHHHHPR (SEC ID n.° 24). Por lo tanto, el gen que se expresó comprendía la secuencia de BcSP seguido de la secuencia de la etiqueta de His, seguido de la secuencia de Gluco_hidro_20 de tipo salvaje maduro. El ADN codificante del péptido maduro de la beta-hexosaminidasa Gluco_hidro_20 SEC ID n.° 34 se amplificó a partir del ADN genómico deCurtobacterium luteummediante técnicas de PCR estándares utilizando cebadores específicos que contenían un extremo protuberante complementario al vector de clonación. El gen se clonó consecutivamente en el mismo marco de una señal de secreción deBacillus clausii,tal como se ha descrito anteriormente. El plásmido de expresión final (BcSP-etiqueta His- Gluco_hidro_20) se transformó en el huésped de expresiónBacillus subtilis.El gen de fusión Gluco_hidro_20 BcSP se integró mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped deBacillus subtilistras la transformación. El constructo génico se expresó bajo el control de un sistema de triple promotor (tal como se describe en el documento n.° WO99/43835). Se utilizó el gen codificante de la cloranfenicol acetiltransferasa como marcador (tal como se describe en Diderichsen et al., 1993, Plasmid 30: 312-315). Se seleccionaron los transformantes en medio LB suplementado con 6 microgramos de cloranfenicol por ml. Se selección un clon recombinante deBacillus subtilisque contenía el constructo de expresión de Gluco_hidro-20 y se cultivó en una mesa de agitación giratoria en matraces Erlenmeyer de 500 ml con deflectores, cada uno de los cuales contenía 100 ml de medio basado en extracto de levadura. Tras 3 a 5 días de cultivo a una temperatura entre 30 °C y 37 °C, se recolectó el sobrenadante que contenía el enzima, mediante centrifugación, y se purificaron los enzimas mediante purificación con la etiqueta His.
Ejemplo 3: método de purificación con etiqueta de His.
Se purificó el enzima hexosaminidasa Gluco_hidro_20 etiquetado con His, mediante cromatografía de metal inmovilizado (IMAC, por sus siglas en inglés) utilizando Ni2+ como el ion metálico en columnas HisTrap Excel de 5 ml (GE Healthcare Life Sciences). La purificación tuvo lugar a pH 7 y la proteína ligada se eluyó con imidazol. Se verificó la pureza del enzima purificado mediante SDS-PAGE y se determinó la concentración del enzima a partir de la absorbancia a 280 nm tras intercambio de tampones en HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0.
Ejemplo 4: ensayo de biofilm.
Staphylococcus aureusfue proporcionado por Iñigo Lasa (Valle et al., Mol Microbiol.2003 May; 48 (4):1075-87). La cepa se cultivó en agar tripticasa de soja (TSA, por sus siglas en inglés) a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se transfirió una sola colonia a 15 ml de caldo tripticasa de soja (TSB, por sus siglas en inglés) y se incubó durante 5 horas a 37 °C bajo agitación. El cultivo se diluyó 1:100 en TSB+glucosa al 1 % y se transfirieron 100 |jl de la suspensión bacteriana a cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos (Thermo Scientific, Nunclon Delta Surface, n.° de cat. 167008) y se incubaron durante 24 horas a 37 °C sin agitación. Se aspiró el sobrenadante y los pocillos se lavaron con 100 j l de solución de cloruro sódico al 0,9 % y se llenaron con 100 j l de agua dura o 3,3 g/l de detergente modelo A que contenía 0 (control) o 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 y 0,01 jg/m l de enzima (el polipéptido maduro que presentaba la SEC ID n.° 20, 33, 34, 35 o 36). Tras la incubación a 37 °C durante 1 hora, se lavaron los pocillos con agua y se tiñeron durante 15 min con 100 j l de solución de cristal violeta al 0,095 % (SIGMA V5265). A continuación, los pocillos se enjuagaron dos veces con 100 j l de agua, se secaron y se escanearon las placas. Se determinó la concentración más baja de cada enzima que pudo eliminar la formación visible debiofilmde S.aureustras 1 hora de incubación, en presencia y en ausencia de detergente (ver la Tabla 4). Todos los enzimas se sometieron a ensayo por duplicado con resultados similares.
Tabla 4. Concentración mínima de enzima que puede reducir la formación visible de S.aureustras 1 hora de incubación en agua dura o en detergente modelo A.
Tabla 4
Ejemplo 5. Limpieza profunda de polipéptidos con actividad hexosaminidasa en detergente modelo líquido.
Como microorganismo modelo en el presente ejemplo se utilizóStaphylococcus aureus(obtenido de Iñigo Lasa (Valle et al., Mol Microbiol.2003 May; 48 (4):1075-87). Se sembró nuevamente S.aureussobre agar triptona de soja (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Basingstoke, Reino Unido) y se incubó durante 1 día a 37 °C. Se inoculó una sola colonia en 10 ml de TSB y se incubó el cultivo durante 16 hora a 37 °C bajo agitación (200 rpm). Tras la propagación, el cultivo de S.aureusse diluyó (1:100) en TSB fresco+glucosa al 1 % (24563; Roquette Freres) y se añadieron alícuotas de 2 ml a los pocillos de microplacas de fondo plano de poliestireno de 12 pocillos (3512; Costar, Corning Incorporated, Corning, NY, EE. UU.), en el que se habían introducido trozos de tejido (diámetro: 2 cm) de poliéster estéril (WFK30A prelavado). A los pocillos de control se añadió TSB estéril+glucosa al 1 %. Tras 48 h a 37 °C (incubación estática), los tejido se enjuagaron dos veces con agua dH 150. Se introdujeron cinco trozos de tejido enjuagados (estériles o con S.aureus)en probetas de 50 ml y se añadieron a cada tubo 10 ml de solución de lavado (agua dH 150 con 0,2 g/l de nanopolvos de óxido de hierro (III) (544884, Sigma-Aldrich) con 3,33 g/l de detergente modelo A líquido) y 0,2 ppm de enzima (polipéptido maduro de SEC ID n.° 20). Los lavados sin enzima se incluyeron a modo de controles. Se introdujeron las probetas en un rotador Stuart y se incubaron durante 1 hora a 37 °C a 20 rpm. A continuación, se extrajo la solución de lavado y los trozos de tejido se enjuagaron dos veces con agua dH 150 y se secaron sobre papel de filtro durante la noche.
Se midieron los valores de la diferencia de color (L) utilizando un aparato Minolta CR-300 manual y se muestran en la Tabla 5. También se indican los valores delta (L (tejido lavado con enzima) - L (tejido lavado sin enzima)).
Los resultados muestran que las hexosaminidasas muestran propiedades de limpieza profunda en detergente modelo A.
Tabla 5. Efectos de limpieza profunda de la hexosaminidasa en el detergente modelo A.
Ejemplo 6: efectos de limpieza profunda de hexosaminidasas en detergente modelo líquido sobre trozos de tejido con biofilm.
Se cultivaronbiofilmsdeStaphylococcus aureussobre trozos de tejido (wfk30A) tal como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 5). Los trozos de tejido incubados con medio estéril se incluyeron a modo de controles. Para examinar las propiedades de limpieza profunda de las hexosaminidasas, se introdujeron cinco trozos de tejido enjuagados (estériles o con S.aureus)en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml y se añadieron a cada tubo 10 ml de solución de lavado (agua dH 150 con 0,2 g/l de nanopolvos de óxido de hierro (III) (544884; Sigma-Aldrich) con 3,33 g/l de detergente modelo A) y 2 ppm de enzima. Los lavados sin enzima se incluyeron a modo de controles. Se introdujeron las probetas en un rotador Stuart y se incubaron durante 1 hora a 37 °C a 20 rpm. A continuación, se extrajo la solución de lavado y los trozos de tejido se enjuagaron dos veces con agua dH 150 y se secaron sobre papel de filtro durante la noche. Se midieron los valores de la diferencia de color (L) utilizando un aparato Minolta CR-300 manual y se muestran en la Tabla 6. También se indican los valores delta (L (tejido lavado con enzima) - L (tejido lavado sin enzima)).
Los resultados muestran que las hexosaminidasas también muestran propiedades de limpieza profunda en un líquido detergente modelo A.
Tabla 6. Efectos de limpieza profunda de hexosaminidasas en el detergente modelo A.
En combinación con el ejemplo anterior, los resultados muestran que todos los polipéptidos de la invención presentan propiedades de limpieza profunda, es decir, alteran y/o eliminan los componentes debiofilmdelbiofilmanalizado en comparación con muestras que no comprenden enzima.
Ejemplo 7. Propiedades de limpieza profunda de las hexosaminidasas sobre trozos de tejido ensuciados con SPE de S. aureus.
Se preparó un extracto crudo de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) debiofilmde S.aureus(obtenido de Iñigo Lasa (Valle, J., A. Toledo-Arana, C. Berasain, J. M. Ghigo, B. Amorena, J. R. Penades y I. Lasa. 2003, Mol. Microbiol. 48:1075-1087) del modo siguiente: La cepa se sembró nuevamente sobre agar triptona de soja (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Basingstoke, Reino Unido) y se incubó durante 1 día a 37 °C. A continuación, se inocularon 500 ml de TSB+glucosa al 2 % (24563; Roquette Freres), se dividieron en alícuotas en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (339652; Thermo Scientific Nunc) (33 ml en cada uno) y se incubaron durante 48 horas a 37 °C bajo agitación (200 rpm). Seguidamente las células se peletizaron mediante centrifugación (10 min, 6000xg, 25 °C), se agruparon y se resuspendieron en un total de 4 ml de NaCl 3 M. La suspensión se sometió a agitación con vórtex vigorosamente y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente para extraer las SPE asociadas a la superficie. A continuación, se peletizaron nuevamente las células (10 min, 5000g, 25 °C) y se recuperó el sobrenadante que contenía SPE y se diluyeron a 10 ml con agua MilliQ estéril. El sobrenadante se filtró a esterilidad dos veces (0,45 |jm seguido de 0,2 |jm), se sometió a ensayo para esterilidad y se almacenó a -20 °C hasta el uso posterior. Para los ensayos del rendimiento de lavado, se aplicaron en puntos alícuotas de 50 j l de extracto de SPE sobre trozos de tejido estériles (WFK20A, mezcla de algodón/poliéster) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Los trozos de tejido (estériles o con SPE) se introdujeron en probetas de 50 ml y se añadieron 10 ml de solución de lavado (agua dH 150 con 0,2 g/l de nanopolvos de óxido de hierro (III) (544884; Sigma-Aldrich) con 3,33 g/l de detergente líquido modelo A) y se añadieron a cada tubo 0,2 |jg/ml o 2 |jg/ml de enzima. Los lavados sin enzima se incluyeron a modo de controles. Se introdujeron las probetas en un rotador Stuart y se incubaron durante 1 hora a 37 °C a 20 rpm. A continuación, se extrajo la solución de lavado y los trozos de tejido se enjuagaron dos veces con agua dH 150 y se secaron sobre papel de filtro durante la noche. Se midieron los valores de intensidad de luz triestímulo (Y) utilizando un sistema de medición del color y captación de imágenes DigiEYE (VeriVide) dotado de una cámara digital Nikon D90 y se muestran en la Tabla 7.
También se indican los valores delta (L (tejido lavado con enzima) - L (tejido lavado sin enzima)). Los datos muestran claramente que las hexosaminidasas presentan propiedades de limpieza profunda contra las SPE de S.aureus.
Tabla 7. Efectos de limpieza profunda de las hexosaminidasas sobre trozos de tejido ensuciados con SPE de S.
aureus.
Ejemplo 8: efectos de limpieza profunda de hexosaminidasas en detergente líquido modelo sobre SPE de otros microorganismos.
Se prepararon extractos crudos de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) debiofilma partir dePseudomonas fluorescens(aislado de Islandia) yAcinetobacter iwoffi(aislado textil de Dinamarca). Se sembró nuevamenteP. fluorescenssobre agar triptona de soja (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Basingstoke, Reino Unido) y se incubó durante 1 día a 20 °C. La cepa se inoculó en 10 ml de TBS y se incubó el cultivo estáticamente durante 16 horas a 20 °C. Tras la propagación, se diluyó el cultivo (1:100) en 400 ml de medio suplementado con M63 ((N H ^SO 415 mM, KH2PO4100 mM, FeSO41,8 jM , MgSO4-7 H2O 1 mM, glicerl al 0,4 % (p/v), casaminoácidos al 0,2 % (p/v) y tiamina al 0,0001 % (p/v)), añadidos a matraces de cultivo celular de cuello en ángulo Corning® CellBIND® de 225 cm2 con tapón ventilado (producto n.° 3293) y se incubaron estáticamente durante 3 días a 20 °C. El cultivo debiofilmseguidamente se peletizó mediante centrifugación (10 min, 8000 g, 25 °C) y las células se resuspendieron en 4 ml de NaCl 3 M y se incubaron durante 30 min a 30 °C para extraer las SPE asociadas a la superficie. El sobrenadante que contenía las SPE obtenido mediante centrifugación (10 min, 5000 g, 25 °C) seguidamente se filtró a esterilidad y se almacenó a -20 °C hasta posteriormente.
El extracto de SPE crudo deA. iwoffise preparó el modo siguiente: Se inocularon 10 ml de caldo LB (L3152, Fluka) y el cultivo se incubó durante 2 días a 30 °C. Tras la propagación, el cultivo se diluyó (1:100) en 300 ml de LB fresco en matraces de cultivo celular de cuello en ángulo Corning® CellBIND® de 225 cm2 con tapón ventilado (producto n.° 3293) y se incubaron estáticamente a 30 °C. Tras 3 días, el cultivo se dividió en alícuotas en tubos de centrífuga cónicos y las células se peletizaron mediante centrifugación 810 min, 6000 g, 25 °C). A continuación, se resuspendieron los pellets en un total de 1,5 ml de NaCl 3 M y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. El sobrenadante que contenía las SPE obtenido mediante centrifugación (10 min, 6000 g, 25 °C) se filtró a esterilidad y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
Para los ensayos de rendimiento de lavado, se aplicaron en puntos alícuotas de 50 j l de los diferentes extractos de SPE crudo sobre trozos de textil estériles (WFK20A) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Los trozos de tejido (estériles o con SPE) se introdujeron en probetas de 50 ml y se añadieron 10 ml de solución de lavado (agua dH 150 con 0,2 g/l de nanopolvos de óxido de hierro (III) (544884; Sigma-Aldrich) con 3,33 g/l de detergente líquido modelo A) y se añadieron a cada tubo 0,2 jg/m l o 2 jg/m l de enzima. Se incluyeron trozos de tejido sin enzima a modo de controles. Se introdujeron las probetas en un rotador Stuart y se incubaron durante 1 hora a 37 °C a 20 rpm. A continuación, se extrajo la solución de lavado y los trozos de tejido se enjuagaron dos veces con agua dH 150 y se secaron sobre papel de filtro durante la noche.
Se midieron los valores de intensidad de luz triestímulo (Y) utilizando un sistema de medición del color y captación de imágenes DigiEYE (VeriVide) dotado de una cámara digital Nikon D90 y se muestran en la Tabla 8.
También se indican los valores delta (L (tejido lavado con enzima) - L (tejido lavado sin enzima)).
Tabla 8. Efectos de limpieza profunda de hexosaminidasas en detergente líquido modelo sobre SPE deb io filmdeP .flu o re sce n syA .iw o ff i
Los datos muestran claramente que las hexosaminidasas también muestran propiedades de limpieza profunda contra las SPE de bacterias gram-negativas.
Ejemplo 9. Efectos de limpieza profunda de hexosaminidasas en diferentes detergentes.
Se preparó un extracto crudo de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) debiofilmde S.aureus(obtenido de Iñigo Lasa (Valle, J., A. Toledo-Arana, C. Berasain, J. M. Ghigo, B. Amorena, J. R. Penades y I. Lasa. 2003, Mol. Microbiol. 48:1075-1087) tal como se ha descrito anteriormente, en el Ejemplo 8.
Se introdujeron dos trozos de tejido circulares de 1 cm de diámetro (20A wfk) en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se aplicaron por puntos 50 |jl de SPE de S.aureusdurante 10 min a TA. Se incluyeron trozos de tejidos sin SPE a modo de controles. Se añadió a cada pocillo un objeto de estrés mecánico (barra de metal con cubierta de plástico conectada mediante caucho); 975 j l de solución de detergente (detergente y concentración final: detergente líquido modelo A: 3,33 g/l; detergente líquido modelo N: 2,0 g/l); hexosaminidasa a una concentración final de 5 mg/l, y 1000 j l de detergente sucio a una concentración final de 15 g/l de máscara facial de arcilla rosa adquirido en www.saebevaerkstedet.dk. Se incluyeron como controles trozos de tejido sin PNAG y pocillos sin enzima. La placa se sometió a agitación durante 30 min a TA con intervalos repetidos de 30 s a 1000 y 1200 rpm, respectivamente. Todas las soluciones se diluyeron en agua dH de 15° de dureza. Tras el lavado, los trozos de tejido se enjuagaron dos veces en agua y se secaron sobre papel de filtro durante un mínimo de 2 horas o durante la noche. Los trozos de tejido secos se fijaron sobre una lámina de papel blanco para el escaneo y se midieron los valores de intensidad de color (L) utilizando el software Color Analyzer.
Las Tablas 9 y 10 muestran los datos de lavado para las hexosaminidasas en 2 detergentes diferentes.
Tabla 9: resultados en detergente modelo A
Tabla 10: resultados en detergente modelo N
Ejemplo 10: construcción de clados y árboles filogenéticos
El dominio Gluco_hidro_20 incluye los polipéptidos de la invención que presentan actividad de PNAG y comprende el dominio DSP, así como agregados tales como los clados.
Se construyó un árbol filogenético, de secuencias polipeptídica que contenían un dominio Gluco_hidro_20, tal como se define en PFAM (PF00728, Pfam, versión 31.0 Finn (2016). Nucleic Acids Research, Database Issue 44:D279-D285). Se construyó el árbol filogenético a partir de una alineación múltiple de secuencias de polipéptido maduro que contenían por lo menos un dominio Gluco_hidro_20. Las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo MUSCLE, versión 3.8.31 (Edgar, 2004. Nucleic Acids Research 32(5): 1792-1797), y los árboles se construyeron utilizando FastTree, versión 2.1.8 (Price et al., 2010, PloS one 5(3)) y se visualizaron utilizando iTOL (Letunic y Bork, 2007. Bioinformatics 23(1): 127-128).
Los polipéptidos que contenían un dominio Gluco_hidro_20 comprenden varios motivos; un ejemplo es GXDE (SEC ID n.° 41), sitaudo en las posiciones 277 a 278 enCurtobacterium luteum(SEC ID n.° 34). Los residuos D y E son los residuos catalíticos clave de los enzimas Gluco_hidro_20 (posiciones 277 a 278 en la SEC ID n.° 34).
Tal como ya se ha descrito, los polipéptidos de la invención que presentan actividad de PNAG pueden comprender los dominios estructurales de Gluco_hidro_20.
Los polipéptidos pueden separarse en múltiples subagregados diferentes, o clados; se denotan los clados posteriormente. Los diferentes motivos para cada clado se describen en detalle posteriormente.
Generación de dominio IES
SE identificó un dominio preferentemente compartido por los polipéptidos de la invención. Dicho dominio no ha sido descrito anteriormente. El dominio se denomina IES y los polipéptidos de este dominio comprenden polipéptidos de dominio Gluco_hidro_20 de origen bacteriano y además presentan actividad de PNAG, caracterizado porque comprenden determinados motivos. Los polipéptidos del dominio comprende el motivo de ejemplo [EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN] (SEC ID n.° 46), correspondiente a QNVGIES en las posiciones 156 a 162 de la SEC ID n.° 34.
Generación de ciado ARAY
El clado ARAY comprende polipéptidos de dominio Gluco_hidro_20 de origen bacteriano que presentan actividad de PNAG. Los polipéptidos del clado comprenden el motivo de ejemplo ARAYYPV (SEC ID n.° 42), correspondiente a las posiciones 124 a 130 de la SEC ID n.° 9, donde R en la posición 125 en SEC ID n.° 34 es parte del sitio activo.
Otro motivo que puede estar comprendido en los polipéptidos del clado ARAY es AWNDGID (SEC ID n.° 43), 306 a 312 en la SEC ID n.° 34, donde R (posición 307 en la SEC ID n.° 34) es parte del sitio activo. Un motivo adicional que puede estar comprendido en los polipéptidos del clado ARAY es DDQNVGI (SEC ID n.° 44), correspondiente a los aminoácidos 154 a 160 en SEC ID n.° 34. Un motivo adicional que puede estar comprendido en los polipéptidos del clado ARAY es DPRIH (SEC ID n.° 45), 320 A 324 en la SEC ID n.° 34.
En la figura 1 se muestra una alineación de los polipéptidos de la invención comprendidos en el clado.
En la figura 2 se muestra un árbol filogenético del clado ARAY.
Ejemplo 11: modelo hmm
El modelo oculto de Markov del dominio catalítico GH20
HMMER3/f [3.1b2 | febrero de 2015]
NOMBRE GH20
LONG 349
ALPH amino
RF no
MM no
CONS sí
CS no
MAP sí
FECHA Mar 19 de abril 15:50:132016
NSEQ 7
EFFN 0.721191
CKSUM 975545072
STATS LOCAL MSV -11.4545 0.70012
STATS LOCAL VITERBI -11.99860.70012
STATS LOCAL FORWARD -5.49570.70012
HMM A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y
m->m m->i m->d i->m i->i d->m d->d
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332 2.911825.200682.897052.249034.579073.499043.630253.97818 1.361163.45021 4.28561 2.98825 3.932832.450992.402002.877243.118023.622845.546794.26966362 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
333 2.413934.727142.948642.468053.937363.405283.65291 3.379642.461573.001003.836882.68148 3.825582.317852.891702.460552.85036 3.073345.238632.87824363 q- - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
334 2.611984.754162.76739 1.962034.198433.286463.753073.582682.58481 3.221544.06081 2.95032 3.816282.928533.018522.38680 1.897463.227655.467224.13649 364 t - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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335 2.199744.952892.982222.520364.32341 3.447543.650653.71385 1.590243.266704.104073.00641 3.885702.506562.543602.773092.993883.374045.439054.15062365 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
336 2.639304.904732.648132.15091 4.318242.822133.700143.763032.540553.332954.143272.55980 2.319732.85291 3.017422.37161 2.921383.377465.540144.17172366 e - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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337 3.330024.74841 4.433944.076873.199974.174584.684902.414863.843120.707793.179544.33748 4.585234.174773.993253.766833.618192.49136 5.13215 3.88991 367 l - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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338 3.27661 4.605634.816384.289793.175064.533434.88108 1.607634.11630 1.031862.996954.54933 4.755804.306434.264073.906983.513882.048945.238334.09917368 l - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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339 2.725895.085082.789182.012634.410683.403283.607983.84476 1.968103.358934.157222.89084 3.834032.20531 2.663432.700002.602103.469235.510474.16207369 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.40513 3.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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340 1.553744.43261 3.016202.721554.249693.103643.954673.664882.851253.322804.152892.15851 3.75481 3.165993.248392.204492.812043.212995.554934.26670370 a - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
341 3.017104.364124.670854.121322.291094.272034.60455 1.637274.00480 1.856843.143794.30821 4.56211 4.177664.150363.60918 3.25731 1.483785.056343.82126371 v---2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
342 3.223674.542974.810424.294773.280524.514884.91059 1.22931 4.12691 1.395643.110954.54183 4.761954.350344.288483.894193.46866 1.87895 5.310624.13865372 i - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.026894.025094.747440.619580.772550.485760.95510
343 2.635384.835482.978492.444694.051692.651723.129383.507302.33651 3.092623.911982.95563 3.824852.369902.518282.661862.862623.182845.290633.27945373 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
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344 2.871284.823703.35071 2.806643.948973.612663.747503.24928 1.454002.14061 3.872833.23468 4.01891 2.940932.52181 2.959483.092773.040765.256033.98953374 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.190544.02509 1.860300.619580.772550.485760.95510
345 2.237754.158553.300253.005924.060122.96551 4.071323.352692.999403.138304.027533.22203 3.677523.348733.302532.02036 1.527182.93111 5.443194.20039 375 t - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.031603.866154.588500.619580.772550.631000.75941
346 2.743994.999092.690022.355954.230843.355952.957803.746582.028293.284744.121002.05927 3.824642.762462.626442.730932.980863.40001 5.403304.04864376 k - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.031603.866154.588500.619580.772550.631000.75941
347 2.298674.616392.319442.445683.952732.831673.689362.783742.562242.98071 3.835802.94017 3.775692.877353.012422.609572.815292.966355.278683.96005377 a --
2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.031603.866154.588500.619580.77255 0.63100 0.75941
348 2.643304.956592.262422.043594.279993.256983.63141 3.714592.487033.290154.106322.78289 2.724262.782732.980692.62871 2.521593.347245.502644.11839378 e - - -2.68618 4.422252.775192.731233.463542.405133.724943.293542.67741 2.693554.246902.903472.73739 3.18146 2.89801 2.378872.775192.985184.584773.61503
0.111293.866152.47241 0.619580.772550.631000.75941
349 2.712404.961522.576382.055124.310622.686383.610783.72641 1.896533.28651 4.126462.82370 3.787582.768142.685292.700762.964953.375345.463734.13251 379 k - - -2.68621 4.422292.775232.731273.463572.405163.724223.293572.677442.693584.246932.903502.73743 3.181502.898042.37871 2.775232.985224.584803.61507
0.19020 1.75326 * 0.660050.727380.00000

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    Composición limpiadora que comprende uno o más polipéptidos que presentan actividad de hexosaminidasa,
    en donde el polipéptido comprende uno o más dominios catalíticos Gluco_hidro_20,
    en donde el polipéptido comprende:
    el motivo conservado I [IV]P[ED][LVI]DXP[AN]H (SEC ID n.° 21),
    el motivo conservado II NYN[AS]Y[SY]LY (SEC ID n.° 22) y/o
    el motivo conservado III GXDE (<s>E<c>ID n.° 41) y
    en donde dicha composición:
    (a) es una composición detergente de lavandería sólida, preferentemente granulada, y comprende, además:
    (a1) por lo menos un mejorador zeolita, preferentemente en una cantidad de entre 10 % y 50 % en peso, más preferentemente de entre 20 % y 30 % en peso,
    (a2) por lo menos un mejorador fosfonato, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 5 % en peso, más preferentemente de entre 0,4 % y 1,5 % en peso,
    (a3) por lo menos un enzima adicional, preferentemente una celulasa, preferentemente en una cantidad de enzima activo de entre 100 y 5000 ppb, más preferentemente de entre 1000 y 2000 ppb, y
    (a4) por lo menos un polímero, preferentemente un polímero polivinilpirrolidona, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 1 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 0,3 % en peso, o
    (b) es una composición detergente de lavandería sólida y comprende, además:
    (b1) por lo menos un mejorador silicato, preferentemente en una cantidad de entre 2 % y 20 % en peso, más preferentemente de entre 5 % y 10 % en peso,
    (b2) opcionalmente carboximetilcelulosa, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 10 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 4 % en peso,
    (b3) por lo menos un enzima adicional, preferentemente una celulasa, preferentemente en una cantidad de enzima activo de entre 0,1 y 100 ppm, más preferentemente de entre 0,1 y 10 ppm, (b4) opcionalmente por lo menos un polímero facilitador del desprendimiento de la suciedad en una cantidad de entre 0,1 % y 3 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 1,0 % en peso, y (b5) por lo menos un sistema blanqueador, que comprende un agente de blanqueo, un activador de blanqueo y un catalizador de blanqueo, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 50 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 30 % en peso, o
    (c) es una composición detergente líquida de lavandería y comprende, además:
    (c1) por lo menos un tensioactivo, preferentemente un tensioactivo no iónico, preferentemente en una cantidad de entre 1 % y 20 % en peso, preferentemente de entre 3 % y 15 % en peso, (c2) opcionalmente por lo menos un mejorador fosfonato, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 3 % en peso, más preferentemente de entre 0,25 % y 1,5 % en peso,
    (c3) opcionalmente por lo menos un enzima adicional, preferentemente una celulasa, preferentemente en una cantidad de composición de enzima de entre 0,001 % y 1 % en peso, más preferentemente de entre 0,001 % y 0,6 % en peso, y
    (c4) opcionalmente por lo menos un solvente orgánico, preferentemente glicerol, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 10 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 5 % en peso, o
    (d) es un detergente líquido de lavandería en forma de dosis unitaria, preferentemente una bolsa que comprende una película soluble en agua, y que comprende, además:
    (d1) agua en una cantidad de hasta 20 % en peso, preferentemente de entre 5 % y 15 % en peso, (d2) opcionalmente por lo menos un agente amargante, preferentemente (2,6-xililcarbamoíl)-metilamoniobenzoato de bencildietilo, preferentemente en una cantidad de entre 0,00001 % y 0,04 % en peso,
    (d3) opcionalmente por lo menos un abrillantador óptico, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 2 % en peso, más preferentemente de entre 0,01 % y 1 % en peso, y
    (d4) opcionalmente por lo menos un polímero, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 7 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 5 % en peso, o
    (e) es un agente de acabado textil y comprende, además:
    (e l) por lo menos una silicona ablandadora, preferentemente una silicona funcionalizada con amino, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 10 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 2 % en peso,
    (e2) por lo menos un perfume, preferentemente encapsulado por lo menos parcialmente en microcápsulas, más preferentemente por lo menos parcialmente encapsulado en microcápsulas de melamina-formaldehído, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 3 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 1 % en peso,
    (e3) opcionalmente policuaternio-10 en una cantidad de entre 0,1 % y 20 % en peso, preferentemente de entre 0,1 % y 13 % en peso,
    (e4) opcionalmente policuaternio-37 en una cantidad de entre 0,1 % y 20 % en peso, preferentemente de entre 0,1 % y 13 % en peso,
    (e5) opcionalmente un esterquat de origen vegetal, preferentemente un esterquat de colza o palma, en una cantidad de entre 0,1 % y 20 % en peso, preferentemente de entre 0,1 % y 13 % en peso, y (e6) opcionalmente ácido adípico, en una cantidad de entre 0,1 % y 20 % en peso, preferentemente de entre 0,1 % y 13 % en peso, o
    (f) es un agente limpiador ácido, preferentemente que presenta un pH inferior a 6, y que comprende, además:
    (f1) tensioactivos de origen vegetal o biológicos, cada uno de ellos preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 5 %, más preferentemente cada uno en una cantidad de entre 0,1 % y 2 % en peso, (f2) por lo menos un biocida ácido, preferentemente seleccionado de ácidos, más preferentemente HCl y ácido fórmico, y
    (f3) por lo menos un polímero facilitador del desprendimiento de la suciedad, repelente al agua o de dispersión del agua, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 3 % en peso, más preferentemente de entre 0,01 % y 0,5 % en peso, o
    (g) es un agente limpiador neutro, preferentemente que presenta un pH de entre 6,0 y 7,5, y que comprende, además:
    (g1) tensioactivos de origen vegetal o biológicos, cada uno de ellos preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 5 %, más preferentemente cada uno en una cantidad de entre 0,1 % y 2 % en peso, (g2) por lo menos un biocida, preferentemente seleccionado de compuestos de amonio cuaternario y alcoholes, y
    (g3) por lo menos un polímero facilitador del desprendimiento de la suciedad, repelente al agua o de dispersión del agua, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 3 % en peso, más preferentemente de entre 0,01 % y 0,5 % en peso, o
    (h) es un agente limpiador alcalino, preferentemente que presenta un pH superior a 7,5 y que comprende, además:
    (h1) tensioactivos de origen vegetal o biológicos, preferentemente cada uno en una cantidad de entre 0,1 % y 5 %, más preferentemente cada uno en una cantidad de entre 0,1 % y 2 % en peso, o
    (i) es un agente lavavajillas para lavado a mano, preferentemente un agente lavavajillas para lavado a mano líquido, y que comprende, además:
    (11) por lo menos un tensioactivo aniónico, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 40 % en peso, más preferentemente de entre 5 % y 30 % en peso,
    (12) por lo menos un tensioactivo anfotérico, preferentemente betaína, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 25 % en peso, más preferentemente de entre 1 % y 15 % en peso, (13) por lo menos un tensioactivo no iónico, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 25 % en peso, más preferentemente de entre 2 % y 10 % en peso,
    (14) por lo menos un enzima adicional, preferentemente seleccionado de proteasas, amilasas y combinaciones de las mismas, preferentemente en una cantidad de composición de enzima de hasta 1 % en peso, más preferentemente de hasta 0,6 % en peso, o
    (j) es una composición lavavajillas para lavado automático y que comprende, además:
    (j1) por lo menos un mejorador seleccionado de citrato, aminocarboxilatos y combinaciones de los mismos, preferentemente en una cantidad de entre 5 % y 30 % en peso, más preferentemente de entre 10 % y 20 % en peso,
    (j2) por lo menos un mejorador fosfonato, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 5 % en peso, más preferentemente de entre 0,4 % y 1,5 % en peso,
    (j3) por lo menos un tensioactivo no iónico, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 10 % en peso, más preferentemente de entre 1 % y 5 % en peso,
    (j4) por lo menos un sistema blanqueador, que comprende un agente de blanqueo, un activador de blanqueo y un catalizador de blanqueo, preferentemente en una cantidad de entre 0,1 % y 50 % en peso, más preferentemente de entre 0,1 % y 30 % en peso,
    (j5) por lo menos un polímero seleccionado de sulfopolímeros, polímeros catiónicos y poliacrilatos, preferentemente en una cantidad de entre 0,01 % y 15 % en peso, más preferentemente de entre 2 % y 10 % en peso, o
    (k) comprende, además:
    (k1) por lo menos un sulfopolímero, preferentemente en una cantidad de entre 1 % y 15 %, más preferentemente de entre 2 % y 10 % en peso, y es preferentemente una composición lavavajillas, preferentemente una composición lavavajillas para el lavado automático, o
    (l) comprende, además:
    (l1) por lo menos un ingrediente auxiliar seleccionado de probióticos, preferentemente microorganismos, esporas o combinaciones de los mismos, o
    (m) se encuentra en forma de dosis unitaria, preferentemente una bolsa, y comprende por lo menos 2, preferentemente 2, 3, 4 o 5 compartimientos separados,
    en donde el polipéptido presenta una identidad de secuencias de por lo menos 93 %, de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 %, de por lo menos 99 % o 100 % respecto al polipéptido maduro de SEC ID n.° 20, SEC iD n.° 33, SEC ID n.° 34 o SEC ID n.° 35.
  2. 2. Composición según la reivindicación 1, en donde el polipéptido presenta actividad de N-acetilglucosaminidasa y/o actividad de p-N-acetilglucosaminidasa.
  3. 3. Composición según la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido comprende uno o más de los motivos:
    ARAYYPV (SEC ID n.° 42),
    AWNDGID (SEC ID n.° 43),
    DDQNVGI (SEC ID n.° 44) o
    DPRIH (SEC ID n.° 45).
  4. 4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición se selecciona de las composiciones (a), (b), (d), (k), (l) y (m) y que comprende, además, hasta 50 % en peso, entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 40 % en peso, entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 30 % en peso, entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 20 % en peso, o entre aproximadamente 5 % en peso y aproximadamente 10 % en peso de por lo menos un tensioactivo, en donde el tensioactivo es preferentemente aniónico y/o no iónico.
  5. 5. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la limpieza profunda de un elemento, en donde el elemento es un textil.
  6. 6. Método para la limpieza, preferentemente la lavandería, de un elemento, que comprende las etapas de:
    a. exponer el elemento a una solución de lavado que comprende una composición limpiadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
    b. opcionalmente completar por lo menos un ciclo de lavado, y
    c. opcionalmente enjuagar el elemento,
    en donde el elemento es un textil o una superficie dura.
  7. 7. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
    (i) para la limpieza o acondicionamiento del elemento,
    (ii) para la prevención, reducción o eliminación de la pegajosidad del elemento,
    (iii) para el pretratamiento de manchas sobre el elemento,
    (iv) para la prevención, reducción o eliminación de la redeposición de suciedad durante un ciclo de lavado, (v) para la prevención, reducción o eliminación de la adherencia de la suciedad al elemento, (vi) para el mantenimiento o la mejora de la blancura del elemento, o
    (vii) para la prevención, reducción o eliminación de los malos olores del elemento, en donde el elemento es un textil.
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