ES2897579T3

ES2897579T3 - Métodos y composiciones para reducir la inmunosupresión por células tumorales

Info

Publication number: ES2897579T3
Application number: ES14735794T
Authority: ES
Inventors: Kai W Wucherpfennig; Glenn Dranoff; Penghui Zhou; Donald Shaffer; Nir Hacohen; Harvey I Cantor; Arias Diana Alvarez
Original assignee: General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2013-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2034-06-10
Also published as: EP3008173B1; EP3892293A1; JP2021040648A; KR20230005422A; WO2014201021A2; KR20160018525A; JP2019176868A; JP6546160B2; BR112015030822A2; MX2015016963A; CA2912389C; US10876120B2; CA2912389A1; KR20210115051A; JP2016526883A; US20230383298A1; US20160122766A1; US20180327750A1; US11597934B2; CA3051222A1

Abstract

Un linfocito T que tiene especificidad tumoral que comprende un vector, comprendiendo el vector una secuencia que codifica un ARNhc, en donde el ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para reducir la inmunosupresión por células tumorales

La presente invención se ha realizado con el respaldo del Gobierno en virtud de las Subvenciones N.° 1R01CA173750-01 y T32 AI07386, concedidas por los Institutos Nacionales de Salud, y la Subvención N.° P30-CA14051 del Instituto Nacional del Cáncer. El Gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a composiciones terapéuticas que modulan dianas inmunoterápicas (por ejemplo, ARNhc, linfocitos T que expresan ARNhc y, en algunos casos, un receptor dirigido a una célula cancerosa, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR)), y métodos de uso relacionados.

ANTECEDENTES

Los linfocitos T citotóxicos desempeñan una función central en el control inmunitario de los cánceres1-3, y los anticuerpos monoclonales que se dirigen a receptores inhibidores en linfocitos T pueden inducir un beneficio clínico significativo en pacientes con enfermedad avanzada4-6. Para sobrevivir, los tumores han desarrollado numerosos mecanismos inmunosupresores para promover su propio crecimiento y evadir con éxito el sistema inmunitario del hospedador, bloqueando eficazmente la actividad de los linfocitos T en el microambiente tumoral. Se trata de un problema fundamental en oncología porque una infiltración fuerte de linfocitos T CD8, que tienen una función citotóxica contra las células tumorales, se asocia a un pronóstico favorable en múltiples tipos de cáncer humano138. Este mecanismo de defensa natural se ve gravemente debilitado en la mayoría de los pacientes por múltiples señales inhibidoras procedentes del tumor, su estroma, los linfocitos T reguladores y las poblaciones de células mieloides.9-11 Se han identificado diversos mecanismos inmunosupresores moleculares y celulares responsables de la evasión tumoral. Algunos de estos mecanismos se dirigen a las células efectoras antitumorales inmunitarias. Sin embargo, muchos de los mecanismos reguladores que dan como resultado la pérdida de función de los linfocitos T en los tumores inmunosupresores siguen siendo desconocidos. La mejora del éxito limitado de la inmunoterapia contra el cáncer requiere nuevos enfoques para inhibir las vías inmunosupresoras iniciadas por las células tumorales para evadir el sistema inmunitario del hospedador.

Hinterleitner et al. (Plos One, vol. 7, n.° 9, 2012, página e44295) describieron la transferencia adoptiva de linfocitos T CD8+ silenciados en Cblb de ARNip. La eficacia de la vacuna antitumoral aumentó en un modelo de melanoma B16; la inmunidad antitumoral se potenció. Riese et al. (Cancer Research, vol. 73, n.° 12, 2013 páginas 3566-3577) describieron linfocitos T CD8 deficientes en diacilglicerol cinasa alfa y/o zeta con actividad antitumoral aumentada e infiltración tumoral potenciada.

SUMARIO

La presente divulgación describe dianas para inhibir vías inmunosupresoras utilizadas por las células tumorales para inactivar y/o suprimir células inmunitarias.

La divulgación también describe composiciones y métodos relacionados con ARNhc con potencial terapéutico.

La divulgación también describe la inclusión de linfocitos T (por ejemplo, células dirigidas a un antígeno tumoral) que expresan al menos un ARNhc capaz de silenciar genes que inhiben la función de los linfocitos T.

En el presente documento se describen linfocitos T, que albergan al menos un vector que expresa un ARNhc y al menos un receptor de antígeno quimérico dirigido a un antígeno tumoral.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona linfocitos T que tienen especificidad tumoral que comprenden un vector que codifica un ARNhc que comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604. En algunos aspectos, la secuencia de ARNhc reduce la expresión de Ppp2r2d. En algunos aspectos, el linfocito T expresa además un receptor de linfocitos T específico de tumor. En algunos aspectos, el linfocito T se selecciona del grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), un linfocito T citolítico natural (NKT), un linfocito T citotóxico ^{( c T l )}y un linfocito T CD4.

En algunas realizaciones, el linfocito T comprende además un vector que codifica un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio estimulador. En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral o un antígeno patógeno. Los antígenos tumorales de ejemplo incluyen, por ejemplo, el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), el Antígeno Carcinoembrionario (CEA), ^{c D 1 9 ,}CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c-Met, Glicolípido F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4.2, CAN, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPYL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL-BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT-SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68 y cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, Fab o un scFv). Los dominios intracelulares de dichos CAR contienen dominios de señalización citoplasmáticos derivados del receptor de linfocitos T y de moléculas coestimuladoras.

En algunas realizaciones, el vector es un plásmido, un vector retrovírico o un vector lentivírico.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un CAR y una secuencia de ARNhc en donde el ácido nucleico aislado codifica un ARNhc que comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604 y en donde en el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio estimulador y un dominio coestimulador. En algunos aspectos, el ácido nucleico aislado codifica una secuencia de ARNhc que reduce la expresión de Ppp2r2d. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito T humano que alberga la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, Fab o un scFv). En algunas realizaciones, el dominio de unión al antígeno es un dominio de señalización citoplasmático derivado del receptor de linfocitos T y de moléculas coestimuladoras.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral (por ejemplo, un antígeno tumoral asociado a un tumor sólido, un tumor linfoide, melanoma, carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, cáncer de riñón, de mama, de pulmón, de vejiga, de colon, de ovario, de próstata, de páncreas, de estómago, de cerebro, de cabeza y cuello, de piel, de útero, de testículo, glioma, de esófago y de hígado).

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención, que codifica un CAR y una secuencia de ARNhc. En algunos aspectos, el vector es un plásmido, un vector lentivírico, un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado. El ARNhc puede estar unido operativamente al promotor de la ARN polimerasa II o a un promotor de la ARN polimerasa III.

En otras realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden linfocitos T de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona linfocitos T transfectados con un primer vector que codifica un CAR y un segundo vector que codifica una secuencia de ARNhc. La secuencia de ARNhc reduce la expresión de Ppp2r2d. El ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 604. En algunos aspectos, el linfocito T comprende además un vector que codifica un receptor de linfocitos T específico de tumor. En algunos aspectos, el linfocito T se selecciona del grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), un linfocito T citolítico natural (NKT), un linfocito T citotóxico (CTL) y un linfocito T CD4.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un linfocito T autólogo modificado para expresar un receptor de linfocitos T específico de tumor o CAR y un ARNhc, en donde la secuencia de ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 604; y en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio estimulador y un dominio coestimulador, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

En el presente documento se describen métodos para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un linfocito T autólogo modificado para expresar un receptor de linfocitos T específico de tumor o CAR y un ARNhc. En el presente documento también se describen métodos para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita silenciando genes que inhiben la función de los linfocitos T, que comprenden administrar al sujeto una célula inmunosensible que comprende un vector, codificando el vector un receptor de linfocitos T específico de tumor o un CAR y un ARNhc.

En el presente documento se describen métodos para identificar un gen que inhibe la función de un linfocito T inmunosensible, comprendiendo el método proporcionar una población de linfocitos T inmunosensibles que albergan vectores que expresan un ARNhc, poner en contacto la población de linfocitos T inmunosensibles con un tumor inmunosupresor, determinar si un ARNhc restablece la función de los linfocitos T dentro del tumor inmunosupresor, e identificar un gen asociado a un ARNhc que restablece la función de los linfocitos T dentro del tumor como un gen que inhibe la función de linfocitos T infiltrantes de tumores.

En el presente documento se describen métodos para aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un agente terapéutico que modula la actividad de un gen seleccionado del grupo que consiste en Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stk17b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc.

En una realización, se proporciona un linfocito T que comprende un vector para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, codificando el vector un receptor de linfocitos T específico de tumor y una secuencia de ARNhc o un CAR y una secuencia de ARNhc, en donde la secuencia de ARNhc comprende una secuencia con al menos 15 nucleótidos contiguos complementarios a la secuencia de ARNm codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604.

En otra realización, se proporciona un método para preparar un linfocito T que tiene especificidad tumoral y resistencia aumentada a la inmunosupresión, que comprende: proporcionar un linfocito T que tiene especificidad tumoral; e introducir en la célula un vector que comprende una secuencia que codifica ARNhc, en donde el ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604.

En algunos casos, la secuencia que codifica un ARNhc comprende una primera secuencia que comprende 15-25 (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) nucleótidos complementarios a Se Q ID NO: 604 y una segunda secuencia que es el complemento inverso de la primera secuencia con uno o ningún desapareamiento (es decir, es perfectamente complementaria a la primera secuencia) y una tercera secuencia de 5-9 nucleótidos situada entre la primera y segunda secuencias.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un diagrama esquemático que demuestra un enfoque de ejemplo para el descubrimiento in vivo de ARNhc que potencian la infiltración y acumulación de linfocitos T dentro del microambiente tumoral.

La FIG. 2 es un conjunto de gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo de linfocitos T CD8+ de ratones transgénicos TCR Rag1-/-/OT-I después de la infección con un vector de ARNhc. La eficiencia de la transducción se determinó basándose en la expresión del indicador Thy1.1 codificado por el vector lentivírico. Los linfocitos T cultivados con citocinas que expresan el ARNhc de control de LacZ después se tiñeron con un panel de marcadores de activación (líneas de color negro; control de isotipo, sombreado). La mayoría de los linfocitos T infectados presentaban un fenotipo de memoria central (CD62L+CD44+).

La FIG. 3 es un conjunto de gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo de linfocitos T OT-I clasificados a partir de tumores y órganos linfoides secundarios para el análisis de secuenciación profunda (GLd, ganglio linfático drenante de tumores; GLir, ganglio linfático irrelevante). Se clasificaron células CD8+Va2+Vp5+Thy1.1+ y se extrajo ADN genómico para la amplificación por PCR del casete de ARNhc.

La FIG. 4 es un conjunto de gráficos que muestran datos de secuenciación profunda del cribado de agrupamientos de ARNhc in vivo. Fila superior, lecturas de secuencias para todos los genes en un agrupamiento en tumor, ganglio linfático irrelevante (GLir) y ganglio linfático drenante (GLd); fila inferior, se representan tres genes individuales (LacZ, control negativo) en comparación con el bazo para tumores, ganglios linfáticos irrelevantes (GLir) y ganglios linfáticos drenantes de tumores (GLd). Se representan lecturas de secuencias para estos tejidos frente al bazo. Las líneas discontinuas indican una desviación de log2 con respecto a la diagonal.

La FIG. 5 es un conjunto de gráficos que muestran datos de secuenciación profunda del cribado de disfunción de linfocitos T. Se representan lecturas de secuenciación de ARNhc para genes positivos en el cribado secundario en comparación con el bazo para tumores (rojo), ganglios linfáticos irrelevantes (GLir, azul) y ganglios linfáticos drenantes de tumores (GLd, verde), con líneas discontinuas que indican una desviación de log2 con respecto desde la diagonal. Los datos muestran el enriquecimiento de ARNhc particulares que representan estos genes en los tumores en comparación con los bazos o los ganglios linfáticos.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra la cuantificación basada en citometría de flujo del enriquecimiento de linfocitos T OT-I CD8+ en los tumores con respecto al bazo. El porcentaje de linfocitos T OT-I que expresan ARNhc se determinó por citometría de flujo en los tumores/bazos por regionalización sobre proteínas indicadoras en linfocitos T CD8+Va2+Vp5+. Se determinó la significación estadística para cada ARNhc experimental frente a ARNhc de LacZ (factor de enriquecimiento tumor/bazo) (n=3; * p<0,05, ** p<0,01, ensayo t de Student).

La FIG. 7 es un conjunto de gráficos que muestran gráficos de citometría de flujo representativos de enriquecimiento celular en el tumor transducido con vectores de ARNhc (LacZ, Akap8I, Smad2, Rbks, Dgkz). El porcentaje de linfocitos T OT-I que expresan ARNhc se determinó por citometría de flujo en los tumores/bazos por regionalización sobre proteínas indicadoras en linfocitos T CD8+Va2+Vp5+.

La FIG. 8 es un conjunto de gráficos que muestran cuantificación basada en la citometría de flujo de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ en los tumores. Se identificaron linfocitos T que expresaban ARNhc en los tumores y bazos usando indicador Thy1.1 (% de linfocitos T CD8 Thy1.1+ o linfocitos T CD4+, paneles superior e inferior). El número total de linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d se determinó en los tumores y bazos 7 días después de la transferencia de 2x106 células que expresaban ARNhc (paneles de la derecha). Se indica el factor de enriquecimiento de linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d frente a LacZ en los tumores.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra la inversión de la expansión de linfocitos T mediada por ARNhc de Ppp2r2d en los tumores por ADNc de Ppp2r2d con un sitio de unión de ARNhc mutado pero con una secuencia de proteína conservada. Las tres poblaciones celulares se identificaron basándose en indicadores coexpresados; se calculó el factor de enriquecimiento basándose en el porcentaje de células positivas para indicador en los tumores frente a bazos.

La FIG. 10a describe la generación de ADNc de Ppp2r2d mutante con la secuencia de proteína conservada pero con el sitio de unión a ARNhc alterado. Se transdujeron células EL4 con ADNc de Ppp2r2d mutante o de tipo silvestre en un vector que también contenía GFP. Se clasificaron células positivas para GFP hasta su pureza y se transdujeron con vectores de ARNhc de LacZ o Ppp2r2d que expresaban un indicador Thy1.1. Se analizaron células (Thy1.1+) transducidas por ARNhc mediante citometría de flujo para la expresión de GFP. El ARNhc de Ppp2r2d redujo los niveles de GFP cuando se expresaba Ppp2r2d de tipo silvestre, pero no cuando se expresaba Ppp2r2d mutante.

La FIG. 10b demuestra que la expresión de ADNc mutante de Ppp2r2d evita el fenotipo inducido por ARNhc de Ppp2r2d. Se transdujeron linfocitos T OT-I con un vector que codificaba ARNhc de LacZ, ARNhc de Ppp2r2d o ARNhc de Ppp2r2d más ADNc de Ppp2r2d mutante. Las diferentes poblaciones celulares se normalizaron para la eficiencia de la transducción y se coinyectaron en ratones portadores de tumor B16-Ova. El porcentaje de cada población de linfocitos T en los tumores y bazos se cuantificó por regionalización en linfocitos T CD8+Va2+Vp5+; las células transducidas se detectaron basándose en la expresión de indicadores fluorescentes Thy1.1 o Ametrina/GFP (datos representativos de 2 experimentos independientes, n=3 ratones por experimento).

La FIG. 10c es un gráfico que demuestra el análisis por PCR en tiempo real para la expresión de Ppp2r2d en linfocitos T OT-I transducidos con ARNhc de LacZ, ARNhc de Ppp2r2d y ARNhc de Ppp2r2d más ADNc mutante de Ppp2r2d. Los datos representan duplicados biológicos (n=3), cada valor representa la media /- d.t.

La FIG. 11 es un gráfico que demuestra el análisis por qPCR en tiempo real para los niveles de ARNm de Ppp2r2d en linfocitos T OT-I transducidos con ARNhc de LacZ o uno de los tres ARNhc de Ppp2r2d identificados en el cribado.

La FIG. 12a es una tabla que demuestra el enriquecimiento de ARNhc particulares en tumor frente a bazo que se calculó basándose en los resultados de secuenciación profunda del cribado secundario.

La FIG. 12b demuestra la agrupación de niveles de expresión medios para los ARNm que se encuentran significativamente regulados por linfocitos T en los tumores que expresaban el ARNhc de control de LacZ o uno de los cinco ARNhc experimentales. Las diferencias de expresión significativas se definieron como un valor p de Anova <0,01 entre linfocitos T que expresaban ARNhc de control de LacZ o uno de los cinco ARNhc experimentales (Alk, Arhgap5, Egr2, Ptpn2 o Ppp2r2d) (JMP-Genomics 6.0, SAS Institute Inc.). Se muestran ARNm significativamente regulados en uno o más grupos de tratamiento después de la agrupación (Fast Ward).

La FIG. 12c es un diagrama de Venn que muestra solapamientos entre distintivos de expresión de linfocitos T infiltrantes de tumores transducidos con uno de los cinco ARNhc experimentales (los distintivos se definen como un Anova p<0,01 como se ha descrito anteriormente). Se indican los números de ID de sonda solapadas para cualquier combinación de los 5 distintivos, como se indica por los óvalos solapados. Se muestra la significación de los solapamientos frente a los esperados por azar aleatorio (Ensayo Exacta de Fisher) en la tabla adjunta.

La FIG. 13a es un conjunto de gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo para demostrar la frecuencia de linfocitos T CD8 transducidos por ARNhc de Ppp2r2d o LacZ en los tumores el día 1.

La FIG. 13b es un par de gráficos que demuestran el grado de proliferación (basado en la dilución CFSE) de linfocitos T CD8 transducidos por Ppp2r2d en comparación con linfocitos T transducidos por ARNhc de LacZ en los tumores los días 1, 3, 5 y 7.

La FIG. 13c es un conjunto de gráficos que demuestran que el silenciamiento de Ppp2r2d inhibe la apoptosis de linfocitos T tras encontrarse con células tumorales. Se cocultivaron linfocitos T OT-I marcados con CFSE con células tumorales B16-Ova durante 72 horas. Las células se tiñeron con CD8 y anexina V.

La FIG. 13d es un conjunto de gráficos que demuestran la tinción intracelular para proteínas antiapoptóticas. Se cocultivaron linfocitos T OT-I que expresan ARNhc de LacZ o Ppp2r2d con células tumorales B16-Ova durante 48 horas y después se tiñeron con control de isotipo (gris) y anticuerpos contra fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Bad (Ser 112) o Bcl-2.

La FIG. 13e es un gráfico que demuestra la secreción de IFN-y aumentada por linfocitos T silenciados en Ppp2r2d. Se sometieron a ensayo linfocitos T OT-I aislados de ratones portadores de tumores B16-Ova para la expresión de IFN-y por tinción intracelular.

La FIG. 13f es un conjunto de gráficos que demuestran que linfocitos T silenciados en Ppp2r2d se expanden en los tumores incluso sin la presentación de antígenos tumorales por las células presentadoras de antígenos profesionales. Se transfirieron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d a ratones C57BL/6 o b2m-l- portadores de tumor B16-Ova del día 14. Se identificaron linfocitos T que expresaban ARNhc basándose en la expresión de proteína fluorescente turquesa (TFP) o Thy1.1 (factor de enriquecimiento en los tumores en comparación con bazos).

La FIG. 13g es un gráfico que demuestra que el silenciamiento de Ppp2r2d inhibe la apoptosis de linfocitos T tras encontrarse con células tumorales. Se cocultivaron linfocitos T OT-I marcados con CFSE con células tumorales B16-Ova durante 72 horas (caspasa-3 activada).

La FIG. 14 es un conjunto de gráficos que demuestran linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d marcados con CFSE y estimulados con anticuerpo contra CD3 durante 72 h. Después, las células se tiñeron con CD8 y anexina V y se analizaron por citometría de flujo.

La FIG. 15 es un conjunto de gráficos que demuestran la acumulación de linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d en los tumores y ganglios linfáticos drenantes de tumores, pero no en otros órganos linfoides secundarios. Se marcaron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ con CFSE y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova. Se aislaron linfocitos T de los órganos indicados los días 1, 3, 5 y 7 para examinar el grado de acumulación de linfocitos T basándose en la dilución del colorante CSFE.

Las FIG. 16a-c son un conjunto de gráficos que demuestran que el silenciamiento de Ppp2r2d potencia la actividad antitumoral de linfocitos T CD4 y CD8. Se activaron linfocitos T con perlas anti-CD3/CD28, se infectaron con lentivirus que impulsaban la expresión de ARNhc de LacZ o Ppp2r2d y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova (a,b) o B16 (c). Se midió el tamaño tumoral cada tres días después de la transferencia de linfocitos T usando calibres en los dos ejes más largos. a,b Se transfirieron linfocitos T TRP-1 CD4+ y/u OT-I CD8+ (2 x 106) (día 12 y 17) a ratones portadores de tumores B16-Ova del día 12. Se evaluó la carga tumoral (a) y la supervivencia (b). c, Se transfirieron linfocitos T TRP-1 CD4+ y pmel-1 CD8+ (3x106 TRP-1 CD4+ más 3x106 pmel-1 CD8+) (día 10 y 15) a ratones con tumores B16 del día 10. Se realizó un ensayo del intervalo logarítmico (Mantel-Cox) usando GraphPad Prism versión 6 para comparar la supervivencia de ratones tratados con linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ frente a Ppp2r2d.

La FIG. 17 es un conjunto de gráficos que demuestran el análisis por FACS del enriquecimiento de linfocitos T en los tumores en comparación con bazo para células que expresaban un panel de ARNhc de Ppp2r2d o Cblb (paneles superiores). Se midieron los niveles de ARNm de Ppp2r2d y Cblb por qPCR antes de la transferencia de linfocitos T (paneles inferiores). Los datos representan duplicados biológicos (n=3), cada valor representa la media /- d.t.

La FIG. 18 es un conjunto de gráficos que demuestran la cuantificación de proteína Ppp2r2d por espectrometría de masas con péptidos sintéticos marcados (AQUA, relación de péptidos endógenos con respecto a péptidos AQUA). Datos representativos de dos experimentos independientes (a-d); ensayo t de Student de dos vías, * P<0,05, ** P<0,01; media /- d.t.

La FIG. 19 es un gráfico que demuestra el análisis por qPCR para ARNm de Ppp2r2d en linfocitos T OT-I infiltrantes de tumores (día 7).

La FIG. 20a son gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran la proliferación de linfocitos T que expresan ARNhc de Ppp2r2d en los tumores y ganglios linfáticos drenantes de tumores. Se marcaron linfocitos T OTI que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ con CFSE y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova. Se aislaron linfocitos T de los órganos indicados los días 1, 3, 5 y 7 para examinar el grado de proliferación de linfocitos T basándose en la dilución de CFSE. Se cuantificaron linfocitos T que no habían diluido CFSE (células no en división) (derecha).

La FIG. 20b son gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran la viabilidad de linfocitos T infiltrantes de tumores. Se inyectaron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de Pp2r2d o LacZ en ratones portadores de tumores B16-Ova. Se aislaron linfocitos T el día 7 y se evaluó la apoptosis por tinción intracelular con un anticuerpo específico para caspasa-3 activada (es posible que la muerte de algunos linfocitos T se deba al procedimiento de aislamiento de tumores).

La FIG. 20c son gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran la tinción de citocinas intracelulares para IFNy por linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ y Ppp2r2d cosechados de tumores B16-Ova; se marcaron linfocitos T con CFSE antes de la inyección. Los datos de todos los experimentos son representativos de dos pruebas independientes. El análisis estadístico se realizó en duplicados biológicos (n=3); * P<0,05, ** P<0,01, ensayo t de Student de dos vías. Cada valor representa la media /- d.t.

Las FIG. 21a-c son una serie de gráficos que demuestran el análisis ex vivo de la producción de citocinas por linfocitos T OT-I infiltrantes de tumores a nivel de célula individual usando un dispositivo de nanopocillos (84.672 pocillos de volumen de picolitros). a, Células individuales representativas en nanopocillos y patrones correspondientes de secreción de citocinas. b, Porcentaje de linfocitos T que secretan las citocinas indicadas. c, Tasas de secreción de citocinas calculadas a partir de curvas patrón (media /- d.t., Ensayo de Mann Whitney * P<0,05).

La FIG. 22a es un conjunto de gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran que la mayoría de las células OT-I transferidas adoptivamente tienen un fenotipo de memoria en ganglios linfáticos pero un fenotipo efector en los tumores. Se inyectaron células pretratadas con citocinas que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. El día 7 después de la transferencia, se recogieron linfocitos T de los órganos indicados y se tiñeron con anticuerpos contra CD62L y CD44. El análisis por FACS de células OT-I que expresaban ARNhc se realizaron por regionalización en células doblemente positivas para CD8/Thy1.1.

La FIG. 22b es un conjunto de gráficos que muestran gráficos representativos de citometría de flujo que demuestran el análisis de marcadores de agotamiento. Se recogieron células OT-I de ganglios linfáticos drenantes y tumores de ratones y se tiñeron con anticuerpos específicos para TIM-3, LAG-3, PD-1 y CD25. Para todos los experimentos (n=3 duplicados biológicos; * P<0,05, ** P<0,01, ensayo t de Student de dos vías); cada valor representa la media /- d.t.

La FIG. 23a es un conjunto de gráficos que demuestran la tinción intracelular para granzima B por linfocitos T OT-I en ganglios linfáticos drenantes de tumores y tumores.

La FIG. 23b es un par de imágenes y un gráfico que demuestran la infiltración de linfocitos T que expresaban ARNhc en los tumores. Se transdujeron linfocitos T OT-I con vectores de ARNhc de LacZ o Ppp2r2d que codificaban un indicador GFP y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova. Después de 7 días, se extirparon tumores y se tiñeron secciones congeladas con anti-GFP y DAPI para enumerar linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc en los tumores.

La FIG. 23c es un par de imágenes y un gráfico que demuestran la inmunohistoquímica TUNEL realizada en secciones de tejido y se cuantificaron las células apoptóticas.

La FIG. 23d es un conjunto de gráficos que demuestran la expresión del MHC de clase I por células tumorales. Los tumores se digirieron con colagenasa y se tiñeron con anticuerpos contra CD45.2 y H-2Kb. Se realizó un análisis por FACS para la expresión de H-2Kb por regionalización de células de melanoma negativas para CD45.2. Los datos representan duplicados biológicos (n=3), cada valor representa la media /- d.t.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente divulgación se basa, en parte, en la observación de que los mecanismos reguladores que dan como resultado la pérdida de función de los linfocitos T dentro de tumores inmunosupresores pueden descubrirse sistemáticamente in vivo usando un enfoque de cribado de ARN de horquilla corto (ARNhc) agrupado destinado a identificar los genes que bloquean la función de linfocitos T infiltrantes de tumores. Como se ha descrito en la sección de antecedentes anterior, los mecanismos inmunosupresores asociados a tumor bloquean activamente la actividad de los linfocitos T en el microambiente tumoral. Los métodos descritos en el presente documento identifican ARNhc que permiten una infiltración y una acumulación sólidas de linfocitos T en los tumores, a pesar de las múltiples señales inhibidoras. Como se describe a continuación, los métodos identifican ARNhc que silencian la expresión de genes responsables de la inmunosupresión por tumores, lo que permite una infiltración y acumulación potenciadas de linfocitos T en los tumores y resistencia a la apoptosis.

En el presente documento se describen métodos para identificar específicamente mecanismos reguladores que dan como resultado la pérdida de función de los linfocitos T dentro del microambiente tumoral. Estos métodos pueden incluir: proporcionar una población de linfocitos T que albergan vectores que expresan un ARNhc; poner en contacto la población de linfocitos T con un tumor inmunosupresor; determinar si un ARNhc restablece la función de los linfocitos T (por ejemplo, restablece la capacidad de los linfocitos T para infiltrarse y proliferar dentro del microambiente tumoral) dentro del tumor inmunosupresor; identificar un gen asociado a un ARNhc que restablece la función de los linfocitos T dentro del tumor como un gen que inhibe la función de los linfocitos T dentro del microambiente tumoral.

En el presente documento se describen genes diana para reducir el efecto inmunosupresor de tumores. La expresión de los genes diana puede reducirse en células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T que reconocen antígenos asociados a tumor, y la reducción de la expresión de los genes diana puede aumentar la capacidad de las células para evadir mecanismos inmunosupresores asociados a tumor.

En el presente documento se describen ARNhc que reducen (por ejemplo, silencian, eliminan, atenúan, inactivan o disminuyen) la expresión de genes que alteran la función de linfocitos T infiltrantes de tumores. Estos ARNhc se identificaron a partir de la transferencia de linfocitos T transducidos por ARNhc en los tumores, seguida de una secuenciación profunda para cuantificar la representación de todos los ARNhc en el tumor y los órganos linfoides. Los ARNhc representativos divulgados en el presente documento incluyen ARNhc que reducen la actividad de genes incluyendo, por ejemplo, Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc.

En el presente documento se describen composiciones terapéuticas (por ejemplo, incluyendo moléculas de ácido nucleico aisladas, vectores que expresan moléculas de ácido nucleico que codifican el ARNhc) relacionadas con los ARNhc que silencian la expresión de genes que bloquean la función de linfocitos T infiltrantes de tumores. En el presente documento se describen células inmunosensibles modificadas (por ejemplo, linfocitos T, incluyendo linfocitos T citolíticos naturales (NKT), linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos T reguladores) que albergan vectores capaces de expresar el ARNhc descrito en el presente documento. Las células inmunosensibles modificadas pueden albergar además un vector capaz de expresar un CAR que tiene un dominio de unión a antígeno que se dirige a un antígeno específico de tumor.

ARN de interferencia

Uno de los descubrimientos recientes más importantes en investigación biomédica es la vía de interferencia de ARN (iARN), que las células usan para regular la actividad de muchos genes. Los principios de iARN han abierto muchas posibilidades nuevas para la identificación de dianas terapéuticas. La interferencia de ARN (iARN) es una herramienta eficaz para el análisis de alto rendimiento a escala genómica de la función génica. La expresión "interferencia de ARN" (iARN), también denominada silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), se refiere al proceso biológico en el que las moléculas de ARN inhiben la expresión génica. Un "agente de interferencia de ARN", como se usa en el presente documento, se define como cualquier agente que interfiere con o inhibe la expresión de un gen diana, por ejemplo, un gen diana de la invención, por interferencia de ARN (iARN). Dichos agentes de interferencia de ARN incluyen, pero sin limitación, moléculas de ácido nucleico que incluyen moléculas de ARN que son homólogas al gen diana, por ejemplo, un gen diana de la invención, o un fragmento del mismo, ARN de interferencia corto (ARNip), ARN de horquilla corto (ARNhc) y moléculas pequeñas que interfieren con o inhiben la expresión de un gen diana por interferencia de ARN (iARN).

La "interferencia de ARN (iARN)" es un proceso por el que la expresión o introducción de ARN de una secuencia que es idéntica o altamente similar a un gen diana da como resultado la degradación específica de secuencia o PTGS de ARN mensajero (ARNm) transcrito a partir de ese gen diana, inhibiendo de este modo la expresión del gen diana. Este proceso se ha descrito en células de plantas, invertebrados y mamíferos. La iARN también puede iniciarse introduciendo moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ARNip sintético o agentes de interferencia de ARN, para inhibir o silenciar la expresión de genes diana. Como se usa en el presente documento, la "inhibición de la expresión del gen diana" o la "inhibición de la expresión del gen marcador" incluyen cualquier disminución de la expresión o la actividad proteínica o el nivel del gen diana (por ejemplo, un gen marcador de la invención) o la proteína codificada por el gen diana, por ejemplo, una proteína marcadora de la invención. La disminución puede ser de al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % o más en comparación con la expresión de un gen diana o la actividad o el nivel de la proteína codificada por un gen diana que no ha sido diana de un agente de interferencia de ARN.

El "ARN de interferencia pequeño" (ARNip), también denominado en el presente documento "ARN de interferencia corto", se define como un agente que actúa inhibiendo la expresión de un gen diana. Estas son las moléculas efectoras para inducir la iARN, lo que conduce al silenciamiento génico postranscripcional con complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Además del ARNip, que puede sintetizarse químicamente, existen otros sistemas diversos en forma de moléculas efectoras potenciales para el silenciamiento génico postranscripcional, tales como ARN de horquilla corto (ARNhc), ARNbc largos, ARN temporales cortos y microARN (miARN). Estas moléculas efectoras se procesan en ARNip, como en el caso de ARNhc, o ayudan directamente al silenciamiento génico, como en el caso de miARN. El ARNhc, así como cualquier otra forma adecuada de ARN, puede afectar al silenciamiento génico postranscripcional por iARN. El uso de ARNhc tiene la ventaja sobre el uso de ARNip sintetizado químicamente de que la supresión del gen diana es normalmente a largo plazo y estable. Un ARNip puede sintetizarse químicamente, puede producirse in vitro por transcripción, o puede producirse dentro de una célula hospedadora a partir de ARNhc expresado.

El ARNip puede ser un ARN de horquilla corto (también denominado bucle de vástago) (ARNhc). Estos ARNhc se componen de una cadena antisentido corta (por ejemplo, 19-25 nucleótidos), seguida de un bucle de 5-9 nucleótidos y la cadena sentido complementaria. Como alternativa, la cadena sentido puede preceder a la estructura de bucle de nucleótidos y la cadena antisentido puede seguirla. Estos ARNhc pueden estar contenidos en plásmidos, retrovirus y lentivirus.

Como se usa en el presente documento, el "silenciamiento génico" inducido por interferencia de ARN se refiere a una disminución del nivel de ARNm en una célula para un gen diana de al menos aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % del nivel de ARNm encontrado en la célula sin la introducción de interferencia de ARN. En una realización preferida, los niveles de ARNm disminuyen al menos aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

El término "reducido" o "reducir", como se usa en el presente documento, significa generalmente una disminución de al menos el 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución de al menos aproximadamente el 20 %, o al menos aproximadamente el 30 %, o al menos aproximadamente el 40 %, o al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 %, o al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 90 % o hasta e incluyendo el 100 %, o cualquier disminución de número entero de entre el 10-100 % en comparación con un nivel de referencia.

El término "aumentado" o "aumento", como se usa en el presente documento, significa generalmente un aumento de al menos el 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente el 20 %, o al menos aproximadamente el 30 %, o al menos aproximadamente el 40 %, o al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 %, o al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 90 % o hasta e incluyendo un aumento del 100 % o cualquier aumento de número entero de entre el 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o un aumento de aproximadamente 2 veces, o de aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 4 veces, o de aproximadamente 5 veces o de aproximadamente 10 veces, o cualquier aumento de entre 2 veces y 10 veces o superior en comparación con un nivel de referencia.

Células inmunosensibles

En el presente documento se describen células inmunosensibles, incluyendo linfocitos T, linfocitos T citotóxicos, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T reguladores (CD4) y linfocitos citolíticos naturales (NKT), que expresan al menos uno de un receptor de reconocimiento de antígeno. Las células inmunosensibles expresan al menos un receptor de reconocimiento de antígeno específico de tumor. Los linfocitos T específicos de antígenos de células tumorales, los linfocitos NKT, TIL y CTL son células inmunosensibles. Los ejemplos no limitantes de células inmunosensibles incluyen linfocitos T, tales como, pero sin limitación, linfocitos T ap-TCR+ (por ejemplo, linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+), linfocitos T Y6-TCR+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos T CD4.

Composiciones de ácido nucleico

La divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc que comprenden una secuencia de al menos 15, 20 o 25 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604. El ARNhc también incluye el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos contigua y una secuencia corta ubicada entre las dos secuencias, de manera que las dos secuencias forman un ARNhc de bucle de vástago que puede procesarse dentro de una célula y proporcionan un ARNip que inhibe la expresión de la proteína codificada por SEQ ID NO: 604-620 y composiciones de las mismas.

La Tabla 1 proporciona una lista de los genes identificados en el presente documento como implicados en la inmunosupresión tumoral de linfocitos T.

TABLA 1

La Tabla 2 demuestra además el enriquecimiento en tumor frente al bazo para el ARNhc seleccionado, basándose en el análisis de secuenciación profunda ("Factor de Enriq")

Tabla 2

Los ARNhc que demuestran un factor de enriquecimiento de ARNhc de al menos >3 en el tumor con respecto al bazo indican una región de secuencia diana más activa.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos que codifican secuencias de ARNhc dirigidas a las secuencias de Ppp2r2d y Cblb humanas proporcionadas en la Tabla 2a.

Tabla 2a.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Ppp2r2d idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, o 386.

En el presente documento también se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Pp2r2d humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, o 386.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Eif2ak3 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 o 147.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Eif2ak3 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 o 147.

En el p re sen te d o cu m e n to se de sc rib en ác ido s nuc le icos a is la d o s que cod ifican s e cu e n c ia s de A R N h c co m p le m e n ta ria s a una se cu e n c ia d ian a de A rh g a p 5 id én tica a al m enos 12, al m en os 15, al m en os 20 o al m en os 25 nu c le ó tid o s con tigu os exp u e s to s en S E Q ID N O :32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, o 42.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Arhgap5 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, o 42.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Smad2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, o 490.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Smad2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, o 490.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Akap8l idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Akap8l humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Rbks idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, o 445.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Rbks humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441,442, 443, 444, o 445.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Egr2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, o 132.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Egr2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, o 132.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Dgka idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 o 117.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Dgka humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 o 117.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Cblb idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, o 72.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Cblb humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, o 72.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Mdfic idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, o 299.

En el presente documento se describen y la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Mdfic humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, o 299.

En el p re sen te d o cu m e n to se d e sc rib e n ác ido s nu c le ico s a is la d o s que cod ifica n s e cu e n c ia s de A R N h c co m p le m e n ta ria s a una se cu e n c ia d ian a de E n tpd l id én tica a al m en os 12, al m en os 15, al m en os 20 o al m en os 25 nu c le ó tid o s con tigu os exp u e s to s en S E Q ID N O :148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, o 162.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Entpdl humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, o 162.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Vamp7 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, o 587.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Vamp7 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, o 587.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Hipk1 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, o 222.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Hipk1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, o 222.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Nuak2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, o 329.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Nuak2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, o 329.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Alk idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o 31.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Alk humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO:16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o 31.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Pdzklipl idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, o 341.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de Pdzk1ip1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, o 341.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Blvrb idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO:52, 53, 54, 55, 56 o 57.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Blvrb humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56 o 57.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Cdkn2a idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86 u 87.

En el presente documento se describen y se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Cdkn2a humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86 u 87.

En el p re sen te d o cu m e n to se de sc rib en á c id o s nuc le icos a is la d o s que cod ifican s e cu e n c ia s de A R N h c co m p le m e n ta ria s a una se cu e n c ia d ian a de F 11 r id én tica a al m en os 12, al m en os 15, al m en os 20 o al m en os 25 nu c le ó tido s con tigu os exp u e s to s en S E Q ID NO: 175, 176 o 177.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una F11 r humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 175, 176 o 177.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Fyn idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 187, 191 o 192.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Fyn humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 187, 191 o 192.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Grk6 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 204, 205, 206 o 207.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Grk6 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 204, 205, 206 o 207.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Inpp5b idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 232, 234, 235, 236 u 237.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Inpp5b humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 232, 234, 235, 236 u 237.

En el presente documento se describen y la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Impk idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 248, 249, 250, 251 u 252.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Impk humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 248, 249, 250, 251 u 252.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Jun idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 263, 264, 265, 266, 267, 268 o 269.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Jun humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 263, 264, 265, 266, 267, 268 o 269.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Mast2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 281, 282, 283 o 284.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Mast2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 281, 282, 283 o 284.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Nptxr idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 311, 312, 313 o 314.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Nptxr humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 311, 312, 313 o 314.

En el p re sen te d o cu m e n to se de sc rib en ác ido s nuc le icos a is la d o s que cod ifican s e cu e n c ia s de A R N h c co m p le m e n ta ria s a una s e cu e n c ia d ian a de Pkd1 id én tica a al m en os 12, al m en os 15, al m enos 20 o al m en os 25 nu c le ó tido s con tigu os exp u e s to s en S E Q ID NO: 351, 352, 353, 354, 355 o 356.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Pkd1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 351, 352, 353, 354, 355 o 356.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Ppmlg idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 367, 368, 369, 370 u 371.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Ppmlg humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 367, 368, 369, 370 u 371.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Ppp3cc idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 399, 400 o 401.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Ppp3cc humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 399, 400 o 401.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Prkab2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 414, 415 o 416.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Prkab2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 414, 415 o 416.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Ptpn2 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 426, 427, 428, 429 u 430.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Ptpn2 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 426, 427, 428, 429 u 430.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Rock1 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 457, 458, 459 o 460.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Rock1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 457, 458, 459 o 460.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Sbfl idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 470, 471, 472, 473, 474 o 475.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Sbfl humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 470, 471, 472, 473, 474 o 475.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Socs1 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 504, 505, 506, 507, 508, 509 o 510.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Socs1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 504, 505, 506, 507, 508, 509 o 510.

En el p re sen te d o cu m e n to se de sc rib en ác ido s nuc le icos a is la d o s que cod ifican s e cu e n c ia s de A R N h c co m p le m e n ta ria s a una se cu e n c ia d iana de S o cs3 id én tica a al m en os 12, al m en os 15, al m enos 20 o al m en os 25 nu c le ó tid o s con tigu os exp u e s to s en S E Q ID NO: 524, 525, 526, 527 u 528.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Socs3 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 524, 525, 526, 527 u 528.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Stkl7b idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 539, 540, 541, 542 u 543.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Stk17b humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 539, 540, 541, 542 u 543.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Tnk1 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 556, 557 o 558.

En otras realizaciones, la divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Tnk1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 556, 557 o 558.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Trpm7 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 569, 570, 571, 572 u 573.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Trpm7 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 569, 570, 571, 572 u 573.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ARNhc complementarias a una secuencia diana de Yes1 idéntica a al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos expuestos en SEQ ID NO: 600, 601, 602 o 603.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un ARNhc que comprende una secuencia complementaria a una Yes1 humana que corresponde a una secuencia diana murina establecida en SEQ ID NO: 600, 601, 602 o 603.

Una secuencia humana que corresponde a una secuencia diana murina es una secuencia que corresponde perfectamente a la secuencia génica humana y, por ejemplo, puede no tener ninguno, 1,2, 3 o 4 desapareamientos de nucleótidos con los al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia diana murina seleccionada.

Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, a condición de que una de las secuencias de ácido nucleico que normalmente se encuentran inmediatamente flanqueando esa molécula de ADN en un genoma de origen natural se retire o esté ausente. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como molécula separada (por ejemplo, un ácido nucleico sintetizado químicamente, ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o un tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN que se incorpora en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociado o herpesvirus), o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico modificado por ingeniería genética tal como una molécula de ADN recombinante que forma parte de un ácido nucleico híbrido o de fusión. Un ácido nucleico que existe entre cientos a millones de otros ácidos nucleicos dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas, o cortes de gel que contienen una digestión por restricción de ADN genómico, no ha de considerarse un ácido nucleico aislado.

Para calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de apareamientos idénticos de nucleótidos o restos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de apareamientos idénticos se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o restos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para obtener un valor de porcentaje de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño de longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una secuencia individual puede alinearse con más de otra secuencia y, por lo tanto, puede tener diferentes valores de porcentaje de identidad de secuencia en cada región alineada. Hay que tener en cuenta que el valor de porcentaje de identidad por lo general se redondea al número entero más cercano. Por ejemplo, el 78,1 %, 78,2 %, 78,3 % y 78,4 % se redondean hacia abajo al 78 %, mientras que el 78,5 %, 78,6 %, 78,7 %, 78,8 % y 78,9 % se redondean hacia arriba al 79 %. También hay que tener en cuenta que la longitud de la región alineada es siempre un número entero.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al grado de identidad entre cualquier secuencia de consulta dada y una secuencia objeto. Un porcentaje de identidad para cualquier secuencia de ácido nucleico o aminoácido de consulta, por ejemplo, un factor de transcripción, con respecto a otra secuencia de ácido nucleico o aminoácido objeto puede determinarse como se indica a continuación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de nucleótidos complementaria", también conocida como "secuencia antisentido", se refiere a una secuencia de un ácido nucleico que es totalmente complementaria a la secuencia de un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína (por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementaria a una secuencia de ARNm). En el presente documento, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos o a toda una cadena codificante de genes, o a solamente a una porción de la misma.

Como se usa en el presente documento, la expresión "corresponder a una secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una secuencia idéntica. En algunos casos, cuando los nucleótidos antisentido (ácidos nucleicos) o los ARNip (ARN inhibidores pequeños) se hibridan con una secuencia diana, una secuencia de ARN inhibidor pequeño (ARNip) o antisentido particular es sustancialmente complementaria a la secuencia diana y, por lo tanto, se unirá específicamente a una porción de un ARNm que codifica polipéptido. Como tal, normalmente las secuencias de esos ácidos nucleicos serán altamente complementarias a la secuencia diana de ARNm y no tendrán más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 desapareamientos de bases en toda la secuencia. En muchos casos, puede ser deseable que las secuencias de los ácidos nucleicos sean apareamientos exactos, es decir, que sean totalmente complementarias a la secuencia a la que se une específicamente el oligonucleótido y, por lo tanto, tengan cero desapareamientos a lo largo del tramo complementario. Las secuencias altamente complementarias normalmente se unirán bastante específicamente a la región de secuencia diana del ARNm y, por lo tanto, serán altamente eficientes para reducir, y/o incluso inhibir, la traducción de la secuencia de ARNm diana en producto polipeptídico.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a cualquier vector vírico o no vírico, así como a cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario en forma lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, que puede ser o no autotransmisible o movilizable, y que puede transformar células hospedadoras procariotas o eucariotas por integración en el genoma celular o que puede existir extracromosómicamente (por ejemplo, plásmido replicante autónomo con un origen de replicación). Está previsto cualquier vector conocido en la técnica para su uso en la práctica de la presente invención.

Los vectores pueden ser víricos o no víricos. Si se usan vectores víricos, es preferible que los vectores víricos sean defectuosos para la replicación, lo que puede conseguirse, por ejemplo, retirando todos los ácidos nucleicos víricos que codifican para la replicación. Un vector vírico defectuoso para la replicación seguirá conservando sus propiedades infecciosas y entrará en las células de manera similar a un vector adenovírico de replicación, sin embargo, una vez admitido en la célula, un vector vírico defectuoso para la replicación no se reproduce ni se multiplica. Los vectores también abarcan liposomas y nanopartículas, así como otros medios para entregar una molécula de ADN a una célula.

La expresión "vectores víricos" se refiere al uso de virus o vectores asociados a virus como portadores de una construcción de ácido nucleico en una célula. Las construcciones pueden integrarse y empaquetarse en genomas víricos defectuosos no replicantes, como adenovirus, virus adenoasociado (AAV) o virus del herpes simple (HSV) u otros, incluyendo vectores retrovíricos y lentivíricos, para su infección o transducción en las células. El vector puede o no incorporarse en el genoma de la célula.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y que por lo general se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.

Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión". Por lo tanto, un "vector de expresión" es un vector especializado que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que ha de expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona células modificadas que albergan vectores capaces de expresar el ARNhc descrito en el presente documento y modificados adicionalmente para expresar un CAR. En un aspecto, el ARNhc y el CAR se expresan en el mismo vector. En otro aspecto, el ARNhc y el CAR se expresan en vectores separados.

Las células modificadas descritas en el presente documento son linfocitos T. En algunos aspectos, los linfocitos T expresan al menos uno de un receptor de reconocimiento de antígeno. En cualquier aspecto, los linfocitos T expresan al menos un receptor de reconocimiento de antígeno específico de tumor. En algunos aspectos, se usan linfocitos T específicos de antígenos de células tumorales, linfocitos NKT, TIL, células CTL u otros linfocitos T. Los ejemplos no limitantes de linfocitos T, incluyen, por ejemplo, linfocitos T ap-TCR+ (por ejemplo, linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+), linfocitos T Y&-TCR+, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos T CD4.

Las composiciones que comprenden los linfocitos T de la invención (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos NKT, TIL, células CTL, o sus progenitores) pueden proporcionarse por vía sistémica o directamente a un sujeto para el tratamiento de un cáncer. En una realización, las células de la invención se inyectan directamente en un órgano de interés (por ejemplo, un órgano afectado por un cáncer). Como alternativa, se proporcionan composiciones que comprenden linfocitos T modificados genéticamente indirectamente al órgano de interés, por ejemplo, mediante administración en el sistema circulatorio (por ejemplo, la vasculatura tumoral). Pueden proporcionarse agentes de expansión y diferenciación antes, durante o después de la administración de las células para aumentar la producción de linfocitos T, linfocitos NKT, TIL, células CTL in vitro o in vivo.

Los linfocitos T modificados pueden administrarse en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, normalmente por vía intravascular, aunque también pueden introducirse en el hueso o u otro sitio conveniente donde las células pueden encontrar un sitio apropiado para la regeneración y diferenciación (por ejemplo, el timo). Por lo general, se administrarán al menos 1*105 células, alcanzando en última instancia a 1 x 1010, o más. Los linfocitos T de la invención pueden comprender una población purificada de células. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente el porcentaje de células inmunosensibles modificadas genéticamente en una población usando diversos métodos bien conocidos, tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Son intervalos preferibles de pureza en las poblaciones que comprenden linfocitos T modificados genéticamente de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 55 %, de aproximadamente el 55 a aproximadamente el 60 % y de aproximadamente el 65 a aproximadamente el 70 %. Más preferentemente, la pureza es de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 75 %, de aproximadamente el 75 a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 80 a aproximadamente el 85 %; y aún más preferentemente, la pureza es de aproximadamente el 85 a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 90 a aproximadamente el 95 % y de aproximadamente el 95 a aproximadamente el 100 %. Las dosis pueden ajustarse fácilmente por los expertos en la materia (por ejemplo, una disminución de la pureza puede requerir un aumento de la dosis).

Las células pueden introducirse por inyección, catéter o similares. Si se desea, también pueden incluirse factores, incluyendo, pero sin limitación, interleucinas, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-6 e IL-11, así como las demás interleucinas, los factores estimuladores de colonias, tales como G-, M- y GM-CSF, interferones, por ejemplo, interferón gamma y eritropoyetina.

Las composiciones de la invención incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden los linfocitos T de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La administración puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, los linfocitos T o los progenitores pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto diferente y compatible.

Receptores de antígenos quiméricos

En el presente documento se describen receptores de antígeno quimérico (CAR) que comprenden un dominio de unión a antígeno dirigido a un antígeno de célula tumoral. Un CAR es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene una porción extracelular que reconoce un antígeno de célula tumoral (por ejemplo, los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo (scFv) y un dominio de señalización citoplasmático derivado del receptor de linfocitos T y el dominio coestimulador. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de agosto de 2011; 3(95)) Kalos et al. describen la generación de linfocitos T CAR que se dirigen a CD 19 y demuestran que los linfocitos T modificados con CAR mediaron un efecto antitumoral potente en pacientes con leucemia linfocítica crónica. Las características de los CAR incluyen su capacidad de redirigir la especificidad y la reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de manera no restringida por CMH, aprovechando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. Los linfocitos T modificados con CAR tienen el potencial de replicarse in vivo y la persistencia a largo plazo permite un control tumoral sostenido y obvia la necesidad de infusiones repetidas de anticuerpo. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de agosto de 2011; 3(95)) El reconocimiento de antígeno no restringido por CMH proporciona a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad de reconocer el antígeno independientemente del procesamiento de antígenos, evitando de este modo un mecanismo importante de escape del tumor. Por lo demás, cuando se expresan en los linfocitos T, los CAR ventajosamente no se dimerizan con las cadenas alfa y beta de los receptores de linfocitos T (TCR) endógenos. Los linfocitos T modificados con CAR se describen en detalle en los documentos W02012/079000 y WO2012/09999 y en Milone et al. 2009 Mol. Ther.

17:1453.

Un CAR combina el sitio de unión de una molécula que reconoce un antígeno al que se dirige (es decir, un "dominio de unión a antígeno") con uno o más dominios de receptores inmunitarios convencionales responsables de iniciar la transducción de señales que conduce a la activación de linfocitos (por ejemplo, el "dominio estimulador" o "dominio de señalización").

En algunas realizaciones, la porción de unión del CAR para su uso en la presente invención deriva de la estructura del fragmento Fab (unión a antígeno) de un anticuerpo monoclonal (mAb) que tiene alta afinidad por el antígeno tumoral al que se dirige. Dado que el Fab es el producto de dos genes, las secuencias correspondientes por lo general se combinan a través de un fragmento enlazador corto que permite que la cadena pesada se pliegue sobre los péptidos derivados de cadena ligera en su configuración nativa, creando una región variable de fragmento monocatenario (scFv).

Los fragmentos de anticuerpo o Fv (scFv) comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica individual. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno.

En algunas realizaciones, la porción de unión del CAR para su uso en la presente invención deriva de un dominio de señalización citoplasmático derivado del receptor de linfocitos T y de moléculas coestimuladoras.

En algunas realizaciones, la porción de señalización del CAR para su uso en la presente invención contiene por lo general los dominios intracelulares de la cadena zeta (Z) del complejo TCR/CD325 o, menos habitualmente, de la cadena gamma (Y) del receptor de inmunoglobulina FcsR26, 27 o la cadena CD3-épsilon (s),28 derivando la región transmembrana de la misma molécula.

En algunos aspectos, el CAR para su uso en la presente invención puede comprender un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio estimulador y un dominio coestimulador. En el presente documento se describen ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los CAR descritos en el presente documento.

En un aspecto, el dominio de unión a antígeno del CAR para su uso en la presente invención se une a un antígeno de célula tumoral. La expresión "antígeno de célula tumoral" o "antígeno tumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido expresado por un tumor que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Los ejemplos no limitantes de antígenos tumorales incluyen, por ejemplo, el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMa ), el Antígeno Carcinoembrionario (CEA), c D19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c-Met, Glicolípido F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4.2, CAN, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPYL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL-BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT-SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68 y cualquier combinación de los mismos.

La presente invención se refiere en general al uso de linfocitos T modificados genéticamente para expresar de forma estable un ARNhc de la invención y un CAR deseado. Los linfocitos T que expresan un CAR se denominan en general linfocitos T CAR. Los linfocitos T que expresan un CAR se denominan en el presente documento linfocitos T CAR o linfocitos T modificados con CAR. Preferentemente, la célula puede modificarse genéticamente para expresar de forma estable un dominio de unión a anticuerpo en su superficie, lo que le confiere una especificidad de antígeno novedosa que es independiente del CMH. En algunos casos, el linfocito T se modifica genéticamente para expresar de forma estable un CAR que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio estimulador intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización). Por lo tanto, además de un dominio de unión a antígeno, el CAR puede incluir los dominios intracelulares de la cadena zeta (Z) del complejo TCR/CD3, la cadena gamma (y) del receptor de inmunoglobulina FceRI26, 27 o la cadena CD3-épsilon (e). El CAR también puede incluir una región transmembrana que sea de las mismas moléculas o de otras proteínas transmembrana de tipo I, tales como CD4, CD8 y CD28.

En una realización, el CAR para su uso en la invención comprende un dominio extracelular que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

En una realización, se usa el dominio transmembrana que se asocia naturalmente a uno de los dominios en el CAR. En otra realización, el dominio citoplasmático puede diseñarse para comprender un dominio estimulador y un dominio coestimulador.

Un CAR puede incluir una porción intracitoplasmática de moléculas coestimuladoras, tal como CD28, CD134/OX40, CD137/4-1BB, Lck, ICOS o DAP10.

La divulgación también se refiere a una estrategia de terapia celular adoptiva (ACT). La ACT es un procedimiento en el que se administran linfocitos terapéuticos a pacientes con el fin de tratar el cáncer. Este enfoque implica la generación ex vivo de linfocitos T específicos de tumores y su infusión a pacientes. Además de la infusión de linfocitos, el hospedador puede manipularse de otras formas que respalden la toma de los linfocitos T y su respuesta inmunitaria, por ejemplo, el preacondicionamiento del hospedador (con radiación o quimioterapia) y la administración de factores de crecimiento de linfocitos (tales como IL-2). Un método para generar dichos linfocitos específicos de tumores implica la expansión de linfocitos T específicos de antígeno.

En una realización, la invención proporciona generar linfocitos T que expresan un ARNhc que comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a SEQ ID NO: 604 y un CAR deseado dirigido a un antígeno tumoral. Los linfocitos T modificados pueden generarse introduciendo en las células un vector (por ejemplo, un plásmido, vector lentivírico, vector retrovírico, vector adenovírico, vector vírico adenoasociado) que codifique tanto 1) un ARNh capaz de reducir la expresión de Ppp2r2d como 2) un CAR deseado. Los linfocitos T modificados de la invención son capaces de replicarse in vivo dando como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir al control tumoral.

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición capaz de silenciar genes que inhiben la función de los linfocitos T. En el presente documento se describen métodos relacionados con la administración de linfocitos T que expresan un ARNhc y un CAR deseado dirigido a un antígeno tumoral. En un aspecto, el linfocito T que ha de administrarse comprende un vector que codifica un ARNhc que comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a SEQ ID NO: 604 y un CAR deseado dirigido a un antígeno tumoral.

Formulaciones farmacéuticas

En algunos casos, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento pueden incluir, además de los linfocitos T dirigidos a tumores, compuestos, fármacos y/o agentes utilizados para el tratamiento del cáncer. Dichos compuestos, fármacos y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos quimioterápicos, fármacos de molécula pequeña o anticuerpos que estimulan la respuesta inmunitaria a un cáncer dado. En otros casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más inhibidores de molécula pequeña que silencien, reduzcan, eliminen, atenúen, inactiven o disminuyan la expresión y/o la actividad de genes seleccionados del grupo que consiste en Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11 r, Fyn, Ype12, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc. En consecuencia, la invención proporciona uno o más inhibidores de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11 r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 o Ppp3cc.

En un aspecto, la composición de la invención comprende además:

uno o más inhibidores de Ppp2r2d;

uno o más inhibidores de Eif2ak3;

uno o más inhibidores de Arhgap5;

uno o más inhibidores de Smad2;

uno o más inhibidores de Akap81;

uno o más inhibidores de Rbks;

uno o más inhibidores de Egr2;

uno o más inhibidores de Dgka;

uno o más inhibidores de Cblb;

uno o más inhibidores de Map3k3;

uno o más inhibidores de vMdfic;

uno o más inhibidores de Entpdl;

uno o más inhibidores de Dgkz;

uno o más inhibidores de Vamp7;

o más inhibidores de Nuak2;

uno o más inhibidores de Hipkl; o

uno o más inhibidores de Alk. En una realización, el inhibidor de Alk incluye, por ejemplo, CH5424802 (Hoffmann-La Roche), LDK378 (Novartis), Crizotinib y PF-02341066 (Pfizer) o AP26113 (Ariad Pharmaceuticals).

En otro aspecto, la composición de la invención comprende además uno o más inhibidores de Pdzklipl.

En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, citocinas, quimiocinas y otras moléculas de señalización biológicas, vacunas específicas de tumores, vacunas celulares contra el cáncer (por ejemplo, células cancerosas transducidas por GM-CSF), anticuerpos monoclonales específicos de tumores, rescate de células madre autólogas y alógenas (por ejemplo, para aumentar los efectos del injerto frente al tumor), otros anticuerpos terapéuticos, terapias moleculares dirigidas, terapia antiangiogénica, agentes infecciosos con intención terapéutica (tales como bacterias localizadoras de tumores) y terapia génica.

En algunos casos, las composiciones terapéuticas desveladas en el presente documento pueden formularse para su uso como o en composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones pueden formularse o adaptarse para la administración a un sujeto a través de cualquier vía, por ejemplo, cualquier vía aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA). Se describen métodos de ejemplo en el Manual de Normas de Datos CDER de la FDA, versión número 004 (que está disponible en fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm).

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas pueden incluir una cantidad eficaz de uno o más péptidos. Las expresiones "cantidad eficaz" y "eficaz para tratar", como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad o una concentración de uno o más péptidos durante un período de tiempo (incluyendo la administración aguda o crónica y la administración periódica o continua) que es eficaz en el contexto de su administración para provocar un efecto o resultado fisiológico previsto.

Las composiciones de la presente invención pueden contener cualquier portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable no tóxico convencional. En algunos casos, el pH de la formulación puede ajustarse con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para potenciar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de entrega.

Métodos

En algunos casos, los métodos pueden incluir la selección de un sujeto humano que tenga o haya tenido una afección o enfermedad (por ejemplo, cáncer). En algunos casos, los sujetos adecuados incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen o tuvieron una afección o enfermedad pero que resolvieron la enfermedad o un aspecto de la misma, presentan síntomas reducidos de la enfermedad (por ejemplo, con respecto a otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de los sujetos) con la misma afección o enfermedad), y/o que sobreviven durante períodos de tiempo prolongados con la afección o enfermedad (por ejemplo, con respecto a otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de los sujetos) con la misma afección o enfermedad), por ejemplo, en un estado asintomático (por ejemplo, con respecto a otros sujetos (por ejemplo, la mayoría de los sujetos) con la misma afección o enfermedad).

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal. En algunos casos, el sujeto es un mamífero. En algunos casos, el término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un ser humano (por ejemplo, un hombre, una mujer o un niño). Las muestras para su uso en los métodos pueden incluir muestras de suero, por ejemplo, obtenidas del sujeto seleccionado.

En algunos casos, la selección del sujeto puede obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo, un sujeto candidato) y someter a ensayo la muestra para obtener una indicación de que el sujeto es adecuado para la selección. En algunos casos, un profesional de la salud puede confirmar o identificar si el sujeto ha tenido o tiene una afección o enfermedad.

En algunos casos, la exhibición de una respuesta inmunitaria positiva hacia una afección o enfermedad puede hacerse a partir de registros del paciente, la historia familiar y/o la detección de una indicación de una respuesta inmunitaria positiva. En algunos casos pueden incluirse múltiples partes en la selección de sujetos. Por ejemplo, una primera parte puede obtener una muestra de un sujeto candidato y una segunda parte puede someter a ensayo la muestra. En algunos casos, los sujetos pueden ser seleccionados y/o remitidos por un médico (por ejemplo, un médico general). En algunos casos, la selección del sujeto puede incluir obtener una muestra de un sujeto seleccionado y almacenar la muestra y/o el uso de la misma en los métodos desvelados en el presente documento. Las muestras pueden incluir, por ejemplo, células o poblaciones de células.

Métodos de uso

En el presente documento se describen métodos para aumentar la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita. En el presente documento se describen terapias que son particularmente útiles para el tratamiento de sujetos que tienen cáncer. Los métodos de tratamiento pueden incluir administrar a un sujeto una composición desvelada en el presente documento.

En el presente documento se describen métodos para tratar y/o prevenir el cáncer o los síntomas del cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición capaz de silenciar genes que inhiben la función de los linfocitos T (por ejemplo, un linfocito T inmunosensible que expresa un ARNhc y un CAR deseado dirigido a un antígeno tumoral). En algunos casos, el linfocito T deriva del paciente que ha de tratarse y se ha modificado para expresar el CAR y un ARNhc que reduce la expresión de un gen diana descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones, el cáncer es un carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, etc., incluyendo cánceres sólidos y linfoides, cáncer de riñón, de mama, de pulmón, de vejiga, de colon, de ovario, de próstata, de páncreas, de estómago, de cerebro, de cabeza y cuello, de piel, de útero, de testículo, glioma, de esófago y de hígado, incluyendo hepatocarcinoma, linfoma, incluyendo linfoma linfoblástico agudo B, linfomas no Hodgkin (por ejemplo, linfomas de Burkitt, de células pequeñas y de células grandes) y linfoma de Hodgkin, leucemia (incluyendo LMA, LLA y LMC) y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, el cáncer es una neoplasia de células plasmáticas, por ejemplo, un mieloma múltiple (MM) o una afección premaligna de células plasmáticas. En algunas realizaciones, se ha diagnosticado al sujeto como que tiene un cáncer o como que está predispuesto al cáncer.

Como se usa en el presente documento, "cáncer" se refiere a cánceres humanos y carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, leucemias, etc., incluyendo cánceres sólidos y linfoides, cáncer de riñón, de mama, de pulmón, de vejiga, de colon, de ovario, de próstata, de páncreas, de estómago, de cerebro, de cabeza y cuello, de piel, de útero, de testículo, glioma, de esófago y de hígado, incluyendo hepatocarcinoma, linfoma, incluyendo linfoma linfoblástico agudo B, linfomas no Hodgkin (por ejemplo, linfomas de Burkitt, de células pequeñas y de células grandes) y linfoma de Hodgkin, leucemia (incluyendo LMA, LLA y LMC) y mieloma múltiple.

La expresión "efecto antitumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células tumorales, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida o una mejoría de diversos síntomas fisiológicos asociados a la afección cancerosa. Un "efecto antitumoral" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición del tumor en primer lugar.

Los términos "trata" o "tratar", como se usan en el presente documento, se refieren a aliviar, inhibir, mejorar y/o aliviar parcial o totalmente la enfermedad o afección que padece el sujeto. En algunos casos, el tratamiento puede dar como resultado la ausencia continuada de la enfermedad o afección que padece el sujeto.

En general, los métodos incluyen la selección de un sujeto con una afección o enfermedad, o en riesgo de padecerla. En algunos casos, la afección o enfermedad del sujeto puede tratarse con una composición farmacéutica divulgada en el presente documento. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos incluyen seleccionar un sujeto con cáncer, por ejemplo, en donde el cáncer del sujeto puede tratarse aumentando la acumulación e infiltración de linfocitos T dentro del tumor.

En algunos casos, los métodos de tratamiento pueden incluir una única administración, múltiples administraciones y la administración repetida como se requiere para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad o afección que padece el sujeto. En algunos casos, los métodos de tratamiento pueden incluir evaluar un nivel de enfermedad en el sujeto antes del tratamiento, durante el tratamiento y/o después del tratamiento. En algunos casos, el tratamiento puede continuar hasta que se detecte una disminución del nivel de enfermedad en el sujeto.

Después de la administración, el sujeto puede evaluarse para detectar, evaluar o determinar su nivel de enfermedad. En algunos casos, el tratamiento puede continuar hasta que se detecte un cambio (por ejemplo, reducción) del nivel de enfermedad en el sujeto.

Tras la mejora de la afección de un paciente (por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una disminución) en el nivel de enfermedad en el sujeto), puede administrarse una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de la presente invención, si es necesario. Posteriormente, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, a un nivel al que se mantenga la mejoría de la afección. Sin embargo, los pacientes pueden requerir un tratamiento intermitente a largo plazo ante cualquier reaparición de los síntomas de la enfermedad.

Cualquiera de los métodos y cualquiera de las composiciones descritos en el presente documento pueden combinarse con uno o más agentes terapéuticos. Un agente terapéutico incluye, pero sin limitación, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, agentes quimioterápicos y radiación.

Cualquiera de los métodos y cualquiera de las composiciones descritos en el presente documento pueden combinarse con terapias contra el cáncer convencionales y con diversos fármacos con el fin de potenciar la eficacia de dichas terapias a través de la reducción de las dosis/toxicidad de las terapias convencionales y/o para aumentar la sensibilidad de las terapias convencionales. Una terapia convencional es el uso de radioterapia. Otra terapia convencional es el uso de fármacos quimioterápicos que pueden dividirse en: agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de topoisomerasa y agentes antitumorales. Todos estos fármacos afectan a la división celular o a la síntesis y función del ADN de alguna manera. Otras terapias contra el cáncer convencionales son agentes que no interfieren directamente con el ADN. Los ejemplos de dichos agentes para combinar con la presente invención pueden incluir, por ejemplo, fármacos de "molécula pequeña" que bloquean enzimas específicas implicadas en el crecimiento de células cancerosas. Los anticuerpos monoclonales, las vacunas contra el cáncer, los inhibidores de la angiogénesis y la terapia génica son terapias dirigidas que también pueden combinarse con las composiciones y métodos descritos en el presente documento porque también interfieren con el crecimiento de células cancerosas.

Métodos de cribado de compuestos de ensayo

En el presente documento se describen métodos para el cribado de compuestos de ensayo, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, compuestos de ensayo inorgánicos u orgánicos de molécula grande o pequeña, para identificar agentes útiles en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, compuestos de ensayo que silencien, reduzcan, eliminen, atenúen, inactiven, modulen o disminuyan la expresión y/o la actividad de genes seleccionados del grupo que consiste en Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11 r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1,

Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc.

Como se usa en el presente documento, "moléculas pequeñas" se refiere a moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas de peso molecular inferior a aproximadamente 3.000 Dalton. En general, las moléculas pequeñas útiles para la invención tienen un peso molecular inferior a 3.000 Dalton (Da). Las moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 100 Da a aproximadamente 3.000 Da (por ejemplo, entre aproximadamente 100 y aproximadamente ximadamen ximadamen ximadamen

Da,

Los compuestos de ensayo pueden ser, por ejemplo, productos naturales o miembros de una biblioteca de química combinatoria. Debe usarse un conjunto de moléculas diversas para cubrir una diversidad de funciones tales como carga, aromaticidad, enlace de hidrógeno, flexibilidad, tamaño, longitud de la cadena lateral, hidrofobia y rigidez. Se conocen técnicas combinatorias adecuadas para sintetizar moléculas pequeñas en la técnica, por ejemplo, como se ejemplifica en Obrecht y Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998), e incluyen aquellas tales como las técnicas de síntesis de "separar y agrupar" o "paralela", las técnicas en fase sólida y en fase de solución y las técnicas codificantes (véase, por ejemplo, Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60-6 (1997)). Además, hay varias bibliotecas de molécula pequeña disponibles en el mercado. En la Patente de los EE.UU. N.° 6.503.713 se enumeran varios compuestos de ensayo de molécula pequeña adecuados.

Las bibliotecas cribadas usando los métodos descritos en el presente documento pueden comprender una diversidad de tipos de compuestos de ensayo. Una biblioteca dada puede comprender un conjunto de compuestos de ensayo estructuralmente relacionados o no relacionados. Los compuestos de ensayo pueden ser moléculas peptídicas o peptidomiméticas. Los compuestos de ensayo pueden ser ácidos nucleicos.

Los compuestos de ensayo y las bibliotecas de los mismos pueden obtenerse alterando sistemáticamente la estructura de un primer compuesto de ensayo, por ejemplo, un primer compuesto de ensayo que sea estructuralmente similar a un compañero de unión natural conocido del polipéptido diana, o una primera molécula pequeña identificada como capaz de unirse al polipéptido diana, por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica o los métodos descritos en el presente documento, y correlacionando esa estructura con una actividad biológica resultante, por ejemplo, un estudio de relación estructura-actividad. Como apreciará un experto en la materia, existe una diversidad de métodos convencionales para crear una relación estructura-actividad de este tipo. Por lo tanto, en algunos casos, el trabajo puede ser en gran medida empírico, y en otros, la estructura tridimensional de un polipéptido endógeno o una porción del mismo puede usarse como

punto de partida para el diseño racional de un compuesto o compuestos de molécula pequeña. Por ejemplo, puede cribarse una biblioteca general de moléculas pequeñas, por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento.

Puede aplicarse un compuesto de ensayo a una muestra de ensayo, por ejemplo, una célula o un tejido u órgano vivo, por ejemplo, un ojo, y se evalúa uno o más efectos del compuesto de ensayo. En una célula cultivada o primaria, por ejemplo, la capacidad del compuesto de ensayo para silenciar, reducir, eliminar, atenuar, inactivar, modular o disminuir la expresión y/o la actividad de genes seleccionados del grupo que consiste en Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc.

La muestra de ensayo puede ser o puede derivar de (por ejemplo, una muestra tomada de) un modelo in vivo de un trastorno como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse un modelo animal, por ejemplo, un roedor tal como una rata.

Se conocen en la técnica métodos para evaluar cada uno de estos efectos. Por ejemplo, la capacidad de modular la expresión de una proteína puede evaluarse al nivel génico o de proteína, por ejemplo, usando métodos de PCR cuantitativa o de inmunoensayo. En algunas realizaciones, pueden usarse métodos de alto rendimiento, por ejemplo, los chips de proteínas o de genes, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el capítulo 12, Genomics, en Griffiths et al., Eds. Modern genetic Analysis, 1999, W. H. Freeman and Company; Ekins y Chu, Trends in Biotechnology, 1999, 17: 217-218; MacBeath y Schreiber, Science 2000, 289(5485): 1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003), para detectar un efecto sobre la actividad o expresión génica de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc.

Un compuesto de ensayo que se ha cribado mediante un método descrito en el presente documento y que se ha determinado que silencia, reduce, elimina, atenúa, inactiva o disminuye la expresión y/o la actividad de genes seleccionados del grupo que consiste en Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpdl, Dgkz, Vamp7, Hipkl, Nuak2, Alk, Pdzklipl, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkdl, Grk6, Cdkn2a, Sbfl, Ipmk, Rockl, Stkl7b, Mast2, Pdpl, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnkl, Prkab2, Trpm7 y Ppp3cc, puede considerarse un compuesto candidato. Un compuesto candidato que se ha cribado, por ejemplo, en un modelo in vivo de un trastorno, por ejemplo, cáncer, y que se ha determinado que tiene un efecto deseable sobre el trastorno, por ejemplo, sobre uno o más síntomas del trastorno, puede considerarse un agente terapéutico candidato. Los agentes terapéuticos candidatos, una vez cribados en un entorno clínico, son agentes terapéuticos. Los compuestos candidatos, los agentes terapéuticos candidatos y los agentes terapéuticos pueden optimizarse y/o derivatizarse opcionalmente, y formularse con excipientes fisiológicamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas.

Por lo tanto, los compuestos de ensayo identificados como "aciertos" (por ejemplo, compuestos de ensayo que inhiben las vías inmunosupresoras utilizadas por las células tumorales para inactivar y/o suprimir las células inmunitarias) en un primer cribado pueden seleccionarse y alterarse sistemáticamente, por ejemplo, usando un diseño racional, para optimizar la afinidad de unión, la avidez, la especificidad u otro parámetro. Dicha optimización también puede ser cribarse usando los métodos descritos en el presente documento. En el presente documento se describe un método de cribado de una primera biblioteca de compuestos usando un método conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento, identificando uno o más aciertos en esa biblioteca, sometiendo esos aciertos a una alteración estructural sistemática para crear una segunda biblioteca de compuestos estructuralmente relacionados con el acierto, y cribando la segunda biblioteca usando los métodos descritos en el presente documento.

EJEMPLOS

Trabajos recientes han demostrado que los linfocitos T citotóxicos desempeñan una función central en el control inmunitario de los cánceres1-3, y los anticuerpos monoclonales que se dirigen a receptores inhibidores en linfocitos T pueden inducir un beneficio clínico significativo en pacientes con enfermedad avanzada4-6. Sin embargo, muchos de los mecanismos reguladores que dan como resultado la pérdida de función de los linfocitos T en los tumores inmunosupresores siguen siendo desconocidos. En los siguientes ejemplos, los inventores demuestran que dichos mecanismos reguladores pueden describirse sistemáticamente in vivo en el microambiente tumoral. Los inventores postularon que los ARNhc dirigidos a inhibidores clave permitirían una infiltración y una acumulación sólidas de linfocitos T en los tumores, a pesar de las múltiples señales inhibidoras. Usando un enfoque de cribado de ARNhc de agrupamiento destinado a identificar genes que bloquean la función de los linfocitos T CD8 infiltrantes de tumores, se descubrieron ARNhc candidatos mediante la transferencia de linfocitos T transducidos por ARNhc a ratones portadores de tumores, seguida de una secuenciación profunda para cuantificar la representación de todas las horquillas en los tumores y órganos linfoides. La mayoría de los ARNhc indujeron la acumulación de linfocitos T en los tumores, pero no en el bazo, lo que demuestra la viabilidad de descubrir ARNhc con acción diferencial en los distintos tejidos. Una de las dianas era Ppp2r2d, una subunidad reguladora de la fosfatasa PP2A7. Los linfocitos T transducidos por ARNhc de control experimentaron apoptosis tras el reconocimiento de células de melanoma, mientras se acumularon linfocitos T transducidos por ARNhc de Ppp2r2d en los tumores debido a la proliferación y la resistencia a la apoptosis potenciadas. Los linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d también retrasaron significativamente el crecimiento tumoral. Este enfoque in vivo tiene amplias aplicaciones para diseccionar funciones inmunitarias complejas en microambientes tisulares relevantes.

Las células inmunitarias desempeñan funciones de vigilancia complejas en todo el cuerpo e interactúan con muchos tipos diferentes de células en microambientes tisulares distintos. Las dianas terapéuticas para modular respuestas inmunitarias normalmente se identifican in vitro y se someten a ensayo en modelos animales en una fase tardía del proceso. En este caso los inventores han abordado el reto de cómo pueden descubrirse sistemáticamente in vivo dianas para la modulación inmunitaria. Se trata de un problema fundamental en oncología porque una infiltración fuerte de linfocitos T CD8, que tienen una función citotóxica contra células tumorales, se asocia a un pronóstico favorable en múltiples tipos de cáncer humano138. Desafortunadamente, este mecanismo de defensa natural se ve gravemente debilitado en la mayoría de los pacientes por múltiples señales inhibidoras procedentes del tumor, su estroma, los linfocitos T reguladores y las poblaciones de células mieloides.9-11

Se ha demostrado que las bibliotecas de ARNhc agrupadas son herramientas de descubrimiento potentes12-14. Los inventores razonaron que los ARNhc capaces de restaurar la función de los linfocitos T CD8 pueden descubrirse sistemáticamente in vivo aprovechando la amplia capacidad proliferativa de los linfocitos T después de la activación del receptor de linfocitos T por un antígeno asociado al tumor. Cuando se introducen en los linfocitos T, solamente un pequeño subconjunto de ARNhc de un agrupamiento restablecerá la proliferación de linfocitos T dando como resultado su enriquecimiento dentro de tumores. La sobrerrepresentación de ARNhc activos dentro de cada agrupamiento puede cuantificarse mediante la secuenciación profunda del casete de ARNhc de los tumores y de los órganos linfoides secundarios (FIG. 1).

Animales de experimentación. Se adquirieron ratones C57BL/6, ratones TRP-1 (ratones transgénicos que expresan el receptor de linfocitos T (TCR) específico para proteína 1 relacionada con tirosinasa)23, ratones pmel-1 (ratones transgénicos que expresan TCR específico para gp100)18 y ratones b2m-l-24 en The Jackson Laboratory. Los ratones Ragl-/- OT-I16 se adquirieron en Taconic Farms, Inc. Los ratones se criaron en las instalaciones de animales del Dana-Farber Cancer Institute. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Dana-Farber Cancer Institute.

Estirpes celulares. Los melanomas B16, un tumor agresivo que es difícil de tratar, expresan el antígeno tumoral sustituto Ovoalbúmina (Ova), que es reconocido por los linfocitos T CD8 de ratones transgénicos para receptores de linfocitos T OT-I16,17. Se mantuvieron células de timoma EL438 y melanoma B16-F1015 en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, estreptomicina 100 pg/ml y penicilina 100 pg/ml. Las células tumorales B16 que expresaban ovoalbúmina (B16-Ova) se mantuvieron en el mismo medio con la adición de G418600 pg/ml (Invitrogen).

Vectores y secuencias de ARNhc. Se seleccionaron ARNhc para 255 genes sobreexpresados en linfocitos T disfuncionales (estado anérgico o agotado). Se obtuvo vector pLKO.3G de The RNAi Consortium. Se modificaron vectores pLKO-Thy1.1, pLKO-Ametrina, pLKO-RFP, pLKO-TFP a partir del vector pLKO.3G reemplazando GFP con el gen indicador correspondiente. En la Tabla 3 se proporcionan secuencias de Ppp2r2d y Cblb murinas a las que se dirigen los 10 ARNhc seleccionados (enumeradas por orden de actividad del ARNhc (de mayor a menor)). También se enumera la secuencia diana de LacZ a la que se dirige un ARNhc de control. Todas las demás secuencias diana pueden encontrarse en la Tabla 2.

Tabla 3.

Anticuerpos y citometría de flu jo. Se tiñeron suspensiones unicelulares en PBS, FBS al 2 % con anticuerpos marcados a 4 °C durante 20 minutos, seguido de dos lavados con PBS enfriado con hielo, FBS al 2 %. Las células se analizaron/clasificaron usando un FACSAria (BD Biosciences) y el software FlowJo (TriStar). Los anticuerpos utilizados fueron específicos para CD4, CD8, Va2, VP5.1/5.2, Thy1.1, CD25, CD44, CD62L, CD69, CD122, CD127, IFNy, TNFa (BioLegend), PD-1, TIM-3, LAG-3, granzima B y H-2Kb (BioLegend),Va3.2 (eBioscience), Vp13, Vp14 (BD Biosciences), fosfo-Akt (Ser473) y fosfo-Bad (Ser112) (Cell Signaling). Se detectaron células apoptóticas marcando con anexina V (BioLegend) o con anticuerpo contra caspasa 3 activada (Cell Signaling). Se adquirieron perlas anti-CD3/CD28 de ratón en Invitrogen.

Aislam iento de linfocitos T de tumores. Se cortaron melanomas B16-Ova en trozos pequeños en placas de Petri que contenían 5 ml de PBS, FBS al 2 % y se lavaron con PBS. Se resuspendieron tumores en 15 ml de RPMI suplementado con FBS al 2 %, colagenasa de tipo IV 50 U/ml (Invitrogen), ADNasa 20 U/ml (Roche), las muestras se incubaron a 37 °C durante 2 horas y el tejido se disoció adicionalmente usando un gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotech). Se lavaron las suspensiones tres veces con PBS y se hicieron pasar a través de un colador de 70 pM. Se aislaron linfocitos por centrifugación en gradiente de densidad y después se analizaron o clasificaron por citometría de flujo usando un FACSAria (BD Biosciences).

Apoptosis de linfocitos T. Se transdujeron células OT-I pretratadas con citocinas con ARNhc de LacZ o Ppp2r2d y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. Después de 7 días, se realizó una tinción intracelular usando un anticuerpo contra caspasa 3 activada (Cell Signaling) y los linfocitos T doblemente positivos para CD8/Thy1.1 se regionalizaron en el análisis por FACS. Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica. Se crioconservaron tumores B16-Ova de ratones tratados con linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d (vector que expresa GFP) en un compuesto de temperatura de corte óptima (T.C.T.) (Tissue-Tek). Se permeabilizaron secciones de 10 pm de tumores crioconservados con Tritón X-100 al 0,2 %, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con un anticuerpo contra GFP (Molecular Probes) en combinación con DAPi. Para la detección de TUNEL, se tiñeron secciones con TACs 2 TdT Blue Label (Trevigen) basándose en las instrucciones del fabricante. Las muestras se visualizaron usando un microscopio confocal de barrido láser (Leica SP5X) y se analizaron con el software ImageJ (NIH).

Ensayo de qRT-PCR. Se extrajo ARN total usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). El ARN se transcribió de forma inversa con el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Se realizaron reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real por triplicado usando un instrumento ABI 7900HT con SYBR de color verde (ABI). Se usaron niveles de Rp123 para la normalización. Se usaron los siguientes cebadores: Ppp2r2d directo GGAAGCCGACATCATCTCCAC (SEQ ID NO: 622), Ppp2r2d inverso GTGAGCGCGGCCTTTATTCT (SEQ ID NO: 623); Cblb directo GGTCGCATTTTGGGGATTATTGA (SEQ ID NO: 624), Cblb inverso TTTGGCACAGTCTTACCACTTT (SEQ ID NO: 625); Rp123 directo CTGT GAAGGGAAT CAAGGGA (SEQ ID NO: 626) y Rp123 inverso TGTCGAATTACCACTGCTGG (SEQ ID NO: 627).

Análisis de micromatrices. Se transdujeron linfocitos T OT-I cultivadas con IL-7/IL-15 con uno de los cinco ARNhc experimentales (Ppp2r2d, Arhgap5, Alk, Egr2, Ptpn2) o un ARNhc de control de LacZ. Las células infectadas se clasificaron hasta su pureza usando GFP codificada por el vector como indicador. Se inyectaron linfocitos T (5x106) por vía i.v. en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. Siete días después, se aislaron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc (CD8+GFP+) de tumores y bazos. Las células se clasificaron dos veces con gran pureza y se extrajo el ARN total con el reactivo TRIzol (Invitrogen) para la elaboración de perfiles de expresión génica Affymetrix (Mouse Genome 4302.0 Arrays). Las matrices para cada ARNhc se realizaron por triplicado (6 ratones por grupo).

Análisis en nanopocillo de la producción de citocinas a nivel unicelular

^{M a t e r i a l e s .}Los anticuerpos utilizados para la activación de linfocitos T fueron anti-CD3 de ratón y anti-CD28 de ratón (Biolegend). Los anticuerpos utilizados para capturar las citocinas secretadas fueron anti-IFNY de ratón (Biolegend), anti-IL-2 de ratón (Biolegend), anti-TNFa de ratón (Biolegend) y anti-GM-CSF de ratón (Biolegend). Los anticuerpos de detección fueron anti-IFNY de ratón (Biolegend), anti-IL-2 de ratón (Biolegend), anti-TNFa de ratón (Biolegend) y anti-GM-CSF de ratón (Biolegend), y se marcaron fluorescentemente con los colorantes Alexa Fluor adecuados (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los lípidos utilizados para preparar las bicapas soportadas fueron: 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfotanolamina-W-(caperuza biotinilo) (PE de caperuza biotinilo) (Avanti-Polar Lipids).

^{F a b r i c a c i ó n d e m a t r i c e s e n P D M S d e n a n o p o c i l l o s y p r e p a r a c i ó n d e b i c a p a s l i p í d i c a s s o p o r t a d a s .}La matriz de nanopocillos se fabricó inyectando polidimetilsiloxano (PDMS, Dow Corning) preparado con una relación de peso base/catalizador de 10:1 en un molde construido a medida que contenía un patrón de silicio microestampado. Las matrices de nanopocillos se curaron a 70 °C durante 4-16 h. Cada matriz comprendía 72 x 24 bloques, conteniendo cada uno una submatriz de nanopocillos de 7 x 7 (50 pm x 50 pm x 50 pm) (un total de 84.672 pocillos). Las matrices de PDMS se adhirieron directamente a un portaobjetos de vidrio de 7,62 cm x 2,54 cm (3" x 1") formando una capa de 1 mm de espesor. Se prepararon bicapas lipídicas soportadas como se ha descrito anteriormente 14. Se generaron bicapas aplicando liposomas de DOPC que contenían biotina-Caperuza-lípidos de PE al 2 % en moles en la matriz de PDMS de nanopocillos. Las superficies se aclararon con agua desionizada para retirar el exceso de liposomas. Antes de su uso, la bicapa lipídica se bloqueó con BSA en PBS (100 pg/ml) durante 45 minutos. Después, la bicapa se incubó con 1 pg/ml de estreptavidina en una solución de BSA 100 pg/ml en PBS, seguido de incubación con anticuerpos contra CD3 y CD28 biotinilados. El dispositivo se aclaró abundantemente con PBS antes de añadir las células.

^{M i c r o g r a b a d o .}Se diluyeron anticuerpos de captura en tampón de borato (borato de sodio 50 mM, sacarosa 8 mM y NaCl 50 mM, pH 9,0) a una concentración final de 10 pg/ml y se depositaron en la superficie de portaobjetos modificados con epoxi durante 1 h a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon con leche desnatada al 3 % en PBST (PBS con Tween 20 al 0,05 % (v/v)) durante 30 min a temperatura ambiente y se lavaron con PBS antes de ponerlos en contacto con la matriz de PDMS de nanopocillos. Se dispensó una suspensión de linfocitos T sobre la superficie de los nanopocillos, se modificó con una bicapa lipídica soportada en medio y se dejó que se asentara en los pocillos. La densidad de células suspendidas aplicada a la matriz se optimizó empíricamente para maximizar la ocupación de los pocillos por células individuales (normalmente ~30 % de los pocillos). Después de la incubación de los pocillos cargados con células, se colocó un portaobjetos de vidrio recubierto con anticuerpos de captura sobre la matriz cargada para la captura de citocinas. La micromatriz y el portaobjetos de vidrio se mantuvieron unidos por compresión en una cámara de hibridación (Agilent Technologies, G2534A) y se incubaron durante 1 h a 37 °C con CO²al 5 %. Después, el portaobjetos se separó de la matriz y se colocó en PBS.

Después del micrograbado, los portaobjetos se incubaron durante 30 min con tampón de bloqueo (PBS, BSA 10 mg/ml, Tween-20 al 0,05 % (v/v), suero de ratón al 2 % y azida sódica 2 mM), se lavaron con PBST (PBS+ Tween-20 al 0,05 % v/v) y, después, se incubaron con anticuerpos de detección de fluorescencia a 1 pg/ml durante 45 min a 25 °C. Los portaobjetos se lavaron con PBST y PBS, se aclararon brevemente con agua y se secaron con una corriente de N². Se generaron portaobjetos de referencia al final de cada experimento con los mismos anticuerpos de detección utilizados en los portaobjetos impresos. Para los portaobjetos de referencia, los anticuerpos se diluyeron en agua, se aplicaron puntualmente en portaobjetos de poli-L-lisina en blanco (1 pl/mancha) y los portaobjetos de referencia se secaron al vacío. Los portaobjetos se barrieron usando un explorador de micromatrices Genepix 4200AL (Molecular Devices). La mediana de la intensidad de fluorescencia de cada mancha se extrajo usando Genepix Pro.

^{C i t o m e t r í a b a s a d a e n i m á g e n e s e n c h i p .}Antes de la formación de imágenes, los linfocitos T se tiñeron con tinción de membrana plasmática CellMask™ (Invitrogen, Life Technologies) y SYTOX de color verde (para la detección de células muertas, Life Technologies). Las matrices de nanopocillos cargadas con células se montaron boca arriba en el microscopio con un cubreobjetos colocado encima de la matriz. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio de epifluorescencia invertido automatizado (Carl Zeiss). Se recogieron micrografías de luz transmitida y epifluorescencia bloque por bloque (7 x 7 micropocillos por bloque). La colección de imágenes resultante se analizó usando un programa personalizado para determinar el número de células presentes en cada pocillo y la intensidad de fluorescencia media de cada marcador. Para el análisis se consideraron solamente los linfocitos T viables. Aunque las células expresaban GFP, la intensidad de fluorescencia de GFP era insignificante con el ajuste de obtención del microscopio utilizado en comparación con el SYTOX de color verde, permitiendo la identificación de células muertas.

^{A n á l i s i s d e d a t o s .}Los datos extraídos tanto de la citometría en chip como de las citocinas impresas se aparearon en Microsoft Excel usando identificadores únicos asignados a cada pocillo dentro de la matriz. El conjunto de datos se filtró para incluir los pocillos que contenían solamente células individuales. Para compensar la pérdida de señal y convertir la intensidad de fluorescencia medida para las citocinas capturadas de una célula determinada en una tasa de secreción, se usaron los datos de curvas de calibración patrón (de portaobjetos de referencia) preparadas con cantidades conocidas de anticuerpos de detección para convertir las intensidades medidas en varias moléculas, como se ha descrito anteriormente (Han, Q., et.al., Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab Chip 10, 1391-1400, doi:10.1039/b926849a (2010).

^{E j e m p l o 1 : D e s c u b r i m i e n t o p o r i A R N} in vivo ^{d e d i a n a s i n m u n o t e r á p i c a s}

Se realizaron dos cribados primarios grandes, el primero centrado en genes sobreexpresados en linfocitos T disfuncionales (anergia o agotamiento de linfocitos T; 255 genes, 1.275 ARNhc divididos en dos agolpamientos), y el segundo en cinasas/fosfatasas (1.307 genes, 6.535 ARNhc divididos en siete agolpamientos) (Tabla 4). En estos cribados primarios, cada gen se representó por ~5 ARNhc.

Tabla 4

Se obtuvieron ARNhc dirigidos a 255 genes sobreexpresados en linfocitos T disfuncionales (estado anérgico o agotado)31-37 y 1.307 genes de cinasa/fosfatasa (~5 ARNhc por gen) en The RNAi Consortium (TRC; Broad Institute, Cambridge, m A, EE.UU.). Se crearon nueve agolpamientos y los ARNhc se subclonaron en el vector lentivírico pLKO-Thy1.1. Cada agrupamiento contenía también 85 ARNhc de control negativo (número de ARNhc: GFP, 24; LacZ, 20; luciferasa 25; RFP 16). Se cultivaron linfocitos T OT-I aislados por selección negativa (Stemcell Technologies) con IL-7 (5 ng/ml, Peprotech) e IL-15 (100 ng/ml, Peprotech) en medio RPMI completo (RPMI 1640, FBS al 10 %, HEpES 20 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 0,05 mM, L-glutamina 2 mM, estreptomicina 100 pg/ml y penicilina 100 pg/ml). El día 2, los linfocitos T OT-I se infectaron por rotación con agrupamientos lentivíricos (nueve agrupamientos lentivíricos de ARNhc y un control de vector lentivírico de ARNhc de LacZ) suplementados con sulfato de protamina (5 pg/ml) en placas de 24 pocillos recubiertas con retronectina (5 pg/ml) a una multiplicidad de infección (MOI) de 15. Normalmente, se infectaron ~5x106 linfocitos T OT-1 para cada agrupamiento.

Después de la infección, las células OT-I se cultivaron con IL-7 (2,5 ng/ml), IL-15 (50 ng/ml) e IL-2 (2 ng/ml) en medio RPMI completo. El día 5, los linfocitos T vivos transducidos por ARNhc se enriquecieron usando un kit de retirada de células muertas (Miltenyi) y las células infectadas se seleccionaron positivamente basándose en el marcador Thy1.1 (Stemcell Technologies) hasta alcanzar una positividad de Thy1.1 del 50-60 %. El éxito de la transducción se controló mediante la expresión en superficie del indicador Thy1.1 (FIG. 2). Se inyectaron linfocitos T (5*106) por vía i.v. en ratones C57BL/6 portadores de tumores B16-Ova del día 14 (15 ratones por agrupamiento de ARNhc) (número de animales elegido para proporcionar suficientes células para el aislamiento de linfocitos T y la PCR). Se aisló ADN genómico de 5*106 células OT-I enriquecidas como población de partida para la secuenciación profunda. Siete días más tarde, se aislaron linfocitos T que expresaban ARNhc (CD8+Va2+Vp5+Thy1.1+) por citometría de flujo de tumores, bazos, ganglios linfáticos drenantes de tumores y ganglios linfáticos irrelevantes para el aislamiento de ADN genómico, seguido de la amplificación por PCR del casete de ARNhc. (FIG. 3) Se aisló ADN genómico (Qiagen) y se generaron moldes de secuenciación profunda por PCR del casete de ARNhc. La representación de ARNhc en cada agrupamiento se analizó mediante secuenciación profunda usando un Illumina Genome Analyzer30. Los datos se normalizaron usando el promedio de lecturas de ARNhc de control en cada agrupamiento. Los genes de cinasa/fosfatasa se seleccionaron para el cribado secundario basándose en los niveles de expresión en linfocitos T.

Para determinados genes, los ARNhc estaban sobrerrepresentados en todos los tejidos sometidos a ensayo en comparación con la población de linfocitos T de partida (por ejemplo, SHP-1), lo que indica una proliferación potenciada independiente del reconocimiento de TCR de un antígeno tumoral. Para otros genes, hubo una pérdida selectiva de ARNhc dentro de los tumores (por ejemplo, ZAP-70, una cinasa crítica en la vía de activación de los linfocitos T). Los presentes inventores centraron su análisis en los genes cuyos ARNhc mostraron una sobrerrepresentación sustancial en el tumor pero no en el bazo, un órgano linfoide secundario. Se observó una acumulación sustancial de linfocitos T en los tumores para varios ARNhc, a pesar del ambiente inmunosupresor. Para los cribados secundarios, los presentes inventores crearon agrupamientos focalizados en los que cada gen candidato estaba representado por ~15 ARNhc.

Se muestran datos primarios de este análisis para tres genes en la FIG. 4: LacZ (control negativo), Cblb (una ubiquitina ligasa E3 que induce la internalización de receptores de linfocitos T)19 y Ppp2r2d (no estudiado anteriormente en linfocitos T). Tanto para Ppp2r2d como para Cblb, aumentaron sustancialmente cinco ARNhc en los tumores (color rojo) en comparación con el bazo, mientras que no se observó ningún enriquecimiento para los ARNhc de LacZ. En general, 43 genes cumplían los siguientes criterios: factor de enriquecimiento >4 para 3 o más ARNhc en los tumores en comparació n con el bazo (Tabla 5, FIG. 4, FIG. 5). El conjunto incluía productos génicos identificados anteriormente como inhibidores de la señalización de receptores de linfocitos T (incluyendo Cblb, Dgka, Dgkz, Ptpn2) así como otros inhibidores bien conocidos de la función de los linfocitos T (por ejemplo, Smad2, Socs1, Socs3, Egr2), validando el enfoque de los presentes inventores (Tabla 5, Tabla 6).20-22 La Tabla 5 describe la clasificación funcional de genes candidatos del cribado secundario.

Tabla 5

Se realizaron cribados secundarios centrándose en los genes cuyos ARNhc mostraron una sobrerrepresentación sustancial en el tumor pero no en el bazo, un órgano linfoide secundario. Se observó una acumulación sustancial de linfocitos T en los tumores para varios ARNhc, a pesar del ambiente inmunosupresor. Para estos cribados secundarios, se sintetizaron ~10 ARNhc adicionales para cada gen (IDT) para un total de ~15 ARNhc por gen. Estos agrupamientos concentrados contenían 85 ARNhc de control negativo. Dos ARNhc de control (uno para RFP y otro para la luciferasa) mostraron cierto enriquecimiento en los tumores con respecto al bazo (4,0 y 5,1 veces, respectivamente). El punto de corte en el cribado secundario se definió como >3 ARNhc con un factor de enriquecimiento >4 en el tumor con respecto al bazo. Los resultados del cribado se validaron a nivel celular introduciendo ARNhc individuales en linfocitos T, junto con una proteína indicadora (GFP, TFP, RFP o proteínas fluorescentes Ametrina, Thy1.1). Este enfoque permitió someter a ensayo simultáneamente cinco ARNhc en un animal (tres ratones por grupo). La proliferación de linfocitos T transducidos por ARNhc se visualizó basándose en la dilución de CFSE después de 24 horas así como 3, 5 y 7 días. Además, se realizó una tinción intracelular los días 3, 5 y 7 para IFNy, TNFa y controles de isotipo. Los resultados del cribado primario y secundario de la biblioteca de ARNhc del agrupamiento de linfocitos T se proporcionan en la Tabla 6. Se enumeran los genes para los que al menos 3 ARNhc mostraron un factor de enriquecimiento >4 en los tumores, junto con una breve descripción de su función. Se muestran resultados del cribado secundario de bibliotecas de ARNhc de cinasas y fosfatasas en la Tabla 7.

Tabla 6

Tabla 7

Ejemplo 2: Expansión impulsada por ARNhc de linfocitos T CD4 y CD8 en melanomas B16

Se clonaron ARNhc positivos del análisis de secuenciación profunda en vectores lentivíricos que codificaban cinco proteínas indicadoras diferentes (GFP, TFP, RFP o proteínas fluorescentes Ametrina, Thy1.1). Se transdujeron linfocitos T OT-I pretratados con citocinas con vectores lentivíricos que impulsaban la expresión de un único ARNhc y una proteína indicadora; se mezclaron 1*10® linfocitos T de cada población y se coinyectaron i.v. en ratones C57BL/6 portadores de tumores B16-Ova del día 14. Después de siete días se aislaron linfocitos T de los tumores, bazos y ganglios linfáticos, y se determinó el porcentaje de linfocitos T CD8+Va2+Vp5+ positivos para el indicador por citometría de flujo basada en los indicadores cointroducidos. El factor de enriquecimiento en los tumores en comparación con el bazo se calculó basándose en el porcentaje de linfocitos T OT-I en cada órgano que expresaba un indicador particular. Cuando el ARNhc de LacZ de control se expresó en linfocitos T CD8 OT-I, la frecuencia de linfocitos T OT-I CD8 que expresaban ARNhc fue menor en los tumores en comparación con el bazo (~2 veces). En cambio, los ARNhc experimentales indujeron la acumulación de linfocitos T OT-I CD8 en los tumores pero no en el bazo (FIG. 6, FIG. 7). Para siete de estos ARNhc (por ejemplo, Ppp2r2D, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap8I, Rbks y Egr2), la acumulación de linfocitos T en los tumores fue >10 veces superior con respecto al bazo. El fenotipo más fuerte se observó con ARNhc dirigidos a Ppp2r2d, una subunidad reguladora de la fosfatasa PP2A 7.

Se inyectaron linfocitos T OT-I CD8+ o TRP-1 CD4+ que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. Se identificaron linfocitos T que expresaban ARNhc en los tumores y los bazos usando el indicador Thy1.1 (FIG. 8, % de linfocitos T CD8 Thy1.1+, paneles de la izquierda). El número total de linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d se determinó en los tumores y bazos 7 días después de la transferencia de 2x106 células que expresaban ARNhc (FIG. 8, paneles de la derecha). Se indica el factor de enriquecimiento de linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d frente a LacZ en los tumores. El ARNhc de Ppp2r2d no solamente indujo la acumulación de linfocitos T CD8 OT-I, sino también de linfocitos T CD4 (de ratones transgénicos para TCR TRP-1)23, siendo el número de linfocitos T en los tumores significativamente mayor cuando se expresaba ARNhc de Ppp2r2d en lugar de LacZ (36,3 veces para los linfocitos T CD8; 16,2 veces para los linfocitos T CD4) (FIG. 8).

Enriquecimiento de linfocitos T en los tumores en comparación con el bazo para células que expresaban un panel de ARNhc de Ppp2r2d o Cblb (FIG. 17, paneles superiores). También se midieron los niveles de ARNm de Ppp2r2d y Cblb por qPCR antes de la transferencia de linfocitos T (FIG. 17, paneles inferiores). El mayor enriquecimiento de linfocitos T en los tumores se observó para los ARNhc con una eficiencia de atenuación >80 % a nivel de ARNm (ARNhc n.° 1 y 2 para Ppp2r2d y Cblb). La acumulación de linfocitos T CD8 se correlacionó con el grado de atenuación de Ppp2r2d, y dos ARNhc de Ppp2r2d con la mayor actividad in vivo indujeron los niveles más bajos de ARNm de Ppp2r2d (FIG. 17).

La atenuación de Ppp2r2d también se confirmó a nivel de proteínas usando un enfoque de espectrometría de masas cuantitativa (FIG. 18). Para medir el efecto de la expresión de ARNhc de Ppp2r2d a nivel de proteínas, se usó un enfoque publicado anteriormente para la cuantificación absoluta (AQUA) de proteínas de lisados celulares por espectrometría de masas (Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W. y Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. PNAS, 100, 6940-6945 (2003). Esta estrategia se basa en un enfoque de "control selectivo de la reacción" en el que se usa un péptido sintético con isótopos estables incorporados como patrón interno para el análisis por espectrometría de masas. Se clasificaron células OT-I que expresan ARNhc de LacZ o Ppp2r2d hasta su pureza usando FACS. Las células (1x106) se lisaron en 1 ml de reactivo de extracción MPER (Pierce) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma), EDTA 1 mM y PMSF 1 mM durante 15 minutos en hielo con agitación con formación de vórtice ocasional. Los residuos celulares se retiraron por centrifugación y el sobrenadante proteínico se filtró (filtro de centrífuga SpinX de 0,2 pm, Costar). La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford (Biorad) y el análisis de UV280 nm (instrumento Nanodrop); se separó 0,1 mg de proteínas celulares por SDS-PAGE y se tiñó con el reactivo azul de Coomassie (Pierce). Se cortaron las bandas de gel correspondientes a un intervalo de Pm de 45-60 kDa seguido de la digestión en gel de las proteínas con tripsina. Los péptidos eluidos se adicionaron con 300 fmol de péptidos marcados isotópicamente Ppp2r2d (FFEEPEDPSS[13C-15N-R]-Oh ) (SEQ ID NO: 628) y Actina B (GYSFTTTAE[13C-15N-R]-OH) (SEQ ID NO: 629) (21 st Century Biochemicals) para su cuantificación por LC MS/MS (LTQ XL Orbitrap, Thermo Scientific). El péptido Ppp2r2d se eligió de una región de la proteína que difiere de otras subunidades reguladoras de PP2A. Inicialmente, se analizó una ejecución de LC-MS/MS de una muestra de ARNhc de LacZ para localizar los péptidos Ppp2r2d y Actina B que se estaban controlando. Los péptidos AQUA de cuantificación absoluta se coeluyeron con los correspondientes péptidos endógenos de la columna de fase inversa, pero su mayor PM (10 Da) permitió determinar la relación de intensidad de pico de los péptidos endógenos y AQUA usando abundantes iones de fragmentos peptídicos. Se analizaron muestras por triplicado por SDS-PAGE - LC-MS/MS y se determinó la significación estadística usando el software Graphpad Prism 6.0 usando un ensayo t de Student de dos vías (ensayo F, * p=0,0062).

Se determinó la especificidad de ARNhc de Ppp2r2d. La actividad de ARNhc de Ppp2r2d fue específica porque el fenotipo se invirtió cuando se cointrodujo un ADNc de Ppp2r2d mutado (con la secuencia de proteína de tipo silvestre, pero con la secuencia de ADN mutada en el sitio de unión a ARNhc) con el ARNhc de Ppp2r2d (FIG. 9, 10a-c). Además, los linfocitos T CD8 OT-I sobreexpresaron Ppp2r2d en los tumores en comparación con el bazo (en ausencia de cualquier expresión de ARNhc), lo que sugiere que es un componente intrínseco de la red de señalización que inhibe la función de los linfocitos T en los tumores (FIG. 19).

Los linfocitos T OT-I transducidos con vectores lentivíricos impulsan la expresión de ARNhc de LacZ, ARNhc de Ppp2r2d, ARNhc de Ppp2r2d. Se generó un ADNc de Ppp2r2d mutante con la secuencia de proteína conservada pero con el sitio de unión a ARNhc alterado. Se aisló ADNc de Ppp2r2d de tipo silvestre por RT-PCR usando el cebador directo GGATCCATGGCAGGAGCTGGAGGC (SEQ ID NO: 630) y el cebador inverso: GCTAGCATTAATTTTGTCCTGGAATATATACAAGTTATTGGTGG (SEQ ID NO: 631). La secuencia diana de ARNhc de Ppp2r2d, CCCACATCAGTGCAATGTATT (SEQ ID NO: 632) se mutó a TCCCCACCAATGTAACGTGTT (SEQ ID NO: 633) por PCR solapada (que conserva la secuencia codificante de proteína) usando el cebador directo: TCCATCCCCACCAATGTAACGTGTTTGTTTACAGCAGCAGCAAGG (SEQ ID NO: 634) y el cebador inverso: AAACAAACACGTTACATTGGTGGGGATGGAACTCTGCGGCAGTGA (SEQ ID NO: 635). (FIG. 10a) Se clonaron ADNc de Ppp2r2d tanto de tipo silvestre como mutante en un vector pLKO.3 modificado con una secuencia de péptido de omisión ribosómico 2A-GFP (dando como resultado una expresión estequiométrica de Ppp2r2d y GFP en las células). Se introdujeron construcciones en células de timoma EL4. Se clasificaron células EL4 que expresaban GFP hasta su pureza y después se transdujeron con vectores lentivíricos de ARNhc de LacZ o Ppp2r2d que impulsaban la expresión de un indicador Thy1.1. Se analizaron células (Thy1.1+) transducidas por ARNhc mediante citometría de flujo para la expresión de GFP. El ARNhc de Ppp2r2d redujo los niveles de GFP cuando el Ppp2r2d era de tipo silvestre. El ARNhc de Ppp2r2d no fue capaz de reducir la expresión del indicador de GFP en las células que expresaban el ADNc de Ppp2r2d mutante, demostrando que el sitio de unión a ARNhc se había mutado satisfactoriamente. (FIG. 10a)

La expresión de ADNc mutante de Ppp2r2d también evita el fenotipo inducido por ARNhc de Ppp2r2d. (FIG. 10b) Se clonó ARNhc de Ppp2r2d en la construcción de ADNc de Ppp2r2d mutante-2A-GFP, lo que dio como resultado la coexpresión de ARNhc de Ppp2r2d y de ADNc de Ppp2r2d mutado en un vector. Se infectaron linfocitos T OT-I por separado con lentivirus que codificaban ARNhc de LacZ (Thy1.1), ARNhc de Ppp2r2d (Ametrina) o ARNhc de Ppp2r2d más ADNc de Ppp2r2d mutante (GFP). (FIG. 10b) Estas tres poblaciones después se mezclaron en la misma relación y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. El día 7, se cuantificó cada población de linfocitos T en los tumores y bazos por regionalización en linfocitos T OT-I (CD8+Va2+Vp5+) seguida del análisis de las poblaciones marcadas por la expresión de Thy1.1, Ametrina o GFP. El porcentaje de cada población de linfocitos T en los tumores y bazos se cuantificó por regionalización en linfocitos T Va2+Vp5+; las células transducidas se detectaron basándose en la expresión de indicadores fluorescentes Thy1.1 o Ametrina/GFP y los resultados se muestran en la FIG. 10b. (datos representativos de 2 experimentos independientes, n=3 ratones por experimento).

La FIG. 10c proporciona el análisis por PCR en tiempo real para la expresión de Ppp2r2d en linfocitos T OT-I transducidos con ARNhc de LacZ, ARNhc de Ppp2r2d y ARNhc de Ppp2r2d más ADNc mutante de Ppp2r2d. Además, el ARNhc de Ppp2r2d con la mayor actividad in vivo se asoció a los niveles más bajos de ARNm de Ppp2r2d (FIG. 11).

El análisis de micromatrices de linfocitos T infiltrantes de tumores que expresaban ARNhc experimentales o de control mostró que cada ARNhc indujo un conjunto distinto de cambios en la expresión génica, con cierto solapamiento entre ARNhc particulares (FIG. 12a-c). Dos genes (Egr2 y Ptpn2) tienen funciones conocidas en los linfocitos T. El enriquecimiento en el tumor frente al bazo se calculó basándose en los resultados de la secuenciación profunda del cribado secundario. (FIG. 12a) La agrupación de niveles de expresión medios para los ARNm que se encuentran significativamente regulados por linfocitos T en los bazos o los tumores que expresaban el ARNhc de control de LacZ o uno de los cinco ARNhc experimentales. (FIG. 12b) Las diferencias de expresión significativas se definieron como un valor p de Anova <0,01 entre linfocitos T que expresaban ARNhc de control de LacZ o uno de los cinco ARNhc experimentales (Alk, Arhgap5, Egr2, Ptpn2 o Ppp2r2d) (JMP-Genomics 6.0, SAS Institute Inc.). Se muestran ARNm significativamente regulados en uno o más grupos de tratamiento después de la agrupación (Fast Ward). La FIG. 12c es un diagrama de Venn que muestra solapamientos entre distintivos de expresión de linfocitos T infiltrantes de tumores transducidos con uno de los cinco ARNhc experimentales (los distintivos se definen como un Anova p<0,01 como se ha descrito anteriormente). Se indican los números de ID de sonda solapadas para cualquier combinación de los 5 distintivos, como se indica por los óvalos solapados. Se muestra la significación de los solapamientos frente a los esperados por azar aleatorio (Ensayo Exacta de Fisher) en la tabla adjunta.

Ejemplo 3: Cambios en la función de los linfocitos T inducidos por Ppp2r2d

Para este ejemplo, se examinaron los mecanismos celulares que impulsan la acumulación de linfocitos T por un ARNhc de Ppp2r2d en los tumores, específicamente la infiltración, la acumulación y la apoptosis de los linfocitos T. La infiltración de linfocitos T en los tumores se evaluó por transferencia de linfocitos T c D8 o T-I marcados con un colorante citosólico, CFSE. Se marcaron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ con CFSE y se inyectaron en ratones portadores de tumores B16-Ova. Veinticuatro horas después, se aislaron los linfocitos T transducidas de los tumores y los bazos y se cuantificaron por citometría de flujo. Los linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d se purificaron usando el indicador Thy1.1 y se cultivaron en medio RPMI completo sin citocinas añadidas durante 24 horas. Las células vivas aisladas por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Sigma) se marcaron con CFSE (diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo, Invitrogen) y se inyectaron 2*106 células marcadas en ratones portadores de tumores B16-Ova del día 14. La dilución de CFSE se cuantificó por citometría de flujo a las 24 horas y los días 3, 5 y 7 después de la transferencia. Además, se realizó una tinción intracelular los días 3, 5 y 7 para IFNy, TNFa y controles de isotipo (BD). No se observaron diferencias en la frecuencia de linfocitos T CD8 transducidos por ARNhc de Ppp2r2d o LacZ en los tumores el día 1, lo que argumenta en contra de un efecto sustancial en la infiltración de linfocitos T (FIG.

13a). Sin embargo, el análisis de puntos temporales posteriores (días 3 y 5) demostró un mayor grado de proliferación (basado en la dilución de CFSE) por los linfocitos T transducidas por ARNhc de Ppp2r2d en comparación con LacZ (FIG.

13b, FIG. 20a). Los linfocitos T transducidos por ARNhc de Ppp2r2d también produjeron niveles mayores de interferón-y, una citocina crítica para la inmunidad antitumoral (Fig. 13e). La acción de Ppp2r2d fue corriente abajo con respecto a la activación de receptores de linfocitos T, porque la acumulación de linfocitos T se potenció en los tumores y, en menor medida, en los ganglios linfáticos drenantes de tumores. Por el contrario, no se observó ninguna acumulación en los ganglios linfáticos irrelevantes o en el bazo, donde el antígeno pertinente no se presenta a los linfocitos T (FIG. 15). Incluso se observó un grado sustancial de acumulación de linfocitos T transducidos por ARNhc de LacZ (dilución completa del colorante CFSE el día 7), a pesar de la presencia de un número pequeño de dichas células en los tumores. Esto sugería que los linfocitos T transducidos por ARNhc de LacZ se perdían por apoptosis. De hecho, se marcó un mayor porcentaje de linfocitos T infiltrantes de tumores con un anticuerpo específico para la caspasa-3 activa cuando se expresó ARNhc de control de LacZ (en lugar de ARNhc de Ppp2r2d) (FIG. 13g, FIG. 20b). Además, el cocultivo de linfocitos T CD8 con células tumorales B16-Ova mostró que la mayoría de los linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ se volvían apoptóticos (65,7 %) mientras que la mayoría de los linfocitos T transducidos por ARNhc de Ppp2r2d eran viables (89,5 %, FIG. 13c).

Se purificaron linfocitos T OT-I que expresaban ARNhc de LacZ o Ppp2r2d basándose en la expresión de Thy1.1 y se marcaron con CFSE, como se ha descrito anteriormente. Se cocultivaron linfocitos T OT-I marcados con CFSE (1*105) con 5*104 células B16-Ova por pocillo en una placa de 96 pocillos durante 72 h. Antes del ensayo, las células B16-Ova se expusieron a Ing/ml de IFNy durante 48 horas (para inducir el MHC de clase I, que no se expresa in vitro) y se lavaron tres veces. La apoptosis de los linfocitos T OT-I se detectó por marcaje con anexina V de las células CD8+. (FIG. 13c) La tinción intracelular de fosfo-AKT (Ser473), fopsho-Bad (Ser 112), Bcl-2 y control de isotipo se realizó a las 48 horas usando un kit de tinción intracelular BD. El cocultivo de linfocitos T CD8 con células tumorales B16-Ova mostró que la mayoría de los linfocitos T que expresaban ARNhc de LacZ eran apoptóticos (65,7 %) mientras que la mayoría de los linfocitos T transducidos por ARNhc de Ppp2r2d eran viables (89,5 %, FIG. 13c). Se observó un fenotipo similar cuando los linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d y LacZ se estimularon con anticuerpos contra CD3 inmovilizados en ausencia de coestimulación con CD28 (FIG. 14). Específicamente, se inyectaron células B16-Ova (2*105) s.c. en ratones C57BL/6 hembra (10 semanas de edad). El día 12, los ratones portadores de tumores de tamaño similar se dividieron en 7 grupos (7-8 ratones/grupo). Se inyectaron i.v. los días 12 y 17 linfocitos T TRP-1 CD4 y/u OT-I CD8 activados por perlas anti-CD3/CD28 infectados con vectores de ARNhc de Ppp2r2d o LacZ (2x106 linfocitos T cada uno). Para el tratamiento de los tumores B16, los ratones fueron tratados el día 10 con linfocitos T TRP-1 CD4 y pmel-1 CD8 activados por perlas anti-CD3/CD28 que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ (3x106 linfocitos T cada uno). El tamaño del tumor se midió cada tres días después de la transferencia y se calculó como longitud * anchura. Los ratones con tumores >20 mm en el eje más largo se sacrificaron.

Estos resultados sugieren la posibilidad de que los linfocitos T CD8 transducidos por ARNhc de Ppp2r2d son capaces de proliferar y sobrevivir incluso cuando reconocen su antígeno directamente presentado por las células tumorales B16-Ova. Esta idea se sometió a ensayo por implantación de células tumorales en ratones b2m-/- que son deficientes en la expresión de proteínas de MHC de clase I24. En dichos ratones, solamente las células tumorales, pero no las células presentadoras de antígenos profesionales del hospedador, pudieron presentar antígenos tumorales a los linfocitos T. De hecho, los linfocitos T CD8 OT-I transducidos por ARNhc de Ppp2r2d mostraron una acumulación masiva dentro de los tumores B16-Ova en ratones b2m-/- (FIG. 12f), mientras que había un número muy pequeño de linfocitos T en los tumores B16 contralaterales que carecían de expresión del antígeno Ova. Por lo tanto, los linfocitos T que expresaban un ARNhc de Ppp2r2d pudieron proliferar eficazmente y sobrevivir en respuesta a las células tumorales, a pesar de la carencia de señales coestimuladoras adecuadas y de un microambiente inhibidor.

El análisis ex vivo de linfocitos T infiltrantes de tumores a nivel de una célula individual usando un dispositivo de nanopocillos también demostró que el silenciamiento de Ppp2r2d aumentó la producción de citocinas por los linfocitos T (FIG. 21a-c). Los linfocitos T se activaron durante 3 horas con anticuerpos contra CD3/CD28 en bicapas lipídicas, seguido de 1 hora de captura de citocinas en portaobjetos recubiertos con anticuerpos. Los linfocitos T CD8 mostraron una mayor tasa de secreción para IFNy, IL-2 y GM-CSF, y una mayor fracción de linfocitos T más de una citocina (FIG. 21b, c). La presencia de un mayor número de linfocitos T productores de IFNy se confirmó por tinción intracelular de citocinas (FIG.

21 d, FIG. 20).

La fosfatasa PP2A se compone de una subunidad catalítica y de armazón, y su especificidad de sustrato está determinada por una de las muchas subunidades reguladoras7. Ppp2r2d dirige a PP2A hacia sustratos de Cdk1 durante la interfase y la anafase; de este modo, inhibe la entrada en la mitosis e induce la salida de la mitosis25. PP2A desempeña un papel de guardián de la apoptosis mediada por BAD. BAD fosforilado es secuestrado en su forma inactiva en el citosol por 14-3-3, mientras que el BAD desfosforilado se dirige a las mitocondrias, donde provoca la muerte celular al unirse a BcI-X^ly Bcl-226. También se ha demostrado que las fosfatasas PP2A interactúan con los dominios citoplasmáticos de CD28 y CTLA-4, así como con Carmal (corriente arriba de la vía NF-kB), pero no se sabe qué subunidades reguladoras se requieren para estas actividades; actualmente no hay disponibles anticuerpos contra Ppp2r2d adecuados para los estudios bioquímicos requeridos.

Ejemplo 4: El silenciam iento de Ppp2r2d potencia la actividad antitumoral de los linfocitos T CD4 y CD8

Se evaluó la capacidad de un ARNhc de Ppp2r2d para potenciar la eficacia de la terapia con linfocitos T adoptivos. Se inyectaron células tumorales B16-Ova (2x105) por vía subcutánea en ratones C57BL/6 hembra (10 semanas de edad). El día 12, los ratones portadores de tumores de tamaño similar se dividieron en siete grupos (7-8 ratones/grupo), que no recibieron linfocitos T, recibieron 2x106 linfocitos T CD4 TRP-1 transducidos por ARNhc, 2x106 linfocitos T Cd 8 OT-I infectados por ARNhc, o ambos linfocitos T CD4 y CD8 (día 12 y día 17). De acuerdo con el grupo, los días 12 y 17 se inyectaron i.v. linfocitos T TRP-1 CD4 y/u OT-I CD8 activados por perlas anti-CD3/CD28 infectados con vectores de ARNhc de Ppp2r2d o LacZ (2x106 linfocitos T cada uno). Para el tratamiento de los tumores B16, los ratones fueron tratados el día 10 con linfocitos T TRP-1 CD4 y pmel-1 CD8 activados por perlas anti-CD3/CD28 que expresaban ARNhc de Ppp2r2d o LacZ (3x106 linfocitos T cada uno). El tamaño del tumor se midió cada tres días después de la transferencia y se calculó como longitud * anchura. Los ratones con tumores >20 mm en el eje más largo se sacrificaron. El silenciamiento de Ppp2r2d mejoró la actividad terapéutica de los linfocitos T CD4 y CD8, y se observó un efecto sinérgico cuando se coadministraron linfocitos T CD4 y c D8 transducidos por ARNhc de Ppp2r2d (FIG. 16a, b). Un ARNhc de Ppp2r2d también potenció las respuestas antitumorales cuando se introdujo en linfocitos T específicos para antígenos tumorales endógenos (linfocitos T CD8 pmel-1 y linfocitos T CD4 TRP-1) (FIG. 16c).

Los linfocitos T silenciadas en Ppp2r2d adquirieron un fenotipo efector en los tumores (FIG. 22a) y >30 % de las células expresaron granzima B (FIG. 23a). En consonancia con el gran aumento del número de dichos linfocitos T efectores en los tumores (FIG. 23b), la tinción TUNEL demostró un aumento de la apoptosis en los tumores cuando había presentes linfocitos T que expresaban ARNhc de Ppp2r2d en lugar de LacZ (FIG. 23c). Los melanomas B16 son tumores muy agresivos, en parte porque la expresión de MHC de clase I es muy baja. Curiosamente, los linfocitos T que expresan ARNhc de Ppp2r2d pero no de LacZ aumentaron significativamente la expresión de MHC de clase I (H-2Kb) por las células tumorales (FIG. 23d), posiblemente debido al aumento observado de la secreción de IFNy por los linfocitos T (FIG. 21a -c, FIG. 13e). Un ARNhc de Ppp2r2d no redujo la expresión de receptores de PD-1 o LAG-3 inhibidores en los linfocitos T infiltrantes de tumores, lo que demuestra que su mecanismo de acción es distinto de estos reguladores negativos conocidos de la función de los linfocitos T (FIG. 22b). Este hallazgo sugiere enfoques de combinación dirigidos a estas moléculas intracelulares y de superficie celular.

Estos resultados establecen la viabilidad del descubrimiento in vivo de nuevas dianas para la inmunoterapia en microambientes tisulares complejos. Los inventores han demostrado que es posible descubrir genes con una acción diferencial en los distintos tejidos, como lo ejemplifica la acumulación de linfocitos T en los tumores en comparación con los órganos linfoides secundarios. En el caso de los genes con acción selectiva de tejidos, es probable que la acumulación y la supervivencia de los linfocitos T estén bajo el control del receptor de linfocitos T y, por lo tanto, no se produzcan en los tejidos que carecen de presentación de un antígeno pertinente. Pueden preverse muchas variaciones del enfoque presentado en el presente documento para investigar el control de funciones particulares de las células inmunitarias in vivo. P o r e jem p lo , pod rían in te g ra rse in d ica d o re s flu o re sce n te s para la e xp res ión de c itoc ina s o m o lécu las c ito tó x icas (g ra n z im a B, pe rfo rin a ) en el en fo q u e de los p re sen te s in ven to res para d e s c u b rir ge ne s que con tro la n las fu n c io n e s e fe c to ra s c ríticas de los lin foc itos T en los tum ores .

El direccionamiento a los interruptores reguladores clave puede ofrecer nuevos enfoques para modificar la actividad de los linfocitos T en el cáncer y otras patologías. La eficacia de dichas terapias basadas en linfocitos T podría potenciarse por silenciamiento mediado por ARNhc de genes que inhiben la función de los linfocitos T en el microambiente tumoral. REFERENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un linfocito T que tiene especificidad tumoral que comprende un vector, comprendiendo el vector una secuencia que codifica un ARNhc,

en donde el ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604.

2. El linfocito T de la reivindicación 1, en donde el linfocito T expresa un receptor de linfocitos T específico de tumor.

3. El linfocito T de la reivindicación 1, en donde el linfocito T comprende además un vector que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR),

en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio estimulador.

4. El linfocito T de la reivindicación 3, en donde el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral o un antígeno patógeno, preferentemente, en donde el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), el Antígeno Carcinoembrionario (Ce a ), CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c-Met, Glicolípido F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4.2, CAN, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPYL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL-BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT-SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68 y cualquier combinación de los mismos.

5. El linfocito T de la reivindicación 3, en donde el CAR comprende además un dominio coestimulador.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una secuencia que codifica un ARNhc, en donde

el ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 604, y

en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio estimulador y un dominio coestimulador.

7. El linfocito T de la reivindicación 1 o el ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en donde la secuencia de ARNhc reduce la expresión de Ppp2r2d.

8. El linfocito T de la reivindicación 4 o el ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en donde el dominio de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, preferentemente, en donde el fragmento de unión a antígeno es un Fab o scFv.

9. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en donde el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno tumoral, preferentemente en donde el antígeno tumoral se asocia a un melanoma, carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, cáncer de riñón, de mama, de pulmón, de vejiga, de colon, de ovario, de próstata, de páncreas, de estómago, de cerebro, de cabeza y cuello, de piel, de útero, de testículo, glioma, de esófago y de hígado; y preferentemente

en donde el antígeno tumoral se asocia a un tumor sólido o un tumor linfoide.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6, preferentemente, en donde el vector es un plásmido, un vector lentivírico, un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector vírico adenoasociado; y preferentemente, en donde la secuencia que codifica el ARNh está unida operativamente a un promotor de ARN polimerasa II o a un promotor de ARN polimerasa III.

11. Una composición que comprende el linfocito T de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 11, que comprende además un inhibidor de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzklip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11 r, Fyn, Ype12, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppmlg, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 o Ppp3cc.

13. El linfocito T de la reivindicación 1 o la composición de la reivindicación 11, en donde el linfocito T es un linfocito T CD8+ o CD4+.

14. El linfocito T de la reivindicación 1 o la composición de la reivindicación 11, en donde el linfocito T se selecciona del grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), un linfocito T citolítico natural (NKT), un linfocito T citotóxico (CTL) y un linfocito T CD4, y en donde el antígeno es un antígeno tumoral o patógeno.

15. Un linfocito T humano que alberga la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.

16. Un linfocito T autólogo modificado para expresar un receptor de linfocitos T específico de tumor y un ARNhc o un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un ARNhc o un linfocito T que comprende un vector, codificando el vector un receptor de linfocitos T específico de tumor y un ARNhc o un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una secuencia de ARNhc para tratar el cáncer en un sujeto,

en donde el ARNhc comprende 15 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 604; y

17. Un método para preparar un linfocito T que tiene especificidad tumoral y una resistencia aumentada a la inmunosupresión, que comprende:

proporcionar un linfocito T que tiene especificidad tumoral; e introducir en la célula un vector que comprende una secuencia que codifica un ARNhc,

18. El método de la reivindicación 17, en donde el linfocito T se selecciona del grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), un linfocito T citolítico natural (NKT), un linfocito T citotóxico (CTL) y un linfocito T CD4.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el linfocito T expresa un receptor de linfocitos T específico de tumor.

20. El método de la reivindicación 17, en donde el linfocito T comprende un vector que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR),

21. El linfocito T de la reivindicación 1, en donde la secuencia que codifica el ARNhc comprende una primera secuencia que comprende 15-25, preferentemente 19-25 nucleótidos complementarios a SEQ ID NO: 604 y una segunda secuencia que es el complemento inverso de la primera secuencia con uno o ningún desapareamiento y una tercera secuencia de 5-9 nucleótidos situada entre la primera y segunda secuencias.

22. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 6, en donde la secuencia que codifica el ARNhc comprende una primera secuencia que comprende 15-25, preferentemente 19-25 nucleótidos complementarios a SEQ ID NO: 604 y una segunda secuencia que es el complemento inverso de la primera secuencia con uno o ningún desapareamiento y una tercera secuencia de 5-9 nucleótidos situada entre la primera y segunda secuencias.

23. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 22, en donde la segunda secuencia es perfectamente complementaria a la primera secuencia.