JP2016526883A - 腫瘍細胞による免疫抑制を低下させるための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明の開示は、部分的に、 インビボにおける免疫療法の標的を発見する方法、治療用組成物（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫応答性細胞）、および それらの使用方法を提供する。【選択図】 図１

Description

関連出願

本出願は、２０１４年１月２１日付けで出願された米国仮出願第６１／９２９，８２１号、２０１３年１２月２７日付けで出願された米国仮出願第６１／９２１，３０３号、および２０１３年６月１０日付けで出願された米国仮出願第６１／８３３，２９８号の優先権および利益を主張するものであり、これらの内容は、この参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる。

政府支援
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）から付与された認可番号１Ｒ０１ＣＡ１７３７５０−０１およびＴ３２ＡＩ０７３８６、ならびに国立癌研究所（National Cancer Institute）から付与された認可番号Ｐ３０−ＣＡ１４０５１に基づく政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

本発明は、インビボにおける免疫療法の標的を発見する方法、免疫療法の標的（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを発現する免疫応答性細胞、ならびにいくつかのケースにおいてはがん細胞を標的とする受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））をモジュレートする治療用組成物、および関連する使用方法に関する。

細胞傷害性Ｔ細胞は、免疫介在性のがんの制御において中心的な役割を果たし^１〜３、Ｔ細胞上の阻害性受容体を標的とするモノクローナル抗体は、進行疾患を有する患者において有意な臨床上の利益を誘導することができる^４〜６。腫瘍は、生存のために、それら自身の成長を促進して、宿主の免疫系からうまく逃れて、腫瘍の微環境におけるＴ細胞の活性を効果的にブロックする多数の免疫抑制メカニズムを発達させてきた。このことは、腫瘍細胞に対する細胞傷害機能を有するＣＤ８Ｔ細胞による強い浸潤は複数のタイプのヒトがんにおいて好都合な予後に関連するため^{１、３、８}、腫瘍学における中核的な問題である。この天然の防御機構は、大部分の患者において、腫瘍、その間質、制御性Ｔ細胞および骨髄の細胞集団から放出される複数の阻害シグナルによって著しく鈍くなる^９〜１１。腫瘍回避に関与する様々な分子および細胞免疫抑制メカニズムが同定されている。ある特定のこれらのメカニズムは、免疫系の抗腫瘍性エフェクター細胞を標的とする。しかしながら、免疫抑制性の腫瘍内におけるＴ細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムの多くは、依然として不明である。がん免疫療法の限定的な成功を改善するには、宿主の免疫系を逃れるための腫瘍細胞によって開始される免疫抑制経路を阻害する新しいアプローチが必要である。

本発明の開示は、免疫細胞を不活性化および／または抑制するための腫瘍細胞によって使用される免疫抑制経路を阻害するための標的を提供する。

本開示はまた、治療可能性を有するｓｈＲＮＡに関する組成物および方法も提供する。

本開示はまた、Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる少なくとも１種のｓｈＲＮＡまたは他の核酸分子を発現する、Ｔ細胞などの免疫応答性細胞（例えば、腫瘍抗原を標的とする細胞）も提供する。

本開示はまた、ｓｈＲＮＡおよび腫瘍抗原に向けられた少なくとも１種のキメラ抗原受容体を発現する少なくとも１種のベクターを含む、Ｔ細胞などの免疫応答性細胞も提供する。

いくつかの実施態様において、本開示は、Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができるｓｈＲＮＡをコードするベクターを含む、腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞を提供する。いくつかの形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍特異的なＴ細胞受容体をコードするベクターをさらに含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、免疫応答性細胞は、ＣＡＲをコードするベクターを含み、ここでＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む。いくつかの形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原または病原体抗原と結合する。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲ、ＥＲＢＢ２、ＢＩＲＣ５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＷＤＲ４６、ＢＡＧＥ、ＣＳＡＧ２、ＤＣＴ、ＭＡＧＥＤ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＧＡＧＥ３、ＧＡＧＥ４、ＧＡＧＥ５、ＧＡＧＥ６、ＧＡＧＥ７、ＧＡＧＥ８、ＩＬ１３ＲＡ２、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＣ２、ＴＰ５３、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＳＡＧＥ１、ＳＹＣＰ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＫＲＡＳ、ＰＲＡＭＥ、ＮＲＡＳ、ＡＣＴＮ４、ＣＴＮＮＢ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＥＥＦ２、ＦＮ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＬＰＧＡＴ１、ＭＥ１、ＨＨＡＴ、ＴＲＡＰＰＣ１、ＭＵＭ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＰＡＰＯＬＧ、ＯＳ９、ＰＴＰＲＫ、ＴＰＩ１、ＡＤＦＰ、ＡＦＰ、ＡＩＭ２、ＡＮＸＡ２、ＡＲＴ４、ＣＬＣＡ２、ＣＰＳＦ１、ＰＰＩＢ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＧＦ５、ＣＡ９、ＴＥＲＴ、ＭＧＡＴ５、ＣＥＬ、Ｆ４．２、ＣＡＮ、ＥＴＶ６、ＢＩＲＣ７、ＣＳＦ１、ＯＧＴ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ、ＭＲＰＬ２８、ＦＯＬＨ１、ＲＡＧＥ、ＳＦＭＢＴ１、ＫＡＡＧ１、ＳＡＲＴ１、ＴＳＰＹＬ１、ＳＡＲＴ３、ＳＯＸ１０、ＴＲＧ、ＷＴ１、ＴＡＣＳＴＤ１、ＳＩＬＶ、ＳＣＧＢ２Ａ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＬＡＮＡ、ＧＰＲ１４３、ＯＣＡ２、ＫＬＫ３、ＳＵＰＴ７Ｌ、ＡＲＴＣ１、ＢＲＡＦ、ＣＡＳＰ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＵＢＸＤ５、ＥＦＴＵＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＮＦＹＣ、ＰＲＤＸ５、ＺＵＢＲ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＣＸｏｒｆ６１、ＣＣＤＣ１１０、ＶＥＮＴＸＰ１、ＳＰＡ１７、ＫＬＫ４、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＲＡＢ３８、ＣＣＮＤ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＤＭ２、ＭＭＰ２、ＺＮＦ３９５、ＲＮＦ４３、ＳＣＲＮ１、ＳＴＥＡＰ１、７０７−ＡＰ、ＴＧＦＢＲ２、ＰＸＤＮＬ、ＡＫＡＰ１３、ＰＲＴＮ３、ＰＳＣＡ、ＲＨＡＭＭ、ＡＣＰＰ、ＡＣＲＢＰ、ＬＣＫ、ＲＣＶＲＮ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ１０Ａ、ＳＬＣ４５Ａ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ＣＳＰＧ４、ＲＧＳ５、ＢＣＲ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＡＢＬ−ＢＣＲ、ＤＥＫ、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＮＰＭ１−ＡＬＫ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＳＹＴ−ＳＳＸ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ２、ＦＬＴ３、ＡＢＬ１、ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ、ＦＵＴ１、ＮＰＭ１、ＡＬＫ、ＰＭＬ１、ＲＡＲＡ、ＳＹＴ、ＳＳＸ１、ＭＳＬＮ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＷＮＫ２、ＯＡＳ３、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、ＣＴＳＨ、ＡＢＣＣ３、ＢＳＴ２、ＭＦＧＥ８、ＴＰＢＧ、ＦＭＯＤ、ＸＡＧＥ１、ＲＰＳＡ、ＣＯＴＬ１、ＣＡＬＲ３、ＰＡ２Ｇ４、ＥＺＨ２、ＦＭＮＬ１、ＨＰＳＥ、ＡＰＣ、ＵＢＥ２Ａ、ＢＣＡＰ３１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＩＴＧＢ８、ＲＰＡ１、ＡＢＩ２、ＣＣＮＩ、ＣＤＣ２、ＳＥＰＴ２、ＳＴＡＴ１、ＬＲＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＪＵＰ、ＤＤＲ１、ＩＴＰＲ２、ＨＭＯＸ１、ＴＰＭ４、ＢＡＡＴ、ＤＮＡＪＣ８、ＴＡＰＢＰ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＰＡＧＥ４、ＰＡＫ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＰＴＨＬＨ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１１、ＴＲＰＭ８、ＴＹＭＳ、ＡＴＩＣ、ＰＧＫ１、ＳＯＸ４、ＴＯＲ３Ａ、ＴＲＧＣ２、ＢＴＢＤ２、ＳＬＢＰ、ＥＧＦＲ、ＩＥＲ３、ＴＴＫ、ＬＹ６Ｋ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＧＰＣ３、ＳＬＣ３５Ａ４、ＨＳＭＤ、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＭＦＩ２、ＭＭＰ１４、ＳＤＣＢＰ、ＰＡＲＰ１２、ＭＥＴ、ＣＣＮＢ１、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＰＡＸ３、ＦＯＸＯ１、ＸＢＰ１、ＳＹＮＤ１、ＥＴＶ５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＭＨＡ１、ＴＲＩＭ６８、およびそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。いくつかの形態において、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。このようなＣＡＲの細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインを含有する。

いくつかの実施態様において、ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。

いくつかの実施態様において、本開示は、ｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸分子を提供する。別の実施態様において、本開示は、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供する。さらに別の実施態様において、本開示は、ＣＡＲおよびｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの形態において、ｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、またはＩｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、単離された核酸は、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡをコードする。

いくつかの実施態様において、単離された核酸は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードする。いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインである。

いくつかの実施態様において、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原（例えば、固形腫瘍、リンパ系の腫瘍、黒色腫、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がんに関連する腫瘍抗原）と結合する。

いくつかの実施態様において、本開示は、ｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸、ＣＡＲをコードする単離された核酸、またはＣＡＲおよびｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの形態において、ベクターは、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能なように連結できる。

さらに他の実施態様において、本発明は、本発明に係る免疫応答性細胞、および医薬的に許容されるキャリアーを含む組成物を提供する。

いくつかの実施態様において、本開示は、ＣＡＲをコードする第一のベクターおよびｓｈＲＮＡ配列をコードする第二のベクターでトランスフェクトされた免疫応答性細胞を提供する。いくつかの形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍａｐ３ｋ３、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる。別の形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍特異的なＴ細胞受容体をコードするベクターをさらに含む。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択される。

いくつかの実施態様において、本開示は、対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはＣＡＲおよびｓｈＲＮＡを発現するように改変された自己Ｔ細胞を対象に投与することを含み、ｓｈＲＮＡ配列は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍａｐ３ｋ３、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、上記方法を提供する。いくつかの形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含み；ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。いくつかの形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。

いくつかの実施態様において、本開示は、対象におけるがんの治療方法であって、本発明の腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはＣＡＲおよびｓｈＲＮＡを発現するように改変された自己Ｔ細胞を対象に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに別の実施態様において、本開示は、Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ベクターは、本発明の腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはＣＡＲおよびｓｈＲＮＡ配列をコードする、上記治療方法を提供する。

いくつかの実施態様において、本開示は、免疫応答性Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子の同定方法であって、ｓｈＲＮＡを発現するベクターを内包する免疫応答性Ｔ細胞の集団を用意すること、免疫応答性Ｔ細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること、免疫抑制性の腫瘍内でｓｈＲＮＡがＴ細胞の機能を回復させるかどうかを決定すること、および腫瘍内でＴ細胞の機能を回復させるｓｈＲＮＡに関連する遺伝子を、腫瘍浸潤Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子と同定することを含む、上記同定方法を提供する。

いくつかの実施態様において、本開示は、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法であって、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の活性をモジュレートする治療剤を投与することを含む、上記方法を提供する。

いくつかのケースにおいて、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、配列番号６０４〜６２０または配列番号６５３〜６７７のいずれかに相補的な１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）ヌクレオチドを含む第一の配列および１つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない（すなわち第一の配列に完全に相補的な）第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する５〜９ヌクレオチドの第三の配列を含む。

特に他の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書で説明されるが、当業界において公知の他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、配列、データベースの登録、および他の参考文献は、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含め本明細書を優先させる。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、さらに特許請求の範囲から明らかであると予想される。

図面の説明
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含有する。カラーの図面を含むこの特許または公開特許公報のコピーは、要請と必要料金の支払いに応じて庁により提供される。

図１は、インビボで腫瘍微小環境内におけるＴ細胞の浸潤および蓄積を強化するｓｈＲＮＡを発見するための例示的なアプローチを示す概略図である。 図２は、ｓｈＲＮＡベクターで感染させた後のＲａｇ１−／−／ＯＴ−ＩＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ８^＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。レンチウイルスベクターによってコードされたＴｈｙ１．１レポーターの発現に基づいて、形質導入効率を決定した。次いで、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡを発現するサイトカイン培養Ｔ細胞を、活性化マーカーのパネルで染色した（黒線；アイソタイプ対照、影付き）。感染したＴ細胞の大部分が、セントラルメモリー表現型を示した（ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ４４^＋）。 図３は、ディープシーケンシング分析のために腫瘍および二次リンパ器官からソートしたＯＴ−ＩＴ細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである（ｄＬＮ、腫瘍流入領域リンパ節；ｉｒＬＮ、無関係のリンパ節）。ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔｈｙ１．１^＋細胞をソートし、ｓｈＲＮＡカセットをＰＣＲで増幅するためにゲノムＤＮＡを抽出した。 図４は、インビボにおけるｓｈＲＮＡプールのスクリーニングにより得られたディープシーケンシングデータを示す一連のグラフである。上の列、プール中の、腫瘍、無関係（ｉｒＬＮ）および流入領域リンパ節（ｄＬＮ）中の全ての遺伝子に関する配列の読み取り；下の列、腫瘍、無関係のリンパ節（ｉｒＬＮ）および腫瘍流入領域リンパ節（ｄＬＮ）における３つの個々の遺伝子（ＬａｃＺ、陰性対照）が、脾臓と比較してプロットされる。配列の読み取りは、これらの組織と脾臓とを対比してプロットされる。点線は、ｌｏｇ２での対角線からの偏差を示す。 図５は、Ｔ細胞の機能不全のスクリーニングにより得られたディープシーケンシングデータを示す一連のグラフである。腫瘍（赤色）、無関係のリンパ節（ｉｒＬＮ、青色）および腫瘍流入領域リンパ節（ｄＬＮ、緑色）における、二次スクリーニングで陽性の遺伝子のｓｈＲＮＡ配列決定の読み取り値が、脾臓と比較してプロットされ、点線は、ｌｏｇ２での対角線からの偏差を示す。データから、脾臓またはリンパ節と比較して、腫瘍でこれらの遺伝子を表す特定のｓｈＲＮＡが濃縮されていることを示す。 図６は、脾臓と比較した腫瘍におけるＯＴ−ＩＣＤ８^＋Ｔ細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示すグラフである。ｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔ細胞中のレポータータンパク質でのゲーティングによる腫瘍／脾臓でのフローサイトメトリーによって決定した。ＬａｃＺのｓｈＲＮＡに対する統計的有意性を、試験用ｓｈＲＮＡごとに決定した（腫瘍／脾臓の濃縮倍率（fold enrichment））（ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。 図７は、ｓｈＲＮＡベクター（ＬａｃＺ、Ａｋａｐ８Ｉ、Ｓｍａｄ２、Ｒｂｋｓ、Ｄｇｋｚ）で形質導入された腫瘍における細胞の濃縮の代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。ｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞のパーセンテージを、ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔ細胞中のレポータータンパク質でのゲーティングによる腫瘍／脾臓でのフローサイトメトリーによって決定した。 図８は、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示す一連のグラフである。腫瘍および脾臓において、Ｔｈｙ１．１レポーターを使用して、ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞を同定した（Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ８Ｔ細胞の％、上および下のパネル）。２×１０^６個のｓｈＲＮＡを発現する細胞の移入から７日後に、腫瘍および脾臓において、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の総数を決定した（右のパネル）。腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄ対ＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の濃縮倍率を示す。 図８は、腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮のフローサイトメトリーベースの定量化を示す一連のグラフである。腫瘍および脾臓において、Ｔｈｙ１．１レポーターを使用して、ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞を同定した（Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の％、上および下のパネル）。２×１０^６個のｓｈＲＮＡを発現する細胞の移入から７日後に、腫瘍および脾臓において、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の総数を決定した（右のパネル）。腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄ対ＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の濃縮倍率を示す。 図９は、ｓｈＲＮＡ結合部位が変異しているがタンパク質配列が保存されているＰｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡによる、腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが介在するＴ細胞拡大の逆転を示すグラフである。共発現されたレポーターに基づき３つの細胞集団を同定し、濃縮倍率を、腫瘍対脾臓におけるレポーター陽性の細胞のパーセンテージに基づき計算した。 図１０ａは、タンパク質配列は保存されているがｓｈＲＮＡ結合部位が破壊された変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡの生成を説明する。ＥＬ４細胞に、ＧＦＰも含有するベクターにおける変異または野生型Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡを形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞をソートして純化し、Ｔｈｙ１．１レポーターを発現するＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡベクターで形質導入した。ｓｈＲＮＡが形質導入された（Ｔｈｙ１．１^＋）細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現に関して分析した。変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄではなく野生型Ｐｐｐ２ｒ２ｄが発現された場合、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、ＧＦＰレベルを低減させた。 図１０ｂは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ変異ｃＤＮＡの発現は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡにより誘導された表現型を予防することを実証する。ＯＴ−ＩＴ細胞を、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡと、変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡとをコードするベクターで形質導入した。異なる細胞集団を形質導入効率に関して正規化して、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに共に注射した。腫瘍および脾臓における各Ｔ細胞集団のパーセンテージを、ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔ細胞でのゲーティングによって定量し、形質導入された細胞を、Ｔｈｙ１．１またはアメトリン／ＧＦＰ蛍光レポーターの発現に基づき検出した（２回の独立した実験からの代表的なデータ、実験１回当たりｎ＝３匹のマウス）。 図１０ｃは、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ、およびＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡと、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ変異ｃＤＮＡとで形質導入されたＯＴ−ＩＴ細胞におけるＰｐｐ２ｒ２ｄ発現に関するリアルタイムＰＣＲ分析を示すグラフである。データは生物学的試験の反復（ｎ＝３）の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。 図１１は、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡまたはスクリーニングで同定された３つのＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡのうち１つで形質導入されたＯＴ−ＩＴ細胞におけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｍＲＮＡレベルに関するリアルタイムｑＰＣＲ分析を示すグラフである。 図１２ａは、二次スクリーニングからのディープシーケンシング結果に基づき計算した、特定のｓｈＲＮＡの濃縮を腫瘍対脾臓で示す表である。 図１２ｂは、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡもしくは５つの試験用ｓｈＲＮＡｓのうち１つを発現するＴ細胞または腫瘍によって有意に調節されることが見出されたｍＲＮＡの平均発現レベルのクラスター化を示す。発現の有意差は、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡまたは５つの試験用ｓｈＲＮＡ（Ａｌｋ、Ａｒｈｇａｐ５、Ｅｇｒ２、Ｐｔｐｎ２またはＰｐｐ２ｒ２ｄ）のうち１つを発現するＴ細胞間におけるＡｎｏｖａのｐ値＜０．０１と定義された（ＪＭＰ−ゲノミクス６．０、ＳＡＳインスティテュート社（SAS Institute Inc.））。クラスター化後に、１つまたはそれより多くの治療群において有意に調節されたｍＲＮＡが示される（ファストワード）。 図１２ｃは、５つの試験用ｓｈＲＮＡ（上述したようにＡｎｏｖａでｐ＜０．０１と定義されたシグネチャー）のうち１つで形質導入された腫瘍浸潤Ｔ細胞による発現シグネチャー間のオーバーラップを示すベン図である。オーバーラップする楕円で示されるように、５つのシグネチャーのあらゆる組み合わせで多数のオーバーラップするプローブ番号が示される。添付の表に、無作為抽出により予測されるものに対するオーバーラップの有意性（フィッシャーの正確検定）を示す。 図１３ａは、１日目の腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＣＤ８Ｔ細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。 図１３ｂは、１、３、５、および７日目における、腫瘍中のＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞と比較した、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＣＤ８Ｔ細胞による増殖の程度（ＣＦＳＥ希釈に基づく）を示すグラフの対である。 図１３ｃは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングが、腫瘍細胞と遭遇するときのＴ細胞のアポトーシスを阻害することを示す一連のグラフである。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＴ細胞を、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞と７２時間共培養した。細胞をＣＤ８およびアネキシンＶで染色した。 図１３ｄは、抗アポトーシスタンパク質に関する細胞内染色を示す一連のグラフである。ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞と４８時間共培養し、次いでアイソタイプ対照（灰色）およびホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ｂａｄ（Ｓｅｒ１１２）またはＢｃｌ−２抗体で染色した。 図１３ｅは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄがサイレンシングされたＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の増加を示すグラフである。Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスから単離したＯＴ−ＩＴ細胞を、細胞内染色によってＩＦＮ−γ発現に関してアッセイした。 図１３ｆは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄがサイレンシングされたＴ細胞は、専門の抗原提示細胞による腫瘍抗原の提示がなかったとしても腫瘍で拡大することを示す一連のグラフである。ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６またはｂ２ｍ−／−マウスに移入させた。ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞を、ティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ：teal fluorescent protein）またはＴｈｙ１．１の発現に基づき同定した（脾臓と比較した腫瘍における濃縮倍率）。 図１３ｇは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングが、腫瘍細胞と遭遇するときのＴ細胞のアポトーシスを阻害することを示すグラフである。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＴ細胞を、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞と７２時間共培養した（活性化されたカスパーゼ−３）。 図１４は、ＣＦＳＥで標識され、ＣＤ３抗体で７２時間刺激されたＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を示す一連のグラフである。次いで細胞をＣＤ８およびアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーで分析した。 図１５は、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節ではＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞が蓄積したが、二次リンパ器官では蓄積しないことを示す一連のグラフである。Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞をＣＦＳＥで標識し、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。１、３、５および７日目にＴ細胞を表示された臓器から単離して、ＣＳＦＥ色素の希釈に基づきＴ細胞の蓄積の程度を試験した。 図１６ａは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。Ｔ細胞移入後、３日毎に、２本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。１２日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに、ＣＤ４^＋ＴＲＰ−１および／またはＣＤ８^＋ＯＴ−ＩＴ細胞（２×１０^６個）を移入させた（１２および１７日目）。腫瘍負荷量を査定した。 図１６ｂは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。Ｔ細胞移入後、３日毎に、２本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。１２日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに、ＣＤ４^＋ＴＲＰ−１および／またはＣＤ８^＋ＯＴ−ＩＴ細胞（２×１０^６個）を移入させた（１２および１７日目）。生存率を査定した。 図１６ｃは、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化することを示す一連のグラフである。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ発現を駆動するレンチウイルスで感染させて、Ｂ１６腫瘍を有するマウスに注射した。Ｔ細胞移入後、３日毎に、２本の最長の軸にカリパスを使用して腫瘍のサイズを測定した。ｃ：１０日目のＢ１６腫瘍を有するマウスに、ＣＤ４^＋ＴＲＰ−１およびＣＤ８^＋ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞（３×１０^６個のＣＤ４^＋ＴＲＰ−１プラス３×１０^６個のＣＤ８^＋ｐｍｅｌ−１）を移入させた（１０および１５日目）。グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）バージョン６を使用して、ＬａｃＺ対Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞で治療したマウスの生存を比較することにより、ログランク（マンテル−コックス）検定を行った。 図１７は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＣｂｌｂｓｈＲＮＡのパネルを発現する細胞に関する脾臓と比較した腫瘍におけるＴ細胞濃縮のＦＡＣＳ分析を示す一連のグラフである（上のパネル）。Ｔ細胞移入の前に、Ｐｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した（下のパネル）。データは生物学的試験の反復（ｎ＝３）の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。 図１８は、標識された合成ペプチドを用いたマススペクトロメトリー（ＡＱＵＡ、内因性ペプチドとＡＱＵＡペプチドとの比率）によりＰｐｐ２ｒ２ｄタンパク質定量化を示す一連のグラフである。２回の独立した実験からの代表的なデータ（ａ〜ｄ）；スチューデントの両面ｔ検定、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１；平均±標準偏差。 図１９は、腫瘍浸潤ＯＴ−ＩＴ細胞（７日目）におけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｍＲＮＡに関するｑＰＣＲ分析を示すグラフである。 図２０ａは、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節におけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の増殖を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである。Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＯＴＩ Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識して、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。１、３、５および７日目にＴ細胞を表示された臓器から単離して、Ｔ細胞増殖の程度をＣＦＳＥ希釈に基づき試験した。ＣＦＳＥを希釈しなかったＴ細胞（非分裂細胞）を定量した（右）。 図２０ｂは、腫瘍浸潤Ｔ細胞の生存率を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである。Ｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。７日目にＴ細胞を単離して、アポトーシスを、活性化されたカスパーゼ−３に特異的な抗体を用いた細胞内染色によって査定した（一部のＴ細胞死は、腫瘍からの単離手法によって引き起こされた可能性がある）。 図２０ｃは、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍から回収されたＬａｃＺおよびＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞によるＩＦＮγに関する細胞内サイトカイン染色を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示すグラフである；Ｔ細胞を、注射前にＣＦＳＥで標識した。全ての実験のデータは、２回の独立した試行を代表するものである。統計的分析を生物学的試験の反復（ｎ＝３）で行った；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントの両側ｔ検定。各値は平均±標準偏差を表す。 図２１ａは、ナノウェルデバイス（ピコリットル体積の８４，６７２ウェル）を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤ＯＴ−ＩＴ細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。ナノウェル中の代表的な単一細胞および対応するサイトカイン分泌パターンである。 図２１ｂは、ナノウェルデバイス（ピコリットル体積の８４，６７２ウェル）を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤ＯＴ−ＩＴ細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。表示されたサイトカインを分泌するＴ細胞のパーセンテージである。 図２１ｃは、ナノウェルデバイス（ピコリットル体積の８４，６７２ウェル）を使用した単一細胞レベルでのエクスビボの腫瘍浸潤ＯＴ−ＩＴ細胞によるサイトカイン産生分析を示す一連のグラフである。標準曲線から計算したサイトカイン分泌速度である（平均±標準偏差、マン‐ホイットニー検定、^＊ｐ＜０．０５）。 図２２ａは、養子導入されたＯＴ−Ｉ細胞の大部分が、リンパ節ではメモリー表現型を有するが、腫瘍ではエフェクター表現型を有することを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。サイトカインで前治療した、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現する細胞を、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。移入から７日目に、Ｔ細胞を表示された臓器から回収して、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４抗体で染色した。ＣＤ８／Ｔｈｙ１．１二重陽性細胞でのゲーティングによって、ｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−Ｉ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。 図２２ｂは、疲弊マーカー（exhaustion marker）の分析を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す一連のグラフである。ＯＴ−Ｉ細胞を、マウスの流入領域リンパ節および腫瘍から回収して、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＣＤ２５に特異的な抗体で染色した。全ての実験に関して（ｎ＝３の生物学的試験の反復；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントの両側ｔ検定）；各値は平均±標準偏差を表す。 同上。 図２３ａは、腫瘍流入領域リンパ節および腫瘍中のＯＴ−ＩＴ細胞によるグランザイムＢの細胞内染色を示す一連のグラフである。 図２３ｂは、ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の腫瘍への浸潤を示す画像とグラフの対である。ＯＴ−ＩＴ細胞を、ＧＦＰレポーターをコードするＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡベクターで形質導入して、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。７日間後、腫瘍を切り出し、凍結切片を抗ＧＦＰおよびＤＡＰＩで染色して、腫瘍中のｓｈＲＮＡ発現ＯＴ−ＩＴ細胞の数を数えた。 図２３ｃは、組織切片に行われたタネル（TUNEL）免疫組織化学を示す画像およびグラフの対であり、アポトーシス細胞が定量された。 図２３ｄは、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ発現を示す一連のグラフである。腫瘍をコラゲナーゼで消化して、ＣＤ４５．２およびＨ−２Ｋｂ抗体で染色した。Ｈ−２Ｋｂ発現のＦＡＣＳ分析を、ＣＤ４５．２陰性黒色腫細胞でのゲーティングによって行った。データは生物学的試験の反復（ｎ＝３）の代表値であり、各値は平均±標準偏差を表す。

本発明の開示は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の機能をブロックする遺伝子を同定することを目的とした、プールされた小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をスクリーニングするアプローチを使用することにより、免疫抑制性の腫瘍内におけるＴ細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムを、インビボで系統的に見出すことができるという観察に部分的に基づく。上記の背景の章で説明したように、腫瘍関連の免疫抑制メカニズムは、腫瘍微小環境中でのＴ細胞の活性を活発にブロックする。本明細書で説明される方法は、複数の阻害シグナルがあるにもかかわらず、腫瘍中で安定したＴ細胞の浸潤および蓄積を可能にするｓｈＲＮＡを同定する。後述するように、本方法は、腫瘍による免疫抑制に関与する遺伝子の発現をサイレンシングして、腫瘍における強化されたＴ細胞の浸潤および蓄積およびアポトーシス耐性をもたらすｓｈＲＮＡを同定する。

いくつかの場合において、本開示は、腫瘍微小環境内におけるＴ細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムを具体的に同定するための方法を提供する。これらの方法は、ｓｈＲＮＡを発現するベクターを内包するＴ細胞の集団を用意すること；Ｔ細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること；免疫抑制性の腫瘍内でｓｈＲＮＡがＴ細胞の機能を回復させる（例えば、腫瘍微小環境内で浸潤および増殖するＴ細胞の能力を回復させる）かどうかを決定すること；腫瘍内でＴ細胞の機能を回復させるｓｈＲＮＡに関連する遺伝子を、腫瘍微小環境内でＴ細胞の機能を阻害する遺伝子と同定することを包含し得る。

本開示は、腫瘍の免疫抑制作用を低減させるための標的遺伝子を提供する。標的遺伝子の発現は、免疫細胞、例えば腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞において低減させることができ、標的遺伝子の発現の低減は、腫瘍関連の免疫抑制メカニズムを逃れる細胞の能力を高めることができる。

本開示は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の機能を損なう遺伝子の発現を低減する（例えば、サイレンシングする、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させる）ｓｈＲＮＡを提供する。これらのｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡで形質導入されたＴ細胞の腫瘍への移入、それに続く腫瘍およびリンパ系器官における全てのｓｈＲＮＡの提示を定量するためのディープシーケンシングにより同定された。本明細書で開示された代表的なｓｈＲＮＡとしては、例えば、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃなどの遺伝子の活性を低減するｓｈＲＮＡが挙げられる。

いくつかの場合において、本開示は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の機能をブロックする遺伝子の発現をサイレンシングするｓｈＲＮＡに関する治療用組成物（例えば、単離された核酸分子、ｓｈＲＮＡをコードする核酸分子を発現するベクターを包含する）を提供する。他の形態において、本開示は、本明細書で説明されるｓｈＲＮＡを発現することができるベクターを内包する改変免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および制御性Ｔ細胞など）を提供する。別の形態において、改変免疫応答性細胞は、腫瘍特異的な抗原を標的とする抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現することができるベクターをさらに内包する。

ＲＮＡ干渉
生物医学的調査における最も重要な近年の発見の１つはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路であり、この経路は、多くの遺伝子の活性を調節するための細胞によって使用される。ＲＮＡｉの原理は、治療標的同定に関する多くの新しい可能性を開いてきた。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ゲノム−スケール、遺伝子機能のハイスループット分析にとって有効なツールである。用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）、またはいわゆる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する生物学的プロセスを指す。「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、標的遺伝子、例えば本発明の標的遺伝子の発現に干渉するかまたはそれを阻害するあらゆる薬剤と定義される。このようなＲＮＡ干渉剤としては、これらに限定されないが、標的遺伝子、例えば本発明の標的遺伝子に相同なＲＮＡ分子を包含する核酸分子、またはそれらのフラグメント、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現に干渉するかまたはそれを阻害する小分子が挙げられる。

「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、標的遺伝子と同一であるかまたは高度に類似した配列のＲＮＡを発現または導入させることにより、その標的化された遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的な分解またはＰＴＧＳが起こり、それによって標的遺伝子の発現が阻害されるプロセスである。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞で説明されている。またＲＮＡｉは、核酸分子、例えば合成ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を導入して、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングすることによっても開始される。「標的遺伝子発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子（例えば、本発明のマーカー遺伝子）もしくは標的遺伝子によってコードされたタンパク質、例えば本発明のマーカータンパク質の、発現またはタンパク質活性もしくはレベルにおけるあらゆる減少を包含する。このような減少は、標的遺伝子の発現、またはＲＮＡ干渉剤によって標的化されていない標的遺伝子によってコードされたタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれより高い減少であってもよい。

「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、本明細書では「短鎖干渉」とも記載されており、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する薬剤と定義される。これらは、ＲＮＡｉを誘導し、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）による転写後の遺伝子サイレンシングを起こすためのエフェクター分子である。化学合成可能なｓｉＲＮＡに加えて、転写後遺伝子サイレンシングのための可能性のあるエフェクター分子の形態の様々な他の系が利用可能であり、このような系としては、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖ｄｓＲＮＡ、短鎖一過性ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。これらのエフェクター分子はいずれも、例えばｓｈＲＮＡのケースのようにｓｉＲＮＡにプロセシングされるか、またはｍｉＲＮＡのケースの場合のように直接的に遺伝子サイレンシングを助ける。したがって本発明は、ＲＮＡｉにより転写後遺伝子サイレンシングを達成するための、ｓｈＲＮＡ、加えてＲＮＡの他のあらゆる好適な形態の使用を包含する。ｓｈＲＮＡの使用は、標的遺伝子の抑制が典型的には長期かつ安定的であるという点で、化学合成されたｓｉＲＮＡの使用を超える利点を有する。ｓｉＲＮＡは、化学合成されてもよいし、インビトロでの転写によって生産されてもよいし、または宿主細胞内で発現されたｓｈＲＮＡから生産されてもよい。

一実施態様において、ｓｉＲＮＡは、小ヘアピン（または、いわゆるステムループ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９〜２５ヌクレオチドの）アンチセンス鎖、それに続いて５〜９ヌクレオチドのループ、および相補的センス鎖で構成される。その代わりに、ヌクレオチドループ構造の前にセンス鎖が存在し、その後にアンチセンス鎖が続いてもよい。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスに含有されていてもよい。

ＲＮＡ干渉により誘導された「遺伝子サイレンシング」は、本明細書で使用される場合、細胞における標的遺伝子のｍＲＮＡレベルが、ＲＮＡ干渉が導入されていない細胞で見出されるｍＲＮＡレベルの、少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少していることを指す。好ましい一実施態様において、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少している。

用語「低減した」または「低減する」は、本明細書で使用される場合、一般的に、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少、またはその値を含め最大１００％の減少、または参照レベルと比較して１０〜１００％の間のあらゆる整数値の減少を意味する。

用語「増加した」または「増加する」は、本明細書で使用される場合、一般的に、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の増加、またはその値を含め最大１００％の増加、または参照レベルと比較して１０〜１００％の間のあらゆる整数値の増加、または約２倍、または約３倍、または約４倍、または約５倍または約１０倍の増加、または参照レベルと比較して２倍から１０倍の間のあらゆる増加、またはそれより多くを意味する。

免疫応答性細胞
いくつかの実施態様において、本開示は、抗原を認識する受容体の少なくとも１種を発現する、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、調節性（ＣＤ４）Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫＴ）細胞などの免疫応答性細胞を提供する。いずれかの形態において、免疫応答性細胞は、少なくとも１種の腫瘍特異的な抗原を認識する受容体を発現する。いくつかの形態において、腫瘍細胞抗原特異的なＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬ細胞または他の免疫応答性細胞が使用される。免疫応答性細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、例えば、αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）、γδ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞などが挙げられる。

核酸組成物
いくつかの実施態様において、本開示は、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な少なくとも１２、１５、２０または２５個の連続したヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。またｓｈＲＮＡは、２つの配列が細胞内でプロセシングされて、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７のうち１つによってコードされたタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡを提供することができるステムループｓｈＲＮＡが形成されるような、２つの配列間に位置する連続したヌクレオチド配列および短い配列の逆の相補物、ならびにそれらの組成物も包含する。

表１に、本発明においてＴ細胞の腫瘍免疫抑制に関与すると同定された遺伝子の一覧を示す。
〔表１〕

いくつかの形態において、本組成物の核酸は、表２に提供される配列を標的とするｓｈＲＮＡ配列をコードする。表２はさらに、ディープシーケンシング分析に基づき選択されたｓｈＲＮＡの腫瘍対脾臓における濃縮（「濃縮倍率」）を示す。

〔表２〕

脾臓と比較して腫瘍において少なくとも３種以上のｓｈＲＮＡの濃縮倍率を示すｓｈＲＮＡは、より活性な標的配列領域を示す。

いくつかの形態において、本組成物の核酸は、表２ａに提供されるヒトＰｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂ配列を標的とするｓｈＲＮＡ配列をコードする。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、または３８６に記載の少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一な、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、または３８６に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｐ２ｒ２ｄ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６または１４７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＥｉｆ２ａｋ３標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６または１４７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＥｉｆ２ａｋ３配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＡｒｈｇａｐ５標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＡｒｈｇａｐ５配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、または４９０に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＳｍａｄ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、または４９０に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＳｍａｄ２配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＡｋａｐ８ｌ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＡｋａｐ８ｌ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、または４４５に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＲｂｋｓ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、または４４５に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＲｂｋｓ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、または１３２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＥｇｒ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、または１３２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＥｇｒ２配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６または１１７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＤｇｋａ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６または１１７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＤｇｋａ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＣｂｌｂ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＣｂｌｂ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、または２９９に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＭｄｆｉｃ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、または２９９に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＭｄｆｉｃ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、または１６２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＥｎｔｐｄ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、または１６２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＥｎｔｐｄ１配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、または５８７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＶａｍｐ７標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、または５８７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＶａｍｐ７配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、または２２２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＨｉｐｋ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、または２２２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＨｉｐｋ１配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、または３２９に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＮｕａｋ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、または３２９に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＮｕａｋ２配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＡｌｋ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＡｌｋ配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、または３４１に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｄｚｋ１ｉｐ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、または３４１に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｄｚｋ１ｉｐ１配列に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５２、５３、５４、５５、５６または５７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＢｌｖｒｂ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５２、５３、５４、５５、５６または５７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＢｌｖｒｂに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号８３、８４、８５、８６または８７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＣｄｋｎ２ａ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号８３、８４、８５、８６または８７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＣｄｋｎ２ａに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１７５、１７６または１７７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＦ１１ｒ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１７５、１７６または１７７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＦ１１ｒに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１８７、１９１または１９２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＦｙｎ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号１８７、１９１または１９２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＦｙｎに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２０４、２０５、２０６または２０７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＧｒｋ６標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２０４、２０５、２０６または２０７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＧｒｋ６に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２３２、２３４、２３５、２３６または２３７に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＩｎｐｐ５ｂ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２３２、２３４、２３５、２３６または２３７に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＩｎｐｐ５ｂに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１または２５２に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＩｍｐｋ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１または２５２に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＩｍｐｋに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８または２６９に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＪｕｎ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８または２６９に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＪｕｎに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２８１、２８２、２８３または２８４に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＭａｓｔ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号２８１、２８２、２８３または２８４に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＭａｓｔ２に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３１１、３１２、３１３または３１４に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＮｐｔｘｒ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３１１、３１２、３１３または３１４に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＮｐｔｘｒに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３５１、３５２、３５３、３５４、３５５または３５６に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｋｄ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３５１、３５２、３５３、３５４、３５５または３５６に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｋｄ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３６７、３６８、３６９、３７０または３７１に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｐｍ１ｇ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３６７、３６８、３６９、３７０または３７１に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｐｍ１ｇに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３９９、４００または４０１に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｐｐ３ｃｃ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号３９９、４００または４０１に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｐｐ３ｃｃに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４１４、４１５または４１６に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｒｋａｂ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４１４、４１５または４１６に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｒｋａｂ２に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４２６、４２７、４２８、４２９または４３０に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＰｔｐｎ２標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４２６、４２７、４２８、４２９または４３０に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＰｔｐｎ２に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４５７、４５８、４５９または４６０に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＲｏｃｋ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４５７、４５８、４５９または４６０に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＲｏｃｋ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４７０、４７１、４７２、４７３、４７４または４７５に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＳｂｆ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号４７０、４７１、４７２、４７３、４７４または４７５に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＳｂｆ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９または５１０に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＳｏｃｓ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９または５１０に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＳｏｃｓ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５２４、５２５、５２６、５２７または５２８に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＳｏｃｓ３標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５２４、５２５、５２６、５２７または５２８に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＳｏｃｓ３に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５３９、５４０、５４１、５４２または５４３に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＳｔｋ１７ｂ標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５３９、５４０、５４１、５４２または５４３に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＳｔｋ１７ｂに相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５５６、５５７または５５８に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＴｎｋ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５５６、５５７または５５８に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＴｎｋ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５６９、５７０、５７１、５７２または５７３に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＴｒｐｍ７標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号５６９、５７０、５７１、５７２または５７３に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＴｒｐｍ７に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号６００、６０１、６０２または６０３に記載の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドと同一なＹｅｓ１標的配列に相補的なｓｈＲＮＡ配列をコードする単離された核酸を提供する。

他の実施態様において、本開示は、配列番号６００、６０１、６０２または６０３に記載の、マウス標的配列に対応するヒトＹｅｓ１に相補的な配列を含むｓｈＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。

あらゆる実施態様において、マウス標的配列に対応するヒト配列は、ヒト遺伝子配列に完全に対応する配列であり、例えば、選択されたマウス標的配列の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドが有し得るヌクレオチドミスマッチは、ゼロ、１、２、３または４個である。

単離された核酸は、例えばＤＮＡ分子であってもよく、ただし、天然に存在するゲノム中でそのＤＮＡ分子に隣接して通常見出される核酸配列の１つが、除去されているかまたは存在しない。したがって、単離された核酸としては、これらに限定されないが、他の配列から独立した、別の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成された核酸、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されたゲノムＤＮＡフラグメント）、加えて、ベクター、自律複製型プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはヘルペスウイルス）に取り込まれるＤＮＡ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれるＤＮＡが挙げられる。加えて、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの加工された核酸を包含し得る。例えばｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含有するゲル切片中の数百から数百万の他の核酸のなかに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされないものとする。

配列同一性パーセントの計算では、２つの配列を並べて、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一なマッチの数を決定する。同一なマッチの数を、並べられた領域の長さ（すなわち、並べられたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、１００を掛けて、配列同一性パーセント値を得る。並べられた領域の長さは、最大で最も短い配列の全長サイズの、一方または両方の配列の一部であり得ることが理解されるものと予想される。また、単一の配列は、１つより多くの他の配列と並べることができ、したがって、並べられた領域ごとに異なる配列同一性パーセント値を有する可能性があることも理解されるものと予想される。同一性値のパーセントは、通常、最も近い整数に概算されることに留意する。例えば、７８．１％、７８．２％、７８．３％、および７８．４％は、端数を切り下げて７８％にされ、一方で７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％、および７８．９％は、端数を切り上げて７９％にされる。また、並べられた領域の長さは常に整数であることにも留意する。

用語「配列同一性パーセント」は、本明細書で使用される場合、いずれかの所与のクエリー配列と対象配列との間の同一性の程度を指す。あらゆるクエリー核酸またはアミノ酸配列、例えば転写因子の、別の対象核酸またはアミノ酸配列に対する同一性パーセントは、以下のように決定することができる。

また、用語「相補的ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、「アンチセンス配列」としても知られており、タンパク質をコードする「センス」核酸の配列に完全に相補的な核酸の配列（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的な）を指す。本明細書では、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチドもしくは全遺伝子コード鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む核酸分子が提供される。

用語「ヌクレオチド配列に対応する」は、本明細書で使用される場合、同一な配列をコードする核酸のヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合において、アンチセンスヌクレオチド（核酸）またはｓｉＲＮＡ（阻害的低分子ＲＮＡ）が標的配列にハイブリダイズする場合、特定のアンチセンスまたは阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列は、標的配列に実質的に相補的であり、したがってポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分に特異的に結合すると予想される。そのようなものとして、典型的には、そのような核酸の配列はｍＲＮＡの標的配列に高度に相補的であると予想され、配列全体が有し得るミスマッチの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基以下と予想される。多くの例において、核酸の配列にとって、正確なマッチであること、すなわちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、それゆえに相補的ストレッチにわたりミスマッチがゼロであることが望ましい場合がある。高度に相補的な配列は、典型的にはｍＲＮＡの標的配列領域に極めて特異的に結合し、それゆえに標的ｍＲＮＡ配列のポリペプチド産物への翻訳を低減させること、および／またはさらには阻害することにおいて高度に効率的であると予想される。

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、あらゆるウイルスまたは非ウイルスベクター、加えて二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状の形態のあらゆるプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターを指し、これらは、自己感染性または可動性であってもよいし、またはそうでなくてもよく、さらに、細胞のゲノムに統合することによって原核または真核宿主細胞を形質転換させることもでき、または染色体外に存在していてもよい（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。本発明の実施における使用のために、当業界において公知のあらゆるベクターが想定される。

ベクターは、ウイルスベクターであってもよいし、または非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターは複製欠損型であることが好ましく、このようなウイルスベクターは、例えば複製に関してコードする全てのウイルス核酸を除去することによって得ることができる。複製欠損型ウイルスベクターは、それでもなおその感染特性を保持すると予想され、複製アデノウイルスベクターと類似の方式で細胞に入るが、一度細胞に入ると、複製欠損型ウイルスベクターは複製したりまたは繁殖したりすることはない。またベクターは、リポソームおよびナノ粒子、ならびに細胞にＤＮＡ分子を送達する他の手段も包含する。

用語「ウイルスベクター」は、細胞への核酸コンストラクトのキャリアーとしての、ウイルス、またはウイルス関連ベクターの使用を指す。コンストラクトは、細胞への感染または形質導入のための、非複製欠損ウイルスゲノム、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルスやレンチウイルスベクターなどのその他のものに統合およびパッケージ化されていてもよい。ベクターは、細胞のゲノムに取り込まれてもよいし、またはそうでなくてもよい。

「コード」は、規定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定のアミノ酸配列およびのいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のテンプレートとしてとして役立つ、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列、例えば遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの本来有する特性と、それにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系中でタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖、すなわちそのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列リストに記載されているもの、および非コード鎖、すなわち遺伝子またはｃＤＮＡの転写用のテンプレートとして使用されるものはどちらも、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。

用語「発現」は、本明細書で使用される場合、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。

ベクターが作動可能（operatively）なように結合している遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。したがって、「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む特殊化したベクターである。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞により供給される場合もあるし、またはインビトロでの発現系中で供給される場合もある。発現ベクターは、当業界において公知のあらゆるベクターを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）である。

いくつかの形態において、本開示は、本明細書で説明されるｓｈＲＮＡを発現することができるベクターを内包するように改変され、ＣＡＲを発現するようにさらに改変された細胞を提供する。一形態において、ｓｈＲＮＡおよびＣＡＲは、同じベクターで発現される。別の形態において、ｓｈＲＮＡおよびＣＡＲは、別のベクターで発現される。

いくつかの実施態様において、本明細書で説明される改変細胞は、免疫応答性細胞である。いくつかの形態において、免疫応答性細胞は、抗原を認識する受容体の少なくとも１種を発現する。いずれかの形態において、免疫応答性細胞は、少なくとも１種の腫瘍特異的な抗原を認識する受容体を発現する。いくつかの形態において、腫瘍細胞抗原特異的なＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬ細胞または他の免疫応答性細胞が使用される。免疫応答性細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、例えばαβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）、γδ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞などが挙げられる。

本発明の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬ細胞、またはそれらの前駆細胞）を含む組成物は、がん治療のために、対象に全身供給されてもよいし、または直接供給されてもよい。一実施態様において、本発明の細胞は、目的の臓器（例えば、がんに罹った臓器）に直接注射される。その代わりに、遺伝子改変免疫応答性細胞を含む組成物は、例えば循環系（例えば、腫瘍の血管系）に投与することによって目的の臓器に間接的に供給される。インビトロまたはインビボでＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、ＣＴＬ細胞の産生を増加させるために、細胞への投与の前、その間またはその後に、拡大および分化のための薬剤が供給されてもよい。

改変免疫応答性細胞は、あらゆる生理学的に許容できるビヒクル中で、通常血管内に投与することができるが、これらはまた、細胞が再生および分化にとって適切な部位（例えば、胸腺）を発見することができる骨または他の好都合な部位に導入することもできる。通常、少なくとも１×１０^５個の細胞が投与されると予想され、最終的には１×１０^１０個またはそれより多くに達する。本発明の免疫応答性細胞は、精製した細胞集団を含んでいてもよい。当業者は、様々な周知の方法、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して集団中の遺伝子改変免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。遺伝子改変免疫応答性細胞を含む集団中の好ましい純度の範囲は、約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、および約６５〜約７０％である。より好ましくは、純度は、約７０〜約７５％、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％であり、さらにより好ましくは、純度は、約８５〜約９０％、約９０〜約９５％、および約９５〜約１００％である。投薬量は、当業者によって容易に調整することができる（例えば、純度が低い場合は、投薬量の増加を要する場合がある）。

細胞は、注射、カテーテル、または同種のものによって導入されてもよい。必要に応じて、これらに限定されないが、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１、同様に他のインターロイキン、コロニー刺激因子、例えばＧ−、Ｍ−およびＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン、例えばガンマ−インターフェロンおよびエリスロポイエチンなどの要素が包含されていてもよい。

本発明の組成物は、本発明の免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞および医薬的に許容されるキャリアーを含む医薬組成物を包含する。投与は、自己であってもよいし、または異種であってもよい。例えば、免疫応答性細胞、または前駆細胞を１の対象から得て、同じ対象または異なる適合する対象に投与してもよい。

キメラ抗原受容体
いくつかの場合において、本発明は、腫瘍細胞抗原に向けられた抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、腫瘍細胞抗原を認識する細胞外部分を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである（例えば、抗体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）およびＴ細胞受容体由来の細胞質内のシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメイン。（Kalos Mら、Sci Transl Med．2011年8月10日；3（95））。Kalosらは、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲＴ細胞の生成を説明しており、慢性リンパ球性白血病患者において、ＣＡＲがＴ細胞が介在する有力な抗腫瘍作用を改変したことを実証している。ＣＡＲの特徴としては、Ｔ細胞の特異性および反応性をＭＨＣに制限されない方式で選択された標的にリダイレクトして、モノクローナル抗体の抗原−結合特性を利用するそれらの能力が挙げられる。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、インビボで複製する潜在力を有し、長期持続することから持続的な腫瘍制御を可能にし、繰り返しの抗体注入への必要性を回避する。（Kalos Mら、Sci Transl Med．2011年8月10日；3（95））。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗原プロセシングとは独立した抗原認識能力をもたらし、したがって腫瘍回避の主要なメカニズムを迂回する。その上、有利なことに、ＣＡＲは、Ｔ細胞中で発現されると、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよびベータ鎖と二量体化しない。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、ＷＯ２０１２／０７９０００およびＷＯ２０１２／０９９９９、ならびにMiloneら、2009年、Mol．Ther．17：1453で詳細に説明されている。

ＣＡＲは、標的化される抗原を認識する分子の結合部位（すなわち、「抗原結合ドメイン」）を、リンパ球活性化を引き起こすシグナル伝達の開始に関与する、従来の免疫受容体の１つまたはそれより多くのドメイン（例えば、「刺激性ドメイン」または「シグナル伝達ドメイン」）と組み合わせる。

いくつかの実施態様において、使用される結合部分は、標的化される腫瘍抗原に高親和性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦａｂ（抗原結合）フラグメントの構造由来である。Ｆａｂは２つの遺伝子の生成物であるため、対応する配列は通常、軽鎖由来のペプチド上に重鎖を折り重ねてそれらの天然立体配置を形成する短いリンカーフラグメントを介して組み合わされ、単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）領域が作り出される。

Ｆｖまたは（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでおり、それによりｓｃＦｖは、抗原結合にとって望ましい構造を形成することができる。

いくつかの実施態様において、使用される結合部分は、Ｔ細胞受容体および共刺激分子由来の細胞質内のシグナル伝達ドメイン由来である。

いくつかの実施態様において、ＣＡＲのシグナル伝達部分は通常、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のゼータ（ζ）鎖^２５、またはあまり一般的ではないが免疫グロブリン受容体ＦｃεＲＩのガンマ（γ）鎖^{２６、２７}、またはＣＤ３−イプシロン（ε）鎖^２８の細胞内ドメインを含有し、膜貫通領域は、同じ分子由来である。

いくつかの形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む。本発明のさらなる実施態様は、関連の核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、またはそれらの抗原結合部分、および本発明のＣＡＲに関する医薬組成物を提供する。

一形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞抗原に結合する。用語「腫瘍細胞抗原」または「腫瘍抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫反応を誘導できる腫瘍によって発現されるあらゆるポリペプチドを指す。腫瘍抗原の非限定的な例としては、例えば、前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＴＣＲ、ＥＲＢＢ２、ＢＩＲＣ５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＷＤＲ４６、ＢＡＧＥ、ＣＳＡＧ２、ＤＣＴ、ＭＡＧＥＤ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＧＡＧＥ３、ＧＡＧＥ４、ＧＡＧＥ５、ＧＡＧＥ６、ＧＡＧＥ７、ＧＡＧＥ８、ＩＬ１３ＲＡ２、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＣ２、ＴＰ５３、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＳＡＧＥ１、ＳＹＣＰ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＫＲＡＳ、ＰＲＡＭＥ、ＮＲＡＳ、ＡＣＴＮ４、ＣＴＮＮＢ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＥＥＦ２、ＦＮ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＬＰＧＡＴ１、ＭＥ１、ＨＨＡＴ、ＴＲＡＰＰＣ１、ＭＵＭ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＰＡＰＯＬＧ、ＯＳ９、ＰＴＰＲＫ、ＴＰＩ１、ＡＤＦＰ、ＡＦＰ、ＡＩＭ２、ＡＮＸＡ２、ＡＲＴ４、ＣＬＣＡ２、ＣＰＳＦ１、ＰＰＩＢ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＧＦ５、ＣＡ９、ＴＥＲＴ、ＭＧＡＴ５、ＣＥＬ、Ｆ４．２、ＣＡＮ、ＥＴＶ６、ＢＩＲＣ７、ＣＳＦ１、ＯＧＴ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ、ＭＲＰＬ２８、ＦＯＬＨ１、ＲＡＧＥ、ＳＦＭＢＴ１、ＫＡＡＧ１、ＳＡＲＴ１、ＴＳＰＹＬ１、ＳＡＲＴ３、ＳＯＸ１０、ＴＲＧ、ＷＴ１、ＴＡＣＳＴＤ１、ＳＩＬＶ、ＳＣＧＢ２Ａ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＬＡＮＡ、ＧＰＲ１４３、ＯＣＡ２、ＫＬＫ３、ＳＵＰＴ７Ｌ、ＡＲＴＣ１、ＢＲＡＦ、ＣＡＳＰ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＵＢＸＤ５、ＥＦＴＵＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＮＦＹＣ、ＰＲＤＸ５、ＺＵＢＲ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＣＸｏｒｆ６１、ＣＣＤＣ１１０、ＶＥＮＴＸＰ１、ＳＰＡ１７、ＫＬＫ４、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＲＡＢ３８、ＣＣＮＤ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＤＭ２、ＭＭＰ２、ＺＮＦ３９５、ＲＮＦ４３、ＳＣＲＮ１、ＳＴＥＡＰ１、７０７−ＡＰ、ＴＧＦＢＲ２、ＰＸＤＮＬ、ＡＫＡＰ１３、ＰＲＴＮ３、ＰＳＣＡ、ＲＨＡＭＭ、ＡＣＰＰ、ＡＣＲＢＰ、ＬＣＫ、ＲＣＶＲＮ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ１０Ａ、ＳＬＣ４５Ａ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ＣＳＰＧ４、ＲＧＳ５、ＢＣＲ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＡＢＬ−ＢＣＲ、ＤＥＫ、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＮＰＭ１−ＡＬＫ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＳＹＴ−ＳＳＸ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ２、ＦＬＴ３、ＡＢＬ１、ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ、ＦＵＴ１、ＮＰＭ１、ＡＬＫ、ＰＭＬ１、ＲＡＲＡ、ＳＹＴ、ＳＳＸ１、ＭＳＬＮ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＷＮＫ２、ＯＡＳ３、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、ＣＴＳＨ、ＡＢＣＣ３、ＢＳＴ２、ＭＦＧＥ８、ＴＰＢＧ、ＦＭＯＤ、ＸＡＧＥ１、ＲＰＳＡ、ＣＯＴＬ１、ＣＡＬＲ３、ＰＡ２Ｇ４、ＥＺＨ２、ＦＭＮＬ１、ＨＰＳＥ、ＡＰＣ、ＵＢＥ２Ａ、ＢＣＡＰ３１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＩＴＧＢ８、ＲＰＡ１、ＡＢＩ２、ＣＣＮＩ、ＣＤＣ２、ＳＥＰＴ２、ＳＴＡＴ１、ＬＲＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＪＵＰ、ＤＤＲ１、ＩＴＰＲ２、ＨＭＯＸ１、ＴＰＭ４、ＢＡＡＴ、ＤＮＡＪＣ８、ＴＡＰＢＰ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＰＡＧＥ４、ＰＡＫ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＰＴＨＬＨ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１１、ＴＲＰＭ８、ＴＹＭＳ、ＡＴＩＣ、ＰＧＫ１、ＳＯＸ４、ＴＯＲ３Ａ、ＴＲＧＣ２、ＢＴＢＤ２、ＳＬＢＰ、ＥＧＦＲ、ＩＥＲ３、ＴＴＫ、ＬＹ６Ｋ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＧＰＣ３、ＳＬＣ３５Ａ４、ＨＳＭＤ、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＭＦＩ２、ＭＭＰ１４、ＳＤＣＢＰ、ＰＡＲＰ１２、ＭＥＴ、ＣＣＮＢ１、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＰＡＸ３、ＦＯＸＯ１、ＸＢＰ１、ＳＹＮＤ１、ＥＴＶ５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＭＨＡ１、ＴＲＩＭ６８、およびそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。

本発明は、一般的に、本発明のｓｈＲＮＡおよび望ましいＣＡＲを安定して発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の使用に関する。ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、一般的に、ＣＡＲＴ細胞と称される。ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、本明細書では、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と称される。このような細胞は、好ましくは、その表面上で抗体結合ドメインを安定して発現して、ＭＨＣとは独立した新規の抗原特異性が付与されるように遺伝子改変されていてもよい。いくつかの場合において、Ｔ細胞は、特異的な抗体の抗原認識ドメインを細胞内刺激性ドメイン（例えば、シグナル伝達ドメイン）と組み合わせたＣＡＲを安定して発現するように、遺伝子改変される。したがってＣＡＲは、抗原結合ドメインに加えて、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のゼータ（ζ）鎖、免疫グロブリン受容体ＦｃεＲＩ２６、２７のガンマ（γ）鎖、またはＣＤ３−イプシロン（ε）鎖の細胞内ドメインを包含していてもよい。またＣＡＲは、同じ分子からの膜貫通領域または他のＩ型膜貫通タンパク質、例えばＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８を包含していてもよい。

一実施態様において、本発明のＣＡＲは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質内ドメインを含む。

一実施態様において、ＣＡＲ中のドメインのうち１つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。別の実施態様において、細胞質内ドメインは、刺激性ドメインおよび共刺激ドメインを含むように設計されてもよい。

ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、Ｌｃｋ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ１０などの共刺激分子の細胞質内部分を包含していてもよい。

本開示はまた、養子細胞治療（ＡＣＴ）の方策にも関する。ＡＣＴは、がんを治療するために、患者に治療用リンパ球を投与する手法である。このアプローチは、エクスビボでの腫瘍特異的なＴ細胞リンパ球の生成とそれらの患者への注入を必然的に伴う。リンパ球注入に加えて、例えば、宿主を予め調整すること（放射線または化学療法で）やリンパ球増殖因子（例えばＩＬ−２）を投与することといったＴ細胞の取得およびそれらの免疫反応を支援する他の方法で宿主を処理してもよい。このような腫瘍特異的なリンパ球を生成するための方法の１つは、抗原特異的なＴ細胞の拡大を含むものである。

一実施態様において、本発明は、本発明のｓｈＲＮＡおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成を提供する。改変Ｔ細胞は、１）本明細書で説明される標的遺伝子の発現を低減させることができるｓｈＲＮＡと、２）望ましいＣＡＲとの両方をコードするベクター（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を細胞に導入することによって生成することができる。本発明の改変Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、その結果として、腫瘍制御をもたらすことができる長期持久性が生じる。

一形態において、本開示は、Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる組成物を投与することを含む、がんの治療方法を提供する。一実施態様において、本方法は、本発明のｓｈＲＮＡおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与に関する。一形態において、投与しようとするＴ細胞は、本発明のｓｈＲＮＡおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいＣＡＲをコードするベクターを含む。

医薬製剤
いくつかの場合において、本明細書で開示された治療用組成物は、腫瘍を標的とするＴ細胞に加えて、がんの治療に使用される化合物、薬物、および／または薬剤を包含していてもよい。このような化合物、薬物、および／または薬剤としては、例えば、所与のがんへの免疫反応を刺激する化学療法薬、小分子薬物または抗体を挙げることができる。他の例において、治療用組成物としては、例えば、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させる１種またはそれより多くの小分子阻害剤を挙げることができる。したがって、本発明は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃの、１種またはそれより多くの阻害剤を提供する。

一形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｐｐｐ２ｒ２ｄの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｅｉｆ２ａｋ３の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ａｒｈｇａｐ５の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｓｍａｄ２の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ａｋａｐ８１の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｒｂｋｓの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｅｇｒ２の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｄｇｋａの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｃｂｌｂの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｍａｐ３ｋ３の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１つまたはそれより多くの、ｖＭｄｆｉｃの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｅｎｔｐｄ１の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｄｇｋｚの阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｖａｍｐ７の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｎｕａｋ２の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｈｉｐｋ１の阻害剤を提供する。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ａｌｋの阻害剤を提供する。一実施態様において、Ａｌｋの阻害剤としては、例えば、ＣＨ５４２４８０２（ホフマン−ラロシュ（Hoffmann-La Roche））、ＬＤＫ３７８（ノバルティス（Novartis））、クリゾチニブおよびＰＦ−０２３４１０６６（ファイザー（Pfizer））またはＡＰ２６１１３（アリアド・ファーマシューティカルズ（Ariad Pharmaceuticals））が挙げられる。

別の形態において、本発明は、１種またはそれより多くの、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１の阻害剤を提供する。

いくつかの場合において、治療用組成物は、例えば、サイトカイン、ケモカインおよび他の生物学的なシグナル伝達分子、腫瘍特異的なワクチン、細胞がんワクチン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ導入がん細胞）、腫瘍特異的なモノクローナル抗体、自己および同種幹細胞レスキュー（例えば、移植片対腫瘍効果を増大させるため）、他の治療抗体、分子標的療法、抗血管新生療法、治療目的の感染因子（例えば腫瘍局在細菌）、ならびに遺伝子治療を包含していてもよい。

いくつかの場合において、本明細書で開示される治療用組成物は、医薬組成物として、または医薬組成物中で使用するために製剤化することができる。このような組成物は、あらゆる経路、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認されたあらゆる経路を介した対象への投与のために製剤化または適合させることができる。例示的な方法は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ標準マニュアル、バージョン番号００４（これは、fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmで利用可能である）で説明されている。

いくつかの場合において、医薬組成物は、有効量の１種またはそれより多くのペプチドを包含し得る。用語「有効量」および「治療するのに有効な」は、本明細書で使用される場合、意図した作用または生理学的な転帰をもたらすためにそれを投与している状況において効果的な期間にわたる１種またはそれより多くのペプチドの量または濃度（短期または長期投与および周期的または連続的な投与を包含する）を指す。

本発明の医薬組成物は、あらゆる従来の非毒性の医薬的に許容されるキャリアー、アジュバントまたはビヒクルを含有していてもよい。いくつかのケースにおいて、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を強化するために、調合物のｐＨを、医薬的に許容される酸、塩基または緩衝液で調整してもよい。

方法
いくつかの場合において、方法は、状態または疾患（例えば、がん）を有するかまたは有していたヒト対象の選択を包含し得る。いくつかの場合において、好適な対象としては、例えば、状態または疾患を有するかまたは有していたが、疾患またはその態様が消散して、疾患の症状の低減を示す対象（例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象（例えば、対象の大部分）と比べて）、および／または状態または疾患と共に、例えば無症状の状況で（例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象（例えば、対象の大部分）と比べて）、長期間生存している対象（例えば、同じ状態または疾患を有する他の対象（例えば、対象の大部分）と比べて）が挙げられる。

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、あらゆる動物を指す。いくつかの場合において、対象は、哺乳動物である。いくつかの場合において、用語「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒト（例えば、ヒト、女性、または子供）を指す。本方法で使用するためのサンプルとしては、血清サンプル、例えば選択された対象から得られた血清サンプルが挙げられる。

いくつかの場合において、対象の選択は、対象（例えば、候補対象）からサンプルを得ること、および対象が選択に好適であるという適応に関してサンプルをテストすることを包含していてもよい。いくつかの場合において、健康管理の専門家によって、状態または疾患を過去に有していた、または現在有すると対象を確認または同定することができる。いくつかの場合において、状態または疾患に対する陽性免疫反応の表示は、患者記録、家族歴、および／または陽性免疫反応の適応の検出から作製することができる。いくつかの場合において、対象の選択において複数の団体が包含されてもよい。例えば、第一の団体が、候補対象からサンプルを得てもよいし、第二の団体が、サンプルを試験してもよい。いくつかの場合において、対象は、医師（例えば、一般開業医）により選択および／または紹介されてもよい。いくつかの場合において、対象の選択は、選択された対象からサンプルを得ること、およびサンプルを貯蔵すること、および／または本明細書で開示された方法で使用することを包含し得る。サンプルとしては、例えば、細胞または細胞集団を挙げることができる。

使用方法
いくつかの実施態様において、本開示は、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法を提供する。本開示は、がんを有する対象の治療（治療）に特に有用な療法を提供する。いくつかの場合において、本開示は、対象に、本明細書で開示された組成物を投与することを包含する、治療方法を提供する。

本明細書において、対象におけるがんまたはがんの症状を治療および／または予防するための方法であって、治療有効量のＴ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることができる組成物（例えば、本発明のｓｈＲＮＡおよび腫瘍抗原に向けられた望ましいＣＡＲ発現免疫応答性Ｔ細胞）を対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかのケースにおいて、Ｔ細胞は、治療しようとする患者由来であり、本明細書で説明される標的遺伝子の発現を低減させるＣＡＲおよびｓｈＲＮＡを発現するように改変されている。

いくつかの実施態様において、がんは、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病など、例えば固形およびリンパ系のがん、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がん、例えば肝細胞癌、リンパ腫、例えばＢ急性リンパ芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキット、小細胞、および大細胞リンパ腫）およびホジキンリンパ腫、白血病（例えばＡＭＬ、ＡＬＬ、およびＣＭＬ）、ならびに多発性骨髄腫である。いくつかの実施態様において、がんは、黒色腫である。いくつかの実施態様において、がんは、形質細胞の悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）または形質細胞の前がん状態である。いくつかの実施態様において、対象は、がんを有する、またはがんに罹りやすいと診断されている。

「がん」は、本明細書で使用される場合、ヒトのがんおよび癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病など、例えば固形およびリンパ系のがん、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がん、例えば肝細胞癌、リンパ腫、例えばＢ急性リンパ芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキット、小細胞、および大細胞リンパ腫）およびホジキンリンパ腫、白血病（例えばＡＭＬ、ＡＬＬ、およびＣＭＬ）、ならびに多発性骨髄腫を指す。

用語「抗腫瘍作用」は、本明細書で使用される場合、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、予測寿命の増加、またはがんの状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって証明することができる生物学的作用を指す。また「抗腫瘍作用」は、第一の場所における腫瘍出現の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても証明することができる。

用語「治療（処置）」または「治療すること」は、本明細書で使用される場合、対象が罹っている疾患または状態を、部分的または完全に軽減、抑制、改善、および／または緩和することを指す。いくつかの場合において、治療の結果、対象が罹っている疾患または状態が継続的にない状態にすることができる。

一般的に、方法は、状態または疾患の危険性があるかまたはそれを有する対象を選択することを包含する。いくつかの場合において、対象の状態または疾患は、本明細書で開示された医薬組成物で治療することができる。例えば、いくつかの場合において、方法は、がんを有する対象を選択することを包含し、ここで例えば、対象のがんは、腫瘍内でのＴ細胞の蓄積および浸潤を増加させることによって治療することができる。

いくつかの場合において、治療方法は、対象が罹っている疾患または状態の予防または治療における必要性に応じて、単回投与、複数回投与、および繰り返しの投与を包含し得る。いくつかの場合において、治療方法は、治療の前に、治療中に、および／または治療後に対象における疾患のレベルを査定することを包含し得る。いくつかの場合において、治療は、対象における疾患のレベルの減少が検出されるまで継続することができる。

投与後、対象を評価して、それらの疾患のレベルを検出、査定、または決定することができる。いくつかの場合において、対象における疾患のレベルの変化（例えば、低減）が検出されるまで、治療を継続してもよい。

患者の状態が改善されたら（例えば、対象における疾患のレベルが変化（例えば、減少）したら）、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量を投与してもよい。その後、投薬量もしくは投与頻度、またはそれら両方を、症状に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低減させてもよい。しかしながら、患者は、長期的に、何らかの疾患症状の再発時における間欠式治療を必要とする場合もある。

また、本明細書で開示された方法のいずれかおよび組成物のいずれかを、１種またはそれより多くの治療剤と組み合わせることも本発明の範囲内である。治療剤としては、これらに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤および放射線が挙げられる。

また、従来の療法の用量／毒性を低減させること、および／または従来の療法の感度を増加させることのいずれかによりこのような療法の効能を強化するために、本明細書で開示された方法のいずれかおよび組成物のいずれかを、従来のがん療法や様々な薬物と組み合わせることも本発明の範囲内である。従来の療法の１つは、放射線療法の使用である。別の従来の療法は、化学療法薬の使用であり、化学療法薬は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および抗腫瘍剤に分類することができる。これらの薬物はいずれも、細胞分裂またはＤＮＡ合成に作用して、何らかの方式で機能する。他の従来のがん療法は、ＤＮＡに直接干渉しない薬剤である。本発明と組み合わせるためのこのような薬剤の例としては、例えば、がん細胞成長に関与する特異的な酵素をブロックする「小分子」薬物を挙げることができる。モノクローナル抗体、がんワクチン、血管形成抑制薬、および遺伝子治療は、がん細胞成長にも干渉することから、本明細書で開示された組成物および方法とも組み合わせることが可能な標的療法である。

試験化合物をスクリーニングする方法
がんの治療において有用な薬剤、例えば、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、モジュレートする、または減少させる試験化合物を同定するための、試験化合物、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、無機または有機の大分子または小分子試験化合物をスクリーニングするための方法が、本明細書に包含される。

「小分子」は、本明細書で使用される場合、分子量が約３，０００ダルトン未満の小さい有機または無機分子を指す。本発明に有用な小分子は、一般的に、３，０００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。小分子は、例えば、少なくとも約１００Ｄａ〜約３，０００Ｄａ（例えば、約１００〜約３，０００Ｄａ、約１００〜約２５００Ｄａ、約１００〜約２，０００Ｄａ、約１００〜約１，７５０Ｄａ、約１００〜約１，５００Ｄａ、約１００〜約１，２５０Ｄａ、約１００〜約１，０００Ｄａ、約１００〜約７５０Ｄａ、約１００〜約５００Ｄａ、約２００〜約１５００、約５００〜約１０００、約３００〜約１０００Ｄａ、または約１００〜約２５０Ｄａ）であってもよい。

試験化合物は、例えば、天然産物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリーの構成要素であってもよい。電荷、芳香族性、水素結合、フレキシビリティー、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および剛性などの様々な機能を取り扱うために、多様な分子の一群が使用されると予想される。小分子の合成に好適なコンビナトリアル技術は、例えば、ObrechtおよびVillalgordo、Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries、ペルガモン−エルゼビアサイエンス社（Pergamon-Elsevier Science Limited）（1998）で例示されているように当業界において公知であり、「スプリット・アンド・プール」または「パラレル」合成技術、固相および液相技術、ならびにコーディング技術などの技術が挙げられる（例えば、Czarnik、Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60〜6（1997）を参照）。加えて、多数の小分子ライブラリーが市販されている。多数の好適な小分子試験化合物が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，５０３，７１３号に列挙されている。

本発明の方法を使用してスクリーニングしたライブラリーは、様々なタイプの試験化合物を含むものでもよい。所与のライブラリーは、構造的に関連する、または関連しない試験化合物の一群を含む可能性がある。いくつかの実施態様において、試験化合物は、ペプチドまたはペプチド模擬体分子である。いくつかの実施態様において、試験化合物は、核酸である。

いくつかの実施態様において、試験化合物およびそれらのライブラリーは、第一の試験化合物、例えば、標的ポリペプチドの公知の天然結合パートナーに構造的に類似する第一の試験化合物、または例えば、当業界において公知の方法もしくは本明細書で説明される方法を使用して、標的ポリペプチドに結合できると同定された第一の小分子の構造を変更し、その構造を結果生じた生物活性と関連付けること、例えば、構造−活性相関研究を行うことにより系統的に得ることができる。当業者は理解していると予想されるように、このような構造−活性相関を作り出すための様々な標準的な方法がある。したがって、一部の例では、その作業の大部分を実験的に行う場合もあるが、他の例では、内因性ポリペプチドまたはそれらの部分の三次元構造を、小分子化合物または化合物の合理的な設計のための開始点として使用することができる。例えば、一実施態様において、一般的な小分子ライブラリーは、例えば、本明細書で説明される方法を使用してスクリーニングされる。

いくつかの実施態様において、試験化合物は、テストサンプル、例えば細胞または生きた組織もしくは臓器、例えば目に適用され、試験化合物の１種またはそれより多くの作用が評価される。培養細胞または初代細胞において、例えば、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、モジュレートする、または減少させる試験化合物の能力が評価される。

いくつかの実施態様において、テストサンプルは、本明細書で説明されているようなインビボの障害モデルであるか、またはそれに由来するものである（例えば、それから採取したサンプル）。例えば、動物モデル、例えばラットなどのげっ歯類を使用することができる。

これらの作用のそれぞれを評価するための方法は当業界において公知である。例えば、タンパク質の発現をモジュレートする能力は、遺伝子またはタンパク質レベルで、例えば定量ＰＣＲまたはイムノアッセイ法を使用して評価することができる。いくつかの実施態様において、ハイスループット法、例えば、当業界において公知の通りのタンパク質または遺伝子チップ（例えば、Griffithsら編、Modern genetic Analysisに記載の第12章、Genomics、1999、W. H. Freeman and Company；EkinsおよびChu、Trends in Biotechnology、1999、17:217〜218；MacBeathおよびSchreiber、Science 2000、289（5485）:1760〜1763；Simpson、Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002；Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003を参照）が、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃの活性または遺伝子発現に対する作用を検出するのに使用することができる。

本明細書で説明される方法によりスクリーニングされ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングする、低減させる、除去する、ノックダウンする、ノックアウトする、または減少させることが決定された試験化合物を、候補化合物とみなすことができる。例えばインビボにおけるがんなどの障害のモデルにおいてスクリーニングされ、障害に対して、例えば障害の１つまたはそれより多くの症状に対して望ましい作用を有することが決定された候補化合物を、候補治療剤とみなすことができる。候補治療剤を臨床条件で一度スクリーニングすれば、それは治療剤である。候補化合物、候補治療剤、および治療剤を場合により最適化および／または誘導体化し、生理学的に許容できる添加剤と配合して、医薬組成物を形成してもよい。

したがって、第一のスクリーニングで「ヒット」と同定された試験化合物（例えば、免疫細胞を不活性化および／または抑制するために腫瘍細胞が使用する免疫抑制経路を阻害する試験化合物）を選択し、例えば合理的設計を使用して、結合親和性、結合活性、特異性、または他のパラメーターが最適化されるように系統的に変更することができる。このような最適化はまた、本明細書で説明される方法を使用するためにスクリーニングされてもよい。したがって、一実施態様において、本発明は、当業界において公知の方法および／または本明細書で説明される方法を使用して、化合物の第一のライブラリーをスクリーニングすること、そのライブラリーにおいて１つまたはそれより多くのヒットを同定すること、そのようなヒットを系統的に構造変更させて、そのヒットに構造的に関連した化合物の第二のライブラリーを作り出すこと、および本明細書で説明される方法を使用して第二のライブラリーをスクリーニングすることを包含する。

以下の実施例において本発明をさらに説明するが、実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。

近年の研究から、細胞傷害性Ｔ細胞は、免疫介在性のがんの制御において中心的な役割を果たし^１〜３、Ｔ細胞上の阻害性受容体を標的とするモノクローナル抗体は、進行疾患を有する患者において有意な臨床上の利益を誘導することができることが示されている^４〜６。しかしながら、免疫抑制性の腫瘍内におけるＴ細胞機能の喪失を引き起こす調節メカニズムの多くが依然として未知のままである。以下の実施例において、本発明者らは、腫瘍微小環境においてこのような調節メカニズムをインビボで系統的に見出すことができることを実証する。本発明者らは、主要な阻害剤を標的とするｓｈＲＮＡが、複数の阻害シグナルがあるにもかかわらず、腫瘍中で安定したＴ細胞の浸潤および蓄積を可能にするであろうと仮定した。腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の機能をブロックする遺伝子を同定することを目的としたプールｓｈＲＮＡスクリーニングアプローチを使用して、ｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞を腫瘍を有するマウスに移入し、続いてディープシーケンシングして腫瘍およびリンパ系器官における全てのヘアピンの出現を定量することにより、候補ｓｈＲＮＡを発見した。ｓｈＲＮＡの大部分が、腫瘍ではＴ細胞の蓄積を誘導したが、脾臓では誘導しなかったことから、組織各所で示差的な作用を有するｓｈＲＮＡを発見する実行可能性が実証された。標的の１つは、ＰＰ２Ａホスファターゼの調節サブユニットであるＰｐｐ２ｒ２ｄであった^７。対照ｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞は、黒色腫細胞を認識するとアポトーシスを起こしたが、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞は、強化された増殖およびアポトーシス耐性のために腫瘍で蓄積された。またＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞は、腫瘍増殖も顕著に遅らせた。このインビボでのアプローチは、関連組織の微小環境における複雑な免疫機能を詳細に分析するための広範な用途を有する。

免疫細胞は、全身にわたり複雑な監視機能を実行し、別個の組織微小環境で多くの様々なタイプの細胞と相互作用する。免疫反応をモジュレートするための治療標的は、典型的にはインビトロで同定され、プロセス後期において動物モデルでテストされる。ここで本発明者らは、どのようにして免疫調節のための標的をインビボで系統的に見出すことができるかという課題に取り組んだ。このことは、腫瘍細胞に対する細胞傷害機能を有するＣＤ８Ｔ細胞による強い浸潤は複数のタイプのヒトがんにおいて好都合な予後に関連するため、腫瘍学における中核的な問題である^{１、３、８}。残念ながら、この天然の防御機構は、大部分の患者において、腫瘍、その間質、制御性Ｔ細胞および骨髄の細胞集団から放出される複数の阻害シグナルによって著しく鈍くなる^９〜１１。

プールされたｓｈＲＮＡライブラリーは、強力な発見ツールであることが示された^{１２〜１４}。本発明者らは、腫瘍関連抗原によるＴ細胞受容体の誘発後のＴ細胞の大規模な増殖能を利用して、ＣＤ８Ｔ細胞の機能を回復させることができるｓｈＲＮＡをインビボで系統的に見出すことができると推論した。プールからのごく一部のｓｈＲＮＡの部分集合が、Ｔ細胞に導入されると、Ｔ細胞の増殖を回復させて、結果として腫瘍内におけるそれらの濃縮をもたらすと予想される。各プール中の活性ｓｈＲＮＡの過剰出現は、腫瘍および二次リンパ器官からのｓｈＲＮＡカセットをディープシーケンシングすることによって定量することができる（図１）。

実験動物。Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＴＲＰ−１マウス（チロシナーゼ関連タンパク質１に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するトランスジェニックマウス）^２３、ｐｍｅｌ−１マウス（ｇｐ１００に特異的なＴＣＲを発現するトランスジェニックマウス）^１８、およびｂ２ｍ−／−マウス^２４を、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory）から購入した。Ｒａｇ１−／−ＯＴ−Ｉマウス^１６を、タコニック・ファーム社（Taconic Farms, Inc.）から購入した。ダナ−ファーバー癌研究所（Dana-Farber Cancer Institute）の動物施設でマウスを飼育した。全ての実験手法は、ダナ−ファーバー癌研究所の動物管理使用委員会によって承認された。

細胞株。治療困難な高侵襲性の腫瘍であるＢ１６黒色腫は、ＯＴ−ＩＴ細胞受容体トランスジェニックマウスからのＣＤ８Ｔ細胞によって認識される代用の腫瘍抗原オバルブミン（Ｏｖａ）を発現する^{１６，１７}。ＥＬ４胸腺腫^３８およびＢ１６−Ｆ１０黒色腫^１５細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのペニシリンが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で維持した。６００μｇ／ｍＬのＧ４１８（インビトロジェン（Invitrogen））が添加された同じ培地中で、オバルブミンを発現するＢ１６腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｏｖａ）を維持した。

ベクターおよびｓｈＲＮＡ配列。機能不全性のＴ細胞（アネルギーまたは疲弊）で過剰発現された２５５種の遺伝子に関してｓｈＲＮＡを選択した。ＲＮＡｉコンソーシアムからｐＬＫＯ．３Ｇベクターを得た。ＧＦＰを対応するレポーター遺伝子で置き換えてｐＬＫＯ．３Ｇベクターを改造することにより、ｐＬＫＯ−Ｔｈｙ１．１、ｐＬＫＯ−アメトリン、ｐＬＫＯ−ＲＦＰ、ｐＬＫＯ−ＴＦＰベクターを得た。表３に、１０種の選択されたｓｈＲＮＡによって標的化されたマウスのＰｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂ配列を示す（ｓｈＲＮＡ活性の順に（最大から最小に）列挙）。対照ｓｈＲＮＡによって標的化されたＬａｃＺ標的配列も列挙する。全ての他の標的配列は、表２で見ることができる。

抗体およびフローサイトメトリー。単一細胞の懸濁液を、ＰＢＳ、２％ＦＢＳ中で、標識抗体で４℃で２０分間染色し、続いて氷冷ＰＢＳ、２％ＦＢＳで２回洗浄した。ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（トリスター（TriStar））を使用して細胞を分析／ソートした。使用された抗体は、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｖα２、Ｖβ５．１／５．２、Ｔｈｙ１．１、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＩＦＮγ、ＴＮＦα（バイオレジェンド（BioLegend））、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、グランザイムＢ、およびＨ−２Ｋｂ（バイオレジェンド）、Ｖα３．２（イーバイオサイエンス（eBioscience））、Ｖβ１３、Ｖβ１４（ＢＤバイオサイエンス）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびホスホ−Ｂａｄ（Ｓｅｒ１１２）（セル・シグナリング（Cell Signaling））に特異的なものであった。アネキシンＶ（バイオレジェンド）または活性化されたカスパーゼ−３抗体（セル・シグナリング）で標識することによってアポトーシス細胞を検出した。マウス抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、インビトロジェン（Invitrogen）から購入した。

腫瘍からのＴ細胞の単離。５ｍＬのＰＢＳ、２％ＦＢＳを含有するペトリ皿中でＢ１６−Ｏｖａ黒色腫を小片に切断し、ＰＢＳで洗浄した。２％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ（インビトロジェン）、２０Ｕ／ｍＬのＤＮアーゼ（ロシュ（Roche））が補充されたＲＰＭＩ（１５ｍＬ）中に腫瘍を再懸濁し、サンプルを３７℃で２時間インキュベートし、ジェントルＭＡＣＳディソシエーター（gentleMACS Dissociator）（ミルテニー・バイオテク（Miltenyi Biotech））を使用して組織をさらに解離させた。懸濁液をでＰＢＳ３回洗浄し、７０μＭのろ過器を通過させた。密度勾配遠心分離によってリンパ球を単離し、次いでＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス）を使用したフローサイトメトリーによって分析またはソートのどちらかを行った。

Ｔ細胞アポトーシス。サイトカインで前治療したＯＴ−Ｉ細胞を、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡで形質導入し、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。７日後、活性化されたカスパーゼ−３抗体（セル・シグナリング）を使用して細胞内染色を行い、ＦＡＣＳ分析でＣＤ８／Ｔｈｙ１．１二重陽性Ｔ細胞をゲーティングした。

免疫蛍光法および免疫組織化学。ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞（ＧＦＰ発現ベクター）で治療したマウスからのＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を、最適切削温度 （O.C.T.：optimal cutting temperature）化合物（ティシュー・テック（Tissue-Tek））中で低温保存した。低温保存した腫瘍からの１０μｍの切片を０．２％トリトン（Triton）Ｘ−１００で膜透過化し、４％パラホルムアルデヒド中で固定して、ＤＡＰＩと組み合わせたＧＦＰ抗体（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））で染色した。タネル検出のために、ＴＡＣＳ２ＴｄＴブルー標識（トレビゲン（Trevigen））で製造元の指示に基づき切片を染色した。レーザー走査共焦点顕微鏡（ライカ（Leica）ＳＰ５Ｘ）を使用してサンプルを可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて分析した。

ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ハイキャパシティーｃＤＮＡ逆転写キット（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））でＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ７９００ＨＴ機器をＳＹＢＲグリーン（ＡＢＩ）と共に使用してリアルタイム定量ＰＣＲ反応を３連で行った。正規化のためにＲｐｌ２３のレベルを使用した。以下のプライマーを使用した：Ｐｐｐ２ｒ２ｄフォワードＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号６２２）、Ｐｐｐ２ｒ２ｄリバースＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＣＴ（配列番号６２３）；ＣｂｌｂフォワードＧＧＴＣＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＡ（配列番号６２４）、ＣｂｌｂリバースＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴ（配列番号６２５）；Ｒｐｌ２３フォワードＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＧＡ（配列番号６２６）およびＲｐｌ２３リバースＴＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号６２７）。

マイクロアレイ分析。ＩＬ−７／ＩＬ−１５と培養したＯＴ−ＩＴ細胞を、５種の試験用ｓｈＲＮＡ（Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ａｒｈｇａｐ５、Ａｌｋ、Ｅｇｒ２、Ｐｔｐｎ２）のうち１種またはＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡで形質導入した。感染細胞を、レポーターとしてベクターによってコードされたＧＦＰを使用してソートして純化した。１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスにＴ細胞（５×１０^６個）を静脈内注射した。７日後、ｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞（ＣＤ８＋ＧＦＰ＋）を腫瘍および脾臓から単離した。細胞を２回ソートして高純度にし、アフィメトリックス（Affymetrix）の遺伝子発現プロファイリング（マウスゲノム４３０ ２．０アレイ）用に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。各ｓｈＲＮＡのアレイを３連で実行した（マウス６匹／グループ）。

単一細胞レベルでのナノウェルにおけるサイトカイン産生分析
材料。Ｔ細胞活性化に使用された抗体は、抗マウスＣＤ３および抗マウスＣＤ２８（バイオレジェンド）であった。分泌されたサイトカインを捕獲するのに使用された抗体は、抗マウスＩＦＮγ（バイオレジェンド）、抗マウスＩＬ−２（バイオレジェンド）、抗マウスＴＮＦα（バイオレジェンド）および抗マウスＧＭ−ＣＳＦ（バイオレジェンド）であった。検出抗体は、抗マウスＩＦＮγ（バイオレジェンド）、抗マウスＩＬ−２（バイオレジェンド）、抗マウスＴＮＦα（バイオレジェンド）および抗マウスＧＭ−ＣＳＦ（バイオレジェンド）であり、これらを、適切なアレクサフルオロ（Alexa Fluor）色素（インビトロジェン）で製造元の説明書に従って蛍光標識した。支持された二重層を調製するのに使用された脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ｃａｐビオチニル）（ビオチニルＣａｐ ＰＥ）（アバンティ・ポーラー・リピッド（Avanti Polar Lipids））であった。

ナノウェルのＰＤＭＳアレイの製作および支持された脂質二重層の調製。１０：１のベース／触媒重量比に調製されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、ダウ・コーニング（Dow Corning））を、マイクロパターンを有するシリコンマスターを包み込む特注の型に注入することによってナノウェルのアレイを製造した。ナノウェルのアレイを７０℃で４〜１６時間硬化した。各アレイは７２×２４個のブロックで構成され、それぞれ７×７（５０μｍ×５０μｍ×５０μｍ）個のナノウェルのサブアレイを含有する（合計８４，６７２ウェル）。ＰＤＭＳアレイを３インチ×１インチのスライドガラスに直接接着させ、厚さ１ｍｍの層を形成した。支持された脂質二重層を、上述したようにして（１４）調製した。ナノウェルのＰＤＭＳアレイに２モル％ビオチン−Ｃａｐ−ＰＥ脂質を含有するＤＯＰＣリポソームを適用することによって二重層を生成した。表面を脱イオン水で濯いで、過量のリポソームを除去した。使用前、脂質二重層をＰＢＳ中のＢＳＡ（１００μｇ／ｍＬ）で４５分間ブロックした。次いで二重層を、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡのＰＢＳ溶液中で１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンとインキュベートし、続いてビオチン化ＣＤ３およびＣＤ２８抗体とインキュベートした。細胞を添加する前、デバイスを広範囲にわたりＰＢＳで濯いだ。

マイクロエングレービング（Microengraving）。ホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、８ｍＭスクロース、および５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０）で捕捉抗体を１０μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈し、エポキシ改変スライドの表面上に室温で１時間堆積させた。スライドを、ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン（Tween）２０を含むＰＢＳ）中の３％無脂肪乳で室温で３０分間ブロックし、ＰＢＳで洗浄し、その後、それらをナノウェルのＰＤＭＳアレイとの接触に適用した。Ｔ細胞の懸濁液をナノウェル表面上に分配し、媒体中の支持された脂質二重層で改変して、そのままウェルに定着させた。アレイに適用された懸濁細胞の密度を経験的に最適化して、単一細胞によるウェルの占有率を最大化した（典型的にはウェルの約３０％）。細胞がローディングされたウェルをインキュベートした後、捕捉抗体でコーティングされたスライドガラスを、サイトカイン捕捉のためにローディング済みアレイに設置した。マイクロアレイとスライドガラスとを、ハイブリダイゼーションチャンバー（アジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies）、Ｇ２５３４Ａ）中での圧縮によって一体化し、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。次いでスライドガラスをアレイから分離し、ＰＢＳ中に入れた。

マイクロエングレービング後、スライドを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０、２％マウス血清および２ｍＭアジ化ナトリウム）と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖトゥイーン−２０）で洗浄し、次いで１μｇ／ｍＬの蛍光検出抗体と共に２５℃で４５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳＴおよびＰＢＳで洗浄し、水で簡単に濯ぎ、Ｎ_２ストリームを用いて乾燥させた。各実験の最後に、プリントされたスライドに使用された同じ検出抗体を用いて参照スライドを生成した。参照スライドの場合、抗体を水で希釈し、ブランクのポリ−Ｌ−リシンスライド（１μＬ／スポット）にスポットし、参照スライドを真空中で乾燥させた。ジーンピックス（Genepix）４２００ＡＬマイクロアレイスキャナー（モレキュラーデバイス（Molecular Devices））を使用してスライドをスキャンした。ジーンピックス・プロ（Genepix Pro）を使用して各スポットの蛍光強度の中央値を抽出した。

チップ上の画像ベースの血球計算法。イメージングの前に、Ｔ細胞を、セルマスク（CellMask（商標））プラズマメンブレンステイン（インビトロジェン、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））およびＳＹＴＯＸグリーン（死細胞検出用、ライフ・テクノロジーズ）で染色した。顕微鏡上に、カバースリップをアレイ上面に置いた、細胞をローディングしたナノウェルのアレイを、上向きにマウントした。自動式倒立落射蛍光顕微鏡（カール・ツァイス（Carl Zeiss））で画像を得た。透過光および落射蛍光顕微鏡写真を、ブロックごとに収集した（ブロック１つ当たり７×７個のマイクロウェル）。各ウェルに存在する細胞の数および各標識の平均蛍光強度を決定できるように特注されたプログラムを使用して、結果得られた画像のコレクションを分析した。生存可能なＴ細胞のみを分析対象とした。それらの細胞はＧＦＰを発現していたが、利用された顕微鏡取得設定では、死細胞の同定を可能にするＳＹＴＯＸグリーンと比較して、ＧＦＰの蛍光強度は無視できる程度であった。

データ分析。チップ上の血球計算法とプリントされたサイトカインの両方から抽出されたデータを、マイクロソフトエクセルで、アレイ内の各ウェルに割り当てられた一意識別子を使用して突き合わせた。単一細胞のみを含有するウェルが含まれるようにデータセットをフィルタリングした。シグナルの漏れを補って、所与の細胞から捕捉されたサイトカインに関して測定された蛍光強度を分泌速度に変換するために、以前にせつめいされたようにして、公知の量の検出抗体を用いて作成された標準検量線（参照スライドより）からのデータを使用して、測定された強度を多数の分子に変換した（Han, Q.ら、Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab Chip 10、1391〜1400、doi:10.1039/b926849a（2010）。

実施例１：インビボでの免疫療法標的のＲＮＡｉの発見
２回の大規模な一次スクリーニングを行い、第一のスクリーニングは、機能不全性のＴ細胞で過剰発現された遺伝子（アネルギーまたは疲弊したＴ細胞；２５５種の遺伝子、１，２７５種のｓｈＲＮＡを２つのプールに分割した）に焦点を当て、第二のスクリーニングは、キナーゼ／ホスファターゼ（１，３０７種の遺伝子、６，５３５種のｓｈＲＮＡを７つのプールに分割した）に焦点を当てた（表４）。これらの一次スクリーニングにおいて、各遺伝子は約５種のｓｈＲＮＡによって表された。

機能不全性のＴ細胞（アネルギーまたは疲弊した状況）^{３１〜３７}で過剰発現された２５５種の遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡと１，３０７種のキナーゼ／ホスファターゼ遺伝子（遺伝子１種当たり約５種のｓｈＲＮＡ）を、ＲＮＡｉコンソーシアム（ＴＲＣ；ブロードインスティテュート（Broad Institute）、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から得た。９つのプールを作り出し、ｓｈＲＮＡをｐＬＫＯ−Ｔｈｙ１．１レンチウイルスベクターにサブクローニングした。また各プールは、８５種の陰性対照のｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡの数：ＧＦＰ、２４；ＬａｃＺ、２０；ルシフェラーゼ、２５；ＲＦＰ、１６）も含有していた。陰性選択（ステムセルテクノロジーズ（Stemcell Technologies））によって単離されたＯＴ−ＩＴ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのペニシリン）中のＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック（Peprotech））およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック）と共に培養した。２日目、レトロネクチン（５μｇ／ｍＬ）でコーティングされた２４−ウェルプレート中の硫酸プロタミン（５μｇ／ｍＬ）が補充されたレンチウイルスのプール（９つのレンチウイルスｓｈＲＮＡプールおよびＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター対照）で、ＯＴ−ＩＴ細胞を１５の重複感染度（ＭＯＩ）でスピンインフェクションした。典型的には、プールごとに約５×１０^６個のＯＴ−１ Ｔ細胞を感染させた。

感染後、完全ＲＰＭＩ培地中のＩＬ−７（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（２ｎｇ／ｍＬ）でＯＴ−Ｉ細胞を培養した。５日目、生きたｓｈＲＮＡが形質導入されたＴを、死細胞除去キット（ミルテニー）を使用して濃縮し、Ｔｈｙ１．１マーカー（ステムセルテクノロジーズ）に基づき５０〜６０％のＴｈｙ１．１陽性率に達するまで感染細胞を陽性選択した。Ｔｈｙ１．１レポーターの表面発現によって形質導入成功をモニターした（図２）。１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウス（ｓｈＲＮＡプール１つ当たり１５匹のマウス）（これは、Ｔ細胞単離およびＰＣＲに十分な細胞が提供されるように選ばれた動物の数である）にＴ細胞（５´１０^６）を静脈内注射した。ディープシーケンシング用の開始集団として５×１０^６個の濃縮ＯＴ−Ｉ細胞をゲノムＤＮＡから単離した。７日後、ゲノムＤＮＡの単離のために腫瘍、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節および無関係のリンパ節からフローサイトメトリーを行い、続いてｓｈＲＮＡカセットのＰＣＲ増幅を行うことによって、ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞（ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔｈｙ１．１^＋）を単離した。（図３）ゲノムＤＮＡを単離し（キアゲン（Qiagen））、ｓｈＲＮＡカセットのＰＣＲによってディープシーケンシングテンプレートを生成した。各プール中でのｓｈＲＮＡの出現を、イルミナ（Illumina）ゲノムアナライザーを使用したディープシーケンシングによって分析した^３０。各プールにおける対照ｓｈＲＮＡの平均読み取り値を使用してデータを正規化した。Ｔ細胞における発現レベルに基づく第二のスクリーニングのためにキナーゼ／ホスファターゼ遺伝子を選択した。

開始のＴ細胞集団（例えばＳＨＰ−１）と比較して、テストされた全組織で所定の遺伝子に関してｓｈＲＮＡが過剰出現されたが、これは、腫瘍抗原のＴＣＲ認識から独立した強化された増殖の指標である。他の遺伝子に関して、腫瘍内におけるｓｈＲＮＡの選択的な喪失が見られた（例えばＺＡＰ−７０、これは、Ｔ細胞活性化経路における重要なキナーゼ）。本発明者らは、そのｓｈＲＮＡが腫瘍で実質的な過剰出現を示したが、脾臓、二次リンパ器官ではそうではなかった遺伝子に、本発明者らの分析を集中させた。多数のｓｈＲＮＡについて、腫瘍における実質的なＴ細胞の蓄積が、免疫抑制性の環境にもかかわらず観察された。二次スクリーニングのために、本発明者らは、約１５種のｓｈＲＮＡによって各候補遺伝子が提示された集中プールを作り出した。

図４に、この分析からの一次データを、３種の遺伝子、すなわち：ＬａｃＺ（陰性対照）、Ｃｂｌｂ（Ｔ細胞受容体の内在化を誘導するＥ３ユビキチンリガーゼ）^１９およびＰｐｐ２ｒ２ｄ（Ｔ細胞中で、これまで研究されていない）に関して示す。Ｐｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂの両方に関して、５種のｓｈＲＮＡが、脾臓と比較して腫瘍で（赤色）実質的に増加したが、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡについて濃縮は観察されなかった。総合すると、４３種の遺伝子が、脾臓と比較して腫瘍において３種またはそれより多くのｓｈＲＮＡについて、以下の基準：４倍以上の濃縮を満たした（表５、図４、図５）。その群は、本発明者らのアプローチを立証する、これまでＴ細胞受容体シグナル伝達の阻害剤として同定された遺伝子産物（Ｃｂｌｂ、Ｄｇｋａ、Ｄｇｋｚ、Ｐｔｐｎ２を包含する）、加えて他の周知のＴ細胞の機能の阻害剤として同定された遺伝子産物（例えばＳｍａｄ２、Ｓｏｃｓ１、Ｓｏｃｓ３、Ｅｇｒ２）、（表５、表６）^{２０〜２２}を包含する。表５に、第二のスクリーニングからの候補遺伝子の機能的な分類を記載する。

腫瘍における実質的な過剰出現を示したが、脾臓、二次リンパ器官では示さなかったｓｈＲＮＡを有する遺伝子に焦点を当てて、二次スクリーニングを行った。免疫抑制性の環境にもかかわらず、腫瘍における実質的なＴ細胞の蓄積を多数のｓｈＲＮＡについて観察した。これらの二次スクリーニングに関して、遺伝子１つ当たり合計約１５種のｓｈＲＮＡが得られるように各遺伝子（ＩＤＴ）につき約１０種の追加のｓｈＲＮＡを合成した。これらの集中プールは、８５種の陰性対照ｓｈＲＮＡを含有していた。２種の対照ｓｈＲＮＡ（１つはＲＦＰに関し、１つはルシフェラーゼに関する）は、脾臓と比較して腫瘍において一定の濃縮を示した（それぞれ４．０倍と５．１倍）。第二のスクリーニングにおけるカットオフを、脾臓と比較して腫瘍において４倍以上の濃縮を示す３種以上のｓｈＲＮＡと定義した。Ｔ細胞に、レポータータンパク質（ＧＦＰ、ＴＦＰ、ＲＦＰまたはアメトリン蛍光タンパク質、Ｔｈｙ１．１）と共に個々のｓｈＲＮＡを導入することによって、スクリーニング結果を細胞レベルで検証した。このアプローチは、動物（グループ１つ当たり３匹のマウス）において５種のｓｈＲＮＡを同時に試験することが可能であった。２４時間後、加えて３、５および７日後に、ｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ希釈に基づき可視化した。加えて３、５および７日目に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびアイソタイプ対照に関して細胞内染色を行った。表６に、機能不全のＴ細胞プールｓｈＲＮＡライブラリーの一次および二次スクリーニングからの結果を示す。少なくとも３種のｓｈＲＮＡが腫瘍において４倍を超える濃縮を示した遺伝子をそれらの機能の簡単な説明と共に列挙する。表７に、キナーゼおよびホスファターゼｓｈＲＮＡライブラリーの二次スクリーニングからの結果を示す。

実施例２：Ｂ１６黒色腫におけるｓｈＲＮＡによって駆動されるＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の拡大
ディープシーケンシング分析からの陽性ｓｈＲＮＡを、５つの異なるレポータータンパク質（ＧＦＰ、ＴＦＰ、ＲＦＰまたはアメトリン蛍光タンパク質、Ｔｈｙ１．１）をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした。サイトカインで前処理したＯＴ−ＩＴ細胞を、単一のｓｈＲＮＡとレポータータンパク質との発現を駆動するレンチウイルスベクターで形質導入し、各集団の１×１０^６個のＴ細胞を混合し、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに共に静脈内注射した。７日後、腫瘍、脾臓およびリンパ節からＴ細胞を単離し、レポーター陽性のＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって共に導入されたレポーターに基づき決定した。脾臓と比較した腫瘍における濃縮倍率を、特定のレポーターを発現する各臓器におけるＯＴ−ＩＴ細胞のパーセンテージに基づき計算した。ＣＤ８ＯＴ−ＩＴ細胞中で対照であるＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現させた場合、ｓｈＲＮＡ発現ＣＤ８ＯＴ−ＩＴ細胞の頻度は、脾臓と比較して腫瘍でより低かった（約２分の１）。対照的に、試験用ｓｈＲＮＡは、腫瘍ではＣＤ８ＯＴ−ＩＴ細胞の蓄積を誘導したが、脾臓では誘導しなかった（図６、図７）。これらのｓｈＲＮＡのうち７種（例えば、Ｐｐｐ２ｒ２Ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８Ｉ、ＲｂｋｓおよびＥｇｒ２）について、腫瘍におけるＴ細胞の蓄積は、脾臓と比較して１０倍より多かった。ＰＰ２Ａホスファターゼ７の調節サブユニットであるＰｐｐ２ｒ２ｄを標的とするｓｈＲＮＡで、最も強い表現型が観察された。

Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＣＤ８^＋ＯＴ−ＩまたはＣＤ４^＋ＴＲＰ−１Ｔ細胞を、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。腫瘍および脾臓において、Ｔｈｙ１．１レポーターを使用して、ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞を同定した（図８、Ｔｈｙ１．１^＋ＣＤ８Ｔ細胞の％、左のパネル）。２×１０^６個のｓｈＲＮＡを発現する細胞の移入から７日後に、腫瘍および脾臓において、ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の総数を決定した（図８、右のパネル）。腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄ対ＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の濃縮倍率を示す。Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、ＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞の蓄積を誘導しただけでなく、ＣＤ４Ｔ細胞の蓄積も誘導し（ＴＲＰ−１ＴＣＲトランスジェニックマウス由来）^２３、腫瘍におけるＴ細胞数は、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡではなくＰｐｐ２ｒ２ｄを発現した場合により有意に高かった（ＣＤ８の場合、３６．３倍；ＣＤ４Ｔ細胞の場合、１６．２倍）（図８）。

Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＣｂｌｂのｓｈＲＮＡのパネルを発現する細胞に関する脾臓と比較した腫瘍におけるＴ細胞の濃縮（図１７、上のパネル）、Ｐｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂのｍＲＮＡレベルも、Ｔ細胞移入前にｑＰＣＲによって測定した（図１７、下のパネル）。ｓｈＲＮＡに関して最も強い腫瘍におけるＴ細胞濃縮が観察され、ノックダウン効率はｍＲＮＡレベルで８０％より大きかった（Ｐｐｐ２ｒ２ｄおよびＣｂｌｂの両方についてｓｈＲＮＡ番号１および２）。ＣＤ８Ｔ細胞の蓄積は、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのノックダウンの程度と相関しており、最大のインビボ活性を有する２種のＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、最小レベルのＰｐｐ２ｒ２ｄのｍＲＮＡを誘導した（図１７）。

またＰｐｐ２ｒ２ｄのノックダウンも、定量的マススペクトロメトリーアプローチを使用してタンパク質レベルで確認された（図１８）。マススペクトロメトリーによる細胞溶解産物由来タンパク質の絶対定量（ＡＱＵＡ）に関してこれまでに報告されているアプローチを使用して、タンパク質レベルにおけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ発現の作用を測定した（Gerber, S.A.、Rush, J.、Stemman, O.、Kirschner, M.W.およびGygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. PNAS、100、6940〜6945（2003）。この方策は、マススペクトロメトリー分析のための内部標準として安定な同位体が取り込まれた合成ペプチドを使用する「選択的反応をモニターする」アプローチに基づく。ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−Ｉ細胞を、ＦＡＣＳを使用してソートして純化した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Sigma））、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有する１ｍｌのＭＰＥＲ抽出試薬（ピアース（Pierce））中で、細胞（１×１０^６個）を、氷上で１５分間、時々ボルテックス混合しながら溶解させた。死細胞片を遠心分離で除去し、タンパク質上清をろ過した（０．２μｍのＳｐｉｎＸ遠心分離機フィルター、コースター（Costar））。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ（Biorad）およびＵＶ２８０ｎｍ分析（ナノドロップ（Nanodrop）の機器）によって決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって０．１ｍｇの細胞タンパク質を分離し、クーマシーブルー試薬（ピアース）で染色した。４５〜６０ｋＤａの分子量範囲に相当するゲルのバンドを切り出し、続いてトリプシンを用いてタンパク質をゲル中で消化した。溶出したペプチドを、ＬＣＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱ ＸＬオービトラップ（Orbitrap）、サーモ・サイエンティフィック）による定量化のために、３００ｆｍｏｌの同位体標識Ｐｐｐ２ｒ２ｄ（ＦＦＥＥＰＥＤＰＳＳ［１３Ｃ−１５Ｎ−Ｒ］−ＯＨ）（配列番号６２８）およびアクチンＢ（ＧＹＳＦＴＴＴＡＥ［１３Ｃ−１５Ｎ−Ｒ］−ＯＨ）（配列番号６２９）ペプチド（２１センチュリーバイオケミカルズ（21st Century Biochemicals））でスパイクした。ＰＰ２Ａの他の調節サブユニットとは異なるタンパク質の領域から、Ｐｐｐ２ｒ２ｄペプチドを選択した。最初に、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡサンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実行を分析して、モニターしていたＰｐｐ２ｒ２ｄおよびアクチンＢペプチドの場所を特定した。逆相カラムから対応する内因性ペプチドで共に溶出させた絶対定量ＡＱＵＡペプチドは、なおより高いＭＷ（１０Ｄａ）を有することから、豊富なペプチドのフラグメントイオンを使用して、内因性およびＡＱＵＡペプチドに関してピーク強度の比率を決定することを可能にした。３連のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、スチューデントの両側ｔ検定を使用したグラフパッド・プリズム６．０ソフトウェアを使用して統計的有意性を決定した（Ｆ検定、^＊ｐ＝０．００６２）。

Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡの特異性を決定した。変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡ（野生型タンパク質配列を有するが、ｓｈＲＮＡ結合部位に変異したＤＮＡ配列を有する）がＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡと共に導入された場合、表現型が逆転することから、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ活性は特異的であった（図９、１０ａ〜ｃ）。さらに、ＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞は、脾臓と比較して腫瘍においてＰｐｐ２ｒ２ｄを過剰発現したころから（あらゆるｓｈＲＮＡ発現の非存在下で）、ＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍においてＴ細胞の機能を阻害するシグナル伝達ネットワークの固有の構成要素であることが示唆される（図１９）。

ＯＴ−ＩＴ細胞を、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡの発現を駆動するレンチウイルスベクターで形質導入した。タンパク質配列は保存されているがｓｈＲＮＡ結合部位が破壊された変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡを生成した。フォワードプライマー：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号６３０）およびリバースプライマー：ＧＣＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧＧ（配列番号６３１）を使用したＲＴ−ＰＣＲにより、野生型Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡを単離した。フォワードプライマー：ＴＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＡＡＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧ（配列番号６３４）およびリバースプライマー：ＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧＴＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡ（配列番号６３５）を使用したオーバーラップＰＣＲ（タンパク質のコード配列を保護する）により、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡの標的配列、ＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴ（配列番号６３２）をＴＣＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＡＡＣＧＴＧＴＴ（配列番号６３３）に変異させた（図１０ａ）。野生型と変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄ両方のｃＤＮＡを、２Ａリボゾームスキップペプチド−ＧＦＰ配列（細胞中で化学量論的なＰｐｐ２ｒ２ｄおよびＧＦＰ発現をもたらす）を用いて改変ｐＬＫＯ．３ベクターにクローニングした。コンストラクトをＥＬ４胸腺腫細胞に導入した。ＧＦＰ発現ＥＬ４細胞をソートして純化し、次いでＴｈｙ１．１レポーターの発現を駆動するＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターで形質導入した。ｓｈＲＮＡが形質導入された（Ｔｈｙ１．１^＋）細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現に関して分析した。Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、野生型Ｐｐｐ２ｒ２ｄの場合、ＧＦＰレベルを低減させた。Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡを発現する細胞中でＧＦＰレポーターの発現を低減させることができなかったことから、ｓｈＲＮＡ結合部位がうまく変異したことが実証された（図１０ａ）。

またＰｐｐ２ｒ２ｄ変異ｃＤＮＡの発現も、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡにより誘導された表現型を予防する（図１０ｂ）。１つのベクターでＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡと変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡとの共発現をもたらす変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡ−２Ａ−ＧＦＰコンストラクトに、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡをクローニングした。ＬａｃＺのｓｈＲＮＡ（Ｔｈｙ１．１）、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ（アメトリン）またはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡに加えて変異Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｃＤＮＡ（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスで、ＯＴ−ＩＴ細胞を別々に感染させた（図１０ｂ）。次いでこれらの３つの集団を同じ比率で混合し、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。７日目に、各Ｔ細胞集団を、腫瘍および脾臓においてＯＴ−Ｉ（ＣＤ８^＋Ｖα２^＋Ｖβ５^＋）Ｔ細胞でのゲーティングにより定量し、続いてＴｈｙ１．１、アメトリンまたはＧＦＰ発現でマーキングされた集団を分析した。腫瘍および脾臓における各Ｔ細胞集団のパーセンテージを、Ｖα２^＋Ｖβ５^＋Ｔ細胞でのゲーティングによって定量し、形質導入された細胞を、Ｔｈｙ１．１またはアメトリン／ＧＦＰ蛍光レポーターの発現に基づき検出した。図１０ｂに結果を示す。（２回の独立した実験からの代表的なデータ、実験１回当たりｎ＝３匹のマウス）。

図１０ｃは、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡ、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡ、およびＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡに加えてＰｐｐ２ｒ２ｄ変異ｃＤＮＡで形質導入されたＯＴ−ＩＴ細胞におけるＰｐｐ２ｒ２ｄ発現に関するリアルタイムＰＣＲ分析を示す。最大のインビボ活性を有するＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡも、最小レベルのＰｐｐ２ｒ２ｄのｍＲＮＡと関連していた（図１１）。

試験用または対照ｓｈＲＮＡを発現する腫瘍浸潤Ｔ細胞のマイクロアレイ分析によれば、各ｓｈＲＮＡは、別個の群の遺伝子発現変化を誘導し、一部は特定のｓｈＲＮＡ間でオーバーラップしていたことが示された（図１２ａ〜ｃ）。２種の遺伝子（Ｅｇｒ２およびＰｔｐｎ２）は、Ｔ細胞において公知の機能を有する。腫瘍対脾臓における濃縮を、二次スクリーニングからのディープシーケンシング結果に基づき計算した（図１２ａ）。ｍＲＮＡの平均発現レベルのクラスター化は、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡもしくは５つの試験用ｓｈＲＮＡｓのうち１つを発現する脾臓中のＴ細胞または腫瘍によって有意に調節されることが見出された（図１２ｂ）。有意な発現の差は、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡまたは５つの試験用ｓｈＲＮＡ（Ａｌｋ、Ａｒｈｇａｐ５、Ｅｇｒ２、Ｐｔｐｎ２またはＰｐｐ２ｒ２ｄ）のうち１つを発現するＴ細胞間におけるＡｎｏｖａのｐ値として、＜０．０１と定義された（ＪＭＰ−ゲノミクス６．０、ＳＡＳインスティテュート社）。クラスター化後に、１つまたはそれより多くの治療群において有意に調節されたｍＲＮＡが示される（ファストワード）。図１２ｃは、５つの試験用ｓｈＲＮＡ（上述したようにＡｎｏｖａでｐ＜０．０１と定義されたシグネチャー）のうち１つで形質導入された腫瘍浸潤Ｔ細胞による発現シグネチャー間のオーバーラップを示すベン図である。オーバーラップする楕円で示されるように、５つのシグネチャーのあらゆる組み合わせで多数のオーバーラップするプローブ番号が示される。添付の表に、無作為抽出により予測されるものに対するオーバーラップの有意性（フィッシャーの正確検定）を示す。

実施例３：Ｐｐｐ２ｒ２ｄにより誘導されたＴ細胞の機能の変化
この実施例で、腫瘍におけるＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡにより、Ｔ細胞の蓄積、具体的にはＴ細胞の浸潤、蓄積およびアポトーシスを駆動する細胞メカニズムを試験した。細胞質色素であるＣＦＳＥで標識されたＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞の移入によって、腫瘍へのＴ細胞浸潤を査定した。Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞をＣＦＳＥで標識し、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。２４時間後、形質導入されたＴ細胞を腫瘍および脾臓から単離し、フローサイトメトリーによって定量した。ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を、Ｔｈｙ１．１レポーターを使用して精製し、サイトカインが添加されていない完全ＲＰＭＩ培地中で２４時間培養した。フィコール密度勾配遠心分離（シグマ）によって単離された生細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル、インビトロジェン）で標識し、２×１０^６個の標識細胞を、１４日目のＢ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに注射した。ＣＦＳＥ希釈を、移入から２４時間ならびに３、５および７日目にフローサイトメトリーによって定量した。加えて、３、５および７日目に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびアイソタイプ対照（ＢＤ）に関して細胞内染色を行った。１日目の腫瘍では、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＣＤ８Ｔ細胞の頻度において差は観察されず、これは、Ｔ細胞浸潤への実質的な作用の反論となった（図１３ａ）。しかしながら、その後のタイムポイント（３および５日目）の分析から、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞と比較した、Ｐｐｐ２ｒ２ｄによるより高い程度の増殖（ＣＦＳＥ希釈に基づく）が実証された（図１３ｂ、図２０ａ）。またＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞は、抗腫瘍免疫にとって重要なサイトカインであるより高いレベルのインターフェロン−γも産生した（図１３ｅ）。Ｔ細胞の蓄積は、腫瘍では強化されたが腫瘍流入領域リンパ節ではそれより低い程度にしか強化されなかったたことから、Ｐｐｐ２ｒ２ｄの作用はＴ細胞受容体活性化の下流であった。対照的に、関連抗原がＴ細胞に提示されない無関係のリンパ節または脾臓では、蓄積は観察されなかった（図１５）。ＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞については、腫瘍中にこのような細胞は少数しか存在しないにもかかわらず、かなりの程度のＴ細胞の蓄積も観察された（７日目までにＣＦＳＥ色素は十分希釈された）。これは、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞はアポトーシスによって失われたことを示唆していた。実際に、ＬａｃＺ対照ｓｈＲＮＡ（Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡではなく）が発現された場合（図１３ｇ、図２０ｂ）、より大きなパーセンテージの腫瘍浸潤Ｔ細胞が、活性なカスパーゼ−３に特異的な抗体で標識された。さらに、ＣＤ８Ｔ細胞とＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞との共培養から、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の大部分がアポトーシスを起こしたが（６５．７％）、ほとんどのＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞が生存可能であった（８９．５％、図１３ｃ）ことが示された。

ＬａｃＺまたはＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＯＴ−ＩＴ細胞を、上述したようにＴｈｙ１．１発現に基づき精製し、ＣＦＳＥで標識した。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＴ細胞（１×１０^５個）を、９６−ウェルプレート中のウェル１つ当たり５×１０^４個のＢ１６−Ｏｖａ細胞と共に７２時間培養した。アッセイ前に、Ｂ１６−Ｏｖａ細胞を１ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγに４８時間晒し（インビトロで発現されないＭＨＣクラスＩを誘導するため）、３回洗浄した。ＣＤ８^＋細胞のアネキシンＶ標識化によって、ＯＴ−ＩＴ細胞のアポトーシスを検出した（図１３ｃ）。ＢＤ細胞内染色キットを使用して、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ｂａｄ（Ｓｅｒ１１２）、Ｂｃｌ−２およびアイソタイプ対照の細胞内染色を４８時間行った。ＣＤ８Ｔ細胞とＢ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞との共培養から、実際に、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞の大部分がアポトーシスを起こしたが（６５．７％）、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＴ細胞の大部分は生存可能であった（８９．５％、図１３ｃ）ことが示された。ＣＤ２８共刺激の非存在下でＰｐｐ２ｒ２ｄおよびＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞を固定されたＣＤ３抗体で刺激したところ、類似の表現型が観察された（図１４）。具体的に言えば、Ｂ１６−Ｏｖａ細胞（２×１０^５個）を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０週齢）の皮下に注射した。１２日目に、マウスが保持する類似サイズの腫瘍を７つのグループに分割した（マウス７〜８匹／グループ）。１２日目および１７日目に、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡベクターで感染させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ４ＴＲＰ−１または／およびＣＤ８ＯＴ−ＩＴ細胞（それぞれ２×１０^６個のＴ細胞）を静脈内注射した。Ｂ１６腫瘍の治療のために、１０日目に、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現する抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ４ＴＲＰ−１およびＣＤ８ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞（それぞれ３×１０^６個のＴ細胞）でマウスを治療した。移入後３日毎に腫瘍のサイズを測定し、長さ×幅として計算した。最も長い軸で２０ｍｍ以上の腫瘍を有するマウスを殺した。

これらの結果から、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＣＤ８Ｔ細胞は、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞によって直接提示されたそれらの抗原を認識する場合であっても、それらは増殖して生存できる可能性があることが示唆された。この概念は、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現が欠失したｂ２ｍ−／−マウスへの腫瘍細胞の埋め込みによって試験された^２４。このようなマウスにおいて、宿主の専門の抗原提示細胞ではなく腫瘍細胞のみが、腫瘍抗原をＴ細胞に提示することができる。実際に、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞は、ｂ２ｍ−／−マウスにおいてＢ１６−Ｏｖａ腫瘍内では大量の蓄積を示したが（図１２ｆ）、Ｏｖａ抗原の発現が欠失した反対に位置するＢ１６腫瘍では極めて少数のＴ細胞しか存在しなかった。したがってＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞は、好適な共刺激シグナルの欠失および阻害性の微小環境にもかかわらず、腫瘍細胞に応答して効果的に増殖し生存することができた。

また、ナノウェルデバイスを使用した単一細胞レベルでの腫瘍浸潤Ｔ細胞のエクスビボの分析も、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングは、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増加させることを実証した（図２１ａ〜ｃ）。脂質二重層において、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によりＴ細胞を３時間活性化し、続いて抗体でコーティングしたスライド上で１時間サイトカイン捕捉を行った。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦについてはより高い分泌速度を示し、より大きい割合のＴ細胞が１種より多くのサイトカインを示した（図２１ｂ、ｃ）。細胞内サイトカイン染色によって、より多数のＩＦＮγ産生Ｔ細胞の存在が確認された（図２１ｄ、図２０）。

ＰＰ２Ａホスファターゼは、触媒サブユニットおよび足場サブユニットで構成され、その基質特異性は、多くの調節サブユニットの１つによって決定される^７。Ｐｐｐ２ｒ２ｄは、分裂間期と後期の際にＰＰ２ＡをＣｄｋ１基質に向かわせることにより、有糸分裂に入らないようにして有糸分裂からの退出を誘導する^２５。ＰＰ２Ａは、ＢＡＤ介在アポトーシスにとってゲートキーパー的な役割を果たす。リン酸化ＢＡＤは、１４−３−３によってサイトゾル中にその不活性型で隔離されるが、脱リン酸化ＢＡＤはミトコンドリアに標的化されて、そこでＢｃｌ−Ｘ_ＬおよびＢｃｌ−２との結合によって細胞死を引き起こす^２６。またＰＰ２Ａホスファターゼは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の細胞質内ドメイン、加えてＣａｒｍａ１（ＮＦ−κＢ経路上流）と相互作用することも示されたが、調節サブユニットがこれらの活性に必要であることは知られていなかった。必要な生化学研究に好適なＰｐｐ２ｒ２ｄ抗体は現在のところ入手が不可能である。

実施例４：Ｐｐｐ２ｒ２ｄのサイレンシングはＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化する
養子Ｔ細胞治療の効能を強化するＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡの能力を査定した。Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍細胞（２×１０^５個）を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０週齢）の皮下に注射した。１２日目に、マウスが保持する類似サイズの腫瘍を７つのグループ（マウス７〜８匹／グループ）に分割し、それらを、Ｔ細胞なし、２×１０^６個のｓｈＲＮＡが形質導入されたＴＲＰ−１ＣＤ４Ｔ細胞、２×１０^６個のｓｈＲＮＡで感染させたＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞のいずれか、またはＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方（１２日目および１７日目）で処理した。１２日目および１７日目に、グループに応じて、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって活性化されたＣＤ４ＴＲＰ−１、または／およびＰｐｐ２ｒ２ｄもしくはＬａｃＺのｓｈＲＮＡベクターで感染させたＣＤ８ＯＴ−ＩＴ細胞（それぞれ２×１０^６個のＴ細胞）を静脈内注射した。Ｂ１６腫瘍の治療のために、１０日目に、Ｐｐｐ２ｒ２ｄまたはＬａｃＺのｓｈＲＮＡを発現する抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ４ＴＲＰ−１およびＣＤ８ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞（それぞれ３×１０^６個のＴ細胞）で、マウスを治療した。移入後３日毎に腫瘍のサイズを測定し、長さ×幅として計算した。最も長い軸で２０ｍｍ以上の腫瘍を有するマウスを殺した。Ｐｐｐ２ｒ２ｄ−サイレンシングはＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の治療活性を改善し、Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡが形質導入されたＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を共に投与した場合に相乗効果が観察された（図１６ａ、ｂ）。またＰｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、内因性腫瘍抗原に特異的なＴ細胞（ｐｍｅｌ−１ＣＤ８Ｔ細胞およびＴＲＰ−１ＣＤ４Ｔ細胞）に導入した場合に抗腫瘍応答も強化した（図１６ｃ）。

Ｐｐｐ２ｒ２ｄがサイレンシングされたＴ細胞は、腫瘍においてエフェクター表現型を獲得し（図２２ａ）、細胞の３０％より多くがグランザイムＢを発現した（図２３ａ）。腫瘍におけるこのようなエフェクターＴ細胞の著しい増加と一致して（図２３ｂ）、タネル染色から、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡではなくＰｐｐ２ｒ２ｄを発現するＴ細胞が存在する場合、腫瘍においてアポトーシスが増加することが実証された（図２３ｃ）。Ｂ１６黒色腫は高侵襲性の腫瘍であるが、その理由の一つはＭＨＣクラスＩ発現が極めて低いためである。興味深いことに、ＬａｃＺのｓｈＲＮＡではなくＰｐｐ２ｒ２ｄを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞によってＭＨＣクラスＩ発現（Ｈ−２Ｋｂ）を有意に増加させ（図２３ｄ）、これは場合により、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌の増加が観察されたことに起因する可能性がある（図２１ａ〜ｃ、図１３ｅ）。Ｐｐｐ２ｒ２ｄのｓｈＲＮＡは、腫瘍浸潤Ｔ細胞における阻害性ＰＤ−１またはＬＡＧ−３受容体の発現を低減させないことから、その作用機序は、これらの公知のＴ細胞の機能の負の調節因子とは異なることが実証される（図２２ｂ）。この発見から、これらの細胞内と細胞表面分子とを標的とする組み合わせのアプローチが示唆される。

これらの結果は、複合組織の微小環境における免疫療法のための、新規の標的のインビボにおける発見の実行可能性を確立する。本発明者らは、二次リンパ器官と比較した腫瘍におけるＴ細胞の蓄積で例示されるような組織間で示差的な作用を有する遺伝子を発見することが可能であることを示した。組織選択的な作用を有する遺伝子について、Ｔ細胞の蓄積および生存は、Ｔ細胞受容体の制御下である可能性が高いために、関連抗原の提示がない組織では起こらない。インビボで特定の免疫細胞機能の制御を調査するために、本明細書に記載されたアプローチの多くのバリエーションを想定することができる。例えば、腫瘍において重要なＴ細胞エフェクター機能を制御する遺伝子を発見するために、サイトカインまたは細胞傷害性分子の発現のための蛍光レポーター（グランザイムＢ、パーフォリン）を本発明者らのアプローチに統合してもよい。

主要な調節スイッチを標的化することは、がんおよび他の病理におけるＴ細胞の活性を改変する新しいアプローチを提供する可能性がある。このようなＴ細胞ベースの療法の効能は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を阻害する遺伝子のｓｈＲＮＡ介在サイレンシングによって強化される可能性がある。

他の実施態様
本発明をそれらの詳細な説明と共に説明したが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するものであり、それらを限定しないことが意図されており、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが理解されるものとする。他の形態、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。

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Claims (51)

1. ベクターを含む腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞であって、ベクターは、ｓｈＲＮＡをコードする配列を含み、
   ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含む、上記免疫応答性細胞。
2. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
3. 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なＴ細胞受容体を発現する、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
4. 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターをさらに含み、
   ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
5. ｓｈＲＮＡ配列が、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
6. ｓｈＲＮＡが、切断依存性ｓｈＲＮＡまたは切断非依存性ｓｈＲＮＡから選択される、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
7. 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原または病原体抗原と結合する、請求項４に記載の免疫応答性細胞。
8. 腫瘍抗原が、前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＴＣＲ、ＥＲＢＢ２、ＢＩＲＣ５、ＣＥＡＣＡＭ５、ＷＤＲ４６、ＢＡＧＥ、ＣＳＡＧ２、ＤＣＴ、ＭＡＧＥＤ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＧＡＧＥ３、ＧＡＧＥ４、ＧＡＧＥ５、ＧＡＧＥ６、ＧＡＧＥ７、ＧＡＧＥ８、ＩＬ１３ＲＡ２、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ９、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥＣ２、ＴＰ５３、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＳＡＧＥ１、ＳＹＣＰ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＫＲＡＳ、ＰＲＡＭＥ、ＮＲＡＳ、ＡＣＴＮ４、ＣＴＮＮＢ１、ＣＡＳＰ８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＥＥＦ２、ＦＮ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＬＰＧＡＴ１、ＭＥ１、ＨＨＡＴ、ＴＲＡＰＰＣ１、ＭＵＭ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＰＡＰＯＬＧ、ＯＳ９、ＰＴＰＲＫ、ＴＰＩ１、ＡＤＦＰ、ＡＦＰ、ＡＩＭ２、ＡＮＸＡ２、ＡＲＴ４、ＣＬＣＡ２、ＣＰＳＦ１、ＰＰＩＢ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＧＦ５、ＣＡ９、ＴＥＲＴ、ＭＧＡＴ５、ＣＥＬ、Ｆ４．２、ＣＡＮ、ＥＴＶ６、ＢＩＲＣ７、ＣＳＦ１、ＯＧＴ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ、ＭＲＰＬ２８、ＦＯＬＨ１、ＲＡＧＥ、ＳＦＭＢＴ１、ＫＡＡＧ１、ＳＡＲＴ１、ＴＳＰＹＬ１、ＳＡＲＴ３、ＳＯＸ１０、ＴＲＧ、ＷＴ１、ＴＡＣＳＴＤ１、ＳＩＬＶ、ＳＣＧＢ２Ａ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＬＡＮＡ、ＧＰＲ１４３、ＯＣＡ２、ＫＬＫ３、ＳＵＰＴ７Ｌ、ＡＲＴＣ１、ＢＲＡＦ、ＣＡＳＰ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＵＢＸＤ５、ＥＦＴＵＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＮＦＹＣ、ＰＲＤＸ５、ＺＵＢＲ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＣＸｏｒｆ６１、ＣＣＤＣ１１０、ＶＥＮＴＸＰ１、ＳＰＡ１７、ＫＬＫ４、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＲＡＢ３８、ＣＣＮＤ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＤＭ２、ＭＭＰ２、ＺＮＦ３９５、ＲＮＦ４３、ＳＣＲＮ１、ＳＴＥＡＰ１、７０７−ＡＰ、ＴＧＦＢＲ２、ＰＸＤＮＬ、ＡＫＡＰ１３、ＰＲＴＮ３、ＰＳＣＡ、ＲＨＡＭＭ、ＡＣＰＰ、ＡＣＲＢＰ、ＬＣＫ、ＲＣＶＲＮ、ＲＰＳ２、ＲＰＬ１０Ａ、ＳＬＣ４５Ａ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ＣＳＰＧ４、ＲＧＳ５、ＢＣＲ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＡＢＬ−ＢＣＲ、ＤＥＫ、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＮＰＭ１−ＡＬＫ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＳＹＴ−ＳＳＸ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ２、ＦＬＴ３、ＡＢＬ１、ＡＭＬ１、ＬＤＬＲ、ＦＵＴ１、ＮＰＭ１、ＡＬＫ、ＰＭＬ１、ＲＡＲＡ、ＳＹＴ、ＳＳＸ１、ＭＳＬＮ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＨＮＲＰＬ、ＷＨＳＣ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＷＮＫ２、ＯＡＳ３、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、ＣＴＳＨ、ＡＢＣＣ３、ＢＳＴ２、ＭＦＧＥ８、ＴＰＢＧ、ＦＭＯＤ、ＸＡＧＥ１、ＲＰＳＡ、ＣＯＴＬ１、ＣＡＬＲ３、ＰＡ２Ｇ４、ＥＺＨ２、ＦＭＮＬ１、ＨＰＳＥ、ＡＰＣ、ＵＢＥ２Ａ、ＢＣＡＰ３１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＩＴＧＢ８、ＲＰＡ１、ＡＢＩ２、ＣＣＮＩ、ＣＤＣ２、ＳＥＰＴ２、ＳＴＡＴ１、ＬＲＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＪＵＰ、ＤＤＲ１、ＩＴＰＲ２、ＨＭＯＸ１、ＴＰＭ４、ＢＡＡＴ、ＤＮＡＪＣ８、ＴＡＰＢＰ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＰＡＧＥ４、ＰＡＫ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＰＴＨＬＨ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１１、ＴＲＰＭ８、ＴＹＭＳ、ＡＴＩＣ、ＰＧＫ１、ＳＯＸ４、ＴＯＲ３Ａ、ＴＲＧＣ２、ＢＴＢＤ２、ＳＬＢＰ、ＥＧＦＲ、ＩＥＲ３、ＴＴＫ、ＬＹ６Ｋ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＧＰＣ３、ＳＬＣ３５Ａ４、ＨＳＭＤ、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＭＦＩ２、ＭＭＰ１４、ＳＤＣＢＰ、ＰＡＲＰ１２、ＭＥＴ、ＣＣＮＢ１、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＰＡＸ３、ＦＯＸＯ１、ＸＢＰ１、ＳＹＮＤ１、ＥＴＶ５、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＭＨＡ１、ＴＲＩＭ６８、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の免疫応答性細胞。
9. 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項４に記載の免疫応答性細胞。
10. 抗原結合フラグメントが、ＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項９に記載の免疫応答性細胞。
11. ＣＡＲが、共刺激ドメインをさらに含む、請求項４に記載の免疫応答性細胞。
12. ベクターが、プラスミド、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項４に記載の免疫応答性細胞。
13. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびｓｈＲＮＡをコードする配列をコードする単離された核酸であって、
    ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含み、
    ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記核酸。
14. ｓｈＲＮＡ配列が、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃ ｓｈＲＮＡからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項１３に記載の単離された核酸。
15. 抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合フラグメントである、請求項４に記載の単離された核酸。
16. 抗原結合フラグメントが、ＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項１５に記載の単離された核酸。
17. 抗原結合ドメインが、腫瘍抗原と結合する、請求項１３に記載の単離された核酸。
18. 腫瘍抗原が、黒色腫、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、神経膠腫、食道がん、および肝臓がんに関連する、請求項１７に記載の単離された核酸。
19. 腫瘍抗原が、固形腫瘍またはリンパ系の腫瘍に関連する、請求項１７に記載の単離された核酸。
20. 請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
21. ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
22. ｓｈＲＮＡをコードする配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結している、請求項２０に記載のベクター。
23. 請求項１３に記載の核酸を含む、免疫応答性細胞。
24. 免疫応答性細胞が腫瘍特異的である、請求項２３に記載の免疫応答性細胞。
25. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項２４に記載の免疫応答性細胞。
26. 請求項１または請求項２３に記載の免疫応答性細胞および医薬的に許容されるキャリアーを含む組成物。
27. Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃの阻害剤をさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
28. 免疫応答性Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔ細胞である、請求項２６に記載の組成物。
29. 免疫応答性Ｔ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択され、ここで抗原は、腫瘍または病原体抗原である、請求項２６に記載の組成物。
30. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第一のベクターおよびｓｈＲＮＡをコードする配列を含む第二のベクターでトランスフェクトされた免疫応答性細胞であって、
    ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含み；
    ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記免疫応答性細胞。
31. 請求項１３に記載の核酸分子を内包するヒトＴ細胞。
32. 対象におけるがんの治療方法であって、該方法は、腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびｓｈＲＮＡを発現するように改変された自己Ｔ細胞を対象に投与することを含み、
    ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含み；
    ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
33. Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、
    該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ここでベクターは、腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびｓｈＲＮＡ配列をコードし、
    ｓｈＲＮＡ配列は、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列によってコードされたｍＲＮＡ配列に相補的な少なくとも１２／１５／２０／２５個の連続したヌクレオチドの配列を含み；
    ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン、および共刺激ドメインを含む、上記治療方法。
34. ベクターが、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３３に記載の方法。
35. ｓｈＲＮＡ配列が、Ｃｂｌｂ、Ｄｇｋａ、Ｄｇｋｚ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｆｙｎ、Ｐｔｐｎ２、Ｓｍａｄ２、Ｓｏｃｓ１またはＳｏｃｓ３からなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
36. Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子をサイレンシングすることによる、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、
    該方法は、ベクターを含む免疫応答性細胞を対象に投与することを含み、ベクターは、腫瘍特異的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびｓｈＲＮＡ配列をコードし、
    ｓｈＲＮＡ配列は、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列によってコードされたｍＲＮＡ配列に相補的な少なくとも１２／１５／２０／２５個の連続したヌクレオチドの配列を含む、上記治療方法。
37. 免疫応答性Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子の同定方法であって、
    ｓｈＲＮＡを発現するベクターを内包する免疫応答性Ｔ細胞の集団を用意すること；
    免疫応答性Ｔ細胞の集団を免疫抑制性の腫瘍と接触させること；
    免疫抑制性の腫瘍内でｓｈＲＮＡがＴ細胞の機能を回復させるかどうかを決定すること；
    腫瘍内でＴ細胞の機能を回復させるｓｈＲＮＡに関連する遺伝子を、腫瘍浸潤Ｔ細胞の機能を阻害する遺伝子と同定すること
    を含む、上記同定方法。
38. それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための方法であって、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７およびＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の活性をモジュレートする治療剤を投与することを含む、方法。
39. 治療剤が、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
40. 腫瘍特異性および免疫抑制に対する増加した耐性を有する免疫応答性細胞を調製するための方法であって、該方法は、
    腫瘍特異性を有する免疫応答性細胞を提供すること；および
    該細胞にｓｈＲＮＡをコードする配列を含むベクターを導入すること
    を含み、
    ｓｈＲＮＡは、配列番号６０４〜６２０および６５３〜６７７からなる群より選択される核酸配列に相補的な１５個の連続したヌクレオチドを含む、上記方法。
41. 免疫応答性細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびＣＤ４Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 免疫応答性細胞が、腫瘍特異的なＴ細胞受容体を発現する、請求項４０に記載の方法。
43. 免疫応答性細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターを含み、
    ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激性ドメインを含む、請求項４０に記載の方法。
44. ｓｈＲＮＡ配列が、Ｐｐｐ２ｒ２ｄ、Ｅｉｆ２ａｋ３、Ａｒｈｇａｐ５、Ｓｍａｄ２、Ａｋａｐ８１、Ｒｂｋｓ、Ｅｇｒ２、Ｄｇｋａ、Ｃｂｌｂ、Ｍｄｆｉｃ、Ｅｎｔｐｄ１、Ｄｇｋｚ、Ｖａｍｐ７、Ｈｉｐｋ１、Ｎｕａｋ２、Ａｌｋ、Ｐｄｚｋ１ｉｐ１、Ｉｎｐｐ５ｂ、Ｓｏｃｓ１、Ｊｕｎ、Ｎｐｔｘｒ、Ｓｏｃｓ３、Ｆ１１ｒ、Ｆｙｎ、Ｙｐｅｌ２、Ｐｋｄ１、Ｇｒｋ６、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｓｂｆ１、Ｉｐｍｋ、Ｒｏｃｋ１、Ｓｔｋ１７ｂ、Ｍａｓｔ２、Ｐｄｐ１、Ｙｅｓ１、Ｍｅｔ、Ｐｐｍ１ｇ、Ｂｌｖｒｂ、Ｔｎｋ１、Ｐｒｋａｂ２、Ｔｒｐｍ７またはＰｐｐ３ｃｃからなる群より選択される遺伝子の発現を低減させる、請求項４０に記載の方法。
45. ｓｈＲＮＡが、切断依存性ｓｈＲＮＡまたは切断非依存性ｓｈＲＮＡから選択される、請求項３９に記載の方法。
46. ｓｈＲＮＡをコードする配列が、配列番号６０４〜６２０または配列番号６５３〜６７７のいずれかに相補的な１５〜２５ヌクレオチドを含む第一の配列および１つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する５〜９ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項１または３０に記載の免疫応答性細胞。
47. 第一の配列が、配列番号６０４〜６２０または配列番号６５３〜６７７のいずれかに相補的な１９〜２５ヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の免疫応答性細胞。
48. 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項４６に記載の免疫応答性細胞。
49. ｓｈＲＮＡをコードする配列が、配列番号６０４〜６２０または配列番号６５３〜６７７のいずれかに相補的な１５〜２５ヌクレオチドを含む第一の配列および１つのミスマッチを含むかまたはミスマッチを含まない第一の配列の逆の相補物である第二の配列、ならびに第一の配列と第二の配列との間に位置する５〜９ヌクレオチドの第三の配列を含む、請求項１３に記載の単離された核酸分子。
50. 第一の配列が、配列番号６０４〜６２０または配列番号６５３〜６７７のいずれかに相補的な１９〜２５ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の単離された核酸分子。
51. 第二の配列が、第二の配列に完全に相補的である、請求項４９に記載の単離された核酸分子。