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CN105431524A - 用于降低通过肿瘤细胞的免疫抑制的方法和组合物 - Google Patents

用于降低通过肿瘤细胞的免疫抑制的方法和组合物 Download PDF

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CN105431524A CN201480033025.XA CN201480033025A CN105431524A CN 105431524 A CN105431524 A CN 105431524A CN 201480033025 A CN201480033025 A CN 201480033025A CN 105431524 A CN105431524 A CN 105431524A
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Abstract

本公开内容部分提供了体内发现免疫治疗靶的方法，治疗组合物(例如shRNA、表达shRNA和/或嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞)及其使用方法。

Description

用于降低通过肿瘤细胞的免疫抑制的方法和组合物
相关申请
本申请要求于2014年1月21日提交的临时申请USSN61/929,821、于2013年12月27日提交的临时申请USSN61/921,303、以及于2013年6月10日提交的临时申请USSN61/833,298的优先权和利益，所述临时申请的内容通过引用全文并入本文。
政府支持
本发明在由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号1R01CA173750-01和T32AI07386，以及由国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)授予的基金号P30-CA14051下，由政府支持进行。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及体内发现免疫治疗靶的方法，调节免疫治疗靶的治疗组合物(例如shRNA、表达shRNA及在一些情况下靶向癌细胞的受体例如嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞)，以及相关使用方法。
背景
细胞毒性T细胞在免疫介导的癌症控制中起关键作用1-3，并且靶向T细胞上的抑制性受体的单克隆抗体可以在患有晚期疾病的患者中诱导显著的临床益处4-6。为了存活，肿瘤已发展众多免疫抑制机制，以促进其自身生长且成功逃避宿主免疫系统，有效阻断肿瘤微环境中T细胞的活性。这是肿瘤学中的关键问题，因为通过CD8T细胞(其具有针对肿瘤细胞的细胞毒性功能)的强浸润与多种类型人癌症中的有利预后相关1,3,8。这种天然防御机制在大多数患者中被源自肿瘤、其基质、调节T细胞和髓样细胞群体的多重抑制信号严重减弱9-11。负责肿瘤逃避的各种分子和细胞免疫抑制机制已得到鉴定。这些机制中的某一些靶向免疫抗肿瘤效应细胞。然而，导致免疫抑制肿瘤内的T细胞功能丧失的许多调节机制仍是未知的。对有限成功的癌症免疫治疗的改善需要新方法来抑制通过肿瘤细胞起始以逃避宿主免疫系统的免疫抑制途径。
概述
本公开内容提供了用于抑制由肿瘤细胞使用以使免疫细胞失活和/或抑制免疫细胞的免疫抑制途径的靶。
本公开内容还提供了与具有治疗潜力的shRNA有关的组合物和方法。
本公开内容还提供了表达能够沉默抑制T细胞功能的基因的至少一种shRNA或其它核酸分子的免疫应答细胞，包括T细胞(例如靶向肿瘤抗原的细胞)。
本公开内容还提供了具有表达shRNA和针对肿瘤抗原的至少一种嵌合抗原受体的至少一种载体的免疫应答细胞，包括T细胞。
在一些实施方案中，本公开内容提供了具有肿瘤特异性的免疫应答细胞，其包含编码能够沉默抑制T细胞功能的基因的shRNA的载体。在一些方面，shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。在另一个方面，shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸。在一些方面，免疫应答细胞进一步包含编码肿瘤特异性T细胞受体的载体。在一些方面，免疫应答细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
在一些实施方案中，免疫应答细胞包含编码CAR的载体，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激结构域。在一些方面，抗原结合结构域结合肿瘤抗原或病原体抗原。示例性肿瘤抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD333/IL3Ra、c-Met、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV-K-MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707-AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK、DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT、NPM1-ALK1、PML-RARA、SYT-SSX1、SYT-SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL-2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3-FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68及其任何组合。在一些方面，抗原结合结构域是抗体的抗原结合片段(例如Fab或scFv)。这样的CAR的细胞内结构域含有来源于T细胞受体和共刺激分子的细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，载体是质粒、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在一些实施方案中，本公开内容提供了编码shRNA序列的分离的核酸分子。在另一个实施方案中，本公开内容提供了编码CAR的分离的核酸分子。在另外一个实施方案中，本公开内容提供了编码CAR和shRNA序列的分离的核酸分子。在一些方面，分离的核酸编码降低选自下述的基因的表达的shRNA序列：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、或Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。在另一个方面，分离的核酸编码包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸的shRNA。
在一些实施方案中，分离的核酸编码包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域的CAR。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体的抗原结合片段(例如Fab或scFv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是来源于T细胞受体和共刺激分子的细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原(例如与实体瘤、淋巴肿瘤、黑素瘤、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、神经胶质瘤、食道癌和肝癌相关的肿瘤抗原)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含编码shRNA序列的分离的核酸、编码CAR的分离的核酸、或编码CAR和shRNA序列的分离的核酸的载体。在一些方面，载体是质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。shRNA可以与RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子可操作地连接。
在其它实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的免疫应答细胞和药学可接受的载体的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用编码CAR的第一载体和编码shRNA序列的第二载体转染的免疫应答细胞。在一些方面，shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Map3k3、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。在另一个方面，shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸。在一些方面，免疫应答细胞进一步包含编码肿瘤特异性T细胞受体的载体。在一些方面，免疫应答细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括给受试者施用经修饰以表达肿瘤特异性T细胞受体或CAR和shRNA的自体T细胞，其中所述shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Map3k3、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。在一些方面，shRNA序列包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸；并且其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。在一些方面，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括给受试者施用经修饰以表达肿瘤特异性T细胞受体或CAR和本发明的shRNA的自体T细胞。在另外一个实施方案中，本公开内容提供了用于通过沉默抑制T细胞功能的基因来治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括给受试者施用包含载体的免疫应答细胞，该载体编码肿瘤特异性T细胞受体或CAR和本发明的shRNA序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定抑制免疫应答T细胞的功能的基因的方法，该方法包括提供具有表达shRNA的载体的免疫应答T细胞群体，使免疫应答T细胞群体与免疫抑制肿瘤接触，测定shRNA是否恢复免疫抑制肿瘤内的T细胞功能，并且将与恢复肿瘤内的T细胞功能的shRNA相关的基因鉴定为抑制肿瘤浸润T细胞功能的基因。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于增加有此需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括施用调节选自下述的基因的活性的治疗试剂：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。
在一些情况下，编码shRNA的序列包括包含与SEQIDNO:604-620或SEQIDNO:653-677之任一互补的15-25(15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)个核苷酸的第一序列，以及其为具有一个错配或无错配(即，与第一序列完全互补)的第一序列的反向互补体的第二序列，以及置于第一和第二序列之间的5-9个核苷酸的第三序列。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明中的方法与材料；还可以使用本领域已知的其它合适的方法与材料。材料、方法和实施例仅是举例说明性的并且不预期是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目及其它参考文献通过引用全文并入。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
本发明的其它特点和优势根据下述详述和附图以及权利要求将是显而易见的。
附图描述
专利或申请文件含有至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要的费用后由专利局提供。
图1是显示用于shRNA的体内发现的示例性方法的示意图，所述shRNA增强肿瘤微环境内的T细胞浸润和累积。
图2是显示在用shRNA载体感染后，来自Rag1-/-/OT-ITCR转基因小鼠的CD8+T细胞的代表性流式细胞术图的一组图表。基于由慢病毒载体编码的Thy1.1报道基因的表达测定转导效率。表达LacZ对照shRNA的细胞因子培养的T细胞随后用一组活化标记物进行染色(黑线；同种型对照，有阴影的)。大多数被感染的T细胞显示出中枢记忆表型(CD62L+CD44+)。
图3是显示OT-IT细胞的代表性流式细胞术图的一组图表，所述OT-IT细胞从肿瘤和次级淋巴样器官中分选用于深度序列分析(dLN，肿瘤引流淋巴结；irLN，无关淋巴结)。分选CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+细胞，并且提取基因组DNA用于shRNA盒的PCR扩增。
图4是显示来自体内shRNA库筛选的深度测序数据的一组图表。上排，关于肿瘤、无关(irLN)和引流淋巴结(dLN)中的库中的所有基因的序列读数；下排，针对肿瘤、无关淋巴结(irLN)和肿瘤引流淋巴结(dLN)与脾相比较标绘三种个别基因(LacZ，阴性对照)。对于这些组织相对脾标绘序列读数。虚线指示通过log2与对角线的偏差。
图5是显示来自T细胞功能障碍筛选的深度测序数据的一组图表。针对肿瘤(红色)、无关淋巴结(irLN，蓝色)和肿瘤引流淋巴结(dLN，绿色)与脾相比较标绘关于次级筛选阳性的基因的shRNA测序读数，其中虚线指示与对角线的log2偏差。数据显示与脾或淋巴结相比较，代表肿瘤中的这些基因的特定shRNA的富集。
图6是显示在肿瘤中相对于脾的OT-ICD8+T细胞富集的基于流式细胞术的定量的图表。通过在CD8+Vα2+Vβ5+T细胞中对报道蛋白质门控，通过流式细胞术测定肿瘤/脾中的表达shRNA的OT-IT细胞的百分比。对于每种实验shRNA针对LacZshRNA测定统计显著性(肿瘤/脾富集倍数)(n＝3；*p<0.05，**p<0.01，斯氏t检验)。
图7是显示用shRNA载体(LacZ、Akap8I、Smad2、Rbks、Dgkz)转导的肿瘤中的细胞富集的代表性流式细胞术图的一组图表。通过在CD8+Vα2+Vβ5+T细胞中对报道蛋白质门控，通过流式细胞术测定肿瘤/脾中的表达shRNA的OT-IT细胞的百分比。
图8是显示在肿瘤中CD4+和CD8+T细胞富集的基于流式细胞术的定量的一组图表。使用Thy1.1报道基因，在肿瘤和脾中鉴定表达shRNA的T细胞(％Thy1.1+CD8T细胞或CD4+T细胞，上图和下图)。在2x106个表达shRNA的细胞转移后7天，在肿瘤和脾中测定表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的T细胞的总数目(右图)。指示了肿瘤中表达Ppp2r2d相对于LacZshRNA的T细胞的富集倍数。
图9是显示通过具有突变的shRNA结合位点但保留的蛋白质序列的Ppp2r2dcDNA逆转肿瘤中的Ppp2r2dshRNA介导的T细胞扩增的图表。基于共表达的报道基因鉴定三个细胞群体；基于肿瘤相对于脾的报道基因阳性细胞的百分比计算富集倍数。
图10a描述了具有保留的蛋白质序列但破坏的shRNA结合位点的突变型Ppp2r2dcDNA的生成。用还含有GFP的载体上的突变型或野生型Ppp2r2dcDNA转导EL4细胞。将GFP阳性细胞分选至一定纯度，并用表达Thy1.1报道基因的LacZ或Ppp2r2dshRNA载体进行转导。通过流式细胞术就GFP表达分析shRNA转导的(Thy1.1+)细胞。当表达野生型Ppp2r2d而不是突变型Ppp2r2d时，Ppp2r2dshRNA降低GFP水平。
图10b显示了Ppp2r2d突变型cDNA的表达阻止通过Ppp2r2dshRNA诱导的表型。用编码LacZshRNA、Ppp2r2dshRNA或Ppp2r2dshRNA加上突变型Ppp2r2dcDNA的载体转导OT-IT细胞。不同细胞群体就转导效率进行标准化，并且共注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。通过对CD8+Vα2+Vβ5+T细胞门控，定量肿瘤和脾中的各T细胞群体的百分比；基于Thy1.1或Ametrine/GFP荧光报道基因的表达检测经转导的细胞(来自2次独立实验的代表性数据；n＝3只小鼠/实验)。
图10c是显示OT-IT细胞中的Ppp2r2d表达的实时PCR分析的图表，所述OT-IT细胞用LacZshRNA、Ppp2r2dshRNA和Ppp2r2dshRNA加上Ppp2r2d突变型cDNA进行转导。数据代表生物学重复(n＝3)，每个值代表平均值+/-s.d.。
图11是显示在OT-IT细胞中就Ppp2r2dmRNA水平的实时qPCR分析的图表，所述OT-IT细胞用LacZshRNA或筛选中鉴定的三种Ppp2r2dshRNA之一进行转导。
图12a是显示肿瘤相对于脾中的特定shRNA的富集的表，所述富集基于来自次级筛选的深度测序结果进行计算。
图12b显示被发现在肿瘤中由T细胞显著调节的mRNA的平均表达水平的聚类，所述肿瘤表达LacZ对照shRNA或五种实验shRNA之一。显著表达差异定义为表达LacZ对照shRNA或五种实验shRNA(Alk、Arhgap5、Egr2、Ptpn2或Ppp2r2d)之一的T细胞之间的方差分析p值<0.01(JMP-Genomics6.0，SASInstituteInc.)。在聚类后显示了在一个或多个处理组中显著调节的mRNA(FastWard)。
图12c是显示通过用五种实验shRNA之一转导的肿瘤浸润T细胞，在表达标志之间的重叠的维恩图(标志定义为如上描述的方差分析p<0.01)。指示的是针对5种标志的任何组合的重叠探针ID的数目，如通过重叠椭圆指示的。重叠相对于由随机机会所预期的那些的显著性(Fisher精确检验)显示于附表中。
图13a是显示代表性流式细胞术图的一组图表，证实在第1天时在肿瘤中的Ppp2r2d或LacZshRNA转导的CD8T细胞的频率。
图13b是显示在第1、3、5和7天时，与肿瘤中的LacZshRNA转导的T细胞相比，Ppp2r2dshRNA转导的CD8T细胞的增殖程度(基于CFSE稀释)的一对图表。
图13c是显示在遇到肿瘤细胞后，Ppp2r2d沉默抑制T细胞凋亡的一组图表。CFSE标记的OT-IT细胞与B16-Ova肿瘤细胞共培养72小时。细胞用CD8和膜联蛋白V进行染色。
图13d是显示针对抗凋亡蛋白质的细胞内染色的一组图表。表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-IT细胞与B16-Ova肿瘤细胞共培养48小时，并且随后用同种型对照(灰色)和磷酸-AKT(Ser473)、磷酸-Bad(Ser112)或Bcl-2抗体进行染色。
图13e是显示Ppp2r2d沉默的T细胞的增加的IFN-γ分泌的图表。从具有B16-Ova肿瘤的小鼠中分离的OT-IT细胞通过细胞内染色就IFN-γ表达进行测定。
图13f是显示肿瘤中的Ppp2r2d沉默的T细胞扩增(甚至无需通过专职性抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原)的一组图表。将表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-IT细胞转移到具有第14天B16-Ova肿瘤的C57BL/6或b2m-/-小鼠。基于蓝绿色荧光蛋白(TFP)或Thy1.1的表达，鉴定表达shRNA的T细胞(在肿瘤中相较于脾的富集倍数)。
图13g是显示在遇到肿瘤细胞后，Ppp2r2d沉默抑制T细胞凋亡的图表。CFSE标记的OT-IT细胞与B16-Ova肿瘤细胞共培养72小时(活化的半胱天冬酶-3)。
图14是显示用CFSE标记且用CD3抗体刺激72小时的表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-IT细胞的一组图表。细胞随后用CD8和膜联蛋白V进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。
图15是显示表达Ppp2r2dshRNA的T细胞在肿瘤和肿瘤引流淋巴结而非其它次级淋巴样器官中的累积的一组图表。表达Ppp2r2d或LacZshRNA的OT-IT细胞用CFSE进行标记，并且注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。在第1、3、5和7天时，从所示器官中分离T细胞，以基于CSFE染料的稀释检查T细胞累积程度。
图16a-c是显示Ppp2r2d的沉默增强CD4和CD8T细胞的抗肿瘤活性的一组图表。T细胞用抗CD3/CD28珠进行活化，用驱动LacZ或Ppp2r2dshRNA表达的慢病毒进行感染，并且注射到具有B16-Ova(a,b)或B16(c)肿瘤的小鼠内。在两个最长轴上使用测径器，在T细胞转移后每三天测量肿瘤大小。a,b：将CD4+TRP-1和/或CD8+OT-IT细胞(2x106)转移(第12和17天)到具有第12天B16-Ova肿瘤的小鼠内。评价肿瘤负荷(a)和存活(b)。c，将CD4+TRP-1和CD8+pmel-1T细胞(3x106CD4+TRP-1加上3x106CD8+pmel-1)转移(第10和15天)到具有第10天B16肿瘤的小鼠内。使用GraphPadPrism第6版执行时序(Mantel-Cox)检验，比较用表达LacZ相对于Ppp2r2dshRNA的T细胞处理的小鼠的存活。
图17是显示针对表达一组Ppp2r2d或CblbshRNA的细胞，在肿瘤相较于脾中T细胞富集的FACS分析的一组图表(上图)。在T细胞转移前，通过qPCR测量Ppp2r2d和CblbmRNA水平(下图)。数据代表生物学重复(n＝3)，每个值代表平均值+/-s.d.。
图18是显示使用标记的合成肽通过质谱法的Ppp2r2d蛋白质定量的一组图表(AQUA，内源与AQUA肽的比)。代表性数据来自两次独立实验(a-d)；两侧斯氏t检验，*P<0.05，**P<0.01；平均值+/-s.d.。
图19是显示在肿瘤浸润OT-IT细胞(第7天)中，针对Ppp2r2dmRNA的qPCR分析的图表。
图20a是显示代表性流式细胞术图的图表，证实在肿瘤和肿瘤引流淋巴结中表达Ppp2r2dshRNA的T细胞的增殖。表达Ppp2r2d或LacZshRNA的OTIT细胞用CFSE进行标记，并且注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。在第1、3、5和7天时，从所示器官中分离T细胞，以基于CSFE稀释检查T细胞增殖程度。定量了不具有稀释的CFSE的T细胞(非分裂细胞)(右)。
图20b是显示证实肿瘤浸润T细胞的活力的代表性流式细胞术图的图表。将表达Pp2r2d或LacZshRNA的OT-IT细胞注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。在第7天时分离T细胞，并且利用特异于活化的半胱天冬酶-3的抗体通过细胞内染色来评价细胞凋亡(一些T细胞死亡可能由从肿瘤的分离操作引起)。
图20c是显示代表性流式细胞术图的图表，证实从B16-Ova肿瘤中收获的表达LacZ和Ppp2r2dshRNA的T细胞就IFNγ的细胞内细胞因子染色；T细胞在注射前用CFSE进行标记。所有实验的数据代表两次独立试验。对生物学重复(n＝3)执行统计分析；*P<0.05，**P<0.01，两侧斯氏t检验。每个值代表平均值+/-s.d.。
图21a-c是显示使用纳米孔装置(皮升体积的84,672个孔)在单细胞水平上肿瘤浸润OT-IT细胞的细胞因子生产的离体分析的一系列图表。a，纳米孔中的代表性单个细胞和细胞因子分泌的相应模式。b，分泌所示细胞因子的T细胞的百分比。c，由标准曲线计算的细胞因子分泌率(平均值+/-s.d.，曼怀二氏检验*P<0.05)。
图22a是显示代表性流式细胞术图的一组图表，证实大多数过继性转移的OT-I细胞具有淋巴结中的记忆表型，而在肿瘤中具有效应表型。将细胞因子预处理的表达Ppp2r2d或LacZshRNA的细胞注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。在转移后第7天时，从所示器官中收获T细胞且用CD62L和CD44抗体进行染色。通过对CD8/Thy1.1双重阳性细胞门控，执行表达shRNA的OT-I细胞的FACS分析。
图22b是显示代表性流式细胞术图的一组图表，其显示耗竭标记物的分析。从小鼠的引流淋巴结和肿瘤中收获OT-I细胞，且用特异于TIM-3、LAG-3、PD-1和CD25的抗体进行染色。对于所有实验(n＝3次生物学重复；*P<0.05、**P<0.01，两侧斯氏t检验)；每个值代表平均值+/-s.d.。
图23a是显示证实在肿瘤引流淋巴结和肿瘤中针对OT-IT细胞的颗粒酶B的细胞内染色的一组图表。
图23b是显示表达shRNA的T细胞浸润到肿瘤内的一对图像和图表。OT-IT细胞用编码GFP报道基因的LacZ或Ppp2r2dshRNA载体进行转导，并且注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。在7天后，切除肿瘤，并且用抗GFP和DAPI染色冷冻切片，以计数肿瘤中表达shRNA的OT-IT细胞。
图23c是显示对组织切片执行的TUNEL免疫组织化学且定量凋亡细胞的一对图像和图表。
图23d是显示肿瘤细胞的MHCI类表达的一组图表。肿瘤用胶原酶进行消化且用CD45.2和H-2Kb抗体进行染色。通过对CD45.2阴性黑素瘤细胞门控，执行针对H-2Kb表达的FACS分析。数据代表生物学重复(n＝3)，每个值代表平均值+/-s.d.。
详述
本公开内容部分基于下述观察：通过使用旨在鉴定阻断肿瘤浸润T细胞功能的基因的合并小发夹RNA(shRNA)筛选方法，可以在体内系统性发现导致免疫抑制肿瘤内的T细胞功能丧失的调节机制。如上文背景部分中所述，肿瘤相关的免疫抑制性机制活跃阻断肿瘤微环境中的T细胞活化。本文描述的方法鉴定尽管存在多重抑制信号，仍在肿瘤中实现强T细胞浸润和累积的shRNA。如下所述，该方法鉴定沉默基因表达的shRNA，所述基因负责通过肿瘤的免疫抑制，从而允许肿瘤中增强的T细胞浸润和累积以及对细胞凋亡的抗性增强。
在一些情况下，本公开内容提供了用于特异性鉴定调节机制的方法，所述调节机制导致肿瘤微环境内的T细胞功能丧失。这些方法可以包括：提供具有表达shRNA的载体的T细胞群体；使T细胞群体与免疫抑制肿瘤接触；测定shRNA是否恢复免疫抑制肿瘤内的T细胞功能(例如恢复T细胞在肿瘤微环境内浸润且增殖的能力)；将与恢复肿瘤内的T细胞功能的shRNA相关的基因鉴定为抑制肿瘤微环境内的T细胞功能的基因。
本公开内容提供了用于降低肿瘤的免疫抑制效应的靶基因。靶基因的表达可以在免疫细胞，例如识别肿瘤相关抗原的T细胞中被降低，并且靶基因表达的降低可以增加细胞逃避肿瘤相关免疫抑制机制的能力。
本公开内容提供了降低(例如沉默、消除、敲低、敲除或减少)损害肿瘤浸润T细胞的功能的基因的表达的shRNA。这些shRNA由shRNA转导的T细胞转移到肿瘤内随后通过深度测序以定量肿瘤和淋巴样器官中所有shRNA的表示来进行鉴定。本文公开的代表性shRNA包括降低基因活性的shRNA，所述基因包括例如Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。
在一些情况下，本公开内容提供了与shRNA相关的治疗组合物(例如包括分离的核酸分子、表达编码shRNA的核酸分子的载体)，所述shRNA沉默阻断肿瘤浸润T细胞的功能的基因的表达。在其它方面，本公开内容提供了经修饰的免疫应答细胞(例如T细胞，包括自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞)，其具有能够表达本文描述的shRNA的载体。在另一个方面，经修饰的免疫应答细胞进一步具有能够表达CAR的载体，所述CAR具有靶向肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域。
RNA干扰
生物医学研究中最重要的近期发现之一是RNA干扰(RNAi)途径，其由细胞用来调节许多基因的活性。RNAi的原理已打开了针对治疗靶鉴定的许多新可能性。RNA干扰(RNAi)是用于基因功能的基因组规模、高通量分析的有效工具。术语“RNA干扰”(RNAi)也称为转录后基因沉默(PTGS)，其是指其中RNA分子抑制基因表达的生物过程。如本文使用的，“RNA干扰试剂”定义为通过RNA干扰(RNAi)来干扰或抑制靶基因例如本发明的靶基因的表达的任何试剂。这样的RNA干扰试剂包括但不限于核酸分子，包括与靶基因例如本发明的靶基因同源的RNA分子、或其片段，短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)来干扰或抑制靶基因表达的小分子。
“RNA干扰(RNAi)”是这样的过程，其中等同于或高度相似于靶基因的序列的RNA的表达或引入导致由该被靶向的基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或PTGS，从而抑制靶基因的表达。该过程已在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中得到描述。RNAi还可以通过引入核酸分子例如合成的siRNA或RNA干扰试剂来起始，以抑制或沉默靶基因的表达。如本文使用的，“靶基因表达的抑制”或“标记物基因表达的抑制”包括靶基因(例如本发明的标记物基因)或由靶基因编码的蛋白质(例如本发明的标记物蛋白质)的表达或蛋白质活性或水平中的任何减少。与未通过RNA干扰试剂靶向的靶基因的表达或者由其编码的蛋白质的活性或水平相比，减少可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。
“短干扰RNA”(siRNA)在本文中也称为“小干扰RNA”，其定义为用于抑制靶基因的表达的试剂。这些是用于诱导RNAi的效应分子，导致利用RNA诱导沉默复合物(RISC)的转录后基因沉默。除可以化学合成的siRNA之外，以用于转录后基因沉默的潜在效应分子形式的各种其它系统是可获得的，包括短发夹RNA(shRNA)、长dsRNA、短时序RNA和微小RNA(miRNA)。这些效应分子被加工成siRNA(例如在shRNA的情况下)或直接帮助基因沉默(如在miRNA的情况下)。本发明因此涵盖shRNA以及任何其它合适形式的RNA的使用，以实现通过RNAi的转录后基因沉默。shRNA的使用具有优于化学合成的siRNA的使用的优势，因为靶基因的抑制通常是长期和稳定的。siRNA可以是化学合成的，可以通过转录经由体外产生，或可以在宿主细胞内从表达的shRNA产生。
在一个实施方案中，siRNA是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。这些shRNA包含短的(例如19-25个核苷酸)反义链，随后为5-9核苷酸的环和互补的有义链。可替代地，有义链可以在核苷酸环结构之前，并且反义链可在之后。这些shRNA可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中。
如本文使用的，由RNA干扰诱导的“基因沉默”是指细胞中靶基因的mRNA水平减少了在未引入RNA干扰的细胞中发现的mRNA水平的至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。在一个优选实施方案中，mRNA水平减少至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。
如本文使用的，术语“降低的”或“降低”一般意指与参考水平相比较，至少10％的减少，例如与参考水平相比较，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的减少或多至且包括100％的减少，或在10-100％之间的任何整数减少。
如本文使用的，术语“增加的”或“增加”一般意指与参考水平相比较，至少10％的增加，例如与参考水平相比较，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加或多至且包括100％的增加，或在10-100％之间的任何整数增加，或与参考水平相比较约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍或约10倍的增加、或在2倍和10倍之间或更大的任何增加。
免疫应答细胞
在一些实施方案中，本公开内容提供了表达至少一种抗原识别受体的免疫应答细胞，包括T细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性(CD4)T细胞和自然杀伤(NKT)细胞。在任何方面，免疫应答细胞表达至少一种肿瘤特异性抗原识别受体。在一些方面，使用肿瘤细胞抗原特异性T细胞、NKT细胞、TIL、CTL细胞或其它免疫应答细胞。免疫应答细胞的非限制性例子包括T细胞，例如αβ-TCR+T细胞(例如CD8+T细胞或CD4+T细胞)γδ-TCR+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
核酸组合物
在一些实施方案中，本公开内容提供了编码shRNA序列的分离的核酸，所述shRNA序列包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列至少12、15、20或25个连续核苷酸互补的序列。shRNA还包括连续核苷酸序列的反向互补体和位于两个序列之间的短序列，
以使得两个序列形成茎环shRNA，其可以在细胞内进行加工以提供抑制由SEQIDNO:604-620和653-677之一编码的蛋白质的表达的siRNA及其组合物。
表1提供了本文鉴定为涉及T细胞的肿瘤免疫抑制的基因的列表。
表1
在一些方面，组合物的核酸编码靶向表2中提供的序列的shRNA序列。表2还显示了基于深度测序分析，针对所选shRNA在肿瘤相对于脾中的富集(“富集倍数”)。
表2
在肿瘤相对于脾中显示至少≥3的shRNA富集倍数的shRNA指示更具活性的靶序列区。
在一些方面，组合物的核酸编码靶向表2a中提供的人Ppp2r2d和Cblb序列的shRNA序列。
表2a.
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Ppp2r2d靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Ppp2r2d靶序列等同于SEQIDNO:372、373、374、375、376、377、378、378、379、380、381、382、383、384、385或386中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Pp2r2d序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Pp2r2d序列对应于SEQIDNO:372、373、374、375、376、377、378、378、379、380、381、382、383、384、385或386中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Eif2ak3靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Eif2ak3靶序列等同于SEQIDNO:133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146或147中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Eif2ak3序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Eif2ak3序列对应于SEQIDNO:133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146或147中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Arhgap5靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Arhgap5靶序列等同于SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Arhgap5序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Arhgap5序列对应于SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Smad2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Smad2靶序列等同于SEQIDNO:476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489或490中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Smad2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Smad2序列对应于SEQIDNO:476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489或490中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Akap8l靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Akap8l靶序列等同于SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Akap8l序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Akap8l序列对应于SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Rbks靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Rbks靶序列等同于SEQIDNO:431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444或445中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Rbks序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Rbks序列对应于SEQIDNO:431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444或445中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Egr2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Egr2靶序列等同于SEQIDNO:118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Egr2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Egr2序列对应于SEQIDNO:118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Dgka靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Dgka靶序列等同于SEQIDNO:88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Dgka序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Dgka序列对应于SEQIDNO:88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Cblb靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Cblb靶序列等同于SEQIDNO:58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Cblb序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Cblb序列对应于SEQIDNO:58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Mdfic靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Mdfic靶序列等同于SEQIDNO:285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298或299中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Mdfic序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Mdfic序列对应于SEQIDNO:285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298或299中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Entpd1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Entpd1靶序列等同于SEQIDNO:148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161或162中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Entpd1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Entpd1序列对应于SEQIDNO:148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161或162中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Vamp7靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Vamp7靶序列等同于SEQIDNO:574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586或587中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Vamp7序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Vamp7序列对应于SEQIDNO:574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586或587中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Hipk1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Hipk1靶序列等同于SEQIDNO:208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221或222中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Hipk1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Hipk1序列对应于SEQIDNO:208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221或222中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Nuak2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Nuak2靶序列等同于SEQIDNO:315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328或329中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Nuak2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Nuak2序列对应于SEQIDNO:315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328或329中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Alk靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Alk靶序列等同于SEQIDNO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Alk序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Alk序列对应于SEQIDNO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Pdzk1ip1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Pdzk1ip1靶序列等同于SEQIDNO:330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340或341中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Pdzk1ip1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Pdzk1ip1序列对应于SEQIDNO:330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340或341中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Blvrb靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Blvrb靶序列等同于SEQIDNO:52、53、54、55、56或57中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Blvrb序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Blvrb序列对应于SEQIDNO:52、53、54、55、56或57中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Cdkn2a靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Cdkn2a靶序列等同于SEQIDNO:83、84、85、86或87中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Cdkn2a序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Cdkn2a序列对应于SEQIDNO:83、84、85、86或87中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与F11r靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述F11r靶序列等同于SEQIDNO:175、176或177中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人F11r序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人F11r序列对应于SEQIDNO:175、176或177中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Fyn靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Fyn靶序列等同于SEQIDNO:187、191或192中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Fyn序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Fyn序列对应于SEQIDNO:187、191或192中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Grk6靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Grk6靶序列等同于SEQIDNO:204、205、206或207中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Grk6序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Grk6序列对应于SEQIDNO:204、205、206或207中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Inpp5b靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Inpp5b靶序列等同于SEQIDNO:232、234、235、236或237中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Inpp5b序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Inpp5b序列对应于SEQIDNO:232、234、235、236或237中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Impk靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Impk靶序列等同于SEQIDNO:248、249、250、251或252中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Impk序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Impk序列对应于SEQIDNO:248、249、250、251或252中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Jun靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Jun靶序列等同于SEQIDNO:263、264、265、266、267、268或269中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Jun序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Jun序列对应于SEQIDNO:263、264、265、266、267、268或269中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Mast2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Mast2靶序列等同于SEQIDNO:281、282、283或284中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Mast2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Mast2序列对应于SEQIDNO:281、282、283或284中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Nptxr靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Nptxr靶序列等同于SEQIDNO:311、312、313或314中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Nptxr序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Nptxr序列对应于SEQIDNO:311、312、313或314中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Pkd1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Pkd1靶序列等同于SEQIDNO:351、352、353、354、355或356中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Pkd1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Pkd1序列对应于SEQIDNO:351、352、353、354、355或356中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Ppm1g靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Ppm1g靶序列等同于SEQIDNO:367、368、369、370或371中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Ppm1g序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Ppm1g序列对应于SEQIDNO:367、368、369、370或371中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Ppp3cc靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Ppp3cc靶序列等同于SEQIDNO:399、400或401中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Ppp3cc序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Ppp3cc序列对应于SEQIDNO:399、400或401中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Prkab2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Prkab2靶序列等同于SEQIDNO:414、415或416中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Prkab2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Prkab2序列对应于SEQIDNO:414、415或416中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Ptpn2靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Ptpn2靶序列等同于SEQIDNO:426、427、428、429或430中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Ptpn2序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Ptpn2序列对应于SEQIDNO:426、427、428、429或430中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Rock1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Rock1靶序列等同于SEQIDNO:457、458、459或460中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Rock1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Rock1序列对应于SEQIDNO:457、458、459或460中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Sbf1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Sbf1靶序列等同于SEQIDNO:470、471、472、473、474或475中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Sbf1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Sbf1序列对应于SEQIDNO:470、471、472、473、474或475中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Socs1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Socs1靶序列等同于SEQIDNO:504、505、506、507、508、509或510中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Socs1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Socs1序列对应于SEQIDNO:504、505、506、507、508、509或510中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Socs3靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Socs3靶序列等同于SEQIDNO:524、525、526、527或528中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Socs3序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Socs3序列对应于SEQIDNO:524、525、526、527或528中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Stk17b靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Stk17b靶序列等同于SEQIDNO:539、540、541、542或543中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Stk17b序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Stk17b序列对应于SEQIDNO:539、540、541、542或543中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Tnk1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Tnk1靶序列等同于SEQIDNO:556、557或558中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Tnk1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Tnk1序列对应于SEQIDNO:556、557或558中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Trpm7靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Trpm7靶序列等同于SEQIDNO:569、570、571、572或573中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Trpm7序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Trpm7序列对应于SEQIDNO:569、570、571、572或573中所示的鼠靶序列。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码与Yes1靶序列互补的shRNA序列的分离的核酸，所述Yes1靶序列等同于SEQIDNO:600、601、602或603中所示的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本公开内容提供了编码包含与人Yes1序列互补的序列的shRNA的分离的核酸，所述人Yes1序列对应于SEQIDNO:600、601、602或603中所示的鼠靶序列。
在任何实施方案中，对应于鼠靶序列的人序列是完全对应于人基因序列的序列，并且例如可以与所选鼠靶序列的至少12、至少15、至少20、或至少25个连续核苷酸具有0、1、2、3或4个核苷酸错配。
分离的核酸可以是例如DNA分子，条件是天然存在的基因组中通常发现紧侧接该DNA分子的核酸序列之一被去除或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于不依赖于其它序列，作为单独的分子存在的DNA分子(例如化学合成的核酸、cDNA或者通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的基因组DNA片段)，以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒)、或者原核生物或真核生物的基因组DNA内的DNA。另外，分离的核酸可以包括经改造的核酸，例如其为杂交或融合核酸的一部分的重组DNA分子。在例如cDNA文库或基因组文库内的数百至数百万其它核酸中或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶切片中存在的核酸不视为分离的核酸。
在计算百分比序列同一性中，将两个序列比对且测定两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配数目。将相同匹配的数目除以比对区的长度(即，比对的核苷酸或氨基酸残基的数目)，并且乘以100以获得百分比序列同一性值。应当理解比对区的长度可以是一个或两个序列的一部分直到最短序列的全长大小。还应当理解单一序列可以与超过一个其它序列比对，并且因此可以在每个比对区上具有不同的百分比序列同一性值。应当指出百分比同一性值通常四舍五入至最近整数。例如，78.1％、78.2％、78.3％和78.4％向下舍入为78％，而78.5％、78.6％、78.7％、78.8％和78.9％向上舍入为79％。还应当指出比对区的长度始终是整数。
如本文使用的，术语“百分比序列同一性”指任何给定问询序列和主题序列之间的同一性程度。任何问询核酸或氨基酸序列例如转录因子相对于另一种主题核酸或氨基酸序列的序列同一性可以如下进行测定。
如本文使用的，术语“互补核苷酸序列”也称为“反义序列”，其是指与编码蛋白质的“有义”核酸的序列完全互补(例如，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补)的核酸序列。在本文中，提供了核酸分子，其包含与至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸或者整个基因编码链或仅其部分互补的序列。
如本文使用的，术语“对应于核苷酸序列”指编码相同序列的核酸的核苷酸序列。在一些情况下，当反义核苷酸(核酸)或siRNA(小抑制性RNA)与靶序列杂交时，特定反义或小抑制性RNA(siRNA)序列与靶序列基本上互补，并且因此将与编码多肽的mRNA的部分特异性结合。像这样，通常，那些核酸的序列将与mRNA靶序列高度互补，并且在整个序列上将具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基错配。在许多情况下，可以期望核酸序列是确切匹配的，即与寡核苷酸特异性结合于的序列完全互补，并且因此沿互补段具有零个错配。高度互补的序列通常与mRNA的靶序列区非常特异性地结合，并且因此在降低和/或甚至抑制靶mRNA序列翻译成多肽产物中是高度有效的。
如本文使用的，术语“载体”指任何病毒或非病毒载体，以及以双链或单链线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或二元载体，其可以是或不是自身可传播或可移动的，并且可以通过整合到细胞基因组内或可染色体外存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主细胞。本领域已知的任何载体均可用于本发明的实践。
载体可以是病毒载体或非病毒载体。如果使用病毒载体，优选病毒载体是复制缺陷型的，其可以例如通过去除编码复制的所有病毒核酸来实现。复制缺陷型病毒载体仍保留其感染特性，并且以与复制型腺病毒载体类似的方式进入细胞，然而，一旦进入细胞，复制缺陷型病毒载体不复制或倍增。载体还涵盖将DNA分子递送至细胞的脂质体和纳米颗粒以及其它方式。
术语“病毒载体”指使用病毒或病毒相关载体作为核酸构建体进入细胞内的载体。构建体可以整合且包装至非复制、缺陷型病毒基因组，如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或单纯疱疹病毒(HSV)或其它，包括逆转录病毒和慢病毒载体，用于感染或转导到细胞内。载体可以掺入或不掺入细胞的基因组内。
“编码”指特定核苷酸序列在多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中充当用于在生物过程中合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其它聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由其产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列等同于mRNA序列且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可被称作为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文使用的，术语“表达”定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。因此，“表达载体”是包含重组多核苷酸的专门化载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些载体，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)、和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一些方面，本公开内容提供了经修饰的细胞，其具有能够表达本文描述的shRNA的载体，并且被进一步修饰以表达CAR。在一个方面，shRNA和CAR在相同载体上表达。在另一个方面，shRNA和CAR在分开的载体上表达。
在一些实施方案中，本文描述的经修饰的细胞是免疫应答细胞。在一些方面，免疫应答细胞表达至少一种抗原识别受体。在任何方面，免疫应答细胞表达至少一种肿瘤特异性抗原识别受体。在一些方面，使用肿瘤细胞抗原特异性T细胞、NKT细胞、TIL、CTL细胞或其它免疫应答细胞。免疫应答细胞的非限制性例子包括T细胞，例如αβ-TCR+T细胞(例如CD8+T细胞或CD4+T细胞)γδ-TCR+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
包含本发明的免疫应答细胞(例如T细胞、NKT细胞、TIL、CTL细胞或其祖细胞)的组合物可以全身性地或直接提供给受试者用于癌症治疗。在一个实施方案中，本发明的细胞直接注射到目的器官(例如受癌症侵袭的器官)内。可替代地，例如通过施用到循环系统(例如肿瘤脉管系统)内，将包含遗传修饰的免疫应答细胞的组合物间接提供给目的器官。扩增和分化试剂可以在细胞施用之前、期间或之后提供，以增加T细胞、NKT细胞、TIL、CTL细胞的体外或体内生产。
经修饰的免疫应答细胞可以在任何生理学可接受的媒介物中施用，通常为血管内地施用，尽管还可以将它们引入骨或其它方便部位，在其中细胞可以发现用于再生和分化的适当部位(例如胸腺)。通常，将施用至少1×105细胞，最终达到1×1010或更多。本发明的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种公知的方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)，容易地测定群体中的经遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。包含经遗传修饰的免疫应答细胞的群体中的优选纯度范围为约50至约55％、约55至约60％和约65至约70％。更优选地，纯度为约70至约75％、约75至约80％、约80至约85％；更优选地，纯度为约85至约90％、约90至约95％和约95至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调整(例如纯度的减少可能需要剂量的增加)。
细胞可以通过注射、导管等引入。需要时，还可包括因子，包括但不限于白细胞介素例如IL-2、IL-3、IL-6和IL-11及其它白细胞介素，集落刺激因子例如G-、M-和GM-CSF，干扰素例如γ干扰素和促红细胞生成素。
本发明的组合物包括药物组合物，其包含本发明的免疫应答细胞或其祖细胞以及药学可接受的载体。施用可以是自体或异体的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获自一个受试者，并施用至同一受试者或不同的相容受试者。
嵌合抗原受体
在一些情况下，本发明提供了包含针对肿瘤细胞抗原的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是人工构建的杂交蛋白质或多肽，其含有识别肿瘤细胞抗原的细胞外部分(例如抗体(scFv)的抗原结合结构域)和来源于T细胞受体和共刺激结构域的细胞质信号传导结构域。(KalosM等人，SciTranslMed.2011Aug10；3(95))Kalos等人描述了靶向CD19的CART细胞的生成，并且显示CAR修饰的T细胞在慢性淋巴细胞白血病患者中介导有力的抗肿瘤效应。CAR的特征包括其通过利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式重新指导针对所选靶的T细胞特异性和反应性的能力。CAR修饰的T细胞具有在体内复制的潜力，并且长期的持久性允许持续的肿瘤控制且避免抗体重复输注的需要。(KalosM等人，SciTranslMed.2011Aug10；3(95))非MHC限制性抗原识别给予表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。CAR修饰的T细胞在WO2012/079000和WO2012/09999以及Milone等人2009Mol.Ther.17:1453中详细描述。
CAR组合识别被靶向的抗原的分子的结合位点(即，“抗原结合结构域”)与负责起始信号转导(其导致淋巴细胞活化)的常规免疫受体的一个或多个结构域(例如“刺激结构域”或“信号传导结构域”)。
在一些实施方案中，使用的结合部分来源于单克隆抗体(mAb)的Fab(抗原结合)片段的结构，所述单克隆抗体对于被靶向的肿瘤抗原具有高亲和力。因为Fab是两种基因的产物，所以相应序列通常经由短接头片段组合，所述短接头片段允许重链在轻链衍生肽上折叠成其天然构型，从而产生单链片段可变(scFv)区。
Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。
在一些实施方案中，所使用的结合部分衍生自来源于T细胞受体和共刺激分子的细胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR的信号传导部分通常含有TCR/CD3复合物的zeta(ζ)链25、或较不常见地免疫球蛋白受体FcεRI的gamma(γ)链26,27、或CD3-epsilon(ε)链28的细胞内结构域，其中跨膜区来源于同一分子。
在一些方面，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。本发明的其它实施方案提供了相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、以及与本发明的CAR相关的药物组合物。
在一个方面，抗原结合结构域与肿瘤细胞抗原结合。如本文使用的，术语“肿瘤细胞抗原”或“肿瘤抗原”指由肿瘤表达的能够诱导免疫应答的任何多肽。肿瘤抗原的非限制性例子包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD333/IL3Ra、c-Met、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV-K-MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707-AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK、DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT、NPM1-ALK1、PML-RARA、SYT-SSX1、SYT-SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL-2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3-FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68及其任何组合。
本发明一般涉及T细胞的用途，所述T细胞经遗传修饰以稳定表达本发明的shRNA和所需CAR。表达CAR的T细胞一般被称为CART细胞。表达CAR的T细胞在本文中被称为CART细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，细胞可以进行遗传修饰，以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，从而赋予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些情况下，T细胞经遗传修饰以稳定表达CAR，其组合特异性抗体的抗原识别结构域与细胞内刺激结构域(例如信号传导结构域)。因此，除抗原结合结构域之外，CAR可以包括TCR/CD3复合物的zeta(ζ)链、免疫球蛋白受体FcεRI26，27的gamma(γ)链或CD3-epsilon(ε)链的细胞内结构域。CAR还可以包括来自同一分子或其它I型跨膜蛋白质例如CD4、CD8和CD28的跨膜区。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含具有抗原识别结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。
在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然结合的跨膜结构域。在另一个实施方案中，细胞质结构域可以被设计为包含刺激结构域和共刺激结构域。
CAR可以包括共刺激分子例如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS或DAP10的细胞质内部分。
本公开内容还涉及过继性细胞疗法(ACT)的策略。ACT是其中治疗性淋巴细胞被施用于患者以治疗癌症的程序。这种方法需要肿瘤特异性T细胞淋巴细胞的离体生成和将其输注给患者。除淋巴细胞输注以外，宿主可以以其它方式进行操作，所述方式支持T细胞及其免疫应答的获得，例如使宿主预条件化(使用放射或化学疗法)和淋巴细胞生长因子(例如IL-2)的施用。用于生成这样的肿瘤特异性淋巴细胞的一种方法涉及抗原特异性T细胞的扩增。
在一个实施方案中，本发明提供了生成表达本发明的shRNA和针对肿瘤抗原的所需CAR的T细胞。经修饰的T细胞可以通过将载体(例如质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)引入细胞内来生成，所述载体编码1)本文描述的能够降低靶基因表达的shRNA和2)所需的CAR。本发明的经修饰的T细胞能够在体内复制，从而导致长期的持久性，这可导致肿瘤控制。
在一个方面，本公开内容提供了治疗癌症的方法，其包括施用能够沉默抑制T细胞功能的基因的组合物。在一个实施方案中，该方法涉及施用T细胞，其表达本发明的shRNA和针对肿瘤抗原的所需CAR。在一个方面，待施用的T细胞包含编码本发明的shRNA和针对肿瘤抗原的所需CAR的载体。
药物制剂
在一些情况下，除肿瘤靶向T细胞之外，本文公开的治疗组合物还可以包括用于癌症治疗的化合物、药物和/或试剂。这样的化合物、药物和/或试剂可以包括例如化学治疗药物、小分子药物或抗体，其刺激针对给定癌症的免疫应答。在其它情况下，治疗组合物可以包括例如一种或多种小分子抑制剂，其沉默、降低、消除、敲低、敲除或降低选自下述的基因的表达和/或活性：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。相应地，本发明提供了Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc的一种或多种抑制剂。
在一个方面，本发明提供了Ppp2r2d的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Eif2ak3的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Arhgap5的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Smad2的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Akap81的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Rbks的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Egr2的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Dgka的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Cblb的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Map3k3的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了vMdfic的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Entpd1的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Dgkz的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Vamp7的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Nuak2的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Hipk1的一种或多种抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了Alk的一种或多种抑制剂。在一个实施方案中，Alk的抑制剂包括例如CH5424802(Hoffmann-LaRoche)、LDK378(Novartis)、克唑替尼和PF-02341066(Pfizer)或AP26113(AriadPharmaceuticals)。
在另一个方面，本发明提供了Pdzk1ip1的一种或多种抑制剂。
在一些情况下，治疗组合物可以包括例如细胞因子、趋化因子和其它生物信号传导分子、肿瘤特异性疫苗、细胞癌症疫苗(例如GM-CSF转导的肿瘤细胞)、肿瘤特异性单克隆抗体、自体和异体干细胞援救(例如以增加移植物抗肿瘤效应)、其它治疗抗体、分子靶向疗法、抗血管生成疗法、具有治疗意图的感染原(例如肿瘤定位细菌)和基因疗法。
在一些情况下，本文公开的治疗组合物可以被配制用作药物组合物或用于药物组合物中。这样的组合物可以被配制或调整用于经由任何途径，例如由食品和药物管理局(FDA)批准的任何途径，施用至受试者。示例性方法在FDA’sCDERDataStandardsManual，版本号004(其可在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm处获得)中描述。
在一些情况下，药物组合物可以包括有效量的一种或多种肽。如本文使用的，术语“有效量”和“有效治疗”是指一种或多种肽在一段时间内(包括急性或慢性施用和定期或连续施用)在其施用背景下有效用于引起预期效应或生理结果的量或浓度。
本发明的药物组合物可以含有任何常规无毒药学可接受的载体、佐剂或媒介物。在一些情况下，制剂的pH可以用药学可接受的酸、碱或缓冲剂进行调整，以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。
方法
在一些情况下，方法可以包括选择患有或已患有病状或疾病(例如癌症)的人受试者。在一些情况下，合适的受试者包括例如患有或已患有病状或疾病但解决了疾病或其一方面、呈现减少的疾病症状(例如相对于患有病状或疾病的其它受试者(例如大多数受试者))、和/或在病状或疾病的情况下存活延长时间段(例如相对于患有病状或疾病的其它受试者(例如大多数受试者))例如处于无症状状态(例如相对于患有病状或疾病的其它受试者(例如大多数受试者))的受试者。
如本文使用的，术语“受试者”指任何动物。在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，如本文使用的，术语“受试者”指人(例如男人、女人或小孩)。用于方法中的样品可以包括血清样品，例如获自所选受试者。
在一些情况下，受试者选择可以包括从受试者(例如候选受试者)中获得样品，并且就受试者适合于选择的指征测试样品。在一些情况下，受试者可以例如通过卫生保健专业人士确认或鉴定为已患有或患有病状或疾病。在一些情况下，针对病状或疾病的阳性免疫应答的展现可以由患者记录、家族史和/或检测阳性免疫应答的指征制成。在一些情况下，多方可以包括在受试者选择中。例如，第一方可以从候选受试者中获得样品，并且第二方可以测试样品。在一些情况下，受试者可以由医学从业者(例如一般从业者)选择和/或参考。在一些情况下，受试者选择可以包括从所选受试者中获得样品，并且贮存样品和/或用于本文公开的方法中。样品可以包括例如细胞或细胞群体。
使用方法
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于增加有此需要的受试者中的免疫应答的方法。本公开内容提供了可特别用于治疗患有癌症的受试者的疗法。在一些情况下，本公开内容提供了治疗方法，其包括给受试者施用本文公开的组合物。
本文提供的是用于治疗和/或预防受试者中的癌症或癌症症状的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的能够沉默抑制T细胞功能的基因的组合物(例如表达本发明的shRNA和针对肿瘤抗原的所需CAR的免疫应答T细胞)。在一些情况下，T细胞来源于待治疗的患者并被修饰以表达CAR和本文描述的降低靶基因表达的shRNA。
在一些实施方案中，癌症是癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、神经胶质瘤、食道癌和肝癌，包括肝肿瘤，淋巴瘤，包括B急性成淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特、小细胞和大细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤，白血病(包括AML、ALL和CML)，以及多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞的恶性肿瘤前病状。在一些实施方案中，受试者已诊断为患有癌症或易患癌症。
如本文使用的，“癌症”指人癌症和癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、神经胶质瘤、食道癌和肝癌，包括肝肿瘤，淋巴瘤，包括B急性成淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特、小细胞和大细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤，白血病(包括AML、ALL和CML)，以及多发性骨髓瘤。
如本文使用的，术语“抗肿瘤效应”是指可以通过下述体现的生物效应：肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移灶数目的减少、预期寿命的增加、或与癌性病状相关的各种生理学症状的改善。“抗肿瘤效应”还可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤的起初发生中的能力来体现。
如本文使用的，术语“治疗”或“治疗性”指部分或完全减轻、抑制、改善和/或缓解受试者遭受的疾病或病状。在一些情况下，治疗可以导致受试者遭受的疾病或病状的连续不存在。
一般而言，方法包括选择处于病状或疾病的风险中或者患有病状或疾病的受试者。在一些情况下，受试者的病状或疾病可以用本文公开的药物组合物进行治疗。例如，在一些情况下，方法包括选择患有癌症的受试者，例如其中受试者的癌症可以通过增加肿瘤内的T细胞累积和浸润进行治疗。
在一些情况下，治疗方法可以包括根据需要的单次施用、多次施用和重复施用，用于预防或治疗受试者遭受的疾病或病状。在一些情况下，治疗方法可以包括在治疗之前、在治疗期间和/或在治疗后，评价受试者中的疾病水平。在一些情况下，治疗可以继续直至检测到受试者中疾病水平的减少。
在施用后，可以对受试者进行评估以检测、评价或测定其疾病水平。在一些情况下，治疗可以继续直至检测到受试者中疾病水平的变化(例如降低)。
在患者的病状改善(例如受试者中的疾病水平的变化(例如减少)后，需要时，可以施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，作为症状的函数，施用剂量或频率或两者可以降低至改善的病状在其下得到保持的水平。然而，在疾病症状的任何复发后患者可能需要在长期基础上的间歇治疗。
还在本发明的范围内的是将本文公开的任何方法和任何组合物与一种或多种治疗试剂组合。治疗试剂包括但不限于小分子、肽、抗体、核酶、反义寡核苷酸、化学治疗试剂和放射。
还在本发明的范围内的是将本文公开的任何方法和任何组合物与常规癌症疗法和各种药物组合以通过降低常规疗法的剂量/毒性和/或增加常规疗法的敏感性来增强这样的疗法的功效。一种常规疗法是使用放射疗法。另一种常规疗法是使用化学治疗药物，其可以分成：烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和抗肿瘤试剂。所有这些药物均以一定方式影响细胞分裂或DNA合成和功能。其它常规癌症疗法是不直接干扰DNA的试剂。用于与本发明组合的这样的试剂的例子可以包括例如阻断涉及癌细胞生长的特定酶的“小分子”药物。单克隆抗体、癌症疫苗、血管生成抑制剂和基因疗法是还可与本文公开的组合物和方法组合的靶向疗法，因为它们也干扰癌细胞的生长。
筛选测试化合物的方法
本文包括的是用于筛选测试化合物的方法，所述测试化合物为例如多肽、多核苷酸、无机或有机的大或小分子测试化合物，以鉴定可用于癌症治疗的试剂，例如沉默、降低、消除、敲低、敲除、调节或降低选自下述的基因的表达和/或活性的测试化合物：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。
如本文使用的，“小分子”是指分子量低于约3,000道尔顿的小的有机或无机分子。一般而言，可用于本发明的小分子具有低于3,000道尔顿(Da)的分子量。小分子可以是例如至少约100Da至约3,000Da(例如约100至约3,000Da、约100至约2500Da、约100至约2,000Da、约100至约1,750Da、约100至约1,500Da、约100至约1,250Da、约100至约1,000Da、约100至约750Da、约100至约500Da、约200至约1500、约500至约1000、约300至约1000Da、或约100至约250Da)。
测试化合物可以是例如天然产物或组合化学文库的成员。应使用一组多样性分子以覆盖各种功能，例如电荷、芳香性、氢键合、柔性、大小、侧链的长度、疏水性和刚性。适合于合成小分子的组合技术是本领域已知的，例如如通过Obrecht和Villalgordo，Solid-Supported CombinatorialandParallelSynthesisofSmall-Molecular-Weight CompoundLibraries，Pergamon-ElsevierScienceLimited(1998)例示的，并且包括技术例如“拆分和合并”或“平行”合成技术、固相和溶液相技术、和编码技术(参见例如Czarnik，Curr.Opin.Chem.Bio.1:60-6(1997))。另外，许多小分子文库是商购可得的。许多合适的小分子测试化合物在美国专利号6,503,713中列出，所述专利通过引用全文并入本文。
使用本发明的方法筛选的文库可以包含各种类型的测试化合物。给定文库可以包含一组结构相关或无关的测试化合物。在一些实施方案中，测试化合物是肽或拟肽分子。在一些实施方案中，测试化合物是核酸。
在一些实施方案中，测试化合物及其文库可以通过下述获得：例如使用本领域已知的方法或本文描述的方法，系统性改变第一测试化合物(例如结构上类似于靶多肽的已知天然结合配偶体的第一测试化合物或鉴定为能够结合靶多肽的第一小分子)的结构，并且使该结构与所得到的生物活性关联，例如结构-活性关系研究。如本领域技术人员将理解的，存在用于生成这样的结构-活性关系的各种标准方法。因此，在一些情况下，工作可以在很大程度上是凭经验的，并且在其它情况下，内源多肽或其部分的三维结构可以用作一种或多种小分子化合物的合理设计的起点。例如，在一个实施方案中，例如使用本文描述的方法筛选小分子的一般文库。
在一些实施方案中，将测试化合物应用于测试样品，例如细胞或活组织或器官，例如眼，并且评估测试化合物的一种或多种效应。例如在培养的或原代细胞中，评估测试化合物沉默、降低、消除、敲低、敲除、调节或降低选自下述的基因的表达和/或活性的能力：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。
在一些实施方案中，测试样品是或来源于(例如从其获取样品)如本文描述的病症的体内模型。例如，可以使用动物模型例如啮齿类动物例如大鼠。
用于评估这些效应的每一种的方法是本领域已知的。例如，调节蛋白质表达的能力可以例如使用定量PCR或免疫测定方法，在基因或蛋白质水平下进行评估。在一些实施方案中，如本领域已知的高通量方法例如蛋白质或基因芯片(参见例如，Griffiths等人编辑的Modern geneticAnalysis，1999,W.H.FreemanandCompany中的第12章，Genomics；Ekins和Chu，TrendsinBiotechnology，1999，17:217-218；MacBeath和Schreiber，Science2000，289(5485):1760-1763；Simpson，ProteinsandProteomics:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress；2002；Hardiman，MicroarraysMethodsand Applications:Nuts&Bolts，DNAPress，2003)，可以用于检测对Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc活性或基因表达的效应。
已通过本文描述的方法筛选且被测定为沉默、降低、消除、敲低、敲除或降低选自下述的基因的表达和/或活性的测试化合物可以视为候选化合物：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。已例如在病症例如癌症的体内模型中筛选且被测定为对病症例如对病症的一个或多个症状具有期望效应的候选化合物可以视为候选治疗试剂。经临床背景下筛选后，候选治疗试剂为治疗试剂。候选化合物、候选治疗试剂和治疗试剂可以任选进行优化和/或衍生，并用生理学可接受的赋形剂进行配制，以形成药物组合物。
因此，可以选择在第一筛选中被鉴定为“苗头化合物(hit)”的测试化合物(例如抑制由肿瘤细胞用来使免疫细胞失活和/或抑制免疫细胞的免疫抑制途径的测试化合物)，并且例如使用合理设计进行系统性改变，以优化结合亲和性、亲合力、特异性或其它参数。这样的优化还可以使用本文描述的方法进行筛选。因此，在一个实施方案中，本发明包括使用本领域已知和/或本文描述的方法筛选化合物的第一文库，鉴定该文库中的一个或多个苗头化合物，对那些苗头化合物实施系统性结构改变，以制备与苗头化合物结构上相关的化合物的第二文库，以及使用本文描述的方法筛选第二文库。
实施例
本发明在下述实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
近期工作已显示细胞毒性T细胞在免疫介导的癌症控制中起关键作用1-3，并且靶向T细胞上的抑制性受体的单克隆抗体可以在患有晚期疾病的患者中诱导显著的临床益处4-6。然而，导致免疫抑制肿瘤内的T细胞功能丧失的许多调节机制仍是未知的。在下述实施例中，本发明人证实这样的调节机制可以在肿瘤微环境中体内系统性发现。本发明人假定尽管存在多重抑制信号，靶向关键抑制剂的shRNA会实现肿瘤中的强T细胞浸润和累积。通过使用旨在鉴定阻断肿瘤浸润CD8T细胞功能的基因的合并shRNA筛选方法，通过将shRNA转导的T细胞转移到荷瘤小鼠内，随后进行深度测序以定量肿瘤和淋巴样器官中的所有发夹的表示，来发现候选shRNA。大多数shRNA诱导肿瘤而非脾中的T细胞累积，证实了发现在组织间具有差异作用的shRNA的可行性。一种靶是Ppp2r2d，其是PP2A磷酸酶的调节亚基7。对照shRNA转导的T细胞在识别黑素瘤细胞后经历细胞凋亡，而Ppp2r2dshRNA转导的T细胞因增强的增殖和对凋亡的抗性而在肿瘤中累积。表达Ppp2r2dshRNA的T细胞还显著延迟肿瘤生长。这种体内方法具有广泛应用，以剖析相关组织微环境中的复杂免疫功能。
免疫细胞执行遍及全身的复杂监视功能，并且在不同的组织微环境中与许多不同类型的细胞相互作用。用于调节免疫应答的治疗靶通常在体外进行鉴定，且在过程晚期时在动物模型中进行测试。此处，本发明人已解决用于免疫调节的靶可如何在体内系统性发现的挑战。这是肿瘤学中的关键问题，因为通过CD8T细胞(其具有针对肿瘤细胞的细胞毒性功能)的强浸润与多种类型的人癌症中的有利预后相关1,3,8。不幸的是，这种天然防御机制在大多数患者中被源自肿瘤、其基质、调节T细胞和髓样细胞群体的多重抑制信号严重减弱。9-11
合并的shRNA文库已显示为有力的发现工具12-14。本发明人推理通过利用在通过肿瘤相关抗原触发T细胞受体后T细胞的广泛增殖能力，可以在体内系统性发现能够恢复CD8T细胞功能的shRNA。当引入T细胞内时，仅来自库的shRNA的小子集将恢复T细胞增殖，导致其在肿瘤内的富集。通过对来自肿瘤和次级淋巴样器官的shRNA盒进行深度测序，可以定量在每个库内的活性shRNA的过度表示(图1)。
实验动物。C57BL/6小鼠、TRP-1小鼠(表达特异于酪氨酸酶相关蛋白质1的T细胞受体(TCR)的转基因小鼠) 23 、pmel-1小鼠(表达特异于gp100的TCR的转基因小鼠) 18 、和b2m-/-小鼠 24 购自TheJacksonLaboratory。Rag1-/-OT-I小鼠 16 购自TaconicFarms，Inc。小鼠在Dana-FarberCancerInstitute动物设施中进行育种。所有实验程序均得到Dana-FarberCancerInstitute动物护理和使用委员会批准。
细胞系。B16黑素瘤是难以治疗的侵袭性肿瘤，其表达替代肿瘤抗原卵白蛋白(Ova)，其由来自OT-IT细胞受体转基因小鼠的CD8T细胞识别16,17。EL4胸腺瘤 38 和B16-F10黑素瘤 15 细胞在RPMI1640中进行维持，所述RPMI1640补充有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素。表达卵白蛋白的B16肿瘤细胞(B16-Ova)在添加600μg/mLG418(Invitrogen)的相同培养基中进行维持。
载体和shRNA序列。shRNA针对在功能障碍的T细胞(无能或耗竭状态)中过表达的255种基因进行选择。pLKO.3G载体得自TheRNAiConsortium。从pLKO.3G载体通过将GFP替换为相应的报道基因修饰pLKO-Thy1.1、pLKO-Ametrine、pLKO-RFP、pLKO-TFP载体。通过10种所选shRNA靶向的鼠Ppp2r2d和Cblb序列在表3中提供(以shRNA活性的次序列出(最高至最低))。还列出了通过对照shRNA靶向的LacZ靶序列。所有其它靶序列可以在表2中发现。
表3.
抗体和流式细胞术。单细胞悬浮液在PBS、2％FBS中用标记抗体在4℃下染色20分钟，随后为用冰冷的PBS、2％FBS的洗涤两次。使用FACSAria(BDBiosciences)和FlowJo软件(TriStar)分析/分选细胞。使用的抗体特异于CD4、CD8、Vα2、Vβ5.1/5.2、Thy1.1、CD25、CD44、CD62L、CD69、CD122、CD127、IFNγ、TNFα(BioLegend)、PD-1、TIM-3、LAG-3、颗粒酶B和H-2Kb(BioLegend)、Vα3.2(eBioscience)、Vβ13、Vβ14(BDBiosciences)、磷酸-Akt(Ser473)和磷酸-Bad(Ser112)(CellSignaling)。凋亡细胞通过用膜联蛋白V(BioLegend)或活化的半胱天冬酶-3抗体(CellSignaling)进行标记来检测。小鼠抗CD3/CD28珠购自Invitrogen。
从肿瘤分离T细胞。B16-Ova黑素瘤在含有5mLPBS、2％FBS的培养皿中切割成小片，并且用PBS进行洗涤。将肿瘤重悬浮于补充有2％FBS、50U/mL胶原酶IV型(Invitrogen)、20U/mLDNA酶(Roche)的15mLRPMI中，样品在37℃下温育2小时，并且使用gentleMACSDissociator(MiltenyiBiotech)进一步解离组织。将悬浮液用PBS洗涤三次，并且经过70μM粗滤器。淋巴细胞通过密度梯度离心进行分离，并且随后通过使用FACSAria(BDBiosciences)的流式细胞术进行分析或分选。
T细胞凋亡。细胞因子预处理的OT-I细胞用LacZ或Ppp2r2dshRNA进行转导，并且注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。在7天后，使用活化的半胱天冬酶-3抗体(CellSignaling)执行细胞内染色，并且在FACS分析中门控CD8/Thy1.1双重阳性T细胞。
免疫荧光和免疫组织化学。来自用表达LacZ或Ppp2r2dshRNA(GFP-表达载体)的OT-IT细胞处理的小鼠的B16-Ova肿瘤在最适切割温度(O.C.T.)化合物(Tissue-Tek)中进行冷冻保留。来自冷冻保留肿瘤的10μm切片用0.2％TritonX-100进行渗透化处理，在4％多聚甲醛中固定，且用与DAPI组合的GFP抗体(MolecularProbes)进行染色。对于TUNEL检测，基于制造商的指导，用TACS2TdTBlueLabel(Trevigen)染色切片。使用激光扫描共焦显微镜(LeicaSP5X)显现样品，并且用ImageJ软件(NIH)进行分析。
qRT-PCR测定。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。用HighCapacitycDNAReverseTranscription试剂盒(AppliedBiosystems)，将RNA逆转录。使用ABI7900HT仪器利用SYBR绿(ABI)以一式三份执行实时定量PCR反应。Rpl23水平用于标准化。使用下述引物：Ppp2r2d正向GGAAGCCGACATCATCTCCAC(SEQIDNO:622)，Ppp2r2d反向GTGAGCGCGGCCTTTATTCT(SEQIDNO:623)；Cblb正向GGTCGCATTTTGGGGATTATTGA(SEQIDNO:624)，Cblb反向TTTGGCACAGTCTTACCACTTT(SEQIDNO:625)；Rpl23正向CTGTGAAGGGAATCAAGGGA(SEQIDNO:626)和Rpl23反向TGTCGAATTACCACTGCTGG(SEQIDNO:627)。
微阵列分析。IL-7/IL-15培养的OT-IT细胞用五种实验shRNA(Ppp2r2d、Arhgap5、Alk、Egr2、Ptpn2)之一或LacZ对照shRNA进行转导。使用由载体编码的GFP作为报道基因，将受感染细胞分选至一定纯度。将T细胞(5x106)i.v.注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。七天后，从肿瘤和脾中分离表达shRNA的OT-IT细胞(CD8+GFP+)。将细胞分选两次至高纯度，并且使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA，用于Affymetrix基因表达谱分析(MouseGenome4302.0Array)。针对每种shRNA的阵列以一式三份完成(6只小鼠/组)。
单细胞水平下细胞因子产生的纳米孔分析
材料。用于T细胞活化的抗体是抗小鼠CD3和抗小鼠CD28(Biolegend)。用于捕获分泌的细胞因子的抗体是抗小鼠IFNγ(Biolegend)、抗小鼠IL-2(Biolegend)、抗小鼠TNFα(Biolegend)和抗小鼠GM-CSF(Biolegend)。检测抗体是抗小鼠IFNγ(Biolegend)、抗小鼠IL-2(Biolegend)、抗小鼠TNFα(Biolegend)和抗小鼠GM-CSF(Biolegend)，并且遵循制造商的说明书，将它们用适当的AlexaFluor染料(Invitrogen)进行荧光标记。用于制备支持双层的脂质是：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基帽)(BiotinylCapPE)(AvantiPolarLipids)。
纳米孔的PDMS阵列的制造和支持脂质双层的制备。通过将以10:1碱/催化剂重量比制备的聚二甲基硅氧烷(PDMS，DowCorning)注射到罩住微图案化硅母板的定制模具内，制备纳米孔的阵列。纳米孔的阵列在70℃下固化4-16小时。每个阵列包含72x24块，各自含有7x7(50μmx50μmx50μm)的纳米孔子阵列(总共84,672个孔)。PDMS阵列直接粘附至3″x1″玻璃载玻片，形成1mm厚的层。支持脂质双层如先前所述进行制备14。通过将含有2摩尔％生物素-Cap-PE脂质的DOPC脂质体施加至纳米孔的PDMS阵列来生成双层。将表面用去离子水清洗，以去除过量脂质体。在使用前，将脂质双层用PBS中的BSA(100μg/mL)封闭45分钟。随后使双层与在PBS中的100μg/mLBSA溶液中的1μg/mL链霉抗生物素蛋白一起温育，随后与生物素化的CD3和CD28抗体一起温育。该装置在添加细胞前用PBS充分清洗。
微雕刻。捕获抗体在硼酸盐缓冲液(50mM硼酸钠、8mM蔗糖和50mMNaCl，pH9.0)中稀释至10μg/mL的最终浓度，并且在室温下沉积到环氧修饰的载玻片的表面上1小时。将载玻片用在PBST(具有0.05％(v/v)Tween20的PBS)中的3％脱脂乳在室温下封闭30分钟，并且在使其与纳米孔的PDMS阵列接触之前，用PBS洗涤。将T细胞悬浮液分配到纳米孔的表面上，用在培养基中的支持脂质双层进行修饰，并且允许沉降到孔内。施加至阵列的悬浮细胞的密度凭经验进行优化，以使通过单细胞的孔占有达到最大(通常为～30％的孔)。在装载细胞的孔的温育后，随后将用捕获抗体包被的玻璃载玻片置于装载的阵列上用于细胞因子捕获。微阵列和玻璃载玻片通过在杂交室(AgilentTechnologies，G2534A)中加压而保持在一起，并且在37℃5％CO2下温育1小时。玻璃载玻片随后与阵列分开且置于PBS中。
在微雕刻后，载玻片与封闭缓冲液(PBS、10mg/mLBSA、0.05％(v/v)Tween-20、2％小鼠血清和2mM叠氮化钠)一起温育30分钟，用PBST(PBS+0.05％v/vTween-20)洗涤，并且随后与1μg/mL的荧光检测抗体一起在25℃下温育45分钟。将载玻片用PBST和PBS进行洗涤，用水短暂清洗，并且用N2气流干燥。参考载玻片在每次实验结束时利用在经打印的载玻片上使用的相同检测抗体生成。对于参考载玻片，抗体在水中稀释，点样在空白聚-L-赖氨酸载玻片上(1μL/斑点)，并且参考载玻片在真空下进行干燥。使用Genepix4200AL微阵列扫描仪(MolecularDevices)扫描载玻片。使用GenepixPro提取每个斑点的中值荧光强度。
基于图像的芯片上细胞计量术。在成像前，T细胞用CellMaskTMPlasmaMembraneStain(Invitrogen，LifeTechnologies)和SYTOX绿(用于检测死细胞，LifeTechnologies)进行染色。装载细胞的纳米孔阵列面朝上固定到显微镜上，其中盖玻片置于阵列之上。图像在自动化倒置落射荧光显微镜(CarlZeiss)上采集。逐块(7x7微孔/块)收集透射光和落射荧光显微照片。使用定制程序分析所得到的图像集合，以测定每个孔中存在的细胞数目和每种标记的平均荧光强度。仅活T细胞考虑用于分析。尽管细胞表达GFP，但与SYTOX绿相比较，GFP的荧光强度在利用的显微镜采集设置下可忽略不计，允许鉴定死细胞。
数据分析。使用对阵列内的每个孔指定的独特标识符，将从芯片上细胞计量术和经打印的细胞因子提取的数据在MicrosoftExcel中进行匹配。将数据集过滤，以包括仅含有单细胞的孔。为了补偿信号渗透且将来自给定细胞的针对捕获的细胞因子的测量荧光强度转换成分泌率，将来自用已知量的检测抗体制备的标准校准曲线(来自参考载玻片)的数据用于将测量的强度转换为分子数目，如先前描述的(Han，Q.等人，Multidimensionalanalysisofthefrequenciesandratesofcytokinesecretionfromsinglecellsbyquantitativemicroengraving.LabChip10，1391-1400，doi:10.1039/b926849a(2010))。
实施例1：免疫治疗靶的体内RNAi发现
执行两次大型初级筛选，其中第一次集中于在功能障碍的T细胞中过表达的基因(T细胞无能或耗竭；255种基因，1,275种shRNA分成两个库)，并且第二次集中于激酶/磷酸酶(1,307种基因，6,535种shRNA分成七个库)(表4)。在这些初级筛选中，每种基因由～5种shRNA表示。
表4
靶向在功能障碍的T细胞(无能或耗竭状态)中过表达的255种基因31-37和1,307种激酶/磷酸酶基因(每基因～5种shRNA)的shRNA得自TheRNAiConsortium(TRC；BroadInstitute，Cambridge，MA，USA)。制备九个库，并且将shRNA亚克隆到pLKO-Thy1.1慢病毒载体内。每个库还含有85种阴性对照shRNA(shRNA数目：GFP，24；LacZ，20；萤光素酶25；RFP16)。通过阴性选择分离的OT-IT细胞(StemcellTechnologies)用IL-7(5ng/mL，Peprotech)和IL-15(100ng/mL，Peprotech)在完全RPMI培养基(RPMI1640、10％FBS、20mMHEPES、1mM丙酮酸钠、0.05mM2-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)中进行培养。在第2天时，OT-IT细胞用在24孔板中的补充有硫酸鱼精蛋白(5μg/mL)的慢病毒库(九个慢病毒shRNA库和LacZ对照shRNA慢病毒载体对照)以15的感染复数(MOI)进行旋转感染，所述24孔板用retronectin(5μg/mL)进行包被。通常，对于每个库感染～5x106OT-1T细胞。
在感染后，OT-I细胞用IL-7(2.5ng/mL)、IL-15(50ng/mL)和IL-2(2ng/mL)在完全RPMI培养基中进行培养。在第5天时，使用死细胞去除试剂盒(Miltenyi)富集活的shRNA转导的T细胞，并且基于Thy1.1标记物(StemcellTechnologies)，将受感染细胞阳性选择至50-60％Thy1.1阳性。通过Thy1.1报道基因的表面表达监控成功转导(图2)。将T细胞(5x106)i.v.注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的C57BL/6小鼠(15只小鼠/shRNA库)内(动物数目选择为提供用于T细胞分离和PCR的足够细胞)。从5×106经富集的OT-I细胞作为起始群体分离基因组DNA，用于深度测序。七天后，通过流式细胞术，从肿瘤、脾、肿瘤引流淋巴结和无关淋巴结中分离表达shRNA的T细胞(CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+)用于分离基因组DNA，随后进行shRNA盒的PCR扩增。(图3)分离基因组DNA(Qiagen)，并且通过shRNA盒的PCR生成深度测序模板。使用IlluminaGenomeAnalyzer，通过深度测序分析每个库中shRNA的表示30。使用每个库中的对照shRNA的平均读数将数据标准化。基于T细胞中的表达水平，选择激酶/磷酸酶基因用于次级筛选。
对于某些基因，与起始T细胞群体相比较，shRNA在所有测试组织中过度表示(例如SHP-1)，指示不依赖于肿瘤抗原的TCR识别的增强增殖。对于其它基因，在肿瘤内存在shRNA的选择性丢失(例如T细胞活化途径中的关键激酶ZAP-70)。我们将分析集中于其shRNA在肿瘤而非脾(次级淋巴样器官)中显示实质性过度表示的基因。尽管处于免疫抑制环境，对于许多shRNA观察到在肿瘤中的实质性T细胞累积。对于次级筛选，我们创建了集中库，其中每种候选基因由～15种shRNA表示。
来自该分析的原始数据在图4中针对三种基因显示：LacZ(阴性对照)、Cblb(诱导T细胞受体内在化的E3泛素连接酶)19和Ppp2r2d(先前未在T细胞中进行研究)。对于Ppp2r2d和Cblb两者，与脾相比较，五种shRNA在肿瘤(红色)中是实质性增加的，而对于LacZshRNA未观察到富集。总体上，43种基因满足下述标准：与脾相比较，在肿瘤中3种或更多种shRNA≥4倍富集(表5、图4、图5)。该集合包括先前被鉴定为T细胞受体信号传导抑制剂的基因产物(包括Cblb、Dgka、Dgkz、Ptpn2)，以及其它公知的T细胞功能抑制剂(例如Smad2、Socs1、Socs3、Egr2)，从而验证了我们的方法(表5、表6)20-22。表5描述了来自次级筛选的候选基因的功能分类。
表5
执行集中于其shRNA在肿瘤而非脾(次级淋巴样器官)中显示实质性过度表示的基因的次级筛选。尽管处于免疫抑制环境，对于许多shRNA观察到在肿瘤中的实质性T细胞累积。对于这些次级筛选，针对每种基因(IDT)合成～10种另外的shRNA，总共～15种shRNA/基因。这些集中的库含有85种阴性对照shRNA。两种对照shRNA(一种针对RFP，一种针对萤光素酶)显示在肿瘤相对于脾中的一些富集(分别为4.0和5.1倍)。次级筛选中的截断定义为在肿瘤相对于脾中具有≥4倍富集的≥3种shRNA。通过将个别shRNA连同报道蛋白质(GFP、TFP、RFP或Ametrine荧光蛋白质、Thy1.1)引入T细胞内，在细胞水平下验证筛选结果。这种方法使得能够在动物中同时测试五种shRNA(三只小鼠/组)。在24小时以及3、5和7天后，基于CFSE稀释显现shRNA转导的T细胞的增殖。另外，对于IFNγ、TNFα和同种型对照，在第3、5和7天时执行细胞内染色。来自T细胞功能障碍库shRNA文库的初级和次级筛选的结果在表6中提供。列出了针对其至少3种shRNA在肿瘤中显示>4倍富集的基因，连同其功能的简短描述。来自激酶和磷酸酶shRNA文库的次级筛选的结果显示于表7中。
表6
表7
实施例2：在B16黑素瘤中shRNA驱动的CD4和CD8T细胞扩增
将来自深度测序分析的阳性shRNA克隆到编码五种不同报道蛋白质(GFP、TFP、RFP或Ametrine荧光蛋白质、Thy1.1)的慢病毒载体内。将细胞因子预处理的OT-IT细胞用慢病毒载体进行转导，所述慢病毒载体驱动单一shRNA和报道蛋白质的表达；将每个群体的1×106个T细胞混合，并且i.v.共注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的C57BL/6小鼠内。在七天后，从肿瘤、脾和淋巴结中分离T细胞，并且基于共引入的报道基因，通过流式细胞术测定报道基因阳性的CD8+Vα2+Vβ5+T细胞的百分比。基于表达特定报道基因的每个器官中的OT-IT细胞百分比，计算肿瘤相较于脾中的富集倍数。当对照LacZshRNA在CD8OT-IT细胞中表达时，表达shRNA的CD8OT-IT细胞的频率相较于脾在肿瘤中更低(～2倍)。相比之下，实验shRNA在肿瘤而非脾中诱导CD8OT-IT细胞的累积(图6、图7)。对于这些shRNA中的七种(例如Ppp2r2D、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap8I、Rbks和Egr2)，相对于脾，肿瘤中的T细胞累积为>10倍。对于靶向Ppp2r2d(PP2A磷酸酶7的调节亚基)的shRNA，观察到最强表型。
将表达Ppp2r2d或LacZshRNA的CD8+OT-I或CD4+TRP-1T细胞注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。使用Thy1.1报道基因，在肿瘤和脾中鉴定表达shRNA的T细胞(图8，％Thy1.1+CD8T细胞，左图)。在转移2x106个shRNA表达性细胞后7天，在肿瘤和脾中测定表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的T细胞的总数目(图8，右图)。指示了在肿瘤中表达Ppp2r2d相对于LacZshRNA的T细胞的富集倍数。Ppp2r2dshRNA不仅诱导OT-ICD8T细胞的累积，还诱导CD4T细胞的累积(来自TRP-1TCR转基因小鼠)23，其中当表达Ppp2r2d而非LacZshRNA时，肿瘤中的T细胞数目显著更高(对于CD8为36.3倍；对于CD4T细胞为16.2倍)(图8)。
针对表达一组Ppp2r2d或CblbshRNA的细胞，在肿瘤相较于脾中的T细胞富集(图17，上图)。还在T细胞转移前，通过qPCR测量Ppp2r2d和CblbmRNA水平(图17，下图)。对于在mRNA水平上具有>80％敲低效率的shRNA，观察到肿瘤中的最强T细胞富集(对于Ppp2r2d和Cblb均为shRNA#1和2)。CD8T细胞累积与Ppp2r2d敲低程度关联，并且具有最高体内活性的两种Ppp2r2dshRNA诱导最低水平的Ppp2r2dmRNA(图17)。
还使用定量质谱法，在蛋白质水平下确认Ppp2r2d敲低(图18)。将先前报道的通过质谱法绝对定量(AQUA)来自细胞裂解物的蛋白质的方法用于在蛋白质水平下测量Ppp2r2dshRNA表达的效应(Gerber，S.A.，Rush，J.，Stemman，O.，Kirschner，M.W.&Gygi，S.P.AbsolutequantificationofproteinsandphosphoproteinsfromcelllysatesbytandemMS.PNAS，100，6940-6945(2003))。这种策略基于“选择性反应监控”方法，其中具有掺入的稳定同位素的合成肽用作质谱法分析的内部标准。使用FACS将表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-I细胞分选至一定纯度。将细胞(1x106)在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)、1mMEDTA和1mMPMSF的1mlMPER提取试剂(Pierce)中于冰上裂解15分钟，伴随临时涡旋。细胞碎片通过离心去除，并且将蛋白质上清液过滤(0.2μmSpinX离心式过滤器，Costar)。通过Bradford测定(Biorad)和UV280nm分析(Nanodrop仪器)确定蛋白质浓度；通过SDS-PAGE分开0.1mg细胞蛋白质，并且用考马斯蓝试剂(Pierce)进行染色。切除对应于45-60kDa的MW范围的凝胶条带，随后使用胰蛋白酶凝胶内消化蛋白质。洗脱的肽用300fmol同位素标记的Ppp2r2d(FFEEPEDPSS[13C-15N-R]-OH)(SEQIDNO:628)和肌动蛋白B(GYSFTTTAE[13C-15N-R]-OH)(SEQIDNO:629)肽(21stCenturyBiochemicals)加标，用于通过LCMS/MS(LTQXLOrbitrap，ThermoScientific)定量。Ppp2r2d肽选自不同于PP2A的其它调节亚基的蛋白质区。最初，分析LacZshRNA样品的LC-MS/MS运行，以定位待监控的Ppp2r2d和肌动蛋白B肽。绝对定量AQUA肽与相应的内源肽从反相柱中共洗脱，而其更高的MW(10Da)使得能够使用丰富肽片段离子测定内源和AQUA肽的峰强度比。一式三份样品通过SDS-PAGE-LC-MS/MS进行分析，并且使用两侧斯氏t检验使利用GraphpadPrism6.0软件测定统计显著性(F检验，*p＝0.0062)。
测定Ppp2r2dshRNA的特异性。Ppp2r2dshRNA活性是特异性的，因为当突变的Ppp2r2dcDNA(具有野生型蛋白质序列，但在shRNA结合位点处具有突变的DNA序列)与Ppp2r2dshRNA共引入时，表型被逆转(图9，10a-c)。此外，与脾相比较，OT-ICD8T细胞在肿瘤中过表达Ppp2r2d(在不存在任何shRNA表达的情况下)，提示它是抑制肿瘤中的T细胞功能的信号传导网络的固有组分(图19)。
OT-IT细胞用驱动LacZshRNA、Ppp2r2dshRNA、Ppp2r2dshRNA的表达的慢病毒载体进行转导。生成具有保留的蛋白质序列但破坏的shRNA结合位点的突变型Ppp2r2dcDNA。使用正向引物GGATCCATGGCAGGAGCTGGAGGC(SEQIDNO:630)和反向引物：GCTAGCATTAATTTTGTCCTGGAATATATACAAGTTATTGGTGG(SEQIDNO:631)，通过RT-PCR分离野生型Ppp2r2dcDNA。使用正向引物:TCCATCCCCACCAATGTAACGTGTTTGTTTACAGCAGCAGCAAGG(SEQIDNO:634)和反向引物:AAACAAACACGTTACATTGGTGGGGATGGAACTCTGCGGCAGTGA(SEQIDNO:635)，通过重叠PCR(其保留蛋白质编码序列)，使Ppp2r2dshRNA的靶序列，CCCACATCAGTGCAATGTATT(SEQIDNO:632)突变为TCCCCACCAATGTAACGTGTT(SEQIDNO:633)(图10a)。用2A核糖体skip肽-GFP序列，将野生型和突变型Ppp2r2dcDNA克隆到经修饰的pLKO.3载体(导致细胞中的化学计量Ppp2r2d和GFP表达)中。将构建体引入EL4胸腺瘤细胞内。将GFP表达性EL4细胞分选至一定纯度，并且随后用驱动Thy1.1报道基因表达的LacZ或Ppp2r2dshRNA慢病毒载体进行转导。shRNA转导的(Thy1.1+)细胞通过流式细胞术就GFP表达进行分析。当野生型Ppp2r2d时，Ppp2r2dshRNA降低GFP水平。Ppp2r2dshRNA不能降低表达突变型Ppp2r2dcDNA的细胞中的GFP报道基因的表达，证实shRNA结合位点已成功突变。(图10a)
Ppp2r2d突变型cDNA的表达还阻止通过Ppp2r2dshRNA诱导的表型(图10b)。将Ppp2r2dshRNA克隆到突变型Ppp2r2dcDNA-2A-GFP构建体内，其导致Ppp2r2dshRNA和突变型Ppp2r2dcDNA在一个载体中的共表达。OT-IT细胞用编码LacZshRNA(Thy1.1)、Ppp2r2dshRNA(Ametrine)或Ppp2r2dshRNA加上突变型Ppp2r2dcDNA(GFP)的慢病毒分开感染(图10b)。这三个群体随后以相同比混合，并且注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。在第7天时，通过对OT-I(CD8+Vα2+Vβ5+)T细胞门控随后分析通过Thy1.1、Ametrine或GFP表达标记的群体，来定量肿瘤和脾中的每个T细胞群体。通过对Vα2+Vβ5+T细胞门控，定量肿瘤和脾中的每个T细胞群体的百分比；基于Thy1.1或Ametrine/GFP荧光报道基因的表达，检测经转导的细胞，并且结果显示于图10b中。(来自2次独立实验的代表性数据，n＝3只小鼠/实验)。
图10c提供了OT-IT细胞中的Ppp2r2d表达的实时PCR分析，所述OT-IT细胞用LacZshRNA、Ppp2r2dshRNA和Ppp2r2dshRNA加上Ppp2r2d突变型cDNA进行转导。另外，具有最高体内活性的Ppp2r2dshRNA与Ppp2r2dmRNA的最低水平相关(图11)。
表达实验或对照shRNA的肿瘤浸润T细胞的微阵列分析显示每种shRNA诱导基因表达变化的独特集合，其中在特定shRNA之间具有一些重叠(图12a-c)。两种基因(Egr2和Ptpn2)在T细胞中具有已知功能。基于来自次级筛选的深度测序结果，计算肿瘤相对于脾中的富集(图12a)。关于mRNA的平均表达水平的聚类发现在脾或肿瘤中由T细胞显著调节，所述脾或肿瘤表达LacZ对照shRNA或五种实验shRNA之一(图12b)。显著表达差异定义为表达LacZ对照shRNA或五种实验shRNA(Alk、Arhgap5、Egr2、Ptpn2或Ppp2r2d)之一的T细胞之间的方差分析p值<0.01(JMP-Genomics6.0，SASInstituteInc.)。在聚类后显示了在一个或多个处理组中显著调节的mRNA(FastWard)。图12c是显示通过用五种实验shRNA之一转导的肿瘤浸润T细胞，在表达标志之间的重叠的维恩图(标志定义为如上描述的方差分析p<0.01)。指示的是针对5种标志的任何组合的重叠探针ID的数目，如通过重叠椭圆指示的。重叠相对于由随机机会所预期的那些的显著性(Fisher精确检验)显示于附表中。
实施例3：通过Ppp2r2d诱导的T细胞功能的变化
对于本实施例，检查了驱动在肿瘤中通过Ppp2r2dshRNA的T细胞累积的细胞机制-特别是T细胞浸润、累积和细胞凋亡。通过用细胞溶质染料CFSE标记的OT-ICD8T细胞的转移，评价肿瘤内的T细胞浸润。表达Ppp2r2d或LacZshRNA的OT-IT细胞用CFSE进行标记，并且注射到具有B16-Ova肿瘤的小鼠内。二十四小时后，经转导的T细胞从肿瘤和脾中进行分离，并且通过流式细胞术进行定量。表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-IT细胞使用Thy1.1报道基因进行纯化，并且在不添加细胞因子的完全RPMI培养基中培养24小时。通过Ficoll密度梯度离心(Sigma)分离的活细胞用CFSE(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯，Invitrogen)进行标记，并且将2×106个标记细胞注射到具有第14天B16-Ova肿瘤的小鼠内。在转移后24小时以及第3、5和7天时，通过流式细胞术定量CFSE稀释。另外，对于IFNγ、TNFα和同种型对照(BD)，在第3、5和7天时执行细胞内染色。在第1天在肿瘤中，在Ppp2r2d或LacZshRNA转导的CD8T细胞的频率中未观察到差异，反驳对T细胞浸润的实质效应(图13a)。然而，较晚时间点(第3和5天)的分析显示:与LacZshRNA转导的T细胞相比较，通过Ppp2r2d的增殖程度更高(基于CFSE稀释)(图13b、图20a)。Ppp2r2dshRNA转导的T细胞还产生更高水平的干扰素-γ，其是对于抗肿瘤免疫关键的细胞因子(图13e)。Ppp2r2d的作用在T细胞受体活化的下游，因为T细胞累积在肿瘤中增强，并且在肿瘤引流淋巴结中增强至较低程度。相比之下，在其中相关抗原未呈递给T细胞的无关淋巴结或脾中未观察到累积(图15)。甚至对于LacZshRNA转导的T细胞观察到实质性程度的T细胞累积(到第7天时CFSE染料的完全稀释)，尽管在肿瘤中存在小数目的这样的细胞。这提示LacZshRNA转导的T细胞通过细胞凋亡而丧失。事实上，当表达LacZ对照shRNA(而不是Ppp2r2dshRNA)时，更大百分比的肿瘤浸润T细胞被特异于活性半胱天冬酶-3的抗体标记(图13g、图20b)。此外，CD8T细胞与B16-Ova肿瘤细胞的共培养显示大多数表达LacZshRNA的T细胞发生凋亡(65.7％)，而大多数Ppp2r2dshRNA转导的T细胞是活的(89.5％，图13c)。
表达LacZ或Ppp2r2dshRNA的OT-IT细胞基于Thy1.1表达进行纯化，并且用CFSE进行标记，如上所述。CFSE标记的OT-IT细胞(1×105)与5×104个B16-Ova细胞/孔一起在96孔板中共培养72小时。在测定之前，使B16-Ova细胞暴露于1ng/mLIFNγ进行48小时(以诱导MHCI类，其在体外不表达)，并且洗涤三次。通过CD8+细胞的膜联蛋白V标记检测OT-IT细胞的凋亡(图13c)。使用BD细胞内染色试剂盒执行磷酸-AKT(Ser473)、磷酸-Bad(Ser112)、Bcl-2和同种型对照的细胞内染色48小时。CD8T细胞与B16-Ova肿瘤细胞的共培养确实显示大多数表达LacZshRNA的T细胞是凋亡的(65.7％)，而大多数Ppp2r2dshRNA转导的T细胞是活的(89.5％，图13c)。当在不存在CD28共刺激的情况下用固定的CD3抗体刺激表达Ppp2r2d和LacZshRNA的T细胞时，观察到类似表型(图14)。具体地，将B16-Ova细胞(2×105)s.c.注射到雌性C57BL/6小鼠(10周龄)内。在第12天时，将具有相似大小肿瘤的小鼠分成7组(7-8只小鼠/组)。在第12天和第17天时，i.v.注射用Ppp2r2d或LacZshRNA载体感染的抗CD3/CD28珠活化的CD4TRP-1和/或CD8OT-IT细胞(各2x106T细胞)。对于B16肿瘤的处理，小鼠在第10天时用抗CD3/CD28珠活化的表达Ppp2r2d或LacZshRNA的CD4TRP-1和CD8pmel-1T细胞(各3x106T细胞)进行处理。在转移后每三天测量肿瘤大小，并且计算为长度×宽度。具有在最长轴上≥20mm的肿瘤的小鼠被处死。
这些结果提示可能的是，Ppp2r2dshRNA转导的CD8T细胞即使在它们识别由B16-Ova肿瘤细胞直接呈递的其抗原时，也可能能够增殖且存活。这个想法通过将肿瘤细胞植入b2m-/-小鼠内进行测试，所述b2m-/-小鼠是MHCI类蛋白质表达缺陷的24。在这样的小鼠中，宿主的仅肿瘤细胞而非专职性抗原呈递细胞可以将肿瘤抗原呈递给T细胞。事实上，Ppp2r2dshRNA转导的OT-ICD8T细胞显示在b2m-/-小鼠中的B16-Ova肿瘤内的大量累积(图12f)，而在缺乏Ova抗原表达的对侧B16肿瘤中存在极少数目的T细胞。表达Ppp2r2dshRNA的T细胞因此可以响应肿瘤细胞有效增殖且存活，尽管合适的共刺激信号缺乏以及抑制性微环境。
使用纳米孔装置在单细胞水平下的肿瘤浸润T细胞的离体分析还证实：Ppp2r2d沉默增加通过T细胞的细胞因子生产(图21a-c)。T细胞通过在脂质双层上的CD3/CD28抗体活化3小时，随后在抗体包被的载玻片上进行1小时细胞因子捕获。CD8T细胞显示对于IFNγ、IL-2和GM-CSF的较高分泌率，以及较大部分的T细胞超过一种细胞因子(图21b、c)。通过细胞内细胞因子染色确认存在更大数目的IFNγ产生性T细胞(图21d、图20)。
PP2A磷酸酶包括催化和支架亚基，并且它的底物特异性由许多调节亚基之一决定7。Ppp2r2d在分裂间期和后期过程中将PP2A导向至Cdk1底物；它从而抑制进入有丝分裂且诱导从有丝分裂离开25。PP2A对于BAD介导的凋亡发挥看门作用。磷酸化的BAD在细胞溶质中被14-3-3隔离在其失活形式中，而脱磷酸的BAD被靶向至线粒体，在其中它通过结合Bcl-XL和Bcl-2引起细胞死亡26。PP2A磷酸酶还已显示与CD28和CTLA-4以及Carma1(NF-κB途径的上游)的细胞质结构域相互作用，但未知哪个调节亚基是这些活性所必需的；适合于所需生物化学研究的Ppp2r2d抗体目前无法获得。
实施例4：Ppp2r2d的沉默增强CD4和CD8T细胞的抗肿瘤活性
评价Ppp2r2dshRNA增强过继性T细胞疗法的功效的能力。将B16-Ova肿瘤细胞(2x105)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠(10周龄)内。在第12天时，将具有类似大小肿瘤的小鼠分成七组(7-8只小鼠/组)，不接受T细胞，接受2x106shRNA转导的TRP-1CD4T细胞、2x106shRNA感染的OT-ICD8T细胞、或CD4和CD8T细胞两者(第12天和第17天)。根据组，在第12天和第17天时，i.v.注射用Ppp2r2d或LacZshRNA载体感染的抗CD3/CD28珠活化的CD4TRP-1和/或CD8OT-IT细胞(各2x106T细胞)。对于B16肿瘤的处理，小鼠在第10天时用抗CD3/CD28珠活化的表达Ppp2r2d或LacZshRNA的CD4TRP-1和CD8pmel-1T细胞(各3x106T细胞)进行处理。在转移后每三天测量肿瘤大小，并且计算为长度×宽度。具有在最长轴上≥20mm的肿瘤的小鼠被处死。Ppp2r2d沉默改善CD4和CD8T细胞的治疗活性，并且当共施用Ppp2r2dshRNA转导的CD4和CD8T细胞时，观察到协同效应(图16a、b)。当引入对于内源肿瘤抗原特异性的T细胞(pmel-1CD8T细胞和TRP-1CD4T细胞)内时，Ppp2r2dshRNA还增强抗肿瘤应答(图16c)。
Ppp2r2d沉默的T细胞获得肿瘤中的效应表型(图22a)，并且>30％的细胞表达颗粒酶B(图23a)。与在肿瘤中极大增加的这样的效应T细胞数目(图23b)一致，当表达Ppp2r2d而非LacZshRNA的T细胞存在时，TUNEL染色显示肿瘤中增加的细胞凋亡(图23c)。B16黑素瘤是部分高度侵袭性肿瘤，因为MHCI类表达极低。有趣的是，表达Ppp2r2d而非LacZshRNA的T细胞显著增加通过肿瘤细胞的MHCI类表达(H-2Kb)(图23d)，可能是由于观察到的通过T细胞的IFNγ分泌增加(图21a-c、图13e)。Ppp2r2dshRNA未降低在肿瘤浸润T细胞上的抑制性PD-1或LAG-3受体的表达，证实它的作用机制不同于这些已知的T细胞功能负调节物(图22b)。该发现提示组合方法靶向这些细胞内和细胞表面分子。
这些结果确定在复杂组织微环境中免疫疗法的新型靶的体内发现的可行性。本发明人已显示能够发现在组织间具有差别作用的基因，如通过与次级淋巴样器官相比较，在肿瘤中的T细胞累积所例示的。对于具有组织选择性作用的基因，T细胞累积和存活可能处于T细胞受体的控制下，并且因此在缺乏相关抗原的呈递的组织中不出现。可以设想本文呈现的方法的许多变化，以研究特定免疫细胞功能的体内控制。例如，针对细胞因子或细胞毒性分子(颗粒酶B、穿孔素)的表达的荧光报道基因可以整合到我们的方法内，以发现控制肿瘤中的关键T细胞效应子功能的基因。
关键调节开关的靶向可以提供新方法以修饰癌症及其它病理学中的T细胞活性。这样的基于T细胞的疗法的功效可以通过shRNA介导的基因沉默得到增强，所述基因抑制肿瘤微环境中的T细胞功能。
其它实施方案
应当理解虽然本发明已与其详述结合进行描述，但前述说明书意欲举例说明而不是限制本发明的范围，其通过所附权利要求的范围进行限定。其它方面、优势和修饰在下述权利要求的范围内。
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Claims (51)

1.一种包含载体的具有肿瘤特异性的免疫应答细胞，所述载体包含编码shRNA的序列，
其中所述shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸。
2.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
3.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞表达肿瘤特异性T细胞受体。
4.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的载体，
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激结构域。
5.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。
6.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述shRNA选自切割依赖性shRNA或切割非依赖性shRNA。
7.权利要求4的免疫应答细胞，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原或病原体抗原。
8.权利要求7的免疫应答细胞，其中所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD333/IL3Ra、c-Met、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、ERBB2、BIRC5、CEACAM5、WDR46、BAGE、CSAG2、DCT、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR、TYRP1、SAGE1、SYCP1、SSX2、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4、CTNNB1、CASP8、CDC27、CDK4、EEF2、FN1、HSPA1B、LPGAT1、ME1、HHAT、TRAPPC1、MUM3、MYO1B、PAPOLG、OS9、PTPRK、TPI1、ADFP、AFP、AIM2、ANXA2、ART4、CLCA2、CPSF1、PPIB、EPHA2、EPHA3、FGF5、CA9、TERT、MGAT5、CEL、F4.2、CAN、ETV6、BIRC7、CSF1、OGT、MUC1、MUC2、MUM1、CTAG1A、CTAG2、CTAG、MRPL28、FOLH1、RAGE、SFMBT1、KAAG1、SART1、TSPYL1、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1、SILV、SCGB2A2、MC1R、MLANA、GPR143、OCA2、KLK3、SUPT7L、ARTC1、BRAF、CASP5、CDKN2A、UBXD5、EFTUD2、GPNMB、NFYC、PRDX5、ZUBR1、SIRT2、SNRPD1、HERV-K-MEL、CXorf61、CCDC110、VENTXP1、SPA17、KLK4、ANKRD30A、RAB38、CCND1、CYP1B1、MDM2、MMP2、ZNF395、RNF43、SCRN1、STEAP1、707-AP、TGFBR2、PXDNL、AKAP13、PRTN3、PSCA、RHAMM、ACPP、ACRBP、LCK、RCVRN、RPS2、RPL10A、SLC45A3、BCL2L1、DKK1、ENAH、CSPG4、RGS5、BCR、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK、DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT、NPM1-ALK1、PML-RARA、SYT-SSX1、SYT-SSX2、FLT3、ABL1、AML1、LDLR、FUT1、NPM1、ALK、PML1、RARA、SYT、SSX1、MSLN、UBE2V1、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL-2、MCL1、CTSH、ABCC3、BST2、MFGE8、TPBG、FMOD、XAGE1、RPSA、COTL1、CALR3、PA2G4、EZH2、FMNL1、HPSE、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1、TPM4、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP、PAGE4、PAK2、CDKN1A、PTHLH、SOX2、SOX11、TRPM8、TYMS、ATIC、PGK1、SOX4、TOR3A、TRGC2、BTBD2、SLBP、EGFR、IER3、TTK、LY6K、IGF2BP3、GPC3、SLC35A4、HSMD、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET、CCNB1、PAX3-FKHR、PAX3、FOXO1、XBP1、SYND1、ETV5、HSPA1A、HMHA1、TRIM68及其任何组合。
9.权利要求4的免疫应答细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体的抗原结合片段。
10.权利要求9的免疫应答细胞，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
11.权利要求4的免疫应答细胞，其中所述CAR进一步包含共刺激结构域。
12.权利要求4的免疫应答细胞，其中所述载体是质粒、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
13.一种分离的核酸，其编码嵌合抗原受体(CAR)和编码shRNA的序列，
所述shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸，并且
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。
14.权利要求13的分离的核酸，其中所述shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3ccshRNA。
15.权利要求13的分离的核酸，其中所述抗原结合结构域是抗体的抗原结合片段。
16.权利要求15的分离的核酸，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
17.权利要求13的分离的核酸，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
18.权利要求17的分离的核酸，其中所述肿瘤抗原与黑素瘤、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、神经胶质瘤、食道癌和肝癌相关。
19.权利要求17的分离的核酸，其中所述肿瘤抗原与实体瘤或淋巴肿瘤相关。
20.一种载体，其包含权利要求13的核酸。
21.权利要求20的载体，其中所述载体是质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
22.权利要求20的载体，其中所述编码shRNA的序列与RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子可操作地连接。
23.一种免疫应答细胞，其包含权利要求13的核酸。
24.权利要求23的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞是肿瘤特异性的。
25.权利要求24的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
26.一种组合物，其包含权利要求1或权利要求23的免疫应答细胞和药学可接受的载体。
27.权利要求26的组合物，其进一步包含Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc的抑制剂。
28.权利要求26的组合物，其中所述免疫应答T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
29.权利要求26的组合物，其中所述免疫应答T细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞，并且其中所述抗原是肿瘤或病原体抗原。
30.一种免疫应答细胞，其用编码嵌合抗原受体(CAR)的第一载体和包含编码shRNA的序列的第二载体进行转染，
其中所述shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸，和
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。
31.一种人T细胞，其具有权利要求13的核酸分子。
32.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受试者施用经修饰以表达肿瘤特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)和shRNA的自体T细胞，
其中所述shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸，和
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。
33.一种通过沉默抑制T细胞功能的基因来治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括
给所述受试者施用包含载体的免疫应答细胞，所述载体编码肿瘤特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)和shRNA序列，
其中所述shRNA序列包含与mRNA序列互补的至少12/15/20/25个连续核苷酸的序列，所述mRNA序列由选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列编码，和
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、刺激结构域和共刺激结构域。
34.权利要求33的方法，其中所述载体是质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
35.权利要求1的免疫应答细胞，其中所述shRNA序列减少选自Cblb、Dgka、Dgkz、Entpd1、Fyn、Ptpn2、Smad2、Socs1或Socs3的基因的表达。
36.一种通过沉默抑制T细胞功能的基因来治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括
给所述受试者施用包含载体的免疫应答细胞，所述载体编码肿瘤特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)和shRNA序列，
其中所述shRNA序列包含与mRNA序列互补的至少12/15/20/25个连续核苷酸的序列，所述mRNA序列由选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列编码。
37.一种鉴定抑制免疫应答T细胞的功能的基因的方法，所述方法包括
提供具有表达shRNA的载体的免疫应答T细胞群体；
使所述免疫应答T细胞群体与免疫抑制肿瘤接触；
测定shRNA是否恢复所述免疫抑制肿瘤内的T细胞功能；和
将与恢复所述肿瘤内的T细胞功能的shRNA相关的基因鉴定为抑制肿瘤浸润T细胞功能的基因。
38.一种用于增加有此需要的受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括施用调节选自下述的基因的活性的治疗试剂：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7和Ppp3cc。
39.权利要求38的方法，其中所述治疗试剂选自小分子、肽、抗体、核酶和反义寡核苷酸。
40.一种用于制备具有肿瘤特异性和对免疫抑制的抗性增加的免疫应答细胞的方法，其包括：
提供具有肿瘤特异性的免疫应答细胞；并且将包含编码shRNA的序列的载体引入细胞内，
其中所述shRNA包含与选自SEQIDNO:604-620和653-677的核酸序列互补的15个连续核苷酸。
41.权利要求40的方法，其中所述免疫应答细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤T细胞(NKT)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4T细胞。
42.权利要求40的方法，其中所述免疫应答细胞表达肿瘤特异性T细胞受体。
43.权利要求40的方法，其中所述免疫应答细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的载体，
其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激结构域。
44.权利要求40的方法，其中所述shRNA序列降低选自下述的基因的表达：Ppp2r2d、Eif2ak3、Arhgap5、Smad2、Akap81、Rbks、Egr2、Dgka、Cblb、Mdfic、Entpd1、Dgkz、Vamp7、Hipk1、Nuak2、Alk、Pdzk1ip1、Inpp5b、Socs1、Jun、Nptxr、Socs3、F11r、Fyn、Ypel2、Pkd1、Grk6、Cdkn2a、Sbf1、Ipmk、Rock1、Stk17b、Mast2、Pdp1、Yes1、Met、Ppm1g、Blvrb、Tnk1、Prkab2、Trpm7或Ppp3cc。
45.权利要求39的方法，其中所述shRNA选自切割依赖性shRNA或切割非依赖性shRNA。
46.权利要求1或30的免疫应答细胞，其中所述编码shRNA的序列包括包含与SEQIDNO:604-620或SEQIDNO:653-677之任一互补的15-25个核苷酸的第一序列，以及其为具有一个错配或无错配的所述第一序列的反向互补体的第二序列，以及置于所述第一和第二序列之间的5-9个核苷酸的第三序列。
47.权利要求46的免疫应答细胞，其中所述第一序列包含与SEQIDNO:604-620或SEQIDNO:653-677之任一互补的19-25个核苷酸。
48.权利要求46的免疫应答细胞，其中所述第二序列与所述第二序列完全互补。
49.权利要求13的分离的核酸分子，其中所述编码shRNA的序列包括包含与SEQIDNO:604-620或SEQIDNO:653-677之任一互补的15-25个核苷酸的第一序列，以及其为具有一个错配或无错配的所述第一序列的反向互补体的第二序列，以及置于所述第一和第二序列之间的5-9个核苷酸的第三序列。
50.权利要求49的分离的核酸分子，其中所述第一序列包含与SEQIDNO:604-620或SEQIDNO:653-677之任一互补的19-25个核苷酸。
51.权利要求49的分离的核酸分子，其中所述第二序列与所述第二序列完全互补。
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