CN111166867B - Pd-1泛素化激动剂的功能与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及PD‑1泛素化激动剂的功能与用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，PD‑1会发生泛素化现象，进而被降解，从而增强T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能，提高肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力，使肿瘤细胞被免疫系统杀伤，FBXO38为能够促进PD‑1泛素化的靶点，促进FBXO38的表达能够显著促进PD‑1的降解。抑制FBXO38的表达可以抑制PD‑1的降解，可以用于治疗自身免疫疾病。因此，本发明从临床病人样品水平、细胞功能水平和分子水平对肿瘤的临床免疫治疗及自身免疫疾病的治疗提供有力的科学证据。

Description

PD-1泛素化激动剂的功能与用途

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及PD-1泛素化激动剂的功能与用途。

背景技术

恶性肿瘤是目前致死率最大的疾病之一，常规治疗手段如手术切除、放疗和化疗等手段较多应用于肿瘤治疗中，但目前这些手段在治疗肿瘤中有其局限性，且很难彻底治愈肿瘤，尤其是一些转移型恶性肿瘤。

作为人体健康最重要的防线，免疫系统承担着既要发现和清除外界多种病原微生物(抗感染)和体内可能产生的有害物质(抗肿瘤)，又要避免由于免疫反应过于激烈而损伤机体或者产生自身免疫病。免疫系统有一套复杂的调控网络保证免疫反应处于平衡状态，比如中枢耐受机制保证免疫系统清除自身反应性T体细胞，免疫抑制性细胞-Treg抑制外周的炎症反应(Lohmann et al.,1996；van Noort et al.,1993)。除此之外，免疫细胞表面表达的免疫抑制性分子也是保证免疫平衡的重要组成部分，比如在CD8+ T细胞表面表达的PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM3等分子。这些免疫抑制性分子激活之后，会启动胞内的信号转导通路，向T细胞传递抑制性信号，提高T细胞激活的阈值，抑制T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能。这些免疫抑制分子活化可以抑制自身免疫疾病的发生。不过，任何事物都有两面性，在肿瘤微环境中，这些免疫抑制分子通路通常持续活化，导致肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力受到抑制，肿瘤细胞进而逃脱了免疫系统的杀伤。

近年来的研究发现，肿瘤微环境中PD-1通路的持续活化是肿瘤免疫逃逸的重要机制。肿瘤浸润的T细胞表面高表达PD-1分子，肿瘤细胞高表达其配体PD-L1分子，这就造成PD-1通路在肿瘤微环境中持续活化，肿瘤浸润的T细胞也因此变得无能。在临床上，通过PD-1的封闭抗体阻断PD-1通路之后，大约20％的肿瘤患者的病情会得到减轻。PD-1抗体的出现是肿瘤治疗的里程碑事件，让大家看到了通过激活免疫系统治疗肿瘤的希望，打开了一个全新的肿瘤治疗之路。不过，不少临床数据提示，PD-1抗体针对大部分实体肿瘤的有效率只有20％-40％左右，意味着还有大部分的患者无法从免疫治疗中获益。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于PD-1泛素化激动剂的功能与用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了PD-1泛素化激动剂在制备PD-1降解剂或制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

进一步的，所述PD-1泛素化激动剂是指对PD-1泛素化具有促进效果的分子。

具体的，所述促进PD-1泛素化可以采用各种化学、物理、生物的方法。包括但不限于：

(1)调节PD-1代谢通路以提高PD-1泛素化水平；

(2)直接将泛素连接到PD-1上。

泛素是一个在真核细胞内由76个氨基酸组成的多肽，所述PD-1泛素化是指，将泛素连接到PD-1的赖氨酸上，进行泛素化修饰，影响PD-1的信号通路或者通过蛋白酶体将PD-1降解。

所述PD-1泛素化激动剂可以增强T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能，提高肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力，使肿瘤细胞被免疫系统杀伤。

所述泛素的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGCAGATCTTTGTGAAGACCCTCACTGGCAAAACCATCACCCTTGAGGTCGAGCCCAGTGACACCATTGAGAATGTCAAAGCCAAAATTCAAGACAAGGAGGGTATCCCACCTGACCAGCAGCGTCTGATATTTGCCGGCAAACAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTCTCAGACTACAACATCCAGAAAGAGTCCACCCTGCACCTGGTGTTGCGCCTCCGCGGTGGATAA。

所述PD-1的Genbank登录号为：AY238517。

进一步的，所述PD-1泛素化激动剂能够促进PD-1的降解。

在一种实施方式中，所述PD-1泛素化激动剂可以为慢病毒或逆转录病毒包装的质粒、碳水化合物、脂类、小分子化合物、RNA、多肽或蛋白。

在一种实施方式中，所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

进一步的，所述FBXO38激动剂是指对FBXO38具有促进效果的分子。

对于FBXO38具有促进效果包括但不限于：增强FBXO38活性，或者促进FBXO38基因转录或表达。

在一种实施方式中，所述FBXO38激动剂选自能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子。

所述能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子可以为慢病毒或逆转录病毒包装的质粒、碳水化合物、脂类、小分子化合物、RNA、多肽或蛋白。

可选的，所述FBXO38激动剂可以为使FBXO38表达量增加载体。具体的，可以是含有FBXO38基因并能表达活性FBXO38的载体。所述载体可以是质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体。例如pHAGE、pMXs、MSCV。

本发明的实施例具体列举了pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen和MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen作为使FBXO38表达量增加载体。pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen具体为：在pHAGE载体上插入N端带有3个连续Myc标签的Fbxo38序列，位于IRES-ZsGreen之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen具体为：在MSCV载体上插入N端带有3个连续Myc标签的Fbxo38序列，位于IRES-ZsGreen之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

所述human FBXO38的Genbank登录号为：BC050424。

所述mouse FBXO38的Genbank登录号为：AK031347。

所述肿瘤免疫治疗药物至少具有以下功用之一：

增强肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力、抑制癌细胞增殖、降低癌细胞活力、促进癌细胞凋亡、抑制肿瘤生长。

所述肿瘤免疫治疗药物必然包含PD-1泛素化激动剂，并以PD-1泛素化激动剂作为前述功用的有效成分。

所述肿瘤免疫治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为PD-1泛素化激动剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

所述肿瘤免疫治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述肿瘤免疫治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

可选的，所述肿瘤免疫治疗药物中，所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

所述肿瘤免疫治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。

本发明的第二方面，提供了一种肿瘤免疫治疗方法，为向对象施用PD-1泛素化激动剂。

所述的对象可以为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述对象可以是罹患肿瘤的患者或者期待治疗肿瘤的个体。

所述PD-1泛素化激动剂可以在接受肿瘤治疗前、中、后向对象施用。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

本发明的第三方面，提供一种肿瘤免疫治疗药物，包括有效量的PD-1泛素化激动剂。

进一步的，所述肿瘤免疫治疗药物，包括有效量的PD-1泛素化激动剂及药用载体。

所述肿瘤免疫治疗药物必然包含PD-1泛素化激动剂，并以PD-1泛素化激动剂作为前述功用的有效成分。

所述肿瘤免疫治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为PD-1泛素化激动剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，为PD-1泛素化激动剂为所述肿瘤免疫治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述肿瘤免疫治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述肿瘤免疫治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

在一种实施方式中，所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

进一步的，所述FBXO38激动剂是指对FBXO38具有促进效果的分子。

对于FBXO38具有促进效果包括但不限于：增强FBXO38活性，或者促进FBXO38基因转录或表达。

在一种实施方式中，所述FBXO38激动剂选自能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子。

所述能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子可以为慢病毒或逆转录病毒包装的质粒、碳水化合物、脂类、小分子化合物、RNA、多肽或蛋白。

可选的，所述FBXO38激动剂可以为使FBXO38表达量增加载体。具体的，可以是含有FBXO38基因并能表达活性FBXO38的载体。所述载体可以是质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体。例如pHAGE、pMXs、MSCV。

本发明的实施例具体列举了pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen和MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen作为使FBXO38表达量增加载体。pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen具体为：在pHAGE载体上插入N端带有3个连续Myc标签的Fbxo38序列，位于IRES-ZsGreen之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen具体为：在MSCV载体上插入N端带有3个连续Myc标签的Fbxo38序列，位于IRES-ZsGreen之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

可选的，所述药物制剂还含有药学上可接受的载体。

所述肿瘤免疫治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

本发明的第四方面，提供了一种肿瘤联合治疗药物组合，包括有效量的PD-1泛素化激动剂和至少一种其他肿瘤治疗药物。

所述其他肿瘤治疗药物是指除了PD-1泛素化激动剂以外的肿瘤治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将PD-1泛素化激动剂和其他肿瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他肿瘤治疗药物为抗肿瘤抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肿瘤治疗药物为化疗药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化疗药物的已知给药途径给药。

二)将PD-1泛素化激动剂和其他肿瘤治疗药物配置成复方制剂。在将PD-1泛素化激动剂和其他肿瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

本发明第五方面，提供了一种肿瘤治疗方法，为向对象施用有效量的PD-1泛素化激动剂，以及向对象施用有效量的其他肿瘤治疗药物和/或向对象实施其他肿瘤治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的PD-1泛素化激动剂和至少一种有效量的其他肿瘤治疗药物。

在一种实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

所述其他肿瘤治疗药物包括但不限于：抗肿瘤抗体、化疗药物或靶向型药物等。

所述PD-1泛素化激动剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他肿瘤治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗肿瘤抗体或化疗药物，一般采用胃肠外给药。

本发明第六方面，提供FBXO38作为作用靶标在筛选肿瘤免疫治疗药物或筛选自身免疫疾病治疗药物中的用途。

在筛选肿瘤免疫治疗药物的用途中，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和结肠癌中的一种或多种。

在筛选肿瘤免疫治疗药物的用途中，所述用途具体是指：将FBXO38作为作用对象，对候选物质进行筛选，验证候选物质是否能使PD-1泛素化增强和/或能否对FBXO38有促进效果，若是，则将之确定为肿瘤免疫治疗候选药物。

在筛选肿瘤免疫治疗药物的用途中，所述候选物质选自核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

在筛选自身免疫疾病治疗药物的用途中，所述自身免疫疾病选自慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化症、结节性多动脉炎、系统性血管炎、硬皮病等自身免疫性疾病中的一种或多种。

在筛选自身免疫疾病治疗药物的用途中，所述用途具体是指：将FBXO38作为作用对象，对候选物质进行筛选，验证候选物质是否能使PD-1泛素化减弱和/或能否对FBXO38有抑制效果，若是，则将之确定为自身免疫疾病治疗候选药物。

在筛选自身免疫疾病治疗药物的用途中，所述候选物质选自核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

对于FBXO38具有抑制效果包括但不限于：抑制FBXO38活性，或者抑制FBXO38基因转录或表达。

本发明第七方面，提供一种肿瘤免疫治疗药物的筛选方法，包括：验证待筛药物是否能使PD-1泛素化增强和/或能否对FBXO38有促进效果，若是，则将之确定为肿瘤免疫治疗候选药物。

在一种实施方式中，将待筛药物作用于表达PD-1的体外细胞上，确定细胞中PD-1是否发生了泛素化增强。

例如，筛选方式可以为：在适宜细胞生长的条件下进行表达PD-1的体外细胞的培养，设置两组对比实验，一组将待筛药物加入到所述体外细胞的培养皿中，另一组加入等量的生理盐水，其余条件均同，孵育，测试体外细胞PD-1是否发生了泛素化增强。

确定泛素化增强的方法具体可以为：western blot技术检测或质谱技术检测。

在一种实施方式中，将待筛药物作用于表达FBXO38的体外细胞上，确定细胞中FBXO38是否发生了活力增强或表达上调。

例如，筛选方式可以为：在适宜细胞生长的条件下进行表达FBXO38的体外细胞的培养，设置两组对比实验，一组将待筛药物加入到所述体外细胞的培养皿中，另一组加入等量的生理盐水，其余条件均同，孵育，测试细胞中FBXO38是否发生了活力增强或表达上调。

确定细胞中FBXO38是否发生了活力增强或表达上调的方法可以为：实时定量PCR，实时定量PCR和Western Blot检测，或质谱检测。

在一种实施方式中，所述肿瘤免疫治疗药物为核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

本发明第八方面，提供一种自身免疫疾病治疗药物的筛选方法，包括：验证待筛药物是否使PD-1泛素化减弱和/或能否对FBXO38有抑制效果，若是，则将之确定为自身免疫疾病治疗候选药物。

在一种实施方式中，将待筛药物作用于表达PD-1的体外细胞上，确定细胞中PD-1是否发生了泛素化减弱。

例如，筛选方式可以为：在适宜细胞生长的条件下进行表达PD-1的体外细胞的培养，设置两组对比实验，一组将待筛药物加入到所述体外细胞的培养皿中，另一组加入等量的生理盐水，其余条件均同，孵育，测试体外细胞PD-1是否发生了泛素化减弱。

确定泛素化减弱的方法具体可以为：western blot技术检测或质谱技术检测。

在一种实施方式中，将待筛药物作用于表达FBXO38的体外细胞上，确定细胞中FBXO38是否发生了活力减弱或表达降低。

例如，筛选方式可以为：在适宜细胞生长的条件下进行表达FBXO38的体外细胞的培养，设置两组对比实验，一组将待筛药物加入到所述体外细胞的培养皿中，另一组加入等量的生理盐水，其余条件均同，孵育，测试细胞中FBXO38是否发生了活力减弱或表达降低。

确定细胞中FBXO38是否发生了活力减弱或表达降低的方法可以为：实时定量PCR，实时定量PCR和Western Blot检测，或质谱检测。

在一种实施方式中，所述自身免疫疾病治疗药物为核酸药物、碳水化合物药物、脂类药物、小分子药物、多肽药物或蛋白药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，PD-1能够发生泛素化进而被降解，从而增强T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能，提高肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力，使肿瘤细胞被免疫系统杀伤，FBXO38为能够促进PD-1泛素化的靶点，促进FBXO38的表达能够显著促进PD-1的降解。抑制FBXO38的表达可以抑制PD-1的降解，可以用于治疗自身免疫疾病。因此，本发明从临床病人样品水平、细胞功能水平和分子水平对肿瘤的临床免疫治疗及自身免疫疾病的治疗提供有力的科学证据。

附图说明

图1.T细胞活化后PD-1发生泛素化修饰和降解

a，用免疫共沉淀及western blot方法检测人的外周血单核细胞PBMC中PD-1的泛素化修饰情况。

b，用免疫共沉淀及western blot方法检测Jurkat细胞系中PD-1不同时间的泛素化修饰动态。

c,用免疫共沉淀及western blot方法检测Jurkat细胞系中PD-1的泛素化修饰情况。

d,用流式细胞技术检测蛋白酶体抑制剂MG132对PD-1的作用情况。

e,用western blot方法检测蛋白酶体抑制剂MG132对ERK的作用情况。

f,用流式细胞技术检测溶酶体抑制剂NH4Cl对PD-1的作用情况。

g,用western blot方法检测溶酶体抑制剂NH4Cl对p62的作用情况。

h,用流式细胞技术检测溶酶体抑制剂BFA对PD-1的作用情况。

i,用western blot方法检测溶酶体抑制剂BFA对p62的作用情况。

图2FBXO38特异性的调控PD-1的水平

a,在293FT细胞中用免疫共沉淀技术检测过转的HA-PD-1和Myc-FBXO38的相互作用情况。

b,在293FT细胞中用免疫共沉淀技术检测过转的Myc-FBXO38和HA-PD-1的相互作用情况。

c,在Jurkat细胞中用免疫共沉淀技术检测过转的Myc-FBXO38和HA-PD-1的相互作用情况。

d,在Jurkat细胞中用免疫共沉淀技术检测过转的Myc-FBXO38和内源的PD-1的相互作用情况。

e,在293FT细胞中用免疫共沉淀技术检测过转的Myc-FBXO47和HA-PD-1的相互作用情况。

f,用western blot方法检测Jurkat细胞中Myc-FBXO38和Myc-FBXO47的过表达情况。

g,用流式细胞技术检测过表达Myc-FBXO38和Myc-FBXO47的Jurkat细胞中CD3的表面水平。

h-i,用流式细胞技术检测过表达Myc-FBXO38和Myc-FBXO47的Jurkat细胞中PD-1的表面水平。

j,用荧光定量PCR技术检测Fbxo38的knock down效率。

k,用western blot方法检测Fbxo38knock down后FBXO38的蛋白水平。

l,用流式细胞技术检测Fbxo38knock down的Jurkat细胞中CD3的表面水平。

m,用流式细胞技术检测Fbxo38knock down的Jurkat细胞中PD-1的表面水平。

n,用荧光定量PCR技术检测Fbxo38knock down的Jurkat细胞中PD-1的mRNA水平。

o，用western blot方法检测Fbxo38knock down的Jurkat细胞中PD-1的蛋白水平。

图3FBXO38催化PD-1发生K-48类型的多聚泛素化修饰并促进降解

a,在293FT细胞中用免疫共沉淀及western blot技术检测FBXO38对PD-1的泛素化情况，及PD-1胞内区保守的两个赖氨酸对PD-1泛素化的影响。

b,用免疫共沉淀及western blot方法检测FBXO38过表达对Jurkat细胞中PD-1泛素化的影响。

c,用免疫共沉淀及western blot方法检测FBXO38knock down对Jurkat细胞中PD-1泛素化的影响。

d,在293FT细胞中用免疫共沉淀及western blot技术检测PD-1胞内区保守的两个赖氨酸K210、K233对PD-1泛素化的影响。

e,在293FT细胞中用免疫共沉淀及western blot技术检测F-box序列对FBXO38介导PD-1泛素化的重要作用。

f,在293FT细胞中用免疫共沉淀及western blot技术检测FBXO38介导的PD-1泛素化类型。g,在293FT细胞中用western blot技术检测FBXO38在促进PD-1降解中的作用。

h,在293FT细胞中用western blot技术检测PD-1胞内区两个保守的赖氨酸在PD-1降解中的作用。

i,在293FT细胞中用western blot技术检测FBXO38的F-box序列在介导PD-1降解中的作用。

图4Fbxo38敲除对T细胞发育的影响

a，WT和FBXO38-CKO小鼠CD8⁺ T细胞中FBXO38的蛋白水平。

b，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠胸腺细胞中CD4^-CD8^-(DN),CD4⁺CD8⁺(DP),CD4⁺CD8^-(CD4SP)and CD4^-CD8⁺(CD8SP)细胞的比例。

c，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠胸腺CD4^-CD8^-细胞中CD44⁺CD25^-(DN1),

CD44⁺CD25⁺(DN2),CD44^-CD25⁺(DN3)和CD44^-CD25^-(DN4)细胞的比例。

d，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例。

e，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠淋巴结中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例。

f，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠脾脏中CD4⁺T细胞中

(CD44^loCD62L^hi),central memory(CD44^hiCD62L^hi；CM)和effector/effector memory(CD44^hi CD62L^lo,effector/EM)的比例。

g，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠淋巴结中CD4⁺T细胞中

(CD44^loCD62L^hi),central memory(CD44^hiCD62L^hi；CM)和effector/effector memory(CD44^hi CD62L^lo,

effector/EM)的比例。

h，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠脾脏CD8⁺ T细胞中

(CD44^loCD62L^hi),central memory(CD44^hiCD62L^hi；CM)和effector/effector memory(CD44^hi CD62L^lo,effector/EM)的比例。

i，用流式细胞技术检测WT和CKO小鼠淋巴结中CD8⁺ T细胞中

(CD44^loCD62L^hi),central memory(CD44^hiCD62L^hi；CM)和effector/effector memory(CD44^hi CD62L^lo,

effector/EM)的比例。

图5Fbxo38敲除对T细胞活化的影响

a，用流式细胞技术检测未活化的WT和CKO CD8⁺ T细胞的TCR和CD28表面水平。

b，用流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后CD44的表达水平。

c，用流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后LAG-3的表达水平。

d，用流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后IFN-γ、Granzyme B和TNF-α的水平。

图6Fbxo38敲除对T细胞增殖和凋亡的影响

a，用Celltracker染色及流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后的增殖情况。

b，使用Annexin V和propidium iodide(PI)染色及流式细胞技术检测WT和CKOCD8⁺ T细胞的凋亡情况。

图7Fbxo38敲除对CD8⁺ T细胞转录组的影响

a,RNA-seq分析WT和CKO CD8⁺ T细胞在

和活化状态下的基因转录水平。图示为与T细胞功能相关的表面分子、功能分子以及重要转录因子的转录水平。

图8Fbxo38调控PD-1的表达水平

a,用流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后PD-1的表达水平。

b,用流式细胞技术检测WT和CKO CD4⁺T细胞体外活化后PD-1的表达水平。

c,用流式细胞技术检测WT和CKO脾脏中nTreg细胞PD-1的表达水平。

图9Fbxo38调控T细胞的抗肿瘤免疫能力

a，用B16F10皮下肿瘤模型研究FBXO38敲除对小鼠肿瘤生长的影响。

b，用B16F10皮下肿瘤模型研究FBXO38敲除对小鼠荷瘤存活的影响。

c，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞中CD44的表达水平。

d，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞中PD-1的表达水平。

e，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞中细胞因子的表达水平。

f，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞中Ki-67的表达水平。

g，B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞、CD4⁺T细胞数量及比例分析。

h，B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的Treg细胞数量分析。

i，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD4⁺T细胞中PD-1的表达水平。

j，用流式细胞技术检测B16F10皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的Treg细胞中PD-1的表达水平。

图10Fbxo38敲除影响T细胞的抗肿瘤免疫

a，用MC38皮下肿瘤模型研究FBXO38敲除对小鼠肿瘤生长的影响。

b，用流式细胞技术检测MC38皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞中PD-1的表达水平。

c，用流式细胞技术检测MC38皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD4⁺T细胞中PD-1的表达水平。

d，用流式细胞技术检测MC38皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的Treg细胞中PD-1的表达水平。

e，MC38皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞、CD4⁺T细胞数量及比例分析。

f，MC38皮下肿瘤模型中肿瘤浸润的Treg细胞数量分析。

图11Fbxo38敲低没有影响T细胞的活化

a，用实时荧光定量PCR技术检测Fbxo38的敲低效率。

b，用western blot技术检测Fbxo38的敲低效率。

c，用流式细胞仪技术检测Fbxo38敲低后细胞表面CD3和CD28的表达水平

d，用western blot技术检测Fbxo38敲低之后体外活化CD8⁺ T细胞TCR信号通路的变化情况。

e，用流式细胞仪技术检测Fbxo38敲低后体外活化CD8⁺ T细胞细胞表面CD69的表达水平。

f，用流式细胞仪技术检测Fbxo38敲低后体外活化24小时CD8⁺ T细胞细胞IFN-γ的表达水平。

g，用流式细胞仪技术检测Fbxo38敲低后体外活化48小时CD8⁺ T细胞细胞IFN-γ的表达水平。

图12Fbxo38敲低能够上调PD-1的水平并且影响CD8⁺ T细胞的肿瘤杀伤能力

a，用流式细胞技术检测Fbxo38敲低后体外刺激CD8⁺ T细胞表面的PD-1水平。

b，用流式细胞技术检测EL-4细胞中PD-L1的表达情况。

c，ELISA检测Fbxo38敲低后CD8⁺ T细胞对EL-4细胞的体外杀伤情况。

d，流式检测Fbxo38在小鼠CTL中的过表达效率。

e，图示为流式检测Fbxo38在小鼠CTL中过表达后PD-1的水平。

f，图示为流式检测Fbxo38在小鼠CTL中过表达后PD-1水平的统计图。

图13FBXO38内源性地调控CD8⁺ T细胞的抗肿瘤能力

a，图示为在B16F10皮下肿瘤模型中进行过继性细胞免疫治疗的实验方法。

b，流式检测第18天肿瘤浸润淋巴结(dLN)中回输的CD8⁺ T细胞(GFP⁺)的比例。

c，流式检测第18天非肿瘤浸润淋巴结(non-dLN)中回输的CD8⁺ T细胞(GFP⁺)的比例。

d，流式检测第18天肿瘤浸润淋巴结(dLN)中回输的CD8⁺ T细胞(GFP⁺)的PD-1的水平。

e，流式检测第18天肿瘤浸润淋巴结(dLN)中回输的CD8⁺ T细胞(GFP⁺)的Ki-67的水平。

f，将Fbxo38knock down后进行过继性免疫治疗后小鼠肿瘤的生长曲线。

g，将Fbxo38knock down后进行过继性免疫治疗后小鼠的生存曲线。

h，将Fbxo38knock down后进行过继性免疫治疗并联合PD-1抗体治疗后小鼠肿瘤的生长曲线。

i，将Fbxo38knock down后进行过继性免疫治疗并联合PD-1抗体治疗后小鼠的生存曲线。所有附图中，Error bars代表mean+/-SEM.

ns代表无明显差异,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

具体实施方式

到目前为止，对PD-1表达调控的研究都集中在转录水平，还没有关于PD-1转录后水平的研究发表。目前PD-1蛋白在翻译后水平的调控依然处于空白状态。本发明在研究中发现，PD-1泛素化能够使PD-1被降解，从而增强T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能，提高肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力，使肿瘤细胞被免疫免疫系统杀伤，FBXO38为能够促进PD-1泛素化的靶点，促进FBXO38的表达能够显著促进PD-1的降解。

泛素是一个在真核细胞内由76个氨基酸组成的非常保守的多肽，它能通过三种酶(E1：Ub-activating enzyme；E2：Ub conjugating enzyme；E3：Ub protein ligase)的作用共价交联到靶蛋白的赖氨酸上，形成对靶蛋白的泛素化修饰，进而影响靶蛋白的信号通路或者通过蛋白酶体将靶蛋白降解。泛素化调节细胞内许多重要的生理过程，比如控制周期、下调膜蛋白、参与信号转导等。靶蛋白的赖氨酸上可以连接一个泛素形成单泛素化修饰，也可以连接许多泛素形成多聚泛素化修饰。在多聚泛素化修饰中，由泛素上第48位赖氨酸介导的多聚泛素化修饰通常会使靶蛋白通过蛋白酶体途径降解，由泛素上第63位赖氨酸介导的多聚泛素化修饰则会在许多信号转导通路中起作用。

所述PD-1泛素化是指，将泛素连接到PD-1的赖氨酸上，进行泛素化修饰，影响PD-1的信号通路或者通过蛋白酶体将PD-1降解。

PD-1泛素化激动剂

是指对PD-1泛素化具有促进效果的分子。

所述PD-1泛素化激动剂可以增强T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌等功能，提高肿瘤浸润的T细胞的杀伤功能和增殖能力，使肿瘤细胞被免疫系统杀伤。

进一步的，所述PD-1泛素化激动剂能够促进PD-1的降解。

进一步的，所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

进一步的，所述FBXO38激动剂是指对FBXO38具有促进效果的分子。

对于FBXO38具有促进效果包括但不限于：增强FBXO38活性，或者促进FBXO38基因转录或表达。

增强FBXO38活性是指使FBXO38活力上升。优选地，相比增强前，FBXO38活力上升至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高至少70％，最佳的提高至少90％。

促进FBXO38基因转录或表达是指：加快FBXO38的基因转录，或提高FBXO38的基因的转录活性，或者加快FBXO38的基因表达，或提高FBXO38的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对FBXO38的基因转录或表达进行调节。

优选地，与野生型相比，FBXO38基因转录或表达提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高至少70％，最佳的提高至少90％。

PD-1泛素化激动剂制备药物

以PD-1泛素化激动剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与PD-1泛素化激动剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将PD-1泛素化激动剂及其他抗肿瘤药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

二)将PD-1泛素化激动剂及其他抗肿瘤药物配置成复方制剂。在将PD-1泛素化激动剂及其他抗肿瘤药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

可以同步的或顺序地给予有效量的PD-1泛素化激动剂及有效量的其他肿瘤治疗药物。使用时，可将有效量的PD-1泛素化激动剂及有效量的其他肿瘤治疗药物同时使用，也可将有效量的PD-1泛素化激动剂及有效量的其他肿瘤治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

化疗药物包括烷化剂(如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等)、抗代谢药(如去氧氟鸟苷、多西弗鸟啶、氟尿嘧啶、巯嘌呤、甲氨蝶呤等核苷酸类似物)、抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、阿霉素和柔红霉素等抗生素)、抗肿瘤动植物成分药(如长春瑞滨、紫杉醇、三尖杉酯碱、伊立替康、泰索帝和长春碱等)、抗肿瘤激素药(如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦和他莫昔芬等)以及如顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌和丙卡巴肼等常用化疗药。

靶向型药物包括EGFR阻断剂如吉非替尼(Gefitinib、Iressa和易瑞沙)和埃罗替尼(Erlotinib、Tarceva)、特定细胞标志物的单克隆抗体如西妥昔单抗(Cetuximab、Erbitux)和抗HER-2单抗(赫赛汀，Trastuzumab、Herceptin)、酪氨酸激酶受体抑制剂如克唑替尼(Crizotinib、Xalkori)、抗肿瘤血管生成药物如Bevacizumab、endostatin和Bevacizumab等、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂如Imatinib和Dasatinib、抗CD20单抗如Rituximab、IGFR-1激酶抑制剂如NVP-AEW541、mTOR激酶抑制剂如CCI-779、泛素-蛋白酶体抑制剂如Bortezomib等。

其他肿瘤治疗手段可选自手术切除、射频消融、氩氦超导手术治疗、激光消融治疗、高强度聚焦超声以及放射治疗包括X-刀、R-刀、3D-CRT和IMRT中的一种或多种。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术、基因突变技术及相关领域的常规技术。

实施例1

1.1实验材料

1.1.1缓冲液配方

Lysis Buffer for Co-IP(用于293FT细胞和Jurkat细胞中的免疫共沉淀试验)：50mM Tris-HCl,pH 7.4,155mM NaCl,2mM EDTA,2mM Na₃VO4,20mM NaF,10mMIodoacetamide,0.5％NP40,1mM PMSF,1mM DTT,Complete Protease Inhibitor Cocktail(Sigma)；

Lysis Buffer for Ubiquitination(用于小鼠和人的活化的CD8⁺ T细胞裂解，检测PD-1的泛素化修饰)：50mM Tris-HCl,pH 7.4,155mM NaCl,2mM EDTA,2mM Na₃VO4,20mMNaF,10mM Iodoacetamide,1％NP40,0.1％SDS,1mM PMSF,1mM DTT,Complete ProteaseInhibitor Cocktail(Sigma)；

Lysis Buffer for Ubiquitination 1(用于293FT细胞中的泛素化试验，包含1％SDS)：50mM Tris-HCl,pH 7.4,155mM NaCl,2mM EDTA,2mM Na₃VO4,20mM NaF,10mMIodoacetamide,1％NP40,1％SDS,1mM PMSF,1mM DTT,Complete Protease InhibitorCocktail(Sigma)；

Lysis Buffer for Ubiquitination 2(用于293FT细胞中的泛素化试验，无SDS)：50mM Tris-HCl,pH 7.4,155mM NaCl,2mM EDTA,2mM Na₃VO4,20mM NaF,10mMIodoacetamide,1％NP40,1mM PMSF,1mM DTT,Complete Protease Inhibitor Cocktail(Sigma)；

Tris缓冲液：50mM Tris,200mM NaCl,pH8.0；

PBS缓冲液：8g NaCl,0.2g KCl,3.58g NaH₂PO₄·12H₂O,0.27g K₂HPO₄，定容至1L，调pH至7.4，高温压灭菌；

蛋白质电泳缓冲液(Tris-甘氨酸)：25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％SDS；

蛋白质转移缓冲液(Transfer Buffer)：39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS；

Stripping Buffer：1.5％甘氨酸，0.1％SDS,1％Tween 20,调整pH到2.2；

TBST缓冲液：150mM NaCl，50mM Tris，0.1％Tween 20，调PH值为7.4，用于配制免疫印迹中的一抗、二抗和封闭液。

免疫印迹封闭液:10％BSA in TBST Buffer；

磁珠分选缓冲液(小鼠/人的CD8⁺ T细胞)：2％FBS，2mM EDTA溶解于PBS中，调pH到7.2,0.2μM滤膜过滤除菌；

表面染色缓冲液：0.1％BSA in PBS Buffer；

胞内染色缓冲液：0.5％BSA in PBS Buffer,0.1％Triton X-100；

1.1.2化学试剂

1.1.3试剂盒、细胞因子、基因工具和酶类

1.1.4细胞株

Jurkat细胞系：分离自20世纪70年代一位T细胞白血病的14岁男孩的外周血，该细胞为悬浮细胞，是研究T细胞信号转导的常用细胞系，可以通过CD3抗体或者PMA+Ionomycin激活。本论文中主要在Jurkat细胞系中过表达或者敲低Fbxo38基因，进而检测PD-1的表达水平和泛素化修饰。

HEK-293FT细胞系：293F细胞是来源于人胚肾细胞的细胞株，其中转染了腺病毒5型DNA片段，该细胞能够激活某些病毒的启动子，促进蛋白表达，具有较快的生长速率。293FT细胞在293F细胞的基础上转染了SV40大T抗原，能从含SV40起点的载体上进行非常高水平的表达。293FT细胞系生长快速，非常易于转染，是实验室常用的细胞系，用于过表达基因或者进行慢病毒包装。

B16F10黑色素瘤细胞系：分离自C57BL/6小鼠皮肤组织黑色素瘤，形态上为纺锤状、上皮状细胞。该细胞为贴壁细胞，易于转染，可稳定传代。该细胞主要用于小鼠黑色素瘤肿瘤模型构建，以及细胞增殖、凋亡和信号转导等研究

B16F10-OVA细胞系：在B16F10细胞系内过表达OVA抗原，并被细胞呈递到表面，作为抗原递呈细胞递呈OVA抗原肽刺激活化OT-1来源的T淋巴细胞。该细胞系可以成功活化OT-1来源的T淋巴细胞，用于ACT模型。

EL4细胞系：EL4细胞系来源中C57背景的淋巴瘤的小鼠，培养在1640培养基中，呈现半悬浮状态，会有轻微的贴壁。经过PD-L1检测，EL4细胞高表达PD-L1蛋白，可以用于CD8⁺T细胞的杀伤实验。

1.1.5质粒介绍

pHAGE-fEF1a-IRES-ZsGreen/mCherry(pHAGE载体)：蛋白过表达和慢病毒包装载体，启动子是fEF1a，同时具有IRES序列。IRES是一段特殊的DNA序列，能够在mRNA中间独立起始翻译过程，IRES后面连接荧光蛋白ZsGreen/mCherry，可以作为细胞转染成功的指标。同时，该载体具有LTRs序列，可以用于慢病毒的包装，用来转染难转染的细胞系，比如Jurat细胞系和小鼠的原代CD8⁺ T细胞。

pHAGE-fEF1a-HA-PD-1-IRES-mCherry：在pHAGE载体上插入N端带有HA标签的Pdcd1序列，位于IRES-mCherry之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有HA标签的PD-1分子，mCherry指示阳性细胞。

pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen：首先在pHAGE载体基础上制作

pHAGE-fEF1a-3Myc-IRES-ZsGreen质粒。将3对互补片段：

互补链1A(SEQ ID NO.2)：

5’-CAGGTGTCGTGAAGCATGGAACAGAAATTGATAAGTGAGGAAGATTTAG-3’；

互补链1B(SEQ ID NO.3)：

5’-TTGCTCTAAATCTTCCTCACTTATCAATTTCTGTTCCATGCTTCACGACACCTG-3’；

互补链2A(SEQ ID NO.4)：

5’-AGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGGAACAGAAATTGATAAGTGAGGAAGATT-3’

互补链2B((SEQ ID NO.5)：

5’-CCGCTAAATCTTCCTCACTTATCAATTTCTGTTCCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTT-3’；

互补链3A(SEQ ID NO.6)：

5’-TAGCGGCCGCAGCAATGCATGCAGGCGCGCCAGAAACGCGTGGGCACCGGTCTGCAGC-3’；互补链3B(SEQ ID NO.7)：

5’-GCTGCAGACCGGTGCCCACGCGTTTCTGGCGCGCCTGCATGCATTGCTGCGG-3’。

分别放到管子里，然后把这三个管子放到沸水中，随沸水自然冷却至室温。分别胶回DNA片段。然后将这三个DNA片段用T4连接酶连接到一起，胶回连接产物，得到3Myc片段，片段为160bp左右。用Not I内切酶切pHAGE载体并胶回，最后用GBclonart无缝克隆试剂盒连接切好的pHAGE-fEF1a-IRES-ZsGreen载体和3Myc片段，制成pHAGE-fEF1a-3Myc-IRES-ZsGreen质粒。以cDNA为模板，

用Fbxo38上游引物(SEQ ID NO.8)：

5’-TGAGGAAGATTTAGCGATGG GGCCACGAAA GAAAAGTG-3’和

Fbxo38下游引物(SEQ ID NO.9)：

5’-TGCATGCATT GCTGCTTAAA TGTAGTCATC TTCAACTG-3’；

扩增出Fbxo38，胶回产物。用内切酶Not I切pHAGE-fEF1a-3Myc-IRES-ZsGreen质粒，并用GBclonart无缝克隆试剂盒连接。制成pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen质粒。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

pHAGE-fEF1a-V5-Ub-IRES-ZsGreen：在pHAGE载体上插入N端带有V5标签的Ub序列，位于IRES-ZsGreen之前，包括Ub WT、UbK48R(将Ub的第48位赖氨酸变成R)、UbK63R(将Ub的第63位赖氨酸变成R)和UbKtoR(将Ub的第48和63位赖氨酸都变成R)，用于293FT细胞中检测PD-1蛋白的泛素化修饰。

MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen：用以下引物：

Fbxo38上游引物(SEQ ID NO.10)：

5’-GCGCCGGAATTAGATCTCATGGAACAGAAATTGATAAGTGAGGAAG-3’

Fbxo38下游引物(SEQ ID NO.11)：

5’-GGGCGGAATTCGTTAACCTTAAATGTAGTCATCTTCAAC-3’

从pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen质粒中扩增出3Myc-FBXO38基因。同时用限制性内切酶XhoI切割MSCV载体并胶回。并用GBclonart无缝克隆试剂盒连接。制成MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen质粒。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO38分子，ZsGreen指示阳性细胞。

pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO47-IRES-ZsGreen：在pHAGE载体上插入N端带有3个连续Myc标签的Fbxo47序列，位于IRES-ZsGreen之前。转染细胞后，可以在细胞内表达带有Myc标签的FBXO47分子，ZsGreen指示阳性细胞。

PLKO.1G载体：用于产生基因特异性的shRNA，在细胞中敲低特定基因。该载体可表达GFP蛋白，用来指示阳性细胞，可以进行筛选。在本课题中，该载体被用来在Jurkat和小鼠的原代CD8⁺ T细胞中敲低Fbxo38基因。

psPAX2和pMD2.G：都属于第二代的慢病毒包装质粒，跟pHAGE载体一起作为三质粒系统，用来产生慢病毒。psPAX2的主要原件包括启动子以及其后面的GAG、POL、TAT、REV序列，pMD2.G主要包括启动子以及其后面的ENV序列。在发明中，psPAX2和pMD2.G可以跟pHAGE载体和PLKO.1G载体转染293FT细胞系，进行慢病毒包装。

1.1.6抗体介绍

1.1.7实验动物介绍

Fbxo38基因条件性敲除小鼠：Fbxo38^flox/flox小鼠购买于北京华夏凯奇生物技术有限公司(Beijing CasGene Biotech公司)，称为F0代。等F0代小鼠长到8周以后，与CD4^cre小鼠进行多代交配，就可以得到FBXO38蛋白在CD4和CD8细胞中特异性敲除的Fbxo38^CKO小鼠。

OT-1小鼠：C57BL/6-Tg(Tcrα，Tcrβ)1100Mjb/J，小鼠转基因组中插入Tcrα-V2和Tcrβ-V5基因，因此该小鼠的转基因T细胞受体只能识别Ovalbumin 257-264(OVA_257-264)位的残基肽段，用来研究CD8⁺ T细胞对抗原的应答。跟大多数TCR转基因小鼠一样，这类小鼠有一定程度上的免疫缺陷。该小鼠为C57BL/6背景，购于

mice。

C57BL/6小鼠：直接购买于上海SLAC公司，SPF级别，8-10周用于动物试验。

在本发明中使用的所有小鼠都饲养在SPF环境中，Fbxo38条件性敲除小鼠和OT1小鼠在使用前都经过PCR鉴定。肿瘤实验中，对照组和实验组的小鼠年龄差别在2周以内，性别一致。

1.2实验方法

1.2.1细胞实验

1.2.1.1使用脂质体转染293FT细胞

1，细胞转染前1-2天，按照1:4-1:8的比例进行细胞传代。使用胰酶消化293FT细胞(密度90％-100％)1分钟，除去胰酶然后迅速加入DMEM培养基，重悬吹打混匀后，传代到新的10cm培养皿中，再用移液枪吹打几次彻底混匀，避免细胞成团拥挤。

2，细胞转染前4h，换液。当细胞密度达到50％左右时，用新的DMEM培养基换掉旧的培养基。可以用移液器吸去6ml旧的培养基，缓慢加入6ml 37度预热的新鲜DMEM培养基，继续培养4h。

3，转染。根据不同的实验目的，选择不同的质粒转染量，同时对应的调整Lipofectamine2000转染试剂的量。

一般情况下，Lipofectamine 2000的量(μl)/质粒的质量(μg)为2:1。具体转染步骤为：取2个1.5mL Ep管，分别加入250μl OPTI-MEM培养基，在其中一管加入10μg质粒，另外一管加入20μl Lipofectamine 2000转染试剂，分别混匀后静置5min；之后，将两管溶液在无菌混合，室温再静置20min；然后，将混合液逐滴加到细胞培养基中，随后轻柔混匀，放置于37℃细胞培养箱中继续培养。对于PD-1泛素化实验，10cm平皿中质粒转染量为：Myc-Fbxo38 15μg、HA-Pd1 3.5μg、V5-Ub 3μg、Lipofectamine 2000 30μl；对于PD-1降解实验，6cm平皿中质粒转染量为：Myc-Fbxo38 4μg、HA-Pd1 1μg、Lipofectamine 2000 10μl。

4，24-72h之后，在荧光显微镜下观察阳性率，转染成功的细胞会表达荧光蛋白。

此实验方法适用于在293FT细胞中过表达基因或者进行慢病毒包装。

1.2.1.2慢病毒系统感染Jurkat细胞系

1，按照1.2.1.1描述的方法进行慢病毒包装，使用Lipofectamine 2000将包装质粒和目的基因质粒转染进293FT细胞系。质粒的质量一般为：10μg目的质粒+7.5μg psPAX2+3μg pMD2.G。

2，转染24h之后，在荧光显微镜下观察，阳性率应该达到80％以上。如果目的蛋白分子量很大，转染效率可能会低。

3，转染48-60h之后，收集病毒上清。将病毒上清小心的放入15ml离心管中，按照6000rpm/min离心5分钟后，再用0.45μm针头式滤器过滤，得到慢病毒上清液，然后直接用慢病毒上清液感染Jurkat细胞。一般10mL病毒液可以加入1-2×10⁶Jurkat T cell，为了安全起见，将上清放在培养瓶中感染细胞。感染72小时之后，可以看到明显的荧光。如果目的基因很大，比如像Fbxo38这样3500bp的基因，阳性率略低，一般30％；如果是shRNA这样只有20bp的DNA序列，一般阳性率是100％。

4，一般感染72-96h之后换液。将病毒上清按照500g离心，换用新鲜的1640培养基重悬细胞，继续培养72-96h，可以得到相对稳定的阳性细胞，可以利用流式细胞仪进行分选。

1.2.1.3慢病毒系统感染小鼠原代细胞系

(1)病毒包装

1，按照上面描述的方法进行慢病毒包装，使用Lipofectamine 2000转染293FT细胞系，质粒的质量为：10μg PLKO.1G+7.5μg psPAX2+3μg pMD2.G。每条shRNA转染三个10cm培养皿，用于后续的病毒浓缩。

2，按照上面描述的方法收病毒上清，用0.45μm针头式滤器过滤后，将3盘病毒上清全部放入一个38ml的超速离心管中，27000rpm/min离心，4度2h。离心结束后，迅速的将上清倒掉，沿着管壁加入500μl不含FBS的1640培养基，重悬病毒，放置于4度中，过夜后使用。

(2)CD8⁺ T细胞培养与感染

1，利用磁珠分选

CD8⁺ T细胞，培养在下面的培养基中：RPMI-1640+10％FBS+1％PS+IL-7(10ng/ml)+IL-15(100ng/ml)+0.05mM 2-mercaptoethanol，每孔培养200万细胞，培养48-72h，可以看到细胞体积变大，出现小的细胞团。感染前一天，在24孔板(货号351147,BD)中铺PBS稀释的RereoNectin(1mg/ml，T100B,Takara)，一般400μl/孔，4度过夜。

2，细胞计数，然后将培养好的CD8⁺ T细胞离心，按照200万/15ml离心管，除去上清后，用500ul浓缩的病毒上清重选200万的CD8⁺ T细胞，然后缓缓的加入到用PBS洗过一次的铺有RereoNectin的孔中，37度，2000g离心60min。

3，离心之后，细胞会贴在24孔板底部，直接除去上清，用新鲜的包含IL-7和IL-15的培养基继续培养3天。

4，用流式细胞仪或者荧光显微镜检测阳性率。阳性的细胞可以根据GFP的表达进行分选，进行后续的功能或者将细胞继续扩大培养，用于ACT模型。

在整个感染过程中，只用含有IL-7和IL-15的培养基培养，细胞会呈现memerylike的状态，但是没有激活TCR信号，所以这些细胞并不表达PD-1蛋白。

1.2.1.4逆转录病毒系统在小鼠原代细胞系中过表达FBXO38

利用逆转录病毒MSCV在小鼠CD8⁺ T细胞中过表达FBXO38蛋白。

(1)病毒包装

1，按照1.2.1.1描述的方法进行逆转录病毒包装，使用Lipofectamine 2000将MSCV-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen质粒转染进plat E细胞。

2，转染48小时后收病毒上清，用0.45μm针头式滤器过滤后，将病毒上清用超滤管(Millipore,100KD)在3000g离速下室温浓缩50-70倍。

3，将OT1小鼠的脾脏取出来，磨碎，将红细胞裂解掉，在含有10nM OVA和10ng/mlIL-2的1640培养基中激活24小时。活化的细胞用1ml病毒培养基(包括500ul浓缩的病毒，500ul新鲜的完全RPMI-1640培养基和10μg/ml polybree)重悬入RetroNectin(1mg/ml,T100B,Takara)提前处理过的24孔板中。接着，细胞在37度2500rpm离心2小时，然后培养箱中培养10小时。然后按以上方法再转染一次。两次转染后将细胞重悬入新的完全RPMI-1640培养基中培养。GFP阳性的细胞即为FBXO38过表达的细胞。在以上过程中，培养基中一直有10ng/ml IL-2。

1.2.2动物实验

1.2.2.1小鼠脾脏中CD8+细胞的分离

1，取8-10周左右Fbxo38^CKO或者C57BL6小鼠，颈椎脱臼致死；

2，70％乙醇消毒，取出脾脏，放置于PBS中，用镊子捣碎整个脾脏并研磨，过40μm尼龙滤网，得到单细胞悬液；

3，500g离心5min，用MACS buffer重悬至10⁸/mL，转移到5mL流式管中；

5，按1mL细胞加入15μL Biotin标记的阴选抗体Cocktail(Stem Cell，mouse CD8⁺T Cell Isolation Kit，19852)，室温孵育15分钟；

6，加入30μL Streptavidin交联的磁珠，室温继续孵育5分钟；

7，补加MACS buffer至3mL体积，然后将流式管插入磁极，室温静置2分钟；

8，翻转磁极，将液体倒入一新的15mL离心管中，400g 4℃离心10min；

9，PBS或RPMI-1640培养基重悬，计数，此细胞即阴选得到的CD4⁺或者CD8⁺ T细胞；

10，取少部分细胞，用anti-CD4或者anti-CD8染色之后，流式染色检测细胞纯度，一般纯度大于90％。

1.2.2.2anti-CD3/CD28抗体激活小鼠CD8+细胞

1，提前一天，用PH＝9.0的PBS稀释抗体，终浓度是anti-CD3(2μg/ml)+anti-CD28(2μg/ml)。一个48孔板中，一般加入140μl的PBS。

2，分离小鼠的原代CD8⁺ T细胞，计数，用含10％FBS+10ng/ml IL-2的RPMI 1640培养基重悬至4×10⁵/mL，加入48孔板中，每孔40万细胞。

3，24-96h之间，收取细胞，进行表面染色检测PD-1表达或者保内染色检测细胞因子分泌。

4，表面染色，检测细胞表面分子表达。收取细胞之后，400g室温离心5分钟，去除上清，再加入500μl 4度的预冷的PBS，再次离心除去上清。之后用PBS+0.1％BSA+抗体的染色液重悬细胞，4度避光放置45分钟。之后加入500μl PBS，400g 4度离心5分钟，除去上清，再加入500μl PBS重悬细胞，进行流式检测。

5,胞内染色，检测细胞因子分泌。收取细胞之后，通常先进行表面染色，比如用anti-CD8标记细胞表面的CD8分子，具体方法同上。用PBS洗一遍之后，加入300μL 4％PFA，室温固定10分钟，然后1500g离心5分钟，去上清；加入1ml的PBS，1500g离心，洗一遍；然后加入PBS+0.5％BSA+0.1％Triton X-100+抗体(例如IFN-γ，TNF-α，Granzyme B)，4度染色2h或者过夜；加入500μl PBS，1500g离心，去掉上清；加入500μl PBS重悬细胞，进行流式检测。

6，细胞增殖检测。在刺激CD8⁺细胞之前，先用0.5μm活细胞染料CellTracker^TMDeep Red fluorescent dye(C34565,Thermo Fisher Scientific)在37度孵育20分钟，然后用PBS洗三次，洗掉染料再进行刺激。不同时间收取细胞，然后用流式细胞仪检测增殖情况。

7，细胞凋亡检测。CD8⁺细胞之后，不同时间收获细胞，用细胞凋亡试剂盒检测凋亡情况(eBioscience)。

1.2.2.3OT1小鼠CTL细胞的诱导

1，颈椎脱臼处死小鼠，70％乙醇消毒，取出脾脏。

2，在6cm培养皿中加入5mL PBS，将细胞滤网置于培养皿中。将脾脏用镊子撕碎后，放在滤网上，用注射器活塞研磨至所有细胞通过滤网扩散到PBS中。

3，将获得的细胞悬液加入到50mL离心管中，加入45mL红细胞裂解液，颠倒混匀后静置2-3min。500g离心5min，弃上清。

4，用50mL PBS重悬，用细胞滤网过滤(可选)，500g离心5min，弃上清。

5，用30mL1640培养基重悬细胞，加入30μL 10μg/mL IL-2(终浓度10ng/mL)，3uL100μM OVA_257-264(终浓度10nM)，混匀后加入到中号培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。

6，一般三天之后培养基变黄，之后每天换液，按照1:3的比例传代，第五天的细胞状态比较好。同时，也可以在每天取细胞进行表面染色，检测PD-1的表达水平。

1.2.2.4CD8+细胞的杀伤试验

1，CTL的诱导。按照1.2.2.3描述的方法利用从OT1小鼠的脾脏诱导产生CTL细胞，一般用第五-六天的CTL细胞进行试验，这时候细胞状态比较好。

2，将靶细胞EL-4细胞用10nM OVA_257-264 37℃孵育1小时；用杀伤缓冲液(phenolfree-RPMI,2％FBS)洗效应CTL细胞和靶细胞两遍，分别重悬至1million/mL和0.1million/mL浓度。于U型底96孔板中，每空加入100μL靶细胞；按照固定效应CTL细胞和靶细胞比例(10:1,5:1,2.5:1,1.25:1)加入梯度稀释的CTL细胞，250g离心4min，于培养箱共同孵育4h，收50μL上清利用Promega试剂盒检测靶细胞死亡释放的LDH，计算效应CTL细胞的杀伤效率。对照孔按照试剂盒要求进行设置。

1.2.2.5B16F10和MC38肿瘤模型

1，B16F10和MC38细胞培养。用胰酶消化细胞，然后用PBS洗三次，再用40μm的滤膜过滤得到单细胞悬液，调整细胞密度至3.2million/ml。培养B16F10细胞时，注意及时更换培养基，避免细胞密度过大影响细胞状态。在用胰酶消化的过程中，B16F10的消化时间比293FT稍长，大概1.5分钟，MC38细胞的消化时间比较短，大概45秒。在接种小鼠之前，将B16F10和MC38细胞密度控制在80％左右，这时候的细胞状态最好，成瘤率最高。

2，B16F10和MC38细胞移植：用8-10周龄小鼠进行肿瘤细胞移植实验，具体操作为：先用3％戊巴比妥钠腹腔注射100μL麻醉小鼠，以皮下注射的方式，将0.4million B16F10或者0.5million MC38单细胞悬液注射进小鼠体背部稍下靠近腹部的表皮，注射体积为125μl。在C57BL/6背景小鼠中，皮下注射肿瘤细胞后，可在6-8天后肉眼观察到肿瘤形成。

3，肿瘤测量和处死。大概8-10天，用游标卡尺记录肿瘤大小，测量肿瘤的长径(mm)和宽径(mm)，肿瘤大小表示为长径乘以宽径。一般来说，肿瘤在13天左右肿瘤达到10mm×10mm，18-20天左右达到15mm×15mm。对于肿瘤的长径或者宽径任何一个指标大于15mm的小鼠，或者肿瘤破溃大于10mm的小鼠，或者实验过程及饲养过程中发生肿瘤患处皮肤破溃至发生继发感染的小鼠进行安乐死。

4，肿瘤浸润的淋巴细胞表型分析。一般在第14-16天，当肿瘤大小在12mm X 12mm左右的时候，颈椎脱臼处死小鼠，70％乙醇消毒，取出脾脏并且切成小块(3mm X 3mm)并且用10ml消化液重悬(5％FBS,20mM Glutamine,50μMβ-mercaptoethanol,1.6mg/mlCollagenase IV,1.6mg/ml Collagenase I,0.02％DNase I)，置于37度转床中旋转1.5小时，可以看到大部分的肿瘤组织都消化成了细胞悬液，只留下少量的脂肪或者解结蹄组织，接下来用70μm的滤器过滤得到单细胞悬液，再用40％和70％Percoll进行密度梯度离心，肿瘤浸润的淋巴细胞会富集在40％和70％Percoll的界面上。用吸管或者移液枪小心的吸出淋巴细胞，用PBS洗两遍就得到了富集的肿瘤浸润的淋巴细胞，可以直接进行表面染色，检测CD8、CD44、PD-1等分子的表达。如果需要检测细胞因子分泌功能，需要用包含1μMIonomycin+50ng PMA+5μg/ml BFA的1640培养基37度刺激4小时，之后进行胞内染色。

1.2.2.6过继性细胞治疗(ACT)模型

1，依照1.2.2.5所述方法皮下接种0.4million B16F10-OVA细胞于C57小鼠内，每个实验组至少15只小鼠。

2，依照1.2.1.3慢病毒系统感染小鼠原代细胞系的方法，在OT1背景的CD8细胞中敲低Fbxo38基因，分选GFP阳性的细胞并且继续用含有IL-7和IL-15的培养基培养三-四天，一般细胞可以扩增三倍。

3，B16F10-OVA细胞注射后第四天，尾静脉注射1.25million/只的Fbxo38敲低的细胞,，对照组注射PBS。

4，大概8-10天的时候统计对照组和实验组的肿瘤大小，两天统计一次。

5，如果需要分析转移的OT1CD8T细胞的表型，在18天左右处死小鼠；如果需要进行anti-PD-1联合ACT治疗，PD-1抗体在第10天左右注射，PD-1抗体的克隆号是J43，100μg/只，三天注射一次，一共注射四次。

1.2.2.7RNA-seq、文库构建和生信分析

1，RNA-seq样品准备。从三对雌性Fbxo38^CKO和对应的同窝野生型小鼠的脾脏中分离

CD8⁺ T细胞，一部分直接用TRIZOL裂解，另一部分按照1.2.2.2所述方法在48孔板中刺激，抗体浓度是anti-CD3(2μg/ml)+anti-CD28(2μg/ml)，刺激时间96小时，收获细胞之后也用TRIZOL裂解。提取总RNA并且通过Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA的质量，并且通过RNAClean XP Kit(Cat A63987,Beckman Coulter)和RNase-Free DNase Set(Cat#79254,QIAGEN)两个试剂盒进一步纯化RNA。

2，文库构建。用

RNA Sample Preparation Kit(Illumina,USA)试剂盒构建文库，并且进一步通过

2.0Fluorometer(Life Technologies)和validated byAgilent 2100bioanalyzer(Agilent Technologies)对文库进行纯化、富集和定量，。

3，测序。用cBot产生Cluster，用Illumina HiSeq 2500(Illumina,USA)进行测序。

4，基因表达分析。每条基因的测序读值会转化成FPKM值，按照下面的公式进行计算：

1.2.3生化实验

1.2.3.1免疫共沉淀

1，取至少10⁷细胞(适用于Jurkat和293FT细胞)，500g离心5min，弃上清，用LysisBuffer for Co-IP裂解，4℃旋转摇床大于20rpm，裂解半小时，待细胞悬液变澄清，有絮状沉淀出现。4℃最大转速离心5min，用200μL枪头挑出絮状沉淀。取30μL上清液，加入4倍浓缩SDS loading buffer混匀，于100度加热器煮样三个5min，留作全细胞裂解液样品。

2，剩余上清液加入40μL Protein G Sepharose beads，4℃旋转摇床孵育2h，取出非特异性结合蛋白。4℃400g离心5min，取出上清液到新的EP管中，加入1.5μg-3μg抗体，4℃旋转摇床孵育12h，再加入60μL Protein G Sepharose beads，孵育4h。

3，4℃400g离心5min，去上清，用1mL 0.5％NP-40的IP裂解液洗涤3次。用扁枪头吸尽上清，加入30μL SDS loading buffer混匀，于100℃加热器煮样，每5min震荡一次，共三次。最大转速离心5min，用扁枪头吸取裂解液于新的EP管中，用于Western Blot实验。

1.2.3.2 293FT细胞中PD-1泛素化检测

1，在293FT细胞中，转染PD-1、FBXO38、Ub的质粒，36h之后收取细胞，直接用PBS从将293FT细胞从10cm dish中吹打下来，500g离心，除去上清，再用PBS洗一次。

2，用100ul的Lysis Buffer for Ubiquitination 1裂解细胞，用枪头吹打至粘稠状，vortex3-5次，然后放到100度的煮样器上孵育10分钟，然后放到冰上降温，约10分钟。

3，加入900μl的Lysis Buffer for Ubiquitination 2，目的是稀释SDS的浓度到0.1％，方便后续的免疫沉淀实验。经过这些处理，样本会形成一个紧实的团块，接下来利用超声破碎仪将团块破碎，形成看起来均匀的乳浊液，放在4度转床1h。

4，4度最高转速离心10分钟，除去沉淀，保留上清，用anti-HA的抗体进行IP，浓度为4μg/ml，留取部分上清作为全细胞裂解样品。

5，其余步骤参考1.2.3.1的免疫共沉淀的方法。

1.3试验统计分析方法

所有实验至少进行3次独立重复(部分小鼠肿瘤试验进行了两次重复)。所有数据都用平均值和标准差或标准误进行表示(mean±SD或mean±SEM)。定义P值小于0.05作为有显著性差异，具体为：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；n.s.p>＝0.05，无显著性差异。

对于n＝3的实验数据：如果两组样本的方差没有显著性差异，使用two-tailedunpaired t-test进行差异性检测；如果如果两组样本的方差有显著性差异，使用two-tailed unpaired t-test with Welch's correction进行差异性检测。

对于n>3的实验数据，首先使用Kolmogorov-Smirnov test检测数据是否符合正态分布：如果符合正太分布，并且方差没有显著性差异，使用two-tailed unpaired t-test进行差异性检测；如果符合正太分布，并且方差有显著性差异，使用two-tailed unpaired t-testwith Welch's correction进行差异性检测；如果不符合正太分布，使用Mann-Whitneytest进行差异性检测。

对于图3.4.1中的a和e中的人的样本，先使用Kolmogorov-Smirnov test检测数据是否符合正态分布：如果符合正太分布，使用paired t-test进行差异性检测；如果不符合正太分布，使用Wilcoxon matched-pairs signed rank test进行差异性检测。

小鼠肿瘤生长曲线使用two-way ANOVA检验进行显著性分析；生存曲线使用log-rank(Mantel-Cox)检验进行显著性分析。

1.4实验结果

1.4.1T细胞活化后PD-1发生泛素化修饰

本发明在激活的人外周血单核细胞(PBMC)和Jurkat细胞系中直接利用PD-1抗体(EH12.1,BD)免疫沉淀PD-1蛋白，然后利用泛素的特异性抗体进行免疫印迹检测，发现了PD-1在人的PBMC和Jurkat细胞系中都存在明显的泛素化修饰，并且在Jurkat细胞系中还存在泛素化修饰的动态变化(图1.a-c)。其中，从人血中分离PBMC细胞的具体方法参照STEMCELL公司的Lymphoprep^TM Density Gradient Medium for the Isolation ofMononuclear Cells分离Kit(Catalog#07801)。

本发明在表达PD-1的小鼠CTL细胞培养基中加入蛋白酶体降解途径抑制剂MG132或者溶酶体降解途径抑制剂NH4Cl、BFA，发现只有MG132可以导致PD-1的积累，而NH4Cl和BFA对PD-1的表达完全没有影响(图1.d-i)。为了确保MG132和NH4Cl、BFA的浓度足够抑制蛋白酶体和溶酶体降解通路，本发明分别检测了ERK1/2蛋白和p62蛋白，分别作为蛋白酶体降解途径和溶酶体降解途径的阳性对照。本发明发现在同样的细胞中，ERK1/2蛋白和p62蛋白存在积累。所以，以上数据提示，PD-1蛋白在CD8⁺诱导表达之后存在明显的动态变化，而PD-1的泛素化修饰和蛋白酶体依赖的降解现象可能是其中的重要机制。

1.4.2FBXO38在Jurkat细胞系中特异性的调控PD-1的表达

本发明运用lipo2000使293FT细胞中过表达Fbxo38，采用慢病毒包装系统感染Jurkat细胞，利用pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen使Jurkat细胞中过表达Fbxo38。293FT细胞和Jurkat细胞系中通过免疫共沉淀实验证明Myc-FBXO38可以跟HA-PD-1相互作用，并且外源过表达的Myc-FBXO38还可以跟内源诱导表达的PD-1相互作用(图2.a-d)。在293FT细胞中，Myc-FBXO47也可以跟HA-PD-1相互作用(图2.e)。为了检测FBXO38和FBXO47对PD-1稳定性的影响，本发明在Jurkat细胞系中分别利用pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO38-IRES-ZsGreen和pHAGE-fEF1a-3Myc-FBXO47-IRES-ZsGreen过表达Fbxo38和Fbxo47基因，发现过表达并不影响Jurkat细胞系表面CD3的表达量，但是经过anti-CD3刺激之后，FBXO38过表达的Jurkat细胞中PD-1表达水平明显比对照组低，而FBXO47过表达的Jurkat细胞中的PD-1并没有受到影响(图2.f-i)，这些数据提示虽然FBXO38和FBXO47都能和PD-1相互作用，FBXO38的作用可能更重要。进一步，本发明在Jurkat细胞系中用shRNA成功的敲低Fbxo38基因，其转录和蛋白水平都明显的降低，而细胞表面的CD3表达未受影响(图2.j-l)。经过anti-CD3刺激之后，Fbxo38敲低组的PD-1表达明显比对照组高，而两组之间的转录水平并没有明显的差异(图2.m-n)。进一步，本发明用PD-1免疫共沉淀的抗体IP:PD-1并用western blot检测到Fbxo38敲低能够明显提高PD-1蛋白水平(图2.o)。结合免疫共沉淀实验以及Jurkat细胞中的过表达和敲低实验，本发明认为FBXO38是调控PD-1稳定性的关键蛋白。

编码所述shRNA的DNA核苷酸序列为5’GACTTCCTTTGTATCAGCTTA 3’(SEQ IDNO.12)。

1.4.3FBXO38催化PD-1发生K-48类型的多聚泛素化修饰并促进降解

本发明首先在293FT细胞中，过表达Myc-Fbxo38、HA-Pd1和V5-Ub，发现FBXO38可以促进PD-1的泛素化，而将PD-1胞内段的两个赖氨酸全部突变成R之后，PD-1的泛素化信号完全消失，这说明FBXO38可能在这两个位点催化PD-1的泛素化(图3.a)。在Fbxo38过表达和敲低的Jurkat细胞系中，本发明发现FBXO38可以显著的影响内源PD-1的泛素化修饰(图3.b-c)。本发明比较了野生型PD-1和分别突变K210R、K233R和两个K都突变的KtoR的泛素化信号后发现，K210R突变不影响PD-1的泛素化信号，而K233R和KtoR突变几乎检测不到PD-1的泛素化修饰，这说明FBXO38在PD-1的K233位点催化泛素化修饰(图3.d)。FBXO38属于F-box E3连接酶家族，这个家族有一个重要的F-box功能域，本发明将F-box删除之后，发现FBXO38催化PD-1泛素化修饰的能力受到了显著的影响(图3.e)。本发明将不同的V5-Ub突变转染到293FT细胞中，发现K-48R突变之后，PD-1的泛素化信号受到了明显的影响，而K63R的信号几乎不受影响，提示FBXO38也是催化PD-1产生K-48类型的多聚泛素化修饰(图3.f)。最后，本发明用蛋白合成抑制剂CHX阻断蛋白合成，检测PD-1的蛋白稳定性，发现FBXO38可以显著的促进PD-1的降解。如果将PD-1的两个赖氨酸突变成R或者将FBXO38的F-box domain删除，PD-1都会变得更加稳定(图3.g-i)。所以，以上数据说明FBXO38可以在PD-1的K233位点催化K-48类型的多聚泛素化修饰，并且促进PD-1降解。

1.4.4Fbxo38敲除对T细胞发育的影响

本发明采用C57背景的Fbxo38条件性敲除的小鼠(Fbxo38^CKO)(图4a)。

本发明首先采用流式细胞技术检测了Fbxo38基因敲除对小鼠T细胞发育的影响。在胸腺中，CD4和CD8细胞的发育在Fbxo38^CKO小鼠中跟对照组相比没有显著性差异，包括DN(CD4^-CD8^-)、DP(CD4⁺CD8⁺)、CD4SP(CD4⁺CD8^-)和CD8SP(CD4^-CD8⁺)，在DN细胞的DN1、DN2、DN3和DN4阶段也没有明显的差异(图4.b-c)。在外周的脾脏和淋巴结中，CD4和CD8细胞的比例在Fbxo38^CKO小鼠中跟对照组相比没有显著性差异，大部分的CD4和CD8细胞都保持在

状态，central memory(CD44^hiCD62L^hi)和effector/effector memory(CD44^hiCD62L^lo)细胞也没有显著的差别(图4.d-i)。所以，这些数据说明，Fbxo38基因敲除不影响T细胞的发育和外周的免疫稳态。

1.4.5Fbxo38敲除对T细胞活化、增殖和凋亡的影响

本发明采用流式细胞技术检测了Fbxo38^CKO和对照组小鼠中CD8⁺ T细胞表面的CD3和CD28的表达量，发现Fbxo38敲除并不影响CD3和CD28的表达(图5.a)。经过anti-CD3和anti-CD28刺激之后，Fbxo38^CKO和对照组CD8⁺ T细胞表面的活化分子CD44的表达量相当(图5.b)。同时，本发明也用流式细胞技术检测了CD8⁺ T细胞活化之后，分泌细胞因子的能力，发现在IFN-γ、TNF-α和GranzymB的分泌在72h和96h两个时间点都没有受到明显的影响(图5.d)。

1.4.6Fbxo38敲除对T细胞增殖和凋亡的影响

本发明进一步用Celltracker染色及流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞体外活化后的增殖情况，使用Annexin V和propidium iodide(PI)染色及流式细胞技术检测WT和CKO CD8⁺ T细胞的凋亡情况，，发现Fbxo38敲除也不影响CD8⁺ T细胞的增殖和凋亡(图6)。

1.4.7Fbxo38敲除对CD8⁺ T细胞转录组的影响

本发明采用RNA-seq分析WT和CKO CD8⁺ T细胞在

和活化状态下的基因转录水平，选择了三对Fbxo38^CKO和对照组小鼠，分离CD8⁺ T细胞，经过anti-CD3和anti-CD28刺激之后，通过RNA-Seq检测了多个细胞表面分子、细胞因子和活化分子以及转录因子的表达变化，发现Fbxo38敲除也不影响CD8⁺ T细胞中这些功能分子的表达。但是，CD8⁺ T细胞活化之后，PD-1的蛋白水平在Fbxo38敲除的CD8⁺ T细胞中有了明显的升高。相反，另外一个免疫抑制分子LAG-3的表达水平并没有差异。在这些实验说明，在CD8+ T细胞中，FBXO38的主要靶点是PD-1，在PD-1通路没有激活的情况下，Fbxo38敲除的小鼠具有正常的活化能力(图7a)。

1.4.8Fbxo38敲除对PD-1的影响

本发明用流式细胞技术检测了WT和Fbxo38^CKO小鼠CD8⁺、CD4⁺T细胞和Treg细胞表面PD-1的表达水平。经过anti-CD3和anti-CD28刺激之后，Fbxo38^CKO与WT相比，CD8⁺和CD4⁺T细胞表面的PD-1水平明显高(图8.a-b)。同时，本发明也用流式细胞技术检测了小鼠脾脏中Treg(CD4⁺CD25⁺)细胞的PD-1水平，发现Fbxo38^CKO与WT相比Treg中PD-1水平明显提高(图8.c)。综上所述，Fbxo38的敲除，使PD-1的表达水平在T细胞中明显提高。

1.4.9Fbxo38敲除影响T细胞抗肿瘤免疫

本发明利用肿瘤模型，在生理条件下研究FBXO38对于CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫能力的作用。B16F10细胞高表达PD-L1分子，发现意味着PD-1-PD-L1通路在B16F10模型中是持续活化，PD-1通路在该模型的肿瘤免疫逃逸中起着重要作用。B16F10是一种非常恶性的肿瘤模型，肿瘤的生长速度很快。不过，跟对照组小鼠相比，Fbxo38^CKO小鼠中肿瘤的生长速度更快，生存期更短(图9.a-b)。进一步的分析肿瘤浸润的T细胞发现(图9.c)，超过90％的肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞都是CD44阳性的，意味着这些细胞都是经过抗原活化的，而Fbxo38^CKO小鼠中CD8⁺ T细胞具有更高的PD-1表达水平、更低的增殖能力(Ki67表达)和分泌细胞因子功能的缺陷(IFN-γ、TNF-α和GranzymB)，CD4⁺、CD8⁺和Treg细胞的比例并没有受到影响(图9.d-j)。

1.4.10Fbxo38敲除影响T细胞抗肿瘤免疫

本发明使用了MC38模型，也发现Fbxo38^CKO小鼠中CD8⁺ T细胞具有更高的PD-1表达水平，肿瘤生长更快(图10.a-f)。这些数据说明了FBXO38蛋白可以通过调控PD-1的表达影响CD8⁺ T细胞的功能。

1.4.11Fbxo38敲低没有影响T细胞的活化

本发明在体外通过shRNA在OT1CD8⁺ T细胞中敲低Fbxo38基因，观察Fbxo38敲低组和对照组的CD8⁺ T细胞的PD-1水平。经过筛选，本发明选择了两条Fbxo38特异性的shRNA，经过qPCR和免疫印迹验证，可以有效地敲低内源的Fbxo38(图11.a-b)。跟在Fbxo38敲除的CD8⁺ T细胞一样，Fbxo38敲低不影响细胞表面的CD3和CD28分子的表达(图11.c)。更进一步，本发明检测了Fbxo38敲低对TCR信号通路的影响，发现包括CD3磷酸化、PLC-磷酸化和ERK磷酸化并没有因为Fbxo38敲低受到影响，T细胞活化分子CD69和细胞因子IFN-的分泌也没有受到影响(图11.d-g)。

编码所述shRNA的DNA核苷酸序列为：

5’GTGGATGCGACTGGTTGATAT 3’(SEQ ID NO.13)

5’CGTAATCGTAACGGAGCATTT 3’(SEQ ID NO.14)

1.4.12Fbxo38敲低上调PD-1的表达并且影响CD8⁺ T细胞的杀伤能力

用anti-CD3和anti-CD28抗体活化T细胞之后流式检测PD-1水平，发现Fbxo38敲低组细胞的PD-1表达水平明显升高(图12.a)，这跟Fbxo38敲除的CD8⁺ T细胞表型一致。为了研究PD-1的高表达是否会影响CD8⁺ T细胞的功能，本发明选择了以EL-4细胞作为靶细胞的OT1CD8⁺ T细胞杀伤系统。EL-4细胞高表达PD-L1，在OT1CD8⁺ T细胞杀伤的时候可以有效的激活PD-1通路(图12.b)。跟对照组相比，Fbxo38敲低组细胞的杀伤能力明显受到了影响；同时，anti-PD-1可以完全恢复这种功能缺陷(图12.c)。进一步验证FBXO38调控CD8⁺ T细胞的PD-1水平，在OVA激活的CTL中用逆转录病毒MSCV将Fbxo38过表达，发现PD-1的水平明显降低(图12.d-f)。这些数据提示PD-1是FBXO38的主要靶点。

1.4.13FBXO38内源性地调控CD8+ T细胞的抗肿瘤能力

本发明使用过继性T细胞治疗(Adoptive Transfer Model)治疗B16F10肿瘤模型进行研究。在这个模型中，本发明在体外通过shRNA在OT1CD8⁺ T细胞中敲低Fbxo38基因(所用shRNA与1.4.11中所用shRNA相同)，分选并扩大培养这些细胞，然后注射到荷瘤小鼠中(B16F10-OVA)，观察Fbxo38敲低组和对照组的CD8⁺ T细胞对肿瘤的控制能力(图13.a)。本发明将未刺激的Fbxo38敲低组和对照组细胞回输到B16F10-OVA荷瘤小鼠中，发现在小鼠的腹股沟淋巴结(draining lymph node)中，Fbxo38敲低组细胞的比例和Ki67的表达量明显比对照组低，而PD-1的表达量却明显比对照组高；而在肠系膜淋巴结(non-draining lymphnode)中，两组细胞的比例相当，说明Fbxo38敲低并没有影响T细胞迁移到次级淋巴器官中(图13.b-e)。因此，Fbxo38敲低组细胞对肿瘤的控制能力明显比对照组低，小鼠的生存期也更短(图13.f-g)，这个数据是跟Fbxo38条件性敲除小鼠的数据一致。最后，本发明研究了anti-PD-1和ACT联合治疗对肿瘤的控制情况，发现在Fbxo38敲低和对照组中，联合治疗明显比ACT单独治疗的效果好，而且联合治疗之后，两组小鼠的肿瘤大小和生存期没有明显差别(图13.h-i)，这说明anti-PD-1可以恢复Fbxo38敲低造成的功能缺陷。这些数据联合Fbxo38敲低条件性敲除的数据说明：FBXO38可以通过特异性的调控PD-1的表达水平调控CD8⁺ T细胞的抗肿瘤免疫功能。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> PD-1泛素化激动剂的功能与用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagatct ttgtgaagac cctcactggc aaaaccatca cccttgaggt cgagcccagt 60

gacaccattg agaatgtcaa agccaaaatt caagacaagg agggtatccc acctgaccag 120

cagcgtctga tatttgccgg caaacagctg gaggatggcc gcactctctc agactacaac 180

atccagaaag agtccaccct gcacctggtg ttgcgcctcc gcggtggata a 231

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtgtcgt gaagcatgga acagaaattg ataagtgagg aagatttag 49

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgctctaaa tcttcctcac ttatcaattt ctgttccatg cttcacgaca cctg 54

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcaaaagct catttctgaa gaggacttgg aacagaaatt gataagtgag gaagatt 57

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctaaatc ttcctcactt atcaatttct gttccaagtc ctcttcagaa atgagctt 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagcggccgc agcaatgcat gcaggcgcgc cagaaacgcg tgggcaccgg tctgcagc 58

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctgcagacc ggtgcccacg cgtttctggc gcgcctgcat gcattgctgc gg 52

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaggaagat ttagcgatgg ggccacgaaa gaaaagtg 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcatgcatt gctgcttaaa tgtagtcatc ttcaactg 38

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgccggaat tagatctcat ggaacagaaa ttgataagtg aggaag 46

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggcggaatt cgttaacctt aaatgtagtc atcttcaac 39

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacttccttt gtatcagctt a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtggatgcga ctggttgata t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgtaatcgta acggagcatt t 21

Claims (12)

1.PD-1泛素化激动剂在制备PD-1降解剂或制备肿瘤免疫治疗药物中的用途,所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.所述PD-1泛素化激动剂是指对PD-1泛素化具有促进效果的分子；

b.所述PD-1泛素化激动剂选自慢病毒或逆转录病毒包装的质粒、碳水化合物、脂类、小分子化合物、RNA、多肽或蛋白。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

c.所述FBXO38激动剂是指对FBXO38具有促进效果的分子；

d.所述FBXO38激动剂选自能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，特征d中，能够使FBXO38表达量增加的分子或者活性增强的分子选自慢病毒或逆转录病毒包装的质粒、碳水化合物、脂类、小分子化合物、RNA、多肽或蛋白。

5.一种肿瘤免疫治疗药物，包括有效量的PD-1泛素化激动剂,所述PD-1泛素化激动剂为FBXO38激动剂。

6.FBXO38作为作用靶标在筛选肿瘤免疫治疗药物或筛选自身免疫疾病治疗药物中的用途。

7.一种肿瘤免疫治疗药物的筛选方法，包括：验证待筛药物能否对FBXO38有促进效果，若是，则将之确定为肿瘤免疫治疗候选药物。

8.如权利要求7所述的肿瘤免疫治疗药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：将待筛药物作用于表达FBXO38的体外细胞上，确定细胞中FBXO38是否发生了活力增强或表达上调。

9.如权利要求8所述的肿瘤免疫治疗药物的筛选方法，其特征在于，

确定细胞中FBXO38是否发生了活力增强或表达上调的方法为：实时定量PCR和/或Western Blot检测，或质谱检测。

10.一种自身免疫疾病治疗药物的筛选方法，包括：验证待筛药物是能否对FBXO38有抑制效果，若是，则将之确定为自身免疫疾病治疗候选药物。

11.如权利要求10所述的自身免疫疾病治疗药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：

将待筛药物作用于表达FBXO38的体外细胞上，确定细胞中FBXO38是否发生了活力减弱或表达降低。

12.如权利要求11所述的自身免疫疾病治疗药物的筛选方法，其特征在于,

确定细胞中FBXO38是否发生了活力减弱或表达降低的方法为：实时定量PCR和/或Western Blot检测，或质谱检测。

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