ES2896504T3

ES2896504T3 - Fármaco que contiene inhibidor de caspasa para el tratamiento o la prevención de trastornos causados por TGF-beta y aplicaciones del mismo

Info

Publication number: ES2896504T3
Application number: ES16877998T
Authority: ES
Inventors: Noriko Koizumi; Naoki Okumura
Original assignee: Doshisha Co Ltd
Current assignee: Doshisha Co Ltd
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2022-02-24
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: WO2017110094A1; JP6273636B2; US20210196656A1; EP3395364B1; EP3395364A1; EP3395364A4; JP2018065860A; JPWO2017110094A1; US11446263B2

Abstract

Un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, cirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED) y trastorno idiopático del endotelio corneal.

Description

DESCRIPCIÓN

Fármaco que contiene inhibidor de caspasa para el tratamiento o la prevención de trastornos causados por TGF-beta y aplicaciones del mismo

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debido al menos a una señal del factor de crecimiento transformante p (TGF-p) y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales.

[Antecedentes de la técnica]

La información visual se reconoce cuando la luz transmitida a la córnea, que es un tejido transparente en la parte más frontal de un globo ocular, llega a la retina y excita las células nerviosas de la retina, y una señal eléctrica generada se transmite a través del nervio óptico a la corteza visual del cerebro. Para lograr una buena visión, es necesario que la córnea sea transparente. La transparencia de la córnea se conserva manteniendo un contenido de agua constante con las funciones de bombeo y barrera de las células endoteliales corneales.

Las células endoteliales corneales humanas están presentes a una densidad de aproximadamente 3000 células por 1 mm2 al nacer. Una vez dañadas, las células endoteliales corneales humanas tienen una capacidad de regeneración muy limitada. La distrofia corneal endotelial de Fuchs es una enfermedad que causa una anomalía en las células endoteliales dentro de la córnea y reduce significativamente la densidad de las células endoteliales corneales, lo que da como resultado un edema de la córnea. Se desconoce la causa de la misma. En la distrofia corneal endotelial de Fuchs, los componentes de la matriz extracelular, tales como el colágeno o la fibronectina, se depositan en una parte de la superficie posterior de la membrana de Descemet, situada en la parte posterior de la córnea, lo que produce guttas (guttas corneales) y el engrosamiento de la membrana de Descemet. Las guttas (guttas corneales) y el engrosamiento de la membrana de Descemet son las causas de fotofobia o visión borrosa en pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs, lo que compromete significativamente la calidad de vida de los pacientes. De esta manera, los componentes de la matriz extracelular, tales como la fibronectina, se asocian a afecciones que causan una disminución de la agudeza visual, tal como guttata en la superficie del endotelio corneal o guttas turbias, y pueden ser la causa principal de un trastorno del endotelio corneal asociado a la opacidad de la córnea, tal como enturbiamiento, nebulosidad corneal o leucoma. Se entiende que no existe un método terapéutico eficaz que no sea el trasplante de córnea para la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Sin embargo, hay una escasez de donación de córnea en Japón, donde el número de pacientes que esperan un trasplante de córnea es de aproximadamente 2600, mientras que el número de trasplantes de córnea realizados en Japón es de aproximadamente 1700 al año.

Para la distrofia corneal endotelial de Fuchs, no se ha informado el cultivo (Bibliografía no relacionada con patentes 1 y 3) ni la inmovilización (Bibliografía no relacionada con patentes 2) de células endoteliales corneales de pacientes con distrofia corneal de Fuchs, sino células adecuadas para el cribado de un fármaco terapéutico o un fármaco para prevenir la evolución, que mantienen las características de la enfermedad, tales como la sobreproducción de matrices extracelulares. Por lo tanto, existe un límite para el desarrollo de un fármaco terapéutico de las mismas. En la actualidad, no existe ningún fármaco terapéutico que se use en la práctica clínica, por lo que la terapia depende del trasplante de córnea.

Además, la Bibliografía de patente 1 desvela un péptido inhibidor de TGF-p1 para tratar la fibrilización y/o la opacidad de las córneas. La Bibliografía de patente 2 desvela anticuerpos que se unen a TGF-p1, 2 o 3. La Bibliografía de patente 3 desvela que se puede usar un agonista o activador de Nrf2 en la terapia de trastornos del endotelio corneal. La Bibliografía de patente 4 desvela un péptido que puede unirse a un factor de crecimiento transformante p1 (TGF-p1) y ser un potente inhibidor de la bioactividad de TGF-p1 al unirse directamente a una citocina. La Bibliografía de patente 5 desvela un supresor de la formación de cicatrices que comprende un polipéptido BMP-7. La Bibliografía de patente 6 describe, en términos generales, los trastornos de la córnea como enfermedades para las que la acción inhibidora de TGF-p es terapéutica o profilácticamente eficaz.

El documento de patente 7 desvela métodos y composiciones para preservar las células epiteliales del pigmento de la retina y fotorreceptores.

El documento de patente 8 desvela un agente crioconservante natural para células madre obtenidas de médula ósea y un método de criopreservación para células madre obtenidas de médula ósea usando dicho agente.

El documento no relacionado con patentes 4 desvela un mecanismo de apoptosis inducida por mitomicina en células endoteliales corneales cultivadas.

[Listado de referencias]

[B ibliografía de patentes]

[PTL 1] Publicación PCT Japonesa en Fase Nacional Abierta a Inspección Pública N.° 2013-520405

[PTL 2] Publicación Internacional N.° WO 2012/167143

[PTL 3] Publicación Internacional N.° WO 2012/009171

[PTL 4] Publicación PCT Japonesa en Fase Nacional Abierta a Inspección Pública N.° 2007-525204

[PTL 5 ] Publicación PCT Japonesa en Fase Nacional Abierta a Inspección Pública N.° 2006-508169

[PTL 6] Publicación Internacional N.° WO 2004/018430

[PTL 7] Publicación Internacional N.° WO 2011/133964

[PTL 8] Publicación Internacional N.° WO 2014/112675

[B ibliografía no relacionada con patentes]

[NPL 1] Zaniolo K, et al. Exp Eye Res.; 94 (1): 22-31. 2012

[NPL 2] Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2; 52 (13): 9291-9297. 2011

[NPL 3] Kelliher C. et al. Exp Eye Res Vol. 93 (6), 880-888, 2011

[NPL 4] Wu, K.Y., et al. Molecular Vision. 14, 1705-1712, 2008

[Sumario de la invención]

[Solución al problema]

Los inventores han completado la presente invención al descubrir que una señal de TGF-p causa un trastorno mediante el uso de un agente tal como el factor de crecimiento transformante p2 (TGF-p2), y al descubrir que tal trastorno puede tratarse sorprendentemente con un inhibidor de caspasa en células de un modelo de trastorno del endotelio corneal de distrofia corneal endotelial de Fuchs. Los inventores también han descubierto que las anomalías mitocondriales se pueden curar con un inhibidor de caspasa. La presente invención se ha completado al descubrir la aplicación de un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de trastornos del endotelio corneal (especialmente trastornos del endotelio corneal en la distrofia corneal endotelial de Fuchs) debidos a un factor de crecimiento transformante p (TGF-p) y/o una anomalía mitocondrial. Para los trastornos del endotelio corneal, tal como la distrofia corneal endotelial de Fuchs, se ha intentado la terapia o la prevención, con la supresión de la muerte celular (especialmente la apoptosis) como objetivo principal, pero se ha señalado que la función visual empeora debido al enturbiamiento, cuya causa principal es la sobreproducción de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, la fibronectina o similares). Dado que la muerte celular y la formación de la matriz extracelular son eventos independientes, es preferible que ambos puedan suprimirse. En la presente invención, los inventores han descubierto inesperadamente que la sobreexpresión de componentes de la matriz extracelular (MEC), tales como la fibronectina, puede suprimirse inhibiendo la caspasa. Los inventores han descubierto así que se puede aplicar un inhibidor de caspasa para la mejora, la terapia o la prevención de enfermedades del endotelio corneal debidas a la sobreexpresión de la matriz extracelular (por ejemplo, guttas, engrosamiento de la capa de Descemet, nebulosidad corneal, leucoma, otras afecciones de enturbiamiento y similares). Los inventores también han descubierto que un inhibidor de caspasa suprime el daño celular debido a la criopreservación de las células endoteliales corneales.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal del factor de crecimiento transformante p (TGF-p) en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, cirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD, por sus siglas en inglés), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED, por sus siglas en inglés) y trastorno idiopático del endotelio corneal. La afección, trastorno o enfermedad es preferentemente distrofia corneal endotelial de Fuchs, tal como una afección debida a la sobreproducción de la matriz extracelular en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, tal como al menos una seleccionada del grupo que consiste en guttata en una superficie del endotelio corneal, guttas turbias de la membrana de Descemet, engrosamiento de la membrana de Descemet, visión borrosa, halo, deslumbramiento, visión reducida, nebulosidad corneal, leucoma y anomalía en el sentido visual. El medicamento que comprende un inhibidor de caspasa puede servir para promover el crecimiento de células endoteliales corneales. El medicamento para promover el crecimiento de las células endoteliales corneales que comprende un inhibidor de caspasa puede comprender además un inhibidor de la MAP cinasa p38. El inhibidor de caspasa es preferentemente Z-VD-FMk . En particular, la presente invención proporciona un medicamento que comprende emricasán para su uso en el tratamiento o la prevención de la distrofia corneal endotelial de Fuchs. La invención también proporciona un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, formación de guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, engrosamiento de la córnea, nebulosidad, cicatrices, nebulosa corneal, mácula corneal, leucoma, fotofobia y visión borrosa. La afección, trastorno o enfermedad es preferentemente distrofia corneal endotelial de Fuchs, tal como al menos una seleccionada de formación de guttas y engrosamiento de la membrana de Descemet en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. La afección, trastorno o enfermedad puede deberse a la sobreexpresión de fibronectina en las células endoteliales corneales.

La invención también proporciona un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, otra distrofia corneal endotelial y un trastorno del endotelio corneal debido a un fármaco, cirugía, traumatismo o infección. La afección, trastorno o enfermedad es preferentemente distrofia corneal endotelial de Fuchs.

El inhibidor de caspasa puede ser un inhibidor de caspasa 3. El inhibidor de caspasa puede seleccionarse del grupo que consiste en Z-VD-FMK, Z-VAD-FMK, emricasán y nivocasán. La concentración de Z-VD-FMK es preferentemente de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 100 pM. La concentración de Z-VAD-FMK es preferentemente de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 30 pM. La concentración del emricasán es preferentemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM. La concentración de nivocasán es preferentemente de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 300 pM.

Los expertos en la técnica reconocen las ventajas de la presente invención leyendo y comprendiendo la siguiente descripción detallada, según sea necesario.

[Efectos ventajosos de la invención]

La presente invención proporciona un medicamento que puede tratar o prevenir un trastorno o enfermedad debida al factor de crecimiento transformante p (TGF-p). La presente invención también proporciona un medicamento que puede tratar o prevenir una enfermedad debida a un trastorno del endotelio corneal debido a la sobreproducción de la matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina) tal como guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, nebulosidad corneal, leucoma u otras afecciones de enturbiamiento.

[Breve descripción de las figuras]

[Figura 1] La figura 1 muestra imágenes de microscopio de células endoteliales corneales después de la irradiación UV y un gráfico de la actividad de caspasa 3/7. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase del grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con irradiación UV emricasán, grupo complementado con irradiación UV Z-VD-FMK y grupo complementado con irradiación UV Z-VAD-FMK. El gráfico de la derecha muestra la actividad de caspasa 3/7 frente al grupo de irradiación UV (%) en el eje vertical, y el grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con irradiación UV emricasán (10 pM), grupo complementado con irradiación UV Z-VD-FMK (10 pM) y grupo complementado con irradiación UV Z-VAD-FMK (10 pM). * indica significación estadística (p<0,01).

[Figura 2] La figura 2 muestra imágenes de microscopio de células endoteliales corneales después de la irradiación UV en los grupos complementados con Z-VD-FMK y los resultados de las transferencias de Western. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) del grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con irradiación UV Z-VAD-FMK (10 pM) y grupos complementados con irradiación UV Z-VD-FMK (3, 10, 20, 30 y 100 pM). Se usaron 100 J/m2 como intensidad UV. El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP y GAPDH para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 3] La figura 3 muestra imágenes de microscopio de células endoteliales corneales después de la irradiación UV en los grupos complementados con emricasán y los resultados de las transferencias de Western. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) del grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con irradiación UV Z-VD-FMK (10 pM) y grupos complementados con irradiación UV emricasán (1, 3, 10, 30 y 100 pM). Se usaron 100 J/m2 como intensidad UV. El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP y GAPDH para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 4] La figura 4 muestra imágenes de microscopio de células endoteliales corneales después de la irradiación UV en los grupos complementados con nivocasán y los resultados de las transferencias de Western. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) del grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con irradiación UV Z-VD-FMK (10 pM) y grupos complementados con irradiación UV nivocasán (1, 3, 10, 30 y 100 pM). Se usaron 100 J/m2 como intensidad UV. El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP y GAPDH para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 5] La figura 5 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido al peróxido de hidrógeno. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) de células endoteliales corneales del grupo de control, grupo complementado con H2O2 (1000 pM), grupo complementado con H2O2 Z-VAD-FMK (10 pM), grupo complementado con H2O2 Z-VD-FMK (10 pM), grupo complementado con H2O2 emricasán (10 pM) y grupo complementado con H2O2 nivocasán (100 pM). El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP, GAPDH y CHOP para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 6] La figura 6 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a MG132. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) de células endoteliales corneales del grupo de control, grupo complementado con MGl32 (10 ^|jM), grupo complementado con MG132 Z-VAD-FMK (10 j M), grupo complementado con MG132 Z-VD-f Mk (10 j M), grupo complementado con MG132 emricasán (10 j M) y grupo complementado con MG132 nivocasán (100 j M). El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP, GAPDH y CHOP para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 7] La figura 7 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a la tapsigargina (TG). El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento de 200 veces) de células endoteliales corneales del grupo de control, grupo complementado con TG (10 j M), grupo complementado con TG Z-VAD-FMK (10 j M) y grupo complementado con TG emricasán (10 j M). El panel de la derecha muestra los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP, GAPDH y CHOP para cada uno de los grupos anteriores.

[Figura 8] La figura 8 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a CCCP. Se muestran los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP y GAPDH para el grupo de control, grupo complementado con CCCP (50 j M), grupo complementado con CCCP Z-VAD-FMK (10 j M), grupo complementado con CCCP Z-VD-FMK (10 j M) y grupo complementado con CCCP emricasán (10 j M).

[Figura 9] La figura 9 muestra la fluorescencia observada de Anexina V en células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV. El panel de la izquierda muestra imágenes de microscopio confocal del grupo de control, grupo de irradiación UV (250 J/m2), grupo complementado con UV Z-VD-FMK (10 j M), grupo complementado con UV Z-VAD-FMK (10 j M), grupo complementado con UV emricasán (10 j M) y grupo complementado con UV nivocasán (100 j M). En el gráfico de la derecha, el eje vertical muestra las células positivas para Anexina V (%), y el eje horizontal muestra, desde la izquierda, el grupo de control, grupo de irradiación UV, grupo complementado con UV Z-VD-FMK, grupo complementado con UV Z-VAD-FMK, grupo complementado con UV emricasán y grupo complementado con UV nivocasán. * indica significación estadística (p<0,01).

[Figura 10] La figura 10 muestra el trastorno funcional observado y la anomalía morfológica en las células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV. La fila superior muestra la fluorescencia de N-cadherina, la fila central muestra la fluorescencia de ZO-1 y la fila inferior muestra la fluorescencia de faloidina. Las imágenes muestran, desde la izquierda, el grupo de control, grupo de irradiación UV (250 J/m2), grupo complementado con UV Z-VD-FMK, grupo complementado con UV Z-VAD-FMK, y grupo complementado con UV emricasán de las células endoteliales corneales.

[Figura 11] La figura 11 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD, por sus siglas en inglés) debido al TGF-p2. Las imágenes muestran iFECD del grupo de control, grupo complementado con TGF-p2 (10 ng/ml), grupo complementado con TGF-p2 SB431542 (10 j M), grupo complementado con TGF-p2 Z-VD-FMK (10 j M), grupo complementado con TGF-p2 Z-VAD-FMK (10 j M) y grupo complementado con TGF-p2 emricasán (10 j M). Se usó un aumento de 100 veces.

[Figura 12] La figura 12 muestra los resultados de la citometría de flujo para medir la muerte celular programada inducida por TGF-p2. Se muestran los resultados de la citometría de flujo para cada uno del grupo de control, grupo complementado con TGF-p2, grupo complementado con TGF-p2 SB431542 (10 j M), grupo complementado con TGF-p2 Z-VD-FMK (10 j M) y grupo complementado con TGF-p2 emricasán (10 j M).

[Figura 13] La figura 13 muestra un gráfico de la relación de células positivas para Anexina V medida por citometría de flujo. El eje vertical muestra el valor (porcentaje) de C1-LD en la figura 12 como la relación de células en la posición de Anexina V (%). El eje horizontal muestra, desde la izquierda, el grupo de control, grupo complementado con TGF-p2, grupo complementado con TGF-p2 SB431542, grupo complementado con TGF-p2 Z-VD-FMK y grupo complementado con TGF-p2 emricasán. Los datos se muestran como media ± SE y n = 3. El valor de p se calculó mediante la prueba de Dunnett. ** indica significación estadística (p<0,01).

[Figura 14] La figura 14 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño celular en un modelo celular de enfermedad de distrofia corneal endotelial de Fuchs debido a TGF-p2. Se muestran los resultados de las transferencias de Western de caspasa 3, PARP y GAPDH. La figura muestra, desde la izquierda, el grupo de control, grupo complementado con TGF-p2, grupo complementado con TGF-p2 SB431542 (10 j M), grupo complementado con TGF-p2 Z-VAD-FMK (10 j M), grupo complementado con TGF-p2 Z-VD-Fm K (10 j m ) y grupo complementado con TGF-p2 emricasán (10 j M).

[Figura 15] La figura 15 muestra el efecto de un inhibidor de caspasa sobre la conservación de la córnea usando córneas de conejo. La fila superior del panel izquierdo muestra imágenes de fluorescencia para N-cadherina, la fila central muestra imágenes de fluorescencia para ZO-1 y la fila inferior muestra imágenes de fluorescencia para faloidina. La columna de la izquierda muestra el grupo de control y la columna de la derecha muestra el grupo complementado con emricasán (10 j M). El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de células que se encontró que tenían formación de anillo contráctil de actina (%) en el eje vertical. La barra izquierda muestra el grupo de control y la barra derecha muestra el grupo complementado con emricasán. * indica significación estadística (p<0,01).

[Figura 16] La figura 16 muestra las mediciones de la tasa de viabilidad celular mediante el uso de diversas soluciones de criopreservación. El gráfico de la izquierda muestra células negativas para azul de tripano (%). El gráfico de la derecha muestra la tasa de viabilidad celular (%) medida usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo. Cada gráfico muestra, desde la izquierda, CELL BANKER PLUS, CELL BANKER 2, STEM-CELLBANKER, KM BANKER, CnT-CRYO, OptiMEM+FBS al 10 %+DMSO al 10 % y el grupo de control no criopreservado.

[Figura 17] La figura 17 muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase de la observación de la supervivencia después de la congelación de las células endoteliales corneales en diversas soluciones de criopreservación. La fila superior muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase de células endoteliales corneales cultivadas en ausencia de Y27632, y la fila inferior muestra imágenes de microscopio de diferencia de fase de células endoteliales corneales cultivadas en presencia de Y27632. Las imágenes muestran, desde la izquierda, la solución de conservación usada, CELL BANKER PLUS, CELL BANKER 2, STEM-CELLBANKER, KM BANKER, CnT-CRYO y OptiMEM+FBS al 10 %+DMSO al 10 %.

[Figura 18] La figura 18 muestra un gráfico del recuento celular después de la congelación de células endoteliales corneales en diversas soluciones de criopreservación. El eje vertical muestra el recuento celular (células) y el eje horizontal muestra, desde la izquierda, CELL BANKER PLUS, CELL BANKER 2, STEM-CELLBANKER, KM BANKER, CnT-CRYO, OptiMEM+FBS al 10 %+DMSO al 10 % y células de pase no criopreservadas.

[Figura 19] La figura 19 muestra el efecto de la inhibición de la caspasa de Z-VD-FMK sobre las células endoteliales corneales después de la criopreservación del endotelio corneal. La imagen de la izquierda muestra células endoteliales corneales del control complementado con DMSO sin añadir un inhibidor de caspasa (se usó KM BANKER como medio), y la imagen de la derecha muestra células endoteliales corneales cuando se añadió Z-VD-FMK.

[Figura 20] La figura 20 muestra la disminución del daño celular en la criopreservación del endotelio corneal debido a Z-VD-FMk . El gráfico de la izquierda muestra la viabilidad celular (%) inmediatamente después de devolver las células congeladas a la temperatura normal. La barra de la izquierda muestra el control Freeze en el que no se añadió Z-VD-FMK a la solución de criopreservación, y la barra de la derecha muestra Freeze Z-VD-FMK, en el que se añadió Z-VD-FMK a la solución de criopreservación. El gráfico de la derecha muestra el recuento celular después de 24 horas de la descongelación de las células y la adición de DMSO o Z-VD-FMK. Los cuatro grupos de la izquierda son grupos que no se complementaron con SB203580, y los cuatro grupos de la derecha son grupos complementados con SB203580. El gráfico muestra, desde la izquierda, el grupo complementado con DMSO de control Freeze, grupo complementado con Z-VD-FMK de control Freeze, grupo complementado con DMSO de Freeze+Z-VD-FMK y grupo complementado con Z-VD-FMK de Freeze+Z-VD-FMK.

[Figura 21] La figura 21 muestra que Z-VD-FMK promueve el cultivo celular después de la congelación cuando se añade a múltiples disolventes de conservación. El gráfico muestra, desde la izquierda, grupos que usan un medio complementado con DMSO, Cell Banker y KM Banker como soluciones de criopreservación. En cada grupo, el gráfico muestra, desde la izquierda, datos de no adición después de la criopreservación (grupo DMSO), adición de Y27632 (5 ^|jM) y adición de Z-VD-FMK (5 j M). El eje vertical muestra el cambio en múltiplos con respecto al recuento celular en el grupo de DMSO.

[Figura 22] La figura 22 muestra el efecto de supresión de un inhibidor de caspasa sobre la sobreexpresión de fibronectina debido a TGF-p2 en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD).

[Figura 23] La figura 23 muestra los resultados de las transferencias de Western de fibronectina, p-Smad2, Smad2 y GAPDH en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD). [Figura 24] La figura 24 muestra un diagrama esquemático de la relación de la visión con las células endoteliales corneales y la deposición de la ECM. El diagrama muestra que la visión se deteriora a medida que aumentan las células endoteliales corneales y la deposición de la ECM. El engrosamiento de la membrana de Descemet o las guttas debido a la deposición de la ECM comúnmente comienza a desarrollarse a los 30 y 40 años en los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs, y evoluciona a lo largo de la vida de los pacientes. La evolución da como resultado una discapacidad visual tal como visión borrosa, halo, deslumbramiento o visión reducida. Mientras progresa la muerte de las células endoteliales corneales, al mismo tiempo, la transparencia de la córnea se mantiene por el endotelio corneal restante, lo que compensa la función de bombeo hasta que la densidad de las células endoteliales corneales está por debajo de aproximadamente 1000 células/mm2. Si la densidad está por debajo de aproximadamente 1000 células/mm2, la infiltración del humor acuoso anterior en la córnea conduce a un edema corneal, lo que da como resultado una discapacidad visual grave. La presente técnica puede mantener la función visual suprimiendo tanto la deposición de la ECM como la muerte de las células endoteliales corneales.

[Descripción detallada]

En lo sucesivo en el presente documento se explica la presente invención. A lo largo de toda la memoria descriptiva, debe entenderse que una expresión en singular abarca el concepto de la misma en forma plural, a menos que se indique específicamente de otro modo. Por lo tanto, los artículos singulares (por ejemplo, "un", "uno/a", "el/la" y similares) también deben entenderse como que abarcan el concepto de los mismos en forma plural, a menos que se indique específicamente de otro modo. Además, los términos usados en el presente documento deben entenderse como usados con el significado que se usa comúnmente en la técnica, a menos que se indique específicamente de otro modo. Por lo tanto, a menos que se defina de otro modo, todas las terminologías y términos científicos y técnicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que el entendimiento general de los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. En caso de contradicción, la presente memoria descriptiva (incluidas las definiciones) tiene prioridad.

(Definiciones)

Como se usa en el presente documento, "caspasa" es un término general para endopeptidasas que hidrolizan un enlace peptídico en el lado del extremo C del ácido aspártico, con cisteína como centro de actividad. Se sabe que las caspasas tienen una función en el procesamiento de citocinas (interleucina 1p y similares), participación en la ejecución de la muerte celular programada y las respuestas inflamatorias. Todas las caspasas se traducen como un precursor enzimático. Las caspasas se activan a partir de la degradación por otra caspasa o por sí mismas y funcionan en forma de cascada. A las caspasas se les asigna un número en el orden de descubrimiento. En la actualidad, en los mamíferos se conocen de la caspasa 1 a la caspasa 14. Se han descubierto aproximadamente 10 tipos de caspasas en las células humanas. Por ejemplo, la caspasa 1 tiene la función de inducir la inflamación mediante el procesamiento de citocinas, la caspasa 3 está directamente involucrada en la ejecución de la muerte celular programada y la caspasa 8 se posiciona cadena arriba de la cascada y es responsable de la señalización en la muerte celular programada.

Como se usa en el presente documento, "inhibidor de caspasa" se refiere a cualquier agente que inhiba la señalización de cualquier caspasa. Por lo tanto, un inhibidor de caspasa es un compuesto que puede inhibir una o más de una familia de caspasas. Un inhibidor de caspasa es preferentemente soluble en agua. Esto se debe a que, a menos que un inhibidor de caspasa sea soluble en agua, puede ser necesario usar un disolvente que no sea altamente biocompatible. La solubilidad en agua se puede clasificar basándose en la definición de solubilidad en la farmacopea. En otras palabras, la cantidad de disolvente requerida para disolver 1 g o 1 ml de soluto se define como extremadamente fácil de disolver: menos de 1 ml; fácilmente soluble: 1 ml o más y menos de 10 ml; algo fácil de disolver: 10 ml o más y menos de 30 ml; algo difícil de disolver: 30 ml o más y menos de 100 ml; difícil de disolver: 100 ml o más y menos de 1000 ml; muy difícil de disolver: 1000 ml o más y menos de 10000 ml; y difícilmente soluble: 10000 ml o más. La solubilidad se evalúa de manera similar en el presente documento. Se entiende que la solubilidad en agua significa que se puede usar una sustancia con cualquier solubilidad, siempre que se pueda disolver una cantidad eficaz de la misma cuando se usa agua como disolvente. Un componente soluble en agua de este tipo se usa ventajosamente como colirio.

Los inhibidores de caspasa que pueden usarse en la presente invención no están particularmente limitados, siempre que sean compuestos que tengan actividad inhibidora de caspasa. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitación, los compuestos descritos en la Publicación Japonesa Abierta a Inspección Pública N.° 2012-036150, Publicación Japonesa Abierta a Inspección Pública N.° 2007-308501, Publicación Japonesa Abierta a Inspección Pública N.° 2005-089324, Publicación Japonesa Abierta a Inspección Pública N.° 2002-338474, Publicación Japonesa Abierta a Inspección Pública N.° 2001-302516, Publicación PCT Japonesa en Fase Nacional Abierta a Inspección Pública N.° 2009-542689, Publicación Internacional N.° WO 2006/054757, y similares, así como Z-VAD-FMK (inhibidor de pan-caspasa), Z-VD-FMK (inhibidores de caspasa 1, 3, 6, 7, 8 y 9 que son sustancialmente inhibidores de pancaspasa), emricasán (cualquier inhibidor de caspasa), nivocasán (inhibidores de caspasa 1, 3, 7 y 9 que son sustancialmente inhibidores de caspasa), Z-YVAD-FMK (inhibidor de caspasa 1), Z-VDVAD-FMK (inhibidor de caspasa 2), Z-DEVD-FMK (inhibidor de caspasa 3), Z-LEv D-FMK (inhibidor de caspasa 4), Z-WEHD-f Mk (inhibidor de caspasa 5), Z-VEID-FMK (inhibidor de caspasa 6), Z-IETD-FMK (inhibidor de caspasa 8), Z-LEHD-FMK (inhibidor de caspasa 9), Z-AEVD-FMK (inhibidor de caspasa 10) y Z-LEED-f Mk (inhibidor de caspasa 13).

Los ejemplos de inhibidores de caspasa preferidos incluyen, pero sin limitación, emricasán. Los ejemplos de otros inhibidores de caspasa preferidos incluyen, pero sin limitación, Z-VAD-FMK, Z-VD-FMK y nivocasán. Un inhibidor de caspasa es preferentemente capaz de inhibir todas las caspasas, pero puede ser un inhibidor de caspasa selectivo. Un inhibidor de caspasa selectivo se refiere a un inhibidor de caspasa que inhibe una o más caspasas en una familia de caspasas. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, dado que se entiende que la caspasa 3 está directamente implicada en la muerte celular programada, un inhibidor que inhibe la caspasa 3 es directo y eficaz, pero también se puede usar un inhibidor que inhiba indirectamente la caspasa 3 inhibiendo una caspasa cadena arriba (por ejemplo, caspasa 2, 8, 9, 10 o similares) en una cascada de caspasas. Como alternativa, un inhibidor de caspasa puede ser un inhibidor que inhiba la caspasa 6 o la caspasa 7, que se consideran factores que ejecutan la muerte celular programada al igual que la caspasa 3, o un inhibidor que inhiba indirectamente la caspasa 6 o la caspasa 7 al inhibir una caspasa cadena arriba en una cascada de caspasas. Preferentemente, un inhibidor de caspasa a usar es ventajosamente un "inhibidor de pan-caspasa". Mientras tanto, se puede usar un inhibidor de caspasa que inhiba directa o indirectamente la caspasa 8, que no es un factor directo para la muerte celular programada, pero se considera una molécula importante para la señalización en la muerte celular programada.

Los ejemplos de otros inhibidores de caspasa que pueden usarse incluyen anticuerpos neutralizantes de caspasas, compuestos que inhiben la actividad de caspasas, compuestos que inhiben la transcripción de un gen que codifica péptidos de caspasa (es decir, ácido nucleico no codificante, ARNi y ribozima), y compuestos de componentes vegetales o similares. La concentración usada es, por ejemplo, de aproximadamente 50 nmol/l a 100 pmol/l, y generalmente de aproximadamente 0,001 a 100 pmol/l, y preferentemente de aproximadamente 0,01 a 75 pmol/l, de aproximadamente 0,05 a 50 pmol/l, de aproximadamente 1 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,01 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,05 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,075 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,5 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l, de aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, de aproximadamente 1,5 a 10 pmol/l, de aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, de aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 2,5 a 10 pmol/l, de aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 5,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 8,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, de aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, de aproximadamente 0,05 a 5,0 pmol/l, de aproximadamente 0,075 a 5,0 pmol/l, de aproximadamente 0,1 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 0,5 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 0,75 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 1,0 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 1,25 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 1,5 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 1,75 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 2,0 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 2,5 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 3,0 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 4,0 a 5,0 jmol/l, de aproximadamente 0,01 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,05 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,075 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,1 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,5 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,75 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 1,0 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 1,25 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 1,5 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 1,75 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 2,0 a 3,0 jmol/l, de aproximadamente 0,01 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,09 a 35 jmol/l, o de aproximadamente 0,09 a 3,2 |jmol/l, y más preferentemente de aproximadamente 0,05 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,075 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,1 a 1,0 jmol/l, de aproximadamente 0,5 a 1,0 jmol/l, o de aproximadamente 0,75 a 1,0 jmol/l, pero la concentración no se limita a las mismas.

Los ácidos nucleicos no codificantes pueden inhibir la expresión y/o la función de un gen (ácido nucleico) que codifica un miembro de una ruta de señalización de una caspasa o similares mediante cualquiera de las acciones descritas anteriormente. El diseño de una secuencia no codificante complementaria a una región no traducida cerca del extremo 5' del ARNm de un gen que codifica la caspasa mencionada anteriormente o similares se considera eficaz para inhibir la traducción del gen. Además, también se puede usar una secuencia que sea complementaria a una región no traducida de 3' o una región codificante. De esta manera, los ácidos nucleicos no codificantes usados en la presente invención incluyen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia no codificante de una secuencia no solo de una región de traducción, sino también de una región no traducida de un gen que codifica la caspasa mencionada anteriormente o similares. Un ácido nucleico no codificante a usar se une cadena abajo de un promotor adecuado, y preferentemente una secuencia que comprende una señal de terminación de la transcripción se une al lado 3'. Un ácido nucleico preparado de esta manera se puede transformar en un animal (célula) deseado usando un método conocido. Una secuencia de un ácido nucleico no codificante es preferentemente una secuencia que es complementaria a un gen que codifica una caspasa o similares del animal (célula) a transformar o una porción del mismo. Sin embargo, tal secuencia no necesita ser completamente complementaria, siempre que la expresión génica pueda suprimirse eficazmente. Un ARN transcrito tiene preferentemente una complementariedad que es del 90 % o más, y mucho más preferentemente del 95 % o más, con respecto a un transcrito de un gen diana. Para inhibir eficazmente la expresión de un gen diana usando un ácido nucleico no codificante, es preferible que la longitud del ácido nucleico no codificante sea de al menos 12 bases y menos de 25 bases. Sin embargo, el ácido nucleico no codificante de la presente invención no se limita necesariamente a esta longitud. Por ejemplo, la longitud puede ser de 11 bases o menos, 100 bases o más, o 500 bases o más. Un ácido nucleico no codificante puede estar compuesto únicamente por ADN, pero puede comprender un ácido nucleico distinto de los ADN, tal como un ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés). Un ácido nucleico no codificante usado en la presente invención puede ser un ácido nucleico no codificante que contiene LNA que comprende LNA en el extremo 5' o LNA en el extremo 3'. La secuencia no codificante se puede diseñar basándose en una secuencia de ácido nucleico de una caspasa o similares mediante el método descrito en, por ejemplo, Hirashima e Inoue, Shin-seikagaku Jikkenn Kouza 2 [New Biochemical Experiment Course 2] Kakusan IV Idenshi no Fukusei to Hatsugen [Duplication and Expression of Gene of Nucleic Acid IV], Ed. por la Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1993, 319-347.

La expresión de caspasas o similares también se puede inhibir utilizando una ribozima o ADN que codifica una ribozima. Una ribozima se refiere a una molécula de ARN que tiene actividad catalítica. Si bien hay ribozimas con diversas actividades, un estudio que se centró especialmente en las ribozimas como enzima para escindir un ARN hizo posible diseñar una ribozima que escinde de manera específica de sitio un ARN. Existen ribozimas con un tamaño de 400 nucleótidos o más como en las ribozimas del intrón del grupo I y ARN M1 contenido en la ARNasa P, pero también existen las que tienen un dominio activo de aproximadamente 40 nucleótidos llamadas ribozimas de cabeza de martillo o en horquilla (Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 1990, 35, 2191).

Por ejemplo, un dominio de autoescisión de una ribozima de cabeza de martillo escinde el lado 3' de C15 de una secuencia denominada G13U14C15. La formación de pares de bases de U14 y A9 se considera importante para la actividad de los mismos. También se demuestra que la escisión también se puede realizar en A15 o U15 en lugar de C15 (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228). Las ribozimas de escisión de ARN de tipo enzima de restricción que reconocen la secuencia UC, UU o UA en los ARN diana se pueden crear diseñando sus sitios de unión al sustrato para que sean complementarios a una secuencia de ARN cerca del sitio diana (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., Makoto Koizumi y Eiko Otsuka, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 7059).

Las ribozimas en horquilla también son útiles para el objetivo de la presente invención. Tal ribozima se encuentra, por ejemplo, en la hebra negativa de un ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (Buzayan J M, Nature, 1986, 323, 349). Se ha demostrado que también se pueden crear ribozimas de escisión de ARN específicas de diana a partir de ribozimas en horquilla (Kikuchi, Y. y Sasaki, N., Nucl. Acids Res, 1991, 19, 6751., Yo Kikuchi, Kagaku to Seibutsu [Chemistry and Biology], 1992, 30, 112). De esta manera, la expresión de un gen que codifica una caspasa o similares puede inhibirse escindiendo específicamente un transcrito del gen usando una ribozima.

La expresión de un gen endógeno tal como una caspasa también se puede suprimir por ARN interferente (en lo sucesivo en el presente documento, abreviado como "ARNi") usando un ARN bicatenario que tiene una secuencia que es idéntica o similar a la secuencia de un gen diana. El ARNi es una metodología que actualmente está llamando la atención, que puede suprimir la expresión de un gen que tiene una secuencia que es homóloga a un ARN bicatenario (ARNbc) cuando el ARNbc se incorpora directamente a una célula. En células de mamífero, se puede usar ARNbc de hebra corta (ARNip) para inducir ARNi. El ARNi tiene muchas ventajas sobre los ratones con genes inactivados, tal como un efecto estable, un experimento facilitado y un bajo coste. El ARNip se analiza en detalle en otras partes de la memoria descriptiva.

Como se usa en el presente documento, "ARNip" es una molécula de ARN que tiene una porción de ARN bicatenario que consiste en 15 a 40 bases, en la que el ARNip tiene la función de escindir el ARNm de un gen diana con una secuencia complementaria a una hebra no codificante del ARNip para suprimir la expresión del gen diana. Específicamente, el ARNip en la presente invención es un ARN que comprende una porción de ARN bicatenario que consiste en una hebra de ARN codificante que consiste en una secuencia homóloga a secuencias de ARN consecutivas en ARNm de caspasas o similares y una hebra de ARN no codificante que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de ARN codificante. El diseño y la fabricación de dichos ARNip y ARNip mutante analizados a continuación están dentro de la competencia técnica de los expertos en la técnica. Cualquier región de ARN consecutiva de ARNm que sea un transcrito de una secuencia de caspasa o similares puede seleccionarse apropiadamente para producir ARN bicatenario correspondiente a esta región, que está dentro del procedimiento ordinario realizado por los expertos en la técnica. Además, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente una secuencia de ARNip que tenga un efecto de ARNi más fuerte a partir de secuencias de ARNm, que son transcritos de la secuencia, mediante un método conocido. Además, si se revela una de las hebras, los expertos en la técnica pueden encontrar fácilmente la secuencia de bases de la otra hebra (hebra complementaria). El ARNip se puede preparar apropiadamente usando un sintetizador de ácido nucleico disponible comercialmente. También se puede utilizar un servicio de síntesis común para la síntesis de ARN deseada.

En términos de bases, la longitud de una porción de ARN bicatenario es de 15 a 40 bases, preferentemente de 15 a 30 bases, más preferentemente de 15 a 25 bases, aún más preferentemente de 18 a 23 bases y mucho más preferentemente de 19 a 21 bases. Se entiende que los límites superiores y los límites inferiores de las mismas no se limitan a dichos límites específicos, y pueden ser de cualquier combinación de los límites mencionados. La estructura de extremo de una hebra codificante o hebra no codificante de ARNip no se limita particularmente y puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con el objetivo. Por ejemplo, tal estructura de extremo puede tener un extremo romo o un extremo pegajoso (saliente). Se prefiere un tipo en el que el extremo 3' sobresalga. El ARNip que tiene un saliente que consiste en varias bases, preferentemente de 1 a 3 bases, y más preferentemente 2 bases en el extremo 3' de una hebra de ARN codificante, y la hebra de ARN no codificante es preferible por tener un gran efecto de supresión de la expresión de un gen diana en muchos casos. El tipo de bases de un saliente no está particularmente limitado, que puede ser una base que constituya un ARN o una base que constituya un ADN. Un ejemplo de una secuencia saliente preferida incluye dTdT en el extremo 3' (2 pb de desoxi T) y similares. Los ejemplos de ARNip preferidos incluyen, pero sin limitación, todos los ARNip con dTdT (2 pb de desoxi T) en el extremo 3' de las hebras codificante o no codificante del ARNip.

Además, también es posible usar ARNip en el que se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden de uno a varios nucleótidos en una o ambas de la hebra codificante y la hebra no codificante del ARNip descritas anteriormente. Una a varias bases, como se usa en el presente documento, no están particularmente limitadas, pero preferentemente se refiere a de 1 a 4 bases, más preferentemente de 1 a 3 bases y mucho más preferentemente de 1 a 2 bases. Los ejemplos específicos de dichas mutaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones que dan como resultado de 0 a 3 bases en la porción saliente, mutaciones que cambian la secuencia de bases de la porción saliente 3' a otra secuencia de bases, mutaciones en las que las longitudes de la hebra de ARN codificante y la hebra de ARN no codificante descritas anteriormente son diferentes en 1 a 3 bases debido a la inserción, adición o deleción de bases, mutaciones que sustituyen una base en la hebra codificante y/o no codificante por otra base, y similares. Sin embargo, es necesario que la hebra codificante y la hebra no codificante puedan hibridarse en dichos ARNip mutantes, y estos ARNip mutantes tienen la capacidad de suprimir la expresión génica que sea equivalente a la de los ARNip sin mutaciones.

El ARNip también puede ser una molécula con una estructura en la que un extremo está cerrado, tal como una estructura en horquilla (ARN de horquilla corta; ARNhc). Un ARNhc es un ARN que comprende un ARN de hebra codificante de una secuencia específica de un gen diana, un ARN de hebra no codificante que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de hebra codificante, y una secuencia enlazadora para conectar las dos hebras, en la que la porción de hebra codificante se hibrida con la porción de hebra no codificante para formar una porción de ARN bicatenario.

Es deseable que el ARNip no muestre el llamado efecto inespecífico en el uso clínico. Un efecto inespecífico se refiere a una acción para suprimir la expresión de otro gen, además del gen diana, que es parcialmente homólogo al ARNip usado. Para evitar un efecto inespecífico, es posible confirmar de antemano que un ARNip candidato no tiene reactividad cruzada mediante el uso de una micromatriz de ADN o similares. Además, es posible evitar un efecto inespecífico confirmando si hay un gen que comprenda un resto que sea altamente homólogo a una secuencia de un ARNip candidato, que no sea un gen diana, usando una base de datos conocida proporcionada por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) o similares.

Con el fin de preparar el ARNip, se puede usar apropiadamente un método conocido, tal como un método que usa síntesis química o un método que usa una técnica de recombinación de genes. Con un método que usa síntesis, se puede sintetizar un ARN bicatenario basándose en la información de secuencia usando un método común. Con un método que usa una técnica de recombinación de genes, se puede producir un ARNip construyendo un vector de expresión que codifique una secuencia de hebra codificante o una secuencia de hebra no codificante e introduciendo el vector en una célula huésped, y a continuación obteniendo cada uno de ARN de hebra codificante y ARN de hebra no codificante producidos por transcripción. También es posible producir un ARN bicatenario deseado expresando un ARNhc que forme una estructura en horquilla, que comprende una hebra codificante de una secuencia específica de un gen diana, una hebra no codificante que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de hebra codificante y una secuencia enlazadora para unir las dos hebras.

Para un ARNip, todo o parte del ácido nucleico que constituye el ARNip puede ser natural o un ácido nucleico modificado, siempre que tal ácido nucleico tenga actividad para suprimir la expresión de un gen diana.

El ARNip no tiene que ser necesariamente un par de ARN bicatenarios con respecto a una secuencia diana. Puede ser una mezcla de una pluralidad de pares (la "pluralidad" no está particularmente limitada, pero se refiere preferentemente a un pequeño número de aproximadamente 2 a 5) de ARN bicatenarios en una región que comprende una secuencia diana. En este sentido, los expertos en la técnica pueden producir apropiadamente un ARNip como una mezcla de ácidos nucleicos correspondiente a una secuencia diana usando un sintetizador de ácido nucleico disponible comercialmente y una enzima DICER. También se puede utilizar un servicio de síntesis común para la síntesis de ARN deseada. Cabe señalar que el ARNip abarca el denominado "ARNip cóctel". Para el ARNip de acuerdo con la presente invención, no todos los nucleótidos tienen que ser un ribonucleótido (ARN). En otras palabras, en la presente invención, uno o una pluralidad de ribonucleótidos que constituyen un ARNip pueden ser un desoxirribonucleótido correspondiente. Este término, "correspondiente", se refiere a tener el mismo tipo de base (adenina, guanina, citosina, timina (uracilo)) pero una estructura de resto de azúcar diferente. Por ejemplo, un desoxirribonucleótido correspondiente a un ribonucleótido que tiene adenina se refiere a un desoxirribonucleótido que tiene adenina.

Además, un ADN (vector) que puede expresar el ARN descrito anteriormente es un ejemplo de un ácido nucleico que puede suprimir la expresión de una caspasa o similares. Por ejemplo, el ADN (vector) que puede expresar el ARN bicatenario descrito anteriormente es un ADN que tiene una estructura en la que un a Dn que codifica una de las hebras del ARN bicatenario y un ADN que codifica la otra hebra del ARN bicatenario están unidos con un promotor para que cada uno de los ADN se pueda expresar. Los expertos en la técnica pueden preparar apropiadamente el ADN descrito anteriormente usando una técnica de ingeniería genética común. Más específicamente, el vector de expresión se puede producir insertando apropiadamente un ADN que codifica el ARN de interés en diversos vectores de expresión conocidos.

Puede usarse un ácido nucleico modificado como ácido nucleico para suprimir la expresión de un gen diana. Un ácido nucleico modificado se refiere a un ácido nucleico, que tiene una modificación en un nucleósido (resto de base, resto de azúcar) y/o un sitio de unión internucleosídica y tiene una estructura que es diferente a la de un ácido nucleico de origen natural. Los ejemplos de "nucleósido modificado" que constituyen un ácido nucleico modificado incluyen: nucleósidos abásicos; arabinonucleósido, 2'-desoxiuridina, a-desoxirribonucleósido, p-L-desoxirribonucleósido y otros nucleósidos que portan modificaciones de azúcar; ácidos peptidonucleicos (PNA), ácidos peptidonucleicos de unión a grupos fosfato (PHONA, por sus siglas en inglés), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos morfolino nucleicos y similares. Los nucleósidos que llevan la modificación de azúcar anterior incluyen 2-O-metilrribosa, 2'-desoxi-2'-fluororribosa, 3-O-metilrribosa y otra pentosa sustituida; 1',2'-desoxirribosa; arabinosa; azúcar de arabinosa sustituido; y nucleósidos que tienen una modificación de azúcar de alfa-anómero y hexosa. Estos nucleósidos también pueden tener una modificación de base en la que se modifica el resto de base. Los ejemplos de dichas bases modificadas incluyen pirimidina, tal como 5-hidroxicitosina, 5-fluorouracilo y 4-tiouracilo; purina, tal como 6-metiladenina y 6-tioguanosina; otras bases heterocíclicas y similares.

Los ejemplos de un "enlace internucleosídico modificado" que constituye un ácido nucleico modificado incluyen enlazador de alquilo, enlazador de glicerilo, enlazador de amino, enlace de poli(etilenglicol), enlace internucleosídico de fosfonato de metilo; y enlaces entre nucleósidos no naturales tales como metilfosfonotioato, fosfotriéster, fosfotiotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, profármaco triéster, sulfona, sulfonamida, sulfamato, formacetal, N-metilhidroxilamina, carbonato, carbamato, morfolino, boranofosfonato y fosforamidato.

La secuencia de ácido nucleico comprendida en el ARNip bicatenario incluye ARNip para una caspasa, otros miembros de señalización de caspasa y similares.

También es posible introducir el ácido nucleico o agente en un retículo endoplásmico de fosfolípidos tal como un liposoma y administrar el retículo endoplásmico. Se puede introducir un retículo endoplásmico en el que se conserva un ARNip o ARNhc en una célula predeterminada usando lipofección. A continuación, la célula resultante se administra sistémicamente, tal como por vía intravenosa, intraarterial o similares. También se puede administrar localmente en un sitio requerido en un ojo o similares. Si bien un ARNip exhibe un efecto supresor posterior a la transcripción específico muy bueno in vitro, el ARNip se degrada rápidamente in vivo debido a la actividad de nucleasa en el suero, de manera que la duración del mismo es limitada. Por lo tanto, ha existido la necesidad de desarrollar un sistema de suministro mejor y más eficaz. Como ejemplo, Ochiya, T et al., Nature Med., 5: 707-710, 1999, Curr. Gene Ther., 1: 31-52, 2001 informan que un material biocompatible, atelocolágeno, cuando se mezcla con un ácido nucleico para formar un complejo, es un portador que tiene la acción de proteger un ácido nucleico de una enzima degradante en un organismo vivo y es extremadamente adecuado como portador de un ARNip. Si bien se puede usar una forma de este tipo, el método para introducir un fármaco de ácido nucleico, terapéutico o profiláctico de acuerdo con la presente invención no se limita al mismo. De esta manera, debido a la rápida degradación por acción de una nucleasa en el suero de un organismo vivo, es posible lograr la continuación de un efecto durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, Takeshita F. PNAS, (2003) 102 (34) 12177-82, Minakuchi Y Nucleic Acids Research (2004) 32 (13) e109 informan que el atelocolágeno obtenido de la piel bovina forma un complejo con un ácido nucleico, que tiene la acción de proteger un ácido nucleico de una enzima degradante en un organismo vivo y es extremadamente adecuado como portador de un ARNip. Se puede usar una técnica de este tipo.

Como se usa en el presente documento, "iFECD" (distrofia corneal endotelial de Fuchs inmovilizada) es una abreviatura para células inmovilizadas en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Como se usa en el presente documento, "HCEC" es una abreviatura para células endoteliales corneales humanas. Adicionalmente, "iHCEC" es una abreviatura para células endoteliales corneales humanas inmovilizadas.

Como se usa en el presente documento, "muerte celular programada" se refiere a un fenómeno de células que mueren espontáneamente en un momento o entorno determinado como si la muerte estuviera programada previamente. La muerte celular programada se usa en el significado que incluye, por ejemplo, "apoptosis".

Como se usa en el presente documento, "factor de crecimiento transformante p (también indicado con la abreviatura TGF-p)" se usa con el mismo significado que los usados en la técnica. Es una citocina homodímera multifuncional con un peso molecular de 25 kD que exhibe una diversidad de actividad biológica, tal como ser responsable de la patogénesis de diversas enfermedades escleróticas, artritis reumatoide y vitreorretinopatía proliferativa, estar profundamente involucrada en la caída del cabello, suprimir el funcionamiento de células inmunocompetentes mientras se suprime la sobreproducción de proteasa para prevenir la degradación del tejido pulmonar que da como resultado enfisema pulmonar, y suprimir el crecimiento de células cancerosas. "Señal de TGF-p" se refiere a una señal mediada por TGF-p, que es provocada por TGF-p. Los ejemplos de señales de TGF-p incluyen señales mediadas por TGF-p2 además de señales mediadas por TGF-p1, TGF-p3 o similares. En los seres humanos, TGF-p tiene tres isoformas, TGF-p1 a p3, que tienen una homología de aproximadamente el 70 % y una acción similar. El TGF-p se produce como una forma latente inactiva con un peso molecular de aproximadamente 300 kD que no puede unirse a un receptor. Su acción se ejerce al activarse sobre la superficie de una célula diana o alrededores de la misma para convertirse en una forma activa que pueda unirse a un receptor.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se entiende que la acción del TGF-p en una célula diana se transmite por una ruta de fosforilación de una serie de proteínas encargadas de transmitir información denominada Smad. En primer lugar, cuando el TGF-p activado se une a un receptor de TGF-p de tipo II en la superficie de una célula diana, se forma un complejo de receptor que consiste en dos moléculas de receptores de tipo II y dos moléculas de receptores de TGF-p de tipo I, y los receptores de tipo II fosforilan los receptores de tipo I. Se entiende que cuando los receptores fosforilados de tipo I fosforilan Smad2 o Smad3, el Smad2 o Smad3 fosforilado forma un complejo con Smad4, en el que el complejo migra a un núcleo y se une a una secuencia diana llamada caja CAGA que está presente en una región promotora del gen diana para inducir la transcripción y la expresión de un gen diana con un coactivador.

Una ruta de señalización del factor de crecimiento transformante p (TGF-p) puede modular muchas actividades celulares, tales como el crecimiento y la diferenciación celular, detención del crecimiento, muerte celular programada y transición epitelial-mesenquimal (EMT, por sus siglas en inglés), modulando el gen diana. Los miembros de la familia TGF-p, incluyendo el propio TGF-p (por ejemplo, TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3), la activina y las proteínas morfogenéticas óseas (BMP, por sus siglas en inglés) son potentes moduladores del crecimiento celular, la diferenciación, la migración, la muerte celular programada y similares.

El TGF-p es una proteína de aproximadamente 24 Kd producida por muchas células incluyendo linfocitos B, linfocitos T y macrófagos activados y por muchos otros tipos de células. Los efectos del TGF-p sobre el sistema inmunitario incluyen la inducción del receptor de IL-2, la inhibición del crecimiento de timocitos inducido por IL-1 y el bloqueo de la activación de macrófagos inducida por IFN-y. Se considera que el TGF-p está implicado en diversas afecciones patológicas (Border et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:1) y se ha demostrado minuciosamente que funciona como sustancia supresora de tumores o como promotor tumoral.

La señalización de TGF-p está mediada por dos receptores de superficie celular de serina/treonina cinasa TGF-pRII y ALK5. La señalización de TGF-p se inicia mediante la dimerización del receptor inducida por ligando que permite al TGF-pRII fosforilar un receptor ALK5. La fosforilación activa la actividad de la cinasa ALK5 y, a continuación, la ALK5 activada fosforila una proteína Simad efectora cadena abajo (homólogo de vertebrados de la proteína MAD o "Madres contra DPP (decapentapléjico)"), Smad2 o Simad 3. Un complejo de p-Smad2/3 con Smad4 entra un núcleo y activa la transcripción de un gen diana.

Smad3 es un miembro del subgrupo R-Smad (Smad activado por receptor) de Smad y un mediador directo de la activación de la transcripción por un receptor de TGF-p. Una estimulación de TGF-p da como resultado la fosforilación y la activación de Smad2 y Smad3, que forman un complejo con Smad4 ("Smad común" o "co-Smad" en los vertebrados). Esto se acumula con el núcleo y modula la transcripción de un gen diana. R-Smad se localiza en un citoplasma y forma un complejo con co-Smad en la fosforilación inducida por ligando por un receptor de TGF-p, migra al núcleo, en el que modula la expresión génica asociada con un factor de transcripción cooperativo y la cromatina. Smad6 y Smad7 son Smad inhibidores ("I-Smad"), es decir, se inducen transcripcionalmente por TGF-p y funcionan como un inhibidor de señalización de TGF-p (Feng et al. (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 659). Smad6/7 obstruye la activación mediada por receptor de R-Smad para ejercer un efecto inhibidor del mismo; y están asociados con un receptor de tipo I, que obstruye competitivamente la movilización y la fosforilación de R-Smad. Se sabe que Smad6 y Smad7 reponen la ubiquitina ligasa E3, que induce la ubiquitinación y la degradación de las proteínas que interactúan con Smad6/7.

Las rutas de señalización de TGF-p también tienen otras rutas que usan la transmisión por BMP-7 o similares, que pasan por ALK-1/2/3/6 para expresar una función a través de Smad1/5/8. Para las rutas de señalización de TGF-p, véanse J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91; Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2 (1): e3; Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J. 18, 816-827 (2004); Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010) 11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166 y similares.

Como se usa en el presente documento, "afección, trastorno o enfermedad endotelial corneal debido al factor de crecimiento transformante p (TGF-p)" se refiere a cualquier afección, trastorno o enfermedad endotelial corneal inducida por TGF-p en células endoteliales corneales. La exposición de células endoteliales corneales tales como células modelo de la distrofia corneal endotelial de Fuchs (por ejemplo, iFECD) al TGF-p2 dio como resultado sorprendentemente diversos trastornos (por ejemplo, muerte celular programada). Este es un fenómeno que no se ha entendido bien convencionalmente. Los inventores, después de un análisis adicional de la afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p, descubrieron inesperadamente que este trastorno se puede suprimir con un inhibidor de caspasa. Una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p se asocia con una ruta de señalización diferente de las caspasas, y el inhibidor de caspasa que se usó no suprimió la ruta de señalización de TGF-p. Por lo tanto, se pudo descubrir una ruta de manifestación de la enfermedad/trastorno y una forma de terapia y profilaxis de la misma, que antes no estaban resueltas. Los ejemplos de afecciones, trastornos o enfermedades del endotelio corneal debidas a una señal de TGF-p incluyen, pero sin limitación, distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, trastorno poscirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED), trastorno idiopático del endotelio corneal y similares en los que se observa expresión de TGF-p.

Como se usa en el presente documento, "afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una anomalía mitocondrial" se refiere a una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debido a una anomalía mitocondrial. Los ejemplos de afecciones, trastornos o enfermedades del endotelio corneal debidas a una anomalía mitocondrial incluyen, pero sin limitación, cualquier distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, trastorno poscirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED) y trastorno idiopático del endotelio corneal en el que se observa una anomalía mitocondrial.

Como se usa en el presente documento, "sobreexpresión de la matriz extracelular en células endoteliales corneales" se refiere a la expresión de la matriz extracelular a un nivel anormal en comparación con los niveles de expresión de la matriz extracelular en células endoteliales corneales normales. "Expresión de la matriz extracelular a un nivel anormal" se refiere a la producción de proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina en una cantidad mayor que la cantidad producida en la matriz extracelular de forma normal. El estado de producción incluye una estimulación nula, así como una mayor cantidad de expresión debido a una respuesta al factor de crecimiento transformante (TGF) p, según sea necesario. Por ejemplo, esta puede ser de aproximadamente 1,1 veces o más, aproximadamente 1,2 veces o más, aproximadamente 1,3 veces o más, aproximadamente 1,4 veces o más, aproximadamente 1,5 veces o más, aproximadamente 1,6 veces o más, aproximadamente 1,7 veces o más, aproximadamente 1,8 veces o más, aproximadamente 1,9 veces o más, o aproximadamente 2,0 veces o más con respecto a la cantidad de matriz extracelular en circunstancias normales para las células endoteliales corneales humanas. La diferencia relativa a lo normal es preferentemente, pero no necesariamente, estadísticamente significativa. Es suficiente que la diferencia sea una diferencia médicamente significativa.

Como se usa en el presente documento, "trastorno del endotelio corneal debido a la sobreproducción de la matriz extracelular (MEC)" o una "afección" del mismo es principalmente un trastorno asociado con engrosamiento, deposición, enturbiamiento debido a la matriz extracelular o similares, o una afección del mismo, que da como resultado guttata en la superficie del endotelio corneal, engrosamiento de la membrana de Descemet, tal como guttas turbias de la membrana de Descemet, o similares, y se asocia a una afección que causa visión reducida. En los trastornos del endotelio corneal, tal como la distrofia corneal de Fuchs, la sobreproducción de la matriz extracelular empeora la visión o el sentido visual incluso sin una reducción en el recuento celular, a diferencia de la exacerbación en una afección debida a la muerte (especialmente la apoptosis) de las células endoteliales corneales. Por lo tanto, incluso si se puede suprimir la muerte celular, esto debe abordarse. Se encontró que un inhibidor de caspasa puede suprimir la causa de los trastornos del endotelio corneal debido a la "nebulosidad" o la "deposición". Esto respalda la capacidad de un inhibidor de caspasa para mejorar, tratar o prevenir un "trastorno del endotelio corneal debido a la sobreproducción de la matriz extracelular (MEC)" y una afección asociada al mismo. "Trastorno del endotelio corneal debido a la sobreproducción de la matriz extracelular (ECM)" y "afección" del mismo incluyen, pero sin limitación, nebulosidad, cicatrices, nebulosa corneal, mácula corneal, leucoma y similares.

Las afecciones, trastornos o enfermedades a los que se dirige la presente invención pueden ser trastornos relacionados con la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Está demostrado que la inducción de TGF-p en células endoteliales corneales está involucrada en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. También se demuestra que la inducción de TGF-p puede estar involucrada en la pérdida de células en FECD. Por lo tanto, se espera naturalmente que la inhibición de una ruta de señalización de TGF-p sea una terapia eficaz para las FECD. Sin embargo, los inventores encontraron inesperadamente que un inhibidor de caspasa puede suprimir un trastorno debido a una señal de TGF-p.

Dado que el medicamento puede tratar el daño celular o similar inducido por TGF-p2, que puede ser una de las causas importantes de anomalías o trastornos en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, se entiende que el medicamento es útil para tratar o prevenir la distrofia corneal endotelial de Fuchs. En particular, el medicamento fue capaz de suprimir el daño celular o la muerte celular programada inducida por TGF-p2 en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs en los Ejemplos, de modo que el medicamento puede considerarse útil en la terapia de pacientes con una enfermedad asociada a TGF-p2 grave en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs. Inesperadamente, el medicamento también puede suprimir la sobreexpresión de la matriz extracelular (ECM), de modo que el medicamento puede tratar o prevenir un trastorno o similares en el endotelio corneal, tal como la deposición de ECM en la membrana de Descemet. Por lo tanto, el medicamento puede tratar o prevenir el daño a las células endoteliales corneales en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, densidad endotelial corneal reducida, formación de guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, engrosamiento de la córnea, trastorno del epitelio corneal, nebulosidad, cicatrices, nebulosidad en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, malestar ocular, disminución del contraste, halo, deslumbramiento, edema del estroma corneal y similares.

El medicamento también puede suprimir anomalías mitocondriales tales como una disminución del potencial de la membrana mitocondrial, una anomalía morfológica de las mitocondrias, una disminución de la biosíntesis mitocondrial y similares.

(Técnicas generales)

La metodología biológica molecular, la metodología bioquímica y la metodología microbiológica que se usan en el presente documento se conocen bien y se usan convencionalmente en la técnica, que se describen, por ejemplo, en Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor y 3a Ed. del mismo (2001); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F. M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al. (1995). p Cr Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley y actualizaciones anuales; Sninsky, J.J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M.J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman y Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, Bessatsu Jikken Igaku [Experimental Medicine, Volumen complementario], Idenshi Donyu y Hatsugen Kaiseki Jikken Ho [Experimental Methods for Transgenesis & Expression Analysis], Yodosha, 1997, o similares. Los informes de Nancy Joyce et al {Joyce, 2004 N.° 161} y {Joyce, 2003 N.° 7} se conocen bien por las células endoteliales corneales. Sin embargo, como se ha analizado anteriormente, el cultivo o subcultivo a largo plazo da como resultado una transformación de tipo fibroblasto, y actualmente se están realizando investigaciones para un método de cultivo eficaz.

En un aspecto, la presente invención proporciona un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal del factor de crecimiento transformante p (TGF-p) en las células endoteliales corneales, que comprende un inhibidor de caspasa.

Si bien se entiende que una caspasa está involucrada en una diversidad de señalización, así como en la inflamación, no todos los mecanismos de la misma se aclaran en el endotelio corneal, por lo que fue inesperado que una caspasa fuera eficaz para curar o prevenir un trastorno del endotelio corneal debido a una señal de TGF-p, trastorno mitocondrial o ambos.

La afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida al factor de crecimiento transformante p (TGF-p) en las células endoteliales corneales se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, trastorno poscirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED) y trastorno idiopático del endotelio corneal.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección debida a la sobreproducción de la matriz extracelular en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Los ejemplos de tal afección incluyen guttata en una superficie del endotelio corneal, guttas turbias de la membrana de Descemet, engrosamiento de la membrana de Descemet, visión borrosa, halo, deslumbramiento, visión reducida, nebulosidad corneal, leucoma y anomalía en el sentido visual. Las afecciones debidas a la sobreproducción de la matriz extracelular se analizan con más detalle a continuación.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, que comprende un inhibidor de caspasa. Como se ha analizado anteriormente, un inhibidor de caspasa puede tratar o prevenir un trastorno del endotelio corneal o similares debido a una señal de TGF-p o una anomalía mitocondrial, pero fue sorprendente que un inhibidor de caspasa también pudiera suprimir la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales. Esto sugiere que un inhibidor de caspasa puede tratar simultáneamente trastornos del endotelio corneal debido a una señal de TGF-p, anomalía mitocondrial y sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales. En particular, la distrofia corneal endotelial de Fuchs es una enfermedad en la que la densidad de las células endoteliales corneales disminuye significativamente debido a una señal de TGF-p y una anomalía mitocondrial, y la matriz extracelular se deposita en la membrana de Descemet, lo que da como resultado guttas corneales y el engrosamiento de la membrana de Descemet. Por esta razón, la supresión de la sobreexpresión de la matriz extracelular significa que la terapia y la profilaxis de la distrofia corneal endotelial de Fuchs se puede mejorar significativamente y es capaz de curar por completo en algunos casos. También es posible mejorar, tratar o prevenir las guttas corneales y el engrosamiento de la membrana de Descemet, así como otras afecciones asociadas a nebulosidad o deposición (nebulosidad irreversible en el estroma corneal debido a edema corneal prolongado o similares) que pueden producirse debido a sobreproducción de la matriz extracelular en trastornos del endotelio corneal tales como la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

En una realización, una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales puede deberse a la sobreexpresión de fibronectina en las células endoteliales corneales.

La afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, formación de guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, engrosamiento de la córnea, nebulosidad, cicatrices, nebulosidad en el estroma corneal, edema del epitelio corneal, trastorno del epitelio corneal, fotofobia y visión borrosa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, que comprende un inhibidor de caspasa. Un inhibidor de caspasa puede tratar o prevenir simultáneamente trastornos del endotelio corneal debidos a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales. La afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, pueden deberse adicionalmente a una anomalía mitocondrial.

La afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, otra distrofia corneal endotelial y un trastorno del endotelio corneal debido a un fármaco, cirugía, traumatismo o infección.

En una realización, una afección, trastorno o enfermedad endotelial corneal debida a una señal de TGF-p, una anomalía mitocondrial y la sobreexpresión de la matriz extracelular en células endoteliales corneales comprende distrofia corneal endotelial de Fuchs. La distrofia corneal endotelial de Fuchs es una enfermedad en la que la densidad de las células endoteliales corneales disminuye significativamente debido a una señal de TGF-p y una anomalía mitocondrial, y la matriz extracelular se deposita en la membrana de Descemet, lo que da como resultado un trastorno tal como guttas corneales y engrasamiento de la membrana de Descemet. Por esta razón, la supresión de la sobreexpresión de la matriz extracelular significa que la terapia puede mejorar significativamente la distrofia corneal endotelial de Fuchs y la curación completa en algunos casos.

Los medicamentos pueden ser, pero sin limitación, colirios. Los métodos de administración para los medicamentos incluyen, pero sin limitación, métodos tales como inyección en la cámara anterior, impregnación en un agente de liberación controlada, inyección subconjuntival y administración sistémica (administración oral e inyección intravenosa).

El inhibidor de caspasa puede ser cualquier tipo de inhibidor de caspasa, siempre que sea eficaz para tratar o prevenir una determinada afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p o mitocondrias, pero preferentemente es un inhibidor que inhibe la caspasa 3, y más preferentemente un inhibidor de pan-caspasa. Los inhibidores de caspasa específicos incluyen al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Z-VAD-FMK, Z-VD-FMK, Emricasán, Nivocasán, Z-YVAD-FMK, Z-VDVAD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-LEVD-FMK, Z-WEHD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK, Z-AEVD-FMK y Z-LEED-FMK.

Los inhibidores de caspasa anteriores se pueden usar solos o en combinación en el medicamento de la presente invención. La concentración de un inhibidor de caspasa usado en la presente invención es generalmente de aproximadamente 0,1 a 300 pM (pmol/l), preferentemente de aproximadamente 1 a 150 pM, y más preferentemente de aproximadamente 3 a 30 pM. Cuando se usan dos o más tipos de inhibidores de caspasa en combinación, la concentración se puede cambiar de manera apropiada. Los ejemplos de otros intervalos de concentración incluyen, pero sin limitación, generalmente de aproximadamente 0,001 a 300 pM, de aproximadamente 0,01 a 150 pM, de aproximadamente 0,001 a 100 pM, de aproximadamente 0,01 a 75 pM, de aproximadamente 0,05 a 50 pM, de aproximadamente 1 a 10 pM, de aproximadamente 0,01 a 10 pM, de aproximadamente 0,05 a 10 pM, de aproximadamente 0,075 a 10 pM, de aproximadamente 0,1 a 10 pM, de aproximadamente 0,5 a 10 pM, de aproximadamente 0,75 a 10 pM, de aproximadamente 1,0 a 10 pM, de aproximadamente 1,25 a 10 pM, de aproximadamente 1,5 a 10 pM, de aproximadamente 1,75 a 10 pM, de aproximadamente 2,0 a 10 pM, de aproximadamente 2,5 a 10 pM, de aproximadamente 3,0 a 10 pM, de aproximadamente 4,0 a 10 pM, de aproximadamente 5,0 a 10 pM, de aproximadamente 6,0 a 10 pM, de aproximadamente 7,0 a 10 pM, de aproximadamente 8,0 a 10 pM, de aproximadamente 9,0 a 10 pM, de aproximadamente 0,01 a 50 pM, de aproximadamente 0,05 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,25 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,5 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,75 a 5,0 pM, de aproximadamente 2,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 2,5 a 5,0 pM, de aproximadamente 3,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 4,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,01 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,05 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,0 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,25 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,5 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,75 a 3,0 pM, de aproximadamente 2,0 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,01 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,05 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,09 a 35 pM, de aproximadamente 0,09 a 3,2 pM, de aproximadamente 0,05 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 1,0 pM o de aproximadamente 0,75 a 1,0 pM.

En una realización preferida, un inhibidor de caspasa se selecciona del grupo que consiste en, por ejemplo, N-(benciloxicarbonil)-L-valil-DL-aspartil-fluorometilcetona (Z-VD-FMK), {benciloxicarbonil-L-valil-L-alanil-[(2s)-2-amino-3-(metoxicarbonil)propionil]}fluorometano (Z-VAD-FMK), ácido 3-[2-[(2-terc-butil-fenilaminooxalil)-amino]-propionilamino]-4-oxo-5-(2,3,5,6-tetrafluoro-fenoxi)-pentanoico (emricasán), (R)-N-((2S,3S)-2-(fluorometil)-2-hidroxi-5-oxotetrahidrofuran-3-il)-5-isopropil-1-3-(isoquinolin-1-il)-4,5-dihidroisoxazol-5-carboxamida (nivocasán), y sales de los mismos.

La concentración de Z-VD-FMK usada es generalmente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 150 pM, preferentemente de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 100 pM, y más preferentemente de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 pM.

La concentración de Z-VAD-FMK usada es generalmente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, preferentemente de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 30 pM, y más preferentemente aproximadamente 10 pM.

La concentración de emricasán usada es generalmente de aproximadamente 0,3 pM a aproximadamente 150 pM, preferentemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, y más preferentemente aproximadamente 10 pM.

La concentración de nivocasán usada es generalmente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 300 pM, preferentemente de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 300 pM, y más preferentemente aproximadamente 100 ^|JM.

Preferentemente, se usa emricasán. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, esto se debe a que se encontró que el tratamiento con emricasán exhibió un resultado terapéutico significativamente mejor en comparación con otros inhibidores de caspasa, y los resultados de curación, especialmente de una enfermedad o trastorno del endotelio corneal asociado con el factor de crecimiento transformante p2 (TGF-p2), tal como la distrofia endotelial de Fuchs, o una enfermedad o trastorno del endotelio corneal asociado con una anomalía mitocondrial, mejoran significativamente.

Un medicamento terapéutico o profiláctico de la presente invención puede dirigirse a cualquier animal con un endotelio corneal, tal como mamíferos. Un medicamento de este tipo está destinado preferentemente a tratar o prevenir en el endotelio corneal de un primate. El objeto de la terapia o profilaxis es preferentemente un endotelio corneal humano.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" se refiere a una diana de administración (trasplante) de un medicamento terapéutico o profiláctico. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos (por ejemplo, un ser humano, ratón, rata, hámster, conejo, gato, perro, vaca, caballo, oveja, mono y similares), pero se prefieren primates y son especialmente preferibles seres humanos.

La dosis eficaz del medicamento, que es eficaz en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección específicos, puede variar dependiendo de las propiedades de un trastorno o afección, pero los expertos en la técnica pueden determinar la dosis eficaz con técnicas clínicas estándar basadas en las descripciones de la presente memoria descriptiva. También es posible usar un ensayo in vitro para ayudar a identificar el intervalo óptimo de dosificación según sea necesario. Dado que una dosis exacta a usar en una formulación puede variar dependiendo de la vía de administración y la gravedad de una enfermedad o trastorno, la dosis debería determinarse de acuerdo con el criterio de un médico y el estado de cada paciente. Sin embargo, la dosificación, aunque no se limita particularmente, puede ser, por ejemplo, de 0,001, 1, 5, 10, 15, 100 o 1000 mg/kg de peso corporal o un valor entre dos cualesquiera de dichos valores por dosis. El intervalo de administración, aunque no se limita particularmente, puede ser, por ejemplo, una o dos dosis cada 1, 7, 14, 21 o 28 días, o una o dos dosis durante varios días entre dos cualesquiera de dichos valores. La dosificación, el número de dosis, el intervalo de administración y el método de administración se pueden seleccionar de forma apropiada dependiendo de la edad o el peso corporal del paciente, la afección, la forma farmacéutica, el órgano objetivo o similares. Por ejemplo, el medicamento se puede usar como colirio. El medicamento también se puede inyectar en la cámara anterior. Un fármaco terapéutico comprende preferentemente una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz de principios activos a los que se ejerce una acción deseada. Se puede determinar que existe un efecto terapéutico cuando un marcador terapéutico disminuye significativamente después de la administración. La dosis eficaz se puede estimar a partir de una curva de respuesta a la dosis obtenida de un sistema de prueba en modelo animal o in vitro.

<Composición para conservación>

A título informativo, se describe una composición para la conservación, tal como la criopreservación, de células endoteliales corneales, que comprende un inhibidor de caspasa. El inhibidor de caspasa adecuado como composición para conservación puede ser adecuado como medicamento.

Como se usa en el presente documento, una "composición para conservación" es una composición para conservar un fragmento de córnea extraído de un donante hasta que el fragmento se trasplante a un receptor, o para conservar las células endoteliales corneales antes de crecer o después de crecer.

La composición para conservación se puede preparar añadiendo un inhibidor de caspasa a un conservante o solución de conservación usados convencionalmente. Los ejemplos de una solución de conservación de córnea de este tipo incluyen soluciones de preservación que se usan comúnmente para el trasplante de córnea (solución de conservación de fragmentos de esclerocórnea (Optisol GS®) o solución de conservación del globo ocular para trasplante de córnea (EPII®)), solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y similares.

La composición para conservación se usa para conservar una córnea que se usa en trasplantes de órganos o similares. La composición para conservación también se usa como una solución de conservación para criopreservar las células endoteliales corneales o como un componente de la misma.

En la composición para conservación usada para la criopreservación, se puede usar una solución de criopreservación existente añadiendo una composición para conservación que comprenda un inhibidor de caspasa. Los ejemplos de una solución de criopreservación incluyen, pero sin limitación, la serie CELLBANKER® proporcionada por Takara Bio (CELL BANKER PLUS (número de catálogo: CB021), CELL BANKER 2 (número de catálogo: CB031), STEM-CELLBANKER (número de catálogo: CB043) y similares), KM BANKER (Kohjin Bio, número de catálogo: KOJ-16092005) y medio de congelación, libre de componentes animales, CRYO Defined (también denominado Cnt-CRYO) (CELLNTEC, número de catálogo: CnT-CRYO-50). La solución de criopreservación usada puede ser KM BANKER. Se entiende que los expertos en la técnica pueden usar una solución de criopreservación modificada adecuada cambiando apropiadamente un componente constituyente de la solución de criopreservación anterior o añadiendo un componente constituyente adicional. Por ejemplo, se pueden añadir adicionalmente a la solución de conservación glicerol, dimetilsulfóxido, propilenglicol, acetamida o similares.

<Composición promotora del crecimiento>

A título informativo, se describe una composición para promover el crecimiento de células endoteliales corneales. El inhibidor de caspasa adecuado como composición para promover el crecimiento de células endoteliales corneales puede ser adecuado como medicamento.

Puede prepararse una composición promotora del crecimiento añadiendo un inhibidor de caspasa a un medio usado convencionalmente. El componente de cultivo puede ser cualquier componente que pueda usarse en el cultivo del endotelio corneal. Este puede ser un componente de medio que se vende y se usa convencionalmente, o un componente desarrollado por separado para el endotelio corneal. Los ejemplos de dichos componentes de medio incluyen, pero sin limitación, OptiMEM, DMEM, M199, MEM y similares (que están disponibles en THERMO-FISCHER=INVITROGEN).

Como se explica en los Ejemplos, se encontró que el cultivo de células endoteliales corneales se promueve cuando las células se cultivan con una solución de criopreservación complementada con la composición promotora del crecimiento que comprende un inhibidor de caspasa como componente de medio. Por lo tanto, se puede usar una solución de criopreservación como componente de medio usado en la composición para promover el crecimiento de células endoteliales corneales. Los ejemplos de soluciones de criopreservación incluyen, pero sin limitación, la serie CELLBANKER® proporcionada por Takara Bio (CELL BANKER PLUS (número de catálogo: CB021), CELL BANKER 2 (número de catálogo: CB031), STEM-CELLBANKER (número de catálogo: CB043) y similares), KM BANKER (Kohjin Bio, número de catálogo: KOJ-16092005) y medio de congelación, libre de componentes animales, CRYO Defined (Cnt-CRYO) (CELLNTEC, número de catálogo: CnT-CRYO-50). La solución de criopreservación usada es preferentemente, pero sin limitación, KM BANKER.

La composición para promover el crecimiento de células endoteliales corneales puede comprender además un inhibidor de MAP cinasa p38. Un "inhibidor de MAP cinasa p38 (también denominado "inhibidor de MAPK p38") se refiere a cualquier agente que inhiba la señalización de una m A p cinasa asociada con p38. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitación, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol (SB-203580), 1-(carbamoil-6-(2,4-difluorofenil)piridin-2-il)-1-(2,6-difluorofenil)urea (VX-702) y 3-[3-bromo-4-[(2,4-difluorofenil)metoxi]-6-metil-2-oxopiridin-1-il]-N,4-dimetilbenzamida (PH797804). Los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la concentración de un inhibidor de MAP cinasa p38 contenido, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a 100 pM (pmol/l), preferentemente de aproximadamente 0,1 a 30 pM, y más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 pM. Los ejemplos de otros intervalos de concentración incluyen, pero sin limitación, generalmente de aproximadamente 0,001 a 100 pM, preferentemente, de aproximadamente 0,01 a 75 pM, de aproximadamente 0,05 a 50 pM, de aproximadamente 1 a 10 pM, de aproximadamente 0,01 a 10 pM de aproximadamente 0,05 a 10 pM, de aproximadamente 0,075 a 10 pM, de aproximadamente 0,1 a 10 pM , de aproximadamente 0,5 a 10 pM, de aproximadamente 0,75 a 10 pM, de aproximadamente 1,0 a 10 pM, de aproximadamente 1,25 a 10 pM, de aproximadamente 1.5 a 10 pM, de aproximadamente 1,75 a 10 pM de aproximadamente 2,0 a 10 pM, de aproximadamente 2.5 a 10 pM, de aproximadamente 3,0 a 10 pM, de aproximadamente 4,0 a 10 pM, de aproximadamente 5.0 a 10 pM, de aproximadamente 6,0 a 10 pM, de aproximadamente 7,0 a 10 pM, de aproximadamente 8.0 a 10 pM, de aproximadamente 9,0 a 10 pM, de aproximadamente 0,01 a 50 pM, de aproximadamente 0,05 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 5,0 pM de aproximadamente 0,1 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,25 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,5 a 5,0 pM, de aproximadamente 1,75 a 5,0 pM, de aproximadamente 2.0 a 5,0 pM, de aproximadamente 2,5 a 5,0 pM de aproximadamente 3,0 a 5,0 pM, de aproximadamente 4.0 a 5,0 pM, de aproximadamente 0,01 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,05 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,0 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,25 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,5 a 3,0 pM, de aproximadamente 1,75 a 3,0 pM, de aproximadamente 2,0 a 3,0 pM, de aproximadamente 0,01 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,05 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,75 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,09 a 35 pM, de aproximadamente 0,09 a 3,2 pM, y más preferentemente, de aproximadamente 0,05 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,075 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,1 a 1,0 pM, de aproximadamente 0,5 a 1,0 pM y de aproximadamente 0,75 a 1,0 pM

La composición promotora del crecimiento se puede usar en el cultivo de células endoteliales corneales. Las células endoteliales corneales se cultivan típicamente de la siguiente manera.

<1> Recogida de células endoteliales corneales y cultivo de las mismas en tubo de ensayo

Las células endoteliales corneales se recogen mediante un método convencional de una córnea de los propios receptores o de un donante adecuado. Si se considera la condición de trasplante, es suficiente con preparar células endoteliales corneales alógenas. Por ejemplo, la membrana de Descemet y la capa de células endoteliales de tejido corneal se separan del estroma corneal y a continuación se transfieren a una placa de cultivo y se tratan con dispasa o similares. De este modo, las células endoteliales corneales se desprenden de la membrana de Descemet. Las células endoteliales corneales que quedan en la membrana de Descemet pueden separarse mediante pipeteo o similares. Después de retirar la membrana de Descemet, las células endoteliales corneales se cultivan en la solución de cultivo. Los ejemplos de medios y soluciones de cultivo que se pueden usar incluyen DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) disponible comercialmente (por ejemplo, Th Er MO-FISCHER=INVITROGEN, número de catálogo: 12320 o similares) al que se añaden apropiadamente FBS (suero fetal bovino) (por ejemplo, BIOWEST, número de catálogo: S1820-500), b-FGF (factor básico de crecimiento de fibroblastos) (por ejemplo, THERMO-FISCHER=INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029), y un antibiótico tal como penicilina o estreptomicina y se añaden componentes de la composición promotora del crecimiento. Es preferible usar un recipiente de cultivo (placa de cultivo) con colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina, matriz extracelular de células endoteliales corneales bovinas o similares que se recubre en la superficie. Como alternativa, se puede usar un recipiente de cultivo común tratado con un agente de recubrimiento disponible comercialmente, tal como FNC coatings mix® (50 ml (AES-0407), ATHENA, número de catálogo: 0407).

La condición de temperatura para cultivar células endoteliales corneales no está particularmente limitada siempre que las células endoteliales corneales crezcan. Por ejemplo, la temperatura es de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C, y para un crecimiento eficaz, la temperatura es preferentemente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, y más preferentemente aproximadamente 37 °C. Se realiza un método de cultivo en condiciones húmedas en un ambiente con una concentración de CO2 de aproximadamente el 5 al 10 % en una incubadora común para cultivo celular.

<2> Pase

Las células endoteliales corneales sometidas a cultivo se pueden transferir después del crecimiento. Preferentemente, las células endoteliales corneales se transfieren a subconfluencia o confluencia. Las células se pueden transferir de la siguiente manera. En primer lugar, las células se separan de la superficie del recipiente de cultivo tratando las células con tripsina-EDTA o similares y, a continuación, se recogen las células. Se añade un medio o solución de cultivo que comprende la composición promotora del crecimiento a las células recogidas para preparar una suspensión celular. Las células se centrifugan preferentemente cuando o después de recoger las células. Puede prepararse una suspensión celular con alta densidad celular mediante tal centrifugación. Una densidad celular preferida es de aproximadamente 1 a 2 x 106 células/ml. Las condiciones de centrifugación a este respecto son, por ejemplo, de 500 rpm (30 g) a 1000 rpm (70 g) y de 1 a 10 minutos.

La suspensión celular se siembra en un recipiente de cultivo de la misma manera que el cultivo primario anterior y se somete a cultivo. El factor de dilución en el momento del pase varía dependiendo del estado de las células, pero es aproximadamente de 1:2 a 1:4, y preferentemente de aproximadamente 1:3. Las células se pueden transferir en las mismas condiciones de cultivo que el cultivo primario anterior. El tiempo de cultivo varía dependiendo del estado de las células usadas o similares, pero es, por ejemplo, de 7 a 30 días. Dicho pase se puede realizar varias veces según sea necesario. Se puede promover el crecimiento para acortar el período de cultivo usando la composición promotora del crecimiento en un medio o solución de cultivo que comprende la composición promotora del crecimiento.

La presente invención se ha explicado mostrando realizaciones preferidas para facilitar la comprensión. La presente invención se explica en lo sucesivo en el presente documento basándose en los Ejemplos. La explicación anterior y los siguientes Ejemplos no se proporcionan para limitar la presente invención, sino con el único propósito de ilustración. Por lo tanto, el alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones y Ejemplos que se desvelan específicamente en el presente documento y está limitado únicamente por el alcance de las reivindicaciones.

[Ejemplos]

En los siguientes ejemplos, las muestras biológicas o similares, cuando sea aplicable, se manipularon de conformidad con las normas dictadas por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, o similares y, cuando sea aplicable, basándose en la Declaración de Helsinki o códigos éticos elaborados en base a la misma. Para la donación de ojos usados para el estudio, se obtuvo el consentimiento de los familiares cercanos de todos los donantes fallecidos. El presente estudio fue aprobado por el comité de ética o un organismo correspondiente del banco de ojos de la Universidad de Erlangen-Nuremberg (Alemania) y SightLife™ (Seattle, WA).

(Ejemplo de preparación: Producción del modelo de línea celular endotelial corneal inmovilizada obtenida de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD))

En este ejemplo, se preparó una línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) a partir de células endoteliales corneales de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Método de cultivo)

Las células endoteliales corneales se despegaron mecánicamente con una membrana basal de una córnea para investigación adquirida en el Seattle Eye Bank. Después de usar colagenasa para separar y recoger la célula endotelial corneal de la membrana basal, las células se sometieron a cultivo primario. Para un medio, se usó medio reducido en suero Opti-MEM I, líquido (INVITROGEN número de catálogo: 31985-070), al que se le añadieron FBS al 8 % (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500), 200 mg/ml de CaCh2H2O (SIGMA número de catálogo: C7902-500G), 0,08 % de sulfato de condroitina (SIGMA número de catálogo: C9819-5G), 20 pg/ml de ácido ascórbico (SIGm A número de catálogo: A4544-25G), 50 pg/ml de gentamicina (INVITROGEN número de catálogo: 15710-064) y 5 ng/ml de EGF (INVITROGEN número de catálogo: PHG0311), y se acondicionó para que se usara una célula alimentadora 3T3 como medio basal. Además, las células se cultivaron en un medio basal al que se le añadieron SB431542 (1 pmol/l) y SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonilfenil)-5(4-piridil) imidazol<4-[4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina) (1 pmol/l) (también denominado "medio acondicionado con SB203580+SB431542+3T3" en el presente documento).

(Método de adquisición)

Se obtuvieron células endoteliales corneales con la aprobación de un comité de ética y el consentimiento por escrito de 3 pacientes humanos que padecían queratopatía bullosa de acuerdo con un diagnóstico clínico de distrofia corneal endotelial de Fuchs y se sometieron a un trasplante de endotelio corneal (queratoplastia endotelial de membrana de Descemet = DMEK). Para la DMEK, las células endoteliales corneales patológicas se despegaron mecánicamente con la membrana basal, es decir, la membrana de Descemet, y se sumergieron en una solución de conservación de la córnea Optisol-GS (Bausch y Lomb). A continuación, se aplicó tratamiento con colagenasa para recoger enzimáticamente las células endoteliales corneales, y las células se cultivaron con un medio acondicionado con SB203580+SB431542+3T3. Para las células endoteliales corneales cultivadas de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs, el antígeno T grande de SV40 y el gen hTERT se amplificaron mediante PCR y se introdujeron en un vector lentiviral (pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc). A continuación, el vector lentiviral se usó para infectar células 293T (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japón) con un reactivo de transfección (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) y tres tipos de plásmidos auxiliares (pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.). El sobrenadante de cultivo que comprendía virus se recogió después de 48 horas desde la infección. Se usaron 5 pg/ml de polibreno y se añadieron a una solución de cultivo de células endoteliales corneales cultivadas de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs, y se introdujeron el antígeno T grande de SV40 y el gen hTERT. Se estudiaron imágenes de la línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs obtenidas con un microscopio de diferencia de fase. Se inmovilizaron células endoteliales corneales cultivadas de una córnea de investigación importada del Seattle Eye Bank mediante el mismo método para producir una línea celular inmovilizada de células endoteliales corneales normales (iHCEC) como control. Cuando se estudian imágenes de la línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) y la línea celular endotelial corneal inmovilizada de un donante sano (iHCEC) de un microscopio de diferencia de fase, tanto la iHCEC como la iFECD tienen una capa de forma poligonal como en las células endoteliales corneales normales. La IHCEC y la iFECD se mantuvieron y se cultivaron con DMEM FBS al 10 %.

(Ejemplo 1: Supresión de la activación de caspasa 3 por inhibidor de caspasa después de irradiación UV)

Este Ejemplo estudió la supresión de la activación de caspasa 3 por un inhibidor de caspasa después de la irradiación UV.

(Materiales y métodos)

Se sembraron 5 x 103 células endoteliales corneales de mono cultivadas en una placa de 96 pocillos recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, 12320-032) FBS al 10 % penicilina-estreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94).

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VD-FMK (10 pM)

Z-VAD-FMK (10 pM)

Emricasán (10 pM)

A continuación, se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 18 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo de irradiación UV se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usó como medio DMEM de Gibco P/S al 1 % (penicilina-estreptomicina).

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular y las células se irradiaron con UV (300 J/m2). Después de la irradiación, se añadieron de nuevo a las células medios que contenían cada inhibidor. Las células se cultivaron durante 7 horas. A continuación, se midió la actividad de caspasa 3/7 usando el ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega, n.° G8091).

(Resultados)

(El inhibidor de la caspasa ha suprimido la actividad de caspasa 3 tras el daño celular)

El gráfico de la figura 1 muestra la relación de actividad de caspasa 3/7 cuando se añadió cada inhibidor de caspasa a la actividad de caspasa 3/7 cuando se irradió UV sin añadir caspasas. Como se muestra, cuando se añadió cada inhibidor, se mostró la misma actividad de caspasa 3/7 que el grupo de control sin adición de UV, demostrando así que un inhibidor de caspasa suprime la activación de la caspasa 3 tras el daño celular.

(Ejemplo 2: Examen del efecto del inhibidor de caspasa sobre la apoptosis de células endoteliales corneales de mono cultivadas)

Este Ejemplo examinó el efecto del inhibidor de caspasa Z-VD-FMK sobre la apoptosis de células endoteliales corneales de mono cultivadas.

(Materiales y métodos)

Se sembraron 1 x 105 células endoteliales corneales de mono cultivadas en una placa de 12 pocillos recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, 12320-032) FBS al 10 % penicilina-estreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94).

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 ^|JM)

Z-VD-FMK (3, 10, 20, 30 y 50 j M)

Emricasán (1, 3, 10, 30 y 100 j m )

Nivocasán (1, 3, 10, 30 y 100 j m )

Se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 18 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo de irradiación UV se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usó como medio DMEM de Gibco P/S al 1 % (mezcla de penicilina-estreptomicina).

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular y las células se irradiaron con UV (100 J/m2). Después de la irradiación, se añadieron de nuevo a las células medios que contenían cada inhibidor. Las células se cultivaron durante 9 horas.

Se observó la morfología celular con un microscopio de diferencia de fase. Después de la observación, se realizó una transferencia de Western en proteínas mediante el siguiente procedimiento.

1) Recogida de proteínas

El medio se recogió en hielo para recoger las células muertas y libres. También se recogió la solución de lavar las células dos veces con 1 x PBS (-). Se centrifugaron 800 g a 4 °C durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante para obtener precipitados. Las células lavadas se complementaron con un tampón de extracción de proteínas (RIPA; Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1 %, DOC al 0,5 %, NP-40 al 1 %) en hielo para extraer las proteínas. Los precipitados de la centrifugación de las células libres y muertas también se suspendieron posteriormente juntos para su extracción. La solución recogida se pulverizó tres veces durante 30 segundos en agua fría con un dispositivo de sonicación (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) y se centrifugó durante 10 min a 4 °C a 15000 rpm para recoger el sobrenadante de proteínas.

2) Transferencia de Western

Se separaron 8 jg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como anticuerpos primarios se usaron un anticuerpo anti caspasa 3 de conejo (Cell Signaling, 9662), un anticuerpo anti PARP de conejo (Cell Signaling, 9542) y un anticuerpo anti GAPDH de ratón (MBL, M171-3). Se usaron un anticuerpo anti conejo marcado con peroxidasa y un anticuerpo anti ratón (GE Healthcare Biosciences, NA934V, NA931V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, anticuerpo anti caspasa 3 de conejo y anticuerpo anti PARP de conejo: dilución de 1000 veces y anticuerpo anti GAPDH de ratón: dilución de 3000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces. Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un analizador de imágenes lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) y el software ImageQuant™ (GE Healthcare).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la activación de la caspasa 3 y la muerte celular tras el daño celular)

Los resultados se muestran en las figuras 2 a 4. Se observó que los grupos de irradiación UV tenían un daño celular significativo a partir de imágenes de microscopio de diferencia de fase. Además, se encontró caspasa 3 escindida de aproximadamente 17 kDa (forma activa) en los grupos de irradiación UV a partir de los resultados de las transferencias de Western. En los grupos complementados con irradiación UV Z-VAD-FMK, no se observó caspasa 3 escindida en forma activa de aproximadamente 17 kDA en ninguna de las regiones de concentración ensayadas, mientras que se observó caspasa 3 escindida de aproximadamente 19 kDa (forma inactiva) (figura 2). La caspasa 3 en forma activa no se observó en el grupo complementado con emricasán en todas las regiones de concentración ensayadas. Adicionalmente, apenas se observó la caspasa 3 escindida en forma inactiva de aproximadamente 19 kDa tras la adición de 1 y 3 pM y no se observó en otras concentraciones (figura 3). Esto significa que la activación de la caspasa 3 está fuertemente suprimida. El efecto de suprimir la caspasa 3 se observó a una concentración de 100 pM en el grupo de nivocasán (figura 4). A partir de estos resultados se reveló que un inhibidor de caspasa suprime la activación de la caspasa 3 tras el daño celular.

(Ejemplo 3: Efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido al peróxido de hidrógeno)

Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido al peróxido de hidrógeno.

(Materiales y métodos)

Se sembraron 1 x 105 células endoteliales corneales de mono cultivadas en una placa de 12 pocillos recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco, 12320-032) FBS al 10 % penicilina-estreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94).

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 pM)

Z-VD-FMK (10 pM)

Emricasán (10 pM)

Nivocasán (100 pM)

Se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 18 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo de peróxido de hidrógeno se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, d Ms O (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usó DMEM de Gibco P/S al 1 % como medio.

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular y las células se complementaron con un medio que contenía cada inhibidor y peróxido de hidrógeno 1000 pM durante 24 horas de cultivo. El grupo de control se complementó con un disolvente de peróxido de hidrógeno, agua esterilizada y un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). El grupo de peróxido de hidrógeno se complementó con un medio complementado con DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64) y peróxido de hidrógeno 1000 pM.

La morfología celular y la apoptosis se observaron bajo un microscopio de diferencia de fase. Después de la observación, se realizó una transferencia de Western en proteínas mediante el siguiente procedimiento.

1) Recogida de proteínas

2) Transferencia de Western

Se separaron 9,6 pg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como anticuerpos primarios se usaron un anticuerpo anti caspasa 3 de conejo (Cell Signaling, 9662), un anticuerpo anti PARP de conejo (Cell Signaling, 9542), un anticuerpo anti GAPDH de ratón (MBL, M171-3) y un anticuerpo anti CHOP de ratón (Cell Signaling, 2895). Se usaron un anticuerpo anti conejo marcado con peroxidasa y un anticuerpo anti ratón (GE Healthcare Biosciences, NA934V, NA931V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, anticuerpo anti caspasa 3 de conejo: dilución de 1000 veces, anticuerpo anti PARP de conejo: dilución de 2000 veces y anticuerpo anti GAPDH de ratón: dilución de 3000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces. Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un analizador de imágenes lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) y el software ImageQuant™ (GE Healthcare).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la activación de la caspasa 3 tras el daño celular debido al peróxido de hidrógeno)

Se sabe que el peróxido de hidrógeno daña las células debido a su potente acción de oxidación. Este Ejemplo confirmó que un inhibidor de caspasa suprime el daño celular debido al peróxido de hidrógeno. Los resultados se muestran en la figura 5. Como se muestra, la caspasa 3 escindida en forma activa se encontró en el grupo complementado solo con peróxido de hidrógeno, mientras que la caspasa 3 escindida en forma activa no se encontró en los grupos complementados con peróxido de hidrógeno inhibidor de caspasa, de modo que el daño celular se suprimió. Por lo tanto, los inhibidores de caspasa suprimen la activación de la caspasa 3 tras el daño celular debido al peróxido de hidrógeno.

(Ejemplo 4: Efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a MG132)

Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a MG132.

(Materiales y métodos)

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 ^|JM)

Z-VD-FMK (10 j M)

Emricasán (10 JM)

Nivocasán (100 j M)

A continuación, se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 6 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo MG132 se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usó DMEM de Gibco P/S al 1 % como medio.

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular. Se añadieron a las células MG132 10 j M y medios que contenían cada inhibidor. Las células se cultivaron durante 18 horas. El grupo de control se complementó con MG132 y un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64).

1) Recogida de proteínas

2) Transferencia de Western

Se separaron 10 jg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.

Como anticuerpos primarios se usaron un anticuerpo anti caspasa 3 de conejo (Cell Signaling, 9662), un anticuerpo anti PARP de conejo (Cell Signaling, 9542), un anticuerpo anti GAPDH de ratón (MBL, M171-3) y un anticuerpo anti CHOP de ratón (Cell Signaling, 2895). Se usaron un anticuerpo anti conejo marcado con peroxidasa y un anticuerpo anti ratón (GE Healthcare Biosciences, NA934V, NA931V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, anticuerpo anti caspasa 3 de conejo: dilución de 1000 veces, anticuerpo anti PARP de conejo: dilución de 2000 veces y anticuerpo anti GAPDH de ratón: dilución de 3000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces. Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un analizador de imágenes lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) y el software ImageQuant™ (GE Healthcare).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime el daño celular debido a la proteína desplegada inducida por MG132 y suprime la activación de la caspasa 3 debido al estrés del retículo endoplásmico)

MG132 es un inhibidor del proteasoma, que induce proteínas desplegadas y da como resultado estrés en el retículo endoplásmico. La acumulación de estrés del retículo endoplásmico activa la caspasa 3 y daña las células. Este Ejemplo confirmó un efecto de supresión del daño celular inducido por MG132 en los grupos complementados con inhibidor de caspasa. Los resultados se muestran en la figura 6. La activación de caspasa 3 observada en el grupo MG 132 no se observó en los grupos complementados con inhibidor de caspasa. Por lo tanto, los inhibidores de caspasa suprimen la activación de la caspasa 3 debido al estrés del retículo endoplásmico inducido por MG132. (Ejemplo 5: Examen del efecto del inhibidor de la caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a la tapsigargina (TG))

Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño a las células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a TG.

(Materiales y métodos)

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 ^|JM)

Emricasán (10 j M)

Se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 18 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo TG se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usaron DMEM de Gibco y P/S al 1 % como medio.

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular. Se añadieron a las células 10 j M de TG y medios que contenían cada inhibidor. Las células se cultivaron durante 5 horas. El grupo de control se complementó con TG y un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64).

1) Recogida de proteínas

2) Transferencia de Western

Se separaron 5,7 jg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime el daño celular debido a las proteínas desplegadas inducidas por tapsigargina (TG) y suprime la activación de la caspasa 3 debido al estrés del retículo endoplásmico)

La tapsigargina (TG) induce estrés en el retículo endoplásmico al igual que MG132. Este Ejemplo confirmó el efecto de supresión del daño celular inducido por TG en los grupos complementados con inhibidor de caspasa. Los resultados se muestran en la figura 7. Se observó caspasa escindida de aproximadamente 17 kDa (forma activa) cuando se añadió solamente TG, mientras que no se observó caspasa escindida en forma activa cuando se añadió un inhibidor de caspasa. Por lo tanto, los inhibidores de caspasa suprimen la activación de la caspasa 3 debido al estrés del retículo endoplásmico inducido por TG.

(Ejemplo 6: Efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño celular en células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a CCCP)

Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño celular en células endoteliales corneales de mono cultivadas debido a CCCP.

(Materiales y métodos)

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 ^|JM)

Z-VD-FMK (10 j M)

Emricasán (10 JM)

Se añadió cada inhibidor a la concentración anterior. Las células se incubaron durante 16 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El grupo de control y el grupo CCCP se complementaron con un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64). Se usó DMEM de Gibco P/S al 1 % como medio.

A continuación, se eliminó el sobrenadante celular. Se añadieron a las células 50 j M de CCCP y medios que contenían cada inhibidor. Las células se cultivaron durante 6 horas. El grupo de control se complementó con CCCP y un disolvente de cada reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, filtrado estéril) (nacalai tesque, 13408-64).

1) Recogida de proteínas

El medio se recogió en hielo para recoger las células muertas y libres. También se recogió la solución de lavar las células dos veces con 1 x PBS (-) y se centrifugó a 4 °C a 800 x g durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante para obtener precipitados. Las células lavadas se complementaron con un tampón de extracción de proteínas (RIPA; Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1 %, DOC al 0,5 %, NP-40 al 1 %) en hielo para extraer las proteínas. Los precipitados de la centrifugación de las células libres y muertas también se suspendieron posteriormente juntos para su extracción. La solución recogida se pulverizó tres veces durante 30 segundos en agua fría con un dispositivo de sonicación (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) y se centrifugó durante 10 min a 4 °C a 15000 rpm para recoger el sobrenadante de proteínas.

2) Transferencia de Western

Se separaron 5 |jg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como anticuerpos primarios se usaron un anticuerpo anti caspasa 3 de conejo (Cell Signaling, 9662), un anticuerpo anti PARP de conejo (Cell Signaling, 9542) y un anticuerpo anti GAPDH de ratón (MBL, M171-3). Se usaron un anticuerpo anti conejo marcado con peroxidasa y un anticuerpo anti ratón (GE Healthcare Biosciences, NA934V, NA931V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, anticuerpo anti caspasa 3 de conejo a una dilución de 1000 veces, anticuerpo anti PARP de conejo a una dilución de 2000 veces y anticuerpo anti GAPDH de ratón a una dilución de 3000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces. Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un analizador de imágenes lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) y el software ImageQuant™ (GE Healthcare).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la muerte celular programada dependiente de las mitocondrias debido a la disminución del potencial de la membrana mitocondrial inducido por CCCP)

Cuando se añade un agente de desacoplamiento CCCP, el potencial de la membrana mitocondrial disminuye debido al desacoplamiento para inducir un trastorno mitocondrial. Un trastorno mitocondrial induce la muerte celular programada, es decir, activa las caspasas. Por esta razón, cuando se añadió CCCP, se observó la caspasa 3 escindida de aproximadamente 17 kDa, así como la activación de la caspasa 3 (figura 8). Sin embargo, cuando se añadió un inhibidor de caspasa, se suprimió la activación de la caspasa 3. A partir de estos resultados se reveló que se puede suprimir el daño celular debido a un trastorno mitocondrial.

(Ejemplo 7: Observación de la fluorescencia de la Anexina V en células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV)

Este ejemplo observó la fluorescencia de la Anexina V en células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV.

(Materiales y métodos)

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VAD-FMK (10 jM )

Z-VD-FMK (10 jM )

Emricasán (10 jM)

Nivocasán (100 jM )

Este ejemplo usó globos oculares de conejo después de 0 a 24 horas desde la eutanasia. Bajo un microscopio estereoscópico, se extirpó la esclerótica usando tijeras de resorte a lo largo del limbo corneal y se extrajeron el cristalino y el iris para preparar un fragmento de esclerocórnea. El fragmento de esclerocórnea se dividió en cuatro partes como grupo de control y cada grupo complementado con inhibidor de caspasa. Después de dividir la córnea, el grupo de control se pretrató con Optisol-GS® complementado con DMSO (Bausch y Lomb) y los grupos complementados con inhibidor de caspasa se pretrataron con Optisol-GS® complementado con cada inhibidor durante 16 horas mientras se decoloraban. Después de lavar la córnea dos veces con PBS (-), se irradió UV sobre las células endoteliales corneales a 250 J/m2, y las células se almacenaron de nuevo mientras se decoloraban durante 24 horas a 4 °C. Se usó DMSO para el grupo de control, y se usó Optisol-GS® complementado con cada reactivo para los grupos complementados con inhibidor de caspasa como solución de conservación.

El fragmento de esclerocórnea se lavó con PBS (-) y se tiñó durante 15 minutos a 37 °C usando el kit de apoptosis MEBCYTO (kit Anexina V-FITC) (fabricante: MBL, Código: 4700). A continuación, el fragmento se inmovilizó con formaldehído al 4 % durante 10 minutos. Después de la inmovilización, el fragmento se tiñó durante 30 minutos con una solución DAPI (fabricante: DOJINDO, Código: GA098) y se complementó con un agente antidecoloración para el montaje. La Anexina V y el núcleo se observaron mediante imágenes fluorescentes usando un microscopio confocal. Además, la relación de células positivas para Anexina V se midió mediante citometría de flujo.

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la muerte celular programada de las células endoteliales corneales debido al daño celular)

Como se muestra en la figura 9 , se observaron células apoptóticas positivas para Anexina V en el grupo de irradiación UV, y la relación de las mismas fue notablemente alta. Mientras tanto, apenas se observó fluorescencia de Anexina V en los grupos complementados con inhibidor de caspasa. La relación de células positivas para Anexina V fue inferior o igual a la relación de células positivas para Anexina V del grupo de control sin irradiación UV.

(Ejemplo 8: Observación del trastorno funcional y anomalía morfológica en células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV)

En este ejemplo, se observaron trastornos funcionales y anomalías morfológicas en células endoteliales corneales de conejo irradiadas con UV bajo un microscopio confocal.

(Materiales y métodos)

Este Ejemplo usó los siguientes inhibidores de caspasa.

Z-VD-FMK (10 ^|JM)

Z-VAD-FMK (10 j M)

Emricasán (10 j M)

Este ejemplo usó globos oculares de conejo después de 0 a 24 horas desde la eutanasia. Bajo un microscopio estereoscópico, se extirpó la esclerótica usando tijeras de resorte a lo largo del limbo corneal y se extrajeron el cristalino y el iris para preparar un fragmento de esclerocórnea. El fragmento de esclerocórnea se dividió en cuatro partes como grupo de control y cada grupo complementado con inhibidor de caspasa. Después de dividir la córnea, el grupo de control se pretrató con Optisol-GS® complementado con DMSO (Bausch y Lomb) y los grupos complementados con inhibidor de caspasa se pretrataron con Optisol-GS® complementado con cada reactivo durante 16 horas mientras se decoloraban. Después de lavar la córnea dos veces con PBS (-), se irradió UV sobre las células endoteliales corneales a 250 J/m2, y las células se almacenaron de nuevo mientras se decoloraban durante 24 horas a 4 °C. Se usó Optisol-GS® complementado con cada inhibidor para los grupos complementados con inhibidor de caspasa como solución de conservación, mientras que se usó Optisol-GS® complementado con DMSO, que es un disolvente de inhibidores, para el grupo de control.

Después de lavar el fragmento de esclerocórnea con PBS (-), el fragmento se inmovilizó con formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y se incubó durante 60 minutos con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 %. Se usaron anticuerpos contra N-cadherina (BD Bioscience) y ZO-1 (Zymed Laboratories) a una dilución de 1:300. Para los anticuerpos secundarios, se usaron anti IgG de ratón de cabra marcado con Alexa Fluor® 488 (Life Technologies) y Alexa Fluor® (Invitrogen, A11009) a una dilución de 1:1000. Se usó una dilución 1:400 de faloidina (Life Technologies) 546 para la tinción de actina. A continuación, se tiñó el núcleo de las células con DAPI (solución DAPI de tinción celular; Dojindo, Kumamoto, Japón). A continuación, se observó la fluorescencia usando un microscopio confocal (TCS Sp2 AOBS; Leica Microsystems, Wetzlar Alemania).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime el trastorno funcional y la anomalía morfológica en las células endoteliales corneales debido a la estimulación que daña las células)

Los resultados se muestran en la figura 10. La N-cadherina y ZO-1 son proteínas implicadas en uniones adherentes y uniones estrechas. La función de barrera, que es una de las funciones de las células endoteliales corneales, puede evaluarse observando la fluorescencia de las mismas. En el grupo de irradiación UV, apenas se observó la fluorescencia de la N-cadherina. Por lo tanto, puede entenderse que las uniones adherentes están dañadas. Al observar la fluorescencia de ZO-1, se puede entender que las uniones estrechas están dañadas. Dado que la faloidina se une a la actina, que tiene diversas funciones, incluido el mantenimiento de la morfología celular, se puede evaluar la morfología celular. Como se puede ver en las imágenes fluorescentes de faloidina, la actina localizada en la corteza celular en el control está fragmentada para exhibir una localización anormal en el grupo de irradiación UV. En contraste con tal observación en el grupo de control de UV, se puede observar que la función/morfología celular que es la misma que la del grupo de control (sin irradiación de UV) se mantiene en los grupos complementados con irradiación UV inhibidor de caspasa.

(Ejemplo 9: Efecto del inhibidor de caspasa sobre el daño celular en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) debido al TGF-p2)

Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre el daño celular en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) debido al TGF-p2.

Se sembraron 1,2 x 105 de iFECD en una placa de 12 pocillos sin recubrimiento y se cultivaron durante 24 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (nacalai tesque, 26252 94) FBS al 10 % (Biological Industries/04-001-1A) penicilina-estreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94).

Después de 24 horas desde la siembra, se añadió cada inhibidor a una concentración de 10 j M y las células se incubaron durante 24 horas en la condición de CO2 al 5 % a 37 °C. El medio se intercambió por el grupo de control y el grupo TGF-p2. Como medio se usó DMEM FBS al 2 % P/S al 1 %.

Se usaron los siguientes reactivos:

SB431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./192-16541); Z-VAD-FMK (Peptide Institute/3188-v); Z-VD-FMK (mezcla de isómeros) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./262-02061); y emricasán (CHEMSCENE, LLC/CS-0599).

A continuación, Se añadieron TGF-p2 (fabricante: R&D Systems, Inc., distribuidor: Wako Pure Chemical Industries, Ltd./códigos del fabricante 302-B2-002, 302-B2-010, códigos del distribuidor: 553-62881,559-62883) (10 ng/ml) en solitario, o tanto TGF-p2 (10 ng/ml) y cada inhibidor (10 j M). Después de 24 horas, se observó la morfología celular y la muerte celular programada usando un microscopio de diferencia de fase.

Después de la observación, se examinó la relación de células en la posición de Anexina V usando citometría de flujo mediante el siguiente procedimiento.

Para recoger células suspendidas y muertas, se recogió la solución de lavar las células dos veces con 1 ml de PBS (-) de Dulbecco (Nissui/05913) y se incubó durante 5 minutos después de gotear en Accutase (INNOVAT/AT104) a 200 jl/pocillo. Después de la incubación, las células se lavaron con 1 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (nacalai tesque, 26252-94) y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para descartar el sobrenadante y obtener precipitados. Se añadió 1 ml de PBS (-) de Dulbecco a los precipitados que se añadieron por pipeteo y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar el sobrenadante. A continuación, se añadieron por goteo 92,5 j l de tampón de unión (MBL/4700-300), 5 jl/pocillo de Anexina V-FITC (reactivo) (MBL/4700-100) y 2,5 jl/pocillo de yoduro de propidio (PI). A continuación, la mezcla precipitada se añadió por pipeteo y se incubó mientras se decoloraba a temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación se midió la relación de células positivas para Anexina V usando el citómetro de flujo BD Accuri TM C6 (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la apoptosis de las células endoteliales corneales en el modelo de células de enfermedad de distrofia corneal endotelial de Fuchs)

Como se muestra en la figura 11, se observó una muerte celular significativa en el grupo TGF-p2, pero se observó que la muerte celular programada se suprimió en los grupos complementados con cada inhibidor de caspasa, al igual que en el grupo complementado con un inhibidor de TGF-p2 SB431542. Este resultado muestra que los inhibidores de caspasa pueden suprimir el daño celular debido a la estimulación de TGF-p2.

Los resultados de la citometría de flujo se muestran en las figuras 12 y 13. La relación de células en la posición de Anexina V fue menor en los grupos complementados con inhibidor de caspasa que en el grupo TGF-p2. Esto significa que un inhibidor de caspasa suprimió fuertemente el daño a las células endoteliales corneales inducido por TGF-p2 en el mismo grado que la inhibición de la señal de TGF-p a pesar de estar mediada por otra ruta.

(Ejemplo 10: Activación de la caspasa 3 por TGF-p2 en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD))

Este Ejemplo investigó el efecto de supresión de un inhibidor de caspasa sobre la activación de la caspasa 3 debido a TGF-p2 en células inmovilizadas obtenidas de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD).

(Materiales y métodos)

Se cultivaron iFECD mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 9.

1) Recogida de proteínas

El medio se recogió en hielo para recoger las células muertas y libres. También se recogió la solución de lavar las células dos veces con PBS (-) de Dulbecco (Nissui/05913) y se centrifugó a 4 °C a 800 x g durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante para obtener precipitados. Las células lavadas se complementaron con un tampón de extracción de proteínas (RIPA; Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1 %, DOC al 0,5 %, NP-40 al 1 %) en hielo para extraer las proteínas. Los precipitados de la centrifugación de las células libres y muertas también se suspendieron posteriormente juntos para su extracción. La solución recogida se sometió a ondas de ultrasonido durante 3 minutos en agua fría con un dispositivo de sonicación (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) y se centrifugó durante 10 min a 4 °C a 1500 rpm para recoger el sobrenadante de proteína.

2) Transferencia de Western

La proteína extraída (se vertieron 9 j l en cada pocillo, y la cantidad de proteína fue de aproximadamente 5,4 jg para la Caspasa 3 escindida y GAPDH, y aproximadamente 6,2 jg para PARp ) se separó por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Se usaron mAb anti GAPDH (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd./M171-3), anticuerpo PARP (CST Japan, KK/9542S) y anticuerpo Caspasa-3 (CST Japan, KK/9662S) como anticuerpos primarios. Se usaron IgG de ratón ECL, Ab completo ligado a h Rp (de oveja) (GE Healthcare Life Sciences/NA931V), IgG de conejo ECL y Ab completo ligado a HRP (de burros) (GE Healthcare Life Sciences/NA934V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, mAb anti GAPDH: dilución de 3000 veces, anticuerpo PARP: dilución de 2000 veces y anticuerpo de caspasa-3: dilución de 1000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces. Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un analizador de imágenes lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) y el software ImageQuant™ (GE Healthcare).

(Resultados)

(El inhibidor de caspasa suprime la activación de la caspasa 3 en el modelo de células de enfermedad de distrofia corneal endotelial de Fuchs)

Los resultados de las transferencias de Western se muestran en la figura 14. Como se muestra, no se observó una banda de caspasa 3 escindida en forma activa (aproximadamente 17 kDa) en los grupos complementados con inhibidor de caspasa, lo que demuestra que los inhibidores de caspasa suprimen la activación de caspasa 3 en un modelo de células de enfermedad de distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Ejemplo 11: Examen del efecto del inhibidor de caspasa sobre la conservación de la córnea utilizando córnea de conejo)

Este ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre la conservación de la córnea usando una córnea de conejo.

(Materiales y métodos)

En el experimento se usaron globos oculares de conejo después de 0 a 24 horas desde la eutanasia. Bajo un microscopio estereoscópico, se extirpó la esclerótica usando tijeras de resorte a lo largo del limbo corneal y se extrajeron el cristalino y el iris para preparar un fragmento de esclerocórnea. El fragmento de esclerocórnea se dividió en dos partes como grupo de control y grupos complementados con emricasán. Después de dividir la córnea, el grupo de control se dejó en reposo en Optisol-GS® complementado con DMSO (Bausch y Lomb) y los grupos complementados con inhibidor de caspasa se dejaron en reposo en Optisol-GS® complementado con emricasán durante 2 semanas a 4 °C.

Después de lavar el fragmento de esclerocórnea con PBS (-), el fragmento se inmovilizó con formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y se incubó durante 60 minutos con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 %. Se usaron anticuerpos contra N-cadherina (BD Bioscience) y ZO-1 (Zymed Laboratories) a una dilución de 1:300. Para los anticuerpos secundarios, se usó anti IgG de ratón de cabra marcado con Alexa Fluor® 488 (Life Technologies, A11009) a una dilución de 1:1000. Se usó una dilución 1:400 de faloidina (Life Technologies) 546 para la tinción de actina. A continuación, se tiñó el núcleo de las células con DAPI (solución DAPI de tinción celular; Dojindo, Kumamoto, Japón). Se observó fluorescencia usando un microscopio confocal (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Wetzlar Alemania). Se contaron las células que tenían anillos contráctiles de actina bajo un microscopio de fluorescencia para medir la relación.

(Resultados)

(Emricasán suprime el daño de las células endoteliales corneales durante la conservación de la córnea debido a la adición del mismo a la solución de conservación de la córnea)

Los resultados se muestran en la figura 15. Como puede verse en las imágenes de fluorescencia después de 2 semanas de conservación a 4 °C, el grupo de control tuvo daño celular, mientras que el grupo complementado con emricasán apenas tuvo daño celular después de 2 semanas de conservación a 4 °C o tenía alguna anomalía morfológica observada en las células. Además, emricasán suprimió significativamente los anillos contráctiles de actina que se encuentran en el daño celular.

(Ejemplo 12: Examen de la solución de criopreservación)

Este ejemplo examinó soluciones de criopreservación.

(Materiales y métodos)

Se añadieron suero fetal bovino y DMSO (Nacalai Tesque) a CELL BANKER PLUS (Takara Bio número de catálogo: CB021), CELL BANKER 2 (Takara Bio número de catálogo: CB031), STEM-CELLBANKER (Takara Bio número de catálogo: CB043), KM BANKER (Kohjin Bio número de catálogo: Ko J-16092005), medio de congelación, libre de componentes animales, CRYO Defined (CnT-CRYO) (CELLNTEC número de catálogo: CnT-CRYO-50) y OptiMEM (INVITROGEN) disponibles comercialmente al 10 % (v/v) para su uso como solución de criopreservación.

La prueba usó medio reducido en suero Opti-MEM I, líquido (INVITROGEN número de catálogo: 31985-070) suero fetal bovino al 8 % (FBS) (BIOWEST, número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml de CaCh2H2O (SIGMA número de catálogo: C7902-500G) sulfato de condroitina al 0,08 % (SIGMA número de catálogo: C9819-5G) 20 |jg/ml de ácido ascórbico (SIGMA número de catálogo: A4544-25G) 50 jg/m l de gentamicina (INVITROGEN número de catálogo: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (INVITROGEN número de catálogo: PHG0311) acondicionado para células alimentadoras MSC. Se usaron células endoteliales corneales humanas cultivadas en el medio descrito anteriormente. Las células se suspendieron en cada solución de criopreservación de modo que la concentración celular fuera de 100.000 células/ml, y se colocó 1 ml de cada solución en un criotubo (CORNING, número de catálogo: 430488). A continuación, los tubos de congelación se colocaron en un BICELL (Nihon Freezer, número de catálogo: BICELL), se almacenaron durante 10 días a -80 °C y a continuación se descongelaron sumergiendo los tubos en un baño de agua a 37 °C. Después de la descongelación, las células se lavaron en un medio y el recuento de células vivas y el recuento de células muertas se midieron mediante la prueba de exclusión por colorante azul de tripano.

La tasa de supervivencia para cada solución de criopreservación se calculó mediante la siguiente ecuación.

Tasa de viabilidad = recuento de células vivas/(recuento de células vivas recuento de células muertas) x 100

Además, se dispensaron 10000 células para calcular la tasa de viabilidad con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega número de catálogo: G7570).

(Resultados)

(KM banker suprime magníficamente el daño a las células endoteliales corneales en diversas soluciones de criopreservación disponibles comercialmente)

Los resultados se muestran en la figura 16. No se encontró una diferencia en la relación de células negativas para azul de tripano entre las soluciones de criopreservación. Sin embargo, la tasa de viabilidad celular calculada cuantificando ATP de células con mayor actividad metabólica fue la más alta con Km banker y apenas fue diferente en el control.

(Ejemplo 13: Supervivencia celular después de congelar células endoteliales corneales en diversas soluciones de criopreservación)

En este ejemplo, se observó la supervivencia celular después de congelar las células endoteliales corneales en diversas soluciones de criopreservación.

(Materiales y métodos)

Se realizó la misma criopreservación y descongelación de células endoteliales corneales que en el Ejemplo 12.

Después de la descongelación, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con laminina E8 (Veritas) a 5000 células por pocillo y se cultivaron en presencia y ausencia de Y27632. Después de tres días de cultivo, se tomaron imágenes de microscopio de diferencia de fase (aumento: x100).

Además, se dibujaron curvas de calibración usando células congeladas y células del mismo lote. Se realizó un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega, número de catálogo: G7570) para medir el recuento de células (n = 6).

(Resultados)

(KM Banker promueve la supervivencia celular después de la congelación de las células endoteliales corneales)

Se observó que la supervivencia celular se promovió cuando se usó KM banker, como se puede ver en las imágenes de microscopio que se muestran en la figura 17. Además, cuando se usó KM banker, el recuento celular fue ligeramente menor en comparación con las células pasadas que no se sometieron a criopreservación, pero se mostró un recuento celular significativamente mayor en comparación con un caso que usó otras soluciones de criopreservación, como se muestra en la figura 18. Esto muestra que KM banker promueve la supervivencia de las células endoteliales corneales después de la criopreservación.

(Ejemplo 14: Promoción del cultivo de células endoteliales corneales después de la criopreservación del endotelio corneal por inhibición de caspasa de Z-VD-FMK)

Este Ejemplo investigó el efecto de la inhibición de caspasa de Z-VD-FMK en cultivo de células endoteliales corneales después de la criopreservación del endotelio corneal.

(Materiales y métodos)

La prueba usó células endoteliales corneales humanas cultivadas en MSC-CM (medio acondicionado con MSC). El medio se eliminó de la placa de cultivo en la que se estaban cultivando células endoteliales corneales humanas, y las células se complementaron con PBS (-) que se precalentó a 37 °C y se lavaron. Esto se repitió dos veces. Después de eliminar el PBS (-), las células se complementaron con TrypLE Select (x10) (GIBCO, A12177-01) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C (CO2 al 5 %). A continuación, las células se criopreservaron con KM BANKER. Después de la conservación durante tres días a -80 °C, el tubo se sumergió en un baño de agua a 37 °C y se descongeló. Además, se sembraron 100000 células en una placa de 12 pocillos recubierta con laminina E8 y se complementaron con Z-VD-FMK de modo que la concentración final en el momento de la siembra fue de 5 pmol/l. Se añadió DMSO para el grupo que no se complementó con Z-VAD-FMK.

(Resultados)

(Z-VD-FMK promueve el cultivo de células endoteliales corneales después de la criopreservación del endotelio corneal)

Como se muestra en la figura 19, cuando se añadió un inhibidor de caspasa Z-VD-FMK, se promovió el crecimiento celular en el cultivo de células endoteliales corneales después de la criopreservación. Por lo tanto, se reveló que los inhibidores de caspasa son útiles en el crecimiento de células endoteliales corneales.

(Ejemplo 15: Reducción del daño celular en la criopreservación del endotelio corneal debido a Z-VD-FMK)

Este ejemplo investigó la reducción del daño celular en la criopreservación del endotelio corneal debido a Z-VD-FMK.

(Materiales y métodos)

La prueba usó células endoteliales corneales humanas cultivadas en MSC-CM. El medio se eliminó de una placa de cultivo en la que se estaban cultivando células endoteliales corneales humanas, y las células se complementaron con PBS (-) que se precalentó a 37 °C y se lavaron. Esto se repitió dos veces. Después de eliminar el PBS (-), las células se complementaron con TrypLE Select (x10) (GIBCO, A12177-01) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C (CO2 al 5 %). A continuación, las células se criopreservaron con KM BANKER añadiendo Z-VD-FMK (Wako Pure Chemical Industries, número de catálogo: 262-02061) de modo que la concentración final fue de 10 pmol/l. Al grupo de control se le añadió un disolvente de un reactivo, es decir, DMSO (dimetilsulfóxido, esterilizado filtrado; nacalai tesque, 13408 64).

Después de la conservación durante tres días a -80 °C, el tubo se sumergió en un baño de agua a 37 °C y se descongeló. Después de la descongelación, las células se lavaron en un medio y el recuento de células vivas y el recuento de células muertas se midieron mediante la prueba de exclusión por colorante azul de tripano. Además, se sembraron 10000 células en una placa de 96 pocillos recubierta con laminina E8 y se complementaron con Z-VD-FMK de modo que la concentración final en el momento de la siembra fue de 5 pmol/l, o se complementaron con SB203580 (Cayman, número de catálogo: 13067) de modo que la concentración final fue de 10 pmol/l. Se añadió DMSO para los grupos que no se complementaron con Z-VAD-FMK o SB203580. Después de 24 horas desde la siembra, se realizó un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega, número de catálogo: G7570) y se midió la cantidad de luminiscencia.

(Resultados)

(La inhibición de caspasa por Z-VD-FMK reduce el daño celular debido a la criopreservación del endotelio corneal)

Este ejemplo investigó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre la tasa de viabilidad celular en la criopreservación y el efecto de un inhibidor de caspasa añadido después de la criopreservación sobre el recuento celular. La tasa de viabilidad celular inmediatamente después de devolver las células congeladas a la temperatura normal fue mayor cuando se añadió Z-VD-FMK a una solución de criopreservación (Freeze Z-VD-FMK) que en un caso sin dicha adición (control Freeze) (figura 20, izquierda). Cuando se añadió Z-VD-FMK después de la criopreservación en el grupo de control Freeze, se suprimió el daño celular y el recuento celular fue de aproximadamente 1,7 veces en comparación con el caso en el que se añadió DMSO después de la criopreservación. En el grupo Freeze Z-VD-FMK, el recuento celular fue de aproximadamente 2,2 veces cuando se añadió DMSO después de la criopreservación. Cuando se añadió más cantidad de Z-VD-FMK después de la criopreservación, el recuento celular fue de aproximadamente 2,5 veces. Se confirmó un efecto sinérgico cuando se añadió un inhibidor de MAPK p38 SB203580.

(Ejemplo 16: Z-VD-FMK promueve el cultivo celular después de la congelación cuando se añade a múltiples soluciones de criopreservación)

(Materiales y métodos)

La prueba usó células endoteliales corneales humanas cultivadas en MSC-CM. El medio se eliminó de una placa de cultivo en la que se estaban cultivando células endoteliales corneales humanas, y las células se complementaron con PBS (-) que se precalentó a 37 °C y se lavaron. Esto se repitió dos veces. Después de eliminar el PBS (-), las células se complementaron con TrypLE Select (x10) (GIBCO, A12177-01) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C (CO2 al 5 %). A continuación, las células se criopreservaron usando Cell BANKER y KM BANKER como soluciones de criopreservación. Se usó DMSO para el grupo de control. Después de la conservación durante tres días a -80 °C, el tubo se sumergió en un baño de agua a 37 °C y se descongeló.

Además, se sembraron 10000 células en una placa de 96 pocillos recubierta con laminina E8 y se complementaron con Z-VD-FMK de modo que la concentración final en el momento de la siembra fue de 5 pmol/l, o se complementaron con Y27632 (Wako Pure Chemical Industries, número de catálogo: 253-00513) de modo que la concentración final fue de 5 pmol/l. Se añadió DMSO a los grupos que no se complementaron con Z-VAD-FMK o Y27632. Después de 24 horas desde la siembra, se realizó un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega, número de catálogo: G7570) y se midió la cantidad de luminiscencia con GROWMAX (Promega).

(Resultados)

(Z-VD-FMK promueve el cultivo celular después de la congelación cuando se añade a múltiples soluciones de criopreservación)

Los resultados se muestran en la figura 21. Como se muestra, se observó que el recuento celular era significativamente mayor cuando se añadió Z-VAD-MK después de la criopreservación en comparación con cuando no se añadió Z-VAD-MK. También puede entenderse que el efecto de Z-VAD-MK es el mismo tanto si se utilizó Cell Banker como si se utilizó KM Banker como solución de criopreservación. Por lo tanto, se demuestra que Z-VAD-MK promueve el cultivo celular de manera similar independientemente de la solución de criopreservación Z-VAD-MK que se añada.

(Ejemplo 17: Efecto de la supresión del inhibidor de caspasa sobre la producción de fibronectina debido a TGFp)

Este ejemplo confirmó que un inhibidor de caspasa suprime la producción de la matriz extracelular de células endoteliales corneales debido al TGF-p2.

(Observación de la fluorescencia)

(Materiales y métodos)

Se colocó un frasco redondo en una placa de 24 pocillos, se desinfectó durante 5 minutos con etanol y se revistió con un fragmento de laminina-511 E8. A continuación, se sembraron iFECD a 4,0 x 105 cada vez y se cultivaron a 37 °C (CO2 al 5 %) hasta alcanzar una confluencia del 60 al 70 %. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, nacalai tesque, 08456-36) FBS al 10 % (Thermo Fisher Scientific, S1820-500) penicilinaestreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94). A continuación se añadieron SB431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./192-16541), Z-VD-FMK (mezcla de isómeros) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./262-02061) y emricasán (CHEMSCENE, LLC/CS-0599) a una concentración de 10 pM, y las células se incubaron durante 24 horas. El medio se intercambió en el grupo de control y el grupo complementado con TFG-p2. Como medio se usó DMEM FBS al 2 % P/S al 1 %. A continuación, se añadieron TGF-p2 solo (10 ng/ml), o tanto TGF-p2 (10 ng/ml) como cada inhibidor (10 pM). Después de 24 horas, se realizó la inmunotinción mediante el siguiente método.

Las células después de 24 horas de estimulación se lavaron con PBS (-) y se inmovilizaron con PFA al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se usó Triton al 0,5 % durante 5 minutos para el tratamiento de permeación y se usó BSA al 1 % para el bloqueo durante 1 hora. Los anticuerpos primarios se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante una hora o durante una noche. En este momento se usaron anticuerpos contra fibronectina (BD Biosciences, 610077) a una dilución de 1:400. Se usó IgG de ratón de anticuerpo de cabra marcado con Alexa 488 (Life Technologies, A11009) diluido 1:1000 para los anticuerpos secundarios. Además, el núcleo celular se tiñó con DAPI (solución DAPI de tinción celular; Dojindo, Kumamoto, Japón) diluido a 1:2000. Se usó un microscopio confocal (Leica Microsystems CMS GmcH Am Friendensplatz 368165 Mannheim, Alemania) para observar la fluorescencia.

(Confirmación de la expresión por transferencia de Western)

(Materiales y métodos)

Se sembraron iFECD a 1,0 x 105 cada vez en una placa de 12 pocillos y se cultivaron a 37 °C (CO2 al 5 %) hasta alcanzar una confluencia del 60 al 70 %. Como medio se usó medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, nacalai tesque, 08456-36) FBS al 10 % (Thermo Fisher Scientific, S1820-500) penicilina-estreptomicina al 1 % (nacalai tesque, 26252-94). A continuación se añadieron SB431542 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./192-16541), Z-VD-FMK (mezcla de isómeros) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd./262-02061) y emricasán (CHEMSCENE, LLC/CS-0599) a una concentración de 10 pM, y las células se incubaron durante 24 horas. El medio se intercambió en el grupo de control y el grupo complementado con TFG-p2. Como medio se usó DMEM FBS al 2 % P/S al 1 %. Se añadieron TGF-p2 solo (10 ng/ml), o tanto TGF-p2 (10 ng/ml) como cada inhibidor (10 pm). Después de 24 horas, las proteínas se recogieron mediante el siguiente método.

(1) Recogida de proteínas

El medio se recogió en hielo para recoger las células muertas y libres. También se recogió la solución de lavar las células dos veces con 1 x PBS (-) y se centrifugó a 4 °C a 800 x g durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante para obtener precipitados. Las células lavadas se complementaron con un tampón de extracción de proteínas (RIPA; Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1 %, DOC al 0,5 %, NP-40 al 1 %) en hielo para extraer las proteínas. Los precipitados de la centrifugación de las células libres y muertas también se suspendieron posteriormente juntos para su extracción. La solución recogida se pulverizó durante 3 minutos con un dispositivo de sonicación (B iOr UPTOR, TOSHO DENKI) y se centrifugó durante 10 min (4 °C a 15000 rpm) para recoger el sobrenadante de proteína.

2) Transferencia de Western

Se separaron 8 |jg de la proteína extraída mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como anticuerpos primarios se usaron un anticuerpo anti fibronectina de conejos (BD Biosciences, 610077), un anticuerpo anti Smad2 de conejo (Cell Signaling, 5339P), un anticuerpo anti p-Smad2 de conejo (Cell Signaling, 3108S) y un anticuerpo anti GAPDH de ratón (MBL, M171-3). Se usaron un anticuerpo anti conejo marcado con peroxidasa y un anticuerpo anti ratón (GE Healthcare Biosciences, NA934V, NA931V) como anticuerpos secundarios. Para los anticuerpos primarios, el anticuerpo anti fibronectina de ratón se diluyó 20000 veces, el anticuerpo anti Smad2 de conejo y el anticuerpo anti p-Smad2 de conejo se diluyeron 1000 veces y GAPDH se diluyó 3000 veces, mientras que el anticuerpo secundario se diluyó 5000 veces.

Para la detección se usó Chemi Lumi ONE Ultra (nacalai tesque, 11644-40). La intensidad de la banda detectada se analizó con un Imager 600 de Amersham™ (GE Healthcare).

(Resultados)

Los resultados se muestran en las figuras 22 y 23. Este Ejemplo examinó el efecto de un inhibidor de caspasa sobre la producción de la matriz extracelular debido a la estimulación de TGF-p2. En el grupo complementado con TGF-p2, la expresión de fibronectina aumentó en comparación con el control. Por otro lado, la expresión disminuyó en los grupos complementados con TGF-p2 inhibidor de caspasa. Además, se encontró la expresión de Smad2 fosforilado (p-Smad2) en el grupo complementado con TGF-p2 y en los grupos de TGF-p2 inhibidor de caspasa.

(Análisis)

Como resulta evidente a partir de las figuras 22 y 23, se encontró una sobreexpresión de fibronectina en el grupo complementado con TGF-p2. En el grupo complementado con inhibidor de TGF-p2 SB431542, se suprimió la sobreexpresión de fibronectina debida a TGF-p2. Adicionalmente, no se encontró Smad2 fosforilado por estimulación de TGF-p2. Por otra parte, en los grupos complementados con inhibidor de caspasa Z-VD-FMK o emricasán, se encontró p-Smad2 a pesar de que se suprimió la sobreexpresión de fibronectina. Esto sugiere que los inhibidores de caspasa suprimen la sobreexpresión de fibronectina a través de una ruta diferente a la de las señales de TGF-p2. De hecho, se sabía que las caspasas estaban implicadas en la muerte celular, pero no se sabía que las caspasas estuvieran implicadas en la expresión de la matriz extracelular. Por lo tanto, fue inesperado que los inhibidores de caspasa suprimieran la sobreexpresión de fibronectina por una ruta diferente a la de las señales de TGF-p2.

En la distrofia corneal endotelial de Fuchs, la sobreproducción de la matriz extracelular, tal como fibronectina, y la deposición de la misma sobre la membrana de Descemet da como resultado un trastorno tal como engrosamiento de la membrana de Descemet o formación de guttas. Este trastorno comúnmente comienza a desarrollarse a los 30 y 40 años en los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs y evoluciona a lo largo de la vida del paciente. La evolución da como resultado una discapacidad visual tal como visión borrosa, halo, deslumbramiento o visión reducida. Mientras que las células endoteliales corneales se dañan continuamente en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, la transparencia de la córnea se mantiene por el endotelio corneal restante, lo que compensa la función de bombeo hasta que la densidad de las células endoteliales corneales está por debajo de aproximadamente 1000 células/mm2. Si la densidad está por debajo de aproximadamente 1000 células/mm2, la infiltración del humor acuoso anterior en la córnea conduce a un edema corneal, lo que da como resultado una discapacidad visual (figura 23). De esta manera, los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs padecen un trastorno de la función visual debido principalmente a dos causas, es decir, la sobreproducción de la matriz extracelular y la muerte de las células endoteliales corneales. El inhibidor de caspasa en la presente invención tiene una función tanto en la supresión de la producción de matriz extracelular como en la supresión de la muerte de las células endoteliales corneales para ser especialmente útil en la terapia de la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Ejemplo 18: Ejemplo de formulación: Solución de conservación de la córnea que contiene inhibidor de caspasa)

Como ejemplo de formulación, este Ejemplo fabrica una solución de conservación de la córnea que contiene un inhibidor de caspasa de la siguiente manera.

La siguiente solución de conservación se prepara mediante un método convencional.

Emricasán 0,5695 mg

Optisol-GS (Bausch-Lomb) dosis óptima

Cantidad total 100 ml

Se puede usar el emricasán fabricado por Chemscene como emricasán.

(Ejemplo 19: Ejemplo de preparación para colirios)

A continuación se muestra la composición de las sustancias de prueba en cada concentración.

Emricasán o una concentración adecuada de otros inhibidores de caspasa 1 a 10 mM (596,5 a 5695 mg) Cloruro de sodio 0,85 g

Dihidrogenofosfato de sodio dehidrato 0,1 g

Cloruro de benzalconio 0,005 g

Hidróxido de sodio Dosis óptima

Agua purificada Dosis óptima

Cantidad total 100 ml (pH 7,0) La concentración se puede diluir usando una base que consiste en los siguientes componentes.

Cloruro de sodio 0,85 g

Dihidrogenofosfato de sodio dehidrato 0,1 g

Cloruro de benzalconio 0,005 g

Hidróxido de sodio Dosis óptima

Agua purificada Dosis óptima

Cantidad total 100 ml (pH 7,0)

(Ejemplo 20: Ejemplo de terapia)

La distrofia corneal endotelial de Fuchs o una enfermedad del endotelio corneal similar puede diagnosticarse, por ejemplo, mediante 1) observación de la formación de guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, edema del epitelio corneal o edema del estroma corneal mediante microscopía con lámpara de hendidura, 2) observación de imágenes de guttas o trastorno del endotelio corneal con un microscopio especular, 3) observación de edema corneal con un Pentacam, OCT, aparato ultrasónico de medición del espesor de la córnea, o similares, y 4) cuando se determina como de alto riesgo por diagnóstico genético. Los ejemplos de administración esperada del medicamento incluyen colirios, inyección en la cámara anterior, administración usando un agente de liberación controlada, inyección intravítrea, inyección subconjuntival y similares.

Se puede usar una sustancia disponible comercialmente que sea compatible con la Farmacopea Japonesa, un producto equivalente de la misma o similares como cada componente distinto del principio activo.

Como se ha analizado anteriormente, la presente invención se ilustra mediante la descripción. Sin embargo, se entiende que el alcance de la presente invención debe interpretarse basándose únicamente en las reivindicaciones.

[Aplicabilidad industrial]

La presente invención proporciona un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno del endotelio corneal debido al factor de crecimiento transformante p (TGF-p) y/o la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, especialmente un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno del endotelio corneal en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. La presente invención proporciona una técnica disponible para las industrias (farmacéuticas o similares) implicadas en técnicas asociadas con la formulación o similares basadas en tal técnica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal del factor de crecimiento transformante p (TGF-p) en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, trastorno postrasplante de córnea, endotelitis corneal, traumatismo, cirugía oftálmica, trastorno poscirugía láser oftálmica, envejecimiento, distrofia polimorfa posterior (PPD), distrofia endotelial hereditaria congénita (CHED) y trastorno idiopático del endotelio corneal.

2. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la afección, trastorno o enfermedad es distrofia corneal endotelial de Fuchs, tal como una afección debida a la sobreproducción de la matriz extracelular en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

3. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la distrofia corneal endotelial de Fuchs es una afección debida a la sobreproducción de la matriz extracelular en la distrofia corneal endotelial de Fuchs que es al menos una seleccionada del grupo que consiste en guttata en una superficie del endotelio corneal, guttas turbias de la membrana de Descemet, engrosamiento de la membrana de Descemet, visión borrosa, halo, deslumbramiento, visión reducida, nebulosidad corneal, leucoma y anomalía en el sentido visual.

4. Un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, formación de guttas, engrosamiento de la membrana de Descemet, engrosamiento de la córnea, nebulosidad, cicatrices, nebulosa corneal, mácula corneal, leucoma, fotofobia y visión borrosa.

5. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la afección, trastorno o enfermedad es distrofia corneal endotelial de Fuchs, tal como al menos una seleccionada de formación de guttas y engrosamiento de la membrana de Descemet en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

6. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la afección, trastorno o enfermedad se debe a la sobreexpresión de fibronectina en las células endoteliales corneales.

7. Un medicamento que comprende un inhibidor de caspasa para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección, trastorno o enfermedad del endotelio corneal debida a una señal de TGF-p y la sobreexpresión de la matriz extracelular en las células endoteliales corneales, en el que la afección, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en distrofia corneal endotelial de Fuchs, otra distrofia corneal endotelial y un trastorno del endotelio corneal debido a un fármaco, cirugía, traumatismo o infección.

8. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la afección, trastorno o enfermedad es la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

9. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 para promover el crecimiento de células endoteliales corneales, que comprende un inhibidor de caspasa.

10. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además un inhibidor de MAP cinasa p38.

11. El medicamento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el inhibidor de caspasa es un inhibidor de caspasa 3.

12. El medicamento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el inhibidor de caspasa se selecciona del grupo que consiste en Z-VD-FMK, Z-VAD-FMK, emricasán y nivocasán.

13. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la concentración de Z-VD-FMK es de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 100 pM, o la concentración de Z-VAD-FMK es de aproximadamente 3 pM a aproximadamente 30 pM, o la concentración de emricasán es de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, o la concentración de nivocasán es de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 300 pM.

14. Un medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento o la prevención de la distrofia corneal endotelial de Fuchs que comprende emricasán.

15. El medicamento para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en el que el inhibidor de caspasa es Z-VD-FMK.