JP6664755B1

JP6664755B1 - 角膜内皮細胞を保存するための方法および容器

Info

Publication number: JP6664755B1
Application number: JP2019070230A
Authority: JP
Inventors: 範子小泉; 直毅奥村
Original assignee: Doshisha
Current assignee: Doshisha
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: JP2020054330A

Abstract

【課題】高い細胞生存率で角膜内皮細胞を保存する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、底面積が少なくとも約０．７ｃｍ２の容器に該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する工程を含む方法を提供する。本発明によれば、角膜内皮細胞を高い細胞生存率で保存することが可能である。また、このようにして保存された角膜内皮細胞は、正常な角膜内皮細胞の機能を有しており、また、角膜内皮疾患等の治療用細胞として使用可能である。【選択図】なし

Description

本発明は、角膜内皮細胞を保存するための技術に関する。

視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。

ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、再生する能力が限られているために重度な障害をうけると機能を維持できず角膜の透明性が失われる。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、ドナー角膜を用いた他家角膜移植が行われている。しかしながら、手術侵襲、拒絶反応、ドナー不足など現在の角膜移植には多くの解決課題が存在する。

これらの課題を克服するために、近年、角膜内皮疾患に対する治療として、侵襲性の低い細胞移植治療が開発されている（非特許文献１）。角膜内皮細胞の培養は困難であり、通常の方法では増殖しない（非特許文献２および３）、線維芽細胞化する（非特許文献４）、細胞老化する（非特許文献５）などの問題があり、角膜内皮細胞の培養方法はさかんに研究されており、実際に臨床応用が可能となった（非特許文献１）。

Kinoshita S, Koizumi N, Ueno M, et al. Injection of cultured cells with a ROCK inhibitor for bullous keratopathy. N Engl J Med 2018;378:995-1003. Okumura N, Ueno M, Koizumi N, et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009;50:3680-3687. Nakahara M, Okumura N, Kay EP, et al. Corneal endothelial expansion promoted by human bone marrow mesenchymal stem cell-derived conditioned medium. PLoS One 2013;8:e69009. Okumura N, Kay EP, Nakahara M, Hamuro J, Kinoshita S, Koizumi N. Inhibition of TGF-beta Signaling Enables Human Corneal Endothelial Cell Expansion In Vitro for Use in Regenerative Medicine. PLoS One 2013;8:e58000. Hongo A, Okumura N, Nakahara M, Kay EP, Koizumi N. The Effect of a p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Inhibitor on Cellular Senescence of Cultivated Human Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2017;58:3325-3334.

本発明者らは、鋭意工夫した結果、角膜内皮細胞を高い生存率で保存する方法を見出すに至った。具体的には、本発明者らは、角膜内皮細胞を特定の底面積を有する容器中で保存することで、高い生存率が維持されることを見出した。このようにして保存された角膜内皮細胞は、正常な角膜内皮細胞の機能を有しており、また、治療用細胞として使用可能であった。

したがって、本発明は以下を提供する。
（項目１）
角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、底面積が少なくとも約０．７ｃｍ^２の容器に該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する工程を含む、方法。
（項目２）
前記細胞の保存のための液体の液面が約０．７５ｍｍ以上である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記容器の底面積が、約０．７〜約４ｃｍ^２である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記容器の底面積が、約１．５〜約３ｃｍ^２である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記容器の底面積が、約１．８〜約２ｃｍ^２である、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記容器は、接着培養のための表面処理がされていない、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記容器は、低接着表面容器または表面非処理容器である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記容器は、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはガラスでできている、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記容器は、２４ウェルプレート、バイアル瓶、シリンジ、ディッシュからなる群より選択される、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞の保存が、約１２℃〜約４２℃の温度で行われる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞の保存が、約１７℃〜約３９℃の温度で行われる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞の保存が、約２７℃〜約３７℃の温度で行われる、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞の保存が、約３７℃の温度で行われる、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存するための容器であって、底面積が少なくとも約０．７ｃｍ^２である、容器。
（項目１５）
前記容器は、液面の高さが、約０．７５ｍｍ以上とすることを許容する構造を有する、項目１４に記載の容器。
（項目１６）
角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存するための容器であって、底面積が約０．７〜約４ｃｍ^２である、項目１４または１５に記載の容器。
（項目１７）
前記容器の底面積が、約１．５〜約３ｃｍ^２である、項目１４〜１６のいずれか一項に記載の容器。
（項目１８）
前記容器の底面積が、約１．８〜約２ｃｍ^２である、項目１４〜１７のいずれか一項に記載の容器。
（項目１９）
前記容器は、接着培養の表面処理がされていない、項目１４〜１８のいずれか一項に記載の容器。
（項目２０）
前記容器は、低接着表面容器または表面非処理容器である、項目１４〜１９のいずれか一項に記載の容器。
（項目２１）
前記容器は、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはガラスでできている、項目１４〜２０のいずれか一項に記載の容器。
（項目２２）
前記容器は、２４ウェルプレート、バイアル瓶、シリンジ、またはディッシュからなる群より選択される、項目１４〜２１のいずれか一項に記載の容器。
（項目２３）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法により保存された角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞。
（項目２４）
項目２３に記載の角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を含む、角膜内皮の障害、疾患または症状を処置または予防するための組成物。
（項目２５）
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記組成物は、ＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２である、項目２５または２６に記載の組成物。（項目２８）
（Ａ）角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞と、（Ｂ）該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存するための容器とを備える、細胞含有容器であって、底面積が少なくとも約０．７ｃｍ^２である、細胞含有容器。
（項目２９）
項目１５〜２２のいずれかまたは複数に記載の特徴をさらに含む、項目２８に記載の細胞含有容器。
（項目３０）
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、項目２８または２９に記載の細胞含有容器。

本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

本発明によれば、角膜内皮細胞を高い細胞生存率で保存することが可能である。また、このようにして保存された角膜内皮細胞は、正常な角膜内皮細胞の機能を有しており、また、角膜内皮疾患等の治療用細胞として使用可能である。

図１Ａは、角膜内皮細胞の保存の例示的な手順の概略を示す。図１Ｂは、２４ウェルプレート（細胞培養プレート）、２４ウェルプレート（超低接着）、４８ウェルプレート（懸濁培養）および９６ウェルプレート（超低接着）において角膜内皮細胞を保存した後、穏やかなピペッティングで細胞が回収された各プレートの位相差顕微鏡画像を示す。図２Ａは、２４ウェルプレート（超低接着）、４８ウェルプレート（懸濁培養）、９６ウェルプレート（超低接着、平底）、９６ウェルプレート（超低接着、丸底）、１５ｍｌコニカルチューブ（超低接着）および２ｍｌクライオチューブにおいて保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。図２Ｂは、２４ウェルプレート（超低接着）において３７℃、２４ウェルプレート（超低接着）において４℃、２４ウェルプレート（細胞培養プレート）において３７℃で保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。図２Ｃは、２４ウェルプレート（超低接着）、２４ウェルプレート（非処理）および１０ｍｌガラスバイアルチューブにおいて保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。図２Ｄは、２４ウェルプレート（超低接着）において、保存液の量３００μｌ、１０００μｌ、１５００μｌおよび２５００μｌで保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。バーの白の部分が死細胞、黒の部分が生細胞を示す。図２Ｅは、２４ウェルプレート（超低接着）において保存した角膜内皮細胞を培養プレートに播種した３時間後および２週間後の位相差顕微鏡画像を示す。図３Ａは、２４ウェルプレート（超低接着）において保存した角膜内皮細胞が前房に注入されたウサギモデルにおける細隙灯画像を示す。図３Ａは、左から注入後１日目、７日目および１４日目の画像を示し、上から対照眼（細胞注入なし）、２４時間保存細胞注入眼、４８時間保存細胞注入眼および７２時間保存細胞注入眼を示す。図３Ｂは、注入後１４日目のシャインプルーフ画像を示す。図４Ａは、２４ウェルプレート（超低接着）において保存した角膜内皮細胞が前房に注入されたウサギモデルにおいて、注入後１４日目にＰｅｎｔａｃａｍ^ＴＭで取得した角膜厚のカラーマップを示す。図４Ｂは、保存した角膜内皮細胞の注入後の中央角膜厚のグラフを示す。図４Ｃは、保存した角膜内皮細胞の注入後の角膜体積のグラフを示す。図４Ｄは、保存した角膜内皮細胞の注入後１４日目の眼の細胞密度のグラフを示す。図４Ｅは、免疫蛍光染色されたウサギ角膜の蛍光顕微鏡画像を示す。青はＤＡＰＩ染色（細胞核）を示す。緑は、左からそれぞれＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１、Ｎ−カドヘリンを示す。図５は、１ｍｌのシリンジに培養した角膜内皮細胞を５０万個を３００μｌの細胞保存液に懸濁して、保存している状態を示す。図６は、１ｍｌのシリンジに角膜内皮細胞を７２時間保存した後の位相差顕微鏡写真を示す。細胞がシリンジの側面に沈殿している。図７は、１ｍｌのシリンジに角膜内皮細胞を７２時間保存した後に、軽くタッピングした後の位相差顕微鏡写真を示す。細胞がシリンジの側面より浮き上がっている。図８は、１ｍｌのシリンジに角膜内皮細胞を７２時間保存した後に、軽くタッピングし、シリンジを細胞保存液にて優しく洗浄した後の位相差顕微鏡写真を示す。細胞のシリンジの側面への接着を認めない。図９は、１２℃、１７℃、２２℃、２７℃、３２℃、３５℃、３７℃、３９℃、および４２℃で保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。バーの白の部分が死細胞、黒の部分が生細胞を示す。図１０は、（１）バイアル瓶（株式会社マルエム、大阪、０５０１−０２）、（２）バイアル瓶（２ｍｌ、直径１６ｍｍ、高さ３３ｍｍ、IRAS処理、岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１０２４）、および（３）バイアル瓶（２ｍｌ、直径１６ｍｍ、高さ３３ｍｍ、IRAS処理およびシリカコート加工（SiO₂コーティング）、岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１１０２）の写真を示す。図１１は、（１）バイアル瓶（株式会社マルエム、大阪、０５０１−０２）、（２）バイアル瓶（２ｍｌ、直径１６ｍｍ、高さ３３ｍｍ、IRAS処理、岩田硝子工業株式会社、大阪）、および（３）バイアル瓶（２ｍｌ、直径１６ｍｍ、高さ３３ｍｍ、IRAS処理およびシリカコート加工（SiO₂コーティング）、岩田硝子工業株式会社、大阪）において保存した角膜内皮細胞の生細胞と死細胞の割合を示す。バーの白の部分が死細胞、黒の部分が生細胞を示す。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。

（定義）
本明細書において、「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜（角膜内皮基底膜）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「ＨＣＥＣ」（human
corneal endothelial cells）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。

本明細書において、「角膜内皮様細胞」とは、幹細胞から分化した細胞、例えばｉＰＳ細胞等から分化した細胞であって、角膜内皮細胞と実質的な同一の機能を有する細胞を指す。幹細胞、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等から角膜内皮様細胞へと分化させる方法は、当該分野で周知である（ＭｃＣａｂｅｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１５Ｄｅｃ２１；１０（１２）：ｅ０１４５２６６；Ａｌｉｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２０１８Ｍａｙ１；５９（６）：２４３７−２４４４）。典型的な例において、簡潔には、細胞解離バッファー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０日目に１：１２希釈でｉＰＳ細胞を３５ｍｍマトリゲルコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する（８０％コンフルエントプレートを１２個のプレートに分ける）。ｉＰＳ細胞を４日間培地（ｍＴｅＳＲ１；ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）中で増殖させる。４日目に、ｍＴｅＳＲ１培地を、８０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭＬ−グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、５００ｎｇ／ｍＬヒト組換えＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）および１０μＭのＳＢ４３１５４２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含むＳｍａｄ阻害剤培地で置換する。６日目に、Ｓｍａｄ阻害剤培地を、８０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭＬ−グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、０．１× Ｂ２７サプリメント（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）および１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−２（ＤＫＫ−２；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含む角膜培地で置換する。７日目に、分化中のＣＥＣを、新しいマトリゲールコーティングプレート（３５ｍｍ）に移し、さらに１３日間角膜培地中で増殖させる。分化したＣＥＣを２０日目に回収する。上記例は典型的な例であって、当業者は、当該分野で周知の他の方法（Ｆｕｋｕｔａｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４Ｄｅｃ２；９（１２）：ｅ１１２２９１；Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６Ｍａｒ１７；５３１（７５９４）：３７６−８０）も使用し得る。また、当業者であれば、当該分野で周知の方法の条件を適宜調節して、角膜内皮様細胞を作製することができる。

「角膜内皮細胞」および「角膜内皮様細胞」は、磁性体（例えば、鉄）を含んでいてもよい。例えば、磁性物質を含む角膜内皮細胞を前房内に注入した場合、磁力により角膜の内側（例えば、デスメ膜）に引き付け接着を促すことが可能である（Patel et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009 May;50(5):2123-31；Mimura et al., Exp Eye Res. 2003 Jun;76(6):745-51；およびMimura et al., Exp Eye Res. 2005 Feb;80(2):149-57）。「磁性体」とは、磁場により磁化される物質を指し、例えば、鉄、コバルト、ニッケル、フェライトなどが挙げられる。

本明細書において、「接着培養」とは、細胞を容器に接着させて培養することをいう。接着培養用の容器としては、例えば、細胞培養（ＴＣ：ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ）処理がされているものが挙げられる。

本明細書において、「低接着」とは、細胞の培養または保存の際に細胞が容器に接着することがほとんどないことを指す。低接着表面容器は、例えば、表面がハイドロゲルでコーティング（例えば、共有結合により）、および／またはシリカ（ＳｉＯ_２）コーティングされている。他の例としては、表面がＩＲＡＳ処理されたガラス容器が挙げられる。ＩＲＡＳ処理されたバイアル瓶は、岩田硝子工業株式会社（大阪）より利用可能である。ＩＲＡＳ処理によって、ホウケイ酸ガラスからのアルカリの溶出が抑制される。低接着表面容器は、懸濁（浮遊）培養用の容器として市販されている場合もあり、懸濁（浮遊）培養用の容器は、細胞が容器に接着しないような表面処理がされている限り、本明細書において、低接着表面容器とみなされる。

本明細書において、「表面非処理」とは、表面処理がされていないことを指し、「表面非処理容器」は、低接着表面容器と同様に細胞が容器に接着することなく細胞を培養または保存することができる容器を指す。表面非処理容器は、懸濁（浮遊）培養用の容器として市販されている場合もあり、懸濁（浮遊）培養用の容器は、表面処理がされておらず、細胞が容器に接着することなく細胞を培養または保存することができる限り、表面非処理容器とみなされる。

本明細書において、細胞の「保存」とは、細胞を増殖させることなく、細胞の機能を維持しつつ溶液中に維持することを指し、細胞を増殖させることを目的とする「培養」とは異なる。

本明細書において「細胞含有容器」とは、細胞（代表的には、角膜内皮細胞又は角膜内皮様細胞）を含有する容器をいい、代表的には、本明細書で開示される特徴を有する。

（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。

（保存方法）
一態様において、本発明は、角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する方法であって、特定の底面積を有する容器に該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する工程を含む、方法を提供する。本発明の方法で使用される容器の底面積は、少なくとも約０．７ｃｍ^２であり得、通常、約０．７〜約４ｃｍ^２であり得る。理論に束縛されることを望まないが、０．７ｃｍ^２よりも底面積が小さい容器（例えば、１２ウェルプレート）の場合は、高い細胞生存率が達成されず、４ｃｍ^２よりも底面積が大きい容器（例えば、４８ウェルプレート）の場合、角膜内皮細胞注入療法に使用され得る細胞懸濁液または細胞の保存のための液体（例えば、約３００μｌ）を容器に入れると液面が低くなりすぎるため保存に適さない。ある実施形態では、細胞の保存のための液体の液面が約０．５ｍｍ以上、約０．６ｍｍ以上、約０．７ｍｍ以上、約０．７５ｍｍ以上、約０．８ｍｍ以上、約０．９ｍｍ以上、約１．０ｍｍ以上、約１．２ｍｍ以上、約１．４ｍｍ以上、約１．６ｍｍ以上、約１．８ｍｍ以上、約２ｍｍ以上であることが好ましい。ある実施形態では、細胞の保存のための液体の液面が約１．０ｍｍ以下、約１．５ｍｍ以下、約１．８ｍｍ以下、約２ｍｍ以下、約３ｍｍ以下、約４ｍｍ以下、約５ｍｍ以下、約６ｍｍ以下、約７ｍｍ以下、約８ｍｍ以下、約９ｍｍ以下、約１０ｍｍ以下、約１５ｍｍ以下、約２０ｍｍ以下などであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される容器の底面積は、約０．７〜約３．５ｃｍ^２、約０．７〜約３ｃｍ^２、約０．７〜約２．５ｃｍ^２、約０．７〜約２．０ｃｍ^２、約１〜約４ｃｍ^２、約１〜約３．５ｃｍ^２、約１〜約３ｃｍ^２、約１〜約２．５ｃｍ^２、約１〜約２ｃｍ^２、約１．５〜約３ｃｍ^２、約１．５〜約４ｃｍ^２、約１．６〜約２．２ｍ^２、または約１．８〜約２ｍ^２であり得る。保存される角膜内皮細胞の懸濁液の量が、角膜内皮細胞注入療法で使用され得る量よりも多い場合は、容器の底面積の上限は特に限定されず、例えば、底面積の範囲において、上限として約４．５ｃｍ^２、約５ｃｍ^２、約５．５ｃｍ^２、約６ｃｍ^２、約７ｃｍ^２、約８ｃｍ^２、約９ｃｍ^２、約１０ｃｍ^２、約１５ｃｍ^２、約２０ｃｍ^２、約２５ｃｍ^２、約３０ｃｍ^２、約４０ｃｍ^２、約５０ｃｍ^２、約６０ｃｍ^２、約７０ｃｍ^２、約８０ｃｍ^２、約９０ｃｍ^２、約１００ｃｍ^２とすることができる。容器の底面積は、好ましくは約１．５〜約３ｃｍ^２であり、より好ましくは、約２ｃｍ^２である。特定の実施形態では、容器の底面積は約１．８８ｃｍ^２である。

本発明の方法は、保存開始時点から高い細胞数および高い細胞生存率を維持しつつ角膜内皮細胞を保存することを可能にする。例えば、本発明の方法は、保存開始時点の全細胞を１００％とすると、少なくとも保存後の総細胞数が約３０％以上かつ生細胞比（生細胞／生細胞＋死細胞）が約７０％以上、好ましくは、保存後の総細胞数が約５０％以上かつ生細胞比が約８０％以上、最も好ましくは、保存後の総細胞数が７０％以上かつ生細胞比が約９０％以上での角膜内皮細胞を達成し得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、細胞生存率（保存開始時点の全細胞と比較した場合の生細胞数の割合）が、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上である。さらなる特定の実施形態では、上記細胞生存率に加えて、生細胞比（生細胞／生細胞＋死細胞）が、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上である。

底面積は、容器の底面と称される面の面積を指す。本発明の方法は、シリンジを横に倒した状態で保存することも企図するが、そのような場合、容器の底面積は、細胞懸濁液が接触する円筒曲面の下半分の面の面積とする。

保存の際の温度は、約１０℃〜約５０℃の範囲内であり得る。高すぎても低すぎても細胞生存率が低下してしまうためである。当業者であれば、保存の際の好適な温度を適切に決定することが可能である。いくつかの実施形態において、保存の際の温度は、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃であり得る。好ましい保存の際の温度範囲は、好ましくは約１２℃〜約４２℃であり、より好ましくは約１７℃〜約３９℃であり、さらに好ましくは約２７℃〜約３７℃である。好ましい実施形態では、保存の際の温度は、室温または約３７℃であり得る。最も好ましい実施形態では、保存の際の温度は約３７℃であり得る。

角膜内皮細胞は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）に由来する細胞であり得るが、霊長類由来が好ましく、特にヒト由来が好ましい。

いくつかの実施形態において、容器は、接着培養のための表面処理がされていない。いくつかの実施形態において、容器は、低接着表面容器または表面非処理容器である。いくつかの実施形態において、容器は、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはガラスでできている。具体的な実施形態において、容器としては、例えば、２４ウェルプレート、バイアル瓶、シリンジ、およびディッシュが挙げられるがこれらに限定されない。

前記容器は、細胞接着が生じることなく保存が可能である限り、酸素透過性の材料でできていてもよく、そうでなくてもよい。酸素透過性の材料としては、例えば、ポリエチレンの他、酸素を透過する任意の材料が挙げられる。また、酸素を透過しない材料を、当該分野で周知の方法により酸素を透過するように加工することも可能である。

角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の保存溶液は、当該分野で使用される周知の保存溶液を使用してよい。使用され得る保存液としては、例えば、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、角膜内皮細胞保存液（本明細書で使用される保存液、ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＦｅａｓｉｂｉｌｉｔｙＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａＮｅｗＶｅｈｉｃｌｅｆｏｒＣｅｌｌ−ＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＴｒｅａｔｉｎｇＣｏｒｎｅａｌＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＤｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＯｋｕｍｕｒａＮ，ＫａｋｕｔａｎｉＫ，ＩｎｏｕｅＲ，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＤ，ＳｈｉｍａｄａＴ，ＮａｋａｈａｒａＭ，ＫｉｙａｎａｇｉＹ，ＩｔｏｈＴ，ＫｏｉｚｕｍｉＮ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１６Ｊｕｎ２９；１１（６）：ｅ０１５８４２７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５８４２７．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ２０１６．ＰＭＩＤ：２７３５５３７３）などが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、保存の際の液量は、例えば、その後の細胞注入に適切な量である約３００μｌであり得るが、目的に応じて適宜変更可能である。例えば、保存の際の液量は、約１００μｌ、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌ、約７００μｌ、約８００μｌ、約９００μｌ、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、または約１０ｍｌであり得る。液量の範囲は、上記数値を適宜組み合わせることができる。

（容器）
別の態様において、本発明は、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を保存するための容器であって、特定の底面積を有する容器を提供する。容器の具体的な特徴は、上記、特に（保存方法）に具体的に記載される任意の実施形態を採用することができる。

（容器）
別の態様において、本発明は、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を保存するための容器とを含む細胞含有容器でであって、ここで使用される容器は、特定の底面積を有する容器を提供する。容器の具体的な特徴は、上記、特に（保存方法）に具体的に記載される任意の実施形態を採用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の容器内には、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が含まれ得る。ここで使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、本明細書に記載される任意の実施形態でありうる。

（角膜内皮細胞）
別の態様において、本発明は、上記方法により保存された角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を提供する。さらなる態様において、本発明は、上記方法により保存された角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を含む、角膜内皮の障害、疾患または症状を処置または予防するための組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、角膜内皮の障害、疾患または症状は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含んでもよいし、ＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などがあげられ、これらの化合物は、市販品（和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。本実施例において用いられる各種試薬は、具体的に示したもののほか、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＡＳＦジャパン株式会社などから入手されるものも用いることができることが理解される。ヒト組織は、ヘルシンキ宣言の倫理規定に基づき扱われた。ヒトドナー角膜は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅ^ＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から提供された。研究目的のための目の寄贈については、故人ドナーの近親者から書面による同意書を得た後、その州の統一死体提供法（ＵＡＧＡ）の基準のもと角膜を採取した。ウサギでの実験は、同志社大学動物実験等委員会により承認された指針に基づき実施された（承認番号Ａ１８００３）。

（実施例１：細胞保存における容器の材質およびサイズのスクリーニング）
（材料および方法）
（角膜内皮細胞の培養）
疾患を患う４０歳以上のドナーから５個のヒトドナー角膜を得た。すべての角膜は、使用前に１４日以内の間４℃でＯｐｔｉｓｏｌ（ＣｈｉｒｏｎＶｉｓｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）において保存された。ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）は、以下に従って培養された。簡潔には、角膜内皮を含むデスメ膜をドナー角膜から機械的に剥離し、１２時間３７℃で１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においてインキュベートすることにより消化した。ＨＣＥＣをＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄後、ラミニンＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１；ニッピ株式会社、東京）でコーティングされた４８ウェルプレートの一つのウェルに播種した。

培地は、以下に従って調製した。簡潔には、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ＥＧＦ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム、０．０８％コンドロイチン硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充されたＯｐｔｉＭＥＭ−ＩをＮＩＨ−３Ｔ３と共に２４時間馴化した。馴化した培地をその後回収し、０．２２μｍのフィルタユニット（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を介してフィルタリングし、ＨＣＥＣの培地として使用した。

５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下においてＨＣＥＣを３７℃で培養し、培地を週３回交換した。ＨＣＥＣの継代培養においては、細胞をＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５分間３７℃でトリプシン化し、１：２の割合で播種した。本試験では５代から９代継代培養されたＨＣＥＣを使用した。

ＨＣＥＣを、Ｃａ^２＋やＭｇ^２＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）で１５分間３７℃でトリプシン化した。細胞を培養プレートから回収した後、２回洗浄し、２８０Ｇで３分間遠心分離し、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉに懸濁した。ＨＣＥＣを上述の無血清培養液（株式会社細胞科学研究所（宮城）により提供された細胞療法培養液）において１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で７２時間４℃か３７℃で細胞懸濁の形態で保存した。ＨＣＥＣ保存のためのサイズおよび材質をスクリーニングするために以下の細胞培養プレート、試験管、およびバイアルが使用された：２４ウェルプレート（超低接着）（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ）、２４ウェルプレート（細胞培養）（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ）、２４−ウェルプレート（非処理）（ＡＧＣテクノグラス株式会社、静岡）、４８ウェルプレート（懸濁培養）（住友ベークライト株式会社）、９６ウェルプレート（超低接着、丸底）（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ）、９６ウェルプレート（超低接着、平底）（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．）、１５ｍｌコニカルチューブ（超低接着）（住友ベークライト株式会社、東京）、２ｍｌクライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および１０ｍｌガラスバイアル瓶（株式会社マルエム、大阪）（表１）。

ＨＣＥＣを７２時間の保存後、細胞培養プレート、試験管、またはバイアルから緩やかにピペッティングで回収し、３分間２８０Ｇで遠心分離し、１．０×１０^６個／６００μｌの細胞密度で細胞療法用培養液に再懸濁した。死細胞を０．５％トリパンブルー染色液（ナカライテスク、京都）で染色することにより細胞生存率を算出した。対照として、ＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）でのトリプシン化により回収したＨＣＥＣを３分間２８０Ｇで遠心分離し、細胞療法用培養液において再懸濁した。その後、細胞懸濁の態様での保存することなく細胞生存率を即座に評価した。

（結果）
（細胞懸濁形態保存条件の細胞生存率に対する影響）
ＨＣＥＣを７２時間ＣＴＶにおいて細胞懸濁形態で１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で保存し、細胞を緩やかなピペッティングで採取し、細胞生存率を評価した（図１Ａ）。位相差画像は、接着培養用プレートの８０から９０％の領域が、細胞回収するための緩やかなピペッティング後にＨＣＥＣで覆われていたことを示した。一方、懸濁細胞培養用２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、および９６ウェルプレートのいずれにおいても細胞はほぼ観察されなかった（図１Ｂ）。接着培養のための表面処理は細胞懸濁の形態としてＨＣＥＣ保存に適用不可能であったため、本実施例では市販の培養プレートおよび試験管のサイズおよび形状の細胞生存率に対する影響を評価した。トリプシン化され培養プレートから採取された直後の対照において生存細胞と死細胞の割合は９０．３％と９．７％であり、２４ウェルプレート（超低接着）で保存された細胞においては８２．６％と１０．１％（保存された元の細胞数に対して）であった。しかし、生存細胞の割合は、４８ウェルプレート（懸濁培養）、９６ウェルプレート（超低接着、平底）、９６ウェルプレート（超低接着、丸底）、１５ｍｌコニカルチューブ（超低接着）、および２ｍｌクライオバイアル（ｐ＜０．０１）の対照と比較して顕著に減少していた（図２Ａ）。おそらく培養プレートまたは試験管の底または壁への細胞接着のため４８ウェルプレート（懸濁培養）、１５ｍｌコニカルチューブ（超低接着）、および２ｍｌクライオバイアルにおける保存後には、採取された細胞数が顕著に減少していた。筆者らはさらに温度の細胞生存率に対する影響を評価し、９５．１％の細胞が３７℃で生存したが、大量の細胞が死滅したため４℃での２４ウェルプレート（超低接着）における保存後細胞はほぼ採取されなかったことを示した（図２Ｂ）。他の培養プレートまたは試験管も接着培養のための表面処理を施すことなく評価した。２４ウェルプレートでの超低接着と同様に、非処理２４ウェルプレートおよび１０ｍｌガラスバイアル管（２４ウェルプレート（約１．９ｃｍ^２）と同様に底面積は約２．７ｃｍ^２）では９０％以上の細胞生存率を維持した（図２Ｃ）．中間体積は細胞の生存率を顕著に変動させなかった（図２Ｄ）。

２４ウェルプレート（超低接着）において細胞懸濁の形態で保存されたＨＣＥＣＫを７２時間３７℃で保存した後培養プレート上に播種した。代表的な位相差画像においては、保存されたＨＣＥＣが、対照と同様に、３時間の播種後に明らかな細胞死を伴わすに培養プレート上に付着したことを示していた。２週間後、保存されたＨＣＥＣは、対象と同様な多角形状の単層シート様構造を形成していた（図２Ｅ）。

（実施例２：ウサギ角膜内皮代償不全モデルへのＲＣＥＣの注入）
（材料および方法）
（ウサギＣＥＣ培養）
本実施例では、フナコシ株式会社（東京）から購入したウサギの眼を１０個使用した。ウサギＣＥＣ（ＲＣＥＣ）を上述のように培養した。簡潔には、ＲＣＥＣを含む剥離デスメ膜を３７℃で１５分間０．６Ｕ／ｍＬＡｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク、京都）においてインキュベートし、回収したＲＣＥＣをＦＮＣＣｏａｔｉｎｇＭｉｘ^{（登録商標）}（ＡｔｈｅｎａＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）でコーティングした培養プレートに播種した。ＲＣＥＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において培養した。１代から３代の継代培養を経た培養ＲＣＥＣを使用した。

（ウサギ角膜内皮代償不全モデルへのＲＣＥＣの注入）
１２匹の日本白色種（ＪａｐａｎｅｓｅＷｈｉｔｅＲａｂｉｔ）の右眼を試験に使用し、左眼は盲目を避けるために使用しなかった。ウサギ角膜内皮代償不全モデルは上述のように作製した。簡潔には、前房を深くするためにレンズを一週間前に除去し、角膜内皮を２０Ｇシリコンニードル（ソフトテーパードニードル、株式会社イナミ、東京）を使用して機械的に取り除いた。デスメ膜から角膜内皮が完全に剥離したことを０．１％トリパンブルー染色液でデスメ膜を染色することにより確認した。

培養ＲＣＥＣをＰＢＳで洗浄し、３７℃で５分間０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン化し、その後培地で中和した。ＲＣＥＣを三回洗浄し、２４ウェルプレート（超低接着）において１．０×１０^６個／３００μｌのＣＴＶの細胞密度で細胞懸濁の形態で保存した。２４、４８、または７２時間の保存後、ウサギの眼に注入するためのＲＣＥＣ（１．０×１０^６個／６００μｌのＣＴＶ、１００μＭのＹ−２７６３２）を調製するために、ＲＣＥＣ（１．０×１０^６個／３００μｌのＣＴＶ）をＲＯＣＫ阻害剤（２００μＭのＹ−２７６３２（和光純薬株式会社）／３００μｌのＣＴＶ）と緩やかに混合した。２６Ｇの注射器を使用することにより角膜内皮代償不全モデルの前房に合計５．０×１０^５のＲＣＥＣと共に１００μＭのＹ−２７６３２を含む３００μｌのＣＴＶを注入した。ウサギを全身麻酔下で内皮表面を下にした状態で３時間維持した。対照として、角膜内皮代償不全モデルの前房にＹ−２７６３２（最終濃度：１００μＭ）を含むＣＴＶを注入した。各グループ（対照、２４時間、４８時間、および７２時間の細胞保存）につき３匹のウサギの眼を使用した。

眼の前方部を１４日間細隙灯試験により評価した。シャインプルーフ画像をＰｅｎｔａｃａｍ（登録商標）（ＯＣＵＬＵＳＯｐｔｉｋｇｅｒａｔｅＧｍｂＨ，Ｗｅｔｚｌａｒ，ドイツ）で取得し、角膜の７ｍｍ径での体積もシャインプルーフ画像を使用して測定した。角膜の中央厚を超音波パキメータ（ＳＰ−２０００；トーメー、名古屋）を使用して測定した。角膜厚は重篤な浮腫により測定不可能であったため、機器の最大読取値である１２００μｍとみなした。

（免疫蛍光およびアクチン染色）
ウサギ角膜を採取し、室温で１０分間４％ホルムアルデヒドで固定化した。検体を４５分間３７℃で１％ウシ血清アルブミンとともにインキュベートし、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体（１：３００、ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ、ＮＹ）、ＺＯ−１（１：３００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｎ−カドレリン（１：３００、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ））とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで検体を３回洗浄後、検体をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^{（登録商標）}４８８標識ヤギ抗マウス（１：１０００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに室温で６０分間インキュベートした。インキュベートした検体に対し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^{（登録商標）}４８８標識ファロイジン（１：４００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で６０分間室温でアクチン染色を施した。細胞核は、ＤＡＰＩ（同仁化学研究所、熊本）で染色した。検体は蛍光顕微鏡で観察した（ＴＣＳＳＰ２ＡＯＢＳ；ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒドイツ）。

（統計分析）
複数サンプル群の比較における統計的有意性（ｐ値）はクラスカル−ウォリス検定により算定した。結果は平均値±標準偏差として表されている。０．０５未満のｐ値を統計的有意な値とした。

（結果）
（ウサギモデルにおける細胞療法のための保存ＲＣＥＣの実施可能性）
培養ＲＣＥＣを採取し３７℃で２４時間、４８時間、または７２時間２４ウェルプレート（超低接着）において細胞培養形態で保存した。ウサギモデルへの注入前にＹ−２７６３２をＲＣＥＣに追加し、ウサギ角膜内皮代償不全モデルの前房に注入した。細隙灯試験では、２４、４８、または７２時間の保存後にＲＣＥＣを注入した眼においては、いずれも角膜が７日以内に透明性を呈することを示していた（図３Ａ）。対照眼では全て角膜内皮代償不全のために角膜が不透明であった。シャインプルーフ画像においては、２４、４８、及び７２時間保存したＲＣＥＣを注入することによって、解剖学上正常な角膜が成功裏に再生することを示すが、対照眼では重篤な角膜浮腫を呈していた（図３Ｂ）。

Ｐｅｎｔａｃａｍ^（商標）で取得した角膜厚のカラーマップは、２４及び４８時間保存したＲＣＥＣが、その注入の１４日後に、角膜の中心から外周部で正常な角膜厚を再生したことを示している。一方、７２時間保存されたＲＣＥＣを注入した眼は、細隙灯試験での観察では角膜が透明であったが、厚みが増していた（図３Ａおよび４Ａ）。超音波パキメータでは、２４及び４８時間保存したＲＣＥＣを注入した眼において１０日後に中心の角膜厚が約４００μｍ（正常範囲）になったことを示した。しかし、７２時間保存したＲＣＥＣを注入した眼では、２４または４８時間保存したＲＣＥＣを注入した眼より中心角膜厚の減少が少なく、１４日間を通して顕著に高かった（ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。中心の角膜厚と同様に、シャインプルーフ画像で特定された角膜体積は、７２時間保存したＲＣＥＣを注入した眼よりも２４または４８時間保存したＲＣＥＣを注入した眼において低かった（図４Ｃ）。アクチン及びＤＡＰＩにより評価した再生角膜内皮の細胞密度は、２４時間保存したＲＣＥＣを注入した眼においては２４６５個／ｍｍ^２であり、４８時間保存したＲＣＥＣを注入した眼においては２３６８個／ｍｍ^２であった。しかし、７２時間保存したＲＣＥＣを注入した眼の細胞密度は１５４８個／ｍｍ^２であり、２４または４８保存したＲＣＥＣを注入した眼のものよりも顕著に低い値を示した（ｐ＜０．０５）（図４Ｄ）。

免疫蛍光染色は、機能関連マーカーＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（ポンプ機能のマーカー）、ＺＯ−１（密集結合のマーカー）、およびＮ−カドヘリン（接着結合のマーカー）が、２４，４８、及び７２時間保存したＲＣＥＣを注入した眼におけるすべての再生ＣＥＣの側膜に発現することを実証した。アクチン染色により再生角膜内皮が多角形単層シート状構造を形成することを示した。一方、対照眼においては、角膜内皮代償不全により、線維化を伴う機能関連マーカーを発現しない細胞がほとんど見られなかった（図４Ｅ）。

（実施例３：１ｍｌシリンジを用いた角膜内皮細胞の保存）
（材料および方法）
ＨＣＥＣを７２時間ＣＴＶにおいて細胞懸濁形態で１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で１ｍｌシリンジ（ディスポーザブルシリンジ、届出番号：０８Ｂ２Ｘ１０００７０００００１、ミサワ医科工業株式会社、茨城県）に保存した。シリンジを横向きに静置し、７２時間３７℃にて保存した。保存後、シリンジを指先で揺すり、２６Ｇ針にて細胞をシリンジ外へ出したのちに、細胞の生存率を評価した。保存中の細胞のシリンジ内面への接着の有無を評価するために、保存後、シリンジを指先で揺すり、細胞をシリンジから取り出したのちに、シリンジ内面を細胞保存液で軽く洗浄したあとのシリンジ内面の状態を観察した。

（底面積の計算）
各実験において液量は３００μｌで一定とし、ピストンの位置を調節することで、底面積を調節した。使用した１ｍｌシリンジの内径は６ｍｍである。シリンジの先端から１０ｍｍの位置にピストンの先端（ゴムの部分）を配置して、シリンジを横に倒した場合、底面積は、本明細書の定義に従い、（６×３．１４÷２）×１０＝９４．２ｍｍ^２＝０．９４２ｃｍ^２となる。このときの空気の量は約０μｌである。

シリンジの先端から２０ｍｍの位置にピストンの先端（ゴムの部分）を配置して、シリンジを横に倒した場合、底面積は、本明細書の定義に従い、（６×３．１４÷２）×２０＝１８８．４ｍｍ^２＝１．８８４ｃｍ^２となる。このときの空気の量は約３００μｌである。

シリンジの先端から２０ｍｍの位置にピストンの先端（ゴムの部分）を配置して、シリンジを縦にした場合、底面積は、６×６×３．１４≒２８ｍｍ^２≒約０．２８ｃｍ^２となる。

（結果）
１ｍｌのシリンジに培養した角膜内皮細胞を５０万個を３００μｌの細胞保存液に懸濁して、保存した（図５）。シリンジに角膜内皮細胞を７２時間保存したところ、細胞のシリンジの側面への沈殿が観察された（図５下左）。軽くタッピングしたところ細胞がシリンジの側面より浮き上がっており、細胞が保存中にシリンジ内面に接着していないことを示す（図５下中）。７２時間保存した後に、軽くタッピングし、シリンジを細胞保存液にて優しく洗浄したところ、細胞のシリンジの側面への接着を認めなかった（図５下右）。

シリンジ内で７２時間保存後の生存細胞率は、保存開始時点の全細胞を１００％とすると（生細胞率：９０．３％、死細胞率：９．７％）に対して、生細胞率：７０．９％、死細胞率：８．２％となり約９０％の細胞が生存しており、保存開始時点と同等であった（図６）。一方、シリンジ内に細胞を保存するときに、空気を入れてシリンジを横にすることで、シリンジ内の底面積を約２ｃｍ^２としたときに細胞の回収数が高かったが、空気を含まずシリンジ内の底面積を約１ｃｍ^２としたときに細胞の回収数が半分程度に低下した。同様にシリンジ内に空気を入れた状態でシリンジを立てると底面積は約０．２８ｃｍ^２となるが、細胞の回収数が著しく低下した（図７）。これらのことから、シリンジ内での細胞保存においても底面積が約２ｃｍ^２程度であることが細胞の回収率、生存率を高くすることが示された。

（実施例４：細胞保存における至適温度の詳細な検討）
（材料および方法）
（角膜内皮細胞の培養）
疾患を患う４０歳以上のドナーから５個のヒトドナー角膜を得た。すべての角膜は、使用前に１４日以内の間４℃でＯｐｔｉｓｏｌ（ＣｈｉｒｏｎＶｉｓｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）において保存された。ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）は、以下に従って培養された。簡潔には、角膜内皮を含むデスメ膜をドナー角膜から機械的に剥離し、１２時間３７℃で１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においてインキュベートすることにより消化した。ＨＣＥＣをＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄後、ラミニンＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１；ニッピ株式会社、東京）でコーティングされた４８ウェルプレートの一つのウェルに播種した。

ＨＣＥＣを、Ｃａ^２＋やＭｇ^２＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）で１５分間３７℃でトリプシン処理した。細胞を培養プレートから回収した後、２回洗浄し、２８０Ｇで３分間遠心分離し、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉに懸濁した。ＨＣＥＣを上述の無血清培養液（株式会社細胞科学研究所（宮城）により提供された細胞療法培養液）において１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で２４−ウェルプレート（非処理）（ＡＧＣテクノグラス株式会社、静岡）に７２時間細胞懸濁の形態で保存した。ＨＣＥＣ保存のための至適温度を検討するために１２℃、１７℃、２２℃、２７℃、３２℃、３５℃、３７℃、３９℃、４２℃の９つの温度条件で保存した。

ＨＣＥＣを７２時間の保存後、細胞培養プレートから緩やかにピペッティングで回収し、３分間２８０Ｇで遠心分離し、１．０×１０^６個／６００μｌの細胞密度で細胞療法用培養液に再懸濁した。死細胞を０．５％トリパンブルー染色液（ナカライテスク、京都）で染色することにより細胞生存率を算出した。対照として、ＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）でのトリプシン化により回収したＨＣＥＣを３分間２８０Ｇで遠心分離し、細胞療法用培養液において再懸濁した。その後、細胞懸濁の態様での保存することなく細胞生存率を即座に評価した。

（結果）
（細胞懸濁形態保存における温度条件の細胞生存率に対する影響）
ＨＣＥＣを７２時間ＣＴＶにおいて細胞懸濁形態で１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で保存し、細胞を緩やかなピペッティングで採取し、細胞生存率を評価した（図９）。

９つの温度条件において３７℃での保存が最も生細胞率が高く、７２時間保存後の生存細胞率は、保存開始時点の全細胞を１００％とすると、生細胞率：９２．４％、死細胞率：７．６％に対して、生細胞率：９５．４％、死細胞率：４．９％となり、保存開始時点と同等の細胞生存率を示した。また３７℃より低い温度条件下では、温度の低下に比例して生細胞率も低下し、１２℃、１７℃、２２℃での保存においては保存開始時点の生細胞率と比べて有意に低い生細胞率を示したが、３０％以上の生存率を維持した。３９℃、４２℃の条件でも、温度の上昇に比例して生細胞率が低下し、保存開始時点の生細胞率と比べて有意に低い生細胞率を示したが、３０％以上の生存率を維持した。このように、３０％以上の生存率を維持することができる１２℃〜４２℃の範囲で保存することが好ましく、６０％以上の生存率を維持することができる１７℃〜３９℃で保存することがより好ましく、８０％以上の生存率を維持することができる２７℃〜３７℃で保存することがさらに好ましく、対照と同等の９０％以上の生存率を維持することができる３７℃で保存することが最も好ましい。

（実施例５：ガラス製バイアル瓶を用いた細胞保存の検討）
（材料および方法）
ＨＣＥＣを７２時間ＣＴＶにおいて細胞懸濁形態で１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度でガラス製バイアル瓶に保存した。以下の３つのガラス製バイアル瓶を使用した：通常のガラス表面であるバイアル瓶（株式会社マルエム、大阪、０５０１−０２）、および低吸着処理（ＩＲＡＳ処理）のなされたバイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１０２４）、シリカによる表面処理（ＩＲＡＳ処理およびＳｉＯ_２コーティング）のなされたバイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１１０２）（図１０）。これらのバイアル瓶の底面積は、約２ｃｍ^２である。

７２時間保存後、バイアル瓶から緩やかにピペッティングで回収し、３分間２８０Ｇで遠心分離し、１．０×１０^６個／６００μｌの細胞密度で細胞療法用培養液に再懸濁した。死細胞を０．５％トリパンブルー染色液（ナカライテスク、京都）で染色することにより細胞生存率を算出した。対照として、ＴｒｙｐＬＥ^（商標）ＳｅｌｅｃｔＥｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）でのトリプシン化により回収したＨＣＥＣを３分間２８０Ｇで遠心分離し、細胞療法用培養液において再懸濁した。その後、細胞懸濁の態様での保存することなく細胞生存率を即座に評価した。

（結果）
ＨＣＥＣを７２時間ＣＴＶにおいて細胞懸濁形態で１．０×１０^６個／３００μｌの細胞密度で保存し、細胞を緩やかなピペッティングで採取し、細胞生存率を評価した（図１１）。

バイアル瓶（株式会社マルエム、大阪、０５０１-０２）においては、バイアル瓶への細胞の接着が見られた。一方で、バイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、１８１０２４）、バイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、１８１１０２）においては、バイアル瓶への細胞の接着はなく、緩やかなピペッティングで回収が可能であった。保存開始時点の全細胞を１００％とすると、コントロールでは生細胞率：９２．４％、死細胞率：７．６％に対して、バイアル瓶（株式会社マルエム、大阪、０５０１−０２）に保存した細胞は、生細胞率：３８．９％、死細胞率：７．４％となり、保存開始時点の生細胞数と比べて有意に低い生細胞数を示した。バイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、１８１０２４）に保存した細胞は、生細胞率：９０．７％、死細胞率：７．８％、バイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、１８１１０２）に保存した細胞は、生細胞率：８４．６％、死細胞率：８．４％となり、保存開始時点と同等の細胞生存率を示した。このように、いずれのガラス製バイアル瓶も、３０％の細胞生存率を示したが、低接着の表面処理がされているものがより高い細胞生存率を示した。

（実施例６：細胞含有製品の製造例および運搬例）
ドナー角膜より培養した角膜内皮細胞または、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経堤細胞などから分化させた角膜内皮細胞または角膜内皮細胞と同様の機能を有する細胞を、酵素処理により培養皿より回収する。回収した細胞を、３００μｌの細胞注入用溶液に対して、例えば約５０万個から約１００万個の割合で懸濁し、約５００μｌから約８００μｌの細胞懸濁液を、バイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１０２４）またはバイアル瓶（岩田硝子工業株式会社、大阪、ｌｏｔ：１８１１０２）に保存する。バイアル瓶はゴム栓およびアルミニウムにて密閉する（一次容器）。バイアル瓶はさらに密封性、防漏性が担保された二次容器に収納する。二次容器は、３７℃に維持されたインキュベーターで保存する。二次容器を外部衝撃を吸収する外装容器に収納し、３７℃に維持された状態で医療機関に輸送する。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

角膜内皮細胞の保存方法が提供される。本発明によれば、角膜内皮細胞を高い細胞生存率で保存することが可能である。このようにして保存された角膜内皮細胞は、正常な角膜内皮細胞の機能を有しており、また、角膜内皮疾患等の治療用細胞として使用可能であるため、製薬等の分野において利用可能である。

Claims

角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を細胞注入療法に使用され得る細胞懸濁状態で保存する方法であって、底面積が少なくとも約０．７ｃｍ^２の容器に該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞を保存する工程を含み、該細胞の保存のための液体の液面の高さが約０．７５ｍｍ以上であり、該角膜内皮細胞および／または角膜内皮様細胞が、約２４〜７２時間保存される、方法。
前記容器の底面積が、約０．７〜約４ｃｍ^２である、請求項１に記載の方法。
前記容器の底面積が、約１．５〜約３ｃｍ^２である、請求項１または２に記載の方法。
前記容器の底面積が、約１．８〜約２ｃｍ^２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記容器は、接着培養のための表面処理がされていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記容器は、低接着表面容器または表面非処理容器である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記容器は、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはガラスでできている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記容器は、２４ウェルプレート、バイアル瓶、シリンジ、ディッシュからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞の保存が、約１２℃〜約４２℃の温度で行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞の保存が、約１７℃〜約３９℃の温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞の保存が、約２７℃〜約３７℃の温度で行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞の保存が、約３７℃の温度で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。