ES2847755T3 - Fármaco terapéutico que comprende un inhibidor de la señal de TGF-beta para enfermedades relacionadas con la muerte celular del retículo endoplásmico en el endotelio corneal - Google Patents

Abstract

Un fármaco terapéutico o profiláctico para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) inducido por TGF-β en un endotelio corneal, que comprende un inhibidor de la señal de TGF-β, en el que la enfermedad, el trastorno o la afección está relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Description

DESCRIPCIÓN

Fármaco terapéutico que comprende un inhibidor de la señal de TGF-p para enfermedades relacionadas con la muerte celular del retículo endoplásmico en el endotelio corneal

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un agente para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés relacionado con el retículo endoplásmico (RE) inducido por TGFp.

[Técnica antecedente]

La información visual se reconoce cuando la luz transmitida a la córnea, que es un tejido transparente en la parte más frontal de un globo ocular, llega a la retina y excita las células nerviosas de la retina, y una señal eléctrica generada se transmite a través del nervio óptico a la corteza visual del cerebro. Para lograr una buena visión, es necesario que la córnea sea transparente. La transparencia de la córnea se mantiene manteniendo un contenido de agua constante con funciones de bombeo y barrera de las células endoteliales corneales.

Las células endoteliales corneales humanas están presentes a una densidad de aproximadamente 3000 células por 1 mm2 al nacer. Sin embargo, una vez dañadas, las células endoteliales corneales humanas tienen una capacidad muy limitada para regenerarse.

Se está realizando una investigación sobre las enfermedades de las células endoteliales de la córnea. La literatura no patente 1 es un documento sobre la investigación básica sobre la relación entre las células endoteliales de la córnea humana y el estrés oxidativo. La literatura no patente 2 es un documento sobre la investigación básica acerca de la relación entre las células endoteliales corneales humanas y el estrés del retículo endoplásmico. La literatura no patente 3 es un documento sobre la investigación básica sobre la relación entre las células endoteliales corneales humanas y el estrés oxidativo.

[Lista de citas]

[Literatura no patente]

[NPL 1] Onouchi H. et al., Biomedical Gerontology: Vol.34, No.2, 51 (2010)

[NPL 2] William L. Corwin et al., Cryobiology: Vol.63, No,1, 46-55 (2011)

[NPL 3] Ula V. Jurkunas et al., Am J Pathol: Vol,177, No,5, 2278-2289 (2010)

Elhalis et al., Ocul. Surf. 2010, vol. 8, páginas 173-184 divulga la asociación de varios genes, así como de diversas áreas de loci cromosómicos con distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD). También revela diferentes categorías de la enfermedad y un sistema de clasificación para ella.

Kim et al., Br. J. Ophthalmol. 2013, vol. 97, páginas 1068-1073 divulga el uso de litio para suprimir la muerte de células endoteliales corneales bovinas que ha sido inducida por estrés ER inducido por tapsigargina.

[Resumen de la invención]

[Solución al problema]

Se requieren diversas consideraciones para mantener un endotelio corneal en excelentes condiciones. Los inventores se han centrado en la relación entre el estrés del retículo endoplásmico (RE) y las células endoteliales de la córnea, entre otros, para descubrir que la condición estresada se puede mejorar inhibiendo una vía del factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) y para descubrir una técnica que pueda tratar o prevenir trastornos relacionados con el estrés ER para completar la presente invención. Por tanto, la presente invención proporciona las siguientes invenciones.

(1) Un fármaco terapéutico o profiláctico para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) en un endotelio corneal, que comprende un inhibidor de la señal de TGFp donde la enfermedad, trastorno o afección es un trastorno relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(2) El fármaco terapéutico o profiláctico del punto (1), en el que el fármaco terapéutico o profiláctico suprime la enfermedad, trastorno o afección que comprende un trastorno de una célula endotelial corneal en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(3) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los puntos (1)-(2), en el que la enfermedad, trastorno o afección comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en disminución de la densidad endotelial corneal, formación de guttae, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de la córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, molestias oculares, contraste disminuido, deslumbramiento y edema del estroma corneal.

(4) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los puntos (1)-(3), en el que el inhibidor de la señal de TGFp comprende al menos uno de 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida, BMP-7, un anticuerpo anti-TGF-p, un anticuerpo anti-receptor de TGF-p, un ARNip de TGF-p, un ARNip de un receptor deTGF-p, un ARNsh de TGF-p, un ARNsh de un receptor de TGF-p, un aptámero de TGF-p, un aptámero de un receptor de TGF-p, un oligonucleótido antisentido de TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida, 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, 6-(4-(piperidin-1 -il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina, 2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino] pteridina, 4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina, A-83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida), una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

(5) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los puntos (1)-(4), en el que el inhibidor de la señal de TGF-p comprende 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

(6) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los puntos (1)-(5), en el que el endotelio corneal es de un primate.

(7) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los puntos (1)-(6), en el que el endotelio corneal es de un ser humano.

(8) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los artículos (1)-(7), que comprende un ingrediente farmacéutico adicional.

(9) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (1)-(8), que son colirios.

(10) Una sustancia inhibidora de la señal de TGFp para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de un trastorno asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) en un endotelio corneal, en el que la enfermedad, trastorno o afección está relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

10A) La sustancia inhibidora de la señal de TGFp del artículo (10), en la que la sustancia inhibidora de la señal de TGFp tiene una característica del inhibidor de cualquiera de los ítems (1 )-(9).

También se divulga, pero no forma parte de la invención:

(12) Un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) en un endotelio corneal en un sujeto, en el que el procedimiento comprende una etapa de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de señal de TGFp al sujeto.

(12A) El procedimiento del elemento (12) que tiene la característica de cualquiera de los ítems (1 )-(10).

También se divulgan los ítems A1-A16A, como sigue:

(A1) Un fármaco terapéutico o profiláctico para una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) en un endotelio corneal, que comprende un inhibidor de la señal de TGF-p.

(A2) El fármaco terapéutico o profiláctico del punto (A1), en el que la enfermedad, trastorno o afección está asociado con insuficiencia mitocondrial.

(A3) El fármaco terapéutico o profiláctico del punto (A1) o (A2), en el que la enfermedad, trastorno o afección está asociado con apoptosis debido a insuficiencia mitocondrial.

(A4) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A3), en el que la enfermedad, trastorno o afección está relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(A5) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A4), en el que el fármaco terapéutico o profiláctico suprime la enfermedad, trastorno o afección que comprende un trastorno de una célula endotelial corneal en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(A6) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A5), en el que el fármaco terapéutico o profiláctico suprime al menos una de las enfermedades, trastornos o afecciones seleccionados del grupo que consiste en una disminución de la densidad endotelial corneal, formación de guttae, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de una córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, malestar ocular, disminución del contraste, deslumbramiento y edema del estroma corneal.

(A7) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A6), en el que el inhibidor de la señal de TGF-p comprende al menos uno de 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida, b MP-7, un anticuerpo anti-TGF-p, un anticuerpo anti-receptor de TGF-p, un ARNip de TGF-p, un ARNip de un receptor de TGF-p, un ARNsh de TGF-p, un ARNsh de un receptor de TGF-p, un aptámero de TGF-p, un aptámero de un receptor de TGF-p, un oligonucleótido antisentido de TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b] piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1 -carbotioamida, 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il-1,5-naftiridina, 6-(4-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il) pirazolo[1,5-a]pirimidina, 2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina, 4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina, A-83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida), una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

(A8) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A7), en el que el inhibidor de la señal de TGF-p comprende 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

(A9) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A8), que comprende además un agente terapéutico para el fallo mitocondrial inducido por estrés ER.

(A10) El fármaco terapéutico o profiláctico del punto (A9), en el que el agente terapéutico para la insuficiencia mitocondrial inducida por estrés ER se selecciona del grupo que consiste en el inductor X de BiP (BIX), ácido 4-fenil butírico (PBA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) y teprenona (también vendida como selbex).

(A11) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1 )-(A10), en el que el endotelio corneal es de un primate.

(A12) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A11), en el que el endotelio corneal es de un ser humano.

(A13) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A12), que comprende un ingrediente farmacéutico adicional.

A14) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems (A1)-(A13), que son colirios.

(A14A) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems descritos anteriormente, en el que la enfermedad, trastorno o afección se acompaña de una mayor expresión de un agresoma.

(A14B) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems descritos anteriormente, en el que la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección asociado con un agresoma.

(A14C) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems descritos anteriormente, en el que la enfermedad, trastorno o afección se acompaña de un plegamiento anormal de una proteína.

(A14D) El fármaco terapéutico o profiláctico de cualquiera de los ítems descritos anteriormente, en el que la enfermedad, trastorno o afección se debe al plegamiento anormal de una proteína.

(A15) Sustancia inhibidora de la señal de TGF-p para tratar o prevenir un trastorno asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE).

(A15A) Sustancia inhibidora de la señal de TGFp del elemento (A15), en la que la sustancia inhibidora de la señal de TGFp tiene una característica del inhibidor de cualquiera de los ítems (A1)-(A14) y (A14A)-(A14D).

(A16) Un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno asociado con el estrés asociado al retículo endoplásmico (RE) en un sujeto, en el que el procedimiento comprende un paso de administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la señal de TGF-p al sujeto.

(A16A) El procedimiento del elemento (A16) que tiene la característica de cualquiera de los ítems (A1)-(A14) y (A14A)-(A14D).

El estrés del retículo endoplásmico es el estrés en las células debido a la acumulación de proteínas que no se plegaron en una conformación normal en las células. El estrés del retículo endoplásmico no se induce en una matriz extracelular normal. En este sentido, fue imposible predecir a partir del conocimiento hasta este punto, como la información relacionada con matrices extracelulares, que el alivio de un trastorno celular debido al estrés del retículo endoplásmico en la distrofia corneal endotelial de Fuchs de la presente invención puede ser proporcionado al suprimir una señal de TGFp.

Se pretende que la presente invención sea capaz de proporcionar una o más de las características mencionadas anteriormente en combinaciones adicionales además de las combinaciones mostradas expresamente. Los expertos en la técnica reconocen otras realizaciones y ventajas de la presente invención al leer y comprender la siguiente Descripción Detallada según sea necesario.

[Efectos ventajosos de la invención]

La presente invención proporciona un medicamento que puede tratar o prevenir una enfermedad asociada al estrés del retículo endoplásmico (RE), que no contaba con un procedimiento de tratamiento distinto al trasplante de córnea, donde la técnica también puede materializarse como colirio o similares.

[Breve descripción de los dibujos]

[Figura 1] La Figura 1 muestra un esquema hipotético de patología de una enfermedad asociada con el estrés del retículo endoplásmico (por ejemplo, distrofia corneal endotelial de Fuchs) centrado en la relación entre el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis basada en la presente invención.

[Figura 2] La Figura 2 muestra una anomalía morfológica en el retículo endoplásmico y las mitocondrias en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. El lado izquierdo muestra células endoteliales corneales humanas inmovilizadas (iHCEC) y el lado derecho muestra células inmovilizadas con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD). Tanto la fila superior como la inferior muestran imágenes de un microscopio electrónico de transmisión. * indica una mitocondria, ** indica retículo endoplásmico e *** indica matriz extracelular.

[Figura 3] La Figura 3 es el resultado de la inmunotinción que muestra que la tensión del retículo endoplásmico sobre las células endoteliales corneales se exacerba en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Se muestra que la expresión de proteínas asociadas al estrés del retículo endoplásmico como GRP78 y GADD153 es prominente en iFECD. En la fila superior, la fluorescencia verde de GRP78 se observa escasamente en iHCEC del panel izquierdo, mientras que la fluorescencia verde se observa de manera prominente en iFECD del panel derecho. Por otro lado, en la fila inferior, la fluorescencia verde de GADD153 apenas se observa en el panel izquierdo, mientras que la fluorescencia verde se observa de manera prominente en el panel derecho.

[Figura 4] La Figura 4 es un diagrama que muestra que TGF-p promueve el estrés del RE en las células endoteliales de la córnea. El panel superior muestra iHCEC y el panel inferior muestra iFECD. Cada panel muestra, desde el lado izquierdo, un control (no estimulado) y estimulaciones con TGF-p o TG. Cada panel muestra, desde arriba, GRP78, IRE1 y GAPDH. Se muestra que los niveles de expresión de la GRP78 chaperona y el sensor de estrés IRE1 son inducidos por TGFp y su nivel de expresión es elevado, particularmente en iFECD. TG se refiere a tapsigargina, que se utilizó como control positivo del estrés ER.

[Figura 5] La Figura 5 es un resultado que muestra que las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs tienen un nivel más alto de estrés del retículo endoplásmico en relación con el control debido a TGF beta (las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs son muy sensibles a estrés del retículo endoplásmico). El lado izquierdo muestra iHCEC y el lado derecho muestra iFECD. A cada lado, la parte superior izquierda muestra el resultado de un control y la parte superior derecha muestra el resultado de agregar SB431542 al control, la parte central izquierda muestra el resultado de una estimulación de TGF-p2 y la parte central derecha muestra el resultado de agregar SB431542 a la estimulación de TGF-p2. La parte inferior izquierda muestra el resultado de una estimulación TG y la parte inferior derecha muestra el resultado de agregar SB431542 a la estimulación TG.

[Figura 6] La Figura 6 es un resultado que muestra que las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs tienen un nivel más alto de estrés del retículo endoplásmico en relación con el control debido a TGFp (las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs son altamente sensibles a estrés del retículo). Este es un ejemplo representativo de un resultado que evalúa la apoptosis en las células de la Figura 5 mediante citometría de flujo. El lado izquierdo muestra iHCEC y el lado derecho muestra iFECD. A cada lado, la parte superior izquierda muestra el resultado de un control y la parte superior derecha muestra el resultado de agregar SB431542 al control. La parte inferior izquierda muestra el resultado de una estimulación de TGF-p2 y la parte inferior derecha muestra el resultado de agregar SB431542 a la estimulación de TGF-p2.

[Figura 7] La Figura 7 es un gráfico que muestra que SB431542 suprime la apoptosis en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. El eje y indica el porcentaje de células positivas a anexina V. El eje x indica, desde la izquierda, el control, SB431542, TGFp2 y TGFp SB431542. El blanco indica iHCEC y el negro indica iFECD. * indica significancia estadística (p <0,01). La barra muestra una desviación estándar.

[Figura 8] La Figura 8 muestra el resultado de un experimento similar a la Figura 7 con A-83-01 y un inhibidor de ALK5. El eje y indica el porcentaje de células positivas a anexina V. El eje x indica, desde la izquierda, el control, TGFp2, TGFp2 SB431542, TGFp2 A-83-01 e inhibidor de TGFp2 ALK5. El blanco indica iHCEC y el negro indica iFECD. * indica significancia estadística (p <0,01). La barra muestra una desviación estándar.

[Figura 9] La Figura 9 es un diagrama que muestra que TGF-p promueve el estrés del RE en las células endoteliales de la córnea. Se muestra que el estrés del RE es inducido por TGF-p en iFECD. Los resultados del inmunoprecipitación Western para diferentes momentos después del tratamiento con TGF-p2 se muestran en 2 columnas a la vez (en cada par de 2 columnas, la columna de la izquierda muestra iHCEC y la columna de la derecha muestra iFECD), indicando, desde la izquierda, 0 horas, 3 horas y 6 horas después del tratamiento. Desde la fila superior, se muestran PERK, PERK fosforilado, ATF6, GRP78, CHOP y GAPDH. PERK y ATF6 indican sensores de estrés ER, GRP78 indica una chaperona molecular responsable de la integridad del ER y CHOP indica un factor inductor de apoptosis mediado por estrés ER. GAPDH es un control. Se muestra que TGF-p promueve la fosforilación de un sensor de estrés ER PERK y promueve la expresión de ATF6. Además, aumenta la expresión de la GRP78 chaperona. Además, se muestra que la expresión de CHOP aumenta y la apoptosis es inducida por estrés ER.

[Figura 10] La Figura 10 es una imagen de tinción con tinte fluorescente JC-1 (yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraetilbencimidazolilcarbocianina). La despolarización mitocondrial se muestra en iFECD. La columna de la izquierda muestra iHCEC y la columna de la derecha muestra iFECD. La fila superior muestra tinción JC1 (teñida en verde) y la fila inferior muestra tinción JC1 (teñida en rojo). El verde indica mitocondrias y el rojo indica potencial de membrana mitocondrial. El azul indica DAPI (tiñe un núcleo). Se observa una disminución del potencial de membrana mitocondrial en iFECD en relación con iHCEC. Para la tinción verde que indica mitocondrias (sección superior), se observa fluorescencia verde que indica mitocondrias en los paneles izquierdo y derecho. Para la tinción roja que indica el potencial de la membrana mitocondrial (sección inferior), la fluorescencia roja se observa de manera prominente en el panel izquierdo, pero apenas se observa en el panel derecho.

[Figura 11] La Figura 11 muestra el potencial de membrana mitocondrial medido con MitoTracker® mediante citometría de flujo. La despolarización mitocondrial se muestra en iFECD. El panel de la izquierda muestra la intensidad de fluorescencia de una membrana mitocondrial. El panel derecho muestra iHCEC en el gráfico de la izquierda e iFECD en el gráfico de la derecha. El panel de la izquierda muestra el porcentaje de células despolarizadas. La columna de la izquierda muestra iHCEC y la columna de la derecha muestra iFECD. El potencial de membrana mitocondrial se reduce significativamente en iFECD en relación con iHCEC. ** indica significancia estadística (p <0,05). El color del panel izquierdo (verde y rojo) indica células despolarizadas con potencial de membrana disminuido con verde y células no despolarizadas sin potencial de membrana disminuido con rojo.

[Figura 12] La Figura 12 muestra la fuga de citocromo c de las mitocondrias al citoplasma. La fuga de citocromo c de las mitocondrias se mide aquí mediante inmunotransferencia Western. Se observa más fuga de citocromo c en iFECD que en iHCEC. La estaurosporina se usa como control. Las dos columnas de la izquierda muestran iHCEC (el lado izquierdo indica que no hay estaurosporina y el lado derecho indica la presencia de estaurosporina) y las dos columnas de la derecha muestran iFECD (el lado izquierdo indica que no hay estaurosporina y el lado derecho indica la presencia de estaurosporina). Desde la fila superior, se muestran las tinciones del citocromo c, GAPDH y VDAC. GAPDH es un marcador de citosol y VDAC es un marcador de mitocondrias.

[Figura 13] La Figura 13 muestra la participación del fallo mitocondrial en la apoptosis. En este diagrama, se induce un trastorno mitocondrial con estaurosporina y las proteínas asociadas a la apoptosis se miden mediante inmunotransferencia Western para determinar si un trastorno mitocondrial induce la apoptosis. En la columna de la izquierda, se muestra el control y 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas y 4 horas después de una estimulación con estaurosporina. En la fila superior, se muestran los resultados de cada caspasa 9, caspasa 3, PARP y GADPH (control). Se puede ver que la caspasa 9, que se sabe que se activa por un trastorno mitocondrial, está activada y también se observa la activación de la caspasa 3 y PARP, lo que demuestra que la apoptosis es inducida por un trastorno mitocondrial.

[Figura 14] La Figura 14 es un diagrama que muestra que la distrofia corneal endotelial de Fuchs tiene un alto nivel de proteínas desnaturalizadas y aumenta con la estimulación de TGF-p. El panel de la izquierda muestra imágenes de células de un control (sin estimulación de TGFp: fila superior) y con estimulación de TGF-p (10 ng/ml; fila inferior) (aumento de 40 veces). Cada uno de los gráficos de la parte superior derecha muestra un resultado de un citómetro de flujo. Desde la izquierda, se muestran la comparación de iHCEC (negro) con iFECD (rojo), la comparación de iHCEC (negro) con iHCEC TGFp (rojo) y la comparación de iFECD (negro) con iFECD TGFp (rojo). El eje y es el recuento de células y el eje x muestra la intensidad de fluorescencia de los agresomas. En el gráfico de la izquierda, se observa iHCEC (negro) desplazado hacia la izquierda como un todo en relación con iFECD (rojo). En el gráfico central, se observa que iHCEC (negro) casi se superpone con iHCEC TGFp (rojo). En el gráfico de la derecha, se observa iFECD (negro) desplazado hacia la parte superior izquierda en relación con iFECD TGFp (rojo). La sección inferior derecha compara la intensidad de fluorescencia de los agresomas para el control con iHCEC e iFECD estimuladas con TGFp. La barra blanca es iHCEC y la barra negra es iFECD. * indica p <0,05.

[Descripción de realizaciones]

La presente invención es descrita a continuación. A lo largo de toda la memoria descriptiva, debe entenderse que una expresión en singular engloba el concepto de la misma en forma plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Por tanto, los artículos singulares (por ejemplo, "un”, “una”, “el/la" y similares en el caso del español) también deben entenderse abarcando el concepto de los mismos en forma plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, los términos usados en este documento deben entenderse como usados en el significado que se usa comúnmente en la técnica, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por tanto, a menos que se defina de otro modo, todas las terminologías y términos científico-técnicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que los términos comúnmente entendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. En caso de contradicción, la presente especificación (incluidas las definiciones) tiene prioridad.

(Definición)

Como se usa en este documento, “iFECD” (distrofia corneal endotelial de Fuchs inmovilizada) es una abreviatura de células inmovilizadas con distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Como se usa en este documento, "HCEC" es una abreviatura de células endoteliales corneales humanas. Además, "iHCEC" es una abreviatura de células endoteliales corneales humanas inmovilizadas.

Como se usa en este documento, "factor de crecimiento transformante-p (también denotado con la abreviatura TGF-p)" se usa con el mismo significado que los usados en la técnica. Es una citoquina homodímera multifuncional con un peso molecular de 25 kD que exhibe una variedad de actividad biológica, como ser responsable de la patogénesis de diversas enfermedades escleróticas, artritis reumatoide y vitreorretinopatía proliferativa, estando profundamente involucrada en la caída del cabello, suprimiendo el funcionamiento de las células inmunocompetentes mientras se suprime la sobreproducción de proteasa para prevenir la degradación del tejido pulmonar que resulta en enfisema pulmonar y suprime el crecimiento de células cancerosas. En los seres humanos, hay tres isoformas, TGF-p1 a p3. El TGF-p se produce como una forma latente inactiva con un peso molecular de aproximadamente 300 kD que no puede unirse a un receptor. La acción del mismo se ejerce al activarse sobre una superficie diana o sus alrededores para convertirse en una forma activa que pueda unirse a un receptor.

Aunque sin pretender limitarse a teoría alguna, se entiende que la acción del TGF-p en una célula diana se transmite por un canal de fosforilación de una serie de proteínas encargadas de transmitir información denominada Smad. Primero, cuando el TGF-p activado se une a un receptor de TGF-p tipo II en la superficie de una célula diana, se forma un complejo receptor, que consta de dos moléculas de receptores de tipo II y dos moléculas de receptores de TGF-p de tipo I, y los receptores de tipo II fosforilan los receptores de tipo I. Se entiende que cuando los receptores fosforilados de tipo I fosforilan entonces Smad2 o Smad3, Smad2 o Smad3 forman un complejo con Smad4, que migra a un núcleo y se une a una secuencia diana llamada caja CAGA presente en una región promotora del gen diana para inducir la transcripción y expresión de un gen diana con un coactivador.

Una vía de señalización del factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) puede modular muchas actividades celulares, como el crecimiento y la diferenciación celular, la detención del crecimiento, la apoptosis y la transición epitelial mesenquimatosa (EMT), modulando el gen diana. Los miembros de la familia TGF-p, incluido el propio TGF-p (por ejemplo, TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3), la activina y las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son potentes moduladores del crecimiento celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis.

El TGF-p es una proteína de aproximadamente 24 kD producida por muchas células que incluyen células B, células T y macrófagos activados y por muchos otros tipos de células. Los efectos del TGF-p en el sistema inmunológico incluyen la inducción del receptor de IL-2, la inhibición del crecimiento de timocitos inducido por IL-1 y el bloqueo de la activación de macrófagos inducida por IFN-y. Se considera que el TGF-p está implicado en diversas afecciones patológicas (Border et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:1) y se ha demostrado minuciosamente que funciona como sustancia supresora de tumores o como promotor de tumores.

La señalización de TGF-p está mediada por dos receptores de superficie celular de serina/treonina quinasa TGF-pRII y ALK5. La señalización de TGF-p se inicia mediante la dimerización del receptor inducida por ligando que permite al TGF-pRII fosforilar un receptor ALK5. La fosforilación activa la actividad de la quinasa ALK5, y la ALK5 activada fosforila una proteína Smad efectora corriente abajo (homóloga de vertebrados de la proteína MAD o "Madres contra DPP (decapentapléjico)", Smad2 o Smad 3. Un complejo p-Smad2/3 con Smad4 entra a un núcleo y activa la transcripción de un gen diana.

Smad3 es un miembro del subgrupo R-Smad (Smad activado por receptor) de Smad y un mediador directo de la activación de la transcripción por un receptor TGF-p. Una estimulación de TGF-p da como resultado la fosforilación y activación de Smad2 y Smad3, que forman un complejo con Smad4 ("Smad común" o "co-Smad" en vertebrados). Esto se acumula con el núcleo y modula la transcripción de un gen diana. R-Smad se localiza en un citoplasma y forma un complejo con co-Smad en la fosforilación inducida por ligando por un receptor de TGF-p, migra al núcleo, donde modula la expresión génica asociada con un factor de transcripción cooperativo y cromatina. Smad6 y Smad7 son cada uno Smad inhibidor ("I-Smad"), es decir, son inducidos transcripcionalmente por TGF-p y funcionan como un inhibidor de señalización de TGF-p (Feng et al. (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 659). Smad6/7 obstruye la activación de R-Smad mediada por receptor para ejercer su efecto inhibidor; y están asociados con un receptor de tipo I, que obstruye competitivamente la movilización y fosforilación de R-Smad. Se sabe que Smad6 y Smad7 reponen la ubiquitina ligasa E3, que induce la ubiquitinación y degradación de las proteínas que interactúan con Smad6/7.

En una realización, la enfermedad, trastorno o afección al que se dirige la presente invención se acompaña de una mayor expresión de un agresoma. Alternativamente, la enfermedad, trastorno o afección al que se dirige la presente invención es una enfermedad, trastorno o afección asociado con un agresoma.

En otra realización, la enfermedad, trastorno o afección al que se dirige la presente invención se acompaña de un plegamiento anormal de una proteína. Alternativamente, la enfermedad, trastorno o afección al que se dirige la presente invención se debe al plegamiento anormal de una proteína.

En células de mamíferos, se sabe que las proteínas agregadas debido a que están desplegadas, mal plegadas, anomalías en la degradación de proteínas o similares (también denominada proteína plegada incompletamente o proteína desnaturalizada (proteína desplegada)) son ubiquitinadas y se acumulan cerca del centrosoma por un motor dineína que se mueve en los microtúbulos para formar un cuerpo de inclusión llamado agresoma. En general, los agresomas se forman por choque térmico, infección viral, estrés oxidativo o similares. Se conocen algunas enfermedades en humanos que involucran cuerpos de inclusión en una célula, como los cuerpos de Lewy observados en las células nerviosas en la enfermedad de Parkinson, los cuerpos de Mallory observados en las células hepáticas en las enfermedades hepáticas alcohólicas y los cuerpos vidriosos observados en los astrocitos en la esclerosis lateral amiotrófica.

Las rutas de señalización de TGF-p tienen además otras rutas que usan la transmisión de BMP-7 o similares, que pasan por ALK-1/2/3/6 a través de Smad1/5/8 para expresar una función. Para las vías de señalización de TGF-p, véase J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91; Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2 (1):e3; Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J. 18, 816-827 (2004); Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010) 11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166 y similares.

Como se usa en este documento, "inhibidor de la señal del factor de crecimiento transformante (TGF)-p" se refiere a cualquier factor que inhibe la señalización del TGF. El TGF-p, cuando antagoniza, puede denominarse antagonista. Sin embargo, como se usa en la presente invención, los antagonistas de TGF-p están englobados por inhibidores de señal de TGF-p. Dado que tal inhibidor es generalmente una sustancia, una "sustancia inhibidora de la señal de TGF-p" se puede usar de manera intercambiable con "inhibidor de la señal de TGF-p". "TGF-p" también puede indicarse en el presente documento como "TGFp" con el mismo significado.

Por tanto, los inhibidores de señal de TGF-p típicos usados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de TGF-p, antagonistas del receptor de TGF-p, inhibidores de Smad3, trampas de ligandos (receptores señuelo, anticuerpos contra un ligando), oligonucleótidos antisentido, inhibidores de quinasa del receptor de TGF-p, aptámeros de péptidos, ARNip, ARNhc y similares (véase Connolly E., et al. Int. J. Biol. Sci. 2012; 8(7): 964-978 Fig 3 y similares).

Ejemplos de inhibidores de la señal de TGF-p que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)]-1H-imidazol-2-il]benzamida), BMP-7, anticuerpos anti-TGF-p, anticuerpos anti-receptor de TGF-p, ARNsi de TGF-p, ARNsi de un receptor de TGF-p, oligonucleótidos antisentido de TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoilo))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, A83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1 -carbotioamida), Inhibidores Stemolecule™ TLK (2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina), inhibidor Stemolecule™ BMP LDN-193189 (6-(4-( piperidin-1 -il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina), SD-208 (2- (5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina), LY364947 (4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina), una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo y similares. Los inhibidores de la señal de TGF-p, composiciones, medicamentos, fármacos terapéuticos y fármacos profilácticos de la presente invención pueden tener una forma neutra, forma de sal o mezclados con otro profármaco (por ejemplo, éster o similar). Como se usa en este documento, "sal" incluye, por ejemplo, sales aniónicas formadas con cualquier grupo ácido (por ejemplo, carboxilo) y sales catiónicas formadas con cualquier grupo básico (por ejemplo, amino). Las sales incluyen sales orgánicas e inorgánicas, incluidas, por ejemplo, las sales descritas en Berge et al., J. Pharm.Sci., 1977, 66, 1-19. Además, las sales incluyen, por ejemplo, sales metálicas, sales de amonio, sales con base orgánica, sales con ácido inorgánico, sales con ácido orgánico y similares. En una realización de la presente invención, "solvato" es un compuesto formado con un soluto y un disolvente. Por ejemplo, se puede hacer referencia a J. Honiget al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953) para los solvatos. Cuando el disolvente es agua, el solvato resultante es un hidrato. Preferiblemente, tal disolvente no obstruye la actividad biológica de un soluto. Ejemplos de tal disolvente preferido no están particularmente limitados, pero incluyen agua y diversos tampones. En una realización de la presente invención, ejemplos de "modificación química" incluyen la modificación mediante PEG o un derivado del mismo, la modificación con fluoresceína, la modificación con biotina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con un grupo carboxilo libre de ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico o similares, las formadas con un grupo amina libre como las de isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína o similares, y los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxido férrico o similares.

Otros inhibidores de la señal de TGF-p incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales y policlonales para una o más isoformas de TGF-p (Patente de los Estados Unidos No. 5,571,714; véase también la Publicación Internacional No. WO 97/13844 y Publicación International No. WO 00/66631), receptores de TGF-p, formas solubles de dicho receptor (por ejemplo, receptor de TGF-p soluble tipo III) o anticuerpos dirigidos a un receptor de TGF-p (Patente de los Estados Unidos No. 5,693,607, Patente de los Estados Unidos No. 6,001,969, Patente Estadounidense No. 6,010,872, Patente Estadounidense No. 6,086,867, Patente Estadounidense No. 6,201,108; Publicación Internacional No. WO 98/48024; Publicación Internacional No. WO 95/10610; Publicación Internacional No. WO 93/09228; Publicación internacional No. WO 92/00330), péptidos asociados a latencia (Publicación internacional No. WO 91/08291), TGF-p latente grande (Publicación Internacional No. WO 94/09812), fetuina (Patente de los Estados Unidos No. 5,821,227), decorina y otros proteoglicanos tales como biglicano, fibromodulina, lumican y endoglina (Publicación Internacional No. WO 91/10727; Patente de los Estados Unidos. No. 5,654,270, Patente de los Estados Unidos No. 5,705,609, Patente de los Estados Unidos No,5,726,149; Patente de los Estados Unidos No. 5,824,655; Publicación Internacional No. WO 91/04748; Patente de los Estados Unidos No. 5,830,847, Patente de los Estados Unidos No. 6,015,693; Publicación Internacional No. WO 91/10727; Publicación internacional No. WO 93/09800; y Publicación Internacional No. WO 94/10187), somatostatina (Publicación Internacional No. WO 98/08529), ácido manosa-6-fosfórico o ácido manosa-1-fosfórico (Patente de los Estados Unidos No. 5,520,926), prolactina (Publicación Internacional No. WO 97/40848), factor de crecimiento similar a la insulina II (Publicación internacional No. WO 98/17304), IP-10 (Publicación internacional No. WO 97/00691), péptidos que contienen Arg-Gly-Asp (Pfeffer, Patente de los Estados Unidos No. 5,958,411; Publicación Internacional No. WO 93/10808), extractos de plantas, hongos y bacterias (EP-A-813875; Publicación japonesa abierta al público No. 8-119984; y Matsunaga et al., Patente Estadounidense No. 5,693,610), oligonucleótidos antisentido (Patente de los Estados Unidos No. 5,683,988; Patente de los Estados Unidos No. 5,772,995; Patente de los Estados Unidos No. 5,821.234, Patente de los Estados Unidos No. 5,869,462; y Publicación Internacional No. WO 94/25588), proteínas asociadas con la señalización de TGF-p que ^{incluyen Simad y MAD (EP-A-874046; Publicación Internacional No. WO 97/31020; Publicación Internacional No.} Wo 97/38729; Publicación Internacional No. WO 98/03663; Publicación internacional No. WO 98/07735; Publicación internacional No. WO 98/07849; Publicación Internacional No. WO 98/45467; Publicación Internacional No. WO 98/53068; Publicación Internacional No. WO 98/55512; Publicación Internacional No. WO 98/56913; Publicación Internacional No. WO 98/53830; Publicación Internacional No. WO 99/50296; Patente de los Estados Unidos No.

5,834,248; Patente de los Estados Unidos No. 5,807,708; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,948,639), Ski and Sno (Vogel, 1999, Science, 286: 665; y Stroschein et al., 1999, Science, 286: 771 a 774), uno o más aptámeros oligonucleotídicos monocatenarios o un plásmido de expresión que los codifica, adecuados para inhibir o interferir con la unión de TGF-p a un receptor del mismo origen, y cualquier mutante, fragmento o derivado de una molécula identificada anteriormente, que conserva la capacidad de inhibir la actividad de TGF-p. El inhibidor de TGF-p puede ser un antagonista de TGF-p y puede ser un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado (o fragmento F(ab)² , fragmento Fv, anticuerpo monocatenario y otras formas o fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse a TGF-p, un fragmento del mismo o similar), que bloquea la unión de TGF-p a un receptor. El receptor de TGF-p y un fragmento de unión a TGF-p, y especialmente un fragmento soluble, del receptor de TGF-p son antagonistas de TGF-p que son útiles en el procedimiento de acuerdo con la presente invención. En una determinada realización, un inhibidor con una función de TGF-p preferida es un receptor de TGF-p soluble, y especialmente un receptor de TGF-p de tipo II (TGFBIIR) o un receptor de TGF-p de tipo III (TGFBIIIR o betaglicano) que incluye, por ejemplo, dominio extracelular de TGFBIIIR o TGFBIIR, preferiblemente un receptor de TGF-p soluble recombinante (rsTGFBIIR o rsTGFBIIIR). El receptor de TGF-p y un fragmento de unión a TGF-p del receptor de TGF-p, especialmente un fragmento soluble, son antagonistas de TGF-p útiles en el procedimiento de acuerdo con la presente invención. Los receptores de TGF-p y los ácidos nucleicos que los codifican son bien conocidos en la técnica. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de TGF-p de tipo 1 se describe en el número de acceso de GenBank L15436 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,538,892 (Donahoe et al.). Una secuencia de ácido nucleico de un receptor de TGF-p tipo 2 está disponible públicamente con los números de acceso de GenBank AW236001, AI35790, AI279872, AI074706 y AA808255. Una secuencia de ácido nucleico de un receptor de TGF-p tipo 3 también está disponible públicamente con los números de acceso de GenBank NM003243, AI887852, AI817295 y AI681599.

Además, otros inhibidores o antagonistas de la señal de TGF-p y procedimientos de fabricación de los mismos son bien conocidos en la técnica, además de muchos que están actualmente en desarrollo. Dado que cualquier antagonista de TGF-p eficaz puede ser útil en el procedimiento de acuerdo con la presente invención, los inhibidores o antagonistas de la señal de TGF-p específicos usados no son aquellos con características limitadas. Ejemplos de tales antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales para TGF-p de uno o más isotipos (Patente de los Estados Unidos No. 5,571,714 y Publicación Internacional No. WO 97/13844), receptores de TGF-p, un fragmento de los mismos, un derivado de los mismos y anticuerpos contra un receptor de TGF-p (Patente de los Estados Unidos No. 5,693,607, Patente de los Estados Unidos No. 6,008,011, Patente de los Estados Unidos No. 6,001,969 y Patente de los Estados Unidos No. 6,010,872, y Publicación Internacional No. WO 92/00330, Publicación Internacional No. WO 93/09228, Publicación Internacional No. WO 95/10610 y Publicación internacional No. WO 98/48024); péptidos asociados a la latencia (Publicación Internacional No. WO 91/08291), TGF-p latente grande (Publicación internacional No. WO 94/09812), fetuina (Patente de los Estados Unidos No. 5,821,227), decorina y otros proteoglicanos tales como biglicano, fibromodulina, lumican, endoglina (Patente de los Estados Unidos No. 5,583,103, Patente de los Estados Unidos No. 5,654,270, Patente de los Estados Unidos No. 5,705,609, Patente de los Estados Unidos No. 5,726,149, Patente de los Estados Unidos No. 5,824,655, Patente de los Estados Unidos No. 5,830,847, Patente de los Estados Unidos No. 6,015,693 y Publicación Internacional No. WO 91/04748, Publicación Internacional No. WO 91/10727, Publicación Internacional No. WO 93/09800 y Publicación Internacional No. WO 94/10187).

Otros ejemplos de tal antagonista incluyen huéspedes de otras proteínas asociadas con la señalización de TGF-p, incluida la somatostatina (Publicación internacional No. WO 98/08529), ácido manosa-6-fosfórico o ácido manosa-1-fosfórico (Patente de los Estados Unidos No. 5,520,926), prolactina (Publicación internacional No. WO 97/40848), factor de crecimiento similar a la insulina II (Publicación Internacional No. WO 98/17304), IP-10 (Publicación Internacional No. WO 97/00691), péptidos que contienen arginina(arg)-glicina(gly)-asparagina(asp) (Patente de Estados Unidos No. 5.958,411 y Publicación Internacional No. WO 93/10808), extractos de plantas, hongos y bacterias (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 813875, Publicación japonesa abierta al público No. 8-119984 y Patente Estadounidense No. 5,693,610), oligonucleótidos antisentido (Patente Estadounidense No. 5,683,988, Patente Estadounidense No. 5,772,995, Patente Estadounidense No. 5,821,234 y Patente Estadounidense No.

5,869,462, y Publicación Internacional No. WO 94/25588), y Smad y MAD (Solicitud de Patente Europea No. EP 874046 Publicación Internacional No. WO 97/31020, Publicación Internacional No. WO 97/38729, Publicación internacional No. WO 98/03663, Publicación internacional No. WO 98/07735, Publicación Internacional No. WO 98/07849, Publicación Internacional No. WO 98/45467, Publicación internacional No. WO 98/53068, Publicación internacional No. WO 98/55512, Publicación internacional No. WO 98/56913, Publicación internacional No. WO 98/53830 y Publicación internacional No. WO 99/50296, y Patente de los Estados Unidos No. 5,834,248, Patente de los Estados Unidos No. 5,807,708 y la Patente de los Estados Unidos No. 5.948.639), y Ski y Sno (G. Vogel, Science, 286: 665 (1999) y Stroschein et al., Science, 286: 771-74 (1999)), y cualquier fragmento y derivado de las moléculas mencionadas anteriormente que conserve la capacidad de inhibir la actividad de TGF-p.

Los antagonistas de TGF-p adecuados para el uso en la presente invención también incluyen mutantes funcionales, mutantes, derivados y análogos de los antagonistas de TGF-p mencionados anteriormente, siempre que su capacidad para inhibir la cantidad o actividad de TGF-p sea retenida. El "mutante", "derivado" y "análogo", como se usa en este documento, se refiere a una molécula que tiene una forma o estructura similar a la de su compuesto original y que retiene la capacidad de actuar como un antagonista de TGF-p. Por ejemplo, cualquiera de los antagonistas de TGF-p descritos en este documento puede cristalizarse y los análogos útiles pueden diseñarse racionalmente basándose en las coordenadas responsables de dar forma a (uno o más) sitios activos. En cambio, los expertos en la técnica pueden alterar un grupo funcional de un antagonista conocido o seleccionar una molécula alterada de este tipo con respecto al aumento de actividad, vida media, biodisponibilidad u otras características deseables, sin experimentos innecesarios. Cuando el antagonista de TGF-p es un polipéptido, se puede producir un fragmento y una variante del polipéptido para aumentar la facilidad de administración, actividad, semivida o similares (por ejemplo, anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos funcionales discutidos anteriormente). Teniendo en cuenta el nivel técnico en la técnica para producir polipéptidos sintéticos y recombinantes, dicha variante puede lograrse sin experimentos innecesarios. Los expertos en la técnica también pueden diseñar un inhibidor nuevo basándose en el conocimiento de la estructura cristalina y/o el sitio activo del inhibidor de TGF-p como se describe en el presente documento. Un inhibidor de polipéptidos, como un receptor de TGF-p soluble, puede introducirse eficazmente mediante transferencia génica. Por tanto, una determinada realización del procedimiento de acuerdo con la presente invención incluye el uso de un vector adecuado para la expresión de un receptor de TGF-p o una pareja de unión, preferiblemente un receptor soluble o una pareja de unión soluble. En una realización preferida, la administración de un antagonista de TGF-p soluble se puede lograr mediante transferencia génica que usa un vector que comprende un ADNc que codifica un antagonista soluble o ADNc que codifica un dominio extracelular de un receptor de TGF-p tipo II (rsTGFBIIR) o un TGF receptor -p tipo III (rsTGFBIIIR). Como este vector, se puede usar cualquier vector adecuado que provoque la expresión in situ de un antagonista de TGF-p soluble en una célula transfectada usando el vector, inhibe la actividad de TGF-p y suprime la fibrogénesis mediada por TGF-p. Los vectores preferidos incluyen un vector de adenovirus, un vector de lentivirus, un vector de virus de Epstein-Barr (EBV), un vector de virus adenoasociado (AAV) y un vector de retrovirus, desarrollado con el propósito de transferencia génica. También se pueden usar otros procedimientos no vectoriales para la transferencia de genes, como el complejo de lípido/ADN, el conjugado de proteína/ADN y los procedimientos de transferencia de ADN desnudo. Otros antagonistas de TGF-p adecuados desarrollados para la administración mediante transferencia génica de adenovirus incluyen, pero no se limitan a, un ADNc quimérico que codifica un dominio extracelular de un receptor de TGF-p tipo II, fusionado a un dominio Fc de Ig (Isaka et al., 1999, Kidney Int., 55: págs. 465 a 475), un vector de transferencia génica de adenovirus de un mutante negativo dominante de un receptor de TGF-p tipo II (Zhao et al., 1998, Mech. Dev., 72: págs. 89 a 100), y un vector de transferencia génica de adenovirus de decorina, que es un proteoglicano de unión a TGF-p (Zhao et al., 1999, Am. J. Physiol., 277: págs. L412 a L422). La transferencia de genes mediada por adenovirus tiene una eficacia extremadamente alta en relación con otras formas de administración de genes.

Los receptores de TGF-p, los fragmentos de unión de TGF-p y los fragmentos solubles del receptor de TGF-p y similares son antagonistas de TGF-p útiles en la presente invención. Los receptores de TGF-p y los ácidos nucleicos que los codifican son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un receptor de TGF-p tipo 1 se describen en el número de acceso de GenBank L15436 y la Patente de los Estados Unidos No.

5,538,892 de Donahoe et al. Las secuencias de ácido nucleico de un receptor de TGF-p de tipo 2 también están disponibles públicamente con los números de acceso de GenBank AW236001; AI35790; AI279872; AI074706; y AA808255. Las secuencias de ácido nucleico de un receptor de TGF-p tipo 3 también están disponibles públicamente con los números de acceso de GenBank NM003243; AI887852; AI817295; y AI681599. En una realización ejemplar, un antagonista de TGF-p es un anticuerpo que bloquea la unión de TGF-p a un receptor del mismo, o a un fragmento F(ab)² , un fragmento Fv, un anticuerpo monocatenario y un fragmento de otro " "formas de anticuerpos" que conservan la capacidad de unirse a TGF-p. Dicho anticuerpo puede ser quimerizado o humanizado. En este documento, un anticuerpo quimerizado incluye una región constante de un anticuerpo humano y una región variable de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo murino. Un anticuerpo humanizado incluye una región constante y una región de marco variable (es decir, regiones variables distintas de las regiones hipervariables) de un anticuerpo humano y una región hipervariable de un anticuerpo no humano tal como un anticuerpo murino. Por supuesto, dicho anticuerpo puede ser cualquier otro tipo de derivado de anticuerpo, tal como un anticuerpo humano seleccionado o recogido de un sistema de presentación de fagos o producido a partir de un XenoMouse.

Los hallazgos relacionados con Smad están aumentando. Una ruta de señalización de TGF-p se inicia cuando una molécula del mismo se une a un complejo de superficie celular heterodímero que consiste en receptores de serina/treonina quinasa de tipo I (TbRI) y tipo II (TbRII) para provocar este complejo de superficie celular heterodímero. Luego, el receptor de heterodímero transmite la señal a través de la fosforilación de una proteína Smad diana corriente abajo. Como se describió anteriormente, hay tres clases funcionales para las proteínas Smad, que son Smad (R-Smad) reguladas por un receptor como Smad2 y Smad3, un co-mediador (Co-Smad) que también se conoce como Smad4, y un inhibidor Smad (I-Smad). Después de la fosforilación por el complejo del receptor heterodímero, R-Smad forma un complejo con Co-Smad, se mueve al núcleo y modula la transcripción del gen diana en cooperación con cada una de las otras proteínas (Derynck, R., et al. (1998)) Celda 95: 737-740); Massague, J. and Wotton, D. (2000) EMBO J. 19: 1745). Una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Smad3 humano se divulgan, por ejemplo, en GenBank Accession No. gi: 42476202. Una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Smad3 murino se describen, por ejemplo, en GenBank Accession No. gi: 31543221. Como se describió anteriormente, una estimulación de TGF-p da como resultado la fosforilación y activación de Smad2 y Smad3, que forman un complejo con Smad4 (también denominado "Smad común" o "co-Smad"), y el complejo se acumula con un núcleo para modular la transcripción del gen diana. Por tanto, la inhibición de la señal de TGF-p también se puede lograr mediante la inhibición de Smad2, 3 o co-Smad (Smad4). R-Smad se localiza en un citoplasma y forma un complejo con co-Smad a través de la fosforilación inducida por ligando por un receptor de TGF-p y se mueve a un núcleo, donde modula la expresión génica asociada con la cromatina y un factor de transcripción cooperativo. Por tanto, la inhibición de la señal de TGF-p también se puede lograr inhibiendo directa o indirectamente R-Smad. Smad6 y Smad7 son inhibidores de Smad (I-Smad), es decir, son inducidos transcripcionalmente por TGF-p para que funcionen como inhibidores de la señalización de TGF-p (Feng et al., (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21: 659). Smad6/7 obstruye la activación de R-Smad mediada por receptor para ejercer un efecto inhibidor del mismo. Están asociados con un receptor de tipo I, que obstruye competitivamente la movilización y fosforilación de R-Smad. Se sabe que Smad6 y Smad7 reponen la ubiquitina ligasa E3, que induce la ubiquitinación y degradación de las proteínas que interactúan con Smad6/7. Por tanto, Smad6 y 7 pueden funcionar como un inhibidor de la señal de TGF-p en la presente invención.

Los inhibidores de Smad3 que se pueden usar en la presente invención incluyen, entre otros, nucleótidos antisentido, ARNip, anticuerpos y similares, además de, como compuesto de bajo peso molecular, 6,7-dimetoxi-2- (2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona y similares disponibles de Calbiochem.

Como se usa aquí, "sustancia (por ejemplo, ácido nucleico) para suprimir la expresión (de TGF-p o similar)" no está particularmente limitada siempre que sea una sustancia que suprima la transcripción de un ARNm de un gen diana, una sustancia (por ejemplo, ácido nucleico) que degrada un ARNm transcrito, o una sustancia (por ejemplo, ácido nucleico) que suprime la traducción de una proteína a partir de un ARNm. Ejemplos de dichas sustancias incluyen ARNip, oligonucleótidos antisentido, ribozima, vectores de expresión de los mismos y otros ácidos nucleicos, entre los que se prefieren un ARNip y un vector de expresión del mismo, y se prefiere particularmente un ARNip. La "sustancia que suprime la expresión de un gen" incluye proteínas, péptidos y otras moléculas pequeñas además de las descritas anteriormente. Cabe señalar que un gen diana en la presente invención se refiere a cualquier gen que esté asociado con una ruta de señalización de TGF-p.

Los expertos en la técnica conocen bien un procedimiento que utiliza una técnica antisentido como procedimiento para inhibir la expresión de un gen endógeno específico tal como TGF-p, que está dirigido en la presente invención. Como acciones de un ácido nucleico antisentido para inhibir la expresión de un gen diana, hay una pluralidad de factores, es decir, inhibición del inicio de la transcripción debido a la formación de tríplex; inhibición de la transcripción debido a la formación de híbridos con un sitio donde la ARN polimerasa forma localmente una estructura de bucle abierto; inhibición de la transcripción debido a la formación de híbridos con un ARN cuya síntesis está a punto de progresar; inhibición del corte y empalme debido a la formación de híbridos en una unión de intrón y exón; inhibición del empalme debido a la formación de híbridos con el sitio de formación del espliceosoma; inhibición de la migración de un núcleo al citoplasma debido a la formación de híbridos con un ARNm; inhibición del corte y empalme debido a la formación de híbridos con un sitio de protección o un sitio de adición de poli (A); inhibición del inicio de la traducción debido a la formación de híbridos con un sitio de unión del factor de inicio de la traducción; inhibición de la traducción debida a la formación de híbridos con un sitio de unión a ribosoma cerca de un codón de iniciación; inhibición de la elongación de una cadena peptídica debido a la formación de híbridos con un sitio de unión de polisoma o una región de traducción de un ARNm; inhibición de la expresión génica debido a la formación de híbridos con un sitio de interacción de un ácido nucleico y una proteína, y similares. De esta manera, un ácido nucleico antisentido inhibe diversos procesos, como la transcripción, el empalme y la traducción, para inhibir la expresión de un gen diana (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Jikken Kouza [New Biochemical Experiment Course] 2, Nucleic Acid, IV Idenshi no Fukusei a Hatsugen [Duplication and Expression of Gene], editado por la Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1993, 319­ El ácido nucleico antisentido utilizado en la presente invención puede inhibir la expresión y/o función de un gen (ácido nucleico) que codifica un miembro de una ruta de señalización del TGF-p descrita anteriormente o similar mediante cualquiera de las anteriores acciones descritas. En una realización, se considera eficaz para inhibir la traducción de un gen diseñar una secuencia antisentido complementaria a una región de no traducción cerca del terminal 5' de un ARNm de un gen que codifica el TGF-p descrito anteriormente o similar. Además, es posible utilizar una secuencia complementaria a una región codificante o una región de no traducción 3'. De esta manera, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia antisentido de una secuencia no solo de una región de traducción, sino también de una región de no traducción de un gen que codifica TGF-p descrito anteriormente o similares están englobados por los ácidos nucleicos antisentido que se utilizan en la presente invención. Un ácido nucleico antisentido utilizado se enlaza corriente abajo de un promotor apropiado y preferiblemente se enlaza a una secuencia que incluye una señal de terminación de la transcripción en el extremo 3'. Un ácido nucleico preparado de tal manera se puede transformar en un animal (célula) deseado usando un procedimiento conocido. Si bien la secuencia de un ácido nucleico antisentido es preferiblemente una secuencia complementaria de un gen que codifica TGF-p o similar de un animal (célula) por transformar o una parte del mismo, no necesariamente es completamente complementaria siempre que la secuencia pueda suprimir la expresión de genes. El ARN transcrito es preferiblemente 90 % o más, y más preferiblemente 95 % o más complementario a un producto de transcripción de un gen diana. Con el fin de inhibir eficazmente la expresión de un gen diana usando un ácido nucleico antisentido, el ácido nucleico antisentido tiene preferiblemente al menos 12 bases o más pero menos de 25 bases de longitud. Sin embargo, el ácido nucleico antisentido de acuerdo con la presente invención no se limita necesariamente a esta longitud. La longitud puede ser, por ejemplo, 11 bases o menos, 100 bases o más, o 500 bases o más. Si bien un ácido nucleico antisentido puede estar compuesto únicamente por ADN, también puede incluir ácidos nucleicos distintos de los ADN, como el ácido nucleico bloqueado (LNA). En una realización, el ácido nucleico antisentido usado en la presente invención puede ser un ácido nucleico antisentido que contiene LNA que incluye LNA en el terminal 5' o en el terminal 3'. En una realización en la que se usa un ácido nucleico antisentido en la presente invención, se puede diseñar una secuencia antisentido basada en una secuencia de ácido nucleico de TGF-p o similar utilizando un procedimiento descrito en, por ejemplo, Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Jikken Kouza [New Biochemical Experiment Course] 2, Nucleic Acid, IV Idenshino Fukuseito Hatsugen [Duplication and Expression of Gene], editado por la Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1993, 319­ 347, por ejemplo.

La expresión de TGF-p o similar también se puede inhibir usando ribozima o ADN que codifica ribozima. Una ribozima se refiere a una molécula de ARN que tiene actividad catalítica. Existen ribozimas con varios tipos de actividades, pero las investigaciones que se centran en una ribozima como enzima para escindir un ARN han hecho posible diseñar una ribozima para escindir el ARN de una manera específica del sitio. Si bien hay ribozimas con un tamaño de 400 nucleótidos o más, como las ribozimas del intrón del grupo I y el ARN M1 incluidos en la ARNasa P, también hay ribozimas que tienen un dominio de actividad de aproximadamente 40 nucleótidos, como los denominados ribosomas de cabeza de martillo y de horquilla. (Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka, Protein Nucleic Acid and Enzyme, 1990, 35, 2191).

Por ejemplo, el dominio de auto-escisión de una ribozima de cabeza de martillo escinde el lado 3' de C15 en una secuencia denominada G13U14C15. La formación de pares de bases de U14 y A9 se considera importante para la actividad de los mismos. Además, se demuestra que la escisión se puede realizar en A15 o U15 en lugar de C15 (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228). Se puede diseñar una ribozima con un sitio de unión de sustrato complementario a una secuencia de ARN cerca de un sitio diana para crear una ribozima de escisión de ARN similar a una enzima de restricción que reconozca una secuencia como UC, UU o UA en un ARN diana (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka, Protein Nucleic Acid And Enzyme, 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 7059).

Además, las ribozimas en horquilla también son útiles para el propósito de la presente invención. Tal ribozima se encuentra, por ejemplo, en una cadena negativa de un ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (Buzayan, J M., Nature, 1986, 323, 349.). También se ha demostrado que se puede crear una ribozima de escisión de ARN específica de la diana a partir de ribozimas en horquilla (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl. Acids Res, 1991, 19, 6751., Kikuchi, Yo, Kagaku to Seibutsu [Chemistry and Organism], 1992, 30, 112). De esta manera, un producto de transcripción de un gen que codifica TGF-p o similar puede escindirse específicamente usando una ribozima para inhibir la expresión del gen.

La expresión de un gen endógeno de TGF-p o similar también puede suprimirse por interferencia de ARN (en adelante, abreviado como "ARNi") usando un ARN bicatenario que tiene una secuencia idéntica o similar a una secuencia de gen diana. El ARNi es una tecnología que está llamando la atención en la actualidad, donde cuando un ARN bicatenario (ARNds) se absorbe directamente en una célula, se suprime la expresión de un gen que tiene una secuencia homóloga al ARNds. En células de mamíferos, se usa un ARNdc de cadena corta (ARNip) para que se pueda inducir el ARNi. En comparación con los ratones inactivados, el ARNi tiene muchas ventajas, como un efecto estable, fácil experimentación y bajo coste. Los ARNsi se describen en detalle en otras partes de la presente especificación.

Como se usa en el presente documento, "ARNsi" se refiere a una molécula de ARN que tiene un resto de ARN bicatenario que consta de 15 a 40 bases. Un ARNip tiene la función de escindir un ARNm de un gen diana que tiene una secuencia complementaria a una cadena antisentido de dicho ARNip para suprimir la expresión del gen diana.

Más específicamente, el ARNip de acuerdo con la presente invención es un ARN que comprende un resto de ARN bicatenario que consiste en una cadena de ARN sentido que consiste en una secuencia homóloga a una secuencia de ARN contigua en un ARNm de TGF-p o similar, y una cadena de ARN antisentido que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de ARN sentido. La fabricación y el diseño del ARNip y del ARNsi mutante descritos a continuación están dentro del alcance de la capacidad de los expertos en la técnica. El concepto de seleccionar cualquier región de ARN contigua de un ARNm, que es un producto de transcripción de una secuencia de TGF-p o similar, y crear un ARN bicatenario correspondiente a la región es simplemente una cuestión dentro de la capacidad creativa normal de aquellos expertos en la técnica. Además, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente una secuencia de ARNip con un efecto de ARNi más potente a partir de una secuencia de ARNm, que es un producto de transcripción de la secuencia, usando un procedimiento conocido. Además, si se identifica una de las cadenas, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la secuencia de bases de la otra cadena (cadena complementaria). Los expertos en la técnica pueden crear apropiadamente un ARNip usando un sintetizador de ácido nucleico disponible comercialmente. Además, se puede utilizar un servicio de síntesis común para la síntesis de ARN deseada.

La longitud de un resto de ARN bicatenario, como base, es de 15 a 40 bases, preferiblemente de 15 a 30 bases, más preferiblemente de 15 a 25 bases, aún más preferiblemente de 18 a 23 bases y lo más preferiblemente de 19 a 21 bases. Se entiende que los límites superior e inferior de los mismos no se limitan a los límites especificados donde los límites pueden ser cualquier combinación de los límites mencionados. La estructura terminal de una cadena sentido o cadena antisentido de un ARNip no está limitada en particular, y puede seleccionarse de manera apropiada dependiendo del objetivo. Por ejemplo, la estructura del terminal puede tener un terminal liso o un terminal saliente (voladizo), mientras que es preferible un terminal 3' saliente. Un ARNip que tiene un saliente que consta de varias bases, preferiblemente de 1 a 3 bases, y aún más preferiblemente 2 bases en el terminal 3' de una cadena de ARN sentido y una cadena de ARN antisentido a menudo se prefiere por tener un gran efecto de supresión de la expresión de un gen diana. El tipo de base que sobresale no está particularmente limitado, que puede ser una base que constituye un ARN o una base que constituye un ADN. Las secuencias salientes preferibles incluyen dTdT (2 pb de desoxi T) en el terminal 3' y similares. Ejemplos de ARNip preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos con dTdT (2 pb de desoxi T) añadido al terminal 3' de las cadenas sentido y antisentido de todos los ARNip.

Además, también es posible usar un ARNip en el que se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden uno a varios nucleótidos en una o ambas de la cadena sentido y la cadena antisentido del ARNip descrito anteriormente. A este respecto, el concepto de una a varias bases no está particularmente limitado, pero es preferiblemente de 1 a 4 bases, aún más preferiblemente de 1 a 3 bases y lo más preferiblemente de 1 a 2 bases. Ejemplos específicos de tal mutación incluyen, pero no se limitan a, mutaciones en las que el número de bases en la porción saliente 3' es de 0 a 3, mutaciones en las que la secuencia de bases de la porción saliente 3' se cambia a otra secuencia de bases, mutaciones en las que las longitudes de la cadena de ARN sentido y la cadena de ARN antisentido descritas anteriormente son diferentes en 1 a 3 bases debido a una inserción, adición o eliminación de bases, mutaciones en las que la base en una cadena sentido y/o la cadena antisentido se sustituye por otra base y similares. Sin embargo, es necesario que la cadena sentido y la cadena antisentido puedan hibridar en tales ARNip mutantes, y que tales ARNip mutantes tengan la misma capacidad para suprimir la expresión génica que un ARNip que no tiene una mutación.

Además, un ARNip puede ser una molécula en la que un extremo tiene una estructura cerrada tal como un ARNip con una estructura de horquilla (ARN en horquilla corta; ARNhc). Un ARNhc es un ARN que comprende un ARN de cadena con sentido de una secuencia específica de un gen diana, un ARN de cadena antisentido que consta de una secuencia complementaria a la secuencia de cadena con sentido y una secuencia enlazadora que conecta las dos cadenas, donde el resto de la cadena con sentido y el resto de cadena antisentido se hibrida para formar un resto de ARN bicatenario.

Es deseable que un ARNip no presente el llamado efecto fuera de la diana en el uso clínico. Un efecto fuera de la diana se refiere a un efecto de suprimir la expresión de otro gen parcialmente homólogo al ARNip utilizado, distinto del gen diana. Es posible confirmar que un ARNip candidato no tiene reactividad cruzada usando una micromatriz de ADN o similar de antemano para evitar un efecto fuera de la diana. Además, es posible evitar un efecto fuera de la diana confirmando si hay un gen que comprende un resto que es altamente homólogo a una secuencia de un ARNip candidato, que no sea un gen diana, utilizando una base de datos conocida proporcionada por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) o similares.

Con el fin de crear el ARNip de acuerdo con la presente invención, se puede usar apropiadamente un procedimiento conocido, tal como un procedimiento que usa síntesis química o un procedimiento que usa una técnica de recombinación genética. Con un procedimiento que usa síntesis, se puede sintetizar un ARN bicatenario basándose en la información de la secuencia usando un procedimiento común. Con el procedimiento que utiliza una técnica de recombinación de genes, se puede preparar un ARNip construyendo un vector de expresión que codifique una secuencia de cadena sentido o una secuencia de cadena antisentido e introduciendo el vector en una célula huésped, y luego obteniendo cada uno de los ARN de cadena sentido y ARN de cadena antisentido producidos por transcripción. Además, es posible crear un ARN bicatenario deseado expresando un ARNhc que forma una estructura de horquilla, que comprende una cadena con sentido de una secuencia específica de un gen diana, una cadena antisentido que consiste en una secuencia complementaria a la secuencia de cadena con sentido, y una secuencia enlazadora para unir las dos cadenas.

Para un ARNip, todo o parte del ácido nucleico que constituye el ARNip puede ser un ácido nucleico natural o modificado siempre que dicho ácido nucleico tenga una actividad para suprimir la expresión de un gen diana.

El ARNip de acuerdo con la presente invención no tiene que ser necesariamente un par de ARN bicatenarios para una secuencia diana. Puede ser una mezcla de una pluralidad de pares (la "pluralidad" no está particularmente limitada, pero preferiblemente se refiere a un pequeño número de aproximadamente 2 a 5) de ARN de doble cadena en una región que comprende una secuencia diana. A este respecto, los expertos en la técnica pueden crear apropiadamente un ARNip como una mezcla de ácido nucleico correspondiente a una secuencia diana usando un sintetizador de ácido nucleico disponible comercialmente y una enzima DICER. Además, se puede utilizar un servicio de síntesis común para la síntesis de ARN deseada. Cabe señalar que el ARNip de acuerdo con la presente invención engloba el denominado "ARNsi cóctel". Para el ARNip de acuerdo con la presente invención, no todos los nucleótidos tienen que ser un ribonucleótido (ARN). Específicamente, en la presente invención, uno o una pluralidad de ribonucleótidos que constituyen un ARNip pueden ser un desoxirribonucleótido correspondiente. El término "correspondiente" se refiere a tener el mismo tipo de base (adenina, guanina, citosina, timina (uracilo)) pero una estructura de resto de azúcar diferente. Por ejemplo, un desoxirribonucleótido correspondiente a un ribonucleótido que tiene adenina se refiere a un desoxirribonucleótido que tiene adenina.

Además, un ADN (vector) que puede expresar el ARN descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención también se incluye como una realización preferida de un ácido nucleico que puede suprimir la expresión de TGF-p o similar. Por ejemplo, el ADN (vector) que puede expresar el ARN bicatenario descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención es un ADN que tiene una estructura en la que un ADN que codifica una de las cadenas del ARN bicatenario y un ADN que codifica la otra cadena del ARN bicatenario se enlaza con un promotor para que cada uno de los ADN se pueda expresar. Los expertos en la técnica pueden preparar apropiadamente el ADN descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención utilizando una técnica de ingeniería genética común. Más específicamente, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención se puede preparar insertando apropiadamente el ADN que codifica un ARN de acuerdo con la presente invención en varios vectores de expresión conocidos.

En la presente invención, se puede usar un ácido nucleico modificado como un ácido nucleico para suprimir la expresión de un gen diana. Un ácido nucleico modificado se refiere a un ácido nucleico, que tiene una modificación en un nucleósido (resto de base, resto de azúcar) y/o un sitio de unión entre nucleósidos, y tiene una estructura diferente a la de un ácido nucleico natural. Ejemplos de "nucleósido modificado", que constituye un ácido nucleico modificado, incluyen: un nucleósido abásico; arabinonucleósido, 2'-desoxiuridina, a-desoxirribonucleósido, p-L-desoxirribonucleósido y nucleósido que tiene otra modificación de azúcar; ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico peptídico de unión a grupos fosfato (PHONA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido morfolino nucleico y similares. Los nucleósidos descritos anteriormente que tienen una modificación de azúcar incluyen 2'-O-metilribosa, 2'-desoxi-2'-fluororibosa, 3'-O-metilribosa y otra pentosa sustituida; 1',2'-desoxirribosa; arabinosa; azúcar arabinosa sustituida; y nucleósido que tiene una modificación de azúcar de anómero alfa y hexosa. Estos nucleósidos pueden ser una base modificada en la que se modifica el resto de base. Ejemplos de tales bases modificadas incluyen 5-hidroxicitosina, 5-fluorouracilo, 4-tiouracilo y otras pirimidinas; 6-metiladenina, 6-tioguanosina y otras purinas; y otras bases heterocíclicas.

Ejemplos de un "enlace entre nucleósidos modificado", que constituye un ácido nucleico modificado, incluyen enlaces entre nucleósidos no naturales, tales como enlazador de alquilo, enlazador de glicerilo, enlazador de amino, enlace de polietilenglicol, enlace entre enlace nucleósido de fosfonato de metilo; metilfosfonotioato, fosfotriéster, fosfotiotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, profármaco triéster, sulfona, sulfonamida, sulfamato, formacetal, N-metilhidroxilamina, carbonato, carbamato, morfolino, boranofosfonato, fosforamidato y similares.

La secuencia de ácido nucleico comprendida en el ARNip bicatenario de acuerdo con la presente invención incluye un ARNip dirigido a TGF-p u otros miembros de señalización de TGF-p, y similares.

También es posible introducir el ácido nucleico o agente de acuerdo con la presente invención en un retículo endoplásmico fosfolípido (vesícula) tal como un liposoma para administrar el retículo endoplásmico. Puede introducirse un retículo endoplásmico en el que se retiene un ARNip o ARNhc en una célula predeterminada mediante lipofección. La célula resultante se administra luego sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial o similar. El retículo endoplásmico también se puede administrar localmente en un sitio requerido en un ojo o similar. Si bien un ARNip exhibe un efecto supresor posterior a la transcripción específico muy bueno in vitro, el ARNip se degrada rápidamente in vivo debido a la actividad nucleasa en el suero. Dado que la duración del mismo es limitada, ha existido la necesidad de desarrollar un sistema de administración mejor y más eficaz. Como ejemplo, Ochiya, T et al., Nature Med., 5: 707-710, 1999, Curr. Gene Ther., 1: 31-52, 2001 informa que un atelocolágeno de material biocompatible, cuando se mezcla con un ácido nucleico para formar un complejo, es un portador que tiene la acción de proteger un ácido nucleico de una enzima degradante en un organismo vivo y es extremadamente adecuado como portador de un ARNip. Aunque se puede usar tal forma, el procedimiento para introducir un ácido nucleico o un medicamento de acuerdo con la presente invención no se limita a este procedimiento. De esta manera, debido a la rápida degradación por la acción de una enzima que degrada el ácido nucleico en el suero de un organismo vivo, es posible lograr la continuación del efecto durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, Takeshita F. PNAS, (2003) 102 (34) 12177-82, Minakuchi Y Nucleic Acids Research (2004) 32 (13) e109 informa que el atelocolágeno derivado de la piel bovina forma un complejo con un ácido nucleico, que tiene acción de proteger un ácido nucleico de una enzima degradante en un organismo vivo y es extremadamente adecuado como portador de un ARNip. Se puede utilizar esta técnica.

Como se usa en este documento, un "agente" se usa en un sentido amplio, y puede referirse a cualquier sustancia u otros ítems (por ejemplo, energía como luz, radiación, calor y electricidad) siempre que la diana deseada pueda ser alcanzada. Ejemplos de dicha sustancia incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, Incluidos ADN como ADNc y ADN genómico, y ARN como ARNm), polisacáridos, oligosacáridos, grasas, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, hormonas, ligandos, sustancias transmisoras de información, moléculas orgánicas pequeñas, moléculas sintetizadas mediante química combinatoria, moléculas pequeñas que pueden usarse como medicina (por ejemplo, un ligando de bajo peso molecular) y similares) y moléculas compuestas de los mismos. Ejemplos representativos de un agente específico para un polinucleótido incluyen, pero no se limitan a, un polinucleótido que tiene complementariedad con cierta homología de secuencia (por ejemplo, 70 % o más de identidad de secuencia) con respecto a la secuencia del polinucleótido, un polipéptido tal como un factor de transcripción que se unen a una región promotora y similares. Ejemplos representativos de un agente específico para un polipéptido incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo específicamente dirigido al polipéptido o un derivado o un análogo del mismo (por ejemplo, anticuerpo monocatenario), un ligando o receptor específico cuando el polipéptido es un receptor o ligando, un sustrato cuando el polipéptido es una enzima, y similares.

Como se usa en este documento, "enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE)" en "endotelio corneal" se refiere a una enfermedad, trastorno o afección de un endotelio corneal, que está asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE).

Como se usa en este documento, "enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés asociado al retículo endoplásmico (RE)" con respecto al endotelio corneal incluye cualquier enfermedad, trastorno o afección asociado ^{con el estrés asociado a la} Re. ^{Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, disminución de la densidad} endotelial corneal, formación de gutta, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de una córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, malestar ocular, disminución del contraste, deslumbramiento, edema del estroma corneal y similares. El estrés ER y el trastorno mitocondrial generalmente coexisten, mientras que todos los síntomas generalmente se manifiestan debido al trastorno mitocondrial. Por tanto, la asociación entre ellos puede detectarse o diagnosticarse confirmando el fallo mitocondrial. Además, muchas de las enfermedades, trastornos y afecciones están asociadas con la apoptosis debido a un fallo mitocondrial, también pueden detectarse o diagnosticarse mediante la conformación de la apoptosis.

Como se usa en este documento, "agente terapéutico para el trastorno mitocondrial (debido al estrés del RE)" se refiere a un agente terapéutico que es sustancialmente similar a un fármaco terapéutico para el estrés del RE. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, BiP inductor X (BIX), ácido 4-fenil butírico (PBA), N-óxido de trimetilamina (TMAO), ácido taurodesoxicólico (TUDCA), teprenona (también vendida como selbex) y similares. (por ejemplo, véase Journal of the Japanese Society of Psychiatry and Neurology (2012) Vol 114 No 2 p. 115).

Como se usa en este documento, una "enfermedad, trastorno o afección relacionada con la distrofia corneal endotelial de Fuchs" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno o afección relacionada con el trastorno corneal endotelial de Fuchs, entre los que se encuentran los asociados con el estrés del retículo endoplásmico (RE) de particular interés para la presente invención, pero no se limitan a la misma. Ejemplos concebibles de dicha enfermedad, trastorno o afección relacionados con la distrofia corneal endotelial de Fuchs asociada con el estrés del retículo endoplásmico (RE) incluyen aquellos asociados con un trastorno de células endoteliales corneales. Alternativamente, ejemplos de otras formas de enfermedad, trastorno o afección relacionados con la distrofia corneal endotelial de Fuchs incluyen, entre otros, disminución de la densidad endotelial corneal, formación de gutta, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de la córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, deterioro visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, molestias oculares, contraste disminuido, deslumbramiento, edema del estroma corneal y similares. La distrofia corneal endotelial de Fuchs es una enfermedad que causa anomalías en las células endoteliales dentro de la córnea, lo que resulta en edema del estroma corneal. Se desconoce la causa de la misma. En la distrofia corneal endotelial de Fuchs, la matriz extracelular, como el colágeno, se deposita en una parte de la superficie posterior de la membrana de Descemet en la parte posterior de la córnea, lo que da como resultado la hipertrofia de la gutta corneal y la membrana de Descemet. La hipertrofia de la gutta corneal y la membrana de Descemet es una causa de fotofobia o visión borrosa, que compromete la calidad de vida de los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs. Se entiende que no existe un procedimiento terapéutico eficaz que no sea el trasplante de córnea para la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Sin embargo, hay una escasez de donación de córnea en Japón, donde los pacientes que esperan un trasplante de córnea son aproximadamente 2600, mientras que el número de trasplantes de córnea realizados en Japón es de aproximadamente 1700 al año.

Hay informes de inmovilización (Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2; 52(13): 9291-9297.2011) y cultivo de células de endotelio corneal de pacientes con córnea de Fuchs (Zaniolo K, et al. Exp. Eye Res.; 94(1): 22-31.2012 AND Kelliher C. et al. Exp. Eye Res Vol.93 (6), 880-888, 2011). Sin embargo, no hay informes de células adecuadas para cribar un fármaco terapéutico o que el fármaco que prevenga la progresión retenga las características de una enfermedad como la producción excesiva de matriz extracelular. Por tanto, el desarrollo de un fármaco terapéutico del mismo es limitado y no existe ningún fármaco terapéutico que esté actualmente en uso clínico. Por tanto, no hay más remedio que confiar en el trasplante de córnea.

(Tecnologías generales)

La tecnología de biología molecular, la tecnología bioquímica y la tecnología microbiológica como se usan en este documento son bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica. Se describen, por ejemplo, en Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and 3 rd Ed• thereo f (2001 ); Ausubel, F• M • (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub• Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F• M • (1989)• Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium o f Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub• Associates and Wiley-Interscience; Innis, M • A • (1990 )• PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F• M • (1992)• Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium o f Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub• Associates; Ausubel, F• M • (1995))• Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium o f Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub• Associates; Innis, M • A • e t ab (1995)^ PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F• M • (1999)• Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium o f Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J • J e t ab (1999)• PCR Applications: Protocols fo r Functional Genomics, Academic Press, Gait, M • J • (1985)^ Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M • J (1990 )• Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F• (1991)• Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R• L • e t al• (1992)• The Biochemistry o f the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z • e t ab (1994)• Advanced Organic Chemistry o f Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G• M • e t al• (1996)^ Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G• T (1996)^ Bioconjugate Techniques, Academic Press, Jikken Igaku Bessatsu [Experimental Medicine, Separate Volume], "Idenshi Dounyu & Hatsugen Kaiseki Jikkenho [M ethod o f Gene Introduction & Expression Analysis Experimental Technique" Yodosha Co\ L td •, 1997, y similares. Con respecto a las células endoteliales de la córnea, los informes de Nancy Joyce et al., {Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7} son bien conocidos, mientras que actualmente se están llevando a cabo investigaciones para procedimientos de cultivo eficaces mediante la realización de la transformación en un fibroblasto de la misma manera a través del cultivo y subcultivo a largo plazo como se discutió anteriormente.

(Descripción de la realización preferida)

A continuación, se describen realizaciones preferidas. Sin embargo, debe entenderse que las realizaciones son ejemplos de la presente invención y el alcance de la presente invención no se limita a tales realizaciones preferidas. También debe entenderse que los expertos en la técnica pueden aplicar fácilmente una alteración, cambio o similar dentro del alcance de la presente invención mientras se refieren a los siguientes ejemplos preferibles. Las realizaciones pueden combinar apropiadamente cualquier realización.

(Tratamiento o prevención de enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) del endotelio corneal, incluido el inhibidor de la señal de TGFp)

En un aspecto, la presente invención proporciona un fármaco terapéutico o profiláctico para una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del r E en un endotelio corneal, que comprende un inhibidor de la señal de TGFp. La presente invención ha encontrado que el estrés del RE puede reducirse o eliminarse inesperadamente, o mantenerse o devolverse a un nivel normal mediante la administración de un inhibidor de señal de TGFp para una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en un endotelio corneal. Por tanto, tal aplicación del inhibidor de la señal de TGFp para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE de un endotelio corneal se reconoce como una aplicación inesperada según el conocimiento convencional.

En una realización preferida, una enfermedad, trastorno o afección diana de la presente invención es un trastorno relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Actualmente no existe un procedimiento terapéutico fundamental de la técnica para la distrofia corneal endotelial de Fuchs de modo que la terapia para la distrofia corneal endotelial de Fuchs dependa del trasplante de córnea. Dado que la presente invención puede tratar el estrés del RE, que es una de las causas importantes de anomalías o trastornos en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, se entiende que la presente invención es útil para tratar o prevenir la distrofia corneal endotelial de Fuchs. En particular, se descubrió que el estrés ER está estrechamente asociado con la apoptosis. Por tanto, se espera que la presente invención sea una terapia fundamental para la distrofia corneal endotelial de Fuchs. La presente invención puede tratar o prevenir trastornos de las células endoteliales corneales en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, así como disminución de la densidad endotelial corneal, formación de guttae, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de la córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía ampollosa, molestias oculares, disminución del contraste, deslumbramiento, edema del estroma corneal y similares.

Para la distrofia corneal endotelial de Fuchs, también se confirma lo siguiente con respecto al estrés del retículo endoplásmico (RE) inducido por TGF-p en células endoteliales corneales. Específicamente, cuando se utilizaron HCEC de córnea de donante normal (iHCEC) y modelo de células inmovilizadas (iFECD) de células endoteliales corneales de pacientes humanos (HCEC) con distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD) establecida por los inventores para investigar la implicación del estrés ER en FECD de la señalización de TGFp, se demostró la participación. También está demostrado que el estrés del RE puede estar involucrado en la pérdida de células en FECD. Por tanto, se entiende que se demuestra que la inhibición de una vía de señalización de TGFp es una posible terapia eficaz de FECD.

Cuando se evaluaron iFECD e iHCEC con un microscopio electrónico de transmisión (TEM) para dilucidar el cambio morfológico en ER en la presente invención para la distrofia corneal endotelial de Fuchs, se observó expansión celular en iFECD, pero no en iHCEC. La expresión de los sensores de estrés del ER (PERK y ATF6) se estimuló con o sin TGFp y se analizó mediante inmunotransferencia Western, y la producción de proteína de matriz extracelular y la colocalización del ER se ensayaron con inmunotinción de colágeno tipo I y IV, fibronectina y proteína marcadora del ER PDI, tipo I y se observó que el colágeno y la fibronectina IV se expresaban más en iFECD que en iHCEC, pero se encontró que estaban colocalizados con ER. Además, se conoce como conocimiento de los inventores que la fosforilación de PERK y la escisión de ATF6 aumentaron más en iFECD que en iHCEC por TGFp. Para investigar la implicación de la señalización de TGFp en la apoptosis, las células se trataron con TGFp y las células de apoptosis positivas a anexina V se evaluaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de células de apoptosis positivas a anexina V en iHCEC no aumentó en relación con el anterior a una estimulación con TGFp (como dato ejemplar, 11,1 ± 0,6 % antes de la estimulación y 12,3 ± 0,5 % después de la estimulación). Mientras tanto, se sabe que TGFp aumenta las células positivas a anexina V después de una estimulación en iFECD en relación con el número antes de una estimulación de TGFp (como datos ejemplares, 19,4 ± 1,4 % antes de la estimulación y 29,9 ± 1,5 % después de la estimulación, p <0,01). Además de esto, se muestra que la expresión de la GRP78 chaperona está elevada. Además, se muestra que la expresión de CHOP está elevada y la apoptosis es inducida por estrés ER. Tal promoción de la fosforilación y expresión se observa más prominentemente en iFECD en relación con iHCEC. Se muestra que el aumento se puede ver después de 3 horas y el efecto de dicho aumento se potencia después de 6 horas. Por lo tanto, se demuestra que aumenta con el tiempo.

Además, en una realización específica de la presente invención, se muestra que el fallo mitocondrial está implicado en el nivel de funcionamiento de las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs. Como se demuestra en los Ejemplos, la implicación del fallo mitocondrial en FECD se demuestra mediante el uso de un modelo celular de HCEC de córnea de donante normal (iHCEC) y un modelo celular inmovilizado de células endoteliales corneales humanas (HCEC) de pacientes con FECD (iFECD).

Para FECD, se observó expansión de mitocondrias en iFECD, pero las mitocondrias en iHCEC son morfológicamente normales como en la evaluación de iFECD e iHCEC con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Por lo tanto, se demostró que las mitocondrias se vuelven morfológicamente anormales en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Además, se muestra que el potencial de membrana mitocondrial (MMP) es menor en iFECD que en iHCEC, como lo muestra el colorante JC-1, MitoTracker® y similares. También se ha demostrado que la fuga de citocromo c de las mitocondrias al citoplasma es mayor en iFECD que en iHCEC con respecto al nivel de citocromo c en una fracción mitocondrial según lo evaluado por Inmunoprecipitación Western. Como se muestra por Inmunoprecipitación Western, se observa que la caspasa 9, la caspasa 3 y la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) son escindidas por un estimulante del estrés mitocondrial (por ejemplo, estaurosporina). Así, se demuestra que la falla mitocondrial está involucrada en la apoptosis. Se sabe que el estrés ER induce un trastorno mitocondrial en muchas células. Por lo tanto, se puede inferir que un trastorno mitocondrial puede aliviarse controlando el estrés del ER. De esta manera, los expertos en la técnica pueden evaluar a partir de los resultados de la presente invención que el fallo mitocondrial está implicado en la patología de FECD y puede usarse como diana de un potente agente terapéutico.

Los objetivos de administración (trasplante) del medicamento o procedimiento de la presente invención incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, monos y similares). Sin embargo, se prefieren los primates y se prefieren especialmente los seres humanos. Hasta este momento, la terapia endotelial corneal en primates no ha obtenido resultados satisfactorios. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona un medicamento y un procedimiento terapéutico innovador.

Las vías de señalización de TGF-p se clasifican aproximadamente en sistemas Smad2/3 a través de ALK4, 5 o 7 y sistemas Smad1/5/8 a través de ALK1,2, 3 o 6, que se sabe que están asociados con la fibrosis (J. Massagu'e, Annu. Rev.Biochem,1998.67: 753-91; Vilar JMG, Jansen R, Sander C(2006) PLoS Comput Biol 2(1): e3; Leask, A., Abraham, D.J. FASEB J. 18, 816-827 (2004); Informes EMBO de Coert Margadant and Arnoud Sonnenberg (2010) 11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166). Se sabe que BMP-7 puede suprimir las señales de TGFp para suprimir la fibrosis (además de los documentos descritos anteriormente, Ralf Weiskirchen, et al., Frontiers in Bioscience 14, 4992-5012, 1 de junio de 2009; Elisabeth M Zeisberg et al., Nature Medicine 13, 952-961 (2007); Michael Zeisberg et al., Nature Medicine 9, 964-968 (2003)). Aunque estos documentos describen la participación de TGF-p en afecciones realmente acompañadas de tejido membranoso que consiste en matriz extracelular como el colágeno debido a un trastorno grave elaborado artificialmente o una enfermedad rara, la queratitis intersticial sifilítica, es difícil predecir el efecto terapéutico de la misma. Además, también se muestra que la fibrosis en un trastorno severo de la córnea se debe a la activación de p38 MAPK durante la fibrosis por IL-1 p. Mientras tanto, se muestra con conejos que la fibrosis observada cuando se sufre de inflamación severa en un organismo vivo debido a una lesión por congelación excesiva en conejos se acompaña de activación de p38 MAPK y la fibrosis se puede suprimir parcialmente con un inhibidor. Tal conocimiento muestra que la activación de p38 MAPK se acompaña en una situación en la que un organismo vivo tiene una inflamación muy fuerte y se acompaña de tejido membranoso que consiste en matriz extracelular. Dicho conocimiento no demuestra que un inhibidor de la señal de TGF-p sea eficaz para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en la endotelia corneal (por ejemplo, un trastorno como la distrofia corneal endotelial de Fuchs), ni proporciona ninguna sugerencia con respecto al mantenimiento de una condición normal. De esta manera, se ha considerado difícil cultivar células endoteliales corneales mientras se mantiene el funcionamiento normal. En última instancia, el conocimiento informado anteriormente no pudo tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en un endotelio corneal como la distrofia corneal endotelial de Fuchs. La supresión de una vía de señalización de TGF-p para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en un endotelio corneal (por ejemplo, un trastorno como la distrofia corneal endotelial de Fuchs) ni siquiera se consideró posible.

Se puede usar cualquier agente como inhibidor de la señal de TGF-p usado en la presente invención, siempre que se pueda inhibir una ruta de señal de TGF-p. Además, como es bien sabido, una vía de señalización de TGF-p a inhibir puede ser un factor asociado con cualquier señal siempre que tenga un efecto similar (completamente opuesto para inhibidores, antagonistas o similares) al de una vía de señalización de TGF-p se ejerce finalmente como en BMP-7, además de factores a los que se asocian directamente los receptores de TGF-p y TGF-p.

La presente invención puede comprender un único inhibidor de la señal de TGF-p solo o usarlo y comprender varios tipos del mismo según sea necesario.

En una realización, un agente inhibidor de la señal de TGF-p comprende al menos uno de un antagonista de TGF-p, un antagonista de un receptor de TGF-p o un inhibidor de Smad3, otros ingredientes ejemplificados en la presente especificación, un fármaco una sal aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cualquier inhibidor del mismo descrito en otras partes de la presente memoria descriptiva puede usarse como inhibidor de antagonista de TGF-p, antagonista de un receptor de TGF-p y inhibidor de Smad3.

En una realización, el inhibidor de la señal de TGF-p que puede usarse en la presente invención comprende al menos uno de SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida), BMP-7, anticuerpo anti-TGF-p, anticuerpo anti-receptor de TGF-p, ARNip de TGF-p, ARNip de un receptor de TGF-p, oligonucleótido antisentido de TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il-prop-2-enoilo))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, A83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1 -carbotioamida), Stemolecule™ inhibidor de TLK (2-(3-(6-metilpiridina-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina), inhibidor de Stemolecule™ BMP LDN-193189 (6-(4-(piperidina-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidina), SD-208 (2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina), LY364947 (4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina), otros ingredientes ejemplificados en la presente memoria descriptiva, una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Los anticuerpos mencionados pueden ser un anticuerpo neutralizante, pero no se limitan a ellos. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría, se entiende que el efecto de la presente invención se puede lograr mediante un inhibidor de la señal de TGF-p de cualquiera de estas rutas. El efecto del inhibidor de ALK-4, 5 y 7 A83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida) también se demuestra en los Ejemplos. Por tanto, se entiende que también se puede utilizar un inhibidor de ALK-4, 5, 7 en los Ejemplos específicos de la presente invención. Además, el efecto del inhibidor de ALK-52-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina también se demuestra en los Ejemplos. Por tanto, se entiende que también se puede utilizar un inhibidor de ALK-5 en los Ejemplos específicos de la presente invención.

En una realización preferida, el agente inhibidor de la señal de TGF-p utilizado en la presente invención comprende SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida). Esto se debe a que se demostró que se mejora una enfermedad, trastorno o afección asociado con estrés ER en un endotelio corneal (por ejemplo, trastorno relacionado con distrofia corneal endotelial de Fuchs o similar). En una realización preferida, SB431542 está compuesto por estar presente a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 pM en uso, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM en uso, y aún más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1 pM en uso.

La concentración del inhibidor de la señal de TGF-p usado en la presente invención es generalmente de aproximadamente 0,1 a 100 pmol/l, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 30 pmol/l y más preferiblemente de aproximadamente 1 pmol/l. Cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración se puede cambiar de forma apropiada. Ejemplos de otros rangos de concentración incluyen, pero no se limitan a, generalmente alrededor de 0,001 a 100 pmol/l, preferiblemente alrededor de 0,01 a 75 pmol/l, alrededor de 0,05 a 50 pmol/l, alrededor de 1 a 10 pmol/l, alrededor de 0,01 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 10 pmol/l aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 pmol/l aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, Aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 pmol/l; aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 pmol/l aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, aproximadamente de 0,05 a 5,0 pmol/l, aproximadamente de 0,075 a 5,0 pmol/l, aproximadamente de 0,1 a 5,0 pmol/l, aproximadamente de 0,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente de 0,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente de 1,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 pmol/l, alrededor de 4,0 a 5,0 p mol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 pmol/l y más preferiblemente aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 pmol/l y aproximadamente 0,75 a 1,0 pmol/l.

En una realización preferida, un inhibidor de la señal de TGF-p que se usa comprende 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización preferida, el inhibidor de la señal de TGF-p usado en la presente invención comprende BMP-7. Esto se debe a que: se suprimió la fibrosis; se demostró que se retuvo una proteína encargada de las funciones normales y que puede resistir el trasplante en primates. En una realización preferida, se comprende que BMP-7 esté presente en una concentración de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml en uso, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml en uso. La BMP-7 puede estar presente en una concentración de aproximadamente 100 ng/ml en uso o en una concentración de aproximadamente 1000 ng/ml.

En una realización, un inhibidor de la señal de TGF-p puede tratar el fallo mitocondrial. El tratamiento del fallo mitocondrial puede ser, por ejemplo, para la distrofia corneal endotelial de Fuchs, pero no se limita a ello.

Alternativamente, se puede usar un agente para tratar la insuficiencia mitocondrial solo o con otro agente tal como un inhibidor de la señal de TGF-p para terapia oftálmica, especialmente terapia endotelial corneal. Ejemplos de agentes para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociado con insuficiencia mitocondrial incluyen, entre otros, vitaminas utilizadas por un elemento específico de una cadena respiratoria mitocondrial (por ejemplo, vitamina E o un derivado de la misma), cofactores, coenzima Q (ubiquitina), nicotinamida, riboflavina, carnitina, biotina, ácido lipoico y similares.

Ejemplos de enfermedades causadas por insuficiencia mitocondrial pueden incluir hinchazón mitocondrial debido a una disfunción latente de las mitocondrias, disfunción debida al estrés oxidativo (por ejemplo, debido a la acción de los radicales libres o especies reactivas de oxígeno), disfunción debida a un factor genético y enfermedades debido a la falla del mecanismo de fosforilación oxidativa para la producción de energía de las mitocondrias. Hay muchos ejemplos específicos de enfermedades que progresan debido a los factores patológicos descritos anteriormente, pero los relacionados con el campo oftálmico incluyen, pero no se limitan a, atrofia óptica, neuropatía óptica, retinitis pigmentosa y cataratas. Además, como otra forma de la enfermedad, trastorno o afección antes mencionada relacionada con la distrofia corneal endotelial de Fuchs, disminución de la densidad endotelial corneal, formación de guttae, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de la córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, malestar ocular, disminución del contraste, deslumbramiento, edema del estroma corneal y similares también son ejemplos de una enfermedad, trastorno o afección asociado con un endotelio corneal causado por falla mitocondrial.

El fármaco terapéutico o profiláctico de la presente invención puede comprender un ingrediente farmacéutico adicional. Ejemplos representativos de dicho producto farmacéutico incluyen inhibidores de la quinasa Rho, esteroides y similares. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría, esto se debe a que, dado que la inclusión de un inhibidor de la quinasa Rho permite la prevención de la pérdida celular al promover la adhesión de las células endoteliales corneales y la formación de una capa de células endoteliales corneales con una excelente morfología celular y una alta densidad celular, se puede potenciar el efecto de un inhibidor de la señal de TGF-p. La presente invención puede comprender un tipo de inhibidor de la quinasa Rho solo o varios tipos de inhibidores de la quinasa Rho para su uso combinado según sea necesario.

Ejemplos de inhibidores de la quinasa Rho que pueden usarse en la presente invención incluyen compuestos descritos en los siguientes documentos: Patente de los Estados Unidos No. 4,678,783, Patente japonesa No. 3421217, Publicación Internacional No. WO 95/28387, Publicación internacional No. WO 99/20620, Publicación Internacional No. WO 99/61403, Publicación Internacional No. WO 02/076976, Publicación Internacional No. WO 02/076977, Publicación Internacional No. WO 2002/083175, Publicación Internacional No. WO 02/100833, Publicación Internacional No. WO 03/059913, Publicación Internacional No. WO 03/062227, Publicación Internacional No. WO 2004/009555, Publicación Internacional No. WO 2004/022541, Publicación Internacional No. WO 2004/108724, Publicación Internacional No. WO 2005/003101, Publicación Internacional No. WO 2005/039564, Publicación Internacional No. WO 2005/034866, Publicación Internacional No. WO 2005/037197, Publicación Internacional No. WO 2005/037198, Publicación Internacional No. WO 2005/035501, Publicación Internacional No. WO 2005/035503, Publicación Internacional No. WO 2005/035506, Publicación Internacional No. WO 2005/080394, Publicación Internacional No. WO 2005/103050, Publicación Internacional No. WO 2006/057270, Publicación Internacional No. WO 2007/026664 y similares. Cada uno de tales compuestos puede fabricarse mediante los procedimientos descritos en los documentos en los que se describen los compuestos respectivos. Los ejemplos incluyen 1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo, fasudil (1-(5-isoquinolinesulfonil)homopiperazina)), (R)-(+)- trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida) o una sal del mismo (por ejemplo, Y-27632 ((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-dihidrocloruro de ciclohexanocarboxamida monohidrato) y similares) y similares.

La concentración del inhibidor de la Rho quinasa en la presente invención es generalmente de aproximadamente 1 a 100 pmol/l, preferiblemente de aproximadamente 5 a 20 pmol/l y más preferiblemente de aproximadamente 10 pmol/l. Cuando se utilizan varios tipos de los mismos, la concentración se puede cambiar de forma apropiada. Ejemplos de otros rangos de concentración incluyen, pero no se limitan a, generalmente alrededor de 0,001 a 100 pmol/l, preferiblemente alrededor de 0,01 a 75 pmol/l, alrededor de 0,05 a 50 pmol/l, alrededor de 1 a 10 pmol/l, alrededor de 0,01 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 10 pmol/l, aproximadamente 0, 075 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 10 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 4,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 5,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 6,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 7,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 8,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 9,0 a 10 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 50 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 2,5 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 3,0 a 5,0 pmol/l, alrededor de 4,0 a 5,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,25 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,5 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 1,75 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 2,0 a 3,0 pmol/l, aproximadamente 0,01 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,05 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,075 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,1 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,5 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,75 a 1,0 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 35 pmol/l, aproximadamente 0,09 a 3,2 pmol/l, y más preferiblemente de 0,05 a 1,0 pmol/l, de 0,075 a 1,0 pmol/l, de 0,1 a 1,0 pmol/l, de 0,5 a 1,0 pmol/l y de 0,75 a 1,0 pmol/l .

La presente invención se puede administrar como colirios.

La dosificación y la frecuencia de dosificación varían dependiendo del síntoma, la edad, el peso o el formato de dosificación. Por ejemplo, cuando se usa como colirios, una formulación que contiene aproximadamente 0,0001-0,1 % p/v de ingrediente eficaz, preferiblemente aproximadamente 0,003-0,03 % p/v, generalmente se puede administrar 1-10 veces al día, preferiblemente 1-6 veces, más preferiblemente 1-3 veces con aproximadamente 0,01-0,1 ml por dosis para adultos. Cuando se inyecta el medicamento de la presente invención en la cámara anterior, se puede usar una formulación con una concentración que sea de 1/10 a 1/1000 de la concentración descrita anteriormente. Los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente el tipo y la concentración de inhibidor de la señal de TGFp, inhibidor de la quinasa Rho o similares, dependiendo del estado de la enfermedad.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una sustancia inhibidora de la señal de TGFp para tratar o prevenir un trastorno asociado con el estrés del r E de un endotelio corneal. Una sustancia inhibidora de la señal de TGFp se puede usar de manera intercambiable con un inhibidor de la señal de TGFp. Cualquier realización explicada en el presente documento puede usarse para el estrés del ER endotelial corneal y el inhibidor de la señal de TGF-p.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en un endotelio corneal en un sujeto, en el que el procedimiento comprende un paso de administrar una cantidad eficaz de un TGF-inhibidor de la señal p para el sujeto. En este procedimiento, cualquier realización explicada en el presente documento puede usarse para el inhibidor de la señal de TGF-p y la enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del ER de un endotelio corneal.

Los objetivos de administración (trasplante) del medicamento o procedimiento de la presente invención incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, monos y similares). Sin embargo, se prefieren los primates y se prefieren especialmente los seres humanos. Hasta este momento, la terapia endotelial corneal en primates no ha obtenido resultados satisfactorios. En vista de lo anterior, la presente invención proporciona un medicamento y un procedimiento terapéutico innovador. La cantidad eficaz de agente terapéutico de la presente invención que es eficaz en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección específicos puede variar dependiendo de la característica del trastorno o afección. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden determinar la cantidad eficaz mediante una técnica clínica estándar basada en la descripción de este documento. Además, el uso de un ensayo in vitro puede ayudar a identificar el rango óptimo de dosis en algunos casos. Dado que la dosis exacta a usar en una mezcla puede variar dependiendo de la vía de administración o la gravedad de la enfermedad o trastorno, la dosis debe determinarse de acuerdo con el criterio de un médico o el estado de cada paciente. Sin embargo, la dosis, aunque no está particularmente limitada, puede ser, por ejemplo, 0,001, 1, 5, 10, 15, 100 o 1000 mg/kg de peso corporal por dosis o dentro de un intervalo de cualquiera de los dos valores. El intervalo de dosificación no está particularmente limitado, pero ejemplos del mismo pueden ser 1 o 2 dosis por 1, 7, 14, 21 o 28 días o 1 o 2 dosis por un rango entre 2 de cualquiera de los valores. La dosificación, el intervalo de dosificación y el procedimiento de dosificación pueden seleccionarse de manera apropiada dependiendo de la edad, el peso, los síntomas, el órgano diana o similar de un paciente. Además, un fármaco terapéutico preferiblemente comprende un ingrediente eficaz en una cantidad terapéuticamente eficaz o en una cantidad eficaz que ejerce una acción deseada. Se puede reconocer la presencia de un efecto terapéutico cuando un marcador terapéutico disminuye significativamente después de la administración. La dosis efectiva se puede estimar a partir de una curva de respuesta a la dosis obtenida de un sistema de prueba en modelo animal o in vitro.

Como se describió anteriormente, la presente invención se ha descrito mostrando realizaciones preferibles para facilitar la comprensión. La presente invención se describe a continuación con base en ejemplos. La divulgación antes mencionada y los siguientes Ejemplos no se proporcionan con el propósito de limitar la presente invención, sino con el único propósito de ejemplificar. Por tanto, el alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones y ejemplos descritos específicamente en este documento y está limitado únicamente por el alcance de las reivindicaciones.

[Ejemplos]

A continuación, se describen ejemplos de la presente invención. Las muestras biológicas o similares, en su caso, se manejaron de conformidad con las normas dictadas por el Ministry of Health, Labour and Welfare, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, o similares y, en su caso, con base en la Declaración de Helsinki o códigos éticos elaborados con base en ella. Para la donación de ojos utilizados para la investigación se obtuvo el consentimiento de los familiares cercanos de todos los donantes fallecidos. La presente investigación fue aprobada por el comité de ética o un organismo correspondiente del banco de ojos de la University of Erlangen y SightLife™ (Seattle, WA).

La distrofia corneal endotelial de Fuchs conduce a la muerte de células endoteliales corneales. Cuando las células endoteliales corneales restantes no pueden compensar la función de bombeo o la función de barrera perdidas, no se puede mantener la transparencia de la córnea, lo que resulta en ceguera debido a la opacidad corneal. Además, se sabe que las células endoteliales de la córnea de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs producen una matriz extracelular excesiva, lo que da como resultado la hipertrofia de la membrana de Descemet y la formación de guttae. La formación de guttae y la hipertrofia de la membrana de Descemet conduce a la dispersión de la luz o similar que causa una agudeza visual reducida, fotofobia o visión borrosa que compromete significativamente la calidad de vida de un paciente. Las líneas celulares endoteliales corneales inmovilizadas (iFECD) de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs se utilizaron como modelo y se compararon con líneas celulares endoteliales corneales inmovilizadas (iHCEC) de un donante sano para dilucidar la causa de la producción de matriz extracelular y para identificar un objetivo terapéutico.

(Ejemplo de preparación 1: Producción de modelo de línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs)

En el presente ejemplo, se preparó una línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) a partir de células endoteliales corneales de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Procedimiento de cultivo)

Las células endoteliales corneales se desprendieron mecánicamente con una membrana basal de una córnea para investigación comprada en el Seattle Eye Bank. Después de que se utilizó colagenasa para separar y recolectar la célula endotelial corneal de la membrana basal, las células se sometieron a cultivo primario. Para un medio se agregaron Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid (INVITROGEN catálogo No.: 31985-070) al que 8 % FBS (BIOWEST, catálogo No.: S1820-500), 200 mg/ml de C a C L ^ O (No de catálogo SIGMA: C7902-500G), 0,08 % de sulfato de condroitina (No de catálogo SIGMA: C9819-5G), 20 pg/ml de ácido ascórbico (No de catálogo SIGMA: A4544-25G), 50 pg/ml de gentamicina (No de catálogo INVITRo Ge N: 15710-064) y 5 ng/ml de EGF (No de catálogo INVITROGEN: PHG0311) y se aclimataron para una celda alimentadora 3T3 se utilizó como medio basal. Además, las células se cultivaron en un medio basal al que SB431524 (1 pmol/l) y SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonilfenil)-5(4-piridil)imidazol<4-[4-(4-fluorfenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-1H-imidazol-5-il]piridina) (1 pmol/l) (también denominado "medio aclimatado SB203580 SB431542 3T3" en el presente documento).

(Procedimiento de adquisición)

Las células endoteliales de la córnea se obtuvieron con la aprobación de un comité de ética y el consentimiento por escrito de 3 pacientes humanos que sufrían de queratopatía bullosa según un diagnóstico clínico de distrofia corneal endotelial de Fuchs y se sometieron a un trasplante de endotelio corneal (Queratoplastia endotelial de membrana de Descemet = DMEK). Para DMEK, las células endoteliales corneales patológicas se desprendieron mecánicamente con la membrana de Descemet, la membrana basal, y se sumergieron en una solución de conservación de la córnea Optisol-GS (Bauch & Lomb). A continuación, se aplicó tratamiento con colagenasa para recoger enzimáticamente las células endoteliales corneales y las células se cultivaron con un medio aclimatado SB203580 SB431542 3T3. Para las células endoteliales corneales cultivadas de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs, el antígeno T grande de SV40 y el gen hTERT se amplificaron mediante PCR y se introdujeron en un vector lentiviral (pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc). El vector lentiviral se utilizó para infectar células 293T (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japón) con un reactivo de transfección (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) y tres tipos de plásmidos auxiliares (pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.). El sobrenadante del cultivo que comprende virus se recogió después de 48 horas desde la infección. Se utilizaron 5 pg/ml de polibreno y se añadieron a una solución de cultivo de células endoteliales corneales cultivadas de un paciente con distrofia corneal endotelial de Fuchs, y se introdujeron el antígeno T grande de SV40 y el gen hTERT. Se estudiaron imágenes de la línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) de pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs obtenidas con un microscopio de diferencia de fases. Las células endoteliales corneales cultivadas de una córnea de investigación importada del Seattle Eye Bank se inmovilizaron mediante el mismo procedimiento para hacer una línea celular inmovilizada de células endoteliales corneales normales (iHCEC) como control. Cuando se estudian las imágenes de la línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD) y la línea celular endotelial corneal inmovilizada de un donante sano (iHCEC) de un microscopio de diferencia de fases, tanto iHCEC como iFECD tienen una capa de forma poligonal como en las células endoteliales corneales normales. IHCEC e iFECD se mantuvieron y cultivaron con DMEM FBS al 10 %. SB431542 se obtuvo de TOCRIS (número de catálogo: 1614). SB203580 se obtuvo de CALBIOCHEM (número de catálogo: 559389).

(Ejemplo de preparación 2: Confirmación del funcionamiento normal de la línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD))

En el presente ejemplo se confirmó el funcionamiento normal de una línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD).

(Inmunotinción por Na+/K+ -ATPasa y ZO-1)

En primer lugar, se realizó la inmunotinción con Na+/K+ -ATPasa y ZO-1 para confirmar el funcionamiento normal de una línea celular endotelial corneal inmovilizada (iFECD). Esto es para examinar las funciones de las células endoteliales corneales, es decir, las funciones de bombeo y barrera. Na+/K+ -ATPasa y ZO-1 indican funciones normales de bombeo y barrera de las células endoteliales corneales, respectivamente. La tecnología es la siguiente.

(Procedimiento de observación de células con tinción o similar (Prueba histológica))

Las células se observaron con un microscopio de diferencia de fases. Una vez inmovilizadas las células, se aplicó inmunotinción con ZO-1 y Na+/K+ -ATPasa como marcadores asociados a la función para la observación con un microscopio fluorescente. Para una prueba de tinción de tejido, las células cultivadas se colocaron en Lab-Tek™ Chamber Slides™ (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca), se inmovilizaron con formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y se incubaron durante 30 minutos con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. Específicamente, las células cultivadas en Lab-Tek™ Chamber Slides™ (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca) se inmovilizaron en formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente y se incubaron durante 30 minutos con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. Para investigar el fenotipo de las células, se realizó un análisis químico inmunohistológico en ZO-1, que es una proteína asociada con un enlace cercano, y Na+/K+ -ATPasa, que es una proteína asociada con la función de bombeo. Se utilizaron ZO-1 y Na+/K+ -ATPasa como marcadores asociados con las funciones celulares. ZO-1 y Na+/K+ -ATPasa se tiñeron con una dilución 1:200 de anticuerpo policlonal ZO-1 (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA) y anticuerpo monoclonal Na+/K+ -ATPasa (Upstate Biotec, Inc., Lake Placid, NY), respectivamente. Para los anticuerpos secundarios, se utilizó una dilución 1:2000 de IgG anti-ratón de cabra marcado con Alexa Fluor® 488 o con marcaje de Alexa Fluor® 594 (Life Technologies). A continuación, los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) o PI (Sigma-Aldrich). A continuación, se observaron los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Welzlar, Alemania).

Cuando se estudiaron los resultados, se expresaron Na+/K+ -ATPasa y ZO-1 en todas las células de iHCEC e iFECD, lo que demuestra que la función normal se mantiene en la línea celular inmovilizada producida.

Además, se examinaron imágenes de observación morfológica de iHCEC e iFECD de un microscopio electrónico de transmisión (datos no mostrados). Se cultivaron IHCEC e iFECD en un suero transpozo libre con un DMEM y se inmovilizaron en un estado confluente después de una semana, y se observó la morfología con un microscopio electrónico de transmisión. A partir de ello se demostró que iHCEC e iFECD eran una capa de células en la que no se encontraron anomalías morfológicas obvias.

Además, se sabe que las células endoteliales corneales de los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs producen una matriz extracelular excesiva, lo que conduce a la formación de guttae e hipertrofia de la membrana de Descemet. A este respecto, para la expresión de colágeno tipo I, colágeno tipo IV y fibronectina, que son proteínas constituyentes de la matriz extracelular, se cultivaron iHCEC e iFECD en una placa de cultivo y se realizó inmunotinción sobre las mismas. Se demostró que la expresión de colágeno tipo I, colágeno tipo IV y fibronectina aumentó en iFECD en relación con iHCEC. Además, cuando se examinaron los niveles de expresión génica de iHCEC e iFECD cultivadas con PCR en tiempo real, se observó una elevación significativa en los niveles de expresión de colágeno de tipo I y fibronectina y se observó una tendencia de expresión elevada para el colágeno de tipo IV. Se llevaron a cabo exámenes para determinar si iFECD producía una matriz extracelular excesiva como en el endotelio corneal de los pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs. Se cultivaron IHCEC e iFECD sin suero en un transpozo con un DMEM, se inmovilizaron en un estado confluente después de una semana y se aplicaron con tinción HE. Se observó producción de matriz extracelular con hipertrofia significativa en iFECD en relación con iHCEC. En vista de lo anterior, se fabricó una célula modelo de enfermedad que tiene la característica de producir una matriz extracelular excesiva en pacientes con distrofia corneal endotelial de Fuchs. Dado que se espera que el análisis usando las células modelo de la enfermedad contribuya a dilucidar la patología de la distrofia corneal endotelial de Fuchs con muchas preguntas sin respuesta, las células se usaron a continuación para intentar el desarrollo de un fármaco terapéutico para la distrofia corneal endotelial de Fuchs como un ejemplo representativo de enfermedades asociadas con el estrés del retículo endoplásmico.

(Ejemplo 1: Observación morfológica del retículo endoplásmico y las mitocondrias en la distrofia corneal endotelial de Fuchs)

El presente Ejemplo observó si se observa una anomalía morfológica en el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células con el modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs preparado en el Ejemplo de preparación descrito anteriormente como ejemplo representativo para estudiar el estrés del retículo endoplásmico.

(Observación de orgánulos por microscopio electrónico)

A continuación, se observaron las células con un microscopio electrónico para confirmar la elevación de la producción de ECM y el estrés del RE. Como preinmovilización, se inmovilizó un transpozo sembrado con células durante tres horas a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2,5 % con un pH de 7,2 diluido con cacodilato de sodio 0,1 M y se lavó tres veces con cacodilato de sodio 0,1 M. Luego, como post inmovilización, se inmovilizó durante 1 hora a temperatura ambiente con ácido ósmico al 1 % diluido con cacodilato de sodio 0,1 M y se lavó tres veces con agua destilada. Para estudiar la localización y el cambio morfológico de los orgánulos, las células se sumergieron durante 1 hora en acetato de uranilo al 0,5 % a temperatura ambiente. Las células se sumergieron durante 10 minutos en cada uno de etanol al 70 % y etanol al 90 % y se sumergieron durante 20 minutos en etanol al 100 % para su deshidratación. Después, las células se sumergieron en óxido de propileno durante 30 minutos y se sumergieron durante 1 hora a temperatura ambiente en una mezcla de 1 parte de óxido de propileno y 1 parte de resina de araldita. El transpozo se sumergió en la mezcla de resina de araldita y se remojó durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de resina de araldita se cambió tres veces cada 2 horas. Después de 12 horas, la resina de araldita se cambió de nuevo cada 2 horas tres veces. Posteriormente, las células se incubaron en una mezcla de resina de araldita, se incubaron durante 24 horas a 60°C y se endurecieron. Se utilizó un micrótomo (Leica EMUC7, Leica Microsystems, Welzlar, Alemania) para hacer una sección de 300 nm y se recogió en una rejilla. Después de teñir la rejilla, se observó la sección con un microscopio electrónico.

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 2. Se reveló que existe una anomalía morfológica en el retículo endoplásmico y las mitocondrias en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Más específicamente, se observaron retículo endoplásmico y mitocondrias de forma normal en iHCEC, mientras que no se encontró matriz extracelular. Por otro lado, el retículo endoplásmico y las mitocondrias se expandieron para mostrar una anomalía morfológica en iFECD. Además, se encontró matriz extracelular entre las células.

En vista de los resultados, se descubrió que el retículo endoplásmico y las mitocondrias tenían anomalías morfológicas en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Ejemplo 2: Elevación del estrés del retículo endoplásmico en las células endoteliales corneales en la distrofia corneal endotelial de Fuchs)

El presente Ejemplo observó la expresión de chaperonas moleculares GRP78 y GADD153 expresadas en respuesta al estrés del retículo endoplásmico con el fin de examinar si el estrés del retículo endoplásmico está elevado en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs. GADD153 se conoce como una proteína, que se expresa/provoca en respuesta a una variedad de estrés, especialmente estrés en el retículo endoplásmico, interrumpe un ciclo celular y está involucrada en la apoptosis (como documento de referencia, véase Verfaillie T, et al. Cancer Lett.2013 May 28; 332(2): 249-64).

(Materiales y procedimientos)

(Observación de expresión con inmunotinción)

Se confirmó que la expresión de GRP78 y GADD153 asociada con el estrés del RE estaba elevada por inmunotinción. El procedimiento de inmunotinción fue de acuerdo con el Ejemplo de preparación 2 descrito anteriormente. Los anticuerpos se cambiaron por anticuerpos para GRP78 y GADD153 para el experimento.

* Anticuerpos contra GRP78: (sc-376768, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)

* anticuerpos contra GADD153: (sc-575, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)

En resumen, se realizó un experimento como sigue.

Para una prueba de tinción de tejido, las células cultivadas se inmovilizaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) con formaldehído al 4 % y se incubaron durante 30 minutos con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %. Se usaron cada uno de los anticuerpos contra GRP78 y GADD153 a una dilución de 1:200. Para los anticuerpos secundarios, se utilizó una dilución 1:2000 de IgG antirratón de cabra marcada con Alexa Fluor® 488 (Life Technologies). Después, los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). A continuación, se observaron los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Welzlar, Alemania).

*Inmunoprecipitación Western: Se aplicó electroforesis a una proteína extraída y obtenida en un tampón RIPA con poliacrilamida al 7,5 %. La proteína aislada se transfirió a una membrana de PVDF (PALL LIFE SCIENCE (número de catálogo: EH-2222)). Una solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; NaCl 100 mM) (Tb S-T) que comprende monolaurato de polietilensorbitán al 0,1 % (vol/vol) (Nacalai Tesque, número de catálogo: 28353-85) complementado con 5 % de LECHE SECA DESNATa Da (CEl L SIGNALING, número de catálogo: 9999) y una membrana seca durante 1 hora para una operación de bloqueo. La membrana se sumergió en anticuerpos anti-GRP78 diluidos 1000 veces con TBS-T complementado con LECHE SECA DESNATADA al 5 % y se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con TBS-T e incubar con un complejo HRP de anticuerpo IgG de ratón (CELL SIGNALING (número de catálogo: 7074P2)) y lavar, se detectó una banda iluminada con un kit de detección de inmunotransferencia Western ECL-ADVAVCE (GE Healthcare Japan (número de catálogo: RPN2135V)).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios en la presente tecnología.

*Anticuerpos anti-GRP78 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, SC-376768)

*Anticuerpos anti-IRE1 (Ce// Signaling Technology, 14C10)

*Anticuerpos anti-GAPDH (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES, M171-3)

Los anticuerpos secundarios fueron los siguientes.

*IgG anti-conejo marcado con HRP o IgG anti-conejo (Cell Signaling Technology) (dilución 1:5000)

Se incubaron tanto los anticuerpos primarios como los secundarios. La membrana se expuso a la luz con un kit de detección de inmunotransferencia Western ECL Advance (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y luego se estudió con un sistema de imágenes LAS4000S (Fuji Film, Tokio)

(Estimulación celular)

Se estimularon las células durante 24 horas con 10 ng/ml de TGFp2 (R&D SYSTEMS). Además, se utilizaron células estimuladas durante 24 horas con 10 pM de tapsigargina (TG; Alomone Laboratories Ltd., Jerusalén, Israel) como control positivo del estrés del RE.

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 3. Se observó un aumento en la expresión de GRP78 y GADD153, que indican un aumento del estrés del retículo endoplásmico, en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs, en relación con las células endoteliales corneales de una córnea normal.

(Ejemplo 3: TGF-p promueve el estrés del RE en las células endoteliales corneales)

Para confirmar que TGF-p promueve el estrés del RE en las células endoteliales de la córnea, se realizó una inmunotransferencia Western similar al Ejemplo 2 y se observó en el presente Ejemplo la tendencia de GRP78 además de IRE1, que es una proteína de membrana involucrada en la señalización de estrés en un sistema endoplásmico membrana del retículo. Las células se estimularon con TGFp2 10 ng/ml (R&D SYSTEMS). Además, las células estimuladas con tapsigargina (TG; Alomone Laboratories Ltd., Jerusalén, Israel) se utilizaron como control positivo del estrés ER.

(Materiales y procedimientos)

La inmunotransferencia Western se realizó de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 2. Se usaron los siguientes anticuerpos además de los usados en el Ejemplo 2.

*Anticuerpos contra IRE1: (14C10, Cell Signaling Technology)

*TGF-p2: (302-B2-002, R&D SYSTEMS)

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 4. La expresión de un GRP78 chaperona y el sensor de estrés IRE1 fue inducida por TGFp en células modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs y células normales. El nivel de expresión fue alto, especialmente en las células modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs. TG se refiere a tapsigargina, que se utilizó como control positivo del estrés ER.

(Ejemplo 4: Las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs son muy sensibles al estrés del retículo endoplásmico)

En el presente ejemplo, se administró un inhibidor de señal de TGFp SB431542 para examinar si la elevación del estrés del RE se cancela con el fin de mostrar que las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs son altamente sensibles al estrés del retículo endoplásmico.

(Materiales y procedimientos)

SB431542 se obtuvo de TOCRIS (número de catálogo: 1614).

(Tecnología)

Las células endoteliales corneales humanas (iHCEC) o las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) preparadas en los Ejemplos de preparación se sembraron en una placa de cultivo recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron durante aproximadamente 3 días hasta alcanzar la subconfluencia bajo la condición de 5 % de CO² a 37°C. Además, se añadieron TGFp2, SB431542 y TG y las células se incubaron durante 24 horas en condiciones de CO² al 5 % a 37°C. Luego se observaron la morfología celular y la apoptosis bajo un microscopio de diferencia de fases.

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 5. Las células fueron dañadas por TGFp2 solo en iFECD, y se observó una gran cantidad de células flotantes en relación con iHCEC. Las células flotantes se cancelaron con SB431542. Mientras tanto, se observó una gran cantidad de células flotantes especialmente en iFECD debido a TG. sin embargo, esto no se canceló con SB431542. Esto indica que SB431542 no es un supresor de daño celular inespecífico, sino que es específico del daño celular inducido por una señal de TGFp. La Figura 6 muestra un ejemplo típico de los resultados de evaluar la apoptosis en las células de la Figura 5 mediante citometría de flujo, y la Figura 7 muestra un gráfico que representa las células de apoptosis positivas a anexina V en el eje vertical.

(Materiales y procedimientos)

*Citometría de flujo:

Las células endoteliales corneales humanas (iHCEC) o las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) preparadas en los Ejemplos de preparación se sembraron en una placa de cultivo recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron durante aproximadamente 3 días hasta alcanzar un nivel inferior a confluencia bajo la condición de 5 % de CO² a 37°C. Además, se añadieron TGFp2 y SB431542 y las células se incubaron durante 24 horas en condiciones de CO² al 5 % a 37°C. Las células se desprendieron con ACCUMAX. Las células positivas para anexina V o PI se midieron utilizando anexina V y PI y un citómetro de flujo (FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)) con MEBCYTO Apoptosis Kit (Annexin V-FITC Kit) 100 test (4700, MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES).

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 7. Como se muestra, para las células de distrofia corneal endotelial de Fuchs, las células apoptóticas aumentaron debido a TGFp2 y el aumento fue cancelado por SB431542. Se sugiere que la apoptosis, que ocurre espontáneamente en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, puede tratarse o prevenirse su progresión suprimiendo el estrés asociado al retículo endoplásmico (RE) inhibiendo una señal de TGFp.

(Ejemplo 7: El inhibidor de la señal de TGFp suprime la apoptosis en la distrofia corneal endotelial de Fuchs) La presente invención examinó si los inhibidores de la señal de TGFp distintos de SB431542 (A-83-01, inhibidores de ALK5) pueden suprimir la apoptosis en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Esto se observó contando las células positivas a anexina V utilizadas como indicador de apoptosis en este ejemplo.

(Tecnología)

Las células endoteliales corneales humanas (iHCEC) o las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) preparadas en los Ejemplos de preparación se sembraron en una placa de cultivo recubierta con FNC Coating Mix y se cultivaron durante aproximadamente 3 días hasta alcanzar un nivel inferior a confluencia bajo la condición de 5 % de CO² a 37°C. Además, TGFp2, SB431542 y TGFp inhibidor de la señal A-83-01 (Wako, Osaka; catálogo No: 018-22521), inhibidor ALK5 (Wako catálogo No: 012-23021; CAS No 446859-33-2; 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina) se añadieron y las células se incubaron durante 24 horas en la condición de 5 % de CO² a 37°C. Las células se desprendieron con ACCUMAX. Las células positivas a anexina V o PI se midieron usando anexina V y yoduro de propidio (PI) con un citómetro de flujo (FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)).

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 8. Como en el Ejemplo 6, las células positivas a la apoptosis aumentaron debido a TGFp2 y el aumento fue cancelado por SB431542 en las células de distrofia corneal endotelial de Fuchs. Además, se encontró que los inhibidores de A-83-01 y ALK5, que son inhibidores de la señal de TGFp distintos de SB431542, suprimen las células apoptóticas.

En vista de lo anterior, se demostró que una enfermedad, trastorno o afección asociado con el retículo endoplásmico (RE) de un endotelio corneal, especialmente la apoptosis, puede tratarse o prevenirse usando no solo SB431542, sino también un inhibidor de la señal de TGFp.

(Ejemplo 9: Experimento con anticuerpo anti-IGF-p2 e inhibidor de Smad)

Se puede realizar un experimento similar al Ejemplo 8 usando un anticuerpo anti-TGF-p2 (R&D SYSTEMS; catálogo No: AB-112-NA) y un inhibidor de Smad (CALBIOCHEM; catálogo No: 556405).

(Ejemplo 10: Promoción del estrés del ER debido a TGF-p en la distrofia corneal endotelial de Fuchs) En el presente ejemplo, se realizó una inmunotransferencia Western como en el Ejemplo 2 para investigar la expresión ^{de la chaperona molecular GRP78 y CHOP involucradas en la apoptosis debido a una respuesta al estrés del} Er ^para confirmar que el TGF-p provoca un estrés del ER más fuerte en la distrofia corneal endotelial de Fuchs. Además, también se examinó la expresión de PERK y ATF6 fosforilados implicados en la señalización de estrés en una membrana de retículo endoplásmico. Se aplicó una estimulación con 10 ng/ml de TGFp2 (R&D SYSTEMS). También se examinó el cambio cronológico.

(Materiales y procedimientos)

La inmunotransferencia Western se realizó de acuerdo con la descripción del Ejemplo 2. Los siguientes anticuerpos se usaron además de los del Ejemplo 2.

* Anticuerpos contra PERK: (D11A8, Cell Signaling Technology)

* Anticuerpos contra PERK fosforilado: (sc-32577, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)

* Anticuerpos contra ATF6: (73-505, Bio Academia)

* Anticuerpos contra GRP78: (SC-376768, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)

* Anticuerpos contra CHOP: (L63F7, Cell Signaling Technology)

* TGF-p2: (302-B2-002, R&D SYSTEMS)

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 9. Se demostró que TGF-p promueve la fosforilación de PERK, que es un sensor de estrés ER, y promueve la expresión de ATF6. Además, se demostró que aumenta la expresión de la GRP78 chaperona. Se observó una promoción más significativa de la fosforilación y la promoción de la expresión en iFECD en relación con iHCEC. De esta manera, se demostró que TGF-p aumentaba un marcador de estrés ER. Además, se demostró que la expresión de CHOP aumenta y produce apoptosis debido al estrés del RE. Además, se demostró que el aumento se observa después de 3 horas y el efecto del aumento se intensifica después de 6 horas.

(Ejemplo 11: involucración de la insuficiencia mitocondrial en células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs)

En el presente ejemplo, se realizó un experimento para confirmar que el fallo mitocondrial está implicado en las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Procedimiento)

Como se describe en los Ejemplos de preparación antes mencionados, los inventores han establecido HCEC corneal de donante normal (iHCEC) y modelo de células inmovilizadas (iFECD) de células endoteliales corneales humanas (HCEC) de pacientes FECD, que se usaron en el presente Ejemplo. El objetivo del ejemplo es utilizar un modelo celular para investigar la implicación del fallo mitocondrial en FECD.

Se evaluó el potencial de membrana mitocondrial de iFECD e iHCEC con un colorante JC-1 (BD Bioscience, 551302) y MitoTracker® Red CMXRos (Life Technologies, M-7512) para investigar el cambio morfológico en las mitocondrias. Se evaluó la liberación de citocromo c desde las mitocondrias al citoplasma mediante fraccionamiento de mitocondrias con un kit de aislamiento de mitocondrias (Thermo SCIENTIFIC, 89874) e inmunotransferencia Western (anticuerpo anti-citocromo C, abcam, ab13575).

Se evaluaron caspasa 9, caspasa 3 y poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) mediante inmunotransferencia Western en iHCEC estimulada con una estaurosporina estimulante del estrés mitocondrial (abcam, ab120056) con el fin de evaluar la implicación del fallo mitocondrial en la apoptosis.

(Resultados y discusión)

La Figura 10 evalúa el potencial de la membrana mitocondrial mediante el uso de una sonda fluorescente de colorante JC-1. La fluorescencia verde indica mitocondrias y la fluorescencia roja indica potencial de membrana mitocondrial. La falta de fluorescencia roja indica que el potencial de membrana mitocondrial está despolarizado. La fluorescencia roja fue más débil en iFECD que en iHCEC. La Figura 11 evaluó el potencial de la membrana mitocondrial mediante citometría de flujo. Se reveló a partir de las evaluaciones con JC-1 y MitoTracker® que el potencial de membrana mitocondrial es menor en iFECD que en iHCEC (en cada una de las Figuras 10 y 11).

Se observó a partir de la inmunotransferencia Western que el nivel de citocromo c en una fracción mitocondrial es mayor en iFECD que en iHCEC (Figura 12). Dado que en la Figura 12 se observa una fuga de citocromo c de las mitocondrias al citoplasma, se muestra que se ha producido un trastorno mitocondrial en las células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Ejemplo 12: Relación entre trastorno mitocondrial y apoptosis)

En el presente ejemplo, se realizó una inmunotransferencia Western similar al Ejemplo 2 para examinar la expresión de caspasa 9, caspasa 3 y PARP, que son proteínas asociadas con la apoptosis, para determinar si un trastorno mitocondrial en las células endoteliales corneales conduce a daño celular. Se aplicó una estimulación con estaurosporina para inducir un trastorno mitocondrial para examinar el cambio cronológico.

(Materiales y procedimientos)

La inmunotransferencia Western se realizó de acuerdo con las descripciones del Ejemplo 2. Se usaron los siguientes anticuerpos además de los usados en el Ejemplo 2.

* Anticuerpos contra la caspasa 9: (9508S, Cell Signaling Technology)

* Anticuerpos contra la caspasa 3: (9662S, Cell Signaling Technology)

* Anticuerpos contra PARP: (9542S, Cell Signaling Technology)

* Estaurosporina: (ab120056, abcam)

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 13. La Figura 13 muestra los resultados de la evaluación de las señales en sentido descendente mediante inmunotransferencia Western en iHCEC estimulada por un factor de estrés mitocondrial, estaurosporina. Se indujo un trastorno mitocondrial con estaurosporina para activar caspasa 9, caspasa 3 y PARP. La morfología de las mitocondrias de iHCEC fue normal, pero se observó expansión en iFECD cuando se observó con un microscopio electrónico. Las células con potencial de membrana mitocondrial disminuido fueron 11,7 ± 1,7 % en iHCEC, mientras que aumentó significativamente a 41,9 ± 10,2 % en iFECD (p <0,05). Además, se encontró una fuerte fuga de citocromo c al citoplasma en iFECD en relación con iHCEC. En vista de los resultados, el estrés mitocondrial induce la fuga del citocromo c, se observa la activación de la caspasa 9 que se sabe que es activada por un trastorno mitocondrial y se observa la activación de la caspasa 3 y PARP. Por tanto, se entiende que la apoptosis es inducida por un trastorno mitocondrial. Se entiende por lo anterior que un trastorno mitocondrial está involucrado en la patología de FECD.

En vista de lo anterior, es posible evaluar a partir del presente Ejemplo que el fallo mitocondrial está implicado en la patología de FECD y puede utilizarse como diana de un potente agente terapéutico. Dado que se sabe que el estrés ER conduce a un trastorno mitocondrial en muchas especies celulares, se entiende que el alivio del estrés ER con un fármaco puede suprimir un trastorno mitocondrial y aplicarse en la terapia de distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Ejemplo 13: Aumento de proteínas desnaturalizadas en la distrofia corneal endotelial de Fuchs)

El presente ejemplo muestra que una proteína desnaturalizada aumenta en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Para investigar la acumulación de proteínas desnaturalizadas (también denominadas proteína desplegada o proteína plegada incompletamente) en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs, se puede medir la expresión de un agresoma que se expresa en respuesta a una proteína desnaturalizada. Se sabe que las proteínas agregadas debido a una proteína desnaturalizada (o proteína mal plegada) o una anomalía en la degradación de la proteína se ubiquitinan y se acumulan cerca del centrosoma por un motor de dineína que se mueve en los microtúbulos para formar un cuerpo de inclusión llamado agresoma.

En general, los agresomas se forman por choque térmico, infección viral, estrés oxidativo o similares. En humanos, existen informes de asociación de los mismos con enfermedades que involucran cuerpos de inclusión en una célula como los cuerpos de Lewy observados en células nerviosas en la enfermedad de Parkinson, los cuerpos de Mallory observados en células hepáticas de enfermedades hepáticas alcohólicas y los cuerpos vidriosos observados en astrocitos en la esclerosis lateral amiotrófica.

(Materiales y procedimientos)

Se confirmó mediante citometría de flujo que los agresomas se acumulaban en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

(Equipamiento usado)

*Kit de detección de agresomas ProteoStat®: (EZN-51035-K100, Enabling Discovery in Life Science ®)

En resumen, se realizó lo siguiente. Se sembraron 1 x 105 células endoteliales corneales humanas (iHCEC) o células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) en una placa de 6 pozos recubierta con una mezcla de recubrimiento FNC y se cultivaron durante aproximadamente 2 días hasta alcanzar la subconfluencia bajo la condición de CO² al 5 % a 37°C. Además, se añadió TGFp2 (10 ng/ml; R&D SYSTEMS) y las células se incubaron durante 24 horas bajo la condición de CO² al 5 % a 37°C. A continuación, las células se desprendieron con ACCUMAXTM (Funakoshi) y los agresomas se midieron con un citómetro de flujo (FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) utilizando un kit de detección de agresomas ProteoStat®: (EZN-51035-K100, Enabling Discovery in Life Science®.

(Resultados)

Los resultados se muestran en la Figura 14. La intensidad de fluorescencia de los agresomas fue 1,22 veces y significativamente mayor en las células con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) en comparación con la de las células endoteliales corneales humanas (iHCEC). Además, los agresomas aumentaron 1,11 veces por una estimulación de TGF-p2 en la distrofia corneal endotelial de Fuchs y se observaron de manera prominente muertes celulares.

En vista de lo anterior, se muestra que hay muchas proteínas desnaturalizadas en las células de la distrofia corneal endotelial de Fuchs y la cantidad de las mismas aumenta mediante una señal de TGF-p. Se entiende que el estrés del retículo endoplásmico debido a proteínas desnaturalizadas posiblemente esté relacionado con la patología de la distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD).

(Ejemplo 13: Las proteínas desnaturalizadas (proteínas desplegadas) se acumulan en la distrofia corneal endotelial de Fuchs)

El presente ejemplo muestra que las proteínas desnaturalizadas (proteínas desplegadas) se acumulan en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Con el fin de investigar la acumulación de proteínas desnaturalizadas en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs, se puede medir la expresión de un agresoma que se expresa en respuesta a una proteína desnaturalizada. Se sabe que las proteínas agregadas debido a una proteína desnaturalizada (o proteína mal plegada) o una anomalía en la degradación de la proteína se ubiquitinan y se acumulan cerca del centrosoma por un motor de dineína que se mueve en los microtúbulos para formar un cuerpo de inclusión llamado agresoma.

En general, los agresomas se forman por choque térmico, infección viral, estrés oxidativo o similares. En humanos, existen informes de asociación de los mismos con enfermedades que involucran cuerpos de inclusión en una célula como los cuerpos de Lewy observados en células nerviosas en la enfermedad de Parkinson, los cuerpos de Mallory observados en células hepáticas de enfermedades hepáticas alcohólicas y los cuerpos vidriosos observados en astrocitos en la esclerosis lateral amiotrófica.

(Materiales y procedimientos)

Se sembraron células endoteliales corneales humanas (iHCEC) cultivadas o células endoteliales corneales con distrofia corneal endotelial de Fuchs (iFECD) en una placa de cultivo recubierta con una mezcla de recubrimiento FNC y se cultivaron durante aproximadamente 3 días hasta alcanzar la subconfluencia en la condición de CO² al 5 % a 37°C. A continuación, las células se desprendieron con ACCUMAXTM (Funakoshi) y los agresomas se tiñeron con un kit de detección de agresomas ProteoStat®: (EZN-51035-K100, Enabling Discovery in Life Science®) y se midieron con un citómetro de flujo (FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey).

(Resultados)

La cantidad de expresión de agresomas es mayor en iFECD en relación con iHCEC. Esto puede interpretarse como una indicación de que las proteínas desnaturalizadas se acumulan en un modelo de distrofia corneal endotelial de Fuchs.

Los resultados de los agresomas y las proteínas desnaturalizadas muestran que el estrés del retículo endoplásmico debido a los agresomas y las proteínas desnaturalizadas está implicado en la distrofia corneal endotelial de Fuchs con respecto a las señales de TGF-p.

(Ejemplo 15: Diagnóstico usando agresomas como indicador)

El presente Ejemplo demuestra que es posible el diagnóstico usando agresomas. Los agresomas se pueden medir basándose en las descripciones de los Ejemplos 13-14 o similares.

Un procedimiento para inyectar un tinte capaz de teñir agresomas en una cámara anterior o similar puede evaluar la deposición de agresomas en células endoteliales corneales para su uso en el diagnóstico.

(Ejemplo 16: Ejemplo de preparación para colirios)

Ejemplo de preparación para colirios

A continuación, se muestra la composición de una sustancia probada en concentraciones respectivas.

SB431542 (disponible en TOCRIS, etc.) 0,1-30 mM, preferiblemente 1-10 mM

Cloruro de sodio 0,85 g

Dihidrogenofosfato de sodio dihidrato 0,1 g

Cloruro de benzalconio 0,005 g

Hidróxido de sodio cantidad apropiada

Agua purificada cantidad apropiada

Cantidad total 100 mg (pH 7,0).

Las colirios también se pueden diluir con un agente base.

La composición de la base es la siguiente

Cloruro de sodio 0,85 g

Dihidrogenofosfato de sodio dihidrato 0,1 g

Cloruro de benzalconio 0,005 g

Hidróxido de sodio cantidad apropiada

Agua purificada cantidad apropiada

Cantidad total 100 mg (pH 7,0)

Se entiende que el alcance de la presente invención debe interpretarse únicamente con base en las reivindicaciones. La presente solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes de Patente Japonesa Nos. 2013-227048 y 2014-184172.

[Aplicabilidad industrial]

La presente invención proporciona una técnica disponible en industrias (industria de cultivo celular, farmacéutica y similares) relacionada con un fármaco profiláctico terapéutico para una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del RE en un endotelio corneal, especialmente una enfermedad, trastorno o condición asociado con estrés ER o apoptosis en la distrofia corneal endotelial de Fuchs, que comprende un inhibidor de la señal de TGFp.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un fármaco terapéutico o profiláctico para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) inducido por TGF-p en un endotelio corneal, que comprende un inhibidor de la señal de TGF-p, en el que la enfermedad, el trastorno o la afección está relacionado con la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

2. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso según la reivindicación 1, en el que el fármaco terapéutico o profiláctico suprime la enfermedad, trastorno o afección que comprende un trastorno de una célula endotelial corneal en la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

3. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el fármaco terapéutico o profiláctico suprime al menos una de las enfermedades, trastornos o afecciones seleccionados del grupo que consiste en disminución de la densidad endotelial corneal, formación de guttae, hipertrofia de la membrana de Descemet, hipertrofia de una córnea, trastorno del epitelio corneal, turbidez en el estroma corneal, fotofobia, visión borrosa, discapacidad visual, oftalmalgia, epífora, hiperemia, dolor, queratopatía bullosa, molestias oculares, disminución del contraste, deslumbramiento y edema del estroma corneal.

4. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el inhibidor de la señal de TGF-p comprende al menos uno de 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida, BMP-7, un anticuerpo anti-TGF-p, un anticuerpo anti-receptor de TGF-p, un ARNip de TGF-p, un ARNip de un receptor de TGF-p, un ARNsh de TGF-p, un ARNsh de un receptor de TGF-p, un aptámero de TGF-p, un aptámero de un receptor de TGF-p, un oligonucleótido antisentido de TGF-p, 6,7-dimetoxi-2-((2E)-3-(1-metil-2-fenil-1H-pirrolo[2,3-b] piridin-3-il-prop-2-enoil))-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolona, 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida, 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, 6-(4-(piperidin-1-il)etoxi)fenil)-3-(piridin-4-il) pirazolo[1,5-a]pirimidina, 2-(5-cloro-2-fluorofenil)-4-[(4-piridinil)amino]pteridina, 4-[3-(2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-quinolina, A-83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotiamida), una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el inhibidor de la señal de TGF-p comprende 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

6. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un agente terapéutico para el fallo mitocondrial inducido por estrés ER.

7. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de la reivindicación 6, en el que el agente terapéutico para la insuficiencia mitocondrial inducida por estrés ER se selecciona del grupo que consiste en inductor de BiP X (BIX), ácido 4-fenil butírico (PBA), trimetilamina N-óxido (TMAO), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) y teprenona.

8. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el endotelio corneal es de un primate, preferiblemente un ser humano.

9. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende un ingrediente farmacéutico adicional.

10. El fármaco terapéutico o profiláctico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que es colirios.

11. Una sustancia inhibidora de la señal de TGF-p para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o afección asociado con el estrés del retículo endoplásmico (RE) inducido por TGF-p en un endotelio corneal, en la que la enfermedad, trastorno o afección está relacionado a la distrofia corneal endotelial de Fuchs.

12. La sustancia inhibidora de la señal de TGF-p para su uso según la reivindicación 11, caracterizada además por una cualquiera de las características de las reivindicaciones 1-10 y en la que la sustancia inhibidora de la señal de TGF-p tiene una característica del inhibidor de la señal de TGF-p.