JP3421217B2 - Ｒｈｏ標的タンパク質Ｒｈｏキナーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する新規
なタンパク質に関する。

【０００２】背景技術 生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。

【０００３】このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／Ｇ
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。

【０００４】天然のＲｈｏＡタンパク質のＣ末端にはＣ
ｙｓ−Ａ−Ａ−Ｌｅｕ（Ａは脂肪族アミノ酸）構造が存
在し、Ｃｙｓ残基にゲラニルゲラニル基転移酵素の働き
によりゲラニルゲラニル基が結合し、さらにＣｙｓ残基
のカルボキシル基がメチル化される。この脂質による翻
訳後修飾は、Ｒｈｏタンパク質の細胞膜への結合や活性
制御タンパク質との相互作用に必要であるとともに、そ
の機能の発現にも必要であると考えられている（Imazum
i, K. et al., 実験医学 13,646-656 (1995)）。

【０００５】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレスファイバ
ー（stress fiber）やフォーカル接着（focal adhesio
n）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられ
ている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell, 70, 389-399
(1992) ,A. J. Ridley & A. Hall, EMBO J., 13, 2600-
2610 (1994) ）。また、サブファミリーであるＲｈｏタ
ンパク質は、細胞の形態変化（H. F. Parterson et a
l., J.Cell Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着
（Morii, N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926
(1992) 、T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 15
29-1537(1993) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Aca
d. Sci. USA, 92, 10629-10633(1995)^＊、Landanna, C.
et al., Science 271, 981-983 (1996)^＊）、細胞運動
（K. Takaishi et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、
細胞質分裂（cytokinesis ）（K. Kishi et al.,J. Cel
l Biol.,120,1187-1195(1993) 、I. Mabuchi etal.,Zyg
ote,1,325-331(1993)）のような細胞骨格の再編成をと
もなった生理機能にも関連があると考えられている。更
に、Ｒｈｏタンパク質は、平滑筋収縮（K.Hirata et a
l.,J. Biol. Chem.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et
al., FEBSLett., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93,1340〜1345 (199
6) ^＊）、フォスファチジルイノシトール ３−キナー
ゼ（ＰＩ３−キナーゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. C
hem.,268,22251-22254 (1993) ）、フォスファチジルイ
ノシトール ４−リン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５
−キナーゼ）（L. D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1
994)）やｃ−ｆｏｓの発現（C. S. Hill et al.,Cell,8
1,1159-1170(1995) ）の制御にも関与していることが示
唆されている。

【０００６】また、最近では、アミノ酸配列を一部置換
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)^＊、R.Qiu et al.、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) ^＊、およびLe
bowitz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995)
^＊）。

【０００７】更に、Ｒｈｏタンパク質は細胞増殖、細胞
運動、細胞凝集ばかりでなく、平滑筋の収縮をも亢進す
ることが明らかとなってきた。最近の研究によれば、Ｒ
ｈｏタンパク質は平滑筋収縮に関与することが知られて
いる（K. Hirata et al.,J.Biol. Chem. 267, 8719-872
2 (1992) および Noda, M. et al., FEBS Lett., 367,
246-250(1995)) 。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合タンパク質もまた、平滑筋収縮に関与する可能性が高
いと考えられる。

【０００８】ミオシン軽鎖リン酸化は、平滑筋収縮（Ka
mm, K. E. & Stull, J. T., Annu.Rev. Pharmacol. Tox
icol. 25, 593-603 (1985) 、Hartshorne, D. J., & Jo
hnson, D. R., (1987) in Physiology of the Gastroin
testinal Tract, (Johnson,L. R., ed) pp. 423-482, R
aven Press, New York、およびSellers, J. R. & Adels
tein, R. S.in The Enzyme (Boyer, P., and Erevs, E.
G., eds) Vol. 18,pp.381-418, Academic Press, San
Diego, CA (1987))、非筋細胞において起こるストレス
ファイバー形成のためのアクチン−ミオシンの相互作用
（Huttenlocher, A. et al., Curr. Opi. Cell Biol.
7, 697-706 (1995)）において重要な役割を果たす。こ
れは、また、細胞質分裂および細胞運動に対する作用を
有する（Huttenlocher, A. et al., Curr. Opi. Cell B
iol. 7, 697-706 (1995)）。

【０００９】ミオシン軽鎖キナーゼはミオシン軽鎖のＳ
ｅｒ−１９を主として（primarily）リン酸化する（Kam
m, K. E. & Stull, J. T., Annu. Rev. Pharmacol. Tox
icol. 25, 593-603 (1985) 、Hartshorne, D. J. & Joh
nson, D. R., (1987) in Physiology of the Gastroint
estinal Tract, (Johnson, L. R., ed) pp. 423-482, R
aven Press, New York 、Sellers, J. R. & Adelstein,
R. S.in The Enzyme(Boyer, P., and Erevs, E. G., e
ds) Vol. 18, pp. 381-418, Academic Press, San Dieg
o, CA (1987)、およびIkebe, M. & Hartshorne, D. J.
J. Biol. Chem. 260, 10027-10031 (1985)）。ミオシン
軽鎖キナーゼのような特異的なキナーゼの外に、これま
で得られたいずれのプロテインキナーゼもこの部位をリ
ン酸化しない（Tan, J. L. et al., Annu. Rev. Bioche
m. 61, 721-759(1992)）。

【００１０】平滑筋を、血管収縮物質のようなアゴニス
トで刺激すると、Ｃａ²⁺は細胞質中へ移動する。Ｃａ²⁺
はカルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼを活性化
する。ミオシン軽鎖のリン酸化によりミオシン−アクチ
ンの相互作用が誘導され、これによりミオシンＡＴＰア
ーゼが活性化され（Kamm, K. E. & Stull, J. T., Ann
u. Rev. Pharmacol. Toxicol. 25, 593-603 (1985) 、H
artshorne, D. J., & Johnson, D. R., (1987) in Phys
iology of the Gastrointestinal Tract, (Johnson, L.
R., ed) pp. 423-482, Raven Press, New York、およ
びSellers, J. R.& Adelstein, R. S.in The Enzyme (B
oyer, P., and Erevs, E. G., eds) Vol.18, pp. 381-4
18, Academic Press, San Diego, CA (1987)）、次いで
これにより平滑筋の収縮が誘導される（Kamm, K. E. &
Stull, J. T., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 25, 5
93-603 (1985) 、Hartshorne, D. J., & Johnson, D.
R.,(1987) in Physiology of the Gastrointestinal Tr
act, (Johnson, L. R., ed) pp. 423-482, Raven Pres
s, New York、およびSellers, J. R. & Adelstein,R.
S.in The Enzyme (Boyer, P. & Erevs, E. G., eds) Vo
l. 18, pp. 381-418,Academic Press, San Diego, CA
(1987) ）。しかしながら、サイトゾルのＣａ²⁺レベル
は常に収縮レベルに比例するわけではなく、平滑筋収縮
のＣａ²⁺感受性を調節しているこれ以外のメカニズムが
提案された（Bradley, A. B. & Morgan,K. G., J. Phys
iol. 385, 437-448 (1987) ）。ＧＴＰγＳ（非加水分
解性ＧＴＰ類似体）は透過性（スキンド）平滑筋の収縮
に必要なＣａ²⁺濃度を低下させるので、ＧＴＰ結合タン
パク質はＣａ²⁺感受性を調節すると推定された（Kitaza
wa, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88,
9307-9310 (1991) 、Moreland, S. et al., Am. J. Ph
ysiol. 263, 540-544 (1992)）。Ｒｈｏタンパク質はＧ
ＴＰによって増強される平滑筋のＣａ²⁺感受性に関係す
ることが示された（Hirata, K. et al., J. Biol. Che
m. 267, 8719-8722 (1992) ）。最近、透過性を高めた
平滑筋細胞において、submaximalなＣａ²⁺濃度で、ＧＴ
ＰγＳが、ミオシン軽鎖のリン酸化を促進させることが
示され、このミオシン軽鎖のリン酸化の促進はＲｈｏタ
ンパク質の活性化およびミオシン軽鎖の脱リン酸化を担
うミオシン軽鎖ホスファターゼの酵素活性の抑制による
ことが示唆された（Noda, M. etal., FEBS Lett. 367,
246-250 (1995) ）。しかしながら、Ｒｈｏタンパク質
がいかなる機構でミオシン軽鎖ホスファターゼを抑制す
るのか、Ｒｈｏタンパク質によるミオシン軽鎖のリン酸
化の増加がミオシン軽鎖ホスファターゼ活性の抑制だけ
によるものなのかどうか、については依然解明されてい
ない。従って、Ｒｈｏタンパク質がいかなる機構で平滑
筋のＣａ²⁺感受性を調節し、その結果平滑筋の収縮が増
強するのかについては依然解明されていない。

【００１１】以上のように、Ｒｈｏタンパク質は、細胞
の形態変化、細胞接着、細胞運動、細胞質分裂、腫瘍の
形成や転移、血管平滑筋の収縮等の多数のシグナル伝達
経路を調節していることがわかってきた。このことよ
り、Ｒｈｏタンパク質には多数の標的分子があり、上記
の多数のシグナル伝達経路を調節していると考えられて
いる。

【００１２】ごく最近（本願の優先権主張の基礎となる
最初の出願の後において）、哺乳類において、いくつか
の候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質
は、プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. e
t al., Science 271, 645-648(1996)^＊; Amano, M. et
al., Science 271, 648-650 (1996) ^＊）、ローフィリ
ン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (199
6)^＊）、シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 3
77, 243-248 (1995)^＊）、ＲＯＫα（Leung, T.et al.,
J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (1995)^＊）、ｐ１
６０^ROCK（Ishizaki, T., et al., EMBO J., 15, 1885-
1893 (1996) ^＊）、ローテキン(Reid,T.etal.,J.Biol.C
hem.,271,13556-13560(1996) ^＊）である。これらのタ
ンパク質はいずれもＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結
合する（ただし、シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タ
ンパク質にも結合する）。

【００１３】これらの内、ＰＫＮはプロテインキナーゼ
Ｃのプロテインキナーゼ触媒領域と高い相同性を有する
触媒領域を有しており、セリン／スレオニン・プロテイ
ンキナーゼ活性を示す（Mukai, H. & Ono, Y., Bioche
m. Biopys. Res. Commun. 199, 897-904 (1994); Muka
i, H. et al., Biochem. Biopys. Res. Commun. 204, 3
48-356 (1994) ）。一方、ＲＯＫα（前掲 Leung, T. e
t al.(1995) ）およびｐ１６０^ROCK（Ishizaki, T., et
al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996) ^＊）もセリン／
スレオニン・プロテインキナーゼ触媒領域様のアミノ酸
配列を有する（前掲Leung, T. et al(1995) ^＊）。

【００１４】一方、上記の哺乳類タンパク質に加えて、
最近、酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、哺乳類
のＲｈｏＡに相当するＲｈｏ１タンパク質の標的タンパ
ク質として、プロテインキナーゼＣ１（ＰＫＣ１）が同
定された（Nonaka, H. et al., EMBO J. 14, 5931-5938
(1995)^＊）。更にごく最近、酵母（Saccharomyces cere
visiae）のＲｈｏ１ｐタンパク質の標的タンパク質とし
て、１，３−β−グルカン合成酵素が同定された（Drgo
nova, J. et al., Science 272, 277-279(1996) ^＊およ
び Qadota, H. et al., Science 272, 279-281(199
6)^＊）。

【００１５】さらに、ごく最近、酵母のＲｈｏ１ｐ標的
タンパク質として、新規のタンパク質ＢＥＭ４が同定さ
れた（Mack, D. et al., Mol. Cell. Biol., 16, 4387-
4395(1996) ^＊、Hirano, H. et al., Mol. Cell. Bio
l., 16, 4396-4403 (1996) ^＊）。

【００１６】しかしながら、活性型Ｒｈｏタンパク質が
関与する細胞情報伝達機構、特に腫瘍形成や平滑筋収縮
に関する機構、は依然として解明されていない。

【００１７】なお、本願の優先権主張の基礎となる最初
の出願の後に発行された刊行物に^＊印を付した。

【００１８】

【発明の概要】今般、本発明者らは、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有
するタンパク質をウシ脳灰白質から単離した。このタン
パク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１
６４ｋＤａであった。また、本発明者らは、このタンパ
ク質（Ｒｈｏキナーゼ）が活性型Ｒｈｏタンパク質のエ
フェクター領域に結合すること、Ｒｈｏキナーゼがキナ
ーゼ活性を示し、そのキナーゼ活性はＧＴＰγＳ・Ｒｈ
ｏタンパク質により亢進されること、Ｒｈｏキナーゼが
その中間部分にコイルド−コイル領域を有すること等を
見出した。すなわち、ＲｈｏキナーゼはＲｈｏタンパク
質の標的となるセリン／スレオニン・キナーゼであり、
Ｒｈｏタンパク質依存的なシグナル伝達経路のメディエ
ーターであることが判明した。また、本発明者らは、Ｒ
ｈｏキナーゼがミオシン軽鎖ホスファターゼのミオシン
結合サブユニットおよびミオシンをリン酸化することお
よび血管平滑筋を収縮させることを見出した。

【００１９】更に、本発明者らは、ヒトＲｈｏキナーゼ
のｃＤＮＡのクローニングに成功した。本発明者らは、
更にまた、培養細胞中へのドミナントアクティブ−Ｒｈ
ｏキナーゼのマイクロインジェクションにより、ストレ
スファイバーおよびフォーカル接着の形成が誘導され、
ドミナントネガティブ−Ｒｈｏキナーゼのマイクロイン
ジェクションによりＬＰＡまたはＲｈｏタンパク質によ
り誘導されたストレスファイバーおよびフォーカル接着
の形成が阻害されること、そしてスタウロスポリンによ
って、インビトロでＲｈｏキナーゼ活性が阻害されたば
かりでなく、Ｒｈｏキナーゼによって細胞に誘導される
ストレスファイバーおよびフォーカル接着の形成も阻害
されることを見出した。本発明は以上の知見に基づくも
のである。

【００２０】即ち、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するタ
ンパク質（以下、「Ｒｈｏキナーゼ」という）の提供を
その目的とする。

【００２１】また、本発明は、該タンパク質の部分タン
パク質、部分タンパク質を含む該タンパク質をコードす
る塩基配列、該塩基配列を含んでなるベクター、該ベク
ターによって形質転換された宿主細胞、該タンパク質等
の製造法、該タンパク質等を含む腫瘍形成または転移抑
制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤、および炎
症性疾患または自己免疫疾患治療剤、活性型Ｒｈｏタン
パク質と該タンパク質等との結合を阻害する物質等のス
クリーニング法、該タンパク質等のプロテインキナーゼ
活性を阻害する物質等のスクリーニング法、ストレスフ
ァイバーまたはフォーカル接着を阻害する物質のスクリ
ーニング法、Ｒｈｏキナーゼの部分アミノ酸配列、該ア
ミノ酸配列等と特異的に反応する抗体、並びに該抗体を
用いた検出法および検出キットの提供をその目的とす
る。

【００２２】

【発明の具体的説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。

【００２３】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいはニペコチン酸等が挙げられる。

【００２４】また、本明細書において「本発明によるタ
ンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用い
られる。

【００２５】更にまた、本明細書において「塩基配列」
とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味す
る。

【００２６】本明細書において、特定の変異を表す場合
には、本来のアミノ酸が最初に、位置番号が二番目に、
そして置換アミノ酸が三番目に示される。例えば「Ｌｙ
ｓ１２１Ｇｌｙ」は、１２１番目のアミノ酸残基である
Ｌｙｓ（Ｋ：リジン）がＧｌｙ（Ｇ：グリシン）で置換
されていることを示す。

【００２７】タンパク質 本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するタン
パク質（Ｒｈｏキナーゼ）またはその誘導体である。こ
こで、Ｒｈｏタンパク質としては、ＲｈｏＡタンパク
質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、または
ＲｈｏＧタンパク質が挙げられる。

【００２８】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価される
タンパク質をいい、例えば、実施例１、４、１１または
１３と同様の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏ
タンパク質との結合が認められたと評価されるタンパク
質を意味するものとする。

【００２９】本明細書においてＲｈｏタンパク質は、Ｒ
ｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実
質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質を
も含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質と
しては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏ
Ａ変異体（ＲｈｏＡ^Val14 ）が挙げられる。

【００３０】本発明において、「プロテインキナーゼ活
性を有するタンパク質」とは、当業者によりプロテイン
キナーゼ活性が認められたと評価されるタンパク質をい
い、例えば、実施例２、５、６〜９または１３と同様の
条件において実験した場合にプロテインキナーゼ活性が
認められたと評価されるタンパク質を意味するものとす
る。

【００３１】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質と結合することによってそのプロテインキナ
ーゼ活性が亢進されるとの性質を有する。ここで「プロ
テインキナーゼ活性」とは、セリン／スレオニン・プロ
テインキナーゼ活性を含む意味で用いられる。

【００３２】本発明によるタンパク質の起源は特に限定
されず、ウシおよびヒトを含むホ乳類由来のものであっ
ても、それ以外を由来とするものであってもよい。ウシ
由来のＲｈｏキナーゼの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる測定で約１６４ｋＤａである。

【００３３】本発明によるタンパク質の例としては、活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキ
ナーゼ活性を有するウシ由来のタンパク質であって、そ
の分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１６４ｋＤ
ａであるタンパク質（以下「ウシＲｈｏキナーゼ」とい
うことがある）が挙げられる。

【００３４】本発明によるタンパク質の例としては、ま
た、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテ
インキナーゼ活性を有するヒト由来のタンパク質（以下
「ヒトＲｈｏキナーゼ」ということがある）が挙げられ
る。

【００３５】本発明によるタンパク質は、例えば、ウシ
脳灰白質から実施例１に記載される方法に従って得るこ
とができる。本明細書において、「タンパク質の誘導
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはタンパク質のカルボキシル末端（Ｃ
末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカル
ボキシル基の一部もしくは全部、および／または、タン
パク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシ
ル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミ
ド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によ
って修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による
修飾は、例えば、タンパク質中に存在する官能基の保
護、タンパク質の安全性および組織移行性の向上、ある
いはタンパク質の活性の増強等を目的として行われる。

【００３６】タンパク質の誘導体としては、具体的に
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル化されているもの（例えば、その水素原
子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘキシル、
フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリルにより
置換されたもの）、アミド型の修飾を受けているもの
（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミド
（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピル
アミド）を形成しているもの）、並びに（３）タンパク
質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基
以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ基
等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の置
換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙げ
られる。

【００３７】本発明によるタンパク質の例としては、配
列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質およびその
誘導体が挙げられる。「ウシＲｈｏキナーゼ」は、この
タンパク質を含む。配列番号１のアミノ酸配列は、例え
ば、そのｃＤＮＡ配列を細菌等において常法に従って発
現させることによって得ることができる。ｃＤＮＡ配列
は前記アミノ酸配列の一部をコードする塩基配列、例え
ば、図９中二重線で示したペプチドに対応するオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用い、市販のｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることによって得ることが
できる（実施例３）。また、本発明によるタンパク質の
例としては、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質およびその誘導体が挙げられる。「ヒトＲｈｏキナ
ーゼ」は、このタンパク質を含む。

【００３８】本発明によるタンパク質の例としては、更
に、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号
１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および
／または挿入され、および／または前記配列番号１のア
ミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠
失されたタンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するも
のが挙げられる。すなわち、ここにいう付加(additio
n)、挿入(insertion) 、置換(substitution)、および欠
失(deletion)とは、配列番号１のアミノ酸配列からなる
タンパク質の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロ
テインキナーゼ活性を損なわない（not damage）ような
ものをいう。

【００３９】また、このような欠失の例は、配列番号１
のアミノ酸配列から９０〜３５９番のアミノ酸配列（プ
ロテインキナーゼ領域）と９４３〜１０６８番のアミノ
酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合領域）とを除いた領域ま
たはその一部の欠失である。具体的には、１〜８９番、
３６０〜９４２番、および／または１０６９〜１３８８
番のアミノ酸配列あるいはこの部分配列の欠失である。

【００４０】本発明の別の面によれば、配列番号１の９
０〜３５９番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領
域）と９４３〜１０６８番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタン
パク質結合領域）とを有するタンパク質が提供される。

【００４１】本発明によるタンパク質の例としては、更
に、配列番号４のアミノ酸配列からなり、前記配列番号
４のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および
／または挿入され、および／または前記配列番号４のア
ミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠
失されたタンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するも
のが挙げられる。ここにいう付加、挿入、置換、および
欠失とは、前記と同様の意味を有する。また、このよう
な欠失の例は、配列番号４のアミノ酸配列から９０〜３
５９番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領域）と９
４３〜１０６８番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタンパク質結
合領域）とを除いた領域またはその一部の欠失である。
具体的には、１〜８９番、３６０〜９４２番、および／
または１０６９〜１３８８番のアミノ酸配列あるいはこ
の部分配列の欠失である。

【００４２】本発明の別の面によれば、配列番号４の９
０〜３５９番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領
域）と９４３〜１０６８番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタン
パク質結合領域）とを有するタンパク質が提供される。
Ｒｈｏキナーゼは、主として大脳および小脳において発
現されるものである（実施例３の（４）参照）。更にＲ
ｈｏキナーゼは、後記する抗体と免疫交差する（実施例
３の（４）および実施例１０参照）。

【００４３】ここで、「主として大脳および小脳におい
て発現される」とは、当業者により大脳および小脳にお
いての発現が、他の部位と比較してより多く認められた
と評価されることをいい、例えば、実施例３の（４）と
同様の条件で実験した場合に大脳および小脳において発
現が他の部位と比較してより多く認められたと評価され
ることをいう。

【００４４】本発明によれば、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さない
タンパク質またはその誘導体が提供される。上記タンパ
ク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からな
り、前記配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸
配列が付加および／または挿入され、および／または前
記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換
および／または欠失されたタンパク質であって、活性型
Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナー
ゼ活性を有さないものが挙げられる。すなわち、ここに
いう付加、挿入、置換、および欠失とは、配列番号１の
アミノ酸配列からなるタンパク質の活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を損なわず、かつプロテインキナーゼ活性を
損なうようなものをいう。

【００４５】このような欠失の例は、配列番号１の９０
〜３５９番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領域）
またはプロテインキナーゼ活性を有するその一部を含む
領域の欠失である。また、このような置換の例は、Ｌｙ
ｓ１２１Ｇｌｙである。

【００４６】また、配列番号１のアミノ酸配列（但し、
付加、挿入、置換および／または欠失を有する）からな
る活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテイ
ンキナーゼ活性を有さないタンパク質またはその誘導体
は、上記付加、挿入、置換および／または欠失に加え
て、そのタンパク質のＲｈｏタンパク質結合能を損なわ
ないような付加、挿入、置換および／または欠失を有し
ていてもよい。

【００４７】このような欠失の例は、配列番号１のアミ
ノ酸配列から９４３〜１０６８番のアミノ酸配列（Ｒｈ
ｏタンパク質結合領域）（実施例１１参照）を除いた領
域またはその一部の欠失である。具体的には、１〜８９
番のアミノ酸配列およびその部分配列、３６０〜９４２
番のアミノ酸配列およびその部分配列、並びに１０６９
〜１３８８番のアミノ酸配列およびその部分配列であ
る。

【００４８】本発明の別の面によれば、配列番号１の４
２１〜１１３７番、４３８〜１１２４番、７９９〜１１
３７番、９４３〜１０６８番、または９４１〜１０７５
番のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその誘導体
が提供される。これらのタンパク質は、活性型Ｒｈｏタ
ンパク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を
有さない。

【００４９】前記タンパク質の例としては、また、配列
番号４のアミノ酸配列からなり、前記配列番号４のアミ
ノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または
挿入され、および／または前記配列番号４のアミノ酸配
列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
タンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を
有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さないものが挙
げられる。すなわち、ここにいう付加、挿入、置換、お
よび欠失とは、配列番号４のアミノ酸配列からなるタン
パク質の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を損なわず、か
つプロテインキナーゼ活性を損なうようなものをいう。

【００５０】このような欠失の例は、配列番号４の９０
〜３５９番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領域）
またはプロテインキナーゼ活性を有するその一部を含む
領域の欠失である。また、このような置換の例は、Ｌｙ
ｓ１２１Ｇｌｙである。

【００５１】また、配列番号４のアミノ酸配列（但し、
付加、挿入、置換および／または欠失を有する）からな
る活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテイ
ンキナーゼ活性を有さないタンパク質またはその誘導体
は、上記付加、挿入、置換および／または欠失に加え
て、そのタンパク質のＲｈｏタンパク質結合能を損なわ
ないような付加、挿入、置換および／または欠失を有し
ていてもよい。このような欠失の例は、配列番号４のア
ミノ酸配列から９４３〜１０６８番のアミノ酸配列（Ｒ
ｈｏタンパク質結合領域）（実施例１１参照）を除いた
領域またはその一部の欠失である。具体的には、１〜８
９番のアミノ酸配列およびその部分配列、３６０〜９４
２番のアミノ酸配列およびその部分配列、並びに１０６
９〜１３８８番のアミノ酸配列およびその部分配列であ
る。

【００５２】本発明の別の面によれば、配列番号４の９
４３〜１０６８番または９４１〜１０７５番（配列番号
１の９４１〜１０７５番のアミノ酸配列に対応）のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質またはその誘導体が提供さ
れる。これらのタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さな
い。

【００５３】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有しないタンパク質または
その誘導体は、また、活性型Ｒｈｏタンパク質によるＲ
ｈｏキナーゼのキナーゼ活性の活性化を阻害する。例え
ば、実施例１３に記載したように、インビトロにおい
て、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテ
インキナーゼ活性を有しないタンパク質またはその誘導
体の一例である配列番号１の９４１〜１０７５番のアミ
ノ酸配列を含むＧＳＴ融合タンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質によるＲｈｏキナーゼのキナーゼ活性の活性
化を阻害する。このように、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有しないタ
ンパク質またはその誘導体は、活性型Ｒｈｏタンパク質
によるＲｈｏキナーゼの活性化を阻害（即ち、活性型Ｒ
ｈｏタンパク質からＲｈｏキナーゼへのシグナル伝達を
遮断）するために用いることができる。

【００５４】本発明の別の面によれば、配列番号１また
は４のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１または４
のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／
または挿入され、および／または前記配列番号１または
４のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／ま
たは欠失され、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質および／ま
たはＲｈｏキナーゼの機能を阻害する、タンパク質およ
びその誘導体（すなわち、ドミナントネガティブ（domi
nant negative ）Ｒｈｏキナーゼ）が提供される。

【００５５】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有しないタンパク質または
その誘導体は、細胞内に内在的に存在するＲｈｏキナー
ゼに対して優勢的に働き（dominate）、その作用が不活
性的（negative）である。従って、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有し
ないタンパク質またはその誘導体は、「ドミナントネガ
ティブＲｈｏキナーゼ」の一形態である。

【００５６】ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼの更
なる例は、配列番号１または４の９４１〜１０７５番ま
たは９４３〜１０６８番のアミノ酸配列、配列番号１ま
たは４の１１２５〜１３８８番のアミノ酸配列、または
１２１番のＬｙｓがＧｌｕによって置換された配列番号
１または４の６〜５５３番のアミノ酸配列からなるタン
パク質である。

【００５７】「活性型Ｒｈｏタンパク質および／または
Ｒｈｏキナーゼの機能」としては、例えば、（ストレス
ファイバー形成やフォーカル接着の形成等の細胞形態変
化や細胞接着の誘導、血小板や白血球の凝集の誘導、平
滑筋収縮の誘導、細胞質分裂の誘導、遺伝子転写活性化
の誘導、腫瘍形成や癌細胞の浸潤・転移の誘導等）が挙
げられる。

【００５８】ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼは、
それを細胞内に存在させた場合に、細胞内に内在的に存
在する活性型Ｒｈｏタンパク質やＲｈｏキナーゼの機能
を阻害する。例えば、実施例１５〜１８に示した様に、
ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼの一例である配列
番号１の９４１〜１０７５番のアミノ酸配列を含むＧＳ
Ｔ融合タンパク質（Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ））、配列番
号１の１１２５〜１３８８番のアミノ酸配列を含むＧＳ
Ｔ融合タンパク質（Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ））、または
置換Ｌｙｓ１２１Ｇｌｙを有する配列番号１の６〜５５
３番のアミノ酸配列を含むＧＳＴ融合タンパク質（Ｒｈ
ｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ））をＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞
内にマイクロインジェクションした場合に、Ｓｗｉｓｓ
３Ｔ３細胞のストレスファイバー形成およびフォーカル
接着形成が阻害された。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞のストレ
スファイバー形成およびフォーカル接着形成の誘導は、
活性型Ｒｈｏタンパク質の代表的な生物学的な機能のひ
とつである（実施例１５および１６、Ridley, A. & Hal
l, A., Cell 70, 389-399 (1992) および Ridley,A. &
Hall, A., EMBO J., 13, 2600-2610 (1994)）。この
ように、ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼは、それ
を細胞内に存在させることによって、細胞内に内在的に
存在する活性型Ｒｈｏタンパク質の作用、例えば活性型
Ｒｈｏタンパク質による内在性Ｒｈｏキナーゼの活性化
およびストレスファイバー形成およびフォーカル接着形
成を阻害するために用いることができる。

【００５９】本発明によれば、また、プロテインキナー
ゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有
さないタンパク質またはその誘導体が提供される。ここ
で「プロテインキナーゼ活性」とは、セリン／スレオニ
ン・プロテインキナーゼ活性を含む。

【００６０】上記タンパク質の例としては、配列番号１
のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配
列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入さ
れ、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１
以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパ
ク質であって、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有さないものが挙げられ
る。すなわち、ここにいう付加、挿入、置換、および欠
失とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
のプロテインキナーゼ活性を損なわず、かつ活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合能を損なうようなものをいう。

【００６１】このような欠失の例は、配列番号１の９４
３〜１０６８番のアミノ酸配列または活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有するその一部を含む領域の欠失であ
る。

【００６２】また、配列番号１のアミノ酸配列（但し、
付加、挿入、置換、および／または欠失を有する）から
なるプロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能を有さないタンパク質またはその誘導
体は、上記付加、挿入、置換、および／または欠失に加
えて、そのタンパク質のプロテインキナーゼ活性を損な
わないような付加、挿入、置換、および／または欠失を
有していてもよい。このような欠失の例は、配列番号１
のアミノ酸配列から９０〜３５９番のアミノ酸配列（プ
ロテインキナーゼ領域）を除いた領域またはその一部の
欠失が挙げられる。具体的には、１〜８９番のアミノ酸
配列およびその部分配列、並びに３６０〜１３８８番の
アミノ酸配列およびその部分配列の欠失である。

【００６３】本発明の別の面によれば、配列番号１の９
０〜３５９番のアミノ酸配列を有するタンパク質または
その誘導体が提供される。この様な誘導体の別の例とし
ては、配列番号１の６〜５５３番のアミノ酸配列を有す
るタンパク質がある（実施例７、および１２〜１７）。
このタンパク質は、プロテインキナーゼ活性を有し、か
つ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有さないものであ
る。

【００６４】前記タンパク質の例としては、また、配列
番号４のアミノ酸配列からなり、前記配列番号４のアミ
ノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または
挿入され、および／または前記配列番号４のアミノ酸配
列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
タンパク質であって、プロテインキナーゼ活性を有し、
かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有さないものが挙
げられる。すなわち、ここにいう付加、挿入、置換、お
よび欠失とは、配列番号４のアミノ酸配列からなるタン
パク質のプロテインキナーゼ活性を損なわず、かつ活性
型Ｒｈｏタンパク質結合能を損なうようなものをいう。

【００６５】このような欠失の例は、配列番号４の９４
３〜１０６８番のアミノ酸配列または活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有するその一部を含む領域の欠失であ
る。また、配列番号４のアミノ酸配列（但し、付加、挿
入、置換、および／または欠失を有する）からなるプロ
テインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有さないタンパク質またはその誘導体は、上
記付加、挿入、置換、および／または欠失に加えて、そ
のタンパク質のプロテインキナーゼ活性を損なわないよ
うな付加、挿入、置換、および／または欠失を有してい
てもよい。

【００６６】このような欠失の例は、配列番号４のアミ
ノ酸配列から９０〜３５９番のアミノ酸配列（プロテイ
ンキナーゼ領域）を除いた領域またはその一部の欠失が
挙げられる。具体的には、１〜８９番のアミノ酸配列お
よびその部分配列、並びに３６０〜１３８８番のアミノ
酸配列およびその部分配列の欠失である。

【００６７】本発明の別の面によれば、配列番号４の９
０〜３５９番のアミノ酸配列または６〜５５３番（配列
番号１の６〜５５３番のアミノ酸配列に対応）を有する
タンパク質またはその誘導体が提供される。このタンパ
ク質は、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒ
ｈｏタンパク質結合能を有さない。

【００６８】本発明のもう一つ面によれば、配列番号１
または４のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１また
は４のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加およ
び／または挿入され、および／または前記配列番号１ま
たは４のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および
／または欠失され、かつキナーゼ活性が構成的に活性化
されたタンパク質およびその誘導体（すなわち、ドミナ
ントアクティブ（dominant active ）Ｒｈｏキナーゼ）
が提供される。ここで、「キナーゼ活性が構成的に活性
化された」とは、他の制御因子（例えば、Ｒｈｏタンパ
ク質）の有無に関係なく常にキナーゼ活性が活性化され
ていることをいう。欠失の例としては、前述と同様のも
のが挙げられる。

【００６９】本発明によるプロテインキナーゼ活性を有
し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有しないタン
パク質またはその誘導体は、細胞内に存在させた場合
に、細胞内に内在的に存在するＲｈｏキナーゼに対して
優勢的に働き（dominate）、その作用がアクティブであ
る。従って、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性
型Ｒｈｏタンパク質結合能を有しないタンパク質または
その誘導体は、「ドミナントアクティブＲｈｏキナー
ゼ」の一態様である。

【００７０】ドミナントアクティブＲｈｏキナーゼは、
活性型Ｒｈｏタンパク質が存在しない場合でも強い活性
を示す。例えば、実施例７、１３および１４に記載した
ように、ドミナントアクティブＲｈｏキナーゼの一例で
ある配列番号１の６〜５５３番のアミノ酸配列を含むＧ
ＳＴ融合タンパク質を用いることによって、活性型Ｒｈ
ｏタンパク質非存在下でも、ミオシン軽鎖のリン酸化の
程度を測定することができる。ドミナントアクティブＲ
ｈｏキナーゼのキナーゼ活性の強さは、活性型Ｒｈｏタ
ンパク質非存在下での天然Ｒｈｏキナーゼ（活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合能およびプロテインキナーゼ活性有す
るタンパク質）のキナーゼ活性に比べて遥かに強く、活
性型Ｒｈｏタンパク質存在下での精製Ｒｈｏキナーゼの
キナーゼ活性よりも強い（実施例７、１３および１
４）。

【００７１】また、ドミナントアクティブＲｈｏキナー
ゼは、それを細胞内に存在させた場合に、常にそのキナ
ーゼ活性が活性化された状態にある。例えば、実施例１
２に記載したように、配列番号１の６〜５５３番のアミ
ノ酸配列を含むＧＳＴ融合タンパク質で、透過性を増し
た摘出平滑筋（スキンド平滑筋）を処理することによ
り、強い平滑筋の収縮を測定することができる。例え
ば、また、実施例１５〜１８に記載したように、配列番
号１の６〜５５３番のアミノ酸配列を含むＧＳＴ融合タ
ンパク質を、線維芽細胞にマイクロインジェクションす
ることにより、線維芽細胞におけるストレスファイバー
やフォーカル接着の顕著な出現を観察することができ
る。ドミナントアクティブＲｈｏキナーゼのこれらの作
用を観察するために、スキンド平滑筋や線維芽細胞に活
性型Ｒｈｏタンパク質とともに投与する必要はない。な
ぜならば、前記のように、ドミナントアクティブＲｈｏ
キナーゼは、活性型Ｒｈｏタンパク質が存在しなくとも
活性化された状態にある（構成的に(constitutively)活
性化されている）からである。

【００７２】以上のように、ドミナントアクティブＲｈ
ｏキナーゼは、活性型Ｒｈｏタンパク質非存在下におい
ても十分に強いキナーゼ活性および生物学的な作用（例
えば平滑筋収縮作用、ストレスファイバーおよびフォー
カル接着形成誘導作用）を示す。従って、これらは、Ｒ
ｈｏキナーゼの活性または作用を測定または観察するの
に有用である。

【００７３】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能とプロテインキナーゼ活性とを有する
もの、あるいはこれらのいずれかを失わせるように改変
されたものである。また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形
成、転移、血小板や白血球の凝集をはじめとして細胞形
態、細胞運動、細胞接着、ストレスファイバーやフォー
カル接着の形成、細胞質分裂等の細胞の機能発現に密接
にかかわっている（前掲Takai, Y., et al. 、G.C.Pren
dergast.et al.、Khosravi-Far, R., et al 、R. Qiu e
t al. 、Lebowitz、P., et al., およびYoshioka,K.et
al. ）。従って、本発明によるタンパク質は、腫瘍の形
成および転移、血小板や白血球の凝集の機構解明に有用
である。

【００７４】また、Ｒｈｏタンパク質は、平滑筋収縮に
関与することが知られている（前掲K. Hirata et al.
および M. Noda et al. ）。従って、本発明によるタン
パク質は、高血圧症、血管攣縮（心血管攣縮および脳血
管攣縮）、狭心症、心筋梗塞、および閉塞性動脈硬化症
のような種々の循環器系疾患の機構の解明にも有用であ
る。

【００７５】塩基配列 本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。この塩基配列の典型的配列は、また、配列番号
５のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。

【００７６】配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のように
ウシ脳由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたもので
ある。このＤＮＡ配列は、ウシＲｈｏキナーゼのオープ
ンリーディングフレームを含み、オープンリーディング
フレームは１〜３番のＡＴＧから始まり、４１６５〜４
１６７番のＴＡＡで終了する。

【００７７】配列番号５のＤＮＡ配列は、ヒト脳由来の
ｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。このＤ
ＮＡ配列は、ヒトＲｈｏキナーゼのオープンリーディン
グフレームを含み、オープンリーディングフレームは１
〜３番のＡＴＧから始まり、４１６５〜４１６７番のＴ
ＡＡで終了する。

【００７８】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号１または４に記載されるアミノ酸配列をコ
ードする種々の塩基配列を選択することができる。従っ
て、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列と
は、配列番号２または５に記載のＤＮＡ配列の一部また
は全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有す
る配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲ
ＮＡ配列も含まれる。

【００７９】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃ
ＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されて
いる方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作
成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを
行う方法、等によって得ることができる。本発明による
塩基配列は、例えば、ウシ脳ｃＤＮＡライブラリーから
図９中二重線で示されたペプチドに対応するオリゴヌク
レオチドをスクリーニングの際のプローブとして用いる
ことによって得ることができる（実施例３参照）。

【００８０】塩基配列が天然由来のものである場合、そ
の起源は特に限定されず、ウシおよびヒトを含むホ乳類
由来のものであっても、それ以外を由来とするものであ
ってもよい。

【００８１】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列の例は、配列番号２の１〜４１６７番のＤＮＡ配列
（オープンリーディグフレームに相当）、配列番号２の
１２６１〜３４１１番、２３９５〜３４１１番、２８２
１〜３２２５番もしくは２８２７〜３２０４番のＤＮＡ
配列（活性型Ｒｈｏタンパク質結合領域に相当）、１３
１２〜３３７２番のＤＮＡ配列（コイルド−コイル領域
に相当）、２６８〜１０７７番もしくは１６〜１６５９
番のＤＮＡ配列（キナーゼ触媒領域に相当）、３３７３
〜４１６４番のＤＮＡ配列（ＰＨ領域に相当）、配列番
号５の２３９５〜３４１１番、２８２１〜３２２５番も
しくは２８２７〜３２０４番のＤＮＡ配列（活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合領域に相当）、２６８〜１０７７番の
ＤＮＡ配列（キナーゼ領域に相当）、３３７３〜４１６
４番のＤＮＡ配列（ＰＨ領域に相当）である。

【００８２】ベクターおよび形質転換された宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、ベク
ターが宿主細胞内で複製可能な状態で、かつその塩基配
列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含むベク
ターが提供される。更に、本発明によれば、このベクタ
ーによって形質転換された宿主細胞が提供される。この
宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパ
ク質との融合タンパク質発現系などを用いることができ
る。融合タンパク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトー
ス結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランス
フェラーゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジ
ン、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。

【００８３】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルス
ベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニッ
クリポソームベクター）等が挙げられる。

【００８４】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー
等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明
による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムで）
含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに導入
してよく、このベクターによる宿主細胞の形質転換の方
法も、この分野で慣用されているものを用いることがで
きる。

【００８５】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。

【００８６】また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。上記形質転換された宿主細胞を
適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明に
よるタンパク質を得ることができる。従って、本発明の
別の態様によれば、本発明によるタンパク質の製造法が
提供される。形質転換された宿主細胞の培養およびその
条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様で
あってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク
質の回収、精製も常法に従って行うことができる。

【００８７】形質転換される細胞が例えばガン患者体内
のガン細胞（例えば、白血病細胞、消化器ガン細胞、肺
ガン細胞、スイ臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、子宮ガン細
胞、メラノーマ細胞、脳腫腸細胞等）であるときは、そ
の前記の本発明による塩基配列を含むベクターをヒトを
含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入するこ
とによって、本発明によるタンパク質を発現させること
により、悪性腫瘍等について遺伝子治療を行うことがで
きる。

【００８８】例えば、本発明によるタンパク質（活性型
Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナー
ゼ活性を有さないタンパク質）がヒトを含む生体内で発
現されることにより、活性型Ｒｈｏタンパク質がこれに
結合し（Ｒｈｏキナーゼと活性型Ｒｈｏタンパク質との
結合を阻害し）、その結果として活性型Ｒｈｏタンパク
質からＲｈｏキナーゼへのシグナル伝達が遮断され、Ｒ
ｈｏタンパク質が関与する腫瘍の形成または転移を抑制
できる。遺伝子治療用のベクターについては、高久史磨
監修の実験医学（増刊号）第１２巻、第１５号「遺伝子
治療の最前線」（１９９４年）を参照することができ
る。

【００８９】用途／医薬組成物 ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼは、活性型Ｒｈｏ
タンパク質やＲｈｏキナーゼの作用を阻害する。

【００９０】活性型Ｒｈｏタンパク質は、腫瘍の形成お
よび転移を促進する。第一に、活性型Ｒｈｏタンパク質
には、弱いながらも腫瘍形成活性が見出せる（Perona,
R. et al., Oncogene 8, 1285-1292 (1992) ）。第二
に、Ｒｈｏタンパク質を活性化するＧＤＰ／ＧＴＰ交換
タンパク質が、プロトオンコジーンとして機能すること
が知られている。Ｒｈｏタンパク質を活性化するＧＤＰ
／ＧＴＰ交換タンパク質には、Ｄｂｌ、Ｖａｖ、Ｏｓ
ｔ、Ｌｂｃ等が知られている（Collard, J., Int.J. On
col., 8, 131-138 (1996)^＊）。これらのタンパク質は
すべて、それらのＮ末側が欠失すると、ＮＩＨ３Ｔ３ト
ランスフォーメーション・アッセイにおいて腫瘍形成作
用を示す（Ron, D. et al., EMBO J., 7, 2465-2473 (1
988), Eva, A. et al., Nature 316, 273-275 (1985),
Katzav, S. et al., EMBO J., 8, 2283-2290 (1989), H
orii, Y. et al., EMBO J., 4776-4786 (1994), Tokso
z, D. et al., Oncogene 9, 621-628 (1994) ）。従っ
て、これらのプロトオンコジーンによって活性化される
Ｒｈｏタンパク質は、腫瘍形成を促進すると考えられ
る。第三に、最近、ヒトの腫瘍の約３０％に関与するオ
ンコジーン産物である活性型Ｒａｓタンパク質の下流に
Ｒｈｏシグナル伝達経路が位置し、活性型Ｒａｓタンパ
ク質の腫瘍形成作用の少なくとも一部は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質を介することが明らかになった（Prendergas
t, G. et al., Oncogene 10, 2289-2296 (1995), Khosr
avi-Far, R. et al., Mol. Cell. Biol., 15, 6443-645
3 (1995), Qiu,R. et al., 92, 11781-11785 (199
5)）。最後に、活性型Ｒｈｏタンパク質によって、細胞
周期が促進されることがわかっている（Yamamoto, M. e
t al., Oncogene 10, 1935-1945 (1993), Olson, M. et
al., Science 269, 1270-1272 (1995) ）。以上より、
活性型Ｒｈｏタンパク質は腫瘍形成を促進する。

【００９１】腫瘍形成ばかりでなく、活性型Ｒｈｏタン
パク質は腫瘍の転移を促進する。癌細胞は転移の過程
で、血管内皮細胞や中皮細胞層などの宿主（患者）のバ
リアを越えて浸潤する。例えば、Imamura, F. et al.,
Biophys. Biochem. Res. Commun., 193, 497-503 (199
3) によれば、コンフルエントになった中皮細胞層の上
に高い転移能を示す腹水癌細胞（ＭＭ１細胞）を重層培
養すると、ＭＭ１細胞は中皮細胞の間隙より中皮細胞層
下に進入し、浸潤巣を形成する。この現象は、転移の過
程での癌細胞の浸潤をよく現している。ＭＭ１の細胞浸
潤は、血清存在下あるいはＬＰＡ存在下で著しく亢進す
る。この血清やＬＰＡの亢進作用は、Ｒｈｏタンパク質
阻害剤（ボツリヌス菌の菌体外酵素Ｃ３）で阻害される
ことから、活性型Ｒｈｏタンパク質を介していることが
わかっている。このことは、活性型Ｒｈｏタンパク質
（Ｒｈｏ^{Ｖａｌ１４}）の遺伝子を導入したＭＭ１細胞
が、血清もＬＰＡも存在しない条件で中皮細胞層に浸潤
すること（ Yoshioka, K. et al.,FEBS Lett., 372, 25
-28 (1995) ）により確かめられた。以上より、活性型
Ｒｈｏタンパク質は癌細胞の浸潤や転移を促進する。

【００９２】本発明者等は、後記する実施例において、
ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼにより、活性型Ｒ
ｈｏタンパク質によるＲｈｏキナーゼの活性化が阻害で
きること、およびＬＰＡによって細胞に誘導されるスト
レスファイバーとフォーカル接着の形成が阻害できるこ
とを見出した。活性型Ｒｈｏタンパク質の機能を阻害で
きることから、ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼは
活性型Ｒｈｏタンパク質が促進する上記の腫瘍形成また
は転移の抑制剤（以下「腫瘍形成等抑制剤」という）と
して用いることができる。加えて、細胞接着能の亢進を
阻害することから、ドミナントネガティブＲｈｏキナー
ゼは、一般的に、細胞接着能が亢進している腫瘍の転移
の抑制剤として用いることができる。

【００９３】ここで、腫瘍形成および転移としては、Ｒ
ｈｏが関与する腫瘍の形成、他の低分子量Ｇタンパク質
（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｌ等）が
関与する腫瘍の形成、低分子量Ｇタンパク質のＧＤＰ／
ＧＴＰ交換タンパク質（例えば、Ｄｂｌ、Ｏｓｔ等）が
関与する腫瘍の形成、リソフォスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）が関与する腫瘍の形成、受容体型チロシンキナーゼ
（例えば、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体等）、転写制
御タンパク質（ｍｙｃ、ｐ５３等）または種々のヒト腫
瘍ウイルスが関与する腫瘍の形成等が挙げられる。

【００９４】また、本発明者らは、平滑筋に存在するミ
オシン軽鎖フォスファターゼおよびそのサブユニットの
一つであるミオシン結合サブユニット（Y. h. Chen. et
al., FEBS Lett., 356, 51-55 (1994) ）が、Ｒｈｏキ
ナーゼの最も適した生理的基質であること（実施例２の
（３）、実施例５および実施例６）、ミオシン軽鎖フォ
スファターゼ（ミオシン結合サブユニットを含む）がリ
ン酸化されると該フォスファターゼ活性が抑制されるこ
と（実施例５および実施例６）、Ｒｈｏキナーゼを内因
的に発現していると考えられる細胞においてＲｈｏタン
パク質を発現させるとミオシン結合サブユニットおよび
ミオシン軽鎖がリン酸化されること（実施例６）を見出
した。

【００９５】更に、本発明者らは、ＲｈｏキナーゼがＧ
ＴＰ結合Ｒｈｏタンパク質依存的な様式で単離ミオシン
軽鎖および無傷のミオシンのミオシン軽鎖の双方をリン
酸化すること（実施例７）、Ｒｈｏキナーゼによるミオ
シン軽鎖の主なリン酸化部位がミオシン軽鎖キナーゼに
よりリン酸化されるＳｅｒ−１９であること（実施例
８）、無傷のミオシンのミオシン軽鎖のリン酸化は、ミ
オシン軽鎖のＭｇＡＴＰアーゼ活性を増加すること（実
施例９）、プロテインキナーゼ活性が恒常的に活性化さ
れたＲｈｏキナーゼ誘導体が平滑筋収縮を促進すること
（実施例１２）を見出した。

【００９６】従って、以下の理論に拘束されるわけでは
ないが、Ｒｈｏタンパク質は下記のメカニズムで平滑筋
収縮を促進すると考えられる。 （１）活性型Ｒｈｏタンパク質がＲｈｏキナーゼへ結合
することによりＲｈｏキナーゼのキナーゼ活性が亢進さ
れる。 （２）上記Ｒｈｏキナーゼによってミオシン軽鎖フォス
ファターゼのミオシン結合サブユニットがリン酸化され
る。 （３）上記リン酸化により、ミオシン軽鎖フォスファタ
ーゼのフォスファターゼ活性が抑制され、ミオシン軽鎖
の脱リン酸化が阻害される。 （４）脱リン酸化が抑制された結果、ミオシンはリン酸
化されたままとなる。 （５）また、（１）のＲｈｏキナーゼによってミオシン
軽鎖がリン酸化される。 （６）現象（４）および（５）より、ミオシンとアクチ
ンとの重合が促進されるとともに脱重合が抑制される。 （７）以上の結果、平滑筋収縮が促進されるとともに持
続する。 尚、上記モデルを図２２に示した。

【００９７】このように、ドミナントネガティブＲｈｏ
キナーゼは、平滑筋収縮抑制剤や平滑筋収縮が関与する
種々の循環器系疾患（高血圧症、血管攣縮（心血管攣縮
および脳血管攣縮）、狭心症、心筋梗塞、および閉塞性
動脈硬化症など）の治療剤として用いることができる。

【００９８】本発明によるドミナントネガティブＲｈｏ
キナーゼは、それを細胞内に存在させた場合に、細胞内
に内在的に存在する活性型Ｒｈｏタンパク質の作用を阻
害する。例えば、実施例１５および１６に示した様に、
ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼの一例である配列
番号１の９４１〜１０７５番のアミノ酸配列を含むＧＳ
Ｔ融合タンパク質をＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞内にマイクロ
インジェクションした場合に、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の
ストレスファイバー形成およびフォーカル接着形成の誘
導が阻害された。ストレスファイバー形成およびフォー
カル接着形成の誘導は、活性型Ｒｈｏタンパク質の代表
的な生物学的な機能のひとつである（Ridley, A. & Hal
l, A., Cell 70, 389-399 (1992) および Ridley, A.
& Hall,A., EMBO J., 13, 2600-2610 (1994)および実
施例１５および１６）。このように、ドミナントネガテ
ィブＲｈｏキナーゼは、それを細胞内に存在させること
によって、細胞内に内在的に存在する活性型Ｒｈｏタン
パク質の作用を阻害することができる。

【００９９】活性型Ｒｈｏタンパク質により、細胞接着
または細胞凝集が誘導される。細胞接着または細胞凝集
としては、例えば、血小板の凝集（Morii, N. et al.,
J. Biol. Chem., 29, 20921-20926 (1992)）および白血
球（リンパ球）の凝集（Tominaga, T. et al., J. Cell
Biol., 120, 1529-1537 (1993) およびLaudanna, C.et
al., Science 271, 981-983 (1996)^＊）が挙げられ
る。前掲Morii, N. et al. (1992) によれば、トロンビ
ンやphorbol myristate acetate （ＰＭＡ）によって誘
導されるｇｐＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体依存的な血小板凝
集は、ボツリヌス菌の菌体外酵素Ｃ３（以下Ｃ３菌体外
酵素と呼ぶ）により阻害された。また、Tominaga, T. e
t al. (1993)によれば、ＰＭＡで誘導されるリンパ球機
能関連抗原（ＬＦＡ−１）依存的なリンパ球の凝集も、
Ｃ３菌体外酵素により阻害された。さらに、前掲Laudan
na, C. et al. (1996)^＊によれば、フォルミルペプチド
（formyl peptide; fMLP）、インターロイキン８（ＩＬ
８）あるいはＰＭＡにより刺激されたリンパ球や好中球
の細胞接着も、Ｃ３菌体外酵素により阻害された。そし
て、そのＣ３菌体外酵素は、リンパ球のα４β１および
好中球のβ２インテグリンを介した接着を阻害すること
によるものであった。以上のように、活性型Ｒｈｏタン
パク質は細胞接着および細胞凝集を誘導するが、その細
胞接着および細胞凝集は細胞接着分子（血小板のｇｐＩ
Ｉｂ−ＩＩＩａ複合体、リンパ球のＬＦＡ−１やα４β
１、好中球のβ２インテグリン）を介する。これらの細
胞接着分子はすべて、インテグリン・ファミリーに含ま
れる（Hynes, R. et al., Cell 69, 11-25 (1992) ）。
以上により、活性型Ｒｈｏタンパク質により、インテグ
リンを介した細胞接着が促進される。

【０１００】ストレスファイバーはアクチンとミオシン
を構成成分として有する。本発明者らは、後記する実施
例において、活性型Ｒｈｏタンパク質によりＲｈｏキナ
ーゼが活性化され、それによりアクチンとミオシンの重
合が促されることを示した。最近、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質によるアクチンとミオシンの重合（contractility
）がストレスファイバーおよびフォーカル接着の誘導
に必須であることが示された（Chrzanowska, M. & Burr
idge, K., J. Cell Biol., 133, 1403-1415 (199
6)^＊）。前記のように、活性型Ｒｈｏタンパク質はイン
テグリンを介した細胞接着および細胞凝集を誘導する。
一方、インテグリンはフォーカル接着を担う細胞表面の
接着斑（adhesion plaque ）に局在し、接着斑は細胞内
に伸びるストレスファイバーの起点となることが知られ
ている。活性型Ｒｈｏタンパク質によるアクチンとミオ
シンの重合（即ちストレスファイバー形成）の誘導はイ
ンテグリンのα鎖とβ鎖の界合を促し、そして形成され
たα鎖とβ鎖のヘテロダイマーを核とした接着斑が形成
されることにより細胞が接着および凝集できるようにな
ると考えられる。

【０１０１】以上のことを総合すると、以下の理論に拘
束されるわけではないが活性型Ｒｈｏタンパク質は下記
のメカニズムで細胞接着および細胞凝集を誘導すると考
えられる。 （１）細胞が様々な刺激（例えば、トロンビン、フォル
ミルペプチド、ＩＬ８やＬＰＡ刺激等）を受ける。 （２）細胞内のＲｈｏタンパク質が活性化される。 （３）活性型Ｒｈｏタンパク質により、Ｒｈｏキナーゼ
が活性化される。 （４）活性化Ｒｈｏキナーゼにより、ミオシン軽鎖がリ
ン酸化されるとともに、ミオシン軽鎖ホスファターゼが
抑制されるために被リン酸化ミオシン軽鎖のレベルが上
昇する。 （５）被リン酸化ミオシンにより、ミオシンとアクチン
の重合が促進され、ストレスファイバーが形成される。 （６）その結果、インテグリンのヘテロダイマーが促進
され、接着斑が形成し、細胞が接着および凝集する。

【０１０２】本発明者らは、前記および後記する実施例
に示したように、ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼ
によって、Ｒｈｏキナーゼの活性あるいは活性型Ｒｈｏ
タンパク質によるＲｈｏキナーゼの活性化が阻害される
こと、およびそれにより細胞のストレスファイバーおよ
びフォーカル接着の形成が阻害されることを示した。上
記モデルによれば、ドミナントネガティブＲｈｏキナー
ゼはまた、インテグリンが関与する細胞接着および細胞
凝集を阻害することは明らかである。また、このような
細胞接着・凝集により、細胞が活性化されることがわか
っている。従って、ドミナントネガティブＲｈｏキナー
ゼは、インテグリンが関与する血小板凝集と活性化、免
疫担当細胞（Ｔリンパ球およびＢリンパ球）の凝集・接
着と活性化、炎症性血液系細胞（好中球、好酸球、好塩
基球やマクロファージ）の接着・凝集と活性化等を阻害
することは明らかであり、抗血小板薬、抗炎症薬、抗ア
レルギー薬、自己免疫疾患（慢性関節リウマチやＳＬＥ
等）等の治療薬として用いることができる。

【０１０３】本発明による抑制剤および治療剤は、後述
する遺伝子治療剤を含む意味で用いられる。

【０１０４】本発明による抑制剤および治療剤は、ま
た、経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下
投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましく
は経口投与することができ、薬剤として経口または非経
口投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動
物に使用される。

【０１０５】抑制剤および治療剤は、例えばその用途に
応じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒
剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注
射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいず
れかの製剤形態に調製することができる。これらの各種
製剤は、通常用いられている賦形剤、例えば、増量剤、
結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散
剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭
剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造す
ることができる。使用可能な無毒性の上記添加剤として
は、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、
炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、
ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボ
キシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポ
リエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリ
ン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩
化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが
挙げられる。

【０１０６】薬剤中における本発明のタンパク質の含有
量はその剤形に応じて異なるが、通常全組成物中約０．
１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約２０重量％濃度
である。種々の抑制および治療のための投与量は、用
法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜
決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５００ｍ
ｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とするのがよ
く、これを１日１回または数回に分けて投与することが
できる。

【０１０７】本発明によれば、ドミナントネガティブＲ
ｈｏキナーゼを、腫瘍が形成されている細胞、その腫瘍
が転移する恐れのある細胞、平滑筋の収縮が亢進してい
る細胞、あるいは炎症や自己免疫が亢進している細胞に
存在させることを含む、腫瘍形成または転移の抑制方
法、平滑筋収縮の亢進抑制方法、炎症や自己免疫の亢進
抑制方法、および血小板の凝集の亢進抑制方法が提供さ
れる。この場合の有効投与量、投与方法、および投与形
態等は、前記腫瘍形成等抑制剤に準ずることができる。

【０１０８】ドミナントネガティブＲｈｏキナーゼをコ
ードする塩基配列は、これを有する前記ベクターを用い
て、あるいはこの配列単独で標的細胞を形質転換し、腫
瘍の形成または転移を抑制する様な態様で、平滑筋収縮
の亢進を抑制するような態様で、あるいは炎症や自己免
疫の亢進を抑制するような態様で用いることができる。
すなわち、該塩基配列は腫瘍形成または転移抑制用遺伝
子治療剤、循環器系疾患遺伝子治療剤、炎症性疾患また
は自己免疫疾患遺伝子治療剤、あるいは血小板凝集阻害
用遺伝子治療剤として用いることができる。

【０１０９】スクリーニング法 本発明によれば、（１）スクリーニングの対象となる物
質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有する本発明によるタンパク質とを含むス
クリーニング系に存在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏ
タンパク質と、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定す
ることを含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合能を有する本発明によるタンパク質と
の結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供され
る。

【０１１０】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系での本発明によるタンパク質と
組換え型ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質との
結合をグルタチオンセファロースビーズを用いて測定す
る方法、動物細胞内（細胞系）での本発明によるタンパ
ク質とＲｈｏタンパク質との結合を免疫沈降とイムノブ
ロットとを用いて測定する方法、ツー・ハイブリッド・
システム（two hybridsystem ）（M.Kawabata 実験医
学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.Cell 74,20
5-214(1993) ）等が挙げられ、例えば、実施例１または
４に記載される方法に準じて結合の阻害の程度を測定す
ることができる。また、本明細書において「結合の阻害
の程度を測定する」とは結合の有無の測定を含む意味で
用いられるものとする。

【０１１１】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞（３Ｙ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細
胞、Ｒａｔ１細胞、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞等）、ＣＨＯ
細胞、血液系細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、
神経細胞、骨髄系細胞、グリア細胞、およびアストロサ
イト等が挙げられる。

【０１１２】スクリーニングの対象となる物質は、特に
限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナロ
グ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。

【０１１３】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、プロテインキナーゼ活性を有
する本発明によるタンパク質またはその誘導体を含むス
クリーニング系に存在させ、そして（２）プロテインキ
ナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質またはその
誘導体のプロテインキナーゼの活性の阻害の程度を測定
することを含む、プロテインキナーゼ活性を有する本発
明によるタンパク質またはその誘導体のプロテインキナ
ーゼの活性を阻害する物質のスクリーニング法が提供さ
れる。

【０１１４】本発明によれば、更にまた、（１）スクリ
ーニングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質
と、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテ
インキナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質また
はその誘導体とを含むスクリーニング系に存在させ、そ
して（２）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつ
プロテインキナーゼ活性を有する本発明によるタンパク
質またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性または
その活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキ
ナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質またはその
誘導体のプロテインキナーゼの活性またはその活性の亢
進を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。

【０１１５】「プロテインキナーゼの活性の阻害の程
度」または「プロテインキナーゼ活性の亢進の阻害の程
度」を測定する方法としては、本発明によるタンパク質
の自己リン酸化活性または適当な基質をリン酸化する活
性、または活性型Ｒｈｏタンパク質存在下でこれらの活
性の亢進の程度を測定する方法が挙げられ、例えば、実
施例２および５、６〜９に記載される方法に準じてプロ
テインキナーゼ活性の亢進の阻害の程度を測定すること
ができる。また、本明細書において「プロテインキナー
ゼの活性の阻害の程度」または「プロテインキナーゼ活
性の亢進の阻害の程度」を測定するとは、プロテインキ
ナーゼの活性またはプロテインキナーゼ活性の亢進の阻
害の有無の測定を含む意味で用いられるものとする。

【０１１６】また、後記する実施例において示される様
に、「プロテインキナーゼの活性の阻害の程度」は、ド
ミナントアクティブＲｈｏキナーゼを用いて測定するこ
とができる（実施例７、１２および１４）。この様なＲ
ｈｏキナーゼ誘導体はそのプロテインキナーゼ活性が恒
常的に活性化した誘導体である。

【０１１７】また、後記する実施例において示されるよ
うに、翻訳後修飾を受けた活性型Ｒｈｏタンパク質は、
修飾を受けない活性型Ｒｈｏタンパク質よりもＲｈｏキ
ナーゼのプロテインキナーゼ活性を強く亢進する（実施
例２の（４））。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質とし
て翻訳後修飾を受けたものを用いると、本発明によるス
クリーニングをより明確に行うことができる。

【０１１８】基質としては、非生理的基質（例えば、ミ
エリン塩基性タンパク質、Ｓ６ペプチド、αＰＫＣ、ヒ
ストン、ビンキュリン、タリン、メタビンキュリン、カ
ルデスモン、フィラミン、α−アクチニン、ＭＡＰ−
４）、および生理的基質（例えば、ミオシン、ミオシン
軽鎖、ミオシン軽鎖フォスファターゼ、そのサブユニッ
トの一つであるミオシン結合サブユニット（ＭＢＳ））
が挙げられる。

【０１１９】後記する実施例２および５において示され
るように基質としてミオシン結合サブユニットを用いる
と、活性型Ｒｈｏタンパク質存在下では、非存在下での
それと比較してリン酸化が５〜１５倍亢進される。従っ
て、活性型Ｒｈｏタンパク質存在下でミオシン結合サブ
ユニットを基質として用いると本発明によるスクリーニ
ングをより明確に行うことができる。

【０１２０】また、後記する実施例７において示される
ように基質としてミオシン軽鎖を用いると、活性型Ｒｈ
ｏタンパク質存在下では、非存在下でのそれと比較して
ＲｈｏキナーゼのＫｍ値が約１／５に低下する。従っ
て、活性型Ｒｈｏタンパク質存在下でミオシンまたはミ
オシン軽鎖を基質として用いると本発明によるスクリー
ニングをより明確に行うことができる。スクリーニング
系およびスクリーニング系の対象は、前記スクリーニン
グ法と同様のものが挙げられる。

【０１２１】本発明によれば、（１）スクリーニングの
対象となる物質を、ドミナントアクティブＲｈｏキナー
ゼを存在させることによってストレスファイバーまたは
フォーカル接着の形成が誘導された細胞系に存在させ、
そして（２）前記細胞系のストレスファイバーまたはフ
ォーカル接着の形成の阻害の程度を測定することを含
む、ストレスファイバーの形成を阻害する物質のスクリ
ーニング法が提供される。

【０１２２】ここで、「ストレスファイバーの形成の阻
害の程度を測定する」方法および「フォーカル接着の形
成の阻害の程度を測定する」方法としては、細胞内のア
クチンを蛍光標識したプローブで可視化する方法等が挙
げられ、例えば、実施例１５〜１７に記載される方法に
準じて結合の阻害の程度を測定することができる。ま
た、本明細書において「形成の阻害の程度を測定する」
とは形成の有無の測定を含む意味で用いられるものとす
る。

【０１２３】細胞は、例えば、酵母細胞、ＣＯＳ細胞、
昆虫細胞、線虫細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞（３Ｙ１
細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｒａｔ１細胞、Ｂａｌｂ／
３Ｔ３細胞、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞等）、ＣＨＯ細胞、
血液系細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細
胞、骨髄系細胞、グリア細胞、およびアストロサイト等
が挙げられる。

【０１２４】スクリーニングの対象となるものは、前記
と同様のものが挙げられる。なお、本発明において、
「スクリーニング法」とはアッセイを含む意味で用いら
れるものとする。

【０１２５】活性型Ｒｈｏタンパク質は、前記のよう
に、腫瘍の形成および転移、平滑筋の収縮並びに、血小
板または白血球の凝集または活性化等に密接に関わって
いることが確認されている。従って、上記のスクリーニ
ング法は、腫瘍形成または転移抑制物質、平滑筋の収縮
を阻害する物質、並びに、血小板または白血球の凝集ま
たは活性化を抑制する物質等のスクリーニング法として
も用いることができる。

【０１２６】ペプチドおよび抗体等 本発明によれば、配列番号３に記載されるアミノ酸配列
からなるペプチドおよび配列番号３に記載されるアミノ
酸配列を含んでなるペプチドが提供される。このペプチ
ドは、ウシまたはヒトＲｈｏキナーゼの部分アミノ酸配
列を含んでなるものである。具体的には、配列番号１ま
たは４の６６９〜６８１番のアミノ酸配列（１３アミノ
酸残基）のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を付加した１
４アミノ酸残基からなるペプチドである。配列番号１ま
たは４の６６９〜６８１番のアミノ酸配列は、Ｒｈｏキ
ナーゼのコイルド−コイル領域内に存在する。

【０１２７】このペプチドは、本発明によるタンパク質
に対する抗体を得るための抗原として用いることができ
る。また、本発明によるタンパク質（特に、Ｒｈｏキナ
ーゼ）は、前述のように腫瘍形成または転移および平滑
筋の収縮に密接に関与している。従って、本発明による
ペプチドは、これらの機構の解明等に有用である。

【０１２８】本発明によれば配列番号３に記載されるア
ミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号３に記載
されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに対する抗体
が提供される。本発明において、抗体は、ポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体を含む。

【０１２９】配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含
んでなるペプチドとしては、配列番号３に記載されるア
ミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意のアミ
ノ酸配列を付加したペプチドが挙げられ、これには上記
の本発明によるタンパク質も含まれる。

【０１３０】本発明による抗体は、当業界において通常
用いられる方法によって製造することができる。例え
ば、配列番号３に記載されるペプチドを、任意の担体
（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに動物体内（例
えば、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に注射
し、一定期間の後に、その動物の血清を精製することに
よって得ることができる。

【０１３１】配列番号３に記載されるペプチドは、Ｒｈ
ｏキナーゼの部分アミノ酸配列（配列番号１または４の
６６９〜６８１番のアミノ酸配列）を含んでなるもので
ある。従って、このポリクローナル抗体の特異的な反応
（すなわち、免疫反応）は、Ｒｈｏキナーゼおよびその
改変タンパク質の存在の１つの指標となる。

【０１３２】従って、本発明のもう一つの面によれば、
上記抗体によって認識されるタンパク質、および本発明
によるタンパク質であって上記抗体によって認識される
ものが提供される。

【０１３３】また、本発明の更にもう一つの面によれ
ば、（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を
含む検出系に存在させ、そして（２）検出の対象となる
物質と本発明による抗体との反応の程度を測定すること
を含んでなる、本発明による抗体によって認識される物
質の検出法が提供される。本発明による抗体との反応の
程度を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイ
ムノアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈
降法、および蛍光抗体法（例えば、単クローン抗体実験
マニュアル、講談社、（１９８７年））等が挙げられ、
例えば、実施例３の（４）に記載される方法に準じて反
応の程度を測定することができる。また、本発明におい
て「反応の程度を測定する」とは、反応の有無を測定す
ることをも含む。

【０１３４】本発明による検出法における検出系は、本
発明によるポリクローナル抗体に加えて、例えば、ラテ
ックス粒子等を含んでいてもよい。更に、本発明によれ
ば、本発明による抗体を含んでなる、前記抗体と特異的
に反応する物質の検出キットが提供される。ここで「検
出キット」には、本発明によるタンパク質が関与する疾
患等の検出試薬並びに診断試薬や診断キットも含まれる
ものとする。

【０１３５】本発明による検出法の具体例としては、
（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を担持
してなるラテックス粒子を含む検出系に存在させ、そし
て（２）前記ラテックス粒子の凝集反応の程度を測定す
ることを含んでなる、前記抗体と特異的に反応する物質
の検出法が挙げられる。ラテックス粒子の凝集反応の程
度は、例えば、比濁法、比ろう法のような光学的測定法
によって測定することができる。

【０１３６】本発明による検出キットは、上記検出系と
同様に、ラテックス粒子を含んでいてもよい。この場
合、ラテックス粒子は抗体をその表面上に担持していて
もよい。また、更にラテックス粒子を含む本発明による
検出キットは、前記した検出法の具体例に示されるよう
な態様で用いることができる。検出の対象となる物質と
しては、ヒトを含む動物由来の体液（例えば、血清、血
液等）、尿、便、組織切片、細胞（例えば腫瘍細胞等）
等が挙げられる。

【０１３７】本発明によるポリクローナル抗体と特異的
に反応する物質としては、ウシまたはヒトＲｈｏキナー
ゼおよびその誘導体（配列番号１および４のアミノ酸配
列６６９〜６８１番を含む）並びに配列番号３に記載さ
れるペプチドを含んでなるタンパク質等が挙げられる。

【０１３８】本発明によるポリクローナル抗体と特異的
に反応する物質（例えば、ウシまたはヒトＲｈｏキナー
ゼ）は、活性型Ｒｈｏタンパク質によりそのプロテイン
キナーゼ活性が亢進される。また、Ｒｈｏキナーゼのプ
ロテインキナーゼの生理的基質は、後記実施例によって
示されたように、ミオシン軽鎖フォスファターゼのミオ
シン結合サブユニットや無傷のミオシンである。更に、
ミオシン結合サブユニットを含むミオシン軽鎖フォスフ
ァターゼは、前記のように平滑筋の収縮に起因する種々
の循環器系疾患（例えば、高血圧症、血管攣縮（心血管
攣縮および脳血管攣縮）、狭心症、心筋梗塞、および閉
塞性動脈硬化症）に関与していることが明らかになって
いる。

【０１３９】従って、上記検出法および検出キットは、
本発明によるタンパク質が関与する疾患、Ｒｈｏタンパ
ク質、ミオシン軽鎖フォスファターゼ、ミオシン結合サ
ブユニット、ミオシン、またはミオシン軽鎖が関与する
疾患、例えば、循環器系疾患、の検出法および検出キッ
ト（検出試薬、診断試薬および診断キットを含む）とし
ても用いることができる。

【０１４０】

【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１ 活性型Ｒｈｏタンパク質結合タンパク質の精
製とその同定 （１）脳膜抽出液の調製 ウシ脳灰白質（２００ｇ）を鋏みで切って小片にし、３
００ｍｌのホモジナイズ用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
_２、１０μＭ（ｐ−アミジオノフェニル）−メタンスル
ホニル フルオライド、１ｍｇ／ｌ ロイペプチン、１
０％ スクロース）に懸濁し粗膜画分とした。粗膜画分
のタンパク質を、４Ｍ ＮａＣｌを含むホモジナイズ用
バッファーを添加することにより抽出した。４℃で１時
間振とうした後、膜画分を２０，０００×ｇで１時間、
４℃で遠心分離した。上清画分をバッファーＡ（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に対して３
回透析した。その後、固形硫安を、最終濃度が４０％飽
和濃度となるように添加した。０−４０％硫安で沈殿し
た沈殿物を１６ｍｌのバッファーＡに溶解し、再びバッ
ファーＡに対して３回透析した後、ウシ脳膜抽出液とし
て利用した。

【０１４１】（２）低分子量Ｇタンパク質アフィニティ
ー・カラムの調製 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下「ＧＳ
Ｔ」とする）−ＲｈｏＡ、ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ^{Ａｌａ３７}、ＧＳＴ−Ｒａｃ１およびＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓは、H. Shimizu et al. ，J. Biol. Chem.，269 ，
30407-30411(1994) 、H. Shimizu et al. ，J. Biol. C
hem.，269 ，22917-22920 (1994)に記載の方法により精
製し、グアニン・ヌクレオチドをロードした。ＧＳＴ−
低分子量Ｇタンパク質（各２４ｎｍｏｌ）を１ｍｌのグ
ルタチオン−セファロースカラム４Ｂに固定化し、カラ
ムにつめた。

【０１４２】（３）ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質アフ
ィニティー・カラム・クロマトグラフィー ウシ脳膜抽出液を、１ｍｌのグルタチオン−セファロー
スカラムにかけた。溶出画分を、２４ｎｍｏｌのＧＳ
Ｔ、ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、あるいはＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡを含むグルタチオン−セファロースカ
ラムにロードした。なお、ＧＴＰγＳは、加水分解され
ないＧＴＰのアナログである。グルタチオン−セファロ
ースカラムに結合したタンパク質を、グルタチオンまた
は１％のＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸）を含む
１０ｍｌのバッファーＡで溶出し、溶出画分を１ｍｌづ
つ回収した。溶出画分の一部を、U. K. Laemmli ,Natur
e, 227, 680-685 (1970)に掲載された方法によりＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行い、銀染色した。結果は図１に示される
通りであった。分子量約１６４ｋＤａのタンパク質（ウ
シＲｈｏキナーゼ）が、２〜１０の画分に溶出された。
ウシＲｈｏキナーゼは、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
を含むグルタチオン−セファロースアフィニティーカラ
ムのみから溶出され、ＧＳＴカラム、あるいはＧＤＰ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡカラムからは溶出されなかった。ま
た、ウシＲｈｏキナーゼは、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡ^{Ａｌａ３７}（エフェクター領域にアミノ酸置換を有
するＲｈｏＡ変異タンパク質）からもほとんど溶出され
なかった。ウシＲｈｏキナーゼは、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ
−Ｒａｃ１やＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓのアフィ
ニティーカラムからも溶出されなかった。このように、
ウシＲｈｏキナーゼはエフェクター領域を介して活性型
ＲｈｏＡに特異的に結合することが明かとなった。

【０１４３】（４）ウシＲｈｏキナーゼの精製 ウシＲｈｏキナーゼを精製するために、ＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡを含むグルタチオン−セファロースアフ
ィニティーカラムからの溶出画分（画分３〜１０）を同
量のバッファーＡで希釈し、バッファーＡで平衡化した
Ｍｏｎｏ Ｑ５／５ カラムにロードした。カラムを１
０ｍｌのバッファーＡで洗浄後、タンパク質を、０〜
０．５ＭのＮａＣｌ溶液の直線密度勾配に調整したバッ
ファーＡで溶出し、溶出画分を０．５ｍｌづつ回収し
た。結果は図２に示される通りであった。ウシＲｈｏキ
ナーゼは、画分１０〜１２にシングルピークとして回収
された（図２上段）。溶出画分（８〜１４）の一部を、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色したところ、精製サン
プルの純度は約９５％であった（図２下段）。

【０１４４】（５）オーバーレイアッセイによるＲｈｏ
タンパク質結合タンパク質の同定 Ｍａｎｓｅｒら（E. Manser et al.,J. Biol. Chem.,26
7 ,16025-16028 (1992) ）によって既に記載された方法
を改良して、オーバーレイアッセイを行った。サンプル
を６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ニトロセルロー
ス膜にブロッティングした。ニトロセルロース膜を４℃
で、５分間、６Ｍのグアニジン塩酸を含むバッファーＢ
（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、０．
５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．０５％ トリトンＸ−１００）
中でインキベートした後、さらに３分間バッファーＢ中
でインキュベートした。これを４回繰り返した後、６Ｍ
のグアニジン塩酸を含むバッファーＢを等量加えた。ニ
トロセルロース膜を１０分間振とうし、さらに等量のバ
ッファーＢを１０分毎に５回加えた。ニトロセルロース
膜をバッファーＢに浸してから、１％のウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、０．１％ トリトンＸ−１００、０．
５Ｍ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴを含むリン酸塩バッ
ファー（ＰＢＳ）の中に移した。ニトロセルロース膜
を、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、または
［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}を
含む０．５ｍｌのＧＡＰバッファー（２５ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、２．５ｍＭ ＤＴＴ、５
ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５％トリトンＸ−１００、１
００ｍＭ ＧＴＰ）に１０分間浸した。ニトロセルロー
ス膜は、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．
０、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５％トリトンＸ−１０
０を含むＰＢＳで３回洗浄した後乾燥させて、Ｘ線フィ
ルムに暴露しオートラジオグラフィーを行った。尚、［
^３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、ＤｕＰｏｎｔ Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社から購入した。

【０１４５】結果は図３に示される通りであった。膜抽
出液中の粗精製ウシＲｈｏキナーゼも精製ウシＲｈｏキ
ナーゼも、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡに
結合するが、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
^{Ａｌａ３７}には結合しなかった。このことから、活性型
ＲｈｏＡタンパク質はエフェクタードメインを介して直
接ウシＲｈｏキナーゼと結合していることが示唆され
た。一方、ウシＲｈｏキナーゼはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１には結合しなかった。

【０１４６】実施例２ ウシＲｈｏキナーゼのキナーゼ
活性試験 ウシＲｈｏキナーゼがリン酸化活性を持つかを調べるた
めに、以下の実験を行なった。キナーゼ活性試験は、精
製したウシＲｈｏキナーゼ（１０ｎｇタンパク質量）を
用いて、２μＭ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（６００−８００
ＭＢｑ／ｍｍｏｌ）を含む５０μｌのキナーゼバッファ
ー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０６％ ＣＨＡ
ＰＳ）中で、基質（ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ６ペ
プチド、またはプロテインキナーゼＣの疑似基質を基に
合成したセリンを含んだ合成ペプチド［αＰＫＣ］、各
４０μＭ）の存在下または非存在下で行った。３０℃で
１０分間インキュベート後、自己リン酸化を調べるため
に、反応溶液をＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸し
て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。放射能標識されたバン
ドは、オートラジオグラフィーにより検出した。反応溶
液は、キナーゼ活性試験をするためにワットマンｐ８１
ペイパーにスポットした。^３２Ｐの基質への取り込み
は、シンチレーションカウンターで計測した。結果は以
下に示される通りであった。尚、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から購入した。

【０１４７】（１）活性型ＲｈｏＡタンパク質によるウ
シＲｈｏキナーゼの自己リン酸化活性の亢進は図４に示
される通りであった。精製されたウシＲｈｏキナーゼ
は、インビトロで［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ存在下で自己リ
ン酸化能を示した。この自己リン酸化能は、ＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン３）により約２倍にまで亢
進されたが、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}
（レーン４）やＧＤＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン
２）の亢進効果はＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡよりも
小さかった。なお、用いたＧＳＴ−ＲｈｏＡの濃度は各
１μＭであった。

【０１４８】（２）非生理的基質を使用した場合におけ
る活性型ＲｈｏＡタンパク質によるウシＲｈｏキナーゼ
活性の亢進は図５および図６に示される通りであった。
ウシＲｈｏキナーゼは、ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ
６ペプチド、αＰＫＣを基質として使用した場合にも、
ＧＳＴ−Ｒｈｏ非存在下でこれらをリン酸化した（図５
および図６）。ウシＲｈｏキナーゼによるミエリン塩基
性タンパク質、Ｓ６ペプチド、αＰＫＣのリン酸化は、
ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡにより亢進されたが、Ｇ
ＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの亢進効果は非常に低かった
（図５）。ウシＲｈｏキナーゼによるＳ６ペプチドのリ
ン酸化は、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡで促進された
が、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−ＲａｓおよびＧＤＰ・Ｇ
ＳＴ−Ｈ−Ｒａｓは全く促進効果を示さず、ＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１およびＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１は痕跡程度の
促進効果を示すのみであった（図６）。このように、上
記３種の基質の内、Ｓ６ペプチドがウシＲｈｏキナーゼ
の基質として最も適していた。なお、用いたＧＳＴ−低
分子量Ｇタンパク質の濃度は各１μＭであった。

【０１４９】（３）活性型ＲｈｏＡタンパク質によるウ
シＲｈｏキナーゼキナーゼ活性を亢進する生理的な基質
タンパク質の検索を行った結果は図７に示される通りで
あった。Ｒｈｏタンパク質は細胞骨格の再編成に関係し
ていると考えられているので、ウシＲｈｏキナーゼによ
る細胞骨格制御タンパク質であるビンキュリン（ｖｉｎ
ｃｕｌｉｎ）、タリン（ｔａｌｉｎ）、メタビンキュリ
ン（ｍｅｔａｖｉｎｃｕｌｉｎ）、カルデスモン（ｃａ
ｌｄｅｓｍｏｎ）、フィラミン（ｆｉｌａｍｉｎ）、ビ
メンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、α−アクチニン（E.
A. Clark & J. S.Brugge、Science 、268 、233-239 (1
995)）、ＭＡＰ−４（H. Aizawa et al.、J. Biol. Che
m.、265 、13849-13855 (1990)）、ミオシン軽鎖フォス
ファターゼのミオシン結合サブユニット（Y. H. Chen e
t al. 、FEBS Lett.、356 、51-55(1994)）のリン酸化
について、上記の条件に準じて検討した。ただし、ミオ
シン軽鎖フォスファターゼのミオシン結合サブユニット
については、ラットのミオシン結合サブユニットのＣ末
端（アミノ酸配列の６９９〜９７６番の配列）とマルト
ース結合タンパク質との融合タンパク質の形態で用い
た。この融合タンパク質は、常法により大腸菌で発現し
たものを精製することにより調製した。その結果、ウシ
ＲｈｏキナーゼはＧＳＴ−ＲｈｏＡ非存在下または存在
下で、これらの基質をリン酸化した。ビンキュリン、タ
リン、メタビンキュリン、カルデスモン、フィラミン、
ビメンチン、α−アクチニンまたはＭＡＰ−４を基質と
して用いた場合には、ＧＴＰγＳ・ＲｈｏＡ存在下での
リン酸化の亢進の程度は低かった（データ省略）。しか
しながら、ミオシン結合サブユニット（５０ｎＭ）を基
質として用いると、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在
下で、リン酸化の程度は著しく亢進した（図７）。ＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下でのミオシンサブユニ
ットのリン酸化の亢進の程度は、非存在下でのそれと比
較して、約１５倍であった（図７）。なお、用いたＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡの濃度は各１μＭであった。

【０１５０】（４）ＲｈｏＡの翻訳後修飾の影響 Ｒａｓタンパク質の翻訳後の修飾が、酵母のアデニルシ
クラーゼ（H. Horiuchi et al., Mol. Cell. Biol. ,1
2,4515-4520 (1992) ）やＲａｓタンパク質依存性ＭＡ
Ｐキナーゼキナーゼキナーゼ（Ｂ−Ｒａｆ）（T. Itoh
, et al. , J. Biol. Chem. , 268, 3025-3028(199
3)）では重要なことが知られている。Ｒａｃタンパク質
の翻訳後の修飾も、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化に
は重要である（S. Ando et al., J. Biol. Chem. , 26
7, 25709-25713(1992) ）。そこで、ＲｈｏＡタンパク
質の翻訳後の修飾が、ウシＲｈｏキナーゼのキナーゼ活
性の亢進に影響を及ぼすかどうかを検討した。H. Horiu
chi et al., Mol. Cell. Biol. , 12 , 4515-4520 (199
2)およびT. Itoh et al., J. Biol. Chem. , 268, 3025
-3028(1993) に記載の方法に準じて、翻訳後修飾Ｒｈｏ
Ａタンパク質を作製した。これを用いて、前述の方法に
従って、ウシＲｈｏキナーゼのキナーゼ活性への影響を
調べた。結果は図８に示される通りであった。翻訳後修
飾されたＧＴＰγＳ結合型ＲｈｏＡタンパク質は、非修
飾型よりもＳ６ペプチドのリン酸化活性を亢進した。

【０１５１】実施例３ ウシＲｈｏキナーゼのアミノ酸
配列およびこれをコードするＤＮＡ配列等 （１）ペプチド断片の配列決定 精製したウシＲｈｏキナーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
た後、ポリビニリデン・ジフルオライド膜にトランスフ
ァーした。ウシＲｈｏキナーゼに相当するバンドを、リ
ジルエンドペプチダーゼ、アクロモバクター・プロテア
ーゼＩ、およびエンドプロテイナーゼ Ａｓｐ−Ｎで消
化し（A.Iwamatsu,Electrophoresis,13,142-147(1992)
）、得られたペプチド断片をＣ１８カラムクロマトグ
ラフィーにより分離し、アミノ酸配列を決定した。３７
種のペプチド断片が得られた。

【０１５２】（２）ｃＤＮＡ クローニング ウシＲｈｏキナーゼをコードするｃＤＮＡをクローニン
グするために、ウシ脳ｃＤＮＡライブラリー（合計１．
２×１０^６の独立したプラーク）（クロンテック社）
を、精製したウシＲｈｏキナーゼで決定された部分アミ
ノ酸配列（図９に示したアミノ酸配列の二重下線で示し
た部分）に相当するデジェネレート・オリゴ・プローブ
でスクリーニングした。ライブラリーをスクリーニング
するときのハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold
Spring Habor Laboratory , Cold Spring Harbor , NY
(1989)に記載されている方法に準じて行った。ｃＤＮＡ
の塩基配列を決定するために、単離したλｇｔ１０ファ
ージのポジティブクローンに挿入されていたｃＤＮＡを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（M. A. Al
ting-Mees & J. M. Short , Nucleic Acids Res. ,17,
9494(1989)）にクローン化し、ＡＢＩ社のＤＮＡ シー
ケンサー３７３Ｓで配列を決定した。

【０１５３】（３）配列分析 ウシＲｈｏキナーゼｃＤＮＡの塩基配列および推定アミ
ノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号１に示
される通りであった。ｃＤＮＡ塩基配列から予想される
ウシＲｈｏキナーゼは、１３８８アミノ酸残基からな
り、計算上の分子量は１６０，７９７Ｄａとなり、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで測定した分子量である約１６４ｋＤａと
類似していた。決定した３７種のペプチド断片全てがｃ
ＤＮＡ塩基配列から予想されるウシＲｈｏキナーゼアミ
ノ酸配列に含まれており、これらは図９のアミノ酸配列
の下線で示される。ウシＲｈｏキナーゼの構造の中に
は、Ｎ末端の２６０アミノ酸からなる配列（配列番号１
の９０〜３５９番のアミノ酸配列に相当）にセリンスレ
オニンキナーゼの一つであるマイトニック・ディストロ
フィー・キナーゼ（J. D. Brook et al., Cell , 68 ,
799-808(1992) 、Y. H. Fu et al. , Science, 255, 12
56-1258(1992) 、M. Madadevan et al. , Science, 25
5, 1253-1255 (1992)）のキナーゼドメインと７２％の
相同性を示す特徴的な配列が存在することが明らかにな
った。ウシＲｈｏキナーゼの構造の中央には、ミオシン
・ロッドと相同性を示すコイルド・コイル領域が（配列
番号１の４３８〜１１２４番のアミノ酸配列に相当）、
Ｃ末端側にはジンク・フィンガー領域が（配列番号１の
１２６１〜１３１５番のアミノ酸配列に相当）存在する
ことが明らかとなった。

【０１５４】ウシＲｈｏキナーゼのキナーゼ領域、コイ
ルド・コイル領域、プレクストリン・ホモロジー（Ｐ
Ｈ）領域とマイトニック・ディストロフィー・キナーゼ
のそれらを比較した結果は図１０に示される通りであっ
た。タンパク質のホモロジー検索は、BLAST プログラム
により行った（S. F. Altschul et al., J. Mol. Bio
l., 215, 403-410 (1990) ）。

【０１５５】（４）抗体生産とイムノブロット解析によ
る組織特異的発現の解析 常法により、ウシＲｈｏキナーゼの部分アミノ酸配列６
６９〜６８１（ＫＲＱＬＱＥＲＦＴＤＬＥＫ）に対する
ウサギ・ポリクローナル抗体を作製するため、合成ペプ
チド（ＣＫＲＱＬＱＥＲＦＴＤＬＥＫ：配列番号３のア
ミノ酸配列に相当）を抗原とし、担体としてウシ血清ア
ルブミンを用いて、常法に従って、ウサギを免疫し、血
清を精製した。

【０１５６】ウシＲｈｏキナーゼのイムノブロット解析
は、E. Harlow & D. Lame, Antibodies: A Laboratory
Mannual: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprin
g Harbor , NY (1988)に記載の方法により実施した。タ
ンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを対象に用いて、
M. Bradford , Anal. Biochem., 72 , 248-254 (1976)
に記載の方法により実施した。また、ウサギで作製した
抗ウシＲｈｏキナーゼ抗体がラットのＲｈｏキナーゼと
交差反応を示すことを確認した。

【０１５７】結果は、図１１に示される通りであった。
ウシＲｈｏキナーゼの組織特異的な発現を調べるために
ラットの組織を使った。Ｒｈｏキナーゼの発現は、大脳
と小脳で顕著であり、心臓、脾臓、胸線、肺および腎臓
での発現は弱く、骨格筋、肝臓および膵臓での発現はほ
とんど認められなかった。

【０１５８】実施例４ 活性型ＲｈｏＡタンパク質と組
換えウシＲｈｏキナーゼとの結合 （１）プラスミド構築 インビトロ翻訳によりウシＲｈｏキナーゼのコイルド−
コイル領域のタンパク質を得るために、ｐＧＥＭ−ＨＡ
−Ｒｈｏ−Ｋｉｎａｓｅを次のようにして構築した。ウ
シＲｈｏキナーゼのうち配列番号１の４２１〜１１３７
番のアミノ酸配列に相当する部分をコードする２．２ｋ
ｂのｃＤＮＡを、ウシＲｈｏキナーゼｃＤＮＡ（実施例
３（２））からＰＣＲにより、プライマー５’ＡＴＡＡ
ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴ
ＣＴＴＧ３’、および５’ＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡ
ＡＣＴＧＣＣＴＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＴＣＣ３’を
用いて増幅した。この増幅ｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｈ
ＡのＢａｍＨＩサイトにクローン化した。

【０１５９】（２）インビトロ翻訳 ｐＧＥＭ−ＨＡ−Ｒｈｏ−Ｋｉｎａｓｅを、説明マニュ
アルに記載されている条件で、ＴＮＴ Ｔ７と共役した
レティキュラーサイト・ライセートの系（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社製）を用いてインビトロ翻訳を行い、ウシＲｈｏキ
ナーゼのコイルド−コイル領域のタンパク質を得た。グ
アニン・ヌクレオチド（各０．７５ｎｍｏｌ）をロード
したＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質を、３１μｌのグル
タチオンーセファロース ４Ｂビーズに固定化して、３
１０μｌ（１０倍量）のバッファーＡで洗浄した。固定
化ビーズを、３０μｌのインビトロ翻訳産物混合液に加
え、これに最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにウシ血
清アルブミンを添加し、４℃で１時間穏和に振とうし
た。ビーズは、１０２μｌ（３．３倍量）のバッファー
Ａで６回洗浄して、結合しているタンパク質をＧＳＴ−
低分子量Ｇタンパク質と共に１０ｍＭ グルタチオンを
含む１０２μｌ（３．３倍量）のバッファーＡで３回溶
出した。最初の溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、真空
乾燥後オートラジオグラフィーを行った。結果は図１２
に示される通りであった。

【０１６０】インビトロ翻訳で得たウシＲｈｏキナーゼ
のコイルド−コイル領域のタンパク質は、ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティービーズと結合し、グル
タチオンによりＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡとともに
溶出された（レーン３）。一方、ＧＳＴ（レーン１）、
ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン２）、ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}（レーン４）、ＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン６）、あるいはＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ（レーン８）のアフィニティービ
ーズには結合しなかった。ウシＲｈｏキナーゼのコイル
ド−コイル領域付近のタンパク質（配列番号１の７９９
〜１１３７番のアミノ酸配列）を用いた場合でも、本質
的に同一の結合パターンが観察された（データ省略）。
このことは、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡは、ウシＲ
ｈｏキナーゼのコイルド−コイル領域と直接結合してい
ることを示している。尚、後述（実施例１１）する様
に、ツー・ハイブリッドシステムを用いてヒトＲｈｏキ
ナーゼ内のＲｈｏ結合領域を決定した。その結果、ウシ
ＲｈｏキナーゼのＲｈｏ結合領域は、配列番号１の９４
３〜１０６８番のアミノ酸配列であると推定された（図
１０）。

【０１６１】実施例５ ウシＲｈｏキナーゼによるニワ
トリ・ミオシン結合サブユニットのリン酸化とこれによ
るミオシン軽鎖ホスファターゼ活性の抑制 （１）ウシＲｈｏキナーゼによるニワトリ・ミオシン結
合サブユニットリン酸化試験 ウシＲｈｏキナーゼはニワトリのミオシン結合サブユニ
ットを用いた場合でも、これをリン酸化した。ニワトリ
のミオシン結合サブユニット（Shimizu, H. etal., J.
Biol. Chem., 269, 30407-30411 (1994) ）のＣ末端側
のペプチド断片（アミノ酸753 〜1004）とマルトース結
合タンパク質との融合タンパク質（ＭＢＳ−Ｃ）を実施
例２（３）に記載の方法に準じて作製し、これを基質と
して用いて、実施例２（３）に記載の方法に準じてウシ
Ｒｈｏキナーゼによるリン酸化の程度を測定した（図１
３）。その結果、ウシＲｈｏキナーゼによるＭＢＳ−Ｃ
のリン酸化の程度は、コントロール（ＧＳＴ存在下、レ
ーン１）に比べ、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下
で５倍以上亢進した（レーン３）。対照的に、ＧＤＰ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン２）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}（レーン４）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒ
ａｃ１（レーン５）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１
（レーン６）ではリン酸化の亢進は認められなかった。
また、ニワトリのミオシン結合サブユニット（Shimizu,
H. et al., J. Biol.Chem., 269, 30407-30411 (1994)
）のＮ末端側のペプチド断片（アミノ酸１〜７２１）
を、ＭＢＳ−Ｃのかわりに基質として用いた場合は、ウ
シＲｈｏキナーゼはこれをリン酸化しなかった（データ
省略）。

【０１６２】（２）ウシＲｈｏキナーゼによるニワトリ
・ミオシン軽鎖ホスファターゼ活性の抑制 ニワトリ砂嚢からの天然のミオシン軽鎖ホスファターゼ
の精製は、Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem., 269,
30407-30411 (1994) に記載の方法に従って実施した。
様々な濃度の天然ウシ脳由来のウシＲｈｏキナーゼ存在
下で、ミオシン軽鎖ホスファターゼのリン酸化を測定し
た（実験１）。また、様々な濃度のウシＲｈｏキナーゼ
存在下でリン酸化したミオシン軽鎖ホスファターゼの酵
素活性を測定した（実験２）。

【０１６３】その結果、ウシＲｈｏキナーゼの濃度依存
的に、ミオシン軽鎖ホスファターゼ中のミオシン結合サ
ブユニットがリン酸化されること、およびウシＲｈｏキ
ナーゼによるリン酸化により、ミオシン軽鎖ホスファタ
ーゼの酵素活性が抑制されることが明かとなった。図１
４は、以上の独立した２つの実験（実験１および実験
２）の結果を合わせて、ウシＲｈｏキナーゼの濃度を横
軸に取って示したものである。尚、実験１および実験２
の具体的な方法は下記に示したとおりである。

【０１６４】ウシＲｈｏキナーゼによる天然のミオシン
軽鎖ホスファターゼのリン酸化（実験１）は、種々の量
のウシＲｈｏキナーゼ存在下、１μＭのＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡ存在下または非存在下で、精製したミオ
シン軽鎖ホスファターゼ（１．０μｇタンパク量）を含
む４０μｌのバッファー（３４ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ， ｐＨ ７．５、３４ｍＭ ＫＣｌ、４．０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１．６２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２ｍＭ
ＤＴＴ、１．３％ シュクロース、０．３８％ＣＨＡＰ
Ｓ、１０μＭ ［^３５Ｓ］ＡＴＰγＳ）中で行なった。
３分間インキュベート後、反応混合液をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけた後、ミオシン結合サブユニットの被リン酸化
の程度をオートラジオグラフィー（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ−
２０００）により測定した。

【０１６５】ミオシン軽鎖ホスファターゼ活性に及ぼす
リン酸化の影響（実験２）を調べるために、上記と同様
の方法により精製したミオシン軽鎖ホスファターゼ
（１．０μｇタンパク量）を、放射能で標識しない１０
μＭ ＡＴＰγＳの存在下または非存在下、１μＭのＧ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下または非存在下で、
種々の濃度のウシＲｈｏキナーゼによりリン酸化した。
反応は５μｌの４６ｍＭＥＤＴＡを加えて停止した。次
に５μｌの放射標識したミオシン軽鎖を含む３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＫＣｌ、
０．５ｍＭ ＤＴＴを加えて、トータル５０μｌの反応
混合液（５μＭ ^３２Ｐ−ミオシン軽鎖を含む）として
反応を開始した。反応は３０℃にて６分間行なった。反
応を停止した後、ミオシン軽鎖に結合した^３２Ｐの量を
Ishihara, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu
n. 159, 871-877 (1989) に記載の方法により測定し
た。

【０１６６】結果は、図１４に示すように、ウシＲｈｏ
キナーゼ濃度依存的に^３５Ｓ−チオリン酸がミオシン結
合サブユニットに取り込まれた。一方、ＡＴＰγＳ存在
下では、ウシＲｈｏキナーゼ濃度依存的にミオシン軽鎖
ホスファターゼ活性の抑制が見い出されたが、この抑制
はＡＴＰγＳ非存在下では見られなかった。以上の結果
より、ウシＲｈｏキナーゼによりリン酸化を受けると、
ミオシン軽鎖ホスファターゼの酵素活性が抑制されるこ
とが明かとなった。

【０１６７】実施例６ ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内でのＲｈ
ｏタンパク質によるミオシン結合サブユニットおよびミ
オシン軽鎖のリン酸化の亢進の測定 下記に記載する様に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内で、Ｒｈｏ
タンパク質によってミオシン結合サブユニットのリン酸
化が亢進するかどうかについて検討した。製造企業（St
ratagene社）の使用説明書に基づき、ＮＩＨ／３Ｔ３細
胞に、ｐ３’ＳＳおよびｐＯＰＲＳＶＩ−ＨＡ−Ｒｈｏ
ＡまたはｐＯＰＲＳＶＩ−ＨＡ−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を
安定的にトランスフェクションした。これらのプラスミ
ドはＩＰＴＧ制御下にヘマグルチニン（ＨＡ）−Ｒｈｏ
ＡまたはＨＡ−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を発現させることが
できる。３５ｍｍディッシュ中で培養しコンフルエント
（confluent ）に達したＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（親株、
ＮＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡ−５、ＮＩＨ／３Ｔ３−Ｒｈ
ｏＡ−２４、ＮＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}−７
およびＮＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}−２５）を
５ｍＭ ＩＰＴＧで２４時間処理した。最後の１２時間
は、血清を除去した培養液中で培養し、その後、９．２
５ ＭＢｑの［^３２Ｐ］−オルトリン酸で２時間標識し
た。その後、^３２Ｐで標識した細胞を溶解し、ミオシン
結合サブユニットを免疫沈降させた。洗浄した免疫沈降
物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィー
した。

【０１６８】上記の方法で、ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
^{Ｖａｌ１４}をＮＩＨ／３Ｔ３細胞中に過剰に発現させた
ところ、A. J. Ridley & A. Hall, Cell 70, 389-399
(1992)およびA. J. Ridley & A. Hall, EMBO J., 13, 2
600-2610 (1994) に記載のように、高いレベルのストレ
ス・ ファイバーおよびフォーカル・コンタクト形成が観
察された。ミオシン結合サブユニットの量は、親株を含
む全てのＮＩＨ／３Ｔ３細胞株でほぼ同程度だった（デ
ータ省略）が、ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を過
剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞内のミオシン結合サ
ブユニットのリン酸化の程度は、親株のＮＩＨ／３Ｔ３
細胞内のミオシン結合サブユニットのリン酸化の程度に
比べて顕著に高かった（図１５）。

【０１６９】次に、親株およびＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
^{Ｖａｌ１４}を過剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞内の
ミオシン軽鎖のリン酸化の程度を、下記に記載の方法に
従って測定した。ＩＰＴＧ処理および血清除去操作を１
００ｍｍディッシュ中で行ったＮＩＨ／３Ｔ３細胞株に
１０％ ＴＣＡを添加した。ミオシン軽鎖のリン酸化の
程度を決定するために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈降
物をグリセロール- ウレア・ゲル電気泳動にかけ、リン
酸化された（monophosphorylated（ＭＬＣＰ）および d
iphosphorylated （ＭＬＣＰ_２））ミオシン軽鎖とリン
酸化されていないミオシン軽鎖の相対的な量を、イムノ
・ブロット法（D. A. Taylor & J. T. Stull, J. Biol.
Chem. 263, 14456 (1988)）により定量した。この際、
細胞を、０．１μＭのホスファターゼ阻害剤（calyculi
n-A (CLA) ）で１０分間処理したところ、ミオシン軽鎖
のリン酸化の程度は上昇した（図１６）。ＲｈｏＡまた
はＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を過剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ
３細胞内のミオシン軽鎖のリン酸化の程度は、親株のＮ
ＩＨ／３Ｔ３細胞内のミオシン軽鎖のリン酸化の程度に
比べて明かに高かった（図１６）。異なる３株のＲｈｏ
ＡまたはＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を過剰に発現させたＮＩＨ
／３Ｔ３細胞を用いて、本質的に同一の結果が得られ
た。

【０１７０】以下の理論に拘束されるわけではないが、
以上の結果は、発現誘導させたＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
^{Ｖａｌ１４}により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内に内因的に存
在するＲｈｏキナーゼが活性化された結果、ミオシン結
合サブユニットのリン酸化が亢進し、ミオシン軽鎖ホス
ファターゼ活性が阻害され、これによって、ミオシン軽
鎖の脱リン酸化が抑制されたと解釈される。

【０１７１】実施例７ ウシＲｈｏキナーゼおよびその
欠失変異体によるミオシン軽鎖のリン酸化 無細胞系において、ウシＲｈｏキナーゼ変異体が単離ミ
オシン軽鎖をリン酸化するかどうかを検討した。具体的
には下記の方法に従って実験を行った。ミオシン軽鎖
（Hathaway, D. R. & Haeberle, J. R. Anal. Biochem.
135, 37-43(1983) ）、ミオシンおよびミオシン軽鎖キ
ナーゼ（Ikebe, M., & Hartshorne, D. J. J. Biol. Ch
em. 260, 10027-10031 (1985) ）は、凍結したニワトリ
の砂嚢から精製した。精製ウシＲｈｏキナーゼは、ウシ
の脳から精製した（実施例１）。

【０１７２】また、ウシＲｈｏキナーゼの触媒領域断片
とＧＳＴとの組換え融合タンパク質（Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ））を、下記に記載の方法に従って作製した。
ウシＲｈｏキナーゼの触媒領域断片（配列番号１の６〜
５５３番のアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ断片
を、プラスミドｐＡｃＹＭ１−ＧＳＴ（Matsuura, Y. e
tal., J. Gen. Virol. 68, 1233-1250 (1987)）のＢａ
ｍＨ１部位中に挿入した。得られたプラスミドを用い、
Matsuura, Y. et al., J. Gen. Virol. 68, 1233-1250
(1987)に記載の方法に従って、バキュロウイルス・シス
テムを利用することによって、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １７１１）にＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を生産
させ、これを精製した。

【０１７３】ウシＲｈｏキナーゼおよびその欠失変異体
についてのキナーゼ反応は、５０μｌの反応混合液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．１
５％ ＣＨＡＰＳ、２５０μＭ ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ
［１〜２０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ］、精製ウシＲｈｏキナー
ゼ［２０ｎｇのタンパク質］またはウシＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）および示した量のミオシン軽鎖またはミオシ
ン）（１μＭ ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ・ＲｈｏＡ存在下、
または非存在下）中で実施した。ミオシン軽鎖キナーゼ
についてのキナーゼ反応は、５０μｌの反応混合液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ 、８５ｍＭ ＫＣｌ、５００μＭ ［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰ［０．５〜５ＧＢｑ／ｍｍｏｌ］、精製ミ
オシン軽鎖キナーゼ［５０ｎｇのタンパク質］および示
した量のミオシン軽鎖またはミオシン）（０．１ｍＭ
ＣａＣｌ₂ および１０μｇ／ｍｌ カルモジュリン存在
下または非存在下）中で実施した。３０℃において１０
分間インキュベートした後、反応混合液をＳＤＳ−試料
バッファー中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥは過去に記載された方法（Laemmli, U.
K. Nature 227, 680-685 (1970) ）に従って実施した。
放射性標識されたバンドを画像解析装置（Ｆｕｊｉ）に
より可視化した。

【０１７４】その結果、ウシＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）
がミオシン軽鎖をリン酸化することを見出した（図１
７）。ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡは精製ウシＲｈｏ
キナーゼによるミオシン軽鎖のリン酸化を増強したが、
ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡまたはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡ^Ala37 は増強しなかった（図１７）。因みに、
Ｒｈｏ^Ala37 はＲａｓ^Ala35 と構造上同等である。Ｒａ
ｓ^Ala35 は、エフェクタードメインの中にアミノ酸置換
を含有し、その置換によりＲａｓ^Ala35 はその標的と結
合することができない（Satoh, T. et al., J. Biol. C
hem. 267, 24149-24152(1992) 、McCormick, F., Curr.
Opin. Genet. Dev. 4, 71-76(1994) ）。また、ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１も効果がなかった。構成的に活
性化されている組換えウシＲｈｏキナーゼ（ウシＲｈｏ
キナーゼ（ＣＡＴ））もミオシン軽鎖をリン酸化した。
同様な条件下で、ミオシン軽鎖キナーゼはＣａ^２＋−カ
ルモジュリン依存的な様式でミオシン軽鎖をリン酸化し
た（図１７）。また、ウシＲｈｏキナーゼが、無傷（in
tact）のミオシンのミオシン軽鎖を、ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡ依存的な様式でリン酸化することを見出し
た（図１７）。最大約１モルのリン酸塩が、１モルの単
離されたミオシン軽鎖または無傷のミオシンのミオシン
軽鎖の中に、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在下
で、精製ウシＲｈｏキナーゼによって、あるいはウシＲ
ｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）によって、取り込まれた（デー
タ省略）。因みに、ミオシン軽鎖キナーゼおよびプロテ
インキナーゼＣのような特定のキナーゼは、無傷のミオ
シンをstoichiometricalな様式でリン酸化することが知
られている（Tan, J. L. et al., Annu. Rev. Biochem.
61, 721-759(1992)）。

【０１７５】精製ウシＲｈｏキナーゼに対する単離され
たミオシン軽鎖の見掛けの親和性は、種々の濃度のミオ
シン軽鎖のリン酸化を測定することによって推定された
（図１８）。ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在下ま
たは非存在下におけるミオシン軽鎖についての見掛けの
Ｋｍ値は、それぞれ、２．６±０．４および１２．６±
１．６μＭであり、そして分子の活性（molecular acti
vities）は０．２６±０．０３および０．１５±０．０
２ｓｅｃ^−１であった。従って、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡはミオシン軽鎖に対するウシＲｈｏキナーゼの
親和性を亢進（increase）し、リン酸化反応の最大速度
を生成（produce ）するように思われた。ウシＲｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）の見掛けのＫｍ値および分子活性はそ
れぞれ０．９１±０．０７μＭおよび０．６７±０．０
９ｓｅｃ^−１であった。ミオシン軽鎖に対するミオシン
軽鎖キナーゼの見掛けのＫｍ値および分子活性（molecu
lar activity）は、前述の条件の下で、それぞれ、５
２．１±７．１μＭおよび２．０±０．３６ｓｅｃ^−１
であった。ミオシン軽鎖に対するウシＲｈｏキナーゼの
Ｋｍ値は、ミオシン軽鎖キナーゼのそれより低い。この
ことより、ウシＲｈｏキナーゼはより低い濃度において
ミオシンをリン酸化するが、ウシＲｈｏキナーゼの分子
活性はミオシン軽鎖キナーゼのそれより低いことが示さ
れた。精製ウシＲｈｏキナーゼの分子活性がウシＲｈｏ
キナーゼ（ＣＡＴ）のそれより低かった理由は、精製過
程で精製ウシＲｈｏキナーゼの活性が失活したという事
実（データ省略）により説明することができる。

【０１７６】実施例８ ウシＲｈｏキナーゼおよびその
欠失変異体によってリン酸化されるミオシン軽鎖のリン
酸化部位の決定 ミオシン軽鎖は、優先的にＳｅｒ−１９が、次にＴｈｒ
−１８がミオシン軽鎖キナーゼによりリン酸化される。
（Ikebe, M. & Hartshorne, D. J. J. Biol. Chem. 26
0, 10027-10031 (1985)）。そして、Ｓｅｒ−１９のリ
ン酸化はアクチンによるミオシンＡＴＰアーゼの活性化
に必須である（Kamisoyama, H. et al., Biochemistry
33, 840-847(1994) 、Bresnick, A. R. et al., Bioche
mistry 34,12576-12583(1995)）。ミオシン軽鎖はＳｅ
ｒ−１、Ｓｅｒ−２およびＴｈｒ−９においてプロテイ
ンキナーゼＣによりリン酸化され、そしてプロテインキ
ナーゼＣによるこのリン酸化はミオシンＡＴＰアーゼに
よるアクチン活性化を阻害する（Nishikawa, M. et a
l., J. Biol. Chem. 259, 8808-8814(1984) 、Bengur,
A. R. et al., J. Biol. Chem. 262, 7613-7617(1987)
、およびIkebe, M. & Reardon, S. Biochemistry 29,
2713-2720(1990)）。

【０１７７】ウシＲｈｏキナーゼによるミオシン軽鎖の
主要なリン酸化部位を決定するために、ウシＲｈｏキナ
ーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼまたはプロテインキナーゼ
Ｃによりｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化されたミオシン軽
鎖のペプチドマッピングを実施した。ミオシン軽鎖のリ
ン酸化ペプチドのマッピング分析は記載されている方法
（Naka, M. et al., Nature 306, 490-492(1983)）に従
って実施した。その結果、ウシＲｈｏキナーゼによりリ
ン酸化されたミオシン軽鎖の２次元ペプチドマッピング
のパターンは、ミオシン軽鎖キナーゼにより生成された
それと同一であったが、プロテインキナーゼＣにより生
成されたそれと異なっていた（図１９）。

【０１７８】次に、リン酸化アミノ酸の分析を、記載さ
れている方法（Hunter, T. & Sefton, B. M., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 1311-1315(1980) ）に従
って実施した。その結果、ウシＲｈｏキナーゼによるリ
ン酸化はミオシン軽鎖の主としてセリン残基と一部のス
レオニン残基において起こること、そしてミオシン軽鎖
キナーゼによるリン酸化はミオシン軽鎖のセリン残基
（Ｓｅｒ−１９）においてのみ起こることが明らかとな
った（データ省略）。この様な条件では、ミオシン軽鎖
キナーゼはミオシン軽鎖のＳｅｒ−１９を優先的にリン
酸化することが想起された。精製ウシＲｈｏキナーゼの
代わりにウシＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を用いた場合で
も、本質的に同一の結果が得られた。

【０１７９】ＧＳＴタンパク質を野生型ミオシン軽鎖お
よびＴｈｒ−１８とＳｅｒ−１９がアラニン残基に置換
されたミオシン軽鎖と融合し、ウシＲｈｏキナーゼおよ
びミオシン軽鎖キナーゼがこれらの組換えタンパク質を
リン酸化することができるかどうかを検討した。これら
の組換えタンパク質を大腸菌で発現させるためのベクタ
ー（ｐＧＥＸ−ミオシン軽鎖およびｐＧＥＸ−ミオシン
軽鎖^Ala18,Ala19 ）は下記のようにして構築した。プラ
イマー５’ＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＡＡＣＣＧ
ＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧ３’および５’ＡＴＡＡＧＧＡ
ＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＧＣＴ
Ｃ３’を使用して、ラット脳ＱｕｉｃｋクローンｃＤＮ
Ａ（Clontech社）から、ポリメラーゼ連鎖反応により、
ミオシン軽鎖をコードする０．５５キロ塩基対のｃＤＮ
Ａ断片を増幅した。アラニン（Ａｌａ）によるＴｈｒ−
１８およびＳｅｒ−１９の置換は、ポリメラーゼ連鎖反
応により実施した（Higuchi, R. in PCR Technology (E
rlich, H. A. ed) pp. 61-70, Stockton Press, New Yo
rk(1989)）。ｃＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨ
Ｉ部位中にクローン化した。

【０１８０】その結果、ウシＲｈｏキナーゼおよびミオ
シン軽鎖キナーゼの双方がＧＳＴ−ミオシン軽鎖をリン
酸化したが、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ミオシン軽鎖
^Ala18,Ala19 をリン酸化しなかった（図２０）。プロテ
インキナーゼＣはＧＳＴ−ミオシン軽鎖およびＧＳＴ−
ミオシン軽鎖^Ala18,Ala19 の双方をリン酸化した（デー
タ省略）。これらの結果より、ウシＲｈｏキナーゼがミ
オシン軽鎖を主としてＳｅｒ−１９においてリン酸化す
ること、このＳｅｒ−１９はミオシン軽鎖キナーゼによ
りリン酸化される部位と同一であることが示された。

【０１８１】実施例９ アクチン活性化ＭｇＡＴＰアー
ゼアッセイ ウシＲｈｏキナーゼが無細胞系においてミオシン軽鎖キ
ナーゼと同等に機能するかどうかを検討するために、ア
クチン活性化ＭｇＡＴＰアーゼアッセイを実施した。精
製された無傷のミオシンをウシＲｈｏキナーゼ（ＣＡ
Ｔ）により１モルのミリオン当り１モルのリン酸化が起
きる様にリン酸化し、次いでアクチンによって活性化さ
れたＭｇＡＴＰアーゼ活性を測定した。具体的には下記
に記載の方法に従って実施した。ミオシンＡＴＰアーゼ
アッセイは、過去に記載されている方法（Ikebe, M. et
al., Biochemistry 23, 5062-5068 (1984) ）に一部変
更を加えて実施した。まず、０．１ｍｇ／ｍｌのミオシ
ンを、ウシＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）（４５０ｎｇのタ
ンパク質）により０．４５ｍｌの反応混合液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、８５ｍＭ ＫＣｌ、１μＭ ＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡおよび５００μＭ ＡＴＰ［８０〜２０
０ＭＢｑ／ｍｍｏｌ］中で、３０℃で２０分間リン酸化
した。また、０．１ｍｇ／ｍｌのミオシンをミオシン軽
鎖キナーゼ（４５０ｎｇのタンパク質）により、０．１
ｍＭ、ＣａＣｌ₂ および１０μｇ／ｍｌカルモジュリン
を存在させる以外は同様の条件でリン酸化した。ミオシ
ンＡＴＰアーゼ反応は、０．４５ｍｌのＡＴＰアーゼバ
ッファー（０．０５ｍｇ／ｍｌ リン酸化ミオシン、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ
ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．５ｍＭ ＥＧ
ＴＡ、８５ｍＭＫＣｌ、および１ｍＭ ＡＴＰ［８０〜
２００ＭＢｑ／ｍｍｏｌ］）（１ｍｇ／ｍｌのＦ−アク
チン存在下、または非存在下）中で３０℃で３０分間実
施した。反応混合液の各８０μｌを示した時間に停止溶
液（１．３％ チャーコール、０．１２Ｍ ＮａＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ および０．３３Ｍ 過塩素酸）に添加し、濾過し
た。［γ−³²Ｐ］ＡＴＰから遊離した無機リン酸塩を、
シンチレーションカウンターにより測定した。尚、Ｆ−
アクチンは、ウサギの骨格筋から精製し（Spudich, J.
A., & Watt, S. J. Biol. Chem. 246, 4866-4871(197
1)）、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰはアマシャム社から購入し
た。

【０１８２】Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）によってリン酸
化されたミオシンのＭｇＡＴＰａｓｅ活性は増加し、そ
の増加はＦ−アクチン依存的な様式であり、その増加の
程度はミオシン軽鎖キナーゼによるそれと同様であった
（図２１）。アクチンに対する見掛けのＫａ値と被リン
酸化ミオシンの分子活性はそれぞれ、０．５６±０．０
５μＭおよび０．１８±０．０２ｓｅｃ^−１であった。
これらの値は、ミオシン軽鎖キナーゼによってリン酸化
されたミオシンに対しての値と、ほぼ同様であった。
尚、天然の精製Ｒｈｏキナーゼの代わりにＲｈｏキナー
ゼ（ＣＡＴ）を本実験に用いた理由は、ミオシンのＡＴ
Ｐａｓｅ活性を測定するのに高い濃度のミオシンが必要
であるが、この実験条件下では天然の精製Ｒｈｏキナー
ゼを用いるとミオシンのstoichiometricalなリン酸化が
見られないからである。

【０１８３】実施例１０ ヒトのＲｈｏキナーゼ ｃＤ
ＮＡのクローニング ヒト脳mRNA(CLONTECH 社）０．５μｇを鋳型としてSupe
rScriptTM Preamplification System(BRL 社）を用いて
1st strand DNAを合成した。この反応液の1/20量を、PC
R の鋳型として用い、ウシＲｈｏキナーゼ ｃＤＮＡの
塩基配列をもとに合成したプライマー（5-CAT TTT CAT
TTC TAG GAG ATG ATT ATT CTC TTG CTTTAA C-3, 5'-AA
A AAG CAC TTC TTC AGC ACA AAA ATG CAG AAT ATC AGC
G-3) で、TAKARA LA PCR Kit を使ってPCR を行い、ヒ
トＲｈｏキナーゼ ｃＤＮＡの部分断片（配列番号４に
記載の塩基配列１１５１〜２４７６）を得た。このｃＤ
ＮＡ断片をプローブとして、ヒト脳λgt10cDNAライブラ
リーを１．０×１０⁶ プラークをスクリーニングした。
スクリーニングは、J.Sambrook et.al., MolecularClon
ing: A Laboratory Manual: Cold Spring Habor Labora
tory, Cold SpringHarbor, NY(1989) の記載に準じて行
った。ウシＲｈｏキナーゼ遺伝子の塩基配列と比較した
結果、得られた２つのクローン、p164−20（配列番号５
の９３８〜３７１０番の塩基配列）およびＣ−９塩基配
列（配列番号５の2898−4365番の塩基配列））で、Ｃ末
端端の翻訳領域約2kbpをカバーしていることが解かっ
た。

【０１８４】足りないＮ末端の約1kbpをクローニングす
るため、さらにヒト脳λgt10cDNAライブラリー１．０×
１０⁶ を、クローンp164-20 をプローブとしてスクリー
ニングした。その結果、ひとつのクローン、N6が開始コ
ドンを含むＮ末端約1kbp（配列番号５に記載の塩基配列
１〜９２９）をカバーしていることが解かった。p164-2
0 とN6の間をカバーするｃＤＮＡ断片を得るために、CL
ONTECH社製 Human Brain QUICK−CloneTM cDNAを鋳型と
して、プライマー5-CCT TTG TCA TCT TCA ATGTCA TCG A
AA TTG-3 と 5-CGT GTA TGA AGA TGG ATG AAA CAG GCA
TGG-3 を使いTAKARA LA −PCR kit （宝酒造社）を用
いてPCR を行い塩基配列７３４〜１１４５に相当するｃ
ＤＮＡ断片を増幅した。

【０１８５】ヒトＲｈｏキナーゼ遺伝子の翻訳領域をカ
バーするこれら４つのクローンは、Stratagene社のpBlu
scriptII SK(−) （M.A.Alting−Mees and J.M.Short,
Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989))中にクローン化
した。塩基配列決定のため、Pharmacia 社製double−st
randed Nested Deletion Kitを使用してdeletion mutan
t を作製し、ABI 社の 377 DNAシークエンサーを使って
配列を決定した。尚、使用したヒト脳λgt10cDNAライブ
ラリーはCLONTECH社より購入した。

【０１８６】ヒトＲｈｏキナーゼcDNAの塩基配列および
推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番
号４に記載した通りであった。ヒトＲｈｏキナーゼの推
定タンパク質は、１３８８アミノ酸からなり、推定分子
量は、約１６１ｋＤａであった。ヒトＲｈｏキナーゼの
アミノ酸配列（配列番号４）は、ウシ（配列番号１）、
ラットＲＯＫα（ Leung, T. et al., J. Biol. Chem.,
270, 29051 −29054(1995)^＊に記載されたラットＲＯ
Ｋαのアミノ酸配列は、Ｎ末端の８４アミノ酸を欠いて
いるが、その後完全長のアミノ酸配列がデータベースに
登録された（EMBL Data Bank accession number U3848
1）。以下、ラットＲＯＫαのアミノ酸配列番号はこの
データベースに記載の配列番号に則り記載する）と高い
同一性を示し、全長のヒトＲｈｏキナーゼのアミノ酸
と、ウシＲｈｏキナーゼおよびラットＲＯＫαのそれら
と、それぞれ９７％および９５％の同一性を示した。Ｎ
末端側にキナーゼドメイン、中央にＲｈｏ結合領域（実
施例１１）を含むコイルドコイル・ドメイン、Ｃ末端側
には、ジンクフィンガー様モチーフが存在した。ヒトＲ
ｈｏキナーゼのキナーゼドメイン（配列番号４の９０〜
３５９番のアミノ酸配列）は、アミノ酸レベルで、ウシ
Ｒｈｏキナーゼ（配列番号１の９０〜３５９番のアミノ
酸配列）と９８％、ラットＲＯＫα（アミノ酸配列８８
〜３５７）と９７％の同一性を示した。ヒトＲｈｏキナ
ーゼのコイルドコイル・ドメイン（配列番号４の４３８
〜１１２４番のアミノ酸配列）は、アミノ酸レベルで、
ウシＲｈｏキナーゼ（配列番号１の４３８〜１１２４番
のアミノ酸配列）と９７％、ラットＲＯＫα（アミノ酸
配列４３６〜１１２２）と９５％の同一性を示した。ヒ
トＲｈｏキナーゼのジンクフィンガー様モチーフ（配列
番号４の１２６１〜１３１５番のアミノ酸配列）は、ア
ミノ酸レベルで、ウシＲｈｏキナーゼ（配列番号１の１
２６１〜１３１５番のアミノ酸配列）と１００％、ラッ
トＲＯＫα（アミノ酸配列１２５９〜１３１３）と９８
％の同一性を示した。

【０１８７】また、ヒトＲｈｏキナーゼのアミノ酸配列
（配列番号４）の６６９番〜６８１番に、ウシＲｈｏキ
ナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の６６９番〜６８
１番と同一の配列であり、実施例３（４）に記載の抗Ｒ
ｈｏキナーゼ抗体によって認識されるアミノ酸配列（Ｋ
ＲＱＬＱＥＲＦＴＤＬＥＫ）が見出された。このことよ
り、ヒトＲｈｏキナーゼも合成ペプチドＣＫＲＱＬＱＥ
ＲＦＴＤＬＥＫを抗原として作製した抗Ｒｈｏキナーゼ
抗体（実施例３（４））によって認識されうることが明
らかとなった。以上より、ヒトＲｈｏキナーゼは、ウシ
Ｒｈｏキナーゼのヒト・カウンターパートのタンパク質
であると結論された。

【０１８８】一方、ヒトＲｈｏキナーゼのアミノ酸配列
（全長）（配列番号４）は、ヒトｐ１６０^ＲＯＣＫ（Is
hizaki, T., et.al. EMBO J., 15, 1885−1893 (1996)
^＊）のそれと６７％の同一性を示した。ヒトＲｈｏキナ
ーゼのキナーゼドメイン（配列番号４の９０〜３５９番
のアミノ酸配列）は、ヒトｐ１６０^ＲＯＣＫのキナーゼ
ドメイン（Ishizaki, T., et.al. EMBO J., 15, 1885−
1893 (1996) ^＊）に記載のアミノ酸配列７４〜３４３）
とも９２％という高い同一性を示した。このことより、
ヒトＲｈｏキナーゼは、ヒトｐ１６０^ＲＯＣＫのアイソ
ザイムであると結論した。

【０１８９】実施例１１ ツー・ハイブリッド・システ
ムを用いたヒトＲｈｏキナーゼと活性型Ｒｈｏタンパク
質の結合の検出 酵母を用いたツー・ハイブリッド・システムにより、以
下に記載の方法に従って、ヒトＲｈｏキナーゼのＲｈｏ
結合領域を決定した。ヒトＲｈｏキナーゼのアミノ酸番
号９４３〜１０６８に相当する塩基配列を、プライマー
（5-TTG CGG CCG CTA AAG ATC ATG AAA GAG CTG GAG AT
C-3', 5' TAG CGG CCG CAA CAT ATG TAGCTT TCT ATT CT
C-3' ）を用いてPCR で増幅した後、p ＶＰ１６のNotI
部位に挿入し、Ｒｈｏキナーゼ−ＶＰ１６−融合タンパ
ク質発現用ベクターを作製した（Vojtek,A.B.et. al. C
ell ,74,205 −214 (1993)) 。LiCl法(Ito, H.et. al.
J.Bacteriol., 153,163 −168 (1983)) により、それぞ
れＬｅｘＡ− 野生型H −Ｒａｓ融合タンパク質、Ｌｅ
ｘＡ− 野生型Ｒｈｏ融合タンパク質、ＬｅｘＡ−活性
型Ｒｈｏ融合タンパク質、ＬｅｘＡ− 野生型Ｈ−Ｒａ
ｓ融合タンパク質とＲｈｏキナーゼ−ＶＰ１６−融合タ
ンパク質、ＬｅｘＡ− 野生型Ｒｈｏ融合タンパク質と
Ｒｈｏキナーゼ−ＶＰ１６−融合タンパク質、ＬｅｘＡ
−活性型Ｒｈｏ融合タンパク質とＲｈｏキナーゼ−ＶＰ
１６−融合タンパク質を酵母（S. cerevisiae ）Ｌ４０
株（Mat a trp1 leu2 his3 ade2 LYS2::(LexAop)4-HIS3
URA3::(LexAop)8-LacZ ）で発現させて、選択培地（Le
u −,Trp−,His−,200mM 3AT）上で培養し、ヒスチジン
要求性を調べた。その結果、ＬｅｘＡ−活性型Ｒｈｏ融
合タンパク質とＲｈｏキナーゼ−ＶＰ１６−融合タンパ
ク質を発現している株のみが、選択培地上で生存するこ
とが出来た（図２３）。このことから、ヒトＲｈｏキナ
ーゼの９４３〜１０６８番のアミノ酸配列もしくはその
部分配列が、Ｒｈｏ結合領域であることが明らかとなっ
た。

【０１９０】ヒトＲｈｏキナーゼのＲｈｏ結合領域と、
ラットＲｈｏキナーゼおよびウシＲｈｏキナーゼの相当
する部分のアミノ酸配列を比較した結果、ヒトＲｈｏキ
ナーゼ（アミノ酸配列９４３〜１０６８）とラットＲＯ
Ｋα（アミノ酸配列９４１〜１０６６）では９８％、ヒ
トＲｈｏキナーゼとウシＲｈｏキナーゼ（アミノ酸配列
９４３〜１０６８）では９８％の同一性を示した。一
方、ヒトＲｈｏキナーゼのＲｈｏ結合領域（アミノ酸配
列９４３〜１０６８）とヒトｐ１６０^ＲＯＣＫの相当す
る部分（アミノ酸配列９１０〜１０３９）では、５３％
の同一性が見られた。

【０１９１】実施例１２ Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）に
よるスキンド平滑筋収縮の誘導 Ｒｈｏタンパク質がミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化
とその結果として起きる平滑筋の収縮を制御しているこ
とはよく知られている（Somlyo, A. P. & Somlyo, A.
V. Nature 372, 231-236 (1994); Noda, M. et al. FE
BS Lett. 367, 246-250 (1995); Hirata, K. et al.
J. Biol. Chem. 267, 8719-8722 (1991);Gong, M. C. e
t al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1340-1345 (19
96)^＊）。Ｒｈｏタンパク質がＣａ^２＋感受性の亢進（G
ong, M. C. et al. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93, 13
40-1345 (1996)^＊）を引き起こすためには、拡散しうる
共役因子（diffusible cofactor）が必要である（Gong,
M. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1340-
1345 (1996)^＊）。しかしながら、これまで、Ｒｈｏタ
ンパク質を介した平滑筋収縮のＣａ^２＋感受性の亢進の
詳細なメカニズムは不明であった（Gong, M. C. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1340-1345 (199
6)^＊）。

【０１９２】一方、本発明者らは、新規のＲｈｏ標的タ
ンパク質であるＲｈｏキナーゼがＲｈｏタンパク質によ
って活性化され、活性化されたＲｈｏキナーゼによりミ
オシン軽鎖ホスファターゼのミオシン結合サブユニット
（ＭＢＳ）がリン酸化されることにより抑制されるこ
と、その結果、ミオシン軽鎖の被リン酸化レベルが亢進
することを見出した（実施例１〜６）。また、本発明者
らはＲｈｏキナーゼが直接ミオシン軽鎖をリン酸化する
ことも見出した（実施例７〜９）。これらのデータは、
ＲｈｏキナーゼがＲｈｏタンパク質の下流の標的タンパ
ク質として働いていることばかりでなく、平滑筋収縮の
制御において極めて重要な役割を果たすことを示してい
る。

【０１９３】本発明者らは、Ｒｈｏキナーゼが、Ｒｈｏ
タンパク質による血管平滑筋収縮のＣａ^２＋感受性の亢
進に必要なＲｈｏ標的タンパク質であることを確認する
ために下記の実験を実施した。 （１）ＲｈｏキナーゼによるTriton X-100で処理したウ
サギ門脈血管の収縮の誘導 まず、本発明者等は、組換えＲｈｏキナーゼ触媒領域
（Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ））（実施例７）をTriton X
-100を用いて透過性を亢進させたウサギ門脈中膜血管
（Triton X-100-permiabilized RPV）の細胞質内に外来
的に投与した際の効果について検討した。その結果、細
胞質内に投与したＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）により血管
が収縮し、それと同時にTriton X-100-permiabilized R
PV中のミオシン軽鎖の一リン酸化（monophosphorylatio
n）が亢進した。この効果は細胞質内のＣａ^２＋濃度が
実質的にゼロの条件（１０ｍＭ ＥＧＴＡの緩衝作用に
よる）においても認められた。詳細を下記に記載する。

【０１９４】0.5% Triton X-100を用いて透過性を著し
く亢進させた Triton X-100-permiabilized RPVでは、
タンパク質等の高分子量の化合物が受容体型Ｇタンパク
質のシグナル伝達とカップリングすることなく細胞膜を
通過できる。このことを利用して、0.5% Triton X-100
を用いて透過性を著しく亢進させたウサギ門脈血管平滑
筋（ＲＰＶ）の細胞質内に外来的にＲｈｏキナーゼ（Ｃ
ＡＴ）（分子量約８０ｋＤａ）を導入した。具体的には
下記に記載の方法に従って実験を実施した。

【０１９５】ウサギ（２〜２．５ｋｇ）の門脈中膜血管
標本の小片（幅５０〜１００μｍ、長さ０．５〜１ｍ
ｍ）を切り出し、等尺性張力トランスジューサー（ミネ
ベア社製ＵＬ−２ＧＲ）に連結し、バブル・プレート
（bubble plate）上のウエルに乗せた（Kobayashi, S.
et al. J. Biol. Chem. 264, 17997-18004 (1989））。
１１８ｍＭ Ｋ^＋によって生じた収縮を記録した後、標
本を弛緩溶液中でインキュベートし、その後０．５％の
Triton X-100で２０分間、２５℃で処理または５０００
ＩＵ／ｍｌのα−トキシンで６０〜７５分間、２５℃で
処理した。上記に用いた溶液は過去に詳細に記載されて
いる（Persechini, A. K. et al. J. Biol.Chem. 261,
6293-6299 (1986)）。カルモジュリン（０．５μＭ）
を、化学的な透過性亢進を利用した実験に使用した反応
溶液すべてに添加した。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）は実
施例７に記載の方法に従って作製した。

【０１９６】その結果、 ｐＣａ６．５（図２４ａおよ
び図２４ｂ）およびｐＣａ＜＜８．０（図２４ｃ）にお
いて、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）は著しい収縮を誘導
した。これらの収縮はＲｈｏキナーゼを洗浄することに
より完全に元に戻った（図２４ｂ）。対照的に、microc
ystin-LRを用いて誘導した収縮では、洗浄によっても元
に戻らなかった（図２４ｂ）。一方、無傷（intact）の
血管標本やα-toxinを用いて透過性を亢進させた血管標
本では、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）による収縮は認めら
れなかった（データ省略）。以上の結果より、Triton X
-100処理によって生じた大きな穴を通過して、Ｒｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）が平滑筋の細胞質に外来的に導入され
たこと、それによって血管が収縮したことが示された。
また、導入されたＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の作用が可
逆的であることから、おそらくこの収縮は生理的な現象
を反映しており、受容体型Ｇタンパク質に共役しなく細
胞質内Ｃａ^２＋濃度に依存しないものであることが示唆
された。

【０１９７】（２）ＲｈｏキナーゼによるTriton X-100
で処理したウサギ門脈血管の収縮感受性の亢進 本発明者等は次に、細胞質に導入したＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）が Triton X-100-permiabilized RPVの収縮
装置（contractile apparatus）のＣａ^２＋感受性を亢
進する（potentiates）かどうかを確認するために、
７．５ｎＭのＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の存在下でのｐ
Ｃａと張力の関係について検討した。その結果、この濃
度のＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）は、ｐＣａ＜＜８では通
常張力反応を誘導しないが、ｐＣａを増加させると収縮
装置を刺激することが明らかになった。即ち、Ｒｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）は、対照に比べて最大張力反応を有意
（ＡＮＯＶＡ解析でｐ＜０．０５）に増強した（図２５
ａ、白丸）。Ｃａ^２＋感受性の指標として最大張力の５
０％を誘導するのに必要なｐＣａ値を示すＥＣ_５０値を
それぞれ決めるために、図２５ａに示したデータを、無
反応条件（ｐＣａ＜８．０での値）と最大反応条件（５
００ｎＭのokadaic acidの存在下または７．５ｎＭのＲ
ｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の存在下または非存在下におけ
るｐＣａ４．５）での値をそれぞれ０％および１００％
と仮定することによって再標準化した。Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）の存在下でのＥＣ_５０値の計算値（０．２９
９±０．０４５μＭ、ｎ＝４）と対照の値（０．３７６
±０．０４６、ｎ＝４）と有意差はなかったが、１型お
よび２Ａ型のタンパク質ホスファターゼに対する強力な
阻害剤であるokadaic acid (OA)（Bialojan, C. et al.
Nature 298, 81-95 (1988); Takai, A. et al. FEBS L
ett. 217, 81-95 (1988)）存在下での値（０．２１２±
０．０１３μＭ、ｎ＝４）は対照に比べて統計的に有意
差が認められた(図２５ａ、黒丸、ｐ＜０．０５）。以
上の結果より、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）は細胞内Ｃａ
^２＋濃度に非依存的に収縮の感受性を亢進するが、この
感受性の亢進のメカニズムはOAによるようなミオシン軽
鎖ホスファターゼの阻害だけによるのではないことが示
唆された。

【０１９８】Ｃａ^２＋−カルモジュリン−ミオシン軽鎖
キナーゼ（ＭＬＣＫ）経路を介したミオシン軽鎖のリン
酸化は、結果としてミオシン−アクチン相互作用および
それに引き続いてミオシンＡＴＰアーゼの活性化を促す
ことから、平滑筋収縮において主要な役割を果たす（Ka
mm, K. E. & Stull, J. T. Annu. Rev. Pharmacol. Tox
ical. 25, 593-603 (1985); Hartshorne et al. in Ph
ysiology of the gastrointestinal Tract (ed Johnso
n, L. R.) 423-482 (Raven Press, New York (1987);
Sellers, J. R. & Adelstein, R. S. in The Enzyme Vo
l.18 (eds Boyer, P. & Erevs, E. G.) 381-418 (Acade
mic Press, San Diego, CA (1987)）。Ｒｈｏキナーゼ
によって誘導される収縮におけるＣａ^２＋−カルモジュ
リン−ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）経路の関与に
ついて調べるために、本発明者等はＲｈｏキナーゼ（Ｃ
ＡＴ）のcummulativeな投与によって誘導される張力形
成におけるwortmannin (WM)の効果について検討した
（図２５ｂ）。その結果、生理的なＣａ^２＋濃度である
ｐＣａ６．５においては張力形成がＲｈｏキナーゼ用量
依存性を示したが、１０μＭのWM存在下では用量依存性
のカーブが下方向にシフトした。ｐＣａ６．５での結果
とは対照的に、ｐＣａ＜＜８．０においてＲｈｏキナー
ゼ（ＣＡＴ）によって誘導された張力形成は、１０μＭ
のWMの存在下でも有意には変化しなかった（ＡＮＯＶＡ
解析で有意差なし）。

【０１９９】因みに、WMはＣａ^２＋依存的ＭＬＣＫを阻
害することが知られている（Nakanishi, S. et al. J.
Biol. Chem. 267, 2157-2163 (1992)）。また、Ｒｈｏ
キナーゼ（ＣＡＴ）非存在下でｐＣａ６．５におけるＣ
ａ^２＋による収縮は１０μＭのWM処理で完全に阻害され
た（データ省略）。以上を考慮すると、ｐＣａ６．５に
おいてＲｈｏキナーゼによって誘導されるＣａ^２＋感受
性の亢進をWMが変化させる理由は、おそらく細胞質内Ｃ
ａ^２＋によって誘導される収縮それ自体を阻害すること
によるものであり、WMがＲｈｏキナーゼを介した経路を
阻害しているからではないと思われる。統計学的解析結
果を含めて以上のデータを総合すると、Ｃａ^２＋非存在
下でＲｈｏキナーゼによって誘導される収縮はＣａ^２＋
−カルモジュリン−ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）
経路とは独立的なメカニズムに基づくと考えられる。 （３）Ｒｈｏキナーゼによる Triton X-100で処理した
ウサギ門脈血管中のミオシン軽鎖のリン酸化の亢進

【０２００】Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）が通常のミオシ
ン軽鎖のリン酸化を伴う収縮を誘導するかどうかを明ら
かにするために、本発明者等はミオシン軽鎖のリン酸化
におけるＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の効果について、抗
ミオシン軽鎖ポリクローナル抗体を用いて検討した。具
体的には下記の方法に従って実験を実施した。

【０２０１】０．２５５μＭのＲｈｏキナーゼ（ＣＡ
Ｔ）および／または１０μＭのwortmannin（WM）で処理
した後、Triton X-100によって透過性を亢進させたフリ
ンジ様（fringe-like）のウサギ門脈血管標本を迅速に
１０％ＴＣＡおよび１０ｍＭＤＴＴを含むアセトンの凍
結したslurry中に置いて収縮反応を停止させた。ＴＣＡ
を除いた後、標本を尿素サンプル緩衝液（２０ｍＭ ト
リス、２２ｍＭ グリシン（ｐＨ８．６）、８Ｍ尿素、
１０ｍＭ ＤＴＴ、１０％ショ糖、０．１％bromphenol
blue）中でホモジェナイズした後、グリセロール−尿
素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、抗ミオシン
軽鎖抗体を用いたイムノブロッティングを実施した（Pe
rsechini, A. K. et al. J. Biol. Chem. 261, 6293-62
99 (1986)）。

【０２０２】その結果、図２６ａのレーン１−３に示し
たように、ｐＣａ＜＜８．０では、ミオシン軽鎖の一リ
ン酸化がＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）存在下（レーン２）
でのみ検出され、そしてそれは１０μＭのWMに非感受性
であった（レーン３）。一方、ｐＣａ６．５（レーン４
−６）では、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）はミオシン軽鎖
の一リン酸化を有意に増強し（レーン５）、そしてそれ
は１０μＭのWMに感受性であった（レーン６）。以上の
結果は、収縮反応におけるＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の
効果と一致した（図２６ｂ）。従って、Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）は、おそらくＣａ２^＋−カルモジュリン−Ｍ
ＬＣＫに非依存的な経路によってメディエートされるミ
オシン軽鎖のリン酸化レベルの亢進の結果、収縮反応を
増強すると結論された。 （４） ＲｈｏキナーゼがTriton X-100で処理したウサ
ギ門脈血管中に存在しないことの証明

【０２０３】ところで、Ｒｈｏタンパク質は、Ｃａ^２＋
感受性の亢進を引き起こすために、拡散性の共役因子
（diffusible cofactor）を要求する（Gong, M. C. et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1340-1345 (199
6)^＊）。即ち、Triton X-100処理によって透過性が亢進
されると、Ｒｈｏを介した情報伝達経路に関る下流の分
子（これらはＣａ^２＋感受性の亢進を引き起こすために
必要な拡散性の共役因子である）が細胞から漏れて（le
ak）しまうために、このようなTriton X-100で強力に透
過性を亢進させたRPV（extensively Triton X-100-perm
eabilized RPV）では、Ｒｈｏは収縮効果を発揮できな
いと推測される（Gong, M. C. et al. Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 93, 1340-1345 (1996)^＊）。

【０２０４】そこで、本発明者等は、Ｒｈｏキナーゼ
が、Ｒｈｏタンパク質によるＣａ^２＋感受性の亢進に必
須である上記の拡散性の共役因子であるかどうかを調べ
るために、extensively Triton X-100-permeabilized R
PV中にＲｈｏキナーゼが存在するかどうかを検討した。
具体的には下記に記載する方法に従って実験を実施し
た。

【０２０５】０．５％のTriton X-100によって透過性を
亢進させたウサギ門脈血管および透過性を亢進させてい
ない（即ち無傷(intact)な）ウサギ門脈血管を抽出緩衝
液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１００
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μＭ p-amidinophenyl me
thansulfonyl fluoride hydrochloride、１０μｇ／ｍ
ｌ ロイペプチン、１ｍＭ ベンザミジン）中でホモジ
ェナイズした。各々の抽出液を４３０００ｒｐｍで３０
分間、４℃で遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けイムノブロッティングした。イムノブロット解析に用
いるために、ウシＲｈｏキナーゼのコイルド−コイル領
域（配列番号１の４２１〜７０１番のアミノ酸配列）と
ＧＳＴとの融合タンパク質（Ｒｈｏキナーゼ（ＣＯＩ
Ｌ））を実施例１３に記載の方法に準じて作製し、常法
に従ってこれを抗原としてウサギを免疫することにより
ポリクローナル抗体を作製した。この抗Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＯＩＬ）抗体および抗２０ｋＤａミオシン軽鎖抗体
（J. T. Stull博士より提供を受けた）を用いたイムノ
ブロット解析は、過去に記載の方法（Harlow, E. & Lan
e, D. Antibodies: A Laboratory Mannual. (Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
(1988)）に従って実施した。染色されたタンパク質は
ＥＣＬ（アマーシャム社）によって可視化し、定量のた
めにdensitometryにかけた。

【０２０６】その結果、図２７に示したように、本発明
者等は、extensively Triton X-100-permeabilized RPV
において、内在性のＲｈｏキナーゼが失われていること
を見出した。図２７ａ（レーン１、２）に示したよう
に、extensively Triton X-100-permeabilized RPVでの
Ｒｈｏキナーゼの量は、無傷（intact）の組織のそれに
比べて著しく減少していた。これに対してextensively
Triton X-100-permeabilized RPVでのミオシン軽鎖（レ
ーン３、４）およびミオシン重鎖（レーン５、６）の量
は、無傷の組織でのそれとほとんど同程度であった。図
２７ｂは図２７ａに示されたデータを要約したものであ
り、各々の値は３回の実験からの平均値±標準偏差で表
されている。これらの結果より、 Triton X-100処理に
よって強力に透過性を亢進されると、Ｒｈｏキナーゼを
含む細胞質のタンパク質が失われてしまうが、ミオシン
軽鎖のような細胞骨格タンパク質は安定的に存在するこ
とが確認された。以上より、外来的にＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）を細胞質内に導入しなければextensively Tr
iton X-100-permeabilized RPVが収縮しない理由は、Ｒ
ｈｏキナーゼが上記の拡散性の共役因子のひとつである
からであると考えられる。このように、本発明者等は、
生理学的な条件下でＲｈｏキナーゼによって収縮反応が
誘導され、これにミオシン軽鎖のリン酸化が伴うという
証拠を示した。このことより、本発明者等は、Ｒｈｏキ
ナーゼが、Ｒｈｏタンパク質による平滑筋収縮における
Ｃａ^２＋感受性の亢進に関る下流の標的タンパク質であ
り、そしてミオシン軽鎖のリン酸化を介する平滑筋収縮
に極めて重要な役割を果たすと結論した。

【０２０７】実施例１３ ウシＲｈｏキナーゼの欠失変
異タンパク質の作製とインビトロでの特徴づけ Ｒｈｏキナーゼは、触媒領域（ＣＡＴ）、コイルドコイ
ル領域（ＣＯＩＬ）、Ｒｈｏ結合領域（ＲＢ）およびプ
レクストリン・ホモロジー領域（ＰＨ）より構成され
る。本発明者らは、それぞれの領域を含む４つの断片
（図２８）をＧＳＴ−融合タンパク質として作製した。
まず、Ｒｈｏ結合領域（ＲＢ）に相当する断片を得るた
めに、実施例４に記載の方法に準じて、Ｒｈｏキナーゼ
（配列番号１の９４１〜１０７５番のアミノ酸配列）を
コードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨ１部位
中に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌に発現させ、
Ｒｈｏキナーゼ（配列番号１の９４１〜１０７５番のア
ミノ酸配列）とＧＳＴとの融合タンパク質（Ｒｈｏキナ
ーゼ（ＲＢ））を精製した。ＲｈｏとＲｈｏキナーゼの
結合は、実施例１に記載の方法に従って、オーバーレイ
・アッセイによって決定した。０．２５μｇの精製Ｒｈ
ｏキナーゼまたは２．５μｇのＲｈｏキナーゼ（ＲＢ）
（配列番号１の９４１〜１０７５番のアミノ酸配列）を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（１２％）
で分離し、これらをニトロセルロース・メンブレンにト
ランスファーした後、〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏＡまたは〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
^{Ａｌａ３７}との結合を検出した。放射能標識されたバン
ドをイメージアナライザーによって可視化した。その結
果、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡはＲｈｏキナーゼ
（ＲＢ）（配列番号１の９４１−１０７５番のアミノ酸
配列））に結合したが、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
^{Ａｌａ３７}はそれに弱く結合した（図２９）。因みに、
ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}はＨ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３５}に構造的に
等しく、Ｈ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３５}はエフェクター結合ドメ
インにおける変異（スレオニンのアラニンへの置換）で
ある（C. Nobes & A. Hall, Curr. Opin. Genet. Dev.
4, 77 (1994)、Y. Takai et al., Trends. Biochem. Sc
i. 2O, 227 (1995) 、T. Satoh et al., J. Biol. Che
m. 267, 24149(1992) 、およびF. McCormick, Curr. Op
in. Genet. Dev. 4, 71 (1994)）。

【０２０８】また、ウシＲｈｏキナーゼ のコイルド−
コイル領域（配列番号１の４２１〜７０１番のアミノ酸
配列）またはＲｈｏキナーゼ のＰＨ領域（配列番号１
の１１２５〜１３８８番のアミノ酸配列）をコードする
ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨ１部位に挿入
し、それぞれｐＧＥＸ−ＧＳＴ−Ｒｈｏ キナーゼ（Ｃ
ＯＩＬ）、 ｐＧＥＸ−ＧＳＴ−Ｒｈｏキナーゼ（Ｐ
Ｈ）を作製した。これらを大腸菌に発現させ、精製する
ことにより、Ｒｈｏキナーゼ （ＣＯＩＬ）およびＲｈ
ｏキナーゼ （ＰＨ）を調製した。

【０２０９】次に、実施例７に記載した様に、Ｒｈｏ結
合部位を含むＣ−末端の半分を欠如する組換えウシＲｈ
ｏキナーゼの触媒領域（ＣＡＴ）（配列番号１の６〜５
５３番のアミノ酸配列））とＧＳＴとの融合タンパク質
（Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を作製し、精製した（図２
８）。具体的には、Ｒｈｏキナーゼ（配列番号１の６〜
５５３番のアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡをｐＡ
ｃＹＭ１−ＧＳＴのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＡｃＹ
Ｍ１−ＧＳＴ−Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）（配列番号１
の６〜５５３番のアミノ酸配列）を作製した。Ｒｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）（配列番号１の６〜５５３番のアミノ
酸配列）は、バキュロウイルス系（Y. Matsuura et a
l., J. Gen. Virol.,68,1233(1987 ））を使用して作製
し、グルタチオンセファロースカラムによってＳｆ９細
胞から精製した。また、ウシＲｈｏキナーゼ触媒領域
（配列番号１の６〜５５３番のアミノ酸配列）のＡＴＰ
結合部位を構成する１２１番目のリジンを常法に従って
グリシンに置換した変異体（Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−
ＫＤ）を、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）と同様の方法に従
ってバキュロウイスル系をＳｆ９細胞に発現させ、精製
した（図２８）。また、天然ウシＲｈｏキナーゼは、実
施例１に記載の方法に従って精製した。

【０２１０】次に、これらの組換え型および天然Ｒｈｏ
キナーゼのキナーゼ活性を、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）を
基質としてチェックした。Ｒｈｏキナーゼのキナーゼ反
応は５０μｌの反応混合液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），２ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，
６．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１％ ＣＨＡＰＳ，０．
１μＭ ｃａｌｙｃｌｉｎ Ａ，１００μＭ 〔γ−³²
Ｐ〕ＡＴＰ〔０．５−２０ ＧＢｑ／ｍｏｌ〕，４μｇ
のミオシン軽鎖および２０ｎｇの天然Ｒｈｏキナーゼま
たは８ｎｇのＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）またはＲｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）中で、１．５μＭ ＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下または非存在下で実施した以
外は、実施例７に記載の方法に従って実施した。

【０２１１】その結果、実施例７と同等の結果が得られ
た。天然ウシＲｈｏキナーゼはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏ依存的にミオシン軽鎖に対しキナーゼ活性を示した
が、ＧＳＴ−Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）はＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在に無関係にキナーゼ活性を示し
た（図３０）。ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在下
における天然ＲｈｏキナーゼおよびＧＴＰγＳ・ＧＳＴ
−ＲｈｏＡの非存在下におけるＲｈｏキナーゼ（ＣＡ
Ｔ）の分子活性は、それぞれ、０．３２±０．０２／ｓ
ｅｃおよび０．７１±０．０２／ｓｅｃであった。これ
はＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）が構成的に活性化されてい
ることを示している。一方、ＡＴＰ結合部位に変異を有
するＲｈｏキナーゼ触媒領域（Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ
−ＫＤ））にはキナーゼ活性が認められなかった（デー
タ省略）。

【０２１２】Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）が用量依存的に、
ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡによって亢進された天然
Ｒｈｏキナーゼの活性化を阻害したが、それがＲｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）のキナーゼ活性に影響を与えないこと
を見出した（図３１）。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）のＩＣ
_５０は０．７μＭであった。一方、Ｒｈｏキナーゼ（Ｃ
ＡＴ−ＫＤ）、Ｒｈｏキナーゼに影響を与えなかった
（データ省略）。

【０２１３】実施例１４ スタウロスポリンによるＲｈ
ｏキナーゼの阻害 Ｒｈｏによって誘導されるストレスファイバーの形成は
スタウロスポリン（staurosporin）のようなタンパク質
キナーゼインヒビターにより阻害されることが知られて
いる（C. D. Nobes & A. Hall, Cell 81, 53 (1995)
）。スタウロスポリンは用量依存的にＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）のキナーゼ活性を阻害した（図３１）。スタ
ウロスポリンのＩＣ_５０は４ｎＭであった。この値はタ
ンパク質キナーゼＣについて記載された値（T. Tamaoki
et al., Biochem. Biophys. Res. Commum. 135, 397
(1986) ）に類似する。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の代
わりに、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡで刺激した天然
Ｒｈｏキナーゼを使用した場合でも、本質的に同様な結
果が得られた（図３１）。

【０２１４】実施例１５ 細胞のストレスファイバー形
成に及ぼすＲｈｏキナーゼ欠失変異体のマイクロインジ
ェクションの効果 Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞におけるストレスファイバー形成
に及ぼすＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）およびＲｈｏキナー
ゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）の作用を検討した。Ｓｗｉｓｓ ３
Ｔ３細胞は、１０％のウシ胎児血清を添加したDulbecc
o's改良Eagle's培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞は
８〜１０×１０^３細胞の密度で１２ｍｍのグラス・カバ
ースリップ上に播種した。４日間の培養後、血清を含ま
ないＤＭＥＭ培地中で２４時間培養することによって、
細胞を血清飢餓状態にした。組換えタンパク質を、マー
カータンパク質（１ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧ）ととも
に細胞の細胞質にマイクロインジェクションした。マイ
クロインジェクション後、細胞を３７℃で３０分間イン
キュベートした。過去に記載の方法（Ridley, A. &Hal
l, A., Cell 70, 389 (1992); Ridley, A. & Hall, A.,
EMBO J., 13, 2600(1994) ）に従って、細胞内のアク
チンを、ＴＲＩＴＣ標識化ファロイジン（phalloidin）
によって可視化した。

【０２１５】その結果、過去に記載されているように
（A. J. Ridley and A. Hall, Cell 70, 389 (1992) 、
およびA. J. Ridley & A. Hall, EMBO J. 13, 2600 (19
94) ）、コンフルエント血清飢餓Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細
胞は非常に微量のストレスファイバーを有し、これらの
ストレスファイバーはファロイジンにより可視化された
（図３２ａ）。過去に記載された方法（A. J. Ridley &
A. Hall, Cell 70, 389(1992) 、およびA. J. Ridley
& A. Hall, EMBO J. 13, 2600 (1994) ）に従って細胞
をＬＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激したとき、新しい
ストレスファイバーが出現し、それらの数および直径が
増加した（図３２Ｂ）。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）
（０．５ｍｇ／ｍｌ）のマイクロインジェクションは、
また、ストレスファイバーの形成を誘導した（図３２
Ｅ）。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）にはこの様な作
用は認められなかった。注入されたＲｈｏキナーゼ（Ｃ
ＡＴ）はしばしば、細胞の中央部においてストレスファ
イバーと結合したアクチンフィラメントの大きい凝集形
成を引き起こした（図３２Ｅ、図３２Ｆ）。このような
ハブ様（hub-like）アクチンフィラメントが存在する理
由は明らかではないが、これは注入されたＲｈｏキナー
ゼ（ＣＡＴ）により誘導されたストレスファイバーの高
い収縮性のためかもしれない。

【０２１６】一方、ＡＤＰリボシル化することによって
Ｒｈｏを阻害するボツリヌス菌の菌体外酵素Ｃ３トラン
スフェラーゼ（Ｃ３）（K. Aktories et al., ibid. 15
8, 209 (1989) 、およびA. Sekine et al., J. Biol. C
hem. 264, 8602 (1989) ）（８０μｇ／ｍｌ）を細胞に
マイクロインジェクションした場合には、過去に記載さ
れているように（H. F. Paterson et al., J. Cell Bio
l. 111, 1001 (1990)）、細胞は３０分以内に丸くなっ
た（データ省略）。注入されたＣ３はＬＰＡによって誘
導されるストレスファイバーの形成を阻害した（図３２
Ｃ）が、それはＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）により誘発さ
れたストレスファイバーの形成は阻害しなかった（図３
２Ｆ）。Ｃ３をＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）とともに同時
注入（coinjection ）すると、細胞が丸くなるのが防止
された（データ省略）。５０ｎＭのスタロウスポリン存
在下でＬＰＡで刺激された細胞では、過去に記載のよう
に（Nobes,C. & Hall,A.Cell 81,53(1995)およびRidle
y,P.et al.,Mol.Cell,Biol.15,1110(1995)）不規則に配
置された（rondomly arraneged）アクチンフィラメント
が生じた（図３２Ｄ）。しかしながら、スタウロスポリ
ン存在下にＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を注入された細胞
ではストレスファイバーは生じなかった（図３２Ｇ）。

【０２１７】実施例１６ 細胞のフォーカル接着に及ぼ
すＲｈｏキナーゼ欠失変異体のマイクロインジェクショ
ンの効果 Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞におけるフォーカル接着形成に
及ぼすＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）およびＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ−ＫＤ）の作用を検討した。細胞の培養、ＬＰ
Ａ濃度、マイクロインジェクションの条件、注入タンパ
ク質の量は、実施例１５に記載したものと同一であっ
た。細胞染色については、過去に記載の方法（Ridley,
A. & Hall, A., Cell 70, 389 (1992); Ridley, A. & H
all, A., EMBO J., 13, 2600 (1994) ）に従って、細胞
内のビンキュリン（vinculin）を抗ビンクリン抗体によ
って可視化した。核は、ビス−ベンジミド（bis-benzim
ide） によって可視化した。

【０２１８】その結果、過去に記載されているように
（A. J. Ridley & A. Hall, Cell 70,389 (1992) 、お
よびA. J. Ridley & A. Hall, EMBO J. 13, 2600 (199
4) ）、コンフルエント血清飢餓Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細
胞において、抗ビンキュリン抗体により、非常にわずか
のフォーカル接着が検出された（図３３Ａ）。細胞をＬ
ＰＡで刺激したとき、過去に観察されたように（A. J.
Ridley & A. Hall, Cell 70, 389 (1992) 、およびA.
J. Ridley & A. Hall, EMBO J. 13, 2600 (1994) ）、
ビンキュリンを含む新たなフォーカル接着が出現し、そ
の数を増加した（図３３Ｂ）。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡ
Ｔ）のマイクロインジェクションはフォーカル接着の形
成を誘導した（図３３Ｅ）。本発明者らは、二重免疫蛍
光分析により、注入されたＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）に
より新しく合成されるストレスファイバーがフォーカル
接着に連結されることを確認した（図３３Ｈ）。Ｃ３の
マイクロインジェクションはＬＰＡによって誘発される
フォーカル接着の形成を阻害した（図３３Ｃ）が、それ
はＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）によって誘導されたフォー
カル接着の形成を阻害しなかった（図３３Ｆ、図３１
Ｇ）。

【０２１９】スタウロスポリン（５０ｎＭ）はＬＰＡお
よびＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）によって誘導されたフォ
ーカル接着形成をいずれも阻害した（図３３ｄおよび図
３３ｇ）。構成的に活性化したＰＫＮ触媒領域またはＭ
ＢＳの注入によっては、ストレスファイバーの形成もフ
ォーカル接着の形成も誘導されなかった（データ省
略）。これらの注入はまた、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）
によって誘導されたストレスファイバー形成およびフォ
ーカル接着の形成に影響を及ぼさなかった（データ省
略）。

【０２２０】実施例１７ Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）、
Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−Ｋ
Ｄ）のマイクロインジェクションによるストレスファイ
バーおよびフォーカル接着形成の阻害 本発明者らは次に、ＬＰＡによって誘導されるストレス
ファイバーおよびフォーカル接着形成におけるＲｈｏキ
ナーゼ（ＲＢ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）、Ｒｈｏキナ
ーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）およびＲｈｏキナーゼ（ＣＯＩ
Ｌ）のマイクロインジェクションの効果について検討し
た。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）またはＲｈｏキナーゼ（Ｐ
Ｈ）の注入により、 ＬＰＡによって誘導されるストレ
スファイバー（図３４Ｃ、Ｄ）およびフォーカル接着
（図３４Ｇ、Ｈ）の形成は阻害された。Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ−ＫＤ）を注入された細胞の約３０％は、ＬＰ
Ａ存在下においてストレスファイバー（図３４Ａ）およ
びフォーカル接着（図３４Ｅ）を形成しなかった。Ｒｈ
ｏキナーゼ（ＣＯＩＬ）は全く効果がなかった（図３４
Ｂ、Ｆ）。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、Ｒｈｏキ
ナーゼ（ＣＯＩＬ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）あるいは
Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）はいずれも、Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）によって誘導されるストレスファイバーおよ
びフォーカル接着形成を阻害しなかった。このことによ
り、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、 Ｒｈｏキナー
ゼ（ＲＢ）あるいはＲｈｏキナーゼ（ＰＨ）は内在性の
Ｒｈｏキナーゼの機能を阻害するが、外来性に過剰に注
入されたＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の機能は阻害しない
ことが示された。

【０２２１】実施例１８ Ｒｈｏキナーゼの欠失変異体
をコードするｃＤＮＡの導入による細胞形態の変化 スイス３Ｔ３細胞はプラスミドの細胞核内への注入には
適していないので、本発明者らはＭＤＣＫ細胞に種々の
Ｒｈｏキナーゼ欠失変異体をコードするｃＤＮＡをマイ
クロインジェクションすることによって、Ｒｈｏキナー
ゼの細胞形態に及ぼす効果について検討した。 まず、
Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ
−ＫＤ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＯＩＬ）、 Ｒｈｏキナ
ーゼ（ＲＢ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）を発現するため
のｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍｙｃ哺乳類発現プラスミドを作製
した。ＭＤＣＫ細胞は１０％の牛胎児血清を添加した最
少必須培地で培養した。２×１０^３の濃度の細胞を１２
ｍｍのガラス・カバースリップの上にシードして１日培
養した。種々のプラスミッドを記載の方法（A. Ridley
et al. Cell 70, 401 (1992)）に従って核内にマイクロ
インジェクションした。マイクロインジェクション後、
細胞を３７℃で３時間培養した。アクチンは、Ridley,
A. & Hall, A. Cell 70, 389 (1992)およびRidley, A.
& Hall, A. EMBO J. 13, 2600 (1994)）に記載の方法に
従って、ＴＲＩＴＣでラベルしたファロイジンで染色し
た。

【０２２２】まず、構成的に活性化されたＲｈｏ変異体
（Ｒｈｏ^{Ｖａｌ１４}）をコードするｃＤＮＡをＭＤＣＫ
細胞にマイクロインジェクションしたところ、過去に記
載されたように（Nobes, C. & Hall, A. Cell 81, 53
(1995)およびRidley, A. et al. Mol. Cell. Biol. 15,
1110 (1995)）、ストレスファイバーの形成（図３５
Ａ）およびフォーカル接着（データ省略）が誘導され
た。ストレスファイバーおよびフォーカル接着は、Ｒｈ
ｏキナーゼ（ＣＡＴ）をコードするｃＤＮＡが注入され
た細胞（図３５Ｂ）において形成された。Ｒｈｏキナー
ゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、構成的に活性化されたＰＫＮまた
はＭＢＳをコードするｃＤＮＡではこの作用は認められ
なかった。

【０２２３】Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、Ｒｈｏ
キナーゼ（ＲＢ）またはＲｈｏキナーゼ（ＰＨ）をコー
ドするｃＤＮＡをＲｈｏ^{Ｖａｌ１４}とともにコインジェ
クションしたところ、 Ｒｈｏ^{Ｖａｌ１４}によって誘導
されたストレスファイバー（図３５Ｃ、Ｄ、Ｅ）および
フォーカル接着（データ省略）の形成は阻害された。Ｒ
ｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）の効果は、Ｒｈｏキナー
ゼ（ＲＢ）またはＲｈｏキナーゼ（ＰＨ）の効果に比べ
て低かった。一方、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＯＩＬ）にはこ
の作用は認められなかった（データ省略）。

【０２２４】実施例１５〜１８に記載したように、本発
明者らはＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の注入によりストレ
スファイバーおよびフォーカル接着の形成が誘導される
こと、そしてＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、Ｒｈｏ
キナーゼ（ＲＢ）またはＲｈｏキナーゼ（ＰＨ）によっ
てＬＰＡまたはＲｈｏ^{Ｖａｌ１４}に誘導されるストレス
ファイバーおよびフォーカル接着の形成が阻害されるこ
とを示した。これらの事実より、細胞内に存在させたＲ
ｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）はドミナント・アクティブ体と
して働き、細胞内に存在させたＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ
−ＫＤ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）およびＲｈｏキナー
ゼ（ＰＨ）はドミナント・ネガティブ体として働くこと
が明らかとなった。

【０２２５】Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）は、本発
明者らの実験条件では、インビトロにおいてＲｈｏキナ
ーゼのキナーゼ活性に影響を及ぼさなかった（実施例１
３）が、より高い酵素濃度ではＲｈｏキナーゼと基質と
の相互作用を阻害する可能性がある。というのは、この
ような現象が他のキナーゼについて記載されているから
である（Kolch, W. et al., Nature 349, 426 (199
1)）。このことから、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−Ｋ
Ｄ）は細胞内でＲｈｏキナーゼの機能を阻害した（実施
例１７〜１８）にもかかわらず、インビトロにおいてＲ
ｈｏキナーゼのキナーゼ活性に影響を及ぼさなかった
（実施例１３）のは、用いたＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−
ＫＤ）の濃度が低かったからであると考えられる。

【０２２６】一方、ＰＨ領域は、これを含むタンパク質
を特定の細胞内領域に極在させる（localize）と考えら
れているので、Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）は細胞内でＲｈ
ｏキナーゼの適切な極在（localization）を阻害すると
考えられる。天然のＲｈｏキナーゼは部分的に細胞間接
着部位に存在するにもかかわらず、Ｒｈｏキナーゼ（Ｃ
ＡＴ）はＭＤＣＫ細胞において細胞質領域に存在した
（データ省略）という事実は、この可能性を示唆する。

【０２２７】ところで、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）は、Ｒ
ｈｏタンパク質とＲｈｏキナーゼとの結合を阻害するだ
けでなく、Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮなどの他のＲｈｏ
標的タンパク質との結合をも阻害する可能性がある。こ
れに対して、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）およびＲ
ｈｏキナーゼ（ＰＨ）は、よりＲｈｏキナーゼに特異的
なインヒビターとして働く可能性がある。

【０２２８】いずれにしても、スイス３Ｔ３細胞やＭＤ
ＣＫ細胞において、ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの下流で、
ストレスファイバーおよびフォーカル接着の形成を制御
すること、およびＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、Ｒ
ｈｏキナーゼ（ＲＢ）およびＲｈｏキナーゼ（ＰＨ）が
Ｒｈｏキナーゼの上記の生理作用を阻害することが示さ
れた。

【０２２９】アクチンフィラメントとミオシンとの結合
は、ミオシン軽鎖のリン酸化により促進され、ストレス
ファイバーの形成の後期段階の１つであると推定されて
いる（J. Kolega et al., Bioimaging l, 136 (1993)、
およびK. A. Giuliano & D.L. Taylor, Curr. Opin. Ce
ll Biol. 7, 4 (1995) ）。Ｒｈｏはミオシン軽鎖（Ｍ
ＬＣ）およびミオシン結合サブユニット（ＭＢＳ）をリ
ン酸化するＲｈｏキナーゼを活性化し、これによりミオ
シン軽鎖のリン酸化に導くことを本発明者らは示した
（実施例２および実施例５〜９）。このリン酸化はアク
チンとミオシンの結合およびそれらの収縮性（contract
ility ）のために必須である（実施例９および実施例１
２）。事実、本発明において注入されたＲｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ）により誘導されるアクチンフィラメントにミ
オシンが結合することを本発明者らは確認した（データ
省略）。これらの観察は、Ｒｈｏによって刺激されるア
クチンとミオシンの収縮性がストレスファイバーおよび
フォーカル接着の形成を推進するという見解（M. Chrza
nowska-Wodnicka & K. Burridge, J. Cell Biol. 133,
1403-1415 (1996)^＊）とよく一致する。

【０２３０】Ｒｈｏキナーゼはフォーカル接着部位を構
成する種々のタンパク質（ビンキュリン、ＦＡＫ、パキ
シリンおよびα−アクチニン）とインテグリンの界合
（assembly）を促進することにより、フォーカル接着形
成を誘導すると考えられる。

【０２３１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３８８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ウシ 配列 Met Ser Arg Pro Pro Pro Thr Gly Lys Met Pro Gly Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Val Ser Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ser Arg Gln Arg Lys Leu Glu Ala 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Pro Arg Ser Pro Ile Asn Val Glu Ser Leu Leu Asp 35 40 45 Gly Leu Asn Pro Leu Val Leu Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 50 55 60 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Val Lys 65 70 75 80 Lys Ile Arg Gly Leu Gln Met Lys Ala Glu Asp Tyr Asp Val Val Lys 85 90 95 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 100 105 110 Ala Ser Gln Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 115 120 125 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 130 135 140 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Cys Ala Phe Gln 145 150 155 160 Asp Asp Lys Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 165 170 175 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Lys 180 185 190 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 195 200 205 Gly Leu Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 210 215 220 His Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asp 225 230 235 240 Glu Thr Gly Met Val His Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 245 250 255 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly 260 265 270 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Phe Glu Met Leu 275 280 285 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 290 295 300 Lys Ile Met Asp His Lys Asn Ser Leu Cys Phe Pro Glu Asp Ala Glu 305 310 315 320 Ile Ser Lys His Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 325 330 335 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Lys Gln His Pro 340 345 350 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp Asn Trp Asp Asn Ile Arg Glu Thr Ala 355 360 365 Ala Pro Val Val Pro Glu Leu Ser Ser Asp Ile Asp Ser Ser Asn Phe 370 375 380 Asp Asp Ile Glu Asp Asp Lys Gly Asp Val Glu Thr Phe Pro Ile Pro 385 390 395 400 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Ile Gly Phe Thr Tyr Tyr 405 410 415 Arg Glu Asn Leu Leu Leu Ser Asp Ser Pro Ser Cys Lys Glu Asn Asp 420 425 430 Ser Ile Gln Ser Arg Lys Asn Glu Glu Ser Gln Glu Ile Gln Lys Lys 435 440 445 Leu Tyr Thr Leu Glu Glu His Leu Ser Thr Glu Ile Gln Ala Lys Glu 450 455 460 Glu Leu Glu Gln Lys Cys Lys Ser Val Asn Thr Arg Leu Glu Lys Val 465 470 475 480 Ala Lys Glu Leu Glu Glu Glu Ile Thr Leu Arg Lys Asn Val Glu Ser 485 490 495 Thr Leu Arg Gln Leu Glu Arg Glu Lys Ala Leu Leu Gln His Lys Asn 500 505 510 Ala Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Asp His Glu Ala Asp Lys Lys Arg Asn 515 520 525 Leu Glu Asn Asp Val Asn Ser Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys 530 535 540 Lys Arg Asn Gln Asn Ser Gln Ile Ser Thr Glu Lys Val Asn Gln Leu 545 550 555 560 Gln Arg Gln Leu Asp Glu Thr Asn Ala Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp 565 570 575 Thr Ala Ala Arg Leu Arg Lys Thr Gln Ala Glu Ser Ser Lys Gln Ile 580 585 590 Gln Gln Leu Glu Ser Asn Asn Arg Asp Leu Gln Asp Lys Asn Cys Leu 595 600 605 Leu Glu Thr Ala Lys Leu Lys Leu Glu Lys Glu Phe Ile Asn Leu Gln 610 615 620 Ser Val Leu Glu Ser Glu Arg Arg Asp Arg Thr His Gly Ser Glu Ile 625 630 635 640 Ile Asn Asp Leu Gln Gly Arg Ile Ser Gly Leu Glu Glu Asp Val Lys 645 650 655 Asn Gly Lys Ile Leu Leu Ala Lys Val Glu Leu Glu Lys Arg Gln Leu 660 665 670 Gln Glu Arg Phe Thr Asp Leu Glu Lys Glu Lys Asn Asn Met Glu Ile 675 680 685 Asp Met Thr Tyr Gln Leu Lys Val Ile Gln Gln Ser Leu Glu Gln Glu 690 695 700 Glu Thr Glu His Lys Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Asp Lys Asn Lys 705 710 715 720 Ile Tyr Glu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Ser Glu Ala Met Lys Glu Met 725 730 735 Glu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Arg Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Asn 740 745 750 Leu Leu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Cys Ser Ile Leu Asp Cys Asp Leu 755 760 765 Lys Gln Ser Gln Gln Lys Ile Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Asp Val 770 775 780 Leu Asn Glu Asp Val Arg Asn Leu Thr Leu Lys Ile Glu Gln Glu Thr 785 790 795 800 Gln Lys Arg Cys Leu Thr Gln Asn Asp Leu Lys Met Gln Thr Gln Gln 805 810 815 Val Asn Thr Leu Lys Met Ser Glu Lys Gln Leu Lys Gln Glu Asn Asn 820 825 830 His Leu Leu Glu Met Lys Met Ser Leu Glu Lys Gln Asn Ala Glu Leu 835 840 845 Arg Lys Glu Arg Gln Asp Ala Asp Gly Gln Met Lys Glu Leu Gln Asp 850 855 860 Gln Leu Glu Ala Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val 865 870 875 880 Arg Glu Leu Lys Glu Glu Cys Glu Glu Lys Thr Lys Leu Cys Lys Glu 885 890 895 Leu Gln Gln Lys Lys Gln Glu Leu Gln Asp Glu Arg Asp Ser Leu Ala 900 905 910 Ala Gln Leu Glu Ile Thr Leu Thr Lys Ala Asp Ser Glu Gln Leu Ala 915 920 925 Arg Ser Ile Ala Glu Glu Gln Tyr Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ile 930 935 940 Met Lys Glu Leu Glu Ile Lys Glu Met Met Ala Arg His Lys Gln Glu 945 950 955 960 Leu Thr Glu Lys Asp Ala Thr Ile Ala Ser Leu Glu Glu Thr Asn Arg 965 970 975 Thr Leu Thr Ser Asp Val Ala Asn Leu Ala Asn Glu Lys Glu Glu Leu 980 985 990 Asn Asn Lys Leu Lys Glu Ala Gln Glu Gln Leu Ser Arg Leu Lys Asp 995 1000 1005 Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gln Phe Glu Lys Gln Leu 1010 1015 1020 Leu Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 1025 1030 1035 1040 Ile Met Asn Arg Lys Glu Pro Val Lys Arg Gly Asn Asp Thr Asp Val 1045 1050 1055 Arg Arg Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu His Met Glu Leu Lys Ser 1060 1065 1070 Glu Arg Glu Lys Leu Thr Gln Gln Met Ile Lys Tyr Gln Lys Glu Leu 1075 1080 1085 Asn Glu Met Gln Ala Gln Ile Ala Glu Glu Ser Gln Ile Arg Ile Glu 1090 1095 1100 Leu Gln Met Thr Leu Asp Ser Lys Asp Ser Asp Ile Glu Gln Leu Arg 1105 1110 1115 1120 Ser Gln Leu Gln Ala Leu His Ile Gly Leu Asp Ser Ser Ser Ile Gly 1125 1130 1135 Ser Gly Pro Gly Asp Thr Glu Ala Asp Asp Gly Phe Pro Glu Ser Arg 1140 1145 1150 Leu Glu Gly Trp Leu Ser Leu Pro Val Arg Asn Asn Thr Lys Lys Phe 1155 1160 1165 Gly Trp Val Lys Lys Tyr Val Ile Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1170 1175 1180 Tyr Asp Ser Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Tyr Met Val Leu 1185 1190 1195 1200 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Thr Asp Val 1205 1210 1215 Tyr Arg Ala Asp Ala Lys Glu Ile Pro Arg Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1220 1225 1230 Ala Asn Glu Gly Glu Ser Lys Lys Glu Gln Glu Phe Pro Val Glu Pro 1235 1240 1245 Val Gly Glu Lys Ser Asn Tyr Ile Cys His Lys Gly His Glu Phe Ile 1250 1255 1260 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Thr Asn Cys Glu Ala Cys Met Lys Pro 1265 1270 1275 1280 Leu Trp His Met Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1285 1290 1295 1300 1305 1310 Ala Pro Cys Lys Val Tyr Tyr Asp Ile Ser Ser Ala Lys Asn Leu Leu 1315 1320 1325 Leu Leu Ala Asn Ser Thr Glu Glu Gln Gln Lys Trp Val Ser Arg Leu 1330 1335 1340 Val Lys Lys Ile Pro Lys Lys Pro Pro Ala Pro Asp Pro Phe Ala Arg 1345 1350 1355 1360 Ser Ser Pro Arg Thr Ser Met Lys Ile Gln Gln Asn Gln Ser Ile Arg 1365 1370 1375 Arg Pro Ser Arg Gln Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser 1380 1385

【０２３２】配列番号：２ 配列の長さ：５０５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源： 生物名：ウシ 配列 ATG AGC CGG CCC CCG CCG ACG GGG AAG ATG CCC GGC GCC CCC GAG GCC 48 Met Ser Arg Pro Pro Pro Thr Gly Lys Met Pro Gly Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 GTG TCG GGG GAC GGC GCG GGC GCG AGC CGC CAG AGG AAG CTG GAA GCG 96 Val Ser Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ser Arg Gln Arg Lys Leu Glu Ala 20 25 30 CTG ATC CGA GAC CCT CGT TCG CCC ATC AAC GTG GAG AGC TTG CTG GAT 144 Leu Ile Arg Asp Pro Arg Ser Pro Ile Asn Val Glu Ser Leu Leu Asp 35 40 45 GGC TTA AAT CCT TTG GTC CTT GAT TTG GAT TTT CCT GCT TTG AGG AAA 192 Gly Leu Asn Pro Leu Val Leu Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 50 55 60 AAC AAA AAT ATA GAT AAT TTC TTA AAT AGA TAT GAG AAA ATT GTG AAA 240 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Val Lys 65 70 75 80 AAA ATT AGA GGT TTA CAG ATG AAG GCA GAA GAC TAC GAT GTT GTA AAA 288 Lys Ile Arg Gly Leu Gln Met Lys Ala Glu Asp Tyr Asp Val Val Lys 85 90 95 GTT ATC GGA AGA GGT GCT TTT GGT GAA GTC CAG TTG GTT CGT CAT AAG 336 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 100 105 110 GCA TCA CAG AAA GTT TAT GCT ATG AAG CTT CTT AGT AAG TTT GAA ATG 384 Ala Ser Gln Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 115 120 125 ATA AAA AGA TCA GAT TCT GCT TTT TTC TGG GAG GAA AGA GAT ATT ATG 432 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 130 135 140 GCC TTT GCC AAC AGT CCC TGG GTG GTT CAG CTC TTT TGT GCC TTT CAA 480 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Cys Ala Phe Gln 145 150 155 160 GAT GAT AAG TAT CTG TAC ATG GTA ATG GAG TAC ATG CCT GGT GGA GAC 528 Asp Asp Lys Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 165 170 175 CTT GTA AAC CTT ATG AGT AAC TAT GAT GTA CCT GAA AAA TGG GCC AAA 576 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Lys 180 185 190 TTT TAT ACT GCT GAA GTT GTT CTT GCT TTG GAT GCC ATA CAC TCC ATG 624 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 195 200 205 GGT TTA ATT CAC AGA GAT GTG AAG CCT GAC AAC ATG CTC TTG GAT AAA 672 Gly Leu Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 210 215 220 CAT GGG CAT CTA AAA TTA GCA GAT TTT GGC ACA TGT ATG AAG ATG GAT 720 His Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asp 225 230 235 240 GAA ACA GGC ATG GTG CAT TGT GAT ACA GCA GTT GGA ACA CCC GAT TAT 768 Glu Thr Gly Met Val His Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 245 250 255 ATA TCA CCC GAG GTC CTG AAA TCA CAA GGG GGT GAT GGT TAC TAT GGG 816 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly 260 265 270 CGA GAA TGT GAT TGG TGG TCC GTG GGT GTT TTC CTT TTT GAA ATG CTG 864 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Phe Glu Met Leu 275 280 285 GTG GGG GAT ACT CCA TTT TAT GCA GAT TCA CTT GTA GGA ACA TAT AGC 912 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 290 295 300 AAA ATT ATG GAT CAT AAA AAC TCA CTA TGT TTC CCT GAA GAT GCA GAA 960 Lys Ile Met Asp His Lys Asn Ser Leu Cys Phe Pro Glu Asp Ala Glu 305 310 315 320 ATT TCT AAA CAT GCG AAG AAT CTC ATC TGT GCC TTC TTA ACA GAT AGG 1008 Ile Ser Lys His Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 325 330 335 GAG GTA CGC CTT GGA AGA AAC GGG GTA GAA GAA ATC AAA CAA CAT CCT 1056 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Lys Gln His Pro 340 345 350 TTC TTT AAG AAT GAT CAG TGG AAT TGG GAT AAC ATA AGA GAG ACT GCA 1104 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp Asn Trp Asp Asn Ile Arg Glu Thr Ala 355 360 365 GCT CCT GTG GTA CCT GAA CTC AGC AGT GAC ATA GAC AGC AGC AAT TTT 1152 Ala Pro Val Val Pro Glu Leu Ser Ser Asp Ile Asp Ser Ser Asn Phe 370 375 380 GAT GAC ATT GAA GAT GAT AAA GGA GAT GTA GAA ACC TTC CCA ATT CCC 1200 Asp Asp Ile Glu Asp Asp Lys Gly Asp Val Glu Thr Phe Pro Ile Pro 385 390 395 400 AAG GCT TTT GTG GGA AAT CAG CTA CCT TTT ATA GGA TTT ACC TAC TAC 1248 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Ile Gly Phe Thr Tyr Tyr 405 410 415 AGA GAA AAT TTG CTA CTA AGT GAC TCT CCA TCT TGT AAA GAA AAT GAC 1296 Arg Glu Asn Leu Leu Leu Ser Asp Ser Pro Ser Cys Lys Glu Asn Asp 420 425 430 TCA ATT CAA TCA AGG AAG AAT GAA GAG AGT CAA GAG ATT CAG AAA AAA 1344 Ser Ile Gln Ser Arg Lys Asn Glu Glu Ser Gln Glu Ile Gln Lys Lys 435 440 445 CTG TAC ACA TTA GAA GAA CAC CTT AGC ACT GAG ATT CAG GCC AAA GAG 1392 Leu Tyr Thr Leu Glu Glu His Leu Ser Thr Glu Ile Gln Ala Lys Glu 450 455 460 GAA CTA GAA CAG AAG TGC AAG TCT GTT AAT ACT CGC TTA GAG AAA GTG 1440 Glu Leu Glu Gln Lys Cys Lys Ser Val Asn Thr Arg Leu Glu Lys Val 465 470 475 480 GCA AAG GAG TTA GAA GAA GAG ATT ACC TTA AGG AAA AAT GTG GAA TCA 1488 Ala Lys Glu Leu Glu Glu Glu Ile Thr Leu Arg Lys Asn Val Glu Ser 485 490 495 ACA TTA AGA CAA TTA GAA AGA GAA AAA GCA CTT CTT CAG CAC AAA AAT 1536 Thr Leu Arg Gln Leu Glu Arg Glu Lys Ala Leu Leu Gln His Lys Asn 500 505 510 GCA GAA TAT CAG CGG AAA GCT GAT CAT GAA GCA GAC AAG AAG CGA AAT 1584 Ala Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Asp His Glu Ala Asp Lys Lys Arg Asn 515 520 525 TTG GAG AAT GAT GTT AAC AGT TTA AAA GAT CAG CTT GAA GAT TTG AAA 1632 Leu Glu Asn Asp Val Asn Ser Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys 530 535 540 AAA AGA AAT CAG AAC TCT CAG ATA TCC ACT GAG AAA GTG AAT CAA CTC 1680 Lys Arg Asn Gln Asn Ser Gln Ile Ser Thr Glu Lys Val Asn Gln Leu 545 550 555 560 CAG AGA CAA CTG GAT GAA ACC AAT GCT TTG CTG CGA ACA GAA TCT GAT 1728 Gln Arg Gln Leu Asp Glu Thr Asn Ala Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp 565 570 575 ACT GCA GCC CGG TTA AGG AAA ACA CAG GCA GAA AGT TCA AAA CAG ATT 1776 Thr Ala Ala Arg Leu Arg Lys Thr Gln Ala Glu Ser Ser Lys Gln Ile 580 585 590 CAG CAG CTG GAA TCT AAC AAT AGA GAT CTA CAA GAC AAA AAT TGC CTG 1824 Gln Gln Leu Glu Ser Asn Asn Arg Asp Leu Gln Asp Lys Asn Cys Leu 595 600 605 CTG GAG ACT GCC AAG TTA AAA CTT GAA AAG GAA TTT ATC AAT CTT CAG 1872 Leu Glu Thr Ala Lys Leu Lys Leu Glu Lys Glu Phe Ile Asn Leu Gln 610 615 620 TCA GTT CTA GAA TCT GAA AGG AGG GAC CGA ACC CAT GGA TCA GAG ATT 1920 Ser Val Leu Glu Ser Glu Arg Arg Asp Arg Thr His Gly Ser Glu Ile 625 630 635 640 ATT AAT GAT TTA CAA GGT AGA ATA TCT GGC CTA GAA GAA GAT GTA AAG 1968 Ile Asn Asp Leu Gln Gly Arg Ile Ser Gly Leu Glu Glu Asp Val Lys 645 650 655 AAT GGT AAA ATC TTA TTA GCA AAA GTA GAG CTG GAG AAG AGA CAA CTA 2016 Asn Gly Lys Ile Leu Leu Ala Lys Val Glu Leu Glu Lys Arg Gln Leu 660 665 670 CAG GAG AGA TTT ACT GAT TTG GAA AAG GAA AAG AAC AAC ATG GAA ATA 2064 Gln Glu Arg Phe Thr Asp Leu Glu Lys Glu Lys Asn Asn Met Glu Ile 675 680 685 GAT ATG ACA TAC CAA CTA AAA GTC ATA CAG CAA AGT TTA GAA CAA GAA 2112 Asp Met Thr Tyr Gln Leu Lys Val Ile Gln Gln Ser Leu Glu Gln Glu 690 695 700 GAA ACT GAA CAT AAG GCT ACA AAA GCA CGG CTT GCA GAT AAA AAC AAG 2160 Glu Thr Glu His Lys Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Asp Lys Asn Lys 705 710 715 720 ATT TAT GAA TCC ATT GAA GAA GCT AAA TCA GAA GCC ATG AAA GAA ATG 2208 Ile Tyr Glu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Ser Glu Ala Met Lys Glu Met 725 730 735 GAG AAA AAG CTC TCG GAG GAA AGA ACT TTA AAA CAG AAA GTA GAG AAC 2256 Glu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Arg Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Asn 740 745 750 TTG TTG CTG GAG GCT GAG AAA AGA TGC TCT ATA TTA GAC TGT GAC CTC 2304 Leu Leu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Cys Ser Ile Leu Asp Cys Asp Leu 755 760 765 AAA CAG TCA CAG CAG AAA ATA AAT GAA CTC CTC AAA CAG AAA GAT GTG 2352 Lys Gln Ser Gln Gln Lys Ile Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Asp Val 770 775 780 CTA AAT GAG GAT GTT AGA AAC TTG ACA TTA AAA ATA GAA CAG GAA ACT 2400 Leu Asn Glu Asp Val Arg Asn Leu Thr Leu Lys Ile Glu Gln Glu Thr 785 790 795 800 CAG AAG CGC TGC CTT ACA CAA AAT GAC TTG AAG ATG CAA ACA CAG CAA 2448 805 810 815 GTT AAC ACA CTA AAA ATG TCA GAA AAG CAG TTA AAG CAA GAG AAT AAT 2496 Val Asn Thr Leu Lys Met Ser Glu Lys Gln Leu Lys Gln Glu Asn Asn 820 825 830 CAT CTC CTA GAA ATG AAA ATG AGC TTG GAA AAA CAG AAT GCT GAA CTT 2544 His Leu Leu Glu Met Lys Met Ser Leu Glu Lys Gln Asn Ala Glu Leu 835 840 845 CGA AAA GAA CGT CAA GAT GCA GAT GGA CAG ATG AAA GAG CTC CAG GAT 2592 Arg Lys Glu Arg Gln Asp Ala Asp Gly Gln Met Lys Glu Leu Gln Asp 850 855 860 CAG CTT GAA GCA GAG CAG TAT TTC TCA ACC CTC TAT AAA ACA CAG GTT 2640 Gln Leu Glu Ala Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val 865 870 875 880 AGG GAA CTT AAG GAA GAA TGT GAA GAA AAG ACC AAA CTT TGT AAA GAA 2688 Arg Glu Leu Lys Glu Glu Cys Glu Glu Lys Thr Lys Leu Cys Lys Glu 885 890 895 TTA CAG CAG AAG AAG CAG GAA TTA CAG GAT GAA AGG GAC TCC TTG GCT 2736 Leu Gln Gln Lys Lys Gln Glu Leu Gln Asp Glu Arg Asp Ser Leu Ala 900 905 910 GCT CAA CTG GAG ATT ACC TTA ACC AAA GCA GAT TCT GAG CAA CTG GCT 2784 Ala Gln Leu Glu Ile Thr Leu Thr Lys Ala Asp Ser Glu Gln Leu Ala 915 920 925 CGT TCA ATT GCT GAG GAA CAG TAT TCT GAT TTG GAA AAA GAG AAG ATC 2832 Arg Ser Ile Ala Glu Glu Gln Tyr Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ile 930 935 940 ATG AAA GAG CTG GAG ATC AAA GAG ATG ATG GCT CGA CAC AAA CAG GAA 2880 Met Lys Glu Leu Glu Ile Lys Glu Met Met Ala Arg His Lys Gln Glu 945 950 955 960 CTC ACC GAA AAA GAT GCT ACT ATT GCG TCT CTT GAA GAA ACT AAT AGG 2928 Leu Thr Glu Lys Asp Ala Thr Ile Ala Ser Leu Glu Glu Thr Asn Arg 965 970 975 ACA CTA ACT AGT GAT GTT GCC AAT CTT GCA AAT GAG AAA GAA GAA TTA 2976 Thr Leu Thr Ser Asp Val Ala Asn Leu Ala Asn Glu Lys Glu Glu Leu 980 985 990 AAT AAC AAA CTG AAG GAA GCC CAA GAG CAA CTA TCA AGG TTG AAA GAT 3024 Asn Asn Lys Leu Lys Glu Ala Gln Glu Gln Leu Ser Arg Leu Lys Asp 995 1000 1005 GAA GAA ATA AGT GCA GCA GCT ATT AAA GCA CAA TTT GAG AAG CAG CTG 3072 Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gln Phe Glu Lys Gln Leu 1010 1015 1020 TTA ACA GAG AGG ACA CTC AAA ACT CAA GCT GTG AAT AAG TTG GCT GAG 3120 Leu Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 1025 1030 1035 1040 ATC ATG AAT CGA AAG GAA CCT GTT AAG CGT GGT AAT GAC ACA GAT GTG 3168 Ile Met Asn Arg Lys Glu Pro Val Lys Arg Gly Asn Asp Thr Asp Val 1045 1050 1055 CGG AGA AAA GAA AAG GAG AAT AGA AAG CTA CAT ATG GAA CTT AAA TCT 3216 Arg Arg Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu His Met Glu Leu Lys Ser 1060 1065 1070 GAA CGC GAA AAA CTG ACC CAG CAG ATG ATC AAG TAT CAG AAA GAA CTG 3264 Glu Arg Glu Lys Leu Thr Gln Gln Met Ile Lys Tyr Gln Lys Glu Leu 1075 1080 1085 AAT GAA ATG CAG GCT CAA ATA GCT GAA GAG AGT CAG ATT CGA ATT GAA 3312 Asn Glu Met Gln Ala Gln Ile Ala Glu Glu Ser Gln Ile Arg Ile Glu 1090 1095 1100 CTA CAG ATG ACA CTG GAC AGT AAG GAC AGT GAC ATT GAG CAG CTG CGC 3360 Leu Gln Met Thr Leu Asp Ser Lys Asp Ser Asp Ile Glu Gln Leu Arg 1105 1110 1115 1120 TCC CAG CTC CAG GCC TTG CAC ATT GGT TTG GAT AGT TCC AGT ATA GGC 3408 Ser Gln Leu Gln Ala Leu His Ile Gly Leu Asp Ser Ser Ser Ile Gly 1125 1130 1135 AGT GGA CCA GGG GAT ACT GAA GCT GAT GAC GGT TTT CCA GAA TCA AGA 3456 Ser Gly Pro Gly Asp Thr Glu Ala Asp Asp Gly Phe Pro Glu Ser Arg 1140 1145 1150 CTA GAA GGA TGG CTT TCA TTG CCT GTG CGA AAC AAC ACT AAG AAA TTT 3504 Leu Glu Gly Trp Leu Ser Leu Pro Val Arg Asn Asn Thr Lys Lys Phe 1155 1160 1165 GGA TGG GTT AAA AAG TAT GTG ATT GTA AGC AGT AAG AAG ATC CTT TTC 3552 Gly Trp Val Lys Lys Tyr Val Ile Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1170 1175 1180 TAT GAC AGT GAG CAA GAT AAA GAA CAA TCT AAT CCT TAC ATG GTT TTA 3600 Tyr Asp Ser Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Tyr Met Val Leu 1185 1190 1195 1200 GAT ATA GAC AAG TTA TTT CAT GTC CGA CCA GTT ACA CAG ACA GAT GTA 3648 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Thr Asp Val 1205 1210 1215 TAT AGA GCA GAT GCT AAA GAA ATT CCA AGG ATA TTC CAG ATT CTG TAT 3696 Tyr Arg Ala Asp Ala Lys Glu Ile Pro Arg Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1220 1225 1230 GCC AAC GAA GGA GAA AGT AAG AAG GAA CAA GAA TTT CCA GTG GAG CCA 3744 Ala Asn Glu Gly Glu Ser Lys Lys Glu Gln Glu Phe Pro Val Glu Pro 1235 1240 1245 GTG GGA GAA AAA TCA AAT TAT ATT TGC CAC AAG GGA CAT GAA TTT ATT 3792 Val Gly Glu Lys Ser Asn Tyr Ile Cys His Lys Gly His Glu Phe Ile 1250 1255 1260 CCT ACT CTG TAT CAT TTC CCA ACC AAC TGT GAG GCA TGT ATG AAG CCA 3840 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Thr Asn Cys Glu Ala Cys Met Lys Pro 1265 1270 1275 1280 TTG TGG CAC ATG TTT AAA CCC CCT CCT GCT TTA GAG TGC CGT CGC TGT 3888 Leu Trp His Met Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1285 1290 1295 CAT ATT AAA TGT CAT AAA GAT CAC ATG GAC AAA AAG GAG GAA ATT ATA 3936 His Ile Lys Cys His Lys Asp His Met Asp Lys Lys Glu Glu Ile Ile 1300 1305 1310 GCG CCT TGC AAA GTG TAT TAT GAT ATT TCA TCG GCA AAG AAT CTA TTG 3984 Ala Pro Cys Lys Val Tyr Tyr Asp Ile Ser Ser Ala Lys Asn Leu Leu 1315 1320 1325 TTA TTG GCA AAT TCT ACA GAA GAG CAG CAA AAG TGG GTT AGT CGG TTA 4032 Leu Leu Ala Asn Ser Thr Glu Glu Gln Gln Lys Trp Val Ser Arg Leu 1330 1335 1340 GTG AAA AAA ATA CCT AAA AAG CCT CCA GCT CCA GAC CCT TTT GCA CGG 4080 Val Lys Lys Ile Pro Lys Lys Pro Pro Ala Pro Asp Pro Phe Ala Arg 1345 1350 1355 1360 TCA TCT CCT AGA ACG TCA ATG AAA ATA CAA CAA AAC CAG TCT ATT CGA 4128 Ser Ser Pro Arg Thr Ser Met Lys Ile Gln Gln Asn Gln Ser Ile Arg 1365 1370 1375 CGG CCA AGT CGA CAA CTT GCT CCA AAC AAA CCA AGC 4164 Arg Pro Ser Arg Gln Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser 1380 1385 TAACTGCCTT CTGTGAATGC AGTCATTATT TAAGGTGATC ATATTCTTCT AGTTGAAACA 4224 AGACTGAAAT ATGATGGCCC AAAATTTATT AAAAAGTTAT ATTTTCCTGA GAGACTAATA 4284 CACATATATA TTCCCTCTAT TCCTGCAATA TAAATTCTAA ATCTTGAATA GGTTTTCTGG 4344 GCTCCTTTGG AGCAACAAGT TGAACCAACA GTGATTGGTT AATAGAATAA GAATATCATG 4404 TGCAACTCTT CCAGACTTAT TCCATAAAGC TCTCCTAGCA TCACTCACAC TACATTGCAT 4464 AAAGGATTTA GAAGAGTTAC AGAAATCATC TTTTCAGCTT CAACAGAGAG ATTTCACCAG 4524 CACATTTGCC AGAAGAATCT GGGAATGGAT TCCACTACAG TGATAGAGAC TGCGTCTTTA 4584 AGAAGTGACC ATTGTAGTGT GTGTGTGAAC ACACACACAC ACATACACAC ACACACACAC 4644 ACACACATAG TACTGTAATA CTGCAAGAGG GTTTTTTAAC TTCCCACTTT ATTTTTTTAT 4704 AAACATTAAT CAGATATCAT TACTTACTGC AGTTGTAACT ATGCACTTGT ATAAAGCCAT 4764 AATGTTGGAG TTTATATCAC TCATTGTGTG TACCTGCTGG AAGCTGCATG TTCATGTTTA 4824 AGCAGTTATT GTAACAAGAA GTTTGAAGTT AATTATATCA GTTTCTTAAT GCTTTGTAAT 4884 AGGCAATTTT ACCCATTTTG AATGCCTTAA TTTAATTTTT TTCAAGGTAT CCACCCTTTC 4944 CTGTATTTAA AACAAAAAAA AAAGTATTTG CCAGCTCTTA GGATGCAAAT TTGCTTTGCA 5004 GAAGAAAATT AGTGCACTAT TTTTACACAT AGTAGTTATC ATTGTCGGC 5053

【０２３３】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ウシ 配列 Cys Lys Arg Gln Leu Gln Glu Arg Phe Thr Asp Leu Glu Lys 1 5 10

【０２３４】配列番号：４ 配列の長さ：１３８８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Ser Arg Pro Pro Pro Thr Gly Lys Met Pro Gly Ala Pro Glu Thr 1 5 10 15 Ala Pro Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ser Arg Gln Arg Lys Leu Glu Ala 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Pro Arg Ser Pro Ile Asn Val Glu Ser Leu Leu Asp 35 40 45 Gly Leu Asn Ser Leu Val Leu Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 50 55 60 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Val Lys 65 70 75 80 Lys Ile Lys Gly Leu Gln Met Lys Ala Glu Asp Tyr Asp Val Val Lys 85 90 95 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 100 105 110 Ala Ser Gln Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 115 120 125 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 130 135 140 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Tyr Ala Phe Gln 145 150 155 160 Asp Asp Arg Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 165 170 175 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Lys 180 185 190 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 195 200 205 Gly Leu Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 210 215 220 His Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asp 225 230 235 240 Glu Thr Gly Met Val His Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 245 250 255 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Gly 260 265 270 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Tyr Glu Met Leu 275 280 285 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 290 295 300 Lys Ile Met Asp His Lys Asn Ser Leu Cys Phe Pro Glu Asp Ala Glu 305 310 315 320 Ile Ser Lys His Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 325 330 335 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Arg Gln His Pro 340 345 350 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp His Trp Asp Asn Ile Arg Glu Thr Ala 355 360 365 Ala Pro Val Val Pro Glu Leu Ser Ser Asp Ile Asp Ser Ser Asn Phe 370 375 380 Asp Asp Ile Glu Asp Asp Lys Gly Asp Val Glu Thr Phe Pro Ile Pro 385 390 395 400 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Ile Gly Phe Thr Tyr Tyr 405 410 415 Arg Glu Asn Leu Leu Leu Ser Asp Ser Pro Ser Cys Arg Glu Asn Asp 420 425 430 Ser Ile Gln Ser Arg Lys Asn Glu Glu Ser Gln Glu Ile Gln Lys Lys 435 440 445 Leu Tyr Thr Leu Glu Glu His Leu Ser Asn Glu Met Gln Ala Lys Glu 450 455 460 Glu Leu Glu Gln Lys Cys Lys Ser Val Asn Thr Arg Leu Glu Lys Thr 465 470 475 480 Ala Lys Glu Leu Glu Glu Glu Ile Thr Leu Arg Lys Ser Val Glu Ser 485 490 495 Ala Leu Arg Gln Leu Glu Arg Glu Lys Ala Leu Leu Gln His Lys Asn 500 505 510 Ala Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Asp His Glu Ala Asp Lys Lys Arg Asn 515 520 525 Leu Glu Asn Asp Val Asn Ser Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys 530 535 540 Lys Arg Asn Gln Asn Ser Gln Ile Ser Thr Glu Lys Val Asn Gln Leu 545 550 555 560 Gln Arg Gln Leu Asp Glu Thr Asn Ala Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp 565 570 575 Thr Ala Ala Arg Leu Arg Lys Thr Gln Ala Glu Ser Ser Lys Gln Ile 580 585 590 Gln Gln Leu Glu Ser Asn Asn Arg Asp Leu Gln Asp Lys Asn Cys Leu 595 600 605 Leu Glu Thr Ala Lys Leu Lys Leu Glu Lys Glu Phe Ile Asn Leu Gln 610 615 620 Ser Ala Leu Glu Ser Glu Arg Arg Asp Arg Thr His Gly Ser Glu Ile 625 630 635 640 Ile Asn Asp Leu Gln Gly Arg Ile Cys Gly Leu Glu Glu Asp Leu Lys 645 650 655 Asn Gly Lys Ile Leu Leu Ala Lys Val Glu Leu Glu Lys Arg Gln Leu 660 665 670 Gln Glu Arg Phe Thr Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ser Asn Met Glu Ile 675 680 685 Asp Met Thr Tyr Gln Leu Lys Val Ile Gln Gln Ser Leu Glu Gln Glu 690 695 700 Glu Ala Glu His Lys Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Asp Lys Asn Lys 705 710 715 720 Ile Tyr Glu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Ser Glu Ala Met Lys Glu Met 725 730 735 Glu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Arg Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Asn 740 745 750 Leu Leu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Cys Ser Leu Leu Asp Cys Asp Leu 755 760 765 Lys Gln Ser Gln Gln Lys Ile Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Asp Val 770 775 780 Leu Asn Glu Asp Val Arg Asn Leu Thr Leu Lys Ile Glu Gln Glu Thr 785 790 795 800 Gln Lys Arg Cys Leu Thr Gln Asn Asp Leu Lys Met Gln Thr Gln Gln 805 810 815 Val Asn Thr Leu Lys Met Ser Glu Lys Gln Leu Lys Gln Glu Asn Asn 820 825 830 His Leu Met Glu Met Lys Met Asn Leu Glu Lys Gln Asn Ala Glu Leu 835 840 845 Arg Lys Glu Arg Gln Asp Ala Asp Gly Gln Met Lys Glu Leu Gln Asp 850 855 860 Gln Leu Glu Ala Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val 865 870 875 880 Arg Glu Leu Lys Glu Glu Cys Glu Glu Lys Thr Lys Leu Gly Lys Glu 885 890 895 Leu Gln Gln Lys Lys Gln Glu Leu Gln Asp Glu Arg Asp Ser Leu Ala 900 905 910 Ala Gln Leu Glu Ile Thr Leu Thr Lys Ala Asp Ser Glu Gln Leu Ala 915 920 925 Arg Ser Ile Ala Glu Glu Gln Tyr Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ile 930 935 940 Met Lys Glu Leu Glu Ile Lys Glu Met Met Ala Arg His Lys Gln Glu 945 950 955 960 Leu Thr Glu Lys Asp Ala Thr Ile Ala Ser Leu Glu Glu Thr Asn Arg 965 970 975 Thr Leu Thr Ser Asp Val Ala Asn Leu Ala Asn Glu Lys Glu Glu Leu 980 985 990 Asn Asn Lys Leu Lys Asp Val Gln Glu Gln Leu Ser Arg Leu Lys Asp 995 1000 1005 Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gln Phe Glu Lys Gln Leu 1010 1015 1020 Leu Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 1025 1030 1035 1040 Ile Met Asn Arg Lys Glu Pro Val Lys Arg Gly Asn Asp Thr Asp Val 1045 1050 1055 Arg Arg Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu His Met Glu Leu Lys Ser 1060 1065 1070 Glu Arg Glu Lys Leu Thr Gln Gln Met Ile Lys Tyr Gln Lys Glu Leu 1075 1080 1085 Asn Glu Met Gln Ala Gln Ile Ala Glu Glu Ser Gln Ile Arg Ile Glu 1090 1095 1100 Leu Gln Met Thr Leu Asp Ser Lys Asp Ser Asp Ile Glu Gln Leu Arg 1105 1110 1115 1120 Ser Gln Leu Gln Ala Leu His Ile Gly Leu Asp Ser Ser Ser Ile Gly 1125 1130 1135 Ser Gly Pro Gly Asp Ala Glu Ala Asp Asp Gly Phe Pro Glu Ser Arg 1140 1145 1150 Leu Glu Gly Trp Leu Ser Leu Pro Val Arg Asn Asn Thr Lys Lys Phe 1155 1160 1165 Gly Trp Val Lys Lys Tyr Val Ile Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1170 1175 1180 Tyr Asp Ser Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Tyr Met Val Leu 1185 1190 1195 1200 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Thr Asp Val 1205 1210 1215 Tyr Arg Ala Asp Ala Lys Glu Ile Pro Arg Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1220 1225 1230 Ala Asn Glu Gly Glu Ser Lys Lys Glu Gln Glu Phe Pro Val Glu Pro 1235 1240 1245 Val Gly Glu Lys Ser Asn Tyr Ile Cys His Lys Gly His Glu Phe Ile 1250 1255 1260 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Thr Asn Cys Glu Ala Cys Met Lys Pro 1265 1270 1275 1280 Leu Trp His Met Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1285 1290 1295 His Ile Lys Cys His Lys Asp His Met Asp Lys Lys Glu Glu Ile Ile 1300 1305 1310 Ala Pro Cys Lys Val Tyr Tyr Asp Ile Ser Thr Ala Lys Asn Leu Leu 1315 1320 1325 Leu Leu Ala Asn Ser Thr Glu Glu Gln Gln Lys Trp Val Ser Arg Leu 1330 1335 1340 Val Lys Lys Ile Pro Lys Lys Pro Pro Ala Pro Asp Pro Phe Ala Arg 1345 1350 1355 1360 Ser Ser Pro Arg Thr Ser Met Lys Ile Gln Gln Asn Gln Ser Ile Arg 1365 1370 1375 Arg Pro Ser Arg Gln Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser 1380 1385

【０２３５】配列番号：５ 配列の長さ：４３６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列 ATG AGC CGG CCC CCG CCG ACG GGG AAA ATG CCC GGC GCC CCC GAG ACC 48 Met Ser Arg Pro Pro Pro Thr Gly Lys Met Pro Gly Ala Pro Glu Thr 1 5 10 15 GCG CCG GGG GAC GGG GCA GGC GCG AGC CGC CAG AGG AAG CTG GAG GCG 96 Ala Pro Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ser Arg Gln Arg Lys Leu Glu Ala 20 25 30 CTG ATC CGA GAC CCT CGC TCC CCC ATC AAC GTG GAG AGC TTG CTG GAT 144 Leu Ile Arg Asp Pro Arg Ser Pro Ile Asn Val Glu Ser Leu Leu Asp 35 40 45 GGC TTA AAT TCC TTG GTC CTT GAT TTA GAT TTT CCT GCT TTG AGG AAA 192 Gly Leu Asn Ser Leu Val Leu Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 50 55 60 AAC AAG AAC ATA GAT AAT TTC TTA AAT AGA TAT GAG AAA ATT GTG AAA 240 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Asn Arg Tyr Glu Lys Ile Val Lys 65 70 75 80 AAA ATC AAA GGT CTA CAG ATG AAG GCA GAA GAC TAT GAT GTT GTA AAA 288 Lys Ile Lys Gly Leu Gln Met Lys Ala Glu Asp Tyr Asp Val Val Lys 85 90 95 GTT ATT GGA AGA GGT GCT TTT GGT GAA GTG CAG TTG GTT CGT CAC AAG 336 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 100 105 110 GCA TCG CAG AAG GTT TAT GCT ATG AAG CTT CTT AGT AAG TTT GAA ATG 384 Ala Ser Gln Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 115 120 125 ATA AAA AGA TCA GAT TCT GCC TTT TTT TGG GAA GAA AGA GAT ATT ATG 432 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 130 135 140 GCC TTT GCC AAT AGC CCC TGG GTG GTT CAG CTT TTT TAT GCC TTT CAA 480 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Tyr Ala Phe Gln 145 150 155 160 GAT GAT AGG TAT CTG TAC ATG GTA ATG GAG TAC ATG CCT GGT GGA GAC 528 Asp Asp Arg Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 165 170 175 CTT GTA AAC CTT ATG AGT AAT TAT GAT GTG CCT GAA AAA TGG GCC AAA 576 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Lys 180 185 190 TTT TAC ACT GCT GAA GTT GTT CTT GCT CTG GAT GCA ATA CAC TCC ATG 624 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 195 200 205 GGT TTA ATA CAC AGA GAT GTG AAG CCT GAC AAC ATG CTC TTG GAT AAA 672 Gly Leu Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 210 215 220 CAT GGA CAT CTA AAA TTA GCA GAT TTT GGC ACG TGT ATG AAG ATG GAT 720 His Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asp 225 230 235 240 GAA ACA GGC ATG GTA CAT TGT GAT ACA GCA GTT GGA ACA CCG GAT TAT 768 Glu Thr Gly Met Val His Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 245 250 255 ATA TCA CCT GAG GTT CTG AAA TCA CAA GGG GGT GAT GGT TTC TAT GGG 816 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Gly 260 265 270 CGA GAA TGT GAT TGG TGG TCT GTA GGT GTT TTC CTT TAT GAG ATG CTA 864 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Tyr Glu Met Leu 275 280 285 GTG GGG GAT ACT CCA TTT TAT GCG GAT TCA CTT GTA GGA ACA TAT AGC 912 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 290 295 300 AAA ATT ATG GAT CAT AAG AAT TCA CTG TGT TTC CCT GAA GAT GCA GAA 960 Lys Ile Met Asp His Lys Asn Ser Leu Cys Phe Pro Glu Asp Ala Glu 305 310 315 320 ATT TCC AAA CAT GCA AAG AAT CTC ATC TGT GCT TTC TTA ACA GAT AGG 1008 Ile Ser Lys His Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 325 330 335 GAG GTA CGA CTT GGG AGA AAT GGG GTG GAA GAA ATC AGA CAG CAT CCT 1056 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Arg Gln His Pro 340 345 350 TTC TTT AAG AAT GAT CAG TGG CAT TGG GAT AAC ATA AGA GAA ACG GCA 1104 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp His Trp Asp Asn Ile Arg Glu Thr Ala 355 360 365 GCT CCT GTA GTA CCT GAA CTC AGC AGT GAC ATA GAC AGC AGC AAT TTC 1152 Ala Pro Val Val Pro Glu Leu Ser Ser Asp Ile Asp Ser Ser Asn Phe 370 375 380 GAT GAC ATT GAA GAT GAC AAA GGA GAT GTA GAA ACC TTC CCA ATT CCT 1200 Asp Asp Ile Glu Asp Asp Lys Gly Asp Val Glu Thr Phe Pro Ile Pro 385 390 395 400 AAA GCT TTT GTT GGA AAT CAG CTG CCT TTC ATC GGA TTT ACC TAC TAT 1248 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Ile Gly Phe Thr Tyr Tyr 405 410 415 AGA GAA AAT TTA TTA TTA AGT GAC TCT CCA TCT TGT AGA GAA AAT GAT 1296 Arg Glu Asn Leu Leu Leu Ser Asp Ser Pro Ser Cys Arg Glu Asn Asp 420 425 430 TCC ATA CAA TCA AGG AAA AAT GAA GAA AGT CAA GAG ATT CAG AAA AAA 1344 Ser Ile Gln Ser Arg Lys Asn Glu Glu Ser Gln Glu Ile Gln Lys Lys 435 440 445 CTG TAT ACA TTA GAA GAA CAT CTT AGC AAT GAG ATG CAA GCC AAA GAG 1392 Leu Tyr Thr Leu Glu Glu His Leu Ser Asn Glu Met Gln Ala Lys Glu 450 455 460 GAA CTG GAA CAG AAG TGC AAA TCT GTT AAT ACT CGC CTA GAA AAA ACA 1440 Glu Leu Glu Gln Lys Cys Lys Ser Val Asn Thr Arg Leu Glu Lys Thr 465 470 475 480 GCA AAG GAG CTA GAA GAG GAG ATT ACC TTA CGG AAA AGT GTG GAA TCA 1488 Ala Lys Glu Leu Glu Glu Glu Ile Thr Leu Arg Lys Ser Val Glu Ser 485 490 495 GCA TTA AGA CAG TTA GAA AGA GAA AAG GCG CTT CTT CAG CAC AAA AAT 1536 Ala Leu Arg Gln Leu Glu Arg Glu Lys Ala Leu Leu Gln His Lys Asn 500 505 510 GCA GAA TAT CAG AGG AAA GCT GAT CAT GAA GCA GAC AAA AAA CGA AAT 1584 Ala Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Asp His Glu Ala Asp Lys Lys Arg Asn 515 520 525 TTG GAA AAT GAT GTT AAC AGC TTA AAA GAT CAA CTT GAA GAT TTG AAA 1632 Leu Glu Asn Asp Val Asn Ser Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys 530 535 540 AAA AGA AAT CAA AAC TCT CAA ATA TCC ACT GAG AAA GTG AAT CAA CTC 1680 Lys Arg Asn Gln Asn Ser Gln Ile Ser Thr Glu Lys Val Asn Gln Leu 545 550 555 560 CAG AGA CAA CTG GAT GAA ACC AAT GCT TTA CTG CGA ACA GAG TCT GAT 1728 Gln Arg Gln Leu Asp Glu Thr Asn Ala Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp 565 570 575 ACT GCA GCC CGG TTA AGG AAA ACC CAG GCA GAA AGT TCA AAA CAG ATT 1776 Thr Ala Ala Arg Leu Arg Lys Thr Gln Ala Glu Ser Ser Lys Gln Ile 580 585 590 CAG CAG CTG GAA TCT AAC AAT AGA GAT CTA CAA GAT AAA AAC TGC CTG 1824 Gln Gln Leu Glu Ser Asn Asn Arg Asp Leu Gln Asp Lys Asn Cys Leu 595 600 605 CTG GAG ACT GCC AAG TTA AAA CTT GAA AAG GAA TTT ATC AAT CTT CAG 1872 Leu Glu Thr Ala Lys Leu Lys Leu Glu Lys Glu Phe Ile Asn Leu Gln 610 615 620 TCA GCT CTA GAA TCT GAA AGG AGG GAT CGA ACC CAT GGA TCA GAG ATA 1920 Ser Ala Leu Glu Ser Glu Arg Arg Asp Arg Thr His Gly Ser Glu Ile 625 630 635 640 ATT AAT GAT TTA CAA GGT AGA ATA TGT GGC CTA GAA GAA GAT TTA AAG 1968 Ile Asn Asp Leu Gln Gly Arg Ile Cys Gly Leu Glu Glu Asp Leu Lys 645 650 655 AAC GGC AAA ATC TTA CTA GCG AAA GTA GAA CTG GAG AAG AGA CAA CTT 2016 Asn Gly Lys Ile Leu Leu Ala Lys Val Glu Leu Glu Lys Arg Gln Leu 660 665 670 CAG GAG AGA TTT ACT GAT TTG GAA AAG GAA AAA AGC AAC ATG GAA ATA 2064 Gln Glu Arg Phe Thr Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ser Asn Met Glu Ile 675 680 685 GAT ATG ACA TAC CAA CTA AAA GTT ATA CAG CAG AGC CTA GAA CAA GAA 2112 Asp Met Thr Tyr Gln Leu Lys Val Ile Gln Gln Ser Leu Glu Gln Glu 690 695 700 GAA GCT GAA CAT AAG GCC ACA AAG GCA CGA CTA GCA GAT AAA AAT AAG 2160 Glu Ala Glu His Lys Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Asp Lys Asn Lys 705 710 715 720 ATC TAT GAG TCC ATC GAA GAA GCC AAA TCA GAA GCC ATG AAA GAA ATG 2208 Ile Tyr Glu Ser Ile Glu Glu Ala Lys Ser Glu Ala Met Lys Glu Met 725 730 735 GAG AAG AAG CTC TTG GAG GAA AGA ACT TTA AAA CAG AAA GTG GAG AAC 2256 Glu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Arg Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Asn 740 745 750 CTA TTG CTA GAA GCT GAG AAA AGA TGT TCT CTA TTA GAC TGT GAC CTC 2304 Leu Leu Leu Glu Ala Glu Lys Arg Cys Ser Leu Leu Asp Cys Asp Leu 755 760 765 AAA CAG TCA CAG CAG AAA ATA AAT GAG CTC CTT AAA CAG AAA GAT GTG 2352 Lys Gln Ser Gln Gln Lys Ile Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Asp Val 770 775 780 CTA AAT GAG GAT GTT AGA AAC CTG ACA TTA AAA ATA GAG CAA GAA ACT 2400 Leu Asn Glu Asp Val Arg Asn Leu Thr Leu Lys Ile Glu Gln Glu Thr 785 790 795 800 CAG AAG CGC TGC CTT ACA CAA AAT GAC CTG AAG ATG CAA ACA CAA CAG 2448 Gln Lys Arg Cys Leu Thr Gln Asn Asp Leu Lys Met Gln Thr Gln Gln 805 810 815 GTT AAC ACA CTA AAA ATG TCA GAA AAG CAG TTA AAG CAA GAA AAT AAC 2496 Val Asn Thr Leu Lys Met Ser Glu Lys Gln Leu Lys Gln Glu Asn Asn 820 825 830 CAT CTC ATG GAA ATG AAA ATG AAC TTG GAA AAA CAA AAT GCT GAA CTT 2544 His Leu Met Glu Met Lys Met Asn Leu Glu Lys Gln Asn Ala Glu Leu 835 840 845 CGA AAA GAA CGT CAG GAT GCA GAT GGG CAA ATG AAA GAG CTC CAG GAT 2592 Arg Lys Glu Arg Gln Asp Ala Asp Gly Gln Met Lys Glu Leu Gln Asp 850 855 860 CAG CTC GAA GCA GAA CAG TAT TTC TCA ACC CTT TAT AAA ACA CAA GTT 2640 Gln Leu Glu Ala Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val 865 870 875 880 AGG GAG CTT AAA GAA GAA TGT GAA GAA AAG ACC AAA CTT GGT AAA GAA 2688 Arg Glu Leu Lys Glu Glu Cys Glu Glu Lys Thr Lys Leu Gly Lys Glu 885 890 895 TTG CAG CAG AAG AAA CAG GAA TTA CAG GAT GAA CGG GAC TCT TTG GCT 2736 Leu Gln Gln Lys Lys Gln Glu Leu Gln Asp Glu Arg Asp Ser Leu Ala 900 905 910 GCC CAA CTG GAG ATC ACC TTG ACC AAA GCA GAT TCT GAG CAA CTG GCT 2784 Ala Gln Leu Glu Ile Thr Leu Thr Lys Ala Asp Ser Glu Gln Leu Ala 915 920 925 CGT TCA ATT GCT GAA GAA CAA TAT TCT GAT TTG GAA AAA GAG AAG ATC 2832 Arg Ser Ile Ala Glu Glu Gln Tyr Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ile 930 935 940 ATG AAA GAG CTG GAG ATC AAA GAG ATG ATG GCT AGA CAC AAA CAG GAA 2880 Met Lys Glu Leu Glu Ile Lys Glu Met Met Ala Arg His Lys Gln Glu 945 950 955 960 CTT ACG GAA AAA GAT GCT ACA ATT GCT TCT CTT GAG GAA ACT AAT AGG 2928 Leu Thr Glu Lys Asp Ala Thr Ile Ala Ser Leu Glu Glu Thr Asn Arg 965 970 975 ACA CTA ACT AGT GAT GTT GCC AAT CTT GCA AAT GAG AAA GAA GAA TTA 2976 Thr Leu Thr Ser Asp Val Ala Asn Leu Ala Asn Glu Lys Glu Glu Leu 980 985 990 AAT AAC AAA TTG AAA GAT GTT CAA GAG CAA CTG TCA AGA TTG AAA GAT 3024 Asn Asn Lys Leu Lys Asp Val Gln Glu Gln Leu Ser Arg Leu Lys Asp 995 1000 1005 GAA GAA ATA AGC GCA GCA GCT ATT AAA GCA CAG TTT GAG AAG CAG CTA 3072 Glu Glu Ile Ser Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gln Phe Glu Lys Gln Leu 1010 1015 1020 TTA ACA GAA AGA ACA CTC AAA ACT CAA GCT GTG AAT AAG TTG GCT GAG 3120 Leu Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 1025 1030 1035 1040 ATC ATG AAT CGA AAA GAA CCT GTC AAG CGT GGT AAT GAC ACA GAT GTG 3168 Ile Met Asn Arg Lys Glu Pro Val Lys Arg Gly Asn Asp Thr Asp Val 1045 1050 1055 CGG AGA AAA GAG AAG GAG AAT AGA AAG CTA CAT ATG GAG CTT AAA TCT 3216 Arg Arg Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu His Met Glu Leu Lys Ser 1060 1065 1070 GAA CGT GAG AAA TTG ACC CAG CAG ATG ATC AAG TAT CAG AAA GAA CTG 3264 Glu Arg Glu Lys Leu Thr Gln Gln Met Ile Lys Tyr Gln Lys Glu Leu 1075 1080 1085 AAT GAA ATG CAG GCA CAA ATA GCT GAA GAG AGC CAG ATT CGA ATT GAA 3312 Asn Glu Met Gln Ala Gln Ile Ala Glu Glu Ser Gln Ile Arg Ile Glu 1090 1095 1100 CTG CAG ATG ACA TTG GAC AGT AAA GAC AGT GAC ATT GAG CAG CTG CGG 3360 Leu Gln Met Thr Leu Asp Ser Lys Asp Ser Asp Ile Glu Gln Leu Arg 1105 1110 1115 1120 TCA CAA CTC CAA GCC TTG CAT ATT GGT CTG GAT AGT TCC AGT ATA GGC 3408 Ser Gln Leu Gln Ala Leu His Ile Gly Leu Asp Ser Ser Ser Ile Gly 1125 1130 1135 AGT GGA CCA GGG GAT GCT GAG GCA GAT GAT GGG TTT CCA GAA TCA AGA 3456 Ser Gly Pro Gly Asp Ala Glu Ala Asp Asp Gly Phe Pro Glu Ser Arg 1140 1145 1150 TTA GAA GGA TGG CTT TCA TTG CCT GTA CGA AAC AAC ACT AAG AAA TTT 3504 Leu Glu Gly Trp Leu Ser Leu Pro Val Arg Asn Asn Thr Lys Lys Phe 1155 1160 1165 GGA TGG GTT AAA AAG TAT GTG ATT GTA AGC AGT AAG AAG ATT CTT TTC 3552 Gly Trp Val Lys Lys Tyr Val Ile Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1170 1175 1180 TAT GAC AGT GAA CAA GAT AAA GAA CAA TCC AAT CCT TAC ATG GTT TTA 3600 Tyr Asp Ser Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Tyr Met Val Leu 1185 1190 1195 1200 GAT ATA GAC AAG TTA TTT CAT GTC CGA CCA GTT ACA CAG ACA GAT GTG 3648 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Thr Asp Val 1205 1210 1215 TAT AGA GCA GAT GCT AAA GAA ATT CCA AGG ATA TTC CAG ATT CTG TAT 3696 Tyr Arg Ala Asp Ala Lys Glu Ile Pro Arg Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1220 1225 1230 GCC AAT GAA GGA GAA AGT AAG AAG GAA CAA GAA TTT CCA GTG GAG CCA 3744 Ala Asn Glu Gly Glu Ser Lys Lys Glu Gln Glu Phe Pro Val Glu Pro 1235 1240 1245 GTT GGA GAA AAA TCT AAT TAT ATT TGC CAC AAG GGA CAT GAG TTT ATT 3792 Val Gly Glu Lys Ser Asn Tyr Ile Cys His Lys Gly His Glu Phe Ile 1250 1255 1260 CCT ACT CTT TAT CAT TTC CCA ACC AAC TGT GAG GCT TGT ATG AAG CCC 3840 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Thr Asn Cys Glu Ala Cys Met Lys Pro 1265 1270 1275 1280 CTG TGG CAC ATG TTT AAG CCT CCT CCT GCT TTG GAG TGC CGC CGT TGC 3888 Leu Trp His Met Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1285 1290 1295 CAT ATT AAG TGT CAT AAA GAT CAT ATG GAC AAA AAG GAG GAG ATT ATA 3936 His Ile Lys Cys His Lys Asp His Met Asp Lys Lys Glu Glu Ile Ile 1300 1305 1310 GCA CCT TGC AAA GTA TAT TAT GAT ATT TCA ACG GCA AAG AAT CTG TTA 3984 Ala Pro Cys Lys Val Tyr Tyr Asp Ile Ser Thr Ala Lys Asn Leu Leu 1315 1320 1325 TTA CTA GCA AAT TCT ACA GAA GAG CAG CAG AAG TGG GTT AGT CGG TTG 4032 Leu Leu Ala Asn Ser Thr Glu Glu Gln Gln Lys Trp Val Ser Arg Leu 1330 1335 1340 GTG AAA AAG ATA CCT AAA AAG CCC CCA GCT CCA GAC CCT TTT GCC CGA 4080 Val Lys Lys Ile Pro Lys Lys Pro Pro Ala Pro Asp Pro Phe Ala Arg 1345 1350 1355 1360 TCA TCT CCT AGA ACT TCA ATG AAG ATA CAG CAA AAC CAG TCT ATT AGA 4128 Ser Ser Pro Arg Thr Ser Met Lys Ile Gln Gln Asn Gln Ser Ile Arg 1365 1370 1375 CGG CCA AGT CGA CAG CTT GCC CCA AAC AAA CCT AGC TAA CTGCCTTCTA 4177 Arg Pro Ser Arg Gln Leu Ala Pro Asn Lys Pro Ser 1380 1385 TGAAAGCAGT CATTATTCAA GGTGATCGTA TTCTTCCAGT GAAAACAAGA CTGAAATATG 4237 ATGACCCCAT GGTACCCGGA TCCTCGAATC TTTTGCTTTT TACCCTGGAA GAAATACTCA 4297 TAAGCCACCT CTGTAATCGG ATCCCCGGGT ACCGAAATAC TCATAAGCCA CCTCTGTAAT 4357 CGGATC 4363

Ｃ

【図面の簡単な説明】

【図１】活性型Ｒｈｏタンパク質に特異的に結合するタ
ンパク質の精製の結果を示した電気泳動写真である。粗
膜画分を、ＧＳＴ（レーン１）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡ（レーン２）、またはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ（レーン３）を含むグルタチオン−セファロース・カ
ラムにかけた。ウシＲｈｏキナーゼの純度を上げるため
に、粗膜画分をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡを含むグ
ルタチオン・セファロースにかけ、ウシＲｈｏキナーゼ
を１％ＣＨＡＰＳの添加により、溶出した（レーン
４）。

【図２】Ｍｏｎｏ Ｑ カラム・クロマトグラフィーに
よるウシＲｈｏキナーゼの精製の結果を示した図および
電気泳動写真である。ＣＨＡＰＳ−溶出画分をＭｏｎｏ
Ｑ カラムにかけ、ＲｈｏキナーゼをＮａＣｌ直線勾配
で溶出した。結果は３回の独立した実験の代表例であ
る。

【図３】ウシＲｈｏキナーゼと活性型ＲｈｏＡとの結合
を示した電気泳動写真である。レーン１およびレーン３
は膜抽出液を、レーン２およびレーン４はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分離した精製Ｒｈｏキナーゼをそれぞれ含むニト
ロセルロース膜を示す。また、レーン１およびレーン２
は［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡを、レーン
３およびレーン４は［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏＡ^{Ａｌａ３７}をプローブとして用いたレーンを示
す。矢印は、ＲｈｏキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位
置を示す。結果は３回の独立した実験の代表例である。

【図４】ウシＲｈｏキナーゼの自己リン酸化能を示した
電気泳動写真である。Ｒｈｏキナーゼを、下記のタンパ
ク質（各１μＭ）存在下で自己リン酸化した。レーン
１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レ
ーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}。矢印は、Ｒｈ
ｏキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を示している。
結果は３回の独立した実験の代表例である。

【図５】ＧＳＴ、ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、あるいは
ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡのいずれかが存在する条
件下での、ウシＲｈｏキナーゼによるミエリン塩基性タ
ンパク質、Ｓ６ペプチド、αＰＫＣ（各４０μＭ）のリ
ン酸化の程度を示した図である。

【図６】ウシＲｈｏキナーゼによるＳ６ペプチド（４０
μＭ）のリン酸化を、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
（１μＭ）が促進することを示した図である。

【図７】ウシＲｈｏキナーゼによるラットのミオシン結
合サブユニットのリン酸化を、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏＡが促進することを示した電気泳動写真である。レ
ーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ。矢印
は、ミオシン結合サブユニットタンパク質のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上の位置を示す。

【図８】ウシＲｈｏキナーゼによるＳ６ペプチドのリン
酸化を示した図である。黒四角形：ＧＴＰγＳ−Ｒｈｏ
Ａ（翻訳後修飾型）、白四角形：ＧＤＰ−ＲｈｏＡ（翻
訳後修飾型）、黒丸：ＧＴＰγＳ−ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
（非翻訳後修飾型）、白丸：ＧＤＰ−ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
（非翻訳後修飾型）。

【図９】ウシＲｈｏキナーゼの推定アミノ酸配列を示し
た図である。ウシ脳灰白質から精製したＲｈｏキナーゼ
の部分ペプチド配列分析で決定されたアミノ酸配列は下
線で示した。ＲｈｏキナーゼｃＤＮＡクローニングに用
いたプローブのアミノ酸配列は二重下線で示した。

【図１０】ウシＲｈｏキナーゼとマイトニック・ディス
トロフィー・キナーゼのドメイン構造を比較をした図で
ある。

【図１１】ウシＲｈｏキナーゼの発現の組織分布を示し
た電気泳動写真である。レーン１：ＧＳＴ−ＲｈｏＡア
フィニティーカラムからの１％ＣＨＡＰＳ溶出液、レー
ン２：大脳、レーン３：小脳、レーン４：心臓、レーン
５：骨格筋、レーン６：脾臓、レーン７：肺、レーン
８：肝臓、レーン９：腎臓、レーン１０：膵臓。矢印
は、ＲｈｏキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を示
す。

【図１２】インビトロ翻訳により合成したウシＲｈｏキ
ナーゼのコイルド−コイル領域のタンパク質と活性型Ｒ
ｈｏとの結合を示した電気泳動写真である。レーン１：
ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}、レーン５：ＧＤＰ
・ＧＳＴ−Ｒａｃ１、レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１、レーン７：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン８：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。

【図１３】ウシＲｈｏキナーゼによるニワトリのミオシ
ン結合サブユニットのリン酸化をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡが促進することを示した電気泳動写真である。
レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}、レーン
５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１、レーン６：ＧＴＰγＳ
・ＧＳＴ−Ｒａｃ１。レーンの上の数字は、リン酸化の
程度を、ＧＳＴ（レーン１）の場合を１．０としたとき
の相対値で表している。

【図１４】ウシＲｈｏキナーゼ濃度依存的なニワトリ・
ミオシン結合サブユニットのチオリン酸化とミオシン軽
鎖フォスファターゼ活性の阻害を示した図である。黒丸
および白丸は、それぞれＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
存在下または非存在下でのミオシン結合サブユニットへ
の^３５Ｓ−チオリン酸の取り込みを示す。黒四角形およ
び白四角形は、それぞれＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
存在下または非存在下、ＡＴＰγＳの存在下でリン酸化
したＲｈｏキナーゼを用いた場合でのミオシン軽鎖フォ
スファターゼの酵素活性を示す。菱形はＡＴＰγＳの非
存在下（即ちリン酸化していないＲｈｏキナーゼを用い
た場合）でのミオシン軽鎖フォスファターゼの酵素活性
を示す。

【図１５】ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を過剰に
発現させた各ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株内でのミオシン結合
サブユニットのリン酸化の程度を示した電気泳動写真で
ある。レーンの上の数字は、リン酸化の程度を、ＧＳＴ
（レーン１）の場合を１．０としたときの相対値で表し
ている。

【図１６】ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}を過剰に
発現させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞株内でのミオシン軽鎖の
リン酸化の程度を示した図である。

【図１７】ウシＲｈｏキナーゼによるミオシン軽鎖のリ
ン酸化を示した電気泳動写真である。単離されたミオシ
ン軽鎖（０．５μｇのタンパク質）を、ＧＳＴ（レーン
１）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン２）、ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン３）、ＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡ^Ala37 （レーン４）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１（レーン５）またはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａ
ｃ１（レーン６）の存在下において精製したウシＲｈｏ
キナーゼ（タンパク質２０ｎｇ）によりリン酸化する
か、またはＧＳＴ−ウシＲｈｏキナーゼ（タンパク質５
ｎｇ）（レーン７）またはＣａ²⁺およびカルモジュリン
の非存在下（レーン８）または存在下（レーン９）にお
いてミオシン軽鎖キナーゼによりリン酸化した。無傷の
ミオシン（タンパク質５μｇ）をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡの非存在下（レーン１０）または存在下（レー
ン１１）においてリン酸化した。リン酸化されたミオシ
ン軽鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、画像解析装置
により可視化した。結果は３回の独立した実験の代表的
なものである。

【図１８】ウシＲｈｏキナーゼによるミオシン軽鎖のリ
ン酸化を示した図である。種々の量のミオシン軽鎖をＲ
ｈｏキナーゼによりリン酸化した。「ＭＬＣ」はミオシ
ン軽鎖を、「Ｒｈｏ−Kinase」はＲｈｏキナーゼを、
「ＭＬＣ Kinase」はミオンシ軽鎖キナーゼを、それぞ
れ意味する（以下同じ）。左図において黒丸はＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下、丸印はＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡ非存在下におけるＲｈｏキナーゼによるリ
ン酸化を示す。黒三角はＧＳＴ−Ｒｈｏキナーゼによる
リン酸化である。右図において黒四角形および四角形は
Ｃａ²⁺およびカルモジュリン存在下および非存在下にお
けるミオシン軽鎖キナーゼによるリン酸化を示す。

【図１９】ミオシン軽鎖のリン酸化ペプチドのマッピン
グ分析を示した電気泳動写真である。ミオシン軽鎖
（０．５μｇのタンパク質）をＲｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ
−Kinase）、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣ Kinase）
またはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）によりリン酸化
した。リン酸化されたミオシン軽鎖をトリプシンで消化
し、各試料をシリカゲルのプレート上にロードした。リ
ン酸化ペプチドを電気泳動（水平方向）およびクロマト
グラフィー（垂直方向）により分離し、次いで画像解析
装置により可視化した。星印は原点を示す。

【図２０】組換えミオシン軽鎖のリン酸化を示した電気
泳動写真である。ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＧＳＴ、Ｇ
ＳＴ−ミオシン軽鎖（ＧＳＴ−ＭＬＣ）またはＧＳＴ−
ミオシン軽鎖^{Ala18 Ala19} （各２μＭ）を図示した様
に、精製Ｒｈｏキナーゼ（２０ｎｇのタンパク質）、Ｇ
ＳＴ−Ｒｈｏキナーゼ（１０ｎｇのタンパク質）、また
はミオシン軽鎖キナーゼ（１０ｎｇのタンパク質）によ
ってリン酸化した。レーン１〜４：ミオシン軽鎖を精製
Ｒｈｏキナーゼでリン酸化した。レーン５〜８：ミオシ
ン軽鎖をＧＳＴ−Ｒｈｏキナーゼによってリン酸化し
た。レーン９〜１２：ミオシン軽鎖をミオシン軽鎖キナ
ーゼによりリン酸化した。レーン１、５および９：ミオ
シン軽鎖、レーン２、６、および１０：ＧＳＴ、レーン
３、７、および１１：ＧＳＴ−ミオシン軽鎖、レーン
４、８、および１２：ＧＳＴ−ミオシン軽鎖
^Ala18,Ala19 。結果は３回の独立の実験の代表的なもの
である。

【図２１】アクチンにより活性化されたＭｇＡＴＰアー
ゼ活性に対するウシＲｈｏキナーゼによるミオシンのリ
ン酸化の効果を示した図である。縦軸はミオシンヘッド
（head）のリン酸化速度である。ミオシンをＧＳＴ・Ｒ
ｈｏキナーゼ（黒四角形）、あるいはミオシン軽鎖キナ
ーゼ（黒菱形）とともに、あるいはキナーゼ非存在下
（黒丸）でインキュベートした。インキュベートの後、
ＡＴＰアーゼ活性を様々な濃度のＦ−アクチンの存在下
で測定した示した値は三回の反復実験の平均±Ｓ．Ｅ．
である。

【図２２】Ｒｈｏタンパク質、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ
−Kinase）およびミオシン軽鎖ホスファターゼによるミ
オシン軽鎖の調節に関するモデルを示した図である。Ｃ
ａｔ：ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニッ
ト、Myosin: ミオシン、ＭＢＳ：ミオシン結合サブユニ
ット。

【図２３】酵母ツー・ハイブリッド・システムによるＲ
ｈｏタンパク質とヒトＲｈｏキナーゼタンパク質との結
合の検出を示した写真である。

【図２４】Triton X-100によって透過性を亢進させたウ
サギ門脈血管をＲｈｏキナーゼが収縮させることを示し
た図である。Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を外来的にウサ
ギ門脈の血管平滑筋標本に導入させた。ｐＣａ６．５
（ａおよびｂ）またはｐＣａ＜＜８．０（ｃ）にてTrit
on X-100によって透過性を亢進させたウサギ門脈血管標
本に誘導させた張力反応の代表的な記録を示している。
これらの結果はいずれも３〜５回の独立した実験からの
代表例である。 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の収縮効果
は、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）を洗浄することによっ
て完全に元に戻った（ｂ）。また、ｃでは、ベヒクル
（vehicle ）の投与用量をトータルのchamberの量（２
００μｌ）に対するパーセンテージで示した。

【図２５】Triton X-100によって透過性を亢進させたウ
サギ門脈血管の収縮の感受性（contractile sensitivit
y）がＲｈｏキナーゼによって亢進される（potentiate
s）ことを示した図である。 ａ：７．５ｎＭ Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）（白丸）ま
たは５００ｎＭ ＯＡ（黒丸）の存在下でのｐＣａと張
力の関係。ｐＣａ７．０以下では７．５ｎＭのＲｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）によって生じた張力の程度は、basal
レベルであった。Steady-stateのＣａ^２＋と張力の関係
を、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）存在下（白丸）またはＯ
Ａ存在下（黒丸）あるいは非存在下（白三角・破線：対
照）で、細胞質のＣａ^２＋濃度をcummulativeに上昇さ
せることにより得た。 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）存在
下またはＯＡ存在下での収縮の感受性の上昇を示すため
に、各々の張力反応は対照のｐＣａ４．５での張力を１
として標準化した相対値で示した。縦軸は張力の相対値
を、横軸はＣａ^２＋濃度をｐＣａで、それぞれ示してい
る。各々の値は４回の実験より得られた平均値±標準偏
差である。 ｂ：Triton X-100によって透過性を亢進させたウサギ門
脈血管におけるＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の用量−反応
曲線に及ぼすwortmannin (WM)（強力なミオシン軽鎖キ
ナーゼ(MLCK)の阻害剤）の効果。実践はｐＣａ６．５で
の、破線はｐＣａ＜＜８．０（１０ｍＭ ＥＧＴＡで緩
衝させた）での効果をそれぞれ示している。Steady sta
teの張力反応を、１０μＭのＷＭの存在下（黒丸はｐＣ
ａ６．５、黒三角はｐＣａ＜＜８．０における）または
非存在下（白丸はｐＣａ６．５、白三角はｐＣａ＜＜
８．０における）で、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）のcumm
ulativeな添加により得た。張力反応は、ｐＣａ４．５
での最大張力反応を１とした相対値で示した。縦軸は張
力の相対値を、横軸はＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）のモル
濃度（μＭ）をそれぞれ示している。各々の値は５−８
回の実験より得られた平均値±標準偏差である。ＡＮＯ
ＶＡ解析を統計学的な有意差を決定するのに用いた。
０．０５以下のＰ値（P value）を「有意である」とみ
なした（＊＊；ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．；有意差な
し）。

【図２６】Ｒｈｏキナーゼが、Ｃａ^２＋非依存的かつWo
rtmannin非感受性な様式で、 Triton X-100によって透
過性を亢進させたウサギ門脈血管中のミオシン軽鎖のリ
ン酸化を誘導することを示した電気泳動写真および図で
ある。 ａ：Triton X-100によって透過性を亢進させたウサギ門
脈血管中リン酸化を受けていないタイプのミオシン軽鎖
（ＭＬＣ−Ｐ０）および一リン酸化されたミオシン軽鎖
（ＭＬＣ−Ｐ１）をグリセロール−尿素ポリアクリルア
ミドゲル電気泳導で分離した後、抗ミオシン軽鎖抗体を
用いたイムノブロットを実施した。対照（レーン１、ｐ
Ｃａ＜＜８．０；レーン２、ｐＣａ６．５）とは対照的
に、０．２５５μＭのＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）は、１
０μＭのＷＭの非存在下（レーン２、５）および存在下
（レーン３、６）において、ｐＣａ＜＜８．０（１０ｍ
ＭＥＧＴＡ；レーン１−３）およびｐＣａ６．５（レー
ン４−６）において、ミオシン軽鎖の一リン酸化を増加
させた。これらの結果は、４回の実験の代表例である。 ｂ：１０μＭのＷＭの存在下または非存在下におけるミ
オシン軽鎖のリン酸化の程度（白抜きの棒線）と収縮反
応（斜線の棒線）に及ぼすＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）の
効果の定量化との比較。白抜きの棒線はトータルのＭＬ
Ｃに対する一リン酸化されたＭＬＣのパーセンテージを
４回の実験の平均値±標準偏差で表現している。トータ
ルのＭＬＣリン酸化の値はStudent's testによって比較
した（＊＊ Ｐ＜０．０１、＊ Ｐ＜０．０５）。各々
のカラムの下の数字は、ａにおける各々のレーンと同一
である。ａにおける略語は下記の通り：Ｇ１０、１０ｍ
ＭＥＧＴＡを含む弛緩溶液；６．５、ｐＣａ６．５；Ｗ
Ｍ、１０ｍＭwortmannin、ＲＫ、０．２５５ Ｒｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ）。

【図２７】Triton X-100によって透過性を亢進させた血
管標本におけるＲｈｏキナーゼの欠如を示した電気泳動
写真および図である。 ａ：無傷のウサギ門脈血管標本（透過性を亢進させてい
ないもの；レーン１、３、５）とTriton X-100によって
透過性を亢進させたウサギ門脈血管標本（レーン２、
４、６）におけるＲｈｏキナーゼの組織分布を比較する
ために、抗Ｒｈｏキナーゼ抗体（レーンＡ）および抗２
０ｋＤａミオシン軽鎖抗体を用いたイムノブロット解析
を実施した。対照として、各々の抽出液のＣＢＢ染色を
示した（レーンＣ）。各々の抽出液を５％ＳＤＳーＰＡ
ＧＥによって（レーンＡおよびＢ）または１５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（レーンＣ）によってそれぞれ解析した。
「ＲＫ」はＲｈｏキナーゼ、「ＭＬＣ」はミオシン軽鎖
を示す。これらの結果は３回の独立した実験の代表例で
ある。 ｂ：ａに示された結果の濃度的（densitometrical ）な
解析。無傷の組織（レーン３、５）および透過性を亢進
させた（skinned）組織（レーン４、６）におけるＲｈ
ｏキナーゼの免疫染色の濃度的な定量値をミオシン軽鎖
のそれに対する比率として表したデータである。データ
は平均値±標準偏差で表現した。

【図２８】実験に用いた種々のＲｈｏキナーゼの構造を
模式的に示した図である。Ｒｈｏキナーゼ、Ｒｈｏキナ
ーゼ（ＣＡＴ）、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）、
Ｒｈｏキナーゼ（ＣＯＩＬ）、 Ｒｈｏキナーゼ（Ｒ
Ｂ）および Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）の模式図を示す。

【図２９】オーバーレイ・アセッイによるＲｈｏタンパ
ク質とＲｈｏキナーゼとの結合を示した電気泳動写真で
ある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ニトロセルロース
膜に移した精製Ｒｈｏキナーゼ（レーン１、３）、Ｒｈ
ｏキナーゼ（ＲＢ）（レーン２、４）を[^３５Ｓ]ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン１、２）あるいは[
^３５Ｓ]ＧＴＰγＳ・ＧＳＴーＲｈｏＡ^{Ａｌａ３７}（レ
ーン３、４）をプローブにしてオーバーレイアッセイし
た結果を示す。結果は、３回の独立した実験の代表例を
示す。

【図３０】ミオシン軽鎖をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ（１．５μＭ）の存在下または非存在下において天然
ＲｈｏキナーゼまたはＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）でリン
酸化した結果を示した図である。データは３回の独立し
た実験の平均値±ＳＥＭである。

【図３１】ドミナントネガティブ変異体およびスタウロ
スポリンのミオシン軽鎖のリン酸化に与える影響を示し
た図である。 ａ：ミオシン軽鎖を種々の濃度のＲｈｏキナーゼ（Ｒ
Ｂ）とともに、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）（□）によ
り、またはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在下にお
いて天然Ｒｈｏキナーゼにより（○）リン酸化した。 ｂ：ミオシン軽鎖を種々の濃度のスタウロスポリンとと
もに、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）により（□）、または
ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの存在下において天然Ｒ
ｈｏキナーゼにより（○）リン酸化した。データは３回
の独立した実験の平均±ｓＳＥＭである。

【図３２】Ｒｈｏキナーゼによるアクチンの再構成を示
す写真（生物の形態の写真）である。ベヒクル（vehicl
e）で刺激（a）、マイクロインジェクションなしでＬＰ
Ａ（２００ｎｇ）で１５分間刺激（ｂ）、Ｃ３酵素（８
０μｇ／ｍｌ）をマイクロインジェクションしてＬＰＡ
で刺激（ｃ）、スタウロスポリン（１００ｎＭ）で処理
１５分後にＬＰＡで処理（ｄ）、Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡ
Ｔ）（０.５ｍｇ／ｍｌ）を単独でマイクロインジェク
ション（ｅ）、 Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）とＣ３をマ
イクロインジェクション（ｆ）、スタウロスポリンで処
理１５分後にＲｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）をマイクロイン
ジェクション（ｇ）した コンフルエントな血清飢餓さ
せたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞で形成されたアクチンフィラ
メントを示す。

【図３３】Ｒｈｏキナーゼによるフォーカル接着（Foca
l adhesion）の形成を示す写真（生物の形態の写真）で
ある。ビンキュリンの局在を示している。写真ｈ以外の
実験条件は図３２と同様である。写真ｈは、Ｒｈｏキナ
ーゼ（ＣＡＴ）をマイクロインジェクションしたＳｗｉ
ｓｓ ３Ｔ３細胞でのアクチンフィラメントとビンキュ
リンの局在を示している。やじり印はマイクロインジェ
クションした場所、棒線は２０μｍを示している。

【図３４】ＬＰＡにより誘導されるアクチンフィラメン
トの再構成とフォーカル接着（Focal adhesion）の形成
に及ぼす種々のＲｈｏキナーゼの影響を示す写真（生物
の形態の写真）である。 コンフルエントな血清飢餓さ
せたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に、２ｍｇ／ｍｌのＲｈｏキ
ナーゼ（ＣＡＴ−ＫＤ）（Ａ、Ｅ）、５ｍｇ／ｍｌのＲ
ｈｏキナーゼ（ＣＯＩＬ）（Ｂ、Ｆ）、５ｍｇ／ｍｌの
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ）（Ｃ、Ｇ）、５ｍｇ／ｍｌのＲ
ｈｏキナーゼ（ＰＨ）（Ｄ、Ｈ）をマイクロインジェク
ションした後２００ｎｇ／ｍｌのＬＰＡで刺激した。ア
クチンフィラメントとビンキュリンの局在を示してい
る。やじり印はマイクロインジェクションした場所、棒
線は２０μｍを示している。

【図３５】ＭＤＣＫ細胞におけるアクチンの再構成を示
した写真（生物の形態の写真）である。ｐＥＦ−ＢＯＳ
−ＨＡ−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}（０.１ｍｇ／ｍｌ）＋ｐ
ＥＦ−ＢＯＳ−ｍｙｃ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ａ）、 ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ｍｙｃ−Ｒｈｏキナーゼ（ＣＡＴ）（０.
１ｍｇ／ｍｌ）＋ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍｙｃ（１ｍｇ／ｍ
ｌ）（Ｂ）、 ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡ
^{Ｖａｌ１４}＋ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍｙｃ−Ｒｈｏキナーゼ
（ＣＡＴ−ＫＤ）（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃ）、 ｐＥＦ−
ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}＋ｐＥＦ−ＢＯＳ−
ｍｙｃ−Ｒｈｏキナーゼ（ＲＢ ）（１ｍｇ／ｍｌ）
（Ｄ）、 ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡ^{Ｖａｌ１４}
＋ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍｙｃ−Ｒｈｏキナーゼ（ＰＨ）
（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｅ）をマイクロインジェクションし
たＭＤＣＫ細胞でのアクチンフィラメントを示してい
る。やじり印はマイクロインジェクションした場所、棒
線は２０μｍを示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/52 (31)優先権主張番号 特願平8−213243 (32)優先日 平成８年７月24日(1996．7．24) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平8−241061 (32)優先日 平成８年８月23日(1996．8．23) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 特許法第30条第１項適用申請有り 生化学，Ｖｏｌ. 67，Ｎｏ．７，1995，Ｐ．649に発表 特許法第30条第１項適用申請有り 平成７年９月16日、 日本生化学会研究集会において、文書をもって発表 (72)発明者 高 橋 信 明 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (72)発明者 小 林 誠 山口県宇部市北琴芝１−２−10−106 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 9/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (64)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
   つプロテインキナーゼ活性を有するその誘導体。
2. 【請求項２】１以上のアミノ酸配列が付加および／また
   は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
   よび／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列を有
   するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒｈ
   ｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活
   性を有するタンパク質またはその誘導体。
3. 【請求項３】配列番号１の１〜８９番のアミノ酸配列ま
   たはその部分配列、および／または３６０〜９４２番の
   アミノ酸配列またはその部分配列、および／または１０
   ６９〜１３８８番のアミノ酸配列またはその部分配列が
   欠失された、請求項２に記載のタンパク質またはその誘
   導体。
4. 【請求項４】配列番号１の９０〜３５９番のアミノ酸配
   列と９４３〜１０６８番のアミノ酸配列とを有するタン
   パク質、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、
   かつプロテインキナーゼ活性を有するその誘導体。
5. 【請求項５】配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
   つプロテインキナーゼ活性を有するその誘導体。
6. 【請求項６】１以上のアミノ酸配列が付加および／また
   は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
   よび／または欠失された配列番号４のアミノ酸配列を有
   するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒｈ
   ｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活
   性を有するタンパク質またはその誘導体。
7. 【請求項７】配列番号４の１〜８９番のアミノ酸配列ま
   たはその部分配列、および／または３６０〜９４２番の
   アミノ酸配列またはその部分配列、および／または１０
   ６９〜１３８８番のアミノ酸配列またはその部分配列が
   欠失された、請求項６に記載のタンパク質またはその誘
   導体。
8. 【請求項８】配列番号４の９０〜３５９番のアミノ酸配
   列と９４３〜１０６８番のアミノ酸配列とを有するタン
   パク質、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、
   かつプロテインキナーゼ活性を有するその誘導体。
9. 【請求項９】１以上のアミノ酸配列が付加および／また
   は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
   よび／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列を有
   するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒｈ
   ｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活
   性を有さないタンパク質またはその誘導体。
10. 【請求項１０】配列番号１の９０〜３５９番のアミノ酸
    配列またはプロテインキナーゼ活性を有するその一部を
    含む領域が欠失された、請求項９に記載のタンパク質ま
    たはその誘導体。
11. 【請求項１１】配列番号１の１２１番目のＬｙｓがＧｌ
    ｙで置換された請求項９に記載のタンパク質またはその
    誘導体。
12. 【請求項１２】配列番号１の４２１〜１１３７番、４３
    ８〜１１２４番、７９９〜１１３７番、９４３〜１０６
    ８番、または９４１〜１０７５番のアミノ酸配列からな
    るタンパク質、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を
    有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さないその誘導
    体。
13. 【請求項１３】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号４のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ
    活性を有さないタンパク質またはその誘導体。
14. 【請求項１４】配列番号４の９０〜３５９番のアミノ酸
    配列またはプロテインキナーゼ活性を有するその一部を
    含む領域が欠失された、請求項１３に記載のタンパク質
    またはその誘導体。
15. 【請求項１５】配列番号４の１２１番目のＬｙｓがＧｌ
    ｙで置換された、請求項１３に記載のタンパク質または
    その誘導体。
16. 【請求項１６】配列番号４の９４３〜１０６８番のアミ
    ノ酸配列からなるタンパク質、または活性型Ｒｈｏタン
    パク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有
    さないその誘導体。
17. 【請求項１７】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質および／またはＲｈｏキナーゼの機能を
    阻害するタンパク質およびその誘導体。
18. 【請求項１８】前記配列番号１のアミノ酸配列が、配列
    番号１の９４１〜１０７５番または９４３〜１０６８番
    のアミノ酸配列である、請求項１７に記載のタンパク質
    およびその誘導体。
19. 【請求項１９】前記配列番号１のアミノ酸配列が、配列
    番号１の１１２５〜１３８８番のアミノ酸配列である、
    請求項１７に記載のタンパク質およびその誘導体。
20. 【請求項２０】前記配列番号１のアミノ酸配列が、１２
    １番のＬｙｓがＧｌｙによって置換された、配列番号１
    の６〜５５３番のアミノ酸配列からなる、請求項１７に
    記載のタンパク質またはその誘導体。
21. 【請求項２１】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号４のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質および／またはＲｈｏキナーゼの機能を
    阻害するタンパク質およびその誘導体。
22. 【請求項２２】前記配列番号４のアミノ酸配列が、配列
    番号４の９４１〜１０７５番または９４３〜１０６８番
    のアミノ酸配列である、請求項２１に記載のタンパク質
    およびその誘導体。
23. 【請求項２３】前記配列番号４のアミノ酸配列が、配列
    番号４の１１２５〜１３８８番のアミノ酸配列である、
    請求項２１に記載のタンパク質およびその誘導体。
24. 【請求項２４】前記配列番号４のアミノ酸配列が、１２
    １番のＬｙｓがＧｌｙによって置換された、配列番号４
    の６〜５５３番のアミノ酸配列からなる、請求項２１に
    記載のタンパク質またはその誘導体。
25. 【請求項２５】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、プロテイ
    ンキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結
    合能を有さないタンパク質またはその誘導体。
26. 【請求項２６】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、キナーゼ
    活性が構成的に活性化されたタンパク質およびその誘導
    体。
27. 【請求項２７】配列番号１の９４３〜１０６８番のアミ
    ノ酸配列または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
    その一部を含む領域が欠失された、請求項２５または２
    ６に記載のタンパク質またはその誘導体。
28. 【請求項２８】配列番号１の９０〜３５９番または６〜
    ５５３番のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはプ
    ロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパ
    ク質結合能を有さないその誘導体。
29. 【請求項２９】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号４のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、プロテイ
    ンキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結
    合能を有さないタンパク質またはその誘導体。
30. 【請求項３０】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号４のアミノ酸配列を
    有するタンパク質またはその誘導体であって、キナーゼ
    活性が構成的に活性化されたタンパク質およびその誘導
    体。
31. 【請求項３１】配列番号４の９４３〜１０６８番のアミ
    ノ酸配列または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
    その一部を含む領域が欠失された、請求項２９または３
    ０に記載のタンパク質またはその誘導体。
32. 【請求項３２】配列番号４の９０〜３５９番または６〜
    ５５３番のアミノ酸配列からなるタンパク質、またはプ
    ロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパ
    ク質結合能を有さないその誘導体。
33. 【請求項３３】請求項１〜８および２５〜３２のいずれ
    か一項に記載のタンパク質またはその誘導体をコードす
    るポリヌクレオチド。
34. 【請求項３４】請求項９〜１６のいずれか一項に記載の
    タンパク質またはその誘導体をコードするポリヌクレオ
    チド。
35. 【請求項３５】請求項１７〜２４のいずれか一項に記載
    のタンパク質またはその誘導体をコードするポリヌクレ
    オチド。
36. 【請求項３６】配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全
    部を有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の
    ポリヌクレオチド。
37. 【請求項３７】ＤＮＡ配列の一部が、配列番号２の２６
    ８〜１０７７番、１６〜１６５９番、１２６１〜３４１
    １番、２３９５〜３４１１番、１３１２〜３３７２番、
    ２８２７〜３２０４番、２８２１〜３２２５番、または
    ３３７３〜４１６４番のＤＮＡ配列である、請求項３６
    に記載のポリヌクレオチド。
38. 【請求項３８】配列番号５のＤＮＡ配列の一部または全
    部を有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の
    ポリヌクレオチド。
39. 【請求項３９】ＤＮＡ配列の一部が、配列番号５の２６
    ８〜１０７７番、２８２７〜３２０４番、２８２１〜３
    ２２５番、または３３７３〜４１６４番のＤＮＡ配列で
    ある、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
40. 【請求項４０】請求項３３〜３９のいずれか一項に記載
    のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
41. 【請求項４１】請求項３４または３５に記載のポリヌク
    レオチドを含んでなる、ベクター。
42. 【請求項４２】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
    ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
    る、請求項４０または４１に記載のベクター。
43. 【請求項４３】請求項４０〜４２のいずれか一項に記載
    のベクターによって形質転換された、宿主細胞（ただ
    し、ヒト細胞にあってはヒトから単離された細胞に限
    る）。
44. 【請求項４４】大腸菌、酵母、昆虫細胞、Ｓｆ９細胞、
    ＣＯＳ細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血
    液系細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択されるも
    のである、請求項４３に記載の宿主細胞。
45. 【請求項４５】請求項４３または４４に記載の宿主細胞
    を培養し、そしてその培養物から請求項１〜３２のいず
    れか一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単
    離することを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記
    載のタンパク質またはそれらの誘導体の製造法。
46. 【請求項４６】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜１６のいず
    れか一項に記載のタンパク質またはその誘導体とを含む
    スクリーニング系に存在させ、そして （２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜１６のい
    ずれか一項に記載のタンパク質またはその誘導体との結
    合の阻害の程度を測定することを含む、活性型Ｒｈｏタ
    ンパク質と、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタ
    ンパク質またはその誘導体との結合を阻害する物質のス
    クリーニング法。
47. 【請求項４７】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項４６に記載のスクリーニング法。
48. 【請求項４８】スクリーニング系が酵母ツー・ハイブリ
    ッド・システムである、請求項４６または４７に記載の
    スクリーニング法。
49. 【請求項４９】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、請求項１〜８および２５〜３２のいずれか一項に記
    載のタンパク質またはその誘導体とを含むスクリーニン
    グ系に存在させ、そして （２）請求項１〜８および２５〜３２のいずれか一項に
    記載のタンパク質またはその誘導体のプロテインキナー
    ゼの活性の阻害の程度を測定することを含む、請求項１
    〜８および２５〜３２のいずれか一項に記載のタンパク
    質またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性を阻害
    する物質のスクリーニング法。
50. 【請求項５０】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜８のいずれ
    か一項に記載のタンパク質またはその誘導体とを含むス
    クリーニング系に存在させ、そして （２）請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質
    またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性またはそ
    の活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、請求
    項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質またはその
    誘導体のプロテインキナーゼの活性またはその活性の亢
    進を阻害する物質のスクリーニング法。
51. 【請求項５１】スクリーニング系に存在させる活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質が、翻訳後修飾されたタンパク質であ
    る、請求項５０に記載のスクリーニング法。
52. 【請求項５２】プロテインキナーゼの活性または活性の
    亢進の阻害の程度を、ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ６
    ペプチド、αＰＫＣ、ビンキュリン、タリン、メタビン
    キュリン、カルデスモン、フィラミン、ビメンチン、α
    −アクチニン、ＭＡＰ−４、ミオシン軽鎖、ミオシン軽
    鎖フォスファターゼ、およびミオシン軽鎖フォスファタ
    ーゼのミオシン結合サブユニットからなる群から選択さ
    れる基質を用いて測定する、請求項４９〜５１のいずれ
    か一項に記載のスクリーニング法。
53. 【請求項５３】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載のス
    クリーニング法。
54. 【請求項５４】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載のタンパク
    質またはその誘導体を存在させることによってストレス
    ファイバーまたはフォーカル接着の形成が誘導された細
    胞系に存在させ、そして （２）前記細胞系のストレスファイバーまたはフォーカ
    ル接着の形成の阻害の程度を測定することを含む、スト
    レスファイバーまたはフォーカル接着の形成を阻害する
    物質のスクリーニング法。
55. 【請求項５５】腫瘍形成または転移抑制物質のスクリー
    ニング法である、請求項４６〜５４のいずれか一項に記
    載のスクリーニング法。
56. 【請求項５６】平滑筋収縮抑制物質のスクリーニング法
    である、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載のスク
    リーニング法。
57. 【請求項５７】血小板または白血球の凝集または活性化
    を抑制する物質のスクリーニング法である、請求項４６
    〜５４のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
58. 【請求項５８】配列番号３に記載されるアミノ酸配列か
    らなるペプチド。
59. 【請求項５９】請求項５８に記載されるペプチドに対す
    る、抗体。
60. 【請求項６０】ポリクローナル抗体である、請求項５９
    に記載の抗体。
61. 【請求項６１】請求項５９または６０に記載の抗体によ
    って認識される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の
    タンパク質またはその誘導体。
62. 【請求項６２】（１）検出の対象となる物質を請求項５
    ９または６０に記載の抗体を含む検出系に存在させ、そ
    して （２）検出の対象となる物質と請求項５９または６０に
    記載の抗体との反応の程度を測定することを含む、前記
    抗体と特異的に反応する物質の検出法。
63. 【請求項６３】請求項５９または６０に記載の抗体を含
    む、前記抗体によって認識される物質の検出キット。
64. 【請求項６４】請求項１〜８のいずれか一項に記載のタ
    ンパク質が関与する疾患の検出キットである、請求項６
    ３に記載の検出キット。