JP7353631B2 - プローブ、ミトコンドリアの状態判定用キット、ミトコンドリアの状態判定方法及びミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プローブ、ミトコンドリアの状態判定用キット、ミトコンドリアの状態判定方法及びミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法に関する。
人類の肥満化は解決されるべき喫緊の課題である。肥満化を抑制するために、蓄積したエネルギー、すなわち脂肪を熱へと放散させる褐色脂肪細胞及びベージュ細胞の機能を高めることが考えられる。褐色脂肪細胞による熱産生に重要な細胞小器官がミトコンドリアである。ミトコンドリアを活性化する薬剤があれば肥満化の抑制の他、ミトコンドリア病の治療が可能となる。
特許文献１には、カルノシン又はアンセリンを有効成分とする、ミトコンドリア活性化剤が開示されている。当該ミトコンドリア活性化剤によって、ミトコンドリアの生合成が促進される。
上記特許文献１に開示されたミトコンドリア活性化剤のようにミトコンドリアの量を増加させるのではなく、個々のミトコンドリアを活性化させる薬剤を探索するには、ミトコンドリアの活性化、特にミトコンドリアにおける熱産生及びエネルギー代謝の活性化を反映する指標が必要である。しかし、ミトコンドリアの制御機構はあまりよく理解されておらず、ミトコンドリアの活性化に関連する有望なマーカーは特定されていないのが現状である。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ミトコンドリアの活性化をモニターし、ミトコンドリアの状態を判定することができるプローブ、ミトコンドリアの状態判定用キット及びミトコンドリアの状態判定方法、並びにミトコンドリアの活性化に基づいて被験物質を評価できるミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者は、鋭意研究を重ね、小胞体（ＥＲ）に存在するセンサー分子であるＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅ（以下、「ＰＥＲＫ」ともいう）の所定のアミノ酸残基がミトコンドリアストレス依存的にリン酸化されること、さらにはこのリン酸化が褐色脂肪細胞の熱産生及びエネルギー代謝の活性化に必須であることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の第１の観点に係るプローブは、
ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を認識して、前記ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅに結合する。
ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を認識して、前記ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅに結合する。
上記本発明の第１の観点に係るプローブは、
抗体である、
こととしてもよい。
抗体である、
こととしてもよい。
本発明の第２の観点に係るミトコンドリアの状態判定用キットは、
上記本発明の第１の観点に係るプローブを備える。
上記本発明の第１の観点に係るプローブを備える。
本発明の第３の観点に係るミトコンドリアの状態判定方法は、
細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップを含む。
細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップを含む。
この場合、前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
本発明の第４の観点に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法は、
細胞を被験物質に暴露する暴露ステップと、
前記細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップと、
前記検出ステップの結果に基づいて前記被験物質を選択する選択ステップと、
を含む。
細胞を被験物質に暴露する暴露ステップと、
前記細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップと、
前記検出ステップの結果に基づいて前記被験物質を選択する選択ステップと、
を含む。
この場合、前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
褐色脂肪細胞である、
こととしてもよい。
本発明に係るプローブ、ミトコンドリアの状態判定用キット及びミトコンドリアの状態判定方法によれば、ミトコンドリアの活性化をモニターし、ミトコンドリアの状態を判定することができる。また、本発明に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法によれば、ミトコンドリアの活性化に基づいて被験物質を評価できる。
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。
（実施の形態１）
本実施の形態に係るプローブは、ＰＥＲＫのキナーゼインサートに含まれるリン酸化されたセリン残基を認識して、ＰＥＲＫに結合する。図１は全長１１１４残基からなるマウスＰＥＲＫの構造を示す。ＰＥＲＫは、ＥＲ内腔に配置されるＥＲ内腔領域、膜貫通領域及びキナーゼ領域を含む。キナーゼ領域にはキナーゼインサートが含まれる。上記セリン残基はキナーゼインサートにおける３個のセリン残基である。マウスＰＥＲＫのアミノ酸配列を配列番号１に示す。マウスＰＥＲＫの場合、上記の３個のセリン残基は、ＰＥＲＫのＮ末端側から７１５、７１７及び７１９番目のセリン残基である。
本実施の形態に係るプローブは、ＰＥＲＫのキナーゼインサートに含まれるリン酸化されたセリン残基を認識して、ＰＥＲＫに結合する。図１は全長１１１４残基からなるマウスＰＥＲＫの構造を示す。ＰＥＲＫは、ＥＲ内腔に配置されるＥＲ内腔領域、膜貫通領域及びキナーゼ領域を含む。キナーゼ領域にはキナーゼインサートが含まれる。上記セリン残基はキナーゼインサートにおける３個のセリン残基である。マウスＰＥＲＫのアミノ酸配列を配列番号１に示す。マウスＰＥＲＫの場合、上記の３個のセリン残基は、ＰＥＲＫのＮ末端側から７１５、７１７及び７１９番目のセリン残基である。
哺乳類のＰＥＲＫでは、上記セリン残基を含む部分のアミノ酸配列が高度に保存されている。例えば、マウスＰＥＲＫのＮ末端側から７１４番目から７２０番目までのアミノ酸配列、ヒトＰＥＲＫのＮ末端側から７１８番目から７２４番目までのアミノ酸配列、及びラットＰＥＲＫのＮ末端側から７１４番目から７２０番目までのアミノ酸配列は、いずれも“ＲＳＲＳＦＳＶ”（配列番号２）である。
プローブは、“ＲＳＲＳＦＳＶ”で示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を認識して、ＰＥＲＫに結合するものであれば限定されない。プローブとしては、上記のリン酸化されたセリン残基を認識してＰＥＲＫに結合する、抗体、アプタマー及び化合物等が挙げられる。アプタマーは、少なくともリン酸化された上記セリン残基を含むＰＥＲＫの部分配列（ペプチド）を標的としたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法及びＳＥＬＥＸ法等の公知の方法で取得できる。化合物は、結合アッセイ、例えば、アフィニティクロマトグラフィ、分光学的方法、ゲルろ過法及び表面プラズモン共鳴測定法等で選択することができる。
好ましくは、プローブは抗体である。抗体は上記ペプチドを抗原ペプチドとして公知の方法で作製できる。免疫の対象とする動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ及びニワトリ等である。好適には、上記ペプチドは上記のリン酸化された３個のセリン残基を含む。
抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の作製では、動物に抗原ペプチドを繰り返し注射し、所定期間経過後に回収した血液から抗体を精製すればよい。好ましくは、ポリクローナル抗体は、抗原ペプチドをアジュバントともに感作させたウサギ等の動物から採血し、抗原ペプチドによりａｆｆｉｎｉｔｙ精製した後、上記抗原ペプチドと同じアミノ酸配列で、かつセリン残基がリン酸化されていないペプチドを用いた吸収作業により得られる。
モノクローナル抗体の作製では、抗原ペプチドで免疫した動物の脾臓又はリンパ節からＢ細胞を採取し、細胞融合によってハイブリドーマを得る。抗原ペプチドに反応するハイブリドーマを選択し、クローン化すればよい。当該ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を産生することができる。
抗原ペプチドのアミノ酸残基数は特に限定されないが、例えばリン酸化された上記３個のセリンを含む１０～２０、１１～１５又は１２～１４個である。抗原ペプチドのアミノ酸配列は、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を包含するＰＳＰＥＲＳＲＳＦＳＶＧＩ（配列番号３）である。
下記試験例２及び下記実施例１に示すように、当該プローブは、褐色脂肪細胞の分化過程においてＥＲストレス非依存的にリン酸化された上記セリン残基を認識してＰＥＲＫに結合する。下記試験例２及び下記試験例４によれば、ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化は、褐色脂肪細胞のミトコンドリアにおける熱産生因子ＵＣＰ１の発現に必須である。また、ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化は、分化誘導した褐色脂肪細胞におけるミトコンドリアの発達に重要であり（下記試験例３参照）、かつ分化過程におけるミトコンドリアでの酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生に関与する（下記試験例５参照）。さらに下記試験例６によれば、上記セリン残基のリン酸化によって制御されるミトコンドリア発生が熱産生に必須である。よって、ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化は、ミトコンドリアにおける熱産生及びエネルギー代謝の活性化に関与する。
本実施の形態に係るプローブは、細胞における熱産生及びエネルギー代謝の活性化に関与するＰＥＲＫのリン酸化された上記セリン残基を認識してＰＥＲＫに結合するため、当該プローブを検出することで、ミトコンドリアの活性化をモニターすることができる。
当該プローブは、公知の方法で検出できる。例えば、プローブを検出するには、プローブを直接標識すればよい。プローブとしての抗体を直接標識する場合、抗体は、放射性同位体、蛍光色素又は発色反応で用いる酵素等で標識される。標識された抗体は、免疫反応によってＰＥＲＫのリン酸化された上記セリン残基に結合する。放射性同位体で標識した抗体を用いる場合、免疫反応後に放射性同位体の放射線を検出すればよい。蛍光色素で標識した抗体を用いる場合、免疫反応の後に蛍光色素に対する励起波長の光を当て、その蛍光を検出すればよい。発色反応で用いる酵素で標識した抗体を用いる場合、免疫反応後に当該酵素に対する発色基質を反応させ、生じた色によってＰＥＲＫを検出すればよい。
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１８Ｏ等が挙げられる。発色反応で用いる酵素は、公知の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼ等である。蛍光色素は、公知の任意のものが使用でき、例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル及びカルボシアニン誘導体等である。蛍光色素は、蛍光タンパク質でもよく、例えば緑色蛍光タンパク質及びその変異体等である。
プローブとして抗体を採用する場合、上記プローブとしての一次抗体と、当該一次抗体に特異的に結合する二次抗体とを用いる間接蛍光抗体法でプローブを検出してもよい。二次抗体は、例えば蛍光色素で標識される。一次抗体として、ヒト以外の動物、例えばヤギで作製した上記セリン残基がリン酸化されたＰＥＲＫに対するヤギ抗体を使用し、二次抗体として、蛍光色素で標識されたロバ抗ヤギ抗体を使用すればよい。なお、抗体の標識には、アビジン－ビオチンシステムを用いてもよい。
本実施の形態に係るプローブは、ミトコンドリアにおける熱産生及びエネルギー代謝の活性化に必要なリン酸化された上記セリン残基を介してＰＥＲＫに結合する。このため、当該プローブを用いて、ミトコンドリアの状態を判定することができる。そこで、他の実施の形態では、上記プローブを備える、ミトコンドリアの状態判定用キットが提供される。
ミトコンドリアの状態判定方法として、ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法について説明する。当該方法は、検出ステップを含む。検出ステップでは、細胞において、ＰＥＲＫの少なくとも１個のリン酸化された上記セリン残基を検出する。細胞は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びハムスター等の哺乳動物の各種細胞である。細胞としては、心筋細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、破骨細胞、実質細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア細胞、脾細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、肝細胞、及びこれらの前駆細胞が例示される。細胞は、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等であってもよい。また、細胞は、正常細胞の他、癌細胞等の細胞、又はＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＳｆ９細胞等の株化された細胞等であってもよい。
好ましくは、当該細胞は、分化誘導又は刺激によってＰＥＲＫの上記少なくとも１個のセリン残基がリン酸化された細胞である。例えば、当該細胞は、褐色脂肪組織から単離された未分化細胞を分化誘導した褐色脂肪細胞である。検出ステップの前に、分化誘導した褐色脂肪細胞を、ミトコンドリアストレスを付与するＣＣＣＰ（ｃａｒｂｏｎｙｌｃｙａｎｉｄｅ ｍ－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）に暴露して当該細胞に刺激を加えてもよい。また、検出ステップの前に、分化誘導した褐色脂肪細胞を、β３アドレナリン受容体アゴニスト、例えばＣＬ３１６，２４３で刺激してもよい。これにより、上記セリン残基のリン酸化が亢進される。
リン酸化された上記セリン残基は、上記プローブを用いて公知の方法で検出できる。例えば、ウエスタンブロット法等を用いて上記プローブとしての一次抗体を二次抗体で検出すればよい。この場合、当該ミトコンドリアの状態判定用キットは、二次抗体をさらに備えてもよい。蛍光標識を利用して細胞を顕微鏡下で観察してシグナルを検出してもよい。シグナルの検出には、近接ライゲーションアッセイ（Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：ＰＬＡ）を用いてもよい。
続いて、例えば、上記プローブを用いて検出されたシグナル又はバンドを公知の方法で定量する。ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化はミトコンドリアの活性化と相関するため、シグナル等の大きさに基づいて、ミトコンドリアの状態としてミトコンドリアの活性化の程度を判定できる。例えば、シグナルが大きい細胞は、小さい細胞と比較して、ミトコンドリアの活性化の程度が大きいと判定できる。また、本実施の形態に係るミトコンドリアの状態判定用キットによれば、刺激後のミトコンドリアの活性化の程度を評価することで、ミトコンドリアの状態として、刺激前の細胞についてミトコンドリアの活性化のポテンシャルを判定できる。
なお、ミトコンドリアの状態判定用キットは、未分化細胞を分化誘導するための試薬に加え、緩衝液、希釈液及びその他試薬を備えてもよい。なお、ＣＣＣＰで刺激を加える細胞は、分化誘導した褐色脂肪細胞に限らず、ＣＣＣＰの刺激によってＰＥＲＫの上記少なくとも１個のセリン残基がリン酸化される細胞であれば任意の細胞を用いることができる。
また、ミトコンドリアの状態を判定することは、細胞の状態を判定することになるため、ミトコンドリアの状態判定用キットは、細胞の状態判定用キットとしても利用することができる。また、上述のミトコンドリアの状態判定方法を、例えば、ｉＰＳ細胞又は心筋細胞シートを構成する心筋細胞等に適用することで、ｉＰＳ細胞又は心筋細胞シートの細胞の品質を評価することもできる。当該用途はｉＰＳ細胞又は心筋細胞シートの品質管理に有用である。
なお、上記ミトコンドリアの状態判定方法を、ヒトから採取した褐色細胞に適用することで、褐色脂肪細胞による熱産生の程度を評価することもできる。また、上記ミトコンドリアの状態判定方法を、ヒトから採取した任意の細胞に適用することで、ミトコンドリア病の易罹患性の予測又は診断も可能である。
（実施の形態２）
続いて、実施の形態２について説明する。本実施の形態に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法は、暴露ステップと、検出ステップと、選択ステップとを含む。暴露ステップでは、細胞を被験物質に暴露する。例えば、暴露ステップでは、細胞の培地に被験物質を添加すればよい。暴露ステップで用いる細胞は、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における細胞と同様である。被験物質に暴露する前に、細胞にＣＣＣＰ又はβ３アドレナリン受容体アゴニスト等で刺激を与えてもよい。被験物質は、特に限定されず、化合物、ペプチド及び核酸等、任意の物質である。検出ステップは、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における検出ステップと同様である。
続いて、実施の形態２について説明する。本実施の形態に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法は、暴露ステップと、検出ステップと、選択ステップとを含む。暴露ステップでは、細胞を被験物質に暴露する。例えば、暴露ステップでは、細胞の培地に被験物質を添加すればよい。暴露ステップで用いる細胞は、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における細胞と同様である。被験物質に暴露する前に、細胞にＣＣＣＰ又はβ３アドレナリン受容体アゴニスト等で刺激を与えてもよい。被験物質は、特に限定されず、化合物、ペプチド及び核酸等、任意の物質である。検出ステップは、上記ミトコンドリアの状態判定用キットの使用方法における検出ステップと同様である。
選択ステップでは、検出ステップの結果に基づいて被験物質を選択する。上記プローブを用いて検出されたシグナルの大きさに基づいて、ミトコンドリアの機能を改善、特には熱産生及びエネルギー代謝を活性化させる被験物質を選択できる。例えば、被験物質に暴露しなかった細胞と被験物質に暴露した細胞との間でシグナルの大きさを比較してもよい。この場合、被験物質に暴露しなかった細胞のシグナルを超えるシグナルが検出された被験物質をミトコンドリアの機能改善剤として選択すればよい。
また、選択ステップでは、ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化を亢進させることが既知であるβ３アドレナリン受容体アゴニスト等を陽性対照に用い、陽性対照と被験物質との間でシグナルの大きさを比較してもよい。この場合、陽性対照のシグナルと同等以上のシグナルが検出された被験物質をミトコンドリア機能改善剤として選択すればよい。
本実施の形態に係るミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法によれば、ＰＥＲＫの上記セリン残基のリン酸化の程度に基づいて被験物質を選択する。上記セリン残基のリン酸化の程度は、熱産生及びエネルギー代謝の活性化の指標となるため、ミトコンドリアの活性化に基づいて被験物質を評価できる。
なお、選択ステップでは、あらかじめ基準として設定された基準値とシグナルの大きさを比較してもよい。また、シグナルの大きさは、β－アクチン等のシグナルで補正して比較してもよい。
なお、本実施の形態に係るミトコンドリア機能改善剤は、ミトコンドリア活性化剤、抗肥満薬、ミトコンドリア病肥満薬としても用いることができる。
以下の試験例及び実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は試験例及び実施例によって限定されるものではない。
（試験例１：褐色脂肪細胞の分化誘導に伴うミトコンドリアとＥＲの近接）
ＩＣＲマウスの新生仔の褐色脂肪組織から未分化細胞を単離し、８日間培養後（ｄａｙ ０）に分化誘導培地に培地交換し、分化誘導した。分化誘導培地の組成は、２０％ＦＢＳ、２０ｎＭインシュリン、１ｎＭトリヨードサイロニン（Ｔ３）、５μＭデキサメタゾン、０．１２５ｍＭインドメタシン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ及び１μＭロシグリタゾンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）とした。分化誘導から２日後及び４日後に分化増強培地に培地交換し、細胞を維持した。分化増強培地の組成は、２０％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２０ｎＭインシュリン、１ｎＭ Ｔ３を含むＤＭＥＭとした。分化誘導６日目の細胞を成熟褐色脂肪細胞（ｄａｙ ６）とした。
ＩＣＲマウスの新生仔の褐色脂肪組織から未分化細胞を単離し、８日間培養後（ｄａｙ ０）に分化誘導培地に培地交換し、分化誘導した。分化誘導培地の組成は、２０％ＦＢＳ、２０ｎＭインシュリン、１ｎＭトリヨードサイロニン（Ｔ３）、５μＭデキサメタゾン、０．１２５ｍＭインドメタシン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ及び１μＭロシグリタゾンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）とした。分化誘導から２日後及び４日後に分化増強培地に培地交換し、細胞を維持した。分化増強培地の組成は、２０％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２０ｎＭインシュリン、１ｎＭ Ｔ３を含むＤＭＥＭとした。分化誘導６日目の細胞を成熟褐色脂肪細胞（ｄａｙ ６）とした。
ｄａｙ ０の細胞及びｄａｙ ６の細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液（パラフォルムアルデヒド及びグルタールアルデヒドの混合液）で固定した。細胞をエタノールで脱水処理後に酢酸ウラニル染色し、電子顕微鏡観察を行った。画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて、電子顕微鏡観察像においてミトコンドリアとＥＲとの間が３０ｎｍ以内で近接している領域（ミトコンドリア－ＥＲ近接領域）の長さを算出した。
（結果）
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、それぞれｄａｙ ０の細胞及びｄａｙ ６の細胞の電子顕微鏡画像を示す。観察像中の点線はミトコンドリア－ＥＲ近接領域である。図２（Ｃ）は、２６枚の観察像におけるミトコンドリア－ＥＲ近接領域の長さの平均値を示す。分化誘導に伴ってミトコンドリア－ＥＲ近接領域の長さが有意に長くなる、すなわちミトコンドリアとＥＲとが近接することが示された（ｔ検定、ｎ＝３）。
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）は、それぞれｄａｙ ０の細胞及びｄａｙ ６の細胞の電子顕微鏡画像を示す。観察像中の点線はミトコンドリア－ＥＲ近接領域である。図２（Ｃ）は、２６枚の観察像におけるミトコンドリア－ＥＲ近接領域の長さの平均値を示す。分化誘導に伴ってミトコンドリア－ＥＲ近接領域の長さが有意に長くなる、すなわちミトコンドリアとＥＲとが近接することが示された（ｔ検定、ｎ＝３）。
（試験例２：分化過程におけるＥＲストレス非依存的なＰＥＲＫリン酸化）
未分化細胞（ｄａｙ －２）を２４ウェルプレートに０．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２日後（ｄａｙ ０）に分化誘導培地に培地交換することで分化誘導し、４日後（ｄａｙ ２）及び６日後（ｄａｙ ４）に分化増強培地に培地交換した。分化誘導２日目（ｄａｙ ２）の分化増強培地への培地交換前及び培地交換してから６時間後及び１２時間後に細胞を回収した。
未分化細胞（ｄａｙ －２）を２４ウェルプレートに０．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２日後（ｄａｙ ０）に分化誘導培地に培地交換することで分化誘導し、４日後（ｄａｙ ２）及び６日後（ｄａｙ ４）に分化増強培地に培地交換した。分化誘導２日目（ｄａｙ ２）の分化増強培地への培地交換前及び培地交換してから６時間後及び１２時間後に細胞を回収した。
一方、細胞へＰＥＲＫを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＥＲＫ）をｄａｙ －２に導入した。詳細には、ｓｉＰＥＲＫとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＭＳＳ２０３８１９（配列番号４）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞へ導入した。
細胞に導入する下記遺伝子をｐＭＸｓ－ＩＰプラスミドに組み込んだ。ＰＥＩ－Ｍａｘを用いて、エコトロピックエンベロープでパッケージングしたレトロウイルス（Ｐｌａｔｉｎｕｍ－ＧＰ）に当該プラスミドを導入した。ｓｉＰＥＲＫを細胞に導入した２４時間後（ｄａｙ －１）に、レトロウイルスを含む培養液と７．５μｇ／ｍＬ（終濃度）のポリブレンとを細胞の培地に添加して、２４時間後に培地を交換した。
レトロウイルスの感染によって細胞に導入した遺伝子は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されたキナーゼ不活性型のＰＥＲＫ（ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡ）をコードする遺伝子である。図３は、哺乳類のＰＥＲＫ及びＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡの構造を示す。ＰＥＲＫはキナーゼ領域のＡＴＰ結合領域にＡＴＰが結合することで自己リン酸化される。このため、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡでは、Ｎ末端から６１８番目である、ＡＴＰ結合領域のリジン（Ｋ６１８）をアラニンに置換して自己リン酸化が生じないようにした。ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡは、ＥＲ内腔領域における、ＰＥＲＫのＮ末端から数えて２９番目から５０２番目までのアミノ酸配列で構成される部分を欠失している。当該部分を欠くことで、ＰＥＲＫはＥＲストレスへの反応が抑制される。
ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞を、ｄａｙ ０及び分化誘導２日目（ｄａｙ ２）に回収した。１ウェル当たり２００μＬの溶解バッファーを添加後、４℃にて３０分間細胞を溶解し、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上清１５０μＬを回収した。溶解バッファーの組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１％デオキシコール酸ナトリウム及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とした。
細胞溶解液に１５０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファー（２０ｍＭのジチオスレイトールを含む）を加えて９８℃で５分間ボイルし、ウエスタンブロッティング解析へと供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後、ゲルから２フッ化ポリビニリデンメンブレン（０．４５μｍ、Ｐａｌｌ社製）にタンパク質を転写し、１％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で室温にて１時間ブロッキングした後、５％ウシ血清アルブミンと０．１％ＮａＮ３を含むＴＢＳ－Ｔで希釈した各一次抗体で４℃にて一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄後、１％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔで希釈した二次抗体で室温にて１時間反応させ、ＴＢＳ－Ｔで３０分間洗浄した。高感度ケミルミネッセンス法にてバンドを検出した。
（結果）
図４は、ｄａｙ ２の分化増強培地への培地交換前（０ｈｒ）及び培地交換してから６時間後（６ｈｒ）及び１２時間後（１２ｈｒ）の細胞におけるＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＧＲＰ７８のバンドを示す。ＰＥＲＫでは高分子量側にシフトしたバンドが見られた。これにより、分化過程においてＰＥＲＫがリン酸化されていることが示された。ＥＲには３つのセンサータンパク質（ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６）があり、いずれもＥＲ膜貫通型である。ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６の下流で発現誘導されるＧＲＰ７８に関してはバンドに変化が見られなかった。このことから、分化過程におけるリン酸化は、ＰＥＲＫに特異的であることが示唆された。
図４は、ｄａｙ ２の分化増強培地への培地交換前（０ｈｒ）及び培地交換してから６時間後（６ｈｒ）及び１２時間後（１２ｈｒ）の細胞におけるＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＧＲＰ７８のバンドを示す。ＰＥＲＫでは高分子量側にシフトしたバンドが見られた。これにより、分化過程においてＰＥＲＫがリン酸化されていることが示された。ＥＲには３つのセンサータンパク質（ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６）があり、いずれもＥＲ膜貫通型である。ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６の下流で発現誘導されるＧＲＰ７８に関してはバンドに変化が見られなかった。このことから、分化過程におけるリン酸化は、ＰＥＲＫに特異的であることが示唆された。
図５は、ｓｉＰＥＲＫでＰＥＲＫをノックダウンした細胞にＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞のｄａｙ ０及びｄａｙ ２におけるＰＥＲＫのバンドを示す。分化過程においてＰＥＲＫのリン酸化を示すバンドのシフトが確認された。既知のＰＥＲＫ経路は、ＰＥＲＫがＥＲ内腔領域でＥＲストレスを感知してリン酸化され、ｅＩＦ２αのリン酸化を介して翻訳を抑制する。ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡはＰＥＲＫのＥＲ内腔領域を欠失しており、キナーゼ不活性型である。このため、図５の結果は、図４に示された分化過程におけるＰＥＲＫのリン酸化がＥＲストレス非依存的であることを示している。ＰＥＲＫは、分化過程において未知の機能を担うことが示唆された。
（試験例３：ＰＥＲＫの発現抑制によるミトコンドリア形態異常）
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にコントロールとしての標的のないｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（商標） Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下「ｓｉｃｔｒｌ」ともいう）又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（配列番号５））を導入後、分化誘導し、ｄａｙ ６まで培養した。試験例１と同様に、細胞を固定、染色し、電子顕微鏡で観察した。平行で密度の大きいクリステの構造を有するミトコンドリアを発達したミトコンドリアとして、計数した。
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にコントロールとしての標的のないｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（商標） Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下「ｓｉｃｔｒｌ」ともいう）又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（配列番号５））を導入後、分化誘導し、ｄａｙ ６まで培養した。試験例１と同様に、細胞を固定、染色し、電子顕微鏡で観察した。平行で密度の大きいクリステの構造を有するミトコンドリアを発達したミトコンドリアとして、計数した。
（結果）
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれｓｉｃｔｒｌ及びｓｉＰＥＲＫを導入した細胞の電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは２μｍを示す。図６（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ図５（Ａ）及び（Ｂ）の白枠で囲った部分の拡大像を示す。図６（Ｅ）は、細胞あたりの発達したミトコンドリアの割合を示す。当該割合は、５０細胞の平均値である。ＰＥＲＫの発現を抑制すると、正常なミトコンドリアで見られる平行で密度の大きいクリステの割合が減少し、異常な形態のクリステの割合が増加した。分化誘導した細胞におけるミトコンドリアの発達にはＰＥＲＫが重要であることが示された。
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれｓｉｃｔｒｌ及びｓｉＰＥＲＫを導入した細胞の電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは２μｍを示す。図６（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ図５（Ａ）及び（Ｂ）の白枠で囲った部分の拡大像を示す。図６（Ｅ）は、細胞あたりの発達したミトコンドリアの割合を示す。当該割合は、５０細胞の平均値である。ＰＥＲＫの発現を抑制すると、正常なミトコンドリアで見られる平行で密度の大きいクリステの割合が減少し、異常な形態のクリステの割合が増加した。分化誘導した細胞におけるミトコンドリアの発達にはＰＥＲＫが重要であることが示された。
（試験例４：ＰＥＲＫを介したミトコンドリア関連タンパク質の発現）
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１）を導入後、分化誘導し、０、２、４、６日目に細胞を回収した。試験例２と同様の方法で、ミトコンドリア、熱産生関連タンパク質及びＥＲストレス関連タンパク質についてウエスタンブロッティング解析を行った。
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１）を導入後、分化誘導し、０、２、４、６日目に細胞を回収した。試験例２と同様の方法で、ミトコンドリア、熱産生関連タンパク質及びＥＲストレス関連タンパク質についてウエスタンブロッティング解析を行った。
（結果）
図７に示すように、分化過程におけるＰＥＲＫの発現抑制によって、主にミトコンドリア内膜を構成するタンパク質及び熱産生に関連するＵＣＰ１の発現が低下した。
図７に示すように、分化過程におけるＰＥＲＫの発現抑制によって、主にミトコンドリア内膜を構成するタンパク質及び熱産生に関連するＵＣＰ１の発現が低下した。
（試験例５：ＰＥＲＫを介した酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生）
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１）を導入後、分化誘導し、０、２、４、６日目に細胞を回収した。回収した細胞を、１μｇ／ｍＬオリゴマイシン Ａで４５分間処理又は無処理後、ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＡＴＰ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）を加え、回収した。細胞懸濁液を９８℃で３分間ボイルし、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心後に上清を回収した。上清中のＡＴＰは、ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて測定した。オリゴマイシン Ａで処理しなかった無処理群の細胞内のＡＴＰ量を細胞内の総ＡＴＰ量とし、処理群を解糖系依存的なＡＴＰ産生量とした。ミトコンドリアでの酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量は、細胞内の総ＡＴＰ量と解糖系依存的なＡＴＰ産生量の測定値とから算出した。
試験例２と同様にｄａｙ －２において未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８２１）を導入後、分化誘導し、０、２、４、６日目に細胞を回収した。回収した細胞を、１μｇ／ｍＬオリゴマイシン Ａで４５分間処理又は無処理後、ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＡＴＰ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、４ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）を加え、回収した。細胞懸濁液を９８℃で３分間ボイルし、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心後に上清を回収した。上清中のＡＴＰは、ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて測定した。オリゴマイシン Ａで処理しなかった無処理群の細胞内のＡＴＰ量を細胞内の総ＡＴＰ量とし、処理群を解糖系依存的なＡＴＰ産生量とした。ミトコンドリアでの酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量は、細胞内の総ＡＴＰ量と解糖系依存的なＡＴＰ産生量の測定値とから算出した。
（結果）
図８に示すように、ｓｉｃｔｒｌを導入した細胞では、分化誘導に伴って酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量の割合が増加した。一方、ＰＥＲＫの発現を抑制することで、酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量の割合が増加しなかった。このことから、ＰＥＲＫが分化過程におけるミトコンドリアでの酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生に関与することが示された。
図８に示すように、ｓｉｃｔｒｌを導入した細胞では、分化誘導に伴って酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量の割合が増加した。一方、ＰＥＲＫの発現を抑制することで、酸化的リン酸化依存的なＡＴＰ産生量の割合が増加しなかった。このことから、ＰＥＲＫが分化過程におけるミトコンドリアでの酸化的リン酸化によるＡＴＰ産生に関与することが示された。
（実施例１：ミトコンドリアストレス特異的に反応するＰＥＲＫリン酸化抗体の作製）
試験例２で示されたＥＲストレス非依存的にリン酸化されるセリン残基の予想部位は、図１に示すキナーゼインサート内の３個のセリン残基である（Ｎ末端側から７１５、７１７及び７１９番目）。そこで、リン酸化された７１５、７１７及び７１９番目のセリン残基を含む１３個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号３）を抗原として抗体（ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体）を作製した。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体の作製では、ウサギに上記ペプチドをアジュバントとともに４回皮内注射することで感作させ、９週後に全採血し、上記ペプチドによりａｆｆｉｎｉｔｙ精製した後、上記ペプチドと同じアミノ酸配列で、かつ３個のセリン残基がリン酸化されていないペプチドにより吸収作業を行った。
試験例２で示されたＥＲストレス非依存的にリン酸化されるセリン残基の予想部位は、図１に示すキナーゼインサート内の３個のセリン残基である（Ｎ末端側から７１５、７１７及び７１９番目）。そこで、リン酸化された７１５、７１７及び７１９番目のセリン残基を含む１３個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号３）を抗原として抗体（ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体）を作製した。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体の作製では、ウサギに上記ペプチドをアジュバントとともに４回皮内注射することで感作させ、９週後に全採血し、上記ペプチドによりａｆｆｉｎｉｔｙ精製した後、上記ペプチドと同じアミノ酸配列で、かつ３個のセリン残基がリン酸化されていないペプチドにより吸収作業を行った。
ｄａｙ －２の未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を導入し、ｄａｙ －１においてレトロウイルスを用いて、Ｖｅｎｕｓ－ＦＬＡＧ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させ、分化誘導を行った。分化誘導３日目の細胞を、１０μＭ ＣＣＣＰで刺激前と刺激後に回収し、試験例２と同様の方法で、ウエスタンブロッティング解析へと供した。
（結果）
図９はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＰＥＲＫは、ＣＣＣＰによるミトコンドリアストレスによってリン酸化され、当該リン酸化を示すバンドをｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体で検出できた。ｓｉＰＥＲＫでＰＥＲＫをノックダウンした細胞にＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞でもｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体でバンドを検出できた。これにより、ミトコンドリアストレスによるＥＲストレス非依存的なＰＥＲＫのリン酸化をｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体で検出できることが示された。
図９はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＰＥＲＫは、ＣＣＣＰによるミトコンドリアストレスによってリン酸化され、当該リン酸化を示すバンドをｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体で検出できた。ｓｉＰＥＲＫでＰＥＲＫをノックダウンした細胞にＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞でもｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体でバンドを検出できた。これにより、ミトコンドリアストレスによるＥＲストレス非依存的なＰＥＲＫのリン酸化をｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体で検出できることが示された。
（実施例２：分化過程において誘導されるＰＥＲＫのリン酸化の解析）
ｄａｙ －２の未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を導入し、２４時間後（ｄａｙ －１）にレトロウイルスを用いて、Ｖｅｎｕｓ－ＦＬＡＧ、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。分化誘導２日目に分化増強培地に培地交換し、１２時間後に細胞を回収した。回収した細胞を試験例２と同様の方法で、ウエスタンブロッティング解析へと供した。
ｄａｙ －２の未分化細胞にｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を導入し、２４時間後（ｄａｙ －１）にレトロウイルスを用いて、Ｖｅｎｕｓ－ＦＬＡＧ、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。分化誘導２日目に分化増強培地に培地交換し、１２時間後に細胞を回収した。回収した細胞を試験例２と同様の方法で、ウエスタンブロッティング解析へと供した。
ＰＥＲＫ－ΔＬＤは、ＥＲ内腔領域における、ＰＥＲＫのＮ末端から数えて２９番目から５０２番目までのアミノ酸配列で構成される部分を欠失している。なお、ＰＥＲＫ－ΔＬＤのＣ末端にもＦＬＡＧタグが付加されている。
ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡは、ＰＥＲＫ－ΔＬＤと同様に、ＥＲ内腔領域における、ＰＥＲＫのＮ末端から数えて２９番目から５０２番目までのアミノ酸配列で構成される部分を欠失している。さらに、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡでは、上記３個のセリン残基がアラニン残基に置換されている。なお、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡのＣ末端にもＦＬＡＧタグが付加されている。
（結果）
図１０はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＥＲ内腔領域の欠失によって、ＰＥＲＫのリン酸化は影響を受けなかった（“ＰＥＲＫ”参照）。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、褐色脂肪細胞の分化における３個のセリン残基の少なくとも１つのリン酸化がＰＥＲＫ及びＰＥＲＫ－ΔＬＤで検出できたが、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡでは、検出されなかった。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、褐色脂肪細胞の分化においてＰＥＲＫのキナーゼインサート内が生理的にリン酸化されることが示された。
図１０はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＥＲ内腔領域の欠失によって、ＰＥＲＫのリン酸化は影響を受けなかった（“ＰＥＲＫ”参照）。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、褐色脂肪細胞の分化における３個のセリン残基の少なくとも１つのリン酸化がＰＥＲＫ及びＰＥＲＫ－ΔＬＤで検出できたが、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡでは、検出されなかった。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、褐色脂肪細胞の分化においてＰＥＲＫのキナーゼインサート内が生理的にリン酸化されることが示された。
（実施例３：β３アドレナリン受容体刺激により誘導されるＰＥＲＫのリン酸化の解析）
ｄａｙ －２の未分化細胞にｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を導入し、ｄａｙ －１においてＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。
ｄａｙ －２の未分化細胞にｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を導入し、ｄａｙ －１においてＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。
分化誘導６日目の細胞を、５０ｎＭ ＣＬ３１６，２４３での刺激前又は刺激後６０分で回収した。１ウェル当たり５５０μＬの溶解バッファーを添加後、４℃にて３０分間細胞を溶解し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清５００μＬを回収した。細胞溶解液に２０μＬの抗ＦＬＡＧ Ｍ２ アフィニティーゲルを添加し、４℃にて３０分間反応させた。上清を除去後、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８．０、５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で２回洗浄し、５０μＬの２×ＳＤＳ サンプルバッファー（２０ｍＭのジチオスレイトールを含む）を加えて９８℃で５分間ボイルし、ウエスタンブロッティング解析へと供した。
（結果）
図１１はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞では、ＣＬ３１６，２４３による刺激によって３個のセリン残基のリン酸化が誘導された。一方、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させた細胞では、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体でバンドが検出されないことを確認した。これにより、β３アドレナリン受容体の刺激によって、ＥＲストレス非依存的にＰＥＲＫがリン酸化されることが示された。
図１１はウエスタンブロッティング解析の結果を示す。ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡを発現させた細胞では、ＣＬ３１６，２４３による刺激によって３個のセリン残基のリン酸化が誘導された。一方、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させた細胞では、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体でバンドが検出されないことを確認した。これにより、β３アドレナリン受容体の刺激によって、ＥＲストレス非依存的にＰＥＲＫがリン酸化されることが示された。
（実施例４：ＰＬＡによるミトコンドリアストレス依存的ＰＥＲＫリン酸化の検出）
６ウェルプレートに１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭで維持したＨｅＬａ細胞を２．０×１０５細胞／ウェルで播種し１２～１６時間後に、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡをコードする遺伝子を０．５μｇ／ウェルで導入した。遺伝子導入から２４時間後に、コラーゲンコートしたカバーガラスを１枚入れた２４ウェルプレートに細胞を０．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間後にグルコースフリー培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭガラクトースを含んだグルコース不含ＤＭＥＭ）に培地交換した。培地交換から２４時間後、細胞を１０μＭ ＣＣＣＰで１時間刺激し、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドにて固定した。
６ウェルプレートに１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭで維持したＨｅＬａ細胞を２．０×１０５細胞／ウェルで播種し１２～１６時間後に、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－ＫＡをコードする遺伝子を０．５μｇ／ウェルで導入した。遺伝子導入から２４時間後に、コラーゲンコートしたカバーガラスを１枚入れた２４ウェルプレートに細胞を０．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間後にグルコースフリー培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭガラクトースを含んだグルコース不含ＤＭＥＭ）に培地交換した。培地交換から２４時間後、細胞を１０μＭ ＣＣＣＰで１時間刺激し、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドにて固定した。
固定後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１００μｇ／ｍＬジギトニンで５分間の細胞膜透過処理を行った。ＰＢＳで５回洗浄後、１％ＢＳＡ溶液でブロッキングし、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体と抗ＦＬＡＧ抗体で１次抗体反応を行った。２次抗体反応は、Ｄｕｏｌｉｎｋ（商標） Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ（商標） ｐｒｏｂｅ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＰＬＵＳとＤｕｏｌｉｎｋ（商標） Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ（商標） ｐｒｏｂｅ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ Ｍｉｎｕｓとを用いた（いずれもシグマアルドリッチ社製）。２次反応後、Ｄｕｏｌｉｎｋ（商標） ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒｅｅｎ（シグマアルドリッチ社製）で細胞を処理し、共焦点レーザー顕微鏡解析を行った。核はＤＡＰＩ染色で可視化した。
（結果）
図１２（Ａ）はＣＣＣＰで刺激しなかった細胞の顕微鏡画像を示す。ＣＣＣＰによる刺激がない場合、ＰＬＡシグナルは検出されなかった。図１２（Ｂ）はＣＣＣＰで刺激した細胞の顕微鏡画像を示す。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、ＣＣＣＰ刺激によるＥＲストレス非依存的なＰＥＲＫのリン酸化を検出することができた。
図１２（Ａ）はＣＣＣＰで刺激しなかった細胞の顕微鏡画像を示す。ＣＣＣＰによる刺激がない場合、ＰＬＡシグナルは検出されなかった。図１２（Ｂ）はＣＣＣＰで刺激した細胞の顕微鏡画像を示す。ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によって、ＣＣＣＰ刺激によるＥＲストレス非依存的なＰＥＲＫのリン酸化を検出することができた。
（実施例５：ミトコンドリア機能改善剤アッセイ系の構築）
ドットブロット法でＰＥＲＫ３Ｓのリン酸化誘導因子、すなわちミトコンドリア機能改善剤を同定するためのアッセイ系を構築した。３５ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで維持したＰＥＲＫ－ＦＬＡＧ－ノックインＨＥＫ２９３細胞を１×１０６細胞播種した。ＰＥＲＫ－ＦＬＡＧ－ノックインＨＥＫ２９３細胞における細胞内因性ＰＥＲＫのＣ末端には、３×ＦＬＡＧタグが付加されている。３×ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列及び３×ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号７に示す。
ドットブロット法でＰＥＲＫ３Ｓのリン酸化誘導因子、すなわちミトコンドリア機能改善剤を同定するためのアッセイ系を構築した。３５ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで維持したＰＥＲＫ－ＦＬＡＧ－ノックインＨＥＫ２９３細胞を１×１０６細胞播種した。ＰＥＲＫ－ＦＬＡＧ－ノックインＨＥＫ２９３細胞における細胞内因性ＰＥＲＫのＣ末端には、３×ＦＬＡＧタグが付加されている。３×ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列及び３×ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号７に示す。
播種してから１２～１６時間後に、グルコースフリー培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭガラクトースを含むＤＭＥＭ）に培地交換した。培地交換から１６時間後、細胞を１０μＭ ＣＣＣＰで３０分間刺激した。上記試験例２と同様に細胞を溶解バッファーで溶解し、抗Ｆｌａｇ抗体（ＤＤＤＤＫ－タグ抗体、ＭＢＬライフサイエンス社製）にて免疫沈降し、上記試験例２と同様に２×ＳＤＳサンプルバッファーにて溶出した。溶出液の１／１０量をニトロセルロースメンブレンにスポットし、上記試験例２と同様に、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体とＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体を用いた免疫反応によってスポットを検出した。
（結果）
図１３に示すように、無刺激の細胞（レーン１）又はグルコース不含培地に順化させた細胞（レーン２）ではｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によるシグナルが検出されなかった。一方、ＣＣＣＰで刺激した細胞（レーン３）では、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体による明確なシグナルが検出された。ＣＣＣＰの代わりに被験物質を作用させてｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体のシグナルを検出することで、当該被験物質をＰＥＲＫ３Ｓのリン酸化誘導因子又はミトコンドリア機能改善剤として同定できる。
図１３に示すように、無刺激の細胞（レーン１）又はグルコース不含培地に順化させた細胞（レーン２）ではｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体によるシグナルが検出されなかった。一方、ＣＣＣＰで刺激した細胞（レーン３）では、ｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体による明確なシグナルが検出された。ＣＣＣＰの代わりに被験物質を作用させてｐＰＥＲＫ（３Ｓ）抗体のシグナルを検出することで、当該被験物質をＰＥＲＫ３Ｓのリン酸化誘導因子又はミトコンドリア機能改善剤として同定できる。
（試験例６：ＰＥＲＫを介した熱産生の制御）
β３アドレナリン受容体刺激時の熱産生におけるＰＥＲＫの機能を解析した。ｄａｙ －２において、ｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を未分化細胞に導入した。２４時間後のｓｉＰＥＲＫ細胞にレトロウイルスを用いて、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。ｄａｙ ５まで培養し、ガラスボトムディッシュに細胞を播種した。２４時間後（ｄａｙ ６）、細胞をＰＢＳで１回、０．５％グルコース溶液で１回洗浄し、温度センサープローブ溶液（０．０４％Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（フナコシ社製）、５％グルコース）を１０分間遮光しながら室温に静置することでプローブを細胞に取り込ませた。
β３アドレナリン受容体刺激時の熱産生におけるＰＥＲＫの機能を解析した。ｄａｙ －２において、ｓｉｃｔｒｌ又はｓｉＰＥＲＫ（ＭＳＳ２０３８１９）を未分化細胞に導入した。２４時間後のｓｉＰＥＲＫ細胞にレトロウイルスを用いて、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ又はＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡを発現させ、分化誘導を行った。ｄａｙ ５まで培養し、ガラスボトムディッシュに細胞を播種した。２４時間後（ｄａｙ ６）、細胞をＰＢＳで１回、０．５％グルコース溶液で１回洗浄し、温度センサープローブ溶液（０．０４％Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（フナコシ社製）、５％グルコース）を１０分間遮光しながら室温に静置することでプローブを細胞に取り込ませた。
細胞を０．５μＭ ＣＬ３１６，２４３で刺激後、１０分毎に共焦点レーザー顕微鏡（ＴＳＣ－ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ社製）で撮影し、蛍光像を取得した。画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて蛍光像から蛍光強度を測定し、細胞内の温度変化を算出した（ｓｉｃｔｒｌが２０細胞、ｓｉＰＥＲＫが１９細胞、ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤが２１細胞、ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡが１８細胞）。検定処理では反復測定分析を行った。
（結果）
図１４は、各細胞の蛍光強度を示す。ｓｉｃｔｒｌで確認されたＣＬ３１６，２４３刺激による細胞内温度の上昇がＰＥＲＫの発現を抑制することで抑制された（ｓｉＰＥＲＫ）。ＰＥＲＫの発現抑制によって上昇が抑制された細胞内温度は、外因性のＰＥＲＫ－ΔＬＤの発現で上昇したが（ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤ）、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡではほとんど上昇しなかった（ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡ）。本試験例の結果及び試験例４の結果によって、ＰＥＲＫのキナーゼインサート内の３個のセリン残基のリン酸化によって制御されるミトコンドリア発生が熱産生に必須であることが示された。
図１４は、各細胞の蛍光強度を示す。ｓｉｃｔｒｌで確認されたＣＬ３１６，２４３刺激による細胞内温度の上昇がＰＥＲＫの発現を抑制することで抑制された（ｓｉＰＥＲＫ）。ＰＥＲＫの発現抑制によって上昇が抑制された細胞内温度は、外因性のＰＥＲＫ－ΔＬＤの発現で上昇したが（ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤ）、ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡではほとんど上昇しなかった（ｓｉＰＥＲＫ＋ＰＥＲＫ－ΔＬＤ－３ＳＡ）。本試験例の結果及び試験例４の結果によって、ＰＥＲＫのキナーゼインサート内の３個のセリン残基のリン酸化によって制御されるミトコンドリア発生が熱産生に必須であることが示された。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が本発明の範囲内とみなされる。
本発明は、細胞の状態判定、品質管理、及び薬剤のスクリーニング方法に好適である。
Claims (7)
- ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を認識して、前記ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅに結合する、
プローブ。 - 抗体である、
請求項１に記載のプローブ。 - 請求項１又は２に記載のプローブを備える、
ミトコンドリアの状態判定用キット。 - 細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップを含む、
ミトコンドリアの状態判定方法。 - 前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
請求項４に記載のミトコンドリアの状態判定方法。 - 細胞を被験物質に暴露する暴露ステップと、
前記細胞において、ＰＫＲ－ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅのキナーゼインサートのＮ末端側からＣ末端側に向かってＲＳＲＳＦＳＶで示されるアミノ酸配列における少なくとも１個のリン酸化されたセリン残基を検出する検出ステップと、
前記検出ステップの結果に基づいて前記被験物質を選択する選択ステップと、
を含む、ミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法。 - 前記細胞は、
褐色脂肪細胞である、
請求項６に記載のミトコンドリア機能改善剤のスクリーニング方法。
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|---|
| 加藤裕紀、西頭英起，褐色脂肪細胞のミトコンドリア機能制御における小胞体センサーＰＥＲＫの新規役割，第９０回日本生化学会大会プログラム，日本，2017年，pp.1050-1051 |
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