CN119487179A

CN119487179A - 培养细胞片及其制造方法、化合物或药物的评价方法、以及培养细胞片的品质评价方法

Info

Publication number: CN119487179A
Application number: CN202380051676.0A
Authority: CN
Inventors: 八冢由纪子; 早乙女秀雄; 美野轮治; 土田胜晴; 冈崎康司; 得能寿子; 大纮太郎; 筱冢启
Original assignee: Oji Holdings Corp
Current assignee: Oji Holdings Corp
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2023-07-05
Publication date: 2025-02-18
Also published as: WO2024010020A1; EP4553148A1; JPWO2024010020A1

Abstract

本发明的课题在于提供不使用特定的药剂且由心肌细胞构成的成熟化的培养细胞片及其制造方法。另外，提供使用了该培养细胞片的化合物或药物的评价方法、以及提供由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法。本发明的培养细胞片是由心肌细胞构成的培养细胞片，心肌细胞具有取向性地配置，在对前述培养细胞片使用抗α‑辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围(71.6μm×71.6μm)内的用α‑辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上。取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×100(1)

Description

培养细胞片及其制造方法、化合物或药物的评价方法、以及培养细胞片的品质评价方法

技术领域

本发明涉及由心肌细胞构成的培养细胞片及其制造方法、使用了该培养细胞片的化合物或药物的评价方法、以及培养细胞片的品质评价方法。

背景技术

从削减药剂开发的成本和缩短药剂开发时间、替代动物实验的观点出发，期待将由人iPS细胞等干细胞分化诱导的细胞利用于创新药开发中。其优点在于：从开发的初始阶段就可以进行以这些人细胞为对象的试验，将以往在动物实验中实施的试验替换成基于人iPS细胞等干细胞源性细胞的试验，可以消除因种属差异产生的药剂响应性的差异。特别是，在源自生物体的细胞难以获得的心肌细胞等中，要求利用源自人iPS细胞等干细胞的心肌细胞。

但是，目前已知能够获得的源自人iPS细胞等干细胞的心肌细胞未成熟，其生理活性、运动功能接近胎儿心肌。因此，关于对药剂的反应性，也有报道显示会与生物体相背离，需要使源自人iPS细胞等干细胞的心肌细胞成熟化的方法。

例如，专利文献1中，提供其自身可在体外培养中促进源自多能胚胎干细胞的胎儿样(未成熟)心肌细胞的成熟的已知组成的培养基组合物，以及，为了提供更有效且有助于大规模产生满足针对心脏研究及临床用途的一般要件的成体样心肌细胞的、通过体外培养来制作成体样心肌细胞的方法而消除本领域的主要限制，公开了无血清且包含甲状腺激素样化合物、脂质混合物及肉碱化合物的水性培养基组合物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2020-022460号公报

发明内容

发明要解决的问题

专利文献1是通过使用特定的培养基而使之成熟为成体样心肌细胞，不能排除该培养基含有的成分对心肌细胞产生除成熟以外的影响的可能性。

本发明的目的在于提供不使用特定的药剂且由心肌细胞构成的成熟化的培养细胞片及其制造方法。另外，本发明的目的在于提供使用了该培养细胞片的化合物或药物(蛋白质、肽、抗体、DNA、RNA等)的评价方法。进而，本发明的目的还在于提供由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法。

用于解决问题的方案

本发明的上述课题可以通过以下的＜1＞～＜19＞的构成来解决。

＜1＞一种培养细胞片，其是由心肌细胞构成的培养细胞片，心肌细胞具有取向性地配置，在对前述培养细胞片使用抗α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围(71.6μm×71.6μm)内的用α-辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上。

取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×100(1)

＜2＞根据＜1＞所述的培养细胞片，其中，在活细胞成像中，显示从运动矢量的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量(取向度)为12％以上。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的培养细胞片，其中，前述心肌细胞为源自干细胞的心肌细胞。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件A1及要件A2中的至少任一者。

要件A1：MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(MYL3/ACTB)为12.0以上。

要件A2：MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋白重链6)基因的表达量之比(MYH7/MYH6)为6.0以上。

＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件B1及要件B2中的至少任一者。

要件B1：CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(CKM/ACTB)为1.80以上。

要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与ACTB的基因表达量之比(LDHA/ACTB)为0.80以上。

＜6＞根据＜1＞～＜5＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件C1～要件C4中的至少任一者。

要件C1：CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为0.085以上。

要件C2：KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员2)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为0.038以上。

要件C3：KCNE1(电压门控钾通道亚家族E调节亚基1)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNE1/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为0.003以上。

要件C4：SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为0.87以上。

＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件D1～要件D4中的至少任一者。

要件D1：LPL(脂蛋白脂肪酶)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(LPL/ACTB)在培养第15天～第45天的任意天为0.45以上。

要件D2：ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(ACAT1/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.43以上。

要件D3：HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHA/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.75以上。

要件D4：HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHB/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.95以上。

＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件E1～要件E8中的至少任一者。

要件E1：PPARGC1A(PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)共激活子1α)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(PPARGC1A/HIF1A)在培养的任意天为0.80以上。

要件E2：ESRRA(雌激素相关受体α)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(ESRRA/HIF1A)在培养的任意天为0.55以上。

要件E3：VEGFA(血管内皮生长因子A)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(VEGFA/HIF1A)在培养的任意天为0.65以上。

要件E4：APLN(Apelin，爱帕琳肽)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(APLN/HIF1A)在培养的任意天为0.005以上。

要件E5：FABP3(脂肪酸结合蛋白3)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(FABP3/HIF1A)在培养的任意天为5.0以上。

要件E6：ESM1(内皮细胞特异性分子1)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(ESM1/HIF1A)在培养的任意天为0.002以上。

要件E7：EMCN(内皮粘蛋白)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(EMCN/HIF1A)在培养第7天以后的任意天为0.002以上。

要件E8：BCL2(BCL2凋亡调节因子)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(BCL2/HIF1A)在培养第7天以后的任意天为0.013以上。

＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述的培养细胞片，其中，每个细胞的线粒体的面积为200μm²以上。

＜10＞根据＜1＞～＜9＞中任一项所述的培养细胞片，其中，将活细胞成像中所检出的收缩速度设为CV(m/sec)、松弛速度设为RV(m/sec)时，满足下述式(2)。

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)

＜11＞根据＜1＞～＜10＞中任一项所述的培养细胞片，其中，在钙成像解析中，将钙瞬变的波形峰高度设为100％时，将20％高度的波形宽度设为Duration(秒)、将峰间的间隔设为Interval(秒)时，满足下述式(3)。

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)

＜12＞根据＜1＞～＜11＞中任一项所述的培养细胞片，其中，构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上，并且最大舒张期电位为-60mV以下。

＜13＞根据＜1＞～＜12＞中任一项所述的培养细胞片，其中，在测定细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，通过添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂，氧消耗速率与β氧化抑制剂添加前相比减少至20％以下。

＜14＞根据＜1＞～＜13＞中任一项所述的培养细胞片，其用于再生医疗。

＜15＞一种培养细胞片的制造方法，其是＜1＞～＜14＞中任一项所述的培养细胞片的制造方法，所述制造方法包括使用细胞片形成用构件来培养心肌细胞的步骤，所述细胞片形成用构件具备用于形成培养细胞片的表面，前述表面具备多个平坦部和多个凹凸部，各平坦部具有沿第一方向延伸的形状，并且前述多个平坦部在前述表面的整体上沿与前述第一方向交叉的第二方向排列，各凹凸部包含填埋彼此相邻的前述平坦部之间的多个高度差结构，前述高度差结构的间距为100nm以上且10μm以下，前述高度差结构为凸部，前述凹凸部在被彼此相邻的前述平坦部夹持的凹部的底面具备多个前述凸部，在细胞片形成用构件的厚度方向上，前述凹凸部中的前端面的高度与前述平坦部的高度之差为0.5μm以下。

＜16＞一种化合物或药物的评价方法，其使作为评价对象的化合物或药物作用于＜1＞～＜14＞中任一项所述的培养细胞片。

＜17＞根据＜16＞所述的化合物或药物的评价方法，其对选自培养细胞片的生理学特性的变化及运动功能的变化中的至少一种变化进行评价。

＜18＞根据＜16＞或＜17＞所述的化合物或药物的评价方法，其中，作为前述评价对象的化合物或药物为选自由INa阻断剂、Ikr阻断剂、Iks阻断剂、ICa阻断剂、5-HT4受体激动剂、α受体阻断剂、β受体阻断剂、α受体激动剂及β受体激动剂、毒性物质、抗癌剂、脂质代谢抑制剂及其他生理活性物质组成的组中的至少一种现有化合物或其候选化合物。

＜19＞一种品质评价方法，其是由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法，所述品质评价方法对下述(i)～(xii)中的任一项进行评价。

(i)在对前述培养细胞片使用抗α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围(71.6μm×71.6μm)内的用α-辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上。

(ii)在活细胞成像中，显示从运动矢量的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量(取向度)为12％以上。

(iii)满足以下的要件A1及要件A2中的至少任一者。

(iv)满足以下的要件B1及要件B2中的至少任一者。

(v)满足以下的要件C1～要件C4中的至少任一者。

(vi)满足以下的要件D1～要件D4中的至少任一者。

(vii)满足以下的要件E1～要件E8中的至少任一者。

要件E4：APLN(Apelin)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(APLN/HIF1A)在培养的任意天为0.005以上。

要件E7：EMCN(内皮粘蛋白)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比(EMCN/HIF1A)在培养的第7天以后的任意天为0.002以上。

(viii)每个细胞的线粒体的面积为200μm²以上。

(ix)将活细胞成像中所检出的收缩速度设为CV(m/sec)、松弛速度设为RV(m/sec)时，满足下述式(2)。

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)

(x)在钙成像解析中，将钙瞬变的波形峰高度设为100％时，将20％高度的波形宽度设为Duration(秒)、将峰间的间隔设为Interval(秒)时，满足下述式(3)。

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)

(xi)构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上，并且最大舒张期电位为-60mV以下。

(xii)在测定细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，通过添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂，氧消耗速率与β氧化抑制剂添加前相比减少至20％以下。

发明效果

根据本发明，可以提供不使用特定的药剂且由心肌细胞构成的成熟化的培养细胞片及其制造方法。另外，根据本发明，可以提供使用了该培养细胞片的化合物或药物的评价方法。进而，根据本发明，可以提供由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法。

附图说明

图1是显示细胞片形成用构件的一个实施方式中的该构件的构成的图，(a)是将细胞片形成用构件的结构与浅底盘一同显示的立体图，(b)是放大显示细胞片形成用构件的表面的一部分的立体图，(c)是放大显示细胞片形成用构件的表面的一部分的俯视图，(d)是放大显示细胞片形成用构件的一部分的局部剖视图。

图2是用于说明细胞片形成用构件的制造方法的一例的工序图。

图3的(a)～(c)是用于说明细胞片的制造过程的示意图。

图4是显示在培养天数第15天、第30天、第45天、第60天时的取向度的图表。

图5是显示MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(MYL3/ACTB)的经时变化的图表。

图6是显示MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋白重链6)基因的表达量之比(MYH7/MYH6)的经时变化的图表。

图7-1是显示CKM(肌酸激酶，M型)基因、COX6A2(细胞色素C氧化酶亚基6A2)基因、CKMT2(线粒体肌酸激酶2)基因及LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)基因的表达量的经时变化的图表。

图7-2是显示CKM基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(CKM/ACTB)、COX6A2基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(COX6A2/ACTB)、CKMT2基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(CKMT2/ACTB)以及LDHA基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(LDHA/ACTB)的经时变化的图表。

图7-3是显示CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)基因、KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员2)基因、KCNE1(电压门控钾通道亚家族E调节亚基1)基因及SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)基因的表达量的经时变化的图表。

图7-4是显示CACNA2D1基因的表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)基因的表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)、KCNJ2基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)、KCNE1基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(KCNE1/ATP1A1)以及SCN5A基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(SCN5A/ATP1A1)的经时变化的图表。

图7-5是显示LPL(脂蛋白脂肪酶)基因、ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)基因、HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)基因及HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)基因的表达量的经时变化的图表。

图7-6是显示LPL基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(LPL/ACTB)、ACAT1基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(ACAT1/ACTB)、HADHA基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(HADHA/ACTB)以及HADHB基因的表达量与ACTB基因的表达量之比(HADHB/ACTB)的经时变化的图表。

图7-7是显示PPARGC1A(PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)共激活子1α)基因、ESRRA(雌激素相关受体α)基因、VEGFA(血管内皮生长因子A)基因及APLN(Apelin)基因的表达量的经时变化的图表。

图7-8是显示PPARGC1A基因的表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)基因的表达量之比(PPARGC1A/HIF1A)、ESRRA基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(ESRRA/HIF1A)、VEGFA基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(VEGFA/HIF1A)以及APLN基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(APLN/HIF1A)的经时变化的图表。

图7-9是显示FABP3(脂肪酸结合蛋白3)基因、ESM1(内皮细胞特异性分子1)基因、EMCN(内皮粘蛋白)基因及BCL2(BCL2凋亡调节因子)基因的表达量的经时变化的图表。

图7-10是显示FABP3基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(FABP3/HIF1A)、ESM1基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(ESM1/HIF1A)、EMCN基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(EMCN/HIF1A)以及BCL2基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(BCL2/HIF1A)的经时变化的图表。

图8是显示每个细胞的线粒体面积及线粒体活性的图表。

图9是对核及线粒体进行了染色的荧光图像。

图10是显示活细胞成像装置中运动矢量的基于角度的频率的图表。

图11-1是显示使用活细胞成像装置测定得到的心率(beating rate，BR)、收缩速度(contractile velocity，CV)、松弛速度(relaxation velocity，RV)、收缩-松弛持续时间(contraction-relaxation duration，CRD)及取向度的经时变化的图表。

图11-2是显示使用活细胞成像装置测定得到的收缩速度与松弛速度之比(CV/RV)的经时变化的图表。

图12是显示利用钙成像解析测定得到的在培养第5天的Duration、Interval及Duration/(Interval)^1/2的图表。

图13是显示膜片钳试验的结果的图表。

图14是显示利用活细胞成像解析测定得到的各化合物对培养细胞片的影响的图表。

图15-1是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(E-4031)对培养细胞片的影响的图表。

图15-2是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(奎尼丁)对培养细胞片的影响的图表。

图15-3是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(西沙必利)对培养细胞片的影响的图表。

图15-4是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(异丙肾上腺素)对培养细胞片的影响的图表。

图15-5是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(DMSO)对培养细胞片的影响的图表。

图16-1是显示利用活细胞成像解析测定得到的化合物(异丙肾上腺素)对培养第15天的培养细胞片的影响的图表。

图16-2是显示利用活细胞成像解析测定得到的化合物(米力农)对培养第15天的培养细胞片的影响的图表。

图17是显示通过活细胞成像解析测定得到的化合物(多柔比星)对培养第15天的培养细胞片的影响的图表。

图18是显示由添加作为β氧化抑制剂的乙莫克舍引起的氧消耗速率的变化的图表。

具体实施方式

以下，对本发明的优选实施方式进行说明。需要说明的是，在本说明书中，表示范围的“X～Y”是指“X以上且Y以下”。在分段记载数值范围的情况下，各数值范围的上限及下限可以任意地组合。

[培养细胞片]

本发明的培养细胞片是由心肌细胞构成的培养细胞片，心肌细胞具有取向性地配置，在对前述培养细胞片使用抗α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围71.6μm×71.6μm面积内的用α-辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体(肌原纤维的Z带)的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上。

棒状结构体是指通过α-辅肌动蛋白检出的肌原纤维的Z带。Z带相对于肌原纤维的朝向直行地存在。在心肌细胞对齐长轴方向而朝向一个方向取向的情况下，Z带相对于细胞的长轴方向显示90°的角度。

关于棒状结构体的图像解析，将所取得的图像分成纵向三等分、横向三等分的9个分区(1个分区为71.6μm×71.6μm的面积)，使用3个分区(左上、中央、右下的分区)。在所取得的图像为3个以上的情况下，对各个图像的左上的1个分区进行测定(n＝3以上)，在所取得的图像为2个以下情况下，从具代表性的1个图像中测定3个分区(左上、中央、右下的分区)。在1个分区中平均包含10个细胞。对于图像上的棒状结构体，可以使用图像解析软件(A-ZO-KUN、旭化成工程株式会社制)等的角度分布解析，检测用α-辅肌动蛋白检出的棒状结构体，并求出将图像的水平方向设为0°时用α-辅肌动蛋白检出的棒状结构体的角度分布(0～180°)。另外，也可以使用图像解析软件(例如Photoshop、Adobe公司制)等对棒状结构体用直线进行标记，接着仅将所标记的直线作为图像进行保存，再使用解析软件(A-ZO-KUN、旭化成工程株式会社制)等对直线的角度分布进行解析。

角度分布以0～180°间的每10°的频率的形式来表示。

需要说明的是，培养细胞片是指：细胞片不是存在于生物体内的细胞片、而是在体外制造的细胞片。

作为使心肌细胞成熟化的手段，认为在接近生物体的状态下培养细胞的方法是有效的。生物体内的心肌以向一个方向取向的状态存在，由细胞间连接介导进行细胞间的电传导，发挥收缩/松弛这样的功能。

在本实施方式中，发现：通过使用取向性培养基材，在心肌细胞发生了取向的状态下进行培养，从而可以促进心肌细胞的成熟化(生理活性、运动功能的改善)。并且发现：通过使用以该方法培养出的细胞，从而能够实现源自人iPS细胞等的心肌细胞在创新药领域的毒性试验、有效性试验中的利用。另外，该培养细胞片的成熟化得以推进，为更接近生物体内的状态，因此还被期待应用于再生医疗中。

从促进心肌细胞的成熟化的观点出发，上述式(1)所示的取向度为23％以上，优选为24％以上，更优选为25％以上，进一步优选为26％以上，而且，上限并无特别限定，但是，从制造容易性的观点出发，为50％以下。

需要说明的是，只要在任一培养天数时上述式(1)所示的取向度满足上述范围即可。

＜心肌细胞＞

本实施方式的培养细胞片由心肌细胞构成。

作为前述心肌细胞，可例示无脊椎动物、包括人和非人在内的脊椎动物的心肌细胞，作为脊椎动物，包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类。具体而言，例如，作为哺乳类，可以为小鼠、大鼠、雪貂、仓鼠、豚鼠或兔等啮齿类、狗、猫、羊、猪、牛、马、或者包括恒河猴(rhesus)、黑猩猩、猩猩、人等在内的灵长类等。另外，除哺乳类以外，还包括鱼类、包括家禽在内的鸟类、爬行类等。

其中，优选为包括人、小鼠在内的哺乳类的心肌细胞，更优选为人的心肌细胞。

在本实施方式中，心肌细胞可以是通过使用了针对各种中胚层系的分化诱导因子等的方法而由多能干细胞(干细胞)分化诱导成的心肌细胞。此外，在本实施方式中，心肌细胞也可以是向患者等的成纤维细胞、血液细胞中导入转录因子而诱导成的诱导心肌细胞(iCM、通过直接重编程得到的心肌细胞)。进而，本实施方式的心肌细胞还可以是由患者等的心脏得到的原代培养(Primary Cell Culture)心肌细胞。

其中，心肌细胞优选为源自干细胞的心肌细胞。

在此，干细胞包括例如：在包括人在内的灵长类、除灵长类以外的哺乳类等生物中能够分化为各种细胞的具有多分化能力的干细胞(Stem Cell)。干细胞适合具有如下性质：能够传代，即使在传代后也保持不进行分化的状态，核型等不易变化或者表观遗传表型不易变化。另外，与此相关，干细胞还适合具备在生物体外(in vitro)的充分的增殖能力。作为这样的干细胞的具体例，可列举胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell、以下称为“ES细胞”。)、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell、以下称为“iPS细胞”。)、其他的人工生成或选择的具备多能性的干细胞等。这些干细胞可以是利用包含特定基因的逆转录病毒、腺病毒、质粒等各种载体、RNA、低分子化合物等对体细胞进行重编程而制作的干细胞。

需要说明的是，作为干细胞，虽然未必需要是具备接近全能性(万能性、pluripotent)的多分化能力的细胞，但优选使用多分化能力比通常高的多能性(multipotency)的细胞。另外，干细胞可以是由从疾病患者得到的细胞制作的细胞、作为其他疾病模型的细胞、整合了报告基因的细胞(报告细胞)、能够条件性敲除(conditionallyknocked out)的细胞、其他经基因重组的细胞等。该基因重组包括：染色体内的基因的增添、修饰或删除；使用各种载体、人工染色体进行的基因等的添加；表观遗传调控的变更；PNA等人工遗传物质的添加；其他基因重组。

其中，在本实施方式中，从获得容易性及向心肌细胞的分化诱导性的观点出发，心肌细胞优选为源自ES细胞或iPS细胞的心肌细胞。

＜基因表达＞

本实施方式的培养细胞片优选发生与心肌细胞的成熟化相伴随的特征性的基因表达量的变化。该特征性的基因表达量的变化例如记载于参考文献1(Circ.Res.2020Apr10:126(8),1086-1106)、参考文献2(Nat Rev Cardiol.2020Jun；17(6):341-359)。

在本发明的方法中，基因表达量通过RNA的表达信息来测定，RNA的表达信息的取得方法并无特别限定，可列举例如：将试样中所含的RNA通过逆转录而转化为cDNA后，测定该cDNA或其扩增产物，由此取得RNA的表达信息。作为测定表达水平的手段，可列举微阵列、定量RT-PCR、RNA-Seq等，优选为RNA-Seq。

关于RNA的表达量，在使用微阵列解析的情况下，通过信号强度比来定量，在RNA-seq解析时，通过映射到基因组的序列读段的数量(读段计数值)来定量。对于映射到各转录物的读段数，通过转录物的长度、该解析中得到的总读段数等进行校正，经过该称之为标准化的作业后，将其用于解析。作为具体的标准化的方法，可列举例如：为了校正在样品间总读段数的不同而将总读段数校正为100万的CPM(Counts Per Million)；以及将转录物的长度设为1kb、将总读段数设为100万，用各基因的基因长进行了校正的读段数即RPKM(ReadsPer Kilobase of exon per Million mapped sequence reads)值。同样将总读段数设为100万并且用各基因的基因长进行了校正的片段数即FPKM(Fragments Per Kilobase ofexon per Million mapped sequence reads)值、表示将各转录产物的读段数用基因长进行校正并且将总读段数设为100万时的转录产物数的TPM(Transcripts Per Million)值等也被广泛使用。在本实施方式中使用了CPM及TPM，但是并不限定于此。

本实施方式的培养细胞片优选MYL3(肌球蛋白轻链3)的基因表达量较多，在假定无论组织、培养期如何ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量均为恒定量的基因表达量时，MYL3的基因表达量与ACTB基因的表达量之比(MYL3/ACTB)优选为12.0以上，更优选为12.5以上。另外，虽然依赖于培养天数，但是进一步优选为15.0以上。上限并无特别限定，一般为30.0以下，优选为25.0以下。需要说明的是，在本实施方式的培养细胞片中，虽然会根据培养天数的不同而确认到基因表达量的变化，但是只要在任一培养天数达成上述的基因表达量之比即可。

另外，有报道显示在心肌细胞中随着成熟化而发生同源异构体(isoform)变化(参照上述参考文献1)，作为这样的同源异构体变化，已知有从MYH6(肌球蛋白重链6)向MYH7(肌球蛋白重链7)的同源异构体转变。

在本实施方式的培养细胞片中，MYH7基因的表达量与MYH6基因的表达量之比(MYH7/MYH6)优选为6.0以上，更优选为7.0以上。另外，上限并无特别限定，一般为15.0以下，优选为10.0以下。需要说明的是，在本实施方式的培养细胞片中，虽然会根据培养天数的不同而确认到基因表达量的变化，但是只要在任一培养天数达成上述的基因表达量之比即可。

进而，在培养细胞片中，优选与心肌收缩相关的CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量增加。在本实施方式的培养细胞片中，CKM基因的表达量在任一培养天数时优选为900TPM(Transcript Per Kilobase Million)以上，更优选为1000TPM以上，进一步优选为1100TPM以上。另外，其上限并无特别限定，但一般为1500TPM以下。

CKM基因与ACTB基因的表达量之比(CKM/ACTB)在任一培养天数时优选为1.80以上，更优选为2.00以上，进一步优选为2.10以上，而且，上限并无特别限定，但一般为5.0以下，优选为4.5以下。

在培养细胞片中，优选定位于线粒体的蛋白质即COX6A2(细胞色素C氧化酶亚基6A2)的基因表达量增加。在本实施方式的培养细胞片中，COX6A2基因的表达量在任一培养天数时优选为850TPM以上，更优选为875TPM以上，进一步优选为900TPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为2000TPM以下，优选为1500TPM以下。

COX6A2基因与ACTB基因的表达量之比(COX6A2/ACTB)在任一培养天数时优选为1.95以上，更优选为2.20以上，进一步优选为2.40以上，而且，上限并无特别限定，一般为5.00以下，优选为3.50以下。

在培养细胞片中，优选定位于线粒体的蛋白质即CKMT2(线粒体肌酸激酶2)的基因表达量增加。在本实施方式的培养细胞片中，CKMT2基因的表达量在任一培养天数时优选为330TPM以上，更优选为350TPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为1000TPM以下，优选为800TPM以下。

CKMT2基因与ACTB基因的表达量之比(CKMT2/ACTB)在培养第15天～第30天优选为0.60以上，更优选为0.65以上，而且，上限并无特别限定，一般为3.0以下，优选为1.5以下。另外，CKMT2/ACTB在任一培养天数时优选为0.80以上。

在培养细胞片中，优选作为糖酵解系酶的LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量增加。认为这是由于：随着细胞的活化，能量生产量提高，由此LDHA的基因表达量增加。

在本实施方式的培养细胞片中，LDHA基因的表达量在任一培养天数时优选为550TPM以上，更优选为600TPM以上，进一步优选为650TPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为2000TPM以下，优选为1500TPM以下。

LDHA基因与ACTB基因的表达量之比(LDHA/ACTB)优选为0.80以上，更优选为1.00以上，进一步优选为1.20以上，而且，上限并无特别限定，一般为5.0以下，优选为4.0以下。

在培养细胞片中，优选与心肌钙离子通道的形成相关的CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)、与心肌钾离子通道的形成相关的KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员2)、KCNE1(电压门控钾通道亚家族E调节亚基1)、与心肌钠离子通道的形成相关的SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)的表达量经时性地增加。认为这是由于：随着心肌细胞的成熟，心肌细胞的收缩松弛运动也活化，随之与离子通道的形成相关的基因的表达量增加。

需要说明的是，在CACNA2D1基因、KCNJ2基因、KCNE1基因、SCN5A基因的情况下，代替前述的ACTB而使用参与生成在细胞膜内外的Na+及K+梯度的ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)。选择其的理由是：据报道ATP1A1是稳定表达的心肌细胞膜蛋白质，并且在源自iPS细胞的心肌细胞、胎儿心肌、成人心肌中的表达量的变动小(参照Okai,et al.,Video-basedassessment of drug-induced effects on contractile motion properties usinghuman induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,Journal ofPharmacological and Toxicological Methods,Volume 105,September 2020,106893)。

在本实施方式的培养细胞片中，与心肌钙离子通道的形成相关的CACNA2D1基因的表达量在任一培养天数时优选为2100CPM以上，更优选为2200CPM以上，进一步优选为2300CPM以上，更进一步优选为2400CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为3500CPM以下，优选为3000CPM以下。

CACNA2D1基因与ATP1A1基因的表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天优选为0.08以上，更优选为0.085以上，进一步优选为0.09以上，更进一步优选为0.095以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.50以下，优选为0.20以下。

在本实施方式的培养细胞片中，KCNJ2基因的表达量在任一培养天数时优选为950CPM以上，更优选为1000CPM以上，进一步优选为1200CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为3000CPM以下，优选为2000CPM以下。

KCNJ2基因与ATP1A1基因的表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天优选为0.038以上，更优选为0.040以上，进一步优选为0.045以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.15以下，优选为0.10以下。

在本实施方式的培养细胞片中，KCNE1基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为50CPM以上，更优选为60CPM以上，进一步优选为70CPM以上，更进一步优选为75CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为200CPM以下，优选为150CPM以下。

KCNE1基因与ATP1A1基因的表达量之比(KCNE1/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天优选为0.0025以上，更优选为0.003以上，进一步优选为0.0035以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.01以下，优选为0.007以下。

在本实施方式的培养细胞片中，SCN5A基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为22000CPM以上，更优选为23000CPM以上，进一步优选为23500CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为50000CPM以下，优选为40000CPM以下。

SCN5A基因与ATP1A1基因的表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天优选为0.85以上，更优选为0.90以上，进一步优选为0.95以上，而且，上限并无特别限定，一般为5.0以下，优选为2.0以下。

在培养细胞片中，优选存在于细胞表面而促进脂质摄取到细胞内的LPL(脂蛋白脂肪酶)、定位于细胞内线粒体且与脂肪酸的β氧化相关的ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)、HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)、HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的表达量经时性地增加。随着心肌细胞的成熟，运动功能提高，ATP消耗量增大。认为为了更高效地产生ATP，这些基因的表达会增加。

在本实施方式的培养细胞片中，LPL基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为3100CPM以上，更优选为3500CPM以上，进一步优选为4000CPM以上，更进一步优选为4500CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为9000CPM以下，优选为7500CPM以下。

LPL基因与ACTB基因的表达量之比(LPL/ACTB)在培养第15天～第45天的任意天优选为0.45以上，更优选为0.50以上，进一步优选为0.60以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.0以下，优选为1.5以下，更优选为1.0以下。

在本实施方式的培养细胞片中，ACAT1基因的表达量在培养第30天～第45天的任意天优选为3500CPM以上，更优选为3800CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为8000CPM以下，优选为6000CPM以下。

ACAT1基因与ACTB基因的表达量之比(ACAT1/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天优选为0.43以上，更优选为0.45以上，进一步优选为0.50以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.0以下，优选为1.5以下，更优选为1.0以下。

在本实施方式的培养细胞片中，HADHA基因的表达量在培养第30天～第45天的任意天优选为6000CPM以上，更优选为6200CPM以上，进一步优选为6500CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为12000CPM以下，优选为10000CPM以下。

HADHA基因与ACTB基因的表达量之比(HADHA/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天优选为0.75以上，更优选为0.80以上，进一步优选为0.90以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.5以下，优选为2.0以下，更优选为1.5以下。

在本实施方式的培养细胞片中，HADHB基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为8200CPM以上，更优选为8300CPM以上，进一步优选为8500CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为20000CPM以下，优选为15000CPM以下。

HADHB基因与ACTB基因的表达量之比(HADHB/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天优选为0.95以上，更优选为1.00以上，进一步优选为1.10以上，更进一步优选为1.20以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.5以下，优选为2.0以下，更优选为1.8以下。

在培养细胞片中，优选编码作为线粒体生物合成的主调节因子发挥作用的转录因子PGC-1α的PPARGC1A基因(PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)共激活子1α)、编码与心肌细胞的成熟化相关的雌激素相关受体ERR-α的ESRRA基因(雌激素相关受体α)、编码血管生长因子的VEGFA基因(血管内皮生长因子A)、编码在心肌中刺激心脏收缩的肌细胞因子的APLN基因(Apelin)、编码在心肌中调控长链脂肪酸摄取的肌细胞因子(myokine)的FABP3基因(脂肪酸结合蛋白3)、内皮细胞特异性表达的ESM1基因(内皮细胞特异性分子1)、编码由上皮细胞等分泌的粘蛋白样糖蛋白质EMCN基因(内皮粘蛋白)的表达量经时性地增加，另外，优选与心肌细胞的分化有关的BCL2基因(BCL2凋亡调节因子)的表达量维持不变。

认为其原因在于：随着心肌细胞的成熟，运动功能亢进，由此参与线粒体的功能化的PPARGC1A基因、参与血管新生的VEGFA基因的表达量增加，并且，随之APLN、FABP3等编码肌细胞因子的基因的表达量增加，进而，内皮细胞特异性的ESM1、EMCN等基因的表达量增加，另外认为，与心肌细胞的分化有关的BCL2基因的表达维持不变。

在本实施方式的培养细胞片中，PPARGC1A基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为4500CPM以上，更优选为4700CPM以上，进一步优选为5000CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为20000CPM以下，优选为15000CPM以下，更优选为8000CPM以下。

PPARGC1A基因与HIF1A基因的表达量之比(PPARGC1A/HIF1A)在培养的任意天优选为0.80以上，更优选为0.85以上，进一步优选为0.90以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.5以下，优选为2.0以下，更优选为1.5以下。

需要说明的是，在PPARGC1A基因、ESRRA基因、VEGF基因、APLN基因、FABP3基因、ESM1基因、EMCN基因、BCL2基因的情况下，代替前述的ACTB而使用在细胞的低氧状态下被诱导的转录因子即HIF1A(缺氧诱导因子1α)。其理由在于：据报道本项目中所述的血管新生的亢进是由低氧症或运动刺激诱导的。另外，认为虽然在细胞培养条件下可以采取任意环境，但是在状态良好的(功能成熟的)心肌细胞中，会发生由运动刺激引起的各因子的表达上升(参照Arany,et al.,HIF-independent regulation of VEGF and angiogenesisby thetranscriptional coactivator PGC-1a,Vol 451|21February2008)。

在本实施方式的培养细胞片中，ESRRA基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为2750CPM以上，更优选为2900CPM以上，进一步优选为3000CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为10000CPM以下，优选为6000CPM以下，更优选为4000CPM以下。

ESRRA基因与HIF1A基因的表达量之比(ESRRA/HIF1A)在培养的任意天优选为0.55以上，更优选为0.57以上，进一步优选为0.60以上，而且，上限并无特别限定，一般为2.0以下，优选为1.5以下，更优选为1.0以下。

在本实施方式的培养细胞片中，VEGFA基因的表达量在培养的任意天优选为3300CPM以上，更优选为3700CPM以上，进一步优选为4500CPM以上，更进一步优选为6000CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为25000CPM以下，优选为15000CPM以下，更优选为10000CPM以下。

VEGFA基因与HIF1A基因的表达量之比(VEGFA/HIF1A)在培养的任意天优选为0.65以上，更优选为0.70以上，进一步优选为0.90以上，更进一步优选为1.2以上，特别优选为1.5以上，而且，上限并无特别限定，一般为5.0以下，优选为3.0以下，更优选为2.0以下。

在本实施方式的培养细胞片中，APLN基因的表达量在培养的任意天优选为100CPM以上，更优选为150CPM以上，进一步优选为200CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为50000CPM以下，优选为3000CPM以下，更优选为2000CPM以下。

APLN基因与HIF1A基因的表达量之比(APLN/HIF1A)在培养的任意天优选为0.005以上，更优选为0.020以上，进一步优选为0.030以上，更进一步优选为0.040以上，而且，上限并无特别限定，一般为1.0以下，优选为0.50以下，更优选为0.30以下。

在本实施方式的培养细胞片中，FABP3基因的表达量在培养的任意天优选为30000CPM以上，更优选为31000CPM以上，进一步优选为32000CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为100000CPM以下，优选为60000CPM以下，更优选为40000CPM以下。

FABP3基因与HIF1A基因的表达量之比(FABP3/HIF1A)在培养的任意天优选为5.0以上，更优选为5.5以上，进一步优选为6.0以上，而且，上限并无特别限定，一般为15.0以下，优选为12.0以下，更优选为8.0以下。

在本实施方式的培养细胞片中，ESM1基因的表达量在培养的任意天优选为5CPM以上，更优选为25CPM以上，进一步优选为40CPM以上，更进一步优选为100CPM以上，特别优选为200CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为3000CPM以下，优选为1000CPM以下，更优选为500CPM以下。

ESM1基因与HIF1A基因的表达量之比(ESM1/HIF1A)在培养的任意天优选为0.002以上，更优选为0.005以上，进一步优选为0.010以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.200以下，优选为0.150以下，更优选为0.100以下。

在本实施方式的培养细胞片中，EMCN基因的表达量在培养第7天以后的任意天优选为10CPM以上，更优选为20CPM以上，进一步优选为40CPM以上，更进一步优选为60CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为1000CPM以下，优选为500CPM以下，更优选为300CPM以下。

EMCN基因与HIF1A基因的表达量之比(EMCN/HIF1A)在培养第7天以后的任意天优选为0.002以上，更优选为0.004以上，进一步优选为0.005以上，更进一步优选为0.010以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.100以下，优选为0.070以下，更优选为0.050以下。

在本实施方式的培养细胞片中，BCL2基因的表达量在培养第7天以后的任意天优选为60CPM以上，更优选为70CPM以上，进一步优选为80CPM以上，更进一步优选为90CPM以上，而且，上限并无特别限定，例如为1000CPM以下，优选为500CPM以下，更优选为300CPM以下。

BCL2基因与HIF1A基因的表达量之比(BCL2/HIF1A)在培养第7天以后的任意天优选为0.013以上，更优选为0.015以上，进一步优选为0.017以上，而且，上限并无特别限定，一般为0.100以下，优选为0.070以下，更优选为0.050以下。

＜线粒体量＞

心肌细胞存在随着其成熟而线粒体量及线粒体活性增加的倾向。

使用基于膜电位选择性地标记线粒体的荧光色素以及选择性地标记核的荧光色素，对本实施方式的培养细胞片进行染色，并取得荧光图像，由此测定线粒体及核的面积和亮度。

作为基于膜电位选择性地标记线粒体的荧光色素，可例示Thermo FisherScientific公司制的Mito-tracker系列等。另外，作为选择性地标记核的荧光色素，可例示Hoechst33342等。

此时，通过除以核数、即细胞数，从而算出每个细胞的线粒体的面积(Area)及亮度(Intensity)。需要说明的是，每个细胞的面积反映线粒体的数量，每个细胞的亮度反映线粒体活性。

每个细胞的线粒体的面积优选为200μm²以上，更优选为300μm²以上，进一步优选为400μm²以上，更进一步优选为450μm²以上，而且，上限并无特别限定，一般为1000μm²以下，优选为800μm²以下。

每个细胞的线粒体的亮度(Intensity)优选为2×10⁶以上，更优选为3×10⁶以上，进一步优选为4×10⁶以上，而且，上限并无特别限定，一般为10×10⁶以下，优选为8×10⁶以下。需要说明的是，每个细胞的亮度是通过实施例中记载的方法测定得到的亮度。

另外，测定上述每个细胞的线粒体的面积及线粒体的亮度时的细胞接种条件为6×10⁴个细胞/孔、培养天数第9天(第5天以后)、96孔的面积(0.33cm²)。

＜活细胞成像＞

对于由心肌细胞构成的培养细胞片，可以检测与心肌细胞的收缩/松弛相伴的运动变化。在生物体内，观察到心肌细胞朝向一个方向取向、并且沿着取向方向进行收缩/松弛。

使用活细胞成像装置(例如SI8000、索尼株式会社制)，在培养条件下拍摄培养细胞片(活细胞)而得到动画数据，根据该动画数据，检测与心肌细胞的收缩/松弛相伴的运动矢量(速度、方向、数量)，由此能够进行心率(BR：beating rate)、收缩速度(CV：contractile velocity)、松弛速度(RV：

relaxation velocity)、收缩-松弛持续时间(CRD：contraction-relaxationduration)及取向度的解析。关于基于活细胞成像进行的BR、CV、RV、CRD等的测定，例如可参照Methods in Molecular Biology，vol.2320,Chapter 15。

另外，关于这些的测定方法，可参照实施例中记载的方法。

在此，取向度通过以下方式来计算：求出将图像水平方向设为0°时运动矢量的角度，再求出显示从矢量角度的众数值的角度起±5°的矢量的数量与所检出的矢量数的总和之比。由活细胞成像装置得到的取向度用下述式来求得。

取向度(％)

＝(众数值±5°的范围所含的矢量的数量)/(矢量的总数)×100

本实施方式的培养细胞片的使用活细胞成像而测定的取向度优选为10％以上，更优选为12％以上，进一步优选为16％以上，更进一步优选为18％以上，特别优选为20％以上。取向度的上限并无特别限定。

在活细胞成像中，存在如下倾向：成人的心率为平均60次/分钟，心率(BR)越接近60次/分钟，则越接近正常的成熟化心肌细胞，收缩速度(CV)越快，则越接近正常的成熟化心肌细胞，松弛速度(RV)越快，则越接近成熟化心肌细胞，搏动时间(CRD)越短，则越接近正常的成熟化心肌细胞。

另外，收缩速度(CV)与松弛速度(RV)之比(CV/RV)越小越优选。本实施方式的培养细胞片的CV/RV优选为2.8以下，更优选为2.6以下，而且，优选为1.0以上。即，CV/RV优选满足以下的式(2)。

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)

＜Ca-成像解析＞

在心肌细胞中，观察到由动作电位引起全细胞质的Ca浓度随着心肌收缩而大致同时上升、即称作钙瞬变的现象。将本实施方式的培养细胞片用荧光Ca指示剂进行处理，再用共聚焦定量成像细胞仪进行观察(Ca-成像解析)，由此能够经时性地观察钙瞬变。作为根据钙瞬变的信号信息制作波形图、并对下述记载的参数进行解析的方法，使用专用的解析软件。

在未成熟的心肌细胞、因疾病而出现某种异常的心肌细胞中，存在钙瞬变的波形峰的20％高度的线宽(Duration)与正常的成熟化心肌细胞相比延长的倾向。20％高度的线宽(Duration)根据心率而发生变动，因此Duration(秒)与Interval(秒)的1/2次方之间的关系优选满足以下的式(3)。

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)

需要说明的是，据报道反映钙瞬变持续时间的20％高度的线宽(Duration)与动作电位持续时间具有相关性。在心肌细胞中，存在成熟化越推进则动作电位持续时间越长的倾向。Interval受到心搏的影响。通常，在心电图的解析中，动作电位持续时间使用的是用心率校正的值，因此如式(3)所示那样采用Duration/(Interval)^1/2。

在本实施方式中，优选的是构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上、并且最大舒张期电位为-60mV以下。

关于膜片钳试验，对于25℃的Tyrode溶液中的心肌细胞，在电流钳下以0.2Hz向细胞内投入20pA～100pA的电流，使其产生动作电位，并测定电位的变化。需要说明的是，电流只要在能够产生适当的动作电位的范围内适宜选择即可。

需要说明的是，作为动作电位持续时间的指标，采用动作电位80％再极化持续时间。这是在将施加电流后作为第一相显示的动作电位的峰高度与最大舒张期电位之差设为100％时达到相当于80％再极化的电位所需的时间。即，这是从动作电位的上升时间至动作电位达到相当于80％再极化的电位所需的时间。

当心肌细胞成熟时，存在如下倾向：与未成熟的心肌细胞相比，动作电位持续时间更长，并且最大舒张期电位更深。

构成本实施方式的培养细胞片的细胞的动作电位80％再极化持续时间优选为600msec以上，更优选为650msec以上，进一步优选为700msec以上，更进一步优选为750msec以上，而且，上限并无特别限定，但是，优选为与生物体内的心肌细胞相同程度的动作电位持续时间，从这一观点出发，优选为1200msec以下，更优选为1050msec以下，进一步优选为900msec以下。

另外，构成本实施方式的培养细胞片的细胞的最大舒张期电位优选为更接近生物体内新细胞的值，从这一观点出发，优选为-60mV以下，更优选为-62.5mV以下，进一步优选为-65mV以下，更进一步优选为-67.5mV以下。另外，下限并无特别限定，但是，由于成人的心室心肌细胞为约-80mV，因此优选为接近-80mV的值。

需要说明的是，关于源自人的正常分离心室肌细胞的动作电位持续时间及最大舒张期电位(静息膜电位)，可参照Circulation，2013；127：575-584。

＜由β氧化抑制剂引起的氧消耗速率的降低＞

在本实施方式中，优选的是：在测定构成培养细胞片的细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，通过添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂，氧消耗速率与β氧化抑制剂添加前相比减少至20％以下。

培养液中所含的氧被细胞摄取后，在通过线粒体的氧化磷酸化而产生ATP的路径中被消耗，因此培养液的氧消耗速率(OCR：Oxygen Consumption Rate)可以作为线粒体功能解析的指标。线粒体中的代谢主要有使用葡萄糖、脂肪酸、谷氨酰胺的路径，并且可以通过添加参与各个代谢的酶的抑制剂来推测代谢路径。

氧消耗量的测定可以使用市售的氧消耗速率平板检测试剂盒(同仁化学株式会社制)等来测定。

成熟化的心肌细胞对脂肪酸代谢的依赖度比未成熟的心肌细胞高。

在测定构成本实施方式的培养细胞片的细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，基于添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂得到的氧消耗速率在将β氧化抑制剂添加前设为100％时优选为30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为15％以下。

＜培养细胞片的用途＞

本实施方式的培养细胞片可以用于各种用途，例如可以用于再生医疗用途。培养细胞片可以是由1层细胞形成的单层片，另外，也可以是由2层以上的细胞形成的多层片。

具体而言，可例示将培养细胞片以其方向与心脏组织的收缩相同的方式直接贴附至因心肌梗塞、心绞痛等缺血性疾病而受到损伤的心脏(以下也称作“损伤心脏”)的心肌组织的损伤部位，并在贴附后进行缝合、插入等方法。在用于再生医疗时，可以在将单层细胞片或多层细胞片重叠数片而层叠后用于再生医疗。需要说明的是，在进行层叠的情况下，优选对齐取向方向而进行层叠，具体而言，只要对齐培养细胞片的收缩方向或取向方向而进行层叠即可。

另外，本实施方式的培养细胞片可以用于如后述那样通过使作为评价对象的化合物或药物起作用来评价化合物或药物对心肌细胞的作用的用途。

[培养细胞片的制造方法]

本实施方式的由心肌细胞构成的培养细胞片的制造方法包括使用特定的细胞片形成用构件来培养心肌细胞的步骤，细胞片形成用构件具备用于形成培养细胞片的表面，前述表面具备多个平坦部和多个凹凸部，各平坦部具有沿第一方向延伸的形状，并且前述多个平坦部在前述表面的整体上沿与前述第一方向交叉的第二方向排列，各凹凸部包含填埋彼此相邻的前述平坦部之间的多个高度差结构，前述高度差结构的间距为100nm以上且10μm以下，前述高度差结构为凸部，前述凹凸部在被彼此相邻的前述平坦部夹持的凹部的底面具备多个前述凸部，在细胞片形成用构件的厚度方向上，前述凹凸部中的前端面的高度与前述平坦部的高度之差为0.5μm以下。

如图1的(a)所示，细胞片形成用构件100例如为载置于浅底盘的培养皿110的片材。浅底盘在被培养皿110和盖120包围的空间中保持细胞悬浮液。需要说明的是，浅底盘的底部可以被加工成上述具有特定的平坦部和凹凸部的表面形状，在该情况下，浅底盘本身为细胞片形成用构件。

如图1的(b)所示，细胞片形成用构件100的表面111具备多个平坦部130和多个凹凸部140。凹凸部140由多个高度差结构构成，多个高度差结构填埋彼此相邻的平坦部130之间。高度差结构为凸部。需要说明的是，凹凸部140具备被彼此相邻的平坦部130夹持的凹部和位于凹部的底面的多个凸部141。

如图1的(c)所示，各平坦部130为沿一个方向即第一方向(图1的(c)的上下方向)延伸的平坦面。各平坦部130在表面111的整体上沿与第一方向正交的第二方向(图1的(c)的左右方向)排列。各凹凸部140也沿第一方向延伸、并且在表面111的整体上沿第二方向排列。

从与表面111相对的方向来看，构成凹凸部140的各凸部141位于例如三角格子的各顶点。各凹凸部140沿着第一方向及第二方向重复凸部141的此种排列。如果是凸部141位于三角格子的各顶点的凹凸部140，则用于形成凸部141的原版能够通过使用适合形成微小重复结构的掩模、例如以单粒子膜作为掩模的蚀刻法来形成。

从与表面111相对的方向来看，各凸部141具有例如圆形状。彼此相邻的凸部141的中心间的距离的众数值为凸部141的间距。另外，凸部141的俯视形状中的凸部的最大宽度为凸部141的直径。

从使心肌细胞的伸长方向与第一方向对齐的观点出发，凸部141的间距满足下述(A)及(B)的构成是合适的。即，从在平坦部130与凹凸部140之间明确地划分对心肌细胞的粘附的优劣的观点出发，凸部141的间距满足下述(A)及(B)的构成是适合的。

(A)凸部141的间距：100nm以上且10μm以下

(B)凸部141的直径：凸部141的间距的50％以上且100％以下

各平坦部130在第二方向(短边方向)上的长度为平坦部130的宽度。另外，彼此相邻的平坦部130间的第二方向(短边方向)上的长度为凹凸部140的宽度。

平坦部130的宽度及凹凸部140的宽度为例如作为培养对象的细胞的大小(5μm以上且100μm以下)的1/10倍以上且10倍以下。从容易使心肌细胞的伸长方向与第一方向对齐的观点出发，平坦部130的宽度及凹凸部140的宽度满足下述(C)及(D)的构成是适合的。

(C)平坦部130的宽度：10μm以上且50μm以下

(D)凹凸部140的宽度：10μm以上且50μm以下

如图1的(d)所示，凹凸部140可以在彼此相邻的凸部141之间以及平坦部130与同其邻接的凸部141之间具备凹部142。由于多个凸部141散布于凹凸部140中，因此凸部141间的空间即凹部142在凹凸部140中沿第一方向及第二方向相连。

在细胞片形成用构件100的厚度方向上，凹部142的底面与平坦部130之间的长度为平坦部130的高度。另外，在细胞片形成用构件100的厚度方向上，各凸部141的前端面与平坦部130之间的高低差为边界高度差。凹部142的底面与各凸部141的前端面的高低差为凸部141的高度。在各凸部141的前端面与平坦部130为同一平面的构成中，平坦部130的高度与凸部141的高度彼此相等。凸部141的间距相对于凸部141的高度之比为凸部141的距高比(aspect ratio)。

从提高细胞片的平坦性的观点出发，边界高度差满足下述(E)的构成是合适的。从提高凹凸部140在结构上的稳定性的观点、以及容易形成凹凸部140的观点出发，凸部141的高度满足下述(F)的构成、以及凸部141的距高比满足下述(G)的构成是合适的。

(E)边界高度差：0.5μm以下，优选为0.3μm以下

(F)凸部141的高度：50nm以上且5μm以下

(G)凸部141的距高比：0.1以上且10以下

而且，如果是满足上述(A)(B)的构成，则无论是对平坦部130的粘附占优势的细胞，还是对凹凸部140的粘附占优势的细胞，细胞都会优先对一个结构体粘附，而对另一个结构体的粘附占劣势，与此相应地，细胞的伸长方向会被对齐于两个结构体的延伸方向即第一方向。结果在沿表面111的二维方向上展开的细胞片中能够使细胞的伸长方向对齐于一维方向、即能够提高细胞的取向性。

另外，满足上述(E)的构成、特别是各凸部141的前端面与平坦部130为同一平面的构成能够提高以覆盖凹凸部140和平坦部130的方式形成的细胞片的平坦性。进而，满足上述(F)的构成能够更进一步提高细胞片的平坦性。

需要说明的是，由于细胞片形成用构件100的表面111具备平坦部130和凹凸部140，因此能够对于对平坦部130的粘附占优势的细胞和对凹凸部140的粘附占优势的细胞这两者应用相同的细胞片形成用构件100。即，还能提高细胞片形成用构件100的通用性。

另外，细胞片形成用构件100的表面111可以出于提高细胞的粘附性的目的而涂布有机物，或者也可以为由金属构成的面，其中，所述有机物含有例如：层粘连蛋白、胶原、明胶、纤连蛋白、聚赖氨酸(PDL或PLL)、透明质酸等细胞外基质；聚合物；凝胶等粘附因子。另外，细胞片形成用构件100的表面111可以出于提高细胞的粘附性、细胞片的平坦性的目的而具有亲水性或疏水性。

另外，为了容易在细胞片形成后剥离/回收细胞片，可以涂布刺激响应性材料。作为刺激响应性材料，优选为水亲和性根据温度变化而发生变化的温度响应性聚合物。具体而言，优选为聚-N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。刺激响应性材料可以使用惯用的涂布方法来涂布于基材，也可以对经刺激响应性材料处理的基材使用下述记载的方法来进行结构加工。

＜细胞片形成用构件的制造方法＞

对细胞片形成用构件的制造方法的一例进行说明。需要说明的是，在以下的说明中，对于使用纳米压印法通过凹版150的转印来形成细胞片形成用构件的表面111的例子进行说明。

如图2所示，细胞片形成用构件的制造方法包括形成凹版150的工序和通过凹版150的转印来形成细胞片形成用构件100的表面111的工序。

凹版150的下表面具备：具有沿第一方向(与纸面正交的方向)延伸的形状且沿与第一方向交叉的第二方向(纸面的左右方向)排列的多个平坦部；和，由填埋彼此相邻的平坦部之间的多个高度差结构构成的凹凸部。凹版150的平坦部是用于通过转印来形成细胞片形成用构件100的平坦部130的部分。凹版150的凹凸部是用于通过转印来形成细胞片形成用构件100的凹凸部140的部分。

凹版150的高度差结构为凸部或凹部。需要说明的是，本实施方式中的凹版150的高度差结构为用于形成凸部141的凹部151，凹部151的间距为100nm以上且10μm以下。在形成凹版150的工序中，例如，针对用于形成凹版150的硅基板，使用光刻法、胶体光刻法、阳极氧化法及干涉曝光法中的至少一种形成凹凸部。另外，凹版150本身可以通过从原版进行1次或多次转印来得到。例如，针对硅基板，使用光刻法、胶体光刻法、阳极氧化法及干涉曝光法中的至少一种在原版中嵌入与凹版150的表面形状对应的形状。

接着，使凹版150的下表面与用于形成细胞片形成用构件100的基材160的表面111相对。基材160的形成材料为例如热塑性树脂、光固化性树脂。而且，在基材160具有流动性的状态下，将凹版150的下表面按压至基材160的表面111。接着，在抑制基材160的流动性的状态下，将凹版150从基材160的表面111脱模。由此，凹版150的凹部151被转印至基材160的表面111，形成平坦部130和凹凸部140。

出于提高细胞的粘附性的目的，可以在基材160的形成材料即热塑性树脂、光固化性树脂的表面涂布有机物，所述有机物含有例如：层粘连蛋白、胶原、明胶、纤连蛋白、聚赖氨酸(PDL或PLL)、透明质酸等细胞外基质；聚合物；凝胶等粘附因子。另外，作为基材160的形成材料，可以使用多糖类、蛋白质等生物材料。

＜培养细胞片的制造方法＞

对使用细胞片形成用构件100制造的细胞片进行说明。

在满足上述(A)的细胞片形成用基材中，如图3的(a)所示，保持于细胞片形成用构件100的细胞悬浮液的细胞为优先对平坦部130粘附的细胞S1，也为虽然相较于平坦部130占劣势但是允许对凹凸部140粘附的细胞S2。或者，保存于细胞片形成用构件100的细胞悬浮液的细胞为优先对凹凸部140粘附的细胞S2，也为虽然相较于凹凸部140占劣势但允许对平坦部130粘附的细胞S1。

在该情况下，如图3的(b)所示，平坦部130及凹凸部140沿第一方向延伸、并在第二方向上交替地配置。因此，在细胞片形成用构件的表面111，例如优先粘附于平坦部130的细胞S1的取向性通过平坦部130的结构及对其进行划分的凹凸部140的结构来调控。

而且，在被彼此相邻的平坦部130夹持的凹凸部140中，通过虽然相较于平坦部130占劣势但粘附至凹凸部140的细胞S2来反映由平坦部130进行的取向性调控。结果如图3的(c)所示那样形成取向性被调控至第一方向的细胞S1、S2在表面111的整体上展开的培养细胞片SA。

或者，优先粘附于凹凸部140的细胞S2的取向性通过凹凸部140的结构及对其进行划分的平坦部130的结构来调控。而且，在被彼此相邻的凹凸部140夹持的平坦部130中，通过虽然相较于凹凸部140占劣势但粘附至平坦部130的细胞S1来反映由凹凸部140进行的取向性调控。结果如图3的(c)所示那样形成取向性被调控至第一方向的细胞S1、S2在表面111的整体上展开的培养细胞片SA。

[化合物或药物的评价方法]

本实施方式的化合物或药物的评价方法中，使作为评价对象的化合物或药物作用于上述的培养细胞片。

优选的是：通过使作为评价对象的化合物或药物作用于培养细胞片，并且对选自培养细胞片的生理学特性的变化及运动功能的变化中的至少一种变化进行评价，从而对化合物或药物进行评价。作为生理学特性的变化，可例示上述的钙瞬变的观察中的BR、Duration、Interval、钙瞬变的峰高度(Intensity)等的变化，作为运动功能的变化，可例示基于上述的活细胞成像观察得到的BR、CV、RV、CRD、收缩时间(Contraction duration)、松弛时间(Relaxation duration)等的变化。

进行评价时的培养细胞片的培养天数并无特别限定，从使心肌细胞的成熟度更高的观点出发，适合使用培养天数为15天左右的培养细胞片来进行评价。

作为评价对象的化合物或药物并无特别限定，但优选为已知对心肌细胞具有作用的现有化合物或其候选化合物，优选为例如选自由INa阻断剂、Ikr阻断剂、Iks阻断剂、ICa阻断剂、5-HT4受体激动剂、α受体阻断剂、β受体阻断剂、α受体激动剂、β受体激动剂、毒性物质、抗癌剂、脂质代谢抑制剂、磷酸二酯酶3抑制剂及其他生理活性物质(例如蛋白质、肽、抗体、DNA、RNA等)组成的组中的至少一种现有化合物或其候选化合物。

作为现有的INa阻断剂，可例示奎尼丁、普萘洛尔(Propranolol)。

作为现有的Ikr阻断剂，可例示E-4031、奎尼丁、索他洛尔、西沙必利、苄普地尔(Bepridil)。

作为现有的Iks阻断剂，可例示苄普地尔、色原烷醇。

作为现有的β阻断剂，可例示索他洛尔、普萘洛尔、卡维地洛(Carvedilol)。

作为现有的α阻断剂，可例示卡维地洛。

作为现有的β受体激动剂，可例示异丙肾上腺素。

作为现有的磷酸二酯酶3抑制剂，可例示米力农。

[培养细胞片的品质评价方法]

根据本实施方式的培养细胞片的品质评价方法，可以提供关于由心肌细胞构成的培养细胞片是否为成熟化推进且用于再生医疗的培养细胞片、或者能够适合用于化合物或药物的评价方法的培养细胞片的品质评价方法。另外，通过在培养细胞片的制造方法中具有上述品质评价方法作为一个工序，从而可以提供品质更优异的培养细胞片。即，在本实施方式中，也优选整合上述品质评价方法作为培养细胞片的制造方法的一个工序。

优选满足下述(i)～(xii)中的至少一者，更优选至少满足(i)且满足(ii)～(xii)中的至少一者，进一步优选满足全部的(i)～(xii)。

(iii)满足以下的要件A1及要件A2中的至少任一者。

要件A1：MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(MYL3/ACTB)为12.0以上。在培养第7天以后，MYL3/ACTB优选为12.0以上。

要件A2：MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋白重链6)基因的表达量之比(MYH7/MYH6)为6.0以上。在培养第7天以后，MYH7/MYH6优选为6.0以上。

(iv)满足以下的要件B1及要件B2中的至少任一者。

要件B1：CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(CKM/ACTB)为1.80以上。在培养第15天～第45天，CKM/ACTB优选为1.80以上。

要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与ACTB的基因表达量之比(LDHA/ACTB)为0.80以上。在培养第7天以后，LDHA/ACTB优选为0.80以上，更优选为1.2以上。

(v)满足以下的要件C1～要件C4中的至少任一者。

要件C2：KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员2)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为0.038以上。

要件C3：KCNE1(电压门控钾通道亚家族E调节亚基1)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNE1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为0.003以上。

要件C4：SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)的基因表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为0.87以上。

(vi)满足以下的要件D1～要件D4中的至少任一者。

(vii)满足以下的要件E1～要件E8中的至少任一者。

(viii)每个细胞的线粒体的面积为200μm²以上。

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)

实施例

以下，为了具体地说明本发明而列举实施例，但是本发明不限定于这些实施例。

(1)源自iPS细胞的心肌细胞的培养-1(CM1)

作为源自人iPS细胞的心肌细胞，使用了iCell心肌细胞(iCell Cardiomyocytev1.0、FUJIFILM Cellular Dynamics公司制)(以下记作CM1)。培养按照以下步骤来实施。

冻结细胞样品在37℃的水浴中加温3分钟，使其融化。细胞液转移至50mL离心管中，加入预先加温至37℃的平板培养基(iCell心肌细胞解冻用培养基、FUJIFILM CellularDynamics公司制)9mL进行混合，对细胞液进行了稀释。

采集一部分经稀释的细胞悬浮液，与等量的锥虫蓝(Trypan Blue)混合，使用血细胞计数器，测定了活细胞数。细胞使用平板培养基调节浓度至1×10⁶cells/2mL(＝5×10⁵/mL)，对预先涂布有明胶的6孔板接种各2mL。

关于培养容器的明胶涂布，将已灭菌的0.1％明胶溶液加入容器(2mL/孔)中，在37℃静置一小时。在使用前去除明胶溶液再接种细胞。

接种后的细胞在37℃的CO₂培养箱(incubator)中静置，以接种当天作为0天，在培养第3天进行培养基更换。

为了在培养第5天进行再接种，将细胞用胰蛋白酶剥离并回收。采集一部分所回收的细胞悬浮液，与等量的锥虫蓝混合，测定活细胞数。细胞使用平板培养基来调节浓度，以8×10⁴个细胞/孔的浓度对预先加入0.05mg/mL的纤连蛋白40μL涂布2小时以上的96孔板接种各0.1mL。96孔板使用ND Cell Aligner(取向性培养板、96孔板型)，作为对照，使用培养面为平坦形状的市售96孔板(平面培养板)。

接种后的细胞在37℃的CO₂培养箱中静置4小时，每两天使用维持培养基(iCell心肌细胞维持用培养基、FUJIFILM Cellular Dynamics公司制)进行培养基更换，进行规定时间的维持培养。

(2)源自iPS细胞的心肌细胞的培养-2(CM2)

作为源自人iPS细胞的心肌细胞，使用了iCell心肌细胞(iCell Cardiomyocytev2.0、FUJIFILM Cellular Dynamics公司制)(以下记作CM2)。培养按照以下步骤来实施。

冻结细胞样品在37℃的水浴中加温3分钟，使其融化。细胞液转移至50mL离心管中，加入预先加温至37℃的平板培养基9mL进行混合，对细胞液进行了稀释。采集一部分经稀释的细胞悬浮液，与等量的锥虫蓝混合，使用血细胞计数器，测定了活细胞数。

细胞浓度使用平板培养基进行调整，以6×10⁴个细胞/孔的浓度接种至预先涂布了纤连蛋白的96孔板。96孔板为ND Cell Aligner(取向性培养板、96孔板型)，作为对照，播种于培养面为平坦形状的市售96孔板(平面培养板)。

在37℃的CO₂培养箱中静置4小时后，使用维持培养基进行培养基更换。对于培养基更换后的细胞，每两天进行培养基更换，进行规定时间的维持培养。

上述(1)及(2)中使用的ND Cell Aligner具有平坦部及凹凸部，各平坦部具有沿第一方向延伸的形状、并且在表面的整体上沿与第一方向交叉的第二方向排列，各平坦部的宽度(第二方向上的长度)为10μm。各凹凸部由填埋彼此相邻的平坦部之间的多个高度差结构构成，各平坦部间的第二方向上的长度为10μm，凹凸部中的凸部的间距为300nm。使用AFM测定凹凸部中的各凸部的高度得到的结果为：从凹部的底面至凸部的前端的高度平均为446nm。另外，从凹部的底面至平坦部的高度平均为455nm。

(3)取向性的解析

使用经维持培养的iCell心肌细胞CM2，对于第15天、第30天、第45天、第60天的细胞，用抗α-辅肌动蛋白抗体对肌节(sarcomere)结构进行免疫染色，并使用Hoechst33342对核进行了染色。使用荧光显微镜，取得荧光图像。

免疫染色按照以下步骤来实施。从培养规定天数的孔板中去除培养基，用PBS对细胞进行清洗。接着，加入4％-低聚甲醛进行固定。用PBST(0.1％tween20)对细胞进行清洗后，加入作为一次抗体的抗α-辅肌动蛋白抗体(abcam公司制、Anti-SarcomericαActininantibody[EA-53])，使其在4℃反应一夜。用PBST(0.1％tween20)进行清洗，除去一次抗体后，加入二次抗体(Alexa Fluor 647标记、life technologies公司制、Alexa Fluor(R)647F{ab}₂山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体片段)，使其反应。接着，添加经稀释的Hoechst33342，对核进行了染色。

荧光图像的取得在60倍(物镜)下进行，肌节在激发波长640nm/荧光波长685nm下进行检测，核在激发波长405nm/荧光波长461nm下进行检测。

从用60倍的物镜观察得到的图像(尺寸：215μm×215μm的面积)中，使用图像解析软件(A-ZO-KUN、旭化成工程株式会社制)的角度分布解析，检测用α-辅肌动蛋白检出的棒状结构体，求得将图像的水平方向设为0°时棒状结构体的角度分布(0～180°)。

由角度分布的众数值的角度±15°的范围内所含的棒状结构体的数量和测定范围内所含的棒状结构体的总数，按照下式求得取向度。

取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×100

图像解析在n＝3～6下实施，求得平均值。在培养天数第15天和第30天，使用从不同的多个孔中取得的图像(9等分的分区中，左上的分区)来实施解析。在培养天数第45天和第60天，对从1个孔中取得的图像9等分，使用3个分区(左上、中央、右下的分区)来实施解析。

角度分布解析的结果以每10°所含的棒状结构体的取向度来表示，对取向培养板和平面培养板的包含最高值在内±15°范围的取向度进行了比较。关于统计检验，对取向培养板和平面培养板的取向度进行T检验，确认到：在培养30天以后，取向培养板和平面培养板的取向度在风险率5％下具有显著性差异。

取向度的测定结果是，在培养第15天以后，用取向培养板培养的CM2的取向度比用平面培养板培养的CM2高。在培养天数第30天～第60天，取向培养板的取向度为23％以上。另一方面，平面培养板的取向度不足21％。结果如图4所示。

(4)成熟化确认试验(基因表达)

采集用取向性培养板和平面培养板培养的iCell心肌细胞(CM1)的培养天数第1天、第7天、第15天、第30天、第45天的细胞，进行基因表达解析。

对所采集的细胞进行破碎来提取RNA(使用Takara Bio Inc.制的NucleoSpinRNAPlus XS)，逆转录和文库构建使用了SMART-Seq v4 Low Input Kit。接着，供于RNA测序(综合性基因表达解析)，得到基因表达数据。作为解析程序，使用RaNA-seq(参考文献3：Bioinformatics,2020Mar 10:36(6),1955-1956)。以源自人iPS细胞的心肌的成熟阶段的特征性基因表达变化(参考文献4：Circ.Res.2020Apr 10:126(8),1086-1106)作为评价指标，对用取向性培养板和平面培养板培养的心肌细胞的基因表达量的经时变化进行了比较。

关于下述(4-1)～(4-3)，用于RNA测序的样品是将从5个孔中提取的RNA(以RNA的质量计)等量混合并用于实验。认为基于RNA测序得到的基因表达解析的结果是5个孔的平均值。

另外，关于下述(4-4)～(4-6)，用于RNA测序的样品是对从3个孔中提取的RNA分别进行RNA测序，求得表达量(CPM)的平均值。对于各基因的表达量(CPM)，为了在各培养天数检出在平面培养板和取向培养板中的基因表达量之差，进行了T检验，P值为0.01≤P＜0.05的情况在图中记作*，P值为P＜0.01的情况在图中记作**。

基于RNA测序得到的基因表达解析的结果是，得到如下结果。

(4-1)MYL3/ACTB

用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，在成熟型心肌中表达的MYL3(肌球蛋白轻链3)的基因表达量增加。另一方面，关于假设无论组织和培养期如何均为恒定量表达的ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量，在用取向性培养板培养的CM1和用平面培养板的CM1中处于同等水平。

在各培养板中，培养第7天以后的MYL3基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在取向性培养板中为12.5以上，在平面培养板中为11.4以下(图5)。

(4-2)MYH7/MYH6

作为与从胎儿型心肌到成人型心肌的成熟相伴的同源异构体变化，确认到从MYH6(肌球蛋白重链6)到MYH7(肌球蛋白重链7)的同源异构体转变较为显著。在各培养板中，培养第7天以后的MYH7基因的表达量/MYH6基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为7.1以上，在用平面培养板培养的CM1中为5.4以下(图6)。

(4-3)CKM、CKM/ACTB、COX6A2、COX6A2/ACTB、CKMT2、CKMT2/ACTB、LDHA、LDHA/ACTB

用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，与心肌收缩相关的CKM(肌酸激酶，M-type)、定位于线粒体的蛋白质COX6A2(细胞色素C氧化酶亚基6A2)、CKMT2(线粒体肌酸激酶2)、糖酵解系酶LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的表达量经时性地增加(图7-1、图7-2)。

在培养第15天以后，CKM基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为1161TPM(Transcripts Per Kilobase Million)以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为824TPM以下(图7-1(A))。

在培养第15天以后，COX6A2基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为875TPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为842TPM以下(图7-1(B))。

在培养第30天以后，CMKT2基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为377TPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为325TPM以下(图7-1(C))。

另外，在培养第7天以后，LDHA基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为682TPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为372TPM以下(图7-1(D))。

在各培养板中，培养第15天以后的CKM基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为2.1以上，在用平面培养板培养的CM1中为1.7以下(图7-2(A))。

培养第15天以后的COX6A2基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为1.95以上，在用平面培养板培养的CM1中为1.92以下(图7-2(B))。

另外，培养第15天～第30天的CKMT2基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.68以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.57以下(图7-2(C))。

进而，培养第7天以后的LDHA基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为1.3以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.6以下(图7-2(D))。

(4-4)CACNA2D1、CACNA2D1/ATP1A1、KCNJ2、KCNJ2/ATP1A1、KCNE1、KCNE1/ATP1A1、 SCN5A、SCN5A/ATP1A1

用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，与心肌钙离子通道的形成相关的CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)、与心肌钾离子通道的形成相关的KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员2)、KCNE1(电压门控钾通道亚家族E调节亚基1)、与心肌钠离子通道的形成相关的SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)的表达量经时性地增加(图7-3、图7-4)。

在培养第15天～第30天，CACNA2D1基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为2469CPM(count per million)以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为2004CPM以下(图7-3(A))。

在培养第15天以后，KCNJ2基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为1026CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为926CPM以下(图7-3(B))。

在培养第15天～第45天，KCNE1基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为79CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为42CPM以下(图7-3(C))。

另外，在培养第15天～第45天，SCN5A基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为23580CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为21571CPM以下(图7-3(D))。

在各培养板中，培养第15天～第30天的CACNA2D1基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.085以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.23以下(图7-4(A))。

培养第15天～第30天的KCNJ2基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.038以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.115以下(图7-4(B))。

另外，培养第15天以后的KCNE1基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.003以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.007以下(图7-4(C))。

进而，培养第15天～第30天的SCN5A基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.87以上，在用平面培养板培养的CM1中为2.6以下(图7-4(D))。

(4-5)LPL、LPL/ACTB、ACAT1、ACAT1/ACTB、HADHA、HADHA/ACTB、HADHB、HADHB/ACTB

用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，定位于心肌的线粒体且与脂肪酸的β氧化相关的LPL(脂蛋白脂肪酶)、ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)、HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)、HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的表达量经时性地增加(图7-5、图7-6)。

在培养第15天以后，LPL基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为3832CPM(count per million)以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为3024CPM以下(图7-5(A))。

在培养第30天～第45天，ACAT1基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为3663CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为3357CPM以下(图7-5(B))。

在培养第30天～第45天，HADHA基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为6240CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为5920CPM以下(图7-5(C))。

另外，在培养第15天以后，HADHB基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为8505CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为8072CPM以下(图7-5(D))。

在各培养板中，培养第15天以后的LPL基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.46以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.43以下(图7-6(A))。

培养第15天～第30天的ACAT1基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.47以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.42以下(图7-6(B))。

另外，培养第15天～第30天的HADHA基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.79以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.74以下(图7-6(C))。

进而，培养第15天～第30天的HADHB基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为1.00以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.91以下(图7-6(D))。

(4-6)PPARGC1A、PPARGC1A/HIF1、ESRRA、ESRRA/HIF1、VEGFA、VEGFA/HIF1、APLN、 APLN/HIF1、FABP3、FABP3/HIF1、ESM1、ESM1/HIF1、EMCN、EMCN/HIF1、BCL2、BCL2/ACTB

用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，编码与线粒体生物合成和功能化有关的PGC-1α的PPARGC1A基因(PPARG共激活子1α)、编码与心肌细胞成熟化相关的雌激素相关受体ERR的ESRRA基因(雌激素相关受体α)、编码血管生长因子的VEGFA基因(血管内皮生长因子A)、编码心肌组织中与心脏收缩相关的肌细胞因子的APLN基因(Apelin)、编码心肌中调控长链脂肪酸的摄取的肌细胞因子的FABP3基因(脂肪酸结合蛋白3)、内皮细胞特异性表达的ESM1基因(内皮细胞特异性分子1)、编码由上皮细胞等分泌的粘蛋白样糖蛋白的EMCN基因(内皮粘蛋白)、与线粒体功能调节相关的BCL2基因(BCL2凋亡调节因子)的表达量经时性地增加(图7-7～图7-10)。

在培养第15天以后，PPARGC1A基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为4577CPM(count per million)以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为4282CPM以下(图7-7(A))。

在培养第15天以后，ESRRA基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为3081CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为3061CPM以下(图7-7(B))。

在培养第7天以后，VEGFA基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为3737CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为3237CPM以下(图7-7(C))。

另外，在培养第7天以后，APLN基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为28.7CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为20.7CPM以下(图7-7(D))。

在培养第15天以后，FABP3基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为28788CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为28529CPM以下(图7-9(A))。

在培养第30天以后，ESM1基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为40CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为1.3CPM以下(图7-9(B))。

在培养第15天以后，EMCN基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为24.6CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为1CPM以下(图7-9(C))。

在培养第7天以后，BCL2基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为83.3CPM以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为58.3CPM以下(图7-9(D))。

在各培养板中，培养第7天以后的PPARGC1A基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.86以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.80以下(图7-8(A))。

培养第7天以后的ESRRA基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.57以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.54以下(图7-8(B))。

另外，培养第7天以后的VEGFA基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.71以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.64以下(图7-8(C))。

进而，培养第7天以后的APLN基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.013以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.004以下(图7-8(D))。

进而，培养第7天以后的FABP3基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为5.3以上，在用平面培养板培养的CM1中为5.2以下(图7-10(A))。

进而，培养第7天以后的ESM1基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.001以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.0003以下(图7-10(B))。

进而，培养第7天以后的EMCN基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.003以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.001以下(图7-10(C))。

进而，培养第7天～第30天的BCL2基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.018以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.012以下(图7-10(D))。

(5)成熟化确认试验线粒体活性的确认

使用经维持培养的iCell心肌细胞CM2，对于第9天的细胞，用膜电位依赖性荧光色素Mito-tracker Red(Thermo Fisher Scientific公司制、M7510)，对线粒体进行染色，并使用Hoechst33342对核进行染色。关于染色，从孔板中除去培养基，加入用维持培养基稀释至规定浓度的Mito-tracker Red，在37℃的CO₂培养箱中静置30分钟后，加入用维持培养基稀释至规定浓度的Hoechst33342，在37℃的CO₂培养箱中静置30分钟。在观察前用培养基进行清洗，使用共聚焦荧光显微镜(共聚焦定量成像细胞计CQ1、横河电机株式会社制)，取得荧光图像。

图像的取得在倍率60倍(物镜)下进行，线粒体在激发波长561nm/荧光波长617nm下检测，核在激发波长405nm/荧光波长461nm下检测。

图像的解析使用解析软件(CellPathfinder、横河电机株式会社制)。从物镜倍率60倍下观察得到的视野的测定范围(尺寸：215μm×215μm的面积)中测定在荧光波长617nm下检测的面积和强度，测定在荧光波长461nm下检测的核数。

需要说明的是，荧光波长617nm的检测值是CQ1的摄相机的检测器检出的值，面积(Area)是荧光波长617nm所检出的面积的总和(单位：μm²)，亮度(Intensity)是检测器检出的明亮度值的总和。亮度(明亮度)是以满刻度(full scale)在同一条件下测定的。

解析在n＝6～10下实施。面积(Area)和亮度(Intensity)用核数进行校正，对每个细胞的面积(Area)和亮度(Intensity)进行比较。统计检验进行T-检验，确认到在风险率1％下具有显著性差异。

需要说明的是，面积(Area)是指线粒体的数量，亮度(Intensity)表示线粒体的活性。结果如图8所示。误差棒显示标准误差。

如图8所示，在培养第9天，用取向培养板培养的CM2中线粒体数、线粒体活性均比用平面培养板培养的CM2显著上升。

另外，在图9中显示培养第9天的用取向培养板培养的CM2和培养第9天的用平面培养板培养的CM2的荧光图像。蓝色显示核，红色显示线粒体。从照片可知：在用取向培养板培养的CM2中，线粒体数及线粒体活性上升。

(6)成熟化确认试验基于使用活细胞成像装置的运动试验法进行的解析

为了检测与接种至各培养板的心肌细胞的收缩/松弛相伴的运动变化，用SI8000(索尼株式会社制)取得了动画数据。关于测定条件，在相位差图像、倍率10倍(物镜)、150帧/秒、分辨率2048×2048像素、8位深度下进行。以图像取得时间为10秒来进行。细胞使用以接种当天作为第0天而维持培养至第15天、第31天、第45天、第61天的CM2。

从动画数据中检出与心肌细胞的收缩/松弛相伴的运动矢量(速度、方向、数量)，对各参数(心率(beating rate；BR)、收缩速度(contractile velocity；CV)、松弛速度(relaxation velocity；RV)、心搏时间(contraction-relaxation duration；CRD)、取向度)进行了解析。

关于取向度，求出将图像水平方向设为0℃时的运动矢量的角度，并求出显示从矢量角度的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量与所检出的矢量数的总和之比，从而根据下述式进行计算。

取向度(％)

＝(众数值的±5°范围所含的矢量的数量)/(矢量的总数)×100

在图10中显示运动矢量的角度及其频率的测定结果的一例。

在图11-1中显示将细胞接种到各培养板并维持培养的CM2的结果。

用取向性培养板培养的CM2与用平面培养板培养的CM2相比，在培养第15天～第61天，心率(BR)、松弛速度(RV)显著地上升，在培养第31天以后，确认到搏动时间(CRD)有缩短的倾向。在培养第15天～第61天，显示细胞的取向度的矢量方向分布度(众数值±5°)得以维持在显著高的水平。

需要说明的是，心率(BR)越高，则越接近成熟心肌细胞，收缩速度(CV)及松弛速度(RV)越快，则越接近成熟心肌细胞，搏动时间(CRD)越短，则越接近成熟心肌细胞。

此时的收缩速度(CV)与松弛速度(RV)之比如图11-2所示。在用取向培养板培养的CM2中，在培养第15天～培养第45天的期间，收缩速度(CV)与松弛速度(RV)之比(CV/RV)为1.8～2.5。另一方面，在用平面培养板培养的CM2中为3.1～3.5。

根据以上的结果，在用取向培养板培养的CM2中收缩速度(CV)与松弛速度(RV)之比(CV/RV)包含在如下范围内。

(式)1.0≤CV/RV≤2.8

需要说明的是，关于矢量方向分布度，在表1中显示第15天的众数值±1.25°、±5°、±10°时的取向度。在众数值±1.25°时，取向培养板/平面培养板之比最高，平面培养板相对于理论值之比最高，解析对象的取向角小的情况认为是由于噪音的影响变大。在众数值±5°与±10°的比较中，平面培养板相对于理论值之比为±5°＞±10°，但是取向培养板/平面培养板之比为±5°＞±10°，因此评价了众数值±5°的取向度作为容易出现取向度倾向的范围。

[表1]

表1

(7)成熟化确认试验使用共聚焦成像装置的Ca-成像解析

利用CQ1(共聚焦荧光显微镜、横河电机株式会社制)对与接种至各培养板的心肌细胞的收缩相伴的Ca荧光强度变化进行了测定。

为了使Ca离子通量(Ca ion flux)可视化，向CM2中添加荧光Ca指示剂(EarlyToxcarditotoxicity kit、Molecular Devices公司制)，在37℃静置15分钟。关于CQ1的测定条件，在激发波长488nm/荧光波长525nm、数据取得时间60秒下进行。另外，在解析中使用CellPathfinder。

细胞使用以接种当天作为第0天而维持培养至第5天的CM2。从测定数据中选择钙瞬变波形峰的20％高度的线宽(Duration)、波形峰的间隔(Interval)作为参数，进行了解析。

用取向性培养板培养的CM2与用平面培养板培养的CM2相比，钙瞬变的波形峰的20％高度的线宽(Duration)和钙瞬变的波形的间隔(Interval)显著地延长(图12(A))。

另外，关于Duration与Interval的平方根的关系，如图12(B)所示。

根据以上的结果，在用取向培养板培养的CM2中，峰的20％高度的线宽(Duration)与波形的间隔(Interval)的平方根之比包含于以下范围。

Duration/(Interval)^1/2≥0.68

据报道钙瞬变持续时间(20％高度的线宽(Duration))与动作电位持续时间具有相关性。一般而言，在所培养的心肌细胞中存在分化度越高则动作电位持续时间越长的倾向。因此认为取向培养板比平面培养板更推进成熟化。

Interval的时间受到心搏的影响，因此通常使用用心率校正后的值，随之，Interval使用(Interval)^1/2的数值来计算。

(8)成熟化确认试验基于膜片钳法进行的细胞内电位的测定

按照上述的步骤，将CM2以6×10⁴个细胞/孔的浓度接种至取向培养板、平面培养板。此时，各培养板不是96孔板，而是将底面膜切取成尺寸4mm×4mm的小片并将其设置于市售的96孔板的底面来使用。关于基于膜片钳试验进行的细胞内电位的测定，对于25℃的Tyrode溶液中的CM2，在电流钳下以0.2Hz向细胞内投入20pA～100pA的电流，使其产生动作电位。需要说明的是，所提供的电流选择可观察到正常的电位变化的电流。

作为结果，将2例代表例示于图13中。用取向培养板培养的CM2是使用培养第8天的细胞的结果，用平面培养板培养的CM2是使用培养22天的细胞的结果。用取向培养板培养的CM2的细胞内电位与用平面培养板培养的CM2相比，动作电位持续时间更长，最大舒张期电位也更深。

用取向培养板培养的CM2的动作电位80％再极化持续时间为791ms，最大舒张期电位为-68.6mV。另一方面，用平面培养板培养的CM2的动作电位80％再极化持续时间为478ms，最大舒张期电位为-57.9mV。

关于源自人的正常分离心室肌细胞中的动作电位，其持续时间与用取向培养板培养的CM2同样长，最大舒张期电位(静息膜电位)比用取向培养板培养的CM2更深(Circulation，2013；127：575-584)。由此可以说用取向培养板培养的CM2比用平面培养板培养的CM2更接近正常心肌细胞的动作电位。

(9)药剂安全性试验-1

使用iCell心肌细胞CM2，研究了常用于引起心肌副作用的四种药剂的容量依赖作用。

按照上述的步骤，将CM2以5×10⁴个细胞/孔的浓度接种至取向培养板(96孔板、NDCell Aligner)、平面培养板(96孔板)。在37℃的CO₂培养箱中进行维持培养，以接种当天作为第0天，在第5天或第6天施用药剂。

药剂使用E-4031、奎尼丁(Quinidine)、西沙必利(Cisapride)、异丙肾上腺素(Isoproterenol)。将药剂溶解于DMSO中，进行累积施用。首先，作为剂量0，在未添加药剂的状态下进行测定。在测定后立即将溶解于DMSO的药剂按照剂量1的浓度添加至各孔中，在15分钟后进行测定。接着，在测定后立即将对应各孔的药剂按照成为剂量2的浓度的方式添加至同一孔中，在15分后进行测定。关于剂量3，也同样地进行操作。

将药剂的种类、作用机制及浓度示于以下的表中。

[表2]

表2

关于药剂施用后的细胞的响应性，实施基于使用共聚焦成像装置(CQ1、横河电机株式会社制)的Ca-成像进行的心律不齐测定法、使用活细胞成像装置(SI8000、索尼株式会社制)的运动试验法，调查了对搏动率及搏动峰的线宽的影响。

(9-1)基于使用活细胞成像装置的运动试验法进行的测定

按照以下步骤来进行。

使用维持培养第5天的CM2，首先，作为剂量0，在未添加药剂的状态下用SI8000(索尼株式会社制)取得动画数据。在测定后立即将剂量1的浓度的各种药剂添加至同一孔板，在15分钟后取得动画数据。关于剂量2和剂量3，也同样地累积施用药剂，取得动画数据。各药剂的添加试验在n＝6下进行。

从SI8000的动画数据中解析搏动率(BR)、收缩速度(CV)、松弛速度(RV)、收缩松弛间隔(CRD)，并比较了药剂对细胞运动的影响。为了校正由搏动率(BR)引起的变动，参照Frederica式，按照下式校正了收缩松弛间隔(CRD)。

CRD/(60/BR)^1/3

关于差异显著性检验，在平面培养板和取向培养板中，在添加了DMSO的对象组和药剂添加组间进行了T检验。

关于从SI8000的参数变化观察到的副作用，记录了早期后除级(earlyafterdepolarization；EAD)和延迟后(delayed afterdepolarization；DAD)、小的规则波形(VT-like)、反应(波形)消失。未被分类为EAD、DAD的波形变化记载为心律不齐。另外，表中的“-”显示未发生心律不齐等的状态。

关于心律不齐的程度，EAD为轻度，DAD为中度，vt-like为重度。记载为“心律不齐”的情况为轻度。

E-4031(Ikr的阻断剂)

用平面培养板培养的CM2、用取向培养板培养的CM2均因E-4031的添加而减小了搏动率(BR)、收缩速度(CV)、松弛速度(RV)。在取向培养板、平面培养板中，CRD(用心率进行校正)均在中浓度(剂量2、0.3μM)、高浓度(剂量3、1μM)下显示出显著地缩短(图14(A))。在平面培养板中更显著地缩短。

在用平面培养板培养的CM2中，6个孔中的6个孔均发生了心律不齐，但是在用取向培养板培养的CM2中，6个孔中的1个孔发生了心律不齐(表3-1、表3-2)。

关于心律不齐的发生率，在用取向培养板培养的CM2中，低浓度(剂量1、0.1μM)下为1/6，中浓度(剂量2、0.3μM)下为1/6、高浓度(剂量3、1μM)下为1/6。另一方面，在用平面培养板培养的CM2中，低浓度(剂量1、0.1μM)下为3/6，中浓度(剂量2、0.3μM)下为5/6，高浓度(剂量3、1μM)下为6/6，具有在用取向培养板培养的CM2中低、在用平面培养板培养的CM2中高的倾向。

[表3-1]

表3-1

[表3-2]

表3-2

异丙肾上腺素(β受体激动剂)

应用1、3、10μM的异丙肾上腺素。BR和RV在用取向培养板培养的CM2、用平面培养板培养的CM2中具有增加的倾向，CV在用平面培养板培养的CM2、用取向培养板培养的CM2中均变化不明显。CRD(用心率进行校正)在取向培养板、平面培养板中在低浓度(剂量1、1μM)、中浓度(剂量2、3μM)、高浓度(剂量3、10μM)下延长。在取向培养板中，显示与溶剂(DMSO)相似的变动，但是平面培养板与溶剂(DMSO)的差异较大，认为这是由于出现了药剂的影响(图14(B))。

另外，在任一浓度下，均未观察到心律不齐等。

(9-2)基于Ca-成像进行的心律不齐测定

按照以下步骤来进行。

向维持培养第6天的CM2中添加荧光Ca指示剂(EarlyTox carditotoxicity kit、Molecular Devices公司制)，对活细胞进行了染色。首先，作为剂量0，在未添加药剂的状态下用CQ1测定了与心肌细胞收缩相伴的Ca荧光强度的变化。在测定后立即将剂量1的浓度的各种药剂添加到同一孔板中，在15分钟后测定了Ca荧光强度的变化。关于剂量2和剂量3，也同样地累积施用药剂，测定了Ca荧光强度的变化。各药剂的添加试验在n＝6下进行。

使用将用CQ1测得的钙瞬变的波形的峰设为100％时的20％波形宽度(Duration)、峰间的间隔(Interval)、峰高度(钙瞬变的蜂)的数据，在接种至平面培养板和取向培养板并培养了6天的CM2中，比较了药剂的作用。差异显著性检验在用平面培养板培养的CM2和用取向培养板培养的CM2中在添加了DMSO的对象组和药剂添加组间进行。

关于从钙瞬变的波形变化观察到的副作用，记录了早期后除级(earlyafterdepolarization；EAD)和延迟后除级(delayed afterdepolarization；DAD)、小的规则波形(VT-like)、反应(波形)消失。另外，表中的“-”显示未发生心律不齐等的状态。关于心律不齐的程度，EAD为轻度，DAD为中度，vt-like为重度。

E-4031(Ikr的阻断剂)

关于钙瞬变的Duration，在0μM下，用取向培养板培养的CM2比用平面培养板培养的CM2略长(显著)，在0.1μM下，用平面培养板培养的CM2略长，在0.3μM下，用平面培养板培养的CM2比用取向培养板培养的CM2显著地变长，在1μM下，虽然不显著但用平面培养板培养的CM2明显延长。

由这些结果可以说E-4031的添加对IKr阻断的影响更容易出现在用平面培养板培养的CM2中，而在用取向培养板培养的CM2中较较少(图15-1)。

关于中度～重度的心律不齐(DAD、VT-like)的发生率，在用取向培养板培养的CM2中，在低浓度(剂量1、0.1μM)下为0/6，在中浓度(剂量2、0.3μM)下为1/6，在高浓度(剂量3、1μM)下为4/6。在用平面培养板培养的CM2中，在低浓度(剂量1、0.1μM)下为3/6，在中浓度(剂量2、0.3μM)下为6/6，在高浓度(剂量3、1μM)下为6/6，具有在用取向培养板培养的CM2中低、在用平面培养板培养的CM2中高的倾向(表4-1、表4-2)。

[表4-1]

表4-1

[表4-2]

表4-2

奎尼丁(INa阻断剂、Ikr阻断剂)

在奎尼丁3、10、30μM下就同样的作用进行研究的结果如下述的图15-2所示。在中浓度(剂量2、10μM)下，在用平面培养板培养的CM2中观察到比用取向培养板培养的CM2更强的Duration、Interval的延长、显著弱的蜂高的降低。在高浓度(剂量3、30μM)下，收缩力极度降低，变化为频率高的波形，因此未示于图中。

关于中度～重度的心律不齐(DAD、VT-like)的发生率，在用取向培养板培养的CM2中，在低浓度(剂量1、3μM)下为0/6，在中浓度(剂量2、10μM)下为0/6，在高浓度(剂量3、30μM)下为6/6。在用平面培养板培养的CM2中，在低浓度(剂量1、3μM)下为0/6，在中浓度(剂量2、10μM)下为0/6，在高浓度(剂量3、30μM)下为4/6，具有在取向培养板中略高的倾向(表5-1、表5-2)。虽然心律不齐的发生率具有在取向培养板中略高的倾向，但是Duration、Interval的变化在用取向培养板培养的CM2中较小，由此认为不易出现药剂的影响。

[表5-1]

表5-1

[表5-2]

表5-2

西沙必利(Ikr的阻断剂、5-HT4受体激动剂)

对于0.01、0.03、0.1μM的西沙必利的作用进行了研究。Duration、Interval均发生用量依赖性地延长(图15-3)。在用取向培养板培养的CM2中，在剂量0下显示的值与在剂量3下显示的值之差比用平面培养板培养的CM2小。认为这是由于：用取向培养板培养的CM2与用平面培养板培养的CM2相比，对西沙必利具有耐受性。

心律不齐的发生在取向培养板的低浓度(剂量1、0.01μM)～高浓度(剂量3、0.1μM)下为1/6。在平面培养板中未发生心律不齐(表6-1、表6-2)。

心律不齐的发生率具有在取向培养板略高的倾向，但是Duration、Interval的变化在用取向培养板培养的CM2中较小，由此认为不易出现药剂的影响。

[表6-1]

表6-1

[表6-2]

表6-2

异丙肾上腺素(β受体激动剂)

对1、3、10μM的异丙肾上腺素的作用进行了研究。Duration、Interval均观察到减少(图15-4)。但是，在平面培养板中的Duration的减少较小。该Duration的减少作用是可以在β受体刺激中观察到的典型的反应。

异丙肾上腺素即使在高浓度(剂量3、10μM)下也不会发生心律不齐。用取向培养板培养的CM2和用平面培养板培养的CM2具有相同的倾向。

DMSO(溶剂)

在溶剂的情况下，Duration轻度地延长。该作用对药物效果没有带来显著的影响(图15-5)。

着眼于动作电位的Duration的延长最为典型的IKr阻断剂的E-4031、类似的作用时，与用平面培养板培养的CM2相比，在用取向培养板培养的CM2中更不易确认到高用量的E-4031下的Duration延长作用，由此认为具有副作用容易出现在用平面培养板培养的CM2中、不易出现在用取向培养板培养的CM2中的倾向。

在大部分的试验体系中，药物适应前的钙瞬变的Duration在用取向培养板培养的CM2中长、在用平面培养板培养的CM2中短，这暗示着动作电位持续时间也同样。该持续时间的延长一般还与心肌细胞的成熟化相关，即使在第6天，也能清楚看到在用取向培养板培养的CM2和用平面培养板培养的CM2中发生了功能变化(取向培养板的分化促进)。

(10)药剂安全性试验-2

将iCell心肌细胞CM2培养15天，在更成熟的状态下，研究了常用于引起心肌副作用的两种药剂的容量依赖作用。

按照上述的步骤，将CM2以6×10⁴个细胞/孔的浓度接种至取向培养板(96孔板、NDCell Aligner)、平面培养板(96孔板)。在37℃的CO₂培养箱中进行维持培养，以接种当天作为第0天，在第15天施用药剂。

药剂使用异丙肾上腺素(Isoproterenol)、米力农(Milrinone)。将药剂溶解于DMSO，进行施用。首先，作为剂量0，在未添加药剂的状态下进行测定。在测定后立即将溶解于DMSO的药剂按照各剂量的浓度添加到各孔中，在经过一定时间后进行测定。将药剂的种类、作用机制及浓度示于以下的表中。

[表7]

表7

关于药剂施用后的细胞的响应性，实施使用活细胞成像装置(SI8000、索尼株式会社制)的运动试验法，调查了对搏动率及收缩速度、松弛速度的影响。

(10-1)基于使用活细胞成像装置的运动试验法进行的测定

按照以下步骤来进行。

使用维持培养第15天的CM2，首先，作为剂量0，在未添加药剂的状态下用SI8000(索尼株式会社制)取得动画数据。在测定后立即将各剂量的浓度的各种药剂添加到同一孔板中，异丙肾上腺素在120分钟后取得动画数据，米力农在15分钟后取得动画数据。各药剂的添加试验在n＝5下进行。

从SI8000的动画数据中解析搏动率(BR)、收缩速度(CV)、松弛速度(RV)，并比较了药剂对细胞运动的影响。

测定数据用未添加药剂的剂量0的平均值进行校正(各测定值/剂量0的测定值)，求出将剂量0的测定值设为1时的相对值。

关于差异显著性检验，将在各药剂添加浓度下的平面培养板和取向培养板的结果与剂量0的结果进行比较，进行了T检验。另外，在药剂添加组中的平面培养板和取向培养板间进行了T检验。关于P值为0.01以下的比较组，在图表中作出了标记。

异丙肾上腺素(β受体激动剂)

用平面培养板培养的CM2、用取向培养板培养的CM2均因异丙肾上腺素的添加而增加了搏动率(BR)、松弛速度(RV)。关于松弛速度，剂量2、剂量3的取向培养板与平面培养板相比有所增加。

收缩速度(CV)在用取向培养板培养的CM2中有所增加，但是在平面培养板中具有减少的倾向。取向培养板的剂量2比药剂添加前显著地增加，并且，在与平面培养板的比较中，剂量2、剂量3的取向培养板显著地增加(图16-1)。

米力农(磷酸二酯酶3抑制剂)

用取向培养板培养的CM2因米力农的添加而增加了搏动率(BR)、收缩速度(CV)、松弛速度(RV)。用平面培养板培养的CM2中，搏动率没有因药剂施用而发生变化，但是收缩速度、松弛速度具有减少的倾向。

用取向培养板培养的CM2的搏动率(BR)在所有剂量下均比药剂添加前显著地增加。松弛速度(RV)在剂量3的取向培养板中比药剂添加前显著地增加。另外，与平面培养板相比显著地增加。收缩速度(CV)在剂量3的取向培养板中比平面培养板显著地增加(图16-2)。

DMSO(溶剂)

在溶剂的情况下，未确认到对药物效果带来显著影响的作用。

如上述(10)所示，将iCell心肌细胞CM2培养15天，在更成熟的状态下，研究了常用于引起心肌副作用的两种药剂的容量依赖作用，由所得的结果表明：通过使用取向培养板，从而观察到收缩速度的显著增加，能够通过取向培养板的使用而对在iCell心肌细胞中难以进行效果验证的正性变力作用进行检测。

(11)药剂安全性试验-3(抗癌剂)

将iCell心肌细胞CM2培养15天，研究了引起对心肌的副作用(中毒性心肌炎、过敏性心肌炎)的抗癌剂的容量依赖作用。

按照与上述的(10)同样的步骤，将CM2以6×10⁴个细胞/孔的浓度接种至取向培养板(96孔板、ND Cell Aligner)、平面培养板(96孔板)。在37℃的CO₂培养箱中进行维持培养，以接种当天作为第0天，在第15天施用药剂。

药剂使用多柔比星(Doxorubicin、蒽环类抗癌剂)。将药剂溶解于DMSO，进行施用。首先，作为事前测定，在未添加药剂的状态下进行测定。在测定后立即将溶解于DMSO的药剂按照3μM的浓度添加到各孔中，在经过24小时、48小时后进行测定。测定与上述(10-1)基于使用活细胞成像装置的运动试验法进行的测定同样地操作。

关于测定数据，将3μM的浓度下的测定值用未添加药剂的事前测定的平均值进行校正(3μM下的测定值/事前测定的测定值)，求出将事前测定的测定值设为1时的变化率。

关于差异显著性检验，将在各时间的药剂添加组的平面培养板和取向培养板的结果与各时间的DMSO添加组进行比较，进行了T检验。另外，在药剂添加组中的平面培养板和取向培养板间进行了T检验。关于P值为0.01以下的比较组，在图表中作出了标记。

作为溶剂使用的DMSO按照最终浓度0.01％进行添加。DMSO的影响通过对DMSO0.01％添加组进行24小时后、48小时后的测定来确认。测定数据与药剂施用组同样地进行处理。

多柔比星(抗癌剂)

用平面培养板培养的CM2、用取向培养板培养的CM2均因多柔比星的添加而增加了搏动率(BR)。48小时后的测定结果与24小时后的测定结果相比有所增加，随着时间的经过，搏动率增加。特别是，在用取向培养板培养的CM2中，通过添加3μM，从而与平面培养板相比，搏动率显著地增加。通过添加DMSO，从而平面培养板和取向培养板均具有搏动率减少的倾向(图17)。

关于CV(收缩速度)，在用取向培养板培养的CM2中确认到有所增加。在24小时后的测定中，与DMSO施用组相比，通过添加3μM，从而CV显著地增加，在24小时后、48小时后的测定中，与平面培养板相比，在用取向培养板培养的CM2中CV显著地增加。通过DMSO的添加，从而平面培养板出现收缩速度减少的倾向，但是取向培养板与药剂施用前没有变化(图17)。

用平面培养板培养的CM2、用取向培养板培养的CM2均因多柔比星的添加而增加了RV(松弛速度)。在48小时后的测定中，与平面培养板相比，在用取向培养板培养的CM2中RV显著地增加。通过DMSO的添加，从而在取向培养板中具有RV增加的倾向，但是平面培养板与药剂施用前没有变化(图17)。

如上述(11)所示，研究了使用抗癌剂多柔比星的容量依赖作用，由所得的结果表明：通过使用取向培养板，从而在搏动率、收缩速度、松弛速度中均出现显著的增加，能够通过取向培养板的使用而检测对心肌的毒性。

(12)氧消耗速率的测定

按照上述的步骤，将CM2以6×10⁴个细胞/孔的浓度接种至取向培养板(96孔板、NDCell Aligner)、平面培养板(96孔板)。在37℃的CO₂培养箱中进行维持培养，以接种当天作为第0天，在第27天测定了氧消耗速率。

测定使用了氧消耗速率平板检测试剂盒(同仁化学株式会社制、E297)。

向培养有CM2的孔板中添加经培养基稀释的氧探针，在预先保温至37℃的读板仪(Plate Reader)内静置30分钟。接着，添加包含终浓度为50μM的抑制脂肪酸代谢酶的β氧化抑制剂即乙莫克舍的样品溶液，立即滴加矿物油，阻断氧的供给。

在保温至37℃的读板仪内静置5分钟后，经时性地测定了荧光强度。关于荧光读板仪的测定条件，在激发波长495nm/荧光波长650nm下，每隔10分钟进行数据取得，并且进行至少168分钟。

关于测定，按照在6个孔中不添加乙莫克舍作为对照、并且在3个孔中添加50μM乙莫克舍来进行。

氧浓度(pmol)通过氧消耗速率平板检测试剂盒附带的计算书来计算、氧消耗速率(pmol/min)由测定开始10～70分钟后的60分钟内的氧浓度减少量来计算。

测定的结果：在平面培养板中，未添加乙莫克舍的OCR为79.1pmol/min，添加乙莫克舍的OCR为77.8pmol/min，通过添加乙莫克舍，从而与添加前的OCR相比，OCR为98.3％。

另一方面，在取向培养板中，未添加乙莫克舍的OCR为63.6pmol/min，添加乙莫克舍的OCR为7.0pmol/min，通过添加乙莫克舍，与添加前的OCR相比，OCR降低至11.0％。

结果如图16所示。图16中，纵轴以未添加乙莫克舍的OCR作为1.0。

根据上述结果，认为本实施方式的培养细胞片与以往的培养细胞片相比更推进成熟化，其结果为：通过使用该培养细胞片，评价对象即化合物或药物的评价方法能够更接近生物体内的评价。

Claims

1.一种培养细胞片，其是由心肌细胞构成的培养细胞片，

心肌细胞具有取向性地配置，

在对所述培养细胞片使用抗α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围(71.6μm×71.6μm)内的用α-辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上，

取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×100(1)。

2.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，在活细胞成像中，显示从运动矢量的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量(取向度)为12％以上。

3.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，所述心肌细胞为源自干细胞的心肌细胞。

4.根据权利要求1所述的培养细胞片，其满足以下的要件A1及要件A2中的至少任一者，

要件A1：MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β-肌动蛋白)基因的表达量之比(MYL3/ACTB)为12.0以上，

5.根据权利要求1所述的培养细胞片，其满足以下的要件B1及要件B2中的至少任一者，

要件B1：CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量与ACTB(β-肌动蛋白)的基因表达量之比(CKM/ACTB)为1.80以上，

6.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，每个细胞的线粒体的面积为200μm²以上。

7.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，将活细胞成像中所检出的收缩速度设为CV(m/sec)、松弛速度设为RV(m/sec)时，满足下述式(2)，

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)。

8.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，在钙成像解析中，将钙瞬变的波形峰高度设为100％时，将20％高度的波形宽度设为Duration(秒)、将峰间的间隔设为Interval(秒)时，满足下述式(3)，

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)。

9.根据权利要求1所述的培养细胞片，其中，构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上，并且最大舒张期电位为-60mV以下。

10.根据权利要求1所述的培养细胞片，其用于再生医疗。

11.一种培养细胞片的制造方法，其是权利要求1～10中任一项所述的培养细胞片的制造方法，

所述制造方法包括使用细胞片形成用构件来培养心肌细胞的步骤，

所述细胞片形成用构件具备用于形成培养细胞片的表面，

所述表面具备多个平坦部和多个凹凸部，

各平坦部具有沿第一方向延伸的形状，并且所述多个平坦部在所述表面的整体上沿与所述第一方向交叉的第二方向排列，

各凹凸部包含填埋彼此相邻的所述平坦部之间的多个高度差结构，所述高度差结构的间距为100nm以上且10μm以下，

所述高度差结构为凸部，

所述凹凸部在被彼此相邻的所述平坦部夹持的凹部的底面具备多个所述凸部，

在细胞片形成用构件的厚度方向上，所述凹凸部中的前端面的高度与所述平坦部的高度之差为0.5μm以下。

12.一种化合物或药物的评价方法，其使作为评价对象的化合物或药物作用于权利要求1～10中任一项所述的培养细胞片。

13.根据权利要求12所述的化合物或药物的评价方法，其对选自培养细胞片的生理学特性的变化及运动功能的变化中的至少一种变化进行评价。

14.根据权利要求12所述的化合物或药物的评价方法，其中，作为所述评价对象的化合物或药物为选自由INa阻断剂、Ikr阻断剂、Iks阻断剂、ICa阻断剂、5-HT4受体激动剂、α受体阻断剂、β受体阻断剂、α受体激动剂、β受体激动剂、毒性物质、抗癌剂及其他生理活性物质组成的组中的至少一种现有化合物或其候选化合物。

15.一种品质评价方法，其是由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法，所述品质评价方法对下述(i)～(viii)中的任一项进行评价，

(i)在对所述培养细胞片使用抗α-辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的图像中，测量将图像水平方向设为0°时处于测定范围(71.6μm×71.6μm)内的用α-辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的角度，其众数值±15°以内所含的棒状结构体的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23％以上，

取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×100(1)；

(ii)在活细胞成像中，显示从运动矢量的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量(取向度)为12％以上；

(iii)满足以下的要件A1及要件A2中的至少任一者，

要件A2：MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋白重链6)基因的表达量之比(MYH7/MYH6)为6.0以上；

(iv)满足以下的要件B1及要件B2中的至少任一者，

要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与ACTB的基因表达量之比(LDHA/ACTB)为0.80以上；

(v)每个细胞的线粒体的面积为200μm²以上；

(vi)将活细胞成像中所检出的收缩速度设为CV(m/sec)、松弛速度设为RV(m/sec)时，满足下述式(2)，

1.0≤CV/RV≤2.8 (2)

(vii)在钙成像解析中，将钙瞬变的波形峰高度设为100％时，将20％高度的波形宽度设为Duration(秒)、将峰间的间隔设为Interval(秒)时，满足下述式(3)，

Duration/(Interval)^1/2≥0.68 (3)

(viii)构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上，并且最大舒张期电位为-60mV以下。