ES2711256T3 - Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber 1 (LCA1) - Google Patents

Abstract

Un vector vírico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleótido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana específico de fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica al menos un primer polipéptido de guanilato ciclasa humana específica de la retina, biológicamente activo, que comprende al menos una primera región de secuencia de aminoácidos contiguos que es al menos idéntica en aproximadamente 95% a una secuencia de al menos 120 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adenoasociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).

Description

DESCRIPCION

Composiciones de rAAV-guanilato ciclasa y metodos para tratar la amaurosis congenita de Leber 1 (LCA1).

Antecedentes de la invencion

Referencia cruzada con aplicaciones relacionadas

La presente aplicacion reivindica la prioridad a la Solicitud de patente provisional de Estados Unidos num.

61/327.521, presentada el 23 de abril de 2010.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere generalmente a los campos de la biologia molecular y la virologia, y en particular, a metodos para usar composiciones de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que expresan al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos un primer producto genico terapeutico, y particularmente aquellos productos utiles en la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas sintomas de enfermedades, trastornos, trauma, lesion o disfuncion del ojo de mamifero. En realizaciones particulares, la invencion proporciona composiciones que incluyen vectores rAAV que expresan un peptido, polipeptido o proteina de guanilato ciclasa biologicamente funcional para usar en uno o mas regimenes investigativos, diagnosticos y/o terapeuticos, que incluyen, por ejemplo, el tratamiento de uno o mas trastornos o enfermedades del ojo de mamifero, y en particular, para tratar la ceguera retiniana congenita, que incluye, distrofia retiniana tal como amaurosis congenita de Leber, tipo 1 (LCA1), en humanos. Tambien se proporcionan metodos para preparar medicamentos de guanilato ciclasa basados en vectores rAAV para usar en terapias genicas basadas en vector virico, que incluyen, por ejemplo vectores rAAV-LCA1 para tratar o mejorar uno o mas sintomas de deficiencia de guanilato ciclasa en humanos. Descripcion de la tecnica relacionada

La amaurosis congenita de Leber (LCA) (anteriormente “amaurosis congenita de Leber”), descrita primero como un tipo congenito de retinitis pigmentosa (RP) por el oftalmologo aleman Dr. Theodor Leber en 1869, es la forma mas temprana y mas grave de retinopatia hereditaria, y explica aproximadamente el 6% de todas las distrofias retinianas hereditarias. LCA es un grupo de enfermedades degenerativas de la retina, y es la causa mas comun de ceguera congenita en los ninos. Esta condicion recesiva autosomica se reconoce normalmente en el nacimiento o durante los primeros meses de vida de un bebe con ceguera total o vision enormemente alterada, fondo normal y electrorretinograma (ERG) extinguido (vease p.ej., Perrault et al., 1996). A pesar de estos deficits funcionales, los pacientes de LCA1 retienen algunos fotorreceptores de bastones y conos en su retina tanto macular como periferica durante anos. Los sintomas de la enfermedad incluyen disfuncion retiniana, movimiento ocular involuntario (nistagmo), vision alterada, respuesta lenta de la pupila, y en ultima instancia, ceguera.

A traves de analisis geneticos, se ha mostrado que las mutaciones en la guanilato ciclasa-1 (Gucy2d), asignada a la posicion LCA1, explican el 20% de todos los casos presentados de LCA (vease p.ej., Milam et al., 2003; Perrault et al., 1996; Perrault et al., 2000). El numero de pacientes afectados por LCA1 es aproximadamente dos veces el de pacientes afectados por defectos en la version de la proteina de 65 kDa especifica del epitelio del pigmento retiniano (RPE65) de la enfermedad (LCA2), que ha conseguido mucha atencion en la comunidad de la terapia genica en anos recientes.

Se estima que 200.000 americanos tienen la enfermedad de Leber tipo 1. Gucy2d codifica la guanilato ciclasa (retGC1) que se expresa en las membranas del segmento externo del fotorreceptor (vease p.ej., Dizhoor et al., 1994; Lui et al., 1994), y juega un papel en la fase de recuperacion de la fototransduccion. Se piensa que las mutaciones que reducen o abolen la actividad de esta enzima crean el equivalente bioquimico de la exposicion cronica a la luz en los fotorreceptores de bastones y conos. LCA se considera normalmente como la consecuencia de o el desarrollo alterado de los fotorreceptores o la degeneracion extremadamente temprana de celulas que se han desarrollado normalmente. La posicion LCA1 (GUCY2D) se ha mapeado en el cromosoma humano 17p 13.1 (LCA1) por mapeo de homocigosidad.

Deficiencias en la tecnica anterior

Actualmente no hay compuestos profilacticos o terapeuticos efectivos disponibles para prevenir o tratar la LCA1 en humanos.

Compendio de la invencion

En un primer aspecto de la presente invencion se proporciona un vector virico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleotido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana especifica del fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos un primer polipeptido de guanilato ciclasa humana especifico de la retina, biologicamente activo, que comprende al menos una primera region de secuencia de aminoacidos contiguos que es al menos aproximadamente identico al 95% a una secuencia de al menos 120 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).

En un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona una composicion que comprende:

(1) el vector rAAV segun la presente invencion; y

(2) un tampon, transporte, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

En un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona el vector de la presente invencion o la composicion de la presente invencion para usar en terapia, preferiblemente para usar en a) la terapia o profilaxis de una distrofia, enfermedad o trastorno humano, que incluye la amaurosis congenita de Leber (LCA1) o b) diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, trastorno, disfuncion o condicion anormal de un ojo de mamifero, o uno o mas sintomas del mismo.

En un aspecto adicional de la presente invencion se proporciona el vector de la presente invencion o la composicion de la presente invencion para usar en un metodo para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, disfuncion, trastorno, deficiencia o condicion anormal en un mamifero, o uno o mas sintomas de los mismos, en la que el mamifero tiene, se sospecha que tiene, esta en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia retiniana.

La presente invencion supera las limitaciones inherentes en la tecnica anterior proporcionando nuevos, no obvios, y utiles constructos geneticos basados en rAAV que codifican uno o mas polipeptidos de mamiferos terapeuticos, y particularmente aquellas proteinas, peptidos, polipeptidos de la familia guanilato ciclasa, para la profilaxis, tratamiento y/o mejora de una o mas enfermedades, trastornos o disfunciones de mamiferos, o uno o mas sintomas de los mismos, que resultan de, o estan exacerbados por, un deficit en, o una deficiencia de, actividad de polipeptido de guanilato ciclasa biologicamente activo. En particular, la invencion proporciona constructos geneticos que codifican uno o mas polipeptidos de guanilato ciclasa especificos de la retina (retGC1) de mamifero, para usar en el tratamiento de dichas condiciones como LCA1, y otras condiciones del ojo tal como formas recesivas y dominantes de distrofia de cono-baston que se manifiestan por una deficiencia o ausencia de niveles fisiologicamente normales de polipeptido de guanilato ciclasa.

La presente descripcion proporciona un vector virico adeno-asociado recombinante (rAAV) que incluye al menos un primer polinucleotido que comprende un promotor unido de forma operable a al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos una primera proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamifero. Preferiblemente, el promotor es un promotor especifico del fotorreceptor (tal como, por ejemplo, un promotor de rodopsina quinasa humana), o un promotor ubicuo (tal como, por ejemplo, un promotor de p-actina de pollo-CMV quimerico truncado). Preferiblemente el primer segmento de acido nucleico codifica al menos una primera proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamifero que comprende, consiste esencialmente en, o de forma alternativa, consiste en, al menos una primera region de secuencia de aminoacidos contiguos que es al menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85% o aproximadamente 90% o mas en identidad con al menos una primera region de secuencia de al menos aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 o mas aminoacidos contiguos de una secuencia como se describe en cualquiera de una o mas de las proteinas guanilato ciclasa de mamifero representadas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

En ciertas realizaciones descritas, el al menos primer segmento de acido nucleico codifica preferiblemente al menos una primera proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamifero que incluye al menos una primer region de secuencia de aminoacidos contiguos que es al menos aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, o aproximadamente 95% o mas de identidad en la secuencia de aminoacidos primaria con al menos una primera region de secuencia de al menos aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140 o aproximadamente 150 O mas aminoacidos contiguos de una secuencia como se describe en cualquiera de una o mas de las secuencias de proteina guanilato ciclasa de mamifero enumeradas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

Preferiblemente, el al menos un primer segmento de acido nucleico codificara al menos una o mas proteinas, peptidos o polipeptidos de guanilato ciclasa de mamifero que cada una incluye preferiblemente al menos una primera secuencia de aminoacidos primarios contiguos que es al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% identica a al menos una primera region de secuencia que incluye al menos aproximadamente 90, aproximadamente 110, aproximadamente 130, aproximadamente 150 o aproximadamente 170 o mas aminoacidos contiguos de al menos una primera proteina guanilato ciclasa como se muestra en una o mas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

Preferiblemente los vectores rAAV de la presente descripcion incluyen al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos una primera protefna, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamffero que comprende, consiste esencialmente en, o alternativamente, consiste en, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de una o mas de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID ⁿO:9, SEQ ID ⁿO:10 y SEQ ID NO:11, o una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a, o especfficamente hibrida con una o mas de dichas secuencias bajo condiciones de hibridacion de rigurosas a altamente rigurosas. Preferiblemente, la primera protefna, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamffero poseera actividad guanilato ciclasa in vitro e in vivo en celulas de mamffero transformadas, y preferiblemente, en celulas huesped humanas transformadas. En aspectos particulares, la protefna, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa poseera una significativa actividad guanilato ciclasa biologicamente activa in vitro e in vivo en celulas de mamffero transformadas, y preferiblemente, en celulas huesped humanas transformadas cuando el segmento de acido nucleico que codifica el peptido, protefna o polipeptido esta unido de forma operable a al menos un primer promotor capaz de expresar la secuencia en una celula huesped de mamffero, y preferiblemente, humana.

Aunque los vectores rAAV de la presente invencion no estan necesariamente limitados a un serotipo particular, en ciertas realizaciones, los inventores contemplan que pueden alcanzarse resultados beneficiosos utilizando un vector rAAV que es uno o mas de los siguientes serotipos conocidos: vector de serotipo 1 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV1), serotipo 2 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV2), serotipo 3 de virus adenoasociado recombinante (rAAV3), serotipo 4 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV4), serotipo 5 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV5), serotipo 6 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV6), serotipo 7 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV7), serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8), o un serotipo 9 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV). En ciertas aplicaciones, los vectores rAAV de la presente invencion pueden ser un vector rAAV auto-complementario (scAAV).

En realizaciones en que se desea un promotor especffico de fotorreceptor, los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden incluir al menos un primer promotor de rodopsina quinasa especffico de fotorreceptor. De forma ejemplar dichos promotores incluyen el promotor de rodopsina quinasa humana, que se ilustra en SEQ ID NO:12. En ciertos aspectos de la invencion, el uso de una secuencia de promotor que incluye al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45 o al menos aproximadamente 50 o mas nucleotidos contiguos de SEQ ID NO:12 se prefiere particularmente cuando se desea la expresion especffica del tejido (y en particular, especffica del fotorreceptor) del constructo terapeutico.

De forma similar, en las realizaciones en que se desea un promotor ubicuo, los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden incluir al menos un primer promotor de p-actina de pollo-CMV quimerico truncado. De forma ejemplar dichos promotores incluyen el promotor de p-actina de pollo-CMV quimerico truncado, que se ilustra en SEQ ID NO:13. En ciertos aspectos de la invencion, el uso de una secuencia de promotor que incluye al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, o al menos aproximadamente 50 o mas nucleotidos contiguos de SEQ ID NO:13 se prefiere particularmente cuando se desea la expresion no especffica de tejido del gen terapeutico.

En algunas realizaciones, la secuencia de promotor empleada en los constructos genicos terapeuticos descritos pueden comprender, consistir esencialmente en, o alternativamente, consistir en, una secuencia de acido nucleico que incluye al menos 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115 o aproximadamente 120 o mas nucleotidos contiguos de las secuencias de promotor descritas o en SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13.

Los vectores de terapia genica descritos en la presente memoria tambien pueden incluir ademas opcionalmente una o mas secuencias reguladoras “corriente arriba” o “corriente abajo”, tal como un primer potenciador unido de forma operable a el al menos un primer segmento nucleico, o una region reguladora de la transcripcion tal como el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota. Los constructos de la invencion tambien pueden incluir ademas opcionalmente una o mas secuencias de intron unidas de forma operable a el al menos un primer segmento nucleico que codifica el agente terapeutico.

Los segmentos de acido nucleico que codifican las protefnas, peptidos y polipeptidos de guanilato ciclasa de mamffero de la invencion pueden derivarse de secuencias naturales, semi-sinteticas o totalmente sinteticas, pero seran preferiblemente de origen mamffero. Fuentes ejemplares de mamffero incluyen, sin limitacion, humana, primates no humanos, murinos, felinos, caninos, porcinos, ovinos, bovinos, equinos, epino, caprino, lupinos y similares.

Los vectores rAAV descritos en la presente memoria pueden estar comprendidos opcionalmente en una partfcula vfrica adeno-asociada infecciosa, un virion, o en una o mas de una pluralidad de partfculas AAV infecciosas. Como tal, la invencion tambien incluye viriones, partfculas vfricas, ademas de celulas huesped recombinantes aisladas que contienen uno o mas de los constructos geneticos de rAAV descritos. Celulas huesped particularmente preferidas para la practica de la invencion incluyen, sin limitacion, celulas huesped de mamifero aisladas que incluyen uno o mas de: un vector rAAV, un virion de AAV, o una pluralidad de particulas viricas infecciosas.

En otros aspectos, la invencion proporciona composiciones nuevas y utiles que incluyen uno o mas de (a) un vector rAAV, un virion de rAAV, una particula virica infecciosa de rAAV, una pluralidad de dichos viriones o particulas infecciosas, o una celula huesped de mamifero aislada que comprende el vector, el virion, la particula infecciosa o una pluralidad de los mismos. Preferiblemente, dichas composiciones incluiran ademas opcionalmente uno o mas tampones, transportes, vehiculos, diluyentes, y similares, farmaceuticamente aceptables, y pueden incluir ademas opcionalmente uno o mas lipidos, liposomas, complejos lipidicos, etosomas, niosomas, nanoparticulas, microparticulas, lipoesferas, nanocapsulas o cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente dichas composiciones se formulan preferiblemente para la administracion al ojo humano, y pueden usarse en terapia o profilaxis, y en la terapia o profilaxis de una distrofia, enfermedad o trastorno retiniano humano (tal como LCA1), en particular.

Como se anota a continuacion, la invencion tambien incluye kits diagnosticos, terapeuticos y profilacticos que incluyen uno o mas de los constructos de vector rAAV descritos en la presente memoria. Dichos kits pueden incluir ademas opcionalmente uno o mas protocolos, regimenes de dosificacion o instrucciones para usar el componente en el diagnostico, prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas sintomas de una distrofia, enfermedad, trastorno o condicion anormal retiniana en un humano. En ciertos aspectos, los kits terapeuticos para el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados con amaurosis congenita de Leber 1 (LCA-1) se contemplan particularmente.

La presente invencion tambien incluye el uso de una o mas de las composiciones basadas en rAAV descritas en la terapia o en la profilaxis de enfermedades o trastornos de mamiferos. Asimismo, la invencion incluye el uso de las composiciones descritas en la fabricacion de un medicamento para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o mas sintomas de una enfermedad, trastorno, disfuncion o condicion anormal de un ojo de mamifero, y en particular, para tratar o mejorar uno o mas sintomas de amaurosis congenita de Leber 1 (LCA-1) en un humano.

La descripcion tambien proporciona un metodo para prevenir, tratar o mejorar uno o mas sintomas de una enfermedad, disfuncion, trastorno, deficiencia o condicion anormal en un mamifero. Dicho metodo generalmente implica administrar a un mamifero que lo necesita, una cantidad efectiva de una composicion de rAAV descrita en la presente memoria durante un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o mejorar el uno o mas sintomas de la enfermedad, disfuncion, trastorno, deficiencia o condicion anormal en el mamifero. Dicho mamifero preferiblemente tiene, se sospecha que tiene, esta en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia retiniana, que incluye, por ejemplo, amaurosis congenita de Leber 1 (LCA-1), o en el que el mamifero esta en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con una o mas deficiencias, defectos o ausencia de proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa funcional, biologicamente activa. El mamifero puede ser de cualquier edad, pero sera mas preferiblemente un neonato, recien nacido, bebe o joven que esta en riesgo de desarrollar o se ha diagnosticado con una distrofia retiniana congenita tal como amaurosis congenita de Leber 1 (LCA-1).

La descripcion tambien proporciona un metodo para proveer a un mamifero con una cantidad terapeuticamente efectiva de un peptido, polipeptido o proteina de guanilato ciclasa de mamifero biologicamente activo a un mamifero que lo necesita. Dicho metodo implica generalmente al menos la etapa de introducir en celulas adecuadas de un mamifero que lo necesita, una cantidad efectiva de uno o mas de los vectores rAAV descritos en la presente memoria, durante un tiempo suficiente para producir un peptido, polipeptido o proteina de guanilato ciclasa biologicamente activo de ellos en al menos una primera poblacion de celulas o al menos un primer tejido del mamifero en que el vector rAAV se ha introducido. En la practica del metodo, el mamifero que lo necesita tendra preferiblemente uno o mas defectos, deficiencias o una sustancial o total ausencia de proteina retGC1 biologicamente activa, funcional, en uno o mas tejidos en o alrededor del cuerpo del mamifero, cuando se compara con el nivel de proteina retGC1 biologicamente activa en un mamifero normal. En ciertas aplicaciones del metodo, una pluralidad de celulas del mamifero se provee con el vector rAAV ex vivo o in vitro, incluyendo ademas el metodo una etapa adicional de introducir posteriormente la pluralidad de celulas provistas en al menos un primer sitio del tejido en o alrededor del cuerpo del mamifero. Por ejemplo, la pluralidad de celulas obtenidas pueden introducirse en al menos un primer sitio en uno o ambos ojos del mamifero, incluyendo por ejemplo, por inyeccion directa en la retina, el espacio sub-retiniano, o a uno o mas tejidos que rodean la retina, o al ojo entero, o a tejidos que rodean el ojo.

En aspectos particulares, la introduccion del constructo genico de guanilato ciclasa vectorizado con rAAV en la celula, y su posterior expresion permite la traduccion del peptido, proteina o polipeptido de guanilato ciclasa funcional, y como resultado, se conservan los fotorreceptores de los conos, y se restaura la funcion mediada por los conos. De forma importante, dicho metodo proporciona un regreso del comportamiento visual normal en el ojo del mamifero, y preferiblemente, un regreso de la vision.

La administracion de los vectores rAAV de la invencion puede ser parte de una terapia de una vez, o puede ser parte de un regimen terapeutico en proceso repetido dos o mas veces durante la vida del sujeto a tratar. En ciertos aspectos, una unica administracion de los constructos de rAAV produce la formacion sostenida de proteina guanilato ciclasa, con conservacion de los fotorreceptores de los conos, y la restauracion de la funcion mediada por los conos y el comportamiento visual durante un periodo de al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, o mas despues de la administracion. Mas preferiblemente, se consigue la terapia o profilaxis a largo plazo usando una o mas administraciones posteriores de los constructos terapeuticos al ojo del mamifero durante periodos de varios meses a varios anos. Preferiblemente, se conservan los fotorreceptores de los conos, y la funcion mediada por los conos y el comportamiento visual se restauran en el mamifero durante un periodo de al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, o mas despues de la administracion. En ciertos aspectos, la conservacion de los fotorreceptores, la funcion mediada por los conos y el comportamiento visual se restauran en el mamifero durante un periodo de al menos un ano, al menos dos anos, al menos tres anos o al menos cuatro anos o mas despues de la terminacion de un regimen de tratamiento que incluye las composiciones descritas en la presente memoria. La invencion proporciona ademas un metodo para aumentar el nivel de proteina retGCI biologicamente activa en una o mas celulas retinianas de un mamifero que tiene, se sospecha que tiene, esta diagnosticado de, o esta en riesgo de desarrollar, LCA1. Dicho metodo generalmente implica introducir en al menos una primera poblacion de celulas retinianas de un mamifero que lo necesita, uno o mas de los constructos de vector virico de rAAV-guanilato ciclasa descritos, en una cantidad y durante un tiempo efectivo para aumentar el nivel de proteina retGCI biologicamente activa en una o mas celulas retiniana del mamifero. Dicho metodo se contempla particularmente para prevenir, tratar o mejorar uno o mas sintomas de distrofia retiniana en un mamifero, y puede implicar preferiblemente administrar directamente o indirectamente a la retina, espacio sub-retiniano o al ojo del mamifero uno o mas de los constructos terapeuticos descritos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar uno o mas sintomas de distrofia retiniana en el mamifero.

La descripcion tambien proporciona composiciones y metodos para prevenir, tratar o mejorar los sintomas de deficiencia de proteina guanilato ciclasa en un mamifero, y particularmente para tratar o reducir la gravedad o extension de la deficiencia en un humano que manifiesta uno o mas de los trastornos unidos a una deficiencia de polipeptidos de guanilato ciclasa biologicamente activos. En un sentido general, el metodo implica la administracion de al menos un primer constructo genetico basado en rAAV que codifica uno o mas peptidos, polipeptidos o proteinas de guanilato ciclasa en un vehiculo farmaceuticamente aceptable al animal en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficiente para tratar o mejorar la deficiencia en el animal sospechoso de sufrir dicho trastorno, o uno o mas sintomas del mismo. Polipeptidos de guanilato ciclasa ejemplares utiles en la practica de la descripcion incluyen, aunque no estan limitados a peptidos, polipeptidos y proteinas que tienen actividad guanilato ciclasa, y que son sustancialmente identicos en la secuencia primaria de aminoacidos a cualquiera de las secuencias descritas en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, y a equivalentes biologicamente funcionales, o derivados de los mismos. Peptidos, proteinas y polipeptidos de guanilato ciclasa ejemplares adicionales utiles en la practica de la invencion incluyen, aunque no estan limitados a aquellos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, una secuencia de aminoacidos que codifica una guanilato ciclasa de mamifero, y particularmente aquellas secuencias como se describen en S^eQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID ⁿ O:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, y a equivalentes biologicamente funcionales, o derivados de los mismos.

Composiciones de vector rAAV-guanilato ciclasa

En una primera realizacion, la descripcion proporciona un vector rAAV que comprende un polipeptido que comprende al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica una proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa, y en particular, una proteina, peptido o polipeptido de guanilato ciclasa de mamifero (o un fragmento o derivado del mismo biologicamente activo), unido de forma operable a al menos un primer promotor capaz de expresar el segmento de acido nucleico en una celula huesped adecuada transformada con dicho vector. En realizaciones preferidas, el segmento de acido nucleico codifica un peptido, polipeptido o proteina de guanilato ciclasa de mamifero, y en particular, una humana, y en particular un peptido, polipeptido o proteina que comprende al menos una primera secuencia de aminoacidos contiguos que es homologa al menos al 90% a al menos una primera secuencia de 30 aminoacidos contiguos de una o mas de las secuencias de aminoacidos descritas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, o un fragmento o variante biologicamente activo de las mismas.

Preferiblemente, el polipeptido comprende al menos una primera secuencia de aminoacidos contiguos que es homologa en al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% a una secuencia de al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o al menos 80 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO:1, y mas preferiblemente, el polipeptido comprende al menos una primera secuencia de aminoacidos contiguos que es homologa en al menos 99% a una secuencia de al menos 90 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO:1.

De forma alternativa, los constructos terapeuticos de la descripcion pueden incluir segmentos de acido nucleico que codifican polipeptidos de guanilato ciclasa de cualquier origen mamifero, tal como por ejemplo acidos nucleicos, peptidos y polipeptidos de origen murino, primate, ovino, porcino, bovino, equino, epino, caprino, canino, felino y/o lupino, o pueden incluir segmentos de acido nucleico modificados o mutagenizados especificamente en el sitio que se obtuvieron inicialmente a partir de una o mas especies de mamiferos, y modificados geneticamente para expresarse en celulas humanas de manera que se retiene su actividad guanilato ciclasa.

En otras realizaciones preferidas, los segmentos preferidos de acido nucleico para usar en la practica de la presente descripcion, codifica un polipeptido de guanilato ciclasa de mamifero, y en particular, uno humano, o un fragmento o variante biologicamente activo del mismo.

Los polinucleotidos comprendidos en los vectores y particulas viricas de la presente descripcion comprenden preferiblemente al menos un primer promotor constitutivo o inducible unido de forma operable a un segmento de acido nucleico que codifica la guanilato ciclasa como se describe en la presente memoria. Dichos promotores pueden ser promotores homologos o heterologos, y pueden estar situados de forma operativa corriente arriba del segmento de acido nucleico que codifica el polipeptido de guanilato ciclasa, de manera que la expresion del segmento que codifica la guanilato ciclasa esta bajo el control del promotor. El constructo puede comprender un unico promotor, o de forma alternativa, dos o mas promotores pueden usarse para facilitar la expresion de la secuencia de ADN que codifica la guanilato ciclasa.

Promotores ejemplares utiles en la practica de la descripcion incluyen, aunque no estan de ninguna manera limitados a, las secuencias de promotor que son operables en celulas, tejidos y organos huesped de mamifero, y en particular, humanos, tal como por ejemplo, promotores ubicuos, tal como un promotor de CMV, promotor, un promotor de p-actina, un promotor de CMV hibrido, un promotor de CMV-p-actina hibrido, un promotor de CMV truncado, un promotor de p-actina truncado, un promotor de CMV-p-actina hibrido truncado, un promotor de EF1, un promotor de U1a o un promotor de U1b; o uno o mas promotores especificos de celulas o tejido (que incluyen, por ejemplo, un promotor especifico de fotorreceptor tal como un promotor de rodopsina quinasa [hGRK1]), o un promotor inducible tal como un promotor Tet-inducible o un promotor de VP16-LexA.

En realizaciones ilustrativas, un polinucleotido que codifica un polipeptido terapeutico se puso bajo el control de un promotor de p-actina de pollo (CBA) hibrido truncado ubicuo, o bajo el control de un promotor de hGRK1 especifico de la celula de fotorreceptor, y se uso para producir niveles terapeuticamente efectivos del polipeptido de guanilato ciclasa codificado cuando las celulas huesped adecuadas se transformaron con el constructo genetico, y el ADN que codifica el polipeptido de guanilato ciclasa se expreso en dichas celulas. Un ejemplo de un promotor de hGRK1 adecuado se muestra en SEQ ID NO:12, mientras que un promotor ubicuo adecuado, tal como el promotor de pactina de pollo (CBA) hibrido truncado se muestra en SEQ iD NO:13.

Los polinucleotidos comprendidos en los vectores y particulas viricas de la presente descripcion pueden tambien comprender ademas opcionalmente uno o mas potenciadores nativos, sinteticos, homologos, heterologos o hibridos o elementos reguladores 5’, por ejemplo, un potenciador natural, tal como el potenciador de CMV, o de forma alternativa, un potenciador sintetico. Los potenciadores especificos de celulas o tejido, que incluyen por ejemplo, los que aumentan la expresion de secuencias genicas unidas de forma operable tambien se contemplan por ser particularmente utiles en la practica de la descripcion.

Dichos potenciadores pueden incluir, aunque no estan limitados a, potenciadores especificos de la retina, potenciadores especificos de los bastones, potenciadores especificos de los conos, y similares.

Los polinucleotidos y segmentos de acido nucleico comprendidos en los vectores y particulas viricas de la presente descripcion pueden tambien comprender ademas opcionalmente una o mas secuencias de intron. En dichos ejemplos, la(s) secuencia(s) de intron sera(n) preferiblemente mamiferas en origen, y mas preferiblemente humanas en origen.

Las secuencias de ADN, segmentos de acido nucleico, y polinucleotidos comprendidos en un vector, virion, particula virica, celula huesped o composicion de la presente descripcion pueden tambien comprender ademas opcionalmente uno o mas elementos post-transcripcionales o 3’ reguladores nativos, sinteticos, homologos, heterologos o hibridos situados de forma operable respecto a los segmentos de acido nucleico que codifican guanilato ciclasa descritos en la presente memoria para proporcionar mayor expresion, mayor estabilidad y/o traduccion mejorada de los polipeptidos codificados. Uno de dichos ejemplos es el elemento regulador posttranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), situado de forma operable corriente abajo del gen de guanilato ciclasa. El uso de elementos tal como esos en dichas circunstancias se conoce bien por los expertos en las tecnicas biologicas moleculares.

En realizaciones ilustrativas, la descripcion afecta a la administracion de una o mas proteinas, peptidos o polipeptidos de guanilato ciclasa biologicamente activos que comprenden una secuencia de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 100 o mas aminoacidos contiguos de las secuencias de polipeptido y peptido descritas a continuacion, y particularmente aquellos polipeptidos como se enumeran en cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

Asimismo, en realizaciones ilustrativas adicionales, la descripcion afecta a la administracion de una o mas proteinas, peptidos o polipeptidos de guanilato ciclasa biologicamente activas que estan codificadas por un segmento de acido nucleico que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 170, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 190, o al menos aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750 o incluso aproximadamente 800 o mas residuos de acido nucleico contiguos de los segmentos de acido nucleico descritos a continuacion, y particularmente aquellas secuencias de ADN que codifican cualquiera de una o mas proteinas de guanilato ciclasa de mamifero, que incluyen por ejemplo, aquellas que se enumeran en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

Los constructos de vector virico adeno-asociado ejemplares y polinucleotidos de la presente descripcion incluyen aquellos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica un peptido o polipeptido que es identico en al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% a la secuencia de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, en las que el peptido o polipeptido tiene actividad guanilato ciclasa cuando se expresa en celulas y/o tejidos de mamifero seleccionados.

En ciertas realizaciones, los constructos de vector virico y polinucleotidos de la presente descripcion incluiran preferiblemente aquellos vectores y polinucleotidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica un peptido o polipeptido que es identico en al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 92% o al menos aproximadamente 94% a una o mas de las secuencias descritas en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o ^s E^q ID NO:11. Dichos constructos codificaran preferiblemente uno o mas peptidos o polipeptidos biologicamente activos que tienen actividad guanilato ciclasa cuando se expresan en celulas y/o tejidos de mamiferos seleccionados y en celulas y/o tejidos humanos en particular.

Los polinucleotidos ejemplares de la presente descripcion tambien incluyen aquellas secuencias que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en al menos un primer segmento de acido nucleico que es identico en al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% a una secuencia de acido nucleico que codifica cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11, en la que el peptido o polipeptido codificado por el segmento de acido nucleico tiene actividad guanilato ciclasa cuando se expresa en celulas y/o tejidos de mamiferos seleccionados.

Particulas viricas y viriones de rAAV, y celulas huesped que los comprenden

Otros aspectos de la descripcion afectan a particulas y viriones de rAAV que comprenden los vectores rAAV-guanilato ciclasa de la presente descripcion, pluralidades de dichas particulas y viriones, ademas de composiciones farmaceuticas y celulas huesped que comprenden uno o mas de los vectores rAAV-guanilato ciclasa descritos en la presente memoria, tal como por ejemplo formulaciones farmaceuticas de los vectores o viriones de rAAV-guanilato ciclasa previstos para la administracion a un mamifero a traves de medios adecuados, tales como, por inyeccion intramuscular, intravenosa o directa a celulas, tejidos u organos seleccionados del mamifero, por ejemplo, una o mas regiones del ojo del mamifero seleccionado. Tipicamente, dichas composiciones se formularan con excipientes, tampones, diluyentes, adyuvantes o transportes farmaceuticamente aceptables, como se describe a continuacion, y pueden comprender ademas uno o mas liposomas, lipidos, complejos lipidicos, microesferas, microparticulas, nanoesferas o formulaciones de nanoparticulas para facilitar la administracion a los organos, tejidos y celulas seleccionados para los que se desea la terapia.

Aspectos adicionales de la descripcion incluyen celulas huesped de mamifero, y pluralidades de las mismas que comprenden uno o mas de los vectores, viriones o particulas viricas infecciosas de rAAV como se describe en la presente memoria. Las celulas particularmente preferidas son las celulas huesped humanas, y en particular, los tejidos oculares humanos, que incluyen, por ejemplo, celulas retinianas.

Kits terapeuticos y composiciones farmaceuticas

Los kits terapeuticos para tratar o mejorar los smtomas de una condicion que resulta de una deficiencia de guanilato ciclasa en un mamffero son tambien parte de la presente descripcion. Kits ejemplares son aquellos que comprenden preferiblemente uno o mas de los constructos, viriones o composiciones farmaceuticas de vector AAV-guanilato ciclasa revelados descritos en la presente memoria, e instrucciones para usar el kit. El uso de dichos kits en metodos de tratamiento de deficiencia de guanilato ciclasa, y en particular, guanilato ciclasa 1 especffica de la retina, es preferible en el tratamiento de defecto o deficiencia de retGCI y en el tratamiento de distrofias retinianas tales como LCA-1 en un mamffero afectado.

Otro aspecto importante de la presente afecta al uso de los vectores, viriones, composiciones descritas y celulas huesped descritas en la presente memoria en la preparacion de medicamentos para tratar o mejorar los smtomas de deficiencia de guanilato ciclasa en un mamffero, y en particular, un humano. El uso de dichas composiciones en la preparacion de medicamentos y en metodos para el tratamiento de defectos neurologicos y/o del sistema nervioso central, que incluyen por ejemplo, condiciones que resultan de una deficiencia o defecto en GC1 retiniana, tal como por ejemplo en distrofias retinianas tales como LCA-1, generalmente implican la administracion a un mamffero, y particularmente a un humano que lo necesita, uno o mas de los vectores, viriones, celulas huesped o composiciones descritas que comprenden uno o mas de los mismos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar los smtomas de dicha deficiencia en el mamffero afectado. Los metodos pueden incluir ademas el tratamiento profilactico de animales sospechosos de tener dichas condiciones, o la administracion de dichas composiciones a aquellos animales en riesgo de desarrollar dichas condiciones o bien despues del diagnostico, o antes del comienzo de los smtomas.

Otro aspecto de la descripcion afecta a las composiciones que comprenden uno o mas de los vectores vfricos adeno-asociados, viriones, partfculas vfricas y celulas huesped descritas como se describen en la presente memoria. Se contemplan particularmente composiciones farmaceuticas que los comprenden por ser utiles en terapia, y particularmente en la preparacion de medicamentos para tratar a mamfferos afectados, y humanos en particular.

Metodos terapeuticos

La descripcion tambien proporciona metodos para distribuir cantidades terapeuticamente efectivas de un polipeptido de guanilato ciclasa a un mamffero que lo necesita. Dichos metodos generalmente comprenden al menos la etapa de proporcionar o administrar a dicho mamffero, una o mas de las composiciones de guanilato ciclasa descritas en la presente memoria. Por ejemplo, el metodo puede implicar proporcionar a dicho mamffero, uno o mas de los vectores, viriones, partfculas vfricas, celulas huesped o composiciones farmaceuticas de rAAV como se describe en la presente memoria. Preferiblemente dicha provision o dicha administracion sera en una cantidad y durante un tiempo efectivo para proporcionar una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas de los polipeptidos de guanilato ciclasa descritos en la presente memoria a celulas, tejidos u organos seleccionados del mamffero, y en particular, niveles terapeuticamente efectivos a las celulas del ojo de mamffero. Dichos metodos pueden incluir inyeccion(ones) sistemica(s) del compuesto terapeutico, o pueden incluso implicar la administracion, inyeccion o introduccion directa o indirecta de las composiciones terapeuticas a celulas, tejidos u organos particulares del mamffero.

Por ejemplo, la composicion terapeutica puede proveerse al mamffero por inyeccion directa a los tejidos del ojo o a la retina, o al espacio sub-retiniano, o a uno o mas tipos de celulas en el ojo del mamffero.

La descripcion tambien proporciona metodos de tratamiento, mejora de los smtomas y reduccion de la gravedad de la deficiencia de guanilato ciclasa en un animal. Estos metodos implican generalmente al menos la etapa de proporcionar a un animal que lo necesita, una o mas de las composiciones del vector rAAV guanilato ciclasa descritas en la presente memoria en una cantidad y durante un tiempo efectivo para tratar el defecto o deficiencia de polipeptido de retGC1, o para tratar una disfuncion resultante de dicha acumulacion, o resultante de una subexpresion o ausencia de polipeptido de guanilato ciclasa biologicamente activo suficiente en el animal, que incluye distrofias retinianas tales como LCA1 y similares. Como se describe anteriormente, dichos metodos pueden implicar inyeccion(ones) sistemica(s) del compuesto terapeutico, o pueden incluso implicar la administracion, inyeccion o introduccion directa o indirecta de las composiciones terapeuticas a celulas, tejidos u organos particulares del animal.

La descripcion afecta ademas al uso de los vectores vfricos adeno-asociados, viriones, partfculas vfricas, celulas huesped y/o las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria en la fabricacion de un medicamento para tratar el defecto o deficiencia de guanilato ciclasa, distrofia retiniana, o LCA1 u otra enfermedad, trastorno o disfuncion ocular relacionada con GC1 en un mamffero. Este uso puede implicar la inyeccion, infeccion o administracion sistemica o localizada a una o mas celulas, tejidos u organos del mamffero. Dicho uso se contempla particularmente en humanos que tienen, se sospecha que tienen o estan en riesgo de desarrollar una o mas distrofias retinianas tales como LCA-1.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede entenderse mejor por referencia a la siguiente descripcion tomadas en conjunto con los dibujos de acompanamiento, en que numeros de referencia similares identifican elementos similares, y en que:

La FIG. 1 muestra trazos de ERG mediados por conos (columna izquierda) y bastones (columna derecha) representativos de ratones /+ (ondas superiores), GC1KO no tratados (ondas intermedias) y tratados con AVV-mGC1 (ondas inferiores). Los trazos negros corresponden a ojos inyectados con hGRK1-mGC1 (ondas inferiores) y sus ojos contralaterales no inyectados (ondas intermedias). Los trazos rojos corresponden a ojos inyectados con smCBA-mGC1 (ondas inferiores) y ojos contralaterales no inyectados (ondas intermedias). Las respuestas de los conos en ojos tratados con AAV-mGC1 se restauran a aproximadamente 45% de lo normal;

La FIG. 2A y FIG. 2B muestran las amplitudes maximas de ondas b fotopicas promedio en controles GC1KO, isogenicos /+, ratones GC1KO tratados con smCBA-mGC1 (FIG. 2A) y tratados con hGRK1 -mGC1 (FIG. 2B) en el tiempo. Las respuestas de los conos de ratones tratados tanto con smCBA-mGC1 como hGRK1-mGC1 son aproximadamente 45% de lo normal durante al menos 3 meses despues de la inyeccion;

La FIG. 3A, FIG. 3B y FIG. 3C ilustran por analisis optomotor que el comportamiento obtenido visualmente se restauro en los ratones GC1KO tratados con o bien smCBA-mGC1 o con hGRK1-mGC1. M1 a M9 corresponden a los nueve ratones usados para las pruebas. Las agudezas fotopicas y las sensibilidades al contraste de los ratones de control /+ (M1, M2), GC1KO no tratados anteriormente (M3, M4), ratones tratados con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) y con hGRK1-mGC1 (M8, M9) revelan que los ratones tratados se comportan como ratones con vista normal (FIG. 3B y FIG. 3C). Se muestran los promedios de todos los ojos /+ (n = 4), ojos GC1KO (n = 9) y ojos tratados con AAV-mGC1 (n = 5) (FIG. 3C). Las respuestas de ERG mediadas por conos de cada raton (M1-M9) se muestran para comparacion electrofisiologica (FIG. 3A);

La FIG. 4A, FIG. 4B, FIG. 4C, FIG. 4D, FIG. 4E y FIG. 4F muestran que AAV5-hGRK1-mGC1 conduce la expresion de GC1 en segmentos externos del fotorreceptor de ratones GC1 KO (FIG. 4A). No se ve expresion de GC1 en el ojo de control contralateral no tratado (FIG. 4B). AAV5-smCBA-mGC1 conduce la expresion de GC1 en segmentos externos del fotorreceptor (FIG. 4C) y ocasionalmente en cuerpos celulares del fotorreceptor (flechas blancas en la FIG. 4F). No se ve dicha expresion de GC1 en el ojo de control contralateral no tratado (FIG. 4D). Los niveles de expresion transgenica terapeutica en ojos tratados con AAV5-mGC1 son similares a los vistos en ojos de control /+ isogenicos (FIG. 4E). Todas las retinas se tomaron de los ratones despues del tratamiento de 3 meses o controles no tratados emparejados por edad. Barras de escala en la FIG. 4A = 100 pm; en la FIG. 4F = 25 pm. OS = segmentos externos; IS = segmentos internos; ONL = capa nuclear externa;

La FIG. 5A, FIG. 5B, FIG. 5C y FIG. 5D muestran la expresion de arrestina de los conos en los fotorreceptores de los conos de ratones /+, GC1KO, tratados con AAV5-smCBA-mGC1 y tratados con AAV5-hGRK1-mGC1. Las retinas GC1KO no tratadas contienen segmentos externos de conos desorganizados, separados, caracteristicos (FIG. 5B), mientras que los segmentos externos de los conos estaban intactos y la distribucion de arrestina de los conos aparecia normal en las secciones retinianas de GC1KO tratado (FIG. 5C y FIG. 5D) y /+ (FIG. 5A). Todas las retinas se tomaron de los ratones 3 meses despues del tratamiento o de controles no tratados emparejados por edad. Barras de escala en la FIG. 5D = 100 pm. OS = segmentos externos, IS = segmentos internos, S = terminales sinapticas;

La FIG. 6A, FIG. 6B, FIG. 6C y FIG. 6D muestran que el tratamiento con AAV-mGC1 da por resultado la conservacion de los fotorreceptores de los conos en los ojos tratados durante al menos tres meses despues del tratamiento. Las preparaciones completas retinianas representativas del estudio de hGRK1-mGC1 (FIG. 6A: “no TX” = no tratado; FIG. 6C: “TX” = tratado), y el estudio de smCBA-mGC1 (FIG. 6B: “no TX” = no tratado; FIG. 6D: “TX” = tratado) y los ojos no inyectados contralaterales tenidos para la arrestina de los conos revelan que los fotorreceptores de los conos se conservan en ratones GC1KO tratados con AAV-mGC1 durante al menos 3 meses despues del tratamiento. Las densidades celulares de los conos se contaron en las retinas centrales e inferiores de ratones tratados y no tratados. Se encontraron diferencias significativas en ambas areas despues del tratamiento con cualquier vector virico;

La FIG. 7 ilustra la cascada de fototransduccion de vertebrados. Bajo estimulacion con luz, los cambios conformacionales en la rodopsina (R) estimulan una cascada de sucesos que incluyen la activacion de la transducina (T) y cGMP fosfodiesterasa (PDE) dando por resultado eventualmente la hidrolisis de cGMP. Esta disminucion de cGMP intracelular provoca un cierre de los canales cerrados por nucleotidos ciclicos (CNG) en las membranas del segmento externo del fotorreceptor. El cierre de estos canales provoca la hiperpolarizacion de la celula y por lo tanto una caida dramatica en el calcio intracelular. Cuando los niveles de calcio caen, la proteina que activa la guanilato ciclasa no unida (GCAP) esta libre para estimular la guanilato ciclasa (GC). La GC juega un papel en la fase de recuperacion de la fototransduccion en que su proposito es producir cGMP. Cuando los niveles de cGMP estan suficientemente elevados por la GC, los canales cerrados por cGMP se vuelven a abrir provocando la despolarizacion de la celula y una vuelta al estado adaptado a la oscuridad;

La FIG. 8 muestra la estructura predicha y la topologia de retGCI muestra la homologia a otras guanilato ciclasas con una unica region que atraviesa la transmembrana, un dominio intracelular y extracelular. El dominio intracelular se divide adicionalmente en una region “tipo quinasa” y el dominio catalitico. La regulacion dependiente de calcio y GCAP1 de retGCI se regula a traves de los dominios intracelulares (KHD). Cuando la concentracion de calcio en la celula fotorreceptora es alta (en el estado oscuro/despolarizado), la GCAP1 unida al calcio evita la activacion de retGCI. Tras la estimulacion con luz, los niveles de calcio disminuyen. El calcio se separa de GCAP1, permitiendo asi que GCAP1 active la retGC1. El papel de retGC1 es producir cGMP;

La FIG. 9 muestra fotorreceptores de conos en ratones normales (WT) frente a GC1KO. En los conos WT, GC1 funciona normalmente para producir cGMP que puede reabrir de forma efectiva los canales cerrados por CNG y devolver a la celula a su estado adaptado a la oscuridad/despolarizado. En los fotorreceptores de los conos del raton GC1KO, GC1 falla al producir cGMP. Este fallo evita la reapertura de los canales cerrados por CNG. Estas celulas estan en esencia, cronicamente hiper-polarizadas (adaptadas a la luz). No transducen luz para la vision (como se evidencia por una carencia de ERG) y degeneraran eventualmente;

La FIG. 10 muestra una alineacion de la secuencia de aminoacidos del GC1 bovino (bov GC1) y GC1 de raton (mGC1) con secuencia de consenso incluida. La region variable situada en el area N-terminal esta resaltada por el rectangulo rojo;

La FIG. 11 muestra mapas de los dos vectores ilustrativos. Uno contiene el promotor ubicuo smCBA, mientras que el otro utiliza el promotor especifico del fotorreceptor, hGRK1;

La FIG. 12 muestra la seccion retiniana representativa de un ojo GC1KO inyectado con AAV5-smCBA-mGC1 tenido por GC1 (rojo) y APN lectina (verde) revela la expresion de GC1 en segmentos externos de los conos (revestimiento amarillo) ademas de en los segmentos externos de los bastones (rojo solo). Los ojos inyectados con hGRK1-mGC1 revelaron el mismo patron;

La FIG. 13A, FIG. 13B y FIG. 13C muestran la restauracion mediada por AAV de la funcion retiniana en ratones GC1KO. FIG. 13A: trazos fotopicos representativos (mediados por los conos) grabados a partir de ojos de ratones GC1KO tratados a ~P14 con AAV5-hGRK1-mGC1 (rojo), AAV5-smCBA-mGC1 (verde) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 o controles GC1 /+ isogenicos, emparejados por edad. Los trazos se generaron a los 4 meses (izquierda), 7 meses (centro) y 9 meses (derecha) despues de la inyeccion. FIG. 13B: amplitudes de onda b de los conos promedio generadas mensualmente con un estimulo 12cds/m2 en ratones GC1KO tratados, GC1KO no tratados y ratones de control GC1 /+ isogenicos emparejados por edad. FIG. 13C: respuestas escotopicas (mediadas por bastones) en ratones GC1KO tratados frente a no tratados en el tiempo. Los valores representan la relacion de amplitudes de onda b de los bastones generadas a 5 cds/m2 en ojos tratados frente a no tratados. Los tres vectores confieren terapia estable a largo plazo a los ratones GC1KO, siendo AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1 el mas eficiente; La FIG. 14 muestra que los ratones GC1KO tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 7 meses despues de la inyeccion. Los ratones tratados con AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 9 meses despues de la inyeccion. Estos ojos ademas de los de unos ratones GC1 /+ de ~11 meses de edad se seccionaron y las retinas se tineron con anticuerpos dirigidos contra GC1 (verde, flecha superior) y arrestina de los conos (rojo, flecha inferior). Los tres vectores terapeuticos condujeron la expresion de GC1 exclusivamente en los fotorreceptores de ratones GC1KO. Se observo algo de adelgazamiento retiniano en los ratones tratados con AAV5-hGRK1-mGC1, un resultado probablemente debido al alto titulo de este vector. La expresion de GC1 y la densidad/morfologia de los conos en ratones tratados con AAV8(Y773F) y AAV5-smCBA se parecieron a las vistas en controles GC1 /+ emparejados por edad. Por el contrario, las retinas de un raton GC1KO emparejado por edad revelo una ausencia de expresion de GC1 y una reduccion marcada en la densidad celular de los conos;

La FIG. 15 muestra que a 7,5 meses despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, un raton GC1KO se sacrifico y sus retinas se usaron para electroinmunotransferencia de Western. Los anticuerpos dirigidos contra GC1 muestran que el nivel de expresion de GC1 mediada por AAV en el ojo GC1 KO tratado son similares a las vistas en el ojo de control GC1 /+ isogenico, emparejado por edad. Los niveles de expresion de proteina que activa la guanilato ciclasa 1 (GCAP1) (un companero bioquimico de la guanilato ciclasa) se evaluo tambien en los ojos GC1KO tratados y no tratados ademas de los de control GC1 /+. De acuerdo con los informes anteriores, la proteina GCAP1 se regulo a la baja en los ojos GC1KO no tratados. La expresion de GC1 mediada por AAV da por resultado la expresion aumentada de GCAP1, similar a los niveles vistos en el control GC1 /+ isogenico;

La FIG. 16A y FIG. 16B muestran los resultados a 11 meses despues de la inyeccion con AAV5-smCBA-mGC1, un raton GC1 KO se sacrifico, sus retinas se prepararon completamente y se tineron con un anticuerpo producido contra la arrestina de los conos. La inmunotincion revelo que los conos estan ausentes en el ojo GC1KO no tratado (FIG.

16A) excepto en la retina superior. La expresion de GC1 mediada por AAV conserva los fotorreceptores de los conos en toda la retina del ojo tratado (FIG. 16B) durante al menos 11 meses (el ultimo punto temporal estudiado);

La FIG. 17 ilustra los datos en que los ratones GC1KO inyectados con AAV8(733)-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 4 meses y 7 meses despues de la inyeccion. Los ratones GC1KO inyectados con AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1 se sacrificaron a los 7 meses y 10 meses despues de la inyeccion. Los ratones GC1KO no tratados anteriormente, emparejados por edad se usaron como controles. Los nervios opticos de los ojos tratados y no tratados, y partes de los cerebros derechos e izquierdos que contenfan las rutas visuales se aislaron y se usaron para la recuperacion de los genomas de los vectores. Notar que AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se inyecto en los ojos izquierdos de los ratones GC1KO mientras que ambos vectores AAV5 se inyectaron en los ojos derechos de los ratones GC1KO. Los genomas de los vectores se recuperaron solo de los nervios opticos de los ojos tratados en todos los casos. A los 10 meses despues de la inyeccion de vectores AAV5, no se recuperaron genomas de vector del cerebro. El mayor numero de genomas de vector se recuperaron de los ratones GC1KO inyectados con el fuerte vector AAV8(733) de rapida actuacion;

La FIG. 18A y FIG. 18B ilustran los datos en que OCT y los ERG de bastones/conos de un raton GCdko dos meses despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1;

La FIG. 19A y FIG. 19B ilustran los datos en que los ERG de bastones y conos representativos de un raton GCdko un mes despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1;

La FIG. 20A y FIG. 20B muestra los estandares de RT-PCR en tiempo real. La fluorescencia (unidades log en el eje Y) se representa frente a los valores C^t umbral del ciclo (eje X). Cada panel representa las curvas estandar (generadas por una serie de dilucion del ADNc de la retina total) para GC1 y transcrito Gapdh usando ADNc retiniano de cada uno de raton GC1 /+ de tipo salvaje (a) o un raton GC1KO tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1. Las curvas estandar generadas por conjuntos de cebador de GC1 y Gapdh fueron paralelas usando cualquier plantilla que indica cineticas de amplificacion similares. El valor del ciclo C^t aumenta con la disminucion de la cantidad de plantilla;

La FIG. 21A y FIG. 21B muestran la expresion de GC1 y arrestina del cono en retinas de ratones GC1 KO tratados y no tratados y controles GC1 /+. FIG. 21A: se uso la inmunohistoqufmica de secciones transversales retinianas congeladas para localizar la expresion de GC1 (verde, flecha superior) y arrestina del cono (rojo, flecha inferior) en ratones GC1KO tratados con vectores AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (7 meses despues de la inyeccion), AAV5-smCBA-mGC1 (10 meses despues de la inyeccion) o AAV5-hGRK1-mGC1 (10 meses despues de la inyeccion) ademas de retinas de ratones GC1 KO no tratados y de control GC1 /+ de 8 meses de edad. Los nucleos se tineron con DAPI (azul). Todas las secciones se captaron en imagenes a amplificacion 20X y se expusieron a configuraciones identicas. FIG. 21B: la inmunotincion de preparaciones completas retinianas de un raton GC1KO 11 meses despues del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 (solo un ojo) con un anticuerpo contra la arrestina del cono revelo la conservacion marcada de los fotorreceptores de los conos en el ojo tratado (abajo derecha) en comparacion con el ojo de control contralateral no tratado (abajo izquierda). Las preparaciones completas retinianas se orientaron de forma similar, con sus partes temporales en la posicion 12 en punto. Las partes de las preparaciones completas se captaron en imagenes con ampliacion de 10X y se mezclaron para la presentacion final. OS = segmentos externos; ONL = capa nuclear externa; INL = capa nuclear interna;

La FIG. 22A y FIG. 22B muestran electrorretinogramas (ERG) mediados por conos de ojos GC1KO tratados y no tratados y control GC1 /+. FIG. 22A: trazos mediados por conos representativos obtenidos por un estfmulo de luz de 12 cds/m2 de ojos GC1KO tratados con AAV5-hGRK1-mGC1 (lfnea roja), AAV5-smCBA-mGC1 (lfnea verde) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (lfnea negra) u ojos de control GC1 /+ emparejados por edad no tratados. Los trazos representativos generados entre 4 meses y 1 ano despues del tratamiento se muestran (panel superior). Escala: eje y = 50 pV, eje x = 20 ms. FIG. 22B: amplitudes de onda b de conos maximas (las generadas a 12 cds/m2) se calcularon de cada raton y se promediaron mensualmente en cada grupo de tratamiento ademas de los controles GC1 KO no tratado y GC1 /+, emparejados por edad. Se hicieron comparaciones entre grupos de animales con una n > 3. Todos los grupos de tratamiento con AAV se compararon estadfsticamente durante 6 meses despues del tratamiento. Los ojos tratados con vector AAV5 se compararon estadfsticamente durante 9 meses despues del tratamiento;

La FIG. 23A y FIG. 23B ilustran los electrorretinogramas (ERG) mediados por bastones de ojos GC1KO tratados y no tratados y de control GC1 /+. FIG. 23A: las amplitudes de onda b de bastones (superior izquierda) y amplitudes de onda a (superior derecha) obtenidas por un estfmulo de 1 cds/m2 bajo condiciones escotopicas se determinaron en los ojos tratados y no tratados de ratones GC1KO tratados con vector AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (cfrculos negros), AAV5-hGRK1-mGC1 (cfrculos rojos) o AAV5-smCBA-mGC1 (triangulos verdes). Las relaciones dentro del raton de ojos tratados y no tratados se generaron dividiendo la amplitud de onda a o b maxima en los ojos tratados por la amplitud maxima en el ojo no tratado. Estas relaciones se promediaron mensualmente en todos los grupos de tratamiento. Se hicieron comparaciones entre grupos de animales con una n > 3. Todos los grupos de tratamiento con AAV se compararon estadfsticamente durante 6 meses. Los vectores AAV5 tambien se compararon estadfsticamente durante 9 meses. La mejora mediada por el vector se definio por una relacion promedio >0,8. FIG.

23B: trazos de ERG mediados por bastones representativos de un raton GC1KO revelan que las respuestas de los bastones del ojo tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (lfnea negra) fueron mayores que las grabadas del ojo de control contralateral no tratado (lfnea verde). Esta respuesta del baston tratado se restauro a ~50% de la respuesta del baston GC1 /+ normal (lfnea roja); y

La FIG. 24A y FIG. 24B muestran los niveles de protefna y transcrito en ratones GC1KO tratados y no tratados y controles GC1 /+. FIG. 24A: electroinmunotransferencia de lisatos retinianos de un ojo de raton GC1KO a 10 meses despues del tratamiento con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 y sondados con anticuerpos de anti-GC1 y anti-GCAP1. El anticuerpo de anti-p-actina se uso en un control de carga interno. FIG. 24B: RT-PCR a tiempo real semicuantitativo de varios transcritos (GC1, GCAP1, GNAT2 y PDE6a en una retina GC1KO tratada con AAV5-smCBA-mGC1, una retina GC1KO tratada con vector AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1, y en retinas de control GC1KO no tratadas o GC1 /+ individuales. Las muestras se realizaron por triplicado usando cebadores especificos de Gapdh como un patron. Los datos se presentan como el cambio multiplo en los niveles de ARNm respecto al control GC1 /+.

Descripcion de realizaciones ilustrativas

A continuacion se describen realizaciones ilustrativas de la invencion. Por el interes de la claridad, no todas las caracteristicas de una implementacion real se describen en esta memoria. Se apreciara por supuesto que en el desarrollo de cualquier realizacion real dicha, deben tomarse numerosas decisiones especificas de la implementacion para alcanzar los objetivos especificos de los desarrolladores, tal como el cumplimiento con las restricciones relacionadas con el sistema y relacionadas con el negocio, que variaran de una implementacion a otra. Ademas, se apreciara que dicho esfuerzo de desarrollo seria complejo y consumidor de tiempo, pero seria sin embargo una rutina emprendida por los expertos en la tecnica que tiene el beneficio de esta descripcion.

Virus adeno-asociado

El virus adeno-asociado 2 (AAV) es un parvovirus humano que puede propagarse tanto como un virus litico o como un provirus (Cukor et al., 1984; Hoggan et al., 1972). El genoma virico consiste en un ADN monocatenario lineal (Rose et al., 1969), 4679 bases de largo (Srivastava et al., 1983), flanqueado por repeticiones terminales invertidas de 145 bases (Lusby et al., 1982). Para el crecimiento litico AAV necesita la co-infeccion con un virus ayudante. O bien adenovirus (Atchinson et al., 1965; Hoggan, 1965; Parks et al., 1967) o herpes simple (Buller et al., 1981) pueden suministrar la funcion ayudante. Sin ayudante, no hay evidencia de replicacion especifica de AAV o expresion genica (Rose y Koczot, 1972; Carter el al., 1983). Cuando no hay disponible un ayudante, el AAV puede seguir como un provirus integrado (Hoggan, 1965; Berns et al., 1975; Handa et al., 1977; Cheung et al., 1980; Berns et al., 1982).

La integracion aparentemente implica la recombinacion entre secuencias de los extremos de AAV y el huesped y la mayoria de las secuencias de AAV permanecen intactas en el provirus. La capacidad de AAV de integrarse en el ADN del huesped es aparentemente una estrategia inherente para asegurar la supervivencia de las secuencias de AAV en ausencia del virus ayudante. Cuando las celulas que portan un provirus de AAV se superinfectan posteriormente con un ayudante, el genoma de AAV integrado se rescata y se da un ciclo litico productivo (Hoggan, 1965).

Las secuencias de AAV clonadas en plasmidos procarioticos son infecciosos (Samulski et al., 1982). Por ejemplo, cuando el plasmido AAV/pBR322 tipo salvaje, pSM620, se transfecta a celulas humanas en presencia de adenovirus, las secuencias de AAV se rescatan del plasmido y sigue un ciclo litico de AAV normal (Samulski et al., 1982). Esto deja posible modificar las secuencias de AAV en el plasmido recombinante y, despues, hacer crecer unas reservas viricas del mutante transfectando el plasmido en celulas humanas (Samulski et al., 1983; Hermonat et al., 1984). El AAV contiene al menos tres regiones fenotipicamente distintas (Hermonat et al., 1984). La region rep codifica una o mas proteinas que se necesitan para la replicacion del ADN y para el rescate del plasmido recombinante, mientras que las regiones cap y lip parecen codificar las proteinas de la capside de AAV y los mutantes en estas regiones son capaces de la replicacion de ADN (Hermonat et al., 1984). Se ha mostrado que los extremos de AAV se necesitan para la replicacion de ADN (Samulski et al., 1983).

Laughlin et al. (1983) han descrito la construccion de dos plasmidos hibridos de E. coli, cada uno de los cuales contiene el genoma de ADN entero de AAV, y la transfeccion de los ADN recombinantes en lineas celulares humanas en presencia del adenovirus ayudante para rescatar con exito y replicar el genoma de AAV (vease tambien Tratschin et al., 1984a; 1984b).

El virus adeno-asociado (AAV) es particularmente atractivo para la transferencia genica porque no induce ninguna respuesta patogena y puede integrarse en el cromosoma celular del huesped (Kotin et al., 1990). Las repeticiones terminales (TR) de AAV son los unicos componentes cis esenciales para la integracion cromosomica (Muzyczka y McLaughin, 1988). Se presenta que estas TR tienen actividad promotora (Flotte et al., 1993). Pueden promover la transferencia genica eficiente del citoplasma al nucleo o aumentar la estabilidad del ADN del plasmido y permitir la expresion genica de mayor duracion (Bartlett y Samulski, 1998). Los estudios que usan ADN de plasmido recombinante que contienen TR de AAV han atraido considerable interes. Se ha mostrado que los plasmidos basados en AAV realizan una mayor y mas larga expresion transgenica que los plasmidos identicos que carecen de las TR de AAV en la mayoria de tipos celulares (Philip et al., 1994; Shafron et al., 1998; Wang et al., 1998).

Hay varios factores que provocan que los investigadores estudien la posibilidad de usar rAAV como un vector de expresion. Uno es que los requisitos para distribuir un gen para integrarse en el cromosoma huesped son sorprendentemente pocos. Es necesario tener las ITR de 145 pb, que son solo el 6% del genoma de AAV. Esto deja espacio en el vector para montar una insercion de ADN de 4,5 kb. Aunque esta capacidad para la carga puede evitar que el AAV distribuya genes grandes, se ajusta ampliamente para la distribucion de constructos antisentido de la presente invencion.

AAV es tambien una buena eleccion para distribuir vehiculos debido a su seguridad. Hay un mecanismo de rescate relativamente complicado: no solo el adenovirus de tipo salvaje sino tambien los genes de AAV se necesitan para movilizar el rAAV. Asimismo, el AAV no es patogeno y no se asocia con ninguna enfermedad. La eliminacion de secuencias de codificacion virica minimiza las reacciones inmunes a la expresion del gen virico, y por lo tanto, rAAV no evoca una respuesta inflamatoria. AAV por lo tanto, representa un candidato ideal para la distribucion de los polinucleotidos que codifican la guanilato ciclasa de la presente invencion.

Produccion de vectores rAAV

Los protocolos tradicionales para producir vectores rAAV se han basado generalmente en un sistema de tres componentes. Un componente de este sistema es un plasmido provirico que codifica el ADN recombinante para empaquetarse como rAAV. Este ADN recombinante esta situado entre las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV-2 de 145 pares de bases (pb) que son las secuencias de AAV-2 que actuan en cis minimas que dirigen la replicacion y el empaquetado del vector. Un segundo componente del sistema es un plasmido que codifica los genes de AAV-2, rep y cap. El gen rep de AAV-2 codifica cuatro proteinas Rep (Rep 78, 68, 52 y 40) que actuan en trans para replicar el genoma de rAAV, resuelven intermedios replicativos, y despues empaquetan los genomas de rAAV monocatenarios. El gen cap de AAV-2 codifica las tres proteinas estructurales (VP1, VP2 y VP3) que comprenden la capside del virus. Debido a que AAV-2 no replica correctamente por si mismo, el tercer componente de un sistema de empaquetado de rAAV es un conjunto de funciones ayudantes de otro virus de ADN. Estas funciones ayudantes crean un medio celular en que la replicacion de rAAV y el empaquetado puede darse de forma eficiente. Las funciones ayudantes proporcionadas por el adenovirus (Ad) se han usado casi exclusivamente para producir rAAV y se codifican por los genes E1a, E1b, E2a, E4orf6 y VA ARN. Aunque los dos primeros componentes del sistema se introducen generalmente en celulas en que la replicacion y empaquetado va a ocurrir por transfeccion, las funciones del ayudante ad se introducen por superinfeccion con virus Ad de tipo salvaje.

Las tecnicas de produccion de rAAV tradicionales estan limitadas en su capacidad para producir grandes cantidades de vector debido a las ineficiencias inherentes en la transfeccion. Tambien se encuentran serias dificultades cuando la escala de transfeccion se aumenta. El requisito por Ad de tipo salvaje puede reducir tambien la cantidad de rAAV producido ya que Ad puede competir por los sustratos celulares y viricos que se necesitan para la replicacion virica pero estan solo presentes en cantidades limitantes. Otro problema encontrado en los protocolos de produccion tradicionales es que la superinfeccion con Ad necesita el desarrollo de procedimientos efectivos para la purificacion de Ad a partir del rAAV producido. Aunque estos procesos de purificacion generalmente tienen exito eliminando la contaminacion de Ad de los preparados de rAAV, tambien reducen los titulos de rAAV. Los ensayos rigurosos para la contaminacion de Ad de rAAV tambien son necesarios.

Para producir rAAV, se usa un doble procedimiento de co-transfeccion para introducir un plasmido de vector de transferencia de rAAV junto con pDG (Grimm et al., 1998) plasmido ayudante de AAV que porta los genes rep y cap de AAV, ademas de genes ayudantes Ad necesarios para la replicacion de rAAV y empaquetado en una relacion molar 1:1. El ADN de plasmido usado en la transfeccion se purifica mediante un protocolo de lisis alcalina/gradiente de CsCl convencional. La transfeccion se realiza como sigue: 293 celulas se separan 1:2 el dia antes del experimento, de manera que, cuando se transfectan, la confluencia de la celula es aproximadamente 75-80%. Diez platos de 15 cm se transfectan como un lote. Para hacer precipitado de CaPO4 se mezclan 0,7 mg de pDG con 180 pg de plasmido de vector de transferencia de rAAV en un volumen total de 12,5 mL de CaCl20,25 M. El medio viejo se elimina de las celulas y la formacion del precipitado de CaPO4 se inicia anadiendo 12,5 ml de 2X HBS (pH 7,05) que se ha pre-calentado a 37°C a la disolucion de ADN-CaCl2. El ADN se incuba durante 1 min; y transferir la mezcla en 200 mL de DMEM- FBS al 10% pre-calentado detiene entonces la formacion del precipitado. Veintidos mL del medio se distribuyen inmediatamente en cada plato y las celulas se incuban a 37°C durante 48 h. El precipitado de CaPO4 se deja estar en las celulas durante todo el periodo de incubacion sin comprometer la viabilidad celular. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion las celulas se recogen por centrifugado a 1.140 x g durante 10 min. Las celulas se lisan entonces en 15 ml de MgCl 0,15 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) mediante 3 ciclos de congelacion/descongelacion en hielo seco-etanol y banos a 37°C. Se anade benzonasa (Nycomed Pharma A/S, grado puro) a la mezcla (50 U/mL de concentracion final) y el lisato se incuba durante 30 min a 37°C. El lisato se clarifica por centrifugado a 3.700 x g durante 20 min y el sobrenadante que contiene el virus se purifica adicionalmente usando un gradiente de densidad discontinua.

El gradiente de la etapa discontinua tipico se forma creando una capa por debajo y desplazando el lisato celular menos denso con lodixanol, 5,5’’[(2-hidroxi-1-3-propanodiil)-bis(acetilamino)]bis[N,N’bi,(2,3-dihidroxipropil-2-4,6-triyodo-1,3-bencenocarboxamida], preparado usando una disolucion esteril al 60% (p/v) de OptiPrep (Nycomed). Especificamente, 15 mL del lisato clarificado se transfieren en un tubo centrifugo de 25 x 89 mm Quick-Seal Ultra­ Clear (Beckman) usando una jeringa equipada con una aguja espinal de 1/27 x 89 mm. Se tiene cuidado para evitar las burbujas, que podrian interferir con el posterior llenado y sellado del tubo. Se usa una bomba peristaltica de velocidad variable, Modelo EP-1 (Bio-Rad), para poner capas debajo en el orden: 9 mL de iodixanol al 15% y NaCl 1 M en tampon PBS-MK que contiene Rojo de fenol (2,5 pL de una disolucion madre al 0,5% por ml de la disolucion de iodixanol); 5 mL de iodixanol al 40% en tampon PBS-MK; y finalmente, 5 mL de iodixanol al 60% en tampon de PBSMK que contiene rojo de fenol (0,1 qL/L). Los tubos se sellan y se centrifugan en un rotor tipo 70 Ti (Beckman) a 350.000 x g durante 1 h a 182C. Cuatro mL de la etapa al 40% clara se aspira despues de pinchar el tubo en el lado con una jeringa equipada con una aguja de calibre 18 con el bisel en la parte superior. La fraccion de iodixanol se purifica adicionalmente usando cromatografia de afinidad de heparina en agarosa convencional.

Para la cromatografia, tipicamente, una columna tipo I de heparina en agarosa de 2,5 mL pre-empaquetada (Sigma) se equilibra con 20 mL de PBS-MK con gravedad. La fraccion de rAAV iodixanol se aplica entonces a la columna pre-equilibrada, y la columna se lava con 10 mL de PBS-MK. Se eluye el rAAV con el mismo tampon que contiene NaCl 1 M. Despues de aplicar el tampon de elucion, los primeros 2 ml del eluyente se descartan, y el virus se recoge en los 3,5 mL posteriores de tampon de elucion.

El virus se concentra entonces y se desala por centrifugado a traves del filtro BIOMAX® 100 K (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) segun las instrucciones del fabricante. El tampon alto en sal se cambia diluyendo repetidamente el virus concentrado con disolucion de Ringer lactato, y repitiendo el titulo tanto de particulas que contienen genoma como particulas de rAAV infecciosas. Un ensayo de transferencia en mancha convencional, ensayo de PCR cuantitativo competitivo (QC PCR) o mas recientemente PCR en tiempo real cuantitativo (aRT-PCR) se usan para determinar los titulos de particula fisica (Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006). Los titulos infecciosos se determinan por ensayo del centro infeccioso (ICA) y ensayo de celulas fluorescentes (FCA), que consigue la expresion de GFP (Zolotukhin et al., 2002).

El metodo QC PCR se basa en co-amplificado competitivo de una secuencia diana especifica con plasmido patron interno de concentracion conocida en un tubo de reaccion. Proporciona una cuantificacion precisa y rapida de las particulas viricas. El patron interno debe correr por los sitios de reconocimiento del cebador con la plantilla especifica. Tanto la plantilla especifica como el patron interno deben amplificarse por PCR con la misma eficiencia y debe ser posible analizar los productos amplificados por PCR de forma separada. La forma mas sencilla de distinguir entre la plantilla y el patron interno es incorporar una diferencia de tamano en los dos productos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, construyendo patrones que tengan la misma secuencia que la diana especifica pero que contengan una eliminacion. La cuantificacion se realiza entonces comparando la senal de PCR de la plantilla especifica con la senal de PCR obtenida con concentraciones conocidas del competidor (el patron interno). La PCR a tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) es un metodo estandar para evaluar la concentracion de ADN de una muestra desconocida por comparacion de la formacion de producto de PCR en tiempo real a un patron de ADN conocido.

La reserva virica purificada se trata primero con DNAsel para digerir cualquier ADN no empaquetado contaminante. Diez qL de una reserva de virus purificado se incuba con 10 U de DNAsel (Boehringer Ingelheim am Rhein, Alemania) en una mezcla de reaccion de 100 qL, que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl210 mM durante 1 h a 37°C. Al final de la reaccion, se anadieron 10 qL de tampon 10X Proteinasa K (Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 10 mM, SDS al 1% de concentracion final), seguido por la adicion de 1 qL de Proteinasa K (18,6 mg/mL, Boehringer). La mezcla se incubo a 37°C durante 1 h. El ADN virico se purifico por extraccion en fenol/cloroformo (dos veces), seguido por extraccion en cloroformo y precipitacion en etanol usando 10 qg de glucogeno como un transporte. El granulado de ADN se disolvio en 100 qL de agua. Las mezclas de reaccion de QC PCR contenian cada una 1 qL del ADN virico diluido y diluciones en serie dos veces del ADN plasmido patron interno, tal como pdl-GFP. El intervalo mas fiable de ADN estandar se encontro que estaba entre 1 y 100 pg. Una alicuota de cada reaccion se analizo entonces mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, hasta que se resolvieron dos productos de PCR. La imagen analoga de gel tenido con bromuro de etidio se digitalizo usando un sistema ImageStore 7500 (UVP; Upland, CA, EE.UU.). Las densidades de las bandas diana y competidor en cada carril se midieron usando el Sistema de Analisis de Imagen ZERO-Dscan, version 1.0 (Scanalytics, Rockville, MD, EE.UU.) y sus relaciones se representan como una funcion de la concentracion de ADN estandar. Una relacion de 1,0, a la que el numero de moleculas de ADN virico es igual al numero de moleculas de ADN competidor se uso para determinar la concentracion de ADN de la reserva de virus.

Una modificacion del protocolo publicado anteriormente (McLaughlin et al., 1988) se uso para medir la capacidad del virus para infectar celulas C12, desempaquetar y replicar. Brevemente, las celulas C2 que contenian genes rep y cap de wtAAV integrados (Clark et al., 1995) se pusieron en platos en un plato de 96 pocillos a una confluencia de aproximadamente 75%, despues se infectaron con Ad5 a un M.O.I. de 20. Un qL de rAAV-sCNTF diluido en serie se califico visualmente usando un microscopio de fluorescencia. Se uso un filtro num. 41012 HighQ FITC LP CHROMA de alta sensibilidad (Chroma Technology, Bellows Fall, VA, EE.UU.) para monitorizar la fluorescencia. Para calcular el titulo por hibridacion, las celulas se recogieron y se procesaron esencialmente como se describe anteriormente (McLaughlin et al., 1988).

Composiciones farmaceuticas

En ciertas realizaciones, la presente invencion se refiere a la formulacion de una o mas de las composiciones de rAAV-guanilato ciclasa descritas en la presente invencion en disoluciones farmaceuticamente aceptables para la administracion a una celula o un animal, o bien solas, o en combinacion con una o mas modalidades distintas de terapia.

Se entendera tambien que, si se desea, las composiciones de segmento de acido nucleico, ARN, ADN o APN que expresan un producto genico terapeutico como se describe en la presente memoria pueden administrarse en combinacion con otros agentes tambien, tales como, p.ej., proteinas o polipeptidos o varios agentes farmaceuticamente activos, que incluyen una o mas administraciones sistemicas o topicas de polipeptidos de guanilato ciclasa. De hecho, no hay virtualmente limite para otros componentes que pueden incluirse tambien, dado que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo tras el contacto con las celulas diana o tejidos huesped. Las composiciones de guanilato ciclasa vectorizados con rAAV pueden por consiguiente distribuirse junto con otros agentes diversos como se necesite en el ejemplo particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de las celulas huesped u otras fuentes biologicas, o de forma alternativa pueden sintetizarse quimicamente como se describe en la presente memoria. Asimismo, dichas composiciones pueden comprender ademas composiciones de ARN, ADN o APN sustituidas o derivadas.

La formulacion de excipientes farmaceuticamente aceptables y disoluciones de transporte se conoce bien por los expertos en la tecnica, como lo es el desarrollo de regimenes de dosificacion y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regimenes de tratamiento, incluyendo p.ej., administracion oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intramuscular y directa a uno o mas tipos de celulas o tejidos en el animal, que incluye por ejemplo, inyeccion ocular, retiniana y sub-retiniana o similares.

Tipicamente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente 0,1% del compuesto activo o mas, aunque el porcentaje del (de los) ingrediente(s) activo(s) puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 o 2% y aproximadamente 60% o 70% o mas del peso o volumen de la formulacion total. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composicion terapeuticamente util puede prepararse de forma tal que una dosis adecuada se obtendra en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, vida media biologica, ruta de administracion, vida util del producto, ademas de otras consideraciones farmacologicas se contemplaran por un experto en la tecnica de preparacion de dichas formulaciones farmaceuticas, y como tal, una variedad de dosificaciones y regimenes de tratamiento puede ser deseable.

En ciertas circunstancias sera deseable distribuir las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria de forma parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe (vease p.ej., Patente de EE.UU. num. 5.543.158; Patente de EE.UU. num. 5.641.515 y Patente de EE.UU. num. 5.399.363). Las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse tambien en glicerol, polietilenglicoles liquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenaje y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmaceuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles (vease p.ej., Patente de EE.UU. num. 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el grado que se de la facil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenaje y debe conservarse frente a la accion contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El transporte puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede provocarse por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administracion parenteral en una disolucion acuosa, por ejemplo, la disolucion se tamponaria de forma adecuada si fuera necesario y el diluyente liquido se volveria primero isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, se conocera un medio acuoso esteril que puede emplearse por un experto en la tecnica a la luz de la presente descripcion. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de disolucion de NaCl isotonica y o bien anadirse a 1000 mL de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusion (vease, p.ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences 15s Ed., paginas 1035-1038 y 1570­ 1580). Alguna variacion en la dosificacion se dara necesariamente dependiendo de la condicion del sujeto a tratar. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para la administracion humana, los preparados deberian cumplir la esterilidad, pirogenicidad y los patrones de seguridad y pureza generales que se requieren por la Oficina de Estandares Biologicos de la Administracion de Alimentos y Farmacos de Estados Unidos (FDA).

Las disoluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos ingredientes distintos como se enumera en la presente memoria, segun se necesite, seguido por esterilizacion filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los demas ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vacfo y secado por congelacion que dan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una disolucion filtrada en esteril previamente de los mismos.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protefna) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhfdrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse tambien de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procafna y similares. Tras la formulacion, las disoluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente efectiva. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion tales como disoluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Como se usa en la presente memoria, “transporte” incluye cualquiera de todos los disolventes, medios de dispersion, vehfculos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, tampones, disoluciones de transporte, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmaceuticas se conoce bien en la tecnica. Salvo en el caso en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse ingredientes activos complementarios en las composiciones.

La frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o inadecuada similar cuando se administra a un humano. La preparacion de una composicion acuosa que contiene una protefna como un ingrediente activo se entiende bien en la tecnica. Tfpicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, o bien como disoluciones o suspensiones liquidas; puede prepararse tambien formas solidas adecuadas para la disolucion en, o suspension en, liquido antes de la inyeccion. La preparacion puede tambien emulsionarse.

Comparacion de secuencia, identidad y homologfa

Para la comparacion de la secuencia y determinacion de la homologfa, tfpicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia a la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parametros de programa del algoritmo de la secuencia. El algoritmo de comparacion de secuencias puede usarse entonces para calcular el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba respecto a la secuencia de referencia, en base a los parametros de programa designados.

La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede realizarse, p.ej., mediante el algoritmo de homologfa local (vease p.ej., Smith y Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineacion de homologfa (vease, p.ej., Needleman y Wunsch, 1970), mediante el metodo de comparacion de similitudes de busqueda (vease, p.ej., Pearson y Lipman, 1988), mediante implementaciones informatizadas de algoritmos tales como GAP, BESTFlT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programa Genetico de Wisconsin, Grupo Informatico de Genetica, Madison, Wl, EEUU, o mediante inspeccion visual. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990) y la matriz de evaluacion BLOSUM62 (vease, p.ej., Henikoff y Henikoff, 1989). El programa para realizar los analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional para la Informacion de Biotecnologfa (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ademas de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, p.ej., Karlin y Altschul, 1993). Otro ejemplo de un algoritmo de alineacion de secuencia util es el programa PILEUP, que crea una alineacion de secuencia multiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones emparejadas, progresivas. Tambien puede representar un arbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineacion. PILEUP usa una simplificacion del metodo de comparacion de alineacion progresiva (vease p.ej., Feng y Doolittle, 1987), y emplea una matriz de alineacion general similar a la descrita por Higgins y Sharp (1989).

Kits terapeuticos y diagnosticos

La invencion tambien incluye una o mas composiciones junto con uno o mas excipientes, transportes, diluyentes, adyuvantes y/u otros componentes farmaceuticamente aceptables, como pueden emplearse en la formulacion de formulaciones de rAAV-guanilato ciclasa particulares, y en la preparacion de agentes terapeuticos para la administracion a un mamffero, y particularmente, a un humano, para una o mas de las condiciones deficientes en guanilato ciclasa, tal como una distrofia retiniana como LCA1, como se describe en la presente memoria. En particular, dichos kits pueden comprender una o mas composiciones de guanilato ciclasa vectorizadas con rAAV en combinacion con instrucciones para usar el vector virico en el tratamiento de dichos trastornos en un mamifero, y tipicamente pueden incluir ademas recipientes preparados para el conveniente envasado comercial.

Como tal, los animales preferidos para la administracion de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria incluyen mamiferos, y particularmente humanos. Otros animales preferidos incluyen primates no humanos, murinos, epinos, bovinos, ovinos, equinos, hircinos, lupinos, leporinos, vulpinos, porcinos, caninos, felinos y similares. La composicion puede incluir composiciones de rAAV-guanilato ciclasa purificadas parcialmente o significativamente, o bien solas, o en combinacion con uno o mas ingredientes activos adicionales, que pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o recombinantes, o que pueden ser obtenibles de forma natural o sintetizarse quimicamente, o producirse alternativamente in vitro a partir de celulas huesped recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos ingredientes activos adicionales.

Tambien pueden prepararse kits terapeuticos que comprenden al menos una de las composiciones descritas en la presente memoria e instrucciones para usar la composicion como un agente terapeutico. Los medios receptores para dichos kits pueden comprender tipicamente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio receptor, en que puede(n) ponerse la(s) composicion(ones) de rAAV descrita(s), y preferiblemente hacerse alicuotas de forma adecuada. Donde se proporciona tambien una segunda composicion de guanilato ciclasa, el kit puede contener tambien un segundo medio receptor distinto en el que puede ponerse esta segunda composicion. De forma alternativa, la pluralidad de composiciones de guanilato ciclasa puede prepararse en una unica composicion farmaceutica, y puede envasarse en un unico medio receptor, tal como un vial, matraz, jeringa, botella u otro medio receptor unico adecuado. Los kits de la presente invencion incluiran tambien tipicamente un medio para contener el(los) vial(es) en estrecho confinamiento para la venta comercial, tal como, p.ej., recipientes de plastico moldeados por inyeccion o soplado en los que se retiene(n) el (los) vial(es) deseado(s).

Expresion en celulas animales

Los inventores contemplan que un polinucleotido que comprende una secuencia de acido nucleico contigua que codifica un polipeptido de guanilato ciclasa terapeutico de la presente invencion puede utilizarse para tratar uno o mas defectos celulares en una celula huesped transformada. Dichas celulas son preferiblemente celulas animales, que incluyen celulas de mamiferos tales como las obtenidas de un humano o un primate no humano, o de una o mas especies de mamiferos que incluyen sin limitacion, murinos, caninos, bovinos, equinos, epinos, felinos, ovinos, hircinos, lupinos, leporinos, porcinos y similares. El uso de dichos constructos para el tratamiento y/o mejora de uno o mas sintomas de una distrofia retiniana tal como LCA1, o de una enfermedad, trastorno, condicion o disfuncion retiniana u ocular relacionada en un sujeto humano sospechoso de sufrir dicho trastorno, o en riesgo de desarrollar dicha condicion se contempla particularmente por los presentes inventores.

Las celulas pueden transformarse con uno o mas vectores rAAV que comprenden uno o mas genes de guanilato ciclasa terapeuticos de interes, de manera que el constructo genetico introducido y expresado en las celulas huesped del animal es suficiente para alterar, reducir, mejorar o prevenir la(s) condicion(ones) nociva(s) o de enfermedad o uno o mas sintomas de las mismas, o bien ex vivo, in vitro, ex situ, in situ y/o in vivo.

Guanilato ciclasa

La guanilato ciclasa (GC) (EC 4.6.1.2) es una liasa que cataliza la conversion de los guanosin trifosfatos (GTP) a 3’,5’-guanosin monofosfato ciclico (cGMP) y pirofosfato. Denominada alternativamente en la bibliografia como “guanil ciclasa” o “guanilil ciclasa”, existen las formas tanto unida a membrana (tipo 1) como soluble (tipo 2) de GC. Amaurosis congenita de Leber

La amaurosis congenita de Leber (LCA) es un grupo de enfermedades recesivas autosomicas que representan la forma mas temprana y mas grave de todas las distrofias retinianas hereditarias. El primer gen implicado en el comienzo de esta enfermedad geneticamente y clinicamente heterogenea, y por lo tanto asignado a la posicion LCA1 fue la guanilato ciclasa especifica de la retina 1 (Gucy2d) (Perrault et al., 1996). Gucy2d codifica la proteina especifica retiniana guanilato ciclasa (retGC1) que se expresa predominantemente en las membranas del segmento externo del fotorreceptor y juega un papel en la regulacion de los niveles de cGMP y Ca2+ en estas celulas. Despues de la estimulacion por luz, los niveles de cGMP en los segmentos externos del fotorreceptor caen rapidamente debido a la hidrolisis por cGMP fosfodiesterasa (PDE). Esta reduccion de cGMP lleva al cierre de los canales cerrados por cGMP, influjo reducido de Ca2+, e hiperpolarizacion de la celula. Esta disminucion en Ca2+ intracelular estimula la recuperacion de los fotorreceptores estimulados por la luz al estado de oscuridad por medio de su interaccion con las proteinas que activan la guanilato ciclasa (GCAP), una familia de proteinas unidas al calcio que regulan la actividad de GC. En el fotorreceptor adaptado a la oscuridad, las GCAP unidas a Ca2+ inhiben la actividad de GC. Tras la estimulacion con luz, sin embargo, las GCAP libres de Ca2+ estimulan la actividad de GC que produce un aumento en los niveles de cGMP, una reapertura de los canales cerrados por cGMP y una vuelta de la celula a un estado despolarizado. Las mutaciones que reducen o abolen la capacidad de GC para reponer la cGMP intracelular y reabrir los canales cationicos cerrados por cGMP, como es el caso en LCA1, se piensa que crean el equivalente bioquimico a la exposicion cronica a la luz en los fotorreceptores de los bastones y conos.

Las mutaciones en Gucy2d explican ~15% de todos los casos de LCA haciendola una de las causas principales de esta enfermedad. El numero de pacientes afectados por LCA1 es aproximadamente el doble de los afectados por la version RPE65 bien conocida de la enfermedad (LCA2), una forma por la que los ensayos de terapia genica mediada por AAV exitosos han conseguido recientemente atencion mundial. El diagnostico de LCA1 se hace tipicamente en los primeros meses de vida en un bebe con ceguera total o vision enormemente alterada, electrorretinograma (ERG) extinguido y nistagmo pendular (Perrault et al., 1999; Chung y Traboulsi, 2009). A pesar de estos deficits funcionales, los pacientes de LCA1 dan fondo normal (Perrault et al., 1999) y retienen algunos fotorreceptores de bastones y conos en su retina tanto macular como periferica durante anos (Milam et al., 2003; Simonelli et al., 2007; Pasadhika et al., 2009). Usando una tomografia de coherencia optica de dominio espectral (SDOCT) para barrer las areas macular central y perifoveal, un estudio reciente revelo que los pacientes de LCA1 (intervalo de edad, 20-53 anos) retenian todas las 6 capas retinianas con la union del segmento interno/externo del fotorreceptor visible. El mantenimiento de la estructura retiniana en LCA1 es diferente de otras formas de la enfermedad que muestran un adelgazamiento retiniano marcado que generalmente empeora con la edad (Pasadhika et al., 2009). Aunque la conservacion de la estructura de la retina no va en paralelo con la mejor agudeza visual en los pacientes de LCA1, sugiere que estan mejor adaptados para futuras estrategias terapeuticas.

Modelos animales

Se han usados dos modelos animales que portan mutaciones anuladoras en el gen de retGC1 para evaluar la terapia de sustitucion genica, la de pollo GUCY1*B que se da de forma natural y la de raton inactivo en guanilato ciclasa 1 (GC1) (vease p.ej., Williams et al., 2006; Haire et al., 2006). El pollo GUCY1*B es ciego al salir del cascaron, muestra ERG escotopico (mediado por bastones) y fotopico (mediado por conos) extinguido y degeneracion retiniana (vease, p.ej., Ulshafer et al.; 1984; Huang, et al., 1998; Semple-Rowland et al., 1998). La transferencia mediada por lentivirales de Gucy2d a la retina GUCY1*B restauro la vision de estos animales como se evidencia por la prueba conductual y el ERG (vease, p.ej., Williams et al., 2006). A pesar del exito terapeutico a corto plazo, esta terapia no alcanzo la conservacion de la estructura retiniana o la funcion a largo plazo. La naturaleza temporal de este resultado, obtenido en una especie que no es mamifero con un vector virico integrante distribuido in ovo sugirio la necesidad de estudios traduccionales mas apropiados hacia el desarrollo de la aplicacion clinica.

Un modelo de mamifero de LCA1, el raton GC1KO, muestra degeneracion de fotorreceptores de los conos (vease, p.ej., Yang et al., 1999; Coleman et al.; 2004). Como en los pacientes de LCA1, la perdida de la funcion de los conos en este modelo de raton precede la degeneracion de los conos (Yang et al., 1999). Ademas, la translocacion inducida por la luz de la arrestina de los conos se interrumpe. Los fotorreceptores de los bastones en este modelo no degeneran y continuan generando respuestas electricas a la luz (Yang et al., 1999), un resultado probablemente debido a la presencia de GC2, un pariente cercano de GC1 en estas celulas (vease p.ej., Lowe et al., 1995; Yang et al., 1995; Yang y Garbers, 1997; Karan et al., 2010). La transferencia mediada por AAV de Gucy2d a la retina GC1KO post-natal restauro la translocacion conducida por la luz de la arrestina de los conos en las celulas transducidas, pero fallo al restaurar las respuestas de ERG de los conos o evitar la degeneracion de los conos (Haire et al., 2006). En los estudios tanto del pollo como del raton, que se realizaron por los mismos investigadores, el ADNc terapeutico fue de origen bovino que es la especie de proteina usada historicamente en ensayos bioquimicos que evaluan la funcionalidad de GC1 (Otto-Bruc et al., 1997; Williams et al., 2006).

Definiciones ejemplares

A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende normalmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque cualquier metodo y composicion similar o equivalente a las descritas en la presente memoria puede usarse en la practica o ensayo de la presente invencion, los metodos y composiciones preferidos se describen en la presente memoria. Por propositos de la presente invencion, los siguientes terminos se definen a continuacion:

De acuerdo con la convencion de la ley de patentes de mucho tiempo, las palabras “un” y “una” cuando se usan en esta memoria, incluyendo las reivindicaciones, denota “uno o mas”.

Como se usa en la presente memoria, el termino “aproximadamente” se entenderia generalmente que se refiere a ambos numeros en un intervalo de numeros. Por ejemplo, “aproximadamente 1 a 10” se entenderia como “aproximadamente 1 a aproximadamente 10”. Ademas, se entenderia que todos los intervalos numericos en la presente memoria incluyen cada numero entero completo en el intervalo, ademas de cada decima. El termino “aproximadamente”, como se usa en la presente memoria, se entenderia generalmente que significa “aproximadamente”, y tipicamente se refiere a numeros aproximadamente iguales a un numero dado enumerado en un intervalo de numeros. Ademas, se entenderia que todos los intervalos numericos en la presente memoria incluyen cada numero entero completo en el intervalo.

De acuerdo con la presente invencion, polinucleotidos, segmentos de acido nucleico, secuencias de acido nucleico, y similares, incluyen, aunque no estan limitados a, ADN (que incluyen y no estan limitados a ADN genomico o extragenomico), genes, acidos peptidonucleicos (APN), ARN (que incluyen, aunque no estan limitados a, ARNr, ARNm y ARNt), nucleosidos y segmentos de acido nucleico adecuados o bien obtenidos de fuentes naturales, sintetizados, modificados o preparados quimicamente de otra forma o sintetizados en su totalidad o en parte por la mano del hombre.

Como se usa en la presente memoria, el termino “acido nucleico” incluye uno o mas tipos de: polidesoxirribonucleotidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleotidos (que contienen D-ribosa), y cualquier otro tipo de polinucleotido es decir un N-glucosido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas (que incluyen sitios abasicos). El termino “acido nucleico”, como se usa en la presente memoria, tambien incluye polimeros de ribonucleosidos o desoxirribonucleosidos que estan unidos de forma covalente, tipicamente mediante uniones^ fosfodiester entre subunidades, aunque en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. “Acidos nucleicos” incluyen ADN mono y bicatenario, ademas de ARN mono y bicatenario. Acidos nucleicos ejemplares incluyen, sin limitacion, ADNg; ARNnh; ARNm; ARNr; ARNt, microARN (ARNmi), ARN de interferencia pequeno (ARNip), ARN nucleolar pequeno (ARNnop), ARN nuclear pequeno (ARNnp) y ARN temporal pequeno (ARNtp), y similares, y cualquier combinacion de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “segmento de ADN” se refiere a una molecula de ADN que se ha aislado libre del ADN genomico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN obtenido de una muestra biologica que usa una de las composiciones descritas en la presente memoria se refiere a uno o mas segmentos de ADN que se han aislado de, o purificado libre de, ADN genomico total de la especies particulares de las que se han obtenido. Incluido en el termino “segmento de ADN” estan los segmentos de ADN y fragmentos mas pequenos de dichos segmentos, ademas de vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, fagos, virus y similares.

De forma similar, el termino “segmento de ARN” se refiere a una molecula de ARN que se ha aislado libre del ARN celular total de una especie particular. Por lo tanto, los segmentos de ARN pueden referirse a uno o mas segmentos de ARN (o bien de origen nativo o sintetico) que se han aislado de, o purificado libres de otros ARN. Incluido en el termino “segmento de ARN” estan los segmentos de ARN y fragmentos mas pequenos de dichos segmentos.

En el contexto de la invencion el termino “expresion” pretende incluir la combinacion de procesos intracelulares, que incluyen transcripcion y traduccion experimentada por un polinucleotido tal como un gen estructural para sintetizar el peptido o polipeptido codificado.

El termino “p.ej.”, como se usa en la presente memoria, se usa meramente por medio de ejemplo, sin limitacion prevista, y no deberia construirse como refiriendose solo a esos puntos explicitamente enumerados en la memoria. Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “promotor” describa generalmente la region o regiones de una secuencia de acido nucleico que regula la transcripcion.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “elemento regulador” describa generalmente la region o regiones de una secuencia de acido nucleico que regula la transcripcion. Elementos reguladores ejemplares incluyen, aunque no estan limitados a potenciadores, elementos post-transcripcionales, secuencias de control transcripcional y similares.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “gen estructural” describa generalmente un polinucleotido, tal como un gen, que se expresa para producir un peptido, polipeptido, proteina, ribozima, molecula de ARN catalitica o molecula antisentido, codificada.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “transformacion” generalmente describa un proceso para introducir una secuencia de polinucleotido exogena (p.ej., un vector virico, un plasmido, o una molecula de ADN o ARN recombinante) en una celula huesped o protoplasto en que el polinucleotido exogeno se incorpora en al menos un primer cromosoma o es capaz de replicacion autonoma en la celula huesped transformada. La transfeccion, electroporacion y absorcion de acido nucleico “desnudo” representan todos ejemplos de tecnicas usadas para transformar una celula huesped con uno o mas polinucleotidos.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “celula transformada” signifique una celula huesped cuyo complemento de acido nucleico se ha alterado por la introduccion de uno o mas polinucleotidos exogenos en esa celula.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “celula transgenica” generalmente signifique cualquier celula que se deriva o regenera de una celula transformada o derivada de otra celula transgenica, o de la progenie o descendencia de cualquier generacion de dicha celula huesped transformada o transgenica.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el termino “vector” generalmente signifique una molecula de acido nucleico (tipicamente comprendida de ADN) capaz de replicacion en una celula huesped y/o a la que otro segmento de acido nucleico puede unirse de forma operativa para provocar la replicacion del segmento unido. Un plasmido, cosmido o un virus es un vector ejemplar.

Los terminos “esencialmente corresponde a”, “esencialmente homologo” o “identidad sustancial” como se usan en la presente memoria indica una caracteristica de un acido nucleico o una secuencia de aminoacidos, en los que una secuencia de acido nucleico o aminoacidos seleccionada tiene al menos aproximadamente 70 a aproximadamente 75 por ciento de identidad de secuencia en comparacion con una secuencia de acido nucleico o aminoacidos de referencia seleccionada. Mas tipicamente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendran al menos aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84 o incluso aproximadamente 85 por ciento de identidad de secuencia, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 95% por ciento o mas de identidad de secuencia. Mas preferiblemente aun, las secuencias altamente homologas a menudo comparten mas de al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia a la que se comparo. El porcentaje de identidad de secuencia puede calcularse sobre la longitud entera de las secuencias a comparar, o puede calcularse excluyendo pequenas eliminaciones o adiciones cuyo total es menor que aproximadamente 25 por ciento o asi de la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como una parte de un gen o secuencia de flanqueo o una parte repetitiva de un cromosoma.

Sin embargo, en el caso de homologia de secuencia de dos o mas secuencias de polinucleotidos, la secuencia de referencia y la secuencia diana comprenderan tipicamente al menos aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleotidos identicos contiguos, mas tipicamente al menos aproximadamente 26 a aproximadamente 35 nucleotidos contiguos que son identicos, e incluso mas tipicamente al menos aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o incluso aproximadamente 100 o asi nucleotidos contiguos que son identicos. De forma deseable, cuyos fragmentos altamente homologos se desean, la extension del porcentaje total de identidad de secuencia entre dos secuencias dadas sera al menos aproximadamente identicas al 80% preferiblemente al menos aproximadamente identicas al 85%, y mas preferiblemente aproximadamente identicas al 90%, aproximadamente identicas al 91%, aproximadamente identicas al 92%, aproximadamente identicas al 93%, aproximadamente identicas al 94% o incluso aproximadamente identicas al 95% o mas, como se determina facilmente por uno o mas de los algoritmos de comparacion de secuencias bien conocidos por los expertos en la tecnica, tal como, p.ej., el analisis por el programa FASTA descrito por Pearson y Lipman (1988).

Los terminos “identico” o porcentaje “de identidad”, en el contexto de dos o mas secuencias de acido nucleico o polipeptido, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para la maxima correspondencia, como se mide usando uno de los algoritmos de comparacion de secuencias descritos a continuacion (u otros algoritmos disponibles para expertos) o por inspeccion visual.

La frase “esencialmente identicos” en el contexto de dos acidos nucleicos se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 90%, preferiblemente 91%, lo mas preferiblemente aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 98,5%, aproximadamente 99%, aproximadamente 99,1%, aproximadamente 99,2%, aproximadamente 99,3%, aproximadamente 99,4%, aproximadamente 99,5%, aproximadamente 99,6%, aproximadamente 99,7%, aproximadamente 99,8% o aproximadamente 99,9% o mas de identidad de residuos de nucleotidos, cuando se comparan y alinean para la maxima correspondencia, como se mide usando un algoritmo de comparacion de secuencias o por inspeccion visual. Dichas secuencias “esencialmente identicas” se consideran tipicamente “homologas” sin referencia a ascendencia real.

El termino “que se da de forma natural” como se usa en la presente memoria como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueden encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptido o polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por la mano del hombre en un laboratorio se da de forma natural. Como se usa en la presente memoria, las cepas de laboratorio de roedores que pueden haberse criado de forma selectiva segun la genetica clasica se consideran animales que se dan de forma natural.

Como se usa en la presente memoria, un “heterologo” se define en relacion a una secuencia genica referenciada predeterminada. Por ejemplo, con respecto a una secuencia genica estructural, un promotor heterologo se define como un promotor que no se da de forma natural adyacente al gen estructural referenciado, sino que se coloca por manipulacion en laboratorio. Asimismo, un gen o segmento de acido nucleico heterologo se define como un gen o segmento que no se da de forma natural adyacente al promotor referenciado y/o elementos potenciadores.

Como se usa en la presente memoria, el termino “homologia” se refiere a un grado de complementariedad entre dos o mas secuencias de polinucleotido o polipeptido. La palabra “identidad” puede sustituirse por la palabra “homologia” cuando una primera secuencia de acido nucleico o aminoacidos tiene la secuencia primaria exactamente igual que una segunda secuencia de acido nucleico o aminoacidos. La homologia de secuencia e identidad de secuencia puede determinarse analizando dos o mas secuencias que usan algoritmos y programas informaticos conocidos en la tecnica. Dichos metodos pueden usarse para evaluar si una secuencia dada es identica u homologa a otra secuencia seleccionada.

Como se usa en la presente memoria, “homologo” significa, cuando se refiere a polinucleotidos, secuencias que tienen la misma secuencia de nucleotidos esencial, a pesar de surgir de diferentes origenes. Tipicamente, las secuencias de acido nucleico homologas se derivan de genes relacionados estrechamente u organismos que poseen una o mas secuencias genomicas esencialmente similares. En contraste, un polinucleotido “analogo” es uno que comparte la misma funcion con un polinucleotido de una especie u organismo diferente, pero tienen una secuencia de nucleotidos primaria significativamente diferente que codifica una o mas proteinas o polipeptidos que cumplen funciones similares o poseen actividad biologica similar. Los polinucleotidos analogos pueden derivarse a menudo de dos o mas organismos que no estan estrechamente relacionados (p.ej., o bien geneticamente o filogeneticamente).

Como se usa en la presente memoria, el termino “polipeptido” pretende incluir un “polipeptido” singular ademas de “polipeptidos” en plural, e incluye cualquier cadena o cadenas de dos o mas aminoacidos. Por consiguiente, como se usa en la presente memoria, los terminos que incluyen, aunque no estan limitados a “peptido”, “dipeptido”, “tripeptido”, “proteina”, “enzima”, “cadena de aminoacidos” y “secuencia de aminoacidos contiguos” se incluyen todos en la definicion de un “polipeptido” y el termino “polipeptido” puede usarse en vez de, o de forma intercambiable con, cualquiera de estos terminos. El termino incluye ademas polipeptidos que han experimentado una o mas modificacion(ones) post-traduccional(es), que incluyen por ejemplo, aunque no estan limitados a, glucosilacion, acetilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion, escision proteolitica, procesado post-traduccion, o modificacion por inclusion de uno o mas aminoacidos que se dan de forma no natural. Existe una nomenclatura convencional en la tecnica para estructuras de polinucleotidos y polipeptidos. Por ejemplo, abreviaturas de una letra y tres letras se emplean ampliamente para describir aminoacidos: alanina (A; Ala), arginina (R; Arg), asparagina (N; Asn), acido aspartico (D; Asp), cisteina (C; Cys), glutamina (Q; Gln); acido glutamico (E; Glu), glicina (G; Gly), histidina (H; His), isoleucina (I; Ile), leucina (L; Leu), metionina (M; Met), fenilalanina (F, Phe), prolina (P; Pro), serina (S; Ser), treonina (T; Thr), triptofano (W; Trp), tirosina (Y; Tyr), valina (V; Val) y lisina (K; Lys). Los residuos de aminoacidos descritos en la presente memoria se prefiere que esten en la forma isomerica “L”. Sin embargo, los residuos en la forma isomerica “D” pueden sustituirse por cualquier residuo L-aminoacido con tal que se retengan las propiedades deseadas de los polipeptidos.

“Proteina” se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “peptido” y “polipeptido” e incluye tanto peptidos como polipeptidos producidos de forma sintetica, recombinante o in vitro y los peptidos y polipeptidos expresados in vivo despues de las secuencias de acido nucleico se administran en un animal o sujeto humano huesped. El termino “polipeptido” pretende preferiblemente referirse a todas las longitudes de cadena de aminoacidos, incluyendo las de peptidos cortos de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 residuos de aminoacido de longitud, oligopeptidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 residuos de aminoacido de longitud, y polipeptidos de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 o mas residuos de aminoacidos de longitud. El termino “secuencia”, cuando se refiere a aminoacidos, se refiere a toda o una parte del orden N-terminal a C-terminal lineal de aminoacidos con una cadena de aminoacidos dada, p.ej., polipeptido o proteina; “subsecuencia” significa cualquier alargamiento consecutivo de aminoacidos en una secuencia, p.ej., al menos 3 aminoacidos consecutivos en una proteina o secuencia de polipeptido dada. Con referencia a cadenas de nucleotidos y polinucleotidos, “secuencia” y “sub-secuencia” tienen significados similares en relacion con el orden 5’ a 3’ de nucleotidos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “esencialmente homologo” incluye dos o mas secuencias biomoleculares que son significativamente similares la una a la otra en el nivel de secuencia de nucleotidos primaria. Por ejemplo, en el contexto de dos o mas secuencias de acido nucleico, “esencialmente homologo” puede referirse a al menos aproximadamente 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 80% y mas preferiblemente al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90% de identidad, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 95%, mas preferiblemente al menos aproximadamente identicas al 97%, mas preferiblemente al menos aproximadamente identicas al 98%, mas preferiblemente al menos aproximadamente identicas al 99%, e incluso mas preferiblemente aun, enteramente identicas (es decir, 100% o “invariante”).

Asimismo, como se usa en la presente memoria, el termino “esencialmente identico” incluye dos o mas secuencias biomoleculares (y en particular secuencias de polinucleotido) que muestran un alto grado de identidad la una con la otra al nivel de nucleotidos. Por ejemplo, en el contexto de dos o mas secuencias de acido nucleico, “esencialmente identicas” puede referirse a secuencias que son al menos aproximadamente 80%, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% identicas la una a la otra, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 95%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 97% identicas, mas preferiblemente al menos aproximadamente 98% identicas, mas preferiblemente al menos aproximadamente 99% identicas, e incluso mas preferiblemente aun, totalmente identicas (es decir, 100% identicas o “no degeneradas”).

El termino “recombinante” indica que el material (p.ej., un polinucleotido o un polipeptido) se ha alterado artificialmente o sinteticamente (no de forma natural) por la intervencion humana. La alteracion puede realizarse en el material en o eliminado de, su medio o estado natural. Especificamente, p.ej., una secuencia promotora es “recombinante” cuando se produce por la expresion de un segmento de acido nucleico manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, un “acido nucleico recombinante” es uno que esta hecho recombinando acidos nucleicos, p.ej., durante la clonacion, barajado de ADN u otros procedimientos, o mediante mutagenesis quimica u otra; un “polipeptido recombinante” o “proteina recombinante” es un polipeptido o proteina que se produce por expresion de un acido nucleico recombinante; y un “virus recombinante”, p.ej., un virus AAV recombinante, se produce mediante la expresion de un acido nucleico recombinante.

Como se usa en la presente memoria, el termino “unido de forma operable” se refiere a una union de dos o mas polinucleotidos o dos o mas secuencias de acido nucleico en una relacion funcional. Un acido nucleico se “une de forma operable” cuando se situa en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta unido de forma operable a una secuencia de codificacion si afecta a la transcripcion de la secuencia de codificacion. “Unido de forma operable” significa que las secuencias de acido nucleico que se unen son tipicamente contiguas, o esencialmente contiguas, y, donde es necesario unir dos regiones de codificacion de proteina, contiguas y en marco de lectura. Como los potenciadores generalmente funcionan cuando estan separados del promotor por varias kilobases y las secuencias intronicas pueden ser de longitudes variables; sin embargo, algunos elementos de polinucleotido pueden estar unidos de forma operable aunque no sean contiguos.

“Elemento regulador transcripcional” se refiere a una secuencia de polinucleotidos que activa la transcripcion solo o en combinacion con una o mas secuencias de acidos nucleicos distintos. Un elemento regulador transcripcional puede, por ejemplo, comprender uno o mas promotores, uno o mas elementos de respuesta, uno o mas elementos reguladores negativos, y/o uno o mas potenciadores.

Como se usa en la presente memoria, un “sitio de reconocimiento del factor de transcripcion” y un “sitio de union al factor de transcripcion” se refiere a una(s) secuencia(s) de polinucleotido(s) o motivo(s) de secuencia que se identifican como que son sitios para la interaccion especifica con la secuencia de uno o mas factores de transcripcion, tomando frecuentemente la forma de union de ADN-proteina directa. Tipicamente, los sitios de union al factor de transcripcion pueden identificarse por la huella de ADN, ensayos de desplazamiento de movilidad en gel, y similares, y/o pueden predecirse en base a los motivos de secuencia de consenso conocidos, o por otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

“Unidad transcripcional” se refiere a una secuencia de polinucleotidos que comprende al menos un primer gen estructural unido de forma operable a al menos una primera secuencia promotora que actua en cis y opcionalmente unido de forma operable a una o mas secuencias de acido nucleico que actuan en cis distintas necesarias para la eficiente transcripcion de las secuencias genicas estructurales, y al menos un primer elemento regulador distal como puede necesitarse para la transcripcion especifica de tejido y de desarrollo apropiada de la secuencia genica estructural situada de forma operable bajo el control del promotor y/o elementos potenciadores, ademas de cualquier secuencia en cis adicional que sean necesarias para la transcripcion y traduccion eficiente (p.ej., sitio(s) de poliadenilacion, secuencia(s) de control de estabilidad del ARNm, etc.

El termino “esencialmente complementario”, cuando se usa para definir las secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos, significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia de oligonucleotidos, es esencialmente complementaria a toda o una parte de la secuencia seleccionada, y por consiguiente se unira especificamente a una parte de un ARNm que codifica la secuencia seleccionada. Como tal, tipicamente las secuencias seran altamente complementarias a la secuencia “diana” de ARNm, y tendran no mas de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, o aproximadamente 10 o asi desapareamientos de base a lo largo de la parte complementaria de la secuencia. En muchos ejemplos, puede ser deseable para las secuencias ser apareamientos exactos, es decir, ser completamente complementarios a la secuencia a la que el oligonucleotido se une especificamente, y por lo tanto no tener ningun desapareamiento a lo largo del alargamiento complementario. Como tal, las secuencias altamente complementarias se uniran tipicamente bastante especificamente a la region de secuencia diana del ARNm y por lo tanto seran altamente eficientes en la reduccion, y/o incluso inhibicion de la traduccion de la secuencia de ARNm diana en el producto polipeptidico.

Las secuencias de acido nucleico esencialmente complementarias seran mayores que aproximadamente el 80 por ciento complementarias (o “% de apareamiento exacto”) a una secuencia diana de acido nucleico correspondiente al que el acido nucleico se une especificamente, y seran, mas preferiblemente mayores que aproximadamente 85 por ciento complementarias a la secuencia diana correspondiente a la que el acido nucleico se une especificamente. En ciertos aspectos, como se describe anteriormente, sera deseable tener secuencias de acido nucleico incluso mas esencialmente complementarias para usar en la practica de la invencion, y en dichos ejemplos, las secuencias de acido nucleico seran mas que aproximadamente 90 por ciento complementarias a la secuencia diana correspondiente a la que el acido nucleico se une especificamente, y puede en ciertas realizaciones ser mayor que aproximadamente 95 por ciento complementaria a la secuencia diana correspondiente a la que el acido nucleico se une especificamente, e incluso hasta e incluyendo aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% e incluso aproximadamente 100% de apareamiento exacto complementario a toda o una parte de la secuencia diana a la que el acido nucleico designado se une especificamente.

El porcentaje de similitud o porcentaje complementario de cualquiera de las secuencias de acido nucleico descritas puede determinarse, por ejemplo, comparando informacion de la secuencia usando el programa informatico GAP, version 6.0, disponible del Grupo Informatico de Genetica de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el metodo de alineacion de Needleman y Wunsch (1970). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el numero de simbolos alineados (es decir, nucleotidos o aminoacidos) que son similares, dividido por el numero total de simbolos en la mas corta de las dos secuencias. Los parametros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparacion unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleotidos, y la matriz de comparacion pesada de Gribskov y Burgess (1986), (2) una penalizacion de 3,0 para cada hueco y una penalizacion adicional de 0,10 para cada simbolo en cada hueco; y (3) sin penalizacion para los huecos finales.

Como se usa en la presente memoria, los terminos “proteina”, “polipeptido” y “peptido” se usan de forma intercambiable, e incluyen moleculas que incluyen al menos un enlace amida que une dos o mas residuos de aminoacido. Aunque se usan de forma intercambiable, en general, un peptido es una molecula relativamente corta (p.ej., de 2 a aproximadamente 100 residuos de aminoacido de longitud), mientras que una proteina o un polipeptido es un polimero relativamente mas largo (p.ej., 100 o mas residuos de longitud). Sin embargo, a menos que se defina especificamente por una longitud de cadena, los terminos peptido, polipeptido y proteina se usan de forma intercambiable.

Como se usa en la presente memoria, el termino “paciente” (tambien denominado de forma intercambiable como “huesped” o “sujeto”) se refiere a cualquier huesped que pueda servir como un receptor para una o mas de las composiciones de guanilato ciclasa basada en rAAV como se trata en la presente memoria. En ciertos aspectos, el receptor sera un animal vertebrado, que pretende indicar cualquier especie animal (y preferiblemente, una especie de mamifero tal como un ser humano). En ciertas realizaciones, un “paciente” se refiere a cualquier huesped animal, que incluyen aunque no estan limitados a, humanos y primates no humanos, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, corvinos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, murinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, que incluyen, sin limitacion, ganado domestico, animales de pastoreo o migratorios, especimenes exoticos o zoologicos, ademas de animales de compania, mascotas y cualquier animal bajo el cuidado de un veterinario.

Como se usa en la presente memoria, el termino “transporte” pretende incluir cualquier disolvente(s), medio de dispersion, recubrimiento(s), diluyente(s), tampon(ones), agente(s) isotonico(s), disolucion(ones), suspension(ones), coloide(s), inerte(s) o similares, o una combinacion de los mismos que es farmaceuticamente aceptable para la administracion al animal relevante o aceptable para un proposito diagnostico, como sea aplicable. El uso de uno o mas vehiculos de distribucion para constructos de terapia genica, particulas viricas, vectores y similares, se conoce bien por los expertos en las tecnicas farmaceutica y molecular. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en composiciones profilacticas y/o terapeuticas. Uno o mas ingrediente(s) activo(s) complementario(s) puede tambien incorporarse, o administrarse en asociacion con, una o mas de las composiciones descritas.

Como se usa en la presente memoria, “una cantidad efectiva” se entenderia por el experto en la tecnica que proporciona un efecto terapeutico, profilactico o beneficioso de otra forma a un paciente receptor.

Las frases “aislado” o “biologicamente puro” se refiere al material que esta sustancialmente, o esencialmente, libre de componentes que normalmente acompanan al material como se encuentra en su estado nativo. Por consiguiente, los polinucleotidos aislados de acuerdo con la invencion preferiblemente no contienen materiales asociados normalmente con los polinucleotidos en su medio natural, o in situ.

“Conectar” o “unir” se refiere a cualquier metodo conocido en la tecnica para conectar de forma funcional una o mas proteinas, peptidos, acidos nucleicos, o polinucleotidos, que incluyen, sin limitacion, fusion recombinante, enlace covalente, enlace disulfuro, enlace ionico, enlace de hidrogeno, enlace electrostatico, y similares.

Como se usa en la presente memoria, el termino “plasmido” o “vector” se refiere a un constructo genetico que esta compuesto de material genetico (es decir, acidos nucleicos). Tipicamente, un plasmido o un vector contiene un origen de replicacion que es funcional en celulas huesped bacterianas, p.ej., Escherichia coli, y marcadores seleccionables para detectar celulas huesped bacterianas que incluyen el plasmido. Los plasmidos y vectores de la presente invencion pueden incluir uno o mas elementos geneticos como se describen en la presente memoria, dispuestos de manera que una secuencia de codificacion insertada puede transcribirse y traducirse en unas celulas de expresion adecuada. Ademas, el plasmido o vector puede incluir uno o mas segmentos de acido nucleico, genes, promotores, potenciadores, activadores, regiones de clonacion multiple, o cualquier combinacion de los mismos, incluyendo segmentos que se obtienen a partir de o se derivan de una o mas fuentes naturales y/o artificiales.

El termino “una secuencia esencialmente como se presenta en la SEQ ID NO:X” significa que la secuencia corresponde esencialmente a una parte de SEQ ID NO:X y tiene relativamente pocos nucleotidos (o aminoacidos en el caso de secuencias de polipeptido) que no son identicos a, o un equivalente biologicamente funcional de, los nucleotidos (o aminoacidos) de SEQ ID NO:X. El termino “equivalente biologicamente funcional” se entiende bien en la tecnica, y se define adicionalmente en detalle en la presente memoria. Por consiguiente, las secuencias que tienen aproximadamente 85% a aproximadamente 90%; o mas preferiblemente, aproximadamente 91% a aproximadamente 95%; o incluso mas preferiblemente, aproximadamente 96% a aproximadamente 99%; de nucleotidos que son identicos o funcionalmente equivalentes a una o mas de las secuencias de nucleotidos proporcionadas en la presente memoria se contemplan particularmente que son utiles en la practica de la invencion.

Las condiciones de hibridacion estandar adecuadas para la presente invencion incluyen, por ejemplo, la hibridacion en 50% de formamida, 5x de disolucion de Denhardts, 5 x de SSC, fosfato sodico 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado a 42°C durante 16 h seguido por 1 h de lavados secuenciales con 0,1x de SSC, disolucion de SDS al 0,1% a 60°C para eliminar la cantidad deseada de senal de fondo. Las condiciones de hibridacion de menor severidad para la presente invencion incluyen, por ejemplo, hibridacion en formamida al 35%, 5x de disolucion de Denhardts, 5x de SSC, fosfato sodico 25 mM, SDS al 0,1% y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado o ADN de E. coli a 42°C durante 16 h seguido por lavados secuenciales con 0,8x de SSC, SDS al 0,1% a 55°C. Los expertos en la tecnica reconoceran que las condiciones pueden ajustarse facilmente para obtener el nivel deseado de severidad.

De forma natural, la presente invencion tambien incluye segmentos de acido nucleico que son complementarios, esencialmente complementarios y/o sustancialmente complementarios a al menos una o mas de las secuencias de nucleotidos especificas presentadas de forma especifica en la presente memoria. Las secuencias de acido nucleico que son “complementarias” son aquellas que son capaces de apareamiento de bases segun las reglas de complementariedad de Watson-Crick estandar. Como se usa en la presente memoria, el termino “secuencias complementarias” significa secuencias de acido nucleico que son esencialmente complementarias, como puede evaluarse por la misma comparacion de nucleotidos presentada anteriormente, o como se define como que son capaces de hibridar con uno o mas de los segmentos de acido nucleico especifico descritos en la presente memoria bajo condiciones relativamente severas tales como las descritas inmediatamente antes.

Como se describe anteriormente, las sondas y cebadores de la presente invencion pueden ser de cualquier longitud. Asignando valores numericos a una secuencia, por ejemplo, el primer residuo es 1, el segundo residuo es 2, etc., puede proponerse un algoritmo que define todas las sondas y cebadores contenidos en una secuencia dada:

n a n y, donde n es un numero entero de 1 al ultimo numero de la secuencia e y es la longitud de la sonda o cebador menos uno, donde n y no excede el ultimo numero de la secuencia. Por consiguiente, para una sonda o cebador de 25 pares de bases (es decir, un “25-mer”), la coleccion de sondas y cebadores corresponden a las bases 1 a 25, bases 2 a 26, bases 3 a 27, bases 4 a 28, etcetera en la longitud entera de la secuencia. De forma similar, para una sonda o cebador de 35 pares de bases (es decir, un “35-mer”), la secuencia de cebador o sonda ejemplar incluye, sin limitacion, secuencias que corresponden a las bases 1 a 35, bases 2 a 36, bases 3 a 37, bases 4 a 38, etcetera en la longitud completa de la secuencia. Asimismo, para 40-mer, dichas sondas y cebadores pueden corresponder a los nucleotidos del primer par de bases al pb 40, del segundo pb de la secuencia al pb 41, del tercer pb al pb 42, etcetera, mientras que para 50-mer, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a una secuencia de nucleotidos que se extiende del pb 1 al pb 50, del pb 2 al pb 51, del pb 3 a pb 52, del pb 4 al pb 53, etcetera.

En ciertas realizaciones, sera ventajoso emplear uno o mas segmentos de acido nucleico de la presente invencion en combinacion con un marcador detectable apropiado (es decir, una “etiqueta”), tal como en el caso de emplear sondas de polinucleotido marcadas en la determinacion de la presencia de una secuencia diana dada en un ensayo de hibridacion. Una amplia variedad de compuestos y composiciones indicadores apropiados se conocen en la tecnica para marcar las sondas de oligonucleotido, que incluyen, sin limitacion, ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimaticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, etc., que son capaces de detectarse en un ensayo adecuado. En realizaciones particulares, se puede emplear tambien una o mas etiquetas fluorescentes o una marca enzimatica tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de reactivos radioactivos u otros reactivos medioambientalmente menos deseables. En el caso de marcas enzimaticas, se conocen sustratos indicadores colorimetricos, cromogenicos o fluorigenicos que pueden emplearse para proporcionar un metodo para detectar la muestra que es visible al ojo humano, o por metodos analiticos tales como escintigrafia, fluorimetria, espectrofotometria, y similares, para identificar la hibridacion especifica con muestras que contienen una o mas secuencias de acido nucleico complementarias o sustancialmente complementarias. En el caso de los denominados ensayos “de multiplexacion”, donde dos o mas sondas etiquetadas se detectan o simultaneamente o secuencialmente, puede ser deseable etiquetar una primera sonda de oligonucleotidos con una primera etiqueta que tiene una primera propiedad o parametro de deteccion (por ejemplo, un maximo espectral de emision y/o excitacion), que tambien etiqueto una segunda sonda de oligonucleotido con una segunda etiqueta que tiene una segunda propiedad o parametro de deteccion que es diferente (es decir, discreto o discernible de la primera etiqueta). El uso de ensayos de multiplexacion, particularmente en el contexto de protocolos de amplificacion/deteccion genetica se conoce bien por los expertos en las tecnicas de genetica molecular.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invencion. Se apreciaria por los expertos en la tecnica que las tecnicas descritas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la invencion, y por consiguiente puede considerarse que constituyen modos preferidos para su practica.

Ejemplo 1 - La terapia genica mediada por AAV restaura la funcion visual y el comportamiento para un modelo de raton de LCA1

En este ejemplo, los inventores evaluaron si la distribucion de una version de retGCI especifica para la especie (es decir, murino) a celulas del cono del raton GC1KO post-natal podrian restaurar la funcion a estas celulas. Se usaron vectores AAV de serotipo 5 para distribuir mGC1 a los fotorreceptores de ratones GC1KO 14 dias despues del nacimiento (P14). Se usaron el electrorretinograma (ERG) y la prueba conductual para evaluar la funcion visual y se uso la inmunocitoquimica para examinar la expresion transgenica terapeutica, la localizacion de arrestina del cono y las densidades del fotorreceptor del cono en los ojos tratados y no tratados.

Este ejemplo demuestra que un vector AAV distribuido de forma sub-retiniana a un ojo de ratones GC1KO P14 facilito la expresion de retGC1 tipo salvaje, la restauracion de la funcion visual y el comportamiento y la conservacion de los fotorreceptores del cono. Cuatro semanas despues de la inyeccion, se analizo la funcion visual (ERG) en ojos tratados y no tratados. El ERG se realizo cada dos semanas a partir de ahi hasta 3 meses despues de la inyeccion (el ultimo punto temporal evaluado). Los ratones con respuestas al ERG positivas ademas de ratones de control tipo salvaje isogenicos y no inyectados se evaluaron para la restauracion del comportamiento visual usando la prueba de reflejo optocinetico. A los 3 meses despues de la inyeccion, todos los animales se sacrificaron y sus retinas tratadas y no tratadas se evaluaron para la expresion de GC1 y la localizacion de arrestina del cono.

Los resultados tambien confirman que la funcion mediada por los conos se restauro en los ojos tratados de ratones GC1KO (las amplitudes de ERG fueron ~60% de las normales). Ademas, el efecto del tratamiento fue estable durante al menos 3 meses despues de la administracion. La prueba conductual revelo fuertes mejoras en el comportamiento visual mediado por los conos, siendo las respuestas de los ratones tratados similares o identicas a las de los ratones de tipo salvaje. La histologia revelo la expresion de GC1 mediada por AAV en los fotorreceptores y una restauracion de la translocacion de arrestina en los conos en ratones tratados. Ademas, las densidades celulares en los conos fueron mayores en los ojos tratados que en los controles contralaterales no tratados. Este resultado sugiere que el tratamiento es capaz de conservar los fotorreceptores de los conos durante al menos de tres meses despues del tratamiento. Esta es la primera demostracion de que la terapia genica postnatal es capaz de restaurar la funcion visual y el comportamiento, y conservar la estructura retiniana en, un modelo mamifero de LCA1. De forma importante, se obtuvieron resultados usando un vector AAV bien caracterizado, clinicamente relevante; los datos del modelo animal in vivo asi obtenidos proporcionan la fundacion de un vector de terapia genica basado en AAV para el tratamiento de ninos afectados con LCA1.

Materiales y metodos:

Animales experimentales:

Se sacaron embriones heterocigotos GC1 /- de una reserva crioconservada en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Los heterocigotos se aparearon en las instalaciones de los inventores para producir descendencia GC1KO (-/-) y de control /+ isogenica. Todos los ratones se criaron y mantuvieron en una instalacion centralizada en la institucion de los inventores en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. La comida y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Todos los estudios animales se aprobaron por el Comite de Cuidado y Uso Animal Institucional local y se realizaron de acuerdo con la Declaracion ARVO para el Uso de Animales en la Investigacion Oftalmica y de la Vision y las regulaciones NIH.

Construccion de vectores AAV:

Los vectores de virus adeno-asociados del serotipo 5 (AAV5) se usaron para distribuir GC1 murino (mGC1) ya que se ha mostrado que presentan fuerte eficiencia de transduccion y un comienzo mas rapido de la expresion en los fotorreceptores retinianos que de otros serotipos de AAV (Yang et al., 2002). Se seleccionaron tanto un promotor especifico de la celula como uno ubicuo para conducir la expresion de mGC1. El receptor acoplado a proteina G quinasa 1 (GRK1), especifico de la celula, tambien conocido como promotor de rodopsina quinasa, se eligio por su capacidad para dirigir especificamente una expresion transgenica fuerte en fotorreceptores de bastones y conos cuando se usa en conjunto con AAV (Khani et al., 2007). El promotor smCBA ubicuo que muestra un patron de expresion similar a CBA de longitud completa en la retina se eligio por su capacidad de dirigir eficientemente la retina neural (Haire et al., 2006). La reaccion de cadena polimerasa que utiliza el siguiente cebador directo:

5'-AAAAGCGGCCGCATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCC-3' (SEQ ID NO:14)

Y el siguiente cebador inverso:

5'-AAAAGCGGCCGCTCACTTCCCAGTAAACTGGCCTGG-3' (SEQ ID NO:15)

Se uso para amplificar mGC1 desde un plasmido que contiene una fusion mGC1-eGFP (Bhowmick et al., 2009). El fragmento resultante se clono en el plasmido pCRblunt (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la secuencia se verifico. El plasmido del vector AAV que contiene smCBA que conduce la expresion de mGC1 (pTR-smCBA-mGC1) se creo sustituyendo el CBA de longitud completa con smCBA en el plasmido pTR-CBSB-hRPE65 (Jacobson et al., 2006) por medio de digestion ecoRI y posterior ligado. Posteriormente, hRPE65 se sustituyo con mGC1 por medio de digestion NotI y ligado, dando por resultado la creacion de pTR-smCBA-mGC1 (FIG. 11). Un plasmido de vector AAV que contiene promotor GRK1 humano que conduce la expresion de mGC1, pTR-GRK1-mGC1 se creo eliminando hGFP de pTR-hGRK1-hGFP (Beltran et al., 2010) y sustituyendolo con mGC1 por medio de digestion Notl y ligado (FIG.

11). Los vectores AAV se empaquetaron segun los metodos publicados previamente (Haire et al., 2006). Las particulas viricas se suspendieron de nuevo en la Solucion Salina Equilibrada (Alcon, Fort Worth, TX, EE.UU.) y se titularon por PCR a tiempo real cuantitativa (Jacobson et al., 2006). Los titulos resultantes fueron 4,69 x 1012 genomas viricos por mL (vg/mL) y 4,12 x 1013 vg/mL para AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1, respectivamente.

Inyecciones sub-retinianas:

Un pL de AAV5-GRK1-mGC1 (4,12 x 1010 genomas de vector distribuidos) o AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector distribuidos) se distribuyeron de forma sub-retiniana en el dia 14 despues del nacimiento (P14) en el ojo derecho de cada raton GC1KO, dejando el ojo izquierdo como un control contralateral. Las inyecciones sub-retinianas se realizaron como se describe anteriormente (Timmers et al., 2001; Pang et al., 2006). Se realizo un analisis adicional solo en animales que recibieron inyecciones comparables con exito (>60% de desprendimiento de retina y complicaciones minimas). Esta bien establecido que el area de desprendimiento de retina corresponde al area de transduccion virica (Cideciyan et al., 2008; Timmers et al., 2001).

Analisis electrorretinografico:

Los electrorretinogramas (ERG) de GC1KO tratados (n=14) y controles /+ isogenicos (n=2) se grabaron usando una unidad de control y grabacion basada en PC (Toennies Multiliner Vision; Jaeger/Toennies, Hochberg, Alemania) segun metodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Haire et al., 2006). Las medidas de ERG iniciales se grabaron a las 4 semanas despues de la inyeccion, y cada 2 semanas posteriores a partir de ahi, hasta los 3 meses despues de la inyeccion (el ultimo punto temporal evaluado en el estudio). Los controles isogenicos /+ emparejados por edad se grabaron junto con los animales tratados en cada punto temporal. Los ratones se adaptaron a la oscuridad toda la noche (mas de 12 horas) y se anestesiaron con una mezcla de 100 mg/kg de ketamina, 20 mg/kg de xilazina y solucion salina en una relacion 1:1:5, respectivamente. Las pupilas se dilataron con tropicamida al 1% e hidrocloruro de fenilefrina al 2,5%. Se uso un bano de agua circulante caliente para mantener la temperatura corporal a 38°C. Se aplico hidroxipropilmetilcelulosa al 2,5% en cada ojo para evitar la deshidratacion de la cornea. Se grabaron los ERG de campo completo usando electrodos de la cornea de bucle de alambre de oro, a medida. Se pusieron los electrodos de referencia y de tierra de forma subcutanea entre los ojos y en la cola, respectivamente. Las grabaciones de los bastones escotopicos se obtuvieron con una serie de destellos blancos de siete intensidades en aumento (0,01 mcds/m2 a 5 cds/m2). Los intervalos entre estimulos para los estimulos de baja intensidad fueron de 1,1 segundos. A las tres intensidades mayores (100 mcds/m2, 1 cds/m2 y 5 cds/m2), los intervalos entre estimulos fueron 2,5, 5,0 y 20,0 segundos, respectivamente. Se grabaron diez respuestas y se promediaron en cada intensidad. Los ratones se adaptaron despues a la luz a un fondo blanco de 100 cds/m2 durante 2 min. Las respuestas de los conos fotopicas se obtuvieron con una serie de cinco intensidades de luz en aumento (100 mcds/m2 a 12 cds/m2). Se grabaron cincuenta respuestas y se promediaron en cada intensidad. Todos los estimulos se presentaron en presencia del fondo de 100 cds/m2. Las amplitudes de onda B se definieron como la diferencia entre los puntos minimos de la onda a los picos positivos de cada onda.

Las amplitudes maximas de onda b fotopica (las generadas a 12 cds/m2) de todos los ratones GC1KO tratados con smCBA-mGC1 (n = 6) y tratados con hGRK1-mGC1 (n = 8) (ojos tratados o no tratados) y de control /+ isogenico se promediaron y se usaron para general errores estandar. Estos calculos se hicieron en cada punto temporal (4 semanas - 13 semanas despues de la inyeccion). Estos datos se importaron a Sigma Plot para una presentacion grafica final. La prueba t apareada se uso para calcular los valores P entre los ojos tratados y no tratados en cada grupo de promotor (smCBA o hGRK1) y entre cada grupo promotor en el tiempo (4 semanas despues de la inyeccion frente a 3 meses despues de la inyeccion). La prueba t estandar se uso para calcular los valores P entre los ojos tratados con smCBA-mGC1 frente a hGRK1-mGC1. Se definio la diferencia significativa como un valor P <0,05. Debido a que algunos de los ratones de cada grupo tratado se quitaron temporalmente del estudio para analisis conductuales, el numero total de ratones promediados y presentados en cada punto temporal en la FIG. 2A y la FIG. 2B difiere. Tres ratones del grupo tratado con smCBA-mGC1 se enviaron para la prueba optomotora, dejando un “n” de 3 ratones usados para el analisis de ERG durante las medidas de 8, 10 y 12 semanas (FIG. 2A). Dos ratones del grupo tratado con hGRK1-mGC1 se enviaron para la prueba optomotora, dejando un “n” de 6 usados para el analisis de ERG durante las medidas de 6, 8, 10 y 12 semanas (FIG. 2B). Todos los ratones enviados para el analisis conductual se midieron a las 13 semanas despues de la inyeccion tras su vuelta a los laboratorios de los inventores (smCBA-mGC1: n = 3, hGRK1-mGC1: n = 2) despues de completar los analisis conductuales.

Prueba optomotora:

Las agudezas visuales fotopicas y las sensibilidades al contraste de ojos de raton GC1KO tratados y no tratados se midieron usando un paradigma de eleccion forzada de dos alternativas como se describe anteriormente (vease p.ej., Umino et al., 2008; Alexander et al., 2007). Para probar la sensibilidad de los ojos individuales del mismo animal se aprovecho el hecho de que la vision del raton tiene un minimo solapamiento binocular y que el ojo izquierdo es mas sensible a la rotacion en el sentido de las agujas del reloj y el derecho a la rotacion en contra del sentido de las agujas del reloj (Douglas et al., 2005). Por consiguiente en el protocolo optomotor “separado al azar” de los inventores, la agudeza de cada ojo y el umbral de sensibilidad al contraste se determino de forma separada y de forma simultanea por medio de funciones escalonadas para corregir las respuestas en las direcciones tanto en el sentido de las agujas del reloj como en contra del sentido de las agujas del reloj. La deteccion correcta de los patrones que rotan en la direccion de las agujas del reloj se condujo principalmente mediante senales visuales que se originan en el ojo izquierdo y las respuestas correctas en la direccion contraria a las agujas del reloj se derivaron de las senales visuales que se originan en el ojo derecho. La agudeza se definio como la mayor frecuencia espacial (100% de contraste) que da una respuesta umbral, y la sensibilidad al contraste se definio como 100 dividido por el porcentaje mas bajo de contraste que da una respuesta umbral. Para la agudeza fotopica, el estimulo inicial fue un patron sinusoidal de 0,200 ciclos/grado con un contraste fijo al 100%. Para medidas de sensibilidad de contraste fotopico, el patron inicial se presento al 100% de contraste, con una frecuencia espacial fija de 0,128 ciclos/grado. La vision fotopica se midio a una luminancia media de 70 cd/m2. Las agudezas visuales y las sensibilidades al contraste se midieron para ambos ojos de cada raton de cuatro a seis veces durante un periodo de 1 semana. Los animales de control /+ isogenicos, emparejados por edad (M1, M2) y los ratones GC1KO no tratados anteriormente (M3, M4) se presentan junto con los ratones tratados con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) y tratados con hGRK1-mGC1 (M8, M9) en la FIG. 3. Las amplitudes de ERG mediadas por los conos generadas a partir de estimulos de 12 cds/m2 de todos los ratones (M1-M9) se presentan junto con los resultados conductuales. Las pruebas t desapareadas se realizaron en valores de agudeza y porcentaje de contraste para determinar la significancia de los resultados.

Preparacion del tejido:

Tres meses despues de la inyeccion, los ratones GC1KO tratado a P14 y los controles /+ isogenicos emparejados por edad se adaptaron a la oscuridad durante 2 h. Inmediatamente despues de la adaptacion a la oscuridad, los ratones se sacrificaron bajo luz roja tenue (>650 nm). El limbo de ojos inyectados y no inyectados se marco con una aguja caliente en la posicion 12:00, facilitando la orientacion. La enucleacion se realizo bajo luz roja tenue y los ojos se colocaron inmediatamente en paraformaldehido al 4%. Los ojos que se iban a usar para la crioseccion se prepararon segun los metodos descritos anteriormente (Haire et al., 2006). Brevemente, las corneas se quitaron de cada ojo, dejando las lentes dentro de la copa ocular restante. Se hizo un pequeno corte en forma de “V” en la esclerotica adyacente al limbo quemado para mantener la orientacion. Despues de la fijacion toda la noche, la lente y el vitreo se eliminaron. La copa ocular que contenia la retina/RPE restante se coloco en sacarosa al 30% en PBS durante al menos 1 h a 4°C. Las copas oculares se pusieron despues en compuesto criostatico (Tissue Tek OCT 4583; Sakura Finetek, Inc., Torrance, CA, EE.UU.) y se congelaron instantaneamente en un bano de hielo seco/etanol. Los ojos se seccionaron en serie a 10 pm con un criostato (Microtome HM550; Walldorf, Alemania). Los ojos que se iban a usar para el analisis de preparacion completa se prepararon segun los metodos descritos anteriormente (Pang et al., 2010). Se alcanzo la orientacion como se menciona anteriormente. Despues de la fijacion toda la noche, la cornea, lente, vitreo y el epitelio pigmentario de la retina se eliminaron de cada ojo sin alterar la retina. Se hizo un corte en la parte superior (dorsal) de la retina adyacente al limbo original quemado para mantener la orientacion.

Inmunohistoquimica y microscopia:

Las criosecciones retinianas y las preparaciones completas se lavaron 3 x en 1X PBS. Despues de estos lavados, las muestras se incubaron en Triton X-100® al 0,5% durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Despues, las muestras se bloquearon en una disolucion de albumina de suero bovino (ASB) al 1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones retinianas se incubaron toda la noche a 37°C con un anticuerpo GC1 policlonal de conejo (1:200, sc-50512, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA, EE.UU.) o anticuerpo de arrestina de conos policlonal de conejo (“Lumij” 1:1000, proporcionado por Dr. Cheryl Craft, Universidad del Sur de California, Los Angeles, CA, EE.UU.) diluido en Triton X-100® al 0,3%/ASB al 1%. Las preparaciones completas retinianas se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con el mismo anticuerpo de arrestina de los conos, diluido al 1:1000 en Triton X-100® al 0,3%/ASB al 1%. Despues de la incubacion primaria, las secciones retinianas y las preparaciones completas se lavaron 3X con 1X PBS.

Las secciones retinianas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios de IgG marcados con fluoroforo Alexa-594 o Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.), diluido a 1:500 en 1X PBS. Despues de la incubacion con anticuerpos secundarios, las secciones y preparaciones completas se lavaron con 1X PBS. Las secciones retinianas se contratineron con 4’,6’-diamino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. Despues de un enjuague final con 1X PBS y agua, las secciones se montaron en un medio con base acuosa (DAKO) y se pusieron en un portaobjetos. Las preparaciones completas retinianas se orientaron en portaobjetos con la parte superior (dorsal) de la retina colocada en la posicion 12:00. Las muestras se montaron en DAKO y se pusieron en un portaobjetos.

Las secciones retinianas se analizaron con microscopia confocal (Microscopio confocal espectral TCS SP2 AOBS Leica equipado con el programa LCS version 2.61, Build 1537, (Bannockburn, IL, EE.UU.). Todas las imagenes se tomaron con configuraciones de exposicion identicas con ampliacion o 20x o 63x. Las longitudes de onda de excitacion usadas para las tinciones DAPI, GC1 y de arrestina de los conos fueron a 405 nm, 488 nm y 594 nm, respectivamente. Los espectros de emision fueron 440-470 nm, 500-535 nm y 605-660 nm, respectivamente. Las preparaciones completas retinianas se analizaron con un microscopio fluorescente de campo completo (Axioplan 2) (Zeiss, Thornwood, NY, EE.UU.) equipado con una Camara Qlmaging Retiga 4000R y el programa Qlmaging QCapture Pro (Qlmaging, Inc., Surrey, BC, Canada). Los cuadrantes de cada preparacion completa se captaron en imagenes a 5x con configuraciones de exposicion identicas y despues se juntaron en Photoshop® (Version 7.0) (Adobe, San Jose, CA, EE.UU.).

Analisis de la imagen:

Las densidades de los fotorreceptores de los conos se analizaron en las preparaciones completas retinianas contando las celulas etiquetadas con fluoroforo secundario dirigido contra el anticuerpo de arrestina de los conos en la retina central e inferior usando el programa ImageJ® (Institutos nacionales de la salud, Bethesda, MD, EE.UU.). Estos valores se obtuvieron haciendo zoom en los archivos 5X TIFF mostrados en la FIG. 6. Se pusieron cinco cuadrados (500 pm2) sobre areas identicas en la retina central e inferior de los ojos GC1KO tanto tratados como no tratados. Para la retina central, los cuadrados se colocaron a una excentricidad igual alrededor de la cabeza del nervio optico en todos los ojos (125 pm). Los fotorreceptores de los conos se contaron en cada area retiniana respectiva, los valores se promediaron y las desviaciones estandar se calcularon. La prueba t estandar se uso para calcular los valores P entre las muestras deseadas. La diferencia significativa se definio como un valor P <0,05.

Resultados

La funcion del fotorreceptor (ERG) se restauro en ratones GC1 KO tratados con AAV:

Se presento anteriormente que las respuestas de los conos en el raton GC1KO son apenas detectables 1 al mes de edad. Aqui los inventores han mostrado que el tratamiento P14 de este raton con un vector AAV que porta el gen GC1 de raton bajo el control del promotor especifico del fotorreceptor (hGRK1) o ubicuo (smCBA) llevo a la restauracion sustancial de la funcion del fotorreceptor de los conos como se mide por el ERG. Las trazos de conos representativos (FIG. 1) (ademas de las amplitudes de onda b fotopicas promedio (FIG. 2A y FIG. 2B) de tratados con hGRK1 -mGC1, tratados con smCBA-mGC1, GC1 KO y controles /+ isogenicos) mostraron que la funcion de los conos en los ojos tratados se restauro a aproximadamente el 45% de lo normal a las cuatro semanas despues de la inyeccion. Similar a los informes anteriores, las respuestas de los conos en ojos contralaterales, no tratados, se extirparon en este punto temporal. A las 4 semanas despues de la inyeccion, la amplitud de onda b mediada por los conos promedio en los ojos tratados con smCBA-mGC1 (65,1 pV) fue significativamente mayor (P = 0,006) que la de los ojos no tratados (3,9 pV). La amplitud de onda b mediada por los conos promedio en ojos tratados con hGRK1-mGC1 (59,1 pV) fue significativamente mayor (P <0,001) que en los ojos no tratados (3,2 pV). El nivel de restauracion alcanzado cuatro semanas despues de la distribucion del vector hGRK1-mGC1 especifico del fotorreceptor no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector smCBA-mGC1 que contiene promotor ubicuo (P = 0,604). A los 3 meses despues de la inyeccion, la amplitud de onda b mediada por los conos promedio en ojos tratados con smCBA-mGC1 (53,3 pV) fue significativamente mayor (P < 0,001) que la de los ojos no tratados (2,8 pV). La amplitud de onda b mediada por conos promedio en ojos tratados con hGRK1-mGC1 (45,3 pV) fue significativamente mayor (P < 0,001) que la de los ojos no tratados (3,4 pV). El nivel de restauracion alcanzado 3 meses despues de la distribucion del vector GRK1-mGC1 especifico del fotorreceptor no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector smCBA-mGC1 que contiene promotor ubicuo (P = 0,331). Ambos promotores dieron niveles similares de restauracion funcional de los conos en los ojos tratados del raton GC1KO en el corto plazo. De forma importante, la restauracion de la funcion del fotorreceptor de los conos permanecio estable durante 3 meses (el ultimo punto temporal evaluado en este estudio (vease FIG. 1, FIG. 2A y FIG. 2B). No hubo una diferencia significativa en las amplitudes de onda b fotopicas de los ojos tratados con smCBA-mGC1 o tratados con hGRK1-mGC1 entre las 4 semanas y los 3 meses despues del tratamiento (P = 0,174 y 0,125, respectivamente).

Los tiempos implicitos de ERG que son una caracteristica importante en el diagnostico de varios trastornos retinianos que incluyen otras formas de LCA (Sun et al., 2010) tambien se determinaron. Aunque no se puede obtener dicha medida de un ojo GC1KO (no hay respuestas de ERG en estos ojos), fue posible comparar los tiempos implicitos de onda b de los conos en ratones tratados con AAV-mGC1 y de control /+ isogenicos. A las 4 semanas despues de la inyeccion, no habia diferencia significativa entre los tiempos implicitos de onda b de los conos en los ojos tratados y de control /+ (P=0,884); los valores promedio en los ojos tratados con AAV-mGC1 y /+ en este punto temporal fueron 50,8 ms y 50,4 ms, respectivamente. A los 3 meses despues de la inyeccion, no hubo tampoco una diferencia significativa entre los dos grupos (P=0,697); los promedios de todos los tiempos implicitos de onda b de los conos en los ojos tratados y de control /+ fueron 59,7 ms y 58,3 ms, respectivamente. Las cineticas de respuesta de los conos en la retina GC1KO tratada (como se determina por medidas de tiempo implicito) parecieron ser normales y estables en el corto plazo.

Se presento anteriormente que los ERG de bastones en el raton GC1KO muestran alteraciones 1 al mes de edad, con la onda a y la onda b de los bastones marcadamente reducidas (Yang et al.,1999). Esta reduccion se estabiliza a los 5 meses de edad con respuestas aproximadamente al 50-70% de la del raton tipo salvaje (WT). Aunque algunos ejemplos de mejoras mediadas por AAV-mGC1 se observaron en los ojos tratados de ratones GC1KO respecto a controles no tratados (ejemplo visto en la FIG. 1), este resultado no fue tan consistente como el visto en las respuestas mediadas por los conos.

El comportamiento visual se restauro en ratones GC1KO tratados con AAV:

El analisis optomotor revelo que los ojos de ratones GC1KO tratados tanto con smCBA-mGC1 (M5, M6, M7) como con hGRK1-mGC1 (M8, M9) respondieron significativamente mejor que los ojos no tratados bajo todas las condiciones mediadas por los conos, fotopicas. Los ojos GC1KO no tratados rindieron pobremente con una agudeza visual de 0,163 ± 0,040 ciclos por grado (FIG. 3B y FIG. 3C, barra, media ± de, n = 9 ojos). Los ojos de control GC1+/+ isogenicos (M1, M2) responden significativamente mejor, mostrando una agudeza promedio de 0,418 ± 0,046 ciclos por grado (n = 4 ojos). Los ojos tratados con AAV-mGC1 (M5-M9) tienen una agudeza promedio de 0,392 ± 0,077 ciclos por grado (n = 5 ojos), un nivel esencialmente identico a los ojos /+ de control y significativamente mejor que los ojos GC1KO no tratados (P<0,0001). Las sensibilidades al contraste fotopicas (FIG. 3B y FIG. 3C) fueron en paralelo a los resultados de agudeza fotopica, mostrando los ojos tratados con AAV-mGC1 (sensibilidad al contraste de 11,9 ± 7,37, n= 5 ojos) umbrales de contraste casi identicos a los ratones /+ (11,94 ± 3,03, n = 4 ojos). De nuevo, los ojos GC1KO tratados a P14 con AAV-mGC1 rindieron significativamente mejor que los ojos no tratados, que mostraron una sensibilidad al contraste promedio de 1,27 ± 0,31 (n = 9, P< 0,0001). En todas las pruebas fotopicas, los ojos GC1KO no tratados rindieron de forma extremadamente pobre, esencialmente equivalente a ninguna funcion mediada por los conos. Las comparaciones estadisticas de estas medidas se muestran en la Tabla 1. Las trazos de ERG mediados por conos de todos los ratones GC1+/+ (M1, M2), GC1 KO (M3, M4), tratados con smCBA-mGC1 (M5, M5, M7) y tratados con hGRK1-mGC1 (M8, M9) usados en el analisis conductual se muestran en la FIG. 3A para relacionar la funcion visual (comportamiento optomotor) con la funcion retiniana (electrofisiologia).

La funcion retiniana de los bastones (ERG) se conserva parcialmente en el raton GC1KO. Los estudios han mostrado que incluso amplitudes de ERG muy pequenas se traducen en fuertes comportamientos visuales (Williams et al., 2006). De hecho, se encontro que los pacientes de LCA2 que recibieron terapia de AAV-RPE65 muestran restauracion conductual a pesar de la completa carencia de respuesta de ERG (Maguire et al., 2008). La prueba optomotora revelo que las agudezas visuales mediadas por los bastones, escotopicas, y las sensibilidades al contraste de los ojos GC1KO son muy similares a los controles /+. Por esta razon, fue imposible comparar la restauracion visual de los ojos tratados frente a no tratados a un nivel conductual. Las comparaciones estadisticas de estas medidas se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1

Comparacion estadistica de las funciones visuales fotopicas de ojos WT, CG1KO tratados con AAV-mGC1 y no tratados como se miden por el comportamiento optomotor

Agudeza fotopica Tipo salvaie (WT) T ratado No tratado Numero de valores 4 5 9 Media 0,4183 0,3919 0,163 Desviacion estandar 0,0456 0,07731 0,03954

Valor P

WT frente a tratado 0,5671 No significativo WT frente a no tratado <0,0001 ^* Tratado frente a no tratado <0,0001 ^* Sensibilidad al contraste fotopica WT T ratado No tratado Numero de valores 4 5 9 Media 11,94 11,16 1,27 Desviacion estandar 3,03 7,37 0,31

Valor P

WT frente a tratado 0,4186 No significativo WT frente a no tratado <0,0001 ^* Tratado frente a no tratado <0,0001 ^*

*= p < 0,0001

Tanto los promotores especificos del fotorreceptor como ubicuos conducen la expresion transgenica de mGC1 en los bastones y conos de los ratones GC1 KO:

La deficiencia de GC1 afecta a los fotorreceptores tanto de los bastones como de los conos en pacientes de LCA1. El promotor RK humano especifico de fotorreceptor y el promotor smCBA ubicuo se eligieron por tanto para este estudio como un medio de dirigir ambos tipos celulares. El promotor RK humano se eligio por su pequeno tamano y capacidad para conducir de forma eficiente la expresion transgenica especificamente en las celulas del fotorreceptor. La inmunotincion de las retinas GC1KO 3 meses despues del tratamiento con AAV-hGRK1-mGC1 revelo que este promotor condujo una fuerte expresion de GC1 en los segmentos externos del fotorreceptor. Una imagen representativa de una seccion transversal de la retina a partir de un ojo inyectado con este vector terapeutico (FIG. 4A) muestra una intensa tincion de GC1 en la capa OS mientras el ojo no tratado contralateral del mismo raton carece de ninguna expresion de GC1 (FIG. 4B). El promotor smCBA tambien condujo de forma eficiente la expresion de GC1 en las celulas fotorreceptoras. Los OS del fotorreceptor mostraron una fuerte expresion de GC1 mediada por smCBA en los ojos tratados (FIG. 4C), respecto al ojo no tratado contralateral (FIG. 4D). Los niveles de expresion de GC1 mediada por hGRK1 y smCBA se aproximaron a los vistos en los ojos de control /+ isogenicos (FIG. 4E). La expresion de GC1 en ojos tratados con hGRK1-mGC1 se restringio a los OS. En los ojos tratados con smCBA-mGC1, la expresion de GC1 se encontro ocasionalmente en los cuerpos celulares del fotorreceptor de la capa nuclear externa (vease p.ej., las flechas de la FIG. 4F). Notablemente sin embargo, ningun constructo promotor condujo la expresion de GC1 terapeutico fuera de las celulas del fotorreceptor. Esta falta de expresion fuera del objetivo es relevante para el desarrollo de futuras aplicaciones clinicas.

La translocacion de arrestina de los conos se restauro en los ratones GC1KO tratados con AAV-mGC1:

El tratamiento con AAV-mGC1 restauro la translocacion de arrestina de los conos inducida por la luz a los fotorreceptores de los conos en la retina GC1 KO tratada. Las secciones transversales de retina tratada, no tratada y /+ representativas inmunotenidas con un anticuerpo generado contra la arrestina de los conos mostro que la arrestina de los conos estaba localizada en los segmentos externos, segmentos internos, axones y terminaciones sinapticas de los fotorreceptores de los conos /+, tratados con smCBA-mGC1 y tratados con hGRK1-mGC1 (FIG.

5A, FIG. 5C y FIG. 5D, respectivamente). Por el contrario, la arrestina de los conos permanecio localizada principalmente en los segmentos externos de los conos en retina GC1KO no tratadas (FIG. 5B). Este resultado fue coherente con la nocion de que los conos de la retina del raton GC1 KO estan hiperpolarizados de forma cronica. No fue solo una restauracion de la localizacion de la arrestina de los conos en las retinas tratadas, adaptadas a la oscuridad, observadas, sino que se vio una sobre-regulacion aparente de la proteina en los ojos tratados respecto a controles no tratados. De forma significativa, las densidades celulares en los conos tambien parecieron mayores en los ojos tratados respecto a los controles no tratados (vease p.ej., FIG. 5A, FIG. 5B y FIG. 5C).

Los fotorreceptores de los conos se conservaron en ratones GC1 KO tratados con AAV-mGC1:

El analisis de preparaciones completas de retinas contralaterales tratadas con smCBA-mGC1 y hGRK-mGC1 y no inyectadas 3 meses despues de la inyeccion con vector terapeutico que se tineron con un anticuerpo dirigido contra la arrestina del cono revelo que los fotorreceptores del cono se conservaron como resultado del tratamiento con el vector terapeutico (FIG. 6). Los conteos de fotorreceptores de los conos en las retinas inferior y central de las preparaciones completas retinianas tanto tratadas como no tratadas revelaron que habia una diferencia estadisticamente significativa en las densidades celulares de conos de los ojos tratados frente a no tratados. Este resultado fue coherente con la observacion de que fue claramente evidente una restauracion fuerte electrofisiologica y conductual. El tratamiento P14 de ratones GC1 KO con cualquier constructo terapeutico fue capaz de conservar la estructura de los fotorreceptores de los conos durante al menos tres meses.

Ejemplo 2 - El modelo animal que contiene una doble inactivacion GC1/GC2

Es importante notar que aunque solo los fotorreceptores de los conos estan afectados en el raton GC1KO (los bastones solo pierden la funcion parcial y no degeneran), los paciente de LCA1 muestran perdida de funcion de los bastones y degeneracion de los bastones. Se especula que la razon para esta diferencia es una diferencia especifica de la especie en dependencia con GC2, un pariente cercano de GC1 que se expresa en los fotorreceptores de los bastones. Los bastones de raton son capaces de funcionar en ausencia de GC1 presumiblemente porque GC2 es capaz de actividad reconstitutiva; sin embargo este no es el caso en humanos. Se necesita GC1para la funcion de los bastones, de ahi la degeneracion de los bastones. Un modelo de raton con doble inactivacion GC1/GC2 se genero y se mostro que tenia perdida de funcion de los bastones (ademas de la perdida de funcion de los conos como se ve en el GC1 K/O) (Baehr et al., 2007). Se probo a traves de estudios bioquimicos con este modelo que GC2 es el que proporciona la funcion a los bastones en ausencia de GC1. Habiendo dicho esto, es el raton con doble inactivacion GC1/GC2 el que imita de manera mas fiable la condicion humana (tanto conos como bastones afectados) (Karan et al., 2010). Para probar los vectores tanto rAAV-smCBA-mGC1 como rAAV-hGRK1-mGC1 en el raton con doble inactivacion GC1/GC2, los vectores rAAV se distribuyen precisamente de la misma manera y tiempo (dia 14 despues del nacimiento) que con el estudio de inactivacion de GC1 mencionado anteriormente. El analisis de la restauracion de la vision, tanto fisiologicamente como conductualmente, tambien se realiza de la misma manera a como se describe anteriormente para el estudio de inactivacion de GC1. Se pone un enfasis particular a las respuestas escotopicas (es decir, bastones), ya que se espera una recuperacion medible de la funcion de los bastones en los ratones con doble inactivacion GC1/GC2 tratados con un constructo del vector GC1.

Ejemplo 3 - Modelo animal murino “humanizado” de LCA1

Este ejemplo describe la creacion de un modelo animal murino “humanizado” de LCA1. En una realizacion, el modelo de raton contiene una desactivacion GC1/GC2/GCAP1. GCAP1 es la proteina que activa GC1. Para crear un sistema in vivo en que el GC1 humano expresado a partir de un vector rAAV de grado clinico disenado para usar en humanos pueda evaluarse para la funcion, se utiliza un raton transgenico hGCAP1 con triple desactivacion GC1/GC2/GCAP1. En este raton, la funcion visual se restaura mediante hGC1 mediado por rAAV que interactua solo con hGCAP1 (es decir, no esta presente GCAP1 murino endogeno). A partir de este estudio, es posible determinar si la proteina GCAP1 humana se necesita para estimular la actividad GC1 humana en el modelo de raton, y si la funcion puede restaurarse a los conos y bastones cuando los dos polipeptidos humanos se reconstituyen y se expresan en el modelo no humano (es decir, murino) de la enfermedad. Para generar el raton transgenico hGCAP1 con triple desactivacion de GC1/GC2/GCAP1 el raton con doble desactivacion GC1/GC2 (Baehr et al., 2007) se cruza con el raton con desactivacion GCAP1 (Mendez et al., 2001). El GCAP1 humano se expresa entonces de forma transgenica en el modelo animal para generar un raton transgenico hGCAP1 con triple inactivacion GC1/GC2/GCAP1. Los estudios en que se proporciona hGC1 vectorizado con rAAV a estos animales se realiza de una manera esencialmente identica a los metodos usados en el estudio de inactivacion de GC1. El analisis de restauracion de la vision, tanto fisiologicamente como conductualmente, se realiza entonces de la misma manera que se llevo a cabo en el estudio de inactivacion de GC1.

Ejemplo 4 - Constructos de vector ejemplares utiles en la practica de la invencion

Los mapas de los dos vectores ilustrativos se muestran en la FIG. 11. Uno contiene el promotor no especifico smCBA y el otro tiene el promotor limitado a bastones/conos GRK1. Ambos se han empaquetado en AAV serotipo 5. Todas las dosis de vector probadas hasta la fecha son seguras en la retina del raton. Cohortes de ratones GC1 -/- se inyectaron entonces de forma sub-retiniana el dia 14 despues del nacimiento (P14) y despues se analizaron periodicamente por ERG y mediante el comportamiento optocinetico fotopico (mediado por los conos). Como el raton GC1-/- mantiene un ERG mediado por los bastones, la monitorizacion del rescate funcional se enfoco primeramente en la restauracion de la funcion de los conos. Para el vector smCBA los ERG se evaluaron a las 4 semanas despues del tratamiento y cada 2 semanas a partir de ahi hasta las 12-13 semanas despues del tratamiento. Los 9 ojos tratados en 9 ratones respondieron al tratamiento. Los resultados, mostrados a continuacion demuestran una restauracion significativa de las amplitudes de ERG fotopicas a partir de esencialmente no grabables en ojos no tratados de control a aproximadamente 50% de lo normal en ojos tratados con vector companero.

Cuatro ratones GC1-/- se analizaron entonces mediante el comportamiento optocinetico escotopico para diferencias mediadas por ojos companeros tratados frente a no tratados (mostrado a continuacion). Los cuatro ojos tratados (289, 290, 294, 295, barras rojas) mostraron una mejora significativa en la agudeza visual sobre sus ojos de control, y tres de los cuatro mostraron sensibilidad al contraste significativamente mejorada. Los ratones 297 y 298 eran controles tipo salvaje, y el raton 299 era un raton GC1-/- no tratado. Los resultados demuestran que el vector consiguio la restauracion funcional y conductual de la vision mediada por los conos en el modelo animal de LCA1.

Para el vector GRK1 que limita la expresion de los bastones y los conos, los ERG se evaluaron en 14 ratones GC1-/-tratados en un ojo a las 4 semanas despues del tratamiento y cada 2 semanas a partir de ahi hasta las 12-13 semanas despues del tratamiento. Doce de los 14 ojos tratados en 12 animales respondieron. Los resultados (mostrados a continuacion) revelaron una significativa restauracion de amplitudes de ERG fotopicas a partir de esencialmente no grabables en los ojos no tratados de control a aproximadamente 40% de lo normal en ojos tratados con vector companero.

Un raton GC1-/- (num. 293) se analizo entonces por el comportamiento optocinetico escotopico para las diferencias en ojos companeros tratados frente a no tratados (mostrado anteriormente). Este raton mostro una mejora significativa tanto en agudeza visual como sensibilidad al contraste en el ojo derecho tratado con vector (barra roja) respecto a su ojo izquierdo de control (barra azul). Las respuestas fueron casi equivalentes a los ratones tipo salvaje de control (297 y 298) y mejoradas significativamente sobre un raton GC1 -/- no tratado (299). Se concluyo por lo tanto que el vector GRK1 tambien alcanza la restauracion funcional y conductual de la vision mediada por los conos en este modelo de LCA1.

Ejemplo 5 - La fijacion como objetivo del cono especifico de wtGC1 mejora el rescate

Los datos presentados anteriormente demuestran claramente que la funcion del cono y el comportamiento mediado por los conos puede rescatarse con el promotor GRK1 limitado a bastones/conos. Como la LCA1 humana muestra deficits tanto de bastones como de conos (a diferencia del raton GC1-/- que muestra principalmente deficits de conos), la expresion no necesita limitarse mas para conseguir la especificidad del cono pura. Sin embargo, hay un fenotipo de cono final en el modelo de raton que es importante estudiar: en condiciones adaptadas a la oscuridad, la arrestina del cono no se mueve normalmente desde los segmentos externos del cono a los segmentos internos, axones y terminaciones sinapticas como lo hace en la retina de tipo salvaje. Los estudios se realizaron por tanto para evaluar si el fenotipo biologico celular se corrigio tambien en ojos GC1-/- tratados con vector. En los resultados mostrados, un raton GC1-/- se trato en un ojo con el vector GRK1, despues a las 7 semanas despues de la inyeccion el raton se adapto a la oscuridad. Las retinas tratada (panel inferior) y de control (panel superior) se analizaron entonces para la localizacion de la arrestina de los conos mediante inmunohistoquimica. En la retina GC1-/- no tratada (panel superior), la arrestina del cono permanecio en gran medida en los segmentos externos del cono (OS) y la capa sinaptica (SL). En contraste, en la retina tratada contralateral (panel inferior) una fraccion sustancial (~50%) ha translocado a los segmentos internos y las terminaciones sinapticas. Se concluyo, por lo tanto, que el tratamiento con vector tambien restauro la correcta translocacion de la arrestina de los conos.

Ejemplo 6 - Terapia a largo plazo de LCA1 usando constructos geneticos vectorizados con rAAV

Los ejemplos anteriores han demostrado que la inyeccion sub-retiniana de vectores rAAV que contienen ADNc de GC1 murino (conducido por el promotor tanto de rodopsina quinasa [hGRKI] humana especifica del fotorreceptor como ubicuo [smCBA]) fueron capaces de restaurar la funcion mediada por los conos y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el raton GC1KO durante al menos tres meses.

En el presente ejemplo, los inventores evaluaron si la terapia a largo plazo era tambien alcanzable en el modelo de roedor de LCA1. Adicionalmente, los inventores examinaron si la distribucion de GC1 a los fotorreceptores del raton de doble inactivacion GC1/GC2 (GCdko), un modelo que muestra perdida de estructura y funcion tanto de bastones como de conos y se parece fenotipicamente a la LCA1 humana, daria terapia a estas celulas.

Metodos

Las inyecciones sub-retinianas de AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 o el mutante altamente eficiente de tirosina de la capside AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se realizaron en un ojo de ratones GC1KO o GCdko entre el dia 14 despues del nacimiento (P14) y P25. La funcion del fotorreceptor de bastones y conos se evaluo electrorretinograficamente. La localizacion de la expresion de GC1 terapeutica y la extension de la conservacion del fotorreceptor de los conos se determinaron por inmunohistoquimica. Los estudios de biodistribucion se usaron para evaluar la presencia de los genomas del vector en los nervios opticos y los cerebros de los animales tratados.

Resultados

La funcion del fotorreceptor de los conos se restauro en los ratones GC1 KO tratados con todos los vectores, siendo el AAV8(733) el mas eficiente. Las respuestas fueron estables durante al menos 10 meses despues del tratamiento. Se encontro GC1 terapeutico en los segmentos externos del fotorreceptor. Durante 10 meses despues de la inyeccion, se detectaron genomas de vectores AAV5 y AAV8(733) solo en los nervios opticos de los ojos tratados de los ratones GC1KO. mGC1 vectorizado con AAV8(733) restauro la funcion tanto en bastones como en conos en ratones GCdko tratados.

Conclusion

La terapia a largo plazo se consigue en un modelo de mamifero de deficiencia de GC1, el raton GC1 KO, usando los constructos de vector rAAV descritos en la presente memoria. De forma importante, la terapia es tambien alcanzable en el raton GCdko que imita el fenotipo de bastones/conos de LCA1. Estos resultados proporcionan la evidencia para el uso de vectores en terapia genica basados en rAAV para el tratamiento de las distrofias retinianas, y LCA1 en particular.

Ejemplo 7 - Conservacion a largo plazo de los fotorreceptores de los conos y la restauracion de la funcion de los conos por terapia genica en el raton GC1 KO

En ejemplos anteriores, se mostro que los vectores AAV5 sub-retinianos que contienen ADNc de GC1 murino conducidos por un promotor o especifico de los fotorreceptores (hGRK1) o ubicuo (smCBA) fueron capaces de restaurar la funcion mediada por los conos y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el raton GC1 KO durante tres meses. En el presente ejemplo, la terapia a largo plazo se evalua usando el mismo modelo murino. AAV5-hGRK1-mGC1, AAV5-smCBA-mGC1 o el mutante de tirosina de capside altamente efectivo AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se distribuyeron de forma sub-retiniana a ratones GC1KO entre el dia 14 despues del nacimiento (P14) y el dia despues del nacimiento (P25). La funcion retiniana se ensayo por electrorretinogramas (ERG). La localizacion de la expresion de GC1 mediada por AAV y la supervivencia de los conos se ensayaron con inmunohistoquimica y la extension de los genomas del vector mas alla de la retina se cuantifico por PCR del nervio optico y el tejido cerebral. La funcion de los conos se restauro con todos los vectores probados, siendo el AAV8(Y733F) el mas eficiente. La expresion mediada por AAV de GC1 se encontro exclusivamente en los fotorreceptores. Durante 10 meses despues de la inyeccion, los genomas de AAV se detectaron solo en el nervio optico de los ojos tratados. Estos resultados demostraron por primera vez que la terapia a largo plazo es alcanzable en un modelo de mamifero de deficiencia de GC1.

La guanilato ciclasa-1 (GC1) retiniana codificada por GUCY2D sirve como funcion clave en la fototransduccion de los vertebrados (Pugh et al., 1997). Despues del estimulo de luz, el segundo mensajero GMP ciclico (cGMP) se hidroliza rapidamente por la fosfodiesterasa (PDE6) en las celulas del fotorreceptor llevando a un cierre de los canales cationicos cerrados por cGMP y la hiperpolarizacion de la celula. Cuando la [Ca2+] citoplasmatica cae por debajo de 50 nM, se activa GC1 mediante proteinas de union a Ca2+ pequenas, GCAP (proteinas que activan la guanilato ciclasa). La CG1 sintetiza cGMP que se une y reabre los canales cerrados por cGMP, devolviendo al fotorreceptor al estado despolarizado, “oscuro” (Pugh et al., 1997; Polans et al., 1996; Wensel, 2008; Lamb y Pugh, 2006; Arshavsky et al., 2002). Por consiguiente, GC1 juega un papel vital en los ciclos de luz-oscuridad y recuperacion, anclando, por medio de cGMP, el bucle de retroalimentacion que une los niveles de calcio intracelular y el estado de polarizacion de los fotorreceptores.

GC1 se expresa en los segmentos externos de los fotorreceptores de los bastones y los conos de las retinas humana, de mono y de raton (Dizhoor et al., 1994; Liu et al., 1994; Haire et al., 2006). Como otras guanilato ciclasas de membrana, contiene una secuencia senal N’-terminal, un dominio extracelular (ECD), un dominio transmembrana sencillo, un dominio de homologia tipo quinasa (KHD), un dominio de dimerizacion (DD) y un dominio catalitico C’-terminal (CCD), y esta presente probablemente como dimeros homomericos (Yang y Garbers, 1997). Las mutaciones en GUCY2D estan asociadas con la amaurosis congenita de Leber 1 (LCA1) recesiva ademas de las formas dominante y recesiva de distrofia de conos-bastones, CORD6 y CORD, respectivamente (Perrault et al., 1996; Perrault et al., 2000; Kelsell et al., 1998; Perrault et al., 1998; Gregory-Evans et al., 2000; Weigell-Weber et al., 2000; Ugur et al., 2010). LCA1 es un grave trastorno de cegado recesivo autosomico, de comienzo temprano, caracterizado por electrorretinograma (ERG) extinguido que precede a la degeneracion del fotorreceptor (Perrault et al., 1999; Chung y Traboulsi, 2009). CORD6 es un trastorno dominante caracterizado por la degeneracion progresiva de los fotorreceptores que comienza con los conos provocando la perdida temprana de la agudeza visual y vision del color seguido por la degeneracion de los bastones llevando a ceguera nocturna progresiva y perdida de campo visual periferico (Kelsell et al., 1998; Perrault et al., 1998). Las mutaciones CORD6 estan restringidas al dominio de dimerizacion (DD) y generalmente provocan un aumento en la activacion mediada por GCAP de GC1 (Payne et al., 2001; Downes et al., 2001; Wilkie et al., 2000). Una mutacion que provoca CORD recesivo recientemente encontrada esta situada en el dominio catalitico (CD) de GC1 y se piensa que reduce la funcion enzimatica total (Ugur et al., 2010). Las mutaciones que provocan LCA1 se distribuyen a lo largo de los dominios ECD, KHD, DD y CCD de GC1 (Karan et al., 2010). Estas mutaciones alteran la estructura enzimatica y la estabilidad, pueden impactar al transporte retrogrado de otras proteinas asociadas a la membrana periferica y son frecuentemente anuladoras.

El raton GC1KO porta una mutacion anuladora en Gucy2e, el homologo murino de GUCY2D. Como en los pacientes de LCA1, la perdida de funcion del cono en este modelo precede a la degeneracion del cono (Timmers et al., 2001). Los bastones retienen el 30-50% de su funcion y no degeneran debido a la presencia de GC2, otra guanilato ciclasa funcional en los fotorreceptores murinos (Yang y Garberse, 1997; Jacobson et al., 2006; Timmers et al., 2001; Cideciyan et al., 2008; Song et al., 2002). En los ejemplos mas tempranos, se mostro que la inyeccion sub-retiniana de vectores viricos adeno-asociados (AAV) de serotipo 5 que contienen el ADNc de GC1 murino conducido por el promotor de rodopsina quinasa humana especifico de fotorreceptor (hGRK1) o el ubicuo (smCBA) fueron capaces de restaurar la funcion mediada por el cono y el comportamiento visual y conservar los fotorreceptores de los conos en el raton GC1KO durante tres meses. En el presente estudio, la terapia de sustitucion genica mediada por AAV se evaluo por su capacidad para proporcionar terapia al raton GC1KO a largo plazo. Se distribuyeron AAV5-hGRK1-mGC1 y AAV5-smCBA-mGC1 y el vector mutante de tirosina de capside altamente eficiente AAv8(Y733F)-hGRK1-mGC1 de forma sub-retiniana a los ratones GC1KO entre el dia 14 despues del nacimiento (P14) y el dia 25 despues del nacimiento (P25). Estos descubrimientos demuestran por primera vez que la terapia a largo plazo es alcanzable en un modelo de mamifero de deficiencia de GC1. La biodistribucion del genoma del vector se evaluo tambien para vectores basados en AAV5 y AAV8(733). Estos descubrimientos tienen relevancia directa en el desarrollo de un ensayo clinico para terapia genica basada en AAV para LCA1 (y posiblemente distrofias del conobaston), y ayudan a desarrollar un diseno de vector estandarizado para una amplia gama de degeneraciones retinianas recesivas mediadas por defectos en genes asociados con los fotorreceptores.

Materiales y metodos

Animales experimentales:

Los controles de GC1KO y /+ congenicos derivados de cruces heterocigotos de ratones GC1 /- proporcionados por The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.) se criaron y mantuvieron en la instalacion de cuidado animal institucional de los inventores en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. El alimento y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con la Declaracion ARVO para el Uso de Animales en Investigacion Oftalmica y de la Vision y las regulaciones NIH.

Construccion de los vectores AAV:

Los plasmidos de vector del virus adeno-asociado de serotipo 5 (AAV5) que contenian o bien el promotor ubicuo (smCBA) o el de rodopsina quinasa humana especifico del fotorreceptor (hGRK1) que conduce el ADNc de GC1 murino (mGC1) se generaron segun los metodos descritos anteriormente (Boye et al, 2010). La mutagenesis dirigida al sitio de los residuos de tirosina expuestos en la superficie en la capside de AAV2 se han presentado (Zhong et al., 2008). Se usaron metodos similares para generar el mutante de capside AAV8(Y733F) descrito en la presente memoria. Todos los vectores se empaquetaron, se purificaron y se titularon segun los metodos descritos anteriormente (Zolotukhin et al., 2002; Jacobson et al., 2006). Los titulos resultantes para AAV5-smCBA-mGC1, AAV5-hGRK1-mGC1 y AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 fueron 4,69 x 1012 genomas de vector por ml (vg/mL), 4,12 x 1013 vg/mL y 1,08 x 1013 vg/mL, respectivamente.

Inyecciones sub-retinianas:

Un pL de AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector), AAV5-hGRK1-mGC1 (4,12 x 1010 genomas de vector) o AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (1,08 x 1010 genomas de vector) se inyectaron de forma sub-retiniana en un ojo de ratones GC1KO entre el dia 14 despues del nacimiento (P14) y el dia 25 posterior al nacimiento (P25). El ojo de control contralateral permanecio sin inyectar. Las inyecciones sub-retinianas se realizaron como se describe anteriormente (Timmers et al., 2001). Se realizo un analisis adicional solo en animales que recibieron inyecciones exitosas comparables (>60% de desprendimiento de retina con minimas complicaciones). Aproximadamente el 75% de todas las cohortes recibieron inyecciones “exitosas”. Esta bien establecido que el area de transduccion del vector corresponde a al menos el area de desprendimiento de retina (Timmers et al., 2001; Cideciyan et al., 2008).

Analisis electrorretinografico:

Los ERG de GC1 KO tratados y controles congenicos (+/+), emparejados por edad, se grabaron usando una unidad de control y grabacion basada en PC (Toennies Multiliner Vision; Jaeger/Toennies, Hochberg, Alemania) segun los metodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Haire et al., 2006; Boye et al., 2010). Las grabaciones de ratones GC1KO tratados con AAV5-smCBA-mGC1 (n = 10), ratones GC1KO tratados con AAV5-hGRK1-mGC1 (n = 6), ratones GC1KO tratados con AAV8(Y773F) (n = 6) y controles (+/+) congenicos (n = 8) comenzaron en fechas diferentes y por lo tanto cada subconjunto de ratones se monitorizo durante longitudes de tiempo ligeramente diferentes. Los ERG de los ratones GC1KO tratados se grabaron 4 semanas despues de la inyeccion y cada mes a partir de ahi hasta 1 ano despues de la inyeccion (ratones tratados con AAV5) o 9 meses despues de la inyeccion (ratones tratados con AAV8[Y773F]). Los ratones de control (+/+) congenicos, emparejados por edad, se siguieron durante 8 meses. Los ratones se quitaron del estudio a diferentes puntos temporales a lo largo del experimento por diversos estudios postmortem (estudios de biodistribucion, analisis inmunohistoquimicos retinianos, RT-PCR a tiempo real del tejido de la retina) o enfermedad/muerte inesperada. Los datos de ERG se presentaron solo para grupos de animales con una n > 3. Por lo tanto, este estudio compara los descubrimientos a 9 meses despues de la inyeccion para los ratones tratados con AAV5 y 6 meses despues de la inyeccion para ratones tratados con AAV8(Y733F). Los ratones tratados continuaron mostrando respuestas de ERG mas alla de estos puntos temporales, sin embargo los tamanos de muestra fueron suficientemente reducidos para que el analisis estadistico no fuera practico mas tiempo. Los trazos mediados por el cono representativos de ratones individuales 1 ano despues del tratamiento con vectores AAV5 y 9 meses despues del tratamiento con AAV8(Y733F) se presentan para apoyar esta contencion. Las grabaciones escotopicas (mediadas por bastones) y fotopicas (mediadas por conos) se obtuvieron usando parametros de grabacion descritos anteriormente (Boye et al., 2010). Las amplitudes de ondas b se definieron como la diferencia entre los puntos minimos de la onda a y el pico positivo posterior de cada onda. Las repuestas de ERG mediadas por bastones en ratones GC1 KO no tratados son variables de animal a animal. (Yang et al., 1999), por tanto, se observaron grandes desviaciones estandar cuando se promediaron las amplitudes de onda a y b escotopicas de diferentes animales. Los datos de ERG de los bastones se presentan en forma de relacion (el promedio de amplitudes de onda a y b de bastones tratados frente a no tratados, dentro del individuo). Como tal, cualquier valor por encima de 1 indica que el tratamiento de AAV-mGC1 mejoro la respuesta de los bastones. Las relaciones se calcularon usando amplitudes generadas con un estimulo de 1 cds/m2. Las amplitudes maximas de onda b mediadas por conos, fotopicas, en ojos inyectados y no inyectados de todos los ratones GC1 KO tratados y ratones de control (+/+) congenicos generadas a 12 cds/m2 se promediaron a cada punto temporal y se usaron para generar errores estandar. Todos los datos se importaron en Sigma Plot para una presentacion grafica final. La prueba t estandar se uso para calcular los valores P entre los conjuntos de datos. La diferencia significativa se definio como un valor P <0,05.

Biodistribucion:

La extension del ADN del vector en tejidos de los ratones GC1KO tratados se determino en muestras recogidas en el sacrificio segun los metodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Jacobson et al., 2006). Los ratones tratados con vector se sacrificaron en los siguientes puntos temporales: ratones tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (4 meses despues de la inyeccion: n =1, 7 meses despues de la inyeccion: n= 1), AAV5-smCBA-mGC1 (7 meses despues de la inyeccion: n = 1; 10 meses despues de la inyeccion: n = 5), AAV5-hGRK1-mGC1 (7 meses despues de la inyeccion; n = 1; 10 meses despues de la inyeccion: n = 1). Los tejidos de control de los ratones GC1KO emparejados por edad a los puntos temporales de 7 meses despues de la inyeccion o 10 meses despues de la inyeccion tambien se evaluaron junto a los animales experimentales. Despues del sacrificio, se usaron diferentes forceps nuevos para enuclear los ojos tratados y no tratados que retuvieron aproximadamente 0,5 cm del nervio optico proximal. Nuevas tijeras de diseccion, diferentes, se usaron entonces para cortar los nervios opticos de los globos oculares despues de lo cual se congelaron instantaneamente en nitrogeno liquido y se transfirieron a -80°C donde permanecieron hasta el momento de la extraccion de ADN. Los globos oculares se sumergieron en paraformaldehido al 4% (PAF) y se procesaron para inmunohistoquimica (vease a continuacion).

Los cerebros se quitaron y se uso una matriz cerebral coronal de raton de acero inoxidable (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE.UU.) para aislar las regiones especificas visuales. Los nucleos geniculados laterales derechos e izquierdos se recogieron de un raton por grupo de tratamiento (en el ultimo punto temporal), se fijaron con formalina y se guardaron en el caso de que los genomas de vector se recuperaran del cerebro y la inmunohistoquimica fuera necesaria. Partes separadas del cerebro derecho e izquierdo que contenian las rutas visuales se recogieron, se congelaron instantaneamente en nitrogeno liquido y se transfirieron a -802C donde permanecieron hasta el momento de extraccion de ADN. Se tomaron precauciones para evitar la contaminacion cruzada mientras se recogian los tejidos. El ADN genomico se extrajo de los tejidos segun el protocolo del fabricante (kit de tejido Qiagen DNeasy). Las concentraciones resultantes de ADN se determinaron usando un Biofotometro Eppendorf (Modelo 6131; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los PCR cuantitativos se realizaron segun los metodos descritos anteriormente con modificaciones menores (Jacobson et al., 2006; Song et al., 2002; Poirier et al., 2004).

Los pares de cebador se designaron a la region de senal de poli-adenilacion SV40 (SV40 polyA) en cada genoma de vector y se establecieron curvas estandar usando concentraciones conocidas de ADN de plasmido que contenian la misma secuencia diana SV40 polyA. Las muestras de ADN se ensayaron por triplicado. Para descartar falsos negativos debido a la inhibicion de PCR, el tercer replicado se “pincho” con ADN de plasmido que contenia la diana (SV40 polyA) en una relacion de 100 copias/gg de ADN genomico. Si se detectaron >40 copias del ADN pinchado, la muestra se considero aceptable para presentar copias del genoma de vector. En algunos casos las muestras que fallaron en “pinchar” se analizaron de nuevo usando menos de 1 gg de ADN genomico en las reacciones de PCR, diluyendo asi los inhibidores de PCR que copurifican con ADN en el tejido extraido. El numero de copias de pinchado se redujo proporcionalmente para mantener la relacion de 100 copias/gg de ADN. Los criterios para presentar las copias de genoma de vector se establecieron segun los metodos descritos anteriormente (Jacobson et al., 2006). Brevemente, mas de 100 copias de genoma/gg se considero positivo y el numero de copias/gg medido se presento. Menos de 100 copias/gg se considero negativo.

Preparacion de tejido, inmunohistoquimica y microscopia:

En el sacrificio, simultaneo con los estudios de biodistribucion realizados a los 7 meses despues de la inyeccion de [AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1] y 10 meses despues de la inyeccion de (AAV5-smCBA-mGC1 y AAV5-hGRK1-mGC1), el limbo de los ratones GC1KO tratados, ratones GC1KO no tratados, emparejados por edad, ademas de ratones GC1+/+ congenicos emparejados por edad, se marcaron con una aguja caliente en la posicion de 12 en punto, facilitando la orientacion. Los controles CG1KO no tratados y GC1 /+ se emparejaron por edad a los ratones tratados con AAV8(Y733F) (8 meses de edad en el momento del sacrificio). Los ojos designados para la crioseccion se procesaron e inmunotineron segun los metodos descritos anteriormente (Haire et al., 2006). Brevemente, secciones de retina de 10 gm se incubaron con anticuerpos dirigidos contra GC1 (policlonal de conejo 1:200, sc-50512 Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) o arrestina de conos de raton (“LUMIj” policlonal de conejo, 1:1000, proporcionado por Dr. Cheryl Craft, Universidad del Sur de California, Los Angeles, CA, EE.UU.). Despues de la incubacion primaria, se aplicaron anticuerpos secundarios de IgG Alexa-488 o Alexa-594, respectivamente, durante 1 hora a temperatura ambiente (1:500 en 1X PBS). Las secciones se contratineron con 4’,6’-diamino-2-fenil-indol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. A los 11 meses despues de la inyeccion, un raton GC1 KO que recibio tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 en un ojo solo se sacrifico y las preparaciones completas retinianas de los ojos tratado y no tratado se procesaron segun los metodos descritos anteriormente (Pang et al., 2010). Brevemente, las preparaciones completas se tineron con LUMIj (1:1000) seguido por Alexa-594 secundaria de IgG (1:500 en 1X PBS) y se pusieron en portaobjetos con la parte superior (dorsal) de la retina orientada a las 12 en punto. Las secciones retinianas se analizaron por microscopia confocal (microscopio Confocal Espectral TCS SP2 AOBS Leica equipado con el programa LCS version 2.61, Build 1537). Las imagenes se tomaron con configuraciones de exposicion identicas con ampliacion 20X. Las preparaciones completas retinianas se analizaron con un microscopio fluorescente de campo completo (Zeiss Axioplan 2) equipado con Camara QImaging Retiga 4000R y el programa QImaging QCapture Pro. Los cuadrantes de cada preparacion completa se tomaron en imagenes a 10X con configuraciones de exposicion identicas y despues se mezclaron en Adobe Photoshop.

Electroinmunotransferencia

A los 7 meses despues de la inyeccion, un raton inyectado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 y un raton (control) GC1 /+ congenico, emparejado por edad, se sacrificaron, sus ojos se enuclearon y se pusieron en 1X PBS. Las retinas se diseccionaron inmediatamente y se procesaron como sigue. Las retinas individuales se solubilizaron en PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM) con Triton X-100 al 1% e inhibidor de proteasa completo (Roche) durante 1 hora a 4°C, seguido por centrifugado a 14000 rpm. La concentracion de proteina del sobrenadante se determino por BCA (Pierce) y se separaron 15 gg de cada muestra en un gel de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas Immobilon-FL durante 1 hora en tampon de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM) que contenia 15% de metanol. Las transferencias se trataron con tampon de bloqueo (Li-Cor) y se etiquetaron durante 1 hora con un anticuerpo monoclonal de raton que reconoce GC1 (IS4, 1:3000, proporcionado por Dr. Kris Palcweski, Universidad Case Western, EE.UU.) y anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra GCAP1 (pAb UW14, 1:25.000, proporcionado por Dr. Wolfgang Baehr, Universidad de Utah) y pactina (1:5000, Abcam). Los anticuerpos secundarios (Ig anti-raton de cabra conjugado con CW800 y anti-conejo de cabra conjugado con IR680) se aplicaron durante 1 hora y las transferencias se tomaron en imagenes con un Sistema de Formacion de Imagenes Infrarrojas Odyssey (Licor, Lincoln, NE, EE.UU.).

Cuantificacion del ARNm por rtPCR, recuperacion del genoma retiniano e IHC del Nervio Optico

Los ojos individuales tratados con nervio optico unido se recogieron de los ratones GC1KO 1 ano despues del tratamiento con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 o AAV5-smCBA-mGC1 y de un raton GC1 /+ no tratado, emparejado por edad. Las retinas se diseccionaron del ojo inmediatamente y se congelaron instantaneamente en nitrogeno liquido. Los nervios opticos se disociaron de los ojos, se fijaron en paraformaldehido al 4% toda la noche a 4°C, se sumergieron en sacarosa al 30% durante 2 horas a 4°C, y despues se congelaron rapidamente en compuesto criostatico (Tissue Tek® OCT 4583; Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA, EE.UU.) en un bano de hielo seco/etanol. Los nervios opticos se seccionaron a 10 pm y se tineron segun los metodos descritos anteriormente (Boye et al., 2010). Las retinas se homogeneizaron en 350 mL de Tampon RLT (Mini Kit de proteccion RNeasy®, Qiagen, Inc., Valencia, CA, EE.UU.) mas BME durante 45 s. Las muestras se centrifugaron y el lisato se dividio por la mitad (una mitad designada para la recuperacion de genoma y la otra mitad para la extraccion de ARN) (Traint y Whitehead, 2009). La recuperacion del genoma se realizo como se describe anteriormente. La extraccion de ARN se realizo con un Mini Kit de Proteccion RNeasy® (Qiagen, Inc.). El ARN se transcribio de forma inversa (kit de sintesis de ADNc iScript®, Biorad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y se uso en PCR a tiempo real (Supermezcla verde iQ SYBR® y sistema de deteccion de PCR a tiempo real MyiQ adaptado con ciclador termico iCycler®, Biorad Laboratories) para medir los siguientes ARNm especificos de la retina: guanilato ciclasa-1 (GC1), proteina que activa la guanilato ciclasa-1 (GCAP1), transducina a del cono (GNAT2), subunidad alfa de fosfodiesterasa 3’,5’ ciclica especifica de cGMP de los bastones (PDE6a) y el gen de mantenimiento, gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Los pares de cebador para GCAP1, GNAT2, PDEa y GAPDH fueron identicos a los usados por Baehr et al. (2007). Los cebadores para GC1 murino (cebador directo: 5'-GACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCA-3' [SEQ ID NO:16], cebador inverso: 5"-CTGCATGTGTAGCAGCCTGTGCCTC-3' [SEQ ID NO:17]) se disenaron para flanquear el exon 5, el sitio de interrupcion genica en el raton GC1KO (Yang et al., 1999) y generar un amplicon de 151 pb. El PCR produjo amplicones dimensionados apropiadamente en muestras de retina GC1 /+ y GC1KO tratado con AAV-mGC1, pero no en la retina de GC1KO no tratada como se esperaba. La identidad del amplicon se verifico por digestion de restriccion con StuI (NEB) que escinde en la secuencia diana para dar fragmentos de 56 pb y 95 pb. La rtPCR con cebadores de GC1 y GAPDH en series de dilucion de ADN transcrito de forma inversa (de muestras de retina tanto de GC1 /+ como de CG1KO tratado con AAV-mGC1) dio por resultado pendientes similares, indicando la idoneidad de los cebadores de GC1 para cuantificar el mensaje de GC1 tanto endogeno como mediado por vector (FIG. 20A y FIG. 20B).

Los resultados son el promedio de 3 reacciones de replicacion y se calcularon usando el metodo 2-^{mc t} (Livak y Schmittgen, 2001) con la senal de GAPDH usada para normalizar las muestras y la muestra GC1 /+ que sirve como el calibrador. Las desviaciones estandar se calcularon a partir de las 3 reacciones de replicacion hechas para cada muestra. Los datos se presentan como el cambio multiplo en los niveles de ARNm respecto a la muestra de GC1 /+.

Resultados

Expresion de GC1 especifica del fotorreceptor, a largo plazo

La inmunotincion con un anticuerpo dirigido contra GC1 revelo que la expresion de proteina terapeutica vectorizada con AAV persistio exclusivamente en los fotorreceptores de los ratones GC1KO tratados durante una fraccion significativa de la vida del animal; AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 durante al menos 7 meses, AAV5-smCBA-mGC1 durante al menos 10 meses y AAV5-hGRK1-mGC1 durante al menos 10 meses (FIG. 21A y FIG. 21B). La expresion de GC1 se limito a los segmentos externos de los bastones y conos tratados con vector AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 mientras se encontro en ambos segmentos externos y mas raramente en los cuerpos celulares del fotorreceptor de ojos tratados con AAV5-smCBA-mGC1, un resultado coherente con la fuerza de este promotor ubicuo respecto a hGRK1 especifico del fotorreceptor (Beltran et al., 2010). Se observaron dos ejemplos de adelgazamiento de la retina. El primero fue una retina GC1KO tratada con AAV5-smCBA-mGC1 (4,69 x 109 genomas de vector totales distribuidos). La capa nuclear externa (ONL) estaba adelgazada ligeramente respecto a la vista en retinas de control GC1KO no tratadas anteriormente o GC1 /+ (ambas de 8 meses de edad). Este puede ser un resultado de la sobre-expresion de GC1 mediada por el promotor smCBA (Beltran et al., 2010).

El segundo implico una retina GC1KO tratada con el AAV5-hGRK1-mGC1 mas concentrado y como antes mostro expresion de GC1 especifica del fotorreceptor pero con profundo adelgazamiento de la capa nuclear externa. Deberia notarse que este vector fue el mas concentrado de los tres evaluados en este estudio (4,12 x 1010 genomas de vector distribuidos frente a 4,69 x 109 y 1,08 x 1010, para el preparado AAV5-smCBA-mGC1 y AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, respectivamente), y de nuevo resalta que la sobre-expresion de GC1 puede ser la causa del adelgazamiento observado. Como minimo, estos resultados sugieren que una toxicidad limitante de dosis puede ser observable en el raton. La expresion de GC1 estuvo ausente de la retina GC1KO no tratada (FIG. 21A y FIG. 21B).

La supervivencia del fotorreceptor de los conos a largo plazo se consigue mediante GC1 vectorizado con AAV

Los fotorreceptores de los conos en ratones GC1KO tratados y no tratados ademas de controles GC1 /+ se identificaron tinendo por la arrestina de los conos de raton. Las secciones transversales retinianas procedentes de ratones sacrificados para el estudio de biodistribucion final y las preparaciones completas retinianas de un raton GC1KO 11 meses despues del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 (solo ojo derecho) se analizaron. Aqui se mostro que las densidades del fotorreceptor del cono se redujeron marcadamente en las retinas de GC1KO no tratadas de 10 meses de edad y confirman informes previos de que los conos se pierden de una manera topograficamente especffica en este modelo de raton (Coleman et al., 2004) (FIG. 21A y FIG. 21B). El analisis de la preparacion completa revelo que la retina no tratada, de 11 meses de edad mostro una densidad de conos escasa, con conos residuales encontrados exclusivamente en las regiones retinianas superiores mientras que la retina tratada P14, companera, conservo una densidad de conos mucho mayor por todas partes, con la excepcion de un pequeno parche de la retina temporal que probablemente no estuvo expuesto al vector durante la inyeccion subretiniana y por lo tanto no contenfa producto transgenico. Comparado con lo visto en las retinas tratadas con AAV5, las densidades de conos y la estructura en las secciones transversales retinianas de los ratones tratados con AAV8(Y733F) parecieron cualitativamente mas similares a las vistas en la retina de GC1 /+ normal (FIG. 21A y FIG.

21B). Aunque sus densidades se aumentaron respecto a los controles no tratados, los conos en las retinas tratadas con AAV5 aparecieron ligeramente desorganizadas, un resultado debido probablemente al ligero trastorno/adelgazamiento total de las capas nucleares externas en estos ratones.

Restauracion a largo plazo de la funcion del fotorreceptor (ERG) en ratones GC1KO tratados con AAV

En los ejemplos anteriores, la funcion mediada por los conos podrfa restaurarse a los ratones GC1KO durante 3 meses despues de la distribucion P14 de AAV5-smCBA-mGC1 o AAV5-hGRK1-mGC1 (Boye et al., 2010). Las amplitudes de onda b fotopica promedio en ratones tratados se restauraron parcialmente a las 4 semanas despues de la inyeccion y permanecieron estables a lo largo de ese estudio. En el presente ejemplo, las respuestas mediadas por los conos a los 9 meses despues del tratamiento se compararon en ratones GC1 KO inyectados entre P14 y P25 con vectores identicos a los usados en el estudio anterior. Todos los ratones que quedaban tratados con vector AAV5-mGC1 continuaron mostrando funcion mediada por los conos medible hasta al menos 1 ano despues del tratamiento. Trazos representativos obtenidos a 12 cds/m2 de un raton individual tratado con AAV5-hGRK1-mGC1 se muestran en la FIG. 22A y FIG. 22B. Las respuestas de los conos fueron estables en el tiempo y fueron significativamente mayores que las respuestas generadas por controles contralaterales no tratados (p < 0,001), sugiriendo que la restauracion de la funcion de los conos es posible durante la vida del animal (FIG. 22A). De acuerdo con el ejemplo anterior, el nivel de restauracion alcanzado despues de la distribucion del vector que contenfa promotor especffico del fotorreceptor (hGRK1) no fue significativamente diferente del alcanzado con el vector que contenfa promotor ubicuo (smCBA) en cualquier punto temporal despues del tratamiento. Las trazos representativos revelan que las cineticas del ERG de los conos restaurados parecieron normales a lo largo del estudio (FIG. 22B). Ademas, se mostraba en este ejemplo que la funcion del fotorreceptor de los conos se restauro de forma estable durante al menos 6 meses despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1 -mGC1.

Las amplitudes de onda b de los conos en ratones GC1KO inyectados con este fuerte mutante de capside de tirosina AAV8 de rapida actuacion fueron mayores que las vistas en ratones GC1KO inyectados con cualquier vector AAV5 en cada punto temporal evaluado. A los 6 meses despues del tratamiento, el ultimo punto temporal en que todos los vectores podrfan compararse en paralelo, habfa una diferencia significativa entre las amplitudes de onda b de los conos en ratones tratados con AAV8(Y733)-hGRK1-mGC1 frente a AAV5-hGRK1-mGC1 (p = 0,033) y ratones tratados con AVV(Y733F)-hGRK1-mGC1 frente a AAV5-smCBA-mGC1 (p = 0,025). Un trazo representativo grabado 9 meses despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (n = 1) fue visiblemente menor que el grabado a los 6 meses despues de la inyeccion.

Debido a su variabilidad entre ratones en las respuestas de los bastones de GC1KO no tratados (50-70% de WT a los 5 meses de edad (23), la comparacion estadfstica de las respuestas de los bastones promedio de ojos tratados frente a no tratados es problematica. Sin embargo, en un animal, las amplitudes de ERG de los bastones son casi iguales entre ojos companeros, por lo tanto se calculo las relaciones de amplitud de onda a y b en un raton promedio para ojos tratados frente a no tratados y despues se representaron estas relaciones con el tiempo (FIG. 23A y FIG.

23B). La restauracion mediada por AAV de la funcion de los bastones se indica por las relaciones con un valor >1,0. Las FIG. 23A y FIG. 23B muestran que, con la excepcion de un punto temporal (4 meses despues del tratamiento), las relaciones promedio de las amplitudes de onda b de los bastones en ojos tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 frente a no tratados fueron todas >1,0. Las relaciones de ojos tratados con AAV5 frente a no tratados fueron solo ocasionalmente >1,0. De forma similar, las relaciones de onda a de los bastones fueron consistentemente mayores en ratones tratados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, mientras que a menudo declinaban despues del tratamiento con cualquier vector AAV5 (FIG. 23B). Estos resultados sugieren que mientras los efectos terapeuticos en bastones fueron sutiles, AAV8(Y733F) dio la mejora funcional mediada por bastones mas fuerte al raton GC1KO (FIG. 23B). Los trazos ERG escotopicos mediados por bastones representativos obtenidos por un estfmulo de 1 cds/m2 se demostraron en un raton GC1KO tratado con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 (6 meses despues del tratamiento), el ojo de control contralateral no tratado y un control GC1 /+ emparejado por edad. Las mejoras mediadas por AAV8(Y733F) en las amplitudes de ERG de los bastones son claras en este ejemplo e indican que aparte de las amplitudes sub-tipo salvaje, las cineticas de respuesta del ojo tratado se parecen a las vistas en el control de GC1 /+.

Biodistribucion del vector:

Los estudios de biodistribucion se realizaron en ratones GC1KO tratados con cada vector para establecer si los genomas del vector distribuido por AAV5 o AAV8(Y733F) podrfan detectarse en los nervios opticos y/o cerebros de ratones tratados despues de un periodo de meses. Los ratones inyectados con vectores AAV5 se evaluaron a los 7 (n = 2) y 10 (n = 5) meses despues del tratamiento y los ratones inyectados con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 se evaluaron a 4 (n = 1) y 7 (n = 1) meses despues del tratamiento. Los nervios opticos de los ojos inyectados y no inyectados se examinaron ademas de partes del cerebro izquierdo y derecho que contenian las rutas visuales. Los vectores AAV5 se inyectaron en los ojos derechos de ratones GC1KO. Por consiguiente, los genomas de vector se detectaron en el nervio optico derecho de los ratones tratados con AAV5 tanto a los 7 como a los 10 meses despues de la inyeccion. A los 7 meses despues de la inyeccion, los genomas de vector se detectaron tambien en el cerebro izquierdo de un raton inyectado con AAV5-hGRK1 -mGC1. No se detectaron genomas de vector del cerebro derecho de ese animal. La observacion de que el nervio optico derecho (inyectado) y el cerebro izquierdo fueran positivos es anatomicamente coherente ya que el hemisferio izquierdo esta predominantemente “conectado” con el ojo derecho.

A los 10 meses despues de la inyeccion, los genomas del vector distribuido con AAV5 se detectaban aun en el nervio optico derecho (inyectado) pero estuvieron ausentes de ambos hemisferios cerebrales. El vector AAV8(Y733) se inyecto en los ojos izquierdos de ratones CG1KO. Por consiguiente, los genomas del vector distribuidos por AAV8(Y733F) se detectaron en los nervios opticos izquierdos tanto a los 4 como a los 7 meses despues de la inyeccion. En ningun punto temporal se detectaron genomas del vector en el raton tratado con AAV8(733) en cualquier hemisferio cerebral. Un mayor numero promedio de genomas de vector se detectaron en los nervios opticos de los ojos inyectados con AAV5-GRK1-mGC1 en comparacion con AAV5-smCBA-mGC1. Este resultado se debe probablemente al mayor titulo del primero (4,12 x 1013 vg/mL) en comparacion con el ultimo (4,69 x 1012 vg/mL).

Ademas, solo los genomas distribuidos por AAV5-hGRK1-mGC1 se detectaron en el tejido cerebral durante este estudio, otra observacion debida probablemente al titulo relativamente alto de este vector. A pesar del hecho de que el titulo del vector AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1 usado (1,08 x 1013 vg/mL) fue menor que el del vector AAV5-hGRK1-mGC1, un mayor numero promedio de genomas de vector se detecto en los nervios opticos de los ojos tratados con AAV8(Y733F). Aunque se sabe que AAV5 es ineficaz para transducir las celulas de los ganglios de la retina del raton (Stieger et al., 2008), se mostro que AAV8 transduce este tipo de celulas (Jacobson et al., 2006). Alguna exposicion del vector a las celulas de los ganglios de la retina se espera ya que la jeringa atraviesa la retina interna durante la inyeccion sub-retiniana y debido a que la relacion del volumen de inyeccion al tamano ocular total es alta en el raton. El mayor numero de genomas de vector detectados en los nervios opticos de los ojos tratados con AAV8(Y733F) por lo tanto podria deberse a la afinidad aumentada de AAV8(Y733F), respecto a a AV5, por las celulas de los ganglios de la retina. Como se esperaba, no se recuperaron genomas de vector AAV de ningun tejido de los ratones de control GC1KO no tratados anteriormente.

El tratamiento de AAV-mGC1 restaura los niveles de tipo salvaje de GC1 y GCAP1 de la retina GC1KO tratada

A los 7 meses despues de la inyeccion con AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1, las retinas tratadas y no tratadas de un raton GC1KO ademas de un raton de control GC1 /+ emparejados por edad se usaron para evaluar los niveles de expresion de proteina GC1 y GCAP1. El objetivo de este experimento no fue comparar los niveles de GC1 a traves de los grupos de tratamiento sino mas bien comparar los niveles de expresion de GC1 mediada por vector con los niveles de GC1 en un animal de tipo salvaje. De forma similar se evaluaron los efectos de GC1 distribuida por AAV en la expresion de GCAP1. Como se esperaba, la proteina GC1 estuvo ausente del ojo no tratado del raton GC1 KO. En contraste, los niveles de GC1 en el ojo tratado con AAV8(Y733F) se aproximaron a los vistos en el control GC1 /+ normal (Figura 4). De acuerdo con los informes anteriores de que GCAP1 se regula a la baja posttraduccionalmente en el raton GC1KO, mostramos que GCAP1 se regulo a la baja en la retina CG1KO no tratada respecto al control GC1 /+ (39). Sin embargo, la distribucion mediada por ^a AV8(Y733F) de GC1 lleva a una sobrerregulacion en la expresion de GCAP1 en la retina del raton GC1KO tratado. Los niveles de expresion de GCAP1 fueron tambien comparables con los vistos en los controles GC1 /+.

En los ratones GC1KO tratados, el ARNm de GC1 esta presente y los niveles de ARNm de GNAT2 estan aumentados respecto a los ratones GC1KO no tratados. Usando un par cebador de GC1 que flanquea la interrupcion genica de neomicina situada en el Exon 5 del raton GC1KO (Timmers et al., 2001) fue posible medir el ARNm de GC1 en ratones tanto GC1 /+ como GC1KO tratados con vector. De forma interesante, un segundo par cebador de GC1 dirigido al exon 18 y 19 de GC1, bien corriente abajo de la interrupcion genica, produjo un producto de PCR en la muestra de raton GC1KO no tratado y por lo tanto estos cebadores no se usaron. A un ano despues del tratamiento, los niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas fueron aproximadamente siete veces (tratado con AAV5) y 14 veces [tratado con AAV8(YY733F)] mayores que las vistas en el raton de control GC1 /+ emparejados por edad (FIG. 24A y FIG. 24B). Usando una tecnica de recuperacion de acido nucleico que permitio la reparticion homogenea de la muestra en 2 mitades iguales, una para la extraccion de ARN y la otra para ADN (Pang et al., 2011), sin embargo fue posible medir los niveles de ARNm y determinar el numero de genomas de vector en la misma muestra. Se encontro que los altos niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas correspondieron a la recuperacion de muchos genomas de vector; 1,57 x 107 genomas de vector/gg de ADN para AAV8(Y733F) y 4,7 x 106 genomas de vector/gg para AAV5. A pesar de los altos niveles de ARNm de GC1 en las retinas tratadas, no se detecto expresion de GC1 en los nervios opticos de los ojos tratados. Este resultado respalda ademas la nocion de que los vectores evaluados en este estudio no dieron por resultado la expresion transgenica fuera de la diana. De acuerdo con los informes previos de que la reduccion de GCAP1 en los ratones GC1KO es post-traduccional (es decir, los niveles de ARNm estan inalterados), no se encontraron cambios sustanciales en los niveles de ARNm de GCAP1 entre las muestras (FIG. 24A y FIG. 24b ).

Como una estimacion inicial del tratamiento en otros ARN especificos de los conos, se evaluaron tambien varios transcritos distintos en estas muestras. Para establecer una base para los niveles de transducina a de los conos (GNAT2), el ARN de GNAT2 se evaluo en muestras de GC1KO no tratados y se encontro que estaban reducidas respecto a los controles GC1 /+, un resultados debido probablemente a la perdida de fotorreceptores de los conos en estas retinas (FIG. 24A y FIG. 24B). En contraste, hubo aumentos apreciables de los niveles de ARNm de GNAT2 en los ojos tratados con vectores o bien AAV5 o AAV8(Y733F) un resultado que respalda adicionalmente la nocion de que los fotorreceptores de los conos se conservan en ratones GC1KO tratados con AAV-mGC1. Los niveles de pDE6a de los bastones estuvieron relativamente inalterados entre las muestras probablemente porque los fotorreceptores de los bastones no degeneran en el raton GC1KO (FIG. 24A y FIG. 24B).

En conclusion, estos estudios demuestran que la expresion persistente de GC1 mediada con AAV es capaz de restaurar la funcion retiniana a largo plazo y conservar los fotorreceptores de los conos en el raton GC1KO. Cohortes de ratones CG1 KO tratados con AAV5 y AAV8(Y733F) se evaluaron para la recuperacion de ERG durante 9 meses y 6 meses despues de la inyeccion, respectivamente. Aunque la comparacion estadistica de las amplitudes de ERG de los conos no continuo mas alla de estos puntos temporales debido a los tamanos decrecientes de muestra, todos los ratones tratados continuaron mostrando rescate funcional (ERG). Una variedad de ensayos realizados en subconjuntos de estos ratones que quedaban mostraron claros indicios de terapia en continuacion. Esta longevidad terapeutica se valido en un numero de diferentes niveles: 1) la existencia de proteina GC1 en los ojos tratados a los 10 meses despues del tratamiento, 2) la restauracion de la funcion de los conos como se mide por ERG a los 12 meses despues del tratamiento, 3) la supervivencia aumentada de los conos en los ojos tratados a los 11 meses despues del tratamiento y 4) la recuperacion de genomas de vector y ARNm de GC1 en retinas a los 12 meses despues del tratamiento. Cuando se vio como analisis discretos, individuales, los tamanos de la muestra usada en estos ensayos fueron a menudo pequenas. Sin embargo, cuando se consideran todas como correlaciones de eficacia terapeutica en ratones que muestran claros signos de rescate funcional, el tamano de muestra es efectivamente mucho mayor. En este contexto, por lo tanto, parece que la terapia persiste mas alla del periodo estadisticamente evaluado para el rescate de ERG. Esta es la primera demostracion de terapia a largo plazo en un modelo animal de deficiencia de GC1.

Se observaron los ERG de conos restaurados en ratones GC1KO tratados con AAV5 y AAV8(Y733) durante al menos 9 meses y 6 meses despues del tratamiento, respectivamente. Las respuestas fueron estables y significativamente mayores que las respuestas de los conos de CG1KO no tratados a lo largo del estudio. La recuperacion fue mas pronunciada en ratones tratados con vector AAV8(Y733F). Las amplitudes promedio de onda b de los conos en ratones tratados con AAV8(Y733F) fueron de forma consistente ~20 pV mayores que las grabadas de ratones GC1 KO tratados con vectores AAV5 estandar (~55 pV frente a ~35 pV, respectivamente). A los 6 meses despues del tratamiento, el ultimo punto temporal en que todos los vectores se compararon estadisticamente, esta diferencia permanecia significativa. Este resultado confirma que un vector AAV8(Y733F) restauro de forma estable la estructura y la funcion retiniana al raton rd10, un modelo refractario al tratamiento con vectores AAV estandar.

Cuantificar las diferencias en las amplitudes de los bastones entre ojos tratados y no tratados en el raton GC1 KO se complica por el hecho de que la funcion de los bastones en este modelo esta parcialmente ayudada por la guanilato ciclasa-2 (GC2) (Sun et al., 2010). Las respuestas de ERG de los bastones son por lo tanto variables de animal a animal (30-50% de lo normal). Por lo tanto, a diferencia de las comparaciones de respuestas de los conos tratados y no tratados, las respuestas de los bastones tratados no pueden compararse con una linea base cero. Sin embargo, los ojos GC1KO emparejados tienen amplitudes ERG de bastones comparables, y la relacion dentro del animal de los ERG de los bastones en los ojos companeros, uno tratado y el otro no tratado, proporciona una metrica valida para evaluar los efectos del tratamiento en la funcion de los bastones. Las mejoras en las respuestas mediadas por los bastones en ratones GC1KO tratados con AAV8(Y733F) se observaron de forma mas consistente que las grabadas a partir de los ratones tratados con AAV5 como se indica comparando la relacion dentro del individuo de las amplitudes de onda a y b de los bastones del ojo tratado y no tratado. Esto sugiere que la expresion agresiva de GC1 en el ojo GC1 KO puede complementar el efecto parcial de GC2 en la funcion de los bastones murinos.

La supervivencia de los fotorreceptores de los conos a largo plazo (11 meses despues de la inyeccion) se demostro por inmunotincion de preparaciones completas retinianas tratadas y no tratadas de un raton tratado con AAV5-smCBA-mGC1 con un anticuerpo dirigido contra la arrestina de los conos. Los conos de identificaron a lo largo de la retina GC1KO tratada. La retina tratada con AAV5-smCBA-mGC1 tambien contenia claramente mas conos que el ojo no tratado que, coherente con los informes previos, retuvo solo una pequena fraccion de conos en su hemisferio superior (Provost et al., 2005). Aunque los conos conservados en la retina GC1KO tratada no se examinaron a un nivel ultraestructural (p.ej., microscopio electronico), la observacion de que los conos permanecieron funcionales en el tiempo por analisis ERG sugiere que su estructura estaba intacta. La conservacion a largo plazo de los fotorreceptores de los conos mediada por AAV-GC1 terapeutico tiene relevancia clinica obvia porque sugiere el potencial para conservar los conos maculares y restaurar la vision diurna/color util para los pacientes con deficiencia de GC1.

La expresion de GC1 mediada por AAV persistio durante al menos 10 meses despues del tratamiento (el ultimo punto temporal evaluado por IHC) y se situo exclusivamente en los fotorreceptores, a pesar del serotipo usado o si un promotor especifico del fotorreceptor (hGRK1) o ubicuo (smCBA) dirigio su expresion. Aunque la expresion transgenica se limito al tipo de celula diana, el promotor hGRK1 fue mas especifico en que dio por resultado la expresion exclusivamente en el compartimiento apropiado de la celula diana (segmentos externos del fotorreceptor). Este resultado, junto con otros estudios preliminares de eficacia exitosos que utilizan este promotor sugiere que el promotor hGRKl deberia considerarse en el diseno de un vector AAV clinico dirigido a fotorreceptores.

La inmunotincion de secciones retinianas GC1KO transversas a los 10 meses despues del tratamiento con AAV5-smCBA-mGC1 revelo un adelgazamiento moderado de la ONL respecto a los controles tipo salvaje y GC1KO no tratado. Adicionalmente, en esta retina se encontro ocasionalmente GC1 en los cuerpos celulares de los fotorreceptores. Es posible que el fuerte promotor smCBA ubicuo condujera la expresion de GC1 a niveles que sobrepasaron la maquinaria de trafico de algunos fotorreceptores y que la acumulacion de producto transgenico en los cuerpos celulares del fotorreceptor constituyera una apoptosis iniciada por estres en estas celulas. Se observo un adelgazamiento de ONL mas dramatico en un raton inyectado con AAV5-hGRK1-mGC1. Con una n de 1, no puede concluirse definitivamente que el adelgazamiento de la retina estuviera presente en todos los ratones tratados con este vector. Sin embargo, coherente con la nocion de toxicidad por sobreexpresion, el titulo del vector AAV5-hGRK1-mGC1 fue el mayor de los tres vectores evaluados en este estudio. Sin embargo, deberia notarse tambien que no hubo acumulacion de GC1 en los cuerpos celulares del fotorreceptor con el vector AAV5-hGRK1-mGC1 de alto titulo.

A pesar de la naturaleza exclusiva al fotorreceptor de la expresion de GC1 mediada por AAV, los inventores se interesaron en evaluar la expansion de los genomas del vector a tejidos fuera del espacio sub-retiniano. De forma importante, estos datos se recogieron de animales “enfermos”. Esto es relevante en base a la evidencia de que el patron de transduccion del vector es diferente en la retina enferma frente a la sana (Kolstad et al., 2010). Esto sugeriria que los patrones de biodistribucion pueden ser tambien diferentes. Por esta razon, era importante evaluar la extension de los genomas en el modelo animal rescatado en si mismo (es decir, con sujetos que mostraron recuperacion de ERG clara). Aunque el tamano de la muestra era limitado, se recogio informacion util sobre la distribucion de los genomas distribuidos por AAV5 y AAV8(Y733F) en el nervio optico y el cerebro.

Esta es la primera evaluacion de la biodistribucion para un vector AAV que contiene una mutacion de tirosina expuesta en la superficie de la capside. Los genomas del vector distribuido por AAV5 y AAV8(Y733F) se detectaron en los nervios opticos de ojos inyectados en todos los puntos temporales evaluados. Solo en un punto temporal (7 meses despues de la inyeccion) los genomas del vector AAV5 se detectaron en el cerebro de un raton GC1KO tratado. Los genomas se recuperaron solo en el hemisferio opuesto al ojo inyectado. Este resultado contrasta con el descubrimiento de Provost et al., 2005 que presento una falta de secuencia distribuida por AAV5 en los cerebros de ratas y perros inyectados de forma sub-retiniana. A los 10 meses despues de la inyeccion, no se recuperaron genomas del vector de los cerebros de los ratones GC1KO tratados con AAV5 ni de los cerebros de ratones tratados con AAV8(Y733F) en ningun punto temporal. Sin embargo, debido al numero relativamente pequeno de ratones analizados, no puede excluirse inequivocamente que los genomas distribuidos por AAV5 estuvieran presentes en cerebros a los 10 meses despues de la inyeccion o que los genomas distribuidos por AAV8(Y733F) no estan presentes nunca en los cerebros de ratones GC1 KO tratados en cualquier momento.

A pesar de recuperar genomas del vector de los nervios opticos de los ojos tratados, la inmunotincion revelo una falta de expresion de GC1 en los nervios opticos de los ojos tratados con vectores tanto AAV5-smBCA-mGC1 como AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1. Un estudio previo de Stieger et al., (2005) detecto la expresion transgenica en los nervios opticos y cerebros de ratas y perros a los 2 meses y 4 semanas despues de la inyeccion sub-retiniana con AAV8 que contenia proteina fluorescente verde (GFP). Teniendo en cuenta que el vector AAV8(Y733F) contenia el promotor hGRK1 especifico del fotorreceptor y el descubrimiento previo de que la expresion de GC1 estaba limitada a los fotorreceptores incluso cuando estaba bajo el control de un promotor ubicuo como smCBA, un carencia de expresion de GC1 en los nervios opticos no es inesperada. Stieger et al., (2005) incorporo el fuerte promotor CMV ubicuo en su vector para conducir GFP, una proteina que es capaz de expresarse de forma estable en una amplia variedad de tejidos cuando se distribuye por medio de vectores viricos.

Aunque los vectores tanto de AAV5 como de AAV8(Y733F) fueron capaces de proporcionar terapia a largo plazo al raton GC1KO, hay ventajas evidentes asociadas con el uso de AAV8(Y733F). Primera y principal, AAV8(Y733F) con un promotor especifico del fotorreceptor confiere respuestas de ERG del cono significativamente mayores a los ratones tratados que cualquier vector AAV5. La razon para esto puede deberse a la capacidad de los vectores AAV8 de transducir areas fuera de la vesicula de la inyeccion en la retina de los roedores mientras que el area de retina transducida por AAV5 permanece principalmente confinado en la vesicula (47). Por consiguiente, AAV8(733F) simplemente transduce de media un area mayor de la retina respecto a los vectores AAV5 y a su vez dan por resultado mas transduccion del cono y una fuerte respuesta de ERG del cono de campo completo, a traves de cualquiera o ambas de supervivencia de conos total aumentada y/o un nivel aumentado de respuesta a la luz en cada cono transducido.

Ejemplo 8 - Secuencias de polipeptido GC1 de mamifero ejemplares

Las secuencias de aminoacidos ejemplares utiles en la practica de la presente invencion incluyen, sin limitacion, una o mas secuencias de aminoacidos que codifican una proteina de guanilato ciclasa de mamifero biologicamente activa. Dichas secuencias incluyen, sin limitacion, las de origen humano, primate no humano, murino, bovino y

Ejemplo 9 - Analisis de la secuencia de polipeptidos de GC1 de mamiferos conocidos

Todos los datos de alineacion de GC1 se generaron usando la secuencia de aminoacidos para las siguientes especies: Bos taurus (bovino, 1110 residuos), Canis lupus familiaris (canino; 1109 residuos), Mus musculus (murino; 1108 residuos), y Homo sapiens (humano; 1103 residuos). Las posiciones de consenso y las regiones variables se basan en residuos numericos que corresponden a Bos taurus ya que es la proteina de GC1 mas larga, 1110 residuos, y no tiene huecos en la alineacion.

Grafico de similitud de alineacion de las proteinas de GC1 de Bos taurus, Canis lupus familiaris, Mus musculus y Homo sapiens.

Regiones de consenso de GC1:

Posiciones de aminoacido: 44-49, 55-90, 98-155, 164-321, 464-549, 561-604, 620-761, 813-1026, 1045-1054 y 1060-1110.

Regiones variables:

Posiciones de aminoacido: 4-43, 50-54, 91-97, 156-163, 322-463, 550-560, 605-619, 762-812, 1027-1044 y 1055­ 1059.

Otras regiones notables de la alineacion de consenso de GC1 incluyen:

(1) Dominio de homologia quinasa: posiciones de aminoacido 531 a 541 de la secuencia de consenso (conocida por ser esencial para la actividad en los fotorreceptores - vease, p.ej., Bereta et al., 2010).

(2) Residuos de serina fosforilada en el dominio de homologia quinasa de la proteina GC1 murina (posicion de consenso/bovina mostrada en parentesis): 530 (532), 532 (534), 533 (535) y 538 (540).

Ejemplo 10 - Secuencia de nucleotidos del promotor smCBA

La secuencia de acido nucleico de un promotor GRK1 humano (hGRK1) ilustrativo que se uso en los estudios descritos anteriormente se muestra a continuacion:

La secuencia de acido nucleico de un promotor smCBA ilustrativo que se uso en los estudios descritos anteriormente se muestra a continuacion:

Referencias

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan detalles procedimentales ejemplarse u otros detalles complementarios a los descritos en la presente memoria.

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Todas las composiciones y metodos descritos y reivindicados en la presente memoria pueden hacerse y ejecutarse sin experimentacion indebida a la luz de la presente descripcion.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un vector virico adeno-asociado recombinante (rAAV) que comprende al menos un primer polinucleotido que comprende un promotor de rodopsina quinasa humana especifico de fotorreceptor unido de forma operable a al menos un primer segmento de acido nucleico que codifica al menos un primer polipeptido de guanilato ciclasa humana especifica de la retina, biologicamente activo, que comprende al menos una primera region de secuencia de aminoacidos contiguos que es al menos identica en aproximadamente 95% a una secuencia de al menos 120 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO:1, en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 5 de virus adenoasociado recombinante (rAAV5) o en el que el vector rAAV es un vector de serotipo 8 de virus adeno-asociado recombinante (rAAV8).

2. El vector rAAV segun la reivindicacion 1, en el que el al menos un primer polipeptido de guanilato ciclasa humana especifica de la retina, biologicamente activo, comprende una primera region de secuencia de aminoacidos contiguos que es al menos identica en aproximadamente 95% a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1.

3. El vector rAAV segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el promotor de rodopsina quinasa humana especifico del fotorreceptor comprende una secuencia de acido nucleico que consiste esencialmente en una secuencia de al menos 60 pares de bases contiguas de SEQ ID NO:12.

4. El vector rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas al menos un primer potenciador o al menos una primera secuencia de intron de mamifero unida de forma operable a al menos un primer segmento de acido nucleico.

5. El vector rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector rAAV esta comprendido en una particula virica adeno-asociada infecciosa, virion, una pluralidad de particulas AAV infecciosas o una celula huesped de mamifero aislada.

6. El vector rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector rAAV esta comprendido en una particula virica AAV5.

7. El vector rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector rAAV esta comprendido en una particula virica AAV8.

8. El vector rAAV segun la reivindicacion 7, en el que el vector rAAV esta comprendido en una particula virica AAV8 Y733F.

9. Una composicion que comprende:

(1) el vector rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y

(2) un tampon, transporte, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

10. El vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion segun la reivindicacion 9 para usar en terapia, preferiblemente para usar en a) la terapia o profilaxis de una distrofia, enfermedad o trastorno humano, que incluye la amaurosis congenita de Leber (LCA1) o b) diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, trastorno, disfuncion o condicion anormal de un ojo de mamifero, o uno o mas sintomas del mismo.

11. El vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion segun la reivindicacion 9 para el uso en un metodo para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, disfuncion, trastorno, deficiencia o condicion anormal en un mamifero, o uno o mas sintomas de los mismos, en el que el mamifero tiene, se sospecha que tiene, esta en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con al menos un primer trastorno, enfermedad o distrofia de la retina.

12. El vector o composicion para el uso segun la reivindicacion 11, en el que el mamifero esta en riesgo de desarrollar, o se ha diagnosticado con una deficiencia en el polipeptido de guanilato ciclasa retiniana biologicamente activo.

13. El vector o composicion para el uso segun la reivindicacion 11 o 12, en el que el mamifero es un neonato, recien nacido, bebe o joven humano que esta en riesgo de desarrollar o se ha diagnosticado con una distrofia retiniana congenita tal como amaurosis congenita de Leber 1 (LCA-1).

14. El vector o composicion para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la enfermedad, disfuncion, trastorno, deficiencia o condicion anormal es amaurosis congenita de Leber 1 (LCA1) o un sintoma de la misma.

15. El vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion segun la reivindicacion 9 para usar en un metodo para proveer a un mamifero con una cantidad terapeuticamente efectiva de un polipeptido de guanilato ciclasa humana especifica de la retina, biologicamente activo, a un mamifero que lo necesita, que comprende introducir en celulas adecuadas de un mamifero que lo necesita, una cantidad efectiva del vector rAAV.

16. El vector o composicion para el uso segun la reivindicacion 15, en el que el mamifero que lo necesita tiene un defecto, deficiencia, o ausencia sustancial de la proteina retGC1 biologicamente activa en al menos un primer tejido del mamifero, cuando se compara con el nivel de proteina retGC1 biologicamente activa en un mamifero normal.

17. El vector o composicion para el uso segun las reivindicaciones 15 o 16, en el que una pluralidad de celulas del mamifero se proveen con el vector rAAV ex vivo o in vitro, y el metodo comprende ademas introducir la pluralidad de celulas provistas en al menos un primer sitio de tejido en o alrededor del cuerpo del mamifero o en el que la pluralidad de celulas obtenidas se introduce en al menos un primer sitio en uno o ambos ojos del mamifero por inyeccion directa en la retina o el tejido circundante.

18. El vector o composicion para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la introduccion del vector rAAV conserva los fotorreceptores de los conos, restaura la funcion mediada por los conos, restaura el comportamiento visual, o cualquier combinacion de los mismos, en el ojo del mamifero, en el que preferiblemente una unica introduccion del vector rAAV en el ojo del mamifero conserva los fotorreceptores de los conos, restaura la funcion mediada por los conos, restaura el comportamiento visual o cualquier combinacion de los mismos, en el mamifero durante un periodo de al menos seis meses o en el que una unica introduccion del vector rAAV en el ojo del mamifero conserva los fotorreceptores de los conos, restaura la funcion mediada por los conos, restaura el comportamiento visual, o cualquier combinacion de los mismos, en el mamifero durante un periodo de al menos diez meses.

19. El vector o composicion para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el mamifero que lo necesita tiene amaurosis congenita de Leber 1 (LCA1) o un sintoma de la misma.

20. El vector segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composicion segun la reivindicacion 9 para el uso en un metodo para aumentar el nivel de proteina retGC1 biologicamente activa en una o mas celulas retinianas de un mamifero que tiene, se sospecha que tiene, esta diagnosticado con, o esta en riesgo de desarrollar, LCA1, que comprende introducir el vector en al menos una primera poblacion de celulas retinianas del mamifero, en una cantidad y durante un tiempo efectivo para aumentar el nivel de proteina retGC1 biologicamente activa en una o mas celulas retinianas del mamifero.