CN112852976B - 蛋鸡ncs1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用，所述分子标记位于NCS1基因的部分编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，共包括3个SNP位点，即第171bp、481bp和565bp处分别存在C/T、C/G和A/G三个等位基因突变位点，由其组成的单倍型组合可以作为蛋鸡后期产蛋性状相关的单倍型分子标记，其中单倍型组合H1H3：CCG/CGG的个体的60周龄产蛋数显著高于其他单倍型组合，通过对该单倍型组合的选取，有助于提高蛋鸡整体的后期产蛋数，即本发明为蛋鸡后期产蛋性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记，实现了对蛋鸡后期产蛋性状的筛选，且筛选方法简单快速。

Description

蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及蛋鸡遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

鸡蛋富含蛋白质、脂肪、卵磷脂等人体所需的多种营养物质，是我国居民饮食结构中的重要组成部分。产蛋后期是鸡群生产性能不断下降的阶段，产蛋后期占了整个产蛋期50％的时间，而且养殖生产中一般在500日龄左右的鸡群会被淘汰，但此时鸡群的产蛋率仍维持在60-70％，所有产蛋后期鸡群的生产性能直接影响蛋鸡养殖的经济效益。产蛋后期蛋鸡产蛋率下降的主要原因是产蛋后期卵巢衰老和机能减退，主要表现为卵泡数量减少、发育的优势卵泡闭锁率增加、卵泡发育受到抑制等，导致产蛋后期蛋鸡的利用期限缩短，经济价值降低，因此，提高产蛋后期蛋鸡产蛋率对于蛋鸡生产具有重要意义。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsim，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，包括单碱基的插入、缺失、转化和颠换等。全基因组关联分析(Gemome-Wide Association Study，GWAS)是应用基因组中数以百万计的SNP为分子遗传标记，进行全基因组水平的对照分析和相关分析。大量SNP标记的出现，使得以单个标记为中心的关联分析方法逐渐转变为以单倍型(haplotype)为主的关联分析方法。单倍型是指在同一染色体上或一定区域内若干个决定同一性状的且紧密相连锁的SNPs，具有统计学关联性。SNP标记及其组成的单倍型由于分布的广泛性和稳定性，在动物的分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)育种上发挥着重要作用，成为蛋鸡产蛋后期性状尤其是限性性状遗传改良的可行性技术。基于此，进一步鉴定与蛋鸡经济性状相关的SNP标记及其单倍型组合，进而借助SNP标记及其单倍型组合序列作为筛选标记用于优良蛋鸡经济性状的辅助选择上，将大大提高选种的准确性，对于培育具有优良经济性状的蛋鸡品种具有一定的意义。

神经元钙传感器1(Neuronal Calcium Sensor 1，NCS1)是一种高度保守的钙结合蛋白，参与多种生理细胞功能，包括胞吐作用、钙通透通道的调节、神经可塑性和对神经元损伤的反应。已有研究表明NCS1在脂肪细胞功能中起重要作用，NCS1缺乏会导致成年小鼠肥胖和2型糖尿病；NCS1表达改变与神经发育和神经退行性疾病有关；可通过促进细胞存活和转移促进肿瘤的侵袭性等等。然而，关于NCS1基因在蛋鸡上的研究却未见报道，迄今为止，尚无有关蛋鸡NCS1基因作为蛋鸡后期产蛋性能的分子标记的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记及其应用，本发明首次发现了蛋鸡的NCS1基因的部分编码区中与后期产蛋性能相关的单倍型分子标记，这为蛋鸡后期产蛋性状辅助选择提供了重要参考依据。

本发明的目的之一在于提供一种蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述分子标记包括：

SNP1位点：在SEQ ID NO:1所示序列中第171bp处存在C/T多态性位点；

SNP2位点：在SEQ ID NO:1所示序列中第481bp处存在C/G多态性位点；

SNP3位点：在SEQ ID NO:1所示序列中第565bp处存在A/G多态性位点。

进一步的，所述序列中的第171bp、481bp和565bp处的优势等位基因分别为C、C、G，优势基因型分别为CC、CC、和GG。

本发明的目的之二在于提供一种用于扩增上述分子标记的引物对，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的目的之三在于提供了一种蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关分子标记的检测方法，具体为：采用上述引物对进行检测。

进一步的，所述检测方法包括：

从蛋鸡血液中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的引物对进行扩增，并将扩增产物进行序列比对，得到如权利要求1中所述的3个SNP位点。

本发明的目的之四在于提供一种包含上述SNP位点的单倍型组合，所述单倍型组合为包含SNP1-SNP3位点的组合。

本发明的目的之五在于提供一种单倍型组合的构建方法，所述方法包括：首先采用上述分子标记的检测方法检测出3个SNP位点；然后构建出六种单倍型，H1：CCG，H2：CCA，H3：CGG，H4：CGA，H5：TGG，H6：TGA；再根据所述单倍型构建单倍型组合，并与蛋鸡的后期产蛋性状相关联。

本发明的目的之六在于提供上述分子标记、或上述引物对、或上述单倍型组合在蛋鸡后期产蛋性状辅助选择中的应用。

进一步的，所述蛋鸡后期产蛋性状包括40周龄产蛋数和/或60周龄产蛋数

本发明的目的之七在于提供一种后期高产蛋鸡的选育方法，所述方法包括：采用上述单倍型组合的构建方法构建单倍型组合，保留单倍型组合为HIH3：CCG/CGG的个体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次发掘了蛋鸡NCS1基因的部分编码区中与蛋鸡的后期产蛋性能相关的单倍型分子标记，其序列如SEQ ID NO:1所示，该序列长度为1575bp，共包括3个SNP位点，即第171bp、481bp和565bp处分别存在C/T、C/G和A/G三个等位基因突变位点，由其组成的单倍型组合可以作为蛋鸡后期产蛋性状相关的单倍型分子标记，其中单倍型组合H1H3：CCG/CGG的个体的60周龄产蛋数显著高于其他单倍型组合，通过对该单倍型组合的选取，有助于提高蛋鸡整体的后期产蛋数，即本发明为蛋鸡后期产蛋性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记，实现了对蛋鸡后期产蛋性状的筛选，且筛选方法简单快速。

附图说明

图1为本发明的技术路线示意图；

图2为本发明实施例蛋鸡NCS1基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测结果，其中M为Marker，1-5为NCS1基因片段扩增结果；

图3为本发明实施例1中蛋鸡NCS1基因3个SNP多态性位点不同基因型个体测序结果比较图：(a)第171bp存在C/T突变位点；(b)第481bp存在C/G突变位点；(c)第565bp存在A/G突变位点；

图4为本发明实施例4中NCS1基因的单倍型block分析结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1蛋鸡NCS1基因部分编码区片段的获得及SNP检测方法的建立

1、蛋鸡基因组DNA的提取

本发明的试验蛋鸡品种包括江汉鸡和洛岛红鸡，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场。蛋鸡基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下：

(1)采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1ml血液，注入经高压灭菌并装有200μL无菌ACD抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。吸取10μL抗凝血，加入500μL BB2和10μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，室温孵育10min；

(2)短暂离心，将全部溶液加入离心柱中，12000g离心1min，弃流出液；

(3)加入500μL溶液CB3，12000g离心30s，弃流出液；

(4)加入500μL溶液WB3，12000g离心30s，弃流出液；

(5)重复步骤4一次；

(6)12000g离心2min，彻底去除残留的WB3；

(7)将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入50-200μL预热的EB或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃下保存备用。

2、蛋鸡NCS1基因部分核苷酸片段的获得

(1)PCR扩增

根据NCBI数据库公布的蛋鸡NCS1基因序列(登录号Gene ID：NC_006104.5)设计引物对，该引物对的序列如下：

上游引物：5’-AGCAGTGGTGAGTAGCAG-3’(SEQ ID NO:2所示)，

下游引物：5’-GACATTGAACACGAAGGT-3’(SEQ ID NO:3所示)。

利用上述引物在蛋鸡基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，产物的片段的大小为1578bp。

(2)PCR扩增产物纯化

上述PCR扩增产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、直接测序法检测分子标记

将上述纯化后获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用DNAStar软件进行Blast比对分析，分析结果如图3所示。结果显示，在该序列中的第171bp、481bp和565bp处分别存在C/T、C/G和A/G三个等位基因突变，上述突变引起NCS1基因的多态性，这3个SNP标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。上述3个多态性位点共形成6种单倍型，分别为CCG、CCA、CGG、CGA、TGG和TGA。

实施例2本发明的分子标记在蛋鸡中的多态性分布检测

对SEQ ID NO:1所示的序列中的3个位点的多态性进行检测，在g.171bp C>T(NCS1_SNP1)、g.482bp C>G(NCS1_SNP2)和g.567bp A>G(NCS1_SNP3)位点均检测到三种基因型，基因型频率、等位基因频率和分布情况如表3所示。

表3蛋鸡NCS1基因基因型频率和等位基因频率

注：基因型频率一列括号内数字为该基因型的个体数。

由表3可知，SEQ ID NO:1所示序列的3个突变位点均检测到3种基因型，在NCS1_SNP1至NCS1_SNP3位点上，优势等位基因分别为C、C、G，优势基因型分别为CC、CC和GG。

实施例3本发明的分子标记与蛋鸡后期产蛋性状的关联分析与应用

为了确定检测出的蛋鸡NCS1_SNP1至NCS1_SNP3标记与蛋鸡后期产蛋性状的差异是否相关，选择江汉鸡和洛岛红鸡(样本总数220个，其中江汉鸡和洛岛红鸡各110个)为试验材料，样本采集于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场，记录每个个体的开产日龄、40周龄产蛋数和60周龄产蛋数性状，利用直接测序法进行多态性检测，并分析蛋鸡NCS1基因部分编码区不同基因型与蛋鸡产蛋后期性状的相关关系。采用SPSS18.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，所用模型如下：

Yij＝u+Gi+Pj+eij

其中，Yij为性状观察值；u为性状总平均值；Gi为基因型效应；Pj为固定效应；eij为随机误差。

在江汉鸡和洛岛红鸡中进行3个突变位点不同基因型与蛋鸡后期产蛋性状间的关联分析，统计分析结果如表4所示。

表4蛋鸡NCS1基因3个突变位点多态性与后期产蛋性状的关联分析

注：上表中相同字母表示差异不显著，字母a、b、c表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。

根据表4的分析结果可以看出，NCS1基因的NCS1_SNP1至NCS1_SNP3位点多态性与开产日龄、40周龄产蛋数、60周龄产蛋数具有显著相关性(p<0.05)。其中NCS1_SNP1位点的TT基因型、NCS1_SNP2位点的CC和CG基因型、NCS1_SNP3位点的AA和GG基因型具有更高的40周龄产蛋数；NCS1_SNP1位点的CT基因型、NCS1_SNP2位点的CG基因型、NCS1_SNP3位点的GG基因型具有更高的60周龄产蛋数。

实施例4本发明的分子标记与蛋鸡后期产蛋性状的关联分析与应用

1、单倍型与单倍型组合的构建

利用Haploview软件进行NCS1_SNP1至NCS1_SNP3的单倍型分析，将得到的所有个体的NCS1_SNP1至NCS1_SNP3位点的基因型数据输入PHASE程序，计算得到每个个体的基因型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度。单倍型block分析结果如图4所示。

由图4可知，根据NCS1_SNP1至NCS1_SNP3位点连锁不平衡分析，共找到1个单倍型block，对该单倍型block进行单倍型分析，在本发明研究的蛋鸡群体中发现6种单倍型，其中每个个体存在两种单倍型，各单倍型的序列和数量统计结果如表5所示。

表5 NCS1基因SNP位点单倍型统计结果

对上述单倍型组成的每个个体的单倍型组合进行分析，共发现11种单倍型组合，如表6所示。

表6 NCS1基因单倍型组合

单倍型组合	序列	数量(只)
			H1H1	CCG/CCG	81
H1H2	CCG/CCA	46
			H1H3	CCG/CGG	20
H1H4	CCG/CGA	5
			H1H5	CCG/TGG	25
H2H2	CCA/CCA	10
			H2H5	CCA/TGG	6
H3H3	CGG/CGG	5
			H3H5	CGG/TGG	6
H4H4	CGA/CGA	11
			H5H6	TGG/TGA	5

剔除样品群体中数量较少的部分单倍型组合，选择数量最多的5种单倍型组合进行关联分析。

2、单倍型组合与后期产蛋性状的关联分析

利用SPSS18.0软件进行单倍型组合与后期产蛋性状的关联分析，结果如表7所示。

表7优势单倍型组合与后期产蛋性状的关联分析结果

注：上表中相同字母表示差异不显著，字母a、b、c表示差异显著，n为该种基因型的个体数量。

根据表7的分析结果可知，单倍型组合H1H2：CCG/CCA和单倍型组合H1H5：CCG/TGG个体的40周龄产蛋数显著高于其他单倍型组合个体(p<0.05)，单倍型组合H1H3：CCG/CGG个体的60周龄产蛋数显著高于其他单倍型组合个体(p<0.05)。综合上述分析结果，在本实施例的试验群体中单倍型组合H1H3：CCG/CGG具有最佳的后期产蛋性状。因此在蛋鸡群体中，通过对该单倍型组合H1H3：CCG/CGG个体的选留，将有助于提高蛋鸡整体的后期产蛋性状。即本发明鉴定的突变位点组成的单倍型组合可作为提高蛋鸡后期产蛋性状的潜在遗传标记以用于高产蛋鸡的辅助选择。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，所述分子标记包括：

SNP1位点：在SEQ ID NO: 1所示序列中第171 bp处存在C/T多态性位点；

SNP2位点：在SEQ ID NO: 1所示序列中第481bp处存在C/G多态性位点；

SNP3位点：在SEQ ID NO: 1所示序列中第565bp处存在A/G多态性位点。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述序列中的第171bp处的优势基因型为CC，所述序列中的第481bp处的优势基因型为CC，所述序列中的第565bp处的优势基因型为GG。

3.一种如权利要求1所述的蛋鸡NCS1基因中与后期产蛋性状相关的分子标记的检测方法，其特征在于，采用引物对进行检测，所述引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

从蛋鸡血液中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的引物对进行扩增，并将扩增产物进行序列比对，得到如权利要求1中所述的3个SNP位点。

5.一种单倍型组合的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先采用权利要求4所述的方法检测出3个SNP位点；然后构建出六种单倍型，H1：CCG，H2：CCA，H3：CGG，H4：CGA，H5：TGG，H6：TGA；再根据所述单倍型构建单倍型组合，并与蛋鸡的后期产蛋性状相关联。

6.权利要求1-2任一所述的分子标记、或权利要求5所述的单倍型组合在蛋鸡后期产蛋性状辅助选择中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋鸡后期产蛋性状包括40周龄产蛋数和/或60周龄产蛋数。

8.一种后期高产蛋鸡的选育方法，其特征在于，所述方法包括：采用如权利要求5所述的方法构建单倍型组合，保留单倍型组合为HIH3：CCG/CGG的个体。