FR3008618A1 - Utilisation de composes pour restaurer la reponse a la lumiere des cellules de la retine - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérases et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase pour une utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs.

Description

UTILISATION DE COMPOSES POUR RESTAURER LA REPONSE A LA LUMIERE DES CELLULES DE LA RETINE La présente invention concerne l'utilisation de composés pour restaurer la réponse à la lumière des cellules de la rétine. Bien que le nombre d'aveugles sur la planète ne soit pas connu avec précision, une étude de l'organisation Mondiale de la Santé a évalué la population mondiale d'aveugles à 38 millions de personnes, en 2002. De plus, 110 millions souffrent de déficience visuelle et courent un grand risque de perdre la vue. Les causes principales de cécité et de basse vision sont la cataracte, le trachome, le glaucome, l'onchocercose et la xérophtalmie. Cependant, d'autres pathologies comme la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge peuvent également être à l'origine de la cécité. La définition actuelle ne fait pas la différence entre les personnes qui n'ont pas de perception lumineuse (cécité "totale") et celles qui ont une perception lumineuse mais qui ont une vision inférieure à 1/20 du meilleur oeil. La rétine constitue l'organe sensible de la vision. La rétine est une structure complexe organisée en deux parties : la neurorétine et l'épithélium pigmentaire. La neurorétine est essentiellement « photosensible » c'est-à-dire qu'elle est capable de convertir les photons lumineux en influx visuels transmis jusqu'aux différentes aires visuelles pour aboutir à la vision. De manière schématique et en dehors de la fovéola, la neurorétine est stratifiée en trois étages. Les photorécepteurs (cônes et les bâtonnets) forment le premier étage rétinien ou rétine externe. Ils font synapse à la couche plexiforme externe avec des interneurones, les cellules horizontales et les cellules bipolaires qui constituent avec les cellules amacrines le deuxième étage rétinien jusqu'à la couche plexiforme interne. Cette dernière est essentiellement divisée en deux sous couches, la sous couche-a, superficielle et la sous couche-b, plus profonde. Le troisième étage neuronal correspond à la couche des cellules ganglionnaires constituées de cellules ganglionnaires et de cellules amacrines déplacées. Ces dernières font synapses entre elles et avec les cellules bipolaires et amacrines dans la couche plexiforme interne.

Les cellules ganglionnaires de la rétine qui reçoivent des entrées synaptiques dans la sous couche-a de la couche plexiforme interne, avec des cellules bipolaires de type OFF sont dites cellules ganglionnaires OFF ; de même, les cellules ganglionnaires qui reçoivent leurs entrées synaptiques dans la sous couche-b avec des cellules bipolaires sont dites cellules ganglionnaires ON. En l'absence de stimulation lumineuse, les cellules ganglionnaires émettent spontanément des potentiels d'action dont les fréquences temporelles sont fonction de leur type cellulaire ON ou OFF. Les cellules ganglionnaires rétiniennes dites ON produisent une augmentation de leur fréquence temporelle de décharge des potentiels d'action par rapport à leur rythme de base (ou réponse « ON »), lorsque la rétine est illuminée dans la région centrale du champ récepteur de ces cellules. Inversement, les cellules ganglionnaires OFF répondent par une diminution de la fréquence temporelle de leurs potentiels d'action par rapport à leur rythme de base (ou réponse « OFF »), lorsque la rétine est illuminée dans la partie centrale de leur champ récepteur. Des cellules sont dites ON-OFF lorsqu'elles produisent des réponses transitoires aux changements de luminosité, ces dernières ont des prolongements dendritiques dans les deux sous couches de la plexiforme interne. Les axones des cellules ganglionnaires se myélinisent à partir de la lame criblée de la papille, pour former les fibres des nerfs optiques qui transfèrent l'information visuelle au cerveau. Les dystrophies rétiniennes constituent une cause non négligeable de cécité. Ce sont des affections dégénératives atteignant de façon diffuse ou localisée, et de manière primaire ou secondaire, les cellules photoréceptrices de la rétine que sont les cônes et les bâtonnets. Ces cellules appartiennent à la couche la plus externe de la rétine et convertissent l'énergie électromagnétique du photon lumineux en un influx nerveux qui est transmis au cerveau par l'intermédiaire du nerf optique. Les dystrophies rétiniennes sont constituées par les rétinites pigmentaires, le syndrome d'Usher, la maladie de Stargardt (10 %), l'amaurose congénitale de Leber, les dystrophies des cônes et la cécité nocturne congénitale stationnaire. Les photorécepteurs dégénèrent également dans des pathologies plus complexes comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge. La dégénérescence des cellules photoréceptrices et/ou l'incapacité de ces cellules à répondre à la lumière conduisent progressivement à la perte de la fonction visuelle. Afin de remédier à ce déficit, plusieurs traitements thérapeutiques sont actuellement en cours de développement. Il s'agit notamment de la thérapie génique dont l'objectif est de corriger des mutations spécifiques ou d'introduire une protéine optogénétique pour resensibiliser le circuit à la lumière (thérapie optogénétique), de la thérapie cellulaire permettant de remplacer des photorécepteurs disparus, des dispositifs neuro-prothétiques qui font appel à la stimulation électrique du nerf optique, de la rétine et du cortex ou bien encore de traitements pharmacologiques à base de petites molécules ou de facteurs trophiques. Le fonctionnement des photorécepteurs ne repose pas sur la genèse de potentiels d'action mais sur des potentiels gradués avec dépolarisation-repolarisation de la cellule.

A l'obscurité, les photorécepteurs sont à l'état dépolarisés, et libèrent à leur base un neuromédiateur, le glutamate, qui diffuse dans la fente synaptique vers les cellules bipolaires ON qu'il inhibe en se fixant sur des récepteurs métabotropiques au glutamate de type mGluR6, et vers les cellules bipolaires OFF, qu'il active en se fixant sur des récepteurs ionotropiques. Il s'ensuit que seules les cellules ganglionnaire OFF ainsi activées par les cellules bipolaires OFF auront une augmentation de la fréquence de leurs potentiels d'action au sein du nerf optique. En présence de lumière, l'absorption des photons au niveau des segments externes des photorécepteurs se solde par une hyperpolarisation cellulaire et corrélativement par une diminution de l'excrétion de glutamate. Il en résulte une activation des cellules bipolaires ON et donc des cellules ganglionnaires ON associées, et inversement, une inhibition des cellules bipolaires OFF. Cette activité neuronale résulte de la cascade de phototransduction dans les segments externes des photorécepteurs. L'illumination de la rétine provoque l'activation d'une protéine membranaire: la rhodopsine. Cette rhodopsine activée va pouvoir activer plusieurs molécules de transducine. L'activation de la transducine conduit à la fixation d'une molécule de GTP et à la dissociation d'une sous-unité de cette protéine qui va pourvoir se lier transitoirement à une sous-unité inhibitrice d'une enzyme jusqu'alors inactive: la phosphodiestérase. La dissociation de cette sous-unité inhibitrice permet l'activation de la phosphodiestérase qui peut hydrolyser de nombreuses molécules de GMP cyclique (GMPc) en GMP. Or, ce GMPc est l'agoniste du canal induisant le courant d'obscurité à l'origine de la dépolarisation des photorécepteurs à l'obscurité. Par conséquent, la diminution de la concentration en GMPc entraîne une fermeture des canaux cationiques et une hyperpolarisation des photorécepteurs. Cette repolarisation qui se propage du segment externe à l'ensemble du photorécepteur se traduit au niveau des terminaisons synaptiques par une réduction de la libération de glutamate dans la fente synaptique. Les phosphodiesterases (PDEs) comprennent une famille de protéines apparentées qui peuvent être subdivisés en 11 familles en fonction de leurs séquences d'acides aminés, de la sensibilité à différents activateurs ou inhibiteurs, et, de leur capacité à hydrolyser préférentiellement l'AMPc ou le GMPc, ou les deux. Au sein de ces enzymes, la phosphodiestérase de type 6 (PDE6) constitue une famille PDE hydrolysant spécifiquement le GMPc. L'expression tissulaire de la PDE6 se situe principalement dans les cellules photoréceptrices de la rétine des mammifères. La PDE6 est constituée de deux sous-unités catalytiques PDE6a et PDEfl codées par les gènes PDE6A et PDE6B ainsi que deux sous-unités identiques inhibitrices PDE6y, codées par le gène PDE6G. Plus le nombre de sites catalytiques PDE6 activés augmente en réponse à un stimulus lumineux, plus le temps d'intégration des signaux lumineux est raccourci, accélérant ainsi la réponse visuelle. La PDE6 a été largement étudiée dans le contexte de dysfonctions visuelles. Cependant, d'autres phosphodiestérases se retrouvent au niveau du tissu rétinien tant dans les cellules endothéliales pour la PDE5 que dans les neurones (PDE1 et PDE9 : cellules bipolaires (Dhingra et al., 2008, J. Comp. Neurol., 510: 484-496); PDE4 : cellules bipolaires, horizontales, amacrines, ganglionnaires (Whitaker et Cooper, 2009, Neuroscience 163 : 1277-91); PDE5 : cellules bipolaires et ganglionnaires (Foresta et al., 2008, Eye (Lond), 22 : 144-149). Le sildénafil est un inhibiteur de la phosphodiestérase (PDE) de type 5 largement utilisé pour le traitement de la dysfonction érectile, sous la forme de Viagra® (citrate de sildénafil). Bien qu'ayant une spécificité optimale pour la PDE5, le sildénafil inhibe également, mais dans une moindre mesure, la PDE6 (Cote, 2004, J Impotence Res. 16 Suppl. 1 : S28-33) et les autres PDEs (Ke, 2004, J Impotence Res. 16 Suppl. 1 : S24-27). Des études cliniques ont signalé des déficits visuels transitoires chez les patients après une utilisation unique de sildénafil. En particulier, une altération transitoire des couleurs a été observée chez des patients placés sous sildénafil. Cependant, l'effet du sildénafil concernant les propriétés de réponse de la rétine la lumière n'est pas entièrement compris.

L'étude de Stockman et al. montre que l'absorption de Viagra® provoque une dégradation des performances visuelles au niveau de la rétine, et provoque notamment un retard dans la réponse à la lumière des cônes (Stockman et al., 2007, J Of Vision, 7(8) :4, 1-15). Dans le document WO 01/10406, le sildenafil est utilisé pour accroitre le flux sanguin dans différents tissus qui composent l'oeil, permettant ainsi de modifier l'évolution de certaines pathologies visuelles. Cette observation a été confirmée par Paris et al. qui montre une augmentation de l'afflux sanguin dans le tissu choroïde de l'oeil (Paris et al., 2001, International Ophtalmology, 23 : 355-358.) Cet effet sur le flux sanguin pourrait avoir un impact important pour des pathologies rétiniennes d'origine vasculaire comme le glaucome ou les conséquences rétiniennes du diabète dénommées rétinopathie diabétique. Dans de nombreuses dystrophies rétiniennes, les patients perdent leur photorécepteurs de type bâtonnet puis les photorécepteurs de type cônes. Les patients deviennent donc aveugles. Différentes stratégies sont à l'étude pour réactiver ce tissu. Il s'agit de prothèses rétiniennes ou de thérapie optogénétique. Au cours de ces études, il a été montré que certains patients conservent un nombre important de photorécepteurs mais que ces derniers ne procurent plus d'information visuelle au circuit ce qui explique la cécité des patients (Busskamp et al., 2010, Science 329 : 413-417) . Compte tenu de la difficulté liée à la mise en place d'une thérapie génique ou cellulaire au niveau de l'oeil, il existe par conséquent un réel besoin d'identifier des produits susceptibles de participer à la réactivation des photorécepteurs et/ou du tissu rétinien. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence un effet bénéfique de l'utilisation d'inhibiteurs de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou guanylate cyclase sur le métabolisme des cellules rétiniennes ce qui permet de restaurer une réponse à la lumière sur ces cellules. Cette démonstration a été faite sur un tissu in vitro, c'est-à-dire dépourvu de toute perfusion sanguine et donc d'effet vasculaire, ce qui implique que l'effet observé est produit par un effet sur les cellules rétiniennes neuronales et non sur le système vasculaire.

Le but de la présente invention est de proposer une méthode de restauration d'une réponse à la lumière des cellules de la rétine qui présentent une dégénérescence ou un dysfonctionnement. Un autre but de la présente invention est de permettre la réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Le traitement pourra également s'appliquer pour des personnes ayant un large scotome (zone aveugle) résultant de la dégénérescence ou de l'inactivation des photorécepteurs. Encore un autre but de la présente invention est de fournir des compositions pharmaceutiques comprenant des principes actifs permettant la réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. La présente invention concerne des produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation d'inhibiteurs de phosphodiestérase sur des rétines aveugles permettait de restaurer la réponse à la lumière. Par « inhibiteurs de phosphodiestérase », on désigne les composés capables d'interagir avec le site actif des enzymes de type phosphodiestérase (PDE) et ainsi d'en perturber l'activité catalytique. Ceci a pour conséquence que le GMPc et/ou l'AMPc, les substrats naturels des PDEs, ne peuvent plus être hydrolysés en GMP ou AMP, entraînant ainsi une augmentation intracellulaire du taux de GMPc et ou de AMPc. Les inhibiteurs de PDE envisagés selon la présente invention peuvent être non-sélectifs des différents types de PDEs, notamment la caféine, la théophylline ou le 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), ou au contraire spécifiques des différents types de PDEs, en particulier des PDE-1, PDE-2, PDE-3, PDE-4, PDE-5, PDE-6 ou PDE-9. Par « activateurs d' adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase», on désigne les composés capables d'activer l'adénylate cyclase ou la guanylate cyclase, familles d'enzymes qui catalysent la conversion d'ATP en AMPc ou de GTP en GMPc. Les expressions adénylate cyclase et adénylyl cyclase sont équivalentes et pourront être employées indifféremment l'une à la place de l'autre. De la même manière, les expressions guanylate cyclase et guanylyl cyclase sont équivalentes et pourront être employées indifféremment l'une à la place de l'autre. Par « réhabilitation de la vision », on désigne la restauration d'une perception visuelle dans une zone considéré comme aveugle. Cette restauration visuelle peut être démontrée par la mesure d'une activité fonctionnelle induite par la lumière au niveau de la population des cellules ganglionnaires rétiniennes non photosensibles. Par « personne aveugle ou atteinte de cécité légale », on désigne les patients dont la capacité visuelle ne permet pas une autonomie dans leur déplacement et leurs tâches quotidiennes. En France, la cécité légale est définie par une acuité visuelle inférieure à 1/20 pour le meilleur oeil après correction. Cette définition correspond à celle établie par l'OMS qui définit la cécité comme une acuité visuelle inférieure à 3/60, ou une perte du champ visuel correspondant à moins de 10 degrés dans le meilleur oeil avec la meilleure correction possible (Classification Internationale statistique des Maladies, traumatismes et causes de décès, 10ème révision (CIM-10) catégories de déficience visuelle 3, 4 et 5). Par « photorécepteurs », on désigne les cônes et les bâtonnets de la rétine. Les photorécepteurs, également appelés cellules photoréceptrices, possèdent des pigments capables d'absorber des photons de la lumière. Ces cellules sont à l'origine du message nerveux sensoriel qui est propagé par les fibres du nerf optique sous forme de signaux électriques jusqu'au cerveau. Les bâtonnets sont les cellules photoréceptrices fonctionnelles en faible éclairement et sont impliqués dans la vision nocturne alors que les cônes fonctionnent lorsque la lumière est intense, dans la vision diurne. Il y a trois types de cônes (de types S, M, ou L) dans la rétine humaine ; chacun présente un maximum de sensibilité pour une plage de longueurs d'ondes données. Ils participent à la vision des couleurs mais sont beaucoup moins sensibles à la lumière que les bâtonnets. Par «dégénérescence et/ou dysfonctionnement », on désigne l'incapacité des photorécepteurs à recevoir un signal lumineux et à le convertir en message nerveux transmissible aux autres cellules de la rétine. Cette incapacité peut notamment résulter de la perte des pigments au niveau des cônes et/ou des bâtonnets ou encore d'un défaut de transduction du signal au sein de ces cellules. L'incapacité peut aussi porter sur le défaut de transmission de l'information visuelle. Toutefois, les cellules photoréceptrices résiduelles restent connectées aux autres cellules de la rétine qui traitent l'information et l'amènent au cerveau. Dans le cadre de la présente invention, la dégénérescence concerne en premier lieu les cellules photoréceptrices, une atteinte des cellules nerveuses pouvant intervenir suite à la perte de photorécepteurs. Cependant, ces cellules nerveuses sont fonctionnelles comme l'indique les essais cliniques sur les prothèses rétiniennes qui ont permis d'obtenir une restauration fonctionnelle. La fonctionnalité de ce tissu résiduel peut d'ailleurs être attestée par l'induction de percepts lumineux par stimulation électrique transcornéenne (Naycheva et al., (2012) IOVS 53 : 7440-7448). La présente invention concerne des produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d' adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs et les cellules nerveuses de la rétine étant fonctionnelles.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne des produits constitués d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Selon un mode de réalisation plus particulier, les activateurs d'adénylate cyclase et ou de guanylate cyclase des produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, sont choisis parmi les composés suivants : BAY 60-2770, BAY 41-8543, BAY 60-4552; BAY 41-2272; Cinaciguat (BAY 58-2667); 3-(5'-Hydroxymethy1-2'-fury1)-1- benzyl indazole (YC-1) ou la forskoline. Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne des produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Plus particulièrement, les inhibiteurs de phosphodiestérase des produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, ont pour cible la phosphodiestérase 5 et/ou la phosphodiestérase 6. Par « phosphodiestérase 5 », on désigne la phosphodiestérase exprimée majoritairement par les cellules musculaires lisses et les cellules bipolaires ou ganglionnaires de la rétine. Par « phosphodiestérase 6 », on désigne la phosphodiestérase exprimée majoritairement par les cellules photoréceptrices, en particulier les cônes et les bâtonnets. Selon un mode de réalisation plus particulier, les inhibiteurs de phosphodiestérase des produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, ont pour cible la phosphodiestérase 1 et/ou la phosphodiestérase 9.

Par « « phosphodiestérase 1 », on désigne la phosphodiestérase exprimée majoritairement par les cellules bipolaires de la rétine.

Par « phosphodiestérase 4 », on désigne la phosphodiestérase exprimée majoritairement par les cellules bipolaires, amacrines, horizontales ou ganglionnaires de la rétine. Par « phosphodiestérase 9 », on désigne la phosphodiestérase exprimée majoritairement par les cellules bipolaires de la rétine. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, les inhibiteurs de phosphodiestérase des produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, sont choisis parmi: l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Selon encore un autre mode de réalisation plus particulier, lesdits produits de l'invention sont constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase, notamment de la phosphodiestérase 5 et/ou la phosphodiestérase 6, notamment choisis parmi l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021.

Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, l'inhibiteur de phosphodiestérase des produits de l'invention pour une utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale est le sildenafil. Par « sildénafil », on désigne le composé dont la dénomination IUPAC est 1-[4- éthoxy-3-(6,7-dihydro-l-méthy1-7-oxo-3-propyl-1H >-pyrazolo [4,3 -d]pyrimidin-5-y1) (phénylsulfonyl]-4-méthylpipérazine. La forme citrate du sildénafil est préférée mais ne doit en aucun cas restreindre la portée de la présente invention qui peut également s'étendre aux bases et aux sels de sildénafil. Selon un mode de réalisation particulier, dans les produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, ledit inhibiteur est susceptible d'être utilisé à une dose unitaire comprise de 2 mg à 200 mg, notamment de 2 mg à 50 mg, de 50 mg à 100 mg, de 100 mg à 150 mg, de 150 mg à 200 mg.

Selon un mode de réalisation encore plus particulier, les doses unitaires sont en particulier de 50 mg pour le sildenafil, le mirodenafil, de 2 mg à 20 mg, en particulier 10 mg pour le tadalafil, le vardenafil, de 40 mg à 80 mg, en particulier 80 mg pour le lodenafil, de 50 mg à 200 mg, en particulier 100 mg pour l'udenafil ou l'avanafil.

Par « dose unitaire », on désigne la quantité spécifique d'inhibiteurs de phosphodiestérase ingérée par le patient en une prise. La dose unitaire est la présentation appropriée d'une quantité déterminée d'inhibiteurs de phosphodiestérase dans un récipient unidose, destinée à l'administration au patient. Le nombre de doses unitaires administrables par jour au patient peut varier de 1 à 3 en fonction de la gravité de l'état à soulager et est déterminé par le praticien. La composition pharmaceutique peut être administrée en une seule fois, ou peut être divisée en un certain nombre de plus petites doses pour être administrées à des intervalles de temps. Il est entendu que le dosage précis et la durée du traitement est fonction de la maladie à traiter et peuvent être déterminées de façon empirique en utilisant des protocoles de test connus, ou par extrapolation à partir des données de tests réalisés in vivo ou in vitro. Il doit en outre être entendu que, pour un patient particulier, les schémas posologiques spécifiques doivent être ajustés au fil du temps selon les besoins individuels et le jugement professionnel de la personne administrant ou supervisant l'administration des produits de l'invention.

Les produits impliqués dans la présente invention peuvent être formulés avantageusement pour une application locale, sous forme de gouttes ou d'implants intraou péri-oculaires. La présente invention concerne également une composition ophtalmique comprenant au moins un inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase, tels que définis précédemment, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA. Par « composition ophtalmique », on désigne tous types de composition permettant une administration directe ou locale dans l'oeil du patient. La composition peut être administrée de manière topique à la surface de l'oeil ou peut être injectée dans l'oeil (i.e. par injection intra-vitréenne, par injection sous-conjonctivale, par injection sous- rétinienne, par injection sous-ténonienne, injection rétrobulbaire).

La composition ophtalmique peut être fournie sous une forme qui permet l'administration locale ou directe de celle-ci dans l'oeil, y compris mais non limité à, une solution, des gouttes, une pulvérisation, une pommade, une lotion, une crème ou un gel. Selon un mode de réalisation plus particulier, dans la composition ophtalmique selon la présente invention la concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase de ladite composition ophtalmologique varie de 0,00001% à 95%. La concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase peuvent être présents dans la composition ophtalmique à toute concentration qui permet à la composition ophtalmique de fonctionner conformément à la présente invention, par exemple, mais non à titre limitatif, l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase peuvent être présents dans une gamme ayant un niveau inférieur choisi parmi 0,0001% 0,005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4% , 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et 2,0%, et un niveau supérieur choisi parmi 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7 %, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% et 95% en poids de la composition.

Selon un mode de réalisation plus particulier, la composition ophtalmique selon la présente invention comprend au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tel que définis précédemment, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, dans laquelle la concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase de ladite composition ophtalmologique varie de 0,00001% à 95%.

Selon un mode de réalisation plus particulier, l'inhibiteur de phosphodiesterase de la composition ophtalmique selon la présente invention est le sildénafil. Selon un mode de réalisation plus particulier, la composition ophtalmique selon la présente invention est formulée pour être délivrée dans l'oeil sous forme de goutte. Selon un mode de réalisation particulier, la composition ophtalmique est fournie sous la forme d'un collyre. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, la composition ophtalmique selon la présente invention contient également un agent facilitant la délivrance de ladite solution dans la rétine.

Par « agent facilitant la délivrance », on désigne un composé qui aide à la pénétration d'une surface de l'oeil, notamment la cornée et /ou de la rétine de l'oeil, pour atteindre le tissu à traité. En outre, le taux de pénétration des compositions ophtalmiques de l'invention devra être suffisant pour délivrer une dose efficace. Selon encore un autre mode de réalisation, la composition ophtalmique selon la présente invention contient au moins un additif, ledit additif pouvant être un agent de mouillage ou un lubrifiant. L'agent de mouillage vise à hydrater ou encore à limiter l'assèchement de l'oeil. Les agents de mouillage sont généralement des polymères hydrophiles ou à base de cellulose. L'agent lubrifiant à une texture proche de celle des larmes naturelles et aide à leur formation. Les agents lubrifiants peuvent être de nature phospholipidique ou non-phospholipidique. A titre illustratif, et sans que cela restreigne la portée de la présente invention, les lubrifiants oculaires peuvent être choisis parmi : le propylène glycol, l'éthylène glycol, le polyéthylène glycol, l'hydroxypropylméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose; les dextranes, des protéines solubles dans l'eau (i.e. la gélatine), les polymères vinyliques (i.e. l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, la povidone), la vaseline, une huile minérale, des carbomères (i.e. les carbomère 934P, le carbomère 941, le carbomère 940, le carbomère 974P). De tels agents de mouillage ou lubrifiants sont bien connus de l'Homme du métier. Les compositions ophtalmiques selon la présente invention peuvent également contenir d'autres excipients, c'est-à-dire d'autres composés pharmaceutiquement acceptables, choisis selon la formulation et le mode d'administration des compositions ophtalmiques de l'invention.

La présente invention concerne également un implant intra- ou péri-oculaire comprenant au moins un inhibiteur de phosphodiestérase et/ou un activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase, tels que définis précédemment, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA. Selon un mode de réalisation plus particulier, dans l'implant intra- ou péri- oculaire selon la présente invention la concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase varie de 0,00001% à 95%.

La concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase peuvent être présents dans l'implant intraou péri-oculaire à toute concentration qui permet à l'implant intra- ou péri-oculaire de fonctionner conformément à la présente invention, par exemple, mais non à titre limitatif, l'inhibiteur de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase peuvent être présents dans une gamme ayant un niveau inférieur choisi parmi 0,0001% 0,005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4% , 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et 2,0%, et un niveau supérieur choisi parmi 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7 %, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% et 95% en poids de la composition. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'implant intra- ou péri-oculaire selon la présente invention comprend au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tels que définis dans l'une des revendications 3 ou 4, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, dans lequel la concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase varie de 0,00001% à 95%. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans l'implant intra- ou péri-oculaire selon la présente invention, l'inhibiteur de phosphodiestérase est le sildénafil.

Selon un autre mode de réalisation, les produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale peuvent être utilisés en combinaison avec un chélateur de calcium. Par « chélateur de calcium », on désigne les composés qui ont la capacité de fixer des cations métalliques, et en particulier le calcium sous sa forme Ca2+, en constituant un complexe stable. La chélation de ces cations perturbe l'activité d'enzymes qui utilisent des métaux lors de la catalyse des substrats. Un chélateur de calcium constitue par conséquent un inhibiteur d'enzyme Ca2+ dépendante, notamment des phosphodiestérases dont l'activité enzymatique nécessite la présence de ce cation divalent. Le calcium est un bloqueur du canal cGMP dépendant des photorecepteurs. Le Ca2+ est également un bloqueur des canaux dépendants du cGMP, sa chélation permet d'augmenter la dépolarisation des photorécepteurs.

Selon un autre mode de réalisation plus particulier, le chélateur de calcium utilisé en combinaison avec les inhibiteurs de phosphodiestérase dans les produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, est l'EDTA.

Par « EDTA », on désigne le composé dont la dénomination IUPAC est l'acide 2,2',2",2"'-(éthane-1,2-diyldinitrilo)tétraacétique. L'EDTA est un chélateur du Ca2+, par conséquent, en solution, il module les concentrations ioniques et notamment la concentration de Ca2+ libre et donc biologiquement disponible. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, le chélateur de calcium utilisé en combinaison avec les inhibiteurs de phosphodiestérase dans les produits de l'invention pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, est l'EGTA. Par « EGTA », on désigne le composé dont la dénomination IUPAC est l'acide N,N,N',N'-bis(2-aminoéthyléther) éthylène glycol tétraacétique. L'EGTA est un chélateur du Ca2+, par conséquent, en solution, il module les concentrations ioniques et notamment la concentration de Ca2+ libre et donc biologiquement disponible. Selon encore un autre mode de réalisation, les produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale peuvent être utilisés en association avec un procédé de restauration de la vision choisi parmi la transplantation de cellules souches, les implants (prothèses rétiniennes), la thérapie optogénétique ou la thérapie génique classique. Par « implant ou prothèse rétinienne », on désigne les dispositifs électroniques permettant de stimuler électriquement les cellules rétiniennes. Le dispositif contient des électrodes qui délivrent des courants au contact ou dans le tissu rétinien résiduel pour modifier l'activité électrique des neurones et ainsi induire une perception visuelle. Par « thérapie optogénétique », on désigne la modification génétique des cellules rétiniennes résiduelles pour les rendre réactives à la lumière. L'illumination de ces cellules ainsi modifiées permet alors soit de les activer soit de bloquer leur activité. Dans le cadre de la présente invention, des photorécepteurs devenus inactifs peuvent recevoir un gène hexogène codant pour un pigment, notamment une rhodopsine ou opsine d'origine humaine ou bactérienne. En particulier, l'opsine choisie pourra être une opsine contrôlant l'ouverture d'un canal ionique comme la channerhodopsine-2 ou une pompe ionique comme l'halorhodopsine (pompe à ions chlorure). Dans le cas de l'halorhodopsine, l'illumination des photorécepteurs ou autres neurones exprimant cette pompe à ions chlorure va induire son activation et l'hyperpolarisation des cellules voire une dépolarisation pour les cellules bipolaires ON. La modification du potentiel de membranes des cellules exprimant la protéine modifie la libération du neuromédiateur par le neurone ou le photorécepteur, signal qui se propage, au travers du nerf optique, vers le cerveau. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur de phosphophodiestérase et/ou d'activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase et un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur de phosphophodiestérase et/ou d'activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase et un chélateur de calcium, en particulier 1'EGTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on désigne les composés entrant la formulation des compositions pharmaceutique de l'invention et qui n'interfère pas avec l'activité ou la biodisponibilité des principes actifs. Ces composés peuvent notamment être des agents de charge, des conservateurs, des lubrifiants mais ne doivent pas être restreints à cette classe de composés. Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention, comprend comme principe actif un inhibiteur de phosphodiestérase et un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La proportion de chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA ou 1'EGTA, dans la composition pharmaceutique peut varier de 0,0010% à 0,050% en poids de la composition. En particulier, la proportion de chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA ou 1'EGTA, dans la composition pharmaceutique peut varier dans une gamme ayant un niveau inférieur choisi parmi 0,0010%, 0,0015%, 0,0020%, 0,0025%, 0,0030%, 0,0035%, 0,0040%, 0,0045%, 0,0050%, 0,0055%, 0,0060%, 0,0065%, 0,0070%, 0,0075%, 0,0080%, 0,0085%, 0,0090%, 0,0095%, et un niveau supérieur choisi parmi 0,01%, 0,015%, 0,020%, 0,025%, 0,030%, 0,035%, 0,040%, 0,045% et 0,050% en poids de la composition.

Dans la composition pharmaceutique selon la présente invention, la proportion en poids dudit inhibiteur de phosphophodiestérase est comprise de 0,0001% et 95%, en particulier de 0,01% à 10%. 10 90% et 95% en poids de la composition. Plus particulièrement, dans la composition pharmaceutique selon la présente invention, ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le 15 sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Encore plus particulièrement, la composition pharmaceutique selon la présente invention comprend comme principe actif au moins un inhibiteur de phosphodiestérase et 20 un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle la proportion en poids dudit inhibiteur de phosphodiestérase est comprise de 0,0001% à 95%, en particulier de 0,01% à 10%, et dans laquelle ledit inhibiteur de phosphodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le 25 sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Encore plus particulièrement, dans la composition pharmaceutique selon la présente invention, ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est le sildenafil. 30 Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention, comprend comme principe actif un activateur d'adénylate cyclase et un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La proportion de l'inhibiteur de phosphodiestérase dans la composition pharmaceutique peut varier dans une gamme ayant un niveau inférieur choisi parmi 0,0001%, 0,005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4% , 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et 2,0%, et un niveau supérieur choisi parmi 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7 %, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, Dans la composition pharmaceutique selon la présente invention, l'activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase est choisi parmi les composés suivants : la forskoline, BAY 60-2770, BAY 41-8543, BAY 60-4552; BAY 41-2272; Cinaciguat (BAY 58-2667); 3-(5'-Hydroxymethy1-2`-fury1)-1-benzyl indazole (YC-1), en particulier la forskoline. Il est également envisageable de combiner les produits de l'invention avec d'autres modes de traitement thérapeutique des cellules photoréceptrices. Ces associations visent à potentialiser les effets bénéfiques de chacune des thérapies afin de donner aux patients un plus grand confort de vision susceptible de l'aider dans ses tâches au quotidien. La présente invention concerne également une association thérapeutique comprenant au moins un inhibiteur de phosphophodiestérase et/ou un activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase tel que défini précédemment et : - un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, ou - des cellules souches non embryonnaires, ou - des implants (prothèses rétiniennes), ou - des gènes pour la mise en oeuvre d'une thérapie optogénétique ou d'une thérapie génique classique, en tant que combinaison pour son utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Par « cellules souches non embryonnaires », on désigne les cellules pluripotentes, totipotentes ou encore les cellules engagées dans un protocole de dédifférenciation cellulaire et qui se distinguent des cellules ES d'origine embryonnaire. Ces cellules peuvent également être appelées cellules progénitrices. Leur origine tissulaire peut être variée. Il est également envisageable d'utiliser des cellules souches embryonnaires autologues, hétérologues ou allogéniques. Par « thérapie génique classique », on désigne l'opération qui consiste à remplacer 30 un gène humain défectueux ou absent dans une cellule par un gène fonctionnel humain ou non humain comme les gènes de protéines optogénétiques. On désigne également l'opération qui consiste à invalider l'expression d'un gène délétère d'une cellule, notamment par l'utilisation de siRNA ou toute autre technique équivalente bien connue de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation particulier, les associations thérapeutiques selon la présente invention comprennent au moins un inhibiteur de phosphophodiestérase et - un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, ou - des cellules souches non embryonnaires, ou - des implants (prothèses rétiniennes), ou - des gènes pour la mise en oeuvre d'une thérapie optogénétique ou d'une thérapie génique classique, en tant que combinaison pour son utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Selon un mode de réalisation plus particulier, l'association thérapeutique selon la présente invention comprend au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tel que défini précédemment et : - un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, ou - des cellules souches non embryonnaires, ou - des implants (prothèses rétiniennes), ou - des gènes pour la mise en oeuvre d'une thérapie optogénétique ou d'une thérapie génique classique. en tant que produit de combinaison pour son utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs, dans laquelle ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021.

Selon un mode de réalisation encore plus particulier, dans les associations thérapeutiques selon la présente invention, ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, dans les associations thérapeutiques selon la présente invention, ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est le sildenafil. La présente invention concerne également une association thérapeutique comprenant au moins un activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase et : - un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, ou - des cellules souches non embryonnaires, ou - des implants (prothèses rétiniennes), ou - des gènes pour la mise en oeuvre d'une thérapie optogénétique ou d'une thérapie génique classique, en tant que combinaison pour son utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs. Selon un autre mode de réalisation plus particulier, dans les produits selon la présente invention, ledit activateur d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase est choisi parmi : la forskoline, BAY 60-2770, BAY 41-8543, BAY 60-4552; BAY 41-2272; Cinaciguat (BAY 58-2667); 3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzyl indazole (YC-1), en particulier la forskoline. Les figures et les exemples suivants servent à illustrer la présente invention mais ne doivent en aucun cas servir à en restreindre la portée.

Légendes des figures Figure 1 : Réponse à la lumière enregistrée par une électrode extracellulaire en présence ou absence de sildénafil sur un explant rétinien cultivé pendant 7 jours. Figure 1-A : Mesure d'un électrorétinogramme en condition basale lors de la stimulation lumineuse. - abscisse : temps écoulé après la stimulation (en seconde, s), - ordonnée : amplitude du signal (en Volt, V).

Figure 1-B : Mesure de l'activité d'une cellule ganglionnaire de la rétine en condition basale. L'activité de la cellule est mesurée par la fréquence des potentiels d'action produits sous l'effet d'une stimulation lumineuse indiquée sur le graphe par la zone en gris. - abscisse : Temps (en seconde), - ordonnée : nombre de potentiels d'action par intervalle de 50 ms. Figure 1-C : Mesure de l'électrorétinogramme en condition sildénafil 10 iuM. La réponse à la lumière présente une modification importante de l'électrorétinogramme en présence de sildénafil par rapport à la réponse basale (cf. Fig.1A). - abscisse : temps écoulé après la stimulation (en seconde, s), - ordonnée : amplitude du signal (en Volt, V). Figure 1-D : Mesure de l'activité de la même cellule ganglionnaire de la rétine en condition sildénafil 10 iuM. La réponse à la lumière est indiquée par l'augmentation importante de la fréquence de décharge des potentiels d'action pendant la période d'illumination (zone en gris). - abscisse : Temps (en seconde), - ordonnée : nombre de potentiels d'action sur une durée de 50 ms. Figure 1-E : Spectre des réponses à la lumière enregistrées sur les cellules ganglionnaires d'un explant rétinien cultivé in vitro pendant 1 jour. Les explants rétiniens sont stimulés à la lumière à différentes longueurs d'ondes, sur une gamme s'étendant de 400 nm à 650 nm en présence de Sildenafil - abscisse : longueur d'onde de la lumière (en nanomètre, nm), - ordonnée : cadence des fréquences (en Hertz, Hz). Figure 1-F : Spectre des réponses à la lumière sur les cellules ganglionnaires d'un explant rétinien cultivé in vitro pendant 7 jours. Les explants rétiniens sont stimulés à la lumière à différentes longueurs d'ondes, sur une gamme s'étendant de 400 nm à 650 nm. - abscisse : longueur d'onde de la lumière (en nanomètre, nm), - ordonnée : cadence des fréquences (en Hertz, Hz).

Figure 2 : Quantification des réponses à la lumière de cellules ganglionnaires de la rétine en présence ou absence de sildenafil. La réponse à la lumière est normalisée par rapport à l'activité cellulaire avant la stimulation. Pour ce rapport, la fréquence des potentiels d'action est mesurée sur une seconde avant et après le début de la stimulation lumineuse. En condition basale (C), l'activité des cellules ganglionnaires pendant la stimulation lumineuse est identique à celle avant la stimulation alors que l'application de sildenafil (S) produit une augmentation de l'activité pendant la stimulation lumineuse. L'application conjointe de sildenafil et de L-AP4 (S+L) supprime l'effet du sildenafil seul. - abscisse : conditions expérimentales à l'état basal (C), en présence de Sildénafil 10 1.1M (S), en présence de Sildénafil 10 1.1M + L-AP4 50 1.1M (S + L), - ordonnée : rapport [réponse à la lumière des cellules sous stimulation/ réponse des cellules à l'état basal]. Figure 3 : Quantification des réponses à la lumière de cellules ganglionnaires de la rétine en présence ou absence de sildenafil et d'EDTA. La réponse à la lumière est normalisée par rapport à l'activité cellulaire avant la stimulation. Pour ce rapport, la fréquence des potentiels d'action est mesurée sur une seconde avant et après le début de la stimulation lumineuse. En condition basale (C), l'activité des cellules ganglionnaires pendant la stimulation lumineuse est identique à celle avant la stimulation. Dans ce cas, l'application de sildenafil seul n'augmente pas l'activité des cellules ganglionnaires rétiniennes par contre l'application de sildenafil et EDTA (S+E) produit une augmentation de l'activité pendant la stimulation lumineuse. - abscisse : conditions expérimentales à l'état basal (C), sous Sildénafil 10 1.1M (S), sous Sildénafil 101.1M + EDTA 0,77 mM (S + E), - ordonnée : rapport [réponse à la lumière des cellules sous stimulation/ réponse des cellules à l'état basal].

Exemples 1 - Matériels et méthodes 1.1 - Animaux Les yeux de singes cynomolgus (Macaca fascicularis) sont issus d'expériences réalisées en partenariat avec le laboratoire MIRCEN-CEA (Fontenay aux roses, France).

Les expériences sont menées en conformité avec les recommandations sur l'utilisation éthique des animaux de la directive du Conseil de la Communauté Européenne (86/609/CEE). 1.2 - Préparation des cultures d'explant Des singes (Macaca fascicularis) sont sacrifiés en utilisant une dose mortelle d'anesthésique (isoflurane). Dans des conditions stériles, les yeux sont prélevés, désinfectés et nettoyés de tout tissu conjonctival. La sclère est perforée avec une aiguille puis découpée juste sous l'anneau limbique. La cornée, le cristallin et le corps vitré sont ensuite délicatement retirés de l'oeil à l'aide de pinces courbes. La coupe oculaire est ensuite placée dans un milieu CO2 indépendant pour son transport jusqu'à la salle de culture cellulaire. Les flacons contenant les yeux sont nettoyés et ouverts sous une hotte de culture. La neurorétine est séparée de l'ora serrata puis décollée de l'épithélium pigmentaire rétinien jusqu'à ce qu'elle ne soit retenue que par le nerf optique. Le nerf optique est coupé et la neurorétine est placée dans une boîte de Pétri contenant du milieu CO2 indépendant. Les explants rétiniens sont préparés à partir de fragments de rétine (25 mm2) déposés sur une membrane de polycarbonate (plaque 6 puits avec inserts perméables) avec les cellules ganglionnaires de la rétine orientées sur la face supérieure. Les explants rétiniens sont ensuite cultivés dans un milieu de culture NBA et placés dans une étuve à 37 °C et 5% de CO2. 1.3 - Enregistrements sur matrice d'électrodes (Multi-Electrode Array, MEA) Pour les enregistrements sur MEA, la membrane de polycarbonate est étroitement coupée autour des explants cultivés et placée sur une MEA. Une grille de platine en forme de U est ajoutée sur le dessus pour stabiliser la rétine au cours de l'expérimentation. Les enregistrements sont effectués dans le milieu Ames. Les enregistrements extracellulaires sont réalisés sur des MEA ou puces électroniques contenant 256 électrodes (MultiChannel System, Allemagne,). Les morceaux carrés de la rétine sont orientés avec la couche de cellules ganglionnaires au contact des puces MEA (électrode 30 iam de diamètre, avec 200 iam d'espacement inter-électrodes, selon un schéma de grille 16 x 16).

Pendant les séances d'enregistrement, les tissus rétiniens sont constamment baignés avec du milieu Ames maintenu à une température de 32-34°C (perfusion de 1 à 2 ml/min, pH 7,4 équilibré avec 95% d'02 et 5% de CO2). Pour obtenir des enregistrements stables, les séances d'enregistrement débutent une heure après que les tissus rétiniens aient été placés dans la chambre d'enregistrement MEA. Les composés chimiques sont ajoutés directement au milieu de culture à l'aide d'un système de perfusion actif. Leurs effets sont généralement suivis pendant 5 à 40 minutes. Les signaux neuronaux extracellulaires sont recueillis à 25 kHz, et stockées pour une analyse hors-ligne. L'activité basale des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est surveillée pendant les sessions expérimentales en utilisant les logiciels MC Rack (MCS) ou BioMEA (Bio-Logic). Tous les enregistrements sont ensuite soumis à un tri des pics hors-ligne en utilisant les logiciels Spike2 (DEC Co. UK) ou Sorter (Plexon Inc, USA) et l'analyse standard est effectuée à l'aide des logiciels Neuroexplorer (Nex Technologies, MA, USA) ou Spike2. La fréquence des décharges de potentiels d'action (potentiels d'action par seconde) est estimées pour chaque CGR en comptant le nombre de potentiels d'action dans une fenêtre mobile de 1 seconde et en divisant ce nombre par la largeur du bac. 1.4 - Stimulation des rétines isolées par la lumière Une source de lumière monochromatique (15 nm de bande passante, TILL Photonics Polychrome V, Agilent Technologies) est utilisée pour provoquer des flashs périodiques de lumière à des longueurs d'ondes définies. Une série de 10 flashs uniformes (2 sec) est appliquée pour chaque bande passante à travers le spectre visible de 400 à 650 nm (gamme d'intensité 1016 photons.cm-2.s-1 à 1018 photons.cm-2 s-1), avec des incréments de 10 nm mais des applications dans un ordre aléatoire. Les intensités lumineuses sont mesurées à l'aide d'un spectromètre (USB 4000, Ocean Optics) calibré avec une source radiométrique de référence (LS1-Cal, Ocean Optics). Le stimulus est généré par un logiciel adapté (Matlab, la société MathWorks et LabVIEW, National Instruments). 1.5 - Analyse statistique Les réponses à la lumière mesurées dans cette étude sont normalisées par rapport à la fréquence de décharge témoin obtenue pour une même cellule avant l'application des composés chimiques. L'analyse statistique est réalisée avec Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) en utilisant une analyse unidirectionnelle de variance (ANOVA) suivie par un test de comparaison multiple de Dunnett. Les valeurs P inférieures à 0,05 sont considérées comme significatives. 2 - Résultats 2.1 - Restauration d'une réponse à la lumière dans la rétine des primates. Lorsque les explants rétiniens de singe ont été enregistrés sur une matrice d'électrodes (MEA), une activité spontanée est observable sur plusieurs électrodes. Bien qu'une activité induite par la lumière semble présente dans le tissu et donc dans les photorécepteurs comme le suggère l'enregistrement de l'électrorétinogramme (A), aucune réponse à la lumière ne peut être détectée dans les cellules ganglionnaires de la rétine (B) en conditions contrôle. En effet, les fréquences de décharge des potentiels d'action au cours des stimulations lumineuses ne sont pas différentes de celle de l'activité spontanée mesurée avant la stimulation à l'état basal. Cependant, quand un inhibiteur de la phosphodiestérase, le citrate de sildénafil (10 1.1M, Sigma, France) est appliqué dans le bain, une augmentation de la fréquence de décharge est observée dans les cellules ganglionnaires de la rétine peu après la stimulation par la lumière (Figure 1D). Suite à l'application de sildénafil (10 1.1M) (figures 1-C et 1-D), l'électrorétinogramme montre également une plus grande onde positive (figure 1-C), suggérant une transmission des informations visuelles aux cellules postsynaptiques aux photorécepteurs. L'onde négative visible en conditions contrôle n'est pas modifiée suggérant que le signal des photorécepteurs n'a pas été modifié par le sildenafil (figure 1-C).

Le spectre des réponses induites par la lumière en présence de sildenafil varie en fonction du temps de culture in vitro des explants rétiniens. Lors de l'application de stimulations à la lumière à différentes longueurs d'onde (figures 1-E et 1-F), les réponses à la lumière sont détectables en présence de sildénafil dans des explants rétiniens gardés soit un jour en culture (figure 1-E) soit 7 jours en culture (figure 1-F). Après une journée de culture, le spectre des réponses à la lumière couvre l'ensemble du spectre de la lumière visible recouvrant ainsi les différentes sensibilités des trois photorécepteurs de type cônes alors que, après 7 jours de culture, le spectre des réponses à la lumière est limité à la sensibilité de la lumière bleue. 2.2 - Restauration bloc des réponses à la lumière par un bloqueur synaptique. Pour s'assurer que ces réponses à la lumière en présence de sildenafil sont issues des photorécepteurs, un bloqueur de la transmission synaptique a été appliqué dans le milieu de perfusion de la rétine. Comme ces réponses à la lumière étaient principalement des réponses dites de type ON à savoir une augmentation des décharges des potentiels d'action des cellules ganglionnaires de la rétine au début de l'illumination, nous avons appliqué un bloqueur sélectif de cette voie le L-AP4 (50 1.1M), un agoniste sélectif des récepteurs métabotropiques du glutamate de type III (Figure 2). Le récepteur mGluR6 est en effet exprimée dans les voies « ON » au niveau des dendrites des cellules bipolaires et est activé par cet agoniste. Lorsque cet agoniste est ajouté à la solution contenant le sildenafil, les réponses à la lumière des cellules ganglionnaires sont supprimées. La quantification des réponses confirme cette observation. Pour cette quantification, la fréquence de décharge des potentiels d'action dans les cellules ganglionnaires de la rétine est mesurée pendant une seconde après le début de l'illumination et rapportée à l'activité spontanée de ces cellules avant l'application de la stimulation lumineuse. Ce rapport redevient proche de 100% comme dans les conditions contrôles alors que l'application de sildénafil avait augmenté ce ratio de manière statistiquement significative. L'application de l'inhibiteur L-AP4 a non seulement supprimé cette augmentation de l'activité des cellules ganglionnaires de la rétine mais semble également révéler une faible composante OFF induite par le sildenafil comme le suggère le ratio légèrement inférieur à 100%. Par ailleurs, lors de l'enregistrement des réponses de l'électrorétinogramme, une petite réponse négative a pu être observée dans les conditions à l'état basal (figure 1-A) alors que l'utilisation du sildenafil induit une forte réponse positive (figure 1-C), suggérant ainsi que le sildénafil augmente l'amplitude de la réponse des cellules bipolaires. L'enregistrement de l'électrorétinogramme confirme que l'utilisation d'inhibiteurs de PDE comme le sildénafil restaure une réponse à la lumière dans une rétine insensible à la lumière. 2.3 - Restauration d'une réponse à la lumière par un chélateur de Ca2+. Lorsqu'aucune réponse à la lumière n'était détectable, même en présence de sildénafil dans le milieu de culture des explants rétiniens, un chélateur de Ca2+, l'EDTA (0,77 mM, instituant une concentration finale de Ca2+ de 0,1 mM dans le milieu), a été rajouté dans la chambre d'enregistrement avec le sildénafil. L'amplitude de la réponse à la lumière des cellules ganglionnaires de la rétine est rapportée à l'activité spontanée de ces cellules avant la stimulation lumineuse. Ce rapport reste proche de 100% dans des conditions contrôles indiquant l'absence de réponse à la lumière. Dans certaines expériences, le sildénafil n'a pas augmenté ce ratio au-delà de 100%. L'ajout d'EDTA en combinaison avec le sildénafil restaure par contre une réponse à la lumière des cellules ganglionnaires de la rétine portant ainsi le ratio à une valeur supérieure et statistiquement significative des 100%. Ces résultats montrent que les réponses à la lumière ont été récupérées dans de nombreuses cellules ganglionnaires de la rétine (figure 3). L'ensemble des résultats présentés suggère que l'inhibition de l'hydrolyse du GMPc ou de l'AMPc respectivement en GMP ou AMP par des inhibiteurs de PDE comme le sildénafil, et/ou la chélation du Ca2+ avec des composés tels que l'EDTA permettent d'augmenter ou de restaurer une réponse à la lumière dans la rétine des primates. Cette stratégie pourrait être appliquée chez les patients ayant perdu leurs réponses à la lumière tels que des patients atteints de rétinite pigmentaire ou de dégénérescence maculaire liée à l'âge. Cette stratégie pourrait également être appliquée pour accroitre les réponses à la lumière restaurées par des approches de type optogénétique ou par l'implantation de prothèses rétiniennes. Pour démontrer l'intérêt des activateurs de la guanylate ou l'adenylate cyclase ou d'autres inhibiteurs de phosphodiesterase, les expériences décrites ci-dessus pour le sildenafil sont reproduites avec ces différentes molécules. Pour valider ces traitements pharmacologiques pour des rétines en état de dégénérescence, les mesures décrites ci- dessus sur une rétine primates en culture sont également réitérées sur des rétines isolées d'animaux aveugles ou très mal-voyants (souris rdl, rat P23H). L'enregistrement des rétines est réalisé sur une matrice d'électrodes et la réponse des cellules ganglionnaires est mesurée en absence puis en présence des molécules dans le milieu d'enregistrement. La pertinence du traitement est mesurée par l'induction d'une réponse à la lumière dans des cellules ganglionnaires. Pour vérifier si le traitement peut effectivement être appliqué in vivo et permettre de restaurer une certaine fonction visuelle, des animaux aveugles ou très mal-voyants (rat P23H ou souris rdl) sont soumis à des tests de fonction visuelle comme le test optomoteur ou la mesure de l'électrorétinogramme. Ces tests sont réalisés en l'absence de tout traitement puis après application du traitement à base d'inhibiteurs de phosphodiesterase ou d'activateurs de guanylate ou adenylate cyclase. Pour le test in vivo, l'augmentation des performances visuelles est indiquée par une augmentation du suivi de la rotation du tambour ou une augmentation de l'acuité visuelle. Dans le cas de l'électrorétinogramme, l'augmentation des performances visuelles est indiquée par l'augmentation des amplitudes de ce signal électrophysiologique. Ces différents tests sont réalisés sur des animaux sans traitement ou sur des animaux dont la rétine a reçu l'injection d'un vecteur viral de thérapie optogénétique pour restaurer une certaine fonction visuelle. 2.3.1 - Electrorétinogramme L'animal est anesthésié avec un mélange Kétamine 500 (Virbac France) (100 mg/kg) et Rompun 2% (bayer) (Xylazine 10 mg/kg). Ses yeux sont dilatés avec une goutte de mydriaticum 0.5% (Théa) (tropicamide) puis également anesthésiés avec un goutte du Chlorhydrate d'oxybuprocaïne (Théa) (1.6mg/0.4m1). Une fois anesthésié, l'animal est préparé pour l'enregistrement. Une électrode d'or annulaire, Lubrital (Vetxx), est positionnée sur la cornée puis des aiguilles sous-cutanées sont placées pour les références et la terre. L'animal est ensuite inséré dans un Ganzfeld ou exposé devant un écran de LEDs (e.g. SIEM Médical, Nimes, France). Des flashs lumineux sont ensuite délivrés dans une gamme d'intensité de 3.10-5 à 10 cd.s.m2. Les enregistrements sont réalisés dans une bande passante de 0.3 à 300Hz. Les flashs sont espacés de 30 secondes. Les amplitudes et les temps de culminations sont mesurés sur les pics de l'onde a et de l'onde b. Pour les potentiels oscillatoires (OPs) l'intensité du flash est de 3 cd.s/m2 filtrés de 100 à 300Hz. En conditions photopiques, 10 flashs de 10 cd.s/m2 sont appliqués après 10 minutes d'adaptation à 25 cd.s/m2. Pour les pseudo-oscillations (flickers), les enregistrements sont faits à 10 et 20 Hz à une intensité de 3 cd.s/m2. 2.3.2 - Test optomoteur L'animal est placé sur la plateforme du système optomoteur tel que celui de Cerebral Mechanics INC (Canada). Un programme adapté permet de projeter sur 4 écrans des bandes verticales blanches et noires dont la taille est ajustée en fonction de la distance de l'animal à l'écran lui faisant face. Pour cet ajustement, une croix rouge est positionnée sur la tête de l'animal. La perception du déplacement ou rotation des barres induit chez l'animal un mouvement de poursuite du regard. Elle s'accompagne par conséquent d'un mouvement ou rotation de la tête à la vitesse angulaire du déplacement des barres. Suivant la taille des barres, une mesure d'acuité visuelle peut être estimée.

Claims (3)

1. REVENDICATIONS1. Produits constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase et/ou d'activateurs d'adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase pour leur utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs.
2. 2. Produits pour leur utilisation selon la revendication 1, lesdits produits étant constitués d'activateurs d' adénylate cyclase et/ou de guanylate cyclase, notamment choisis parmi : la forskoline, BAY 60-2770, BAY 41-8543, BAY 60-4552, BAY 41-2272, Cinaciguat (BAY 58-2667),
3. 3-(5'-Hydroxymethy1-2`-furyl)-1-benzyl 3.4. 5. 6. indazole (YC-1), en particulier la forskoline. Produits pour leur utilisation selon la revendication 1, lesdits produits étant constitués d'inhibiteurs de phosphodiestérase, notamment de la phosphodiestérase 5 et/ou la phosphodiestérase 6, notamment choisis parmi l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Produits pour leur utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ledit inhibiteur de phosphodiesterase est le sildenafil. Produits pour leur utilisation selon l'une des revendications 3 ou 4, en combinaison avec un chélateur de calcium, notamment choisi parmi l'EDTA ou l'EGTA. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur de phosphodiestérase et un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle la proportion en poids dudit inhibiteur de phosphodiestérase est comprise de 0,0001% 7. 8. 20 25 9. 30 10. à 95%, en particulier de 0,01% à 10%, et dans laquelle ledit inhibiteur de phosphodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2-EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T1032, T-0156, E4021. Composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle ledit inhibiteur de phosphodiestérase est le sildenafil. Association thérapeutique comprenant au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tel que défini dans l'une des revendications 3 ou 4 et : - un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, ou - des cellules souches non embryonnaires, ou - des implants (prothèses rétiniennes), ou - des gènes pour la mise en oeuvre d'une thérapie optogénétique ou d'une thérapie génique classique. en tant que produit de combinaison pour son utilisation dans le traitement de réhabilitation de la vision chez une personne aveugle ou atteinte de cécité légale, la cécité étant liée à la dégénérescence et/ou au dysfonctionnement des photorécepteurs, dans laquelle ledit inhibiteur de phosphophodiestérase est choisi parmi : l'acetildenafil, l'aidenafil, l'avanafil, l'icariin, le lodenafil, le mirodenafil, le nitrosoprodenafil, le sildenafil, le sulfoaildenafil, le tadalafil, le thiomethisosildenafil, le vardenafil, l'udenafil, le zaprinast, la vimpocetine, le 2EHNA, le cilostamide, le rolipram, YM976, le dipyridamole, T-1032, T-0156, E4021. Association thérapeutique selon la revendication 8, dans laquelle ledit inhibiteur de phosphodiestérase est le sildenafil. Composition ophtalmique comprenant au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tel que définis dans l'une des revendications 3 ou 4, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier l'EDTA, dans laquelle la concentration de l'inhibiteur dephosphodiestérase de ladite composition ophtalmologique varie de 0,00001% à 95%. 11. Composition ophtalmique selon la revendication 10, dans laquelle l'inhibiteur de phosphodiesterase est le sildénafil. 12. Implant intra- ou péri-oculaire comprenant au moins un inhibiteur de phosphodiestérase tels que définis dans l'une des revendications 3 ou 4, et éventuellement un chélateur de calcium, en particulier 1'EDTA, dans lequel la concentration de l'inhibiteur de phosphodiestérase varie de 0,00001% à 95%. 13. Implant intra- ou péri-oculaire selon la revendication 12, dans lequel l'inhibiteur de phosphodiestérase est le sildénafil.15