ES2648046T3 - Vacuna de polisacárido para infecciones estafilocócicas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un polisacárido aislado que comprende un polímero de ß-1,6-glucosamina, que tiene una longitud de al menos cuatro unidades monoméricas, un peso molecular de al menos 2500 Daltons y una estructura de**Fórmula** en la que n es un número entero que es al menos cuatro, R está seleccionado del grupo que consiste en -NH-COCH3 y -NH2, a condición de que menos del 40 % de los grupos R sean -NH-CO-CH3, en la que la composición es estéril.

Description

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El grado de pureza de la composición de PNAGd puede evaluarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la pureza puede evaluarse por ensayos de análisis químicos, además de cromatografía de gases y resonancia magnética nuclear, para verificar los aspectos estructurales del material.

Otro contaminante importante de algunas preparaciones de PNAGd puede ser el ácido teicoico que contiene fosfato. La contaminación de ácido teicoico puede interferir con tanto la caracterización química como la inmunogenicidad del antígeno PNAGd de la invención. Los métodos de la invención descritos en el presente documento son capaces de producir una preparación de PNAGd aislada que está sustancialmente libre de ácido teicoico. Una preparación de PNAGd que está sustancialmente libre de ácido teicoico es una que tiene menos del 1,0 % de fosfato, y más preferentemente una que tiene menos del 0,1 % de fosfato. La cantidad de fosfato presente en la muestra puede evaluarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. La cantidad de contaminación de fosfato puede evaluarse usando los métodos descritos en Keleti, G. y W. H. Lederer, ((1974) Handbook of Micromethods for the Biological Sciences, Van Nostrand Reinhold Co., Nueva York). Brevemente, la prueba se realiza del siguiente modo: a 100 µg de muestra se añaden 100 µl de una disolución hecha añadiendo juntos 43,5 ml de agua, 6,5 ml de 70 % de ácido perclórico (HClO4) y 50 ml de ácido sulfúrico 20 N (H2SO4). Esto se calienta a 95 ºC durante 2 horas en un tubo con una canica en su parte superior. La mezcla se pone entonces en un horno a 165 ºC y se calienta durante 2 horas adicionales, luego se enfría a temperatura ambiente. A continuación se añade a la muestra un ml del reactivo 5, preparado por el siguiente método:

Reactivo 1:1,36 gramos de acetato sódico.3H2O disuelto en 10 ml de agua.

Reactivo 2: 500 mg de molibdato de amonio disuelto en 20 ml de agua.

Reactivo 3: 2 ml del reactivo 1, 2 ml del reactivo 2 y 16 ml de agua.

Reactivo 4: 2 g de ácido ascórbico disuelto en 20 ml de agua, preparado inmediatamente antes de uso.

Reactivo 5: Añadir en un baño de hielo 9 ml del reactivo 3 y 1 ml del reactivo 4.

Después de añadir el reactivo 5, los tubos se mezclan muy bien y se lee la densidad óptica a 820 nm en un espectrofotómetro. Se usa una curva patrón que consiste de fosfato de sodio monobásico (intervalo de 0,1-5 µg por tubo) para calcular la cantidad de fosfato presente en las muestras de prueba (Lowry, O.H., N.R. Roberts, K.Y. Leiner, M.L. Wu y A.L. Farr. (1954), Biol. Chem. 207,1).

Las composiciones de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones diferentes que incluyen el diagnóstico in vitro, in situ e in vivo de estados patológicos, tales como infección. Las composiciones pueden usarse para inmunizar sujetos in vivo para prevenir o tratar una infección. Las composiciones también pueden usarse para desarrollar anticuerpos y otros péptidos de unión que son útiles para los mismos fines que las composiciones de PNAGd de la invención. Así, la invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden PNAGd o agentes de unión correspondientes (por ejemplo, anticuerpos), que pueden usarse para fines de vacunación para inducir inmunidad ya sea activa o pasiva en un sujeto en necesidad de la misma. Se describen métodos para generar agentes de unión, tales como anticuerpos que se unen a PNAGd, que pueden usarse para el diagnóstico y tratamiento de infecciones estafilocócicas y afecciones asociadas.

La PNAGd puede usarse en una forma conjugada o no conjugada. En una forma conjugada, la PNAGd puede conjugarse con un compuesto vehículo, ya sea directamente o mediante un conector. La conjugación puede producirse en cualquier posición en la unidad de monómero de glucosamina o en los extremos del polímero.

Un "compuesto vehículo", como se usa en el presente documento, es un compuesto que puede conjugarse con un polisacárido, ya sea directamente o mediante el uso de un conector, y que puede ser inmunológicamente activo o inerte.

Los compuestos vehículo incluyen, pero no se limitan a, proteínas, o péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, u otros polímeros, lípidos y moléculas pequeñas. Las proteínas incluyen, por ejemplo, proteínas del plasma tales como albúmina de suero, inmunoglobulinas, apolipoproteínas y transferrina; polipéptidos bacterianos tales como TRPLE, β-galactosidasa, polipéptidos tales como proteína gD del herpes, alérgenos, toxoides diftéricos y tetánicos, flagelina de Salmonella, pilina de Haemophilus, proteínas de membrana de 15 kDa, 28-30 kDa y 40 kDa de Haemophilus, proteínas de Escherichia coli, enterotoxina de marca de calor Itb, toxina del cólera y proteínas virales que incluyen proteínas de rotavirus VP y de virus respiratorio sincitial f y g. Las proteínas útiles en la invención incluyen cualquier proteína que sea segura para su administración a mamíferos y opcionalmente que sea una proteína transportadora inmunológicamente eficaz.

Los compuestos vehículo que son particularmente útiles para inmunización incluyen proteínas, tales como hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino o inhibidor de tripsina de soja. Puede usarse similarmente cualquier otro compuesto que sea inmunogénico en la especie de animal que va a inmunizarse.

Se conocen en la técnica muchos métodos de conjugación de un polisacárido con una proteína. En general, el polisacárido debe activarse o hacerse de otro modo susceptible a la conjugación, es decir, debe hacerse que al

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menos un resto sea susceptible a la unión covalente con una proteína u otra molécula. Muchos de tales métodos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 4.356.170, concedida a Jennings, describe el uso de ácido peryódico para generar grupos aldehído sobre el polisacárido y entonces se realiza aminación reductora usando cianoborohidruro. La patente de EE.UU. N.º 4.663.160, concedida a Tsay et al., también usó ácido peryódico para generar grupos aldehído, pero entonces unen el polisacárido con una proteína derivatizada con un resto de 412 carbonos (preparado en presencia de un agente de condensación), con una reacción de base de Schiff en presencia de un agente reductor tal como cianoborohidruro. La patente de EE.UU. N.º 4.619.828, concedida a Gordon, usó bromuro de cianógeno para activar el polisacárido y entonces lo conjuga con la proteína por medio de un puente espaciador de 4-8 átomos de carbono. En la patente de EE.UU. N.º 4.808.700, concedida a Anderson y Clements, se modificó un polisacárido para producir al menos un extremo reductor usando escisión oxidativa limitada por peryodato, hidrólisis con glucosidasas, o hidrólisis ácida, y se conjugó con una proteína por medio de aminación reductora en presencia de cianoborohidruro. La patente de EE.UU. N.º 4.711.779, concedida a Porro y Costantino, describió la activación de polisacáridos introduciendo grupos amino primarios en el grupo reductor terminal usando cianoborohidruro de sodio, seguido de conversión a ésteres en presencia de derivados de ácido adípico, y conjugación con un toxoide en presencia de un solvente orgánico tal como sulfóxido de dimetilo. Se conocen en la técnica muchos otros métodos de conjugación.

El compuesto vehículo puede conjugarse con PNAGd mediante un conector o espaciador. Puede acoplarse un polisacárido a un conector o un espaciador mediante cualquier medio conocido en la técnica que incluye, por ejemplo, el uso de un extremo reductor libre del polisacárido para producir un enlace covalente con un espaciador o conector. Puede producirse un enlace covalente convirtiendo un extremo reductor libre de PNAGd en un 1aminoglucósido libre, que posteriormente puede unirse covalentemente a un espaciador por acilación (Lundquist et al., J. Carbohydrate Chem., 10:377 (1991)). Alternativamente, la PNAGd puede unirse covalentemente al espaciador usando un éster activo de N-hidroxisuccinimida como grupo activado sobre el espaciador (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146:C1 (1986)). El extremo reductor libre de PNAGd también puede convertirse en una lactona usando yodo e hidróxido de potásico (Isebell et al., Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, Nueva York (1962)). La lactona puede unirse covalentemente al espaciador por medio de un grupo amino primario sobre el espaciador o conector. El extremo reductor libre de PNAGd también puede unirse covalentemente al conector o espaciador usando aminación reductora.

La invención engloba anticuerpos que se unen a PNAGd. Los anticuerpos pueden ser o bien anticuerpos monoclonales o bien anticuerpos policlonales. Los anticuerpos contra PNAGd se unen a PNAGd y también pueden unirse a formas de PNAG que están más del 50 % acetiladas.

Los anticuerpos policlonales generalmente se producen en animales por inyecciones subcutáneas o intraperitoneales de un antígeno y un adyuvante. Pueden generarse anticuerpos policlonales contra PNAGd inyectando PNAGd en forma conjugada o no conjugada, sola o en combinación con un adyuvante.

Un ejemplo de una preparación de anticuerpo policlonal es como sigue. Se combina PNAGd o una PNAGd conjugada con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund (por ejemplo, 100 µg de conjugado para conejos o ratones en 1-3 volúmenes del adyuvante de Freund), y se inyecta por vía intradérmica en múltiples sitios. Aproximadamente un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 -1/10 de la cantidad original del antígeno, o conjugado de antígeno, en adyuvante, por inyección subcutánea en múltiples sitios. Una o dos semanas después se extrae sangre de los animales y se ensaya el suero para la presencia de anticuerpo. Los animales pueden ser reforzados repetidamente hasta alcanzar mesetas del título de anticuerpo. El animal puede reforzarse con PNAGd sola, PNAGd conjugada o PNAGd conjugada con un compuesto vehículo diferente, con o sin un adyuvante. En algunas realizaciones, los refuerzos pueden comprender PNAG en vez de PNAGd, o pueden contener una mezcla de PNAGd y PNAG.

Además de suministrar una fuente de anticuerpos policlonales, los animales inmunizados pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales anti-PNAGd. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de inmunoglobulinas que se unen al mismo epítope (es decir, determinante antigénico) de PNAGd. Este epítope también puede estar presente en formas de PNAG que están más del 50 % acetiladas. Los anticuerpos monoclonales tienen el mismo reordenamiento de gen de Ig y así demuestran especificidad de unión idéntica. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por cualquier método conocido en la técnica, tal como por inmortalización de células del bazo aisladas del animal inmunizado, por ejemplo por fusión con células de mieloma o por transformación con el virus de Epstein Barr, y selección de clonas que expresan el anticuerpo deseado. Otros métodos implican el aislamiento de secuencias del gen de Ig reordenadas y la clonación en líneas celulares inmortalizadas. Los métodos de preparación y uso de anticuerpos monoclonales son muy conocidos en la técnica.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales murinos anti-PNAGd por cualquiera de estos métodos utilizando PNAGd como inmunogén. La siguiente descripción de un método de desarrollo de un anticuerpo monoclonal anti-PNAGd es a modo de ejemplo y solo se proporciona para fines ilustrativos. Se inmunizan por vía intraperitoneal ratones Balb/c con aproximadamente 75-100 µg de PNAGd purificada en adyuvante completo de Freund. Se administran inyecciones de refuerzo de aproximadamente 25-50 µg de PNAGd en medio incompleto de Freund aproximadamente los días 15 y 35 después de la inyección inicial. En el día 60-65, los ratones reciben inyecciones

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de refuerzo de aproximadamente 25 µg de PNAGd en ausencia de adyuvante. La inyección de refuerzo puede comprender alternativamente una preparación de PNAG nativa o una mezcla de PNAGd y PNAG. Tres días después, los ratones se sacrifican y las células del bazo aisladas se fusionan con células de mieloma de murino NS1 usando polietilenglicol mediante un procedimiento tal como el descrito por Oi (Oi VT: lmmunoglobulin-producing hybrid cell lines, en Herzenberg LA (ed): Selected Methods in Cellular Biology, San Francisco, California, Freeman, (1980)). Se seleccionan células de hibridoma usando hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT) y se cultivan en cultivo. Catorce a quince días después de la fusión, las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales anti-PNAGd se identifican usando un radioinmunoensayo en fase sólida capturando anticuerpos anti-PNAGd del medio acondicionado con anti-lgG de ratón de cabra inmovilizado, seguido de cuantificación de PNAGd o PNAG marcada con 125l unido específicamente. Los hibridomas que dan positivo para los anticuerpos contra PNAGd se subclonan por dilución limitante y se vuelven a probar. Entonces se prepara ascitis para los hibridomas en ratones BALB/c sensibilizados a pristano inyectando aproximadamente 1 x 106 células/ratón. Se producen concentrados enriquecidos en los anticuerpos monoclonales seleccionados a partir de líquido ascítico por filtración en gel sobre S200 y se concentran con NH4SO4. Los sedimentos se disuelven en una disolución de almacenamiento apropiada, tal como glicerol 50 % de glicerol/H2O, y se almacenan a 4 ºC.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo anti-PNAGd" incluye anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo, así como también anticuerpos monoclonales y policlonales intactos que se unen a PNAGd y en algunos casos también a formas de PNAG que están más del 50 % acetiladas. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monoclonal humanizado" es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento funcionalmente activo del mismo que tiene al menos regiones humanas constantes, y una región de unión de PNAGd (por ejemplo, una CDR) de un mamífero de una especie diferente a la humana. Un anticuerpo monoclonal anti-PNAGd humanizado intacto en una forma aislada o en una preparación farmacéutica es particularmente adecuado para algunos aspectos de la invención. Los anticuerpos humanizados tienen utilidad clínica particular ya que reconocen específicamente PNAGd y también preferiblemente formas de PNAG nativas, pero no provocarán una respuesta inmunitaria en seres humanos contra el mismo anticuerpo. En una realización preferida, una CDR murina se injerta en la región estructural de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véanse, por ejemplo, L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985) y EPA 0 239 400 (publicada el 30 de septiembre de 1987).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, tal como los desvelados en la patente de EE.UU. N.º 5.567.610, concedida a Borrebaeck et al.; la patente de EE.UU. N.º 565.354, concedida a Ostberg; la patente de EE.UU. N.º 5.571.893, concedida a Baker et al.; Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, Nueva York, 1987), y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991). Además de los métodos convencionales para preparar anticuerpos monoclonales humanos, tales anticuerpos también pueden prepararse inmunizando animales transgénicos que son capaces de producir anticuerpos humanos (por ejemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y la patente de EE.UU. N.º 5.569.825 concedida a Lonberg).

Los siguientes ejemplos de métodos de preparación de anticuerpos monoclonales humanizados que interaccionan con PNAGd, y preferentemente también con otras formas de PNAG nativas, son a modo de ejemplo y se proporcionan solo para fines ilustrativos. Pueden construirse anticuerpos monoclonales humanizados, por ejemplo, reemplazando las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero no humano con regiones similares de anticuerpos humanos, mientras que se retienen al mismo tiempo la especificidad epitópica del anticuerpo original. Por ejemplo, CDR no humanas y opcionalmente algunas de las regiones estructurales pueden unirse covalentemente con regiones FR o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional. Existen en los Estados Unidos entidades que sintetizan comercialmente anticuerpos humanizados a partir de regiones de anticuerpo murinas específicas, tales como Protein Design Labs (Mountain View California), Abgenix y Medarex

La solicitud de patente europea 0239400 proporciona una enseñanza a modo de ejemplo de la producción y uso de anticuerpos monoclonales humanizados, en la que al menos la porción CDR de un anticuerpo murino (u otro mamífero no humano) se incluye en el anticuerpo humanizado. Brevemente, los siguientes métodos son útiles para construir un anticuerpo monoclonal CDR humanizado que incluye al menos una porción de una CDR de ratón. Se prepara un primer vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica al menos un dominio variable de una cadena pesada o ligera de Ig, y se prepara el dominio variable que comprende regiones estructurales de un anticuerpo humano y una región CDR de un anticuerpo murino. Opcionalmente, se prepara un segundo vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de una cadena ligera o pesada de Ig humana complementaria, respectivamente. Entonces se transforma una línea de células con los vectores. Preferentemente, la línea celular es una línea celular de mamífero inmortalizada de origen linfoide, tal como una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma, o es una célula linfoide normal que ha sido inmortalizada por transformación con un virus. La línea celular transformada se cultiva entonces en condiciones conocidas para aquellos expertos en la materia para producir el anticuerpo humanizado.

Como se expone en la solicitud de patente europea 0239400, varias técnicas son muy conocidos en la técnica para crear los dominios de anticuerpo particulares que van a insertarse en el vector replicable (vectores y técnicas

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recombinantes preferidas se tratan abajo en mayor detalle). Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el dominio puede prepararse por síntesis de oligonucleótidos. Alternativamente, un gen sintético que carece de las regiones CDR, en el que cuatro regiones estructurales están fusionadas junto con sitios de restricción adecuados en las uniones, de tal manera que casetes de CDR subclonados sintéticos bicatenarios o restringidos con extremos cohesivos podrían ligarse en las uniones de las regiones estructurales. Otro método implica la preparación de la secuencia de ADN que codifica el dominio que contiene la CDR variable por mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido. Cada uno de estos métodos es muy conocido en la técnica. Por lo tanto, aquellos expertos en la materia pueden construir anticuerpos humanizados que contienen una región CDR murina sin destruir la especificidad del anticuerpo para su epítope.

También pueden obtenerse anticuerpos humanos recuperando linfocitos productores de anticuerpo de la sangre u otros tejidos de seres humanos que producen anticuerpo contra PNAGd. Estos linfocitos pueden tratarse para producir células que crecen por sí solas en el laboratorio bajo condiciones de cultivo apropiadas. Los cultivos celulares pueden cribarse para la producción de anticuerpo contra PNAGd y entonces clonarse. Pueden usarse cultivos clonales para producir anticuerpos monoclonales humanos contra PNAGd, o los elementos genéticos que codifican las porciones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo pueden clonarse e insertarse en vectores de ácido nucleico para la producción de anticuerpo de tipos diferentes.

También están englobados por la invención fragmentos de anticuerpo de unión de PNAGd. Como es bien conocido conocidos en la técnica, solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratope, participa en la unión del anticuerpo a su epítope (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc del anticuerpo, por ejemplo, son efectores de la cascada de complemento, pero no participan en la unión al antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que ha sido producido sin la región pFc', designado un fragmento F(ab')2, retiene los dos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento F(ab')2 aislado se denomina un fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión al antígeno. Similarmente, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que ha sido producido sin la región Fc, designado el fragmento Fab, retiene uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacto. Procediendo más, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unido covalentemente y una porción de la cadena pesada de anticuerpo indicada Fd (región variable de la cadena pesada). Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede asociarse a hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo), y los fragmentos Fd retienen la capacidad de unión al epítope en aislamiento.

Los términos Fab, Fc, pFc', F(ab')2 y Fv se emplean con sus significados inmunológicos estándar [Klein, Immunology (John Wiley, New York, NY, 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]. Los fragmentos de anticuerpo funcionalmente activos bien conocidos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos F(ab')2, Fab, Fv y Fd de los anticuerpos. Estos fragmentos que carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión inespecífica de tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos monocatenarios según los métodos descritos en la patente de EE.UU. N.º 4.946.778 a Ladner et al. Tales anticuerpos monocatenarios incluyen las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas unidas por un resto de conector flexible. También se han informado métodos de obtención de un anticuerpo de un solo dominio ("Fd") que comprende un único dominio variable aislado de cadena pesada (véase, por ejemplo, Ward et al., Nature 341:644646 (1989), que desvela un método de cribado para identificar una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de un único dominio VH), con afinidad suficiente por su epítope diana para unirse al mismo en una forma aislada). Métodos de preparación de fragmentos Fv recombinantes basados en secuencias conocidas de la región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo son conocidos en la técnica y han sido descrito, por ejemplo, Moore et al., patente de EE.UU. N.º 4.462.334. Otras referencias que describen el uso y la generación de fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), fragmentos Fv (Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976); Ehrilch et al., patente de EE.UU. N.º 4.355.023) y porciones de moléculas de anticuerpo (Audilore-Hargreaves, patente de EE.UU. N.º 4.470.925). Así, los expertos en la materia pueden construir fragmentos de anticuerpo de diversas porciones de anticuerpos intactos sin destruir la especificidad de los anticuerpos por el epítope de PNAGd. Debe entenderse que el epítope reconocido por anticuerpos anti-PNAGd también puede estar presente en otras formas de PNAG nativas.

Los fragmentos de anticuerpo también engloban "fragmentos de anticuerpo humanizado". Como reconocerá un experto en la materia, tales fragmentos podrían prepararse por escisión enzimática tradicional de anticuerpos humanizados intactos. Sin embargo, si los anticuerpos intactos no son susceptibles a tal escisión debido a la naturaleza de la construcción implicada, las construcciones indicadas pueden prepararse con fragmentos de inmunoglobulina usados como materiales de partida, o si se usan técnicas recombinantes, las secuencias de ADN mismas pueden adecuarse para que codifiquen el "fragmento" deseado que, cuando se expresa, puede combinarse in vivo o in vitro, por métodos químicos o biológicos, para preparar el fragmento de inmunoglobulina intacto deseado final.

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Pueden usarse otros agentes de unión de PNAGd que tienen especificidad de unión por PNAGd en los métodos de diagnóstico descritos. Pueden usarse varios ensayos rutinarios para identificar fácilmente péptidos de unión de PNAGd. Se realizan ensayos de cribado para identificar los péptidos de la invención, por ejemplo, usando procedimientos de presentación en fago tales como aquellos descritos en Hart et al., J. Biol. Chem. 269:12468 (1994). Hart et al. informan de una genoteca de presentación en fago filamentoso para identificar ligandos de péptido novedosos para receptores de células de mamífero. En general, las genoteca de presentación en fago que usan, por ejemplo, el fago M13 o fd, se preparan usando procedimientos convencionales, tales como aquellos descritos en la referencia anterior. Las genotecas presentan inserciones que contienen de 4 a 80 restos de aminoácidos. Las inserciones representan opcionalmente péptidos completamente degenerados o una matriz orientada de péptidos. Se obtienen ligandos que se unen selectivamente a PNAGd seleccionando el fago que expresa sobre su superficie un ligando que se une a PNAGd. Entonces, este fago se somete a varios ciclos de reselección para identificar el fago que expresa el ligando de péptido que tiene las características de unión más útiles. Normalmente, los fagos que presentan las mejores características de unión (por ejemplo, afinidad más alta) se caracterizan adicionalmente por análisis de ácido nucleico para identificar las secuencias de aminoácido particulares de los péptidos expresados sobre la superficie del fago, y la longitud óptima del péptido expresado para lograr una unión óptima a PNAGd.

Alternativamente, tales ligandos de péptido pueden seleccionarse de genotecas combinatorias de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Además, pueden sintetizarse genotecas tales que contengan restos sintéticos no peptídicos que estén menos sujetos a degradación enzimática en comparación con sus homólogos que existen de forma natural.

Para determinar si un péptido se une a PNAGd puede emplearse cualquier ensayo de unión conocido. Por ejemplo, el péptido puede inmovilizarse sobre una superficie y entonces ponerse en contacto con una PNAGd marcada. La cantidad de PNAGd que interacciona con el péptido, o la cantidad que no se une al péptido, puede entonces cuantificarse para determinar si el péptido se une a PNAGd. Una superficie que tiene un anticuerpo anti-PNAGd inmovilizado en la misma puede servir de control positivo. Los ensayos de unión también pueden determinar el grado al que un anticuerpo específico de PNAGd putativo se une a otras formas nativas de PNAG.

Las composiciones de la invención son útiles para muchas aplicaciones in vivo e in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención son útiles para producir una respuesta de anticuerpos, por ejemplo, como una vacuna para la inmunización activa de seres humanos y animales para prevenir infección estafilocócica e infecciones causadas por otras especies de bacterias que producen PNAG; como una vacuna para la inmunización de seres humanos o animales para producir anticuerpos anti-PNAGd que pueden administrarse a otros seres humanos o animales para prevenir o tratar infecciones estafilocócicas; como un antígeno para cribar agentes biológicos tales como anticuerpos monoclonales capaces de prevenir la infección estafilocócica, genotecas de genes implicados en la producción de anticuerpos, o peptidomiméticos; como un reactivo de diagnóstico para infecciones estafilocócicas e infecciones causadas por otras especies de bacterias que producen PNAG; y como un reactivo de diagnóstico para determinar el estado inmunológico de seres humanos o animales con respecto a su susceptibilidad a infecciones estafilocócicas e infecciones causadas por otras especies de bacterias que producen PNAG.

Puede usarse PNAGd para proteger a un sujeto contra la infección por bacterias que producen PNAG, induciendo la inmunidad activa para la infección por estafilococos en un sujeto. El método se lleva a cabo administrando al sujeto una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta de anticuerpo contra estafilococos, de cualquiera de las composiciones de PNAGd de la invención. Como se usa en el presente documento, "inmunidad activa" implica la introducción de un antígeno en un sujeto de forma que el antígeno produzca la diferenciación de algunas células linfoides en células que producen anticuerpo, y en algunos casos de otras células linfoides en células de memoria. Las células de memoria no secretan anticuerpos, sino que incorporan los anticuerpos en su membranas con el fin de detectar el antígeno si se administra al cuerpo otra vez.

El método es útil para inducir inmunidad contra la infección por estafilococos. Como se usa en el presente documento, "estafilococos" se refiere a todas las especies bacterianas estafilocócicas que expresan PNAG. Aunque no pretende quedar ligado a mecanismo particular alguno, se cree que las formas altamente acetiladas de PNAG (es decir, > 50 % acetiladas) no son capaces de provocar la producción de anticuerpos opsónicos protectores al mismo grado que PNAGd. Las bacterias que se clasifican como estafilococos son muy conocidas para aquellos expertos en la materia y se describen en la bibliografía de microbiología. Los estafilococos que expresan PNAG incluyen, pero no se limitan a, Staphylococcus epidermidis (que incluye RP62A (N.º de ATCC: 35984), RP12 (N.º de ATCC: 35983), y M187), Staphylococcus aureus (que incluye RN4220 (pCN27) y MN8 mucoide), y cepas tales como Staphylococcus carnosus transformado con los genes en el locus ica (que incluyen TM300 (pCN27)). Otras cepas bacterianas que expresan PNAG pueden ser fácilmente identificadas por aquellos expertos habituales en la materia. Por ejemplo, las bacterias estafilocócicas que expresan el locus ica expresarán PNAG. Un experto habitual en la materia puede cribar fácilmente la expresión de ARNm o proteína relacionada con el locus ica, ya que la secuencia de ácido nucleico del locus ica es conocida (SEQ ID NO: 1 y descrita originalmente por Heilmann, C., O. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack y F. Gotz (1996) Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis, Molec. Microbiol. 20:1083). También pueden identificarse cepas bacterianas que expresan PNAG por microscopía inmunoelectrónica (u otro inmunoensayo) que usa anticuerpos anti-PNAG o anticuerpos anti-PNAGd para detectar la presencia de PNAG sobre la superficie de las bacterias. Además, puede aislarse y analizarse la cápsula de cepas bacterianas usando cromatografía de líquidos y espectroscopía de masas.

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administración de liberación y son conocidos para aquellos expertos habituales en la materia. Incluyen sistemas basados en polímero tales como ácido poliláctico y poliglicólico, polianhídridos y policaprolactona; sistemas no poliméricos que son lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di-y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptido; recubrimientos de cera, comprimidos por compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados y similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a:

(a) sistemas de erosión en los que el polisacárido está contenido en una forma dentro de una matriz, encontrado en las patentes de EE.UU. N.º 4.452.775 (Kent); 4.667.014 (Nestor y otros); y 4.748.034 y 5.239.660 (Leonard), y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo penetra a una velocidad controlada a través de un polímero, encontrado en las patentes de EE.UU. N.º 3.832.253 (Higuchi et al.) y 3.854.480 (Zaffaroni). Además, puede usarse un sistema de administración de hardware basado en bomba, algunos de los cuales están adaptados para implantación.

También se apreciará por aquellos expertos habituales en la materia que los antígenos PNAG de la presente invención pueden tener propiedades de adyuvante por sí solos. En la medida que los polisacáridos descritos en la presente potencian respuestas inmunitarias humanas, pueden usarse como adyuvantes en combinación con otros materiales.

Pueden administrarse los antígenos PNAGd y anticuerpos anti-PNAGd de la invención conjuntamente con otro fármaco antibacteriano (es decir, bactericida), o en forma de combinaciones antibacterianas o con otros antígenos bacterianos o anticuerpos antibacterianos. Una combinación de antibióticos antibacterianos es una mezcla de cualquiera de las composiciones de la invención con un fármaco antibacteriano. El uso de antibióticos en el tratamiento de infección bacteriana es rutinario. El uso de antígenos para inducir inmunización activa y anticuerpos para inducir inmunización pasiva también es rutinario. En esta realización, un vehículo de administración común (por ejemplo, comprimido, implante, disolución inyectable, etc.) podría contener tanto la composición útil en presente invención como el fármaco antibiótico antibacteriano y/o antígeno o anticuerpo. Alternativamente, el fármaco antibiótico antibacteriano y/o antígeno o anticuerpo pueden dosificarse por separado. El agente antibacteriano (por ejemplo, un antibiótico) también puede conjugarse con PNAGd o con un anticuerpo anti-PNAGd.

Los fármacos antibióticos antibacterianos son muy conocidos e incluyen: penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina, epicilina, hetacilina, pivampicilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, avlocilina, mezlocilina, piperacilina, amdinocilina, cefalexina, cefradina, cefadoxilo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima axetilo, cefamandol, cefonicid, cefoxitin, cefotaxima, ceftizoxima, cefinenoxina, ceftriaxona, moxalactam, cefotetan, cefoperazona, ceftazidima, imipenem, clavulanato, timentin, sulbactam, neomicina, eritromicina, metronidazol, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, vancomicina, trimetoprim-sulfametoxazol, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y rifampinas (véase Goodman and Gilman's, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8ª ed., 1993, McGraw Hill Inc.).

Otros antígenos de polisacárido y anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los siguientes antígenos de polisacárido, y/o anticuerpos para los mismos, pueden administrarse conjuntamente con el antígeno PNAGd y/o anticuerpo para el mismo: antígeno Vi de la cápsula de Salmonella typhi (Szu, S. C., X. Li, A. L. Stone y

J. B. Robbins, Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide, Infection and Immunity 59:4555-4561 (1991)); cápsula K5 de E. coli (Vann, W., M. A. Schmidt, B. Jann y K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli, 010:K5:H4. A polymer similar to desulfoheparin, European Journal of Biochemistry 116:359-364, (1981)); cápsula de tipo 5 de Staphylococcus aureus (Fournier, J.-M., K. Hannon, M. Moreau, W. W. Karakawa y W. F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (Paris). 138:561-567, (1987)); expolisacárido II de Rhizobium meliloti (Glazebrook, J. y G. C. Walker, A novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti, Cell, 65:661-672 (1989)); estreptococos del grupo B de tipo III (Wessels, M. R., V. Pozsgay, D. L. Kasper y H. J. Jennings, Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry, 262:8262-8267 (1987)); cadena lateral O-especifica Fisher 7 de Pseudomonas aeruginosa (Knirel, Y. A., N. A. Paramonov, E. V. Vinogradov, A. S. Shashkow, B. A. N. K. Kochetkov,

E. S. Stanislavsky y E. V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa; The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharides of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 and 7, European Journal of Biochemistry, 167:549, (1987)); cadena lateral O-especifica de Shigella sonnei (Kenne, L., B. Lindberg y K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research, 78:119-126, (1980)); cápsula de tipo I de S. pneumoniae (Lindberg, B., Lindqvist, B., Lonngren, J., Powell, D. A., Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 1, Carbohydrate Research, 78:111-117 (1980)); y antígeno del grupo de Streptococcus pneumoniae (Jennings, H. J., C. Lugowski y N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from Streptococcus pneumoniae type 1, Biochemistry, 19:4712-4719 (1980)).

Otros antígenos no polipeptídicos y anticuerpos para los mismos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia y pueden usarse conjuntamente con las composiciones de PNAGd de la invención.

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secuencia de expresión de gen estaría unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico ica si la secuencia de expresión de gen fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico ica de forma que el transcrito resultante pudiera ser traducido en la proteína o polipéptido deseado.

El ácido nucleico ica de la invención puede administrarse a la célula hospedera solo o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar: (1) la administración de una molécula de ácido nucleico que contiene los genes del locus ica que codifica las proteínas implicadas en la síntesis de PNAG,

o (2) la captación de una molécula de ácido nucleico que contiene los genes en el locus ica que codifican proteínas implicadas en la síntesis de PNAG por una célula diana. Preferentemente, los vectores transportan la molécula ica a la célula diana con degradación reducida con respecto al grado de degradación que resultaría en ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención se dividen en dos clases: vectores biológicos y vectores químicos/físicos. Los vectores biológicos son útiles para la administración/captación de ácidos nucleicos ica a/por una célula diana. Los vectores químicos/físicos son útiles para la administración/captación de ácidos nucleicos ica o polipéptidos de ica a/por una célula diana.

Vectores biológicos incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes virales o bacterianas que han sido manipuladas por inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico de la invención, y fragmentos de ácido nucleico libres que se pueden unir a las secuencias de ácido nucleico de la invención. Los vectores virales son un tipo preferido de vector biológico e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus tales como: virus de leucemia murina de Moloney; virus del sarcoma murino de Harvey; virus del tumor mamario murino; virus del sarcoma de Rous; adenovirus; virus adenoasociado; virus de tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la variolovacuna; virus de la poliomielitis; y virus de ARN, tales como cualquier retrovirus. Pueden emplearse fácilmente otros vectores no nombrados, pero conocidos en la técnica.

Los vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que los genes no esenciales se han sustituido con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo vital implica la transcripción inversa de ARN genómico viral en ADN, con integración proviral posterior en el ADN celular del hospedador. En general, los retrovirus son deficientes de replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (que incluyen las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular revestida con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de encapsidación, recogida de partículas virales del medio de cultivo de tejido, e infección de las células blanco con partículas virales), son proporcionados por Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual" W. H. Freeman Co., Nueva York (1990), y Murry, E. J. Ed. "Methods in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, Nueva Jersey (1991).

Otro virus preferido para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adenoasociado puede ser manipulado para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar una amplia gama de tipos y especies de células. Además, tiene ventajas tales como estabilidad al calor y disolventes lipídicos; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes; y ausencia de inhibición de superinfección, permitiendo así series múltiples de transducciones. Supuestamente, el virus adenoasociado puede integrarse en ADN celular humano de manera específica de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y la variabilidad de la expresión del gen insertado. Además, las infecciones con virus adenoasociado no mutado han sido seguidas en cultivo de tejido durante al menos 100 pases en ausencia de presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de forma extracromosómica.

Además de los vectores biológicos, pueden usarse vectores químicos/físicos para administrar una molécula ica a una célula diana y facilitar así la captación. Como se usa en el presente documento, un "vector químico/físico" se refiere a una molécula natural o sintética, distinta de aquellas derivadas de fuentes bacteriológicas o virales, capaz de administrar la molécula ica a una célula.

Un vector químico/físico preferido de la invención es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípido que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido de la invención es un liposoma. Los liposomas son vasos de membrana artificiales que son útiles como vector de administración in vivo o in vitro. Se ha mostrado que vasos unilaminares grandes (LUV), que oscilan en tamaño de 0,2 -4,0 µm, pueden encapsular macromoléculas grandes. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente activa (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., (1981) 6:77). Con el fin de que un liposoma sea un vector eficiente de transferencia génica, deben estar presentes una o más de las siguientes características: (1) encapsulación del gen de interés con alta eficiencia con retención de la actividad biológica; (2) administración del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficiencia; y (3) expresión exacta y eficaz de la información genética.

Están disponibles comercialmente liposomas de Gibco BRL, por ejemplo como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que se forman de lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA)

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y bromuro de dimetil-dioctadecilamonio (DDAB). Métodos de preparación liposomas son muy conocidos en la técnica y se han descrito en muchas publicaciones. Los liposomas también han sido revisados por Gregoriadis, G. en Trends in Biotechnology, (1985) 3:235-241.

También pueden usarse agentes de compactación, solos o en combinación con un vector biológico o químico/físico de la invención. Como se usa en el presente documento, un "agente de compactación" se refiere a un agente tal como histona, que neutraliza las cargas negativas sobre el ácido nucleico y así permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la captación del ácido nucleico en la célula diana. Los agentes de compactación pueden usarse solos, es decir, para administrar la molécula ica en una forma que es más eficientemente captada por la célula, o, más preferentemente, en combinación con uno o más de los vectores anteriormente descritos.

Otras composiciones a modo de ejemplo que pueden usarse para facilitar la captación por una célula diana de los ácidos nucleicos ica incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos de transporte intracelular, composiciones de microinyección, electroporación y composiciones de recombinación homóloga (por ejemplo, para integrar el ácido nucleico ica en una localización preseleccionada dentro del cromosoma de la célula diana).

Los siguientes ejemplos se incluyen para fines de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Purificación de PNAGd.

Se ha descubierto según la invención que puede producirse PNAGd de cualquier cepa bacteriana que exprese el locus ica. Específicamente, éstas incluyen Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus y otras cepas estafilocócicas tales como Staphylococcus carnosus transformado con los genes en el locus ica. Pueden usarse las siguientes cepas específicas según la invención para purificar PNAG que incluyen S. epidermidis RP62A (N.º de ATCC: 35984), S. epidermidis RP12 (N.º de ATCC: 35983), Staphylococcus epidermidis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27) y S. aureus MN8 mucoide.

El siguiente es un método que puede usarse para producir PNAGd a partir de estafilococos que contienen el locus

ica.

El material de partida se prepara a partir de cultivos de estafilococos que expresan los genes ica cultivando las bacterias del siguiente modo: El polisacárido se prepara a partir de cultivos de 16 litros de medio de crecimiento bacteriano. Un medio preferido es un medio definido químicamente (CDM) basado en RPMI-1640 AUTO-MOD, una preparación de RPMI modificada para permitir la esterilización en autoclave (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). El CDM se complementa con aminoácidos adicionales, vitaminas y nucleótidos para ajustar su concentración a la encontrada en otro CDM (Hussain, M., J.G.M. Hastings, and P.J. White, 1991, A chemically defined medium for slime production by coagulase-negative Staphylococci. J. Med. Microbiol. 34:143-147). El medio también se complementa con sacarosa y glucosa hasta una concentración final del 1 %.

Se inoculan cultivos líquidos con una única colonia de una cepa de bacteria productora de polisacárido. La cepa preferida se designa Staphylococcus aureus MN8m, una cepa que es un sobreproductor constitutivo del polisacárido. Se toma una única colonia de una placa de agar de soja tríptica, o placa similar de medio de crecimiento bacteriano, y se cultiva a 37 ºC. También son aceptables temperaturas de 10-42 ºC. Los cultivos líquidos se incuban a 37 ºC durante 1-96 horas mientras se agita continuamente y se lava con oxígeno a una velocidad de 2 litros/min. El pH se mantiene a 7,0 durante todo el periodo de crecimiento mediante la adición de NaOH 10 N mediante un titulador de pH. Al final del periodo de crecimiento, los cuerpos celulares se sedimentan a 9000 g durante 30 minutos, y el sobrenadante se concentra a ∼500 ml mediante filtración de flujo tangencial (membranas de corte de peso molecular de 10.000-500.000). Se añaden dos volúmenes de etanol para precipitar la preparación de polisacárido bruto. El precipitado se recupera por centrifugación, resuspensión en agua y diálisis durante la noche contra agua destilada. El antígeno es insoluble. El antígeno bruto insoluble se suspende en 50 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato 0,1 M, cloruro sódico 0,15 M) para ser digerido con la lisozima (0,5 mg) y lisostafina (0,5 mg) durante 0,5 a 16 h a 37 ºC. Las suspensiones de antígeno se tratan adicionalmente con nucleasas (0,5 mg) a 37 ºC durante 0,5-16 h, seguido de incubación durante 0,5-16 h con proteinasa K (5 mg) a 3756 ºC. Después de la diálisis y liofilización, los extractos secados se disuelven en HCI 5 M y el pH se ajusta a 2 con NaOH 4 N. Se aplican alícuotas de veinte ml de esta disolución a una columna de 5x88 cm rellena de Sephacryl S300 (Pharmacia, Piscataway, NJ) usando tampón HCI 0,1 N/NaCl 0,15 M, con el polisacárido eluido identificado por absorción óptica a 206 nm. Las fracciones que corresponden al polisacárido que representan un intervalo continuo de tamaños moleculares se reúnen por separado, se dializan contra agua y se liofilizan. Alternativamente, puede realizarse fraccionamiento por tamaño con una variedad de procedimientos alternativos conocidos en la técnica, tales como el uso de membranas de diafiltración.

Puede ajustarse el nivel de acetilación tratando químicamente el polisacárido nativo. Así, se aísla polisacárido con >50 % de acetato y se desacetila para lograr el nivel de acetilación deseado. El tratamiento es una disolución básica conocida para eliminar los grupos acetato unidos con amino de la glucosamina. Un medio preferido es la incubación a 37 ºC durante 2-20 horas en NaOH 1,0 M. Son igual de eficaces disoluciones más débiles y tiempos de incubación

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más largos o temperaturas más altas, o disoluciones más fuertes con tiempos de incubación más cortos o temperaturas más bajas. Generalmente, cualquier tratamiento que eleve el pH por encima de 10 sería eficaz bajo la temperatura apropiada.

También existen medios enzimáticos para desacetilar el antígeno. Éstos incluyen enzimas desacetilantes tales como aquellas relacionadas con cloranfenicol desacetilasa y el producto del gen icaB.

Ejemplo 2: Preparación de vacuna de conjugado PNAGd-toxoide diftérico (DTm).

Se acopló covalentemente DTm a PNAGd purificada por aminación reductiva. Primero se introdujeron grupos aldehído sobre la superficie del toxoide diftérico (DTm) por tratamiento de la proteína con glutaraldehído como se describe en la etapa 1 a continuación. Posteriormente, el DTm activado se hizo reaccionar con PNAGd, mediante sus grupos amino libres en presencia del agente reductor cianoborohidruro de sodio, como se describe en la etapa 2 más adelante.

Etapa 1: Activación de DTm con glutaraldehído

Se dializaron 10 mg de DTm (disolución de 4,86 mg/ml en tampón HEPES 20 mM, NaCI 50 mM, pH 8) contra tampón de carbonato 0,1 M (pH 10) durante 3 horas (h) a temperatura ambiente usando un casete de diálisis de MWCO de 10 kDa. Cuando la disolución de proteína se intercambió completamente con el tampón carbonato, se agregó glutaraldehído hasta una concentración final de 1,25 % y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Esto produjo DTm activado, que se intercambió con disolución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7,4), y se concentró hasta aproximadamente 10 mg/ml por ultrafiltración usando una membrana de filtración de MWCO de 10 kDa.

Etapa 2: Acoplamiento de DTm activado con PNAG

Se purificó PNAG como se describe en Maira et al. (Maira-Litrán T, Kropec A, Abeygunawardana C, Joyce J, Mark III G, Goldmann DA y Pier GB. Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70: 4433-4440). Una fracción de este material, designada PNAG-II por Maira et al., se usó para preparar la PNAG desacetilada (PNAGd). La PNAG nativa se disolvió hasta una concentración de 2 mg/ml en NaOH 5 M y se incubó a 37 ºC con agitación. Después de 18 h, la muestra se puso en una suspensión de hielo y se dejó enfriar a <10 ºC. También se enfrió sobre hielo HCI 5 N y se añadió en alícuotas de 0,5 ml hasta que la disolución alcanzó el pH neutro. La disolución de PNAGd se dializó entonces durante la noche contra agua destilada, en un casete de diálisis de corte de peso molecular de 10 KiloDaltons (MWCO de 10K) y se liofilizó. Este procedimiento dio PNAGd que tiene 15-20 % de sustituciones de acetato.

Se disolvió PNAGd purificada (10 mg) en 0,25 ml de HCI 5 M, se neutralizó con un volumen igual de NaOH 5 M y el volumen final se ajustó a 2 ml con PBS. Las disoluciones de PNAGd son insolubles a pH neutro pero permanecen completamente solubles a pH ligeramente ácido o básico. Por lo tanto, para garantizar la solubilidad, el pH de las disoluciones de PNAGd se ajustó a 9,0. Se mezcló PNAGd (10 mg) con 1 ml de una disolución de 10 mg/ml de DTm activado en PBS, y el pH de la reacción se ajustó a 7,5. Se añadieron a la mezcla doscientos mg de cianoborohidruro de sodio purificado y la reacción se dejó proceder en la oscuridad durante 14 h a 37 ºC con mezcla. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se intercambió por diálisis con tampón carbonato 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 10 (casete de diálisis de MWCO de 10 kDa), y el conjugado de alto peso molecular se purificó de los componentes no acoplados con una columna Superase 6 grado preparativa por cromatografía de filtración en gel. El conjugado PNAGd-DTm se dializó contra tampón HEPES 20 mM, NaCI 50 mM, pH 8 y se guardó congelado a -2 ºC.

Ejemplo 3: Preparación de vacuna de conjugado PNAG nativa-DTm.

Se acopló covalentemente PNAG nativa (en este caso que tenía 95 %-100 % de sustituciones de acetato) con DTm purificado usando el agente de cianilación orgánico tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) para activar los grupos hidroxilo del polisacárido como se describe en la etapa 1 a continuación. Posteriormente se acopló la PNAG activada con CDAP con DTm como se describe en la etapa 2 más adelante, sin la necesidad de moléculas espaciadoras adicionales.

Etapa 1: Activación de PNAG con CDAP

Se disolvieron 10 mg de PNAG purificada en 150 microlitros de HCl 5 M, se neutralizó con un volumen igual de NaOH 5 M y se diluyó hasta 1 ml con tampón borato, pH 9,2. CDAP se enrasó a una concentración de 100 mg/ml en acetonitrilo y se guardó a -20 ºC durante hasta 1 mes. Se añadieron lentamente con pipeta 200 microlitros de CDAP (que contienen 20 mg) en una disolución previamente agitada con vórtice de PNAG-II (Maira et al., Infect. Immun. 2002, 70:4433:4440) en tampón borato (la adición rápida del co-disolvente orgánico precipita el polisacárido), y la reacción se dejó proceder durante dos minutos.

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