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KR101847051B1 - 병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물 - Google Patents

병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물 Download PDF

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KR101847051B1
KR101847051B1 KR1020160051073A KR20160051073A KR101847051B1 KR 101847051 B1 KR101847051 B1 KR 101847051B1 KR 1020160051073 A KR1020160051073 A KR 1020160051073A KR 20160051073 A KR20160051073 A KR 20160051073A KR 101847051 B1 KR101847051 B1 KR 101847051B1
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Abstract

본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다. 나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.

Description

병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물{Antibiotic peptides having an antibiotics and comprising antibiotic composition thereof}
본 발명은 병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생능을 갖는 LPcinⅠ 펩타이드 중 일부 아미노산을 결실 및/또는 치환하여 항생능력을 현저하게 증대시킨 LPcinⅠ 펩타이드 유래의 병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물에 관한 것이다.
미생물의 침입에 대한 곤충의 방어기작에 관한 연구결과로부터 누에 애벌레에서 새로운 펩타이드 항생제인 세크로핀이 발견된 이래, 생리활성 물질로서 펩타이드의 중요성이 크게 인식되었다. 최근 수 년 간의 연구 결과 거의 모든 고등생물이 병원성 미생물에 대한 방어수단으로서 면역체계와 별도의 항생 펩타이드를 체내에 축적하거나 분비하는 것으로 알려졌다. 현재까지 약 2,000 종 이상의 펩타이드 항생제가 발견되고 있으며, 이들 펩타이드들 은 발견된 종마다 그 아미노산 조성이 상이하지만 항생 작용기작은 유사한 것으로 알려지고 있다. 대표적인 항생 펩타이드로 세크로핀(cecropin), 머게이닌(magainin), 봄비닌(bombinin), 디펜신(defensin), 타키플레신(tachyplesin) 및 부포린(buforin) 등이 알려졌는데, 이들 항생 펩타이드들은 공통적으로 17-24개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그람 음성균 및 그람 양성균뿐만 아니라 원핵생물 또는 곰팡이 등에 대해서도 항생력을 가지며, 일부는 암세포와 바이러스에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 상기 펩타이드 항생제 중 머게이닌은 양서류 표피에서 분리된 23개의 아미노산 조성을 갖는 펩타이드(Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp5449-5453, 1987)로서, 병원균뿐 아니라 인체 폐암세포에도 작용하는 것으로 보고되었다. 또한, 항생 펩타이드의 대부분은 특이적으로 세포에 작용하여 목적세포를 신속하게 죽이고, 대부분 넓은 범위에서 활성 스펙트럼을 나타낸다(Park, C.B. et al., Biochem. Biophys. Res.Comm., 218,pp408-413, 1996).
상기 항생 펩타이드들은, 첫째, 광범위한 미생물에 대하여 강력한 항생력을 가지며, 둘째, 숙주세포는 파괴하지 않으면서 외부에서 침입한 병원균에만 작용하여 인체에 무해한 항생물질로서 작용하며, 셋째, 미생물의 내성유발이 문제시되고 있는 종래의 항생제와는 전혀 다른 활성기작으로 항생활성을 나타내므로 내성유발 가능성이 적고, 넷째, 글리코실레이션(glycosylation)과 같은 2차 변형(secondary modification)이 없기 때문에 유전자 조작을 통하여 대량 생산할 수 있으며, 다섯째, 열, 산 또는 알칼리 등에 강한 이화학적 안정성을 가지고 있기 때문에 제약 및 식품분야에서의 산업적 이용성이 매우 크다는 장점을 갖는다.
현재까지 보고된 항생 펩타이드의 작용기작은 크게 두 가지로 분류된다. 첫째, 대부분의 항생 펩타이드들은 균의 세포막의 투과성을 증가시켜 막전위를 파괴하고 세포대사를 멈추게 하는 작용기작을 갖는다. 둘째, 이 외의 소수의 항생 펩타이드들은 균 세포 내로 침투하여 DNA 또는 RNA와 결합하여 전사(transcription) 또는 번역(translation)을 억제하는 강력한 작용기작을 나타낸다.
이들 항생 펩타이드들의 활성에 중요하다고 알려진 구조적인 요소로서는 다음과 같은 것들이 있다: 첫째, 양친매성 나선구조(amphipathic helix), 둘째, 상기 나선구조를 안정화시키는 잔기들의 분포, 셋째, 염기성 잔기들의 분포, 넷째, 소수성 잔기들의 분포, 다섯째, 전하를 띠는 잔기들과 나선구조의 쌍극자 간의 상호작용, 및 여섯째, 반대 전하를 띠는 잔기들 간의 염다리를 들 수 있다.
한편, 소의 우유에 존재하는 락토포리신 (LPcin-I)은 23 개의 아미노산 잔기를 가진 양이온, 양친매성 펩타이드로 PP3의 카르복시 말단 113 ~ 135 영역이다. LPcin-I은 그람-양성균과 그람-음성균 둘 다의 성장을 억제하지만 200 μM이하의 농도에서 용혈작용이 나타나지 않는다. LPcin-I과 반대로, PP3의 아미노산 119 ~ 135영역에 해당하는 LPcin-II는 항생기능이 없다고 알려져 있다.
그런데 항생능이 있는 것으로 알려진 LPcin-I은 이를 상업화하기 위하여 야생형 LPcin-I보다 높은 항생능 및 제조원가를 낮추기 위하여 보다 짧은 아미노산 서열로 이루어진 항생 펩타이드를 제조하는 기술개발이 절실하게 요구되었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 23개의 아미노산으로 이루어진 야생형 락토포리신 (LPcin-I) 항생 펩타이드에 비하여, 아미노산 서열의 개수는 적으면서도 항생력이 현저하게 향상된 병원균에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.
발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 병원균에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식Ⅰ로 표현되는 펩타이드를 제공한다.
[일반식 Ⅰ]
[(N-말단)-N K V K E W X1 K X2 L K X3 X4 F X5-(C-말단)]
여기에서, X1은 I 또는 W이고; X1이 I이면, X2는 Y이고, X1이 W이면, X2는 W이며; X3는 S 또는 K이고; X4는 L 또는 K이며; X5는 S 또는 K이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 일반식Ⅰ에서 X3 X4 F X5 또는 F X5가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생 펩타이드 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항생 활성은 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라균(Salmonella), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대한 항생활성인 것일 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다. 또한 항생펩타이드는 약물 전달 과정에서 아미노산 길이가 짧을수록 생체 내에서 소화 되지 않고 필요한 곳 까지 운반되기 용이하다. 나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.
도 1은 하나의 그람-양성균(Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 두개의 그람-음성균(Salmonella ATCC 19430 및 Escherichia coli KCTC 1682)으로 구성되는 3종의 미생물에 대하여 항생활성시험을 수행한 결과사진이다.
도 2는 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)에 대한 최소억제농도를 측정한 그래프 및 도표이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 소의 우유에 존재하는 락토포리신 (LPcin-I)은 23 개의 아미노산 잔기를 가진 양이온, 양친매성 펩타이드로 PP3의 카르복시 말단 113 ~ 135 영역이다. LPcin-I은 그람-양성균과 그람-음성균 둘 다의 성장을 억제하지만 200 μM이하의 농도에서 용혈작용이 나타나지 않는다.그런데 항생능이 있는 것으로 알려진 LPcin-I은 이를 상업화하기 위하여 야생형 LPcin-I보다 높은 항생능 및 제조원가를 낮추기 위하여 보다 짧은 아미노산 서열로 이루어진 항생 펩타이드를 제조하는 기술개발이 절실하게 요청되었다.
이에, 본 발명의 일실시예에 따른 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 병원균에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표현되는 펩타이드를 제공하여 상술한 문제의 해결을 도모하였다. 이를 통해 본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다. 나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.
[일반식 Ⅰ]
[(N-말단)-N K V K E W X1 K X2 L K X3 X4 F X5-(C-말단)]
여기에서, X1은 I 또는 W이고; X1이 I이면, X2는 Y이고, X1이 W이면, X2는 W이며; X3는 S 또는 K이고; X4는 L 또는 K이며; X5는 S 또는 K임.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A, 아르기닌 R, 아스파라긴 N, 아스파르트산 D, 시스테인 C, 글루탐산 E, 글루타민 Q, 글라이신 G, 히스티딘 H, 이소루신 I, 루신 L, 리신 K, 메티오닌 M, 페닐알라닌 F, 프롤린 P, 세린 S, 트레오닌 T, 트립토판 W, 티로신 Y, 발린 V.
본 발명의 일반식 Ⅰ에서 X1은 I, W 또는 무극성 아미노산일 수 있으며, X1이 I이면 X2는 Y이고, X1이 W이면 X2는 W이다.
한편, 본 발명에서 무극성 아미노산은 글라이신(G), 알라닌(A), 발린(V), 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C), 프롤린(P)으로 구성된다. 극성 아미노산은 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)으로 구성된다. 산성 아미노산은 아스파르트산(D), 글루탐산(E)으로 구성되며, 염기성 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)으로 구성된다.
한편, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 C-말단으로부터 X3 X4 F X5 또는 F X5가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 서열번호 7 내지 9로 표시되는 항균 펩타이드들은 F X5 가 결실된 항균 펩타이드이며, 서열번호 10로 표시되는 항균 펩타이드는 X3 X4 F X5 가 결실된 항균 펩타이드이다. 이들 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 항균펩타이드는 야생형 LPcin-I(서열번호 11)에 비하여 현저하게 우수한 항균활성을 나타낸다(실험예 2 참조).
발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것이 제작비용을 절감하고 우수한 항균활성을 나타내는데 매우 유리하다(실험예 1 참조). 가장 바람직하게 본 발명에서 우수한 항균활성을 나타내는 항균 펩타이드는 YK5(서열번호 3), YK8(서열번호 6) 및 YK11 펩타이드(서열번호 9)일 수 있다.
본 발명의 항균 펩타이드 YK5, YK8 및 YK11는 YK3과 비교하여 더욱 낮은 농도에서 상기 언급한 5가지 균주를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 더욱 경제적이다. 아울러, YK11는 아미노산 서열이 YK3보다 2mer 적게 포함되어 있어, 상업적으로 제조하기에 경제적인 이점이 있다.
한편 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 서열번호 11으로 표시되는 23개의 아미노산으로 이루어진 LPcin-I 펩타이드는 통상의 펩타이드 합성방법을 통해 제작될 수 있으며, 구체적으로 자동 펩타이드 합성기를 통해 제작되거나, 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 정제하여 제작될 수 있으며, 재조합 발현벡터를 통해 LPcin-I 항생 펩타이드를 합성하는 방법에 관한 한국특허출원 제2008-130593호는 본 발명에 참조로서 삽입된다.
또한, Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하는 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성할 수 있다(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963).
또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 서열번호 1 ~ 10로 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 서열번호 11의 항생 펩타이드의 제작과 마찬가지로 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 이를 통해 제작된 본 발명의 항생 펩타이드들은 그람(+)균주, 그람(-)균주 등에 대하여 높은 항생 활성을 가지며 이들의 대표적인 균주인 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)에 대하여 높은 항생활성을 가지나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 항생제, 항진균제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 외상치료제, 안약 및 의약품 보존제의 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 본발명의 항생 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용할 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들을 약제로 사용할 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드의 유효용량은 0.1∼3 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물을 제공한다. 이 경우 유효용량은 사료 1㎏에 대하여 0.01∼100㎎이 함유될 수 있으며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
신규한 항균 펩타이드의 제조
자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기 표 1에 기재된 서열의 펩타이드들을 합성하고, 이들 합성된 펩타이드들을 preparative 역상 고분해능 액체 크로마토그래피(Shiseido capcell pak C18 column을 사용한 Shimadzu Prominence HPLC)를 이용하여 순수분리하였다.
상기 표 1에서 서열번호 11번은 23개 아미노산 서열을 가지는 야생형 LPcin-I 항생 펩타이드이고, 서열번호 1번 내지 6번은 15개 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드 서열이며, 서열번호 7번 내지 9번은 13개 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드 서열이다. 또한, 서열번호 10번은 11개 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드 서열이다.
펩타이드 명칭 아미노산 서열 서열번호
YK3 (15mer) NKVKE WIKYL KSLFS 1
YK4 (15mer) NKVKE WWKWL KSLFS 2
YK5 (15mer) NKVKE WIKYL KSLFK 3
YK6 (15mer) NKVKE WIKYL KSKFS 4
YK7 (15mer) NKVKE WWKWL KSLFK 5
YK8 (15mer) NKVKE WIKYL KSKFK 6
YK9 (13mer) NKVKE WWKWL KSL 7
YK10 (13mer) NKVKE WIKYL KKL 8
YK11 (13mer) NKVKE WWKWL KKL 9
YK12 (11mer) NKVKE WWKWL K 10
LPcin-I (23mer) NTVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKT 11
항균활성 측정실험
상기 실시예 1에서 합성한 1 내지 11번의 11개의 펩타이드에 대하여 항생활성을 측정하였다. 구체적으로 미생물에 대한 항생 활성은 Brain heart infusion agar (BactoTM)를 사용하여 수행했다. 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)의 다섯 가지의 미생물에 대해 agar disc diffusion 테스트에 기초했다. 접종원은 37℃ , 3.7% Brain heart infusion 5 ml에서 박테리아를 하룻밤 동안 배양하는 것으로 준비했다. 현탁액의 혼탁 정도는 600 nm에서 분광 광도계로 0.05 표준탁도액(1 x 108CFU/mL)과 같게 최종농도를 조절했다. 20 ml의 Brain heart infusion agar를 φ90 mm의 세포 배양 플레이트에 도포했다. Agar 플레이트에 멸균된 spreader를 사용하여 30 ul의 박테리아 현탁액을 접종시켰다. 접종된 agar 플레이트는 30분 동안 상온에서 말렸다. Agar 플레이트 표면에 멸균된 6 mm의 filter paper(Whatman No. 1)를 위치시키고 항생펩타이드들은 10 mM의 농도로 멸균물에 녹여 20 ul의 용액을 filter paper에 접종시켰다. 상온에서 30분 동안 pre-diffusion을 시킨 뒤, 플레이트들을 37 ℃에서 24 시간 동안 배양했다. 24 시간이 지난 후, filter paper 주변의 박테리아 군의 성장 억제 직경을 측정함으로써 박테리아 군에 대한 항생 펩타이드들의 민감도는 박테리아 생장을 억제하는 영역의 크기와 없앤 정도에 의해서 결정했다. 측정은 2 번 반복하여 얻었다.
도 1은 24 시간이 경과한 후 관찰한 agar disc diffusion 테스트 결과를 나타내는 사진이다. 이 중 YK3는 한국특허출원 제2011-0049538호에 기재된 방법에 따라 항생활성을 갖는 펩타이드로써 새로운 펩타이드와의 비교를 위해 실시되었다.
세포독성 실험
Cyto XTM cell viability assay kit (LPS solution) 시험법을 이용하여 세포독성 실험을 실시하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트는 corning社로부터 구이바였으며, 포유세포주는 ATCC로부터 구입하였다. 또한 Cyto XTM 세포 가시분석 키트는 LPS solution으로부터 구입하였다.
실험 방법으로는 동결보관한 세포를 해동하여 10% FBS를 포함하는 DMEM 또는 RPMI1640 배지에 배양한 후, 세포의 밀도가 80 ~ 90%에 도달할 때, 2~3일 간격으로 계대 배양을 실시하였다. 실험을 위하여 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 세포의 개수가 10,000개가 되도록 96-웰에 분주하였다. 그 후, 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 준비한 펩타이드를 DMSO에 희석하여 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 mM의 농도로 준비한 후, 각각의 웰에 DMSO 또는 준비된 펩타이드를 1 μl씩 첨가함으로써 1/100배 희석하여 처리되도록 하였다. 그 후 37℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포독성을 측정하기 위해, Cyto XTM 세포 가시분석 키트(LPS solution)에 준비한 펩타이드를 10 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃ CO2 인큐베이터에서 1~4시간 배양한 후, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후, 얻어진 결과를 DMSO 대비 측정값의 퍼센트 값을 구하고, GraphPad prism 5에서 그래프를 그린 후, IC50값을 구하였다.
4종의 펩타이드(YK3, YK5, YK8 및 YK11)에 대한 다양한 포유동물 세포주에서 IC50 값은 하기 표 2에 기재된 바와 같다. 4종의 펩타이드에 의한 IC50가 각각의 세포주에서 10 μM 이상이면 일반 세포독성이 없는것으로 판단되는데, 하기 4종의 펩타이드는 일반 세포독성에 대해 안전한 것으로 확인되었다.
특히, CHO-K1세포주에 4종의 펩타이드를 처리하였을 때, YK3 펩타이드는 56.2uM에서 IC50 값을 보였으나, YK5, YK8 및 YK11 펩타이드는 이보다 높은 값인 57.0, 71.9 및 86.8 uM의 IC50값을 보였다. 즉, YK5, YK8 및 YK11 펩타이드가 YK3 펩타이드보다 더욱 낮은 세포 독성을 띄는 것으로 확인되었다.
세포독성 측정결과
화합물 IC50(μM)
VERO HFL-1 L929 NIH3T3 CHO-K1
YK3 99.1 94.0 >100 76.0 56.2
YK5 >100 >100 >100 >100 57.0
YK8 >100 >100 >100 >100 71.9
YK11 83.7 >100 >100 96.6 86.8
최소억제농도 측정실험
항균 어세이는 표준 브로스 미량희석법 (broth microdilution method)을 이용하여 최소 억제 농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 값을 측정함으로써 수행하였다. 각 펩타이드의 항균 활성은 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)을 이용하여 수행하였다. 이 5가지 균을 50μl로 준비한 후, 5ml의 3.7% BHI에 혼합하고 하룻동안 37℃, 240 rpm 조건에서 배양하였다. 그 후, 배양된 균 50μl을 5ml의 3.7% BHI에 혼합하고 2시간동안 37℃, 240rpm 조건에서 배양하였다. 배양한 균은 0.037% BHI 용액으로 희석하여 1×108 CFU/㎖의 농도로 준비하였다.
용해시킨 합성 펩타이드를 96 well-plate에서 BHIB로 2배씩 단계 희석하였다. 다양한 농도의 합성 펩타이드 100 μl와 희석하여 준비한 각각의 균 5 μl를 96 well-plate(microreader plate)에서 혼합한 후 37℃에서 12시간동안 진탕배양하였다. 배양 후, Microplate Reader Multiskan FC(Thermo scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 600 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였으며, MIC의 범위는 세균의 성장이 억제되기 시작하는 펩타이드의 가장 낮은 농도로 하였다. MIC 뿐만 아니라 대조군과 비교하여 세균의 성장이 50%가 되는 반수억제농도(Half maximal Inhibitory Concentration, IC50)를 확인하였다. 용매 대조군으로서 펩타이드를 포함하지 않는 BHIB 용액 100 ㎕를 균 5 ㎕와 혼합하여 실험군과 동일한 방법을 수행하였으며, 실험의 정확성을 위해 본 실험은 3회 반복 수행하였다.
그 결과, 하기 도 2에 나타난 바와 같이 실험에 사용된 병원균에 대하여 모든 펩타이드가 항균활성을 나타내었다. 특히, YK3 펩타이드보다 YK5, YK8 및 YK11 펩타이드가 보다 낮은 농도에서 효과적으로 5가지 균에 대하여 항균활성을 나타내었다.
실험 펩타이드 정보
펩타이드 아미노산 서열 분자량 서열번호

15 mer		 YK3 NKVKE WIKYL KSLFS 1883.2 1
YK5 NKVKE WIKYL KSLFK 1883.2 3
YK8 NKVKE WIKYL KSKFK 1939.2 6
13 mer YK11 NKVKE WWKWL KKL 1786.2 9
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 항생 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내며 인체에 안전하므로 사료첨가제. 식품방부제, 화장품 및 의약품 보존제, 상처치료 촉진제, 외상치료제, 구강청정제 및 안약 등의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (5)

  1. 병원균에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표현되는 펩타이드.
    [일반식 Ⅰ]
    [(N-말단)-N K V K E W X1 K X2 L K X3 X4 F X5-(C-말단)]
    (여기에서, X1은 I 또는 W이고; X1이 I이면, X2는 Y이고, X1이 W이면, X2는 W이며; X3는 S 또는 K이고; X4는 L 또는 K이며; X5는 S 또는 K이고; 및 X1 는 I, X2 는 Y, X3 는 S, X4 는 L, X5 는 S인 경우는 제외함.)

  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 일반식Ⅰ에서 X3 X4 F X5 또는 F X5가 결실된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2 내지 10 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생 펩타이드 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항생 활성은 포도상구균(Staphylococcus aureus), 살모넬라균(Salmonella), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 균에 대한 항생활성인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 조성물.
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