KR101953828B1

KR101953828B1 - 왕귀뚜라미에서 유래한 항균 펩타이드 테레오그릴루신 1 및 그의 조성물

Info

Publication number: KR101953828B1
Application number: KR1020170050773A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 김미애; 남성희; 안미영; 김성현; 이준하; 김인우; 윤은영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: KR20180117792A

Abstract

본 발명은 왕귀뚜라미로부터 분리한 신규한 테레오그릴루신 1 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 화학적으로 합성된 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 또는 진균류에 대한 강한 항균 작용을 나타내면서도 세포 독성이 거의 없기 때문에 항균제, 항진균제, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제, 장염 치료제 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

왕귀뚜라미에서 유래한 항균 펩타이드 테레오그릴루신 1 및 그의 조성물 {An anti-microbial peptide, Teleogryllusine 1 isolated from Teleogryllus emma and its synthetic composition}

본 발명은 왕귀뚜라미부터 유래한 신규 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 왕귀뚜라미부터 유래하여 세포 독성이 없으면서도 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내는 신규 테레오그릴루신 1 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것이다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 병원성 미생물이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 병원성 미생물 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다.

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 이러한 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 발생되는데, 이로 인해 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다. 아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주되며, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 병원성 미생물들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있기에, 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 병원성 미생물들에 의한 피해를 막기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 병원성 미생물의 감염을 효과적으로 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.

한편, 생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 관련 선행기술로 한국등록특허 제10-0625875호(아스퍼질러스 니듈란스로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물)와 한국등록특허 제10-0964136호(울도하늘소유충으로부터 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드 유전자 및 항균 또는 항진균 활성을 가지는 합성펩타이드)가 공지되어 있으나, 현재까지 왕귀뚜라미로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이들의 신규 용도에 대한 연구는 이루어져 있지 않은 실정이다.

한국등록특허 제10-0625875호 (발명의 명칭 : 아스퍼질러스 니듈란스로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 출원인 : 학교법인조선대학교, 등록일 : 2006년09월12일) 한국등록특허 제10-0964136호 (발명의 명칭 : 울도하늘소유충으로부터 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드 유전자 및 항균 또는 항진균 활성을 가지는 합성펩타이드, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2010년06월09일)

본 발명의 목적은 그람 음성균, 그람 양성균 및 진균으로 유도되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 왕귀뚜라미로부터 분리된 항균 펩타이드 테레오그릴루신 1의 아미노산 서열 및 그의 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 왕귀뚜라미(Teleogryllus emma)로부터 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드의 유전자에서 합성된 하기 서열번호 1로 표현되는 펩타이드에 관한 것이다.

서열번호 1: VKWKRLNNNKVLQKIYFVKI-NH₂

상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상에 대하여 항균 활성을 나타낼 수 있다. 또는 상기 펩타이드는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항진균 활성을 나타낼 수 있다.

상기 펩타이드는 렛의 적혈구 세포에 대해 무독성인 것이 특징이다.

본 발명은 상기와 같은 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균 제제용 약학적 조성물, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 장염 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 식중독 또는 장염은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상을 원인균으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 왕귀뚜라미(Teleogryllus emma)로부터 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드의 유전자에서 합성된 서열번호 1로 표현되는 펩타이드에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 서열번호 1과 동일한 서열을 갖는 왕귀뚜라미로부터 직접 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드에 관한 것일 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1과 동일한 서열을 갖는 왕귀뚜라미로부터 직접 분리한 항균 또는 항진균 펩타이드에 관한 것일 수 있으며, 이때의 펩타이드는 카르복실 말단이 -NH₂ 형태 또는 -OH 형태일 수도 있다.

본 발명에서는 상기 왕귀뚜라미 유래 펩타이드 유전자를 확인하기 위해 먼저 왕귀뚜라미를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 왕귀뚜라미의 RNA 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인하며, 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산(펩타이드)의 서열을 바탕으로 기존의 밝혀진 항균 펩타이드의 성질을 이용하여 항균 또는 항진균 활성을 나타내는 펩타이드로 추정되는 유니진을 선별할 수 있다.

상기 펩타이드의 아미노산 서열은 VKWKRLNNNKVLQKIYFVKI-NH₂로 20개 아미노산으로 구성되며 이를 테레오그릴루신 1(Teleogryllusine 1)로 명명한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항진균 제제용 약학적 조성물, 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.

보다 구체적으로 설명하면, 상기 테레오그릴루신 1 펩타이드는, 항균 활성 대상균으로 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157), 항진균 활성 대상균으로 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 RDA assay(radial diffusion assay)에서 항균 또는 항진균 활성을 나타낸다(도 1 참조).

또한, 적혈구 세포 파괴능 확인 실험에서, 항진균 또는 항균 효과가 우수하다고 알려진 벌독인 멜리틴이 세포독성이 매우 높게 나타나는 반면, 본 발명의 신규 테레오그릴루신 1 펩타이드는 세포독성이 거의 없는 것으로 확인된다(표 2 참조). 즉, 상기 펩타이드는 렛의 적혈구 세포에 독성이 미미함을 특징으로 한다.

이처럼 본 발명의 신규 테레오그릴루신 1 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항진균 및 항균 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없는 것으로 나타나기 때문에, 안전한 항균제나 항진균제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 테레오그릴루신 1 펩타이드를 함유하는 약학적 조성물은 또한 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 펩타이드 또는 이를 함유하는 조성물은 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드 또는 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규 펩타이드를 함유하는 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명은 상기 신규 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제를 제공한다. 이때, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 또는 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품 방부제, 화장품 또는 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

본 발명의 신규 테레오그릴루신 1 펩타이드는 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이 항균 또는 항진균 활성을 나타내고 독성이 미미하므로 식품의 방부제, 화장품 또는 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 장염 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157)에 대한 항진균 효과가 있기 때문에, 상기 식중독 또는 장염은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상을 원인균으로 한다.

본 발명은 왕귀뚜라미로부터 유래한 항균 펩타이드 테레오그릴루신 1 및 그의 조성물에 관한 것으로서, 상기 항균 펩타이드는 세포 독성이 거의 없고 탁월한 항균 또는 항진균 활성을 나타내므로 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등으로 제공될 수 있다.

도 1은 왕귀뚜라미로부터 유래한 본 발명의 신규한 테레오그릴루신 1 펩타이드의 항균 및 항진균 활성을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 왕귀뚜라미 유래 항균 펩타이드 유전자 선발>

왕귀뚜라미로부터 항균 또는 항진균 활성을 나타내는 펩타이드 유전자를 확인하기 위해 먼저 왕귀뚜라미를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하였고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 왕귀뚜라미 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인하였으며 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 기존의 항균 펩타이드 성질을 바탕으로 유니진 전체를 filtration 하였으며 그 결과 새로운 항균 펩타이드로 추정되는 유전자를 선발하였다. 선별된 아미노산 서열은 VKWKRLNNNKVLQKIYFVKI-NH₂으로 20개 아미노산으로 구성되었으며 테레오그릴루신 1(Teleogryllusine 1)로 명명하였다(표 1).

펩타이드	아미노산 서열
테레오그릴루신 1	VKWKRLNNNKVLQKIYFVKI-NH₂

<실시예 2. 테레오그릴루신 1 합성 및 분리정제>

상기 실시예 1의 왕귀뚜라미로부터 유래하는 테레오그릴루신 1 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다.

먼저, 테레오그릴루신 1 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)을 사용하여 펩타이드를 제조하였다. 상기 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-아미노 그룹(amino group)의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장(elongation)은 DCC(N-hydroxybenzo-triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide)법에 의하였다.

각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다.

여기에 TFA(trifluoroacetic acid):phenol:thioanisole:H₂O:triisop ropylsilane(85:5:5:2.5:2.5, v:v:v:v:v) 혼합용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC 컬럼(reverse phase-HPLC column, Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μm, 19.0mm×30mm, Waters)을 이용하여 정제하였다.

합성 펩타이드를 6N HCl로 110℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02N HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다.

그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실시예 3. 테레오그릴루신 1 항균 펩타이드의 병원성 미생물에 대한 항균 활성 조사>

테레오그릴루신 1 펩타이드에 대한 항균 활성을 조사하기 위해 RDA(radial diffusion assay)를 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴(Melittin)을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

실시예 3-1. 항균 활성 측정

항균 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 병원성 세균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157)를 3 %(w/v) TSB(trypticase soy broth)에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4×10⁶ CFU(colony forming units)/㎖ 농도가 되도록 2시간 30분간 2차 배양하였다.

그 후 시트레이트 포스페이트 버퍼(Citrate phosphate buffer; 9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH 7.4)와 1%(w/v) typeⅠ(low electroendosmosis) 아가로스, 0.03%(w/v) TSB로 구성된 멸균된 언더레이 겔(underlay gel)에다 배양된 세균(4×10⁶colony forming units/㎖)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 붓고, 언더레이 겔이 굳으면 지름 3mm의 구멍을 내어 농도별 펩타이드(peptide)를 5㎕ 씩 구멍에 넣었다.

펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, 오버레이 겔(Overlay gel; 6 % TSB, 1 % agarose) 10㎖을 붓고 37℃에서 다시 배양하여 클리어 존(CLEAR ZONE)의 형성 여부를 확인하였으며 얻어진 결과는 도 1에 나타내었다.

실시예 3-2. 항진균 활성 측정

항균 펩타이드의 항진균 활성의 측정에는 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 YPD 배지(1%(w/v) yeast extract, 2%(w/v) peptone, 2%(w/v) dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 밤새 키운 후, 이를 새 배지에 접종하여 2시간 키워 대수기가 되도록 하였다.

그 후 Citrate phosphate buffer(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.4)와 1%(w/v) type agarose(low electroendosmosis), 0.03% TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에다 배양된 세균(4×10⁶colony forming units/㎖)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 붓고, underlay gel이 굳으면 지름 3mm의 구멍을 내어 농도별 펩타이드(peptide)를 5㎕씩 구멍에 넣었다.

펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, Overlay gel( 6 % TSB, 1 % agarose) 10㎖을 붓고 37℃에서 다시 배양하여 클리어 존(CLEAR ZONE)의 형성 여부를 확인하였으며 얻어진 결과는 도 1에 나타내었다.

실시예 3-3. 항균 활성 결과

도 1에 나타있듯이, 테레오그릴루신 1 펩타이드는 음성균과 양성균에 대한 활성이 있음을 확인하였으며 이는 농도의존적으로 증가함을 알 수 있다. 이는 기존의 유해균주에 대한 치료제로서의 가능성이 있음을 보여준다. 그러나 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴과 비교하였을 때 음성균 양성균 모두 멜리틴보다는 낮은 활성을 보인다.

실시예 3-4. 항진균 활성결과

도 1에 나타나 있듯이, 테레오그릴루신 1 펩타이드의 항진균 활성 측정의 결과 클리어 존(CLEAR ZONE)이 형성됨을 확인하였으며 음성균 양성균과 마찬가지로 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인된다. 하지만 대조군으로 사용된 강력한 항진균제인 멜리틴보다는 낮은 항진균 활성을 나타낸다.

<실시예 4. 테레오그릴루신 1 펩타이드의 렛 적혈구 세포에 대한 세포 독성 측정>

렛(Rat) 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다.

적혈구 세포(Rat erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액(PBS, pH 7.4)으로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액(PBS, pH 7.4)으로 희석하여, 5.0%의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 후, 5.0% 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주한 후에 항균 펩타이드의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다. 이어서 모든 튜브에 총액의 양이 200㎕가 되도록 인산-염화나트륨 완충액(PBS, pH 7.4)을 넣어주고, 37℃ 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 96웰 플레이트로 옮겼다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 550nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1%(w/v) 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100% 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 이에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[수학식 1]

% 파괴능 = (펩타이드를 처리한 용액의 흡광도 550nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 550nm)/(트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도 550nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 550nm) × 100

조건	% 렛 적혈구 파괴능^a(㎍/㎖)
조건	0	12.5	25	50	100	200
테레오그릴루신 1	0	1.3	1.5	1.0	1.07	0.7
멜리틴	0	75.8	83.1	89.8	88.3	91.4
[주] a:세포 독성은 적혈구 세포에 대한 항균 펩타이드의 파괴능으로 측정

상기 표 2에 나타나 있듯이, 테레오그릴루신 1 펩타이드는 적혈구 세포의 파괴능이 거의 없음이 확인된다. 그에 비해 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴의 경우에는 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타냄을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명에서 발견된 항균 펩타이드는 세포 독성이 없으며 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내므로 안전한 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품으로 사용가능함을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> An anti-microbial peptide, Teleogryllusine 1 isolated from Teleogryllus emma and its synthetic composition <130> 0265 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Teleogryllus emma <400> 1 Val Lys Trp Lys Arg Leu Asn Asn Asn Lys Val Leu Gln Lys Ile Tyr 1 5 10 15 Phe Val Lys Ile 20

Claims

왕귀뚜라미(Teleogryllus emma)로부터 유래된 하기 서열번호 1로 이루어진 항균 또는 항진균 펩타이드.
서열번호 1: VKWKRLNNNKVLQKIYFVKI-NH₂
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 대장균 0-157(Escherichia coli 0-157) 중 어느 하나 이상에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 렛 적혈구 세포에 대해 무해한 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 제제용 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항생제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 방부제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 보존제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 의약품 보존제.
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