ES2607460T3 - Nueva inmunoterapia contra varios tumores incluidos tumores neuronales y cerebrales - Google Patents

Abstract

Péptido consistente en la secuencia LTFGDVVAV (SEQ ID N.º 10).

Description

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La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de esta invención se ensamblan con fragmentos de ADNc y oligonucleótidos cortos de enlace, o con una serie de oligonucleótidos, que dan como resultado un gen sintético capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores procedentes de un operón microbiano o vírico.

El término «producto de expresión» define el polipéptido o la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.

El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, exento de materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes corriente abajo (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.

El término «marco de lectura abierto (ORF)» designa una serie de tripletes que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación y que forman una secuencia (potencialmente) traducible en proteína.

El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero ese mismo polinucleótido o polipéptido lo estará si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleótidos podrán formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrán formar parte de una composición, y seguir estando aislados en dicho vector o composición puesto que estos no forman parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.

Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en “forma enriquecida”. Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente del 0,01% en peso, y preferiblemente de al menos 0,1% aproximadamente en peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.

El término «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria (es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra −solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado− a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.

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inmunógenos e inmunogénicos acorde con la presente invención.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación. En lo que respecta a los linfocitos T cooperadores restringidos a las MHC de clase II, las funciones efectoras pueden consistir en la secreción inducida por el péptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-2, o la desgranulación inducida por el péptido. Las posibles funciones efectoras de los CTL y de los linfocitos T cooperadores no se limitan a esta lista.

Preferiblemente, cuando los CTL específicos para un péptido de las SEQ ID N.º 1 a 25 se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 µM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 pM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los CTL de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.

Así pues, los epítopos de la presente invención pueden ser idénticos a epítopos asociados a tumor que aparecen de forma natural o a epítopos específicos de tumor.

La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para desencadenas una respuesta inmunitaria que es específica contra los antígenos expresados en la superficie de células tumorales y que a través de este mecanismo de acción sea capaz de inducir la regresión, paralice o frene el crecimiento del tumor. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y de destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). A partir del análisis de 415 especímenes de pacientes aquejados de cáncer colorrectal, Galon et al. fueron capaces de demostrar que el tipo, la densidad y la localización de las células inmunitarias en el tejido tumoral son realmente mejores predictores de la supervivencia del paciente que la ampliamente utilizada estadificación TNM de los tumores (Galon et al., 2006).

Las moléculas MHC de clase I presentan péptidos procedentes de la proteólisis de proteínas endógenas, DRiP y péptidos grandes. Las moléculas de MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan predominantemente péptidos de proteínas exógenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y después son procesadas por las mismas (Cresswell, 1994). Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T colaboradores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes en una relación estequiométrica de

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Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003).Inicialmente, la sensibilización y la expansión de los CTL en los ganglios linfáticos está sustentada por los linfocitos T CD4+ (Schoenberger et al., 1998).Así pues, un mecanismo podría ser el direccionamiento de los linfocitos CD8+ vírgenes hacia el lugar donde tiene lugar la interacción funcional entre los linfocitos T CD4+ y las APC (Castellino et al., 2006).Por último, la generación de los linfocitos CD8+ de memoria funcionales depende casi siempre de la asistencia de los linfocitos T CD4+ (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003).Por todas esas razones, la identificación de epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003).

Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL

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(Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) y que atrae a las células efectoras, como por ejemplo los propios CTL, células NK, macrófagos y granulocitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).

En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer se ha descubierto con sorpresa que las células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006).

En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogenia mediante la secreción de interferón gamma (IFN-γ) (Qin and Blankenstein, 2000). También ha sido propuesta la destrucción directa de las células tumorales por los linfocitos T CD4+ citotóxicos a través de linfotoxinas y granzima B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).

Además se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante la inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II (Kennedy et al., 2003).

A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) es pequeño.

Dado que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las células del sistema inmunitario (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epítopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, esto es, los epítopos, pueden ser moléculas derivadas de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. que son expresados y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.

La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005):

1.

Antígenos cáncer-testículo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase (van der Bruggen et al., 1991), que inicialmente se denominó antígenos cáncer-testículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y, por tanto, se consideran como específicos de tumor desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.

2.

Antígenos de diferenciación: Estos TAA están presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son específicas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata.

3.

TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.

4.

Antígenos específicos de tumor: Estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como βcatenina, CDK4, etc.) Algunos de esos cambios moleculares están relacionados con la transformación neoplásica y/o su progresión. Los antígenos específicos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.

5.

TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de proteínas que no son específicas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a raíz de patrones de glucosilación alterados que generan epítopos nuevos en tumores como MUC1 o fenómenos como el ayuste de proteínas durante la degradación que en algunos casos pueden ser específicos de tumor (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).

6.

Proteínas de oncovirus: Estos TAA son proteínas virales que podrían desempeñar un papel crítico en el proceso oncogénico y que, como extrañas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una

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posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como por ejemplo la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos pueden tenerse en

5 cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

Los péptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Estos pueden ser utilizados como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra

10 aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

Además se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

La Tabla 1 muestra los péptidos descritos, de las cuales la SEQ ID N.º 10 es acorde con la presente invención, sus

15 respectivas SEQ ID N.º, los alelos HLA a los que se unen cada uno de ellos y las proteínas originarias de las que pueden surgir tales péptidos. Reviste especial interés que el péptido conforme a la SEQ ID N.º 1 se una tanto a HLA-DR como a HLA-A*02, con lo que puede desencadenar dos respuestas distintas.

Tabla 1: Péptidos (SEQ ID N.º 10 acorde con la presente invención)

SEQ ID N.º

Código del péptido Secuencia Alelos HLA Proteína(s) originaria(s)

1

CSP-001 TMLARLASA HLA-A*02 CSPG4

2

ACS-001 KIMERIQEV HLA-A*02 ACSBG1

3

BCA-001 FLGDPPEKL HLA-A*02 BCAN

4

BCA-002 ALWAWPSEL HLA-A*02 BCAN

5

CHI3L1-010 TLYGMLNTL HLA-A*02 CHI3L1

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CLIP2-001 SLNELRVLL HLA-A*02 CLIP2

7

SLCO1C1-001 YLIAGIISL HLA-A*02 SLCO1C1

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DTNA-001 KLQDEAYQV HLA-A*02 DTNA

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EGFR-007 ALAVLSNYDA HLA-A*02 EGFR

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FABP7-001 LTFGDVVAV HLA-A*02 FABP7

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GFAP-001 NLAQDLATV HLA-A*02 GFAP

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GPR56-002 FLLSEPVAL HLA-A*02 GPR56

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GRI-001 NILEQIVSV HLA-A*02 GRIA4

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IGF2BP3-001 KIQEILTQV HLA-A*02 IGF2BP3

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MLC-001 SVVEVIAGI HLA-A*02 MLC1

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NES-001 GLQSQIAQV HLA-A*02 NES

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NES-002 SLQENLESL HLA-A*02 NES

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NES-003 FLFPGTENQEL HLA-A*02 NES

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NES-004 NLAEELEGV HLA-A*02 NES

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NLGN4X-001 NLDTLMTYV HLA-A*02 NLGN4X

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NR2E1-001 KIISEIQAL HLA-A*02 NR2E1

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NRCAM-001 GLWHHQTEV HLA-A*02 NRCAM

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PDPN-001 TLVGIIVGV HLA-A*02 PDPN

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TNC-001 AMTQLLAGV HLA-A*02 TNC

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TNC-002 QLLAGVFLA HLA-A*02 TNC

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BIR-002 TLGEFLKLDRERAKN HLA-DR y HLA-A*02 BIRC5

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Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4)

El CSPG4 (proteoglucano sulfato de condroitina) es un proteoglucano integral de membrana presente en los pericitos nacientes que cumple un papel funcional en la neovascularización (Ozerdem, 2006). Durante la embriogenia, el proteoglucano CSPG4 se expresa en los capilares inmaduros, pero a medida que estos vasos maduran la expresión se pierde. Es conocido por ser un marcador superficial de progresión precoz del melanoma, implicado en la estimulación de la proliferación, la migración y la invasión de las células tumorales. El CSPG4 se expresa intensamente en >90% de las lesiones de melanoma humano. Aunque el CSPG4 no es estrictamente específico de tumor, las respuestas de los linfocitos T CD4+ reactivos a tumores en pacientes con melanoma y en individuos sanos reconocen el CSPG4693-709 en células de melanoma que expresan el HLA-DR11 en ausencia de autoinmunidad (Erfurt et al., 2007).

La expresión del CSPG4 potencia la diseminación de las células mediada por integrinas, la fosforilación de FAK (cinasa de adhesión focal) y la activación de ERK1/2 (cinasa regulada por señal extracelular) (Yang et al., 2004). Asimismo, existen cada vez más indicios procedentes de datos in vitro de que el CSPG4 desempeña un importante papel en la angiogenia tumoral. Así pues, en los tumores positivos para CSPG4 se ha observado una tasa de neovascularización y volúmenes vasculares notablemente elevados, y se ha comprobado que el CSPG4 secuestra la angiostatina, cosa que normalmente inhibe la proliferación de las células endoteliales y la angiogenia. Los vasos inmaduros también contienen pericitos positivos para CSPG4, lo cual apunta a la intervención de esta población celular en la modulación de la proliferación de las células endoteliales por medio del bloqueo de los efectos inhibitorios de la angiostatina durante el desarrollo de los vasos (Chekenya et al., 2002b).

La expresión de CSPG4 también ha sido descrita en otros tejidos normales aparte de los pericitos activados, tales como las células endoteliales, condrocitos, miocitos lisos, ciertos queratinocitos basales de la epidermis, así como en células del folículo piloso (Campoli et al., 2004).

En el curso de la angiogenia y como respuesta a patologías del SNC, las células de alta motilidad que expresan el CSPG4 sufren rápidos cambios morfológicos y son reclutadas en puntos donde está teniendo lugar crecimiento y reparación vascular. El CSPG4 se sobreexpresa tanto en las células tumorales como en los pericitos de los vasos sanguíneos de tumores cerebrales malignos (Chekenya and Pilkington, 2001). Con la implantación de células procedentes de una estirpe celular humana de glioma positiva para CSPG4 en cerebros de ratas atímicas inmunodeficientes se pudo demostrar que estos tumores presentan una densidad microvascular superior a la de las ratas control, lo cual implica que la expresión del CSPG4 regula tanto la función como la estructura de la vasculatura tumoral derivada del hospedador (Brekke et al., 2006). En un experimento de xenoinjerto consistente en implantar material biópsico de glioblastoma a ratas atímicas, el CSPG4 se identificó como asociado principalmente a los vasos sanguíneos tanto en los pericitos como en los componentes de la membrana basal de la vasculatura tumoral y su expresión también estuvo asociada con zonas de elevada proliferación celular (Chekenya et al., 2002a). Además, la expresión del CSPG4 corrió paralela a la progresión del tumor en un modelo de implantación de glioma (Wiranowska et al., 2006). La progresión maligna se mantiene por la intercomunicación entre el tumor y su estroma, por la cual el estroma activado nutre a las células neoplásicas proliferativas e invasivas, aportando nueva vasculatura, componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento estimuladores. En ese contexto, el CSPG4 desempeña un papel importante en la activación del tumor-estroma a través de alteraciones en la adhesión, migración y proliferación celulares y en la morfogenia vascular (Chekenya and Immervoll, 2007).

El CSPG4 se expresa diferencialmente en los gliomas humanos, con mayor expresión en los gliomas de alto grado que en los de bajo (Chekenya et al., 1999). La elevada expresión del CSPG4 aparece correlacionada con la multirresistencia farmacológica mediada por el aumento de la activación de la vía de señalización de la 31integrina/PI3K y sus dianas ulteriores, que promueve la supervivencia de la célula (Chekenya et al., 2008).

CSP-001 ha sido hallado en los siguientes órganos y tejidos y tipos de cáncer:

Cerebro: -glioblastoma;

-glioblastoma secundario (derivado de astrocitoma)

Colon: -adenocarcinoma (excluido el tipo mucinoso), primario;

Recto: -adenocarcinoma, metástasis

Estómago: -adenocarcinoma (excluido el tipo con células en anillo de sello), primario

Riñón: -carcinoma de células renales, estirpe celular;

-carcinoma de células renales, tipo de células claras, metástasis, todos los focos secundarios; -carcinoma de células renales, tipo de células claras, primario; carcinoma de células renales, primario

Pulmón: -adenocarcinoma, primario:

-carcinoma adenoescamoso, primario;

-cáncer primario;

-carcinoma microcítico, primario;

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EGFR en suero indican una supervivencia reducida (Quaranta et al., 2007). Asimismo, se ha demostrado que las personas afectadas por astrocitomas de alto grado que disfrutan de una supervivencia dilatada son negativas para el EGFRvIII (Liang et al., 2008).

Notch-1 regula al alza la expresión del EGFR y se hallan correlaciones entre los niveles de EGFR y el ARNm de Notch-1 en el glioma de alto grado primario humano (Purow et al, 2008).

El EGFR en sí mismo está implicado en la activación constitutiva de la cinasa de NH2-terminal c-Jun (JNK), que contribuye a la proliferación, la supervivencia y la oncogenia en algunos tumores, entre ellos los gliomas (Li et al., 2008).

Aunque el EGFRvIII se expresa únicamente en un pequeño porcentaje de las células del glioma, la mayoría de las células exhiben un fenotipo transformado. Se ha demostrado que la expresión del EGFRvIII en células de glioma indolentes estimula la formación de microvesículas relacionadas con las balsas lipídicas que contienen EGFRvIII, las cuales son liberadas en el entorno de la células y pueden fusionarse con las membranas plasmáticas de las células cancerosas que carecen del EGFRvIII causando la transferencia de la actividad oncógena (Al-Nedawi et al., 2008).

Proteína de unión a ácidos grasos 7, cerebro (FABP7)

Las proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) son proteínas citosólicas de 14-15 kDa que supuestamente intervienen en la captación, el transporte y el direccionamiento de los ácidos grasos (AG). Podrían modular la concentración de ácidos grasos y de ese modo influir en la función de enzimas, membranas, canales iónicos y receptores, así como en la expresión génica y el crecimiento y la diferenciación celular. Se pueden diferenciar nueve tipos de FABP según su distribución específica en los tejidos. Si bien la identidad de la secuencia de aminoácidos varía entre el 30% y el 70%, la estructura terciaria de beta-clamp a la cual se une el ácido graso es similar en todas ellas. El tejido nervioso alberga cuatro tipos de FABP, con una distribución espacio-temporal distintiva (Veerkamp and Zimmerman, 2001). La FABP7 se expresa con profusión en el cerebro y en la retina en desarrollo y su expresión disminuye notablemente en el SNC adulto (Godbout et al., 1998). A raíz de resultados obtenidos in vitro, se ha planteado que la FABP7 sería necesaria para el establecimiento del sistema glial radial en el cerebro en desarrollo (Mita et al., 2007). La proteína FABP7 del cerebro normal apenas es detectable pero presenta una expresión moderada o intensa en el núcleo y en el citoplasma en varios glioblastomas multiformes. Las células transfectadas con FABP7 presentan una migración cinco veces mayor que las células de control. Así pues, la supervivencia total más breve asociada con la sobreexpresión de FABP7, especialmente en el glioblastoma, podría deberse al aumento de la migración y la invasión de las células tumorales en el parénquima cerebral circundante (Liang et al., 2005). La translocación nuclear de FABP7 está relacionada específicamente con la amplificación del EGFR y con los tumores más invasivos (Kaloshi et al., 2007). Así pues, la activación del EGFR puede estimular a la FABP7 nuclear y promover así la migración de las células tumorales del glioblastoma (Liang et al., 2006).

También se ha demostrado que la expresión de FABP7 es un marcador del carcinoma de células renales. La expresión de FABP7 se detecta únicamente en los tejidos de carcinoma pero no en las partes no cancerosas de las muestras renales (Teratani et al., 2007). La expresión de FABP7 en el carcinoma de las células renales ha demostrado ser 20 veces mayor en el tumor en comparación con el tejido renal normal (Domoto et al., 2007; Buchner et al., 2007). También se ha demostrado que FABP7 se expresa con frecuencia en el melanoma, donde podría intervenir en la proliferación y la invasión celular (Goto et al., 2006).

Proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP)

GFAP codifica una de las principales proteínas de los filamentos intermedios de los astrocitos maduros. Se usa como marcador para distinguir los astrocitos de otras células gliales durante el desarrollo. Las mutaciones de este gen causan la enfermedad de Alexander, un raro trastorno de los astrocitos del sistema nervioso central. Se ha descrito otra variante de transcripción, pero su secuencia entera no ha sido determinada. Se han descrito niveles elevados en el cerebro de personas autistas, en tanto que el cerebro de personas con depresión grave presentó niveles reducidos de GFAP.

Se analizaron los cerebros de primates que habían desarrollado tumores de novo diez años después de recibir radiación en todo el órgano cerebral. Las células precursoras tumorales evidenciaron atipia celular y mitosis, siendo negativas para los marcadores tumorales GFAP, EGFR y p53 (Lubensky et al., 2006).

En las neoplasias astrocíticas el número de células positivas para GFAP y la intensidad de la tinción fueron directamente proporcionales al grado de malignidad. Los tres casos de oligodendroglioma presentaron una reacción negativa a la GFAP (Reyaz et al., 2005). Los oligodendrogliomas puros son inmunohistológicamente negativos para la GFAP (Mokhtari et al., 2005). Las concentraciones séricas de GFAP en pacientes con glioma de alto grado presentan una correlación lineal con el volumen tumoral (Brommeland et al., 2007). Incluso en los pacientes con glioblastoma se puede detectar una correlación significativa entre el volumen tumoral, el volumen de necrosis tumoral, la cantidad de células necróticas positivas para la GFAP y la concentración sérica de esta proteína (Jung et al., 2007).

Tras el tratamiento de estirpes celulares de glioblastoma con 4-fenilbutirato, un inhibidor de la histona desacetilasa,

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se observaron concentraciones elevadas de la GFAP sin fosforilar, mientras que las isoformas fosforiladas permanecieron intactas (Asklund et al., 2004).

En una estirpe celular de glioblastoma tratada con TGF-alfa, la transcripción del gen GFAP, el nivel de ARNm y la síntesis de la proteína en cuestión descendieron en torno a un 50% (Zhou and Skalli, 2000).

Técnicamente, el promotor de GFAP se usa a menudo como herramienta en modelos de ratón para provocar la expresión de proteínas específicamente en el sistema nervioso.

Los islotes de Langerhans del páncreas están envueltos por células de Schwann perinsulares (pSC) que expresan la GFAP. El ataque autoinmunitario contra elementos tisulares del sistema nervioso del páncreas parece ser parte integral inicial de la diabetes de tipo 1 (Winer et al., 2003). Esta expresión en el páncreas no es reflejada por Immatics ni por los datos de expresión génica externa en la mayoría de los tejidos. Se ha publicado que la GFAP001 es un epítopo contra el cual los diabéticos de tipo 1 y sus parientes no diabéticos que presentan una respuesta humoral contra autoantígenos de la diabetes (riesgo elevado de sufrirla) muestran una reactividad exacerbada de los CTL secretores de granzima B (ELISPOT ex vivo) en comparación con los donantes sanos (Standifer et al., 2006).

Un dato interesante es que parece existir una correlación inversa entre la manifestación de las enfermedades autoinmunitarias, sobre todo de la diabetes, y el riesgo de aparición del glioma (Aronsonand Aronson, 1965; Schlehofer et al., 1999; Brenner et al., 2002; Schwartzbaum et al., 2003; Schwartzbaum et al., 2005).

Receptor acoplado a proteína G, 56 (GPR56)

GPR56 es un receptor acoplado a proteína G atípico (GPCR) por estar dotado de una región extracelular N-terminal inusualmente grande, que contiene una larga región rica en Ser/Thr que forma un pedúnculo similar al de la mucina y, debido a este rasgo, se cree que puede intervenir en las interacciones entre células y entre la célula y la matriz. Esto, sumado al elevado nivel de expresión del ARNm y a la amplia distribución de este receptor, ha llevado a plantear su posible papel en los procesos de interacción entre las células (Liu et al., 1999). GPR56 pertenece al GPCR de la familia de las secretinas que intervienen en el desarrollo de las células progenitoras neurales y ha sido vinculado con malformaciones del cerebro humano durante el desarrollo. La expresión elevada de GPR56 aparece relacionada con los fenotipos de transformación celular de varios tejidos cancerosos en contraste con sus homólogos normales, lo cual denota una función potencialmente oncógena. El silenciamiento del GPR56 mediante ARN de interferencia desencadena la apoptosis y reduce el crecimiento independiente de la fijación de las células cancerosas a través del aumento del anoikis. El silenciamiento de GPR56 también reduce la adhesión celular con la matriz extracelular (Ke et al., 2007). La regulación al alza de GPR56 ha sido demostrada en el glioblastoma multiforme con genómica funcional. Los estudios de inmunohistoquímica han confirmado la expresión de GPR56 en la mayoría de muestras tumorales de glioblastoma/astrocitoma, frente a niveles indetectables de expresión en el cerebro adulto normal (Shashidhar et al., 2005). En las células cancerosas pancreáticas, el ARNm del GPR56 se expresa con profusión mientras que la proteína homónima se halla en niveles ínfimos o es indetectable, lo cual parece indicar que su expresión queda suprimida en dichas células (Huang et al., 2008). Estudios previos sobre la metástasis habían mostrado que el GPR56 aparece notablemente regulado a la baja en variantes altamente metastásicas de una estirpe celular de melanoma humano, de lo que se deduce que su sobreexpresión suprime el crecimiento tumoral y la metástasis. Dicha supresión del crecimiento se cree mediada por la interacción del GPR56 con una transglutaminasa tisular (TG2), un componente abundante en el tejido y el estroma, que ha sido implicado en la supresión de la progresión tumoral (Xu et al., 2006; Xu and Hynes, 2007). Se ha descrito otro efecto inhibidor de GPR56 sobre la migración de las células progenitoras neurales (NPC). GPR56 se expresa con profusión en las NPC y probablemente participe en la regulación del movimiento de las NPC a través de la vía de señalización de Rho y G alfa (12/13), lo cual apunta a un cometido importante de la misma en el desarrollo del sistema nervioso central (Iguchi et al., 2008).

Receptor de glutamato, ionotrópico, AMPA 4 (GRIA4)

Los receptores del glutamato de tipo amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionato (AMPA) o AMPAR intervienen en la neurotransmisión rápida en las sinapsis excitadoras del SNC y están compuestos por subunidades formadas por un conjunto de cuatro proteínas, GluR1 a GluR4 (GRIA4).

Las subunidades GRIA4 se expresan ubicuamente en las células de glioblastoma humanas, operando como AMPAR permeables al Ca2+. Su conversión a receptores impermeables al Ca2+ inhibe la locomoción celular y promueve la apoptosis, mientras que la sobreexpresión de los receptores de AMPA permeables al Ca2+ facilita la migración y la proliferación de las células tumorales. Por consiguiente, los receptores AMPA permeables al Ca2+ parecen tener un papel crucial en el crecimiento del glioblastoma (Ishiuchi et al., 2002).

Proteína 3 de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 (IGF2BP3)

La IGF2BP3 pertenece a la familia de las proteínas de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide-II, implicada en la localización, el recambio y el control traduccional del ARNm. La proteína codificada contiene varios dominios KH, que son importantes para la unión al ARN y se sabe que intervienen en la síntesis y el metabolismo del ARN. Se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario y en ciertos tumores. Por ello, la IGF2BP3 se

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El NR2E1 (TLX) es un factor de transcripción esencial para la proliferación y la autorrenovación de los neurocitoblastos mediante el reclutamiento de las histona desacetilasas (HDAC) hacia los genes diana situados corriente abajo con el fin de reprimir su transcripción, lo que a su vez regula la proliferación de los neurocitoblastos. El reclutamiento de las HDAC conduce a la represión de la transcripción de los genes diana TLX, el inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p21(CIP1/WAF1)(p21) y el gen oncosupresor PTEN (Sun et al., 2007). La subfamilia TLX/HOX11 de genes homeobox divergentes interviene en diversos aspectos de la embriogenia y, en el caso de TLX1/HOX11 y de TLX3/HOX11L2, destacan notablemente como oncogenes en la leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (Dixon et al., 2007). El NR2E1 dirige un programa de desarrollo fundamental de la organización retiniana y controla la generación del número apropiado de progenies retinianas y el desarrollo de los gliocitos durante el prolongado período de la retinogenia (Miyawaki et al., 2004). No se ha hallado información específica referente al glioblastoma.

Molécula de adhesión celular neuronal (NRCAM)

La NRCAM humana (Molécula de adhesión celular relacionada con la neuroglía) aparece sobreexpresada en el tejido de glioblastoma multiforme (GMT) con respecto al tejido cerebral normal. La NRCAM es descrita como una proteína transmembrana de tipo I de un solo paso que interacciona con la anquirina. La neutralización con hNRCAM antisentido causó la reducción de la expresión de la hNRCAM natural, cambios en la morfología celular, redujo el ritmo de proliferación celular y prolongó el ciclo celular. Además, la sobreexpresión de las hNRCAM antisentido en dichas células causó un acusado descenso del número de colonias en agar blando y la invasión a través del gel de la matriz extracelular en condiciones in vitro. La inyección subcutánea a ratones atímicos de células de glioblastoma que sobreexpresaban las hNRCAM antisentido causó la completa inhibición de la formación de tumores en contraste con las células transfectadas únicamente con el vector. La inoculación en el seno del tumor de un plásmido que expresaba hNRCAM antisentido también ralentizó el crecimiento tumoral en ratones atímicos en condiciones in vivo (Sehgal et al., 1999). El análisis por RT-PCR específico del gen indicó que la hNRCAM aparece sobreexpresada en los tejidos tumorales de glioblastoma, gliomas y astrocitomas de alto grado en comparación con el tejido cerebral normal (Sehgal et al., 1998). La NRCAM, una molécula de adhesión intercelular perteneciente a la familia de las moléculas de adhesión celular similares a las inmunoglobulinas, conocida por su función en el crecimiento y la orientación de las ramificaciones neuronales, ha sido identificada recientemente como un gen diana de la señalización de la beta-catenina en células y tejidos de melanoma y de carcinoma de colon humanos. La transducción de la NRCAM en fibroblastos a través de retrovirus estimula la motilidad celular y la oncogenia (Conacci-Sorrell et al., 2005). El fomento de la transcripción de la NRCAM a través de la beta-catenina o de la plakoglobina desempeña un papel en la oncogenia del melanoma y del cáncer de colon, probablemente al promover el crecimiento y la motilidad de las células (Conacci-Sorrell et al., 2002). Otras dianas de la vía de señalización de la beta-catenina también aparecen reguladas al alza, como es el caso de MYC (Liu et al., 2008). La NRCAM aparece sobreexpresada en los carcinomas papilares de tiroides humanos a nivel del ARNm y de la proteína, en cualquiera de los estadios tumorales (Gorka et al., 2007).

La sobreexpresión del ARNm de la NRCAM en los tumores está relacionada con altos índices de proliferación y se asoció a un desenlace negativo en ependimomas (Zangen et al., 2007).

Podoplanina (PDPN)

La PDPN es una glucoproteína integral de membrana de tipo I similar a la mucina que presenta una distribución diversa en los tejidos humanos. Interviene en la migración, la invasión y la metástasis de las células cancerosas, así como en la progresión maligna y está implicada en la agregación plaquetaria. CLEC-2 es el primer receptor fisiopatológico de la podoplanina descubierto (Kato et al., 2008). Se estudió una serie de 115 glioblastomas mediante técnicas de inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-PDPN. El 47% de ellos expresaban la PDPN en células de la superficie, sobre todo alrededor de las zonas necróticas y en las células endoteliales en proliferación. Asimismo, la expresión del ARNm y de la proteína de la PDPN resultaron notablemente superiores en el glioblastoma que en los astrocitomas anaplásicos, lo cual parece indicar que la expresión de dicha proteína podría estar relacionada con la malignidad de los astrocitos (Mishima et al., 2006). En otros análisis, la PDPN también ha sido hallada expresada en el 82,9% de una serie de glioblastomas (29/35) (Shibahara et al., 2006). En otro estudio que investigó la expresión de la PDPN y la actividad estimuladora de la agregación plaquetaria por parte de estirpes celulares de glioblastoma, la estirpe LN319 expresó con profusión la PDPN y fomentó la agregación. El NZ-1, un anticuerpo anti-PDPN altamente reactivo, neutralizó la agregación plaquetaria facilitada por la LN319, lo cual apunta a que la PDPN sería el principal determinante de la agregación estimulada por la misma (Kato et al., 2006). Los niveles de expresión génica de la PDPN fueron notablemente mayores en los glioblastomas que en la sustancia blanca no neoplásica, extremo confirmado por técnicas inmunohistoquímicas (Scrideli et al., 2008). La PDPN se expresa específicamente en las células endoteliales linfáticas pero no en las del endotelio vascular sanguíneo en cultivo y en la linfangiogenia tumoral. Si bien la PDPN parece estar básicamente ausente en la epidermis humana normal, su expresión resultó muy intensa en 22 de 28 carcinomas espinocelulares, lo cual parece indicar su implicación en la progresión tumoral (Schacht et al., 2005). La PDPN aparece regulada al alza en el frente invasor de ciertos carcinomas humanos. El análisis de la expresión de la PDPN en células de cáncer de mama humano cultivadas, en un modelo murino de carcinogenia de las células beta pancreáticas, y en biopsias tumorales humanas indica que la PDPN promueve la invasión de las células tumorales en condiciones in vitro e in vivo. La PDPN induce la migración colectiva de las células por medio de la formación de filopodios a través de la regulación a la baja de las

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en los gliomas cerebrales podría desempeñar un papel importante en la proliferación maligna, los mecanismos antiapoptósicos y la angiogenia (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006b). Se han realizado diversos análisis para estudiar la expresión de la survivina y su repercusión en la supervivencia en el marco del glioblastoma. En resumen, la expresión de la survivina, sobre todo la expresión simultánea en el núcleo y el citoplasma en los tumores astrocíticos apareció relacionada significativamente con el grado de malignidad (con la mayor expresión de survivina en el glioblastoma) y con tiempos de supervivencia global más cortos que los pacientes con tumores negativos para la survivina (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).La sobreexpresión de la survivina también se ha descrito en otros tipos de tumores. En el cáncer de mama, la expresión de la survivina aparece asociada con un grado mayor y menor supervivencia sin progresión (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). En estirpes celulares de cáncer de esófago, la actividad promotora de la survivina ha resultado ser 28,5 veces más elevada que en los tejidos normales (Sato et al., 2006). La expresión de la survivina en el cáncer colorrectal también está relacionada con el grado patológico y la metástasis ganglionar (Tan et al., 2005). También se ha demostrado que la agresividad del carcinoma de células renales claras está relacionada con la expresión de la survivina. Asimismo, su expresión está inversamente relacionada con la supervivencia dependiente específicamente del cáncer (Kosari et al., 2005). La expresión de la survivina se puede detectar en un conjunto de neoplasias queratinocíticas y lesiones cutáneas hiperproliferativas pero no en la piel normal (Bowen et al., 2004). En estirpes celulares de cáncer de páncreas, la survivina aparecía amplificada en el 58% de las estirpes celulares estudiadas (Mahlamaki et al., 2002). En el carcinoma epidermoide, la expresión de la survivina puede ayudar a identificar los casos con un fenotipo clínico más agresivo e invasivo (Lo et al., 2001).

Las posibilidades que ofrece la survivina como diana en el tratamiento contra el cáncer ha propiciado la realización de estudios con péptidos derivados de la misma en los cuales ha demostrado su inmunogenicidad en pacientes oncológicos al desencadenar respuestas mediadas por los linfocitos T CD8+. Asimismo, la survivina estimuló de forma específica la reactividad de los linfocitos T CD4+ en linfocitos de sangre periférica de los mismos pacientes (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).

La survivina (SVN, BIRC) se sobreexpresa en multitud de tipos de cáncer distintos. Por lo que en general su sobreexpresión se considera vinculada con una menor supervivencia global y mayor grado de malignidad.

La presente invención describe además proteínas marcadoras concretas que pueden ser utilizadas para el pronóstico del glioblastoma. Y además, el uso de estas nuevas dianas para el tratamiento del cáncer.

Tal y como se muestra en la presente memoria, las proteínas GFAP, FABP7, DTNA, NR2E1, SLCO1C1, CHI3L1, ACSBG1, IGF2BP3, NLGN4X, MLC1, NRCAM, BCAN, EGFR, PDPN, NES y CLIP2 aparecen intensamente sobreexpresadas en los glioblastomas en comparación con el cerebro normal y con otros tejidos vitales (p. ej. hígado, riñón o corazón). Se ha demostrado que las proteínas GRP56, CSPG4, NRCAM, TNC, BIRC5, CLIP2, NES, PDPN, EGFR, BCAN y GRIA4 tienen una importante función en la oncogenia puesto que intervienen en la transformación maligna, el crecimiento y la proliferación celular, la angiogenia o la invasión del tejido normal.

Las proteínas NES, TNC, BIRC5 y EGFR están relacionadas con oncocitoblastos o con nichos de citoblastos en el glioblastoma. Las células madre cancerosas son una subpoblación de células tumorales dotada del potencial de autorrenovación necesario para el crecimiento sostenido del tumor. Estas células residen en estructuras especializadas y altamente organizadas, llamadas nichos de células madre cancerosas que son necesarias para el mantenimiento del potencial de autorrenovación de las células madre cancerosas. Se ha demostrado que la sobreexpresión de las proteínas BIRC5, NRCAM y IGF2BP3 en los tumores está relacionada con estadios avanzados de la enfermedad y con un pronóstico negativo para los pacientes.

Se ha demostrado que BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN desempeñan un papel importante en la remodelación de los tejidos necesaria para el crecimiento del tumor en el sistema nervioso. Así pues, la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN puede ser utilizada como marcador para distinguir el glioblastoma de otras formas de cáncer.

En consecuencia, se describen métodos para identificar un animal, preferentemente un ser humano que es probable que padezca un glioblastoma. En una forma de realización, la probabilidad determinada varía entre el 80% y el 100%. Tal método comprende la determinación del nivel de al menos una de las proteínas BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN en una muestra tumoral del sujeto animal. En una forma de realización, la muestra se obtiene por cirugía radical. En otra forma de realización, la muestra se obtiene mediante biopsia por punción.

Cuando el nivel determinado de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN indica que están regulados al alza en el 20% o más de las células respecto al determinado en células epiteliales benignas del mismo individuo, se considera que el sujeto animal probablemente tenga un glioblastoma.

Cuantas más proteínas del grupo estén reguladas al alza, a saber, BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN, más alta será la probabilidad de que el sujeto animal esté afectado por un glioblastoma.

En una forma de realización, la determinación del nivel de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN

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NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN, peor será el pronóstico para el paciente.

Los métodos de diagnóstico y pronóstico descritos implican el uso de métodos conocidos, p. ej., métodos a base de anticuerpos para detectar polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN y métodos basados en la hibridación y/o la amplificación de ácidos nucleicos para detectar el ARNm de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN.

Además, como la destrucción rápida de las células tumorales provoca a menudo la generación de autoanticuerpos, los marcadores tumorales de glioblastoma de la invención pueden ser usados en ensayos serológicos (p. ej., en una prueba de ELISA con el suero del sujeto) para detectar autoanticuerpos contra BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN en un sujeto. Los niveles de autoanticuerpos específicos contra los polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN que sean al menos unas 3 veces mayores (y preferiblemente al menos 5 o 7 veces mayores, o más preferiblemente al menos 10 o 20 veces mayores) que una muestra de control serán indicativos de glioblastoma.

Los polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN localizados en la superficie celular, en el interior de la célula o secretados pueden ser empleados para el análisis de biopsias, p. ej. muestras de tejido o de células (incluidas células obtenidas de muestras de líquido como el líquido de la cavidad peritoneal) para identificar una biopsia tisular o celular como portadora de células de glioblastoma. La biopsia puede ser analizada como un tejido intacto o como una muestra celular íntegra, o la muestra de tejido o de células puede ser disgregada y/o solubilizada si el tipo de prueba diagnóstica así lo exige. Por ejemplo, las biopsias o las muestras pueden ser sometidas a un análisis del tejido entero o de las células íntegras para determinar los niveles de polipéptidos o de ARNm de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN in situ, p. ej. mediante inmunohistoquímica, hibridación de ARNm in situ o RT-PCR in situ. La persona versada en la técnica sabrá cómo procesar los tejidos o células para el análisis de los niveles de polipéptidos o de ARNm con métodos inmunológicos como ELISA, inmunotransferencia, o métodos equivalentes, o análisis de los niveles de ARNm mediante métodos analíticos basados en ácidos nucleicos tales como RT-PCR, hibridación Northern, o transferencia puntual o por ranuras.

Equipos para medir los niveles de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN

La presente invención describe equipos para detectar el aumento del nivel de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN como genes marcadores del glioblastoma en un sujeto. Un equipo para detectar un polipéptido marcador del glioblastoma contiene preferentemente un anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido marcador de glioblastoma seleccionado. Un equipo para detectar el ARNm de un marcador de glioblastoma contiene preferentemente uno o más ácidos nucleicos (p. ej. uno o más cebadores o sondas oligonucleotídicos, sondas de ADN, sondas de ARN, o moldes para generar sondas de ARN) que hibriden específicamente con el ARNm de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN.

En concreto, el equipo con anticuerpo puede ser utilizado para detectar la presencia y/o medir el nivel de un polipéptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y/o PDPN que es reconocido específicamente por el anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo del mismo. El equipo puede incluir un anticuerpo reactivo con el antígeno y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo con el antígeno. Tal equipo puede ser un kit ELISA y puede contener un control (p. ej. una cantidad especificada de un polipéptido marcador de glioblastoma en concreto), anticuerpos primarios y secundarios si procede, y cualquier otro reactivo necesario como moléculas detectables, sustratos enzimáticos y reactivos colorimétricos como los antes descritos. Alternativamente, el equipo de diagnóstico puede ser un kit de inmunotransferencia que en general comprende los componentes y reactivos descritos en la presente memoria.

Se puede usar un equipo de ácidos nucleicos para detectar y/o medir el nivel de expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN mediante la detección y/o la medición de la cantidad de ARNm de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN presente en una muestra, como una biopsia de tejido o de células. Por ejemplo, un equipo de RT-PCR para la detección de la expresión elevada de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN contiene preferentemente suficientes cebadores oligonucleotídicos para llevar a cabo la transcripción inversa del ARNm del marcador de glioblastoma en ADNc y la amplificación con PCR de dicho ADNc, y preferentemente también contendrá moldes y cebadores de PCR de control para llevar a cabo los pertinentes controles negativo y positivo, así como controles internos para la cuantificación. Una persona con conocimientos ordinarios de la técnica sabrá seleccionar los cebadores adecuados para llevar a cabo las reacciones de transcripción inversa y PCR, así como las reacciones de control pertinentes. Se pueden encontrar indicaciones por ejemplo en F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1997. En la técnica se conocen muchas variaciones de la RT-PCR. La administración dirigida de inmunotoxinas contra BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN puede servir como dianas terapéuticas para el tratamiento o la prevención del glioblastoma. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo que se una específicamente a polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN localizados en la superficie puede ser conjugada con un radioisótopo u otro compuesto tóxico. Los conjugados de anticuerpo se administran al sujeto de modo que la unión del anticuerpo a su polipéptido afín del glioblastoma se traduce en la administración dirigida del compuesto terapéutico en las células de glioblastoma, tratando así un cáncer de ovario.

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La fracción terapéutica puede ser una toxina, radioisótopo, fármaco, sustancia química, o una proteína (véase p. ej. Bera et al. "Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2" Cancer Res. 59:4018-4022 (1999)). Por ejemplo, el anticuerpo puede estar ligado o conjugado a una toxina bacteriana (p. ej., toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas, toxina colérica) o toxina vegetal (p. ej., toxina del ricino) para la administración dirigida de la toxina en una célula que exprese BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN. Esta inmunotoxina puede ser administrada a una célula y tras su unión al polipéptido marcador del glioblastoma localizado en la superficie celular, la toxina conjugada con el anticuerpo específico del marcador de glioblastoma entrará en contacto con la célula.

Además, con cualquier polipéptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN para el cual exista un ligando específico (p. ej., un ligando que se une a una proteína localizada en la superficie celular), el ligando se puede usar en lugar de un anticuerpo para introducir de forma dirigida un compuesto tóxico en una célula de glioblastoma, tal y como se ha descrito antes.

El término «anticuerpos» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas, el término «anticuerpos» también incluye fragmentos o polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moléculas de inmunoglobulina, siempre que posean alguna de las propiedades deseadas (p. ej., la unión específica de un polipéptido marcador del glioblastoma, la administración de una toxina contra una célula de glioblastoma que exprese un gen marcador de glioblastoma con un nivel elevado, y/o inhibición de la actividad de un polipéptido marcador del glioblastoma) descritos en la presente memoria.

Si es posible los anticuerpos descritos se podrán adquirir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la invención también se pueden fabricar con métodos consabidos. La persona versada en la técnica entiende que para generar los anticuerpos se pueden emplear tanto los polipéptidos marcadores del glioblastoma enteros como fragmentos de los mismos. El polipéptido necesario para generar un anticuerpo se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un ADNc que codifica un polipéptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, o un fragmento de los mismos, se puede expresar en células procariotas (p. ej., bacterias) o células eucariotas (p. ej. de levadura, insecto o mamífero), a partir de las cuales se puede purificar una proteína recombinante con la que generar una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una específicamente al polipéptido marcador de glioblastoma usado para generar el anticuerpo.

Una persona versada en la técnica sabrá que la generación de dos o más conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej. ELISA, inmunohistoquímica, técnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con métodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej. ELISA, inmunohistoquímica, inmunoterapia, etc.; para más detalles sobre la generación y el análisis de anticuerpos, véase por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, inmunotransferencia (Western blot), tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido de glioblastoma congelados o fijados en formol. Después de la caracterización inicial in vitro, los anticuerpos destinados a uso terapéutico o diagnóstico in vivo se analizan con métodos de ensayo clínicos conocidos.

El término «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población notablemente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeño número. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad antagonista deseada (N.º pat. de EE.UU. 4.816.567).

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar con métodos basados en hibridomas. En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar con métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE.UU. N.º 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej. con sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de ratón).

Los métodos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de

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anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo con técnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión se puede realizar con papaína. Ejemplos de la digestión con papaína aparecen descritos en WO 94/29348, publicada el 22.12.1994 y en la Pat. de EE. UU. N.º 4.342.566. La digestión de anticuerpos con papaína normalmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de unión al antígeno, así como un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento que tiene dos sitios de combinación con antígenos y todavía es capaz de reconocer antígenos de reactividad cruzada.

Los fragmentos de anticuerpo, estén unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones concretas o de residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo sin modificar. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o añadir aminoácidos capaces de establecer puentes de sulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las características de secreción, etc. En cualquier caso el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de unión, regulación de unión al dominio de unión, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagenia de una región específica de la proteína, seguida por la expresión y el análisis del polipéptido expresado. Tales métodos son obvios para toda persona versada en la técnica y pueden incluir la mutagenia dirigida del ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos descritos también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej. de ratón) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos quiméricos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una pequeña secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que está dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no están presentes ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá casi todas de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderán a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR serán las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o varios residuos de aminoácidos de origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos con frecuencia son denominados residuos «importados», que normalmente se extraen del dominio variable «importado». La humanización se puede llevar a cabo básicamente sustituyendo la o las secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (Pat. EE.UU. N.º 4.816.567), en los que una parte notablemente más pequeña que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

Se pueden emplear animales transgénicos (p. ej. ratones) que tras la inmunización sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes germinales provoca la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. También se pueden producir anticuerpos humanos en fagotecas.

Los anticuerpos descritos se administran preferiblemente a un sujeto incorporándolos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Normalmente a la formulación se le añade una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que sea isotónica. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución Ringer y solución de dextrosa. Es preferible que el pH de la solución oscile aproximadamente entre 5 y 8, y más preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación prolongada como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej. películas, liposomas o micropartículas. Para las personas versadas en la técnica será evidente que son preferibles ciertos vehículos dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se va a administrar.

Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, al paciente o a las células mediante inyección (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, etc.), o con otros métodos como la infusión que aseguren su liberación efectiva en el torrente sanguíneo. Los anticuerpos también se pueden administrar por vía intratumoral o peritumoral

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60

para ejercer un efecto terapéutico a la par sistémico y local. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Las dosis y pautas de administración más adecuadas se pueden determinar empíricamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos a administrar depende, por ejemplo, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la vía de administración, el tipo concreto de anticuerpo y de otros medicamentos que se le estén administrando. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. La dosis diaria típica de anticuerpo cuando se utiliza solo puede oscilar entre 1 µg/kg y 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administración del anticuerpo como tratamiento contra el glioblastoma, su eficacia se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el médico especialista. Por ejemplo se puede controlar el tamaño, el número y/o la distribución del glioblastoma en el sujeto receptor del tratamiento utilizando técnicas de imagen oncológicas estándar. Todo anticuerpo administrado con fines terapéuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extensión y/o impida la aparición de nuevos tumores en contraste con la evolución de la enfermedad si no se produjera la administración del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del glioblastoma.

Puesto que los marcadores tumorales del glioblastoma BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN de la invención se expresan con profusión en las células del glioblastoma pero en cambio lo hacen extremadamente poco en las células normales, la inhibición de la expresión de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN o de la actividad de sus polipéptidos puede formar parte de una estrategia terapéutica para tratar o prevenir el glioblastoma.

El principio de la terapia antisentido se basa en la hipótesis de que es posible suprimir la expresión génica de secuencias específicas (ya sea por vía transcripcional o traduccional) mediante la hibridación en el interior de la célula del ADN genómico o del ARNm con una molécula antisentido complementaria a ellos. La formación de ese ácido nucleico bicatenario híbrido trastoca la transcripción del ADN genómico que codifica el antígeno tumoral que constituye la diana, o altera el procesamiento/transporte/traducción y/o la estabilidad del ARNm del antígeno tumoral diana.

Los ácidos nucleicos antisentido se pueden hacer llegar a las células con diversas estrategias. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar directamente oligonucleótidos antisentido o ARN antisentido (p. ej., por inyección intravenosa) de tal forma que puedan ser absorbidos por las células tumorales. Otra alternativa consiste en la introducción en células in vivo de vectores virales o plasmídicos que codifiquen ARN antisentido (o fragmentos de ARN). Los efectos antisentido también se pueden inducir con secuencias codificantes, pero la magnitud de los cambios fenotípicos es muy variable. Los cambios fenotípicos inducidos por la terapia antisentido se valoran en función de los cambios en, p. ej. las concentraciones del ARNm diana, concentraciones de la proteína diana y/o niveles de actividad de dicha proteína.

En un ejemplo concreto, la inhibición de la función del marcador/diana del glioblastoma con terapia génica antisentido se puede lograr con la administración directa de ARN antisentido del marcador del glioblastoma a un sujeto. El ARN antisentido del marcador tumoral se puede producir y aislar con una técnica estándar, pero se produce más fácilmente con la transcripción in vitro utilizando un ADNc antisentido del marcador tumoral controlado con un promotor eficiente (p. ej. el promotor de T7). La administración a células del ARN antisentido del marcador tumoral se puede efectuar con cualquiera de los métodos de administración directa de ácidos nucleicos descritos a continuación.

Un estrategia alternativa para inhibir la función de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN con terapia génica implica la expresión intracelular de un anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM

o PDPN o de una porción de un anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. Por ejemplo, el gen (o fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN y que inhibe su actividad biológica se sitúa bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora específica (p. ej. específica de tejido o de tumor), dentro de un vector de expresión de ácidos nucleicos. A continuación el vector se administra al sujeto de tal modo que es captado por las células del glioblastomas u otras células, que después segregarán el anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN y de ese modo bloquearán la actividad biológica del polipéptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN. Preferentemente, los polipéptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN estarán presentes en la superficie externa de las células de glioblastoma.

En los métodos susodichos, que incluyen la administración y la absorción de ADN exógeno por las células del sujeto (transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser incorporados a un vector en forma de ADN desnudo o de ácidos nucleicos para suministrar los ácidos nucleicos a las células con los que inhibir la expresión de la proteína marcadora del glioblastoma. El vector puede estar disponible en una preparación comercial, como un vector adenovírico (Quantum Biotechnologies Inc., Laval, Quebec, Canadá). La liberación del ácido nucleico o del vector en las células se puede materializar a través de varios mecanismos. Como ejemplo, puede ser a través de liposomas con preparaciones comerciales de liposomas como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.), así como otros liposomas

imagen16

SEQ ID N.º 1 a 25, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y será capaz de determinar si tales variantes mantienen la capacidad de unión a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de la presente invención conservan la capacidad para unirse a los TCR de los CTL activados, que después pueden reaccionar con células y matar las que expresan un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los

5 aspectos de la invención.

Aquellos residuos de aminoácido que no contribuyan sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T se pueden modificar mediante el reemplazo con otro aminoácido cuya incorporación no altere sustancialmente la reactividad del linfocito T y no suprima la unión al MHC. Así pues, aparte de la salvedad dada, el péptido de la invención puede ser cualquier péptido (término en el que los inventores incluyen oligopéptido o polipéptido), que

10 incluye las secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas como se indica.

Tabla 2: Variantes y motivos de los péptidos acordes con las SEQ ID N.º 1 a 25

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CSP-001

Código del péptido T M L A R L A S A

SEQ ID 1

Variantes L

L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ACS-001

Código del péptido K I M E R I Q E V

SEQ ID 2

Variantes M L

L

L

K

I

A G I A

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

P

N

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

BCA-001

Código del péptido F L G D P P E K L

SEQ ID 3

Variantes M

E

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

BCA-002

Código del péptido A L W A W P S E L

SEQ ID 4

Variantes M

E

K

I

A G I I A

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CHI3L1-010

Código del péptido T L Y G M L N T L

SEQ ID 5

Variantes M

E

K

I

A I I A E

L

P K Y

F

F

T Y T H

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CLIP2-001

Código del péptido S L N E L R V L L

SEQ ID 3

Variantes M

E

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

BCA-002

Código del péptido A L W A W P S E L

SEQ ID 4

Variantes M

E

K

I

A G I I A

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CHI3L1-010

Código del péptido T L Y G M L N T L

SEQ ID 5

Variantes M

E

K

I

A I I A E

L

P K Y

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CLIP2-001

Código del péptido S L N E L R V L L

SEQ ID 6

Variantes M

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

SLCO1C1-001

Código del péptido Y L I A G I I S L

SEQ ID 7

Variantes M

E

K

I

A G I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

S

V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

DTNA-001

Código del péptido K L Q D E A Y Q V

SEQ ID 8

Variantes M L

L

E

K

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

I

A G I I A E

L

Y P K

L

F

F

T Y T H

P

N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

EGFR-007

Código del péptido A L A V L S N Y D A

SEQ ID 9

Variantes M L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

FABP7-001

Código del péptido L T F G D V V A V

SEQ ID 10

Variantes M L

L

L

E

K

I

A I I A E

Y

P K L

Y

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

GFAP-001

Código del péptido N L A Q D L A T V

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

SEQ ID 11

Variantes M L

L

E

K

I

G I I E

L

Y P K Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

GPR56-002

Código del péptido F L L S E P V A L

SEQ ID 12

Variantes M

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

GRI-001

Código del péptido N I L E Q I V S V

SEQ ID 13

Variantes M L

L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

IGF2BP3-001

Código del péptido K I Q E I L T Q V

SEQ ID 14

Variantes M L

L

L

K

I

A G I A E

L

Y P K Y

F

F

T Y T H

P

N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

MLC-001

Código del péptido S V V E V I A G I

SEQ ID 15

Variantes M L

L

L

K

I

A G I E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NES-001

Código del péptido G L Q S Q I A Q V

SEQ ID 16

Variantes M L

L

E

K

I

A G I E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NES-002

Código del péptido S L Q E N L E S L

SEQ ID 17

Variantes M

K

I

A G I I A E

L

Y P K Y

F

F

T Y T H

K

P

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

NES-003

Código del péptido F L F P G T E N Q

SEQ ID 18

Variantes M L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y K L Y

T

Y H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NES-004

Código del péptido N L A E E L E G V

SEQ ID 19

Variantes M L

L

K

I

G I I A E

L

Y P K Y

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NLGN4X-001

Código del péptido N L D T L M T Y V

SEQ ID 20

Variantes M L

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NR2E1-001

Código del péptido K I I S E I Q A L

SEQ ID 21

Variantes M

L

E

K

I

A G I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

P

N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NRCAM-001

Código del péptido G L W H H Q T E V

SEQ ID 22

Variantes M L

L

(cont.)

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PDPN-001

Código del péptido T L V G I I V G V

SEQ ID 23

Variantes M L

L

E

K

I

A A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

TNC-001

Código del péptido A M T Q L L A G V

SEQ ID 24

Variantes L

L

L

E

K

I

A G I I E

L

Y P K Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

Posición

1 2 3 4 5 6 7 8 9

imagen17

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imagen19

10

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25

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50

55

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido de la invención. Así pues, el ADN que codifica el péptido de la invención puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para transformar una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las reveladas en las patentes de EE.UU. N.º 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.

En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibióticos.

Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la célula hospedadora.

Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invención se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas reveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.

Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.

Un típico vector plasmídico de expresión constitutiva para células de mamífero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.

La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como por ejemplo las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, Maryland, EE.UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, Maryland, EE.UU. (N.º ATCC 31343).Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero

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preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas por ejemplo en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,” Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.

La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse por ejemplo Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU. El método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o la transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se pueden identificar con técnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación de péptidos de la invención, por ejemplo las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) son en la actualidad objeto de investigación como tratamiento contra el cáncer de próstata (Sipuleucel–T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).

Otro aspecto de la invención proporciona un método para la producción de un péptido, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.

En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido puede ser preparado para la inyección por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 µg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 µg a 500 µg de péptido o ADN. Dosis en esos intervalos se han empleado en ensayos anteriores (Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007).

Otro aspecto de la presente invención incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho método la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moléculas MHC humanas de clase I o II cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada por tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera específica de antígeno, siendo el antígeno un péptido conforme a la invención. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

Cuando se esté utilizando como antígeno un epítopo de MHC de clase II, los linfocitos T serán linfocitos cooperadores CD4-positivos, preferiblemente del tipo TH1. Las moléculas MHC de clase II se pueden expresar en la superficie de cualquier célula adecuada. Preferiblemente la célula no debe expresar de forma natural moléculas MHC de clase II (de ser así, la célula tendrá que ser transfectada para que exprese dicha molécula). Si, en cambio, la célula expresa de forma natural moléculas MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o presentación de antígenos. De ese modo será posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II quede completamente cargada con el antígeno peptídico escogido antes de activar el linfocito T.

La célula presentadora de antígeno (o célula estimuladora) normalmente posee moléculas MHC de clase II en su superficie y es preferible que sea básicamente incapaz de cargar dicha molécula de MHC de clase II con el antígeno seleccionado. La molécula MHC de clase II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

Preferiblemente, la célula de mamífero carece del transportador de péptidos TAP o bien este se presenta en un nivel

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ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (p. ej. MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). También se pueden usar citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej. el TNF-α), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras antígeno de los linfocitos T (p. ej. GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE.UU. N.º 5.849.589, incorporada específicamente a la presente memoria en su integridad como referencia) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej. la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al. 1996).

También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en las vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo cual resulta en una mayor activación de los linfocitos TH1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta TH1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Krieg et al. 2006).La patente de EE. UU. N.º 6.406.705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (p. ej., CpR, Idera), análogos ARNdc como poli(I:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimús, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por las personas versadas en la técnica sin demasiada experimentación. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, interferones alfa o beta, CpG7909, IC31, imiquimod, resimiquimod, PeviTer, ARN, tadalafilo, temozolomida y JuvImmune.

Los adyuvantes preferidos son dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, resimiquimod, GM-CSF, interferón alfa, PeviTer y JuvImmune o combinaciones de los anteriores.

En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante se selecciona del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, sargramostim), imiquimod, resiquimod e interferón alfa.

En una forma de realización preferida la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en los factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), immiquimod y resimiquimod.

En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es imiquimod o resimiquimod.

Esta composición está destinada a la administración parenteral, como por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular, o bien para la administración oral. Para ello, los péptidos y opcionalmente otras moléculas se disuelven o se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como tampones, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes, lubricantes, etc. Los péptidos también se pueden administrar junto con sustancias inmunoestimuladoras, como citocinas. En una composición tal se puede usar una amplia lista de excipientes, como por ejemplo, los tomados de

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A continuación se describirá la presente invención con los ejemplos y figuras siguientes que muestran las formas de realización preferidas de la misma a título ilustrativo, sin que con ello se pretenda limitar la invención.

Figura 1: Ejemplo de espectro de masas de IGF2BP3-001 que demuestra su presentación en la muestra GB6010 de tumor primario. Se llevó a cabo una cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas nanoESI con una mezcla de péptidos eluida de la muestra de glioblastoma GB6010. El cromatograma de masas de m/z 536,3238 ± 0,001 Da, z = 2 muestra un pico de péptido en el tiempo de retención 49,89 min. B). El pico detectado en el cromatograma de masa a los 48,76 min reveló una señal de m/z 536,3239 en el espectro de EM. C) El espectro de masas resultante de la desintegración inducida por colisiones del precursor seleccionado m/z 536,3239 registrado en el experimento de CL-EM nanoESI en el tiempo de retención indicado confirmó la presencia de IGF2BP3-001 en la muestra tumoral GB6010. D) Para verificar la secuencia se registró el patrón de fragmentación del péptido de referencia sintético IGF2BP3-001 y se comparó con el patrón de fragmentación generado por el TUMAP natural mostrado en C.

La Figura 2a muestra los perfiles de expresión de ARNm de proteínas seleccionadas en muestras de tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.

La Figura 2b muestra los perfiles de expresión de ARNm de proteínas seleccionadas en muestras de tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.

La Figura 3 expone la inmunogenicidad in vitro de ejemplo de los TUMAP de clase I de IMA950

La Figura 4 muestra a título de ejemplo las afinidades de péptidos de HLA de clase I de la invención hacia el HLAA*02.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Identificación de los péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular

Muestras de tejido

Las muestras de tejido tumoral de pacientes fueron facilitadas por el Hôpital Cantonal Universitaire de Genève (Oncología Médica, Laboratorio de inmunología tumoral) y la Neurochirurgische Universitäts-Klinik de Heidelberg (Laboratorio de biología molecular). Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y permanecieron a -80ºC hasta el aislamiento de los TUMAP.

Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido

Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitación de los tejidos sólidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) con el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7.2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.

Métodos:

Las mezclas de péptidos HLA se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía en fase invertida (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm de d.i. x 250 mm) rellena con material de fase invertida C18 de 1,7 µm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los péptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introducción en la fuente micro-ESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el método TOP5. En resumen, se inició un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precisión de masa en el orbitrap (R = 30 000), al que siguieron barridos EM/EM también en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes y exclusión dinámica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tándem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptídica identificada se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el péptido natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de idéntica secuencia. La Fig. 1 muestra un ejemplo de espectro obtenido de tejido tumoral correspondiente al péptido asociado a MHC de clase I IGF2BP3-001 y su perfil de elución en el sistema UPLC.

Ejemplo 2

Perfiles de expresión de los genes que codifican los péptidos de la invención

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No todos los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de ellos proceden de proteínas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de células. Muy pocos de esos péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.

El péptido ideal sería el derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos que derivaban de genes dotados con un perfil de expresión similar al ideal los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y después a los genes originarios y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.

Fuentes de ARN y preparación

Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por dos centros clínicos (véase Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y después se purificó con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Ámsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, California, EE.UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezcló de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporción. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los leucocitos.

La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoraron con un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y con el RNA RNA6000 Pico Lab Chip Kit (Agilent)

Experimentos con micromatrices

El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuó con micromatrices oligonucleotídicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, California, EE.UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, a partir de 5–8 µg de ARN total se sintetizó ADNc bicatenario con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripción in vitro se llevó a cabo con el BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE.UU.) en el caso de las matrices U133A y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2.0, y después se procedió a la fragmentación del ARNc, a su hibridación y tinción con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes por defecto en todos los parámetros. Para la normalización se utilizaron 100 genes constitutivos (housekeeping) suministrados por Affymetrix. Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de los ratios logarítmicos de señal dados por el software y la muestra normal de riñón se ajustó de forma arbitraria en 1,0.

Los perfiles de expresión de los genes originarios de la presente invención que aparecen altamente sobreexpresados en el glioblastoma de la presente invención se muestran en la Fig. 2.

Ejemplo 3:

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I de IMA950

Para obtener información relativa a la inmunogenicidad de los TUMAP de la presente invención, llevamos a cabo análisis con una conocida plataforma de estimulación in vitro descrita por (Walter S., Herrgen L., Schoor O., Jung G., Wernet D., Buhring H.J., Rammensee H.G., and Stevanovic S.; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). De este modo pudimos descubrir la inmunogenicidad notablemente elevada de 13 TUMAP restringidos por HLA-A*201 de la invención (detección en ≥ 50% de los CTL específicos de TUMAP de donantes analizados), lo cual demuestra que dichos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los que existen linfocitos T precursores CD8+ en el ser humano (Tabla 3).

Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8+

Para llevar a cabo las estimulaciones in vitro con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con un complejo péptido-MHC (pMHC) y anticuerpo anti-CD28, primero aislamos células mononucleares de sangre

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periférica (PBMC) de capas leucocíticas HLA-A*02+ frescas por medio de un medio de separación en gradiente de densidad ordinario (PAA, Cölbe, Alemania). Las capas leucocíticas procedían del banco de sangre de Tubinga y del Katharinen hospital de Stuttgart. Las PBMC aisladas se incubaron hasta el día siguiente con medio para linfocitos T (TCM) para la sensibilización humana in vitro. El medio consistía en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con suero AB humano termoinactivado al 10% (PAA, Cölbe, Alemania), penicilina 100 U/ml/estreptomicina 100 µg/ml (Cambrex, Verviers, Bélgica), piruvato sódico 1 mM (CC Pro, Neustadt, Alemania) y gentamicina 20 µg/ml (Cambrex). Los linfocitos CD8+ se aislaron con un kit de selección positiva MACS para CD8+ (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ obtenidos se incubaron hasta su uso en TCM suplementado con IL-7 2,5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Chiron, Munich, Alemania). La fabricación de las microperlas recubiertas de pMHC/anti-CD28, las estimulaciones de los linfocitos T y las lecturas se llevaron a cabo del modo descrito por otros (Walter et al., 2003) con pequeñas modificaciones. En suma, con el método descrito por (Altman et al., 1996) se sintetizaron moléculas recombinantes y biotiniladas de HLA-A*0201 desprovistas del dominio transmembrana y biotiniladas en el extremo carboxi de la cadena pesada. El anticuerpo coestimulador purificado Ab 9.3, una IgG2a de ratón anti-CD28 humano (Jung et al., 1987) se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistían en partículas de poliestireno de 5,60 µm recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.).Los complejos pMHC usados como controles positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV de Melan-A modificado/MART-1) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) o A*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV), respectivamente.

Se tapizaron placas de 96 pocillos con 800.000 microperlas/200 µl en presencia de 600 ng de anti-CD28 biotinilado más 200 ng del pMHC-biotina relevante (microperlas de alta densidad) o de 2 ng del relevante más 200 ng de MHC irrelevante (biblioteca de pMHC) (microperlas de baja densidad). Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 µl de TCM suplementado con IL-12 5 ng/ml (PromoCell) durante 3 o 4 días a 37 °C. La mitad del medio se renovó con TCM fresco suplementado con IL-2 80 U/ml y la incubación continuó otros 3 o 4 días a 37 °C. Este ciclo de estimulación se efectuó en total tres veces. Por último, se llevarán a cabo análisis tetraméricos de los tetrámeros de MHC fluorescentes (producidos del modo descrito por (Altman et al., 1996) más anticuerpo CD8-FITC del clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) en un citómetro FACSCalibur de cuatro colores (BD). Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis tetramérico se hizo con el programa FCS Express (De Novo Software). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ tetrámero+ específicos se detectó aplicando el acotamiento de subpoblaciones (gating) adecuado y comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si por lo menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una estirpe de linfocitos T CD8+ específica después tras la estimulación (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de tetrámero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células tetrámero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos de IMA950

En el caso de los péptidos de HLA de clase I analizados, la inmunogenicidad in vitro se puede demostrar con la generación de líneas de linfocitos T específicos de ese péptido. En la Figura 3 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de dos péptidos de la invención tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP. Los resultados de 13 péptidos de la invención se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos de HLA clase I altamente inmunogénicos de la invención

Antígeno

Donantes positivos / donantes analizados Pocillos positivos / pocillos analizados

BCA-001

60% 5%

BCA-002

75% 35%

CLIP2-001

75% 6%

CSP-001

100% 57%

FABP7-001

100% 27%

IGF2BP3-001

50% 21%

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30

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(cont.)

Antígeno

Donantes positivos / donantes analizados Pocillos positivos / pocillos analizados

NES-001

75% 38%

NLGN4X-001

100% 62%

NRCAM-001

86% 39%

PDPN-001

60% 11%

SLCO1C1-001

60% 7%

TNC-001

60% 30%

TNC-002

50% 14%

Ejemplo 4

Unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I de la invención a HLA-A*0201

Objetivo y resumen

El objetivo del análisis consistía en evaluar la afinidad de los péptidos de HLA de clase I a la molécula de MHC codificada por el alelo HLA-A*0201 ya que este es un importante parámetro del mecanismo de acción de los péptidos como parte de la inmunoterapia contra el cáncer. Las afinidades hacia el HLA-A*0201 variaron entre medias y altas en todos los péptidos restringidos a HLA de clase I de la invención analizados; las constantes de disociación se hallaron en el orden de las del péptido usado como control positivo HBV-001, un derivado del antígeno central del virus de la hepatitis B que posee una fuerte afinidad de unión por el alelo A*02. Estos resultados confirman la potente afinidad de unión de todos los péptidos de HLA de clase I de la presente invención.

Principio de la prueba

Los complejos estables de HLA/péptido constan de tres moléculas: cadena pesada de HLA, beta-2 microglobulina (b2m) y el ligando peptídico. La actividad de las moléculas de cadena pesada recombinantes y desnaturalizadas del HLA-A*0201 solas se puede conservar convirtiéndolas en equivalentes funcionales de «moléculas HLA-A*0201 vacías». Cuando se diluyen en un tampón acuoso que contiene b2m y un péptido adecuado, estas moléculas se pliegan con rapidez y con eficacia de un modo que depende totalmente del péptido. La disponibilidad de estas moléculas se utiliza en un ensayo ELISA para medir la afinidad de la interacción entre el péptido y la molécula HLA de clase I (Sylvester-Hvid et al., 2002).

Moléculas recombinantes y purificadas de HLA-A*0201 se incubaron con b2m y dosis escalonadas del péptido de interés. La cantidad de complejos de HLA plegados de novo/péptido se determinó con un ELISA cuantitativo. Las constantes de disociación (valores KD) se calcularon con una curva patrón trazada con disoluciones de un complejo HLA/péptido de calibración.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 4. Cuanto más bajo es el valor de KD mayor es la afinidad hacia el HLAA*0201.Todos los péptidos de la invención analizados mostraron afinidades potentes hacia el HLA-A*0201 que rondaron el valor de la KD del péptido de control positivo HBV-001, poseedor de una potente afinidad de unión para con el alelo A*02. Por tanto, todos los TUMAP de clase I de la invención tienen una afinidad de unión alta por las moléculas del MHC A*02.

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Claims (1)

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