CN112824427B - 一种抑制胶质瘤的短肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制胶质瘤的短肽及其应用，其含有如下氨基酸序列：Trp‑Arg‑Ser‑His‑Ser‑Ser‑Tyr。本发明筛选得到的短肽可以作为潜在的恶性胶质瘤治疗药物，特异性的抑制L1/HPA/CD24信号轴的表达，从而抑制恶性胶质瘤的增殖。

Description

一种抑制胶质瘤的短肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抑制胶质瘤的短肽及其应用。

背景技术

L1神经细胞粘附分子(L1 cell adhesion molecules；L1-CAM，简称L1)是一种分子量约220kDa的细胞粘附分子。作为免疫球蛋白超家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞间及细胞外基质粘附的跨膜蛋白。最初在脑组织中被发现，通过调节细胞和细胞之间的粘附，在神经系统的发生和发育过程中起着重要作用。随后发现在起源于神经组织的恶性肿瘤中也有L1蛋白的高表达，并且L1的高表达不仅会促进肿瘤细胞的增殖，同时也上调与肿瘤侵袭转移相关的蛋白表达，从而促进肿瘤的侵袭转移。因此，近年来L1作为一种潜在的恶性胶质瘤治疗的靶向位点，得到了较为广泛的关注，深入阐释L1在恶性胶质瘤发病机制中的生物学功能，有望改进恶性胶质瘤治疗方案，并筛选出潜在的抗恶性胶质瘤靶向药物，从而提高恶性胶质瘤患者的预后。

长期以来，L1在肿瘤发生、侵袭转移过程中被广泛认为可能是通过激活PI3K、Rac-1以及ERK信号通路发挥其生物学功能。近年来，还有研究发现L1在肿瘤细胞中的表达异常可能导致NF-κB信号通路的激活，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。另有报道证明L1可上调IL-1β的表达，进而激活NF-κB信号通路。同时也有报道表明L1可以与细胞骨架蛋白ankyrin、actin、spectrin以及ERM等蛋白有相互作用。然而在胶质瘤发生、侵袭转移过程中，L1，特别是L1水解片段的生物学功能仍不清楚。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抑制恶性胶质瘤增长和侵袭的短肽，用于解决现有技术中易复发、预后差、没有靶向药物、难以穿透血脑屏障等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抑制胶质瘤的短肽，其含有如SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列中的至少一种：

1)Ala-Arg-Asp-Ser-Leu-Met-Phe(SEQ ID NO.1，简写为ARDSLMF)；

2)Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr(SEQ ID NO.2，简写为WRSHSSY)；

3)Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr-His(SEQ ID NO.3，简写为RSHSSYH)。

上述短肽主要用于抑制恶性胶质瘤的增长和侵袭。

短肽是指由3-9个的氨基酸残基组成的短链肽。

本发明还提供上述短肽在制备治疗或预防胶质瘤的药物中的应用。

可选地，所述胶质瘤包括纤维型星形细胞瘤、低度恶性星形细胞瘤(LGA)、退变型星形细胞瘤(AA)、多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

可选地，所述短肽靶向抑制L1/HPA/CD24信号轴。

本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述短肽。

本发明还提供一种载体，所述载体含有上述多核苷酸。

如上所述，本发明的抑制胶质瘤的短肽及其应用，具有以下有益效果：本发明筛选得到的短肽可以作为潜在的恶性胶质瘤治疗药物，特异性的抑制L1/HPA/CD24信号轴的表达，从而抑制恶性胶质瘤的增殖。

附图说明

图1a显示为本发明实施例1中噬菌体展示筛选出的P1、P2、P3的测序序列图。

图1b显示为本发明实施例1中三种短肽对不同浓度的L1/CD24/HPA1的抑制作用结果图。

图1c显示为本发明实施例1中ELISA测定检测三种短肽和CD24之间相互作用能力的结果图。

图1d显示为本发明实施例1中三种短肽对不同浓度的胶质瘤侵袭的抑制作用结果图。

图1e显示为本发明实施例1中三种短肽对不同浓度的胶质瘤迁移的抑制作用结果图。

图2a和图2b显示为本发明实施例2中三种短肽抑制蛋白相互作用的结果图。

图3a显示为本发明实施例3中成瘤21天后Control组的移植瘤与不同浓度C1和C2组的移植瘤的总体外观图。

图3b显示为本发明实施例3中三组移植瘤的重量统计结果图。

图3c显示为本发明实施例3中三组移植瘤的体积统计结果图。

图4显示为本发明实施例5中对照组和给肽组的小鼠动物成像图。

图5显示为对照组小鼠的脑组织切片HE染色图。

图6显示为给肽组小鼠的脑组织切片HE染色图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本课题组前期利用蛋白质谱和Co-IP技术验证，发现约10余种蛋白可以与L1蛋白相互作用，其中包括heparanase和CD24蛋白。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proeglycans，简称HSPGs)是脊椎动物细胞表面和细胞外基质中广泛存在的大分子物质，也是基底膜的结构组分，其基础结构由几条硫酸类类肝素(HS)共价连接形成的蛋白核心组成。乙酰肝素酶(heparanase，简称HPA，又称HPSE)是裂解细胞外基质(ECM)和细胞基底膜(BM)中HS的统称。HPA可以结合多种生物分子，如生长因子、细胞因子等，并且能够调节各种结合蛋白的生物学功能，造成肿瘤微环境结构的改变和HS结合生长因子的释放，从而促进肿瘤的侵袭转移和血管生成。在恶性胶质瘤组织中，HPA呈高表达，并且其高表达与胶质瘤的侵袭性、肿瘤血管生成，以及恶性胶质瘤患者预后密切相关。

CD24是一种低分子量高度糖基化的细胞表面粘附分子，充当细胞连接位点上分子间相互作用的媒介，可以介导细胞间、细胞与基质间的粘附。最近有研究表明，CD24高表达于多种恶性肿瘤细胞表面，包括肾癌、肺癌、鼻咽癌、肝细胞癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和胶质瘤，并且和肿瘤侵袭转移、复发和预后密切相关。高表达的CD24对肿瘤细胞的增殖有促进作用。还有研究证明CD24在肿瘤细胞表达水平高的患者生存率明显降低，同时CD24表达与肿瘤分级呈正相关，细胞浆染色水平与肿瘤大小有关，提示CD24的表达可能可以作为肿瘤的不良预后指标之一。还有研究表明CD24阳性细胞可以迅速与基质附着，而CD24阴性细胞的附着较慢，表明CD24的表达与肿瘤的侵袭转移具有相关性。在恶性胶质瘤中，已有研究表明CD24的表达水平与患者预后不良呈正相关，然而其分子机制尚未完全阐明。

L1、HPA和CD24这三种蛋白在恶性胶质瘤中呈高表达，这三种蛋白表达水平均与恶性胶质瘤恶性程度和预后水平有相关性，且这三种蛋白可以相互作用形成蛋白质复合体。L1、HPA和CD24相互作用共同组成L1/HPA/CD24信号轴调控恶性胶质瘤的发生和侵袭转移，并且这一信号轴可能可以作为一个重要的预后指标，对胶质瘤患者的预后进行评价。

噬菌体展示技术是20世纪80年代兴起的一项蛋白质相互作用的技术，其可以用来抗原表位筛选、诊断试剂研究、疫苗研究、药物靶向研究。由于噬菌体展示技术可以将其表型与基因型联系一起，利用其配体独特的亲和力，结构简单，库容量大，所以将目的蛋白或短肽筛选出来再进一步开发成药物具有极大的可能性(参考Kazuki N.Sugahara，etal.Science328，1031(2010))。噬菌体展示技术已经成为开发药物的快速有效的方法。

本发明的目的是提供一组CD24原核蛋白结合肽，其能够与CD24蛋白结合，竞争性抑制L1/HPA/CD24信号轴表达，并能够运用于恶性胶质瘤治疗。

具体实施过程如下：

实施例1

本发明通过噬菌体随机展示7肽库对CD24原核表达蛋白进行筛选，最终得到三组具有生物活性的短肽，CD24蛋白结合肽的筛选与鉴定按照下述步骤进行：

(1)将纯化的CD24-His蛋白及L1-His蛋白置于96孔板中孵育过夜，第二天在96孔板中加入1％牛血清白蛋白(BSA)，37℃孵育1h后，加入Ph.D.原始噬菌体展示七肽库原液(滴度为2×10pfu/mL)，37℃孵育1h，用0.05％TBST洗涤5次，去除未与细胞结合的噬菌体，加入0.2mol/L甘氨酸洗脱液1mL，将结合噬菌体洗脱下来，将洗脱液加入到已经封闭好的96孔板中，室温下作用1h，上清液即为第一轮筛选得到的噬菌体。

(2)应用PEG法提纯，将纯化的CD24-His蛋白及L1-His蛋白置于96孔板中，孵育过夜；第二天在96孔板中加入1％牛血清白蛋白(BSA)37℃孵育1h后，加入10ul的Ph.D.噬菌体展示库七肽库原液(滴度为1×10⁹pfu/mL)，置于37℃烘箱孵育1h，用0.05％TBST洗涤5次去除未与细胞结合的噬菌体，加入0.2mol/L甘氨酸洗脱液1mL，将结合噬菌体洗脱下来。将洗脱液加入到已经封闭好的96孔板中，室温下作用1h，上清液即为第二轮筛选得到的噬菌体。

(3)应用PEG法提纯，进入下一轮筛选。噬菌体展示肽库体外减性筛选条件，肽库与蛋白结合时间(即烘箱中孵育时间)分别减少到45min(第2轮)、30min(第3轮)和20min(第4轮)，最后一轮测定滴度后，选择合适的浓度，挑选蓝色阳性菌落不超过100个的平板，随机挑选40个阳性菌落进行扩增。

(4)将扩增4.5小时后的培养物在10000rpm离心30秒，离心后将上清转移至新的离心管，加入200ul的PEG/NaCl颠倒混匀，室温放置10分钟后，再次离心10分钟，弃掉上清，再次短暂离心30秒，小心的吸去残余的上清，将沉淀物用100ul碘化物缓冲液重悬，再向其中加入250ul的预冷的无水乙醇，室温孵育10分钟后离心十分钟，弃掉上清，用预冷的70％的无水乙醇清洗沉淀，随后进行短暂的真空干燥，用30ul的灭菌超纯水重悬沉淀，用Ph.D.-7噬菌体展示肽库试剂盒自带的测序引物：5′HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG 3′，送至上海生工有限公司测序，将得到的特异性短肽的序列送至上海强耀生物科技有限公司，合成短肽。

(5)通过上述筛选过程，最终筛选获得具有下列氨基酸序列的多肽，如图1a所示：

P1：Ala-Arg-Asp-Ser-Leu-Met-Phe(SEQ ID NO.1，简写为ARDSLMF)；

P2：Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr(SEQ ID NO.2，简写为WRSHSSY)；

P3：Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr-His(SEQ ID NO.3，简写为RSHSSYH)。

(6)得到短肽后，进行ELISA实验检测短肽对CD24的亲和力，用短肽处理U87细胞(人神经胶质瘤细胞，购自美国模式培养物集存库，American type culture collection，简称ATCC)，利用CCK8、Transwelll(细胞侵袭)、细胞划痕以及裸鼠皮下移植瘤等实验检测三种短肽对U87肿瘤细胞的抑制作用，结果表明，具有上述氨基酸序列的短肽均可以专一地与CD24蛋白结合，本发明筛选得到的短肽可以作为潜在的恶性胶质瘤治疗药物，特异性的抑制L1/HPA/CD24信号轴的表达，从而抑制恶性胶质瘤的增殖，其中效果最好的一组短肽为P2：Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr。

1、ELISA以及CCK8实验

对于恶性胶质瘤的临床治疗，由于血脑屏障的存在，治疗性抗体疗效通常不佳。因此，我们在筛选出靶向抑制L1/HPA/CD24信号轴的肽段后，将短肽作用于U87MG胶质母细胞瘤细胞系(人脑星形胶质母细胞瘤)，并通过ELISA以及CCK8实验(CCK8实验检测用试剂盒购于MCE，货号：HY-K0301，操作步骤严格按照试剂盒所附说明书执行)，验证短肽对细胞的增殖作用。结果如图1b和1c所示。结果表明，三种短肽对L1/CD24/HPA信号轴均有所抑制。

ELISA包被抗原的具体过程如下：

(1)用50mM的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解CD24蛋白，使CD24蛋白浓度为10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4℃放置过夜。

(2)第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl 1％BSA 37℃封闭1小时。

(3)PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的短肽，并加入对照样品，37℃孵育2小时。

(4)PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1小时。

(5)PBST洗涤5次后，显色剂(购自碧云天，货号ST746)显色20min后，酶标仪上读取A405吸收值。

2、Transwell侵袭实验：

准备好适当比例的基质胶以及24孔板，加入30ul到transwell小室(购自coring公司)中，消化细胞，用无血清培养基稀释计数，加入每孔1万个细胞，上层加入无血清培养基，下层加入有血清的培养基，置于培养箱中培养24小时。取出24孔板，保留transwell小室，去掉上下层培养基，随后上下层均用PBS(1X)洗三次，每次洗5分钟，PFA加入上下层固定15分钟后，PBS将上下层洗三次，每次5分钟，随后用结晶紫染色，去掉结晶紫，清洗后在显微镜下观察计数，记录每个小室穿过的细胞数量并进行统计。结果如图1d所示。结果显示，三种短肽对胶质瘤侵袭均有抑制作用，其中P2短肽对胶质瘤侵袭的抑制作用最为明显。

3、细胞划痕实验：

(1)先用marker笔在48孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔；每孔至少穿过5条线。

(2)在空中加入约1×104个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

(3)第二天用*头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，*头要垂直，不要倾斜。

(4)用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

(5)放入37℃5％CO2培养箱中培养。按实验需要分时取样，拍照。

结果如图1e所示。结果显示，三种短肽对胶质瘤迁移均有抑制作用，其中P2短肽对胶质瘤迁移的抑制作用最为明显。

实施例2

为了进一步验证P1、P2、P3三种短肽对L1/CD24/HPA复合体的作用，我们分别将三种短肽与纯化后的L1/CD24/HPA蛋白一同加入吸附柱中进行GST-pull down实验，蛋白浓度为100μg/ml和200μg/ml，并设置有空白对照。

结果如图2a和2b所示。结果表明，三种短肽对不同浓度的胶质瘤侵袭和迁移均有抑制作用，其中P2短肽与L1/CD24/HPA复合体的结合更为紧密，特异性抑制作用更为明显。

实施例3

为了研究针对L1/CD24/HPA信号轴特异性短肽对胶质瘤生长的作用，我们将U87细胞系进行小鼠皮下移植瘤实验，实验方法如下：

取4-5周龄的裸鼠，用异氟烷将裸鼠麻醉(待其进入深度麻醉后开始实验)，用酒精面球擦拭要进针部位，将100万肿瘤细胞与Matrigel(BD)以1∶1混合后，用1mL注射器吸取后匀速缓慢的推入大腿外侧的皮下，注射后要注意观察小鼠的移植瘤生长情况。小鼠成瘤后，将小鼠分为三组，其中一组为Control组(空白对照组)，另外两组腹腔注射C1(10mg/ml)C2(20mg/ml)两种不同浓度的特异性短肽P2，持续注射十天。持续饲养，饲养过程中要每天记录移植瘤体积及重量。

成瘤21天后，对小鼠进行人道主义脱颈处死，随后取下移植瘤，检测并统计三组小鼠移植瘤的直径、重量和体积大小，结果如图3a、3b和3c所示。结果表明，P2能够有效抑制裸鼠移植瘤的生长。

实施例4

P2短肽(Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr)对肿瘤干细胞的增殖有抑制作用。

流式分选出CD133阳性的U87细胞(细胞来源于ATCC)，用干细胞培养基培养，调整细胞浓度为3×10⁴个细胞/ml，实验组加入400ng/ml的P2短肽，同时对照组用DMSO处理，两周后观察成球情况，结果显示实验组成球数明显少于对照组，说明P2短肽对肿瘤干细胞的增殖有一定的抑制作用。

实施例5

P2短肽(Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr)在体外抑制裸鼠原位移植瘤的增殖。

用异氟烷将裸鼠麻醉(待其进入深度麻醉后开始实验)，实验用裸鼠分两组，共14只，用酒精面球擦拭要进针部位；在饭盒中取出已灭菌的微量进样器，吸取5ul的细胞悬液(吸取前将细胞混匀)；在之前定好的进针部位垂直进针，3-4mm左右，匀速缓慢的推入细胞(5*10⁵/只)，大概两分钟左右，细胞推进后，针滞留30s，将针缓慢的拔出；在接种下一只之前，微量注射器吸取适量的生理盐水冲洗注射器，然后再吸取5ul的细胞悬液，进针前用酒精面球擦拭进样器针尖，待酒精挥发后进行注射；注射完成后观察小鼠的状态，待其苏醒后放入笼中。等待五天后，开始对小鼠注射P2短肽，注射方式为鼠尾静脉注射，浓度为20mg/ml，7只为给肽组，每天注射一次，共注射十天；另外7只为对照组。在种瘤后的12天、28天对小鼠进行小动物成像，结果如图4所示。结果表明，多肽能够穿过血脑屏障，有效抑制小鼠原位移植瘤的生长。

实施例6

1、小鼠灌注以及脑组织获取：

准备好异氟烷以及麻醉小室，用适量异氟烷将小鼠麻醉后，用1mL注射器的针头将小鼠四肢固定，将其固定在平整的泡沫板上，准备好手术用剪刀，将小鼠的胸腔剪开，将小鼠心脏和肝脏露出来，此时小心剪破小鼠的右心耳，安装好灌注装置，开启装置流动生理盐水将一端的空气排出，此时将一端1mL注射器的针头插入小鼠左心室，开始灌注生理盐水，观察小鼠。待其四肢和肝脏变白之后，此时开始换上预冷过的4％PFA灌流固定。观察小鼠，等待小鼠的四肢变僵硬后，停止灌注，将小鼠在室温下放置2h。用手术剪刀剪下小鼠头部，用尖头的手术镊子打开小鼠的颅骨，缓慢取出小鼠的脑组织，浸泡在合适体积的4％的多聚甲醛中固定。

采用上述方法获取实施例5中的对照组的小鼠与给肽组的小鼠的脑组织。2、HE染色

将上述小鼠的脑组织制成石蜡切片，制好的切片取出后首先进行脱腊，分别浸入二甲苯I，二甲苯II中各10min；随后进行酒精梯度脱苯，按照按照100％乙醇I→95％乙醇I→85％乙醇I→75％乙醇I的顺序，每个梯度脱水5min；脱水后用自来水冲洗5min进行水化。取出后用免疫组化笔将样品圈好，向样品上滴加苏木素染蓝，苏木素染色时间根据需要自行掌控，染色后迅速浸入盐酸乙醇溶液并且马上抽出，用自来水再冲洗5min进行分化，甩去水珠后，滴加伊红染色40s，用自来水冲洗2min；晾干后用棉签的木棍端沾少许的中性树胶滴在切片组织上，轻轻放下一端的盖玻片用手指固定，随后缓缓放下另一边盖玻片，注意不要有气泡。在通风橱中晾干除味后在显微镜下观察统计即可。

图5和图6分别为对照组小鼠和给肽组小鼠的脑组织切片HE染色图。从图5和图6可以看出，HE染色后对照组的小鼠脑组织的肿瘤较大，而给肽组小鼠的脑组织肿瘤较小，说明P2短肽对胶质瘤有一定的治疗效果。

综上所述，本发明筛选得到的P1、P2、P3短肽可以作为潜在的恶性胶质瘤治疗药物，特异性的抑制L1/HPA/CD24信号轴的表达，从而抑制恶性胶质瘤的增殖，其中P2短肽的抑制作用最为明显。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨小骏 刘培

<120> 一种抑制胶质瘤的短肽及其应用

<130> PCQYX198258

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ala-Arg-Asp-Ser-Lev-Met-Phe

<400> 1

Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ser Glu Arg Leu Glu Val Met

1 5 10 15

Glu Thr Pro His Glu

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr

<400> 2

Thr Arg Pro Ala Arg Gly Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Arg Thr Tyr Arg

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Arg- Ser- His- Ser- Ser- Tyr- His

<400> 3

Ala Arg Gly Ser Glu Arg His Ile Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr

1 5 10 15

Tyr Arg His Ile Ser

20

Claims (6)

1.一种抑制胶质瘤的短肽，其特征在于：其为如下SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列：Trp-Arg-Ser-His-Ser-Ser-Tyr。

2.根据权利要求1所述的短肽在制备治疗或预防胶质瘤的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述胶质瘤包括维型星形细胞瘤、低度恶性星形细胞瘤、退变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述短肽靶向抑制L1/HPA/CD24信号轴。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码权利要求1所述的短肽。

6.一种载体，所述载体含有权利要求5所述的多核苷酸。

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