CN103555731A - NF-κB RelA/p65的Ser536磷酸化基因及其用途 - Google Patents

Abstract

NF-κB RelA/p65的Ser536磷酸化基因及其用途。本发明公开了一种可用于抗癌基因治疗的基因及抗癌蛋白，基因核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。该基因及其编码的蛋白质参与调控肿瘤细胞的生长、侵袭及转移，可以用该基因抑制肿瘤的生长、侵袭与转移，达到抗癌效果，在肿瘤的基因治疗等方面，具有广泛的用途。

Description

NF-κB RelA/p65的Ser536磷酸化基因及其用途

技术领域

本发明涉及医疗领域，具体涉及癌症或肿瘤的预防和治疗，尤其涉及与抑制癌症有关的基因及其用途。

背景技术

真核转录因子蛋白家族 NF-κB RelA/p65是免疫应答和炎症反应中的关键调控蛋白。哺乳动物的 NF-κB/Rel 家族包括5个亚单位，它们分别是Rel (cRel)、p65 ( RelA、NF-κB3)、 RelB、p50 /p105 ( NF-κB1) 和 p52 /p100 (NF-κB2)。各亚单位通过其N末端的Rel同源域 ( Rel homology domain，RHD) 组成同源或者异源二聚体。

NF-κB激活肝癌，乳腺癌，胰腺癌，直肠癌，促进癌细胞的生长和转移。对NF-κB的抑制使得胰腺癌细胞对由化学药物诱导的细胞凋亡变得敏感。从NF-κB 发现至今，人们对其结构和功能进行了广泛的研究。最近的研究表明，作为 NF-κB 的一个亚单位的 RelA/p65，其翻译后修饰能够精细地调控 NF-κB 的转录激活，并在肿瘤、炎症反应及炎症反应相关疾病的发生和发展过程中发挥重要的作用。

NF-κB转录后的修饰包括磷酸化，乙酰化和甲基化。RelA/p65 是NF-κB 家族中最重要的亚基/成员，RelA/p65 磷酸化是一种决定性的翻译后激活调节机制。迄今为止RelA/p65共有12个磷酸化位点被确定，包括9个丝氨酸和3个苏氨酸。其中，Ser205，Thr254，Ser276，Ser281和Ser311位于或毗邻同源域（RHD）的N-端，而Thr435，Ser468，Thr505，Ser529，Ser535，Ser536和Ser547磷酸化位点则位于反式激活域的C-端。

Ser536是 RelA/p65一个重要的磷酸化位点，可以被多种磷酸化激酶磷酸化，例如IκB激酶，TANK结合激酶（TBK1），核糖体亚基激酶1（RSK1）等都可激活Ser536。我们的研究结果表明，在正常结肠黏膜，从隐窝底部到顶端的阶段，RelA/p65 Ser536磷酸化逐步增加，在即将凋亡和脱落入肠道管腔的成熟上皮细胞中的表达达到高峰。但相比之下，在结肠癌细胞中RelA/p65 Ser536磷酸化显着减少。在培养的乳腺癌（MCF7）和结肠癌（HCT116）细胞中，NF-κB RelA/p65 Ser536磷酸化（即NF-κB/p65S536D）引起戏剧性的细胞凋亡，细胞自噬，及细胞衰老。将Ser536磷酸化的NF-κB RelA/p65（即NF-κB/p65S536D）注射入小鼠移植瘤，能有效地抑制肿瘤生长。我们的数据表明，Ser536的磷酸化赋予NF-κB RelA/p65肿瘤抑制作用；NF-κB RelA/p65在肿瘤发生中的促癌或抑癌作用，取决于其特异性活性位点的激活。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够抑制肿瘤生长，用于肿瘤基因治疗的NF-κB RelA/p65Ser536磷酸化基因（即NF-κB/p65S536D）的cDNA序列，以及该cDNA序列编码的蛋白，并用来抑制癌症或肿瘤，进行抗癌或肿瘤治疗，及其相关实验治疗。

本发明提供了一种NF-κB RelA/p65的Ser536磷酸化基因的cDNA序列，命名：Ser536持续活化型p65基因，即NF-κB/p65S536D基因，在GenBank登陆号: L19067.1所示天然NF-κB RelA/p65基因的基础上突变而成，所述突变导致编码的第276位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，第536位由丝氨酸突变为天冬氨酸，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其简并序列。

本发明还提供所述的NF-κB/p65S536D基因在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。

本发明还提供一种NF-κB p65的Ser536磷酸化基因cDNA序列编码的蛋白，命名：Ser536持续活化型p65蛋白，即NF-κB/p65S536D蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该蛋白含有永续性Ser536磷酸化活性，能够抑制癌症的生长、侵袭与转移，为抑癌因子，可用于抗癌治疗。

本发明还提供一种NF-κB RelA/p65 siRNA序列，即：NF-κB/p65 siRNA/shRNA，其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，可用来沉默内、外源性NF-κB RelA/p65，用来进行NF-κB RelA/p65基因的功能与作用机制的研究。

本发明还提供一种NF-κB RelA/p65基因突变型cDNA序列，即NF-κB/p65siRNA-Res，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，以抵抗上述NF-κB/p65 siRNA/shRNA的攻击，但是不改变RelA/p65基因编码的蛋白及蛋白的功能，可用来进行NF-κB RelA/p65基因的功能与作用机制的研究。

本发明还提供含有所述的NF-κB/p65S536D基因或所述的NF-κB/p65siRNA/shRNA序列或所述的NF-κB RelA/p65基因突变型cDNA序列的表达载体，含有所述表达的重组细胞或重组宿主菌。

本发明具有的有益效果是：本发明提供的Ser536持续活化型p65基因（即NF-κB/p65S536D基因）是一种抑癌基因，它编码的蛋白质具有永续性Ser536磷酸化活性，同时还具有Ser276显性失活的特征。NF-κB/p65S536D基因是在人体自身存在的天然基因即NF-κB RelA/p65的基础上进行人工改造而成的新型基因。天然NF-κB RelA/p65基因在癌症的发生发展中存在双面性与不确定性，但是在绝大多数情况下，起促癌基因的作用，实验研究证明，我们的这一改造不但去掉了其促癌作用，而且使其具有极强活性的抑癌性，成为抑癌基因，因此该基因及其编码的蛋白质参与调控并抑制肿瘤细胞的生长、侵袭及转移，达到抗癌效果，在肿瘤的基因治疗等方面，具有广泛的用途。本发明NF-κB RelA/p65 siRNA序列（即NF-κB/p65siRNA/shRNA），可用来沉默内、外源性NF-κB RelA/p65，用来进行NF-κB RelA/p65基因的功能与作用机制的研究；NF-κB RelA/p65基因突变型cDNA序列（即NF-κB/p65siRNA-Res），以抵抗上述NF-κB/p65siRNA/shRNA的攻击，但是不改变RelA/p65基因编码的蛋白及蛋白的功能，可用来进行NF-κB RelA/p65基因的功能与作用机制的研究。

附图说明

图1. NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）诱导乳腺癌细胞MCF7凋亡。

其中，NF-κB/p65S536D基因与对照空白载体分别转染乳腺癌细胞MCF7，72小时后进行显微照相，左：空白载体；右：NF-κB/p65S536D基因。

图2. NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）诱导结肠癌细胞HCT116凋亡。

其中，NF-κB/p65S536D基因与对照空白载体分别转染结肠癌细胞HCT116，72小时后进行显微照相，左：空白载体；右：NF-κB/p65S536D基因。

图3 .NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）诱导的乳腺癌细胞MCF7自噬。

其中，NF-κB/p65S536D基因与对照空白载体分别转染乳腺癌细胞MCF7，72小时后进行吖啶橙（acridine orange）染色及显微照相。

图4. NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）诱导结肠癌细胞HCT116衰老。

其中，NF-κB/p65S536D基因与对照空白载体分别转染结肠癌细胞HCT116，72小时后进行衰老相关性β-半乳糖苷酶染色及显微照相，左：空白载体；右：NF-κB/p65S536D基因。

图5. NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）诱导结肠癌细胞HCT116凋亡。

其中，NF-κB/p65S536D基因与对照空白载体分别转染结肠癌细胞HCT116，培养92小时后，用胰蛋白酶-EDTA从平板上收集细胞，并进行Annexin V-APC (BD Biosciences, NJ) 和PI染色，然后进行流式细胞分析，左：空白载体；右：NF-κB/p65S536D基因。

图6. NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）抑制小鼠结肠移植瘤生长。

其是用荧光素酶标记的HCT116细胞（1x10⁷细胞/注射）与等体积基底膜基质蛋白（Matrigel basement membrane matrix）(BD Biosciences, NJ）混合，皮下注射到4-6周龄的裸鼠。形成明显肿瘤后，动物随机分组。分别肿瘤內注射NF-κB/p65S536D或空白载体，在不同的时间节点，用体内生物发光法测量肿瘤体积，左：空白载体；右：NF-κB/p65S536D基因。

图7. NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：4）诱导的内源性NF-B RelA/p65沉默。

其是用经典的siRNA转染试剂和方法将NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）双链siRNA转入乳腺癌细胞MCF7，72小时后收集细胞。进行 A) 蛋白印记杂交，示p65蛋白水平下降与B) 实时RT-PCR，示p65 mRNA水平下降。

图8. NF-κB/p65siRNA-Res（SEQ ID NO：4）抵抗NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）诱导的沉默。

其中，NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）与NF-κB/p65siRNA-Res（SEQ ID NO：5）或与野生型NF-κB/p65分别转染乳腺癌细胞MCF7，72小时后收集细胞，进行蛋白质印记杂交。图示NF-κB/p65siRNA-Res （SEQ ID NO：5）抵抗NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）诱导的沉默。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

 

实施例1  NF-κB/p65S536D基因（SEQ ID NO：1）的构建

用PCR方法，从人原性细胞扩增及克隆天然NF-κB RelA/p65基因（GenBank登陆号: L19067.1），获得NF-κB RelA/p65载体。然后在此基础上，用基于PCR方法的靶向突变原理，将NF-κB RelA/p65基因中编码276号丝氨酸（Ser）的密码子tcc定位突变为编码丙氨酸（Ala）的gct（或gcc，gca，和gcg）的密码子，再进一步地将编码536号丝氨酸的密码子tcc定位突变为编码天冬氨酸的（Asp）gat（或gac）密码子，即获得NF-κB/p65S536D基因序列。然后将NF-κB/p65S536D基因序列克隆到pCDH慢病毒载体(System Biosciences, CA)，获得pCDH-NF-κB/p65S536D克隆。然后用常规方法扩增、纯化获得批量的pCDH-NF-κB/p65S536D质粒。该改造去掉了NF-κB RelA/p65基因的促癌作用，产生永续性抑癌作用，见后续实施例。

  

实施例2  NF-κB/p65S536D诱导乳腺癌及结肠癌细胞凋亡、自噬及衰老

将pCDH-NF-κB/p65S536D慢病毒载体与包装载体VSVG，Gag与Rev，体外转染试剂（TurboFect，Fisher Scientific, FL) 转染入人胚肾（HEK）293T细胞，包装假型pCDH病毒，48小时后，使用0.22μm的注射器过滤器（Fisher Scientific公司，美国）过滤收集上清液。加入4ug/ml聚凝胺(Millipore, MA)传染病毒，比例为MOI=5。空白载体作对照，细胞平板培养72小时，显微镜检测受感染的细胞（图1-2），或吖啶橙（acridine orange）染色检测细胞自噬，或衰老相关性β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，或流式细胞技术分析检测细胞凋亡。结果：乳腺癌细胞MCF7显微照相显示NF-κB/p65S536D诱导大量细胞死亡（右）（图1）。 结肠癌细胞HCT116显微照相显示NF-κB/p65S536D诱导大量细胞死亡（右）（图2）。

吖啶橙（acridine orange）染色检测细胞自噬：感染pCDH-NF-κB/p65S536D的乳腺癌细胞MCF7在6孔板培养72小时后用1μg/ml的吖啶橙的孵育15分钟，替换新鲜培养基后由倒置荧光显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)照像。用488nm的蓝光激发，分别用绿色（510-530nm）和红色（>650nm的）照相。结果见图3：NF-κB/p65S536D诱导的乳腺癌细胞MCF7自噬。

衰老相关性β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老：感染pCDH-NF-κB/p65S536D的结肠癌细胞培养6天，用甲醇固定6分钟，PBS漂洗3次，然后按照说明书用衰老细胞组化染色试剂盒（senescent cell histochemical staining kit）(Sigma-Aldrich, MO)染色。通过显微镜观察蓝染的细胞。结果见图4：NF-κB/p65S536D诱导的结肠癌细胞衰老。

流式细胞技术分析检测细胞凋亡：感染pCDH-NF-κB/p65S536D的乳腺癌细胞MCF7在6孔板培养92小时后，用胰蛋白酶-EDTA从平板上收集细胞，并用冰冷的含有2％马血清的PBS洗细胞三次，然后在冰上用70％乙醇固定。用Annexin V-APC (BD Biosciences, NJ)和PI在FACS结合缓冲液（10mM Hepes/NaOH, pH7.4, 140mM NaCl, and 2.5mM CaCl2)染色15min，然后进行流式细胞分析，结果见图5。

 

实施例3  NF-κB/p65S536D抑制小鼠移植瘤生长

用荧光素酶标记的HCT116细胞（1x10⁷细胞/注射）与等体积基底膜基质蛋白（Matrigel basement membrane matrix）(BD Biosciences, NJ）混合，皮下注射到4-6周龄的裸鼠（Harlan 实验室，Madison, WI)。形成明显肿瘤后，动物随机分组。分别肿瘤內注射NF-κB/p65S536D或空白载体，在不同的时间节点，测量肿瘤体积。其方法是用150mg/kg D-荧光素（D-luciferin，Gold biotechnology, MO）腹腔给药，用体内生物发光法成像并定量 (Caliper lifesciences, MA)。结果见图6：NF-κB/p65S536D抑制小鼠移植瘤生长。

 

实施例4  NF-κB/p65siRNA/shRNA沉默内源性NF-κB RelA/p65

用siRNA设计软件分析NF-κB RelA/p65基因序列，预测多个活性siRNA，然后化学合成其双链，并进行生物活性测试，选定活性siRNA序列。该选定序列可作为小分子siRNA使用，也可构成shRNA表达载体，因此称之为NF-κB/p65siRNA/shRNA，其选定序列为SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO:4。具体步骤：双链siRNA用化学方法合成，用常规的siRNA转染试剂和方法转入乳腺癌细胞MCF7，72小时后收集细胞。使用Lysis-M buffer (Roche, IN)溶解细胞，按照说明书制备可溶性蛋白质，用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Fisher, FL)定量蛋白质浓度。通过12% SDS-PAGE分离蛋白质（50ug），转移到醋酸纤维膜上，用p65抗体进行蛋白质印记杂交（Western blot）或实时RT-PCR示p65 mRNA水平。结果见图7：NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4）诱导的内源性NF-B RelA/p65沉默，蛋白及mRNA水平下降。

 

实施例5　NF-κB/p65siRNA-Res抵抗NF-κB/p65 siRNA或shRNA诱导的沉默

SEQ ID NO：5是一种NF-κB RelA/p65基因的突变基因，其是在GenBank登陆号: L19067.1所示天然NF-κB RelA/p65基因的基础上核苷酸碱基突变而成，但所述突变不改变任何编码的氨基酸，转入宿主细胞后能发挥正常NF-κB RelA/p65基因的功能和作用，但是，该突变能抵抗NF-κB/p65 siRNA或shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）诱导的沉默。因此该序列的特点是，可用于对NF-κB/p65基因的任何靶向突变及基因改造。

NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）与NF-κB/p65siRNA-Res（SEQ ID NO：5）或与野生型NF-κB/p65分别转染乳腺癌细胞MCF7，72小时后收集细胞。使用Lysis-M buffer (Roche, IN) 溶解细胞，按照说明书制备可溶性蛋白质，用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Fisher, FL)定量蛋白质浓度。通过12% SDS-PAGE分离蛋白质（50ug），转移到醋酸纤维膜上，用p65抗体进行蛋白质印记杂交（Western blot）。结果见图8：NF-κB/p65siRNA-Res（SEQ ID NO：5）抵抗NF-κB/p65siRNA/shRNA（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）诱导的沉默（蛋白水平下降）。

序列表

 

<110>湖南莱拓福生物科技有限公司

<120> NF-κB RelA/p65的Ser536磷酸化基因及其用途

 

<160> 5

<210> 1

<211> 1656

<212> DNA

<400> 1

atg gacgaac tgttccccct catcttcccg gcagagccag cccaggcctc tggcccctat 60

gtggagatca ttgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct tccgctacaa gtgcgagggg 120

cgctccgcgg gcagcatccc aggcgagagg agcacagata ccaccaagac ccaccccacc 180

atcaagatca atggctacac aggaccaggg acagtgcgca tctccctggt caccaaggac 240

cctcctcacc ggcctcaccc ccacgagctt gtaggaaagg actgccggga tggcttctat 300

gaggctgagc tctgcccgga ccgctgcatc cacagtttcc agaacctggg aatccagtgt 360

gtgaagaagc gggacctgga gcaggctatc agtcagcgca tccagaccaa caacaacccc 420

ttccaagttc ctatagaaga gcagcgtggg gactacgacc tgaatgctgt gcggctctgc 480

ttccaggtga cagtgcggga cccatcaggc aggcccctcc gcctgccgcc tgtcctttct 540

catcccatct ttgacaatcg tgcccccaac actgccgagc tcaagatctg ccgagtgaac 600

cgaaactctg gcagctgcct cggtggggat gagatcttcc tactgtgtga caaggtgcag 660

aaagaggaca ttgaggtgta tttcacggga ccaggctggg aggcccgagg ctccttttcg 720

caagctgatg tgcaccgaca agtggccatt gtgttccgga cccctcccta cgcagacccc 780

agcctgcagg ctcctgtgcg tgtctccatg cagctgcggc ggcctgctga ccgggagctc 840

agtgagccca tggaattcca gtacctgcca gatacagacg atcgtcaccg gattgaggag 900

aaacgtaaaa ggacatatga gaccttcaag agcatcatga agaagagtcc tttcagcgga 960

cccaccgacc cccggcctcc acctcgacgc attgctgtgc cttcccgcag ctcagcttct 1020

gtccccaagc cagcacccca gccctatccc tttacgtcat ccctgagcac catcaactat 1080

gatgagtttc ccaccatggt gtttccttct gggcagatca gccaggcctc ggccttggcc 1140

ccggcccctc cccaagtcct gccccaggct ccagcccctg cccctgctcc agccatggta 1200

tcagctctgg cccaggcccc agcccctgtc ccagtcctag ccccaggccc tcctcaggct 1260

gtggccccac ctgcccccaa gcccacccag gctggggaag gaacgctgtc agaggccctg 1320

ctgcagctgc agtttgatga tgaagacctg ggggccttgc ttggcaacag cacagaccca 1380

gctgtgttca cagacctggc atccgtcgac aactccgagt ttcagcagct gctgaaccag 1440

ggcatacctg tggcccccca cacaactgag cccatgctga tggagtaccc tgaggctata 1500

actcgcctag tgacaggggc ccagaggccc cccgacccag ctcctgctcc actgggggcc 1560

ccggggctcc ccaatggcct cctttcagga gatgaagact tctccgatat tgcggacatg 1620

gacttctcag ccctgctgag tcagatcag ctcc taa1656

<210> 2

<211> 551

<212> 氨基酸

<400> 2

 

Met Asp Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala Ser Gly Pro Tyr 20

Val Glu Ile Ile Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg Tyr Lys Cys Glu Gly 40

 Arg Ser Ala Gly Ser Ile Pro Gly Glu Arg Ser Thr Asp Thr Thr Lys Thr His Pro Thr  60

Ile Lys Ile Asn Gly Tyr Thr Gly Pro Gly Thr Val Arg Ile Ser Leu Val Thr Lys Asp  80

Pro Pro His Arg Pro His Pro His Glu Leu Val Gly Lys Asp Cys Arg Asp Gly Phe Tyr 100

 Glu Ala Glu Leu Cys Pro Asp Arg Cys Ile His Ser Phe Gln Asn Leu Gly Ile Gln Cys 120

 Val Lys Lys Arg Asp Leu Glu Gln Ala Ile Ser Gln Arg Ile Gln Thr Asn Asn Asn Pro 140

 Phe Gln Val Pro Ile Glu Glu Gln Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Asn Ala Val Arg Leu Cys 160

 Phe Gln Val Thr Val Arg Asp Pro Ser Gly Arg Pro Leu Arg Leu Pro Pro Val Leu Ser 180

 His Pro Ile Phe Asp Asn Arg Ala Pro Asn Thr Ala Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn 200

Arg Asn Ser Gly Ser Cys Leu Gly Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln 220

Lys Glu Asp Ile Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser Phe Ser 240

Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Pro Tyr Ala Asp Pro 260

Ser Leu Gln Ala Pro Val Arg Val Ser Met Gln Leu Arg Arg Pro Ala Asp Arg Glu Leu 280

Ser Glu Pro Met Glu Phe Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu 300

Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly 320

Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala Ser 340

Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr 360

Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala 380

Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val 400

Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala 420

Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu 440

Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro 460

Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln 480

Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile 500

Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala 520

Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Asp Ile Ala Asp Met 540

Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser 551

 

 

<210> 3

<211> 19  

<212> DNA

<400> 3

accatcaagatcaatggct

                                               

<210> 4

<211> 19  

<212> DNA

<400> 4

agccattgatcttgatggt

 

 <210> 5

<211> 1656  

<212> DNA

<400> 5

 

atg gacgaac tgttccccct catcttcccg gcagagccag cccaggcctc tggcccctat 60

gtggagatca ttgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct tccgctacaa gtgcgagggg 120

cgctccgcgg gcagcatccc aggcgagagg agcacagata ccaccaagac ccaccccaca180

attaaaatta acggatacac aggaccaggg acagtgcgca tctccctggt caccaaggac 240

cctcctcacc ggcctcaccc ccacgagctt gtaggaaagg actgccggga tggcttctat 300

gaggctgagc tctgcccgga ccgctgcatc cacagtttcc agaacctggg aatccagtgt 360

gtgaagaagc gggacctgga gcaggctatc agtcagcgca tccagaccaa caacaacccc 420

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cgaaactctg gcagctgcct cggtggggat gagatcttcc tactgtgtga caaggtgcag 660

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cccaccgacc cccggcctcc acctcgacgc attgctgtgc cttcccgcag ctcagcttct 1020

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gacttctcag ccctgctgag tcagatcagc tcc taa 1656

 

Claims (10)

1.一种NF-κB RelA/p65基因的突变基因，其特征在于，在GenBank登陆号: L19067.1所示天然NF-κB RelA/p65基因的基础上突变而成，所述突变导致编码的第276位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，第536位由丝氨酸突变为天冬氨酸，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其简并序列。

2.如权利要求1所述的突变基因在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。

3.如权利要求1所述的突变基因编码的抗癌蛋白，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求3所述的抗癌蛋白在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。

5.一种siRNA或shRNA，其中siRNA碱基序列如SEQ ID NO:3所示，shRNA A碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

6.如权利要求5所述的siRNA或shRNA在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。

7.一种RelA/p65靶向突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.如权利要求7所述的突变基因在制备预防或治疗肿瘤药物及制备靶向突变体与基因改造体中的用途。

9.含有权利要求1所述的突变基因或权利要求5所述的siRNA或shRNA或权利要求7所述的突变基因的表达载体。

10.含有权利要求9所述的表达载体的重组细胞或重组宿主菌。

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