ES2575526T3

ES2575526T3 - Endoglucanasa STCE y preparación de celulasa que contiene la misma

Info

Publication number: ES2575526T3
Application number: ES04792875.9T
Authority: ES
Inventors: Jinichiro Koga; Yuko Baba; Akitaka Nakane; Satoshi Hanamura; Tomoko Nishimura; Shuichi Gomi; Hidetoshi Kubota; Toshiaki Kono
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2024-10-22
Also published as: EP1700917A1; CN102766614A; CN1902315A; EP1700917A4; US20070111278A1; CN1902315B; JPWO2005054475A1; EP1700917B1; US7595182B2; JP4547335B2; WO2005054475A1; DK1700917T3

Abstract

Una proteína que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, (b) una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 30 aminoácidos se han eliminado, sustituido, insertado, o añadido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y que tiene una actividad endoglucanasa, y (c) una proteína homóloga que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la de SEQ ID NO: 3, y que tiene una actividad endoglucanasa.

Description

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invención puede contener otras enzimas celulasas, tales como celobiohidrolasa, β-gulucosidasa, y/o una endoglucanasa distinta de la endoglucanasa de la presente invención.

El granulo sin polvo (preferentemente un gránulo que no tenga pulverulencia), que es una forma de preparación de celulasa, puede producirse de acuerdo con el procedimiento de granulación en seco común. Es decir, una proteína en polvo de la presente invención se mezcla con una o una pluralidad de sustancias que se seleccionan de entre el grupo que comprende sales inorgánicas (tales como sulfato sódico o cloruro sódico) que son neutras y no tienen efecto sobre la actividad de la endoglucanasa; minerales (tales como la bentonita o montmorilonita) que no tienen efecto sobre la actividad de la endoglucanasa; y sustancias orgánicas neutras (tales como el almidón o la celulosa molida). A continuación, se añaden a la mezcla polvos o la suspensión finamente suspendida de uno o una pluralidad de tensioactivos no iónicos, y luego el producto que se obtiene se mezcla completamente o se amasa. Dependiendo de la situación, se añade opcionalmente un polímero sintético (tal como polietilenglicol) o un polímero natural (tal como el almidón), que se une a los sólidos y se amasa adicionalmente. A continuación se lleva a cabo la granulación por moldeado en extrusión, utilizando por ejemplo, un granulador de disco, y el material moldeado obtenido se convierte entonces en una forma esférica utilizando un Marumerizer seguido por secado, de forma que se pueden producir gránulos sin polvo. La cantidad de uno o una pluralidad de surfactantes no iónicos no está particularmente limitada, y es preferentemente del 0,1 al 50 % por peso, más preferentemente del 0,1 al 30 % por peso, más preferentemente de 1 al 10 % por peso de la cantidad total de preparación de celulasa de la presente invención.

Además, la preparación líquida que es una de las preparaciones de celulasa (preferentemente un líquido estabilizado), se puede preparar mezclando un estabilizador de endoglucanasa (tal como un polímero sintético o natural) con una solución que contiene la proteína de la presente invención, y si fuera necesario, añadir sales inorgánicas y/o un conservante sintético. En este caso, se pueden mezclar uno o una pluralidad de tensioactivos no iónicos con la preparación líquida. La cantidad de uno o una pluralidad de tensioactivos no iónicos no está particularmente limitada, y es preferentemente del 0,1 al 50 % por peso, más preferentemente del 0,1 al 30 % por peso, más preferentemente del 1 al 10 % por peso de la cantidad total de la preparación de celulasa de la presente invención.

Además, la presente invención proporciona una composición de detergente que comprende la proteína de la presente invención o la preparación de celulasa de la presente invención. La composición detergente puede comprender también tensioactivos, que pueden ser aniónicos, no iónicos, catiónicos, anfotéricos, o zwiteriónicos, o una mezcla de los mismos. La composición detergente puede comprender otras composiciones detergentes conocidas en la técnica, por ejemplo, un adyuvante de detergencia, blanqueador, agente blanqueante, un inhibidor de deslustre, un secuestrante, un polímero liberador de suelo, saborizante, otras enzimas (tales como proteasas, lipasas, o amilasas), un estabilizador para enzimas, un granulador, un abrillantador óptico, y/o un agente espumante. Como tensioactivos aniónicos típicos se pueden mencionar, por ejemplo, sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS), alquil sulfato (AS), α-olefin sulfonato (AOS), alquiléter sulfonato de polioxietileno (AES), α-sulfoéster de ácidos grasos (α-SFMe), o sales alcalinometálicas o ácidos grasos de origen natural. Como tensioactivos no iónicos, se pueden mencionar, por ejemplo, alquil éter de polioxietileno (AE), glicol éter de alquilpolietileno, glicol éter de nonilfenol polietileno, etoxilato de metil éster de ácido graso, sacarosa, o éster de ácido graso glucosa, o ésteres de alquilglucósido o alquilglucósido polietoxilado.

El procedimiento de la presente invención para tratar un tejido que contiene celulosa se lleva a cabo poniendo en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína de la presente invención, la preparación de celulasa de la presente invención, o la composición detergente de la invención. Las siguientes propiedades del tejido que contiene celulosa pueden mejorarse con el procedimiento de la presente invención:

(1): Eliminación de pelusa (reducción de la tasa de formación de pelusa, y reducción de pelusa);

(2): Mejoría del tacto y apariencia de un tejido reduciendo su peso;

(3): Clarificación del color de un tejido que contiene celulosa coloreada;

(4): Proporciona un cambio de color localizado a un tejido que contiene celulosa coloreada, es decir, proporciona una apariencia y textura tipo lavado a la piedra a un tejido que contiene celulosa coloreada, típicamente tela vaquera; y

(5): Suaviza un tejido (reducción de la tasa de rigidez, y una reducción de la rigidez).

Más particularmente, el procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo añadiendo la proteína de la presente invención, la preparación de celulasa de la presente invención, o la composición detergente de la presente invención en el agua en la que el tejido se empapará, por ejemplo durante el remojo, lavado o aclarado de un tejido.

Las condiciones tales como la temperatura de contacto o la cantidad de proteína, preparación de celulasa, o composición detergente que se va a añadir puede determinarse apropiadamente de acuerdo con otras distintas condiciones. Por ejemplo, cuando se reduce la tasa de formación de pelusa o se reduce la pelusa del tejido que contiene celulosa, la proteína, la preparación de celulasa, o la composición detergente con una concentración proteica 0,01 a 20 mg/l se utilizan preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a 60 C.

Cuando se reduce el peso para mejorar el tacto y apariencia de un tejido que contiene celulosa, la proteína, la

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La actividad de liberación de fibrillas del algodón absorbente se ensayó de acuerdo con una modificación del procedimiento de Neena Din y col. [Neena Din y col., "Biotechnology", 9(1991), p. 1096-1099]. Es decir, se midió una absorbancia a 600 nm utilizando un Launder Meter en las siguientes condiciones, para determinar la cantidad de pelusa liberada del algodón absorbente.

Aparato de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón)

Temperatura: 40 C

Tiempo: 120 minutos

pH de reacción: pH 7 (50 mmol/l de tampón fosfato)

Se añadió a una solución de tratamiento, una cantidad adecuada de algodón absorbente y perlas inoxidables junto con cada fracción de solución.

Ejemplo 2: Secuenciación de secuencias de aminoácidos parciales de endoglucanasas STCE1 y STCE3 derivadas de Staphylotrichum coccosporum

(1): Identificación de secuencias de aminoácidos hacia el extremo N de STCE1 y STCE3

La fracción STCE1 y la fracción STCE3 que se obtuvieron en el Ejemplo 1 se sometieron a SDS-PAGE, y se transfirieron eléctricamente a un membrana PVDF Problot™ (Applied Biosystems). La membrana se tiñó con una solución de tinción CBB (0,1 % azul Coomasie G250, 30 % de metanol, y 10 % de ácido acético), y se decoloró y se secó al aire. De la membrana, se escindieron cada una de las porciones, de las cuales se transfirió una proteína (STCE1) que tenía un peso molecular de aproximadamente 49 kD que se correspondía con la fracción STCE1 o una proteína (STCE3) que tenía un peso molecular de aproximadamente 45 kD que se correspondía con la fracción STCE3. Cada pieza escindida se mojó con una cantidad minuto de metanol, se lavó ligeramente con un tampón de reducción (8 mol/l de hidrocloruro de guanidina, 0,5 mol/l Tris, un 0,3 % EDTA-Na2, y un 5 % de acetonitrilo), y se sumergieron en un microtubo con aproximadamente 100 µl del tampón de reducción. Tras añadir 1 mg de ditiotreitol al microtubo, se llenó el microtubo con gas nitrógeno y se selló. El microtubo se dejó en reposo durante más de 1 hora, y se añadieron 1,5 µl de vinilpiridina (Aldrich) al mismo, para llevar a cabo la piridiletilación de los restos de cisteína de la proteína durante más de 20 minutos con agitado ocasional, mientras se protegía de la luz. Cada pieza se lavó con agua desionizada y a continuación con un 2 % de acetonitrilo, y se procesó en un secuenciador Procise491 (Applied Biosystems) para determinar las secuencias de aminoácidos del extremo N (25 restos) de STCE1 y STCE3. Las secuencias de aminoácidos del extremo N (25 restos) de STCE1 y STCE3 se concordaron una con otra, y la secuencia era la siguiente: Secuencia de aminoácidos del extremo N de STCE1 y STCE3: Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn (25 restos) (SEQ ID NO: 1).

(2): Identificación de secuencias de aminoácidos internas de STCE1 y STCE3

Las STCE1 y STCE3 que se obtuvieron en el Ejemplo 1 se desalaron utilizando un Ultrafree/Biomax-5K (Millipore), y se liofilizaron. Cada una de STCE1 y STCE3 (aproximadamente 40 µg) se transfirieron independientemente a un microtubo de 1,5 ml, y se disolvieron en 500 µl del tampón de reducción. Después se añadieron 1,4 mg de ditiotreitol al microtubo, se llenó el microtubo con gas nitrógeno y se selló. El microtubo se dejó en reposo durante 5 horas. Además, se añadió al mismo 2,7 mg de mono-yodoacetato y se dejó en reposo durante 30 minutos mientras se protegía de la luz, para llevar a cabo la carboximetilación de los restos de cisteína de la proteína. Se desaló todo y se concentró utilizando un Ultrafree/Biomax-5K (Millipore). A cada una de las STCE1 y STCE3 carboximetiladas reducidas (aproximadamente 10 µg), se añadió una cantidad molar de aproximadamente 1/100 de endopeptidasa de lisis (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.), y se llevó a cabo la digestión en 50 µl de tampón Tris a 50 mmol/l (pH 9,0) a 37 C durante 72 horas. Cuando se aplicó cada solución de STCE1 y STCE3 digeridas a un sistema 173A Micro Blotter (Applied Biosystems), se transfirieron siete péptidos por separado a una membrana PVDF [poli (difluoruro de vinildeno)]. Las secuencias de aminoácidos de los fragmentos peptídicos que se obtuvieron se determinaron con un secuenciador de proteínas.

Las secuencias internas de aminoácidos de STCE1 eran las siguientes:

LE-1: Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 restos) (SEQ ID NO: 4)

LE-2: Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 restos) (SEQ ID NO: 5)

LE-3: Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 restos) (SEQ ID NO: 6)

LE-4: Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys (10 restos) (SEQ ID NO: 7)

LE-5: Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe (7 restos) (SEQ ID NO: 8)

LE-6: Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr (7 restos) (SEQ ID NO: 9)

LE-7: Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu (9 restos) (SEQ ID NO: 10)

Cuando la secuencia de aminoácidos del extremo N y las secuencias internas de aminoácidos que se obtuvieron por mapeo peptídico se utilizaron para llevar a cabo una búsqueda de homología, el resultado sugería que STCE1 era una nueva endoglucanasa que pertenecía a la familia 45.

Las secuencias internas de aminoácidos de STCE3 eran las siguientes:

LE-8: Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys (8 restos) (SEQ ID NO: 11) LE-9: Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys (9 restos) (SEQ ID NO: 12) LE-10: Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg (10 restos) (SEQ ID NO: 13) LE-11: Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg (16 restos) (SEQ ID NO: 14)

5 LE-12: Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-Ala-Val-Asn-Asp-Asn (22 restos) (SEQ ID NO: 15) LE-13: Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys (11 restos) (SEQ ID NO: 16) LE-14: Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn (16 restos) (SEQ ID NO: 17)

A partir de la búsqueda de homología utilizando la secuencia de aminoácidos del extremo N y las secuencias

10 internas de aminoácidos que se obtuvieron por el mapeo peptídico, se consideró que STCE3 también era una endoglucanasa que pertenecía a la familia 45. Sin embargo, las secuencias internas de aminoácidos correspondientes a STCE1 y STCE3 concordaban completamente entre ellas, y esto sugería que STCE3 era un producto parcialmente degradado de STCE1.

Ejemplo 3: Evaluación de actividad de la endoglucanasa STCE1 purificada para eliminar pelusa del tejido 15 que contiene celulosa

La solución de preparación de celulasa bruta y la STCE1 purificada, que se obtuvieron en el Ejemplo 1, se utilizaron para evaluar la actividad de eliminación de pelusa en un tejido de punto de algodón.

Los tejidos de punto de algodón teñidos de azul se trataron con un tensioactivo y bolas de goma en una gran lavadora para generar pelusa. Los tejidos de punto de algodón azules con pelusa se trataron en las siguientes

20 condiciones para eliminar la pelusa, hasta calcular la concentración proteica necesaria para eliminar aproximadamente el 50 % de la pelusa formada en base a la evaluación visual, en cada caso de adición de la solución de preparación de celulasa bruta o la endoglucanasa STCE1 purificada.

Aparato de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón) Temperatura: 40 C

25 Tiempo: 60 minutos Cantidad de solución de reacción: 40 ml pH de reacción: pH 6 (5 mmol/l de tampón fosfato)

En cada solución de tratamiento, se añadió un número adecuado bolas de goma con cada solución de endoglucanasa.

30 La concentración proteica se determinó utilizando un kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). El resultado se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1

Concentración proteica necesaria para eliminar el 50 % de pelusa Muestra

del tejido de algodón (mg/l) Solución de preparación de celulasa bruta 95,0 STCE1 purificada 0,21

Ejemplo 4: Evaluación de la actividad decolorante de la endoglucanasa STCE1 purificada en un tejido que 35 contiene celulosa teñido con índigo

Utilizando la solución de preparación de celulasa bruta y la endoglucanasa STCE1 purificada que se obtuvieron en el Ejemplo 1, se llevó a cabo un tratamiento de decoloración de una tela vaquera azul de 340,19 g sin apresto en las siguientes condiciones.

Aparato de ensayo: Lavadora de 20 kg (Lavadora automática SCW5101, Sanyo Electric)

40 Temperatura: 55 C Tiempo: 60 minutos pH de reacción: pH 6,2 (6,7 mmol/l de tampón fosfato) Cantidad de solución de reacción: 15 l

En cada solución de tratamiento, se añadió un número adecuado de bolas de goma con cada solución de 45 endoglucanasa.

Para medir el grado de decoloración, se midió un valor L (claridad) de un sistema Lab utilizando un espectrocolorímetro (CM-525i, Minolta). Un aumento en el valor L (aumento de claridad) con respecto a un control (tejido no tratado) (= valor ΔL) se determinó para evaluar el grado de decoloración. Más particularmente, los valores de ΔL se midieron en 10 puntos (n = 10) en cada grupo de ensayo, y se calculó la media de los mimos. Se calculó la 50 concentración proteica necesaria para un valor ΔL de 5, en cada uno de los casos de adición de las soluciones de

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preparación de celulasa bruta y endoglucanasa STCE1 purificada. La concentración proteica se determinó utilizando un kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). El resultado se muestra en la Tabla 2. Tabla 2

Muestra Concentración proteica necesaria para un valor ΔL (decoloración) de 5 (mg/l)

Solución de preparación de celulasa bruta 108,0

STCE1 purificada 0,37

Ejemplo 5: Evaluación comparativa de la actividad de eliminación de pelusa (actividad de clarificación del color) de endoglucanasas STCE1, NCE4, NCE5, y RCEI purificadas en una composición detergente

Se utilizaron la endoglucanasa STCE1 purificada que se obtuvo en el Ejemplo 1, la endoglucanasa NCE4 purificada obtenida de un cultivo líquido de Humicola insolens (documento WO 98/03640), endoglucanasa NCE5 purificada obtenida de un cultivo líquido de Humicola insolens (documento WO 01/90375), y endoglucanasa RCEI purificada como único componente de Humicola insolens en la que se sobre-expresaba RCEI [RCEI-H4 (25 kD) en la que se había eliminado el dominio de unión a la celulosa (documento WO 02/42474)], para evaluar la actividad de eliminación de pelusa (actividad de clarificación del color) en un tejido de punto de algodón en un detergente tipo occidental.

Los tejidos de punto de algodón teñidos de azul se trataron con un tensioactivo y con bolas de goma en una gran lavadora para generar la pelusa. Los tejidos de punto de algodón azules con pelusa se trataron con un detergente en las siguientes condiciones, para calcular una concentración proteica necesaria para eliminar aproximadamente el 50 % de la pelusa formada basándose en una evaluación visual, en cada uno de los casos de adición de las endoglucanasas STCE1, NCE4, NCE5, y RCEI purificadas.

Aparato de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón) Temperatura: 40 C Tiempo: 60 minutos Cantidad de solución de reacción: 40 ml Detergente: NEW Persil (Funcionamiento en pastillas biológicas) (fabricado por LEVER: obtenido en el Reino Unido en marzo de 2002) Cantidad de detergente: 0,8 % Solución de tratamiento: agua de dureza controlada [25 FH: preparada diluyendo agua de dureza controlada de 1000 FH que contenía 80 mmol/l de cloruro cálcico y 20 mmol/l de cloruro magnésico en agua desionizada, con agua desionizada]

En cada solución de tratamiento, se añadió un número adecuado de bolas de goma con cada solución de endoglucanasa.

La concentración proteica se determinó utilizando un kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

Concentración proteica necesaria para eliminar un 50 % de pelusa del

Muestra

tejido de algodón (mg/l)

STCE1 purificada 2,5

NCE4 purificada 2,5

NCE5 purificada 40,0

RCE1 purificada 200,0 o más

Ejemplo 6: Efecto de la dureza del agua de grifo sobre la actividad de eliminación de pelusa de cada una de las endoglucanasas purificadas

Se utilizaron la endoglucanasa STCE1 purificada que se obtuvo en el Ejemplo 1, la endoglucanasa NCE4 purificada obtenida de un cultivo líquido de Humicola insolens (documento WO 98/03640), endoglucanasa NCE5 purificada obtenida de un cultivo líquido de Humicola insolens (documento WO 01/90375), y endoglucanasa RCEI purificada como único componente de Humicola insolens en la que se sobre-expresaba RCEI [RCEI-H4 (25 kD) en la que se había eliminado el dominio de unión a la celulosa (documento WO 02/42474)], para evaluar la actividad de eliminación de pelusa en un tejido de punto de algodón en agua de dureza controlada.

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de Transferencia HybondN + Nyron, Amersham). Se trató la membrana con hidróxido sódico 0,4 N para inmovilizar los ADN en la membrana, se lavó con 5 x SSC (75 mmol/l de citrato sódico y 750 mmol/l de cloruro sódico), y se secó.

Se preparó una sonda digiriendo un plásmido pJND-c5 (documento WO 01/90375) que contenía un ADNc del gen NCE5 con BamHI y se recolectó un fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %. La sonda se marcó utilizando un sistema de detección de marcado de ADN/ARN directo ECL (Amersham). De acuerdo con un protocolo adjunto al kit, después de que la membrana en la que se había inmovilizado se prehibridara a 42 C durante 1 hora, se añadió la sonda marcada NCE5 para llevar a cabo la hibridación a 42 C durante 15 horas.

Después de la hibridación, la membrana se lavó de acuerdo con el protocolo adjunto al kit de la siguiente manera. La membrana se lavó dos veces con 0,6 x SSC (9 mmol/l de citrato sódico y 90 mmol/l de cloruro sódico) suplementado con un 0,4 % de SDS y 6 mol/l de urea a 42 C durante 20 minutos, y luego se lavaron dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de lavar la membrana se sumergió en una solución de detección adjunta al kit durante 1 minuto, se expuso a la membrana una película de rayos X Fuji medical (Fuji film).

Como resultado, cuando el ADN genómico se digirió con EcoRI, BamHI, XhoI, o NcoI, se hibridaron dos bandas de diferentes longitudes con la sonda. El resultado sugería que había dos genes homólogos al NCE5 en el ADN genómico de Staphylotrichum coccosporum. Cuando el ADN genómico se digirió con EcoRI, se detectaron dos bandas de aproximadamente 10 kpb y aproximadamente 5 kpb en la hibridación. El gen detectado como la banda de aproximadamente 10 kpb se clonó en el siguiente procedimiento.

(3): Preparación de la biblioteca de ADN genómico

Se digirió el ADN genómico de Staphylotrichum coccosporum con EcoRI, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % utilizando un SeaKemLE agarosa (FMC). Los fragmentos de ADN entre aproximadamente 8 a 12 kpb que incluían aproximadamente 10 kpb se extrajeron y purificaron de acuerdo con procedimientos convencionales. Un vector fago (vector Lambda DASH II; Stratagene) se utilizó para unir estos fragmentos de ADN entre ellos. Las construcciones se precipitaron con etanol y se disolvieron en tampón TE. Se utilizó la cantidad completa de la solución y el kit Gigapack III Gold Packaging (Stratagene) para empaquetar las construcciones en las cabezas de los fagos lambda, y se infectó una cepa de Escherichia coli XL1-Blue MRA con los fagos. La biblioteca de fagos que se obtuvo (5 x 104 fagos) se utilizó para clonar un gen de interés.

(4): Exploración de genes homólogos de NCE5 por hibridación en placa

La biblioteca de ADN genómico (biblioteca EcoRI) que se obtuvo en el Ejemplo 7 (3) se transfirió a una membrana de nilón (Membrana de Transferencia Hybond N + Nyron, Amersham). Se trató la membrana con hidróxido sódico 0,4 N para inmovilizar los ADN en la membrana, se lavó con 5 x SSC, y se secó. De acuerdo con el protocolo adjunto al kit anterior, después de una prehibridación a 42 C durante 1 hora, se añadió la sonda marcada NCE5 del Ejemplo 7 (2) para llevar a cabo la hibridación a 42 C durante 15 horas.

Tras la hibridación, la membrana se lavó de acuerdo con el protocolo adjunto al kit de la siguiente manera. La membrana se lavó dos veces con 0,6 x SSC suplementado con 0,4 % y 6 mol/l de urea a 42 C durante 20 minutos, y luego se lavó dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después la membrana lavada se sumergió en una solución de detección adjunta al kit durante 1 minuto, se expuso una película de rayos X Fuji medical (Fuji film) a la membrana. Como resultado, se obtuvieron cuatro clones de fago.

Cada uno de los clones de fago que se obtuvieron se utilizó para infectar Escherichia coli XL-Blue MRA con los mismos. Después de 18 horas desde la infección, las partículas de fago se recolectaron independientemente. De acuerdo con un procedimiento de Grossberger (Grossberger, D., "Nucleic Acids. Res.", 15, 6737, 1987), las partículas de fago recolectadas se trataron con proteinasa K seguido por fenol, y se precipitaron con etanol, para purificar cada fago ADN.

(5) Subclonación del gen homólogo de NCE5

Cada uno de los cuatro clones de los fagos ADN se digirió con una pluralidad de enzimas de restricción, y se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %. Los ADN se transfirieron a una membrana de nilón de acuerdo con un procedimiento de Southern (Southern, E.M., "J. Mol. Biol.", 98, p. 503-517, 1975), y se llevó a cabo la hibridación de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7 (4). Como resultado, se obtuvieron patrones de hibridación en los cuatro clones de fagos ADN, independientemente del tipo de enzima de restricción utilizada. Cuando se digerían los cuarto clones de fagos ADN con SaII, se detectaban comúnmente dos bandas de aproximadamente 4,4 kpb con una fuerte señal y aproximadamente 2,5 kpb con una señal débil en la hibridación como se describe en el Ejemplo 7 (4). Estos resultados indicaban que el gen homólogo de interés se localizaba en ambos ADN de aproximadamente 4,4 kpb y aproximadamente 2,5 kpb, y por lo tanto, se recolectaron ambos ADN y se subclonaron en el plásmido pUC118 en el sitio SaII del mismo, independientemente. El plásmido que se obtuvo subclonando el ADN de aproximadamente 4,4 kpb se llamó pSTCE-SaI4,4, y el plásmido que se obtuvo subclonando el ADN de aproximadamente 2,5 kpb se llamó pSTCE-SaI2,5.

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cabo una PCR para la amplificación añadiendo una polimerasa Taq (Taq recombinante, Takara Shuzo) y el cebador para el lado del extremo N y repitiendo un ciclo que consistía en una reacción a 94 C durante 1 minuto, una reacción a 50 C durante 2 minutos, y una reacción a 72 C durante 2 minutos, 30 veces. El fragmento amplificado se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que era un fragmento de 1 kpb. El fragmento se subclonó en un plásmido pUC18, y el plásmido obtenido se llamó plásmido pUC-STCE1.

(3) Secuenciación del gen STCE1

La secuencia de nucleótido del fragmento obtenido se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. La secuencia de nucleótido determinada se comparó con la del genoma para determinar un intrón. Como resultado, se determinó la longitud completa de la secuencia de nucleótido del ADNc del gen STCE1 derivado de Staphylotrichum coccosporum (SEQ ID NO: 2).

Basándose en la secuencia del ADNc del gen STCE1, se aisló un fragmento de ADN que contenía una región codificante del gen STCE1 que incluía el intrón. Se llevó a cabo una PCR utilizando una mezcla de los cuatro clones de fagos ADN descritos en el Ejemplo 7 (5) como armazón y los siguientes cebadores STCE-HNBam y STCE-HCBam. El fragmento amplificado se separó y purificó por una electroforesis en gel de agarosa, y se digirió con BamHI. Los fragmentos digeridos se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa para separar y purificar el fragmento de interés.

STCE-HNBam: 5’-GGG GGA TCC TGG GAC AAG ATG CGT TCC TCC CCC GTC CTC-3’ (39mero) (SEQ ID NO: 20) STCE-HCBam: 5’-GGG GGA TCC GCT CAA AGG CAC TGC GAG TAC CAG TC-3’ (35mero) (SEQ ID NO: 21)

El fragmento purificado de aproximadamente 1,1 kpb se insertó en el sitio BamHI del plásmido pUC118 para obtener el plásmido pUC118-STCEex (FERM P-19602). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento insertado de acuerdo con el procedimiento que se ha descrito anteriormente, para confirmar la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 22) del intrón y la región codificante del gen STCE1. En este contexto, el codón de parada TAA se cambió por TGA utilizando el cebador STCE-HCBam en la PCR, pero la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada de esta manera se mantenía.

Ejemplo 10: Expresión del gen STCE1 en Humicola insolens

Se construyó un vector de expresión pJND-STCE1 para Humicola insolens MN200-1 (FERM BP-5977), de forma que se fusionaron 16 restos de aminoácidos del extremo N de NCE4 con los restos de aminoácidos remanentes de STCE1 en una proteína que se va a expresar, utilizando el plásmido pJND-NCE4 que se obtiene insertando el gen NCE4 (documento WO 98/03640) en el sitio BamHI del plásmido pJD01 (documento WO 00/24879).

Esto es debido a que los 16 restos de aminoácido del extremo N de NCE4 concuerdan con los de STCE1, y por lo tanto, la proteína expresada en la que se fusionaron los 16 restos de aminoácido del extremo N de NCE4 con los restos de aminoácido remanentes de STCE1 era la misma STCE1.

El plásmido pJND-NCE4 se construyó de la siguiente manera. Para insertar el gen NCE4 (documento WO98/03640) en el sitio BamHI del plásmido pJD01, se diseñaron los siguientes cebadores que contenían sitios BamHI en la región corriente arriba adyacente al codón de inicio y en la región corriente abajo adyacente al codón de parada. De acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 (1) 1) del documento WO 01/90375, el plásmido pCNCE4 (documento WO 98/03640) se utilizó como armazón para amplificar un fragmento de ADN con una mutación por una PCR.

NCE4-N-BamHI: 5’-GGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCC-3’ (39mero) (SEQ ID NO: 23)

NCE4-C-BamHI: 5’-GGGGATCCTGCGTTTACAGGCACTGATGGTACCAGTC-3’ (37mero) (SEQ ID NO: 24)

El ADN amplificado se digirió con BamHI, y se subclonó en el sitio BamHI del plásmido pJD01 [Ejemplo D1(2)(b) del documento WO 00/24879] para obtener el plásmido pJND-NCE4.

(1) Construcción del plásmido de expresión de STCE1

Se llevó a cabo una PCR utilizando el plásmido pUC-STCE1 que se preparó en el Ejemplo 9 (2) como armazón y los siguientes cebadores STCE1-N-S9A4 y STCE1-C-FokF. El fragmento amplificado se separó y purificó por electroforesis en gel de agarosa, y se digirió con BamHI y FokI. Los fragmentos digeridos se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa para separar y purificar el fragmento de interés.

STCE1-N-S9A4: 5’-GGGATCCTGCGTTTAAAGGCACTGCGAGTACCAG-3’(34mero)(SEQ ID NO: 25)

STCE1-C-FokF: 5’-GGGATGCAAGCCGTCGTGCTCGTG-3’(24mero)(SEQ ID NO: 26)

Se llevó a cabo una PCR utilizando el plásmido pJND-NCE4 como armazón y los siguientes cebadores STCE1-N-FokR4 y STCE1-C-BamF. El fragmento amplificado se separó y purificó por una electroforesis en gel de agarosa y se digirió con BamHI y FokI. Los fragmentos digeridos se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa para separar y purificar el fragmento de interés.

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STCE1-N-FokR4:5’-GGGATGGGCCCAGCCGCACGAAG-3’ (23mero) (SEQ ID NO: 27)

STCE1-C-BamF:5’-GGGATCCTGGGACAAGATGC-3’ (20mero) (SEQ ID NO: 28)

Los dos fragmentos que se obtuvieron se insertaron en el sitio BamHI del plásmido pDJ01 para obtener el plásmido pJND-STCE1. La secuencia de nucleótidos del fragmento insertado se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, para confirmar que la secuencia concordaba con la del gen STCE1 (SEQ ID NO: 2).

(2) Preparación del transformante de Humicola insolens con el plásmido pJND-STCE1

Se cultivó Humicola insolens MN200-1 en un medio NS (un 3,0 % de glucosa, un 2,0 % de extracto de levadura, un 0,1 % de peptona, un 0,03 % de cloruro cálcico, un 0,03 % de cloruro magnésico, pH 6,8) a 37 C durante 24 horas. El cultivo se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos para recolectar los micelios. Los micelios obtenidos se lavaron con 0,5 mol/l de sacarosa, y se suspendió en 10 ml de una solución enzimática para generar protoplastos (3 mg/ml de β-glucuronidasa, 1 mg/ml de quitinasa, 1 mg/ml de zimoliasa, y 0,5 mol/l de sacarosa) previamente filtrados con un filtro (0,45 µm). La suspensión se agitó a 30 C durante 60 y 90 minutos para generar protoplastos. La suspensión se filtró, y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos para recolectar los protoplastos. Los protoplastos se lavaron con un tampón SUTC [0,5 mol/l de sacarosa, 10 mmol/l de cloruro cálcico, y 10 mmol/l de Tris-HCl (pH 7,5)].

Los protoplastos se suspendieron en 1 ml de tampón SUTC. A 100 µl de la suspensión se añadieron 10 µl de una solución que contenía 10 µg de plásmido pJND-STCE1, y se dejó en reposo en hielo durante 5 minutos. Además, se añadieron 400 µl de una solución PEG [un 60 % de PEG4000, 10 mmol/l de cloruro cálcico, y 10 mmol/l de Tris-HCl (pH 7,5)], y se dejó en reposo en hielo durante 20 minutos. Después se añadieron 10 ml de tampón SUTC, se centrifugó todo a 2500 rpm durante 10 minutos. Los protoplastos recolectados se suspendieron en 1 ml de tampón SUTC, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos, y finalmente se suspendió en 100 µl de tampón SUTC.

Los protoplastos tratados anteriormente se cubrieron con agar blando YMG, en un medio YMG [un 1 % de glucosa, un 0,4 % de extracto de levadura, un 0,2 % de extracto de malta, y un 1 % de agar (pH 6,8)] que contenía higromicina (200 µg/ml), y se incubó a 37 C durante 5 días para obtener las colonias de transformantes.

(3): Cultivo e identificación de transformantes con pJND-STCE1

(i): Evaluación por SDS-PAGE

A partir de los transformantes que se obtuvieron transformando Humicola insolens MN200-1 con el plásmido pJND-STCE1 según anteriormente, se seleccionaron 40 cepas resistentes a higromicina. Cada cepa se cultivó en un medio (N) (un 5,0 % de avicel, un 2,0 % de extracto de levadura, un 0,1 % de polipeptona, un 0,03 % de sulfato magnésico, pH 6,8) a 37 C durante 4 días. Cada sobrenadante del cultivo se analizó por SDS-PAGE [Precast Mini Gel 14 %-SDS-PAGEmini, 1,0 mm de espesor de gel (Tefco)]. Como resultado, se confirmó que la proteína que tenía un peso de aproximadamente 45 a 49 kD, que se consideraba como STCE1, estaba extraordinariamente sobre-expresada en 13 clones.

(ii): Identificación del resto de aminoácido del extremo N de la STCE1 recombinante

Para confirmar que la proteína sobre-expresada descrita en el ejemplo 10 (3) (i) se derivaba del gen STCE1 se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo N. El sobrenadante del cultivo se sometió a SDS-PAGE, y las proteínas se transfirieron eléctricamente por separado a una membrana PVDF de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 45 a 49 kD se sometió a un secuenciador de proteínas. Como resultado, la secuencia determinada concordaba con la secuencia de aminoácidos del extremo N (SEQ ID NO: 1) de endoglucanasa STCE1.

Ejemplo 11: Evaluación de la actividad de STCE1 que se expresa en Humicola insolens para eliminar la pelusa del tejido que contiene celulosa

Entre las 13 cepas en las que la expresión de la proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 45 a 49 kD se confirmó por SDS-PAGE en el ejemplo 10 (3), se seleccionó una cepa (4A-9) que mostraba una expresión extraordinaria. Se utilizó el sobrenadante del cultivo de la cepa 4A-9 para medir la actividad de eliminación de pelusa en un tejido de punto de algodón. Como control, se utilizó un sobrenadante del cultivo de la cepa parental (es decir, no transformante). Se llevó a cabo la evaluación de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 3. Los tejidos de punto de algodón azules con pelusa se trataron en las condiciones anteriores (pH 6, 40 C, 1 hora) con cada sobrenadante del cultivo, para calcular una concentración proteica necesaria para eliminar aproximadamente el 100 % de la pelusa formada basándose en la evaluación visual.

La concentración proteica se determinó utilizando el Kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). Los resultados se muestran en la Tabla 5.

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En cada solución de tratamiento, se añadió un número adecuado de bolas de goma con cada sobrenadante del cultivo.

La concentración proteica se determinó utilizando el Kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

Concentración proteica necesaria para eliminar el 50 % de pelusa del tejido de algodón (mg/l)

Humicola insolens MN200-1 (cepa parental) 833 Humicola insolens 4A-9 22

Ejemplo 14: Efecto de la dureza del agua de grifo sobre la actividad de eliminación de pelusa de cada endoglucanasa que se expresa en Humicola insolens

Se utilizaron los sobrenadantes de los cultivos de cuatro cepas, es decir, la cepa que sobre-expresaba STCE1 (4A9) que se obtuvo en el Ejemplo 10, un transformante de Humicola insolens que sobre-expresaba NCE5 (documento WO 01/90375), un transformante de Humicola insolens que sobre-expresaba NCE4 (documento WO 98/03640), y un transformante de Humicola insolens que sobre-expresaba RCEI [RCEI-H4 (25 kD) en la que se eliminó el dominio de unión a la celulosa] (documento WO 02/42474), para evaluar la actividad de eliminación de pelusa en un detergente con respecto a un tejido de punto de algodón, en agua que tenía diferentes durezas.

Se trataron tejidos de punto de algodón teñidos de marrón con un tensioactivo y con bolas de goma en una gran lavadora para generar pelusa. Los tejidos de punto de algodón marrones con pelusa se trataron con cada uno de los cuatro sobrenadantes de cultivo en cada una de las aguas de dureza controlada (0FH, 5FH, 10 FH, 20 FH, o 40FH) en las siguientes condiciones.

Aparato de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón) Temperatura: 40 C Tiempo: 60 minutos Cantidad de solución de reacción: 100 ml Detergente: NEW Persil (Funcionamiento en pastillas biológicas) (fabricado por LEVER: obtenido en el Reino Unido en marzo de 2002) Cantidad de detergente: 0,4 % Solución de tratamiento: agua de dureza controlada [0FH, 5FH, 10FH, 20FH, y 40FH: preparado diluyendo agua de dureza controlada de 1000FH que contenía 80 mmol/l de cloruro cálcico y 20 mmol/l de cloruro magnésico en agua desionizada, con agua desionizada]

En cada solución de tratamiento, se añadió un número adecuado de bolas de goma con cada sobrenadante de cultivo.

Después del tratamiento, se calculó la concentración proteica necesaria para eliminar aproximadamente el 50 % de pelusa formada basándose en una evaluación visual, y la recíproca de la concentración proteica se consideró como la actividad de eliminación de pelusa. Además, se determinó un valor relativo de actividad de eliminación de pelusa en cada dureza cuando la actividad de eliminación de pelusa con una dureza de 0FH se consideró como 100. El resultado se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8

Valor relativo de actividad de eliminación de pelusa en cada dureza ( %)

0FH 5FH 10FH 20FH 40FH

a: 100 100 100 100 93

b: 100 107 127 140 160

c: 100 129 143 171 257

d: 100 70 55 40 30

[a: STCE1-sobre-expresada por H. insolens,

b: NCE4-sobre-expresada por H. insolens,

c: NCE5-sobre-expresada por H. insolens, y

d: RCE1-sobre-expresada por H. insolens]

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10 ml de tampón SUTC, se centrifugó todo a 2500 rpm durante 10 minutos, Los protoplastos recolectados se suspendieron en 1 ml de tampón SUTC, se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos, y finalmente se suspendió en 100 µl de tampón SUTC.

Los protoplastos tratados anteriormente se depositaron, con agar blando dextrosa de patata (PD) (1,3 % de agar dextrosa de patata y un 17,1 % de sacarosa), en un medio agar PD (un 3,9 % de agar dextrosa de patata y un 17,1 % de sacarosa) que contenía higromicina B (20 µg/ml), y se incubó a 28 C durante 5 días para obtener las colonias de transformantes.

Ejemplo 16: Identificación de STCE1 en un cultivo de transformantes de Trichoderma viride con el gen STCE1 y evaluación de la actividad de eliminación de pelusa

(1): Evaluación por HPLC

De los transformantes que se obtuvieron por transformación de Trichoderma viride MC300-1 con el plásmido STCE1N-pCB1 o STCE1M-pCB1 como anteriormente, se seleccionaron 50 cepas resistentes a la higromicina B. Cada cepa se cultivó en el medio S a 37 C durante 5 días. Cada sobrenadante del cultivo se analizó con un análisis HPLC utilizando una columna TSKgel TMS-250 (4,6 mm I.D. x 7,5 cm) (TOSOH Corporation). En el análisis HPLC, se llevó a cabo la elución con un caudal de 1,0 ml/min utilizando un gradiente lineal del 0 % al 80 % de acetonitrilo en un 0,05 % de TFA (ácido trifluoroacético), y se detectaron picos a UV de 280 nm. Como resultado, un pico, que no se detectaba en el sobrenadante del cultivo de Trichoderma viride MC300-1 (tipo silvestre), se detectó en los 3 clones de los transformantes con STCE1N-pCB1 y en los 3 clones de los transformantes con STCE1MpCB1. El pico se recolectó y se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo N de los mismos con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Como resultado, la secuencia de aminoácidos estaba de acuerdo con la secuencia de aminoácidos del extremo N (SEQ ID NO: 1) de STCE1.

(2): Evaluación de actividad de eliminación de pelusa en el cultivo de transformantes STCE1

Se utilizaron los sobrenadantes del cultivo de dos cepas de Trichoderma viride transformantes que expresan STCE1, que se obtuvieron en el Ejemplo 16 (1), y la cepa parental (MC300-1) como no transformante. De acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, se trataron tejidos de punto de algodón azules con pelusa a pH 10 (5 mmol/l de tampón de carbonato sódico) y 40 C durante 1 hora en cada sobrenadante de cultivo, para calcular una concentración proteica necesaria para eliminar aproximadamente el 50 % de la pelusa formada basándose en la evaluación visual.

La concentración proteica se determinó utilizando el kit Protein Assay (BioRad Laboratories) y albúmina sérica bovina (como referencia). El resultado se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9

Concentración proteica necesaria para eliminar el 50 % de pelusa del tejido de algodón (mg/l) Incluso cuando se añadían 330 mg/l, no se eliminaba el 50 % de

Trichoderma viride MC300-1 (tipo silvestre)

pelusa. Trichoderma viride (STCE1N-pCB1

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transformante) Trichoderma viride (STCE1M-pCB1

28transformante)

Aplicabilidad industrial

Las nuevas endoglucanasas STCE de la presente invención son útiles, por ejemplo, en el tratamiento de un tejido que contiene celulosa, eliminación de tinta del papel desechado, mejora de la liberación de agua de la pasta de papel, o mejora de la digestibilidad del pienso para animales.

Aunque la presente invención se ha descrito en referencia a realizaciones específicas, son posibles varios cambios y modificaciones obvios para los expertos en la técnica sin alejarse del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una parte (el lado del extremo N) de un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la endoglucanasa STCE1 [péptido de señal (SEQ ID NO: 33) y proteína madura (SEQ ID NO: 3)] de la presente invención, la endoglucanasa NCE4 [péptido de señal (SEQ ID NO: 34) y proteína madura (SEQ ID NO: 35)] que se sabe que pertenece a la familia 45, y la endoglucanasa NCE5 [péptido de señal (SEQ ID NO: 36) y proteína madura (SEQ ID NO: 37)] que se sabe que pertenece a la familia 45. La figura 2 es la parte restante (el lado del extremo C) del alineamiento que se muestra en la Figura 1.

Claims

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