ES2267200T3 - Celulasa producida por actinomycetes y metodo para producirla. - Google Patents
Celulasa producida por actinomycetes y metodo para producirla. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2267200T3 ES2267200T3 ES98960266T ES98960266T ES2267200T3 ES 2267200 T3 ES2267200 T3 ES 2267200T3 ES 98960266 T ES98960266 T ES 98960266T ES 98960266 T ES98960266 T ES 98960266T ES 2267200 T3 ES2267200 T3 ES 2267200T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cellulase
- dna
- seq
- sequence
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
- D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/02—After-treatment
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/13—Fugitive dyeing or stripping dyes
- D06P5/137—Fugitive dyeing or stripping dyes with other compounds
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/15—Locally discharging the dyes
- D06P5/158—Locally discharging the dyes with other compounds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Paper (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
Abstract
Una celulasa que comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada en SEQ. ID NO: 1 o su derivado que tiene actividad celulolítica y una identidad de secuencia de al menos el 70% respecto a la SEQ. ID NO: 1.
Description
Celulasa producida por Actinomycetes y
método para producirla.
La presente invención se refiere a composiciones
de celulasa producidas por Actinomycete, métodos para
producir tales celulasas y el uso de tales celulasas. La presente
invención se refiere además al uso de la nueva celulasa en
composiciones que se reconocen en la técnica que tienen celulasa
añadida de forma ventajosa en éstas, incluyéndola, como un aditivo
en una composición detergente, en el tratamiento de tejidos tales
como telas que contienen celulosa y fibras útiles de éstas, como un
aditivo de pienso animal, como una ayuda del procesamiento en la
cocción, en el tratamiento de pulpa y papel y en el tratamiento de
almidón para la producción de jarabe de maíz de fructosa superior o
etanol.
Las celulasas son enzimas que son capaces de la
hidrólisis de los enlaces
\beta-D-glucosídicos en celulosas.
Las enzimas celulolíticas han sido divididas tradicionalmente en
tres clases principales: endoglucanasas, exoglucanasas o
celobiohidrolasas y \beta-glucosidasas (Knowles,
J. et al. (1987), TIBTECH, 5,
255-261); y se sabe que son producidas por un gran
número de bacterias, levaduras y hongos.
Principalmente, entre las aplicaciones que han
sido desarrolladas para el uso de enzimas celulolíticas están las
que implican degradar la pulpa de celulosa (madera) en azúcares para
la producción de (bio)etanol, tratamientos textiles como el
"lavado a la piedra" y el "biopulido", y en composiciones
detergentes. Así, se sabe que las celulasas son útiles en
composiciones detergentes para eliminar la suciedad, es decir, para
la limpieza. Por ejemplo, las solicitudes de Gran Bretaña N^{os}.
2.075.028, 2.095.275 y 2.094.826 ilustran un comportamiento de
limpieza mejorado cuando los detergentes incorporan celulasa.
Además, la solicitud de Gran Bretaña 1.358.599 ilustra el uso de
celulasa en detergentes para reducir la dureza de telas que
contienen algodón.
Otra propiedad útil de las celulasas en el
tratamiento de los tejidos es su capacidad de reacondicionar telas
usadas haciendo sus colores más vivos. Por ejemplo, el lavado
repetido de telas que contienen algodón causa un aspecto grisáceo a
la tela que, según se cree, es debido a la rotura y el desorden de
las fibrillas, a veces llamadas "bolitas", causadas por la
acción mecánica. Este aspecto grisáceo es particularmente apreciable
en telas coloreadas. Como consecuencia, tiene valor la capacidad de
la celulasa de eliminar la capa superior desordenada de la fibra y
mejorar así el aspecto global de la tela.
Como los detergentes, que son una aplicación
primaria de la celulasa, funcionan generalmente en condiciones
alcalinas hay una fuerte demanda de celulasas que tengan una
actividad excelente a pH 7-10. Las celulasas
micóticas bien caracterizadas, tales como las de Humicola
insolens y Trichoderma reesei, funcionan de forma
adecuada a un pH de neutro a bajo alcalino. Además, un número de
enzimas que muestran actividad de celulasa a un pH alcalino alto
han sido aisladas a partir de Bacillus y otros procariotas,
véase por ejemplo, los números de publicación PCT WO 96/34092 y WO
96/34108. Así, tanto las celulasas micóticas como las bacterianas
han sido investigadas a fondo. Sin embargo, un tercer grupo de
celulasas, las que han sido aisladas a partir de
Actinomycetes, han atraído sólo alguna atención. Wilson et
al., Critical Reviews in Biotechnology, vol. 12,
págs. 45-63 (1992), han estudiado las celulasas
producidas por Thermomonospora fusca, Thermonomospora
curvata y Microbispora bispora y han ilustrado que muchas
de estas celulasas muestran amplios perfiles de pH y una buena
estabilidad respecto a las temperaturas. Asimismo, Nakai et
al. Agric. Biol. Chem., vol. 51, págs.
3061-3065 (1987) y Nakai et al. Gene,
vol. 65, págs. 229-238 (1988) han ilustrado
la celulasa alcalina-tolerante casA de la cepa
KSM-p de Streptomycetes que también posee una
estabilidad a pH alcalino óptima y excelente a diversas
temperaturas.
A pesar del conocimiento en la técnica
relacionada de muchas composiciones de celulasa que tienen
propiedades deseables, incluyendo las de Actinomycetes, hay una
continua necesidad de nuevas celulasas que tengan un espectro
variable de características que sean útiles, por ejemplo, en el
tratamiento de tejidos, como un componente de composiciones
detergentes, en el tratamiento de pulpa y papel, como un suplemento
del pienso animal, como una ayuda para el procesamiento por cocción
y la conversión de la biomasa. Los solicitantes han descubierto
ciertas celulasas que tienen tales características complementarias y
que son útiles en tales aplicaciones conocidas de la celulasa.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de
Actinomycete que tengan perfiles de pH y temperatura útiles
para su uso en detergentes.
Es un objeto más de la presente invención
proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de
Actinomycete que tengan características útiles para el
tratamiento de tejidos para producir calidades deseables en hilos
textiles, telas y prendas.
Es un objeto más de la presente invención
proporcionar nuevas composiciones de celulasa derivadas de
Actinomycete que tengan características útiles para su uso
como un aditivo del pienso animal, como una ayuda en la cocción, en
el tratamiento de pulpa y papel y en la reducción de la biomasa.
Es un objeto más de la presente invención
proporcionar un método para producir composiciones de celulasa
derivadas a partir de tal nueva Actinomycetes.
Es aún un objeto más de la presente invención
proporcionar un ADN y la secuencia de aminoácidos que facilitan la
producción industrial de las nuevas composiciones de celulasa de la
invención.
Es todavía un objeto más de la presente
invención proporcionar una nueva celulasa que tenga propiedades
excelentes para su uso en detergentes, tratamiento de tejidos, como
un suplemento alimenticio y en la fabricación de la pulpa y del
papel.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una nueva celulasa que es obtenible a partir de
Actinomycete o un derivado de dicha celulasa.
Preferiblemente, la celulasa de la invención comprende una secuencia
de aminoácidos de acuerdo con la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), o su
derivado que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia,
preferiblemente más del 75% de identidad de secuencia y más
preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta.
De acuerdo con otra realización, se proporciona
una composición que comprenda ADN que codifique la celulasa de la
invención. Preferiblemente, el ADN codifica para una secuencia de
aminoácidos de acuerdo con la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), o su
derivado que tiene más del 72% de identidad de secuencia,
preferiblemente más del 80% de identidad de secuencia y más
preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta y las
celulasas producidas así. La presente invención además incorpora
ADN que se hibrida a una sonda de ADN tomada a partir del ADN
representado en la Figura 2 en condiciones apropiadas y las
celulasas así producidas.
De acuerdo con aún otra realización de la
invención, se proporciona un método para transformar un
microorganismo adecuado con ADN que codifica para una celulasa de
acuerdo con la invención y un método para producir la celulasa de
acuerdo con la invención a partir de aquel microorganismo
transformado como se establece en las reivindicaciones.
En una realización especialmente preferida de la
presente invención, la celulasa madura se deriva a partir de
Actinomycete y tiene un peso molecular de aproximadamente 35
kD según se mide con SDS-PAGE (denominada en este
documento de aquí en adelante como la celulasa de 35 kD). La
celulasa de aproximadamente 35 kD madura tiene un punto
isoeléctrico calculado de aproximadamente 4,5 y un grado óptimo de
pH en CMC de aproximadamente 6 a 40ºC y de 6 o menos a 60ºC. La
celulasa de la presente invención mostró una actividad más alta a
60ºC que a 40ºC con amplios rangos de actividad desde al menos pH 5
a pH 10.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
deducida de una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con la
invención mostrándose la secuencia líder en negrita. Las letras en
códigos son las correspondientes a la Comisión de Nomenclatura
Bioquímica IUPAC-IUB (como se describe en el GenBank
Patentln User Manual, Versión
PC-DOS/MS-DOS, Noviembre de 1990)
(SEQ. ID NO: 1).
La figura 2 muestra la secuencia de ADN que
codifica para una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con
la invención (SEQ. ID NO: 2).
La figura 3 muestra el perfil de pH/actividad de
una celulasa de aproximadamente 35 kD de acuerdo con la invención a
40ºC y 60ºC.
La figura 4 muestra el vector pHPLT.
La figura 5 muestra el vector pHP11AG3.
La figura 6 muestra la secuencia 16s ARN de
Actinomycete a partir de la cual puede ser obtenida la
celulasa de la invención (SEQ. ID NO: 3).
Con "derivado" se pretende indicar una
proteína que se deriva a partir de la proteína nativa por la adición
de uno o varios aminoácidos en uno o ambos extremos C y N de la
proteína nativa, la sustitución de uno o varios aminoácidos en uno
o un número de sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos
nativos, la deleción de uno o varios aminoácidos en uno o ambos
extremos de la proteína nativa o en uno o varios sitios en la
secuencia de aminoácido o la inserción de uno o varios aminoácidos
en uno o varios sitios en la secuencia de aminoácidos nativa. La
preparación de un derivado de enzima preferiblemente se logra
modificando una secuencia de ADN que codifica para la proteína
nativa, la transformación de aquella secuencia de ADN en un huésped
adecuado, y la expresión de la secuencia de ADN modificada para
formar la enzima derivada. El derivado de la invención incluye
péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos modificadas en
comparación con una secuencia de aminoácidos de enzima precursora
(por ejemplo, una enzima tipo nativa o en estado natural de acuerdo
con la presente invención) y cuyos péptidos conservan una
naturaleza enzimática característica de la enzima precursora, pero
que tiene propiedades modificadas en algún aspecto específico. Por
ejemplo, una celulasa modificada puede tener un mayor pH óptimo o
mayor resistencia a las temperaturas, pero conservará su actividad
celulolítica característica.
"Célula huésped" significa una célula que
tiene la capacidad de actuar como huésped y vehículo de expresión
para un vector de ADN recombinante de acuerdo con la presente
invención. En una realización preferida de acuerdo con la presente
invención, "célula huésped" significa las células de
Bacillus.
"Constructo de ADN" o "vector de ADN"
significa una secuencia de nucleótidos que comprende uno o varios
fragmentos de ADN que codifican para cualquiera de las nuevas
celulasas o los derivados de celulasa descritos anteriormente.
En una realización preferida, la celulasa de la
invención es una celulasa de aproximadamente 35 kD (calculada sobre
la base de la secuencia de aminoácidos de la proteína madura)
derivada a partir de Actinomycete (denominada en este
documento como la "celulasa de 35 kD"). La celulasa de 35 kD
tiene un pl calculado para la proteína madura de aproximadamente
4,5 y un grado óptimo de pH en carboximetilcelulosa (CMC) a 40ºC de
aproximadamente 6 y a 60ºC de 5 o menos.
El gen que codifica la secuencia de aminoácidos
de la celulasa de 35 kD fue analizado por comparación con los datos
de secuencia accesibles en varias genotecas (GenBank,
Swiss-Prot, EMBL y PIR). Una búsqueda de bases de
datos para una comparación de la celulasa codificada por la
secuencia de ADN de la presente invención con celulasas codificadas
por secuencias génicas de celulasa publicadas o conocidas fue
realizada para determinar a los compañeros filogenéticos cercanos.
La cantidad más alta de homología encontrada fue con la celulasa E5
derivada de Thermomonospora fusca y la CeIA de
Streptomyces lividans. Se mostró que la celulasa de
aproximadamente 35 kD era 61,2% idéntica a la secuencia de
aminoácidos de E5 en un traslapo de 268 residuos y 54,9% idéntica a
la secuencia de CeIA en un traslapo de 244 pares de bases usando el
programa TFastA como se describe en Pearson y Lipman, Proc. Nat.
Acad. Sci., vol. 85, págs. 2444-2448
(1988). El Programa de Busca de Datos TFastA está disponible en la
Versión 6.0 del Paquete de Software de Análisis de Secuencias (Grupo
de Bioinformática, Centro de Biotecnología de la Univ. de
Wisconsin, Madison, Wisconsin 53705). Una comparación de las
secuencias de ADN que codifican para la celulasa de 35 kD con el ADN
que codifica para E5 y CeIA utilizando el programa TFastA mostró
una identidad de nucleótidos del 71,3% de identidad respecto al ADN
que codifica E5 en un traslapo de 1134 pares de bases y una
identidad del 62,8% respecto al ADN que codifica CeIA con un
traslapo de 1306 pares de bases.
Así, la presente invención abarca una celulasa
que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la de la
Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o su derivado que tiene al menos una
identidad de secuencia del 70%, preferiblemente una identidad de
secuencia mayor del 75% y lo más preferiblemente una identidad de
secuencia mayor del 90% en ésta. Asimismo, la presente invención
además abarca un ADN de acuerdo con la Figura 2 ID NO: 2) o su
derivado que tiene más del 72% de identidad de secuencia,
preferiblemente más del 80% de identidad de secuencia y lo más
preferiblemente más del 90% de identidad de secuencia en ésta.
La hibridación se usa en este documento para
analizar si un fragmento dado o un gen corresponden a la celulasa
descrita en este documento y si cae en la amplitud de la presente
invención. El ensayo de hibridación es esencialmente como sigue: El
ADN genómico de una fuente objetivo particular se fragmenta por
digestión con una(varias) enzima(s) de restricción,
por ejemplo, EcoR I, Hind III, Bam HI, Cla I, Kpn I, Mlu I, Spe I,
Bgl II, Nco I, Xba I, Xho I y Xma I (suministradas por Biolabs de
Nueva Inglaterra, Inc., Beverly, MA y Boehringer Mannheim) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras entonces
se someten a electroforesis a través de un gel de agarosa (tal
como, por ejemplo, agarosa del 0,8%) de modo que la separación de
los fragmentos de ADN pueda ser visualizada por tamaños. El gel
puede ser aclarado brevemente en H_{2}O destilada y posteriormente
puede ser despurinado en una solución apropiada (tal como, por
ejemplo, HCl 0,25 M) con agitación suave seguido de la
desnaturación durante 30 minutos con agitación suave seguido de la
desnaturación durante 30 minutos (en, por ejemplo, NaOH 0,4 M) con
agitación suave. Una etapa de renaturación puede ser incluida en la
que el gel se coloca en NaCl 1,5 M, Tris 1 M, pH 7,0 con agitación
suave durante 30 minutos. El ADN entonces debe ser transferido a
una membrana apropiada cargada positivamente, por ejemplo, una
membrana Maximum Strength Nytran Plus (Schleicher & Schuell,
Keene, N.H.), utilizando una solución de transferencia (tal como,
por ejemplo, 6XSSC (NaCl 900 mM, citrato de trisodio 90 mM).
Después de que la transferencia sea completa, generalmente a
aproximadamente 2 horas o más, la membrana se aclara y se seca al
aire a temperatura ambiente después de utilizar una solución de
aclarado (tal como, por ejemplo, 2X SSC [2X SSC = NaCl 300 mM,
citrato de trisodio 30 mM]). La membrana entonces se prehibrida,
(durante aproximadamente 2 horas o más) en una solución de
prehibridación adecuada (tal como, por ejemplo, una solución acuosa
que contiene por cada 100 ml: 20-50 ml de formamida,
25 ml de 20X SSPE (1X SSPE = NaCl 0,18 M, EDTA 1 mM,
NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,7), 2,5 ml de SDS del 20%, 1 ml de
ADN de esperma de arenque fraccionado de 10 mg/ml). Como sabe
cualquier experto en la técnica, la cantidad de formamida en la
solución de prehibridación puede ser variada dependiendo de la
naturaleza de la reacción obtenida de acuerdo con métodos
rutinarios. Así, una cantidad inferior de formamida puede causar un
gel más completo en términos de moléculas de hibridación
identificantes que el mismo procedimiento usando una cantidad más
grande de formamida. Por otra parte, una banda de hibridación fuerte
puede ser identificada más fácilmente visualmente usando más
formamida.
Una sonda de ADN tomada a partir de la secuencia
en la Figura 2 se aisla por electrofóresis en un gel de agarosa, el
fragmento se excinde del gel y se recupera de la agarosa excindida.
Entonces se marca este fragmento purificado de ADN (utilizando, por
ejemplo, el sistema de marcaje Megaprime de acuerdo con las
instrucciones del fabricante para incorporar P^{32} en el ADN
(Amersham International pIc, Buckinghamshire, Inglaterra)). La sonda
marcada se desnaturaliza calentándose a 95ºC durante 5 minutos e
inmediatamente se añade a la solución de prehibridación que
contiene la membrana anterior. La reacción de hibridación debe
proceder durante un tiempo adecuado y bajo las condiciones
apropiadas, por ejemplo, durante 18 horas a 37ºC con agitación
suave. La membrana se aclara (por ejemplo, en 2X SSC/SDS del 0,3%)
y luego se lava con una solución de lavado apropiada y con agitación
suave. La severidad deseada será una reflexión de las condiciones
en las cuales la membrana (el filtro) se lava.
Específicamente, la severidad de una reacción
dada (es decir, el grado de homología necesario para una hibridación
acertada) dependerá de las condiciones de lavado a las cuales el
filtro del Southern Blot es sometido después de la hibridación. Las
condiciones de "severidad baja" como se definen en este
documento comprenderán el lavado de un filtro del Southern Blot con
una solución de 0,2X SSC/SDS del 0,1% a 20ºC durante 15 minutos. Las
condiciones de "severidad estandar" comprenden una etapa de
lavado más que comprende el lavado del filtro del Southern Blot una
segunda vez con una solución de 0,2X SSC/SDS del 0,1% a 37ºC durante
30 minutos.
La presente invención también describe un
procedimiento para la producción de la celulasa. Es posible producir
la celulasa rastreando muestras de lago de soda para producir y
aislar el organismo que produce la celulasa apropiada. Este
organismo entonces puede hacerse crecer de acuerdo con medios
aprobados en la técnica para cultivar tal Actinomycetes. Sin
embargo, mejor que aislar la cepa que produce la celulasa correcta,
es mucho más simple y más eficiente aislar la celulasa de acuerdo
con la presente invención utilizando técnicas de ingeniería
genética transformando una célula huésped adecuada con el ADN
proporcionado en este documento que codifica la celulasa y cultivar
el microorganismo recombinante resultante en condiciones apropiadas
para el crecimiento de la célula huésped y la expresión de
celulasa. Como una primera etapa, puede ser obtenido el ADN
cromosómico a partir de la cepa de Actinomycete donante, por
ejemplo, por el método de Saito y Miura (Saito y Miura, Biochim.
Biophys. Acta., vol. 72, pág. 619 (1963)) o por un método
similar. La división de la enzima de restricción del ADN
cromosómico así obtenido da fragmentos de ADN que contienen el gen
de celulasa alcalino. Por esta razón, puede ser usada cualquier
enzima de restricción con la condición de que no rompa la región de
dicho gen. En una alternativa, puede ser usada una enzima de
restricción que rompa el gen, usando sin embargo, una concentración
de enzima reducida o un tiempo de incubación que permita una
digestión sólo parcial. Una endonucleasa de restricción preferida
es Sau3A. A partir de la mezcla de digestión resultante, pueden ser
aislados fragmentos adecuados (4-10 kb) y ser usados
para transformar una célula huésped adecuada con un constructo de
ADN.
El gen que codifica la celulasa de la presente
invención puede ser clonado usando vectores (de expresión) de
X-bacteriófago y células huésped de E. coli.
(De forma alternativa, puede ser usada la clonación por PCR
utilizando iniciadores adecuados diseñados en dominios
conservadores). Los solicitantes han descubierto que la
transformación del gen que codifica la celulasa de la presente
invención y la expresión en E. coli causa una proteína
activa. Después de una primera etapa de clonación en E. coli,
un gen de celulasa de acuerdo con la presente invención puede ser
transferido a un huésped de expresión industrial más preferido tal
como de la especie Bacillus o Streptomyces, un hongo
filamentoso tal como Aspergillus o Trichoderma, o una
levadura tal como Saccharomyces. La expresión a un nivel alto
y la secreción obtenible en estos organismos huésped permiten la
acumulación de la celulasa en el medio de fermentación a partir del
cual posteriormente puede ser recuperada.
La celulasa puede ser recuperada a partir del
medio según procedimientos convencionales incluyendo la separación
de las células del medio por centrifugación o filtración, si fuera
necesario después de la rotura de las células, precipitando los
componentes proteicos del sobrenadante o del filtrado mediante una
sal, por ejemplo, sulfato de amonio, seguido de la purificación por
una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o
procedimientos similares reconocidos en la técnica. Para la
producción de la celulasa alcalina de acuerdo con la invención, se
prefiere cultivar en condiciones alcalinas usando medios que
contienen una fuente de energía basada en celulosa.
Preferiblemente, la célula huésped de expresión
comprende un Bacillus spp., más preferiblemente Bacillus
licheniformis o Bacillus subtils. En una realización
especialmente preferida, el huésped de transformación es suprimido
para los genes de proteasa para asegurarse de que la celulasa
producto no está sometida a proteolisis en el caldo de fermentación
o su concentrado. Una transformación general preferida y un
protocolo de expresión para cepas de Bacillus suprimida la
proteasa se proporciona en Ferrari et al., patente de EE.UU.
Nº. 5.264.366. La transformación y la expresión en
Aspergillus son descritas, por ejemplo, en Berka et
al., patente de EE.UU. Nº. 5.364.770, incorporada en este
documento como referencia. Los solicitantes han encontrado que la
transformación del presente gen en Bacillus era pobre o
ineficaz en términos de expresión resultante cuando se utilizaba la
maquinaria reguladora nativa. En consecuencia, cuando se transforma
en Bacillus spp., es preferido utilizar el promotor
aprE en combinación con las secuencias reguladoras de la
señal derivada de Bacillus estándar conocida y otras. Cuando
la célula huésped de transformación es Aspergillus el
promotor preferido es glaA.
El tratamiento de tejidos de acuerdo con la
presente invención contempla el procesamiento o la limpieza de
tejidos con una composición que comprende una celulasa. Tal
tratamiento incluye, pero no está limitado, al lavado a la piedra,
la modificación de la textura, la sensación y/o el aspecto de telas
que contienen celulosa u otras técnicas usadas durante la
fabricación o limpieza/reacondicionamiento de telas que contienen
celulosa. Además, el tratamiento dentro del contexto de esta
invención contempla la eliminación de algodón "inmaduro" o
"muerto", a partir de la tela celulósica o fibras. El algodón
inmaduro es considerablemente más amorfo que el algodón maduro y
causa una tela de calidad menor cuando está presente debido, por
ejemplo, a un teñido desigual. La composición contemplada en la
presente invención incluye además un componente de celulasa
potenciada para uso en el lavado de una tela fabricada que contiene
celulosa manchada. Por ejemplo, la celulasa potenciada puede ser
usada en una composición detergente para lavar la colada.
Composiciones detergentes útiles conforme a la presente invención
incluyen formulaciones especiales tales como composiciones de
prelavado, preempapado y de restauración del color de uso
doméstico. Tales composiciones de tratamiento, según se describe en
este documento, pueden estar en forma de un concentrado que
requiera la dilución o en forma de una solución diluida o en una
forma que pueda ser aplicada directamente a la tela que contiene
celulosa. Técnicas de tratamiento generales para el tratamiento de
celulasa de tejidos son descritas, por ejemplo, en la publicación EP
Nº. 220 016 y las solicitudes de GB Nº. 1.368.599 y 2.095.275.
El tratamiento de un material celulósico de
acuerdo con la presente invención contempla además el tratamiento
de pienso animal, pulpa y/o papel, alimentos y grano para los
objetivos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se sabe que la
celulasa aumenta el valor del pienso animal, mejora la capacidad de
drenaje de la pasta de papel, realza los productos de alimentación
y reduce la fibra en el grano durante el procedimiento de molienda
del grano en húmedo o el procedimiento de molienda en seco.
El tratamiento de acuerdo con la presente
invención comprende la preparación de una solución acuosa que
contiene una cantidad eficaz de celulasa junto con otros
ingredientes opcionales incluyendo, por ejemplo, un tampón, un
tensioactivo, y/o un agente de lavado. Una cantidad eficaz de
composición de enzima celulasa es una concentración de enzima
celulasa suficiente para su objetivo pretendido. Así, por ejemplo,
una "cantidad eficaz" de celulasa en una composición de lavado
a la piedra de acuerdo con la presente invención es aquella cantidad
que proporcionará el efecto deseado, por ejemplo, para producir un
aspecto de usado y descolorido en las costuras y en los paneles de
la tela. Asimismo una "cantidad eficaz" de celulasa en una
composición pretendida para mejorar la sensación y/o el aspecto de
una tela que contiene celulosa es aquella cantidad que producirá
mejoras cuantificables en la sensación, por ejemplo, mejorando la
suavidad de la tela, o el aspecto, por ejemplo, quitando las bolitas
y fibrillas que tienden a reducir la apariencia de nuevo de una
tela. La cantidad de celulasa empleada es también dependiente del
equipo empleado, los parámetros de procedimiento empleados (la
temperatura de la solución de tratamiento de celulasa, el tiempo de
exposición a la solución de celulasa, y similares) y la actividad
de celulasa (por ejemplo, una solución particular requerirá una
concentración inferior de celulasa cuando sea usada una composición
de celulasa más activa cuando se compara con una composición de
celulasa menos activa). La concentración exacta de celulasa en la
solución de tratamiento acuosa que se añade a la tela que se trata
puede ser determinada fácilmente por cualquier experto en la técnica
basado en los factores anteriores así como en el resultado deseado.
En los procedimientos de lavado a la piedra, generalmente era
preferido que la celulasa estuviera presente en la solución acuosa
de tratamiento en una concentración de aproximadamente 0,5 a 5.000
ppm y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 a 200 ppm de
proteína total. En las composiciones para la mejora de la sensación
y/o el aspecto de una tela que contiene celulosa, generalmente era
preferido que la celulasa estuviera presente en la solución acuosa
de tratamiento en una concentración de aproximadamente 0,1 a 2000
ppm y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 200 ppm de
proteína total.
En una realización de tratamiento preferida, el
tampón es empleado en la composición de tratamiento tal que la
concentración de tampón sea suficiente para mantener el pH de la
solución dentro del intervalo en el que la celulasa empleada
muestre una actividad que, a su vez, dependa de la naturaleza de la
celulasa empleada. La concentración exacta de tampón empleado
dependerá de varios factores que cualquier experto en la técnica
puede tener en cuenta fácilmente. Por ejemplo, en una realización
preferida, el tampón así como la concentración del tampón se
seleccionan para mantener el pH de la solución de celulasa final
dentro del intervalo de pH requerido para que la actividad de
celulasa sea la óptima. La determinación del intervalo del pH óptimo
de las celulasas potenciadas de la invención puede ser averiguado
de acuerdo con técnicas conocidas. Tampones adecuados al pH dentro
del campo de actividad de la celulasa potenciada son conocidos por
los expertos en la técnica en el área.
Además de la celulasa y un tampón, la
composición de tratamiento puede contener opcionalmente un
tensioactivo. Tensioactivos adecuados incluyen cualquier
tensioactivo compatible con la celulasa y la tela incluyendo, por
ejemplo, tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfibólicos.
Tensioactivos aniónicos adecuados para uso en este documento
incluyen alquilbencenosulfatos lineales o ramificados; sulfatos de
olefin-alquil o alquenil éter que tienen grupos
alquilo lineales o ramificados o grupos alquenilo; sulfatos de
alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; alcanosulfonatos y otros
similares. Contraiones adecuados para tensioactivos aniónicos
incluyen iones de metal alcalino tales como el sodio y el potasio;
iones metálicos alcalino-térreos tales como calcio
y magnesio; ión de amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3
grupos alcanol de 2 ó 3 números de carbono. Tensioactivos
anfibólicos incluyen sal de sulfonatos de amonio cuaternario, y
tensioactivos anfibólicos del tipo de betaína. Tales tensioactivos
anfibólicos tienen tanto grupos positivos como negativos cargados en
la misma molécula. Los tensioactivos no iónicos comprenden
generalmente éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de
ácido graso superior o sus aductos de óxido de alquileno, y
monoésteres de glicerina de ácido graso. Las mezclas de
tensioactivos también pueden ser empleadas en medios conocidos para
los expertos en la técnica.
Una composición de celulasa concentrada puede
prepararse para uso en los métodos descritos en este documento.
Tales concentrados contienen cantidades concentradas de la
composición de celulasa descritas anteriormente, tampones y el
tensioactivo, preferiblemente en una solución acuosa. Cuando se
formulan así, el concentrado de celulasa puede ser diluido
fácilmente con agua para preparar preparaciones de celulasa
potenciadas rápidamente y con exactitud que tienen la concentración
precisa de cada constituyente. Cuando se formulan los concentrados
acuosos, estos concentrados pueden ser diluidos para llegar a la
concentración precisa de los componentes en la solución de celulasa
como se indica anteriormente. Como es fácilmente evidente, tales
concentrados de celulasa permitirán la formulación fácil de las
soluciones de celulasa así como permitirán el transporte factible
de la composición a la posición en la que ésta será usada. El
concentrado de tratamiento puede estar en cualquier forma aprobada
por la técnica, por ejemplo, líquida, emulsión, gel o pasta. Tales
formas son conocidas por los expertos en la técnica.
Cuando se emplea un concentrado de celulasa
sólido, la composición de celulasa puede estar en gránulos, polvos,
un aglomerado o un disco sólido. Los gránulos pueden ser formulados
para que contengan materiales para reducir la velocidad de
disolución de los gránulos en el medio de lavado. Tales materiales y
gránulos son descritos en la patente de EE.UU. Nº. 5.254.283 que se
incorpora en este documento como referencia íntegramente.
También pueden ser usados o colocados otros
materiales en la composición de celulasa de la presente invención
cuando se desee, incluyendo piedras, piedra pómez, rellenos,
disolventes, activadores enzimáticos y agentes de antiredeposición
dependiendo del uso eventual de la composición.
De modo ilustrativo, serán descritos
detalladamente métodos de lavado a la piedra, sin embargo, los
parámetros descritos se modifican fácilmente por cualquier experto
en la técnica para otras aplicaciones, es decir, mejorando la
sensación y/o el aspecto de una tela. Se ponen en contacto la tela
que contiene celulosa con la composición de lavado a la piedra que
contiene celulasa que contiene una cantidad eficaz de celulasa
entremezclando la composición de tratamiento con la composición de
lavado a la piedra, y así se lleva a la enzima celulasa a la
proximidad de la tela. Posteriormente, la solución acuosa que
contiene la celulasa y la tela se agitan. Si la composición de
tratamiento es una solución acuosa, la tela puede ser empapada
directamente por la solución. Asimismo, cuando la composición de
lavado a la piedra es un concentrado, el concentrado se diluye en un
baño maría con la tela que contiene celulosa. Cuando la composición
de lavado a la piedra está en una forma sólida, por ejemplo, puede
ponerse en contacto un gel de prelavado o una barra sólida con la
composición de lavado a la piedra aplicando directamente la
composición a la tela o a las aguas de lavado.
La tela que contiene celulosa se incuba con la
solución de lavado a la piedra en condiciones eficaces para
permitir a la acción enzimática conferir un aspecto de lavado a la
piedra a la tela que contiene celulosa. Por ejemplo, durante el
lavado a la piedra, el pH, la relación de aguas, la temperatura y el
tiempo de reacción pueden ser ajustados para optimizar las
condiciones en las cuales la composición de lavado a la piedra
actúa. "Condiciones eficaces" se refiere necesariamente al pH,
la relación de las aguas, y la temperatura que permite a la enzima
celulasa reaccionar de manera eficiente con la tela que contiene
celulosa, para producir en este caso el efecto de lavado a la
piedra. Generalmente, las celulasas de la presente invención deben
ser utilizadas en condiciones operables para el uso de la(s)
celulasa(s) relacionada(s). Sin embargo, tales
condiciones son fácilmente averiguables por cualquier experto en la
técnica. Las condiciones de reacción eficaces para las
composiciones de lavado a la piedra de la presente invención son
sustancialmente similares a los métodos conocidos usados con las
composiciones de celulasa correspondientes de la técnica anterior.
En consecuencia, está dentro de la pericia de los expertos en la
técnica maximizar las condiciones para usar las composiciones de
lavado a la piedra de acuerdo con la presente invención.
Las relaciones de aguas durante el lavado a la
piedra, es decir, la relación en peso de la solución de la
composición de lavado a la piedra (es decir, las aguas de lavado)
respecto al peso de la tela, empleadas en este documento son
generalmente una cantidad suficiente para alcanzar el efecto de
lavado a la piedra deseado en la tela tejana y son dependientes del
procedimiento usado. Preferiblemente, las relaciones de aguas son
de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 50:1; más preferiblemente
de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, y lo más
preferiblemente de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1.
Las temperaturas de reacción durante el lavado a
la piedra con las presentes composiciones de lavado a la piedra son
gobernadas por dos factores competidores. En primer lugar, las
temperaturas más altas generalmente corresponden a una cinética de
reacción realzada, es decir, reacciones más rápidas, que permiten
tiempos de reacción reducidos cuando se compara con los tiempos de
reacción requeridos a temperaturas inferiores. En consecuencia, las
temperaturas de reacción son generalmente de al menos
aproximadamente 10ºC y mayores. En segundo lugar, la celulasa es
una proteína que pierde la actividad más allá de una temperatura de
reacción dada, cuya temperatura es dependiente de la naturaleza de
la celulasa usada. Así, si se permite a la temperatura de reacción
ser demasiado alta, la actividad celulolítica se pierde como
consecuencia de la desnaturalización de la celulasa. Aunque las
temperaturas estándar para el uso de celulasa en la técnica
generalmente están en el intervalo de 35ºC a 65ºC, cuyas
condiciones también se esperaría que fueran las adecuadas para la
celulasa de la invención, las condiciones óptimas de temperatura
deben ser averiguadas de acuerdo con las técnicas conocidas en lo
que concierne a la celulasa específica usada.
Los tiempos de reacción son dependientes de las
condiciones específicas a las cuales el lavado a la piedra ocurre.
Por ejemplo, el pH, la temperatura y la concentración de celulasa
todas afectarán el tiempo de reacción óptimo. Generalmente, los
tiempos de reacción son de aproximadamente 5 minutos a
aproximadamente 5 horas, y preferiblemente de aproximadamente 10
minutos a aproximadamente 3 horas y, más preferiblemente, de
aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1 hora.
De acuerdo con aún otra realización preferida de
la presente invención, la celulasa de la invención puede ser
empleada en una composición detergente. Las composiciones
detergentes de acuerdo con la presente invención son útiles como
composiciones de prelavado, composiciones de preempapado, o para
limpiar durante el lavado regular o el ciclo de aclarado.
Preferiblemente, la composición detergente de la presente invención
comprende una cantidad eficaz de celulasa, un tensioactivo, y
opcionalmente incluye otros ingredientes descritos debajo.
Una cantidad eficaz de celulasa empleada en las
composiciones detergentes de esta invención es una cantidad
suficiente para impartir los efectos deseables conocidos por ser
producidos por la celulasa en telas que contienen celulosa, por
ejemplo, desfrisado, suavizado, anti-frisado,
eliminación de fibra superficial, antigrisáceado y limpieza.
Preferiblemente, la celulasa en la composición detergente se emplea
a una concentración de aproximadamente 10 ppm a aproximadamente
20.000 ppm de detergente.
La concentración de enzima celulasa empleada en
la composición detergente preferiblemente se selecciona de modo que
en dilución en un medio de lavado, la concentración de enzima
celulasa esté en el intervalo de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 1000 ppm, preferiblemente de aproximadamente 0,02
ppm a aproximadamente 500 ppm, y lo más preferiblemente de
aproximadamente 0,5 ppm a aproximadamente 250 ppm de proteína total.
La cantidad de enzima celulasa empleada en la composición
detergente dependerá del grado al que el detergente será diluido en
la adición al agua para formar una solución de lavado.
Las composiciones detergentes de la presente
invención pueden estar en cualquier forma aprobada por la técnica,
por ejemplo, como un líquido, en gránulos, en emulsiones, en geles o
en pastas. Tales formas son conocidas por el experto en la técnica.
Cuando se emplea una composición de detergente sólida, la celulasa
preferiblemente se formula como gránulos. Preferiblemente, los
gránulos pueden ser formulados para que contengan además un agente
protector de la celulasa. El gránulo puede ser formulado para que
contenga materiales que reduzcan la velocidad de disolución del
gránulo en el medio de lavado. Tales materiales y gránulos son
descritos en la patente de EE.UU. Nº. 5.254.283 que se incorpora en
este documento como referencia íntegramente.
Las composiciones detergentes de esta invención
emplean un agente superficial activo, es decir, un tensioactivo,
incluyendo tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfibólicos
conocidos por su uso en composiciones detergentes.
Tensioactivos aniónicos adecuados para uso en la
composición detergente de esta invención incluyen
alquilbencenosulfatos lineales o ramificados; sulfatos de éter de
alquilo o alquenilo que tengan grupos alquilo lineales o ramificados
o grupos alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo;
olefinsulfonatos; y alcanosulfonatos. Contraiones adecuados para
tensioactivos aniónicos incluyen iones de metal alcalino tales como
sodio y potasio; iones de metal alcalino-térreo
tales como calcio y magnesio; ión de amonio; y alcanolaminas que
tienen de 1 a 3 grupos alcanol de 2 ó 3 números de carbono.
Tensioactivos anfibólicos incluyen sal de sulfonato de amonio
cuaternario, y tensioactivos anfibólicos del tipo betaína. Tales
tensioactivos anfibólicos tienen tanto grupos positivos como
negativos cargados en la misma molécula. Tensioactivos no iónicos
comprenden éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de
ácido graso superior o su aducto de óxido de alquileno, monoésteres
de glicerina de ácido graso, y otros similares. Tensioactivos
adecuados para uso en esta invención son descritos en la solicitud
de patente británica Nº. 2094826 A, cuya descripción se incorpora
en este documento como referencia. Las mezclas de tales
tensioactivos también pueden ser usadas. El tensioactivo o una
mezcla de tensioactivos generalmente son empleados en las
composiciones detergentes de esta invención en una cantidad de
aproximadamente 1 por ciento en peso a aproximadamente 95 por
ciento en peso de la composición total detergente y de
aproximadamente 5 por ciento en peso a aproximadamente 45 por
ciento en peso de la composición total detergente. Además de la
composición de celulasa y del(de los)
tensioactivo(s), las composiciones detergentes de esta
invención opcionalmente pueden contener uno o varios de los
componentes siguientes:
Las hidrolasas adecuadas incluyen éster de
carboxilato hidrolasa, tioester hidrolasa, monoéster de fosfato
hidrolasa, y diester de fosfato hidrolasa que actúan sobre el enlace
éster; glicósido hidrolasa que actúa sobre el compuesto glicosilo;
una enzima que hidroliza el compuesto N-glicosilo;
tioeter hidrolasa que actúa sobre el enlace éter; y
a-amino-acil-péptido
hidrolasa, peptidil-aminoácido hidrolasa,
acil-aminoácido hidrolasa, dipéptido hidrolasa, y
peptidil-péptido hidrolasa que actúan sobre el
enlace peptídico. Preferible entre ellas están éster de carboxilato
hidrolasa, glicósido hidrolasa y peptidil-péptido
hidrolasa. Las hidrolasas adecuadas incluyen (1) proteasas que
pertenecen a peptidil-péptido hidrolasa tales como
pepsina, pepsina B, renina, tripsina, quimotripsina A,
quimotripsina B, elastasa, enteroquinasa, catepsina C, papaína,
quimopapaína, ficina, trombina, fibrinolisina, renina, subtilisina,
aspergilopeptidasa A, colagenasa, clostridiopeptidasa B, calicreína,
gastrisina, catepsina D., bromelina, queratinasa, quimotripsina C,
pepsina C, aspergilopeptidasa B, uroquinasa, carboxipeptidasa A y
B, y aminopeptidasa; (2) glicósido hidrolasas (la celulasa que es un
ingrediente esencial está excluida de este grupo)
\alpha-amilasa, \beta-amilasa,
gluco-amilasa, invertasa, lisozima, pectinasa,
quitinasa, y dextranasa. Preferiblemente entre ellas están
\alpha-amilasa y \beta-amilasa.
Funcionan en sistemas de ácidos a neutros, pero una que sea
obtenida a partir de bacterias exhibirá una alta actividad en un
sistema alcalino; (3) éster de carboxilato hidrolasa incluyendo
carboxilo esterasa lipasa, pectina esterasa y clorofilasa.
Especialmente eficaz entre ellas es la lipasa.
Otras hidrolasas distintas a la celulasa se
incorporan en la composición detergente tanto como sean requeridas
de acuerdo con el objetivo. Preferiblemente debe ser incorporada en
una cantidad de 0,001 a 5 por ciento en peso, y más preferiblemente
0,02 a 3 por ciento en peso, en términos de proteína purificada.
Esta enzima debe ser usada en forma de gránulos hechos a partir de
enzima a granel sola o en combinación con otros componentes en la
composición detergente. Los gránulos de enzima a granel son usados
en tal cantidad que la enzima purificada esté entre 0,001 y 50 por
ciento en peso en los gránulos. Los gránulos son usados en una
cantidad de 0,002 a 20 y preferiblemente de 0,1 a 10 por ciento en
peso. Como con las celulasas, estos gránulos pueden ser formulados
para que contengan un agente protector de la enzima y un material
retardante de la disolución.
Tales tensioactivos catiónicos y sales de ácido
graso de cadena larga incluyen sales de ácido graso saturadas o
insaturadas, sales de éter de ácido carboxílico de alquilo o
alquenilo, sales o ésteres de ácido a-sulfograso,
tensioactivos del tipo amino ácido, tensioactivos de éster de
fosfato, sales de amonio cuaternario incluyendo las que tienen de 3
a 4 sustituyentes de alquilo y hasta 1 sustituyente de alquilo
fenilo-sustituido. Tensioactivos catiónicos
adecuados y sales de ácido graso de cadena larga son descritos en la
solicitud de patente británica 2 094 826 A, cuya descripción se
incorpora en este documento como referencia. La composición puede
contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en
peso de tales tensioactivos catiónicos y sales de ácido graso de
cadena larga.
La composición puede contener de aproximadamente
0 a aproximadamente 50 por ciento en peso de uno o varios
componentes estructuradores seleccionados a partir del grupo que
consiste en sales de metal alcalino y sales de alcanolamina de los
compuestos siguientes: fosfatos, fosfonatos, fosfonocarboxilatos,
sales de aminoácidos, electrólitos moleculares superiores de
aminopoliacetatos, polímeros no disociantes, sales de ácidos
dicarboxílicos, y sales de aluminosilicato. Agentes secuestrantes
divalentes adecuados son los descritos en la solicitud de patente
británica Nº. 2 094 826 A, cuya descripción se incorpora en este
documento como referencia.
La composición puede contener de aproximadamente
1 a aproximadamente 50 por ciento en peso, preferiblemente de
aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, basado en
la composición de una o varias sales de metal alcalino del
compuesto siguiente tales como álcalis o electrólitos inorgánicos:
silicatos, carbonatos y sulfatos así como álcalis orgánicos tales
como trietanolamina, dietanolamina, monoetanolamina y
triisopropanolamina.
La composición puede contener de aproximadamente
0,1 a aproximadamente 5 por ciento en peso de uno o varios de los
compuestos siguientes como agentes antiredeposición:
polietilenglicol, poli(alcohol de vinilo),
polivinilpirrolidona y carboximetilcelulosa.
Entre ellos, una combinación de
carboximetil-celulosa y/o polietilenglicol con la
composición de celulasa de la presente invención proporciona una
composición que elimina la suciedad especialmente útil.
El uso de la celulasa de la presente invención
en combinación con un agente de blanqueo tal como monopersulfato de
potasio, percarbonato de sodio, perborato de sodio, aducto de
peróxido de hidrógeno/sulfato de sodio y aducto de peróxido de
hidrógeno/cloruro de sodio o/y un tinte de blanqueo fotosensible tal
como sal de cinc o aluminio de ftalocianina sulfonada además mejora
los efectos detergentes. Asimismo, pueden ser usados agentes
blanqueantes y catalizadores de blanqueo tales como los descritos en
el documento EP 684 304.
Varios agentes colorantes azules y tintes
fluorescentes pueden ser incorporados a la composición, si fuera
necesario. Agentes colorantes azules y tintes fluorescentes
adecuados son descritos en la solicitud de patente británica Nº. 2
094 826 A, cuya descripción se incorpora en este documento como
referencia.
Los inhibidores de la corrosión siguientes
pueden ser incorporados al detergente pulverulento: sales del ácido
p-toluenosulfónico, sales del ácido xilenosulfónico,
sales del ácido acético, sales del ácido sulfosuccínico, talco,
sílice fina pulverizada, sílices amorfas, arcilla, silicato de
calcio (tales como Micro-Cell de Johns Manville
Co.), carbonato de calcio y óxido de magnesio.
Los activadores varían dependiendo de la
variedad de las celulasas. En presencia de proteínas, cobalto y sus
sales, magnesio y sus sales, y calcio y sus sales, potasio y sus
sales, sodio y sus sales o monosacáridos tales como manosa y
xilosa, las celulasas son activadas y sus poderes detergentes son
mejorados notablemente.
Los antioxidantes incluyen, por ejemplo,
terc-butil-hidroxitolueno,
4,4'-butilidenobis(6-terc-butil-3-metilfenol),
2,2'-butilidenobis(6-terc-butil-4-metilfenol),
cresol monoestirenado, cresol diestirenado, fenol monoestirenado,
fenol diestirenado y
1,1-bis(4-hidroxi-fenil)ciclohexano.
Los solubilizadores incluyen, por ejemplo,
alcoholes inferiores tales como etanol, sales de bencenosulfonato,
sales de alquilbencenosulfato inferiores tales como sales de
p-toluenosulfonato, glicoles tales como
propilenglicol, sales de acetilbenceno-sulfonato,
acetamidas, amidas del ácido piridindicarboxílico, sales de benzoato
y urea.
La composición detergente de la presente
invención puede ser usada en un amplio intervalo de pH ácido a
alcalino. En una realización preferida, la composición detergente
de la presente invención puede ser usada en un medio de lavado
detergente suavemente ácido, neutro o alcalino que tenga un pH
superior a 5 a no más de aproximadamente 12.
Aparte de los ingredientes anteriores, pueden
ser usados perfumes, tampones, conservantes, tintes y similares, de
ser deseado, con las composiciones detergentes de esta invención.
Tales componentes son empleados de manera convencional en las
cantidades antes usadas en la técnica.
Cuando una base detergente usada en la presente
invención está en forma de un polvo, éste puede prepararse por
cualquier método de preparación conocido incluyendo un método de
secado por pulverización y un método de granulación. La base
detergente obtenida particularmente por el método de secado por
pulverización, método de aglomeración, método de mezcla en seco o
métodos de mezcla a partir de los ingredientes individuales es
preferida. La base detergente obtenida por el método de secado por
pulverización no está restringida en lo que concierne a las
condiciones de prepeparación. La base detergente obtenida por el
método de secado por pulverización son gránulos huecos que son
obtenidos pulverizando una mezcla acuosa de ingredientes resistentes
al calor, tales como agentes superficiales activos y
estructuradores, en un espacio caliente. Después del secado por
pulverización, pueden ser añadidos perfumes, enzimas, agentes
blanqueantes, estructuradores alcalinos inorgánicos. Con una base
altamente densa, a la base del detergente granular obtenido tal como
por el método de secado por pulverización, granulación o
aglomeración, también pueden ser añadidos varios ingredientes
después de la preparación de la base.
Cuando la base del detergente es un líquido,
puede ser una solución homogénea o una dispersión no homogénea.
Para eliminar la descomposición de carboximetilcelulosa por la
celulasa en el detergente, es deseable que la carboximetilcelulosa
sea granulada o revestida antes de la incorporación en la
composición.
Las composiciones detergentes de esta invención
pueden ser incubadas con la tela que contiene celulosa, telas, por
ejemplo, manchadas, en usos industriales y domésticos a
temperaturas, tiempos de reacción y relaciones de aguas empleadas
de manera convencional en estos ambientes. Las condiciones de
incubación, es decir, las condiciones eficaces para tratar telas
que contienen celulosa con composiciones detergentes de acuerdo con
la presente invención, serán fácilmente averiguables por los
expertos en la técnica. En consecuencia, las condiciones apropiadas
eficaces para el tratamiento con los detergentes presentes
corresponderán a las que usan composiciones detergentes similares
que incluyen celulasas conocidas.
Detergentes de acuerdo con la presente invención
pueden ser formulados además como un prelavado en la solución
apropiada a un pH intermedio en el que exista una actividad
suficiente para proporcionar las mejoras deseadas de suavidad,
desfrisado, prevención de formación de bolitas, eliminación de fibra
superficial o limpieza. Cuando la composición detergente sea una
composición de preempapado (por ejemplo, prelavado o
pretratamiento), tal como una composición líquida, pulverizada, gel
o pasta, la enzima celulasa potenciada generalmente se emplea de
aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 por ciento en peso basado
en el peso total de la composición de preempapado o pretratamiento.
En tales composiciones, puede ser empleado un tensioactivo
opcionalmente y cuando se emplee, estará generalmente presente en
una concentración de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 20 por
ciento en peso basado en el peso total del preempapado. El resto de
la composición comprende componentes convencionales usados en el
preempapado, es decir, diluyente, tampones, otras enzimas
(proteasas), y similares a sus concentraciones convencionales.
Se contempla que las composiciones que
comprenden enzimas de celulasa truncadas descritas en este documento
puedan ser usadas en usos domésticos como una composición
individual solo adecuada para restaurar el color en telas
descoloridas por ejemplo, patente de EE.UU. Nº. 4.738.682, que se
incorpora en este documento como referencia íntegramente) así como
usarse en un quitamanchas y para desfrisar y antifrisar (prevención
de formación de bolitas).
El uso de la celulasa de acuerdo con la
invención puede ser particularmente eficaz en aditivos alimenticios
y en el tratamiento de pulpa y papel. Estas aplicaciones
industriales adicionales son descritas, por ejemplo, en la
publicación PCT Nº. 95/16360 y la patente finlandesa concedida Nº.
87372, respectivamente.
Para ilustrar además la presente invención y sus
ventajas, se proporcionan los ejemplos siguientes específicos para
su comprensión que se ofrecen para ilustrar la presente invención y
que no deben ser interpretados de ningún modo como una limitación
de su alcance.
Muestras de fango alcalino fueron suspendidas en
5 ml de NaCl del 4% (p/v): Na_{2}CO_{3} del 1% (p/v) y fueron
agitadas enérgicamente. Diluciones sucesivas en la misma solución
fueron puestas en palcas en agar de extracto de suelo, pH 10 que
contenía rifampicina de 50 \mug ml^{-1}.
El agar de extracto de suelo fue preparado como
sigue: 1 kg de suelo de jardín se suspende en 1 litro de agua
desmineralizada. La suspensión se somete a un autoclave durante 20
minutos a 120ºC. La suspensión se filtra en un filtro de fibra de
vidrio (Whatman, GF/A) y los sólidos se lavan dos veces con agua
desmineralizada (1 x 200 ml, 1 x 100 ml). El filtrado se completa
hasta con 1 litro de agua. Un volumen igual de filtrado
esterilizado se mezcla con una solución estéril de NaCl del 8%
(p/v): Na_{2}CO_{3} del 2% (p/v) con agar del 2% (p/v) añadido
para la solidifica-
ción.
ción.
Las placas fueron incubadas a 30ºC durante
varias semanas en una caja cerrada para prevenir la evaporación.
Las placas fueron examinadas periódicamente bajo el microscopio y
las microcolonias fueron transferidas a agar alcalino que contenía
carboximetilcelulosa del 0,3% (p/v). Los cultivos en duplicados
fueron usados para detectar la actividad de celulasa inundando una
de las placas con Congo Rojo del 0,1% (p/v) durante 15 minutos. Las
placas fueron desteñidas con NaCl 1 M durante 30 minutos. Las cepas
que mostraron un área aclarada alrededor de la colonia fueron
seleccionadas como potenciales microorganismos que producen
celulasa.
Las cepas que mostraron áreas aclarada fueron
fermentadas en 25 ml como se describe en la publicación PCT Nº. WO
96/34108 (pág. 8) después de lo cual fue añadida CMC.
Usando el método descrito anteriormente, la cepa
que produce la celulasa de la invención fue aislada y después fue
caracterizada como una bacteria filamentosa. Basado en el aspecto y
el análisis de la secuencia génica de 16s rARN parcial (Ejemplo 4),
el microorganismo se clasifica como una especie de
Streptomyces.
Fue realizado un examen morfológico de la cepa
que producía la celulasa. Cuando se cultiva en agar de extracto de
suelo a pH 10; la pequeña colonia inicial transparente brillante
redonda se desarrolla después de unos días en un micelio aéreo de
blanco a gris-blanco. Sobre el agar alcalino la cepa
forma una colonia seca curtida, color crema, opaca que produce un
micelio aéreo en la madurez. Al microscopio, la cepa exhibe un
pseudomicelio ampliamente ramificado que se fragmenta en barras
irregulares, esporas aisladas y esporas en cadenas.
Una cepa de Actinomycete alcalifílica
aislada por el Ejemplo 1 fue escogida como una cepa donadora para
la expresión clonando en E. coli. El ADN cromosómico fue
aislado de acuerdo con el método descrito por Saito y Miura,
Biochim. Biophys. Acta., vol. 72, págs.
619-629 (1963).
El ADN cromosómico aislado se digiere
parcialmente por la enzima de restricción Sau3A utilizando
soluciones de enzima diluidas en serie, durante una hora a 37ºC
utilizando Tampones de Reacción (Gibco BRL Life Technologies,
Gaithersburg, Md., EE. UU) en las condiciones recomendadas por el
proveedor. El ADN digerido se fracciona por electrofóresis en gel
de agarosa y las fracciones adecuadas (2-6
kilobytes) son aisladas a partir del gel usando un Kit de
Extracción de Gel QIAquick de acuerdo con el protocolo descrito por
el proveedor (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, EE.UU.).
Las genotecas genómicas de genes de las cepas de
Actinomycete alcalino-tolerantes son
construidas en un plásmido derivado de PUC19
(Yanisch-Perron, C. et al. (1985) Gene
33: 103). Los clones recombinantes son rastreadas por
difusión en agar como se describe en Wood et al., Meth.
Enzym., vol. 160, págs. 59-74 (1988).
Las cepas que muestran áreas aclaradas alrededor de la colonia son
aisladas. El ADN del plásmido del recombinante que produce la
celulasa se aísla usando un Kit de Plásmido de QAprep de acuerdo con
el protocolo descrito por el proveedor (QIAGEN, Inc). La secuencia
de nucleótidos de un fragmento de 4,5 kilobytes es determinada a
partir de ambos extremos hasta que sea identificada una secuencia
que lleve la semejanza en las secuencias de celulasa conservadoras
conocidas por una búsqueda en FastA frente a las bases de datos
públicas. En la determinación de las secuencias conservadoras, fue
secuenciado el resto del gen.
El gen aislado contiene 1056 pares de bases que
codifican para una proteína precursora que tiene 371 aminoácidos
incluyendo una secuencia señal de 39 aminoácidos. La proteína madura
comprende 344 aminoácidos y un peso molecular calculado de 34.902 y
un pl de 4,5. La secuencia de nucleótidos del gen (SEQ. ID NO: 2)
que codifica para dicha celulasa y la secuencia de aminoácidos
deducida (SEQ ID NO: 1) de la celulasa madura son ilustradas en
las Figuras 1 y 2.
El fragmento de ADN del gen de celulasa que
codifica para el gen estructural preparado como se describe
anteriormente fue clonado en el vector pHPLT (véase la Figura 4).
Este vector contiene al promotor y a la secuencia señal del gen de
amilasa termoestable de Bacillus licheniformis y causa una
alta expresión en Bacillus (véase la Figura 5). La
transformación de células huésped de Bacillus competentes fue
realizada con los clones de Bacillus que producen la
celulasa recombinante resultantes aislados y cultivados en
condiciones adecuadas para producir la celulasa clonada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones de Bacillus licheniformis que
producen la celulasa del Ejemplo 2 fueron cultivados en un medio
complejo que comprendía Caldo de Soja Trypton (Oxoid CM129) del 3%,
20 \mug/ml de neomicina. La purificación puede ser lograda como
sigue: El caldo de fermentación se separa del líquido de cultivo por
centrifugación (8000 rpm). La celulasa en el sobrenadante es
precipitada con sulfato de amonio (saturación del 65%). El
precipitado se disuelve en tampón de fosfato 25 mM a pH 7 + EDTA 5
mM hasta que sea alcanzada una conductividad de 7 mS/cm. Esta
solución es aplicada a una columna de intercambio aniónico FF de
Q-Sepharose (diámetro 5 cm, longitud 10 cm),
después de lo cual la columna es lavada con tampón fosfato 25 mM a
pH 7 + EDTA 5 mM hasta una absorbancia de 0,2 AU. Un gradiente de 0
a 0,5 M de NaCl en fosfato 25 mM a pH 7 es aplicado a la columna en
80 minutos seguido de un gradiente de 0,5 a 1 M de NaCl en 10
minutos. La elución puede ser realizada en el primer gradiente.
Después de la elución la columna se limpia (corriente arriba) con
NaOH 1 M y se reequilibra con fosfato 25 mM a pH 7 + EDTA 5 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos de las 400 primeras
pares de bases de la secuencia de 16s rADN del organismo donador
aislado en el Ejemplo 1 que produce la celulasa de los Ejemplos 2 y
3 fue obtenida y se proporciona en la Figura 6 (SEQ ID NO: 3).
Esta secuencia fue analizada con el paquete de software de análisis
de secuencia FastA para proporcionar una comparación de las
secuencias en las bases de datos públicas. Los resultados del
análisis ilustraron que el vecino más cercano era Streptomyces
albus que tenía una identidad de 16S rADN del 97,6% en un
traslapo de 422 pares de bases. El porcentaje de identidad de la
fracción 16S rADN parcial de las cepas es una indicación fuerte de
que la cepa representa una especie desconocidade
Antinomycetes. Basado en un análisis de la secuencia de 16S
rADN obtenida (en combinación con la apariencia, Ejemplo 1), el
microorganismo fue clasificado como una especiede
Streptomyces.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el perfil de pH/temperatura de
la celulasa de aproximadamente 36 kD de acuerdo con la invención,
la actividad de la celulasa fue medida en CMC a varios valores de pH
y temperaturas. Este procedimiento era el método colorimétrico para
la determinación de la actividad de celulasa (total), utilizando
carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato. La celulasa libera
azúcares reductores, que reaccionan con "PAHBAH" a un alto pH y
temperatura. Este producto de reacción puede ser medido con un
espectrofotómetro. La actividad fue determinada usando una curva de
calibración de glucosa.
- CMC, viscosidad baja (Sigma
C-5678, lote Nº. 23HO244)
- hidrazida del ácido
p-hidroxibenzoico ("PAHBAH", Sigma H 9882)
- Monohidrato de D-glucosa
(Boom 8342)
- NaH_{2}PO_{4} * 1 ac. (Merck
6346)
- H_{3}PO_{4} (85%; Merck 573)
- Ácido cítrico * 1 ac. (Merck 244)
- NaOH 4 N
- HCl 0,5 N
1,38 g de NaH_{2}PO_{4} * 1 ac. fueron
disueltos en 800 ml de agua demi. El pH fue ajustado a 7 con NaOH 4
N y la mezcla fue rellenada hasta 1000 ml con agua demi. Finalmente
el pH se comprueba y se ajusta si es necesario. Este tampón fue
usado para disolver y diluir las muestras de la enzima.
23,06 g de H_{3}PO_{4} fueron disueltos en
agua demi hasta un volumen final de 200 ml (= 1 M). 42 g de ácido
cítrico fueron disueltos en agua demi hasta un volumen final de 200
ml (= 1 M). Una solución de 20 ml de ácido cítrico fue combinada
con 20 ml de ácido fosfórico, después el volumen fue rellenado hasta
150 ml con agua demi. El pH (intervalo de 4 a 10) fue ajustado con
NaOH 4 N y el volumen final se rellenó hasta 200 ml con agua demi.
Este tampón fue usado para diluir la preparación de sustrato.
El tampón de incubación B fue diluido 1:1 con
agua demi. El pH fue comprobado y corregido, si era necesario. Esta
solución fue usada para la curva de calibración de glucosa.
En agitación fuerte fue añadido despacio 1 g de
CMC a 100 ml de agua demi. Enérgicamente la agitación se continuó
durante al menos una hora seguido de un tratamiento con un
ultraturrax durante 30 segundos.
La muestra de la enzima se disolvió y se diluyó
en tampón de incubación A hasta una actividad de aproximadamente
0,05 U/ml (a mitad de camino de la curva de calibración de
glucosa).
5 g de PAHBAH fueron disueltos en 80 ml de HCl
0,5 N, después de lo cual la solución fue rellenada hasta 100 ml
con HCl 0,5 N. Antes del uso, una parte de la solución de PAHBAH fue
diluida con cuatro partes de NaOH 0,5 N.
- Solución madre 1: 1000 mg de glucosa se disuelven en 100 ml de agua demi (10 mg/ml).
- Solución madre 2: 0,5 ml de solución madre 1 se diluyen con 9,5 ml de tampón de incubación C al pH de {}\hskip2.6cm interés (0,5 mg/ml).
El esquema de titulación siguiente fue
usado:
| \muMol de glucosa/0,1 | solución madre Nº. 2 | tampón de incubación C |
| 0 | 0 | 1000 \mul |
| 0,05 | 200 \mul | 800 \mul |
| 0,1 | 400 \mul | 600 \mul |
| 0,15 | 600 \mul | 400 \mul |
| 0,2 | 800 \mul | 200 \mul |
| 0,25 | 1000 \mul | 0 \mul |
(1) los tubos de ensayo de los estándares de
glucosa, controles, muestras y blancos fueron rellenos de 0,5 ml de
sustrato (1%) y 0,5 ml de tampón de incubación B del pH deseado y
fueron colocados en un baño maría a la temperatura deseada;
(2) las soluciones fueron preincubadas durante
10 minutos;
(3) cada 15 segundos fueron añadidos a los tubos
con el sustrato 100 ml de estándar de glucosa, control o
muestra;
(4) las soluciones fueron agitadas durante 3
segundos y vueltas a colocar en el baño maría;
(5) cada muestra fue incubada durante 30
minutos;
(6) la reacción enzimática fue parada añadiendo
3 ml del reactivo PAHBAH;
(7) las soluciones resultantes fueron agitadas
durante 3 segundos y fueron colocadas en un estante fuera del baño
maría;
(8) cuando todos los tubos fueron parados,
fueron añadidos 100 ml de muestra a los tubos blanco de interés y
fueron agitados 3 segundos;
(9) las muestras fueron colocadas durante 15
minutos en un baño de agua hirviendo;
(10) las muestras resultantes fueron enfriadas
en agua del grifo fría durante 5 a 10 minutos y luego fueron
agitadas de nuevo durante 3 segundos;
(11) la absorbancia de la mezcla fue medida a
410 nm con agua como referencia.
Los resultados son mostrados en la figura 3.
Como se muestra en la figura 3, el grado óptimo de pH de la celulasa
de 35 kD es de aproximadamente 6 a 40ºC y de 5 o menos a 60ºC.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Jones, Brian E.
\hskip4.1cmVan Der Kleij, Wilhelmus A.H.
\hskip4.1cmVan Solingen, Piet
\hskip4.1cmWeyler, Walter
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Novel Cellulase Producing Actinomycetes, Cellulase Produced Therefrom"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genencor Internacional, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 925 Page Mill Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94304-1013
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ Versión 2.0 de Windows
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 09/102.204
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-JUN-1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/974.041
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-NOV-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Stone, Christopher L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35,696
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: GC539
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 650-846-7555
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 650-845-6504
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 352 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1059 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 421 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
Claims (17)
1. Una celulasa que comprende la secuencia de
aminoácidos proporcionada en SEQ. ID NO: 1 o su derivado que tiene
actividad celulolítica y una identidad de secuencia de al menos el
70% respecto a la SEQ. ID NO: 1.
2. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicho derivado tiene una identidad de secuencia mayor
que el 75% respecto a la SEQ. ID NO: 1.
3. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicho derivado tiene una identidad de secuencia mayor
que el 90% respecto a la SEQ. ID NO: 1.
4. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha celulasa está codificada por una secuencia de
ADN que se selecciona a partir del grupo que consiste en ADN que
corresponde a la secuencia de SEQ. ID NO: 2 y ADN que tiene una
identidad de secuencia de al menos el 76% respecto a la SEQ. ID NO:
2.
5. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha celulasa comprende la secuencia de aminoácidos
proporcionada en SEQ. ID NO: 1.
6. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha celulasa es obtenible a partir de
Actinomycete.
7. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
4, en el que dicha celulasa es codificada por la secuencia de ADN
correspondiente a la SEQ ID NO: 2.
8. La celulasa de acuerdo con la reivindicación
4, en el que dicha celulasa es codificada por un ADN que tiene una
identidad de secuencia de al menos el 90% respecto a la SEQ ID NO:
2.
9. Un ADN que codifica una celulasa de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
10. Un método para producir la celulasa de
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, método que comprende
las etapas de:
- (a)
- aislar una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 9;
- (b)
- transformar el ADN en un organismo adecuado para su expresión;
- (c)
- hacer crecer dicho organismo transformado en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ADN que codifica dicha celulasa; y
- (d)
- recuperar de la mezcla resultante acuosa que comprende a la celulasa.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que la celulasa además es purificada a partir de la
mezcla acuosa.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
10 o la reivindicación 11, en el que el organismo esun Bacillus
sp.
13. Una composición detergente que comprende la
celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
14. Un aditivo de pienso animal que comprende la
celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
15. El uso de una celulasa de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el tratamiento de
tejidos.
16. El uso de una celulasa de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el tratamiento de
pulpa y papel.
17. El uso de una celulasa de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como un aditivo para pienso
animal.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US974041 | 1992-11-10 | ||
| US97404197A | 1997-11-19 | 1997-11-19 | |
| US97404297A | 1997-11-19 | 1997-11-19 | |
| US974042 | 1997-11-19 | ||
| US09/102,204 US6190899B1 (en) | 1997-11-19 | 1998-06-22 | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same |
| US102204 | 1998-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2267200T3 true ES2267200T3 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=27379307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98960266T Expired - Lifetime ES2267200T3 (es) | 1997-11-19 | 1998-11-18 | Celulasa producida por actinomycetes y metodo para producirla. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1034280B1 (es) |
| JP (1) | JP2001523464A (es) |
| KR (1) | KR20010032218A (es) |
| AT (1) | ATE328089T1 (es) |
| AU (1) | AU1590899A (es) |
| CA (1) | CA2309886A1 (es) |
| DE (1) | DE69834741T2 (es) |
| ES (1) | ES2267200T3 (es) |
| WO (1) | WO1999025847A2 (es) |
Families Citing this family (116)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999051808A1 (en) * | 1998-04-03 | 1999-10-14 | Novo Nordisk A/S | Treatment of denim fabric with a pectolytic enzyme |
| WO2009085935A2 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| CA2745760A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| US8809033B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-08-19 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material in the presence of cellobiose dehydrogenase |
| US8338121B2 (en) | 2008-12-19 | 2012-12-25 | Novozymes, Inc. | Methods for determining cellulolytic enhancing activity of a polypeptide |
| US8337663B2 (en) | 2008-12-19 | 2012-12-25 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material |
| CA2747056A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-07-15 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material in the presence of a peroxidase |
| CN102388134A (zh) | 2009-01-28 | 2012-03-21 | 诺维信股份有限公司 | 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
| WO2010088463A2 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having expansin activity and polynucleotides encoding same |
| EP2411511B1 (en) | 2009-03-24 | 2018-08-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same |
| DK2435561T3 (en) | 2009-05-29 | 2018-11-05 | Novozymes Inc | PROCEDURES FOR IMPROVING THE DEGRADATION OR CONVERSION OF CELLULOSE SUBSTANCES |
| DK2438163T3 (en) | 2009-06-02 | 2015-04-20 | Novozymes Inc | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them |
| US8143021B2 (en) | 2009-07-07 | 2012-03-27 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| EP2478096B1 (en) | 2009-09-17 | 2017-05-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| CN102712916B (zh) | 2009-09-18 | 2015-11-25 | 诺维信股份有限公司 | 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
| US8211665B2 (en) | 2009-09-29 | 2012-07-03 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
| BR112012006982B1 (pt) | 2009-09-29 | 2021-12-21 | Novozymes, Inc. | Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente |
| EP2483402A1 (en) | 2009-09-30 | 2012-08-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| EP2483296B1 (en) | 2009-09-30 | 2015-07-29 | Novozymes Inc. | Polypeptides derived from thermoascus crustaceus having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2011050037A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Novozymes, Inc. | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
| CA2776336A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
| CN103068976A (zh) | 2009-11-06 | 2013-04-24 | 诺维信股份有限公司 | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
| ES2574054T3 (es) | 2009-11-06 | 2016-06-14 | Novozymes, Inc. | Polipéptidos con actividad de xilanasa y polinucleótidos que los codifican |
| BR112012020503A2 (pt) | 2010-03-31 | 2015-09-15 | Novozymes Inc | variante isolado de celobioidrolase precursor, polipeptídeo isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produzir um variante de celobioidrolas precursor, métodos para obter o variante, para degradar variante de celobioidrolase precursor, métodos para obter o variante, para degradar ou converter um material celulósico, poara produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico, e, composição de enzima. |
| US8581042B2 (en) | 2010-06-30 | 2013-11-12 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2012021399A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Novozymes, Inc. | Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a nitrogen-containing compound and uses thereof |
| WO2012030844A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| US8629325B2 (en) | 2010-08-30 | 2014-01-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
| DK2735611T3 (en) | 2010-08-30 | 2019-01-28 | Novozymes As | POLYPEPTIDES WITH CELLULOLYSE INCREASING ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM |
| US20130212746A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-08-15 | Novoyzmes A/S | Polypeptides Having Hemicellulolytic Activity And Polynucleotides Encoding Same |
| US8624082B2 (en) | 2010-08-30 | 2014-01-07 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2012030811A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
| MX2013003237A (es) | 2010-09-30 | 2013-05-30 | Novozymes Inc | Variantes de polipeptidos que tienen actividad potenciadora celulolitica y polinucleotidos que codifican a los mismos. |
| EP2622068B1 (en) | 2010-09-30 | 2016-07-20 | Novozymes, Inc. | Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| CN105886485B (zh) | 2010-10-01 | 2019-09-24 | 诺维信股份有限公司 | β-葡糖苷酶变体及其编码多核苷酸 |
| US20130260423A1 (en) | 2010-10-26 | 2013-10-03 | Novozymes North America, Inc. | Methods of Saccharifying Sugar Cane Trash |
| US9932414B2 (en) | 2010-11-02 | 2018-04-03 | Novozymes, Inc. | Methods of pretreating cellulosic material with a family 61 polypeptide |
| WO2012059053A1 (en) | 2010-11-04 | 2012-05-10 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
| EP2638153B1 (en) | 2010-11-12 | 2017-07-12 | Novozymes Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| BR112013010129A2 (pt) | 2010-11-18 | 2016-07-05 | Novozymes Inc | polipeptídeo gh61 quimérico isolado, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um polipeptídeo gh61 quimérico, para degradas ou converter um material celulóstico, para sintetizar um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico e para limpar ou lavar uma superfície dura ou roupa para lavar, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, uso do polipeptídeo gh61 quimérico, composição detergente, e, formulação de caldo ou composição de cultura de células completas |
| WO2012078656A1 (en) | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Novozymes North America, Inc. | Methods of hydrolyzing oligomers in hemicellulosic liquor |
| MX337913B (es) | 2011-01-26 | 2016-03-28 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
| BR112013018695B1 (pt) | 2011-01-26 | 2021-03-30 | Novozymes A / S | Célula hospedeira microbiana recombinante, processos para produzir um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, e, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão |
| WO2012103322A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| MX2013007720A (es) | 2011-01-26 | 2013-08-09 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos. |
| BR112013018304A2 (pt) | 2011-01-26 | 2016-10-04 | Novozymes A S E Novozymes Inc | célula hospedeira microbiana transgênica, processo para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula originária, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação e para fermentar um material celulósico, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado |
| WO2012134626A2 (en) | 2011-01-31 | 2012-10-04 | Novozymes North America, Inc. | Processes for enzymatic refining of pretreated cellulosic material for saccharification |
| DK2678352T3 (en) | 2011-02-23 | 2018-03-05 | Novozymes Inc | Polypeptides with cellulolysis enhancing activity and polynucleotides encoding them |
| US9150842B2 (en) | 2011-03-09 | 2015-10-06 | Novozymes A/S | Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide |
| WO2012122477A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2012130120A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Novozymes A/S | Method for degrading or converting cellulosic material |
| WO2012135719A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Novozymes, Inc. | Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same |
| WO2012135659A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Novozymes A/S | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
| US9926547B2 (en) | 2011-04-28 | 2018-03-27 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| DK2702162T3 (da) | 2011-04-29 | 2020-05-18 | Novozymes Inc | Fremgangsmåder til forbedring af nedbrydningen eller omdannelsen af celluloseholdigt materiale |
| EP2710132A1 (en) | 2011-05-19 | 2014-03-26 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins |
| WO2012159009A1 (en) | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins |
| EP2734633B1 (en) | 2011-07-22 | 2019-05-01 | Novozymes North America, Inc. | Processes for pretreating cellulosic material and improving hydrolysis thereof |
| DK2739728T3 (en) | 2011-08-04 | 2017-10-16 | Novozymes As | Polypeptides with endoglucanase activity and polynucleotides encoding them |
| EP3382016B1 (en) | 2011-08-04 | 2019-10-09 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2013028915A2 (en) | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Novozymes, Inc. | Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell |
| AU2012298799B2 (en) | 2011-08-24 | 2018-02-01 | Novozymes, Inc. | Methods for producing multiple recombinant polypeptides in a filamentous fungal host cell |
| BR112014005564A2 (pt) | 2011-09-13 | 2017-03-21 | Novozymes North America Inc | método para degradar um material celulósico pré-tratado |
| US20140308705A1 (en) | 2011-09-20 | 2014-10-16 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same |
| WO2013089889A2 (en) | 2011-09-30 | 2013-06-20 | Novozymes, Inc. | Chimeric polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2013064075A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| BR112014011902A2 (pt) | 2011-11-18 | 2017-05-16 | Novozymes As | polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, e para produzir um mutante de uma célula parental, processos para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico ou material contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico ou material contendo xilano, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células |
| CN103958672A (zh) | 2011-11-21 | 2014-07-30 | 诺维信股份有限公司 | Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸 |
| EP2782998B1 (en) | 2011-11-22 | 2018-01-10 | Novozymes Inc. | Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same |
| US9624481B2 (en) | 2011-12-01 | 2017-04-18 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same |
| EP3272862A1 (en) | 2011-12-16 | 2018-01-24 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same |
| EP2794870A4 (en) | 2011-12-19 | 2015-06-17 | Novozymes Inc | POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE |
| CN104768391A (zh) | 2011-12-19 | 2015-07-08 | 诺维信公司 | 用于增加纤维素材料的消化率的方法和组合物 |
| US10036050B2 (en) | 2011-12-20 | 2018-07-31 | Novozymes, Inc. | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2013096652A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Novozymes, Inc. | Methods for determining the degradation of a biomass material |
| DK2841570T3 (en) | 2012-04-23 | 2018-03-12 | Novozymes As | POLYPEPTIDES WITH GLUCURONYL STERASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM |
| US9446102B2 (en) | 2012-04-23 | 2016-09-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same |
| CN119193513A (zh) | 2012-04-27 | 2024-12-27 | 诺维信股份有限公司 | Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸 |
| BR112015005884A2 (pt) | 2012-09-19 | 2017-08-08 | Novozymes Inc E Novozymes As | processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação, e de fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células |
| US10035996B2 (en) | 2012-10-08 | 2018-07-31 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2014066141A2 (en) | 2012-10-24 | 2014-05-01 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| EP2931885A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2014099798A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancinc activity and polynucleotides encoding same |
| EP2964760B1 (en) | 2013-03-08 | 2021-05-12 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
| PL3594335T3 (pl) | 2014-09-05 | 2024-09-16 | Novozymes A/S | Warianty modułów wiążących węglowodany i polinukleotydy je kodujące |
| BR112017014749B1 (pt) | 2015-01-28 | 2023-04-11 | Dsm Ip Assets B.V | Processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares |
| MY196163A (en) | 2015-01-28 | 2023-03-17 | Dsm Ip Assets Bv | Process for Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Material And Fermentation of Sugars |
| WO2016120298A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| FI3739045T3 (fi) | 2015-02-24 | 2024-11-13 | Novozymes As | Sellobiohydrolaasivariantteja ja niitä koodittavia polynukleotideja |
| EP3067428A1 (en) | 2015-03-12 | 2016-09-14 | BETA RENEWABLES S.p.A. | A process for producing a hydrolyzed mixture from a pre-treated ligno-cellulosic slurry comprising a slurry liquid and slurry solids |
| WO2016169893A1 (en) | 2015-04-20 | 2016-10-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Whole fermentation broth |
| WO2016169892A1 (en) | 2015-04-20 | 2016-10-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| WO2016207144A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| MY197083A (en) | 2016-06-09 | 2023-05-24 | Dsm Ip Assets Bv | Seed train for large scale enzyme production |
| US10913938B2 (en) | 2016-07-29 | 2021-02-09 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof |
| US20190276809A1 (en) | 2016-11-24 | 2019-09-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzyme composition |
| EP3545100A1 (en) | 2016-11-24 | 2019-10-02 | DSM IP Assets B.V. | Enzyme composition |
| WO2018185071A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| WO2019072732A1 (en) | 2017-10-09 | 2019-04-18 | Dsm Ip Assets B.V. | PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC MATERIAL AND FERMENTATION OF SUGARS |
| WO2019086369A1 (en) | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| WO2019086370A1 (en) | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars |
| WO2019185681A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-03 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzyme composition |
| US11193145B2 (en) | 2018-03-28 | 2021-12-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzyme composition |
| WO2019219804A1 (en) | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for producing a polypeptide |
| CN112204151B (zh) | 2018-05-30 | 2024-06-11 | 维尔萨利斯股份公司 | 从碳水化合物材料产生糖的方法 |
| WO2020058248A1 (en) | 2018-09-18 | 2020-03-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars |
| WO2020058249A1 (en) | 2018-09-18 | 2020-03-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars |
| WO2020058253A1 (en) | 2018-09-18 | 2020-03-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars |
| BR112021006739A2 (pt) | 2018-10-24 | 2021-07-13 | Dsm Ip Assets B.V. | processo para hidrólise enzimática de material de carboidrato e fermentação de açúcares |
| US12157906B2 (en) | 2019-03-12 | 2024-12-03 | Versalis S.P.A. | Process for producing a fermentation broth |
| EP4028536A1 (en) | 2019-09-10 | 2022-07-20 | DSM IP Assets B.V. | Enzyme composition |
| WO2022013148A1 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for the production of biogas |
| US20240218341A1 (en) | 2021-04-06 | 2024-07-04 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzyme composition |
| CA3214435A1 (en) | 2021-04-06 | 2022-10-13 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzyme composition |
| BR112023020357A2 (pt) | 2021-04-06 | 2023-11-21 | Dsm Ip Assets Bv | Composição de enzima |
| WO2022214460A1 (en) | 2021-04-08 | 2022-10-13 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for the preparation of a sugar product and a fermentation product |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6112282A (ja) * | 1984-06-28 | 1986-01-20 | Kao Corp | アルカリ性セルラーゼ生産菌 |
| US5677151A (en) * | 1994-06-24 | 1997-10-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable cellulase from a thermomonospora gene |
-
1998
- 1998-11-18 AT AT98960266T patent/ATE328089T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-18 DE DE69834741T patent/DE69834741T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-18 AU AU15908/99A patent/AU1590899A/en not_active Abandoned
- 1998-11-18 CA CA002309886A patent/CA2309886A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-18 JP JP2000521212A patent/JP2001523464A/ja not_active Withdrawn
- 1998-11-18 KR KR1020007005414A patent/KR20010032218A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-11-18 EP EP98960266A patent/EP1034280B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-18 ES ES98960266T patent/ES2267200T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-18 WO PCT/US1998/024650 patent/WO1999025847A2/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1034280A2 (en) | 2000-09-13 |
| AU1590899A (en) | 1999-06-07 |
| WO1999025847A3 (en) | 1999-07-22 |
| DE69834741D1 (de) | 2006-07-06 |
| WO1999025847A2 (en) | 1999-05-27 |
| KR20010032218A (ko) | 2001-04-16 |
| ATE328089T1 (de) | 2006-06-15 |
| EP1034280B1 (en) | 2006-05-31 |
| JP2001523464A (ja) | 2001-11-27 |
| DE69834741T2 (de) | 2007-05-03 |
| CA2309886A1 (en) | 1999-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2267200T3 (es) | Celulasa producida por actinomycetes y metodo para producirla. | |
| JP3661995B2 (ja) | 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法 | |
| JP4392778B2 (ja) | 新規なセルラーゼを産生する放線菌、その放線菌が産生するセルラーゼ、およびそのセルラーゼを作成する方法。 | |
| US6562612B2 (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| ES2267310T3 (es) | Variantes de celulasa del tipo egiii y sus composiciones. | |
| EP1683860B1 (en) | Novel endoglucanases | |
| EP0934402B1 (en) | High molecular weight trichoderma cellulase | |
| US6566112B2 (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| KR20000062296A (ko) | 직물 가공용 증대된 셀룰라제 조성물 | |
| WO1998013465A9 (en) | Cellulase obtainable from thermomonospora fusca for use in industrial processes | |
| CN1237200A (zh) | 用于工业过程的获自褐色高温单孢菌的纤维素酶 | |
| US6187577B1 (en) | Cellulase producing Actinomycetes cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| US6190899B1 (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| AU4437002A (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
| MXPA99003713A (es) | Celulasa obtenible de thermomonospora fusca parautilizarse en procesos industriales |