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CN103958672A - Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸 - Google Patents

Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸 Download PDF

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CN103958672A
CN103958672A CN201280057243.8A CN201280057243A CN103958672A CN 103958672 A CN103958672 A CN 103958672A CN 201280057243 A CN201280057243 A CN 201280057243A CN 103958672 A CN103958672 A CN 103958672A
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M.马兰塔
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M.拉姆萨
B.G.汉森
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M.斯维尼
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Abstract

本发明涉及GH61多肽变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

GH61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸
关于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明是根据能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080在政府支持下完成的。政府在本发明中享有一定权利。
对序列表的引用
本申请含有一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及GH61多肽变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。
相关技术的说明
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置处消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端按序释放纤维二糖分子。纤维二糖是一种水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将木质纤维素原料转化成乙醇具有以下优点：大量原料的易得性、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物、以及城市固体废物已被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素、以及木质素组成。一旦将木质纤维素转化成可发酵的糖(例如葡萄糖)，那么这些可发酵的糖就可以容易地被酵母发酵成乙醇。
WO2005/074647、WO2008/148131、以及WO2011/035027披露了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2005/074656和WO2010/065830披露了来自金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2007/089290和WO2012/149344披露了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864、以及WO2009/085868披露了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2010/138754披露了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/005867披露了来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/039319披露了来自嗜热子囊菌属物种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041397披露了来自青霉属物种(Penicillium sp.(埃默森(emersonii))的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041504披露了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2012/030799披露了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2012/113340披露了来自嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2012/146171披露了来自特异腐质霉(Humicola insolens)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO2008/151043披露了通过向包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物中添加可溶性活化二价金属阳离子来增加该多肽的活性的方法。
WO2012/044835和WO2012/044836披露了具有纤维素分解增强活性以及改善的热活性和热稳定性的GH61多肽变体。
本发明提供了具有增加的热稳定性的GH61多肽变体。
发明概述
本发明涉及分离的GH61多肽变体，其包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；以及(c)从发酵物中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中该纤维素材料在本发明的GH61多肽变体的存在下用酶组合物糖化。在一个方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，这些方法进一步包括从发酵物中回收该发酵产物。
附图简要说明
图1示出编码具有纤维素分解增强活性的GH61B多肽的烟曲霉基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO:29)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。
图2示出质粒pMMar44的限制性图谱。
图3示出质粒pMMar49的限制性图谱。
图4示出质粒pMMar45的限制性图谱。
图5示出质粒pDFng113的限制性图谱。
图6示出添加烟曲霉GH61B多肽变体对高温纤维素组合物在50℃、55℃、以及60℃下进行的PCS转化的影响。
图7示出质粒pDFng153-4的限制性图谱。
图8示出质粒pDFng154-17的限制性图谱。
图9示出质粒pDFng155-33的限制性图谱。
图10示出质粒pBGMH16的限制性图谱。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指一种羧基酯酶(EC3.1.1.72)，它催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯、以及乙酸对硝基苯酯的水解。出于本发明的目的，乙酰木聚糖酯酶活性是在含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物来测定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5、25℃下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶量。
等位变体：术语“等位变体”意指基因的占据相同染色体基因座的两种或两种以上可替代形式中的任一者。等位变异通过突变天然地发生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用每ml的100mM乙酸钠(pH5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞(Bray,Co.Wicklow,Ireland)以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，美国加州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。出于本发明的目的，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据德弗里斯(de Vries)，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180:243-249来测定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，β-葡糖苷酶活性是根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生化特性(Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定的。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH5下在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相对应的基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤加工，这些步骤包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识(Crystalline cellulose degradation:New insight into thefunction of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？(Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient oncrystalline cellulose？)，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范.帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)，149:152-156；范.帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。总纤维素分解活性通常使用不溶性底物来测量，这些底物包括瓦特曼(Whatman)1级滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素，等等。最常见的总纤维素分解活性测定是使用瓦特曼1级滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。
出于本发明的目的，纤维素分解酶活性通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)在合适的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)、以及合适的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续3-7日。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的预处理的玉米秸秆(PCS)，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH5)，1mMMnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行糖分析。40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并且通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而被加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是一种线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，处于具有一系列取代基的复杂分支结构(complex branchedstructures with a spectrum of substituent)中。尽管通常是多形的，但是发现植物组织中的纤维素主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材中。纤维素材料可以是，但不限于：农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、以及木材(包括林业残余物)(参见，例如，维色洛戈尔(Wiselogel)等人，1995，于《生物乙醇手册》(Handbook on Bioethanol)(查尔斯E.怀曼(Charles E.Wyman)编)，第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington D.C.)；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(BioresourceTechnology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(AppliedBiochemistry and Biotechnology)24/25:695-719；T.谢伯(T.Scheper)主编的生物化学工程/生物技术的进展(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology)中的莫思尔(Mosier)等人，1999，木质纤维的生物转化的最近进展(Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics)，第65卷，第23-40页，纽约斯普林格出版社(Springer-Verlag,New York)。在此应理解的是，纤维素的形式可以是木质纤维素、包含木质素的植物细胞壁材料、纤维素和混合基质中的半纤维素。在一个优选方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面，纤维素材料是木质纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻草。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面，纤维素材料是小麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是冷杉。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉绒。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如在此所使用的，术语“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)、或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在一个优选方面，纤维素材料经过了预处理。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对编码本发明的变体的多核苷酸的表达来说必需的核酸序列。各个控制序列对于编码该变体的该多核苷酸来说可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个控制序列对于彼此来说可以是天然的或外源的。这类控制序列包括但不限于：前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以具有用于引入特异性限制位点目的的接头，这些特异性限制位点促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖、以及含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内切水解。内切葡聚糖酶活性可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(BiotechnologyAdvances)24:452-481)所测定的还原性末端的增加来测定。出于本发明的目的，根据高斯，1987，纯粹与应用化学59:257-268的程序，在pH5、40℃下使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，其包含一种多核苷酸，该多核苷酸编码变体并且可操作地连接至规定其表达的控制序列上。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特B.(Henrissat B.)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类法(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316、以及亨利萨特B.和贝洛赫A.(Bairoch A.)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类法(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时，它们增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。出于本发明的目的，阿魏酸酯酶活性是在50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物来测定。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5、25℃下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶量。
片段：术语“片段”意指一种多肽，该多肽中不存在其成熟多肽的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如若干个)氨基酸，其中该片段具有纤维素分解增强活性。在一个方面，片段含有GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基、或至少95％的氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如若干种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham)，Y.微生物半纤维素酶(Microbialhemicellulases)，微生物学新见(Current Opinion In Microbiology)，2003，6(3):219-228。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物半纤维素是支化和线性多糖的异质群体，这些多糖通过氢键键合至植物细胞壁中的纤维素微纤维上，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价连接至木质素，从而与纤维素共同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织需要许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可以被指派为GH和CE家族。一些具有总体上类似的折叠的家族可以进一步被分组为系(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。半纤维素分解酶活性可以根据高斯和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752在合适的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下进行测量。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在65℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的任何后代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与和亲本相比被改善的变体相关联的特征。这种改善的特性包括但不限于增加的热稳定性。
增加的热稳定性：术语“增加的热稳定性”意指相对于亲本，GH61多肽变体在某一温度下孵育一段时期之后纤维素分解增强活性的保留较高。变体相对于亲本的热稳定性增加可以例如在一个或多个(例如若干个)温度的条件下评估。例如，该一个或多个(例如若干个)温度可以是45℃至95℃范围内的任何一个温度或多个温度，例如，45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、或95℃(或在此之间，例如62℃、68℃、72℃，等等)，在一个或多个(例如若干个)pH下，该一个或多个pH在3至9的范围内，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0(或在此之间)，进行合适时期(时间)的孵育，例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、或60分钟(或在此之间，例如23分钟、37分钟，等等)，这样使得该变体保留残余活性。然而，也可以使用更长时期的孵育。术语“增加的热稳定性”能够与“改善的热稳定性”可互换地使用。
变体相对于亲本的热稳定性增加可以通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域中的标准方法来测定(参见，例如，斯特蒂文特(Sturtevant)，1987，物理化学年度综述(Annual Review of Physical Chemistry)38:463-488；实例9和17)。变体相对于亲本的热稳定性增加还可以使用蛋白质热解折叠分析来测定(参见，例如，在此的实例10、18、以及23)。变体相对于亲本的热稳定性增加还可以使用本领域中已知的用于具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的任何酶测定以测量温度处理后的残余活性来测定。参见例如，WO2005/074647、WO2008/148131、WO2005/074656、WO2010/065830、WO2007/089290、WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864、WO2009/085868、以及WO2008/151043，它们通过引用结合在此。可替代地，变体相对于亲本的热稳定性增加可以使用其中将变体的性能与亲本相比较的用于该变体的任何应用测定来测定。例如，可以使用实例5、12、以及13中描述的应用测定。
分离的：术语“分离的”意指处于不天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从一种或多种或全部与其天然相关联的天然存在的成分移除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的该物质通过人力修饰的任何物质；或(4)相对于与其天然相关联的其他组分，通过增加该物质的量而被修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在50℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指处于其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，这些修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化，等等。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至326。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸18至239。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:6的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸20至258。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸19至226。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:10的氨基酸20至304。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:12的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸16至317。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:14的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸22至249。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:16的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:16的氨基酸20至249。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:18的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸18至232。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸16至235。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸19至323。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:24的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸16至310。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:26的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸20至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:28的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸22至354。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:30的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸22至250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:32的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸22至322。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:34的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:34的氨基酸24至444。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:36的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸26至253。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:38的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:38的氨基酸18至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:40的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:40的氨基酸20至334。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:42的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸18至227。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:44的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸20至223。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:46的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:46的氨基酸22至368。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:48的氨基酸1至24是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:48的氨基酸25至330。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:50的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:50的氨基酸17至236。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:52的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:52的氨基酸19至250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:54的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:54的氨基酸23至478。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:56的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:56的氨基酸17至230。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:58的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:58的氨基酸20至257。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:60的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:60的氨基酸23至251。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:62的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:62的氨基酸19至349。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:64的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:64的氨基酸24至436。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:66的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:66的氨基酸21至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:68的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:68的氨基酸26至400。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:70的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:70的氨基酸21至389。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:72的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:72的氨基酸22至406。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:74的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:74的氨基酸20至427。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:76的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:76的氨基酸18至267。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:78的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:78的氨基酸21至273。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:80的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:80的氨基酸23至272。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:82的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:82的氨基酸22至327。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:84的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:84的氨基酸23至274。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:86的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:86的氨基酸21至322。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:88的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:88的氨基酸18至234。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:90的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:90的氨基酸24至233。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:92的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:92的氨基酸17至237。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:94的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:94的氨基酸20至484。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:96的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:96的氨基酸22至329。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:98的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:98的氨基酸18至227。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:100的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:100的氨基酸17至257。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:102的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:102的氨基酸20至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:104的氨基酸1至27是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:104的氨基酸28至265。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:106的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:106的氨基酸16至310。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:108的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:108的氨基酸21至354。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:110的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:110的氨基酸22至267。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:112的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:112的氨基酸16至237。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:114的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:114的氨基酸20至234。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:116的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:116的氨基酸18至226。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:118的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:118的氨基酸17至231。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:120的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:120的氨基酸22至248。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:122的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:122的氨基酸18至233。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:124的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:124的氨基酸21至243。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:126的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:126的氨基酸21至363。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:128的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:128的氨基酸20至296。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:130的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:130的氨基酸16至318。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:132的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:132的氨基酸19至259。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:134的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:134的氨基酸20至325。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:136的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:136的氨基酸19至298。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:138的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:138的氨基酸20至298。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:140的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:140的氨基酸22至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:142的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:142的氨基酸20至330。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:144的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:144的氨基酸19至216。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:146的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:146的氨基酸18至490。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:148的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:148的氨基酸21至306。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:150的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:150的氨基酸22至339。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:152的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:152的氨基酸22至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:154的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:154的氨基酸23至408。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:156的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:156的氨基酸19至234。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:158的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:158的氨基酸22至248。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:160的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:160的氨基酸21至242。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:162的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:162的氨基酸23至334。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:164的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:164的氨基酸18至230。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:166的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:166的氨基酸19至397。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:168的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:168的氨基酸23至410。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:170的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:170的氨基酸20至232。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:172的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:172的氨基酸21至266。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:174的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:174的氨基酸24至324。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:176的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:176的氨基酸21至240。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:178的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:178的氨基酸21至225。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:180的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:180的氨基酸16至235。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:182的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:182的氨基酸20至336。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:184的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:184的氨基酸17至253。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:186的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:186的氨基酸18至255。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:188的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:188的氨基酸18至225。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:190的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:190的氨基酸16至237。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:192的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:192的氨基酸18至227。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:194的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:194的氨基酸22至315。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:196的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:196的氨基酸21至439。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:198的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:198的氨基酸18至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:200的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:200的氨基酸19至324。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:202的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:202的氨基酸21至242。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:204的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:204的氨基酸16至306。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:206的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:206的氨基酸20至252。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:208的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:208的氨基酸20至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:210的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:210的氨基酸22至347。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:212的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:212的氨基酸23至334。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:214的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:214的氨基酸24至366。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:216的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:216的氨基酸21至364。在本领域中已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或两种以上不同成熟多肽(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维素分解增强活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸330至387编码信号肽的SignalP程序(尼尔森等人，1997，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸388至1332。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:3的核苷酸47至97编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸98至821。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:5的核苷酸69至125编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸126至978。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:7的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸55至678。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:9的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:9的核苷酸58至912。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:11的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:11的核苷酸46至951。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:13的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸64至796。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:15的核苷酸20至76编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸77至766。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:17的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸52至921。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:19的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸46至851。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:21的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸55至1239。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:23的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸46至1250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:25的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:25的核苷酸58至811。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:27的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:27的核苷酸64至1112。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:29的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:29的核苷酸64至859。在另一个方面，基于预测SEQID NO:31的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:31的核苷酸64至1018。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:33的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:33的核苷酸70至1483。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:35的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:35的核苷酸76至832。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:37的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:37的核苷酸52至875。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:39的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:39的核苷酸58至1250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:41的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:41的核苷酸52至795。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:43的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:43的核苷酸58至974。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:45的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:45的核苷酸64至1104。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:47的核苷酸1至72编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:47的核苷酸73至990。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:49的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:49的核苷酸49至1218。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:51的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:51的核苷酸55至930。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:53的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:53的核苷酸67至1581。在另一个方面，基于预测SEQID NO:55的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:55的核苷酸49至865。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:57的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:57的核苷酸58至1065。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:59的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:59的核苷酸67至868。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:61的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:61的核苷酸55至1099。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:63的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:63的核苷酸70至1490。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:65的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:65的核苷酸61至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:67的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:67的核苷酸76至1200。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:69的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:69的核苷酸61至1167。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:71的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:71的核苷酸64至1218。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:73的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:73的核苷酸58至1281。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:75的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:75的核苷酸52至801。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:77的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:77的核苷酸61至819。在另一个方面，基于预测SEQID NO:79的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:79的核苷酸67至869。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:81的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:81的核苷酸64至1036。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:83的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:83的核苷酸67至878。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:85的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:85的核苷酸61至966。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:87的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:87的核苷酸52至702。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:89的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:89的核苷酸70至699。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:91的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:91的核苷酸49至711。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:93的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:93的核苷酸58至1452。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:95的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:95的核苷酸64至1018。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:97的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:97的核苷酸52至818。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:99的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:99的核苷酸49至1117。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:101的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:101的核苷酸58至875。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:103的核苷酸1至81编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码码序列是SEQ ID NO:103的核苷酸82至1064。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:105的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:105的核苷酸46至1032。在另一个方面，基于预测SEQID NO:107的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:107的核苷酸61至1062。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:109的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:109的核苷酸64至801。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:111的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:111的核苷酸46至840。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:113的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:113的核苷酸58至702。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:115的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:115的核苷酸52至750。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:117的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:117的核苷酸49至851。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:119的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:119的核苷酸64至860。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:121的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:121的核苷酸52至830。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:123的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:123的核苷酸61至925。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:125的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:125的核苷酸61至1089。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:127的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:127的核苷酸58至1083。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:129的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:129的核苷酸46至1029。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:131的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:131的核苷酸55至1110。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:133的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:133的核苷酸58至1100。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:135的核苷酸1至54编码信号码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:135的核苷酸55至1036。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:137的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:137的核苷酸58至1022。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:139的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:139的核苷酸64至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:141的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:141的核苷酸58至1054。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:143的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:143的核苷酸55至769。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:145的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:145的核苷酸52至1533。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:147的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:147的核苷酸61至918。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:149的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:149的核苷酸64至1089。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:151的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:151的核苷酸64至1086。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:153的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:153的核苷酸67至1395。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:155的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:155的核苷酸55至899。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:157的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:157的核苷酸64至807。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:159的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:159的核苷酸61至726。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:161的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:161的核苷酸67至1078。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:163的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:163的核苷酸52至872。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:165的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:165的核苷酸55至1191。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:167的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:167的核苷酸67至1230。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:169的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:169的核苷酸58至696。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:171的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:171的核苷酸61至798。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:173的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:173的核苷酸70至972。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:175的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:175的核苷酸61至1112。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:177的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:177的核苷酸61至985。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:179的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:179的核苷酸46至856。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:181的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:181的核苷酸58至1008。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:183的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:183的核苷酸49至1312。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:185的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:185的核苷酸52至921。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:187的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:187的核苷酸52至739。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:189的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:189的核苷酸46至898。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:191的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:191的核苷酸52至941。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:193的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:193的核苷酸64至945。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:195的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:195的核苷酸61至1377。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:197的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:197的核苷酸52至818。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:199的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:199的核苷酸55至1122。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:201的核苷酸1至61编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:201的核苷酸60至1034。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:203的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:203的核苷酸46至1197。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:205的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:205的核苷酸58至756。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:207的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:207的核苷酸58至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:209的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:209的核苷酸64至1041。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:211的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:211的核苷酸67至1002。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:213的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:213的核苷酸70至1098。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:215的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:215的核苷酸61至1088。在以上各方面中，术语“成熟多肽编码序列”应理解成包括基因组DNA序列的cDNA序列或cDNA序列的基因组DNA序列。
中等严谨度条件：术语“中等严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在55℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中-高等严谨度条件：术语“中-高等严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在60℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种构型，在该构型中，将一个控制序列放置在相对于一个多核苷酸的编码序列的适当位置，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本GH61多肽：术语“亲本”或“亲本GH61多肽”意指一种GH61多肽，对其做出改变以产生本发明的GH61多肽变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解增强的GH61多肽或其变体。出于本发明的目的，纤维素分解增强活性通过测量来自由纤维素分解酶在以下条件下水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定：1-50mg总蛋白质/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白质由50％w/w-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白以及0.5％w/w-50％w/w GH61多肽或其变体的蛋白质组成，在合适的温度(如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)以及合适的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续1-7天，与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比较。在一个优选方面，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014中所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在下的1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦巴格斯瓦尔德(Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
用于测定GH61多肽或其变体的纤维素分解增强活性的另一种测定是在40℃下将GH61多肽或其变体与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH5)、1mM MnSO4、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01％X100一起孵育24-96小时，然后测定从PASC释放的葡萄糖。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽或其变体通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
预处理的玉米秸杆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理、或中性预处理从玉米秸杆得到的纤维素材料。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列一致性使用如EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更高版本)的Needle程序中所实现的尼德尔曼-文施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和文施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10、缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并且计算如下：
(相同残基x100)/(比对长度–比对中缺口的总数)
出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性使用如EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更高版本)的Needle程序中所实现的尼德尔曼-文施算法(尼德尔曼和文施，1970，同上)来测定。使用的参数为缺口罚分(gappenalty)10、缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并且计算如下：
(相同脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度–比对中缺口的总数)
子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失一个或多个(例如若干个)核苷酸的多核苷酸，其中该子序列编码具有纤维素分解增强活性的片段。在一个方面，一个子序列含有GH61多肽的成熟多肽编码序列的至少85％的核苷酸，例如至少90％的核苷酸或至少95％的核苷酸。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置上包含改变，即取代、插入、和/或缺失的具有纤维素分解增强活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有其亲本GH61多肽的纤维素分解增强活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
极高严谨度条件：术语“极高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在70℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
极低严谨度条件：术语“极低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑鱼精子DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹程序进行预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在45℃下将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
野生型GH61多肽：术语“野生型”GH61多肽意指由天然存在的微生物表达的GH61多肽，这些微生物如在自然界中发现的细菌、酵母、或丝状真菌。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖、和/或由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖构成的不同寡糖。木聚糖类型的多糖可以分为均木聚糖和杂木聚糖，这些杂木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖、阿拉伯木聚糖、以及复合杂木聚糖。参见，例如，埃伯林格罗瓦(Ebringerova)等人，2005，聚合物科学进展(Adv.Polym.Sci.)186:1–67。
在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个优选方面，该含木聚糖材料是木质纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括：别雷(Biely)和普乔尔德(Puchard)，2006，木聚糖分解酶测定的最近进展(Recentprogress in the assays of xylanolytic enzymes)，食品与农业科学杂志(Journalof the Science of Food and Agriculture)86(11):1636-1647；斯帕尼科瓦(Spanikova)和别雷，2006，葡糖醛酸酯酶-由产生的新型碳水化合物酯酶裂褶菌(Schizophyllum commune)(Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrateesterase produced by Schizophyllum commune)，欧洲生化学会联合会快报580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrmann)、沃散斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫西(Hirsch)、别雷、以及库比切克(Kubicek)，1997，里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶(Thebeta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylanxylohydrolase)，生物化学杂志(Biochemical Journal)321:375-381。
总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖形成的还原糖来测量，这些木聚糖包括(例如)燕麦斯佩尔特小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)、以及落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可以通过从不同共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段的光度测定来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如贝利(Bailey)、别雷、剖坦恩(Poutanen)，1992，用于木聚糖酶活性的测定方法的实验室间测试(Interlaboratory testing of methods for assay of xylanaseactivity)，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性还可在37℃下在0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下在200mM磷酸钠(pH6)缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
出于本发明的目的，木聚糖降解活性通过测量由木聚糖降解酶在以下典型条件下造成的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))水解的增加来测定：1ml反应、5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物、50mM乙酸钠(pH5)、50℃、24小时，如里弗(Lever)，1972，用于碳水化合物的比色测定的新反应(A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates)，分析生物化学(Anal.Biochem)47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，木聚糖酶活性是在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中在37℃下，使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
变体命名惯例
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:30中披露的成熟多肽来确定另一个GH61多肽中相对应的氨基酸残基。将另一个GH61多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:30中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，可以使用如EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更高版本)的Needle程序中所实现的尼德尔曼-文施算法(尼德尔曼和文施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ ID NO:30中所披露的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10、缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。氨基酸位置的编号基于SEQ ID NO:30的全长多肽(例如，包括信号肽)，其中位置1是信号肽的第一个氨基酸(如，Met)。
另一个GH61多肽中相对应氨基酸残基的鉴定可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数进行的多个多肽序列的比对来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过log期望的多序列比较；3.5版或更高版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)；MAFFT(6.857版或更高版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学(Bioinformatics)26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更高版本；汤普森等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。
例如，与烟曲霉GH61多肽(SEQ ID NO:30)中的位置105相对应的位置是埃默森青霉GH61多肽(SEQ ID NO:36)中的位置109、金黄色嗜热子囊菌GH61多肽(SEQ ID NO:14)中的位置105、以及棘孢曲霉GH61多肽(SEQ ID NO:68)中的位置103；与烟曲霉GH61多肽中的位置188相对应的位置是埃默森青霉GH61多肽中的位置192、金黄色嗜热子囊菌GH61多肽中的位置188、以及棘孢曲霉GH61多肽中的位置186；与烟曲霉GH61多肽的位置154相对应的位置是棘孢曲霉GH61多肽中的位置152；并且与烟曲霉GH61多肽中的位置189相对应的位置是埃默森青霉GH61多肽中的位置193以及棘孢曲霉GH61多肽中的位置187。
当另一个GH61多肽与SEQ ID NO:30的成熟多肽歧异，这样使得传统的基于序列的比较无法检测出它们的关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛氟松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志295:613-615)，可以使用其他配对序列比较算法。基于序列的搜索中的较高的灵敏度可以使用利用多肽家族的概率表现(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生序型，并且能够检测出远程同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可以实现更高灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对序型以及溶解势)的信息作为预测所查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，可以使用高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法来将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可以进而用于生成该多肽的同源性模型，并且这类模型可以针对准确度使用多种为那个目的开发的工具加以评价。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，并且那些比对是可获取并且可下载的。两个或两个以上蛋白质结构可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm and Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合延伸(combinatorialextension)(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和博尔内(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)进行比对，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，霍尔姆(Holm)和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的GH61多肽变体时，为了方便参照起见，采用了以下所述的命名法。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。相应地，将位置226处的苏氨酸取代为丙氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过添加加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，对应地代表分别位置205和411的甘氨酸(G)取代为精氨酸(R)，以及丝氨酸(S)取代为苯丙氨酸(F)。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。相应地，在位置195处的缺失命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过添加加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。相应地，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸#1，插入氨基酸#2；等等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过在一个或多个插入氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对一个或多个插入氨基酸残基进行编号。因此，在以上实例中，序列将为：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个取代。包含多个取代的变体通过添加加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”对应地代表分别在位置170处的精氨酸取代为酪氨酸，以及在位置195处甘氨酸取代为谷氨酸。
不同的取代。在可以在一个位置处引入不同的取代的情况下，这些不同取代由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸取代为酪氨酸或谷氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指以下变体：
“Tyrl67Gly+Argl70Gly”、“Tyrl67Gly+Argl70Ala”、“Tyrl67Ala+Argl70Gly”、以及“Tyrl67Ala+Argl70Ala”。
发明详细说明
本发明涉及分离的GH61多肽变体，包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性。
变体
在一个实施例中，该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。
在一个方面，本发明的变体中取代的数目是1-6个，例如1、2、3、4、5、或6个取代。
在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的四个位置处的取代。在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的五个位置处的取代。在另一个方面，变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的每个位置处的取代。
在另一个方面，该变体包含在与位置105相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置105相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Pro或Lys。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P或E105K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置154相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Ile或Leu。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I或E154L，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置188相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Ala、Met、Phe、或Trp。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A、G188F、G188M、或G188W，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置189相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置189相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为His或Lys。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N189H或N189K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置216相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置216相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Leu或Tyr。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A216L或A216Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置229相对应的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置229相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Trp、His、Ile或Tyr。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代K229W、K229H、K229I、或K229Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105和154相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105和188相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105和189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105和216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105和229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154和188相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154和189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154和216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154和229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188和189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188和216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188和229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置189和216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置189和229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置216和229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、以及188相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、以及189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、以及189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、以及189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、以及189相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置188、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、189、以及216相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、189、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、188、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置154、188、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的位置处的取代(如以上描述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ IDNO:30相对应的位置处的选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代或由其组成：E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y，或包含选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代或由其组成：E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y。
在以下各方面中，该变体包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ IDNO:30相对应的位置处的一个或多个(例如若干个)以下描述的取代，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K和E154I,L，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K和G188A,F,M,W，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K和N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K和A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K和K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L和G188A,F,M,W，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L和N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L和A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L和K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W和N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W和A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W和K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N189H,K和A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N189H,K和K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A216L,Y和K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、以及G188A,F,M,W，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、以及N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、以及N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、以及N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、以及N189H,K，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A,F,M,W、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、以及A216L,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、G188A,F,M,W、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P,K、E154I,L、G188A,F,M,W、N189H,K、A216L,Y、以及K229W,H,I,Y，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:14的成熟多肽的取代D105K,P，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:14的成熟多肽的取代Q188W,F,M，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代D109P,K，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代N192A,W,M，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代N193K,H，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代D109P,K，或由其组成。在另一个方面，该取代是SEQID NO:36的成熟多肽的N192A,W,M。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代N193K,H，或由其组成。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:68的成熟多肽的取代D103K,P，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:68的成熟多肽的取代N152I,L，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:68的成熟多肽的取代G186A,F,M,W，或由其组成。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:68的成熟多肽的取代N187H,K，或由其组成。
这些变体可以进一步包含在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的改变，例如，取代、插入、或缺失。
氨基酸改变可以具有次要性质,即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域中已知的，并且(例如)由H.纽拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在《蛋白质》(The Proteins)(学术出版社(Academic Press)，纽约(New York))中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的这样一种性质。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
本发明的变体可以进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性(WO2012/044835)。
在一个方面，本发明的变体中另外的取代的数目是1-4个，如1、2、3、或4个取代。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、155、以及162中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、155、以及162中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、155、以及162相对应的每个位置处的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置111相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Val。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置152相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置152相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Ser。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置155相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置155相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Leu。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代M155L。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置162相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置162相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Trp。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A162W。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111和152相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111和155相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111和162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置152和155相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置152和162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置155和162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、以及155相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、以及162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、155、以及162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置152、155、以及162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置111、152、155、以及162相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ ID NO:30相对应的位置处的选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代：L111V、D152S、M155L、以及A162W；或选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代：L111V、D152S、M155L、以及A162W。
在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、以及G188A，或在其相对应的位置处的相同取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、G188F、以及K229W，或在其相对应的位置处的相同取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、以及K229W，或其相对应的取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、A216Y、以及K229W，或在其相对应的位置处的相同取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、N189K、以及K229W，或在其相对应的位置处的相同取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、以及N189K，或在其相对应的位置处的相同取代。在另一个方面，该变体包含取代L111V、D152S、M155L、A162W、以及G188W，或在其相对应的位置处的相同取代。
在以下各方面中，该变体进一步包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ ID NO:30相对应的位置处的一个或多个(例如若干个)以下描述的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+M155L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S+M155L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代M155L+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+M155L+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S+M155L+A162W、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W、或其相对应的取代。
在以上各方面中，本发明的变体可以进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性(WO2012/044836)。
在一个方面，本发明的变体中另外的取代的数目是1-5个，如1、2、3、4、或5个取代。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的四个位置处的取代。在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的每个位置处的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置96相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Val。在另一个方面，该变体进一步包含SEQID NO:30的成熟多肽的取代I96V。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置98相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Leu。在另一个方面，该变体进一步包含SEQID NO:30的成熟多肽的取代F98L。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置200相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置200相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Ile。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置202相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置202相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Leu。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I202L。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置204相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置204相对应的位置处的氨基酸取代为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val、优选取代为Val。在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I204V。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96和98相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96和200相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96和202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96和204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98和200相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98和202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98和204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置200和202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置200和204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置202和204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、以及200相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、以及202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、200、以及202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、200、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98、200、以及202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98、200、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置200、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、以及202相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、200、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置98、200、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的位置处的取代，如以上描述的那些。
在另一个方面，该变体进一步包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ ID NO:30相对应的位置处的选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V；或选自由以下各项组成的组的一个或多个(例如若干个)取代：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V。
在以下各方面中，该变体进一步包含在与在此描述的其他GH61多肽的SEQ ID NO:30相对应的位置处的一个或多个(例如若干个)以下描述的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F200I、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+F200I、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+F200I、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F200I+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F200I+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+F200I+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+F200I+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+F200I+I202L、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F200I+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+F200I+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L+F200I+I202L+I204V、或其相对应的取代。
在另一个方面，该变体进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V+F98L+F200I+I202L+I204V、或其相对应的取代。
该变体可以由相对应的亲本GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基组成。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，在分子中的每个残基中引入单个丙氨酸突变，并且针对纤维素分解增强活性测试所得突变分子，以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点也可以通过对如用如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记的这类技术测定的结构进行物理分析，结合对推定的接触位点氨基酸进行突变而测定。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报309:59-64。必需氨基酸的身份还可以从与相关多肽的比对来推断。GH61多肽中的必需氨基酸与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置22、107、194、和/或196相对应。
在一个实施例中，与其亲本GH61多肽相比，变体具有增加的热稳定性。
在一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和95℃下测定。
在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和95℃下测定。
在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育1分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育5分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育10分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育15分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育20分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育25分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育30分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育45分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育60分钟来测定。也可以使用比60分钟更长的时间段。
在一个方面，与亲本相比，具有纤维素分解增强活性的变体的热稳定性增加至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。
亲本GH61多肽
亲本GH61多肽可以是具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽。
亲本GH61多肽可以是(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由在至少低严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体；或(c)由与以下具有至少60％的序列一致性的多核苷酸编码的多肽：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列。
在一个方面，该亲本与具有纤维素分解增强活性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
在另一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽有至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的不同。
在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的氨基酸序列，或由其组成。
在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽，或由其组成。
在另一个方面，该亲本是含有GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基的片段。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽的等位变体。
在另一个方面，该亲本由在极低严谨度条件下、低严谨度条件下、中等严谨度条件下、中-高等严谨度条件下、高严谨度条件下、或极高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列、或其全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆(Molecular Cloning)实验室手册(A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(New York))。
SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的多核苷酸、或其子序列，以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的多肽、或其片段可以用来设计核酸探针，以根据本领域中熟知的方法由不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体来说，可以根据标准的Southern印迹程序，将这类探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便在其中鉴定和分离相对应的基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)，以检测相对应的基因。这类探针涵盖于本发明。
可以筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中与上述探针杂交并且编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离来自这类其他菌株的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素或其他合适的载体材料上并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215、或其子序列杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于Southern印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在极低至极高严谨度条件下与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215；(ii)其成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X射线片或本领域中已知的任何其他检测手段检测核酸探针在这些条件下所杂交的分子。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列。
在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。
在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215。
在另一个实施例中，该亲本由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多核苷酸编码。
该亲本可以是一种杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一个多肽的区域的N末端或C末端。
该亲本可以是一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N末端或C末端。融合多肽是通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合至本发明的多核苷酸来产生。产生融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，以使得它们同框，并且融合多肽的表达受到相同的启动子和终止子的控制。融合多肽还可以使用内蛋白技术构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以进一步在两个多肽之间包含一个裂解位点。一旦分泌了融合蛋白，该位点就被裂解，从而释放这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；罗斯默森-威尔森(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-雷西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传学(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(DrugDiscovery World)4:35-48。
该亲本可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此与给定来源结合使用的术语“获自”，意思应为由多核苷酸编码的亲本由该来源产生，或由其中插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，该亲本分泌到胞外。
该亲本可以是一种细菌GH61多肽。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)GH61多肽；或一种革兰氏阴性菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)GH61多肽。
在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)GH61多肽。
在另一个方面，该亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)GH61多肽。
在另一个方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)GH61多肽。
该亲本可以是一种真菌GH61多肽。例如，该亲本可以是一种酵母GH61多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)GH61多肽；或一种丝状真菌GH61多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)GH61多肽。
在另一个方面，该亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)GH61多肽。
在另一个方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillusterreus)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、雪白芬尼菌(Fennellia nivea)、拟杆镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Talaromyces leycettanus、金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)GH61多肽。
应理解的是，对于以上提到的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectand imperfect states)二者，以及其他分类学的等同物，例如无性型，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适当的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众来说是容易获得的，这些保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水，等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接从天然生境分离微生物和DNA的技术是本领域内熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的方法，包括：(a)在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且任选地(b)回收该变体。在一个方面，该方法进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入该亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。在另一个方面，该方法进一步或甚至更进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入该亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
这些变体可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组，等等来制备。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点引入一个或多个(例如若干个)突变的技术。
定点诱变可以在体外通过涉及使用含有所希望突变的寡核苷酸引物的PCR达成。定点诱变还可以在体外通过表达盒诱变来执行，这涉及用限制酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行裂解，并且随后将含有该突变的寡核苷酸连接在该多核苷酸中。消化该质粒和该寡核苷酸的限制酶通常是相同的，从而允许该质粒和插入物的粘性末端互相连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。
定点诱变还可以在体内通过本领域已知的方法达成。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
位点饱和诱变在一个或多个(例如，若干个)特定位置处将多肽编码序列系统性地置换为编码全部19个氨基酸的序列(帕里克(Parikh)和松村(Matsumura)，2005，分子生物学杂志352:621-628)。
任何定点诱变程序都可以在本发明中使用。有许多可以用于制备变体的可获得的商业试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计成编码目标多肽的多核苷酸分子。基因合成可以利用多种技术来执行，如由田(Tian)等人(2004，自然432:1050-1054)所描述的基于多通道微芯片(multiplex microchip-based)的技术、以及类似技术，其中合成寡核苷酸并且在光可编程的微流芯片上组装。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入并且使用诱变、重组、和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409、WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(内丝(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)l7:893-896)。编码活性多肽的诱变DNA分子可以从宿主细胞回收并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中个别氨基酸残基的重要性。
半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面而达成。半合成构建典型的是利用合成的多核苷酸片段与PCR技术的组合的方法。基因的限定区域因而可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物扩增，而其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以将多核苷酸子序列改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的GH61多肽变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列上，该一个或多个控制序列在合适的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用多种方式操纵该多核苷酸，以提供GH61多肽变体的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域中熟知的。
控制序列可以是启动子，其是由用于表达编码本发明的变体的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。该启动子含有介导GH61多肽变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的、以及杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌crylllA基因(埃盖斯(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白质”(“Useful proteins from recombinantbacteria”)、以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例在WO99/43835中披露。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变的、截短的、以及杂合的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1/GAP、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由罗马努斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述。
控制序列还可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。该终止子可操作地连接至编码该GH61多肽变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(休(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
控制序列还可以是前导序列，其为对于宿主细胞的翻译来说重要的mRNA非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该GH61多肽变体的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，其是可操作地连接至GH61多肽变体编码序列的3’末端的序列，并且在转录时，被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA上的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列从以下基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭(Guo)和舍曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接至GH61多肽变体的N末端的信号肽，并且指导该变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列的5’末端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码该变体的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可替代地，编码序列5’末端可以含有对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不含天然信号肽编码序列时可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva)，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于GH61多肽变体N末端的前肽。所得多肽称为前酶或前多肽(或在一些情况下称为酶原)。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化裂解从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽和前肽序列二者均存在的情况下，前肽序列的位置紧接着GH61多肽变体的N末端，并且信号肽序列的位置紧接着前肽序列的N末端。
还可能希望添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节GH61多肽变体的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及以重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将可操作地连接至该调节序列。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，该重组表达载体包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号。多种核苷酸和控制序列可以接合在一起，以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点，以允许在这类位点插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过在适当的用于表达的载体中插入多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体来表达该多核苷酸。在创建表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，以使得该编码序列与适当的控制序列可操作地连接用于表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于载体与该载体待引入其中的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何构件。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的一个或多个染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或两个以上载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组中的完整DNA，或可以使用转座子。
载体优选含有一个或多个选择性标记，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的、或类似细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性、等等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选用于曲霉属细胞的是的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
选择性标记可以是WO2010/039889中所述的双重选择性标记系统。在一个方面，该双重选择性标记是hph-tk双重选择性标记系统。
载体优选含有其允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖编码GH61多肽变体的多核苷酸序列或载体的用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的任何其他元件。可替代地，载体可以含有另外的用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组的一条或多条染色体中的一个或多个精确位置的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相对应的靶序列具有高度序列一致性以提高同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所谈论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中具有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建可以根据在WO00/24883中披露的方法达成。
可以将一个以上拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中，以增加GH61多肽变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合到宿主细胞基因组中、或与多核苷酸一起包括可扩增的选择性标记基因，其中可以通过在适当的选择剂的存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝、并且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸，其可操作地连接至指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，以使得该构建体或载体如前所述以染色体整合体形式或以自我复制的染色体外载体形式维持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在GH61多肽变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌、梭菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、海洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌、大肠杆、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门菌、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
可以通过如下方法实现将DNA引入芽孢杆菌细胞中：原生质体转化(参见，例如，常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，扬(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829、或Dubnau和达维多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或接合(参见，例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。可以通过如下方法实现将DNA引入大肠杆菌细胞中：原生质体转化(参见，例如，哈纳汉(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)、或电穿孔(参见，例如，道尔等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。可以通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌细胞中：原生质体转化、电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microbiol.(Praha))49:399-405)、接合(参见，例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见，例如，布尔克(Burke)等人，2001，美国科学院院刊98:6289-6294)。可以通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌细胞中：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)、或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。可以通过如下方法实现将DNA引入链球菌细胞中：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)、或接合(参见，例如，克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用用于将DNA引入宿主细胞的本领域已知的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所使用的“真菌”包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)、以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，在安-倍氏菌物辞典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，英国剑桥大学出版社(UniversityPress,Cambridge,UK)中所定义)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及属于不完全真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities ofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编，应用细菌学学会第9次系列座谈会(Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9)，1980)中所述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟赌菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的合适方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因78:147-156、以及WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及Hinnen等人，1978，美国科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生GH61多肽变体的方法，包括：(a)在适合于该变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并且任选地(b)回收该变体。
使用本领域中已知的方法在适合于产生该GH61多肽变体的营养培养基中培养该宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中并且在允许表达和/或分离该变体的条件下进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，那么该变体能够从该培养基中直接回收。如果变体不被分泌，那么其可以从细胞裂解物中回收。
可以使用本领域中已知的对于该变体是特异性的方法来检测该GH61多肽变体。这些检测方法包括但不限于：使用特异性抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，酶测定(enzyme assay)可以用于测定该变体的活性。参见，例如，在实例5中描述的测定。
GH61多肽变体可以使用本领域中已知的方法回收。例如，变体可以通过常规程序从营养培养基中回收，这些常规程序包括但不限于：收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了包含本发明的变体的整个发酵液。
GH61多肽变体可以通过本领域中已知的多种程序纯化以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦、以及尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，不回收GH61多肽变体，而是使用表达该变体的本发明的宿主细胞作为该变体的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，其被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀灭的全液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例来说，当使微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下孵育以允许蛋白质合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级或分级的内含物。一般来说，发酵液是未分级的，并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，该第一有机酸组分包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐，并且该第二有机酸组分包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个特定实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或两种以上的混合物，并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷甲酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或两种以上的混合物。
在一个方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中，从细胞杀灭的全液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，如选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白(swollenin)。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如若干种)酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
该细胞杀灭的全液或组合物可以含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级的内含物。典型地，该细胞杀灭的全液或组合物含有用过的培养基以及在使微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，在限制碳的条件下孵育以允许蛋白质合成(例如纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶酶类的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、以及杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，在细胞杀灭的全液或组合物中存在的微生物细胞可以使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。
如在此所述的全液或细胞组合物典型地为液体，但是可能含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分，以提供澄清的液体组合物。
本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO90/15861或WO2010/096673中描述的方法来产生。
下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及组合物使用的其他条件可以根据本领域已知的方法来确定。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。优选地，这些组合物富集了这种变体。术语“富集”表明该组合物的纤维素分解增强活性(例如)增加了以至少1.1的富集因子。
这些组合物可以包含本发明的变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白。这些组合物还可以包含选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如若干种)酶：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这些组合物可以根据本领域中已知的方法制备，并且可以呈液体或干组合物的形式。这些组合物可以根据本领域中已知的方法稳定化。
下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及组合物使用的其他条件可以根据本领域已知的方法来确定。
用途
本发明还针对使用具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体、或其组合物的以下方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。该纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可以使用本领域中已知的方法与不溶性纤维素材料分离，例如像离心、过滤、或重力沉降。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵物中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中该纤维素材料在本发明的GH61多肽变体的存在下用酶组合物糖化。在一个方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，这些方法进一步包括从发酵物中回收该发酵产物。
本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将这些可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇、和/或平台化学品(platform chemical)(例如酸、醇、酮、气体、等等)。从纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域常规的方法达成。此外，本发明的方法可以使用配置成根据发明操作的任何常规生物质加工设备实施。
分别或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分别水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分别水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用单独的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体，然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖至乙醇的发酵被组合在一个步骤中(《生物乙醇手册：生产和利用》(Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization)(怀曼，C.E.(Wyman,C.E.)编，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212)中，菲利皮迪斯，G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulosebioconversion technology))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩，J.(Sheehan,J.)和希默尔，M.(Himmel,M.)，1999，酶、能量与环境：美国能源部研究和开发生物乙醇的战略性观点(Enzymes,energy and the environment:Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research anddevelopment activities for bioethanol)，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF在同时糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，该步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下执行，即高温酶糖化，随后在发酵菌株能够耐受的较低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(酶产生、水解和发酵)组合在一个或多个(例如若干个)步骤中，其中使用相同生物体来产生用于将纤维素转化成可发酵糖的酶并且将可发酵糖转化成最终产物(林德，L.R.(Lynd,L.R.)，韦默，P.J.(Weimer,P.J.)，范泽尔，W.H.(van Zyl,W.H.)、以及普利特瑞斯，I.S.(Pretorius,I.S.)，2002，微生物纤维素利用：基础与生物技术(Microbialcellulose utilization:Fundamentals and biotechnology)，微生物分子生物学综述(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合，可以用于实施本发明的方法。
常规设备可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(费尔南达.德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝(Fernanda de Castilhos Corazza)、弗拉维奥.法里亚.德.莫赖斯(FlávioFaria de Moraes)、吉塞拉.玛丽亚.扎宁(Gisella Maria Zanin)以及伊沃.雷特泽尔(Ivo Neitzel)，2003，用于纤维二糖水解的补料分批反应器的优化控制(Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，科技学报(自然科学版)(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨科夫，A.V.(Gusakov,A.V.)和辛涅特西，A.P.(Sinitsyn,A.P.)，1985，纤维素的酶水解动力学：1.分批反应器加工的数学模型(Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)、研磨反应器(隆，S.K.(Ryu,S.K.)和李，J.M.(Lee,J.M.)，1983，通过使用研磨反应器进行的废弃纤维素的生物转化(Bioconversion of waste cellulose by using an attritionbioreactor)，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)25:53-65)、或具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(古萨科夫，A.V.、辛涅特西，A.P.、谢尔盖，I.Y.(Davydkin,I.Y.)、谢尔盖，V.Y.、普罗塔斯，O.V.(Protas,O.V.)，1996，使用具有由电磁场引起的强烈搅拌的新型反应器增强酶纤维素水解(Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化、以及用于水解和/或发酵的挤出机型反应器。
预处理。在本发明的方法的实践中，可以使用本领域已知的任何预处理过程来破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理：木质纤维素的高效酶水解的关键？(Substratepretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？)，生物化学工程/生物技术的进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficientbioethanol production)，生物化学工程/生物技术的进展108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman)，2009，用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosicbiomass)，生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18；莫热(Mosier)等人，2005，用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosicbiomass)，生物资源技术96:673-686；塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生：综述(Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogasproduction:A review)，分子科学国际杂志(Int.J.of Mol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤、和/或调理。
常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体、以及γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前执行。可替代地，预处理可以与酶水解同时执行，以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至需要的温度和压力，并且在其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140℃-250℃，例如160℃-200℃、或170℃-190℃下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选为1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，以使得纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，迅速闪变至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术855:1-33；盖博和小林，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。
化学预处理：术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理方法的实例包括：(例如)稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体、以及有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2SO4或SO2(典型地0.3至5％w/w)，其降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；萨斯那(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(典型地为H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至所希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计执行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫和默里，1996，见上文，舍尔(Schell)等人，2004，生物资源技术91:179-188，李(Lee)等人，1999，生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的若干预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85℃-150℃的温度下执行石灰预处理，并且停留时间从1小时到若干天(怀曼等人，2005，生物资源技术96:1959-1966；莫热等人，2005，生物资源技术96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900、以及WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180℃-200℃下持续5-15分钟(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术64:139-151；帕罗内(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术117:1-17；瓦尔加(Varga)等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1％-40％干物质，例如2％-30％干物质或5％-20％干物质执行，并且由于添加碱如碳酸钠，初始pH经常增加。
被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停停留时间之后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而终止预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在如90℃-150℃的中等温度和如17-20bar的高压下，用液体或气态氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(格拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术98:23-35；俊达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖类复合物被裂解。
有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下提取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861；库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除了大部分半纤维素和木质素。
合适的预处理方法的其他实例由舍尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术，第105-108卷，第69-85页、和莫热等人，2005，生物资源技术96:673-686、以及美国公开申请2002/0164730描述。
在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选以连续稀酸处理形式执行。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1-5，例如1-4或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度优选在0.0.1至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。使酸与纤维素材料相接触，并在优选140℃-200℃，例如165℃-190℃范围内的温度下保持1至60分钟范围内的时期。
在另一个方面，预处理在含水浆料中进行。在优选方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％之间，例如20-70wt％或30-60wt％，如大约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒大小减少的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨(grinding)或碾磨(milling)(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
纤维素材料可以进行物理(机械)和化学预处理二者。机械或物理预处理可以与以下相结合：蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波福射)、或其组合。在一个方面，高压意指在优选约100至约400psi，例如约150至约250psi范围内的压力。在另一个方面，高温意指在约100℃至约300℃，例如约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统来执行，其使用如上所定义的高压和高温，该系统例如来自顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典(Sweden)的Sunds水解器(Sunds Hydrolyzer)。这些物理和化学预处理可以根据需要依次执行或同时执行。
因此，在一个优选方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，《生物乙醇手册：生产和利用》(怀曼C.E.编，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212)中，舒T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatment of biomass)；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemical and biological treatments forenzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass)，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；用于燃料生产的生物质的酶转化(EnzymaticConversion of Biomass for Fuels Production)(希默尔，M.E.、贝克，J.O.、以及奥弗伦R.P.(Overend,R.P.)编，美国化学学会第566次系列座谈会(ACSSymposium Series566)，美国化学学会(American Chemical Society)，华盛顿特区，第15章)中，麦克米兰，J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)；生物化学工程/生物技术的进展(舍佩尔，T.编，德国海德堡柏林(Berlin Heidelberg,Germany)施普林格(Springer-Verlag)，65:207-241)中，贡，C.S.(Gong,C.S.)、卡奥，N.J.(Cao,N.J.)、杜，J.(Du,J.)、以及曹，G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可更新资源生产乙醇(Ethanol production from renewable resources)；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，由木质纤维素材料生产乙醇：技术现状(Production of ethanol from lignocellulosic materials:State ofthe art)，生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
糖化。在水解步骤(也称为糖化)中，将(例如预处理的)纤维素材料水解，以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在本发明的GH61多肽变体的存在下酶促进行。这些组合物的酶可以同时或依次添加。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下、在合适的含水环境中执行。在一个方面，水解在适于一种或多种酶组分的活性，即对于该一种或多种酶组分最佳的条件下执行。水解可以作为补料分批或连续过程执行，其中将纤维素材料逐渐馈入例如含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中、在受控的pH、温度、以及混合条件下执行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续至多200小时，但是典型地执行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度在优选约25℃至约80℃，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃范围内。pH在优选约3至约9，例如约3.5至约7、约4至约6、或约5.0至约5.5范围内。干燥固体含量在优选约5至约50wt％，例如约10至约40wt％或约20至约30wt％范围内。
该酶组合物可以包含适用于降解纤维素材料的任何蛋白。
在一个方面，该酶组合物包含或进一步包含选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白。在另一个方面，该纤维素酶优选为一种或多种(例如，若干种)选自由以下各项组成的组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面，该半纤维素酶优选为一种或多种(例如，若干种)选自由以下各项组成的组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
在另一个方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一个方面，该酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面，该酶组合物包含选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如，若干种)酶。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，该酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、以及具有纤维素分解增强活性的多肽。
在另一个方面，该酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，该酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，该酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，该酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，该酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，该酶组合物包含甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，该酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选方面，该木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一个优选方面，该木聚糖酶是家族11木聚糖酶。在另一个方面，该酶组合物包含木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)。
在另一个方面，该酶组合物包含酯酶。在另一个方面，该酶组合物包含苹果菌素。在另一个方面，该酶组合物包含漆酶。在另一个方面，该酶组合物包含木质素分解酶。在一个优选方面，该木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选方面，该木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选方面，该木质素分解酶是H2O2产生酶。在另一个方面，该酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，该酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，该酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，该酶组合物包含扩张蛋白。
在本发明的方法中，该一种或多种酶可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或之中添加。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，若干种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)其他组分的细胞的天然蛋白。该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以作为单组分产生，然后将其组合以形成该酶组合物。该酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制备物的组合。
在本发明的方法中使用的酶可以处于适于使用的任何形式，例如像，发酵液配制品或细胞组合物、含或不含细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶制备物、或宿主细胞，作为酶的来源。酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体、或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可以根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或另外的多元醇、和/或乳酸或另外的有机酸)而加以稳定化。
酶和GH61多肽变体的最佳量取决于若干因素，包括但不限于：纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及发酵生物体(例如，用于同时糖化和发酵的酵母)的纳入。
在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，例如，约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个方面，GH61多肽变体对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如，约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，GH61多肽变体对纤维素分解或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约1.0g，例如，约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g每g纤维素分解或半纤维素分解酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及适用于纤维素材料的降解的其他蛋白质/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在下文统称为“具有酶活性的多肽”)可以源自或获自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还意指该酶可以已在宿主生物体中采用在此所述的方法重组产生，其中重组产生的酶对于宿主生物体是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如，若干个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，如具有酶活性的芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳杆菌、乳球菌、梭菌、土芽孢杆菌、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor)、热酸菌属(Acidothermus)、Thermobifidia、或海洋芽孢杆菌多肽；或革兰氏阴性菌多肽，如具有酶活性的大肠杆菌、假单胞菌、沙门菌、弯曲杆菌、螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、或脲原体属多肽。
在一个方面，该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个方面，该多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个方面，该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、或浅青紫链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选地是酵母多肽，如具有酶活性的假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽；或更优选地一种丝状真菌多肽，如具有酶活性的枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。
在一个方面，该多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母多肽。
在另一个方面，该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、谷类镰抱、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或褐孢长毛盘菌(Trichophaeasaccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是重组组分，即，通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)。该宿主优选是异源宿主(酶对宿主是外源的)，但该宿主在某些条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化这种蛋白质来制备。
在一个方面，该一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶包含商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括：(例如)CTec(诺维信公司)、CTec2(诺维信公司)、CTec3(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、NOVOZYMTM188(诺维信公司)、CELLUZYMETM(诺维信公司)、CEREFLOTM(诺维信公司)、以及ULTRAFLOTM(诺维信公司)、ACCELERASETM(杰能科国际(Genencor Int.))、LAMINEXTM(杰能科国际)、SPEZYMETMCP(杰能科国际)、NL(帝斯曼(DSM))；S/L100(帝斯曼)、ROHAMENTTM7069W(罗姆股份有限公司(GmbH))、LDI(Dyadic国际有限公司(Dyadic International,Inc.))、LBR(Dyadic国际有限公司)、或150L(Dyadic国际有限公司)。所添加的纤维素酶的有效量为约0.001至约5.0wt％的固体，例如0.025至约4.0wt％的固体、或约0.005至约2.0wt％的固体。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039、WO93/15186、美国专利号5,275,944、WO96/02551、美国专利号5,536,655、WO00/70031、WO05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)、里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)、里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology13:219-228，GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究18:5884)；川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)、尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)、灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)、Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)、粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶、担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶、担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶、土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶、土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶、土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶、土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶、土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶、Cladorrhinum foecundissimumATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶、以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
适用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO2009/042871)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。
适用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人，1996，基因173:287-288)、烟曲霉(WO2005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人，2000，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275:4973-4980)、米曲霉(WO2002/095014)、巴西青霉IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)、土生梭孢霉(WO2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)。
β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。
其他适用内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶披露于使用根据以下的分类法的许多糖基水解酶家族中：亨利萨特B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的一种分类法，生物化学杂志280:309-316、以及亨利萨特B.和贝洛赫A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类法，生物化学杂志316:695-696。
可以用于本发明的其他纤维素分解酶描述于以下文献中：WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、以及美国专利号5,686,593。
在本发明的方法中，具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽都可以被用作酶组合物的组分。
适用于本发明的方法的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于：来自土生梭孢霉(WO2005/074647、WO2008/148131、以及WO2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(WO2005/074656和WO2010/065830)、里氏木霉(WO2007/089290)、嗜热毁丝霉(WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864、WO2009/085868)、烟曲霉(WO2010/138754)的GH61多肽；来自：嗜松青霉(WO2011/005867)、嗜热子囊菌属物种(WO2011/039319)、青霉属物种(WO2011/041397)、甲壳嗜热子囊菌(WO2011/041504)、棘孢曲霉(WO2012/0307990)、以及嗜热棉毛菌(WO2012/113340)的GH61多肽。WO2012/146171披露了来自特异腐质霉的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及其多核苷酸。
在一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体和GH61多肽在根据WO2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体和GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆(PCS))获得的液剂的存在下使用。
该二氧化合物可以包括含有两个或两个以上氧原子的任何合适化合物。在一些方面，该二氧化合物含有如在此所述的取代的芳基部分。该二氧化合物可以包含一个或多个(例如，若干个)羟基和/或羟基衍生物，但是还包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基部分。二氧化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；以及甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或其盐或溶剂合物。
该二环化合物可以包括如在此所述的任何合适的取代稠合环系统。这些化合物可以包含一个或多个(例如，若干个)另外的环，并且除非另外说明，否则不限于具体的环数。在一个方面，该二环化合物是类黄酮。在另一个方面，该二环化合物是任选取代的异类黄酮。在另一个方面，该二环化合物是任选取代的花色离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色素苷、或其衍生物。二环化合物的非限制性实例包括：表儿茶素、槲皮素、杨梅黄酮、黄杉素、山奈酚、桑色素、金合欢素、柚皮素、异鼠李素、芹菜苷配基、花青素、花青苷、kuromanin、花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)、或其盐或溶剂合物。
该杂环化合物可以是任何合适的化合物，如包含杂原子的任选取代的芳环或非芳环，如在此所描述。在一个方面，该杂环是包含任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分的化合物。在另一个方面，该任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是任选取代的5元杂环烷基或任选取代的5元杂芳基部分。在另一个方面，该任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基部分是选自以下的任选取代的部分：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并-吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基、氮杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、哌啶基、以及氧杂环庚三烯基。在另一个方面，该任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括：(1,2-二羟乙基)-3,4-二羟呋喃-2(5H)-酮、4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮、5-羟基-2(5H)-呋喃酮、[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮、α-羟基-γ-丁内酯、核糖酸γ-内酯、己酸糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)、葡糖酸δ-内酯、4-羟基香豆素、二氢苯并呋喃、5-(羟甲基)糠醛、1,2-二呋喃乙醇酮、2(5H)-呋喃酮、5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮、以及5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、或其盐或溶剂合物。
该含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何合适化合物。在一个方面，该含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺、或氧化亚氮部分。含氮化合物的非制定性实例包括：丙酮肟、紫尿酸、吡啶-2-醛肟、2-氨基苯酚、1,2-苯二胺、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基、5,6,7,8-四氢生物蝶呤、6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤、以及马来酰胺酸、或其盐或溶剂合物。
该醌化合物可以是如在此所述的包含醌部分的任何合适的化合物。醌化合物的非限制性实例包括：1,4-苯醌、1,4-萘醌、2-羟基-1,4-萘醌、2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0、2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌、1,4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素、4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌、吡咯并喹啉醌、或其盐或溶剂合物。
该含硫化合物可以是包含一个或多个硫原子的任何合适化合物。在一个方面，该含硫化合物包含选自亚硫酰、硫醚、亚磺酰、磺酰、磺酰胺、氨苯磺胺、磺酸、以及磺酸酯的部分。含硫化合物的非限制性实例包括：乙硫醇、2-丙硫醇、2-丙烯-1-硫醇、2-巯基乙磺酸、苯硫醇、苯-1,2-二硫醇、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸、或其盐或溶剂合物。
在一个方面，以上所述的这种化合物对纤维素材料的有效量，作为对纤维素的葡糖基单元的摩尔比为约10-6至约10，例如，约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2。在另一个方面，以上所述的这种化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如，约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂(liquor)”意指在此所述的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖，等等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合中的任一个)、以及其可溶性内含物。用于GH61多肽或变体的纤维素分解增强的液剂可以通过，任选在催化剂(例如酸)的存在下、任选在有机溶剂的存在下、并且任选与该材料的物理破坏组合，来通过施加热和/或压力对木质纤维素或半纤维素材料(或原料)进行，并且然后将溶液与残余固体分离来产生。这类条件确定在由纤维素酶制剂水解纤维素底物的过程中，通过液剂和GH61多肽或变体的组合可获得的纤维素分解增强的程度。该液剂可以使用本领域中的标准方法(如过滤、沉积、或离心)与处理的材料分离。
在一个方面，该液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如，约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g每g纤维素。
在一个方面，该一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂的实例包括：(例如)SHEARZYMETM(诺维信公司)、HTec(诺维信公司)、HTec2(诺维信公司)、HTec3(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、HC(诺维信公司)、Xylanase(杰能科)、XY(杰能科)、XC(杰能科)、TX-200A(AB酶制剂公司(AB Enzymes))、HSP6000Xylanase(帝斯曼)、DEPOLTM333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，英国威尔士(Wales,UK))、DEPOLTM740L(生物催化剂有限公司，英国威尔士)以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士)。
适用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)、烟曲霉(WO2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属物种(WO2010/126772)、土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)。
适用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的β-木糖苷酶：粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、以及埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)。
适用于本发明的方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(WO2010/014880)、粗糙链孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(Uniprot登录号Q0UHJ1)、以及土生梭孢霉NRRL8126(WO2009/042846)。
适用于本发明的方法的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase或ferulic acidesterase)的实例包括但不限于来自以下的阿魏酸酯酶：特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙链孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(WO2009/127729)、以及土生梭孢霉(WO2010/053838和WO2010/065448)。
适用于本发明的方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的阿拉伯呋喃糖苷酶：黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)、以及巨多孔菌(M.giganteus)(WO2006/114094)。
适用于本发明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的α-葡糖醛酸糖苷酶：棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt登录号alccl2)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、橘灰青霉(WO2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
用于本发明的方法的具有酶活性的多肽可以通过在含有合适碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域中已知的程序(参见，例如，班尼特，J.W.(Bennett,J.W.)和拉热,L.(LaSure,L.)(编)，真菌中的更多基因操纵(More Gene Manipulations in Fungi)，学术出版社(AcademicPress)，加利福尼亚州(CA)，1991)发酵上述微生物菌株来产生。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见，例如，贝利，J.E.(Bailey,J.E.)和奥利斯,D.F.(Ollis,D.F.)，生物化学工程基础(Biochemical EngineeringFundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，NY,纽约1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的任何细胞培养方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许该酶得以表达或分离的条件下执行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可以从发酵培养基中回收并且通过常规程序纯化。
发酵。可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业、以及烟草业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖由发酵生物体(如酵母)发酵成产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是分开或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的水解的纤维素材料。通常基于所希望的发酵产物(即，要从发酵获得的物质)和采用的方法来选择该材料，如本领域中所熟知的。
术语“发酵培养基”在此可理解为指添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时的糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体二者均是本领域中所熟知的。合适的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由琳(Lin)等人，2006，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)69:627-642描述。
能够发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属菌株，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。
能够以天然状态发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属菌株，优选休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或C.sonorensis；和毕赤酵母属菌株，优选树干毕赤酵母(P.stipitis)，如树干毕赤酵母CBS5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)菌株，优选为嗜鞋管囊酵母(P.tannophilus)。不能够发酵戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的生物体可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。
能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium phytofermentans、土芽孢杆菌属物种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(菲利皮迪斯，1996，见上文)。
其他发酵生物体包括以下的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如C.sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产元假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是遗传修饰以改善乙醇产率的大肠杆菌菌株；土芽孢杆菌属物种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),如解糖热厌氧杆菌、以及发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌。
在一个优选方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个优选方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是Candidasonorensis。在另一个更优选方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个优选方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选方面，酵母是毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是酵母属物种。在另一个更优选方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选方面，细菌是Clostridiumphytofermentans。在另一个更优选方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选方面，细菌是土芽孢杆菌属物种。在另一个更优选方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个优选方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选方面，细菌是运动发酵单胞菌。
可商购获得的适用于乙醇生产的酵母包括，例如，BIOFERMTMAFT和XR(NABC-北美生物产品基团(North American Bioproducts Corporation)，美国佐治亚州(GA,USA))、ETHANOL REDTM酵母(弗曼迪斯/乐斯福(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALITM(菲氏酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)、FERMIOLTM(帝斯曼配料部(DSM Specialties))、GERT STRANDTM(Gert Strand AB，瑞士(Sweden))、以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(乙醇技术(Ethanol Technology)，美国威斯康辛州(WI,USA))。
在一个优选方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆和改善表达(Cloning and improving theexpression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomycescerevisiae)，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147；霍等人，1998，遗传工程改造能够有效共表达葡萄糖和木糖的酵母菌属酵母(Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectivelycofermenting glucose and xylose)，应用与环境微生物学64:1852-1859；科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，酿酒酵母的木糖发酵(Xylosefermentation by Saccharomyces cerevisiae)，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783；瓦尔弗里德森(Walfridsson)等人，1995，过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiaestrains overexpressing the TKL1and TAL1genes encoding the pentosephosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase)，应用与环境微生物学61:4184-4190；凯珀(Kuyper)等人，2004，用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程：原理的证实(Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof ofprinciple)，欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research)4:655-664；比尔(Beall)等人，1991，通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究(Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303；英格拉姆(Ingram)等人，1998，用于乙醇产生的细菌的代谢工程(Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技术与生物工程58:204-214；张(Zhang)等人，1995，产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程(Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis)，科学(Science)267:240-243；狄安妲(Deanda)等人，1996，通过代谢途径工程开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株(Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering)，应用与环境微生物学62:4465-4470；WO2003/062430，木糖异构酶)。
在一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中熟知的是，上述生物体还可以用于产生其他物质，如在此所述。
典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且执行发酵持续约8至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如pH4-5、6、或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并执行发酵持续约12至约96小时，如典型地24-60小时。在另一个方面，温度优选在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物的施用量优选为约105-1012，优选约107-1010，特别是约2×108活细胞计数每ml发酵液。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材”(“The Alcohol Textbook”)(编辑K.雅克(K.Jacques)、T.P.里昂(T.P.Lyons)和D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)，诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press)，联合王国(United Kingdom)1999)，其通过引用结合在此。
发酵刺激物可以与在此所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，并且尤其是改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇产率。“发酵刺激物”是指用于发酵微生物(尤其是酵母)生长的刺激物。用于生长的优选发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D、以及E。参见，例如，阿尔芬诺尔(Alfenore)等人，通过在补料分批过程中的微生物馈送策略改善乙醇生产和酿酒酵母的存活(Improving ethanol production and viability ofSaccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batchprocess)，施普林格(Springer-Verlag)(2002)，其通过引用结合在此。矿物质的实例包括可以提供营养物的矿物质和矿物质盐，这些营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是而不限于：醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选方面，发酵产物是醇。应理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选方面，该醇是正丁醇。在另一个更优选方面，该醇是异丁醇。在另一个更优选方面，该醇是乙醇。在另一个更优选方面，该醇是甲醇。在另一个更优选方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，该醇是丁二醇。在另一个更优选方面，该醇是乙二醇。在另一个更优选方面，该醇是丙三醇。在另一个更优选方面，该醇是甘油。在另一个更优选方面，该醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选方面，该醇是山梨醇。在另一个更优选方面，该醇是木糖醇。参见，例如，生物化学工程/生物技术的进展(舍佩尔，T.编，德国海德堡柏林施普林格，65:207-241)中，贡,C.S.、卡奥,N.J.、杜,J.、以及曹,G.T.，1999，由可更新资源生产乙醇；西尔韦拉,M.M.(Silveira,M.M.)和乔纳斯,R.(Jonas,R.)，2002，山梨醇的生物技术生产(The biotechnological production of sorbitol)，应用微生物学与生物技术59:400-408；尼加姆,P.(Nigam,P.)和辛格,D.，1995，用于木糖醇-一种糖替代品的发酵产生工艺(Processes for fermentative production ofxylitol-a sugar substitute)，过程生物化学(Process Biochemistry)30(2):117-124；Ezeji,T.C.、库雷希,N.(Qureshi,N.)和布拉舍克,H.P.(Blaschek,H.P.)，2003，通过拜季林斯基羧菌BA101生产丙酮、丁醇和乙醇并且通过气提原位回收(Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping)，微生物与生物技术世界杂志(World Journal of Microbiology and Biotechnology)19(6):595-603。
在另一个优选方面，发酵产物是烷烃。该烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选方面，该烷烃是戊烷。在另一个更优选方面，该烷烃是己烷。在另一个更优选方面，该烷烃是庚烷。在另一个更优选方面，该烷烃是辛烷。在另一个更优选方面，该烷烃是壬烷。在另一个更优选方面，该烷烃是癸烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十一烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十二烷。
在另一个优选方面，发酵产物是环烷烃。在另一个更优选方面，该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环己烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环辛烷。
在另一个优选方面，发酵产物是烯烃。该烯烃是未支化或支化的烯烃。在另一个更优选方面，该烯烃是戊烯。在另一个更优选方面，该烯烃是己烯。在另一个更优选方面，该烯烃是庚烯。在另一个更优选方面，该烯烃是辛烯。
在另一个优选方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是天冬氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是苏氨酸。参见，例如，理查德,A.(Richard,A.)和马加里蒂斯,A.(Margaritis,A.)，2004，用于聚谷氨酸生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的经验模型(Empirical modeling of batch fermentation kineticsfor poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers)，生物技术与生物工程87(4):501-515。
在另一个优选方面，发酵产物是气体。在另一个更优选方面，该气体是甲烷。在另一个更优选方面，该气体是H2。在另一个更优选方面，该气体是CO2。在另一个更优选方面，该气体是CO。参见，例如，片冈,N.(Kataoka,N.)、A.米亚(A.Miya)、以及K.桐山(K.Kiriyama)，1997，通过产氢厌氧细菌产生氢气的研究(Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科学与技术(Water Science and Technology)36(6-7):41-47；以及古那森兰V.N.(Gunaseelan V.N.)于生物质与生物能源(Biomass and Bioenergy)，第13(1-2)卷，第83-114页，1997，用于甲烷生产的生物质的厌氧消化：综述(Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)。
在另一个优选方面，发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选方面，发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”包括包含一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选方面，该酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克，2003，见上文。
在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面，该有机酸是己二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面，该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选方面，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是甲酸。在另一个更优选方面，该有机酸是富马酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选方面，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乳酸。在另一个更优选方面，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是草酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面，该有机酸是木糖酸。参见，例如，陈,R.(Chen,R.)和李,Y.Y.，1997，用于由纤维素生物质生产的乳酸的膜介导的萃取发酵(Membrane-mediatedextractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass)，应用生物化学与生物技术63-65:435-448。
在另一个优选方面，发酵产物是聚酮化合物。
回收。可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收发酵产物，这些方法包括但不限于：色谱、电泳程序、差示溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得纯度高达约96体积％的乙醇，其可以用作(例如)燃料乙醇、饮用乙醇，即，饮用中性酒、或工业乙醇。
洗涤剂组合物
本发明还涉及包含本发明的GH61多肽变体和表面活性剂的洗涤剂组合物。本发明的GH61多肽变可以添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。在一个方面，本发明还涉及用于清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，该方法包括使该硬表面或该衣物与本发明的洗涤剂组合物相接触。
在一个特定方面，本发明提供包含本发明的GH61多肽变体的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂以及该洗涤剂组合物可以包含一种或多种(例如，若干种)选自由以下各项组成的组的酶：淀粉酶、阿拉伯糖酶、角质酶、碳水化合物酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及木聚糖酶。
一般来说，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。
可商购获得的纤维素酶包括CELLUZYMETM和CAREZYMETM(诺维信公司)、CLAZINASETM和PURADAX HATM(杰能科国际有限公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。优选为微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO89/06270和WO94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
适用蛋白酶的实例为在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116、以及WO98/34946中描述的变体，特别是具有在一个或多个以下位置处的取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
优选的可商购获得的蛋白酶包括：ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、以及KANNASETM(诺维信公司)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM、以及FN3TM(杰能科国际有限公司)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。适用脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(与嗜热霉属同义)，例如来自如EP258068和EP305216描述的疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉或来自如WO96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、施氏假单胞菌(GB1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达图瓦(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学报(Biochemica et BiophysicaActa)，1131:253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)。
脂肪酶变体的其他实例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079以及WO97/07202中描述的那些。
优选的可商购获得的脂肪酶包括：LIPOLASETM和LIPOLASE ULTRATM(诺维信公司)。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，在GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株。
适用淀粉酶的实例为在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873、以及WO97/43424中描述的变体，特别是具有在一个或多个以下位置处的取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、以及444。
可商购获得的淀粉酶为DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM以及BANTM(诺维信公司)；RAPIDASETM和PURASTARTM(从杰能科国际有限公司)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些酶。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。适用过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602、以及WO98/15257中描述的那些。
可商购获得的过氧化物酶包括GUARDZYMETM(诺维信公司)。
一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种(例如，若干种)酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂而包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以例如配制为颗粒、液体、浆料，等等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，尤其是无尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。
无尘颗粒可以例如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。
本发明的洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。
该洗涤剂组合物包含一种或多种(例如，若干种)表面活性剂，其可以是非离子型(包括半极性型)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。这些表面活性剂典型地以按重量计0.1％至60％的水平存在。
当其中包括阴离子型表面活性剂时，该洗涤剂将通常含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸、或皂类。
当其中包括非离子型表面活性剂时，该洗涤剂将通常含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧化物、壬基苯酚乙氧化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
该洗涤剂可以含有0-65％洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特(Hoechst)的SKS-6)。
该洗涤剂可以包含一种或多种(例如，若干种)聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡啶-N-氧化物、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白系统，其可以包含H2O2源，如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，该漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺、或砜类型的过氧酸。
可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如为多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制。
该洗涤剂还可以含有其他常规洗涤剂成分，例如像织物调理剂，包括黏土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污物再沉积剂、染料、杀细菌剂、光学增亮剂、助水溶剂、晦暗抑制剂、或香料。
在洗涤剂组合物中，任何酶的添加量可以对应于0.01-100mg酶蛋白每升洗液，优选0.05-5mg酶蛋白每升洗液，尤其是0.1-1mg酶蛋白每升洗液。
在洗涤剂组合物中，具有纤维素分解增强活性的本发明的GH61多肽变体的添加量可以对应于0.001-100mg蛋白质、优选0.005-50mg蛋白质、更优选0.01-25mg蛋白质、甚至更优选0.05-10mg蛋白质、最优选0.05-5mg蛋白质，并且甚至最优选0.01-1mg蛋白质每升洗液。
具有纤维素分解增强活性的本发明的GH61多肽变体还可以结合到WO97/07202(通过引用由此结合)中披露的洗涤剂配制品中。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生GH61多肽变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将含有该变体的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草(temperate grass)，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模型生物体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞代谢区，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在这些宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入所讨论的植物中所必需的DNA序列(后者取决于使用的DNA引入方法)。
调节序列(如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列)的选择(例如)基于期望何时、何处以及如何表达变体而确定。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分(如种子或叶)。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)、或代谢库组织(metabolic sinktissue)(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本技术领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可以选自本领域内可用的那些。
核酸构建体是根据本领域已知的常规技术并入到植物基因组中，这些常规技术包括：农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(盖瑟(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。
目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括在美国专利号6,395,966和7,151,204中描述的那些(这两个专利均通过引用以其全文结合在此)。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有结合的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将编码变体的构建体通过杂交引入具体植物品种，而根本无需直接转化那个给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从根据本发明转化的细胞直接再生的植物，还包括这类植物的后代。如在此所使用，后代可以指根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后裔。这种后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。这类步骤的非限制性实例在美国专利号7,151,204中描述。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法，包括：(a)在有助于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且(b)回收该变体。
通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为限制本发明的范围。
实例
菌株
使用米曲霉菌株PFJO218(amy-、alp-、Npl-、CPA-、KA-、pyrG-、ku70-；美国专利申请20100221783)作为GH61多肽变体的表达宿主。
还使用米曲霉菌株COLs1300作为GH61多肽变体的表达宿主。通过缺失启动子以及亚硝酸盐还原酶(niiA)基因和硝酸盐还原酶(niaD)基因二者的5'部分而由米曲霉PFJ0220(EP2147107B1)产生黑曲霉COLs1300(amyA、amyB、amyC、alpA、nprA、kusA、niaD、niiA、amdS+)。
培养基和试剂
AMG痕量金属溶液由以下组成：14.3g的ZnSO4·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、0.5g的NiCl2·6H2O、13.8g的FeSO4·7H2O、8.5g的MnSO4·H2O、3g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
COLs1300培养基由100ml的蔗糖培养基和1ml的1M尿素组成。
COLs1300原生质体化溶液由以下组成：80mg的(诺维信公司，丹麦鲍斯韦(Bagsvaerd,Denmark))、0.5mg/ml的壳多糖酶(西格玛化学有限公司，美国密苏里州圣路易斯)、10ml的1.2M MgSO4、以及100μl的1M NaH2PO4(pH5.8)。
COVE-N-Gly平板由以下组成：50ml的COVE盐溶液、218g的山梨醇、10g的甘油、2.02g的KNO3、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升。
具有10mM尿苷的COVE-N-Gly平板由以下组成：50ml的COVE盐溶液、218g的山梨醇、10g的甘油、2.02g的KNO3、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升；然后以10mM的浓度向各个平板中添加尿苷。
COVE盐溶液由以下组成：26g的KCl、26g的MgSO4·7H2O、76g的KH2PO4、50ml的COVE痕量元素溶液、以及去离子水补足至1升。
COVE痕量元素溶液由以下组成：40mg的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO2·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及去离子水补足至1升。
LB培养基由以下组成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、以及去离子水补足至1升。
LB+Amp培养基由以下组成：每ml补充有100μg氨苄青霉素的LB培养基。
M400培养基由以下组成：50g的麦芽糖糊精、2g的MgSO4·7H2O、2g的KH2PO4、4g的柠檬酸、8g的酵母提取物、2g的尿素、0.5ml的AMG痕量金属溶液、0.5g的CaCl2、以及去离子水补足至1升；用NaOH调节至pH6。在pH调节之后，添加0.7ml的消泡剂。
Magnificent Broth由以下组成：50g的Magnificent Broth粉(麦克康纳尔研究公司(MacConnell Research Corp.)美国加州圣迭戈(San Diego,CA,USA))以及去离子水补足至1升。
MaltV1培养基由以下组成：20g的麦芽糖、10g的细菌蛋白胨、1g的酵母提取物、1.45g的(NH4)2SO4、2.08g的KH2PO4、0.28g的CaCl2、0.42g的MgSO4·7H2O、0.42ml的木霉痕量金属溶液、0.48g的柠檬酸、19.52g的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、以及去离子水补足至1升；用NaOH调节至pH5.5。
MDU2BP培养基(pH5.0)由以下组成：135g的麦芽糖、3g的MgSO4·7H2O、3g的NaCl、6g的K2SO4、36g的KH2PO4、21g的酵母提取物、6g的尿素、1.5ml的AMG痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
PEG溶液由以下组成：6g的聚乙二醇4000(PEG4000)、100μl的1MTris(pH7.5)、100μl的1M CaCl2、以及去离子水补足至10ml。
原生质体化培养基由以下组成：92ml的转化蔗糖培养基、2ml的1M尿苷、1ml的1M NaNO3、以及10ml的YP培养基。
原生质体化溶液由以下组成：15ml的1.2M MgSO4、150μl的1MNaH2PO4(pH5.8)、100mg的(诺维信公司，丹麦鲍斯韦)、以及10mg的壳多糖酶(西格玛化学有限公司，美国密苏里州圣路易斯)。
ST溶液由以下组成：1.5ml的2M山梨醇、500μl的1M Tris(pH7.5)、以及去离子水补足至5ml。
STC溶液由以下组成：60ml的2M山梨醇、1ml的1M Tris(pH7.5)、1ml的1M CaCl2、以及去离子水补足至100ml。
蔗糖培养基由以下组成：20ml的COVE盐溶液、342g的蔗糖、以及去离子水补足至1升。
蔗糖琼脂平板由以下组成：20ml的木霉痕量金属溶液、20g的诺布尔琼脂、342g的蔗糖、以及去离子水补足至1升。
TAE缓冲液由以下组成：40mM的2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇、20mM的冰醋酸、以及2mM乙二胺四乙酸(pH8.0)。
TBE缓冲液由以下组成：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、以及0.74g的EDTA(pH8)于补足至1升的去离子水中。
TE缓冲液由以下组成：10mM Tris-0.1mM EDTA(pH8)。
顶层琼脂由以下组成：500ml的蔗糖培养基、5g的低熔点琼脂糖、以及10ml的20mM Tris(pH7.5)。
转化蔗糖培养基由以下组成：70ml的1M蔗糖以及20ml的COVE盐溶液。
木霉痕量金属溶液由以下组成：216g的FeCl3·6H2O、58g的ZnSO4·7H2O、27g的MnSO4·H2O、10g的CuSO4·5H2O、2.4g的H3BO3、336g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
2XYT琼脂平板由以下组成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌琼脂、以及去离子水补足至1升。
2XYT+Amp琼脂平板由以下组成：每ml补充有100μg氨苄青霉素的2XYT琼脂。
YP培养基由以下组成：10g细菌酵母提取物、20g的细菌蛋白胨、以及去离子水补足至1升。
实例1：表达载体pMMar44、pMMar49、pMMar45、以及pDFng113的构建
如下所述构建质粒pMMar44，以表达烟曲霉GH61B多肽并且生成突变体基因文库。此外，如下所述构建质粒pMMar49、pMMar45、以及pDFng113，以分别表达烟曲霉GH61B多肽变体(WO2012/044835)、青霉属物种(埃默森)GH61A多肽(下文埃默森青霉GH61A多肽)、以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽，并且生成变体。
用Bam HI和Not I消化含有用于在曲霉菌属中自主维持的AMA序列的质粒pENI2376(美国专利申请20060234340)，以使该质粒线性化并且去除一个8bp片段。使用PCR纯化试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN Inc.)，美国加州瓦伦西亚(Valencia,CA,USA))根据制造商的说明纯化消化的质粒。
使用表1中示出的引物由以下描述的源质粒扩增烟曲霉GH61B多肽编码序列(图1；SEQ ID NO:29[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:30[推导的氨基酸序列])、突变烟曲霉GH61B多肽编码序列(WO2012/044835)、埃默森青霉GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:35[基因组DNA序列]和SEQ IDNO:36[推导的氨基酸序列])、以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:13[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])。粗体字母代表编码序列。其余序列与用于表达GH61多肽编码序列的pENI2376的插入位点同源。
表1
以下描述含有烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒pMMar44的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、由质粒pAG43(WO2010/138754)扩增烟曲霉GH61B多肽编码序列。
将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下组成的PCR反应：90ng的pAG43、1X2PCR缓冲液(科隆达实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，美国加州山景城(Mountain View,CA,USA))、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1X2DNA聚合酶混合物(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)。使用 5333(艾本德科技有限公司(Eppendorf Scientific,Inc.)，美国纽约韦斯特伯里(Westbury,NY,USA))执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约862bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)进行提取。
使用IN-FUSIONTM PCR克隆试剂盒(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)将862bp PCR产物与消化的pENI2376的同源末端接合在一起。将总共63ng的862bp PCR产物和200ng的Bam HI/Not I消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下组成的反应：4μl的5XIN-FUSIONTM反应缓冲液(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)以及2μl的IN-FUSIONTM酶(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌超级感受态细胞(Stratagene公司，美国加州拉霍亚(La Jolla,CA,USA))中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。烟曲霉GH61B多肽编码序列插入物使用染料终止子化学(吉塞克(Giesecke)等人，1992，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)38:47-60)、用Model377XL自动DNA测序仪(应用生物系统有限公司(Applied Biosystems Inc.)，美国加州福斯特市(Foster City,CA,USA))，通过DNA测序来证实。用于基因插入物和序列的验证的测序引物在以下示出。
引物996271：
ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT(SEQ ID NO:225)
引物pALLO23’：
GAATTGTGAGCGGATAACAATTTCA(SEQ ID NO:226)
选择含有正确的烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar44(图2)。
以下描述质粒pMMar49的构建，该质粒含有八个碱基对改变，导致烟曲霉GH61B多肽的四个氨基酸突变(WO2012/044835)。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、由质粒pTH230扩增突变烟曲霉GH61B多肽编码序列(WO2012/044835)。
将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下组成的PCR反应：100ng的pTH230、1X2PCR缓冲液(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1X2DNA聚合酶混合物(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)。使用5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约862bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。
使用IN-FUSIONTM PCR克隆试剂盒将862bp PCR产物与消化的pENI2376的同源末端接合在一起。将总共90ng的862bp PCR产物和220ng的Bam HI/Not I消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下组成的反应：4μl的5X IN-FUSIONTM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSIONTM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌XL超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。突变型烟曲霉GH61B多肽编码序列插入物使用染料终止子化学(吉塞克(Giesecke)等人，1992，见上文)、用Model377XL自动DNA测序仪，通过DNA测序来证实。测序引物996271和pALLO23’用于基因插入物和序列的验证。
选择含有正确的突变型烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar49(图3)。
以下描述含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pMMar45的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、由含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pDM286扩增埃默森青霉GH61A多肽编码序列。
根据以下方案构建质粒pDM286。使用PHUSIONTM高保真度热启动DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波(Espoo,Finland))以及以下示出的基因特异性正向和反向引物，由质粒pGH61D23Y4(WO2011/041397)扩增埃默森青霉GH61A多肽基因。处于斜体的区域代表与插入位点同源的载体。
正向引物：
5'-CGGACTGCGCACCATGCTGTCTTCGACGACTCGCAC-3'(SEQ ID NO:227)反向引物：
5'-TCGCCACGGAGCTTATCGACTTCTTCTAGAACGTC-3'(SEQ ID NO:228)
扩增反应含有30ng的质粒pGH61D23Y4、50皮摩尔的以上列出的每种引物、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的10mM共混物、1XPHUSIONTM高保真度热启动DNA聚合酶缓冲液(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波)以及1个单位的PHUSIONTM高保真度热启动DNA聚合酶缓冲液(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波)，最终体积为50μl。
扩增反应在5333epgradient S(艾本德科技有限公司，美国纽约韦斯特伯里)中孵育，其被编程为：1个循环，在98℃下持续30秒；35个循环，在98℃下持续10秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。
PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。将0.87kb的片段从凝胶切离并且使用提取II试剂盒(Macherey-Nagel有限公司，美国宾夕法尼亚州伯利恒(Bethlehem,PA,USA))根据制造商的方案进行提取。
用Nco I和Pac I消化质粒pMJ09(US2005/0214920A1)，并且在消化之后，通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离消化的载体，其中将大约7.1kb的片段从凝胶切离并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。使用IN-FUSIONTM PCR克隆试剂盒根据制造商的方案将0.87kb PCR产物插入Nco I/Pac I消化的pMJ09中。IN-FUSIONTM反应由以下组成：1X IN-FUSIONTM反应缓冲液、180ng的Not I/Pac I消化的质粒pMJ09、108ng的0.87kb PCR产物、以及1μl的IN-FUSIONTM酶，反应体积为10μl。该反应在37℃下孵育15分钟，并且接着在50℃下持续15分钟。向该反应中添加40μl的TE，并且使用2μl来根据制造商的方案转化ONETOP10感受态细胞(英杰(Invitrogen)，美国加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA,USA))。通过测序筛选转化体，并且鉴定出含有插入物而没有PCR错误的一个克隆并命名为质粒pDM286。可以用Pme I消化质粒pDM286，以生成用于里氏木霉转化的大约5.4kb片段。这个5.4kb片段含有表达盒[里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶(CBHI)启动子、埃默森青霉糖基水解酶61A(GH61A)基因、里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶(CBHI)终止子]以及构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。
为了构建pMMar45，将50皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下组成的PCR反应：120ng的pDM286、1XPCR缓冲液(罗氏诊断产品有限公司(Roche Diagnostics,Inc.)，美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,USA))、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1XDNA聚合酶混合物(罗氏诊断产品有限公司，美国印第安纳州印第安纳波利斯)。使用5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约762bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。
使用IN-FUSIONTM PCR克隆试剂盒将762bp PCR产物与Bam HI/Not I消化的pENI2376的同源末端接合在一起。将总共90ng的762bp PCR产物和200ng的消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下组成的反应：4μl的5X IN-FUSIONTM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSIONTM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌XL超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。埃默森青霉GH61A多肽编码序列插入物使用染料终止子化学(吉塞克(Giesecke)等人，1992，见上文)，用Model377XL自动DNA测序仪，通过DNA测序来证实。测序引物996271和pALLO23’用于基因插入物和序列的验证。
选择含有正确的埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar45(图4)。
以下描述含有金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒pDFng113的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、由质粒pDZA2(WO2005/074656)扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列。
将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下组成的PCR反应：100ng的pDZA2、1XPCR缓冲液、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1XDNA聚合酶混合物。使用5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在94℃下持续2分钟；30个循环，在94℃下持续15秒、59.9℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。
将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约822bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。
使用IN-FUSIONTM PCR克隆试剂盒将822bp PCR产物与Bam HI/Not I消化的pENI2376的同源末端接合在一起。将总共37ng的799bp PCR产物和200ng的消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下组成的反应：4μl的5X IN-FUSIONTM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSIONTM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至50μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌XL高效感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列插入物使用染料终止子化学(吉塞克(Giesecke)等人，1992，见上文)，用Model377XL自动DNA测序仪，通过DNA测序来证实。测序引物996271和pALLO23’用于基因插入物和序列的验证。
选择含有正确的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng113(图5)。
实例2：烟曲霉GH61B多肽位点饱和文库的构建
烟曲霉GH61B多肽编码序列的位点饱和文库由GeneArt AG(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成。对于总共165个残基，除去最保守残基，平均每个位置合成16.8个突变，得到总共2768种突变体。含有具有已知突变的突变质粒的大肠杆菌DH10B(英杰，美国加州卡尔斯巴德)菌株排列在96孔平板中作为50μl甘油原种，并且在-80℃下储存。
通过使用无菌96孔复制器将GeneArt平板压印到2XYT+Amp琼脂平板上，从解冻的GeneArt平板产生DNA。该琼脂平板在37℃下孵育过夜。从该琼脂平板所得的克隆被用于接种96深孔块，其中每孔含有补充有400μg氨苄青霉素(每ml)的1ml Magnificent broth。用气孔可透气盖覆盖该块并且接着在加湿箱中在37℃、350rpm下过夜。在1100x g下将该块离心10分钟并且弃去上清液。使用9600从细胞沉淀中提取质粒。
实例3：烟曲霉GH61B、埃默森青霉GH61A、以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体在米曲霉PFJO218中的表达
将米曲霉PFJO218在10mM尿苷存在下在COVE-N-Gly平板上孵育并且在34℃下孵育直到汇合。通过用8ml的0.01％20洗涤从该平板收集孢子。将1ml的孢子悬浮液用于接种500ml聚碳酸盐摇瓶中的103ml的原生质体化培养基。将该摇瓶在30℃下孵育，并且在180rpm下振荡17-20小时。通过衬有(Calbiochem，美国加州拉霍亚)的漏斗过滤菌丝体并且用200ml的0.6M MgSO4洗涤。将洗涤的菌丝体在125ml无菌聚碳酸盐摇瓶中的15ml的原生质体化溶液中重悬并且在冰上孵育5分钟。向摇瓶中添加12mg牛血清白蛋白/ml去离子水的溶液1ml，并且接着将该摇瓶在37℃下、在70rpm下混合孵育1-3小时，直到原生质体化完成。通过衬有的漏斗将菌丝体/原生质体混合物过滤到50ml锥形管中，并且用5ml的ST覆盖。在低加速/减速下将该50ml锥形管在1050xg下离心15分钟。离心后，液体被分成3相。将含有原生质体的中间相转移到新的50ml锥形管。在1050x g下简短离心5分钟之后，向原生质体中添加两体积的STC。弃去上清液。在重悬原生质体沉淀、在1050x g下离心10分钟、并且每次撇出上清液的情况下，用20ml的STC洗涤原生质体两次。在最终撇出后，在STC中在1×108/ml浓度下重悬原生质体沉淀。在转化之前将原生质体冰冻于-80℃。
在其中每孔有3.5μl的PEG溶液的24孔平板中，使用1.3μl体积的每种突变质粒转化3.5μl的米曲霉PFJO218原生质体。还如上将质粒pMMar44、pMMar45、或pDFng113(表1)转化到米曲霉PFJO218原生质体中，以提供包含烟曲霉、埃默森青霉、或金黄色嗜热子囊菌野生型GH61多肽的培养液。将该24孔平板在37℃下静止孵育30分钟，其后添加28.6μl的含有10mM NaNO3和14.3μl的STC的转化蔗糖培养基。然后将该24孔平板置于加湿箱中在37℃下静止持续7天。在第7天，向每孔添加1ml的MaltV1培养基。将该平板返回加湿箱中在39℃下静止并且再孵育5天。使用移液管收获至少550μl的每种变体或野生型烟曲霉、埃默森青霉、或金黄色嗜热子囊菌GH61多肽的培养液，以去除菌丝体面并且吸出液体，用于使用PASC作为底物进行测定。产生具有使用PASC测定(实例5)的改善的热稳定性的突变体的突变质粒被再次转化并且使用上述方案重新测试。
对一些突变体进行孢子纯化用于进一步特征化。在7天的转化孵育之后并且在添加1ml的MaltV1表达培养基之前，将一个环在来自转化的初始生长上触击以收集孔中的孢子。然后将孢子在COVE-N-Gly平板上划线并且在37℃下孵育大约36小时。将单个单独的转化体从平板上切除并且转移到新鲜的COVE-N-Gly平板上。将这些平板储存在34℃下直到汇合。一旦汇合，则将浸泡在0.01％20中的环在孢子上触击，其接着用于接种24孔平板，其中每孔含有1ml的MaltV1表达培养基。将该24孔平板置于39℃下的加湿箱中。在第五天，通过去除菌丝体面并且用移液管向上吸取培养液来收获样品。
实例4：烟曲霉β-葡糖苷酶的制备
根据WO2005/047499使用米曲霉作为宿主重组制备烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:243[DNA序列]和SEQ ID NO:244[推导的氨基酸序列])。
用20％乙酸钠将过滤的培养液调节至pH8.0，这使得该溶液浑浊。为了去除浑浊，将该溶液在20,000x g下离心20分钟，并且通过0.2μm过滤单元(Nalgene，美国纽约罗切斯特(Rochester,NY,USA))过滤上清液。用去离子水稀释滤液，以达到与50mM Tris/HCl(pH8.0)相同的电导率。将调节的酶溶液施加到用50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的QFastFlow柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，美国新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ,USA))中，并且用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。合并各部分并且用1％(w/v)活性炭处理，以从β-葡糖苷酶池去除颜色。由通过0.2μm过滤单元(Nalgene，美国纽约罗切斯特)过滤悬浮液去除炭。滤液用20％乙酸调节至pH5.0并且用去离子水稀释10倍。将调节的滤液施加到用10mM琥珀酸(pH5.0)平衡的SPFast Flow柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)中，并且用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Fischer Scientific)，美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA))来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
实例5：烟曲霉GH61B多肽变体文库的筛选
使用具有热循环器(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，美国加州里士满(Richmond,CA,USA))的FX实验室自动工作站(贝克库曼特(Beckman Coulter)，美国加州富尔顿(Fullerton,CA,USA))，将来自MaltV1培养基(实例3)中生长的烟曲霉GH61B变体和亲本(野生型)多肽的文库平板的80μl的每种培养液样品与20μl的1M乙酸钠-10mM MnSO4pH5.0缓冲液混合。然后将这些样品在62℃、65℃、以及68℃下热激发20分钟并且与环境温度对照相比较。在热激发之后，在2mMMnSO4-200mM乙酸钠(pH5)中将这些培养液样品稀释1.25、2.5、6.25、以及15.625倍，并且接着将12.5μl的稀释液转移到384孔聚丙烯测定平板中，该平板含有25μl的1％磷酸膨胀纤维素(PASC)和12.5μl的辅因子溶液(400mM乙酸钠(pH5)、4mM MnSO4、0.4％没食子酸、0.1mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.04％X100)。使用ALPS-300TM(Abgene，联合王国埃普索姆(Epsom,United Kingdom))用塑料板将这些板热密封并且在40℃下孵育4天。
缓冲液处理的培养液样品的背景葡萄糖浓度在孵育之前通过每升使用以下试剂执行葡萄糖测定进行测定：0.9951g的ATP、0.5176g的NAD、0.5511g的MgSO4·7H2O、20.9g的MOPS、1000单位的己糖激酶、1000单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、以及0.01％X-100(pH7.5)。FX实验室自动工作站用于这个测定。使用水作为稀释剂在384孔聚苯乙烯平板中执行四个2倍连续稀释。向新的384孔聚苯乙烯平板中添加5μl的稀释液，其后添加60μl的以上试剂。将该平板在环境温度(22℃+2℃)下孵育30至45分钟。在360nm的激发和465nm的发射下使用DTX880平板读取器(贝克库曼特，美国加州富尔顿)测定相对荧光单位(RFU)，并且与在与样品相同的平板中稀释的葡萄糖标准(1mg/ml和0.125mg/ml)相比较。在第四天末，使用上述葡萄糖测定针对葡萄糖浓度对40℃孵育的PASC平板进行分析。从适当样品中减去任何背景葡萄糖，并且然后通过将环境样品处理的PASC测定中释放的葡萄糖与热激发样品处理的PASC测定中释放的葡萄糖相比较来计算残余活性。在计算中仅使用拟合曲线中的线性部分的数据(定义为在含有5mg/ml PASC的测定中产生小于或等于1mg/ml葡萄糖)。用于计算热处理的残余活性的公式如下：(热处理样品产生的mg/ml葡萄糖/环境处理样品产生的mg/ml葡萄糖)×100％。改进的变体是与来自处于至少一种种热处理条件的MaltV1培养基的野生型烟曲霉GH61A多肽培养液相比，具有较高残余活性％的那些。全部计算使用(微软公司(Microsoft Corporation)，美国华盛顿州雷德蒙德(Redmond,WA,USA))。
实例6：通过热处理后的残余活性测量的烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性
基于如实例5中描述的残余活性比，在之前实例中构建的文库的筛选产生表2和3中列出的结果。
表2示出在62、65、或68℃下处理后(来自每种变体和野生型对照的3-5个样品)的平均残余活性％。当温度从62℃增加至65℃至68℃时，亲本烟曲霉GH61B多肽分别显示出70％、45％、以及22％的降低的残余活性。与野生型烟曲霉GH61多肽相比，烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性的增加在62℃处理下在1.03至1.1倍增加范围内、在65℃处理下在1.09至1.4倍增加范围内、并且在68℃处理下在1.5至2.5倍增加范围内。这些结果显示在68℃处理下的改善最显著。
表2在62℃、65℃、以及68℃处理下具有改善的热稳定性的变体
表3示出在62℃、65℃、或68℃下处理后(来自每种变体的3-5个样品和野生型对照的110个样品)的平均残余活性％。当温度从62℃增加至65℃至68℃时，亲本烟曲霉GH61B多肽对应地显示出56％、35％、以及12％的降低的残余活性。与野生型烟曲霉GH61多肽相比，烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性的增加在62℃处理下在1.02倍至1.2倍增加范围内、在65℃处理下在1.14倍至1.6倍增加范围内、并且在68℃处理下在2.08倍至3.25倍增加范围内。这些结果显示在68℃处理下的改善最显著。
表3在62℃、65℃、以及68℃处理下具有改善的热稳定性的烟曲霉GH61B多肽变体
实例7：烟曲霉GH61B组合变体的热稳定性
通过使用II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，美国加州拉霍亚)在pMMar49(实例1)上执行定点诱变来构建烟曲霉GH61B多肽的四种变体。为每个构建体设计两种致突变引物以插入所希望的突变。将125ng的每种引物(表4)用于最终体积为50μl的含有以下的PCR反应：大约25ng的模板质粒、1X反应缓冲液、3μl的1μl的XL dNTP混合物、以及1μl的2.5U/μl Pfu高效酶。在以下设置下使用热循环器：95℃热启动；一个循环，在95℃下持续1分钟；18个循环，每个循环在95℃下持续50秒、在60℃下持续50秒、并且在68℃下持续10分钟；以及4℃保持。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。根据制造商的说明，使用2μl体积的DpnI消化的反应来转化大肠杆菌XL10-Gold高效感受态细胞(Stratagene，美国加州拉霍亚)。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。具有所希望的突变的克隆之一命名为以下列出的每种质粒。
突变G188A、G188W、K229W、以及N189K单独地添加在含有突变L111V、D152S、M155L、以及A162W的烟曲霉GH61B多肽变体(pMMar49，实例1)的顶部，从而分别得到pLSBF09-1、pLSBF09-2、pLSBF09-3、以及pLSBF09-4。用于定点诱变反应的寡核苷酸的汇总以下在表4中示出。
通过使用如上所述的II XL定点诱变试剂盒在pLSBF09-3上执行定点诱变来构建烟曲霉GH61B的三种另外的变体。如所描述单独添加突变G188F、N189K、以及A216Y，从而得到pDFNG146、pDFNG147、以及pLSBF21。用于定点诱变反应的寡核苷酸的汇总以下在表4中示出。
使用9600制备以上七种变体质粒。然后使用3130xl遗传分析器(应用生物系统，美国加州福斯特市)对变体质粒构建体进行测序以验证改变。
表4
基于根据实例5测定的残余活性比，在之前实例中构建的文库的筛选产生表5中列出的结果。表5示出在65℃、68℃、或72℃下处理后(来自每种组合变体的1-14个样品和野生型的23个样品)的平均残余活性％。
当温度从65℃增加至68℃至72℃时，亲本烟曲霉GH61B多肽对应地显示出33％、3％、以及1％的降低的残余活性。与野生型烟曲霉GH61多肽相比，烟曲霉GH61B多肽组合变体的热稳定性的增加在65℃下在1.66倍至2.42倍增加范围内、在68℃下在14.36倍至19.57倍增加范围内、并且在72℃下在31.45倍至80.07倍增加范围内。这些结果显示在72℃处理下的改善最显著。
表5在65℃、68℃、以及72℃处理下具有改善的热稳定性的烟曲霉GH61B多肽变体
实例8：烟曲霉GH61B多肽变体的纯化
如之前在WO2012/044835中所描述对野生型烟曲霉GH61B多肽进行表达和纯化。
培养烟曲霉GH61B多肽变体菌株以回收培养液用于纯化。在分离单克隆之后，将米曲霉PFJO218转化体在34℃下在COVE-N-GLY平板上培养4天，以制备更大规模的发酵。使用0.01％20从每个平板回收孢子。将每种孢子悬浮液(500μl)接种到125ml塑料摇瓶中的25ml的M400培养基中。在150rpm振荡下将这些转化体在39℃下发酵3天，并且收集培养液并使用0.22μm过滤器过滤。然后使用1005kDa MWCO离心浓缩装置(赛多利斯(Sartorius Stedim)，德国哥廷根(Goettingen,Germany))通过离心超滤将过滤的培养液浓缩，并且接着缓冲液交换为20mM Tris-HCl(pH8.5)。
浓缩的并且缓冲液交换的烟曲霉GH61B多肽变体通过一种或多种色谱方法进一步纯化。在一种方法中，该浓缩的并且缓冲液交换的培养液接着各自被施加到用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的HR16/10柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)。结合的蛋白质用20mMTris-HCl(pH8.0)中的0-600mM氯化钠的线性梯度洗脱。各部分使用无染色Tris-HCl8％-16％SDS-PAGE凝胶(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)通过SDS-PAGE进行分析、基于约25kDa条带的丰度而合并、并且使用5kDa MWCO离心浓缩装置(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)浓缩。可替代地，该浓缩并且脱盐的培养液接着各自被施加到用20mM Tris-HCl(pH8.0)和150mM NaCl平衡过的26/6075(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)尺寸排阻柱。使用20mM Tris-HCl(pH8.0)和150mM NaCl作为流动相等度洗脱施加的蛋白质。各部分使用无染色Tris-HCl8％-16％SDS-PAGE凝胶通过SDS-PAGE进行分析、基于约25kDa条带的丰度而合并、并且使用5kDa MWCO离心浓缩装置浓缩。
使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
实例9：通过差式扫描量热法测定烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的Tm(解链温度)
如在实例8中所述进行纯化的烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性使用VP差示扫描量热计(微凯尔有限公司(MicroCal Inc.)，通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)通过差示扫描量热法(DSC)来测定。将解链温度Tm(℃)记为以恒定编程的加热速率加热1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH5.0)、100μM CuSO4中的酶溶液、或1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH5.0)、10mM EDTA(pH5.0)中的酶溶液之后获得的热谱图(Cp相对于T)中的顶部变性峰值(主热吸收峰)。1ml的样品和参比溶液在装载量热计的样品和参比池之前在25℃下使用ThermoVac(微凯尔有限公司，通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)进行脱气。将样品和参比(参比：脱气的水)溶液手动装载到DSC中并且进行热预平衡至25℃之后以90K/小时的扫描速率从25℃至95℃执行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度测定变性温度。烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性测定的结果在表6中示出。
表6如通过差示扫描量热法测定的烟曲霉GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽的变体的解链温度(℃)
实例10：通过蛋白质热解折叠分析测定烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的Tm(解链温度)
烟曲霉GH61B多肽变体的蛋白质热解折叠使用宝石橙蛋白染色试剂(Orange Protein Stain)(英杰，丹麦奈鲁姆(Naerum,Denmark))、使用StepOnePlusTM实时PCR系统(应用生物系统有限公司，美国加州福斯特市)进行监测。在96孔白色PCR平板中，将100mM乙酸钠(pH5.0)中的15μl蛋白质样品(如实例8中所述进行制备)与20mM EDTA中的宝石橙(所得浓度＝10X；储备溶液＝DMSO中5000X)混合(1:1)。用光学PCR密封件密封该平板。PCR仪被设置扫描速率为76℃每小时，在25℃下开始，并且在96℃下完成。每20秒使用内置LED蓝光进行激发并且使用ROX过滤器(610nm，发射)来监测荧光。Tm值计算为一阶导数(dF/dK)的最大值(格雷戈里(Gregory)等人，2009，生物分子筛选杂志(J.Biomol.Screen.14:700))。热稳定性测定的结果在表7中示出。
表7通过热解折叠分析测定的烟曲霉GH61B多肽和变体的解链温度(℃)
突变 Tm
野生型 59
E105P 62
E154L 61
A216Y 60
A216L 63
K229H 61
K229I 60
实例11：高温纤维素酶组合物的制备
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:245[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:246[推导的氨基酸序列])。烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I的过滤的培养液使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔Filtron(Pall Filtron)，美国麻萨诸塞州诺斯伯勒(Northborough,MA,USA))的切向流动浓缩器(颇尔Filtron，美国麻萨诸塞州诺斯伯勒)进行浓缩并且与20mM Tris-HCl(pH8.0)进行缓冲液交换。
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:247[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:248[推导的氨基酸序列])。烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的过滤的培养液使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流动浓缩器进行浓缩并且与20mM Tris-HCl(pH8.0)进行缓冲液交换。
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:249[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:250[推导的氨基酸序列])。里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II的过滤的培养液使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流动浓缩器进行浓缩并且与20mM Tris-HCl(pH8.0)进行缓冲液交换。
根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2(WO2000/39322)作为宿主重组制备烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:251[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:252[推导的氨基酸序列])。烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的过滤培养液使用26/10脱盐柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)根据制造商的说明进行脱盐并且与50mM乙酸钠(pH5.0)进行缓冲液交换。
如实例4中所述制备烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶。
如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备烟曲霉GH3β-木糖苷酶(SEQ ID NO:253[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:254[推导的氨基酸序列])并且根据WO2011/057140进行纯化。
使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定上述每种单组分的蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。该纤维素酶组合物由以下组成：44.7％烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I、29.4％烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II、11.8％里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II、5.9％烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)、5.9％烟曲霉β-葡糖苷酶、以及2.3％烟曲霉β-木糖苷酶。该纤维素酶组合物在此命名为“高温纤维素酶组合物”。
实例12：预处理的玉米秸杆水解测定
在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)使用1.4wt％硫酸在165℃和107psi下对玉米秸秆预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶性固体含有大约59％纤维素、5％半纤维素、以及28％木质素。纤维素和半纤维素通过两段硫酸水解、以及随后通过使用NREL标准分析程序#002的高效液相色谱法的分析进行测定。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素部分后，使用NREL标准分析程序#003用重量分析法进行测定。
PCS的水解使用2.2ml深孔平板(爱思进(Axygen)，美国加州联合市(Union City,CA,USA))在1.0ml的总反应体积中进行。利用50mg PCS每ml的含有1mM硫酸锰和高温纤维素酶组合物的蛋白质装载量(表示为mg蛋白质每克纤维素)的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液执行水解。制备酶混合物并且然后以100μl的体积同时添加到所有孔中，以使各反应中的最终体积为1ml。然后使用ALPS-300TM平板热密封件(Abgene，联合王国埃普索姆)将平板密封、彻底混合、并且在50℃、55℃、以及60℃下孵育72小时。所有实验一式三份执行。
在水解后，用0.45μm96孔过滤器平板(密理博(Millipore)，美国麻萨诸塞州新贝德福德(Bedford,MA,USA))过滤样品并且如以下所述针对糖含量对滤液进行分析。在不立即使用时，将过滤的含糖等分试样冰冻于-20℃。稀释于0.005M H2SO4中的样品的糖浓度使用4.6x250mmHPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA))，通过用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H2SO4，在0.6ml每分钟的流速下、在65℃下洗脱，并且使用由纯糖样品标定的反射指数检测器(1100HPLC，安捷伦科技(AgilentTechnologies)，美国加州圣克拉拉(Santa Clara,CA,USA))通过葡萄糖和纤维二糖信号的积分定量来进行测量。使用所得等价量来计算每种反应的纤维素转化百分比。
所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCELTM软件(微软，美国华盛顿里奇兰(Richland,WA,USA))执行。针对适当稀释因子，调节测量的糖浓度。单独测量葡萄糖和纤维二糖。然而，为了计算总转化，合并葡萄糖和纤维二糖值。将纤维二糖浓度乘以1.053，以便转化成葡萄糖等价量并且加到葡萄糖浓度中。纤维素转化的程度使用以下方程式计算：
转化％＝([样品葡萄糖浓度]/[有限消化物中的葡萄糖浓度])×100
为了计算转化％，基于50mg纤维素酶组合物每克纤维素(CELLUCLAST PLUSTM，诺维信公司，丹麦鲍斯韦)的纤维素酶对照设定一个100％转化点，并且所有值除以这个数并接着乘以100。将三份数据点平均并且计算标准差。
实例13：添加烟曲霉GH61B多肽变体对高温纤维素酶组合物在50℃、55℃、以及60℃下进行的PCS的转化的影响
针对增强高温纤维素酶组合物(实例11)在50℃、55℃、或60℃下水解PCS的能力对烟曲霉GH61B野生型多肽和烟曲霉GH61B多肽变体N189K、G188W、K229W、以及G188A进行评价。如实例12中所述执行预处理的玉米秸秆水解测定。高温组合物在测定中当以3mg蛋白质每克纤维素装载时具有以下每克纤维素的酶装载量：1.34mg的烟曲霉纤维二糖水解酶I每克纤维素、0.88mg的烟曲霉纤维二糖水解酶II每克纤维素、0.18mg的烟曲霉β-葡糖苷酶每克纤维素、0.18mg的烟曲霉GH10木聚糖酶(Xyl3)每克纤维素、0.18mg的烟曲霉β-木糖苷酶每克纤维素、以及0.35mg的里氏木霉CEL5A内切葡聚糖酶II每克纤维素。
如实例12中所述测定通过以下各物获得的对预处理的玉米秸秆的转化：高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体N168K多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体G167W多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合；高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体K208W多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合；以及高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体G167A多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合。在50℃、55℃、或60℃下孵育72小时之后，如实例12中所述，收集和分析数据。这些结果在图6中示出。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化46.8±0.3％、47.9±1.0％、以及45.2±0.2％。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B野生型多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化55.3±0.3％、56.2±0.7％、以及51.3±0.4％。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体N189K多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化56.3±0.5％、57.5±0.3％、以及51.3±0.3％。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体G188W多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化55.8±0.4％、57.5±0.4％、以及52.4±0.04％。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体K229W多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化56.8±0.7％、57.6±0.1％、以及53.0±0.3％。
高温纤维素酶组合物(3mg蛋白质每克纤维素)和烟曲霉GH61B变体G188A多肽(0.25mg蛋白质每克纤维素)的组合在50℃、55℃、或60℃下分别使预处理的玉米秸秆转化55.9±0.3％、56.9±0.5％、以及51.3±0.3％。
实例14：埃默森青霉GH61A和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体的构建
通过如实例7中所述使用定点诱变试剂盒(Stratagene，美国加州拉霍亚)，分别在质粒pMMar45和pDFng113上执行定点诱变来构建埃默森青霉GH61A多肽的变体(SEQ ID NO:35[DNA序列]和SEQ ID NO:36[氨基酸序列])和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽的变体(SEQ ID NO:13[DNA序列]和SEQ ID NO:14[氨基酸序列])。用于定点诱变的引物以及获得的变体的汇总在表8中示出。使用在实例7中描述的相同方案。
使用9600制备所得突变质粒DNA。使用3130xl遗传分析器对每种突变质粒进行测序以验证取代。测序引物996271和pALLO23’用于验证。
表8
根据实例3中描述的程序来执行使用米曲霉PFJO218作为宿主表达埃默森青霉GH61A多肽变体和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体。
实例15：埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的制备
如实例8中所述培养埃默森青霉GH61A多肽野生型和变体菌株，以回收培养液用于纯化。
然后使用205kDa MWCO离心浓缩装置(赛多利斯(Sartorius Stedim)，德国哥廷根(Goettingen,Germany))通过离心超滤将过滤的培养液浓缩，并且接着缓冲液交换为20mM Tris-HCl(pH8.0)。使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
在埃默森青霉GH61A野生型多肽、埃默森青霉GH61A多肽变体N192W、以及埃默森青霉GH61A多肽变体N193K的情况下，通过将浓缩的并且缓冲液交换的培养液施加到用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的QFast Flow柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)中来进行进一步纯化。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl(pH8.0)中的0-500mM氯化钠的线性梯度洗脱。各部分使用Tris-HCl8％-16％SDS-PAGE凝胶(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行分析、基于约25kDa条带的丰度而合并、并且使用5kDa MWCO离心浓缩装置浓缩。使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
实例16：金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体的制备
如实例8中所述培养金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽野生型和变体菌株，以回收培养液用于纯化。
然后使用205kDa MWCO离心浓缩装置(赛多利斯(Sartorius Stedim)，德国哥廷根(Goettingen,Germany))通过离心超滤将过滤的培养液浓缩，并且接着缓冲液交换为20mM Tris-HCl(pH8.0)。使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
通过将浓缩的并且缓冲液交换的培养液施加到用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的 Fast Flow柱中来进行纯化。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl(pH8.0)中的0-500mM氯化钠的线性梯度洗脱。各部分使用Tris-HCl8％-16％SDS-PAGE凝胶通过SDS-PAGE进行分析、基于约25kDa条带的丰度而合并、并且使用5kDaMWCO离心浓缩装置浓缩。使用微平板BCATM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。
实例17：通过差式扫描量热法测定埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的Tm(解链温度)
如在实例15中所述进行纯化的埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的热稳定性使用VP差示扫描量热计通过差示扫描量热法(DSC)来测定。将解链温度Tm(℃)记为以恒定编程的加热速率加热1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH5.0)、100μM CuSO4中的酶溶液、或1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH5.0)、10mM EDTA(pH5.0)中的酶溶液之后获得的热谱图(Cp相对于T)中的顶部变性峰值(主热吸收峰)。在装载量热计的样品和参比池之前，将1ml的样品和参比溶液在25℃下使用ThermoVac进行脱气。将样品和参比(参比：脱气的水)溶液手动装载到DSC中并且进行热预平衡至25℃之后以90K/小时的扫描速率从25℃至95℃执行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度测定变性温度。
埃默森青霉GH61A多肽变体的热稳定性测定的结果在表9中示出。
表9如通过差示扫描量热法测定的埃默森青霉GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽的变体的解链温度(℃)
酶样品 Tm+100μm CuSO4
埃默森青霉GH61A 82
埃默森青霉GH61A N192W 84
埃默森青霉GH61A N193K 83
实例18：通过蛋白质热解折叠分析测定埃默森青霉GH61A和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体的Tm(解链温度)
埃默森青霉GH61A和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体的蛋白质热解折叠使用宝石橙蛋白染色试剂进行监测并且如实例10中所述使用StepOnePlusTM实时PCR系统执行。如实例15中所述将埃默森青霉GH61A野生型多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体浓缩并且缓冲液交换。如实例16中所述纯化金黄色嗜热子囊菌GH61A野生型多肽和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体。热稳定性测定的结果在表10中示出。
表10通过蛋白质热解折叠分析得到的埃默森青霉GH61A和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽变体的解链温度(℃)
实例19：表达载体pDFng153-4、pDFng154-17、以及pDFng155-33的构建
如以下所述构建质粒pDFng153-4(图7)、pDFng154-17(图8)、以及pDFng155-33(图9)，用于分别表达金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽、埃默森青霉GH61A多肽、以及棘孢曲霉GH61多肽，并且生成在表11中列出的变体。使用质粒pBGMH16(图10)构建这些质粒。
根据以下所述的方案构建质粒pBGMH16。通过用引物对BGMH24/BGMH25对pUC19进行PCR扩增，其后进行基于尿嘧啶特异性切除试剂USERTM的克隆(纽英伦生物技术(New England BioLabs)，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA,USA))来去除pUC19中的Nb.BtsI识别位点。质粒pUC19在杨尼斯-佩龙(Yanisch-Perron)等人，1985，基因(Gene)3(1):103-19中描述。
BGMH24 ATGCAGCGCUGCCATAACCATGAGTGA(SEQ ID NO:271)
BGMH25 AGCGCTGCAUAATTCTCTTACTGTCATG(SEQ ID NO:272)
加下划线的序列用于PCR片段的USERTM辅助融合，从而产生pBGMH13。USERTM(尿嘧啶特异性切除试剂)酶(纽英伦生物技术，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)在尿嘧啶的位置处生成单一核苷酸缺口。USERTM酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切除，从而形成无碱基(脱嘧啶)位点，而保持磷酸二酯骨架的完整。内切核酸酶VIII的裂解酶活性在碱基位点的3′和5′侧破坏磷酸二酯骨架，这样使得释放无碱基的脱氧核糖。
最终体积为50μl的扩增反应由以下组成：100ng的每种引物、10ng的pUC19、Cx反应缓冲液(Stratagene，美国加州拉霍亚)、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶(Stratagene，美国加州拉霍亚)。使用5333执行反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续3分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。添加5μl的10X NEBuffer4(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)和20单位的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。将总体积为10μl的总共100ng的PCR产物和1单位的USERTM酶在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下20分钟。将10μl转化到TOP10感受态细胞中。这产生质粒pBHMG13。
质粒pBGMH14含有作为载体骨架的pBGMH13的部分和一个PacI/Nt.BbvCI USERTM盒(汉森(Hansen等人，2011，应用与环境微生物学77(9):3044-51)，该盒在一侧侧接米曲霉niaD基因的部分并且在另一侧侧接米曲霉niiA基因的部分。可以用Pac I和Nt.BbvCI使Pac I/Nt.BbvCI USERTM盒线性化，并且具有相容的突出端的PCR产物可以克隆到这个位点(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)。
加下划线的序列用于三种片段的USERTM辅助融合。以粗体标记的序列用于在niiA与niaD片段之间引入PacI/Nt.BbvCI USERTM盒(汉森等人，2011，见上文)。
使用引物BGMH27和BGMH29生成米曲霉niiA片段。引物对BGMH28/BGMH32用于扩增米曲霉niaD基因区，而引物对BGMH30/BGMH31用于扩增质粒骨架区。
来自米曲霉BECH2的基因组DNA(WO00/39322)使用FASTDNATM2ml SPIN Kit for Soil(安倍生物医疗(MP Biomedicals)，美国加州圣安娜(SantaAna,California,USA))进行纯化。
最终体积为50μl的扩增反应由以下组成：100ng的每种引物、模板DNA(pBGMH13或米曲霉BECH2基因组DNA)、1XCx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶。使用 5333执行反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续4分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。对于模板DNA为质粒的PCR管，添加5μl的10X NEBuffer4和20单位的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。将总体积为10μl的总共50ng的每种PCR产物和1单位的USERTM酶在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下20分钟。接着将10μl转化到ONETOP10感受态细胞中。通过基于尿嘧啶特异性切除试剂的克隆融合这三种片段，从而产生pBGMH14。
启动子P13amy是来自pJaL676(WO2003/008575)的NA-2tpi启动子的衍生物。使用的黑曲霉AMG终止子由克里斯滕森等人，1988，自然生物技术(Nature Biotechnology)6:141-1422描述。
将P13amy启动子和AMG终止子克隆到pBGMH14中的PacI/Nt.BbvCIUSERTM盒中。设计引物，以使在启动子和终止子之间引入AsiSI/Nb.BtsIUSERTM盒(汉森等人，2011，见上文)。
加下划线的序列用于两种片段到PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14中的USERTM辅助的融合。以粗体标记的序列用于在启动子与终止子之间引入AsiSI/Nb.BtsI USERTM盒(汉森等人，2011，见上文)。
使用用以扩增启动子P13amy的引物对BGMH49/BGMH50和用以扩增AMG终止子的引物对BGMH51/BGMH52对启动子P13amy和AMG终止子进行PCR扩增。最终体积为50μl的扩增反应由以下组成：100ng的每种引物、模板DNA、1XCx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶。使用5333执行反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续45秒；以及最终延长，在72℃下持续3分钟。接着添加5μl的10X NEBuffer4和20单位的Dpn I并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。
这两种片段通过基于USERTM的克隆方法，在总体积为10μl的由10ng的PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14、50ng的两种PCR产物中的每一种、以及1单位的USERTM酶组成的反应中融合到PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14中。该反应在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下20分钟。接着将10μl转化到TOP10感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上选择大肠杆菌转化体并且使用Spin Miniprep试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)制备质粒DNA。通过测序分析证实质粒pBGMH16。
使用Model377XL自动DNA测序仪和染料终止子化学(吉塞克等人，1992，见上文)执行DNA测序。用于BGMH16中的niiA、niaD、P13amy启动子、AsiSI/Nb.BtsI USERTM盒、以及AMG终止子序列的验证的测序引物在以下示出。
BGMH36 ACGCCATTGCTATGATGCTTGAAG(SEQ ID NO:283)
BGMH37 TGGTGAGGTGCTATCGTCCTT(SEQ ID NO:284)
BGMH38 CTTCCTGTAGGTGCACCGAAG(SEQ ID NO:285)
BGMH39 ACAGAACGATATCGGACCTCG(SEQ ID NO:286)
BGMH40 TCGTTATGTTAAGTCTTCTATCA(SEQ ID NO:287)
BGMH41 AGAGCTCGAAGTTCCTCCGAG(SEQ ID NO:288)
BGMH42 TATCACGAGGCCCTTTCGTCTC(SEQ ID NO:289)
BGMH43 TCCGTCGGCTCCTCTCCTTCGT(SEQ ID NO:290)
BGMH44 TGCATATCCTCTGACAGTATATGA(SEQ ID NO:291)
BGMH45 CAGTGAAGAGGGCAGTCGATAGT(SEQ ID NO:292)
BGMH46 ACGAGGAACATGGCTATCTGGA(SEQ ID NO:293)
BGMH47 TCAGCTCATTCTGGGAGGTGGGA(SEQ ID NO:294)
BGMH48 ACTCCAGGATCCTTTAAATCCA(SEQ ID NO:295)
BGMH53 ACTGGCAAGGGATGCCATGCT(SEQ ID NO:296)
BGMH54 TGATCATATAACCAATTGCCCT(SEQ ID NO:297)
BGMH55 AGTTGTGTATATAGAGGATTGA(SEQ ID NO:298)
BGMH56 TGGTCCTTCGCTCGTGATGTGGA(SEQ ID NO:299)
BGMH57 AGTCCTCAGCGTTACCGGCA(SEQ ID NO:300)
BGMH58 ACCCTCAGCTGTGTCCGGGA(SEQ ID NO:301)
BGMH59 TGGTATGTGAACGCCAGTCTG(SEQ ID NO:302)
质粒pBGMH16含有设计成修复米曲霉COLs1300中的niiA基因和niaD基因的侧翼区。用Asi Si和Nb Bts I消化质粒pBGMH16，以使该质粒线性化并且产生单链突出端，这样使得具有相容突出端的PCR产物可以通过USERTM克隆(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)克隆到这个位点。使用DNA纯化试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)根据制造商的说明纯化消化的质粒。
使用表11中示出的引物由以下描述的源质粒扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:13[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])、埃默森青霉GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:35[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:36[推导的氨基酸序列])、以及棘孢曲霉GH61多肽编码序列(SEQ ID NO:67[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:68[推导的氨基酸序列])。粗体字母代表编码序列。插入到每个引物中的单个脱氧尿苷(U)残基是使用USERTM酶(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)从PCR产物切除的U，以获得用于插入位点的突出端。加下划线的字母代表His标签。其余序列与用于表达GH61多肽的pBGMH16的插入位点同源。
表11
以下描述含有金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒pDFng153-4的构建。使用表11中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物、由质粒pDFng113扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增由以下组成：100ng的在表11中列出的每种引物、30ng的pDFng113、1XCx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶。使用 5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、57.7℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR反应进行分析，其中观察到约894bp PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer4在37℃下将PCR反应消化过夜并且使用纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。
在由含有894bp PCR产物的10μl的PCR、1μl的AsiSI和Nb.BtsI消化的质粒pBGMH16、以及1μl的USERTM酶(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)组成的反应中将894bp PCR反应以及AsiSI和Nb.BtsI消化的pBGMH16的同源末端接合在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列插入物使用Model377XL自动DNA测序仪和染料终止子化学(吉塞克等人，1992，见上文)，通过DNA测序来证实。以下示出的测序引物用于基因插入物和序列的验证。
引物TaGH61seqF：
CCCAGTTATCAACTACCTTG(SEQ ID NO:309)
引物pBGMH16seqF：
CTCAATTTACCTCTATCCAC(SEQ ID NO:310)
引物pBGMH16seqR：
TATAACCAATTGCCCTCATC(SEQ ID NO:311)
选择含有正确的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng153-4。
以下描述含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pDFng154-17的构建。使用表11中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物、由质粒pMMar45扩增埃默森青霉GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增由以下组成：100ng的在表11中列出的每种引物、30ng的pMMar45、1XCx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶。使用5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，在95℃下持续30秒、64.1℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR反应进行分析，其中观察到大约930bp PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer4在37℃下将PCR反应消化过夜并且使用纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。
在由含有930bp PCR产物的10μl的PCR、1μl的AsiSI和Nb.BtsI消化的pBGMH16、以及1μl的USERTM酶组成的反应中将930bp PCR反应以及AsiSI和Nb.BtsI消化的pBGMH16的同源末端接合在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。埃默森青霉GH61A多肽编码序列插入物使用Model377XL自动DNA测序仪和染料终止子化学(吉塞克等人，1992，见上文)，通过DNA测序来证实。测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及以下示出的引物PeGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。
PeGH61seqF:
GCACCGTCGAGCTGCAGTGG(SEQ ID NO:312)
选择含有正确的埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng154-17。
以下描述含有棘孢曲霉GH61A多肽编码序列的质粒pDFng155-33的构建。使用表11中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物、由质粒Xyz1566(WO2012/030799，实例3，P23NJ4基因)扩增棘孢曲霉GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增反应由以下组成：100ng的在表11中列出的每种引物、30ng的质粒Xyz1566、1XCx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Cx热启动DNA聚合酶。使用5333(艾本德科技有限公司)执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、63.4℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃浸泡循环。
通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR反应进行分析，其中观察到大约1.3kb PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer4在37℃下将PCR反应消化过夜并且使用纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。
在由含有1.3kb PCR产物的10μl的PCR、1μl的消化的pBGMH16、以及1μl的USERTM酶组成的反应中将1.3kb PCR反应以及消化的pBGMH16的同源末端接合在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。棘孢曲霉GH61A多肽编码序列插入物使用Model377XL自动DNA测序仪和染料终止子化学(吉塞克等人，1992，见上文)，通过DNA测序来证实。以下示出的测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及引物AaGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。
引物AaGH61seqF：
CCTTGCCAACTGCAATGGTG(SEQ ID NO:313)
选择含有正确的棘孢曲霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng155-33。
实例20：金黄色嗜热子囊菌GH61A和埃默森青霉GH61A多肽变体的构建
通过使用表12中所述的引物，根据实例7中所述的程序，分别在质粒pDFng153-4和pDFng154-17上执行定点诱变来构建金黄色嗜热子囊菌GH61A的变体和埃默森青霉GH61A多肽的变体。
测序引物pBGMH16seqF、pBGMH16seqR、以及TaGH61seqF(仅用于金黄色嗜热子囊菌GH61A变体)、以及以下示出的引物PeGH61seqR(仅用于埃默森青霉GH61A变体)用于验证。
PeGH61seqR(仅用于埃默森青霉GH61A变体)：
GCACCGTCGAGCTGCAGTGG(SEQ ID NO:314)
表12
由用于米曲霉COLs1300转化的突变质粒、金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽质粒pDFng153-4和埃默森青霉GH61A多肽质粒pDFng154-17扩增PCR片段。最终体积为50μl的扩增由以下组成：10μM的引物1201513和1201514中的每一种(参见下文)、10ng的pDFng153-4、pDFng154-17、或一种突变质粒中的任一个、5X高保真度缓冲液(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及0.5μl的高保真度DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)。对于pDFng154-17和埃默森青霉GH61多肽突变质粒，还添加1.5μl的DMSO。使用5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续30秒；10个循环，每个循环在98℃下持续10秒、65℃下(每循环减1℃)持续30秒、以及72℃下持续3分钟；25个循环，每个循环在98℃下持续10秒、55℃下30秒、以及72℃下持续3分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃浸泡循环。
引物1201513：
CCAGACCAGCAGAGGAGATAATACT(SEQ ID NO:323)
引物1201514：
CAAGGATACCTACAGTTATTCGA(SEQ ID NO:324)
每种PCR反应通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中观察到来自金黄色嗜热子囊菌的7718bp PCR产物或来自埃默森青霉的7754bp PCR产物。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer4在37℃下将PCR反应消化过夜并且使用纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。
实例21：棘孢曲霉GH61多肽变体的构建
通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng155-33构建棘孢曲霉GH61多肽变体。简单地说，第一PCR反应使用了正向引物BGMH110V2F和突变特异性反向引物(表13)。第二PCR反应使用了反向引物BGMH109V2R和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表13)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR反应使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用正向引物BGMH110V2F和反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。
引物BGMH110V2F：
5’-CCAGACCAGCAGAGGAGATAATACTCTGCG-3’(SEQ ID NO:325)
引物BGMH109V2R：
5’-CAAGGATACCTACAGTTATTCGAAACCTCCTG-3’(SEQ ID NO:326)
用于棘孢曲霉GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一SOE-PCR反应含有0.5皮摩尔的BGMH110V2F引物、0.5皮摩尔的在表13中列出的反向引物、50ng的模板(pDFng155-33)、5纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个,1X高保真度缓冲液、以及0.7单位的高保真度DNA聚合酶。使用Gradient(艾本德科技有限公司，美国纽约韦斯特伯里)执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续25秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。
用于棘孢曲霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第二SOE-PCR反应含有0.5皮摩尔的在表13中列出的正向引物、0.5皮摩尔的BGMH109V2R引物、50ng的模板(pDFng155-33)、5纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个，1X高保真度缓冲液、以及0.7单位的高保真度DNA聚合酶。使用Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续25秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。
每种PCR反应通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个3.9至6.5kb(如表13中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余余的野生型模板。该反应在37℃下孵育1小时并且接着使用96UF纯化试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)进行纯化。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop2000(塞默科技(Thermo Scientific)，美国北卡罗来纳州威尔明顿(Wilmington,DE,USA))进行测量。
用于棘孢曲霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第三PCR反应含有100至200ng的在第一和第二SOE-PCR反应中产生的每种片段、5纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个，1X高保真度缓冲液、以及0.7单位的高保真度DNA聚合酶。使用Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续15秒、68℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。在第五循环的退火/延长步骤期间添加引物BGMH110V2F引物(0.5皮摩尔)和引物BGMH109V2R(0.5皮摩尔)，以允许重叠核苷酸剪接。
使用类似于第三PCR反应的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下组成：50ng的模板(pDFng155-33)、0.5皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.5皮摩尔的引物BGMH109V2R、5纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个，1X高保真度缓冲液、以及0.7单位高保真度DNA聚合酶。使用 Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续15秒、68℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。
通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳对每种PCR反应进行分析，其中观察到大约8kb PCR产物条带，指示正确扩增。接着使用96UF纯化试剂盒纯化剩余的45μl的每种PCR反应。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop2000进行测量。然后如实例22中所述将整个体积转化到米曲霉COLs1300菌株中。
表13
实例22：金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、以及棘孢曲霉GH61多肽变体在米曲霉COLs1300中的表达
将米曲霉COLs1300在含有10mM尿苷的COVE-N-Gly平板上接种并且在34℃下孵育直到汇合。通过用10ml的YP培养基洗涤从该平板收集孢子。将全部孢子悬浮液用于接种500ml聚碳酸盐摇瓶中的101ml的COL1300原生质体化培养基。将该摇瓶在30℃下孵育，并且在200rpm下振荡18-24小时。通过衬有的漏斗过滤菌丝体并且用200ml的0.6M MgSO4洗涤。将洗涤的菌丝体在125ml无菌聚碳酸盐摇瓶中的10ml的COLs1300原生质体化溶液中重悬并且在室温下孵育3分钟。向摇瓶中添加12mg BSA/ml去离子水的溶液1ml，并且接着将该摇瓶在37℃下、在以65rpm混合下孵育45-90分钟，直到原生质体化完成。通过衬有的漏斗将菌丝体/原生质体混合物过滤在50ml锥形管中，并且用5ml的ST覆盖。在低加速/减速下将该50ml锥形管在1050x g下离心15分钟。离心后，液体被分成3相。将含有原生质体的中间相转移到新的50ml锥形管。在1050x g下简短离心5分钟之后，向原生质体中添加两体积的STC。弃去上清液，并且在重悬原生质体沉淀、在1050x g下离心5分钟、并且每次撇出上清液的情况下，用5ml的STC洗涤原生质体两次。在最终撇出后，在STC中在5×107/ml浓度下重悬原生质体沉淀。在转化之前将原生质体冰冻于-80℃。
如实例21中所述，将15μl体积的每种突变片段用于转化15ml圆底管中的100μl米曲霉COLs1300原生质体。在室温下初始孵育15分钟之后，向含有转化混合物的15ml圆底管中添加300μl的PEG溶液。该反应在室温下再孵育15分钟。向该反应中添加6ml的熔化的顶层琼脂并且将全部混合物均匀地倒在补充有10mM NaNO3的蔗糖琼脂平板上，并且留放在室温下直到顶层琼脂凝固。将这些平板在37℃下孵育4-6天。使用无菌接种环挑取所得的转化体并且接种到每孔含有200μl的MDU2BP的96孔平底平板中。该平板在34℃下在加湿箱中静止孵育。在第五天，通过去除菌丝体面收获样品。
实例23：通过蛋白质热解折叠分析测定金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、以及棘孢曲霉GH61多肽变体的Tm(解链温度)
金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、以及棘孢曲霉GH61多肽变体的蛋白质热解折叠通过根据实例10中所述的蛋白质热解折叠分析进行测定。金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、以及棘孢曲霉GH61多肽变体以及其野生型多肽如实例22中所述进行制备。热稳定性测定的结果在表14中示出。
表14通过蛋白质热解折叠分析测定的金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、以及棘孢曲霉GH61多肽变体的解链温度(℃)
蛋白质骨架 突变 Tm
金黄色嗜热子囊菌GH61 野生型 75
金黄色嗜热子囊菌GH61 Q188F 78
金黄色嗜热子囊菌GH61 Q188M 76
埃默森青霉GH61 野生型 71
埃默森青霉GH61 N192M 74
埃默森青霉GH61 N193H 73
棘孢曲霉GH61 野生型 46
棘孢曲霉GH61 D103K 48
棘孢曲霉GH61 D103P 48
棘孢曲霉GH61 N152I 48
棘孢曲霉GH61 N152L 49
棘孢曲霉GH61 G186F 51
棘孢曲霉GH61 G186M 51
棘孢曲霉GH61 G186A 48
棘孢曲霉GH61 G186W 49
棘孢曲霉GH61 N187H 48
棘孢曲霉GH61 N187K 48
通过以下编号的段落进一步描述本发明：
[1]一种GH61多肽变体，包含在与30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
[2]如段落1所述的变体，该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。
[3]如段落1或2中任一项所述的变体，该变体是选自由以下各项组成的组的具有纤维素分解增强活性的亲本GH61多肽的变体：(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由在至少低严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列具有至少60％的序列一致性的多核苷酸编码的多肽；(d)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽的片段。
[4]如段落3所述的变体，其中该亲本GH61多肽与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[5]如段落3所述的变体，其中该亲本GH61多肽由在低严谨度条件下、中等严谨度条件下、中-高等严谨度条件下、高严谨度条件下、或极高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体。
[6]如段落3所述的变体，其中该亲本GH61多肽由一个多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[7]如段落3所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽，或由其组成。
[8]如段落3所述的变体，其中该亲本GH61多肽是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽的片段，其中该片段具有纤维素分解增强活性。
[9]如段落1-8中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是少于100％的序列一致性。
[10]如段落2-9中任一项所述的变体，其中该变体由该亲本GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基组成。
[11]如段落1-10中任一项所述的变体，其中取代的数目为1-6个，例如，1、2、3、4、5、或6个取代。
[12]如段落1-11中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105相对应的位置处的取代。
[13]如段落12所述的变体，其中该取代是Pro或Lys。
[14]如段落1-13中任一项所述的变体，该变体包含在与位置154相对应的位置处的取代。
[15]如段落14所述的变体，其中该取代是Ile或Leu。
[16]如段落1-15中任一项所述的变体，该变体包含在与位置188相对应的位置处的取代。
[17]如段落16所述的变体，其中该取代是Ala、Met、Phe、或Trp。
[18]如段落1-17中任一项所述的变体，该变体包含在与位置189相对应的位置处的取代。
[19]如段落18所述的变体，其中该取代是His或Lys。
[20]如段落1-19中任一项所述的变体，该变体包含在与位置216相对应的位置处的取代。
[21]如段落20所述的变体，其中该取代是Leu或Tyr。
[22]如段落1-21中任一项所述的变体，该变体包含在与位置229相对应的位置处的取代。
[23]如段落22所述的变体，其中该取代是Trp、His、Ile、或Tyr。
[24]如段落1-23中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[25]如段落1-23中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的三个位置处的取代。
[26]如段落1-23中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的四个位置处的取代。
[27]如段落1-23中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何一个相对应的五个位置处的取代。
[28]如段落1-23中任一项所述的变体，该变体包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的每个位置处的取代。
[29]如段落1-28中任一项所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y。
[30]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K和E154I,L；或其相对应的取代。
[31]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K和G188A,F,M,W；或其相对应的取代。
[32]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K和N189H,K；或其相对应的取代。
[33]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K和A216L,Y；或其相对应的取代。
[34]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K和K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[35]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L和G188A,F,M,W；或其相对应的取代。
[36]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L和N189H,K；或其相对应的取代。
[37]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L和A216L,Y；或其相对应的取代。
[38]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L和K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[39]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W和N189H,K；或其相对应的取代。
[40]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W和A216L,Y；或其相对应的取代。
[41]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W和K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[42]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代N189H,K和A216L,Y；或其相对应的取代。
[43]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代N189H,K和K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[44]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代A216L,Y和K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[45]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；以及G188A,F,M,W；或其相对应的取代。
[46]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；以及N189H,K；或其相对应的取代。
[47]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[48]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[49]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；以及N189H,K；或其相对应的取代。
[50]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[51]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[52]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[53]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[54]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[55]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；以及N189H,K；或其相对应的取代。
[56]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[57]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[58]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[59]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[60]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[61]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[62]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[63]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[64]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[65]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；以及N189H,K；或其相对应的取代。
[66]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[67]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[68]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[69]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[70]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[71]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[72]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[73]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[74]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[75]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[76]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[77]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[78]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[79]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[80]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；以及A216L,Y；或其相对应的取代。
[81]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[82]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[83]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[84]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[85]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[86]如段落1-29中任一项所述的变体，该变体包含取代E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y；或其相对应的取代。
[87]如段落1-86中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
[88]如段落87所述的变体，其中取代的数目为1-4个，例如，1、2、3、或4个取代。
[89]如段落87或88所述的变体，该变体包含在与位置111相对应的位置处的取代。
[90]如段落89所述的变体，其中该取代是Val。
[91]如段落87-90中任一项所述的变体，该变体包含在与位置152相对应的位置处的取代。
[92]如段落91所述的变体，其中该取代是Ser。
[93]如段落87-92中任一项所述的变体，该变体包含在与位置155相对应的位置处的取代。
[94]如段落93所述的变体，其中该取代是Leu。
[95]如段落87-94中任一项所述的变体，该变体包含在与位置162相对应的位置处的取代。
[96]如段落95所述的变体，其中该取代是Trp。
[97]如段落87-96中任一项所述的变体，该变体包含在与位置111、152、155、以及162中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[98]如段落87-96中任一项所述的变体，该变体包含在与位置111、152、155、以及162中的任何一个相对应的三个位置处的取代。
[99]如段落87-96中任一项所述的变体，该变体包含在与位置111、152、155、以及162相对应的每个位置处的取代。
[100]如段落87-99中任一项所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：L111V、D152S、M155L、以及A162W。
[101]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+D152S；或其相对应的取代。
[102]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+M155L；或其相对应的取代。
[103]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+A162W；或其相对应的取代。
[104]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代D152S+M155L；或其相对应的取代。
[105]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代D152S+A162W；或其相对应的取代。
[106]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代M155L+A162W；或其相对应的取代。
[107]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+D152S+M155L；或其相对应的取代。
[108]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+D152S+A162W；或其相对应的取代。
[109]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+M155L+A162W；或其相对应的取代。
[110]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代D152S+M155L+A162W；或其相对应的取代。
[111]如段落87-100中任一项所述的变体，该变体包含取代L111V+D152S+M155L+A162W；或其相对应的取代。
[112]如段落1-111中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
[113]如段落112所述的变体，其中取代的数目为1-5个，例如，1、2、3、4、或5个取代。
[114]如段落112或113所述的变体，该变体包含在与位置96相对应的位置处的取代。
[115]如段落114所述的变体，其中该取代是Val。
[116]如段落112-115中任一项所述的变体，该变体包含在与位置98相对应的位置处的取代。
[117]如段落116所述的变体，其中该取代是Leu。
[118]如段落112-117中任一项所述的变体，该变体包含在与位置200相对应的位置处的取代。
[119]如段落118所述的变体，其中该取代是Ile。
[120]如段落112-119中任一项所述的变体，该变体包含在与位置202相对应的位置处的取代。
[121]如段落120所述的变体，其中该取代是Leu。
[122]如段落112-121中任一项所述的变体，该变体包含在与位置204相对应的位置处的取代。
[123]如段落120所述的变体，其中该取代是Val。
[124]如段落112-123中任一项所述的变体，该变体包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的两个位置处的取代。
[125]如段落112-123中任一项所述的变体，该变体包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的三个位置处的取代。
[126]如段落112-123中任一项所述的变体，该变体包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何一个相对应的四个位置处的取代。
[127]如段落112-123中任一项所述的变体，该变体包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的每个位置处的取代。
[128]如段落112-127中任一项所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V。
[129]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L；或其相对应的取代。
[130]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F200I；或其相对应的取代。
[131]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+I202L；或其相对应的取代。
[132]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+I204V；或其相对应的取代。
[133]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+F200I；或其相对应的取代。
[134]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+I202L；或其相对应的取代。
[135]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+I204V；或其相对应的取代。
[136]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F200I+I202L；或其相对应的取代。
[137]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F200I+I204V；或其相对应的取代。
[138]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I202L+I204V；或其相对应的取代。
[139]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+F200I；或其相对应的取代。
[140]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+I202L；或其相对应的取代。
[141]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+I204V；或其相对应的取代。
[142]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F200I+I202L；或其相对应的取代。
[143]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F200I+I204V；或其相对应的取代。
[144]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[145]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+F200I+I202L；或其相对应的取代。
[146]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+F200I+I204V；或其相对应的取代。
[147]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F200I+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[148]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[149]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+F200I+I202L；或其相对应的取代。
[150]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F200I+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[151]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[152]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+F200I+I204V；或其相对应的取代。
[153]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代F98L+F200I+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[154]如段落112-128中任一项所述的变体，该变体包含取代I96V+F98L+F200I+I202L+I204V；或其相对应的取代。
[155]如段落1-154中任一项所述的变体，其中与该亲本相比，该变体的热稳定性增加至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。
[156]一种分离的多核苷酸，其编码如段落1-155中任一项所述的变体。
[157]一种核酸构建体，其包含如段落156所述的多核苷酸。
[158]一种表达载体，其包含如段落156所述的多核苷酸。
[159]一种宿主细胞，其包含如段落156所述的多核苷酸。
[160]一种产生GH61多肽变体的方法，包括：在适于该变体表达的条件下培养如段落159所述的宿主细胞。
[161]如段落160所述的方法，进一步包括回收该变体。
[162]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用如段落156所述的多核苷酸进行了转化。
[163]一种产生如段落1-155中任一项所述的变体的方法，包括：在有助于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。
[164]如段落163所述的方法，进一步包括回收该变体。
[165]一种用于获得GH61多肽变体的方法，包括：在亲本GH61多肽的与30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处引入取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且任选地回收该变体。
[166]如段落165所述的方法，进一步包括在该亲本GH61多肽的与30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处引入取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
[167]如段落165或166所述的方法，进一步包括在该亲本GH61多肽的与30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处引入取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
[168]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在如段落1-155中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。
[169]如段落168所述的方法，其中该纤维素材料经过了预处理。
[170]如段落168或169所述的方法，进一步包括回收该降解的纤维素材料。
[171]如段落168-170中任一项所述的方法，其中该酶组合物包含选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白。
[172]如段落171所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、以及β-葡糖苷酶。
[173]如段落171所述的方法，其中该半纤维素酶是选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[174]如段落168-173中任一项所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖。
[175]如段落174所述的方法，其中该糖选自由以下各项组成的组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。
[176]一种用于产生发酵产物的方法，包括：(a)在如段落1-155中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；以及(c)从发酵物中回收该发酵产物。
[177]如段落176所述的方法，其中该纤维素材料经过了预处理。
[178]如段落176或177所述的方法，其中该酶组合物包含选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白。
[179]如段落178所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、以及β-葡糖苷酶。
[180]如段落178所述的方法，其中该半纤维素酶是选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[181]如段落176-180中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是在同时的糖化和发酵中同时执行。
[182]如段落176-181中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[183]一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如段落1-155中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物糖化该纤维素材料。
[184]如段落183所述的方法，其中该纤维素材料在糖化之前经过了预处理。
[185]如段落183或184所述的方法，其中该酶组合物包含选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及扩张蛋白。
[186]如段落185所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、以及β-葡糖苷酶。
[187]如段落185所述的方法，其中该半纤维素酶是选自由以下各项组成的组的一种或多种酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[188]如段落183-187中任一项所述的方法，其中该纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[189]如段落189所述的方法，进一步包括从发酵物中回收该发酵产物。
[190]如段落188或189所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[191]一种全液配制品或细胞培养组合物，包含如段落1-155中任一项所述的变体。
[192]一种洗涤剂组合物，包含表面活性剂和如段落1-155中任一项所述的变体。
[193]如段落192所述的组合物，进一步包含选自由以下各项组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：淀粉酶、阿拉伯糖酶、角质酶、碳水化合物酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及木聚糖酶。
[194]如段落192或193所述的组合物，该组合物被配制为条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。
[195]一种用于清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，该方法包括使该硬表面或该衣物与如段落192-194中任一项所述的组合物相接触。
在此描述和要求的本发明的范围不受在此披露的具体方面限制，这是因为这些方面意欲作为本发明的若干方面的阐述。意欲任何等同方面都是在本发明的范围内。事实上，除了在此示出和描述的那些之外，本发明的各种修改将根据以上描述而对本领域技术人员变得显而易见。意欲这类修改也落入随附权利要求的范围内。在不一致的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (21)

1.一种GH61多肽变体，包含一个在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
2.如权利要求1所述的变体，该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。
3.如权利要求1或2中任一项所述的变体，该变体是选自由以下各项组成的组的具有纤维素分解增强活性的亲本GH61多肽的变体：(a)与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；(b)由在至少低严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、或179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、或215的成熟多肽编码序列具有至少60％的序列一致性的多核苷酸编码的多肽；以及(d)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽的片段。
4.如权利要求3所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽，或由其组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、或180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、或216的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：E105P,K；E154I,L；G188A,F,M,W；N189H,K；A216L,Y；以及K229W,H,I,Y。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体进一步包含一个在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
8.如权利要求7所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：L111V、D152S、M155L、以及A162W。
9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，该变体进一步包含一个在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。
10.如权利要求9所述的变体，该变体包含选自由以下各项组成的组的一个或多个取代或相对应的取代：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V。
11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，其中与该亲本相比，该变体的热稳定性增加至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。
12.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-11中任一项所述的变体。
13.一种产生GH61多肽变体的方法，包括：(a)在适于该变体表达的条件下培养包含如权利要求12所述的多核苷酸的宿主细胞；并且任选地(b)回收该变体。
14.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用如权利要求12所述的多核苷酸进行了转化。
15.一种产生如权利要求1-11中任一项所述的变体的方法，包括：(a)在有助于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；并且任选地(b)回收该变体。
16.一种用于获得GH61多肽变体的方法，包括在亲本GH61多肽的与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处引入一个取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且任选地回收该变体。
17.一种用于降解或转化纤维素材料的工艺，包括：在如权利要求1-11中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
18.一种用于产生发酵产物的工艺，包括：(a)在如权利要求1-11中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。
19.一种发酵纤维素材料的工艺，包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如权利要求1-11中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物糖化该纤维素材料。
20.一种全液配制品或细胞培养组合物，包含如权利要求1-11中任一项所述的变体。
21.一种洗涤剂组合物，包含一种表面活性剂和如权利要求1-11中任一项所述的变体。
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