ES2562791T9 - Mejoras en nitrilasa microbiana inmovilizada para la producción de ácido glicólico - Google Patents

Description

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La SEQ ID NO: 38 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dio como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (L201 K; Leu → Lys).

La SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 38) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (Leu201 → Lys) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 40 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (L201 N; Leu → Asn).

La SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 40) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (Leu201 → Asn) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (L201S; Leu → Ser).

La SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 42) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 201 (Leu201 → Ser) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168K; Phe → Lys).

La SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 44) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Lys) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 46 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168M; Phe → Met).

La SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 46) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Met) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 48 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168T; Phe → Thr).

La SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 48) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Thr) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 50 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (F168V; Phe → Val).

La SEQ ID NO: 51 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 50) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (Phe168 → Val) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 52 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácidos en el residuo de la posición 168 (T210A; Thr → Ala).

La SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 52) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 210 (Thr210 → Ala) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 54 es la secuencia de nucleótidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codón que dió como resultado una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 168 (T210C; Thr → Cys).

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La SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 54) que comprende una única sustitución de aminoácido en el residuo de la posición 210 (Thr210 → Cys) de la nitrilasa de

A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 56 es la secuencia de nucleótidos de la nitrilasa de A. facilis 72W expresada en la cepa i SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).

La SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos deducida de la nitrilasa mutante de A. facilis 72W expresada en la cepa SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).

Depósitos biológicos

Los siguientes depósitos biológicos se han hecho en los términos del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento internacional del Depósito de microorganismos para los fines del procedimiento en materia de patentes:

Referencia para identificación del Designación internacional del Fecha del depósito depositante depósito

Acidovorax facilis 72W ATCC 55746 8 de marzo 1996

E. coli SS1001 ATCC PTA-1177 11 de enero 2000

Como se usa en a presente memoria, "ATCC" se refiere al Organismo internacional para el depósito de microorganismos American Type Culture Collection domiciliado en ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. La "Designación del depósito Internacional" es el número de acceso al cultivo depositado en ATCC.

Los depósitos mencionados se mantendrán en el depósito internacional indicado durante al menos treinta (30) años y se pondrán a disposición del público tras la concesión de una patente que los describe. La disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

Descripción detallada de la invención

Se proporciona un procedimiento para mejorar la actividad específica de un catalizador enzimático inmovilizado, reticulado y deshidratado, que tiene actividad de nitrilasa para la hidrólisis de glicolonitrilo a ácido glicólico después de la rehidratación. En particular, se proporciona un procedimiento para pretratar con glutaraldehído un catalizador enzimático que tiene actividad de nitrilasa, inmovilizar las células pretratadas con glutaraldehído y reticular químicamente las células inmovilizadas antes de la deshidratación. Después de la rehidratación, el catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído, inmovilizado y reticulado presenta mejor actividad específica de nitrilasa en comparación con catalizadores enzimáticos inmovilizados y reticulados que tienen actividad de nitrilasa que están deshidratados y rehidratados sin dicho tratamiento.

Definiciones:

En esta descripción, se utilizan una serie de términos y abreviaturas. Salvo que se especifique lo contrario se aplican las siguientes definiciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "que comprende" significa la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados a los que se refieren las reivindicaciones, pero que no excluye la presencia o adición de una o más de otras características, números enteros, etapas, componentes o sus grupos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" que modifica la cantidad de un ingrediente

o reaccionante de la invención empleado se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, por los procedimientos típicos de medición y manipulación de líquidos utilizados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; por errores involuntarios en estos procedimientos; por diferencias en la fabricación, la fuente o la pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones

o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" incluye también cantidades que difieren debido a las diferentes condiciones de equilibrio para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Sean o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantidades. En una realización, el término "aproximadamente" significa dentro de 10% del valor numérico descrito, preferiblemente dentro de 5% del valor numérico descrito.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "glicolonitrilo" se abrevia como "GLN" y es sinónimo de hidroxiacetonitrilo, 2-hidroxiacetonitrilo, hidroximetilnitrilo y todos los demás sinónimos del compuesto de número de registro en el Chemical Abstracts Service (CAS) 107-16-4.

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Fuente de nitrilasa

Número de acceso en GenBank® Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Secuencia del resto distintivo (posiciones de los residuos de aminoácidos)

Synechocystis sp. PCC 6803

NP_442646.1 13 GALACWEHYNPL (165-176)

Pseudomonas entomophila L48

YP_6090481.1 14 GAAVCWENYMPL (161-172)

Zymomonas moblis

YP_162942.1 15 GAAICWENYMPV (161-172)

Bacillus sp. OxB-1

BAA90460.1 16 GGLQCWEHFLPL (158-169)

Comamonas testosteroni

AAA82085.1 17 GGLQCWEHALPL (159-170)

Synechococcus sp. CC9605

YP_381420.1 18 GALACWEHYNPL (156-167)

Pseudomonas fluorescens Pf-5

YP_260015.1 19 GAVICWENMMPL (161-172)

Nocardia farcinica IFM 10152

YP_119480.1 20 GALCCWEHLQPL (159-170)

Alcaligenes faecalis 1650

AAY06506.1 21 GALCCWEHLSPL (159-170)

Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

AAY35081.1 22 GALCCWEHLQPL (157-168)

Bradyrhizobium sp. BTAil

ZP_00859948.1 23 GALCCWEHLQPL (163-174)

Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216

CAC88237 24 GALNCWEHFQTL (161-172)

Rhodococcus rhodochrous ATCC 39484™

N/A 25 GALNCWEHFQTL (161-172)

También se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa, aislado de un género seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax, Rhodococcus, Nocardia, Bacillus y Alcaligenes. En otro ejamplo, el catalizador nitrilasa comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa aislado de un género seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax y Rhodococcus.

En otra realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa procede de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)

o un polipéptido (que tiene actividad de nitrilasa) que es sustancialmente similar a la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (SEQ ID NO: 4) o la enzima derivada de A. facilis 72W representada por la SEQ ID NO: 51.

En una realización, el catalizador nitrilasa es una célula microbiana hospedante transformada para expresar al menos un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa. En una realización, la célula hospedante transformada se selecciona del grupo que consiste en: Comamonas sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Rhodococcus sp., Azotobacter sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Klebsiella sp., Salmonella sp., Lactobacillus sp., Aspergillus sp., Saccharomyces sp., Yarrowia sp., Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Candida sp., Hansenula sp., Dunaliella sp., Debaryomyces sp., Mucor sp., Torulopsis sp., Methylobacteria sp., Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp., y Streptomyces sp. En una realización preferida, la célula microbiana hospedante se selecciona del grupo que consiste en Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Escherichia sp. En una realización preferida, el catalizador es una célula hospedante de Escherichia coli que expresa recombinantemente uno o más de los polipéptidos que tienen actividad de nitrilasa.

También se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de nitrilasa, en donde dicho polipéptido que tiene actividad de nitrilasa tiene al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 51, preferiblemente al menos 70% de identidad con la SEQ ID NO: 51, incluso más preferiblemente al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 51, e incluso más preferiblemente al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 51, y lo más preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 51.

En la presente memoria se describen ejemplos de trabajo de diversos catalizadores que tienen actividad de nitrilasa derivados de diversas fuentes, incluyendo un catalizador derivado de nitrilasa de A. facilis 72W. Se han descrito en la técnica diversos mutantes derivados de la enzima nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (Patentes de EE.UU. 7.148.051 y. 7.198.927).

En una realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En otra realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En

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otra realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En otra realización, el polipéptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 24, 25 y 51. En otra realización, el catalizador nitrilasa comprende el polipéptido de la SEQ ID NO SEQ ID NO: 51.

Nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)

La nitrilasa de A. facilis 72W (EC 3.5.5.1) es un catalizador robusto para la producción de ácidos carboxílicos a partir de nitrilos alifáticos o aromáticos (documento WO 01/75077; Patente de EE.UU 6.870.038; y Chauhan et al., supra). También se ha demostrado que cataliza la conversión de α-hidroxinitrilos (es decir, glicolonitrilo) en ácidos α-hidroxicarboxílicos (es decir, ácido glicólico) (véanse las patentes de EE. UU. 6.383.786 y 6.416.980). Sin embargo, los catalizadores nitrilasa que tengan mejor actividad y/o estabilidad de nitrilasa (con relación a la nitrilasa de A. facilis 72W) cuando conviertan glicolonitrilo en ácido glicólico reducirán el coste de fabricación del ácido glicólico. Por tanto, un método para producir ácido glicólico que use un mejor catalizador de nitrilasa es útil para reducir el coste de fabricación del ácido glicólico, sin embargo la nitrilasa de A. facilis 72W es un catalizador enzimático para los fines de los procedimientos de la presente invención, así como dichas mejores nitrilasas descritas con detalle anteriormente.

Producción industrial del catalizador microbiano

Cuando se desea la producción comercial de los catalizadores enzimáticos descritos en la presente memoria, se puede utilizar una variedad de metodologías de cultivo. Se pueden realizar operaciones de fermentación de modos por lotes, por lotes alimentados o continuo, siendo dichos métodos bien conocidos en la técnica (Thomas D. Brock en Biotecnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, (1989); Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36(3): 227-234 (1992)).

Un método de cultivo por lotes clásico es un sistema cerrado donde la composición de los medios se ajusta al comienzo del cultivo y no está sometida a alteraciones artificiales durante el procedimiento de cultivo. Por tanto, al comienzo del procedimiento de cultivo el medio se inocula con el organismo u organismos deseados y se deja que tenga lugar el crecimiento o la actividad metabólica no añadiendo nada al sistema. Típicamente, sin embargo, un cultivo "por lotes" es por lote con respecto a la adición de la fuente de carbono y con frecuencia se realizan intentos de controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas por lotes, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en el que se termina el cultivo. Dentro de los cultivos por lotes, las células se moderan desde de una fase logarítmica estática hasta una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente hasta una fase estacionaria donde disminuye o se detiene la velocidad de crecimiento. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente morirán. En algunos sistemas las células en la fase logarítmica son con frecuencia responsables de la mayor parte de la producción del producto final o producto intermedio. En otros sistemas se puede obtener una producción en fase estacionaria o postexponencial.

Una variación en el sistema por lotes estándar es el sistema por lotes alimentado. Los procedimientos de cultivo por lotes alimentados son también adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que progresa el cultivo. Los sistemas por lotes alimentados son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. La medición de la concentración real del sustrato en los sistemas por lotes alimentados es difícil y por lo tanto se estima basándose en los cambios de factores medibles, tales como pH, oxígeno disuelto y presión parcial de los gases residuales, tales como CO2. Los métodos de cultivo por lotes y por lotes alimentados son usuales y bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Brock (supra) y Deshpande (supra).

La producción comercial de los presentes catalizadores enzimáticos que tienen actividad de nitrilasa también se puede realizar por un cultivo continuo. Los cultivos continuos son un sistema abierto en el que se añade continuamente a un biorreactor un medio de cultivo definido y se elimina simultáneamente durante el procedimiento una cantidad igual de medio acondicionado. Los cultivos continuos mantienen generalmente las células a una densidad en fase líquida alta y constante donde las células se desarrollan principalmente en fase logarítmica. Alternativamente, el cultivo continuo se puede realizar con células inmovilizadas a las que se añaden continuamente carbono y nutrientes y se eliminan continuamente de la masa celular productos valiosos, subproductos o productos residuales. La inmovilización celular se puede realizar utilizando una amplia gama de soportes sólidos compuestos de materiales naturales y/o sintéticos.

El cultivo continuo o semicontinuo permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentración celular final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, en una tasa fija y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas, se pueden alterar continuamente una serie de factores que afecten al crecimiento mientras se mantenga constante la concentración celular, medida por la turbidez del medio. Los sistemas continuos intentan mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y, por tanto, la

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pérdida de células debido a los medios que se retiran debe equilibrarse con la tasa de crecimiento celular en el cultivo. Los métodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento en los procedimientos de cultivo continuos, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de células, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una variedad de métodos han sido detallados por Brock (supra).

Los medios de fermentación en la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, aunque sin limitación, monosacáridos, tales como glucosa y fructosa, disacáridos, tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos, tales como almidón o celulosa, o sus mezclas, y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como líquido filtrado de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Por tanto, se considera que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contengan carbono y solamente estará limitada por la elección del organismo.

Pretratamiento con glutaraldehído del catalizador enzimático antes de la inmovilización

El tratamiento con glutaraldehído de un cultivo de fermentación del catalizador enzimático puede ser una manera conveniente de matar los microbios en el cultivo, evitando así problemas de contención y seguridad en la manipulación, la conservación y el transporte asociados con los cultivos recombinantes vivos. Se ha descubierto ahora que el pretratamiento con glutaraldehído, o el pretratamiento con glutaraldehído seguido de tratamiento con bisulfito, puede preservar la actividad de nitrilasa en células en suspensión y en una forma inmovilizada.

La preservación de la actividad de nitrilasa por pretratamiento con glutaraldehído de un catalizador enzimático se ve afectada por el tiempo, la temperatura, la concentración de glutaraldehído, el pH y la concentración de productos inhibidores como amoniaco y otras aminas (por ejemplo, aminoácidos y péptidos) en los medios que interactúan con el glutaraldehído. Un método de pretratamiento con glutaraldehído preferido trata las células procedentes de la fermentación de alta densidad (100-150 DO550) con 5-10% en peso de glutaraldehído en agua que es suministrado preferiblemente como una mezcla adecuada de 50 mg a 500 mg de glutaraldehído/L-min, más preferiblemente suministrado como una mezcla adecuada de 50 mg a 200 mg de glutaraldehído/L-min, lo más preferiblemente suministrado como una mezcla adecuada de 50 mg a 100 mg de glutaraldehído/L-min, dando como resultado una concentración final de aproximadamente 3 g a aproximadamente 5 g de glutaraldehído/L (aproximadamente 0,025 g a aproximadamente 0,042 g de glutaraldehído por DO550), más preferiblemente de aproximadamente 3,6 g a aproximadamente 5 g de glutaraldehído/L (aproximadamente 0,030 g a aproximadamente 0,042 g de glutaraldehído por DO550). El cultivo pretratado con glutaraldehído se puede mantener en el fermentador durante aproximadamente 1 a 5 horas. A continuación se añade opcionalmente una solución al 10% en peso de bisulfito de sodio en agua a 1 g/L para inactivar el glutaraldehído residual.

El pH preferido para el pretratamiento con glutaraldehído del catalizador enzimático en el caldo de fermentación o en suspensión celular es desde pH 5,0 hasta 9,0, más preferiblemente desde pH 5,0 hasta 8,0, incluso más preferiblemente desde pH 5,0 hasta 7,0, todavía más preferiblemente desde pH 5,0 hasta 6,0, y lo más preferiblemente desde pH 5,0 hasta 5,5. La concentración de glutaraldehído residual después del pretratamiento con glutaraldehído es típicamente baja, en el intervalo de 10 -200 ppm, y puede ser inactivado como se ha indicado anteriormente, con la adición de bisulfito de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 1 g/L. Se encontró que el pretratamiento con glutaraldehído y bisulfito no tenía ningún efecto perjudicial significativo sobre la actividad de nitrilasa. La suspensión celular pretratada con glutaraldehído o glutaraldehído/bisulfito se enfría opcionalmente hasta 5 – 10ºC, y se lava opcionalmente (por concentración y re-dilución de la suspensión celular o del caldo de fermentación) con agua o un tampón de conservación adecuado para eliminar el bisulfito residual y el glutaraldehído sin reaccionar.

Inmovilización del catalizador enzimático pretratado con glutaraldehído y reticulación química

Los métodos para la inmovilización de catalizadores enzimáticos han sido documentados ampliamente y son bien conocidos por los expertos en la técnica (Methods in Biotecnology, Vol. 1: Immobilization of enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997). También se ha documentado previamente la inmovilización del catalizador nitrilasa de A. facilis 72W (patente de EE.UU. 6.870.038).

Además, existe un método para la inmovilización en carragenina y posterior reticulación con glutaraldehído/polietilenimina del catalizador enzimático inmovilizado (y como se ha descrito en la patente de EE.UU 6.870.038 y como se ha descrito con detalle en la patente de EE.UU. 6.551.804 B), sin embargo, un experto en la técnica reconocería y aplicaría fácilmente variaciones para realizar la inmovilización y reticulación.

Dichas variaciones están contempladas en la presente memoria y están dentro del alcance del presente procedimiento. Además, las cantidades o concentraciones de los componentes utilizados para la inmovilización y reticulación química variarán dependiendo de la cantidad y tipo de catalizador enzimático y la producción por fermentación del catalizador enzimático. Un experto en la técnica reconocería estos factores y ajustaría en consecuencia los procedimientos de inmovilización y reticulación química. Con relación a la reticulación con glutaraldehído y polietilenimina, la patente de EE.UU. 6.551.804 (supra), describe los procesos y procedimientos

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para reticular químicamente células inmovilizadas con alginato. Dicha descripción se aplica también en la presente invención para células inmovilizadas en carragenina.

Deshidratación/rehidratación del catalizador enzimático microbiano inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehído/polietilenimina

Como se indicó anteriormente, un problema particular relacionado con el uso de un catalizador nitrilasa microbiano abordado en la presente solicitud es la conservación y transporte del catalizador enzimático. Aspectos de interés para la conservación y transporte de los catalizadores enzimáticos que tienen actividad de nitrilasa incluyen dificultades con el volumen del material y la inactivación de la actividad enzimática del material con el tiempo. Cuando se inmovilizó en carragenina y posteriormente se reticuló con glutaraldehído y polietilenimina, el catalizador nitrilasa microbiano inmovilizado resultante contenía aproximadamente 90% en peso de agua, y el catalizador se conservó típicamente a 5ºC en un peso equivalente de tampón acuoso. Una reducción en la cantidad de agua presente en el catalizador de nitrilasa microbiano inmovilizado, y la eliminación del tampón acuoso utilizado para conservar el catalizador, disminuiría el volumen del catalizador y del tampón asociado necesario para ser transportado y conservado antes de su uso, y mejoraría aún más significativamente la economía de fabricación del ácido glicólico.

La deshidratación del catalizador enzimático inmovilizado y reticulado con glutaraldehído/polietilenimina se puede realizar por cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, deshidratación al aire, deshidratación en una corriente de un gas inerte, deshidratación en una estufa a vacío con o sin purga con un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón) o liofilización (secado por congelación). La temperatura para la deshidratación puede variar preferiblemente desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 60ºC, más preferiblemente desde aproximadamente 15ºC hasta aproximadamente 50ºC y lo más preferiblemente desde aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 40ºC. Las perlas deshidratadas resultantes pueden perder hasta aproximadamente 91% de su peso húmedo inicial (cuando se comienza con perlas constituidas por aproximadamente 5% en peso de células secas de células que contiene nitrilasa microbianas). El catalizador celular inmovilizado y deshidratado puede ser conservado al aire o bajo una atmósfera inerte, y preferiblemente a temperaturas en el intervalo de – 25ºC a 35ºC, preferiblemente de 5ºC a 25ºC. El catalizador celular inmovilizado y deshidratado puede ser rehidratado colocando las perlas deshidratados en agua o en un tampón acuoso adecuado, por ejemplo, una solución de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3), siendo la temperatura de rehidratación preferiblemente de aproximadamente 5ºC a aproximadamente 35ºC. Las perlas rehidratadas resultantes se pueden usar directamente en una reacción para la producción de ácido glicólico a partir de glicolonitrilo, o conservarse en el líquido de rehidratación desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 35ºC hasta su uso.

Hidrólisis de glicolonitrilo a ácido glicólico usando un catalizador nitrilasa

La conversión enzimática de glicolonitrilo en ácido glicólico (en forma de ácido y/o de la sal de amonio correspondiente) se puede realizar poniendo en contacto un catalizador enzimático, un catalizador enzimático inmovilizado o un catalizador enzimático inmovilizado y reticulado que tiene actividad de nitrilasa en condiciones de reacción adecuadas, como se describe a continuación (es decir, en una mezcla de reacción acuosa a determinados intervalo de pH, temperaturas, concentraciones, etc.). En una realización, las células microbianas recombinantes enteras se pretratan con glutaraldehído, se inmovilizan en carragenina, se reticulan, se deshidratan y después de rehidratación el catalizador enzimático resultante se utiliza directamente para la conversión de glicolonitrilo en ácido glicólico, o las células inmovilizadas se pueden mantener separadas de la mezcla de reacción a granel usando cartuchos de membrana de fibra hueca o membranas de ultrafiltración. En una segunda realización, las células microbianas recombinantes enteras se inmovilizan en gel de poliacrilamida, y el catalizador enzimático resultante se utiliza directamente para la conversión de glicolonitrilo en ácido glicólico.

La concentración de catalizador enzimático en la mezcla de reacción acuosa depende de la actividad específica del catalizador enzimático y se elige para obtener la velocidad de reacción deseada. El peso de células húmedas de las células microbianas utilizadas como catalizador en reacciones de hidrólisis varía típicamente desde 0,001 gramos hasta 0,250 gramos de células húmedas por mL de volumen de reacción total, preferiblemente desde 0,002 gramos hasta 0,050 gramos de células húmedas por mL. El % en peso indicado de células húmedas por volumen de volumen de reacción total puede estar presente en la mezcla de reacción en forma de un catalizador enzimático inmovilizado preparado como se ha descrito anteriormente (supra), donde el peso de células húmedas como porcentaje del peso total del catalizador enzimático inmovilizado se conoce por el método de preparación del catalizador enzimático inmovilizado.

La temperatura de la reacción de hidrólisis de glicolonitrilo se elige para controlar tanto la velocidad de reacción como la estabilidad de la actividad del catalizador enzimático. La temperatura de la reacción puede variar desde justo por encima del punto de congelación de la mezcla de reacción (aproximadamente 0ºC) hasta aproximadamente 65ºC, con un intervalo preferido de temperatura de reacción desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 35ºC. La suspensión de catalizador enzimático se puede preparar poniendo en suspensión las células inmovilizadas y deshidratadas en agua destilada, o en una solución acuosa de un tampón que mantenga el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

pH inicial de la reacción entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 10,0, preferiblemente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,0, más preferiblemente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,7, y lo más preferiblemente desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 7,7. A medida que avanza la reacción, el pH de la mezcla de reacción puede cambiar debido a la formación de una sal de amonio del ácido carboxílico a partir de la funcionalidad nitrilo correspondiente. La reacción se puede realizar para completar la conversión de glicolonitrilo sin control de pH, o se puede añadir un ácido o una base adecuados durante el transcurso de la reacción para mantener el pH deseado.

Se encontró que el glicolonitrilo era completamente miscible con agua en todas las proporciones a 25ºC. En los casos en los que se eligen las condiciones de reacción, de tal manera que la solubilidad del sustrato (es decir, un α-hidroxinitrilo) también dependa de la temperatura de la solución y/o la concentración de sal (tampón o el producto sal de amonio del ácido glicólico, también conocido como glicolato de amonio) en la fase acuosa, la mezcla de reacción puede estar compuesta inicialmente de dos fases: una fase acuosa que contiene el catalizador enzimático y α-hidroxinitrilo disuelto, y una fase orgánica (el α-hidroxinitrilo sin disolver). A medida que progresa la reacción, el α-hidroxinitrilo se disuelve en la fase acuosa, y finalmente se obtiene una mezcla de producto en una sola fase. La reacción también puede ser realizada añadiendo el α-hidroxinitrilo a la mezcla de reacción a una velocidad aproximadamente igual a la velocidad de reacción de la hidrólisis enzimática, manteniendo de este modo una mezcla de reacción acuosa en una sola fase, y evitando el problema potencial de inhibición por el sustrato de la enzima a altas concentraciones de material de partida.

El ácido glicólico puede estar en la mezcla de productos como una mezcla del ácido carboxílico protonizado y/o su sal de amonio correspondiente (dependiendo del pH de la mezcla de productos; el pKa del ácido glicólico es aproximadamente 3,83) y adicionalmente puede estar presente como una sal del ácido carboxílico con cualquier tampón que adicionalmente pueda estar presente en la mezcla de productos. Típicamente, el ácido glicólico producido está principalmente en forma de sal de amonio (el pH de la reacción de hidrólisis del glicolonitrilo está típicamente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,7). El producto de ácido glicólico se puede aislar de la mezcla de reacción como el ácido carboxílico protonizado, o como una sal del ácido carboxílico, según se desee.

La concentración final de ácido glicólico en la mezcla de productos en la conversión completa de glicolonitrilo puede variar desde 0,001 M hasta el límite de solubilidad del producto ácido glicólico. En una realización, la concentración de ácido glicólico variará desde aproximadamente 0,10 M hasta aproximadamente 5,0 M. En otra realización, la concentración de ácido glicólico variará desde aproximadamente 0,2 M hasta aproximadamente 3,0

M.

El ácido glicólico puede ser recuperado en forma del ácido o la sal correspondiente usando una variedad de técnicas que incluyen, aunque sin limitación, intercambio iónico, electrodiálisis, extracción con disolvente reactivo, polimerización, descomposición térmica, alcoholisis y sus combinaciones.

Además, cuando una cantidad, concentración u otro valor o parámetro se da en forma de un intervalo, un intervalo preferido o una lista de valores superiores preferibles y valores inferiores preferibles, debe entenderse que están descritos específicamente todos los intervalos formados a partir de una pareja de cualquier límite superior del intervalo o valor preferido y cualquier límite inferior del intervalo o valor preferido, independientemente de si los intervalos se describen por separado. Cuando en la presente memoria se enumera un intervalo de valores numéricos, a menos que se indique lo contrario, se pretende que el intervalo incluya sus extremos, y todos los números enteros y fracciones dentro del intervalo. No se pretende que el alcance de la invención esté limitado a los valores específicos citados cuando se define un intervalo.

Métodos generales

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para llevar bien a la práctica la invención, y por tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Técnicas adecuadas para uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar descritos en Manual of Methods for General Bacteriology (1994) (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC.) o por Thomas D. Brock, en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, (1989) Second Edition, (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA). Los métodos para inmovilizar catalizadores enzimáticos se pueden encontrar en Bickerstaff, G. F., supra).

Los procedimientos requeridos para la preparación de DNA genómico, la amplificación por PCR, las modificaciones del DNA por endo-y exo-nucleasas para generar extremos deseados para la clonación del DNA, las ligamientos y la transformación bacteriana, son bien conocidos en la técnica. Técnicas de DNA recombinante y de

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Tabla 2. Medios de fermentación, antes de la esterilización.

(NH4)2SO4

5,0 g/L

K2HPO4

4,0 g/L

KH2PO4

3,5 g/L

MgSO4.7H2O

0,6 g/L

Citrato sódico.2H2O

1,0 g/L

NZ Amine AS (Quest)

2,5 g/L

Antiespumante -Biospumex 153K

0,25 mL/L

Tabla 3. Elementos trazas en la fermentación

Concentración

Ácido cítrico

10 g/L

CaCl2.2H2O

1,5 g/L

FeSO4.7H2O

5 g/L

ZnSO4.7H2O

0,39 g/L

CuSO4.5H2O

0,38 g/L

CoCl2.6H2O

0,2 g/L

MnCl2.4H2O

0,3 g/L

Tabla 4. Puntos de ajuste de la fermentación

Puntos de ajuste iniciales

Mínimo Máxim o

Agitador (rpm)

400 400 1000

Caudal de aire (litros estándar por minuto)

2 2 10

pH

6,8 6,8 6,8

Presión (kPa)

0,5 0,5 0,5

Oxígeno disuelto (Od)

25% 25% 25%

Temperatura ºC

30 30 30

Tabla 5. Protocolo de alimentación de la fermentación usado con inducción de lactosa 5

Tiempo de fermentación transcurrido (h)

Caudal de alimentación (g/min) Sustrato

0

0

Glucosa (por lotes)

5

0,27 Glucosa (50% p/p)

14

1,3 Lactosa (25% p/p)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 2

Inmovilización de E. coli MG1655/pNM18-168V en perlas de carragenina reticuladas con GA/PEI

Con agitación rápida, se añadieron lentamente 12 g de carragenina (FMC GP911) a 228 g de agua destilada desionizada, a 50ºC, la mezcla resultante se calentó hasta 80ºC hasta que la carragenina se disolvió completamente, y la solución resultante se enfrió con agitación hasta 52ºC. En un vaso separado equipado con una barra de agitación, se añadieron 83,2 g de células congeladas de E. coli MG1655/pNM18-168V (25,2% en pcs) a 84,8 g de Na2HPO4 0,35 M (pH 7,3) a aproximadamente 25ºC y se mezcló hasta que las células se pusieron en suspensión, y a continuación se añadió una solución de desoxirribonucleasa I (10 µL de 12.500 U/mL de DNasa (Sigma)/100 mL de suspensión celular). La suspensión celular se filtró consecutivamente por un elemento filtrante Nupro TF de 230 micrómetros y 140 micrómetros y se calentó con agitación hasta 50ºC. A la solución de carragenina a 52ºC, se añadieron con agitación, 160,0 g de una suspensión celular de E. coli MG1655/pNM18168V a 50ºC, y la suspensión de células/carragenina resultante se bombeó a través de una aguja de calibre 20 calentada eléctricamente a 47ºC y se añadió gota a gota con agitación a KHCO3 0,25 M (pH = 7,3) a aproximadamente 37-38ºC; el caudal a través de la aguja se ajustó a 5-8 mL/min. Se dejaron endurecer las perlas resultantes en este mismo tampón durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación, y se conservaron en bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3).

La reticulación química de las perlas inmovilizadas de células/carragenina se realizó por adición de 0,5 g de glutaraldehído (GA) al 25% en agua (Sigma M 752-07) a 20 g de perlas en suspensión en 48 mL de bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3) y agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. A la suspensión de perlas se añadieron luego 2,0 g de polietilenimina al 12,5% en peso (PEI, BASF LUPASOL PS) en agua, y la suspensión de perlas se agitó durante 18 horas más a temperatura ambiente. Las perlas reticuladas con GA/PEI se recuperaron de la suspensión, se agitaron dos veces durante 15 minutos en 48 mL de bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3), y a continuación se almacenaron en bicarbonato de amonio 1,0 M (pH 7,3) a 5ºC. Antes de su uso como catalizador para la conversión del glicolonitrilo en ácido glicólico (como la sal de amonio), las perlas se lavaron dos veces durante 15 minutos con 180 mL de glicolato de amonio 0,1 M (pH 7,3) a temperatura ambiente para eliminar el tampón de conservación de bicarbonato de amonio 1,0 M (pH 7,3). El catalizador celular inmovilizado resultante se identificó como NIT 60 inmovilizado.

Ejemplo 3

Deshidratación/rehidratación del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehído/polietilenimina

Las perlas del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizadas en carragenina y reticuladas con glutaraldehído/polietilenimina preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 se deshidrataron en una estufa a vacío (176 mm de Hg) a 35ºC con purga de nitrógeno durante 24 horas. La relación entre el peso de las perlas deshidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,0914. Las perlas deshidratadas se rehidrataron posteriormente colocando las perlas deshidratadas en una solución 20 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3) a 5ºC o 25ºC durante 18 horas. Las perlas rehidratadas resultantes se lavaron dos veces con una solución 9 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3), y a continuación se pesaron; la relación entre el peso de las perlas rehidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,210 para las perlas rehidratadas a 5ºC, y la relación entre el peso de las perlas rehidratadas y el peso de las perlas originales fue 0,212 para las perlas rehidratadas a 25ºC.

Ejemplo 4

Actividad específica del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehído/polietilenimina antes y después de la deshidratación/rehidratación

Las reacciones por lotes para la conversión de glicolonitrilo en ácido glicólico se realizaron a 25ºC en un baño de agua a temperatura controlada. Un primer recipiente de reacción equipado con una barra de agitación magnética se cargó con 8,0 g de perlas de E. Coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI (peso de células secas 0,40 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 sin deshidratación/rehidratación), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 21,7 mL de agua destilada desionizada. Un segundo recipiente de reacción equipado con una barra de agitación magnética se cargó con 1,71 g de perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI rehidratadas (peso de células secas 0,41 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 3 con deshidratación a 35ºC y rehidratación a 5ºC), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 28,0 mL de agua destilada desionizada. Un tercer recipiente de reacción equipado con una barra de agitación magnética se cargó con 1,70 g de perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI rehidratadas (peso células secas 0,40 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 con deshidratación a 35ºC y rehidratación a 25ºC), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 28,0 mL de agua destilada desionizada. A continuación se añadieron simultáneamente y con agitación a cada recipiente de reacción 3,50 mL (3,75 g) de glicolonitrilo (GLN) al 60,8% en

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Tabla 7: Protocolo de alimentación

Intervalos de tiempo de alimentación, (h)

Caudal de alimentación, g/min Sustrato Etapa

0

6,13 50% p/p de glucosa 1ª

1

7,13 50% p/p de glucosa 1ª

2

8,28 50% p/p de glucosa 1ª

3

9,62 50% p/p de glucosa 1ª

4

11,18 50% p/p de glucosa 1ª

5

11,18 50% p/p de glucosa 1ª

6

11,18 50% p/p de glucosa 1ª

7

11,18 50% p/p de glucosa 1ª

8

11,18 50% p/p de glucosa 1ª

0

11,22 25% p/p de glucosa 2ª

2

24,42 25% p/p de glucosa 2ª

20

16,72 25% p/p de glucosa 2ª

30

18,7 25% p/p de glucosa 2ª

40

18,7 25% p/p de glucosa 2ª

Al final de la fermentación, la agitación se redujo hasta 150 rpm, se detuvo la aireación y la temperatura se mantuvo a 35ºC. Se retiró parte del caldo de fermentación, dejando aproximadamente 180 kg en el fermentador. Este caldo remanente se tituló hasta pH 5,2 y se mantuvo a este pH con H2SO4 al 20% (20% p/p) y NaOH (50% 5 p/p), mientras se añadían con agitación 9,0 L de glutaraldehído acuoso (GA, 10% p/p) a un caudal de ~90 mL/min; este caudal de adición era equivalente a 50 mg de glutaraldehído/L de caldo de fermentación/min, y la concentración final de glutaraldehído fue aproximadamente 5 g de glutaraldehído/L (0,035 g de glutaraldehído/DO550). Después de 5 h desde el inicio de la adición de glutaraldehído al caldo, el pH se ajustó a 7,0 y se añadieron con agitación 1,8 L de bisulfito de sodio acuoso (10% p/p, pH 7) (aproximadamente 1 g de bisulfito 10 de sodio/L de concentración final), y el caldo se agitó durante 15 minutos más. A continuación se disminuyó la temperatura del caldo hasta 10ºC y la agitación se disminuyó hasta 100 rpm. El caldo se concentró hasta 40 kg de suspensión celular usando una centrifugadora Diskstack (Alfa Laval), después se añadieron a la suspensión 50 kg de agua DI (20ºC) y la mezcla se concentró por centrifugación para producir 40 kg de suspensión celular lavada. La suspensión (identificada como NIT 188A-C2) se conservó a 5ºC, y una porción de la suspensión celular se usó 15 directamente para la preparación de un catalizador celular inmovilizado (Ejemplo 6). La actividad específica de

nitrilasa durante cada etapa del procedimiento se resume en la Tabla 8.

Tabla 8: Actividad de nitrilasa durante las diferentes etapas del tratamiento con GA y bisulfito

Etapa de fermentación

U de BZN/g pcs

Pretratamiento con GA

2819

Postratamiento con GA

3300

NaHSO3

2493

Ejemplo 6

Inmovilización de E. coli MG1655/pNM18-168V pretratada con glutaraldehído en perlas de carragenina reticuladas 20 con GA/PEI.

El concentrado de la suspensión celular final recuperado del caldo de fermentación tratado con bisulfito de sodio y glutaraldehído del Ejemplo 5 se centrifugó a 5ºC. El sedimento celular resultante se volvió a poner en suspensión en una cantidad 5 veces en peso de tampón de fosfato de potasio 0,35 M (pH 7,2), y la centrifugación de la suspensión celular resultante a 5ºC produjo una pasta celular húmeda que se inmovilizó y reticuló químicamente

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Claims (1)

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