ES2562791T3 - Mejoras en nitrilasa microbiana inmovilizada para la producción de ácido glicólico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir un catalizador enzimático deshidratado que tiene actividad de nitrilasa con mejor actividad específica, que comprende: (a) producir por fermentación un catalizador enzimático que tiene actividad de nitrilasa; (b) pretratar dicho catalizador enzimático con glutaraldehído; (c) inactivar opcionalmente el glutaraldehído sin reaccionar con bisulfito después del pretratamiento con glutaraldehído; (d) recuperar el catalizador enzimático de (b) o (c) e inmovilizar dicho catalizador enzimático en carragenina; (e) reticular el catalizador enzimático inmovilizado en carragenina resultante de (d) con glutaraldehído y polietilenimina; y (f) deshidratar el catalizador enzimático inmovilizado y reticulado producido en la etapa (e); en donde dicho catalizador enzimático comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57.

Description

DESCRIPCION

Mejoras en nitrilasa microbiana inmovilizada para la produccion de acido glicolico Campo de la invencion

Esta invencion se refiere al campo de la smtesis de acidos organicos y a la microbiologia. Mas espedficamente, se 5 proporciona un procedimiento para mejorar la actividad espedfica de un catalizador enzimatico deshidratado que tiene actividad de nitrilasa para la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico por rehidratacion. En particular, se proporciona un procedimiento para pretratar un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa con glutaraldehido, inmovilizar las celulas pretratadas con glutaraldehido y reticular qmmicamente las celulas inmovilizadas antes de la deshidratacion. Tras la rehidratacion, el catalizador enzimatico presenta una mejor 10 actividad espedfica de nitrilasa en comparacion con los catalizadores enzimaticos que tienen actividad de nitrilasa

que son deshidratados y rehidratados sin dicho tratamiento.

Antecedentes de la invencion

El acido glicolico (HOCH2COOH; Numero de registro en Chemical Abstracts (CAS) 79-14-1) es el miembro mas sencillo de la familia de los a-hidroxiacidos de los acidos carboxflicos. Sus propiedades lo hacen ideal para un 15 amplio espectro de aplicaciones de consumo e industriales, incluyendo el uso en la rehabilitacion de pozos de agua, la industria del cuero, la industria del petroleo y gas, y la industria de lavanderia y textil, como monomero en la preparacion de poli(acido glicolico) (PGA) y como componente en productos para el cuidado personal. El acido glicolico es tambien un ingrediente principal para agentes de limpieza en una variedad de industrias (agentes de limpieza para equipos de tratamiento en las industrias lactea y alimentaria, agentes de limpieza para el hogar e 20 instituciones, agentes de limpieza industriales [para equipo de transporte, mamposteria, placas de circuitos impresos, calderas de acero inoxidable y equipos de procedimientos, torres de refrigeracion/intercambiadores de calor] y el procesamiento de metales [para el decapado de metales, abrillantamiento de cobre, ataque qmmico, electrochapado y electropulido]). Tambien se ha informado de que el poli(acido glicolico) es util como material barrera para gases (es dedr, presenta altas caracteristicas de barrera para el oxigeno) para el envasado de 25 alimentos y bebidas carbonicas (documento WO 2005/106005 A1). Sin embargo, la smtesis qmmica tradicional del acido glicolico produce una cantidad significativa de impurezas que se deben eliminar antes de su uso. Por tanto seria muy bien recibida en la industria una nueva tecnologia para producir comercialmente acido glicolico, especialmente una que produzca acido glicolico de alta pureza y a bajo coste.

Los catalizadores enzimaticos microbianos pueden hidrolizar un nitrilo (por ejemplo, glicolonitrilo) directamente a 30 los correspondientes acidos carboxflicos (por ejemplo, acido glicolico) usando una nitrilasa (EC 3.5.5.7), donde no hay produccion intermedia de la amida correspondiente (Ecuacion 1), o por una combinacion de las enzimas nitrilo-hidratasa (EC 4.2.1.84) y amidasa (EC 3.5.1.4), donde una nitrilo-hidratasa (NHasa) convierte inicialmente un nitrilo en una amida, y luego la amida es convertida posteriormente por la amidasa en el correspondiente acido carboxflico (Ecuacion 2):

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nitrilasa^ , .

HOCH2CN 2 H O HOCH2C02H + NH3

imagen1

La hidrolisis enzimatica de nitrilos a acido glicolico con fines comerciales requiere la produccion del catalizador enzimatico a gran volumen por fermentacion. Gran parte del volumen es atribuible al contenido de agua del caldo de fermentacion. Debido a que dicho caldo de fermentacion de gran volumen, el almacenamiento, y en muchos 40 casos el transporte de dicho caldo de fermentacion que contiene el catalizador enzimatico, se plantean tanto problemas logisticos como economicos. Un mecanismo para proporcionar facilidad de almacenamiento y transporte del catalizador enzimatico es aislar el catalizador enzimatico del caldo de fermentacion, inmovilizar el catalizador enzimatico (por ejemplo, mediante atrapamiento en un gel de carragenina), y deshidratar el catalizador enzimatico inmovilizado. El catalizador enzimatico inmovilizado puede ser rehidratado antes de su uso para la 45 produccion de acido glicolico. Sin embargo, la deshidratacion y la rehidratacion frecuentemente dan como resultado una perdida significativa de la actividad enzimatica.

La deshidratacion o secado de catalizadores celulares inmovilizados se ha descrito previamente. La patente de EE.UU. 5.998.180 describe un procedimiento para la produccion de una nitrilasa microbiana inmovilizada y secada, donde las celulas de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 o NCIMB 408333 que contienen dicha 50 nitrilasa retienen al menos 80% de su actividad inicial despues de la inmovilizacion en perlas de poliacrilamida reticulada, y donde la nitrilasa celular inmovilizada resultante retiene al menos 90% de su actividad inmovilizada

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inicial despues de que las perlas de poliacrilamida reticulada sean secadas hasta 12% de humedad a 60°C. B. DeGiulio et al., (World J. Microbiol. Biotechnol. 21: 739-746, (2005)) describen la inmovilizacion de bacterias de acido lactico en alginato de calcio, seguido por liofilizacion del catalizador celular inmovilizado resultante, en donde al menos 72% de las celulas retuvo la actividad metabolica despues de la liofilizacion. La patente de EE.UU. 5.846.762 describe la deshidratacion de perlas de gelatina que contienen celobiasa covalentemente inmovilizada, y senala en la columna 6, lmeas 9-11, que el alginato de calcio y la perlas de kappa-carragenina, una vez deshidratados, generalmente no pueden ser rehidratados.

Ninguno de los metodos descritos inmediatamente antes, para la deshidratacion o liofilizacion de catalizadores enzimaticos inmovilizados y posterior rehidratacion implica una mejora en la actividad de la enzima recuperada despues de la rehidratacion, o mejora en la estabilidad de la actividad enzimatica cuando se emplea el catalizador enzimatico rehidratado resultante en una reaccion para convertir sustrato en producto, en comparacion con un catalizador enzimatico inmovilizado y rehidratado comparable que no se preparo con celulas pretratadas con glutaraldeddo.

Ademas de la perdida de actividad del catalizador enzimatico como resultado del tratamiento de dicho catalizador enzimatico, tal como en el caso de deshidratacion/rehidratacion, la hidrolisis enzimatica de glicolonitrilo a acido glicolico requiere tipicamente una forma sustancialmente pura de glicolonitrilo. Se han descrito previamente metodos para sintetizar glicolonitrilo por reaccion de soluciones acuosas de formaldeddo y cianuro de hidrogeno (Patentes de EE.UU. 2.175.805; 2.890.238; y 5.187.301; Ecuacion 3).

(3) HCN + HCHO ► HOCH2CN

Sin embargo, estos metodos dan como resultado ripicamente un producto de reaccion de glicolonitrilo acuoso que requiere una purificacion significativa (por ejemplo, purificacion por destilacion) puesto que muchas de las impurezas y/o subproductos de la reaccion (incluyendo el exceso de formaldeddo reactivo) pueden interferir con la conversion enzimatica de glicolonitrilo en acido glicolico, incluyendo la supresion de la actividad del catalizador (es decir. disminucion de la actividad espedfica). En particular, es bien sabido que el formaldeddo puede crear modificaciones indeseables en las protemas por reaccion con los grupos amino de residuos de aminoacidos N- terminales y las cadenas laterales de residuos de arginina, cistema, histidina, y lisina (Metz et al., J. Biol. Chem., 279 (8): 6235-6243 (2004)). La supresion de la actividad del catalizador disminuye la productividad global del catalizador (es decir, gramos totales de acido glicolico formados por gramo de catalizador), anadiendo un costo significativo al procedimiento global que puede hacer la produccion enzimatica economicamente no viable en comparacion con la smtesis qdmica. Como tales, se necesitan condiciones de reaccion que puedan ayudar a proteger la actividad enzimatica contra las impurezas indeseables que disminuyen la actividad del catalizador.

Se ha descrito un metodo de producir glicolonitrilo de alta pureza sometiendo formaldeddo a un tratamiento termico antes de la reaccion de smtesis del glicolonitrilo (solicitudes de patente US 2006/0160196 y US 2006/0247467; Ecuacion 3). Sin embargo, el glicolonitrilo puede disociarse reversiblemente en formaldeddo y cianuro de hidrogeno. Por tanto, sigue habiendo necesidad de proteger la actividad de nitrilasa contra los efectos indeseables tanto del formaldeddo como del cianuro de hidrogeno producidos por la disociacion de glicolonitrilo.

El documento WO 01/04278 ensena un metodo para conservar celulas microbianas inmovilizadas o no inmovilizadas que tienen actividad de nitrilasa y para estabilizar la actividad de nitrilasa de celulas microbianas no inmovilizadas.

Panova et al., Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1462-1467 describen un procedimiento quimioenzimatico para la produccion de acido glicolico de alta pureza usando un transformante de E. coli MG1655 inmovilizada en carragenina y reticulado con glutaraldeddo/polietilenamina que expresa el mutante de nitrilasa de A. facilis 72W.

La patente de EE.UU. 5.508.181 describe tambien dificultades similares relacionadas con la inactivacion rapida del catalizador enzimatico cuando se convierten compuestos de nitrilo en alfa-hidroxiacidos. Espedficamente, la patente de EE.UU. 5.508.181 establece que los compuestos de alfa-hidroxi-nitrilo se disocian parcialmente en los aldeddos correspondientes, de acuerdo con el equilibrio de disociacion. Se informo de estos aldeddos inactivaban la enzima en un corto periodo de tiempo uniendose a la protema, lo que hace que sea dificil obtener el a-hidroxi- acido o la a-hidroxi-amida en una alta concentracion con una alta productividad a partir de alfa-hidroxi-nitrilos (col. 2, lmeas 16-29). Como solucion para evitar la inactivacion de la enzima debido a la acumulacion de aldeddos, se anadieron a la mezcla de reaccion iones fosfato o hipofosfito. Similarmente, la patente de EE.UU. 5.326.702 describe el uso de iones sulfito, disulfito o ditionito para secuestrar el aldeddo y prevenir la inactivacion de la enzima, pero concluye que la concentracion de a-hidroxi-acido producido y acumulada incluso usando tales aditivos no es suficiente para la mayoria de los propositos comerciales.

Ademas la patente de EE.UU. 6.037.155 ensena que la baja acumulacion de producto a-hidroxi-acido esta relacionada con la inactivacion enzimatica en un corto periodo de tiempo, debido a la acumulacion del aldeddo disociado. Los inventores de dicha patente sugieren que la actividad enzimatica es inhibida en presencia de cianuro de hidrogeno (Asano et al., Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, pp. 1165-1174 (1982)) generado en la

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disociacion parcial del a-hidroxi-nitrilo en agua junto con el aldehndo o cetona correspondiente (Mowry, David T., Chemical Reviews, vol. 42, pp. 189-283 (1948)). Los inventores abordan el problema de la inactivacion enzimatica inducida por el aldehndo usando microorganismos cuya actividad enzimatica podna ser mejorada por adicion de una sustancia de cianuro a la mezcla de reaccion. La adicion de una sustancia de cianuro limitana la disociacion del a-hidroxi-nitrilo a aldehndo y cianuro de hidrogeno. Si bien esta tactica proporciona un beneficio para el sistema, solo se refiere a un aspecto asociado con la inactivacion enzimatica en la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico, porque, como se ha indicado anteriormente, se sabe que el glicolonitrilo se disocia reversiblemente en cianuro de hidrogeno y formaldehndo, y se sabe que ambos afectan negativamente a la actividad del catalizador enzimatico.

El documento WO 2006/069114 proporciona un procedimiento para producir acido glicolico a partir de formaldehndo y cianuro de hidrogeno. Mas espedficamente, el formaldehndo tratado termicamente y el cianuro de hidrogeno se hacen reaccionar para producir glicolonitrilo que tiene bajas concentraciones de impurezas. El glicolonitrilo se convierte posteriormente en una solucion acuosa de glicolato de amonio usando un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa derivado de Acidovorax facilis 72W (ATCC 57746).

Se ha desarrollado un procedimiento separado para proteger la actividad espedfica de un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa cuando convierte glicolonitrilo en acido glicolico en presencia de formaldehndo, donde se consiguieron mejoras significativas en la actividad y estabilidad del catalizador por adicion a la mezcla de reaccion de un protector de amina o por inmovilizacion del catalizador nitrilasa en o sobre una matriz que se compone de un protector de amina, por ejemplo PEI, polialilamina, PVOH/polivinilamina, etc. En ese sistema, se mejora la actividad espedfica del catalizador en presencia de formaldetndo.

El documento WO 2007/036235 se refiere a la inmovilizacion de enzimas, absorbiendo las enzimas, una amina polifuncional y un agente de reticulacion sobre un soporte poroso en partfculas en un aparato mezclador o en un aparato de lecho fluido.

La patente EP1233057 ensena la esterilizacion de una celula microbiana viable habiendo producido en ella una enzima industrialmente util, sin desactivar la enzima.

A pesar de que muchos de los medios anteriores mejoraron la productividad del catalizador nitrilasa para el acido glicolico, se sigue todavfa observando generalmente una disminucion significativa en la actividad enzimatica inicial de la nitrilasa microbiana inmovilizada en el uso de dicho catalizador en las reacciones para la hidrolisis de glicolonitrilo, por ejemplo, en reacciones por lotes consecutivas con reciclaje del catalizador, o en la etapa inicial de puesta en marcha de una reaccion continua en deposito agitado (abreviadamente en lo sucesivo CSTR por la expresion inglesa Continous Stirred Tank Reaction) o un reactor de columna de lecho fijo. El problema de la perdida significativa de actividad inicial de la nitrilasa durante la hidrolisis de glicolonitrilo fue abordado en parte por el pretratamiento del catalizador microbiano con glutaraldehndo antes de la inmovilizacion en carragenina, donde se retuvo un porcentaje significativamente mayor de la actividad espedfica inicial de la nitrilasa microbiana inmovilizada (pmoles de glicolonitrilo hidrolizado por minuto y por gramo de catalizador) durante la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico (como sal de amonio).

La patente de EE.UU. 4.288.552 describe (columna 1, lmeas 46-49, y columna 2, lmeas 50-55) que las enzimas sensibles al glutaraldehndo (tales como tiol-enzimas (por ejemplo, nitrilasa) y otras con un grupo SH en el sitio activo, o muy cerca de el, de la molecula de enzima) son inactivadas por agentes reactivos con tiol, tal como glutaraldehndo. Por lo tanto, no solo era impredecible que el pretratamiento de un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa con glutaraldehndo no diera como resultado una disminucion significativa de la actividad de nitrilasa microbiana antes de la inmovilizacion, pero sorprendentemente, el pretratamiento con glutaraldehndo se encontro que beneficiaba la actividad del catalizador enzimatico, particularmente cuando el catalizador enzimatico inmovilizado fue deshidratado, y posteriormente rehidratado antes de su uso para la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico. El procedimiento so de la presente invencion evita una perdida significativa de actividad durante las etapas de deshidratacion/rehidratacion, y da como resultado un catalizador enzimatico inmovilizado y rehidratado con una actividad inicial y posterior estabilidad de la actividad del catalizador enzimatico durante el posterior uso de la enzima inmovilizada rehidratada para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico. Este beneficio incorporado en el procedimiento descrito en la presente memoria que se proporciona para hacer frente a la necesidad de un procedimiento comercial, que incluye una etapa de deshidratacion, para producir un catalizador enzimatico que tiene actividad espedfica mejorada para la produccion de acido glicolico despues de la rehidratacion.

Por lo tanto, el problema a resolver es la necesidad de un procedimiento comercialmente viable para la produccion de un catalizador enzimatico que tenga actividad de nitrilasa para la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico con actividad espedfica mejorada. Mas espedficamente, se necesita un procedimiento comercialmente aceptable para el uso de un catalizador enzimatico que tenga actividad de nitrilasa para la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico que minimice la perdida de la actividad enzimatica resultante de la deshidratacion y la rehidratacion antes de su uso y como resultado de la inactivacion por impurezas o disociacion de los reaccionantes.

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Sumario de la invencion

Los presentes problemas han sido resueltos proporcionando un procedimiento para producir un catalizador enzimatico deshidratado que tiene actividad de nitrilasa con actividad espedfica mejorada, que comprende:

(a) producir por fermentacion un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa;

(b) pretratar dicho catalizador enzimatico con glutaraldehfdo;

(c) inactivar opcionalmente el glutaraldehfdo sin reaccionar con bisulfito despues del pretratamiento con glutaraldelddo;

(d) recuperar el catalizador enzimatico de (b) o (c) e inmovilizar dicho catalizador enzimatico en carragenina;

(e) reticular el catalizador enzimatico inmovilizado en carragenina resultante de (d) con glutaraldehfdo y polietilenimina; y

(f) deshidratar el catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado producido en la etapa (e);

en donde dicho catalizador enzimatico comprende un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57.

Tambien se describe un procedimiento para producir un catalizador enzimatico inmovilizado y deshidratado que tiene una mejor actividad espedfica despues de la rehidratacion y el uso de dicho catalizador enzimatico para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) producir por fermentacion un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa;

(b) pretratar dicho catalizador enzimatico con glutaraldeddo;

(c) inactivar opcionalmente el glutaraldeddo sin reaccionar con bisulfito despues del pretratamiento con glutaraldeddo;

(d) recuperar el catalizador enzimatico de (b) o (c) e inmovilizar dicho catalizador enzimatico en carragenina;

(e) reticular el catalizador enzimatico inmovilizado en carragenina resultante de (d) con glutaraldeddo y polietilenimina; y

(f) deshidratar el catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado producido en la etapa (e).

Un aspecto adicional de la invencion es rehidratar el catalizador inmovilizado y deshidratado de la etapa (f) anterior, en una solucion acuosa. Y ademas, poner en contacto dicho catalizador enzimatico rehidratado con glicolonitrilo en una solucion acuosa, con lo cual se produce acido glicolico. En un aspecto adicional, el acido glicolico se recupera de dicha solucion acuosa.

El catalizador enzimatico inmovilizado que se produce por el procedimiento de las etapas (a) a (f) anteriores, conserva un porcentaje significativamente mayor de su actividad espedfica inicial (pmoles de glicolonitrilo hidrolizado por minuto y por gramo de catalizador) cuando se compara con un catalizador enzimatico inmovilizado preparado sin pretratamiento con glutaraldeddo del catalizador enzimatico antes de la inmovilizacion, reticulacion, deshidratacion y rehidratacion, cuando se utiliza para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico (como la sal de amonio).

La solicitud proporciona el catalizador enzimatico deshidratado como un mejor catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa. El catalizador enzimatico pretratado con glutaraldeddo inmovilizado, reticulado y deshidratado de la invencion conserva al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90% de su actividad espedfica despues de la rehidratacion.

Breve descripcion de la figura, listado de secuencias y los depositos biologicos

La invencion puede ser entendida mas completamente a partir de la figura, lista de secuencias, los depositos biologicos, y la descripcion detallada que juntos forman esta solicitud.

Figura

La Figura 1, paneles A-G, es un alineamiento por el programa CLUSTAL W (version 1.83 utilizando parametros por defecto) de varias secuencias de nitrilasa. La secuencia distintiva del catalizador conservada que rodea al residuo de cistema del catalizador esta resaltada con sombreado gris. Estan subrayados los aminoacidos que

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representan la tnada catalttica (Glu48, Lysi30 y Cysi64; con la numeracion basada en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4).

Listado de secuencias

Las siguientes descripciones de secuencias y listados de secuencias adjuntas cumplen con las normas que rigen las descripciones de secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos en las solicitudes de patentes como se establece en el 37 C.F.R §1.821-1.825. Las descripciones de secuencias contienen el codigo de una letra para los caracteres de las secuencias de nucleotidos y los codigos de tres letras para los aminoacidos como se define de conformidad con las normas de la IUPAC-IYUB descritas en Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (N° 2): 345-373 (1984). Los sfmbolos y formatos utilizados para los datos de secuencias de nucleotidos y aminoacidos cumplen con las normas establecidas en 37 C.F.R §1.822.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoacidos del resto distintivo catalftico que abarca el residuo de cistema esencial de las enzimas nitrilasas (Formula 1).

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoacidos de un resto distintivo catalftico preferido que abarca el residuo de cistema esencial de las enzimas nitrilasas (Formula 2).

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleotidos de la secuencia codificadora de nitrilasa de Acidovorax facilis 72W que comprende un cambio en el codon de inicio de TTG a ATG para facilitar la expresion recombinante en E. coli.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746).

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Alcaligenes faecalis JM3 (GENBANK® BAA02684.1).

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous J1 (GENBANK® Q03217).

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous K22 (GENBANK® Q02068).

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Nocardia sp. C-14-1 (GENBANK® AAX18182.1).

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Bordetella bronchiseptica RB50 (GENBANK® NP_887662.1).

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Arabidopsis thaliana (GENBANK® AAB60275.1 y AAA19627.1).

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Synechococcus elongatus PCC 7942 (GENBANK® YP_399857.1).

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Synechococcus elongatus PCC 6301 (GENBANK® YP_171411.1).

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Synechocystis sp. PCC 6803 (GENBANK® NP_442646.1).

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Entomophila Pseudomonas L48 (GENBANK® YP_609048I. 1).

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Zymomonas moblis (GENBANK® YP_162942.1).

La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Bacillus sp. OxB-1 (GENBANK® BAA90460.1).

La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Comamonas testosteroni (GENBANK® AAA82085.1).

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Synechococcus sp. CC9605 (GENBANK® YP_381420.1).

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La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Pseudomonas fluorescens Pf-5 (GENBANK® YP_260015.1).

La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Nocardia farcinica IFM 10152 (GENBANK® YP_119480.1).

La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Alcaligenes faecalis 1650 (GENBANK® AAY06506.1).

La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (GENBANK® AAY35081.1).

La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Bradyrhizobium sp. BTAil (GENBANK® ZP_00859948.1).

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 (GENBANK® CAC88237).

La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoacidos de la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous ATCC™ 39484.

La SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201Q; Leu ^ Gln).

La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 26) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Gln) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201A; Leu ^ Ala).

La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 28) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Ala) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 30 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201C; Leu ^ Cys).

La SEQ ID NO: 31 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 30) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Cys) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 32 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201T; Leu ^ Thr).

La SEQ ID NO: 33 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 32) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Thr) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 34 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201 G; Leu ^ Gly).

La SEQ ID NO: 35 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 34) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Gly) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 36 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201 H; Leu ^ His).

La SEQ ID NO: 37 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 36) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ His) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

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La SEQ ID NO: 38 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201 K; Leu ^ Lys).

La SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 38) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Lys) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 40 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201 N; Leu ^ Asn).

La SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 40) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Asn) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (L201S; Leu ^ Ser).

La SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 42) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 201 (Leu201 ^ Ser) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (F168K; Phe ^ Lys).

La SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 44) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (Phe168 ^ Lys) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 46 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (F168M; Phe ^ Met).

La SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 46) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (Phe168 ^ Met) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 48 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (F168T; Phe ^ Thr).

La SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 48) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (Phe168 ^ Thr) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 50 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (F168V; Phe ^ Val).

La SEQ ID NO: 51 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 50) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (Phe168 ^ Val) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 52 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacidos en el residuo de la posicion 168 (T210A; Thr ^ Ala).

La SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 52) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 210 (Thr210 ^ Ala) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 54 es la secuencia de nucleotidos de una nitrilasa mutante de A. facilis 72W que comprende un cambio de codon que dio como resultado una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 168 (T210C; Thr ^ Cys).

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La SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante (SEQ ID NO: 54) que comprende una unica sustitucion de aminoacido en el residuo de la posicion 210 (Thr210 ^ Cys) de la nitrilasa de A. facilis 72W.

La SEQ ID NO: 56 es la secuencia de nucleotidos de la nitrilasa de A. facilis 72W expresada en la cepa i SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).

La SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoacidos deducida de la nitrilasa mutante de A. facilis 72W expresada en la cepa SS1001 de E. coli (ATCC PTA-1177).

Depositos biologicos

Los siguientes depositos biologicos se han hecho en los terminos del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento internacional del Deposito de microorganismos para los fines del procedimiento en materia de patentes:

Referencia para identificacion del Designacion internacional del Fecha del deposito

depositante deposito

Acidovorax facilis 72W ATCC 55746 8 de marzo 1996

E. coli SS1001 ATCC PTA-1177 11 de enero 2000

Como se usa en a presente memoria, "ATCC" se refiere al Organismo internacional para el deposito de microorganismos American Type Culture Collection domiciliado en ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. La "Designacion del deposito Internacional" es el numero de acceso al cultivo depositado en ATCC.

Los depositos mencionados se mantendran en el deposito internacional indicado durante al menos treinta (30) anos y se pondran a disposicion del publico tras la concesion de una patente que los describe. La disponibilidad de un deposito no constituye una licencia para practicar la presente invencion en derogacion de los derechos de patente concedidos por la accion gubernamental.

Descripcion detallada de la invencion

Se proporciona un procedimiento para mejorar la actividad espedfica de un catalizador enzimatico inmovilizado, reticulado y deshidratado, que tiene actividad de nitrilasa para la hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico despues de la rehidratacion. En particular, se proporciona un procedimiento para pretratar con glutaraldehudo un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa, inmovilizar las celulas pretratadas con glutaraldehudo y reticular qmmicamente las celulas inmovilizadas antes de la deshidratacion. Despues de la rehidratacion, el catalizador enzimatico pretratado con glutaraldehudo, inmovilizado y reticulado presenta mejor actividad espedfica de nitrilasa en comparacion con catalizadores enzimaticos inmovilizados y reticulados que tienen actividad de nitrilasa que estan deshidratados y rehidratados sin dicho tratamiento.

Definiciones:

En esta descripcion, se utilizan una serie de terminos y abreviaturas. Salvo que se especifique lo contrario se aplican las siguientes definiciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "que comprende" significa la presencia de las caractensticas, numeros enteros, etapas o componentes indicados a los que se refieren las reivindicaciones, pero que no excluye la presencia o adicion de una o mas de otras caractensticas, numeros enteros, etapas, componentes o sus grupos.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "aproximadamente" que modifica la cantidad de un ingrediente o reaccionante de la invencion empleado se refiere a la variacion en la cantidad numerica que puede ocurrir, por ejemplo, por los procedimientos tfpicos de medicion y manipulacion de lfquidos utilizados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; por errores involuntarios en estos procedimientos; por diferencias en la fabricacion, la fuente o la pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los metodos; y similares. El termino "aproximadamente" incluye tambien cantidades que difieren debido a las diferentes condiciones de equilibrio para una composicion que resulta de una mezcla inicial particular. Sean o no modificadas por el termino "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantidades. En una realizacion, el termino "aproximadamente" significa dentro de 10% del valor numerico descrito, preferiblemente dentro de 5% del valor numerico descrito.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "glicolonitrilo" se abrevia como "GLN" y es sinonimo de hidroxiacetonitrilo, 2-hidroxiacetonitrilo, hidroximetilnitrilo y todos los demas sinonimos del compuesto de numero de registro en el Chemical Abstracts Service (CAS) 107-16-4.

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Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "acido glicolico" se abrevia como "GLA" y es sinonimo de acido hidroxiacetico, acido hidroxietanoico y todos los demas sinonimos del compuesto de numero de registro en el CAS 79-14-1. El acido gNcolico producido por los presentes procedimientos puede estar en forma del acido carboxflico protonizado y/o la sal de amonio correspondiente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "glicolato de amonio" se abrevia "NH4GLA".

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "glicolamida" es la amida derivada de la reaccion de amomaco con acido glicolico y se refiere a todos los otros sinonimos de compuesto que tienen el numero de registro CAS 598-42-5.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "glicolido" se refiere al compuesto de numero de registro en el CAS 502-97-6.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "formaldehudo" se abrevia como "FA" y es sinonimo de aldehfdo formico, aldehfdo metflico, oxometano, y todos los demas sinonimos del compuesto de numero de registro en el CAS 50-00-0. El formaldehudo comercialmente disponible se compone tfpicamente de una mezcla de formaldehudo monomero ("formaldel'ndo libre") y diversos oligomeros de formaldehudo junto con algo de metanol (tfpicamente alrededor de 1% en peso a alrededor de 15% en peso).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "cianuro de hidrogeno" es sinonimo de acido prusico, acido cianhudrico y todos los demas sinonimos del compuesto de numero de registro en el CAS 200-821-6.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "glutaraldehudo" se abrevia "GA" y es sinonimo de pentanodial, 1,5-pentanodial, 1,5-pentanodiona, aldehfdo diglutarico, glutaral, glutardialdehfdo, dialdehfdo del acido glutarico, dialdehido glutarico y todos las demas sinonimos de los compuestos de numero de registro en el CAS 111-30-8.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "bisulfito" o "bisulfito de sodio" es sinonimo de sal sodica del acido sulfuroso, sal monosodica del acido sulfuroso, sulfito de sodio e hidrogeno, hidrogenosulfito de sodio, sulfito monosodico, sulfito acido de sodio, bisulfito de sodio, bisulfato de sodio (sic), hidrogenosulfito de sodio, sulfito de sodio (NaHSOa) y todos los otros sinonimos del compuesto de numero de registro en el CAS 7631-90-5.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "recuperacion" significa aislamiento, purificacion o transferencia del producto formado por el presente procedimiento. Los metodos para aislar y purificar el o los productos a partir de la mezcla de reaccion son bien conocidos en la tecnica y pueden incluir, aunque sin limitacion, precipitacion selectiva, cristalizacion, filtracion, extraccion con disolventes reactivos, intercambio ionico, electrodialisis, polimerizacion, destilacion, descomposicion termica, alcoholisis, cromatograffa en columna y sus combinaciones. En una realizacion, el termino "recuperacion" tambien puede incluir transferencia de la mezcla de productos (tfpicamente despues de filtrar el catalizador enzimatico) a otra reaccion para crear uno o mas productos. En una realizacion preferida, se utiliza intercambio ionico para recuperar el acido glicolico.

Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "catalizador enzimatico", "catalizador nitrilasa" o "catalizador de celulas microbianas" se refiere a un catalizador que se caracteriza por una actividad de nitrilasa (es decir, comprende al menos un polipeptido que tiene actividad de nitrilasa) para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico y amomaco. Una enzima nitrilasa convierte directamente un nitrilo (preferiblemente, un nitrilo alifatico) en el acido carboxflico correspondiente, sin formacion de la amida correspondiente como producto intermedio (vease la ecuacion 1). Las nitrilasas comparten varios dominios distintivos conservados conocidos en la tecnica, incluyendo un dominio distintivo en la presente invencion denominado "secuencia distintiva catalttica" o "secuencia distintiva". Esta region comprende un residuo de cistema esencial (por ejemplo, Cysi64 de la SEQ ID NO: 4). Como tales, los polipeptidos que tienen actividad de nitrilasa se pueden identificar por la existencia de la secuencia distintiva de dominio cataNtico (SEQ ID NO: 1). En una realizacion preferida, la secuencia distintiva es la SEQ ID NO: 2. El catalizador enzimatico puede estar en forma de celulas microbianas enteras o celulas microbianas permeabilizadas. Tal como se usa en la presente memoria, "catalizador enzimatico reciclado" se refiere a un catalizador enzimatico que se reutiliza como catalizador enzimatico en reacciones por lotes o continuas. Dependiendo de la etapa del procedimiento de produccion o utilizacion del catalizador enzimatico descrito en la presente memoria, el catalizador enzimatico puede ser pretratado con glutaraldelmdo, inmovilizado, reticulado y deshidratado o rehidratado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "Acidovora facilis" y "A. facilis" se usan intercambiablemente y se refieren a Acidovorax facilis 72W depositado en la American Type Culture Collection (una autoridad internacional de deposito), que tiene el numero de acceso 55746 ("ATCc 55746"). Los nitrilasas mutantes derivadas de A. facilis 72W caracterizadas por su mejor actividad de nitrilasa en convertir glicolonitrilo en acido glicolico han sido descritas previamente (vease la patente de EE.UU. 7.198.927 compartida con la sociedad titular de la presente). Ejemplos de estas nitrilasas mutantes derivadas de A. facilis 72W se proporcionan en las SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 y 55.

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Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "Escherichia col!' y "E. coli". se usan intercambiablemente. Varias cepas de E. coli adecuadas para la expresion recombinante se describen en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitacion, E. coli MG1655 que tiene el numero de deposito internacional ATCC 47076, E. coli FM5 que tiene el numero de deposito internacional ATCC 53911, E. coli W3110 que tiene el numero de deposito internacional ATCC 27325, E. coli MC4100 que tiene el numero de deposito internacional ATCC 35695 y E. coli W1485 que tiene el numero de deposito internacional ATCC 12435. En una realizacion las cepas de Escherichia coli adecuadas incluyen E. coli FM5 (ATCC 53911) y E. coli MG1655 (ATCC 47076).

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "E. coli SS1001" o "SS1001" se refieren a una cepa de E. coli transformada que expresa la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W que tiene el numero de acceso en ATCC PTA- 1177 (vease la patente de EE.UU. 6.870.038; incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia). La nitrilasa de E. coli SS1001 expresada recombinantemente (SEQ ID NO: 57) contiene 2 cambios de secuencia menores en comparacion con la secuencia de nitrilasa de 72W de tipo natural (SEQ ID NO: 4). El codon de iniciacion estaba cambiado de GTG a ATG para facilitar la expresion recombinante y se introdujo un artefacto durante la clonacion que dio como resultado un cambio de un unico aminoacido cerca del extremo C (Pro367 [CCA] ^ Ser [TCA]).

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "mezcla de reaccion de glicolonitrilo acuosa adecuada" y "mezcla de reaccion acuosa adecuada" se refieren a los materiales (incluyendo al menos un protector de amina) y agua en la que entran en contacto el glicolonitrilo y el catalizador enzimatico. Los componentes de la mezcla de reaccion acuosa adecuada se proporcionan en la presente memoria y los expertos en la tecnica apreciaran la gama de variaciones de componentes adecuada para este procedimiento.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "solucion de glicolato de amonio acuosa", "solucion acuosa que comprende glicolato de amonio" y "solucion acuosa de glicolato de amonio" se utilizaran para describir una solucion acuosa que comprende glicolato de amonio producido por la hidrolisis enzimatica de glicolonitrilo bajo condiciones tfpicas de reaccion enzimatica (es decir, un intervalo de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8). La solucion acuosa de glicolato de amonio comprende glicolato de amonio a una concentracion de al menos aproximadamente 0,1 por ciento en peso a aproximadamente 99% en peso de glicolato de amonio. En otra realizacion, la solucion acuosa de glicolato de amonio se compone de al menos aproximadamente 10% en peso a aproximadamente 75% en peso glicolato de amonio. En una realizacion adicional, la solucion acuosa de glicolato de amonio se compone de al menos aproximadamente 20% en peso a aproximadamente 50% en peso de glicolato de amonio. El pH de la solucion acuosa de glicolato de amonio puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente 5 a aproximadamente 10, mas preferiblemente 6 a aproximadamente 8. El pH se puede ajustar segun sea necesario antes de iniciar las etapas del procedimiento relacionadas con la recuperacion del acido glicolico (en forma de acido o sal) de la solucion acuosa de glicolato de amonio.

Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "productividad del catalizador" y "productividad del catalizador enzimatico" se refieren a la cantidad total de producto producida por gramo de peso de celulas secas de catalizador enzimatico. En la presente invencion, el catalizador enzimatico comprende una enzima nitrilasa (EC 3.5.5.7) y el producto formado es acido glicolico y/o glicolato de amonio (dependiendo del pH de la reaccion). En general, los procedimientos producidos que pretenden producir acido glicolico se realizan en condiciones esencialmente de pH neutro de modo que el acido glicolico producido este predominantemente en forma de la sal correspondiente del acido glicolico (es decir, glicolato de amonio). Generalmente, en reacciones por lotes con reciclaje del catalizador, la actividad del catalizador disminuye con cada reaccion de reciclaje (inactivacion enzimatica).

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "productividad volumetrica" se refiere a la produccion volumetrica de acido glicolico en la reaccion, expresada como gramos de acido glicolico producido por volumen de mezcla de reaccion por unidad de tiempo. Tfpicamente la productividad volumetrica se expresa como gramos de acido glicolico /L/h.

El termino "actividad de nitrilasa" o "actividad espedfica" se refiere a la actividad enzimatica por unidad de masa (por ejemplo, miligramos) de protema, peso de celulas secas o peso de perlas (catalizador inmovilizado) cuando se convierte glicolonitrilo en acido glicolico (o el glicolato de amonio correspondiente). Se midieron comparaciones de la actividad de nitrilasa proporcionales al peso de celulas secas o al peso de perlas.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "una unidad de actividad enzimatica" o "una unidad de actividad de nitrilasa" o "U" se define como la cantidad de actividad enzimatica requerida para la produccion de 1 |jmol de producto acido glicolico por minuto (U de GLA/g en peso de celulas secas o en peso de perlas) a una temperatura especificada (por ejemplo, 25°C).

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "actividad relativa de nitrilasa", "mejor actividad de nitrilasa", y "mejora relativa de la actividad de nitrilasa" se refieren a la actividad de nitrilasa expresada como un multiplo (o fraccion) de una actividad de nitrilasa de referencia (control). Las nitrilasas descritas en la presente

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memoria muestran una mejora significativa de la actividad de nitrilasa en relacion con la actividad de nitrilasa observada con la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W natural. Una "mejora significativa" de la actividad relativa de nitrilasa es una mejora de al menos 1,5 veces mayor que la actividad de nitrilasa en comparacion con la actividad de nitrilasa de un control en condiciones de reaccion identicas. En otra realizacion, la mejora es al menos 2 veces mayor que la actividad de nitrilasa en comparacion con la actividad de nitrilasa del control en condiciones de reaccion identicas. En una realizacion adicional, la mejora es al menos 4 veces mayor que la actividad de nitrilasa en comparacion con la actividad de nitrilasa del control en condiciones de reaccion identicas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "velocidad de reaccion inicial" es una medicion de la velocidad de conversion de glicolonitrilo en acido glicolico en las condiciones de reaccion indicadas, donde la medicion de la velocidad de reaccion comienza tras la adicion inicial de glicolonitrilo a la mezcla de reaccion, y donde la velocidad de reaccion se mide durante un penodo de tiempo en el que la concentracion de glicolonitrilo se mantiene por encima de aproximadamente 50 milimolar (mM) durante el curso de la reaccion. La velocidad de reaccion se mide como el cambio en la concentracion de acido glicolico producido por unidad de tiempo (por ejemplo, en moles de acido glicolico/L/min o mM de acido glicolico/hora).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "mejora de la retencion de la actividad espedfica inicial" se refiere a una comparacion de un catalizador enzimatico pretratado con glutaraldelddo, inmovilizado y reticulado con un catalizador enzimatico no pretratado con glutaraldelddo, inmovilizado y reticulado, teniendo ambos actividad de nitrilasa, durante la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico en las condiciones de reaccion establecidas despues de la deshidratacion y rehidratacion, medida como micromoles de acido glicolico producido por minuto y por g en peso de celulas secas de catalizador enzimatico, o micromoles de acido glicolico producido por minuto y por g de catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado, en donde la actividad espedfica como se mide en una primera reaccion o reaccion "inicial" despues de la rehidratacion, es retenida en mayor medida por el catalizador enzimatico pretratado con glutaraldeddo, inmovilizado y reticulado que por el catalizador enzimatico no pretratado con glutaraldeddo, inmovilizado y reticulado, para una o mas reacciones posteriores. La mejora mas notable, como se describe en la presente memoria, es para la cantidad de actividad retenida para la reaccion inmediatamente despues de una reaccion por lotes inicial, medida en una o mas reacciones por lotes subsiguientes con reciclaje del catalizador. Una segunda mejora notable, como se describe en la presente memoria, es para la cantidad de actividad retenida durante el curso de la realizacion de la reaccion en un reactor de deposito continuamente agitado (CSTR), o en un reactor de flujo de piston en lecho fijo, o en un reactor de lecho fluidizado o de lecho semi-fluidizado, despues de la produccion de al menos 40 g de acido glicolico por gramo en peso de celulas secas de catalizador enzimatico pretratado con glutaraldeddo, inmovilizado y reticulado que ha sido deshidratado y rehidratado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "organismo recombinante", "hospedante transformado", "transformante", "organismo transgenico", y "hospedante microbiano transformado" se refieren a un organismo hospedante que ha sido transformado con DNA heterologo o extrano. Los organismos recombinantes de la presente invencion expresan secuencias codificadoras extranas o genes que codifican la enzima nitrilasa activa. "Transformacion" se refiere a la transferencia de un fragmento de DNA al organismo hospedante. El fragmento de DNA transferido puede ser incorporado cromosomica o extracromosomicamente (es decir, a traves de un vector) en el organismo hospedante. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "casete de transformacion" se refiere a un fragmento espedfico de DNA que contiene un conjunto de elementos geneticos convenientemente dispuestos para su insercion en una celula hospedante, por lo general como parte de un plasmido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "casete de expresion" se refiere a un fragmento espedfico de DNA que contiene un conjunto de elementos geneticos convenientemente dispuestos para su insercion en una celula hospedante, por lo general como parte de un plasmido que tambien permite una mayor expresion genica en el hospedante.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "fragmento de acido nucleico" y "molecula de acido nucleico" se refieren a una molecula de DNA que puede codificar un gen completo, la secuencia codificadora, y/o secuencias reguladoras que preceden (5', aguas arriba) o siguen (3', aguas abajo) a la secuencia codificadora. En un aspecto, las presentes moleculas de acidos nucleicos codifican polipeptidos que tienen actividad de nitrilasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "gen" se refiere a una molecula de acido nucleico que expresa una protema espedfica. Como se usa en la presente memoria, puede o no puede incluir secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificadoras) y que siguen (secuencias 3' no codificadoras) a la secuencia codificadora. "Gen quimerico" se refiere a cualquier gen que no es un gen natural, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimerico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Gen endogeno" se refiere a un gen natural en su localizacion natural en el genoma de un organismo. Un gen "extrano" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedante, pero que se introduce en el organismo hospedante por transferencia de genes. Los genes extranos pueden comprender genes naturales insertados en un organismo no natural o genes

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quimericos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformacion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "secuencia codificadora" se refiere a una secuencia de DNA que codifica una secuencia espedfica de aminoacidos. Tal como se usa en la presente memoria, "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a secuencias de nucleotidos localizadas aguas arriba (secuencias no codificadoras en 5'), dentro de, o aguas abajo (secuencias no codificadoras en 3') de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripcion, procesamiento o estabilidad del RNA, o la traduccion de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias situadas antes de las secuencias que se traducen, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilacion, sitios de procesamiento del RNA, sitios de union a efectores, y estructuras de tallo-bucle.

"Promotor" se refiere a una secuencia de DNA capaz de controlar la expresion de una secuencia codificadora o RNA funcional. En general, una secuencia codificadora esta situada en 3' respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen natural o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de DNA sinteticos. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayona de tipos de celulas, en la mayona de veces, o bajo la mayona de condiciones ambientales se denominan comunmente "promotores constitutivos". Los promotores que hacen que un gen se exprese solo en presencia de un compuesto particular o condicion ambiental se denominan comunmente "promotores inducibles". Dado que en la mayona de los casos los lfmites exactos de las secuencias reguladoras no han sido completamente definidos, los fragmentos de DNA de diferentes longitudes pueden tener identica actividad promotora.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "unida operativamente" se refiere a la asociacion de secuencias de acido nucleico con una unica molecula de acido nucleico de modo que la funcion de una secuencia se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a una secuencia codificadora cuando es capaz de afectar a la expresion de esa secuencia codificadora (es decir, que la secuencia codificadora esta bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras pueden unirse operativamente a las secuencias reguladoras en orientacion con sentido o antisentido.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "secuencias no codificadoras en 3'" se refiere a secuencias de DNA localizadas aguas abajo de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de la poliadenilacion (normalmente limitadas a eucariotas) y otras secuencias que codifican senales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del mRNA o a la expresion genica. La senal de poliadenilacion (normalmente limitada a los eucariotas) se caracteriza normalmente por afectar a la adicion de tramos de poli(acido ademlico) al extremo 3' del precursor del mRNA.

Los expertos en la tecnica conocen bien el "sesgo de codones" exhibido por una celula hospedante espedfica en el uso de codones de nucleotidos para especificar un aminoacido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para mejorar la expresion en una celula hospedante, es deseable disenar el gen de modo que su uso de codones refleje el sesgo de codones preferido por la celula hospedante. Un estudio de genes derivados de la celula hospedante cuando esta disponible la informacion de la secuencia puede determinar su sesgo de codones. La optimizacion de codones es bien conocida en la tecnica y se ha descrito para varios sistemas, incluyendo, aunque sin limitacion, levadura (Outchkourov et al., Protein Expr. Purif. 24 (1): 18-24 (2002)) y E. coli (Feng et al., Biochemistry, 39 (50):15399-15409 (2000)).

Catalizadores enzimaticos que tienen actividad de nitrilasa.

Todas las nitrilasas (EC 3.5.5.7) comparten una triada catalftica conservada (Glu, Lys y Cys) (Chauhan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 61:118-122 (2003); Pace, H. and Brenner, C., Genome Biol. [archivo digital en Internet] 2(1):reviews 0001.1-0001.9 (2001)). Todas las nitrilasas conocidas tienen una cistema nucleofila en el sitio de la actividad enzimatica (Cowan et al., Extremophiles, 2:207-216 (1998); Pace, H. and Brenner, C., supra; y Chauhan et al., supra) y todas son susceptibles de inactivacion por reactivos de tiol (concentraciones 1,0 mM de cloruro de cobre, nitrato de plata, acetato mercurico o cloruro ferrico produdan cada uno disminuciones importantes en la actividad de la enzima nitrilasa de A. facilis 72W). Los residuos de cistema son tambien capaces de ser oxidados irreversiblemente a acido sulfmicos, dando como resultado una perdida de la actividad enzimatica. A pesar de la sensibilidad de las enzimas nitrilasas a diversos mecanismos inactivantes, las celulas de A. facilis 72W inmovilizadas son robustas, y capaces de retener mucha de su actividad de nitrilasa despues de numerosas reacciones de reciclaje (Patentes de EE.UU. 6.870.038; 7.148.051 y 7.198.927; y Chauhan et al., supra). Los catalizadores nitrilasas derivados de la nitrilasa de A. facilis 72W han demostrado tambien catalizar la conversion de a-hidroxinitrilos (es decir, glicolonitrilos) a acidos a-hidroxicarboxflicos (es decir, acido glicolico) (veanse las patentes de EE.UU. 6.383.786; 6.416.980 y 7.198.927).

Se han descrito comparaciones de secuencias de la nitrilasa de A. facilis 72W con otras nitrilasas bacterianas (Patente de EE.UU. 6.870.038; Chauhan et al., supra). La nitrilasa de 72W tiene diversos dominios distintivos conservados incluyendo una region de 16 aminoacidos cerca del extremo amino (residuos de aminoacidos 40-55

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de la SEQ ID NO: 4) y una region catalttica de 12 aminoacidos (residuos de aminoacidos 160-171 de la SEQ ID NO: 4) que contiene el residuo de cistema esencial. Este residuo de cistema esencial (Cysi64 de la SEQ ID NO: 4), junto con el acido glutamico conservado (Glu48 de la SEQ ID NO:4) y los residuos de lisina (Lysi30 de la SEQ ID NO:4), forman el resto de la triada catalttica encontrado en todas las nitrilasas (Pace, H., y Brenner, C., supra).

Las regiones que rodean cada uno de los residuos de la triada catalttica estan altamente conservadas, especialmente la region que rodea al residuo catalttico de cistema. El residuo catalttico de cistema esencial esta localizado en una region altamente conservada denominada el "resto distintivo catalttico" o "resto distintivo". Por tanto, el procedimiento descrito en la presente memoria es util para proteger la actividad enzimatica de cualquier nitrilasa que contenga el resto distintivo catalttico definido por la Formula 1 (los residuos de aminoacidos en letras negritas indican los residuos de aminoacidos estrictamente conservados, los residuos de aminoacidos en letra cursiva son los que presentan minima variabilidad [es decir, una variacion minima de 3 o menos residuos de aminoacidos], el residuo catalttico de cistema esta subrayado):

Formula 1 (SEQ ID NO: 1). Glv-Xaa?-Xaa?-Xaa3-Cvs-Trp-Glu-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaas

en donde

Xaa1 = Ala o Gly;

Xaa2 = Leu, Val o Ala;

Xaa3 = Ala, Asn, Ile, Cys, Val o Gln;

Xaa4 = His o Asn;

Xaa5 = Leu, Tyr, Phe, Ala, Met, Lys, Val, Thr o Arg;

Xaa6 = Asn, Gln, Met, Leu o Ser;

Xaa7 = Pro o Thr; y Xaa8 = Leu o Val.

En una realizacion preferida, el resto distintivo de nitrilasa de Formula 1 es Xaa1 = Ala o Gly; Xaa2 = Leu; Xaa3 = Ala, Asn, Ile, Cys, Val o Gln; Xaa4 = His; Xaa5 = Leu, Tyr, Phe, Ala, Met, Lys, Val, Thr o Arg; Xaa6 = Ser, Gln, Asn o Met; Xaa7 = Pro; y Xaa8 = Leu; dando como resultado el resto distintivo catalttico representado por la siguiente formula:

Gly-Xaa-i-Leu-Xaa3-Cys-Trp-Glu-His-Xaa5-Xaa6-Pro-Leu (SEQ ID NO: 2)

Ejemplos de nitrilasas, que incluyen las secuencias y la posicion en la secuencia de resto distintivo catalttico correspondiente se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1. Region de cistema catalttica conservada - Restos distintivos cataltticos

Fuente de nitrilasa

Numero de acceso en GenBank® Secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: Secuencia del resto distintivo (posiciones de los residuos de aminoacidos)

Acidovorax facilis 72W

ABD98457.1 4 GGLNCWEHFQPL (160-171)

Alcaligenes faecalis JM3

BAA02684.1 5 GALCCWEHLSPL (159-170)

Rhodococcus rhodochrous J1

Q03217 6 GALNCWEHFQTL (161-172)

Rhodococcus rhodochrous K22

Q02068 7 GGLNCWEHFQPL (166-177)

Nocardia sp. C-14-1

AAX18182.1 8 GGLNCWEHFQPL (154-165)

Bordetella bronchiseptica RB50

NP_887662.1 9 GAWCWENYMPL (161-172)

Arabidopsis thaliana

AAB60275.1 AAA19627.1 10 GAAICWENRMPL (175-186)

Synechococcus elongatus PCC 7942

YP_399857.1 11 GALACWEHYNPL (157-168)

Synechococcus elongatus PCC 6301

YP_171411.1 12 GALACWEHYNPL (157-168)

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Fuente de nitrilasa

Numero de acceso en GenBank® Secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: Secuencia del resto distintivo (posiciones de los residuos de aminoacidos)

Synechocystis sp. PCC 6803

NP_442646.1 13 GALACWEHYNPL (165-176)

Pseudomonas entomophila L48

YP_6090481.1 14 GAAVCWENYMPL (161-172)

Zymomonas moblis

YP_162942.1 15 GAAICWENYMPV (161-172)

Bacillus sp. OxB-1

BAA90460.1 16 GGLQCWEHFLPL (158-169)

Comamonas testosteroni

AAA82085.1 17 GGLQCWEHALPL (159-170)

Synechococcus sp. CC9605

YP_381420.1 18 GALACWEHYNPL (156-167)

Pseudomonas fluorescens Pf-5

YP_260015.1 19 GAVICWENMMPL (161-172)

Nocardia farcinica IFM 10152

YP_119480.1 20 GALCCWEHLQPL (159-170)

Alcaligenes faecalis 1650

AAY06506.1 21 GALCCWEHLSPL (159-170)

Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

AAY35081.1 22 GALCCWEHLQPL (157-168)

Bradyrhizobium sp. BTAil

ZP_00859948.1 23 GALCCWEHLQPL (163-174)

Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216

CAC88237 24 GALNCWEHFQTL (161-172)

Rhodococcus rhodochrous ATCC 39484™

N/A 25 GALNCWEHFQTL (161-172)

Tambien se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipeptido que tiene actividad de nitrilasa, aislado de un genero seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax, Rhodococcus, Nocardia, Bacillus y Alcaligenes. En otro ejamplo, el catalizador nitrilasa comprende un polipeptido que tiene actividad de nitrilasa aislado de un genero seleccionado del grupo que consiste en Acidovorax y Rhodococcus.

En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad de nitrilasa procede de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) o un polipeptido (que tiene actividad de nitrilasa) que es sustancialmente similar a la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (SEQ ID NO: 4) o la enzima derivada de A. facilis 72W representada por la SEQ ID NO: 51.

En una realizacion, el catalizador nitrilasa es una celula microbiana hospedante transformada para expresar al menos un polipeptido que tiene actividad de nitrilasa. En una realizacion, la celula hospedante transformada se selecciona del grupo que consiste en: Comamonas sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Rhodococcus sp., Azotobacter sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Clostridium sp., Klebsiella sp., Salmonella sp., Lactobacillus sp., Aspergillus sp., Saccharomyces sp., Yarrowia sp., Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Candida sp., Hansenula sp., Dunaliella sp., Debaryomyces sp., Mucor sp., Torulopsis sp., Methylobacteria sp., Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp., y Streptomyces sp. En una realizacion preferida, la celula microbiana hospedante se selecciona del grupo que consiste en Bacillus sp., Pseudomonas sp. y Escherichia sp. En una realizacion preferida, el catalizador es una celula hospedante de Escherichia coli que expresa recombinantemente uno o mas de los polipeptidos que tienen actividad de nitrilasa.

Tambien se describe en la presente memoria el catalizador nitrilasa que comprende un polipeptido que tiene actividad de nitrilasa, en donde dicho polipeptido que tiene actividad de nitrilasa tiene al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 51, preferiblemente al menos 70% de identidad con la SEQ ID NO: 51, incluso mas preferiblemente al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO: 51, e incluso mas preferiblemente al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 51, y lo mas preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 51.

En la presente memoria se describen ejemplos de trabajo de diversos catalizadores que tienen actividad de nitrilasa derivados de diversas fuentes, incluyendo un catalizador derivado de nitrilasa de A. facilis 72W. Se han descrito en la tecnica diversos mutantes derivados de la enzima nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (Patentes de EE.UU. 7.148.051 y. 7.198.927).

En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En

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otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad de nitrilasa se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 24, 25 y 51. En otra realizacion, el catalizador nitrilasa comprende el polipeptido de la SEQ ID NO SEQ ID NO: 51.

Nitrilasa de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)

La nitrilasa de A. facilis 72W (EC 3.5.5.1) es un catalizador robusto para la produccion de acidos carboxflicos a partir de nitrilos alifaticos o aromaticos (documento WO 01/75077; Patente de EE.UU 6.870.038; y Chauhan et al., supra). Tambien se ha demostrado que cataliza la conversion de a-hidroxinitrilos (es decir, glicolonitrilo) en acidos a-hidroxicarboxflicos (es decir, acido glicolico) (veanse las patentes de EE. UU. 6.383.786 y 6.416.980). Sin embargo, los catalizadores nitrilasa que tengan mejor actividad y/o estabilidad de nitrilasa (con relacion a la nitrilasa de A. facilis 72W) cuando conviertan glicolonitrilo en acido glicolico reduciran el coste de fabricacion del acido glicolico. Por tanto, un metodo para producir acido glicolico que use un mejor catalizador de nitrilasa es util para reducir el coste de fabricacion del acido glicolico, sin embargo la nitrilasa de A. facilis 72W es un catalizador enzimatico para los fines de los procedimientos de la presente invencion, asf como dichas mejores nitrilasas descritas con detalle anteriormente.

Produccion industrial del catalizador microbiano

Cuando se desea la produccion comercial de los catalizadores enzimaticos descritos en la presente memoria, se puede utilizar una variedad de metodologfas de cultivo. Se pueden realizar operaciones de fermentacion de modos por lotes, por lotes alimentados o continuo, siendo dichos metodos bien conocidos en la tecnica (Thomas D. Brock en Biotecnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, (1989); Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36(3): 227-234 (1992)).

Un metodo de cultivo por lotes clasico es un sistema cerrado donde la composicion de los medios se ajusta al comienzo del cultivo y no esta sometida a alteraciones artificiales durante el procedimiento de cultivo. Por tanto, al comienzo del procedimiento de cultivo el medio se inocula con el organismo u organismos deseados y se deja que tenga lugar el crecimiento o la actividad metabolica no anadiendo nada al sistema. Tfpicamente, sin embargo, un cultivo "por lotes" es por lote con respecto a la adicion de la fuente de carbono y con frecuencia se realizan intentos de controlar factores tales como el pH y la concentracion de oxfgeno. En los sistemas por lotes, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en el que se termina el cultivo. Dentro de los cultivos por lotes, las celulas se moderan desde de una fase logantmica estatica hasta una fase logantmica de alto crecimiento y finalmente hasta una fase estacionaria donde disminuye o se detiene la velocidad de crecimiento. Si no se tratan, las celulas en la fase estacionaria finalmente moriran. En algunos sistemas las celulas en la fase logantmica son con frecuencia responsables de la mayor parte de la produccion del producto final o producto intermedio. En otros sistemas se puede obtener una produccion en fase estacionaria o post- exponencial.

Una variacion en el sistema por lotes estandar es el sistema por lotes alimentado. Los procedimientos de cultivo por lotes alimentados son tambien adecuados en la presente invencion y comprenden un sistema por lotes tfpico con la excepcion de que el sustrato se anade en incrementos a medida que progresa el cultivo. Los sistemas por lotes alimentados son utiles cuando la represion de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las celulas y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. La medicion de la concentracion real del sustrato en los sistemas por lotes alimentados es diffcil y por lo tanto se estima basandose en los cambios de factores medibles, tales como pH, oxfgeno disuelto y presion parcial de los gases residuales, tales como CO2. Los metodos de cultivo por lotes y por lotes alimentados son usuales y bien conocidos en la tecnica y se pueden encontrar ejemplos en Brock (supra) y Deshpande (supra).

La produccion comercial de los presentes catalizadores enzimaticos que tienen actividad de nitrilasa tambien se puede realizar por un cultivo continuo. Los cultivos continuos son un sistema abierto en el que se anade continuamente a un biorreactor un medio de cultivo definido y se elimina simultaneamente durante el procedimiento una cantidad igual de medio acondicionado. Los cultivos continuos mantienen generalmente las celulas a una densidad en fase lfquida alta y constante donde las celulas se desarrollan principalmente en fase logantmica. Alternativamente, el cultivo continuo se puede realizar con celulas inmovilizadas a las que se anaden continuamente carbono y nutrientes y se eliminan continuamente de la masa celular productos valiosos, subproductos o productos residuales. La inmovilizacion celular se puede realizar utilizando una amplia gama de soportes solidos compuestos de materiales naturales y/o sinteticos.

El cultivo continuo o semicontinuo permite la modulacion de un factor o de cualquier numero de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentracion celular final. Por ejemplo, un metodo mantendra un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrogeno, en una tasa fija y permitira que se moderen todos los demas parametros. En otros sistemas, se pueden alterar continuamente una serie de factores que afecten al crecimiento mientras se mantenga constante la concentracion celular, medida por la turbidez del medio. Los sistemas continuos intentan mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y, por tanto, la

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perdida de celulas debido a los medios que se retiran debe equilibrarse con la tasa de crecimiento celular en el cultivo. Los metodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento en los procedimientos de cultivo continuos, asf como las tecnicas para maximizar la velocidad de formacion de celulas, son bien conocidos en la tecnica de la microbiologfa industrial y una variedad de metodos han sido detallados por Brock (supra).

Los medios de fermentacion en la presente invencion deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, aunque sin limitacion, monosacaridos, tales como glucosa y fructosa, disacaridos, tales como lactosa o sacarosa, polisacaridos, tales como almidon o celulosa, o sus mezclas, y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como lfquido filtrado de suero de queso, licor de mafz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Por tanto, se considera que la fuente de carbono utilizada en la presente invencion puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contengan carbono y solamente estara limitada por la eleccion del organismo.

Pretratamiento con glutaraldetndo del catalizador enzimatico antes de la inmovilizacion

El tratamiento con glutaraldetndo de un cultivo de fermentacion del catalizador enzimatico puede ser una manera conveniente de matar los microbios en el cultivo, evitando asf problemas de contencion y seguridad en la manipulacion, la conservacion y el transporte asociados con los cultivos recombinantes vivos. Se ha descubierto ahora que el pretratamiento con glutaraldetndo, o el pretratamiento con glutaraldetndo seguido de tratamiento con bisulfito, puede preservar la actividad de nitrilasa en celulas en suspension y en una forma inmovilizada.

La preservacion de la actividad de nitrilasa por pretratamiento con glutaraldetndo de un catalizador enzimatico se ve afectada por el tiempo, la temperatura, la concentracion de glutaraldetndo, el pH y la concentracion de productos inhibidores como amoniaco y otras aminas (por ejemplo, aminoacidos y peptidos) en los medios que interaction con el glutaraldetndo. Un metodo de pretratamiento con glutaraldetndo preferido trata las celulas procedentes de la fermentacion de alta densidad (100-150 DO550) con 5-10% en peso de glutaraldetndo en agua que es suministrado preferiblemente como una mezcla adecuada de 50 mg a 500 mg de glutaraldetndo/L-min, mas preferiblemente suministrado como una mezcla adecuada de 50 mg a 200 mg de glutaraldetndo/L-min, lo mas preferiblemente suministrado como una mezcla adecuada de 50 mg a 100 mg de glutaraldetndo/L-min, dando como resultado una concentracion final de aproximadamente 3 g a aproximadamente 5 g de glutaraldetndo/L (aproximadamente 0,025 g a aproximadamente 0,042 g de glutaraldetndo por DO550), mas preferiblemente de aproximadamente 3,6 g a aproximadamente 5 g de glutaraldetndo/L (aproximadamente 0,030 g a aproximadamente 0,042 g de glutaraldetndo por DO550). El cultivo pretratado con glutaraldetndo se puede mantener en el fermentador durante aproximadamente 1 a 5 horas. A continuacion se anade opcionalmente una solucion al 10% en peso de bisulfito de sodio en agua a 1 g/L para inactivar el glutaraldetndo residual.

El pH preferido para el pretratamiento con glutaraldetndo del catalizador enzimatico en el caldo de fermentacion o en suspension celular es desde pH 5,0 hasta 9,0, mas preferiblemente desde pH 5,0 hasta 8,0, incluso mas preferiblemente desde pH 5,0 hasta 7,0, todavfa mas preferiblemente desde pH 5,0 hasta 6,0, y lo mas preferiblemente desde pH 5,0 hasta 5,5. La concentracion de glutaraldetndo residual despues del pretratamiento con glutaraldetndo es tfpicamente baja, en el intervalo de 10 - 200 ppm, y puede ser inactivado como se ha indicado anteriormente, con la adicion de bisulfito de sodio hasta una concentracion final de aproximadamente 1 g/L. Se encontro que el pretratamiento con glutaraldetndo y bisulfito no tema ningun efecto perjudicial significativo sobre la actividad de nitrilasa. La suspension celular pretratada con glutaraldetndo o glutaraldetndo/bisulfito se enfna opcionalmente hasta 5 - 10°C, y se lava opcionalmente (por concentracion y re-dilucion de la suspension celular o del caldo de fermentacion) con agua o un tampon de conservacion adecuado para eliminar el bisulfito residual y el glutaraldetndo sin reaccionar.

Inmovilizacion del catalizador enzimatico pretratado con glutaraldetndo y reticulacion qrnmica

Los metodos para la inmovilizacion de catalizadores enzimaticos han sido documentados ampliamente y son bien conocidos por los expertos en la tecnica (Methods in Biotecnology, Vol. 1: Immobilization of enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997). Tambien se ha documentado previamente la inmovilizacion del catalizador nitrilasa de A. facilis 72W (patente de EE.UU. 6.870.038).

Ademas, existe un metodo para la inmovilizacion en carragenina y posterior reticulacion con glutaraldetndo/polietilenimina del catalizador enzimatico inmovilizado (y como se ha descrito en la patente de EE.UU 6.870.038 y como se ha descrito con detalle en la patente de EE.Uu. 6.551.804 B), sin embargo, un experto en la tecnica reconocena y aplicana facilmente variaciones para realizar la inmovilizacion y reticulacion.

Dichas variaciones estan contempladas en la presente memoria y estan dentro del alcance del presente procedimiento. Ademas, las cantidades o concentraciones de los componentes utilizados para la inmovilizacion y reticulacion qrnmica variaran dependiendo de la cantidad y tipo de catalizador enzimatico y la produccion por fermentacion del catalizador enzimatico. Un experto en la tecnica reconocena estos factores y ajustana en consecuencia los procedimientos de inmovilizacion y reticulacion qrnmica. Con relacion a la reticulacion con glutaraldetndo y polietilenimina, la patente de EE.UU. 6.551.804 (supra), describe los procesos y procedimientos

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para reticular qmmicamente celulas inmovilizadas con alginato. Dicha descripcion se aplica tambien en la presente invencion para celulas inmovilizadas en carragenina.

Deshidratacion/rehidratacion del catalizador enzimatico microbiano inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehndo/polietilenimina

Como se indico anteriormente, un problema particular relacionado con el uso de un catalizador nitrilasa microbiano abordado en la presente solicitud es la conservacion y transporte del catalizador enzimatico. Aspectos de interes para la conservacion y transporte de los catalizadores enzimaticos que tienen actividad de nitrilasa incluyen dificultades con el volumen del material y la inactivacion de la actividad enzimatica del material con el tiempo. Cuando se inmovilizo en carragenina y posteriormente se reticulo con glutaraldehndo y polietilenimina, el catalizador nitrilasa microbiano inmovilizado resultante contema aproximadamente 90% en peso de agua, y el catalizador se conservo tfpicamente a 5°C en un peso equivalente de tampon acuoso. Una reduccion en la cantidad de agua presente en el catalizador de nitrilasa microbiano inmovilizado, y la eliminacion del tampon acuoso utilizado para conservar el catalizador, disminuina el volumen del catalizador y del tampon asociado necesario para ser transportado y conservado antes de su uso, y mejorana aun mas significativamente la econoirna de fabricacion del acido glicolico.

La deshidratacion del catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado con glutaraldehndo/polietilenimina se puede realizar por cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica, incluyendo, aunque sin limitacion, deshidratacion al aire, deshidratacion en una corriente de un gas inerte, deshidratacion en una estufa a vacfo con o sin purga con un gas inerte (por ejemplo, nitrogeno o argon) o liofilizacion (secado por congelacion). La temperatura para la deshidratacion puede variar preferiblemente desde aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 60°C, mas preferiblemente desde aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 50°C y lo mas preferiblemente desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 40°C. Las perlas deshidratadas resultantes pueden perder hasta aproximadamente 91% de su peso humedo inicial (cuando se comienza con perlas constituidas por aproximadamente 5% en peso de celulas secas de celulas que contiene nitrilasa microbianas). El catalizador celular inmovilizado y deshidratado puede ser conservado al aire o bajo una atmosfera inerte, y preferiblemente a temperaturas en el intervalo de - 25°C a 35°C, preferiblemente de 5°C a 25°C. El catalizador celular inmovilizado y deshidratado puede ser rehidratado colocando las perlas deshidratados en agua o en un tampon acuoso adecuado, por ejemplo, una solucion de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3), siendo la temperatura de rehidratacion preferiblemente de aproximadamente 5°C a aproximadamente 35°C. Las perlas rehidratadas resultantes se pueden usar directamente en una reaccion para la produccion de acido glicolico a partir de glicolonitrilo, o conservarse en el lfquido de rehidratacion desde aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 35°C hasta su uso.

Hidrolisis de glicolonitrilo a acido glicolico usando un catalizador nitrilasa

La conversion enzimatica de glicolonitrilo en acido glicolico (en forma de acido y/o de la sal de amonio correspondiente) se puede realizar poniendo en contacto un catalizador enzimatico, un catalizador enzimatico inmovilizado o un catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado que tiene actividad de nitrilasa en condiciones de reaccion adecuadas, como se describe a continuacion (es decir, en una mezcla de reaccion acuosa a determinados intervalo de pH, temperaturas, concentraciones, etc.). En una realizacion, las celulas microbianas recombinantes enteras se pretratan con glutaraldehndo, se inmovilizan en carragenina, se reticulan, se deshidratan y despues de rehidratacion el catalizador enzimatico resultante se utiliza directamente para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico, o las celulas inmovilizadas se pueden mantener separadas de la mezcla de reaccion a granel usando cartuchos de membrana de fibra hueca o membranas de ultrafiltracion. En una segunda realizacion, las celulas microbianas recombinantes enteras se inmovilizan en gel de poliacrilamida, y el catalizador enzimatico resultante se utiliza directamente para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico.

La concentracion de catalizador enzimatico en la mezcla de reaccion acuosa depende de la actividad espedfica del catalizador enzimatico y se elige para obtener la velocidad de reaccion deseada. El peso de celulas humedas de las celulas microbianas utilizadas como catalizador en reacciones de hidrolisis vana tfpicamente desde 0,001 gramos hasta 0,250 gramos de celulas humedas por mL de volumen de reaccion total, preferiblemente desde 0,002 gramos hasta 0,050 gramos de celulas humedas por mL. El % en peso indicado de celulas humedas por volumen de volumen de reaccion total puede estar presente en la mezcla de reaccion en forma de un catalizador enzimatico inmovilizado preparado como se ha descrito anteriormente (supra), donde el peso de celulas humedas como porcentaje del peso total del catalizador enzimatico inmovilizado se conoce por el metodo de preparacion del catalizador enzimatico inmovilizado.

La temperatura de la reaccion de hidrolisis de glicolonitrilo se elige para controlar tanto la velocidad de reaccion como la estabilidad de la actividad del catalizador enzimatico. La temperatura de la reaccion puede variar desde justo por encima del punto de congelacion de la mezcla de reaccion (aproximadamente 0°C) hasta aproximadamente 65°C, con un intervalo preferido de temperatura de reaccion desde aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 35°C. La suspension de catalizador enzimatico se puede preparar poniendo en suspension las celulas inmovilizadas y deshidratadas en agua destilada, o en una solucion acuosa de un tampon que mantenga el

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pH inicial de la reaccion entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 10,0, preferiblemente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,0, mas preferiblemente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,7, y lo mas preferiblemente desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 7,7. A medida que avanza la reaccion, el pH de la mezcla de reaccion puede cambiar debido a la formacion de una sal de amonio del acido carboxflico a partir de la funcionalidad nitrilo correspondiente. La reaccion se puede realizar para completar la conversion de glicolonitrilo sin control de pH, o se puede anadir un acido o una base adecuados durante el transcurso de la reaccion para mantener el pH deseado.

Se encontro que el glicolonitrilo era completamente miscible con agua en todas las proporciones a 25°C. En los casos en los que se eligen las condiciones de reaccion, de tal manera que la solubilidad del sustrato (es decir, un a-hidroxinitrilo) tambien dependa de la temperatura de la solucion y/o la concentracion de sal (tampon o el producto sal de amonio del acido glicolico, tambien conocido como glicolato de amonio) en la fase acuosa, la mezcla de reaccion puede estar compuesta inicialmente de dos fases: una fase acuosa que contiene el catalizador enzimatico y a-hidroxinitrilo disuelto, y una fase organica (el a-hidroxinitrilo sin disolver). A medida que progresa la reaccion, el a-hidroxinitrilo se disuelve en la fase acuosa, y finalmente se obtiene una mezcla de producto en una sola fase. La reaccion tambien puede ser realizada anadiendo el a-hidroxinitrilo a la mezcla de reaccion a una velocidad aproximadamente igual a la velocidad de reaccion de la hidrolisis enzimatica, manteniendo de este modo una mezcla de reaccion acuosa en una sola fase, y evitando el problema potencial de inhibicion por el sustrato de la enzima a altas concentraciones de material de partida.

El acido glicolico puede estar en la mezcla de productos como una mezcla del acido carboxflico protonizado y/o su sal de amonio correspondiente (dependiendo del pH de la mezcla de productos; el pKa del acido glicolico es aproximadamente 3,83) y adicionalmente puede estar presente como una sal del acido carboxflico con cualquier tampon que adicionalmente pueda estar presente en la mezcla de productos. Tfpicamente, el acido glicolico producido esta principalmente en forma de sal de amonio (el pH de la reaccion de hidrolisis del glicolonitrilo esta tfpicamente entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 7,7). El producto de acido glicolico se puede aislar de la mezcla de reaccion como el acido carboxflico protonizado, o como una sal del acido carboxflico, segun se desee.

La concentracion final de acido glicolico en la mezcla de productos en la conversion completa de glicolonitrilo puede variar desde 0,001 M hasta el lfmite de solubilidad del producto acido glicolico. En una realizacion, la concentracion de acido glicolico variara desde aproximadamente 0,10 M hasta aproximadamente 5,0 M. En otra realizacion, la concentracion de acido glicolico variara desde aproximadamente 0,2 M hasta aproximadamente 3,0 M.

El acido glicolico puede ser recuperado en forma del acido o la sal correspondiente usando una variedad de tecnicas que incluyen, aunque sin limitacion, intercambio ionico, electrodialisis, extraccion con disolvente reactivo, polimerizacion, descomposicion termica, alcoholisis y sus combinaciones.

Ademas, cuando una cantidad, concentracion u otro valor o parametro se da en forma de un intervalo, un intervalo preferido o una lista de valores superiores preferibles y valores inferiores preferibles, debe entenderse que estan descritos espedficamente todos los intervalos formados a partir de una pareja de cualquier lfmite superior del intervalo o valor preferido y cualquier lfmite inferior del intervalo o valor preferido, independientemente de si los intervalos se describen por separado. Cuando en la presente memoria se enumera un intervalo de valores numericos, a menos que se indique lo contrario, se pretende que el intervalo incluya sus extremos, y todos los numeros enteros y fracciones dentro del intervalo. No se pretende que el alcance de la invencion este limitado a los valores espedficos citados cuando se define un intervalo.

Metodos generales

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar las realizaciones preferidas de la invencion. Los expertos en la tecnica deben apreciar que las tecnicas descritas en los ejemplos siguientes representan tecnicas descubiertas por el inventor para llevar bien a la practica la invencion, y por tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su practica.

Los materiales y metodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la tecnica. Tecnicas adecuadas para uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar descritos en Manual of Methods for General Bacteriology (1994) (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC.) o por Thomas D. Brock, en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, (1989) Second Edition, (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA). Los metodos para inmovilizar catalizadores enzimaticos se pueden encontrar en Bickerstaff, G. F., supra).

Los procedimientos requeridos para la preparacion de DNA genomico, la amplificacion por PCR, las modificaciones del DNA por endo- y exo-nucleasas para generar extremos deseados para la clonacion del DNA, las ligamientos y la transformacion bacteriana, son bien conocidos en la tecnica. Tecnicas de DNA recombinante y de

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clonacion molecular estandares utilizadas en la presente invencion son bien conocidas en la tecnica y han sido descritas por Maniatis, supra; y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, (1984) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, NY; y por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1994-1998) John Wiley & Sons, Inc., New York.

Todos los reactivos y materiales se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma/Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) salvo indicacion contraria.

Las abreviaturas en la memoria descriptiva corresponden a unidades de medida, tecnicas, propiedades o compuestos de la siguiente manera: "s" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa densidad en g/mL, "jL" significa microlitros, "mL" significa mililitros, "L" significa litros, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "p" significa peso, "% en peso" significa porcentaje en peso, "g" significa gramos, "jg" significa microgramos, "HPLC" significa cromatograffa de lfquidos de alta resolucion, "DO" significa densidad optica a la longitud de onda designada, "pcs" significa peso de celulas secas, "U" significa unidades de actividad de nitrilasa; "EDTA" significa acido etilendiamintetraacetico y "DTT" significa ditiotreitol. Una U de actividad de nitrilasa corresponde a la hidrolisis de 1 jmol de glicolonitrilo/min.

Metodologfa analftica

Analisis por HPLC

A menos que se indique lo contrario, se utilizo el siguiente metodo de HPLC. Las mezclas de productos de reaccion se analizaron por el siguiente metodo de HPLC. Se anadieron partes alfcuotas (0,01 mL) de la mezcla de reaccion a 1,50 mL de agua y se analizo por HPLC (columna HPX 87H, 30 cm x 7,8 mm; fase movil H2SO4 0,01 N; caudal 1,0 mL/min a 50°C; volumen de inyeccion 10 jL; detector infrarrojo (IR), tiempo de analisis 20 min). El metodo se calibro para glicolonitrilo en una serie de concentraciones utilizando glicolonitrilo comercialmente disponible adquirido a Aldrich.

Analisis cuantitativo por 13C RMN

Los espectros cuantitativos de 13C RMN se obtuvieron utilizando un espectrometro Varian Unity Inova (Varian, Inc., Palo Alto, CA) que funciona a 400 MHz. Las muestras se prepararon tomando 3,0 mL del producto de reaccion junto con 0,5 mL de D2O en un tubo de RMN de 10 mm. Los espectros de 13C RMN se obtuvieron tfpicamente usando una anchura espectral de 26 KHz con el transmisor situado en 100 ppm, puntos 128K y un pulso de 90 grados (pw90 = 10,7 microsegundos a una potencia del transmisor de 56 db). El 13C T1 mas largo (23 s) se asocio con el carbono del nitrilo GLN, y el tiempo total de reciclaje se fijo a un valor diez veces mayor que este valor (retraso del reciclaje d1 = 240 s, tiempo de adquisicion, ta = 2,52 s). La senal media de 360 escaneos dio un tiempo de experimento total de 26,3 horas. La mejora nuclear Overhauser (NOE) fue suprimida controlando el desacoplamiento 1H modulado por Waltz solo durante el tiempo de adquisicion (ta).

Ejemplo 1

Fermentacion de E. coli MG1655/pSW138-168V

Se realizaron cultivos de siembra de E. coli MG1655/pSW138-168V en 500 mL de medio LB complementado con 0,1 mg de ampicilina por mL durante 6-10 horas (DO550 = 1-2) a 30°C con agitacion (300 rpm) antes de la inoculacion del fermentador. El cultivo de la cepa de E. coli MG1655/pSW138-168V productora de nitrilasa se realizo en fermentadores Braun Biostat C de 14 L (B. Braun Biotech International Gmbh, Melsungen, Alemania) utilizando un medio mineral con glucosa, amomaco y sales, y se uso lactosa para induccion. El medio del fermentador antes de la esterilizacion (7,5 L) se describe en la Tabla 2. Las adiciones despues de la esterilizacion incluyen elementos trazas esterilizados por filtracion (Tabla 3), 0,1 mg de ampicilina por mL, 2 g de casaminoacidos (Difco) por litro, 4 g de glucosa por litro y 500 mL de cultivo de siembra

Los puntos de ajuste de la fermentacion se describen en la Tabla 4. Para controlar el pH se utilizaron NH4OH (40% p/v) y H3PO4 (20% p/v). La concentracion de oxfgeno disuelto se controlo al 25% de saturacion en aire con la agitacion ajusta para elevar en primer lugar el aumento de la demanda de oxfgeno seguido por aireacion. El protocolo de alimentacion de la fermentacion utilizado con la induccion de lactosa se recoge en la Tabla 5. Los caudales de alimentacion de glucosa se redudan si la glucosa se acumulaba por encima de 5 g/L. Despues de 4056 horas, el caldo de fermentacion se enfrio bruscamente hasta 5-10°C y las celulas se recogieron por centrifugacion. La pasta celular se congelo y conservo a -70°C. La pasta celular se denomino NIT 60 (1910 U de GLN/g en pcs).

Tabla 2. Medios de fermentacion, antes de la esterilizacion.

(NH4)2SO4

5,0 g/L

K2HPO4

4,0 g/L

KH2PO4

3,5 g/L

MgSO4.7H2O

0,6 g/L

Citrato sodico.2H2O

1,0 g/L

NZ Amine AS (Quest)

2,5 g/L

Antiespumante - Biospumex 153K

0,25 mL/L

Tabla 3. Elementos trazas en la fermentacion

Concentracion

Acido cttrico

10 g/L

CaCl2.2H2O

1,5 g/L

FeSO4.7H2O

5 g/L

ZnSO4.7H2O

0,39 g/L

CuSO4.5H2O

0,38 g/L

CoCl2.6H2O

0,2 g/L

MnCl2.4H2O

0,3 g/L

Tabla 4. Puntos de ajuste de la fermentacion

Puntos de ajuste iniciales Mmimo Maxim o

Agitador (rpm)

400 400 1000

Caudal de aire (litros estandar por minuto)

2 2 10

PH

6,8 6,8 6,8

Presion (kPa)

0,5 0,5 0,5

Oxfgeno disuelto (Od)

25% 25% 25%

Temperatura °C

30 30 30

Tabla 5. Protocolo de alimentacion de la fermentacion usado con induccion de lactosa

Tiempo de fermentacion transcurrido (h)

Caudal de alimentacion (g/min) Sustrato

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Glucosa (por lotes)

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0,27 Glucosa (50% p/p)

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1,3 Lactosa (25% p/p)

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Ejemplo 2

Inmovilizacion de E. coli MG1655/pNM18-168V en perlas de carragenina reticuladas con GA/PEI

Con agitacion rapida, se anadieron lentamente 12 g de carragenina (FMC GP911) a 228 g de agua destilada desionizada, a 50°C, la mezcla resultante se calento hasta 80°C hasta que la carragenina se disolvio completamente, y la solucion resultante se enfrio con agitacion hasta 52°C. En un vaso separado equipado con una barra de agitacion, se anadieron 83,2 g de celulas congeladas de E. coli MG1655/pNM18-168V (25,2% en pcs) a 84,8 g de Na2HPO4 0,35 M (pH 7,3) a aproximadamente 25°C y se mezclo hasta que las celulas se pusieron en suspension, y a continuacion se anadio una solucion de desoxirribonucleasa I (10 pL de 12.500 U/mL de DNasa (Sigma)/100 mL de suspension celular). La suspension celular se filtro consecutivamente por un elemento filtrante Nupro TF de 230 micrometros y 140 micrometros y se calento con agitacion hasta 50°C. A la solucion de carragenina a 52°C, se anadieron con agitacion, 160,0 g de una suspension celular de E. coli MG1655/pNM18- 168V a 50°C, y la suspension de celulas/carragenina resultante se bombeo a traves de una aguja de calibre 20 calentada electricamente a 47°C y se anadio gota a gota con agitacion a KHCO3 0,25 M (pH = 7,3) a aproximadamente 37-38°C; el caudal a traves de la aguja se ajusto a 5-8 mL/min. Se dejaron endurecer las perlas resultantes en este mismo tampon durante 1 hora a temperatura ambiente con agitacion, y se conservaron en bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3).

La reticulacion qmmica de las perlas inmovilizadas de celulas/carragenina se realizo por adicion de 0,5 g de glutaraldehfdo (GA) al 25% en agua (Sigma M 752-07) a 20 g de perlas en suspension en 48 mL de bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3) y agitacion durante 1 hora a temperatura ambiente. A la suspension de perlas se anadieron luego 2,0 g de polietilenimina al 12,5% en peso (PEI, BASF LUPASOL PS) en agua, y la suspension de perlas se agito durante 18 horas mas a temperatura ambiente. Las perlas reticuladas con GA/PEI se recuperaron de la suspension, se agitaron dos veces durante 15 minutos en 48 mL de bicarbonato de potasio 0,25 M (pH 7,3), y a continuacion se almacenaron en bicarbonato de amonio 1,0 M (pH 7,3) a 5°C. Antes de su uso como catalizador para la conversion del glicolonitrilo en acido glicolico (como la sal de amonio), las perlas se lavaron dos veces durante 15 minutos con 180 mL de glicolato de amonio 0,1 M (pH 7,3) a temperatura ambiente para eliminar el tampon de conservacion de bicarbonato de amonio 1,0 M (pH 7,3). El catalizador celular inmovilizado resultante se identifico como NIT 60 inmovilizado.

Ejemplo 3

Deshidratacion/rehidratacion del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehndo/polietilenimina

Las perlas del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizadas en carragenina y reticuladas con glutaraldehndo/polietilenimina preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 se deshidrataron en una estufa a vacfo (176 mm de Hg) a 35°C con purga de nitrogeno durante 24 horas. La relacion entre el peso de las perlas deshidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,0914. Las perlas deshidratadas se rehidrataron posteriormente colocando las perlas deshidratadas en una solucion 20 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3) a 5°C o 25°C durante 18 horas. Las perlas rehidratadas resultantes se lavaron dos veces con una solucion 9 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3), y a continuacion se pesaron; la relacion entre el peso de las perlas rehidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,210 para las perlas rehidratadas a 5°C, y la relacion entre el peso de las perlas rehidratadas y el peso de las perlas originales fue 0,212 para las perlas rehidratadas a 25°C.

Ejemplo 4

Actividad espedfica del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldehido/polietilenimina antes y despues de la deshidratacion/rehidratacion

Las reacciones por lotes para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico se realizaron a 25°C en un bano de agua a temperatura controlada. Un primer recipiente de reaccion equipado con una barra de agitacion magnetica se cargo con 8,0 g de perlas de E. Coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI (peso de celulas secas 0,40 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 sin deshidratacion/rehidratacion), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 21,7 mL de agua destilada desionizada. Un segundo recipiente de reaccion equipado con una barra de agitacion magnetica se cargo con 1,71 g de perlas de E. coli

MG1655/pSw138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI rehidratadas (peso de celulas secas 0,41 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 3 con deshidratacion a 35°C y rehidratacion a 5°C), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 28,0 mL de agua destilada desionizada. Un tercer recipiente de

reaccion equipado con una barra de agitacion magnetica se cargo con 1,70 g de perlas de E. coli

MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI rehidratadas (peso celulas secas 0,40 g, preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 2 con deshidratacion a 35°C y rehidratacion a 25°C), 6,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 28,0 mL de agua destilada desionizada. A continuacion se anadieron simultaneamente y con agitacion a cada recipiente de reaccion 3,50 mL (3,75 g) de glicolonitrilo (GLN) al 60,8% en

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peso en agua (GLN 40,0 mmol, formaldehndo 0,320 mmol; estabilizado con acido glicolico al 0,7% en peso) y se anadieron 0,80 mL de hidroxido de amonio acuoso (NH3 al 1,875% en peso) (pH final 7,5). Las muestras de reaccion (0,100 mL) se retiraron en tiempos predeterminados despues de la adicion de GLN y se mezclaron con 0,100 mL de agua, 0,010 mL de HCl 6,0 N y 0,200 mL de n-propanol 0,25 M en agua (patron externo para HPLC), la mezcla se centrifugo y el lfquido sobrenadante resultante se analizo por HPLC para determinar la velocidad de reaccion inicial y la actividad espedfica del catalizador (U/g pcs) (Tabla 6).

Tabla 6. Actividad espedfica del transformante E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldeddo/polietilenimina antes y despues de la deshidratacion/rehidratacion

Biocatalizador celular inmovilizado

Temperatura de deshidratacion (°C) Temperatura de rehidratacion (°C) Actividad espedfica (U/g pcs) Actividad despues de la rehidratacion (%)

Sin deshidratacion

ninguna ninguna 1787 -

Deshidratado/rehidratado

35 5 1049 59

Deshidratado/rehidratado

35 25 1032 58

Ejemplo 5

Pretratamiento de E. coli MG1655/pSW138-168V con glutaraldeddo antes de la inmovilizacion

Se realizo una fermentacion de 200 L para producir un caldo que contuviera celulas de E. coli MG1655/pSW138- 168V que se pretrataron posteriormente con glutaraldeddo in situ antes de la inmovilizacion. En primer lugar se preparo un cultivo de pre-siembra cargando un matraz de agitacion de 2 L con 0,5 L de medio de siembra que contema extracto de levadura (Ambrex 695, 5,0 g/L), K2HPO4 (10,0 g/L), KH2PO4 (7,0 g/L), citrato de sodio dihidrato (1,0 g/L), (NH4)2SO4 (4,0 g/L), MgSO4 heptahidrato (1,0 g/L) y citrato de amonio ferrico (0,10 g/L). El pH del medio se ajusto hasta 6,8 y el medio se esterilizo en el matraz. Las adiciones posteriores a la esterilizacion incluyeron glucosa (10 mL, 50% en peso) y 1 mL de ampicilina (25 mg/mL). El medio de pre-siembra se inoculo con 1 mL de un de cultivo madre congelado de E. coli MG1655/pSW138-168V en glicerol al 20% y se cultivo a 35°C y 300 rpm. El cultivo de siembra se transfirio a aproximadamente 2 DO550 a un fermentador de siembra de 14 L (Braun) con 8 L de medio que contema KH2PO4 (3,50 g/L), FeSO4 heptahidrato (0,05 g/L), MgSO4 heptahidrato (2,0 g/L), citrato de sodio dihidrato (1,90 g/L), extracto de levadura (Ambrex 695, 5,0 g/L), antiespumante Biospumex153K (0,25 mL/L, Cognis Corporation), NaCl (1,0 g/L), CaCl2 dihidrato (10 g/L) y solucion de elementos trazas de NIT (10 mL/L). La solucion de elementos traza contema acido dtrico monohidrato (10 g/L), MnSO4 hidratado (2 g/L), NaCl (2 g/L), FeSO4 heptahidrato (0,5 g/L), ZnSO4 heptahidrato (0,2 g/L), CuSo4 pentahidrato (0,02 g/L) y NaMoO4 dihidrato (0,02 g/L). Las adiciones posteriores a la esterilizacion incldan 120 g de solucion de glucosa (50% p/p) y 16 mL de solucion madre de ampicilina (25 mg/mL).

La concentracion de oxfgeno disuelto (Od) se controlo a 25% de saturacion en aire. El Od se controlo en primer lugar por una velocidad de agitacion de paletas (400 hasta 1400 rpm) y mas tarde por una velocidad de aireacion (2 a 10 litros estandares por minuto). El pH se controlo a 6,8. Para el control del pH se usaron NH4OH (29% p/p) y H2SO4 (20% p/v). La temperatura se controlo a 35°C y la presion en cabeza fue 0,5 bares. A aproximadamente 6 DO550 el cultivo se transfirio al fermentador Biostat-D Braun de 200 L. El medio utilizado fue el mismo que en el fermentador de siembra, el volumen de trabajo inicial fue 140 L y se cargo glucosa al 50% p/p a 8 g/L. La fermentacion se inicio como una operacion por lotes, y una vez que se agoto la glucosa (<0,5 g/L) se inicio una operacion por lotes alimentados con glucosa al 50% p/p a un caudal predeterminado (Tabla 6), a aproximadamente 25 DO550 la alimentacion se cambio a una solucion de D-lactosa al 25% con un caudal predeterminado (Tabla 7).

La temperatura se controlo a 35,0°C, la presion en cabeza a 0,5 bares, el pH en la primera etapa (fase de glucosa) a 6,8 y en la segunda etapa (fase de lactosa) a 7,2, se utilizaron NH4OH (29% p/p) y H2SO4 (20% p/v) para el control del pH, el Od se controlo en la primera etapa al 25% de saturacion en aire y en la segunda etapa al 10%, el Od se controlo en primer lugar por agitacion (250-450 rpm) y mas tarde por aireacion (25-35 litros estandares por minuto). Los niveles de glucosa y lactosa se monitorizaron durante la operacion de alimentacion y si los niveles de glucosa superaban 0,1 g/L o la lactosa estaba por encima de 1 g/L, se detendna o se reducina temporalmente el programa de alimentacion. La operacion se termino 40 horas despues de la iniciacion de la alimentacion de lactosa, y las celulas se recogieron por centrifugacion o microfiltracion o se mantuvieron en el recipiente para el tratamiento con glutaraldeddo. La fermentacion produjo aproximadamente 8 kg en peso de celulas secas con una actividad espedfica de nitrilasa de 2819 U de BzN/g pcs (1788 U de GLN /g pcs).

Tabla 7: Protocolo de alimentacion

Intervalos de tiempo de alimentacion, (h)

Caudal de alimentacion, g/min Sustrato Etapa

0

6,13 50% p/p de glucosa 1a

1

7,13 50% p/p de glucosa 1a

2

8,28 50% p/p de glucosa 1a

3

9,62 50% p/p de glucosa 1a

4

11,18 50% p/p de glucosa 1a

5

11,18 50% p/p de glucosa 1a

6

11,18 50% p/p de glucosa 1a

7

11,18 50% p/p de glucosa 1a

8

11,18 50% p/p de glucosa 1a

0

11,22 25% p/p de glucosa 2a

2

24,42 25% p/p de glucosa 2a

20

16,72 25% p/p de glucosa 2a

30

18,7 25% p/p de glucosa 2a

40

18,7 25% p/p de glucosa 2a

Al final de la fermentacion, la agitacion se redujo hasta 150 rpm, se detuvo la aireacion y la temperatura se mantuvo a 35°C. Se retiro parte del caldo de fermentacion, dejando aproximadamente 180 kg en el fermentador. Este caldo remanente se titulo hasta pH 5,2 y se mantuvo a este pH con H2SO4 al 20% (20% p/p) y NaOH (50% 5 p/p), mientras se anadfan con agitacion 9,0 L de glutaraldehndo acuoso (GA, 10% p/p) a un caudal de ~90 mL/min;

este caudal de adicion era equivalente a 50 mg de glutaraldehndo/L de caldo de fermentacion/min, y la concentracion final de glutaraldetndo fue aproximadamente 5 g de glutaraldehndo/L (0,035 g de glutaraldehndo/DO55o). Despues de 5 h desde el inicio de la adicion de glutaraldetndo al caldo, el pH se ajusto a 7,0 y se anadieron con agitacion 1,8 L de bisulfito de sodio acuoso (10% p/p, pH 7) (aproximadamente 1 g de bisulfito 10 de sodio/L de concentracion final), y el caldo se agito durante 15 minutos mas. A continuacion se disminuyo la temperatura del caldo hasta 10°C y la agitacion se disminuyo hasta 100 rpm. El caldo se concentro hasta 40 kg de suspension celular usando una centrifugadora Diskstack (Alfa Laval), despues se anadieron a la suspension 50 kg de agua DI (20°C) y la mezcla se concentro por centrifugacion para producir 40 kg de suspension celular lavada. La suspension (identificada como NIT 188A-C2) se conservo a 5°C, y una porcion de la suspension celular se uso 15 directamente para la preparacion de un catalizador celular inmovilizado (Ejemplo 6). La actividad espedfica de nitrilasa durante cada etapa del procedimiento se resume en la Tabla 8.

Tabla 8: Actividad de nitrilasa durante las diferentes etapas del tratamiento con GA y bisulfito

Etapa de fermentacion

U de BZN/g pcs

Pretratamiento con GA

2819

Postratamiento con GA

3300

NaHSOa

2493

Ejemplo 6

Inmovilizacion de E. coli MG1655/pNM18-168V pretratada con glutaraldehndo en perlas de carragenina reticuladas 20 con GA/PEI.

El concentrado de la suspension celular final recuperado del caldo de fermentacion tratado con bisulfito de sodio y glutaraldehndo del Ejemplo 5 se centrifugo a 5°C. El sedimento celular resultante se volvio a poner en suspension en una cantidad 5 veces en peso de tampon de fosfato de potasio 0,35 M (pH 7,2), y la centrifugacion de la suspension celular resultante a 5°C produjo una pasta celular humeda que se inmovilizo y reticulo qmmicamente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

con GA y PEI como se ha descrito en el Ejemplo 2. El catalizador celular inmovilizado resultante se identifico como NIT 188A-C2 inmovilizado.

Ejemplo 7

Deshidratacion/rehidratacion del biocatalizador inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldetndo/polietilenimina preparado usando los transformantes E. coli MG1655/pNM18-168V y E. coli MG1655/ pSW138-F168V pretratados con glutaraldetndo

Las perlas del transformantes E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizadas en carragenina y reticuladas con glutaraldetndo/polietilenimina preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 6 utilizando celulas pretratadas con glutaraldetndo se deshidrataron en una estufa a vado (176 mm de Hg) a 35°C con purga de nitrogeno durante 20 horas, se pesaron y se deshidrataron como antes durante 4 horas mas (un total de 24 horas). La relacion entre el peso final de las perlas deshidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,217. Las perlas deshidratadas se rehidrataron posteriormente colocando las perlas en una solucion 20 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3) a 5°C durante 72 horas. Las perlas rehidratadas resultantes se lavaron dos veces con una solucion 9 veces (en peso) de glicolato de amonio 0,10 M (pH 7,3), a continuacion se pesaron; la relacion entre el peso de las perlas rehidratadas y el peso de las perlas originales (no deshidratadas) fue 0,578 para las perlas rehidratadas a 5°C. El biocatalizador resultante se identifico como NIT 188A-C2-D inmovilizado.

Ejemplo 8

Actividad espedfica del biocatalizador E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldetndo/polietilenimina preparado usando los transformantes E. coli MG1655/pNM18-168V y E. coli MG1655/pSW138-F168V pretratados con glutaraldetndo, antes y despues de la deshidratacion/re-hidratacion del biocatalizador inmovilizado

En un procedimiento tfpico, se realizaron series duplicadas de reacciones por lotes para la conversion de glicolonitrilo en acido glicolico en recipientes de reaccion con camisa, de 50 mL, equipados con agitacion superior y control de temperatura a 25°C. En una primera serie de reacciones duplicadas, cada recipiente de reaccion se cargo con 4 g de perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI (0,20 g en peso de celulas secas; NIT 188A-C2 inmovilizado, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 6 (pretratamiento con GA de las celulas antes de la inmovilizacion)), 3,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 7,75 mL de agua destilada desionizada. En una segunda serie de reacciones duplicadas, cada recipiente de reaccion se cargo con 2,55 g de perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI (0,20 g en peso de celulas secas; NIT 188A-C2-D inmovilizado, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 7 (pretratamiento con GA de las celulas antes de la inmovilizacion y posterior deshidratacion/rehidratacion)), 3,0 mL de glicolato de amonio acuoso (4,0 M, pH 7,0) y 9,10 mL de agua destilada desionizada.

Cada recipiente de reaccion se purgo con nitrogeno y la mezcla se agito a 25°C, mientras se utilizaban bombas de jeringa programables para anadir simultaneamente 0,520 mL de glicolonitrilo (GLN) al 62% en peso en agua (GLN 6,0 mmol, formaldetndo 0,006 mmol; estabilizada con acido glicolico al 0,7 % en peso) y 0,150 mL de hidroxido de amonio acuoso (NH3 al 0,9375% en peso); cada 2 h se anadio simultaneamente un volumen equivalente de soluciones de GLN e hidroxido de amonio (total de ocho adiciones simultaneas de solucion de GLN e hidroxido de amonio acuoso) para mantener la concentracion de GLN a < 400 mM y el pH en un intervalo de 7,0-7,5. Se retiraron muestras de reaccion (0,050 mL) en momentos predeterminados despues de la primera adicion de GLN y se anadieron a 0,010 mL de HCl 6,0 N y 0,200 mL de iso-propanol 0,25 M en agua (patron externo de HPLC), se centrifugo la mezcla resultante, y el lfquido sobrenadante se analizo por HPLC para determinar la velocidad de reaccion inicial y la actividad espedfica del catalizador (pmol de acido glicolico/min/g en pcs de biocatalizador). Al completarse la reaccion, se produjo una conversion del 100% de GLN en acido glicolico (en forma de sal de amonio) con un rendimiento > 99%. La Tabla 9 recoge las actividades espedficas iniciales de los biocatalizadores.

Al final de la primera reaccion, la mezcla acuosa de producto se decanto del catalizador (bajo nitrogeno) en cada recipiente de reaccion, dejando una mezcla de catalizador celular inmovilizado y permaneciendo la solucion del producto remanente. A continuacion se anadio al recipiente de reaccion suficiente agua destilada desionizada para reproducir el volumen de reaccion inicial en la primera reaccion antes de la adicion de soluciones de GLN e hidroxido de amonio (aproximadamente 15,3 mL de volumen de reaccion inicial) y se realizo una segunda reaccion a 25°C por adicion de partes alfcuotas de GLN acuoso e hidroxido de amonio como se acaba de describir. Las actividades espedficas del biocatalizador recuperado en reacciones por lotes consecutivas con reciclaje del catalizador se recogen en la Tabla 10.

Tabla 9. Actividad espedfica del biocatalizador E. coli MG1655/pSW138-F168V inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldeddo/polietilenimina preparado usando los transformantes E. coli MG1655/pNM18-168V y E. coli MG1655/pSW138-F168V pretratados con glutaraldeddo.

Biocatalizador celular inmovilizado

Temperatura de deshidratacion, (°C) Temperatura de rehidratacion, (°C) Actividad espedfica. (U/g pcs) Actividad despues de la rehidratacion, (%)

NIT 188A-C2

ninguna ninguna 1826 -

NIT 188A-C2

ninguna ninguna 1857 -

NIT 188A-C2-D

35 5 1660 90

NIT 188A-C2-D

35 5 1584 86

Tabla 10. Actividad espedfica del biocatalizador recuperado en reacciones por lotes consecutivas con reciclaje del 5 biocatalizador utilizando un biocatalizador microbiano inmovilizado en carragenina y reticulado con

glutaraldeddo/PEI preparado utilizando celulas pretratadas con glutaraldeddo.

Actividad espedfica del biocatalizador (U de GLN/g pcs) en reacciones por lotes consecutivas

Biocatalizador celular inmovilizado

Celulas inmovilizadas deshidratadas / rehidratadas Reaccion 1 Reaccion 2 Reaccion 3 Reaccion 4 Disminucion de la actividad espedfica, rxn1 a rxn4 (%)

NIT 188C2

no 1826 1518 1596 1759 4

NIT 188C2

no 1857 1656 1581 1947 0

NIT 188C2-D

sf 1660 1369 1472 1674 0

NIT 188C2-D

sf 1584 1392 1485 1417 10

Ejemplo 9

Estabilidad en durante la conservacion del biocatalizador inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldeddo/polietilenimina preparado utilizando un transformante E. coli MG1655/pNM18-168V pretratado con 10 glutaraldeddo, antes y despues de la deshidratacion/rehidratacion del biocatalizador inmovilizado

Perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI recien preparadas (NIT 188A-C2 inmovilizado, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 6 (pretratamiento con GA de las celulas antes de la inmovilizacion)) se conservaron durante 28 dfas en bicarbonato de amonio 1,0 M (pH 7,3) a 5°C. Las perlas de E. coli MG1655/pSW138-168V/carragenina reticuladas con GA/PEI deshidratadas (NIT 188A-C2 inmovilizado, 15 deshidratado como se ha descrito en el Ejemplo 7) se conservaron en seco bajo nitrogeno a 5°C durante 28 dfas, y luego se rehidrataron tal como se ha descrito en el Ejemplo 7. Antes de su uso, los biocatalizadores se lavaron dos veces durante 15 minutos con 180 mL de glicolato de amonio 0,1 M (pH 7,0) a temperatura ambiente, luego se evaluaron en series duplicadas de reacciones por lotes consecutivas con reciclaje del biocatalizador utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. La actividad espedfica de cada biocatalizador en cuatro reacciones por 20 lotes consecutivas para convertir glicolonitrilo en glicolato de amonio se recoge en la Tabla 11.

Tabla 11. Actividad espedfica en reacciones por lotes consecutivas con reciclaje del biocatalizador usando catalizador microbiano inmovilizado en carragenina y reticulado con glutaraldeddo/PEI preparado utilizando celulas pretratadas con glutaraldelddo; biocatalizador conservado durante 28 dfas a 5°C, con o sin deshidratacion.

Actividad espedfica del biocatalizador en reacciones por lotes consecutivas (U de GLN/g pcs)

Biocatalizador celular inmovilizado (celulas pretratadas con glutaraldeddo)

Reaccion 1 Reaccion 2 Reaccion 3 Reaccion 4 Disminucion de la actividad espedfica, rxn1 a rxn4 (%)

No deshidratado

1910 1455 1580 1543 19

No deshidratado

1987 1434 1472 1783 10

Deshidratado/rehidratado

1474 1467 1585 1318 11

Deshidratado/rehidratado

1493 1412 - 1665 0

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir un catalizador enzimatico deshidratado que tiene actividad de nitrilasa con mejor actividad espedfica, que comprende:

   (a) producir por fermentacion un catalizador enzimatico que tiene actividad de nitrilasa;

   (b) pretratar dicho catalizador enzimatico con glutaraldehndo;

   (c) inactivar opcionalmente el glutaraldelddo sin reaccionar con bisulfito despues del pretratamiento con glutaraldelddo;

   (d) recuperar el catalizador enzimatico de (b) o (c) e inmovilizar dicho catalizador enzimatico en carragenina;

   (e) reticular el catalizador enzimatico inmovilizado en carragenina resultante de (d) con glutaraldehfdo y polietilenimina; y

   (f) deshidratar el catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado producido en la etapa (e);

   en donde dicho catalizador enzimatico comprende un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 y 57.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa (g) rehidratar el catalizador enzimatico de la etapa (f) en una solucion acuosa.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2, que comprende ademas la etapa (h) poner en contacto el catalizador enzimatico rehidratado de la reivindicacion 2 con glicolonitrilo en una solucion acuosa en condiciones de reaccion adecuadas en las que se produce acido glicolico.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, que comprende ademas la etapa (i) recuperar el acido glicolico producido en la etapa (h).
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el pH se mantiene entre 5,0 y 9,0 durante el pretratamiento con glutaraldehfdo.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el pretratamiento con glutaraldehfdo en la etapa (b) comprende anadir glutaraldehfdo a un caldo de fermentacion producido en la etapa (a) en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 3 g/L (0,025 g de GA por DO550) y aproximadamente 5 g/L (0,042 g de GA por DO550).
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el pretratamiento con glutaraldehfdo en la etapa (b) comprende anadir glutaraldehfdo a un caldo de fermentacion producido en la etapa (a) a un caudal de 50 mg/L/h a 500 mg/L/h.
8. 8. El catalizador enzimatico inmovilizado y reticulado, pretratado con glutaraldehfdo y deshidratado producido por el procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho catalizador retiene al menos aproximadamente 70% de su actividad espedfica para hidrolizar glicolonitrilo a acido glicolico despues de rehidratacion.