ES2358795T3

ES2358795T3 - Derivados de indol o derivados de bencimidazol para modular la ikb quinasa.

Info

Publication number: ES2358795T3
Application number: ES03793685T
Authority: ES
Inventors: Olaf Ritzeler; Gerhard Jaehne
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2002-08-17
Filing date: 2003-08-05
Publication date: 2011-05-13
Anticipated expiration: 2023-08-05
Also published as: US8778955B2; MEP60608A; UY27941A1; AU2003263196A1; NO330981B1; IL166785A0; MA27382A1; DK1530568T3; ECSP055612A; NZ538296A; MXPA05001314A; CA2498559C; ATE557018T1; ATE493402T1; PA8580501A1; DE10237722A1; CN1314683C; CY1112991T1; HRP20050042B1; PT2233483E

Abstract

Compuesto de la fórmula I **Fórmula** y/o una forma estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I, en que X y M son idénticos o diferentes y representan, independientemente uno de otro, un átomo de N o CH, R1 y R11 son idénticos o diferentes, y representan, independientemente uno de otro, 1. un átomo de hidrógeno, 2. F, Cl, I o Br, 3. -alquilo (C1-C4), 4. -CN, 5. -CF3, 6. -OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 7. -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 8. -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), o 9. -S(O)x-R5, en que x significa el número entero cero, 1 ó 2, y R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), R2 representa 1. un radical heteroarilo del grupo 3-hidroxipirro-2,4-diona, imidazol, imidazolidina, imidazolina, indazol, isotiazol, isotiazolidina, isoxazol, 2-isoxazolidina, isoxazolidina, isoxazolona, morfolina, oxazol, 1,3,4-oxadiazol, oxadiazolidindiona, oxadiazolona, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido, 5-oxo-4,5-dihidro-[1,3,4]oxadiazol, 5-oxo-1,2,4- tiadiazol, piperazina, pirazina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, piridazina, pirimidina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiomorfolina, triazol o triazolona, y y el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, inde25 pendientemente una de otra, con 1.1 -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 1.2 -alquilo (C1-C4), 1.3 -O-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 1.4 -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 1.5 halógeno, o 1.6 un radical ceto, 2. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4), 3. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4), o 4. -C(O)-N(R7)-R8, en que R7 y R8 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, -alquil (C1-C4)-OH, -O-alquilo (C1-C4) o -(alquilo C1-C4), R3 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4), R4 representa 1. un radical heteroarilo del grupo pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxidos, triazolonas, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidinadiona, triazol, 3- hidroxipirro-2,4-dionas, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, β-carbolina y derivados de ciclopenta o derivados de ciclohexa, condensados con benzo, de estos radicales heteroarilo, en que el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C5), -alcoxi (C1-C5), halógeno, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)- carbonilo, o.

Description

La invención se refiere a derivados de indol o a derivados de bencimidazol que inhiben IκB quinasa, a procedimientos para prepararlos y a su uso como medicamento.

En la solicitud de patente WO 94/12478 se describen, entre otros, derivados de indol que inhiben la agregación de las 5 plaquetas de la sangre. En las solicitudes de patente WO 01/00610 y WO 01/30774 se describen derivados de indol y derivados de bencimidazol que son capaces de modular NFκB.

NFκB es un factor de transcripción heterodímero, que es capaz de activar un gran número de genes que codifican, entre otros, citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, IL-2, TNFα o IL-6. NFκB está presente en el citosol de las células en donde está complejado con su inhibidor IκB que se produce en la naturaleza. La estimulación de las células, 10 por ejemplo por parte de citoquinas, conduce a que el IκB sea fosforilado y disgregado subsiguientemente de forma proteolítica. Esta disgregación proteolítica conduce a la activación de NFκB que luego migra al núcleo de la célula en donde activa a un gran número de genes proinflamatorios.

En enfermedades tales como artritis reumatoide (en relación con la inflamación), osteoartritis, asma, infarto de corazón, enfermedades de Alzheimer, diabetes tipo II, "enfermedad del intestino inflamatorio" o aterosclerosis, NFκB es activado 15 más allá de su grado normal. La inhibición de NFκB es también valiosa en el tratamiento del cáncer, ya que se utiliza en un tratamiento de este tipo por si misma o para aumentar la terapia citostática. Pudo demostrarse que medicamentos tales como glucocorticoides, salicilatos o sales de oro, que se utilizan en la terapia del reumatismo, inhiben la cadena de la señal de activación de NFκB en diversos puntos o interfieren directamente en la transcripción de los genes. 20

La primera etapa en la cascada de señales antes mencionada es la disgregación de IκB. Esta fosforilación es regulada por la IκB quinasa específica. Hasta la fecha, no se conocen inhibidores que inhiban específicamente la IκB quinasa.

El inconveniente de los inhibidores conocidos de la IκB quinasa es la carente especificidad para inhibir únicamente una clase de quinasas. Por ejemplo, la mayoría de los inhibidores de la IκB quinasa inhiben varias quinasas diferentes al mismo tiempo, ya que las estructuras de los dominios catalíticos de estas quinasas son similares. Por consiguiente, los 25 inhibidores actúan, de una manera indeseable, sobre muchas enzimas, incluidas las que poseen la función vital.

En la solicitud de patente WO 01/30774 ya se han descrito derivados de indol que son capaces de modular NFκB y que exhiben un fuerte efecto inhibidor sobre la IκB quinasa. Sin embargo, los compuestos dados a conocer en el documento WO 01/30774, y que se describen en los ejemplos, muestran también un potente efecto inhibidor sobre otras quinasas tales como la proteína quinasa dependiente de cAMP, la proteína quinasa C o la caseína quinasa II. Sin 30 embargo, cuando se mejora su especificidad, algunos de estos derivados de indol muestran una disminución en su capacidad de inhibir la IκB quinasa. Además, el nivel de plasma sanguíneo que puede conseguirse con los compuestos descritos en el documento WO 01/30774 es insuficiente para administrar estos derivados por vía oral.

En un esfuerzo por obtener compuestos eficaces para tratar artritis reumatoide (asociada con la inflamación), osteoartritis, asma, infarto de corazón, enfermedades de Alzheimer, enfermedades cancerígenas (potenciación de las 35 terapias con agentes citotóxicos) o aterosclerosis, se ha encontrado ahora que los derivados de indol y los derivados de bencimidazol de acuerdo con la invención no adolecen de los inconvenientes antes mencionados. Los derivados de indol y derivados de bencimidazol de acuerdo con la invención son potentes inhibidores de la IκB quinasa, inhibiendo a este respecto las quinasas de modo muy selectivo, y presentan un alto nivel en el plasma sanguíneo después de la administración oral. 40

Por lo tanto, la invención se refiere al compuesto de fórmula I

y/o una forma estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I, en que

X y M son idénticos o diferentes y representan, independientemente uno de otro, un átomo de N o CH,

R1 y R11 son idénticos o diferentes, y representan, independientemente uno de otro, 5

1. un átomo de hidrógeno,

2. F, Cl, I o Br,

3. -alquilo (C1-C4),

4. -CN,

5. -CF3, 10

6. -OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

7. -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

8. -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), o

9. -S(O)x-R5, en que x significa el número entero cero, 1 ó 2, y R5 representa un átomo de hidrógeno o 15 -alquilo (C1-C4),

R2 representa 1. un radical heteroarilo del grupo 3-hidroxipirro-2,4-diona, imidazol, imidazolidina, imidazolina, indazol,

isotiazol, isotiazolidina, isoxazol, 2-isoxazolidina, isoxazolidina, isoxazolona, morfolina, oxazol, 1,3,4-oxadiazol, 20 oxadiazolidindiona, oxadiazolona, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido, 5-oxo-4,5-dihidro-[1,3,4]oxadiazol, 5-oxo-1,2,4-tiadiazol, piperazina, pirazina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, piridazina, pirimidina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiomorfolina, triazol o triazolona, y

y el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con 25

1.1 -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

1.2 -alquilo (C1-C4),

1.3 -O-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

1.4 -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 30

1.5 halógeno, o

1.6 un radical ceto,

2. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4),

3. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4), o

4. -C(O)-N(R7)-R8, en que R7 y R8 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, -alquil (C1-C4)-OH, -O-alquilo (C1-C4) o -(alquilo C1-C4), 5

R3 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4),

R4 representa 1. un radical heteroarilo del grupo pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxidos, triazolonas, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidinadiona, triazol, 3-hidroxipirro-2,4-dionas, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, β-carbolina y derivados de ciclopenta o derivados de 10 ciclohexa, condensados con benzo, de estos radicales heteroarilo,

en que el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C5), -alcoxi (C1-C5), halógeno, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)-carbonilo, o 15

2. un radical arilo del grupo fenilo, naftilo, 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, 2-bifenililo, 3-bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo, y

el radical arilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C5), -alcoxi (C1-C5), halógeno, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi 20 (C1-C4)-carbonilo.

La invención se refiere, además, a compuestos de la fórmula I, en que

R1 y R11 son como se definen antes en los apartados 1. a 9.,

R2 representa 1. un radical heteroarilo del grupo imidazol, isotiazol, isoxazol, 2-isoxazolidina, isoxazolidina, 25 isoxazolona, 1,3,4-oxadiazol, oxadiazolidinadiona, 1,2,3,5-oxadiazolona, oxazol, 5-oxo-4,5-dihidro-[1,3,4]oxadiazol, te-trazol, tiadiazol, tiazol, triazol o triazolona, y el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con

1.1 un radical ceto,

1.2 halógeno, o 30

1.3 -alquilo (C1-C2), o

2. -C(O)-N(R7)-R8, en que R7 y R8 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, -alquil (C1-C4)-OH, -O-alquilo (C1-C4) o -alquilo (C1-C4),

R3 representa un átomo de hidrógeno, metilo o etilo,

R4 representa 1. un radical heteroarilo del grupo de los anillos insaturados, parcialmente saturados o 35 completamente saturados, que se derivan de piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, triazol o isotiazol,

en que el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C4), -alcoxi (C1-C4), F, Cl, I, Br, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)-40 carbonilo, o

2. fenilo, y fenilo está no sustituido o está sustituido, una vez, dos veces o tres veces, indepen-dientemente una de otra, con F, Cl, I, Br, CF3, -OH, -alquilo (C1-C4) o -alcoxi (C1-C4).

La invención se refiere, además, al compuesto

[(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 5

[(S)-1-(5-oxo-4,5-dihidro-1,3,4-oxadiazol-2-il)-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, [2-[(4-fluro-fenil)-piridin-2-il-amino]-1-(4H-[1,2,4]triazol-3-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 10

[1-carbamoil-2-(fenil-tiazol-2-il-amino)-etil]-amida del ácido (S)-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

[1-metoxicarbamoil-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido (S)-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 15

[1-(2-hidroxi-etilcarbamoil)-2-(fenil-pirimidin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

ácido (S)-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-[fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amino]- propiónico,

1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-20 5-carboxílico,

((S)-1-carbamoil-2-difenilamino-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico, o

{1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-25 carboxílico.

Por el término "halógeno" se entiende flúor, cloro, bromo o yodo. Por el término "-alquilo (C1-C5)" o "-alcoxi (C1-C5)" se entienden radicales hidrocarbonados, cuya cadena de carbonos es lineal o ramificada y contiene de 1 a 5 átomos de carbono tales como metilo, etilo, propilo, n-butilo, pentilo o butilo terciario. Por la expresión "radical heteroarilo del grupo de los anillos insaturados, parcialmente saturados o completamente saturados que se derivan de piridina, pirazina, 30 pirimidina, piridazina, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol e isotiazol" han de entenderse, por ejemplo, compuestos tales como piperazina, pirazolina, imidazolina, pirazolidina, imidazolidina, tetrahidropiridina, isoxazolina, isoxazolidina, morfolina, isotiazolina, isotiazolidina, tetrahidro-1,4-tiazina o piperidina.

La preparación de los compuestos de la fórmula I tiene lugar, por ejemplo, según se describe en las solicitudes de patente WO 01/00610 y WO 01/30774. Las sustancias de partida para las reacciones químicas son conocidas o se 35 pueden preparar fácilmente utilizando métodos conocidos de la bibliografía.

La invención se refiere, además, a un procedimiento para preparar el compuesto de la fórmula I y/o una forma estereoi-sómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la formula I, caracterizado porque

a) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula IV 40

en que R1, R2 y R4 son como se definen en la fórmula I, con un cloruro de ácido o un éster activado del compuesto de la fórmula III,

en que D1 significa -COOH y R11, X, M y R3 son como se definen en la fórmula I, en presencia de una base 5 o, eventualmente, de un agente deshidratante en solución, y se convierte en un compuesto de la fórmula I,

b) se separa un compuesto de la fórmula I, que ha sido preparado por el procedimiento a) y que, en virtud de su estructura química, aparece en formas enantiómeras, en los enantiómeros puros por medio de la formación de sales con ácidos o bases puros en cuanto a los enantiómeros, cromatografía en fases estacionarias quirales o derivatización utilizando compuestos quirales puros en cuanto a los enantiómeros tales como aminoácidos, separando los 10 diastereoisómeros resultantes y eliminando los grupos auxilares quirales, o

c) se aísla el compuesto de la fórmula I que ha sido preparado por los procedimientos a) o b) en forma libre o, en caso de estar presentes grupos de carácter ácido o básico, se convierte en sales fisiológicamente toleradas.

La preparación de los derivados del ácido indol-carboxílico o del ácido bencimidazol-carboxílico tiene lugar según un método como el descrito en Houben-Weyl "Methoden der Org. Chemie", volumen E6-2A o E6-2B. Así, con el fin de 15 preparar los derivados del ácido indol-carboxílico o del ácido bencimidazol-carboxílico de la fórmula III, preferiblemente ácidos hidrazinobenzoicos y aril-cetonas o heteroaril-cetonas se hacen reaccionar a 145ºC en presencia de ácido polifosfórico en calidad de disolvente. La preparación de los ácidos hidrazinobenzoicos necesarios tiene lugar según métodos que son familiares para una persona experta, por ejemplo a partir de las correspondientes anilinas de ácido benzoico; aril-cetonas o heteroaril-cetonas se preparan también utilizando métodos que resultan familiares a la persona 20 experta, por ejemplo a partir de los correspondientes cloruros de ácido o nitrilos, mediante reacción, por ejemplo, con compuestos organometálicos.

Métodos de acoplamiento de la Química de los Péptidos, que son bien conocidos per se por la persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, volúmenes 15/1 y 15/2, editorial Georg Thieme, Stuttgart, 1974), se utilizan ventajosamente para condensar los compuestos de la fórmula IV con los de 25 la fórmula III. En calidad de agentes de condensación o reactivos de acoplamiento entran en consideración compuestos tales como carbonildiimidazol, carbodiimida, tal como diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida (DIC), el tetrafluoroborato de O-((ciano(etoxicarbonil)-metileno)-amino)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TOTU) o anhídrido propilfosfónico (PPA).

Las condensaciones se pueden llevar a cabo en condiciones convencionales. En la condensación es necesario, por 30 norma general, que los grupos amino no reactivos, que estén presentes, sean protegidos con grupos protectores reversibles. Esto mismo se aplica a los grupos carboxilo que no participan en la reacción, estando presentes preferiblemente estos grupos, durante la condensación, en forma de ésteres alquílicos (C1-C6), ésteres bencílicos o ésteres terc.-butílicos. No es necesaria una protección de los grupos amino si los grupos amino están todavía presentes en forma de precursores tales como grupos nitro o grupos ciano, y sólo se forman por hidrogenación 35 después de la condensación. Después de la condensación, los grupos protectores que están presentes se eliminan de una manera adecuada. Por ejemplo, se pueden eliminar por hidrogenación grupos NO2 (protección guanidino en aminoácidos), grupos benciloxicarbonilo y grupos bencilo en ésteres bencílicos. Los grupos protectores del tipo terc.-butilo se eliminan en condiciones ácidas, mientras que el radical 9-fluorenilmetiloxicarbonilo se separa utilizando aminas secundarias. 40

La invención se refiere también a agentes farmacéuticos que se caracterizan por una cantidad eficaz de al menos un compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I y/o una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I, junto con una sustancia vehículo, aditivo y/u otros compuestos activos y sustancias auxiliares farmacéuticamente adecuados y fisiológicamente tolerados.

Debido a sus propiedades farmacológicas, los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados para la 5 profilaxia y terapia de todas las enfermedades cuyo curso implica una actividad incrementada de la IκB quinasa. A ellas pertenecen, por ejemplo, enfermedades crónicas del aparato locomotor tales como artritis inflamatorias, inmunológicamente agudas o agudas mediadas por el metabolismo y crónicas, artropatías, artritis reumatoide, o enfermedades degenerativas de las articulaciones tales como osteoartrosis, espondilosis, diabetes tipo II, enfermedad del intestino inflamatorio, pérdida de cartílago tras un trauma de la articulación o un período relativamente largo de 10 inmovilización de la articulación después de lesiones de menisco o rótula o roturas de ligamento, o enfermedades del tejido conjuntivo tales como colagenosis y enfermedades periodontales, mialgias y perturbaciones del metabolismo de los huesos, o enfermedades que son debidas a una sobre-expresión del factor de necrosis de tumores alfa (TNFα) o a una concentración incrementada del TNFα tales como caquexia, esclerosis múltiple, trauma craneocerebral, enfermedad de Crohn y úlceras intestinales, o enfermedades tales como aterosclerosis, estenosis, ulceración, 15 enfermedades de Alzheimer, abatimiento muscular, enfermedades cancerígenas (potenciación del tratamiento con agentes citotóxicos), infarto cardíaco, gota, sepsis, choque séptico, choque endotóxico, infecciones víricas tales como gripe, hepatitis, infecciones por VIH, SIDA o enfermedades provocadas por adenovirus o virus herpes, infecciones parasitarias tales como malaria o lepra, infecciones por hongos o levaduras, meningitis, enfermedades crónicas de los pulmones inflamatorios tales como bronquitis crónica o asma, síndrome del dolor respiratorio agudo, sinovitis aguda, 20 tuberculosis, psoriasis, diabetes, tratamiento de reacciones de rechazo agudas o crónicas de parte del receptor de órganos contra el órgano trasplantado, enfermedades crónicas de injerto frente a huésped y enfermedades vasculares inflamatorias. Las enfermedades mencionadas pueden tratarse mucho más específicamente y con un espectro menor de efectos secundarios con los compuestos que se utilizan de acuerdo con la invención, ya que es esencialmente sólo la IκB quinasa la que es inhibida. 25

La aplicación de los agentes farmacéuticos de acuerdo con la invención puede tener lugar por medio de administración oral, por inhalación, rectal o transdermal, o por medio de inyección subcutánea, intra-articular, intraperitoneal o intravenosa. Se prefiere la administración oral.

La invención se refiere también a un procedimiento para producir un agente farmacéutico, caracterizado porque se reúne al menos un compuesto de la fórmula I con un excipiente farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente 30 tolerado y, eventualmente, otros compuestos activos, aditivos o sustancias auxiliares adecuados, a una forma adecuada para la administración.

Formas de preparados sólidas o galénicas adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, grageas, tabletas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones inyectables, así como preparados con una liberación retraída del compuesto activo, en cuya preparación se utilizan sustancias auxiliares 35 habituales tales como sustancias de vehículo, desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de expansión, deslizantes o lubricantes, saboreantes, edulcorantes y solubilizantes. Sustancias auxiliares frecuentemente empleadas que se pueden mencionar son carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteínas de la leche, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, aceite de nuez molida o aceite de sésamo, polietilenglicol, y disolventes tales 40 como agua estéril y alcoholes monovalentes o polivalentes tales como glicerol. Los preparados farmacéuticos se producen y administran preferiblemente en unidades de dosificación, conteniendo cada unidad, en calidad de constituyente activo, una dosis determinada del compuesto de la fórmula I de acuerdo con la invención. En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como tabletas, cápsulas, grageas o supositorios, esta dosis puede ser de hasta aproximadamente 1000 mg, preferiblemente de aproximadamente 50 mg a 300 mg y, en el caso de soluciones de 45 inyección en forma de ampolla, de hasta aproximadamente 300 mg, preferiblemente de aproximadamente 10 mg a 100 mg. Dependiendo de la actividad del compuesto de acuerdo con la fórmula I, para tratar un paciente adulto de aproximadamente 70 kg de peso están indicadas dosis diarias de aproximadamente 20 mg a 1000 mg de compuesto activo, preferiblemente de 100 mg a 500 mg. Bajo determinadas circunstancias, también pueden ser apropiadas dosis diarias mayores o menores. La administración de la dosis diaria puede tener lugar tanto por medio de una sola 50 administración en forma de una unidad de dosificación sencilla o de varias unidades de dosificación menores, o por medio de la administración múltiple de dosis subdivididas a intervalos predeterminados.

Como norma general, los productos finales se determinan por métodos de espectroscopía de masas (FAB-MS, ESI-MS). Los datos de temperatura se dan en grados centígrados; RT significa temperatura ambiente (de 22ºC a 26ºC). Las abreviaturas que se utilizan se explican o corresponden a los convenios habituales. La invención se explica con mayor 55

detalle a continuación con ayuda de ejemplos.

Ejemplos de preparación

A) Preparación de anilina

A.1.) 2-(p-fluoroanilino)piridina (3)

5

Una mezcla de 29,34 g (0,264 mol) de 4-fluoroanilina (1) y 29,98 g (0,264 mol) de 2-cloropiridina (2) se calentó a 150ºC durante 2 h. Después de haber sido enfriada hasta RT, se distribuyó entre 500 ml de NaOH 1 N y 500 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo 2 veces en cada caso con 300 ml de acetato de etilo y las fases orgánicas reunidas se secaron con sulfato de magnesio. Después de haber evaporado el disolvente, el residuo se recogió en 500 ml de acetato de etilo y se añadieron aproximadamente 40 g de carbón vegetal activo. Se agitó a RT durante 10 minutos y se 10 filtró a través de tierra de infusorios. El carbón vegetal activo se volvió a lavar 4 veces, en cada caso con 1 l de acetato de etilo. El disolvente se separó en vacío (i.v.), y el residuo se precipitó a partir de 120 ml de acetato de etilo. El sólido se separó por filtración con succión y se secó a 50ºC i.v.. Se obtuvieron 41 g de 2-(p-fluoroanilino)piridina (3);

rendimiento 83%

Fórmula empírica C11H9N2; P.M. = 188,21; MS (M+H) 189,1. 15

1H RMN (CDCl3) 6,68-6,75 (m, 2H), 6,88 (s, 1H), 7,05 (t, 2H), 7,24-7,32 (m, 2H), 7,43-7,49 (m, 1H), 8,18 (d, 1H).

A.2.) 2-(anilino)pirimidina (6)

9,15 g (31%) de la anilinopirimidina 6 se obtuvieron a partir de 16,2 g de anilina (4) por reacción con 2-cloropirimidina (5) de una manera análoga a la descrita en el apartado A.1.). 20

Fórmula empírica C10H9N3; P.M. = 171,08; MS (M+H) 172,2.

B.) Síntesis de aminoácidos mediante la Z-serina-lactona 8

B.1.) (S)-2-amino-3-difenilaminopropionato de metilo (11)

B.1.1.) N-benciloxi-carbonil-L-serina-β-lactona (8)

54,8 g (0,209 mol) de trifenilfosfina se suspendieron en 600 ml de acetonitrilo, y la suspensión se enfrió desde –35ºC hasta –45ºC al tiempo que se excluía la humedad. A esta temperatura y en el espacio de 50 minutos se añadieron gota a gota 36,4 g (0,209 mol) de éster dietílico del ácido azodicarboxílico. Se agitó luego a –35ºC durante 15 minutos. 5 Después se añadió lentamente gota a gota a esta mezcla una solución que consistía en 50 g (0,209 mol) de N-benciloxicarbonil-L-serina (7) en 500 ml de acetonitrilo, de modo que la temperatura no se elevara por encima de

-35ºC. Después, la mezcla resultante se agitó a 5ºC durante 12 h. Con el fin de terminar la reacción, la solución de reacción se liberó del disolvente a presión reducida, y el producto bruto se purificó mediante cromatografía a presión media sobre gel de sílice. (DCM/AcCN: 25/1). 20,8 g de N-benciloxi-carbonil-L-serina-β-lactona (8) se obtuvieron 10 después de haber separado el disolvente; rendimiento 45%; (véase también Org. Synth. 1991 (70) 1 y siguientes) en agujas finas.

Fórmula empírica C11H11NO4; P.M. = 221,2; MS (M+H) 222,1.

1H RMN (DMSO-d6) 4,30 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,22 (m, 2H), 7,45 (m, 5H), 8,20 (d, J = 9,8 Hz, 1H).

B.1.2.) Ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-3-difenilamino-propiónico (9) 15

5,0 g (22,6 mmol) de serina-lactona (5) se agitaron junto con 20 g (118,2 mmol) de difenilamina y la mezcla se agitó a 100ºC durante 2 h. El producto bruto se purificó por medio de cromatografía a presión media sobre gel de sílice. (DCM/metanol: 9/1, luego acetato de etilo/n-heptano: 4/1). Después de haber separado el disolvente, se obtuvieron 3,65 g (rendimiento 42%) de ácido 2-benciloxicarbonilamino-3-difenilamino-propiónico (9) puro.

Fórmula empírica C23H22N2O4; P.M. = 390,44; MS (M+H) 391,2. 20

1H RMN (DMSO-d6) 3,85 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,3 (m, 1H), 4,9 (m, 2H), 6,9 (m, 5H), 7,25 (m, 10H).

B.1.3.) Éster metílico del ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-3-difenilamino-propiónico (10)

6,5 ml (89,1 mmol) de cloruro de tionilo se añadieron gota a gota, a –5ºC, a 75 ml de metanol, y la mezcla se agitó durante 15 min. Después se añadieron 3,6 g (9,22 mmol) de ácido 2-benciloxicarbonilamino-3-difenilamino-propiónico (9), disueltos en 75 ml de metanol, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas (h) adicionales. 25 Después de haber evaporado los disolventes, el residuo se recogió en acetato de etilo y el conjunto se extrajo con solución de carbonato de sodio. La purificación por medio de cromatografía de resolución rápida (n-heptano/acetato de etilo 7:3) proporcionó 2,76 g (rendimiento del 50%) de éster metílico del ácido 2-benciloxicarbonilamino-3-difenilamino-propiónico (10).

Fórmula empírica C24H24N2O4; P.M. = 404,47; MSD (M+H) 405,2. 30

1H RMN (DMSO-d6) 3,58 (s, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,4 (m, 1H), 4,95 (m, 2H), 6,9 (m, 6H), 7,3 (m, 9H), 7,85

(d, J = 9,8 Hz, 1H).

B.1.4.) Éster metílico del ácido (S)-2-amino-3-difenilamino-propiónico (11)

Con el fin de eliminar el grupo protector Z, 2,7 g (6,68 mmol) del derivado Z-protegido (10) se disolvieron en 500 ml de metanol, y 100 mg de catalizador (Pd(OH)2 al 10%-C) se suministraron bajo una atmósfera protectora de nitrógeno. A continuación, el gas inerte se desplazó con un gran exceso de hidrógeno, y la mezcla se sacudió durante 2 h en la 5 atmósfera de hidrógeno. Con el fin de terminar la reacción, el catalizador se separó por filtración y el filtrado se concentró. Se obtuvieron 1,65 g (rendimento: 91%) de éster metílico del ácido (S)-2-amino-3-difenilamino-propiónico (11).

Fórmula empírica C16H18N2O2; P.M. = 270,32; MS (M+H) 271,2.

1H RMN (DMSO-d6) 3,45 (s, 3H), 3,58 (m, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 6,9 (m, 6H), 7,3 (m, 4H). 10

B.2.) Síntesis de aminoácidos por medio del ácido acrílico 13.

B.2.1.) Separación de los enantiómeros

Los aminoácidos racémicos que se prepararon por medio del ácido acrílico se separaron en los enantiómeros por medio de HPLC preparativa utilizando fases quirales tales como Chiralpak AD (Daicel) 100 x 380, RT, caudal 300 ml/min. La pureza de los enantiómeros pudo determinarse por medio de HPLC analítica tal como Chiralpak-AD-H 15 (Daicel) 4,6 x 250, 30?C, caudal 1 ml/min, temperatura ambiente).

B.2.2. Éster metílico del ácido (3-(N-4-fluorofenil-N-2-piridil)-amino)-2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-aminopropiónico (14)

B.2.2.1) Éster metílico del ácido 2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-acrílico (13)

50 g (0,228 mol) de Boc-serina (12) se disolvieron en 300 ml de acetonitrilo. Se añadieron 107 g (0,493 mol) de 20 anhídrido Boc y 2,64 g (22 mmol) de DMAP. La mezcla se agitó a RT durante una noche, después de lo cual el disolvente se separó i.v. y el residuo se recogió en 500 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con 500 ml de HCl 1 N y se secó utilizando sulfato de magnesio. Se obtuvieron 23 g del ácido acrílico 13 mediante cristalización en 200 ml de heptano a –30ºC y después de filtración con succión. Las aguas madre se concentraron y el residuo se disolvió en 140 ml de acetonitrilo. Se añadieron 31 g (0,142 mol) de anhídrido Boc y 1,26 g (10 mmol) de DMAP. 25 Después de calentar a 50ºC durante 8 h, el disolvente se separó i.v., y el residuo se recogió en 500 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con 400 ml de HCl 1 N y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de haber separado el disolvente i.v., se obtuvieron 31,5 g adicionales del acrilato 13 mediante cristalización en heptano. Rendimiento 54,5 g (0,181 mol) 79%.

Fórmula empírica C14H23NO6; P.M. = 301,34; MS ((M*2)+Na+) 625,7. 30

1H RMN (DMSO-d6) 1,40 (s, 18H), 3,74 (s, 3H), 5,85 (s, 1H), 6,28 (s, 1H).

B.2.2.2.) Éster metílico del ácido (3-(N-4-fluorofenil-N-2-piridil)-amino)-2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (14)

11,5 g (38,2 mmol) de acrilato 13 se mezclaron con 7,2 g (38,2 mmol) de anilina 3 y 37,3 g (114 mmol) de carbonato de cesio. Se añadieron 100 ml de acetonitrilo, y se agitó a 55ºC durante 2 días. Después de ello, se agitó a RT durante 2 días adicionales. Los sólidos se separaron por filtración con succión a través de tierra de infusorios y se lavaron 3 veces, en cada caso con 100 ml de acetonitrilo. El disolvente se separó de las fases orgánicas reunidas i.v., el residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 4:1. Rendimiento: 14 g (75%) de 14. 5

Fórmula empírica C25H32FN3O6; P.M. = 489,55; MS (M+H) 490,6.

1H RMN (CDCl3) 1,28 (s, 18H), 3,72 (s, 3H), 4,25 (dd, 1H), 4,75 (dd, 1H), 5,83 (dd, 1H), 6,22 (d, 1H), 6,56-6,61 (m, 1H), 7,05-7,12 (m, 2H), 7,19-7,26 (m, 3H), 8,18 (d, 1H).

B.2.3.) Éster metílico del ácido (3-(N-fenil-N-2-pirimidil)-amino)-2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (15)

10

3 g (7%) del aminoácido 15 se obtuvieron a partir de 35 g de 6 llevando a cabo la reacción de una manera análoga a la descrita en el apartado B.2.2.2.).

Fórmula empírica C24H32N4O6; P.M. = 472,23; MS (M+H) 473,1.

C.) Síntesis de los cuerpos básicos heterocíclicos

15

C.1.) Síntesis del cuerpo básico indol:

Ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (20)

C.1.1.) 1-dimetilamino-4,4-dimetoxipent-1-en-3-ona (18)

100 g (0,76 mol) de 3,3-dimetoxi-2-butanona (16) se agitaron junto con 90,2 g de N,N-dimetilformamida-dimetil-acetal (17) (0,76 mol) a 120ºC durante 48 h. El metanol que se formó en la reacción se separó continuamente de la solución 20 de reacción por medio de destilación. La cristalización se produjo espontáneamente cuando se enfrió la solución, completándose la cristalización al añadir un poco de heptano. Esto dio como resultado 128,24 g de producto bruto 18 (rendimiento 90%) que se hicieron reaccionar sin purificación adicional.

Fórmula empírica C9H17NO3; P.M. = 187,24; MS (M+H) 188,2.

1H RMN (DMSO-d6) 1,22 (s, 3H), 2,80 (s, 3H), 3,10 (s, 9H), 5,39 (d, J = 15 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 15 Hz, 1H).

C.1.2.) [4-(1,1-dimetoxi-etil)-pirimidin-2-il]-metil-amina (19)

1,22 g (53 mmol) de sodio se disolvieron en 100 ml de etanol absoluto. A esta solución se añadieron, con agitación, 5,8 g (53 mmol) de hidrocloruro de metilguanidina y 10 g (53 mmol) de 1-dimetilamino-4,4-dimetoxipent-1-en-3-ona (18) y el conjunto se calentó a la temperatura de ebullición durante 4 h. Con el fin de terminar la reacción, el etanol se evaporó. 5 El producto así resultante 19 se utilizó para la subsiguiente reacción sin purificación adicional. Rendimiento 11,5 g (58 mmol, cuantitativo)

Fórmula empírica C9H15N3O2; P.M. = 197,24; MS (M+H) 198,2.

1H RMN (DMSO-d6) 1,45 (s, 3H), 2,78 (s, 3H), 3,10 (s, 6H), 6,75 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,0-7,1 (s(b), 1H), 8,30 (d, J = 3 Hz, 1H). 10

C.1.3.) Ácido 2-(2-metilaminopirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (20)

5 g (25 mmol) de [4-(1,1-dimetoxi-etil)-pirimidin-2-il]-metil-amina (19) y 3,85 g ácido 4-hidrazinobenzoico, se añadieron, a la temperatura ambiente y al tiempo que se agitaba, a 150 ml de ácido sulfúrico al 50%, y la mezcla se calentó a 130ºC durante 4 h. El metanol que se formó en la reacción se separó continuamente de la solución de reacción por medio de destilación. Después de haber sido enfriado hasta 10ºC, la mezcla de reacción se vertió sobre 200 ml de 15 hielo y se ajustó a un pH de aproximadamente 5,5 con lejía de sosa concentrada. El precipitado de sulfato de sodio y la mezcla de producto que se formó en este caso se separó por filtración y el residuo del filtro se extrajo varias veces con metanol. Los extractos en metanol reunidos se concentraron y el producto 20 se purificó por medio de cromatografía de resolución rápida (DCM/metanol 9:1). Rendimiento: 0,76 g (11%).

Fórmula empírica C14H13N4O2; P.M. = 268,28; MS (M+H) 269,1. 20

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s, 3H), 6,90-7,10 (s(b), 1H), 7,18 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,4 (s, 1H), 7,58 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,30 (s, 1H), 7,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 3 Hz, 1H), 11,85 (s, 1H), 12,40-12,60 (s(b), 1H).

C.2.) Síntesis del cuerpo básico bencimidazol:

Ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (25)

25

C.2.1.) 4-dimetilamino-1,1-dimetoxibut-but-3-en-2-ona (22)

300 g (307 ml, 2,54 mol) de metilglioxal-dimetil-acetal (21) se agitaron, a 110ºC durante 4 horas (h), junto con 303 g (337 ml, 2,54 mol) de N,N-dimetilformamida-dimetil-acetal (17). El metanol que se formó durante la reacción se separó continuamente de la solución de reacción por destilación. Después de enfriar la solución de reacción, ésta se extrajo con heptano, y los disolventes se evaporaron. Esto dio como resultado 303 g de producto 22 bruto (rendimiento 70%), 30 que se hizo reaccionar sin purificación adicional.

Fórmula empírica C8H15NO3; P.M. = 173,21; MS (M+H) 174,1.

1H RMN (DMSO-d6) 2,10 (s, 1H), 2,80 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,3 (s, 3H), 4,42 (s, 1H), 5,19 (d(b), J = 12,8 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 15 Hz, 1H).

C.2.2.) (4-dimetoximetil-pirimidin-2-il)-metil-amina (23)

0,33 g (14,4 mmol) de sodio se disolvieron en 50 ml de etanol absoluto. 1,57 g (14,4 mmol) de hidrocloruro de metilguanidina y 2,48 g (14,4 mmol) de 4-dimetilamino-1,1-dimetoxi-but-3-en-2-ona (22) se añadieron a esta solución al 5 tiempo que se agitaba, y el conjunto se calentó a la temperatura de ebullición durante 3 h. La reacción se terminó evaporando el etanol. El producto 23 así obtenido se utilizó sin purificación adicional. Rendimiento 2,6 g (cuantitativo).

Fórmula empírica C8H13N3O2; P.M. = 183,21; MS (M+H) 184,1.

1H RMN (DMSO-d6) 2,78 (s, 6H), 3,10 (s, 3H), 5,02 (s, 1H), 6,62 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 3 Hz, 1H).

C.2.3.) 2-metilaminopirimidina-4-carbaldehído (24) 10

10 g (54 mmol) de (4-dimetoximetil-pirimidin-2-il)metil-amina (23) se disolvieron en 54 ml de ácido sulfúrico 2N, y la solución se calentó a 80ºC durante 3 h al tiempo que se agitaba. Después de haber enfriado la reacción, la solución de reacción se llevó cuidadosamente a un pH de aproximadamente 9 utilizando Na2CO3 sólido y se extrajo 3 veces con etanol. Los extractos secados reunidos proporcionaron el aldehído 24 del título en un rendimiento del 60% (4,47 g) después de haber evaporado el disolvente. 15

Fórmula empírica C6H7N3O; P.M. = 137,12; MS (M+H) 138,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,60-2,80 (s(b), 3H), 6,95 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,40 - 7,60 (s(b), 1H), 8,55 (d, J = 3 Hz, 1H).

C.2.4.) Ácido 2-(2-metilaminopirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (25)

4,3 g (31,3 mmol) de metilaminopirimidina-4-carbaldehído (24) y 4,8 g (31,1 mmol) de ácido 3,4-diaminobenzoico se calentaron a 150ºC durante 2 h en 300 ml de nitrobenceno. Después de haber enfriado la mezcla hasta 0ºC, el 20 precipitado del bencimidazol se separó del nitrobenceno por filtración, y el producto 25 se purificó por medio de cromatografía de resolución rápida (DCM/metanol 4:1). Rendimiento: 2,66 g (32%),

Fórmula empírica C13H11N5O2; P.M. = 269,28; MS (M+H) 270,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s, 3H), 7,50 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,35 (s, 1H), 8,55 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,70-9,05 (s(b), 1H). 25

D.) Productos finales de indol

D.1.) [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (28)

D.1.1.) Éster metílico del ácido 3-difenilamino-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-(S)-amino}- propiónico (26)

5,0 g (18,64 mmol) de ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (20) se disolvieron en 1,2 l de DMF y luego se mezclaron consecutivamente con 7,9 g (24,08 mmol) de TOTU y 7,9 ml (46,45 mmol) de etildiisopropilamina. 5 Se agitó a 5ºC durante 20 min, y a la solución se añadieron 0,73 g (3,28 mmol) de éster metílico del ácido (S)-2-amino-3-difenilamino-propiónico (11). Después de haber agitado durante 15 h, se concentró a presión reducida, el residuo se recogió en n-butanol y la fase orgánica se extrajo con una solución saturada de hidrógeno-carbonato de sodio con el fin de separar los subproductos. Después de haber secado con MgSO4 y de haber concentrado la fase orgánica, el éster metílico del compuesto del título 26 se aisló mediante cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice 10 (DCM:MeOH = 19:1). Rendimiento: 4,3 g (98%).

Fórmula empírica C30H28N6O3; P.M. = 520,22; MS (M+H) 521,3.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s(b), 3H), 3,60 (s, 3H), 4,19-4,58 (m, 2H), 4,85 (q, 1H), 6,90-7,10 (m, 7H), 7,18 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 7,50 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,35 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,70 (d, J = 3,75 Hz, 1H), 11,85 (s, 1H). 15

D.1.2.) ((S)-2-difenilamino-1-hidrazino-carbonil-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (27)

1,0 g (1,92 mmol) de éster metílico del ácido 3-difenilamino-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-(S)-amino}-propiónico (26) se disolvió en 10 ml de metanol, se mezclaron con 0,48 g (9,95 mmol) de hidrato de hidrazina, y se agitó a RT durante 15 h. El precipitado del producto (0,3 g) se separó de las aguas madre mediante filtración. 20 Hidrazida 27 adicional (0,1 g) se aisló de las aguas madre concentradas por medio de cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 19:1). Rendimiento: 0,4 g (40%).

Fórmula empírica C29H28N8O2; P.M. = 520,6; MS (M+H) 521,4.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s(b), 3H), 4,02-4,58 (m, 2H), 4,4 (s, 2H), 4,85 (q, 1H), 6,90-7,10 (m, 7H), 7,18 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,20-7,45 (m, 5H), 7,50 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 8,25 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,35 (s(b), 25 1H), 9,30 (s, 1H), 11,70 (s, 1H).

D.1.3.) [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]-oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (28)

200 mg (0,384 mmol) de ((S)-2-difenilamino-1-hidrazinocarbonil-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (27) se suspendieron en 20 ml de cloruro de metileno y se añadió gota a gota a 0ºC, mientras se 30 agitaba, una solución al 20% de fosgeno en tolueno (0,398 mmol). Se agitó a la temperatura ambiente durante 15 h

adicionales y el disolvente se evaporó. A continuación, la oxadiazolona 28 se aisló mediante cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 19:1). Rendimiento: 160 mg (76%).

Fórmula empírica C30H26N8O3; P.M. = 546,6; MS (M+H) 547,3.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s(b), 3H), 4,02-4,58 (m, 2H), 4,85 (q, 1H), 6,90-7,10 (m, 7H), 7,15 (d, J = 3 Hz, 1H), 7,20-7,40 (m, 6H), 7,52 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,92 (d, J = 3 Hz, 1H), 11,78 (s, 1H), 12,15-12,40 5 (s(b), 1H).

D.2.) {1-carbamoil-2-[(4-fluorofenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-car-boxílico (30)

D.2.1.) Éster metílico del ácido 3-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-10 carbonil]-amino}-propiónico (29)

0,75 g (1,53 mmol) de 14 se disolvieron en 10 ml de dioxano, y se enfrió hasta 0ºC. Se añadieron 10 ml de HCl 4 N en dioxano y se dejó llegar a RT en el espacio de 2 h y se agitó subsiguientemente durante 12 h. El disolvente se separó i.v.. El residuo se recogió en 10 ml de DMF (solución A). 617 mg del ácido 20 se disolvieron en 20 ml de DMF, y se enfrió hasta 0ºC. Se añadieron 1,05 g de HATU y 1,6 ml de DIEA. Después de haber agitado a 0ºC durante 40 minutos, 15 se añadió la solución A. Se dejó llegar a RT y luego se agitó subsiguientemente durante 4 h. El disolvente se separó i.v. y el residuo se repartió entre 100 ml de una solución saturada (sat.) de NaHCO3 y 100 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo 3 veces con en cada caso 50 ml de acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavaron con 100 ml de una solución saturada de NaCl. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio. Los disolventes se separaron i.v. y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice con heptano/acetato de etilo 1:3. Se obtuvieron 560 mg 20 (68%) del éster 29.

Formula empírica C29H26FN7O3; P.M. = 539,57; MS (M+H) 540,2.

D.2.2.) {1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (30)

320 mg (0,593 mmol) del éster 29 se disolvieron, a 0ºC, en 50 ml de metanol saturado con amoníaco. Se agitó durante 25 24 h y luego se dejó llegar a RT. Los disolventes se separaron i.v. y el residuo se precipitó en 5 ml de acetato de etilo. El sólido se separó por filtración con succión y se secó a 50ºC i.v.. Se obtuvieron 270 mg (87%) de la amida 30.

Formula empírica C28H25FN8O2; P.M. = 524,56; MS (M+H) 525,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,45 (s, 3H), 4,10 (d, 1H), 4,52-4,66 (m, 2H), 6,26 (d, 1H), 6,77 (t, 1H), 7,02 (bs, 1H), 7,09-7,17 (m, 2H), 7,22-7,32 (m, 5H), 7,38-7,46 (m, 1H), 7,47-7,58 (m, 3H), 7,92 (s, 1H), 8,27-8,36 (m, 2H), 8,59 (d, 1H), 11,70 (s, 30

1H).

D.3.) [(S)-1-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,3-oxadiazol-2-il)-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (33)

D.3.1.) Éster metílico del ácido (3-(N-fenil-N-2-piridil)-amino)-2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (31) 5

4,96 g (16,5 mmol) de acrilato 13 se mezclaron con 5,6 g (32,9 mmol) de 2-anilinopiridina y 32,16 g (98,7 mmol) de carbonato de cesio. Se añadieron 50 ml de acetonitrilo, y se agitó a 45ºC durante 2 días. El sólido se separó por filtración con succión a través de tierra de infusorios y se lavó 3 veces con en cada caso 100 ml de acetonitrilo. Las fases orgánicas reunidas se evaporaron y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/dietiléter 1:1. Se obtuvieron 5,66 g (73%) del éster 31. 10

Fórmula empírica C25H33N3O6; P.M. = 471,56; MS (M+H) 472,2.

D.3.2.) Los enantiómeros se separaron según se describe en el apartado B.2.1).

D.3.3.) Éster metílico del ácido 2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-(fenil-piridin-2-il-amino)-propiónico de metilo (32)

2,9 g del enantiómero S de 31 se disolvieron en 30 ml de dioxano, y se enfrió a 0ºC. Se añadieron 30 ml de HCl 4 N en 15 dioxano, después de lo cual se dejó llegar a RT y luego se agitó durante 12 h. El disolvente se separó i.v.. El residuo se recogió en 30 ml de DMF (solución A). 2,47 g (9,2 mmol) del ácido 20 se disolvieron en 50 ml de DMF y se enfriaron hasta 0ºC. Se añadieron 4,21 g de HATU y 6,4 ml de DIEA. Después de haber agitado a 0ºC durante 45 minutos, se dejó llegar a RT y se añadió solución A. Se agitó a RT durante 12 h. El disolvente se separó i.v. y el residuo se repartió entre 300 ml de una solución sat. de NaHCO3 y 300 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo 3 veces con en 20 cada caso 100 ml de acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavaron con 400 ml de una solución sat. de NaCl. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio. Los disolventes se separaron i.v. y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 1:3. Se obtuvieron 1,78 g (55%) del éster 32.

Formula empírica C29H27N7O3; P.M. = 521,58; MS (M+H) 522,2.

D.3.4.) [(S)-1-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,3-oxadiazol-2-il)-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-25 pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (33)

1,78 g (3,4 mmol) del éster 32 se disolvieron en 30 ml de MeOH. Se añadieron 0,83 ml de hidrato de hidrazina, y se

agitó a 40ºC durante 5 h. Después de ello, se añadieron 1,6 ml adicionales de hidrato de hidrazina, y se agitó a RT durante 15 h. Los disolventes se separaron i.v. y el residuo se recogió en 80 ml de diclorometano. Se añadieron 3,2 ml de una solución al 20% de fosgeno en tolueno y se agitó durante 3 días. Después de ello, el disolvente se separó i.v. y el residuo se repartió entre 80 ml de agua y 80 ml de acetato de etilo. Con ello, precipitó un sólido y se separó por filtración con succión. La fase orgánica se concentró y el residuo se combinó con el sólido y se cromatografió sobre gel 5 de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 1:5. Se obtuvieron 390 mg (21%) de la oxadiazolona 33.

Formula empírica C29H25N9O3; P.M. = 547,58; MS (M+H) 548,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,96 (s, 3H), 4,30 (dd, 1H), 4,67 (dd, 1H), 5,40 (dd, 1H), 6,32 (d, 1H), 6,70-6,75 (m, 1H), 6,98 (bs, 1H), 7,16 (d, 1H), 7,22-7,33 (m, 4H), 7,38-7,46 (m, 3H), 7,52 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 8,08 (s, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,31-8,35 (m, 1H), 9,00 (d, 1H), 11,72 (s, 1H), 12,15 (s, 1H). 10

D.4.) {1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (35)

D.4.1.) Éster metílico del ácido 3-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-2-{[2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-propiónico (34) 15

370 mg (46%) del éster metílico 34 se obtuvieron a partir de 750 mg de 14 cuando se llevó a cabo la reacción de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.1.).

Fórmula empírica C28H24FN7O3; P.M. = 525,55; MS (M+H) 526,2.

D.4.2.) {1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (35) 20

95 mg (65%) de la amida 35 se obtuvieron a partir de 150 mg de 34 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C27H23FN8O2; P.M. = 510,54; MS (M+H) 511,2.

1H RMN (DMSO-d6) 4,08-4,17 (m, 1H), 4,54-4,65 (m, 2H), 6,29 (d, 1H), 6,54 (s, 2H), 6,74-6,80 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,22-7,31 (m, 4H), 7,38-7,56 (m, 6H), 7,92 (s, 1H), 8,29-8,35 (m, 2H), 8,74 (d, 1H), 11,80 (s, 1H). 25

D.5.) [2-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-1-(4H-[1,2,4]triazol-3-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (36)

30 mg (0,25 mmol) de la amida 35 se disolvieron en 10 ml de DMF. Se añadieron 40 μl de DMF-dimetilacetal, y se calentó a 90ºC durante 4 h. El disolvente se separó i.v. y el residuo se recogió en 3,5 ml de ácido acético. Después de haber añadido 27 μl de hidrato de hidrazina, la mezcla se agitó durante 18 h. El disolvente se separó i.v. y el residuo se purificó por medio de HPLC preparativa. Se obtuvieron 84 mg (50%) del triazol 36. 5

Fórmula empírica C29H25FN10O; P.M. = 548,59; MS (M+H) 549,2.

1H RMN (DMSO-d6) 3,04 (s, 3H), 4,36-4,43 (m, 1H), 4,49-4,59 (m, 1H), 5,60-5,67 (m, 1H), 6,50 (d, 1H), 6,78 (t, 1H), 7,17-7,37 (m, 7H), 7,45-7,65 (m, 4H), 8,02 (s, 1H), 8,19 (d, 1H), 8,35 (d, 1H), 8,39 (d, 1H), 11,85 (s, 1H).

D.6.) [1-carbamoil-2-(fenil-tiazol-2-il-amino)etil]-amida del ácido S-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (42) 10

D.6.1.) feniltiazol-2-ilamina (39)

10 g (65,7 mmol) de feniltiourea 37 se disolvieron en 100 ml de ácido acético. Se añadieron 9,9 ml del acetal 38, y la mezcla se calentó a 100ºC durante 2 h. El disolvente se separó i.v. y el residuo se repartió entre 300 ml de NaOH 1 N y 300 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo 2 veces con en cada caso 100 ml de acetato de etilo y las fases 15 orgánicas reunidas se secaron con sulfato de magnesio. El disolvente se separó y el residuo se precipitó en 50 ml de diisopropil-éter. El sólido se separó por filtración con succión y se secó a 50ºC i.v.. Se obtuvieron 2,5 g de anilina 39. Las aguas madre de diisopropil-éter se concentraron y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 2:1. Con ello se obtuvieron 3,5 g adicionales de 39. Rendimiento: 6,0 g (52%).

Fórmula empírica C9H8N2S; P.M. = 176,24; MS (M+H) 177,1. 20

D.6.2.) Éster metílico del ácido (3-(N-fenil-N-2-tiazolil)-amino)-2-(di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (40)

4,5 g (75%) del éster 40 se obtuvieron a partir de 3,8 g (12,5 mmol) del acrilato 13, 2,2 g (12,5 mmol) de la anilina 39 y

20 g de carbonato de cesio cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.3.1.)

Fórmula empírica C23H31N3O6S; P.M. = 477,58; MS (M+H) 478,2.

D.6.3.) Los enantiómeros se separaron según se describe en el apartado B.2.1.).

D.6.4.) Éster metílico del ácido S-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-(fenil-tiazol-2-il-amino)-5 propiónico (41)

640 mg (55%) de 41 se obtuvieron a partir de 1,07 g (2,2 mmol) del éster 40 y 901 mg (3,3 mmol) del ácido 20 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.3.3.).

Fórmula empírica C27H25N7O3S; P.M. = 527,61; MS (M+H) 528,1.

D.6.4.) [1-carbamoil-2-(fenil-tiazol-2-il-amino)-etil]-amida del ácido S-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-10 carboxílico (42)

340 mg (70%) de la amida 42 se obtuvieron a partir de 500 mg (0,95 mmol) de 41 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C26H24N8O2S; P.M. = 512,60; MS (M+H) 513,3.

1H RMN (DMSO-d6) 2,97 (s, 3H), 4,23-4,30 (m, 1H), 4,39-4,48 (m, 1H), 4,71-4,78 (m, 1H), 6,78 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 15 7,28-7,35 (m, 3H), 7,37-7,60 (m, 7H), 7,98 (s, 1H), 8,33 (d, 1H), 8,62 (d, 1H), 11,70 (s, 1H).

D.7.) [1-metoxicarbamoil-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido S-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (43)

800 mg (0,95 mmol) de hidrocloruro de O-metilhidroxilamina se disolvieron en 10 ml de THF y se enfriaron hasta 20

-40ºC. Se añadieron gota a gota 0,95 ml (1,9 mmol) de una solución 2 M de cloruro de isopropil-magnesio en THF. Se dejó llegar a –20ºC en el espacio de 1 h. Después se añadió gota a gota una solución de 100 mg (0,19 mmol) del éster 32 en 3 ml de THF. Se dejó llegar a RT en el espacio de 4 h, y la reacción se finalizó añadiendo 5 ml de agua. El THF se separó i.v. y el residuo se repartió entre 20 ml de una solución saturada de cloruro de amonio y 20 ml de acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo 3 veces con en cada caso 20 ml de acetato de etilo y las fases orgánicas reunidas se 25 secaron utilizando sulfato de magnesio. El disolvente se separó i.v. y el residuo se purificó por medio de HPLC preparativa. Se obtuvieron 60 mg (61%) del hidroxamato de metilo 43.

Fórmula empírica C29H28N8O3; P.M. = 536,60; MS (M+H) 537,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s, 3H), 3,52 (s, 3H), 4,09-4,18 (m, 1H), 5,51-4,62 (m, 2H), 6,33 (d, 1H), 6,78 (t, 1H), 7,00 (bs, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,25-7,33 (m, 4H), 7,49-7,61 (m, 5H), 7,98 (s, 1H), 8,29-8,36 (m, 2H), 8,79 (d, 1H), 11,31 (s, 1H), 30

11,75 (s, 1H).

D.8.) [1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil]-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (45)

D.8.1.) Éster metílico del ácido 3-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-2-{[2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-propiónico (44) 5

816 mg (80%) del éster metílico 44 se obtuvieron a partir de 540 mg de rac-10 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en los apartados B.1.4.) y D.1.1.).

Fórmula empírica C29H26N6O3; P.M. = 506,56; MS (M+H) 507,37.

D.8.2.) [1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil]-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (45)

162 mg (67%) de la amida 45 se obtuvieron a partir de 150 mg de 44 cuando la reacción se llevó a cabo de una 10 manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C28H25N7O2; P.M. = 491,56; MS (M+H) 492,32.

1H RMN (DMSO-d6) 3,18 (s(b), 3H), 4,05-4,13 (m, 2H), 4,85 (q, 1H), 6,58 (s(b), 2H), 6,88-7,59 (m, 19H), 7,98 (s, 1H), 8,25 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,35 (d, J = 2 Hz, 1H), 11,78 (s, 1H).

D.9.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-15 carboxílico (47)

D.9.1.) Éster metílico del ácido 3-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-propiónico (46)

1,75 mg (67%) del éster metílico 46 se obtuvieron a partir de 2,36 g de 15 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.1.).

Fórmula empírica C28H26N8O3; P.M. = 522,57; MS (M+H) 523,3.

D.9.2.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (47) 5

440 mg (65%) de la amida 47 se obtuvieron a partir de 700 mg de 46 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C27H25N9O2; P.M. = 507,21; MS (M+H) 508,4.

1H RMN (DMSO-d6) 3,0 (s(b), 3H), 4,20-4,32 (m, 1H), 4,45-4,59 (m, 2H), 4,75-4,90 (m, 1H), 6,75 (m, 1H), 7,10-7,60 (m, 12H), 7,95 (s, 1H), 8,35-8,45 (m, 4H), 11,85 (s(b), 1H). 10

D.10) [1-(2-hidroxietilcarbamoil)-2-(fenil-pirimidin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (49)

D.10.1.) Ácido 2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-(fenil-pirimidin-2-il-amino)-propiónico (48)

4,0 g del éster metílico 46 se disolvieron en 400 ml de metanol. A ello se añadieron 40 ml de una solución acuosa 2 N 15 de NaOH, y se agitó a la temperatura ambiente durante 12 h. Después de haber evaporado los disolventes, el residuo se disolvió con agua y el pH se ajustó a  5 utilizando una solución saturada de NaH2PO4. El precipitado resultante se separó por filtración y se lavó con agua. Así se obtuvieron 1,3 g (rendimiento 93%) del ácido 48.

Fórmula empírica C29H26N6O3; P.M. = 506,21; MS (M+H) 507,3.

D.10.2.) [1-(2-hidroxietilcarbamoil)-2-(fenil-pirimidin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-20 indol-5-carboxílico (49)

200 mg del ácido 48 se disolvieron en 2 ml de DMF absoluta. Se añadieron 94 mg de HOAt y 158 μl de DIEA. Luego se añadieron gota a gota 56 μl de etanolamina y se enfrió hasta 0ºC y se añadieron 195 mg de EDC. Después de agitar durante 2 días a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó y el producto bruto se purificó por medio de MPLC (eluyente: DCM:MeOH = 9:1). Rendimiento: 108 mg (50%) de la amida 49 del título. 25

Fórmula empírica C31H31N8O2; P.M. = 549,64; MS (M+H) 550,4.

1H RMN (DMSO-d6) 1,2 (t, 2H), 3,0 (s(b), 3H), 3,35 (t, 1H), 4,00-4,32 (m, 2H), 4,80-4,99 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 7,00-7,65 (m, 7H), 7,90 (m, 1H), 8,35-8,40 (m, 1H), 11,90 (s(b), 1H).

D.11.) Ácido (S)-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-[fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amino]-propiónico (54) 30

D.11.1.) Fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amina (51)

5,1 g (78%) de la anilina 51 se obtuvieron a partir de 5,1 g de la anilina (4) y 5 g de cloropirimidina 50 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado A.1.).

Fórmula empírica C11H8F3N3; P.M. = 239,20; MS (M+H) 240,1. 5

D.11.2.) Éster metílico del ácido (3-(N-fenil-N-4-trifluorometilpirimidin-2-il)-amino)-2-di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (52)

3,9 g (86%) del éster 52 se obtuvieron a partir de 2,5 g (8,4 mmol) del acrilato 13, 3 g (12,5 mmol) de la anilina 51 y 16 g (50 mmol) de carbonato de cesio cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.3.1.). 10

Fórmula empírica C25H31F3N4O6; P.M. = 540,54; MS (M+H) 541,2.

D.11.3.) Los enantiómeros se separaron según se describe en el apartado B.2.1.).

D.11.4.) Éster metílico del ácido S-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-[fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amino]-propiónico (53)

467 mg (58%) de 53 se obtuvieron a partir de 743 mg (1,375 mmol) del enantiómero S del éster 52 y 550 mg (1,436 15 mmol) del ácido 20 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.3.3.).

Fórmula empírica C29H25F3N8O3; P.M. = 590,57; MS (M+H) 591,7.

D.11.5.) Ácido (S)-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-[fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amino]-propiónico (54)

38 mg (40%) del ácido 54 se obtuvieron a partir de 97 mg (0,164 mmol) del éster 53 cuando la reacción se llevó a cabo 20 de una manera análoga a la descrita en el apartado D.10.1.).

Fórmula empírica C28H23F3N8O3; P.M. = 576,54; MS (M+H) 577,7.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s, 3H), 4,27-4,34 (m, 1H), 4,54-4,63 (m, 1H), 4,83-4,92 (m, 1H), 6,90 (bs, 1H), 7,15 (d, 2H), 7,19-7,23 (m, 1H), 7,27-7,36 (m, 5H), 7,45-7,55 (m, 2H), 7,96 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,41 (bs, 1H), 8,66 (d, 1H), 11,70 (s, 1H). 25

D.12.) {1-carbamoil-2-[(4-fluorofenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-

1H-indol-5-carboxílico (61)

D.12.1.) Éster pentafluorofenílico del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (55)

6,38 g (23,78 mmol) del ácido 20 se suspendieron en 100 ml de THF. A ello se añadieron 5,25 g (28,54 mmol) de pentafluorofenol y 5,47 g (28,54 mmol) de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC*HCl). Se 5 agitó a RT durante 15 h, después de lo cual el disolvente se separó i.v. y el residuo se repartió entre 300 ml de una solución sat. de NaHCO3 y 300 ml de acetato de etilo. Los sólidos se separaron por filtración a través de tierra de infusorios, y el residuo se lavó 2 veces con en cada caso 100 ml de acetato de etilo. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo 2 veces con en cada caso 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con 200 ml de una solución sat. de NaCl y luego se secaron con MgSO4. Después de haber separado los disolventes i.v., el 10 residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 1:1. Se obtuvieron 4,7 g (46%) del éster pentafluorofenílico 55.

Fórmula empírica C20H11F5N4O2; P.M. = 434,33; MS (M+H) 435,4.

D.12.2.) 2-cloro-5-metil-pirimidina (57)

10,0 g (61,35 mmol) de 2,4-dicloro-5-metilpirimidina (56) se disolvieron en 50 ml de THF. Se añadieron 12,93 g (184 15 mmol) de zinc y se calentó a reflujo. Después se añadió lentamente, gota a gota, una solución de 3,51 ml (61,35 mmol) de ácido acético en 10 ml de THF. Después de haber concluido la adición, se calentó a reflujo durante 1 h adicional. Se añadieron gota a gota 1,5 ml adicionales de ácido acético en 5 ml de THF y se calentó a reflujo durante 1 h. Luego se dejó enfriar hasta RT, después de lo cual se filtró a través de tierra de infusorios; a ello le siguieron 2 lavados con en cada caso 20 ml de THF. Los disolventes se separaron i.v. y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice. Se 20 obtuvieron 4,7 g (60%) de la cloropirimidina 57.

Fórmula empírica C5H5ClN2; P.M. = 128,56; MS (M+H) 129,2.

D.12.3.) (4-fluoro-fenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amina (58)

1,8 g (45%) de la anilina 58 se obtuvieron a partir de 2,5 g (19,45 mmol) de 2-cloro-5-metilpirimidina (57) y 2,7 g (24,31 mmol) de 4-fluoroanilina (1) cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado A.1.). 5

Fórmula empírica C11H10FN3; P.M. = 203,22; MS (M+H) 204,2.

D.12.4.) Éster metílico del ácido (3-N-4-fluoro-fenil-N-5-metil-pirimidin-2-il)-amino)-2-di-terc.-butiloxicarbonil)-amino-propiónico (59)

2,88 g (64%) del éster 59 se obtuvieron a partir de 2,67 g (8,86 mmol) del acrilato 10, 1,8 g (8,86 mmol) de la anilina 58 y 8,66 g (26,58 mmol) de carbonato de cesio cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita 10 en el apartado D.3.1.).

Fórmula empírica C25H33FN4O6; P.M. = 504,56; MS (M+H) 505,6.

D.12.5.) Éster metílico del ácido 3-[(4-fluoro-fenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amino]-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-propiónico (60)

500 mg (0,991 mmol) del éster 59 se disolvieron en 10 ml de diclorometano y se enfrió hasta 0ºC. Se añadieron 5 ml de 15 TFA, se dejó llegar a RT y se agitó durante 1 h. Los disolventes se separaron i.v.. El residuo se recogió en 10 ml de DMF, y se añadieron 430 mg (0,991 mmol) de 55 y 1,38 ml (7,93 mmol) de DIEA. Se dejó agitar a RT durante 15 h, los disolventes se separaron i.v. y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 1:3. Se obtuvieron 423 mg (77%) de 60.

Fórmula empírica C29H27FN8O3; P.M. = 554,59; MS (M+H) 555,2. 20

D.12.6.) {1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (61)

250 mg (99%) de la amida 61 se obtuvieron a partir de 260 mg (0,469 mmol) del éster 60 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C28H26FN9O2; P.M. = 539,58; MS (M+H) 540,2. 25

1H RMN (DMSO-d6) 2,11 (s, 3H), 2,95 (s, 3H), 4,21 (dd, 1H), 4,48 (dd, 1H), 4,75-4,80 (m, 1H), 7,01 (bs, 1H), 7,10-7,16 (m, 4H), 7,22-7,30 (m, 3H), 7,43 (s, 1H), 7,47-7,53 (m, 2H), 7,91 (s, 1H), 8,26 (s, 2H), 8,29-8,34 (m, 2H), 11,70 (s, 1H).

F.) Productos finales de bencimidazol

F.1.) ((S)-1-carbamoil-2-difenilamino-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (63) 30

F.1.1.) Éster metílico del ácido 3-difenilamino-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carbonil]-(S)-amino}-propiónico (62)

2,6 g (9,6 mmol) de ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (25) se disolvieron en 300 ml de DMF y se añadieron consecutivamente 3,17 g (9,6 mmol) de TOTU y 1,6 ml (11,6 mmol) de etildiisopropilamina. Se 5 agitó a 5ºC durante 20 min y se añadieron a la solución 2,6 g (9,6 mmol) de éster metílico del ácido (S)-2-amino-3-difenilamino-propiónico (11). Después de haber agitado durante 16 h, se concentró a presión reducida, a continuación el éster metílico 62 se aisló por medio de cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice (DCM:MeOH = 9:1). Rendimiento: 1,61 g (32%).

Fórmula empírica C29H27N7O3; P.M. = 521,58; MS (M+H) 522,3. 10

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s(b), 3H), 3,60 (s, 3H), 4,19-4,40 (m, 2H), 4,90 (q, 1H), 6,90-7,10 (m, 6H), 7,25-7,35 (m, 6H), 7,40 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,60-7,80 (d(b), 1H), 8,05-8,25 (d(b), 1H), 8,45 (d, J = 3 Hz, 1H), 8,90 (s(b), 1H), 11,85 (s(b), 1H).

F.1.2.) ((S)-1-carbamoil-2-difenilamino-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (63) 15

50 ml de metanol (absoluto) se saturaron con amoníaco a 0ºC. A ello se añadieron 0,5 g (0,959 mmol) de éster metílico del ácido 3-difenilamino-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carbonil]-(S)-amino}-propiónico (62), y se agitó a la temperatura ambiente durante 24 h. Después de haber evaporado el disolvente y el amoníaco en exceso, la amida 63 se aisló por medio de cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice (DMC:MeOH = 19:1). Rendimiento: 0,43 g (89%). 20

Fórmula empírica C29H28N8O2; P.M. = 506,57; MS (M+H) 507,2.

1H RMN (DMSO-d6) 2,95 (s(b), 3H), 4,02-4,35 (m, 2H), 4,85 (q, 1H), 6,80-7,10 (m, 6H), 7,15-7,25 (m, 5H), 7,40 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,58 (d(b), 1H), 7,68 (s(b), 1H), 8,06-8,19 (d(b), 1H), 8,40-8,58 (m, 2H), 13,10 (s, 1H).

F.2.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (65) 25

F.2.1.) Éster metílico del ácido 3-{(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carbonil]-amino}-propiónico (64)

210 mg (29%) del éster metílico 64 se obtuvieron a partir de 657 mg de 15 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.1.). 5

Fórmula empírica C27H25N9O3; P.M. = 523,56; MS (M+H) 524,2.

F.2.2.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (65)

110 mg (65%) de la amida 65 se obtuvieron a partir de 200 mg de 64 cuando la reacción se llevó a cabo de una manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.). 10

Fórmula empírica C26H24FN10O2; P.M. = 508,55; MS (M+H) 509,3.

1H RMN (DMSO-d6) 3,0 (s(b), 3H), 4,20-4,32 (m, 1H), 4,41-4,55 (m, 2H), 4,80-4,90 (m, 1H), 6,75 (m, 1H), 7,10-7,50 (m, 10H), 7,65 (q, 2H), 8,10 (s, 1H), 8,45 (d, 2H), 8,50 (d, 1H), 8,58 (d, 1H), 12,95 (s(b), 1H).

F.3.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (67) 15

F.3.1.) Éster metílico del ácido 3-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carbonil]-amino}-propiónico (66)

0,85 g (22%) del éster metílico 66 se obtuvieron a partir de 3,44 g de 31 cuando la reacción se llevó a cabo de una

manera análoga a la descrita en el apartado D.2.1.).

Fórmula empírica C28H26N8O3; P.M. = 522,57; MS (M+H) 523,3.

F.3.2.) {1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico (67)

160 mg (98%) de la amida 67 se obtuvieron a partir de 200 mg de 66 cuando la reacción se llevó a cabo de una 5 manera análoga a la descrita en el apartado D.2.2.).

Fórmula empírica C27H25N9O2; P.M. = 507,56; MS (M+HCOO-) 552,3.

1H RMN (DMSO-d6) 3,0 (s(b), 3H), 4,20-4,32 (m, 1H), 4,41-4,55 (m, 2H), 4,70-4,80 (m, 1H), 6,63 (m, 1H), 6,85 (m, 1H), 7,20-7,75 (m, 14H), 8,10 (s, 1H), 8,20 (d, 2H), 8,50 (d, 1H), 8,88 (d, 1H).

Ejemplos farmacológicos 10

ELISA de IκB quinasa:

La actividad de la IκB quinasa se determinó utilizando un ELISA que consistía en un péptido sustrato biotinilado que contenía la secuencia de aminoácidos de la proteína de IκB desde la serina 32 a la serina 36 y un anticuerpo policlonal o monoclonal específico (por ejemplo, obtenido de New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU., cat: 9240) que solamente se unía a la forma fosforilada del péptido IκB. Este complejo se inmovilizó sobre una placa de unión de 15 anticuerpos (revestida con proteína A) y se detectó utilizando un conjugado compuesto de una proteína de unión a biotina y HRP (por ejemplo estreptavidina-HRP). La actividad se cuantificó con ayuda de una curva estándar que se construyó utilizando el sustrato fosfopéptido.

Implementación:

Con el fin de obtener el complejo de quinasa, 10 ml de extracto S100 de células HeLa S3 se diluyeron con 40 ml de 20 HEPES 50 mM, pH 7,5, llevado al 40% con respecto al sulfato de amonio y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. El sedimento precipitado se disolvió en 5 ml de tampón SEC (HEPES 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, EDTA 0,5 mM, 2-glicerofosfato 10 mM), se centrifugó a 20.000 x g durante 15 minutos y se filtró a través de un filtro de 0,22 μm. La muestra se cargó sobre una columna Superose-6 FPLC de 320 ml (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) que había sido equilibrada con tampón SEC y que se hizo funcionar a 4ºC con un caudal de 2 ml/min. Las 25 fracciones que se localizaron en el tiempo de migración del patrón de peso molecular de 670 kDa se combinaron para la activación. La activación se consiguió por medio de una incubación durante 45 minutos con 100 nM de MEKK1Δ, 250 μM de MgATP, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM, 2-glicerofosfato 10 mM y 2,5 μM de microcistina-LR a 37ºC. La enzima activada se almacenó a –80ºC.

Las sustancias de ensayo (2 μl), disueltas en DMSO, se preincubaron, a 25ºC durante 30 minutos, con 43 μl de enzima 30 activada (diluida en la relación 1:25 en tampón de reacción HEPES 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, β-glicerofosfato 10 mM, 2,5 μM de microcistina-LR). Luego se añadieron 5 μl de sustrato péptido (biotina-(CH2)6-

DRHDSGLDSMKD-CONH2) (200 μM), se incubó durante una hora y la reacción se detuvo con 150 μl de HEPES 50 mM, pH 7,5, BSA al 0,1%, EDTA 50 mM, anticuerpo [1:200]. 100 μl de la mezcla de reacción detenida o de una serie de dilución de fosfopéptidos estándar (biotina-(CH2)6-DRHDS[PO3]GLDSMKD-CONH2) se transfirieron a una placa de 35 proteína A (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, EE.UU.),y se incubó durante 2 horas al tiempo que se sacudía. Después de 3 etapas de lavado con PBS, se añadieron durante 30 minutos 100 μl de 0,5 μg/ml de estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) (diluida en HEPES 50 mM/BSA al 0,1%). Después de 5 etapas de lavado con PBS, se añadieron 100 μl de sustrato TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, EE.UU.) y el desarrollo de color se detuvo añadiendo 100 μl de ácido sulfúrico 0,18 M. La absorción se midió a 450 nm. La curva estándar se produjo 40 mediante regresión lineal correspondiente a una relación de dosis-efecto de 4 parámetros. La curva estándar se utilizó para cuantificar la actividad enzimática o su inhibición por parte de las sustancias de ensayo.

La CI50 para [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico era 0,050 μM.

Nivel en plasma sanguíneo de [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-45 metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico

El compuesto [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pi-rimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, denominado compuesto 28 en lo que sigue, se administró a ratones C57/BL6

machos. Para ello, en cada caso se administraron aproximadamente 25 mg de compuesto 28 por kg de peso corporal de los ratones, molidos en húmedo en hidroxietil-celulosa (HEC) al 0,5%, por vía oral en forma de una suspensión (por medio de una sonda esofágica). Se tomaron muestras de sangre después de 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6 y 8 horas (la sangre del sacrificio se retiró de en cada caso 2 animales en cada uno de los instantes mencionados). Las muestras de sangre se convirtieron en plasma heparínico. Las muestras de plasma se almacenaron a -20?C hasta que se analizaron. 5

Análisis:

Las muestras de plasma se descongelaron. Las proteínas del plasma que interferían con el análisis se precipitaron luego con acetonitrilo.

Tratamiento: 50 μl de plasma + 20 μl de patrón interno (5 μg/ml) + 50 μl de tampón (2 mmol de solución de formiato de amonio, pH 2,6/acetonitrilo, 40:60, v/v) se mezclaron durante aproximadamente 10 s en un Whirlmixer. Después se 10 añadieron 150 μl de acetonitrilo y el conjunto se mezcló una vez de nuevo durante aproximadamente 10 s. Después, las muestras se centrifugaron (Hettich, EBA 12, aproximadamente 12000 revoluciones por minuto). El material sobrenadante (aproximadamente 200 μl) se transfirió a recipientes de vidrio. Se inyectaron 70 μl del material sobrenadante.

El respectivo material sobrenadante se utilizó para determinar el contenido en nivel de plasma del compuesto 13 por 15 medio de LC-MS/MS de acuerdo con el siguiente método:

Sistema HPLC: Agilent 1100

Software: Analyst

Columna: 125 x 4 mm Nucleosil 120 5 C18 (Machery & Nagel)

Longitud de la columna: 125 mm 20

Detección: LC-MS/MS

Instrumento MS: PE-Sciex API 365 (espectrómetro de masas Triple Quadrupole)

Software : software MacQuan (PE-Sciex)

Tipo de detección: MS/MS (MRM)

Caudal: 0,5 mL/min 25

Volumen de inyección: 70 μl

Patrón interno: SK-7 en acetonitrilo

Fase móvil: acetonitrilo/2 mmol de solución de formiato de amonio, pH 2,6 (70:30, v/v)

Tiempos de retención (Rt):

Patrón interno: 4,4 min 30

Compuesto 28: 3,9 min

El límite de detección inferior del método es 0,01 μg/ml.

Resultados:

El nivel en plasma del compuesto 28 era a lo sumo de 4,3 μg/ml. La exposición, medida como ADC = área debajo de la curva, era 5,4 μg/ml x h. 35

Proteína tirosina quinasa

Como ejemplos de la especificidad de los inhibidores de IκB quinasa que habían sido descubiertos, se determinaron sus valores CI50 en el caso de la enzima quinasa proteína tirosina quinasa.

La actividad de la proteína tirosina quinasa se determinó utilizando el kit de ensayo apropiado procedente de Upstate Biotechnologie de acuerdo con las instrucciones del fabricante y a una concentración de ATP de 50 μM. A diferencia 40 del método del fabricante, se utilizaron placas Multi-Screen (Millipore; fosfocelulosa MS-PH, cat. MAPHNOB10, o

Durapore PVDF, cat. MADVNOB 50), junto con el sistema de agotamiento apropiado, en lugar de filtros de fosfocelulosa. Como sustrato del kit de ensayo se utilizó Poly (Glu, Tyr 4:1) (Sigma cat. P0275) a una concentración de ensayo de 1 mg/ml. A continuación, las placas se midieron en un contador de centelleo Wallac MicroBeta. En cada caso se utilizaron 100 μM de la sustancia de ensayo.

La sustancia de ensayo se sometió a ensayo en una determinación por duplicado. Los cálculos de CI50 se efectuaron 5 utilizando el paquete de software GraFit 3,0.

La CI50 para [(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico (compuesto 28) en el análisis de la proteína tirosina quinasa era 82,5 μM.

Experimento comparativo:

El compuesto 10

se preparó según se describe en el documento WO 01/30774 y se denomina en lo que sigue el compuesto comparativo. El compuesto comparativo se administró a ratones NMRI machos. Para ello, en cada caso aproximadamente 50 mg del compuesto comparativo por kg de peso corporal de los ratones se administraron por vía oral en forma de una suspensión en HEC al 0,5% (por medio de una sonda esofágica). Se tomaron muestras de sangre 15 después de 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6 y 8 horas (la sangre del sacrificio se retiró en caso de 2 animales en cada uno de los instantes mencionados). Las muestras de sangre se convirtieron en plasma heparínico. Las muestras de plasma se almacenaron a –20ºC hasta que se analizaron.

Análisis: El análisis se llevó a cabo utilizando HPLC/UV.

Tratamiento: 50 μl de plasma + 20 μl de patrón interno (5 μg/ml) + 50 μl de tampón (ácido fórmico al 1%/acetonitrilo, 20 40:60, v/v) se mezclaron durante aproximadamente 10 s en un Whirlmixer. Después se añadieron 150 μl de acetonitrilo, y se mezcló de nuevo durante aproximadamente 10 s. Después, las muestras se centrifugaron (Hettich, EBA 12, aproximadamente 12000 revoluciones por min). El material sobrenadante (aproximadamente 200 μl) se transfirió a recipientes de vidrio. Se inyectaron 100 μl del material sobrenadante.

El material sobrenadante respectivo se utilizó para determinar el contenido en nivel de plasma de compuesto 25 comparativo por medio de HPLC/UV de acuerdo con el siguiente método:

Sistema HPLC: Bomba Gynkoteck P580 HPG + automuestreador Gilson Abimed XL-231

Software: Mass-chrom

Columna: 125 x 4 mm Protosil 120 3 ODS AQ 3 (de Bischoff)

Longitud de la columna: 125 mm 30

Detección: LC-MS/MS

Instrumento MS: PE-Sciex API 365 (espectrómetro de masas Triple Quadrupole)

Software: software MacQuan (PE-Sciex)

Tipo de detección: MS/MS (MRM)

Caudal: 0,5 mL/min 35

Volumen de inyección: 100 μl

Patrón interno: SK-7 (compuesto de Aventis) en acetonitrilo

Tiempos de retención (Rt):

Patrón interno: 4 min

Compuesto comparativo: 1,5 min

A 0,01 μg/mL, el límite de detección inferior era idéntico al obtenido cuando se empleaba LC-MS/MS utilizando el 5 compuesto 28.

Resultados: el nivel en plasma del compuesto comparativo era a lo sumo de 1,5 μg/ml. La exposición, medida como el ADC = área bajo la curva, era 1,7 μg/ml x h.

En comparación con el ejemplo utilizando el compuesto 28, el nivel en plasma sanguíneo máximo era aproximadamen-te 60% inferior en el experimento comparativo, a pesar de que, a 50 mg/kg, el compuesto comparativo se administró a 10 una dosis que era el doble de alta que en el caso del compuesto 28. Los valores de ADC que se determinaron para el compuesto comparativo proporcionan también el mismo resultado.

En el análisis de la proteína tirosina quinasa antes descrito, la CI50 para el compuesto comparativo era 46,35 μM. Por lo tanto, la CI50 es acusadamente mejor que en el caso del compuesto 28.

La mejora en la especificidad con respecto a la IκB quinasa se vuelve incluso más evidente cuando se comparan las 15 relaciones de los valores CI50 para la proteína tirosina quinasa con relación a la IκB quinasa. En el caso del compuesto 28, esta relación es 1650 (82,5/0,05), mientras que en el caso del compuesto comparativo es de 46,35 (46,35/1,0; de acuerdo con los datos procedentes del documento WO 01/30774).

Las relaciones de especificidad y/o los niveles en plasma y la exposición de los otros ejemplos se determinaron de una manera análoga. 20

Ejemplo nº: Fórmula molecular compuesto neutro Peso molecular IKK CI50 50 μM Relación de especificidad

28: C30 H26 N8 O3 546,59 0,05 1650

30: C28 H25 FN8 O2 524,56 0,05 > 200

33: C29 H25 N9 O3 547,58 0,012 > 833

35: C27 H23 FN8 O2 510,54 0,01 > 1000

36: C29 H25 FN10 O 548,59 0,005 > 2000

42: C26 H24 N8O2S 512,60 0,009 > 1110

43: C29 H28 N8O3 536,60 0,0008 > 12500

45: C28 H25 N7O2 491,55 0,015 > 665

47: C27 H25 N9O2 507,56 0,006 > 1665

49: C31 H31 N7O3 549,63 0,035 > 285

54: C28 H23 F3N8 O3 576,54 0,003 > 3330

61: C28 H26 FN9 O2 539,58 0,006 > 1650

63: C28 H26 N8 O2 506,57 0,003 > 1000

65: C26 H24 N10 O2 508,55 0,004 > 2500

67: C27 H25 N9 O2 507,56 0,002 > 5000

> significa mejor que

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Compuesto de la fórmula I

y/o una forma estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I, en que 5

X y M son idénticos o diferentes y representan, independientemente uno de otro, un átomo de N o CH,

R1 y R11 son idénticos o diferentes, y representan, independientemente uno de otro,
1. un átomo de hidrógeno,
2. F, Cl, I o Br,
3. -alquilo (C1-C4), 10
4. -CN,
5. -CF3,
6. -OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),
7. -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 15
8. -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), o
9. -S(O)x-R5, en que x significa el número entero cero, 1 ó 2, y R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

R2 representa 1. un radical heteroarilo del grupo 3-hidroxipirro-2,4-diona, imidazol, imidazolidina, imidazolina, indazol,

isotiazol, isotiazolidina, isoxazol, 2-isoxazolidina, isoxazolidina, isoxazolona, morfolina, oxazol, 1,3,4-oxadiazol, 20 oxadiazolidindiona, oxadiazolona, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido, 5-oxo-4,5-dihidro-[1,3,4]oxadiazol, 5-oxo-1,2,4-tiadiazol, piperazina, pirazina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, piridazina, pirimidina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiomorfolina, triazol o triazolona, y

y el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, inde-pendientemente una de otra, con 25
1.1 -C(O)-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),
1.2 -alquilo (C1-C4),
1.3 -O-R5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),
1.4 -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de

hidrógeno o -alquilo (C1-C4),
1.5 halógeno, o
1.6 un radical ceto,
2. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4),
3. -C(O)-OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4), o 5
4. -C(O)-N(R7)-R8, en que R7 y R8 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, -alquil (C1-C4)-OH, -O-alquilo (C1-C4) o -(alquilo C1-C4),

R3 representa un átomo de hidrógeno o -(alquilo C1-C4),

R4 representa 1. un radical heteroarilo del grupo pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxidos, triazolonas, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidinadiona, triazol, 3-10 hidroxipirro-2,4-dionas, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, β-carbolina y derivados de ciclopenta o derivados de ciclohexa, condensados con benzo, de estos radicales heteroarilo,

en que el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C5), -alcoxi (C1-C5), halógeno, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, 15 hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)-carbonilo, o
2. un radical arilo del grupo fenilo, naftilo, 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, 2-bifenililo, 3-bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo, y

el radical arilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente 20 una de otra, con -alquilo (C1-C5), -alcoxi (C1-C5), halógeno, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)-carbonilo.
2.- El compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1, en el que 25

X y M son idénticos o diferentes y son, independientemente uno de otro, un átomo de N o CH,

R1 y R11 son idénticos o diferentes y representan, independientemente uno de otro,
1. un átomo de hidrógeno,
2. F, Cl, I o Br,
3. -alquilo (C1-C4), 30
4. -CN,
5. -CF3,
6. -OR5, en que R5 representa un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),
7. -N(R5)-R6, en que R5 y R6 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), 35
8. -C(O)-R5, en que R5 es un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4), o
9. -S(O)x-R5, en que x es el número entero cero, 1 ó 2, y R5 es un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4),

R2 representa 1. un radical heteroarilo del grupo imidazol, isotiazol, isoxazol, 2-isoxazolidina, isoxazolidina, isoxazolona, 1,3,4-oxadiazol, oxadiazolidinadiona, 1,2,3,5-oxadiazolona, oxazol, 5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol, tetra-40 zol, tiadiazol, tiazol, triazol o triazolona, y

el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con
1.1 un radical ceto,
1.2 F, Cl, I o Br, o
1.3 -alquilo (C1-C2), o 5
2. -C(O)-N(R7)-R8, en que R7 y R8 representan, independientemente uno de otro, un átomo de hidrógeno, -alquil (C1-C4)-OH, -O-alquilo (C1-C4) o -alquilo (C1-C4),

R3 representa un átomo de hidrógeno, metilo o etilo,

R4 representa 1. un radical heteroarilo del grupo de los anillos insaturados, parcialmente saturados o completamente saturados, que se derivan de piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, 10 pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, triazol o isotiazol,

en que el radical heteroarilo está no sustituido o está sustituido una vez, dos veces o tres veces, independientemente una de otra, con -alquilo (C1-C4), -alcoxi (C1-C4), F, Cl, I, Br, nitro, amino, trifluorometilo, hidroxilo, hidroxi-alquilo (C1-C4), metilendioxi, etilendioxi, formilo, acetilo, ciano, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo o -alcoxi (C1-C4)-carbonilo, o 15
2. fenilo, y fenilo está no sustituido o está sustituido, una vez, dos veces o tres veces, indepen-dientemente una de otra, con F, Cl, I, Br, CF3, -OH, -alquilo (C1-C4) o -alcoxi (C1-C4).
3.- Compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de la fórmula I es

[(S)-2-difenilamino-1-(5-oxo-4,5-dihidro[1,3,4]oxadiazol-2-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 20

{1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

[(S)-1-(5-oxo-4,5-dihidro-1,3,4-oxadiazol-2-il)-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 25 [2-[(4-fluro-fenil)-piridin-2-il-amino]-1-(4H-[1,2,4]triazol-3-il)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

[1-carbamoil-2-(fenil-tiazol-2-il-amino)-etil]-amida del ácido (S)-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

[1-metoxicarbamoil-2-(fenil-piridin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido (S)-2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico, 30

{1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-amino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

[1-(2-hidroxi-etilcarbamoil)-2-(fenil-pirimidin-2-il-amino)-etil]-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

ácido (S)-2-{[2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carbonil]-amino}-3-[fenil-(4-trifluorometil-pirimidin-2-il)-amino]- 35 propiónico,

1-carbamoil-2-[(4-fluoro-fenil)-(5-metil-pirimidin-2-il)-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-indol-5-carboxílico,

((S)-1-carbamoil-2-difenilamino-etil)-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-carboxílico,

{1-carbamoil-2-[(fenil)-pirimidin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-40 carboxílico, o

{1-carbamoil-2-[(fenil)-piridin-2-il-amino]-etil}-amida del ácido 2-(2-metilamino-pirimidin-4-il)-1H-bencimidazol-5-

carboxílico.
4.- Procedimiento para preparar el compuesto de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque

a) se hace reaccionar un compuesto de la fórmula IV

5

en que R1, R2 y R4 son como se definen en la fórmula I, con un cloruro de ácido o un éster activado del compuesto de la fórmula III,

en que D1 significa -COOH y R11, X, M y R3 son como se definen en la fórmula I, en presencia de una base o, eventualmente, de un agente deshidratante en solución, y se convierte en un compuesto de la 10 fórmula I,

b) se separa un compuesto de la fórmula I, que ha sido preparado por el procedimiento a) y que, en virtud de su estructura química, aparece en formas enantiómeras, en los enantiómeros puros por medio de la formación de sales con ácidos o bases puros en cuanto a los enantiómeros, cromatografía en fases estacionarias quirales o derivatización utilizando compuestos quirales puros en cuanto a los enantiómeros 15 tales como aminoácidos, separando los diastereoisómeros resultantes y eliminando los grupos auxilares quirales, o

c) se aísla el compuesto de la fórmula I que ha sido preparado por los procedimientos a) o b) en forma libre o, en caso de estar presentes grupos de carácter ácido o básico, se convierte en sales fisiológicamente toleradas. 20
5.- Producto farmacéutico, caracterizado por un contenido eficaz de al menos un compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I y/o una forma opcionalmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I, junto con una sustancia de vehículo, aditivo y/u otros compuestos activos y sustancias auxiliares farmacéuticamente adecuados y fisiológicamente tolerados.
6.- Uso del compuesto de la fórmula I según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un producto 25 farmacéutico para la profilaxia y terapia de todas las enfermedades cuyo curso implica una actividad incrementada de la IκB quinasa.
7.- Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque las enfermedades son enfermedades crónicas del aparato locomotor tales como artritis inflamatorias, inmunológicamente agudas o agudas mediadas por el metabolismo y crónicas, artropatías, artritis reumatoide, o enfermedades degenerativas de las articulaciones tales como osteoartrosis, 30 espondilosis, diabetes tipo II, enfermedad del intestino inflamatorio, pérdida de cartílago tras un trauma de la articulación o un período relativamente largo de inmovilización de la articulación después de lesiones de menisco o rótula o roturas de ligamento, o enfermedades del tejido conjuntivo tales como colagenosis y enfermedades periodontales, mialgias y perturbaciones del metabolismo de los huesos, o enfermedades que son debidas a una sobre-expresión del factor de necrosis de tumores alfa (TNFα) o a una concentración incrementada del TNFα tales 35 como caquexia, esclerosis múltiple, trauma craneocerebral, enfermedad de Crohn y úlceras intestinales, o enfermedades tales como aterosclerosis, estenosis, ulceración, enfermedades de Alzheimer, abatimiento muscular, enfermedades cancerígenas, infarto cardíaco, gota, sepsis, choque séptico, choque endotóxico, infecciones víricas

tales como gripe, hepatitis, infecciones por VIH, SIDA o enfermedades provocadas por adenovirus o virus herpes, infecciones parasitarias tales como malaria o lepra, infecciones por hongos o levaduras, meningitis, enfermedades crónicas de los pulmones inflamatorios tales como bronquitis crónica o asma, síndrome del dolor respiratorio agudo, sinovitis aguda, tuberculosis, psoriasis, diabetes, tratamiento de reacciones de rechazo agudas o crónicas de parte del receptor de órganos contra el órgano trasplantado, enfermedades crónicas de injerto frente a huésped y enfermedades 5 vasculares inflamatorias.