ES2343965T3 - Anticuerpos anti-cd22 e inmunocongujados mutados. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a CD22, anticuerpo que comprende: una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 2 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 4, con la condición de que: (i) la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena VL se seleccionan entre HG, GR, RG y AR; y (ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena VH se seleccionan entre SSY, THW, YNW, TTW y STY.

Description

Anticuerpos anti-CD22 e inmunoconjugados mutados.

Antecedentes de la invención

Los tumores malignos hematológicos son un problema de salud pública muy importante. Se ha estimado que, en el año 2000, se produjeron más de 50.000 nuevos casos de linfoma de no Hodgkin y más de 30.000 nuevos casos de leucemia en Estados Unidos (Greenlee, R. T. et al., CA Cancer J Clin., 50: 7-33 (2000)), enfermedades de las cuales se esperaban más de 45.000 muertes. Hay muchos más pacientes que viven con una morbosidad relacionada con enfermedades crónicas. Desafortunadamente, en un alto porcentaje de los pacientes, las terapias convencionales no pueden producir remisiones completas a largo plazo.

En los últimos años, se han desarrollado inmunotoxinas como enfoque terapéutico alternativo para tratar estos tumores malignos. Originariamente, las inmunotoxinas estaban compuestas por un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina es interiorizada provocando la muerte celular mediante la detención de la síntesis proteica y la inducción de la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2: 439- 446 (1996)).

Los tumores malignos hematológicos constituyen una interesante diana para las terapias con inmunotoxinas, porque las células tumorales son fácilmente accesibles y los antígenos diana se expresan a un nivel elevado (Kreitman, R. J. y Pastan, I., Semin. Cancer Biol., 6: 297-306 (1995)). Uno de estos antígenos es el CD25. Una prueba clínica con la inmunotoxina LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38) dirigida a CD25 demostró que el agente fue bien tolerado y que tenía una considerable actividad antitumoral (Kreitman, R. J. et al., Blood, 94: 3340-3348 (1999); Kreitman, R. J. et al., J. Clin. Oncol., 18: 16222-1636 (2000)). Se observó una respuesta completa en un paciente con leucemia de células vellosas y respuestas parciales en pacientes con leucemia de células vellosas, leucemia linfocítica crónica, linfoma de células T cutáneas, enfermedad de Hodgkins y leucemia de células T del adulto.

Otro antígeno que ha sido usado como una diana de inmunotoxina es el CD22, un antígeno de células B restringido a un linaje expresado en el 60-70% de los linfomas y las leucemias de células B. El CD22 no está presente en la superficie celular en los estadios tempranos del desarrollo de las células B y no se expresa en células madre (Tedder, T. F. et al., Annu. Rev. Immunol., 5:481-504 (1997)). Se han realizado pruebas clínicas con una inmunotoxina que contiene un anticuerpo frente a CD22, el RFB4, o su fragmento Fab, acoplado a ricina A desglicosilada. En estas pruebas, se han observado respuestas clínicas sustanciosas; sin embargo, el grave y, en ciertos casos, fatal síndrome de fuga vascular fue limitante de la dosis (Sausville, E. A. et al., Blood, 85: 3457-3465 (1995); Amlot, P. L. et al., Blood, 82: 2624-2633 (1993); Vitetta, E. S. et al., Cancer Res., 51: 4052-4058 (1991)).

Como enfoque alternativo, se usó el anticuerpo RFB4 para crear una inmunotoxina recombinante en la que el fragmento Fv en una forma monocatenaria está fusionado a una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). La PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE, pero carece de la parte de unión celular (Hwang, J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). La RFB4(Fv)-PE38 es citotóxica frente a las células positivas en CD22 (Mansfield, E. et al., Biochem. Soc. Trans., 25:709-714 (1997)). Para estabilizar la inmunotoxina de Fv monocatenario y hacerla más adecuada para el desarrollo clínico, se diseñaron genéticamente residuos de cisteína en regiones marco de la V_{H} y la V_{L} (Mansfield, E. et al., Blood, 90: 2020-2026 (1997)) generando la molécula RFB4(dsFv)-PE38.

RFB4(dsFv)-PE38 puede matar células leucémicas de pacientes y produjo remisiones completas en ratones que portaban xenoinjertos de linfoma (Kreitman, R. J. et al., Clin. Cancer Res., 6: 1476-1487 (2000); Kreitman, R. J. et al., Irat. J. Cancer, 81: 148-155 (1999)). La RFB4(dsFv)-PE38 (BL22) fue evaluada en una prueba clínica de fase I en el Instituto Nacional del Cáncer en pacientes con tumores malignos hematológicos. Se trataron dieciséis pacientes con leucemia de células vellosas resistente a análogos de purina con BL22 y once de ellos (86%) alcanzaron remisiones completas.

Estos resultados muestran que BL22 es el primer agente capaz de producir una tasa elevada de remisión completa en pacientes con LCV resistente a análogos de purina y de establecer el concepto de que las inmunotoxinas pueden producir un beneficio clínico en pacientes con tumores malignos avanzados (Kreitman, R. J., et al., N. Engl J. Med., 345 (4): 241-7 (2001)).

HA22 es una forma mejorada, desarrollada recientemente, de BL22. Para producir esta inmunotoxina, se mutó la región de unión del anticuerpo RFB4 y se usó un despliegue en fagos del anticuerpo para aislar el fago mutante que mejor se uniera a CD22 debido a las mutaciones en CDR3 de la cadena pesada. En HA22, los residuos SSY de CDR3 de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo ("V_{H}") se mutaron a THW. En comparación con su anticuerpo parental RFB4, HA22 tiene una actividad citotóxica de 5-10 veces mayor en diversas líneas celulares positivas en CD22 y es hasta 50 veces más citotóxico para las células de pacientes con LLC y LCV (Salvatore, G., et al., Clin Cancer Res, 8(4):995-1002 (2002); véase también la solicitud en co-propiedad PCT/US02/30316, Publicación internacional WO 03/027135).

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BL22 parece funcionar bien en tumores malignos, tales como la LCV, que expresan cantidades relevantes de CD22. Sin embargo, mostró una actividad mucho menor en la leucemia linfocítica crónica (LLC), en la que las células sólo expresan cantidades pequeñas de CD22. Como se indica anteriormente, la inmunotoxina basada en HA22 es mucho más citotóxica para las células de personas con LLC que BL22. Sin embargo, dada la baja densidad de CD22 en las células de la LLC, sería deseable seguir mejorando la dirección hacia las células de la LLC mediante el desarrollo de anticuerpos con una afinidad incluso mayor por CD22 que la de HA22.

Desafortunadamente, los factores que influyen en la afinidad de unión son muy diversos, y la obtención de fragmentos Fv monocatenarios con una mayor afinidad no es algo trivial. Aunque la estructura cristalina de anticuerpo-antígeno puede sugerir qué residuos están implicados en la unión, no se disponen de los datos estructurales de resolución atómica de la mayoría de los anticuerpos. Además, incluso cuando se dispone de tales datos, en general, no se puede predecir qué residuos y qué mutaciones darán como resultado un anticuerpo con una mayor actividad de unión antigénica.

Sin embargo, incluso si las inmunotoxinas se unen estrechamente a la superficie de células diana, no se garantiza la muerte de la célula diana. Las toxinas comúnmente usadas (p. ej., la toxina de la difteria, gelonina, ricino y PE) actúan a nivel ribosómico para desactivar la síntesis proteica. De este modo, la toxina debe ser dirigida correctamente al ribosoma para que tenga lugar la muerte celular. La dirección de inmunotoxinas a receptores de la superficie celular específicos implica una endocitosis mediada por el receptor en una vesícula intracelular apropiada, seguida por la translocación de la toxina a través de la membrana vesicular hacia el citosol. Un tráfico intracelular ineficiente, p. ej., el transporte de las inmunotoxinas hacia los lisosomas, da como resultado una gran reducción de la utilización de la toxina diana (Thrush, G. R., et al., Annu Rev Immunol, 14:49-71 (1996)).

De este modo, además de aumentar la afinidad de anticuerpos tales como BL22 o HA22 frente a CD22, otro modo de aumentar la citotoxicidad de las inmunotoxinas hacia las células de la LLC consistiría en aumentar la citotoxicidad del resto de toxina. Como se indica anteriormente, una prueba clínica de BL22 usó como la forma tóxica una forma de la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") truncada para reducir la toxicidad inespecífica, y la PE se ha usado en pruebas clínicas con otros agentes de dirección a dianas. Dada la utilidad de la PE en agentes terapéuticos, sería útil seguir mejorando la toxicidad de la PE. Pero la complicada manera en la que la PE ejerce su toxicidad hace que la mejora de esa toxicidad sea problemática.

En base a la estructura cristalográfica de la PE (Allured, V. S., et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 83(5): 1320-4 (1986)) y a muchos estudios funcionales, se cree que BL22 mata células diana en circulación mediante las siguientes etapas. En primer lugar, en circulación, se elimina el residuo de lisina carboxi-terminal (Hessler, J. L., et al., Biochemistry, 36(47): 14577-82 (1997)). A continuación, la parte Fv de la inmunotoxina se une a CD22 sobre la superficie de la célula diana, y la molécula es interiorizada en el compartimento endocítico, en el que la proteasa furina escinde la toxina entre los aminoácidos 279 y 280 de la PE (Chiron, M. F., et al., J Biol Chem, 269 (27):18167-76 (1994); Ogata, M., et al., J Biol Chem, 265(33): 20678-85 (1990)). Posteriormente, se reduce el enlace tipo disulfuro que une las cisteínas de las posiciones 265 y 287 produciendo dos fragmentos. Luego, la secuencia REDL del fragmento carboxi-terminal se une al receptor de reciclaje KDEL, y el fragmento que contiene parte del dominio 2 y todo el dominio 3 es transportado desde el aparato de Golgi trans-reticular al retículo endoplasmático (RE) (Kreitman, R. J., et al., Semin Cancer Biol, 6 (5): 297-306 (1995)). Una vez allí, los aminoácidos 280-313 facilitan de algún modo la translocación de la toxina en el citosol, probablemente, aprovechando los poros preexistentes del RE (Theuer, C. P., et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 90(16): 7774-8 (1993); Theuer, C., et al., Biochemistry, 33(19): 5894-900 (1994)). En el citosol, la actividad de ribosilación del ADP ubicada en el dominio III de la PE desactiva catalíticamente el factor de elongación 2, inhibiendo la síntesis proteica y conduciendo a la muerte celular.

La presente invención proporciona soluciones para algunos de estos difíciles problemas.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos mejorados que se unen específicamente a CD22. En un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo según la reivindicación 1. De este modo, la CDR1 del anticuerpo tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.º 7, 8, 9 y 10. En algunas realizaciones, la CDR1 de la V_{L} del anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 7. La CDR2 de la V_{L} del anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 11 y la CDR3 tiene la secuencia de SEC ID N.º 12. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20.

En algunas realizaciones, la cadena V_{H} del anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

En otro grupo de realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden (a) un anticuerpo que se une específicamente a CD22 según la reivindicación 1 y (b) un resto terapéutico o un marcador detectable. El resto terapéutico o un marcador detectable pueden estar conjugados o fusionados al anticuerpo. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y la cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El resto terapéutico puede ser, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En algunas realizaciones, el resto terapéutico es una citotoxina seleccionada del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de difteria, o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, exotoxina A de Pseudomonas, o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), o toxina botulínica A a F. En algunas realizaciones, la PE se selecciona del grupo constituido por PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. En algunas realizaciones, la PE tiene un sustituyente de glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. En una realización preferida, el sustituyente de la posición 490 es alanina.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en el párrafo anterior y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona el uso de un anticuerpo que se une específicamente a CD22 según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y dicha cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}. En algunas realizaciones preferidas, el resto terapéutico es una citotoxina. En algunas realizaciones, la citotoxina se selecciona del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de difteria, o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, exotoxina A de Pseudomonas, o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), o toxina botulínica A a F. Cuando la citotoxina es PE, la PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. En algunas realizaciones preferidas, la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. En una realización preferida, la alanina está sustituida por arginina en la posición 490.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican una cadena ligera variable (V_{L}) del anticuerpo de la reivindicación 1. Los ácidos nucleicos pueden codificar además una cadena pesada variable (V_{H}) del anticuerpo de la reivindicación 1. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y dicha cadena V_{H} de dicho anticuerpo codificado tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica además un polipéptido que es un resto terapéutico o un marcador detectable. Cuando el ácido nucleico codifica un resto terapéutico, el resto puede ser, por ejemplo, un fármaco o una citotoxina. Cuando es una citotoxina, puede ser, por ejemplo, exotoxina A de Pseudomonas o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"). La PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. En algunas realizaciones, la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. En realizaciones preferidas, la alanina está sustituida por arginina en la posición 490.

En otras realizaciones más, la invención proporciona vectores de expresión que comprenden uno de los ácidos nucleicos aislados descritos en el párrafo anterior ligado operativamente a un promotor.

También se revelan en la presente memoria procedimientos de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+ mediante la puesta en contacto de dicha célula con una molécula quimérica que comprende (a) un anticuerpo que se une a CD22 según la reivindicación 1 y (b) un resto terapéutico, en la que el resto terapéutico inhibe el crecimiento de dicha célula. En algunos de los procedimientos, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y dicha cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}. El resto terapéutico puede ser, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. Cuando el resto terapéutico es una citotoxina, la citotoxina puede ser, por ejemplo, ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de difteria, o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, exotoxina A de Pseudomonas, o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), o toxina botulínica A a F. La PE puede estar constituida por, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. Cuando la citotoxina es PE, la PE puede tener una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. En una realización preferida, la alanina está sustituida por arginina en una posición correspondiente la posición 490 de la SEC ID N.º 24.

También se revelan en la presente memoria procedimientos para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica. Los procedimientos comprenden (a) poner en contacto células de la muestra biológica con una molécula quimérica que comprenda (i) un anticuerpo que se una específicamente a CD22 según la reivindicación 1 conjugado o fusionado con (ii) un marcador detectable; y (b) detectar la presencia o la ausencia de dicho marcador, en el que la detección de la presencia de dicho marcador indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra. La CDR2 de dicha V_{L} de dicho anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 11 y la CDR3 de la V_{L} de dicho anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 12. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y la cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona equipos. Los equipos comprenden (a) un envase y (b) una molécula quimérica que comprende (i) un anticuerpo anti-CD22 según la reivindicación 1 conjugado o fusionado con (ii) un marcador detectable o un resto terapéutico. La CDR2 de la V_{L} del anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 11 y la CDR3 de la V_{L} del anticuerpo tiene la secuencia de SEC ID N.º 12. En algunas realizaciones, la cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y la cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}. El resto terapéutico puede ser, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina.

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También se revelan en la presente memoria la exotoxina A de Pseudomonas o fragmentos citotóxicos o mutantes de la misma, en la que la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. La PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. La PE puede tener una alanina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24.

La invención proporciona además moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo de la reivindicación 1 conjugado o fusionado con una exotoxina A de Pseudomonas o fragmentos citotóxicos o mutantes de la misma ("PE"), en la que PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. La PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. En algunas realizaciones preferidas, la PE tiene una alanina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

También se revelan en la presente memoria ácidos nucleicos aislados que codifican exotoxina A de Pseudomonas o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), en la que la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. La PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. La PE puede tener una alanina en la posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24. El ácido nucleico puede codificar además un resto de dirección. El resto de dirección es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

También se revelan en la presente memoria vectores de expresión que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el párrafo anterior ligados operativamente a un promotor.

También se revelan en la presente memoria usos de un resto de dirección conjugado o fusionado con exotoxina A de Pseudomonas o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), en la que la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24, para la fabricación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento de células a las que se dirige dicho resto de dirección. La PE puede ser, por ejemplo, PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E o PE38QQR. La PE puede tener una alanina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. El resto de dirección puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

También se revelan en la presente memoria procedimientos de inhibición del crecimiento de una célula que porta una molécula diana. Los procedimientos comprenden poner en contacto la célula con una molécula quimérica que comprende (a) un resto de dirección que se une a la molécula diana y (b) exotoxina A de Pseudomonas o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE"), en la que la PE tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de la arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24, en los que la puesta en contacto de la célula con la molécula quimérica inhibe el crecimiento de dicha célula. La molécula diana puede ser un receptor de citocina y el resto de dirección es una citocina que se une al receptor. La molécula diana puede ser un antígeno y la molécula de dirección puede ser un anticuerpo que se une al antígeno. El antígeno puede ser un antígeno asociado a un tumor. La PE puede tener una alanina en lugar de arginina en la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24. La molécula diana puede ser el receptor IL-13 y la molécula de dirección puede ser IL-13, una IL-13 mutada que conserve la capacidad de unirse al receptor IL-13, una IL-13 permutada circularmente o un anticuerpo que se una específicamente a una cadena del receptor IL-13.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La figura 1 presenta la secuencia de nucleótidos (SEC ID N.º 1) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 2) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la secuencia de nucleótidos (SEC ID N.º 3) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 4) de la región variable de la cadena pesada de RFB4. Las CDR asignadas usando el programa IMGT (Lefranc, Nucl. Acids Res. 29: 207-209, 2001; también disponible en línea, entrando en "http://", seguido de "imgt.cines.fr") están subrayadas (aunque sin numerar, las CDR 1, 2 y 3 de cada cadena se presentan en su respectiva
cadena en orden numérico creciente). Los puntos calientes de ADN (A/G-G-C/T-A/T y A-G-C/T) están marcados.

Figura 2. La figura 2 es un listado de número de entrada 038145 de la base de datos de Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 2) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la numeración de la posición de Kabat correspondiente a cada residuo de aminoácido.

Figura 3. La figura 3 es un listado de número de entrada 038146 de la base de datos de Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 4) de la región variable de la cadena pesada de RFB4 y la numeración de la posición de Kabat correspondiente a cada residuo de aminoácido.

Figuras 4A y B. Figura 4A. Perfil de elución con inmunotoxina HA22 purificada (R490A) a partir de una cromatografía de columna de filtración de gel Superose-12. Los números de la parte inferior de (A) son números de las fracciones marcadas en el cromatograma. Figura 4B. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de HA22 (R490A) en condiciones no reductoras y reductoras. El HA22 (R490A) se preparó según lo descrito en el ejemplo 2 y la fracción de elución n.º 12 fue analizada sobre gel de poliacrilamida del 4% al 20%. Carriles: Carril M: patrones de peso molecular; Carril 1: condición no reductora; y Carril 2: la inmunotoxina HA22 purificada (R490A) se redujo mediante ebullición durante 5 min en tampón de muestra de SDS que contenía DTT. El gel se tiñó con azul de Coomassie. La migración de inmunotoxina de dsFv no reducida muestra un M_{r} = \sim63.000; el Carril 2 muestra que se disoció en una cadena V_{L} (M_{r} = \sim12.000) y una proteína de fusión V_{H}-PE38 (M_{r} = \sim51.000) en condiciones reductoras.

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Figuras 5A-C: Las figuras 5A y 5B muestran la inhibición de la síntesis de proteína y la figura 5C muestra la viabilidad celular en células positivas en CD22 puestas en contacto con uno de los tres constructos de inmunotoxina: BL22, HA22 y HA22 (R490A). En las figuras 5A y B, la inhibición de la síntesis de proteína se determinó como el porcentaje de incorporación de [^{3}H]leucina en las células tras un tratamiento de 20 h con las concentraciones de inmunotoxinas indicadas. Figura 5A: células CA-46; Figura 5B: células Daudi. La inhibición (50%) de la síntesis de proteína está entre el nivel de incorporación en ausencia de la toxina y aquél en presencia de 10 \mug/ml de cicloheximida. Figura 5C: Las células CA-46 se incubaron con inmunotoxina durante 40 h antes de añadir WST-8 durante 4 h. La producción de Formazán se midió a una DO de 450 nm y 650 nm. Para las tres figuras, los símbolos son los siguientes: O: BL22; \Box: HA22; y \Delta: HA22 (R490A). Se calculó la media de los valores de las muestras por triplicado para cada punto.

Figura 6. Análisis de la viabilidad celular de células HUVEC en contacto con diversas inmunotoxinas. Las HUVEC (3 x 10^{3} células/pocillo) se incubaron con diversas concentraciones de inmunotoxinas durante 72 h. La viabilidad celular se determinó mediante un análisis de conversión de WST según lo descrito en el ejemplo 2. Los análisis muestran que las inmunotoxinas dirigidas a otros receptores celulares son más tóxicas para las células HUVEC que BL22, HA22 y HA22 (R490A). Los resultados se ofrecen como un % de la viabilidad sin la incubación de las inmunotoxinas y representan la media de los valores por triplicado.

Legenda: O: BL22; \Box: HA22; \Delta: HA22 (R490A); \lozenge: HB21Fv-PE40; y X: LMB-7.

Figura 7. Farmacocinéticas de HA22 (R490A) en ratones. Se inyectaron i.v. 10 \mug de HA22 (\bullet) o de HA22 (R490A) (\nabla) a ratones suizos hembra normales. Las muestras sanguíneas fueron extraídas en los puntos temporales mostrados. La concentración de cada inmunotoxina en circulación se determinó mediante ELISA.

Figuras 8A y B. Actividades anti-tumorales de HA22 y de HA22 (R490A). Ambas figuras: Se inocularon células CA46 s.c. en ratones SCID el día 0. Figura 8A: El día 6, cuando se habían desarrollado tumores > 100 mm^{3}, se tomaron grupos de ocho o de diez ratones para bien ser observados (\blacksquare) o ser tratados con inyecciones i.v. de HA22 (\bullet) o de HA22 (R490A) (\nabla) diluidas en 0,2 ml de PBS/ASH al 0,2%. La terapia se administró una vez cada dos días (en los días 6, 8 y 10; según lo indicado por las flechas) con 150 \mug/kg de QOD x 3. Figura 8B: Se contrastó la respuesta anti-tumoral de los ratones tratados con HA22 (\bullet) a 300 \mug/kg de QOD x 3 con la de los ratones que no fueron tratados (\blacksquare) o tratados con HA22 (R490A) 300 \mug/kg de QOD x 3 (\nabla). La terapia se administró una vez cada dos días (en los días 6, 8 y 10; según lo indicado por las flechas). No se observaron muertes a estas dosis. Ambas figuras: Las barras de error indican las desviaciones estándar de las medias de cada grupo de ratones. Las comparaciones entre HA22 y HA22 (R490A) a cada dosis fueron estadísticamente relevantes (P = 0,01-0,001).

Descripción detallada de la invención Introducción A. Descubrimiento de anticuerpos Anti-CD22 de afinidad más elevada

El trabajo de laboratorio anterior de los presentes inventores dio como resultado el descubrimiento de formas del anticuerpo frente a CD22 RFB4 que tenían una afinidad notablemente mayor por CD22. En esos estudios, el anticuerpo RFB4 fue mejorado mediante la mutación de residuos en la CDR3 de la V_{H} de RFB4 (H-CDR3). Véase, Salvatore, G., et al., Clin Cancer Res, 8(4):995-1002 (2002) y la solicitud PCT/US02/30316 del solicitante, publicación internacional WO 03/027135. Estos mutantes de alta afinidad de RFB4 se crearon mutando la secuencia nativa SSY en las posiciones 100, 100A y 100B de H-CDR3 a una de las cuatro siguientes secuencias: THW, YNW, TTW y STY. El mutante de mayor afinidad fue la mutación de SSY a THW. Cuando se hizo en una inmunotoxina, un dsFv de RFB4 con THW sustituida por SSY aumentó 50 veces la actividad citotóxica de la inmunotoxina hacia células de la leucemia linfocítica crónica cancerosas que portaban CD22 en comparación con la misma inmunotoxina creada con un dsFv de RFB4 con la secuencia SSY nativa. Por comodidad, a continuación se usará el término "HA22" para hacer referencia a las secuencias de RFB4 en las que la "SSY" de H-CDR3 está mutada a "THW" y, en ocasiones, para hacer referencia específicamente a la forma de dsFv fusionada a una citotoxina de PE38. El significado que se pretenda dar al término quedará claro según el contexto.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que se puede mejorar incluso el anticuerpo de alta afinidad HA22 para proporcionar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tengan una mayor afinidad de unión por células cancerosas que porten el antígeno CD22 en comparación no sólo con RFB4, sino además en comparación con HA22. Además, las inmunotoxinas creadas con las nuevas variantes de mayor afinidad tenían una citotoxicidad incluso mayor que las inmunotoxinas creadas con HA22. De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona nuevos reactivos y agentes importantes para detectar y para atacar a las células cancerosas que expresan a CD22.

Los nuevos mutantes cambian la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones 30 y 31 de CDR1 de la cadena V_{L} de RFB4 ("L-CDR1"), estando esas posiciones numeradas según el sistema de numeración de residuos de anticuerpo de "Kabat y Wu", de la secuencia de tipo natural serina-asparagina (en código de una sola letra, "SN") a

(a) Histidina-glicina ("HG", el anticuerpo creado combinando una cadena ligera de RFB4 que contiene este mutante de L-CDR1 con una cadena pesada de RFB4 que contiene el mutante de H-CDR3 THW es denominado "B5"),

(b) Glicina-arginina ("GR", el anticuerpo creado combinando una cadena ligera de RFB4 que contiene este mutante de L-CDR1 con una cadena pesada de RFB4 que contiene el mutante de H-CDR3 THW es denominado "E6"),

(c) Arginina-glicina ("RG", el anticuerpo creado combinando una cadena ligera de RFB4 que contiene este mutante de L-CDR1 con una cadena pesada de RFB4 que contiene el mutante de H-CDR3 THW es denominado "B8") o

(d) Alanina-arginina ("AR", el anticuerpo creado combinando una cadena ligera de RFB4 que contiene este mutante de L-CDR1 con una cadena pesada de RFB4 que contiene el mutante de H-CDR3 THW es denominado "D8").

La secuencia de aminoácidos de la cadena V_{L} de RFB4 (SEC ID N.º 2) y la numeración de Kabat y Wu de cada residuo de la cadena se muestra en la figura 2 (el número de Kabat y Wu de cada residuo se presenta en la segunda de las dos columnas verticales de números).

Los nuevos mutantes se descubrieron en el transcurso de estudios de maduración de la afinidad in vitro. Asombrosamente, algunas de las mejores mutaciones de unión resultaron de mutaciones dobles e incluso triples de cada codón, lo que raras veces ocurre en la hipermutación somática en células B. Como se señala, cada uno de estos cuatro mutantes tenía una afinidad mayor por CD22 que el anticuerpo parental HA22. El orden de cualquier afinidad relativa es, de menor a mayor afinidad, B8, D8 y E6 (que son aproximadamente iguales) y B5.

Sorprendentemente, cuando se combinó la mutación THW de la CDR3 de la cadena pesada de RFB4 en una inmunotoxina con los mutantes recién descubiertos de la CDR1 de la cadena ligera de RFB4, la citotoxicidad de las inmunotoxinas se volvió a duplicar frente a la toxicidad de la inmunotoxina basada en HA22. Por el contrario, como se muestra a continuación en la tabla 5 del ejemplo 1, los mutantes creados mediante la maduración de la afinidad in vitro de CDR1 de la cadena pesada de HA22 no tuvieron efecto sobre la citotoxicidad de las inmunotoxinas creadas a partir de los mutantes resultantes, lo que probó que no todas las CDR pueden ser mutadas de modo que se mejore bien la afinidad del anticuerpo o de la citotoxicidad de inmunotoxinas creadas a partir de los anticuerpos.

Los mutantes de L-CDR1 presentados anteriormente pueden ser sustituidos en la secuencia nativa de la cadena ligera de RFB4 (SEC ID N.º 2), en combinación con una cadena pesada de RFB4 de la secuencia nativa (SEC ID N.º 4) para crear anticuerpos de mayor afinidad por CD22 que el anticuerpo parental RFB4. Preferiblemente, las mutaciones de L-CDR1 presentadas anteriormente se usan en una cadena ligera de RFB4 en combinación con uno de los cuatro mutantes de H-CDR3 descritos anteriormente, en los que la secuencia nativa SSY de las posiciones 100, 100A y 100B de H-CDR3 está mutada a una de las cuatro siguientes secuencias: THW, YNW, TTW y STY. Más preferiblemente, los mutantes de L-CDR1 descritos anteriormente se usan en una cadena ligera de RFB4 en combinación con una cadena pesada de RFB4 en la que la secuencia nativa SSY de las posiciones 100, 100A y 100B de H-CDR3 está mutada a THW.

Los expertos en la técnica reconocerán que son las regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") las responsables de una especificidad y afinidad de los anticuerpos, mientras que las regiones marco contribuyen más generalmente a la forma y la configuración tridimensional de la molécula, y tienen un menor impacto en la especificidad y la afinidad del anticuerpo. Los expertos también saben que, comúnmente, se pueden hacer, por ejemplo, sustituciones conservadoras en las regiones marco (tres de las cuales están presentes en cada cadena ligera y pesada variable) sin afectar significativamente a la unión o especificidad antigénica.

Se entenderá, por tanto, que es posible hacer cambios en el anticuerpo RFB4, tal como cambios en la región marco, sin afectar significativamente a la capacidad del anticuerpo para unirse a CD22. De este modo, se puede diseñar genéticamente un anticuerpo con facilidad que comprenda uno de los mutantes de L-CDR1 de la invención y que no tenga la secuencia exacta de los anticuerpos ejemplares tratados en la presente memoria. De este modo, los anticuerpos anti-CD22 de la invención engloban anticuerpos que se unen a CD22 y que comprenden uno de los mutantes de L-CDR1 de la invención como la CDR1 de su cadena ligera, tengan o no la secuencia completa del resto de las CDR o la cadena ligera descrita en la presente memoria.

Las regiones marco (regiones no CDR) de los anticuerpos se pueden diseñar genéticamente para sustituir residuos encontrados en determinadas posiciones de los anticuerpos de animales no humanos, tales como ratones, con los residuos encontrados más comúnmente en la misma posición en anticuerpos humanos. Los anticuerpos diseñados genéticamente de estos modos se denominan "anticuerpos humanizados" y son los preferidos, pues tienen un menor riesgo de provocar efectos secundarios y, comúnmente, pueden permanecer en circulación más tiempo. Los procedimientos de anticuerpos humanizados son conocidos en la técnica y se presentan en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º 6.180.377; 6.407.213; 5.693.762; 5.585.089 y 5.530.101. Además, como las CDR de las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo, las CDR o los Fv descritos anteriormente pueden ser injertados o diseñados genéticamente en el anticuerpo deseado para conferir especificidad por CD22 a ese anticuerpo. Por ejemplo, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), i. e., los bucles de unión antigénica de un anticuerpo de un animal no humano, tal como un ratón, pueden ser injertadas en el marco de un anticuerpo humano de estructura tridimensional conocida (véase, p. ej.., WO 98/45322; WO 87/02671; patente estadounidense n.º 5.859.205; patente estadounidense n.º 5.585.089; patente estadounidense n.º 4.816.567; solicitud de patente EP 0173494; Jones, et al. Nature 321:522 (1986); Verhoeyen, et al., Science 239: 1534 (1988), Riechmann, et al. Nature 332:323 (1988); y Winter y Milstein, Nature 349: 293 (1991)).

En realizaciones preferidas, la cadena ligera y la cadena pesada de la región variable están unidas por un enlace tipo disulfuro entre cisteínas diseñadas genéticamente en la región marco para formar un Fv estabilizado por unión disulfuro o "dsFv". La formación de dsFv se conoce en la técnica, y se enseña, por ejemplo, en Pastan, patente estadounidense n.º: 6.558.672, que presenta una serie de posiciones en las que las cisteínas pueden estar diseñadas genéticamente en la región marco para facilitar la formación del enlace de tipo disulfuro entre las cadenas. En una forma particularmente preferida, las cisteínas están diseñadas genéticamente en la región marco como las posiciones usadas para crear el dsFv de RFB4. Como se indica en el apartado de antecedentes, se ha usado satisfactoriamente un dsFv de RFB4, un dsFv creado a partir de la secuencia de RFB4 nativa, en pruebas clínicas para dirigir la citotoxina a células de un cáncer que expresa a CD22. El dsFv de RFB4 está diseñado genéticamente con una cisteína que reemplaza la glicina en la posición 100 (según la numeración de Kabat mostrada en la figura 2) de la cadena V_{L} y una cisteína que reemplaza la arginina de la posición 44 (según la numeración de Kabat mostrada en la figura 3) de la cadena V_{H}. Por ejemplo, en Kreitman et al., Clin. Cancer Res 6:1476-1487 (2000) y Kreitman et al., Intl J Cancer 81:148-155 (1999), se presentan materiales y procedimientos para construir el dsFv de RFB4.

Es posible usar estos mismos procedimientos para generar los dsFv de las presentes formas mutadas de RFB4 de la invención. Comúnmente, las dos cadenas se expresan desde plásmidos separados en una célula huésped procariota, tal como E. coli, y se permite la unión antes de purificar la proteína de los cuerpos de inclusión, según lo descrito en los ejemplos que se presentan más adelante.

Se puede incorporar la afinidad mejorada de los anticuerpos y de los fragmentos de anticuerpos proporcionada por la presente invención en inmunoconjugados quiméricos para mejorar la capacidad del inmunoconjugado quimérico para dirigirse a células B que porten el antígeno CD22. Los inmunoconjugados pueden portar, por ejemplo, un marcador detectable, tales como un radioisótopo, un resto fluorescente o una enzima indicadora. Estos inmunoconjugados marcados se pueden usar, por ejemplo, en análisis in vitro para detectar la presencia de células que expresen a CD22 en una muestra biológica. Comúnmente, la muestra biológica será una muestra sanguínea o contendrá linfocitos de una muestra sanguínea.

En otro conjunto de usos in vitro, el inmunoconjugado porta una citotoxina en lugar de un marcador detectable. Se pueden usar tales inmunotoxinas para purgar una muestra sanguínea o cultivo de linfocitos de un paciente. Entonces se puede volver a administrar la muestra o el cultivo purgados al paciente para potenciar la población de glóbulos blancos funcionales.

En usos in vivo, las inmunotoxinas creadas con los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden usar para inhibir el crecimiento y la proliferación de células cancerosas que porten el antígeno CD22. Como se indica en el apartado de antecedentes, una prueba clínica de una inmunotoxina creada con el anticuerpo parental RFB4 en pacientes con la leucemia de células vellosas cancerosa ejemplar que expresa a CD22 dio como resultado remisiones completas en el 86% de los pacientes. La mayor afinidad de los anticuerpos y de los fragmentos de anticuerpos de la invención en comparación con los anticuerpos RFB4 parental y HA22, y la mayor citotoxicidad de las inmunotoxinas resultantes significan que es posible administrar menores cantidades de las inmunotoxinas, consiguiendo así el mismo efecto terapéutico mientras se reduce la posibilidad de efectos secundarios.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un scFv o un dsFv. Muchas de las inmunotoxinas recombinantes producidas a partir de los constructos de scFv tienen el tamaño de un tercio de los conjugados químicos de IgG-toxina y tienen una composición homogénea. La eliminación de la parte constante de la molécula de IgG del scFv da como resultado un aclarado más rápido de la inmunotoxina tras la inyección en animales, incluyendo primates, y el menor tamaño de los conjugados mejora la penetración del fármaco en tumores sólidos. Conjuntamente, estas propiedades disminuyen los efectos secundarios asociados con el resto tóxico reduciendo el tiempo en el que la inmunotoxina (IT) interactúa con los tejidos no diana y los tejidos que expresan niveles muy bajos de antígeno. La elaboración de Fv estabilizados por unión disulfuro (dsFv) a partir de anticuerpos anti-CD22 se trata anteriormente y en la solicitud en co-propiedad de FitzGerlad et al., número de publicación internacional WO 98/41641, que está incorporada en la presente memoria por referencia.

Sin embargo, estas ventajas son compensadas en cierto grado por la pérdida de la afinidad de unión antigénica que tiene lugar cuando las IgG se convierten en scFv (Reiter et al., Nature Biotechnol. 14:239-1245 (1996)). Se ha observado que una mayor afinidad mejora la administración selectiva de scFv en tumores (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)) y es probable que aumente su utilidad en la generación de imágenes tumorales y en el tratamiento de tumores. Por lo tanto, el aumento de la afinidad de scFv y otros restos de dirección (tales como dsFv, Fab y F(ab')_{2}) de inmunoconjugados es deseable para mejorar la eficacia de estos agentes en la administración de moléculas efectoras, tales como toxinas y otros agentes terapéuticos, a sus dianas deseadas. Por lo tanto, la mejor afinidad de los anticuerpos de la invención supone un importante avance en la administración de toxinas, fármacos y otros agentes terapéuticos a células de cánceres que expresan a CD22.

B. Descubrimiento de una forma más citotóxica de exotoxina A de Pseudomonas

Durante unos 15 años, se ha investigado la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") como la parte tóxica de moléculas quiméricas, tales como inmunotoxinas. Ese trabajo se ha plasmado en el desarrollo de un número de formas mutadas de PE en las que se ha conservado la actividad citotóxica, mientras que se ha reducido o eliminado la toxicidad inespecífica de la molécula. La mayoría de estos mutantes están truncados, lo que mejora su penetración en el tumor. Algunos de estos mutantes también han sufrido modificaciones, tales como la modificación de los residuos carboxi-terminales, o la eliminación de la necesidad de una escisión entre los residuos 279 y 280 por la proteasa furina, que ha aumentado la citotoxicidad o la actividad.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que es posible duplicar la toxicidad de PE mediante la sustitución de un solo aminoácido en la molécula. Se puede diseñar genéticamente la mutación con facilidad en las diversas formas de PE modificadas desarrolladas en la técnica con anterioridad (tales como PE40, PE38, PE37, PE35, PE4E, PE38QQR y PE38KDEL) para aumentar su potencia y su actividad. Se espera que esto permita reducir la dosis de inmunotoxinas basadas en PE necesaria para producir un resultado clínico deseado, lo que debería reducir la posibilidad de los efectos secundarios no deseados. Por el contrario, se puede administrar la misma dosis de inmunotoxina basada en PE, pero con un efecto más potente. Por consiguiente, la presente revelación proporciona un importante nuevo medio para aumentar la potencia de los inmunoconjugados basados en PE, tales como los constructos de dsFv-PE de RFB4 que se emplean actualmente en pruebas clínicas y los constructos creados con los diversos mutantes de RFB4 presentados anteriormente y según lo reivindicado.

Las PE mejoradas reveladas en la presente memoria comprenden mutaciones de la arginina (R) de la posición 490 de la molécula de PE (por convención, las posiciones de la PE y sus variantes se describen en referencia a la secuencia de la molécula de PE nativa). La secuencia de 613 aminoácidos de la PE nativa es ampliamente conocida en la técnica y se presenta, por ejemplo, como la SEC ID N.º 1 de la patente estadounidense n.º 5.602.095). La R es mutada a un aminoácido que tiene una cadena lateral alifática que no comprende un hidroxilo. De este modo, la R puede ser mutada a glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I). El sustituyente puede ser G, A o I. La alanina es la más preferida.

Las comparaciones de la inmunotoxina HA22 con una inmunotoxina similar creada con la mutación R490A ("R490A de HA22") mostraron que la inmunotoxina de HA22 con R490A tenía de dos a tres veces más citotoxicidad hacia las células diana de la inmunotoxina HA22. Véase el ejemplo 3. Además, se realizaron comparaciones del efecto de HA22 con R490A y de HA22 en animales que portaban xenoinjertos de tumores humanos que expresaban a CD22. Se observaron reducciones notablemente mayores en la masa tumoral de los animales tratados con HA22 con R490A que en los animales sometidos a un tratamiento idéntico con la misma inmunotoxina creada sin la mutación R490A. Véase el ejemplo 4.

El cambio de citotoxicidad es el más sorprendente de todos dado que los mutantes creados anteriormente, que engloban sustituciones en la misma posición, cambiaron la semivida de las moléculas en circulación, pero no cambiaron la citotoxicidad. Véase, Brinkmann et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU. 89: 3065-3069 (1992). Los mutantes de PE presentan una semivida ligeramente acortada en circulación en comparación con constructos de PE similares que no contienen la mutación de la posición 490. Sin embargo, dada la relevante reducción de la masa tumoral en los animales tratados con una inmunotoxina con la mutación R490A en comparación con los animales tratados con la misma cantidad de la misma inmunotoxina creada sin la mutación R490A, es evidente que la mayor citotoxicidad de la molécula de PE tiene más peso que la pequeña disminución de la semivida.

Se realizaron estudios para confirmar que los resultados observados con HA22 se podían aplicar en general a las inmunotoxinas basadas en PE. La mesotelina es un antígeno expresado a un nivel elevado en los cánceres de páncreas y de ovario, y en los mesoteliomas. SS1 es un anticuerpo con una afinidad elevada por la mesotelina, según lo descrito en la solicitud internacional PCT/US00/14829 del solicitante, publicada como WO 00/73346. SS1P es una inmunotoxina de SS1-PE que se une a la mesotelina y mata las células que expresan la mesotelina. Como se presenta en el ejemplo 5, la SS1P creada con la mutación R490A fue el doble de citotóxica para las líneas celulares que expresaban la mesotelina que la propia SS1P.

De este modo, es posible usar las mutaciones de R490 según lo descrito en la presente memoria para conferir una mayor citotoxicidad a las moléculas quiméricas usando PE y sus derivados como el resto tóxico. Los expertos conocen que hay diversos tipos de moléculas que pueden servir como base para dirigirse a células que el profesional desee matar o inhibir. Como resulta evidente a partir de lo tratado anteriormente, los anticuerpos son un tipo especialmente preferido de agente de dirección. Las moléculas quiméricas de los anticuerpos unidos a una PE son particularmente útiles para inhibir el crecimiento de células cancerosas que porten antígenos asociados a tumores. Se conoce un gran número de antígenos asociados a tumores en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los antígenos de melanomas MART-1, gp100 y MAGE-1, el antígeno de cáncer de colon "CEA" (antígeno carcino-embrionario), el antígeno de cáncer de mama HER-2, el antígeno de cáncer de pulmón L6 ((Kao et al., Clin Cancer Res. 9(7):2807-16 (2003)), el antígeno de cáncer de ovario CA125 y, por supuesto, la mesotelina. Como es ampliamente conocido en la técnica, se prefieren los antígenos que permanecen accesibles sobre la superficie celular como dianas, pues la unión de la molécula quimérica con ellos permite la entrada de la PE en la célula, dando como resultado la muerte celular.

La parte o el resto de dirección de la molécula quimérica es una citocina que se puede usar para dirigir toxinas hacia células que sobre-expresen un receptor de la citocina o un anticuerpo frente al receptor. Por ejemplo, se sabe que los receptores IL-13 son muy sobre-expresados en el exterior de células de ciertos cánceres, tales como gliomas, y que actúan como un factor autocrino de crecimiento en cánceres tales como el carcinoma de células renales, el sarcoma de Kaposi y la enfermedad de Hodgkin. Véase, por ejemplo, el documento WO 01/34645, WO 03/039600 y la patente estadounidense n.º 6.518.061. Se pueden usar IL-13 o diversos mutantes y formas permutadas circularmente de IL-13 como la parte de dirección de citotoxinas, tales como moléculas de PE que contengan una mutación R490 en un aminoácido alifático que no contenga un grupo hidroxilo en la cadena lateral, hacia células que expresen el receptor IL-13. De manera similar, es posible dirigir el receptor IL-13 mediante anticuerpos hacia el receptor IL-13. Los anticuerpos específicos del receptor IL-13 que tampoco se unen a IL-4 también son adecuados para su uso en tales procedimientos. Como se sabe en la técnica, por ejemplo, IL-13R\alpha2 no está implicado en complejos que también se unen a IL-4. De este modo, es posible expresar la cadena de IL-13R\alpha2 humana, y los anticuerpos producidos frente a la misma o el ADN que codifica la cadena se pueden inyectar en ratones tal que sea expresada en ratones y se generen anticuerpos. Cabe señalar que el receptor IL-4 ha sido clonado. De este modo, es posible analizar fácilmente cualquier anticuerpo en particular generado frente al receptor IL-13 para ver si se une al receptor IL-4 mediante análisis sencillos, tales como procesar el anticuerpo frente al receptor IL-13 por una columna que tenga al receptor IL-4
inmovilizado.

Además, se pueden usar las diversas formas de IL-13, incluyendo las formas permutadas circularmente, y los anticuerpos frente al receptor para dirigir moléculas de PE con las mutaciones R490 hacia células de los pulmones que expresen al receptor IL-13 con el fin de reducir o acabar con los síntomas de las afecciones mediadas o agravadas por IL-13, tales como el asma, la rinitis alérgica, y hacia células de cualquier otra parte del cuerpo con el fin de reducir o acabar con los síntomas de la dermatitis atópica y la fibrosis hepática en la esquistosomiasis, según lo tratado en la publicación internacional WO 01/34645.

Además de las citocinas, se conocen otros muchos ligandos en la técnica y se pueden usar para dirigir las moléculas de PE a células diana. Por ejemplo, se ha usado la transferrina como un medio para dirigir toxinas a células que expresan receptores de transferrina. Cualquier célula implicada en una enfermedad puede ser la diana si hay un antígeno sobre la superficie celular que sea expresado específicamente, p. ej., gp120 en las células infectadas por VIH, CD25 en células T que están implicadas en la enfermedad del injerto frente al huésped o diversas moléculas superficiales que son expresadas en células cancerosas, tales como CEA, CD30 o CD33.

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Definiciones

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A no ser que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en sentido de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en sentido de amino a carboxilo. Los títulos proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención, que pueden ser tenidos por referencia a la memoria en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación son definidos de manera más completa por referencia a la memoria en su totalidad.

"CD22" se refiere al antígeno de células B restringido a un linaje que pertenece a la superfamilia de las Ig. Se expresa en el 60-70% de los linfomas y las leucemias de las células B, y no está presente en la superficie celular en los estadios tempranos del desarrollo de las células B o en las células madre. Véase, p. ej., Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11:267-297 (1991).

Como se usa en la presente memoria, el término "anti-CD22" en referencia a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a CD22, e incluye la referencia a un anticuerpo que es generado frente a CD22. En realizaciones preferidas, el CD22 es un CD22 de primate tal como CD22 humano. En una realización preferida, el anticuerpo es generado frente a CD22 humano sintetizado por un mamífero no primate tras la introducción en el animal de ADNc que codifica CD22 humano.

"RFB4" se refiere a un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón que se une específicamente a CD22 humano. RFB4 está comercialmente disponible con el nombre RFB4 en varios lugares, tales como, Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham AL; n.º cat. 9360-01), Autogen Bioclear UK Ltd. (Calne, Wilts, RU; n.º cat. AB147), Axxora LLC (San Diego, CA). RFB4 es muy específico de células del linaje B y no tiene reactividad cruzada detectable con otros tipos de células normales. Li et al., Cell. Immunol. 118:85-99 (1989). Se han clonado las cadenas pesada y ligera de RFB4. Véase, Mansfield et al., Blood 90: 2020-2026 (1997). La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de RFB4 son la SEC ID N.º 3 y la SEC ID N.º 4, respectivamente. La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de RFB4 son la SEC ID N.º 1 y la SEC ID N.º 2, respectivamente. En la figura 1, se presentan las secuencias de cada cadena.

Es posible determinar las posiciones de las CDR y de las regiones marco de RFB4 usando diversas definiciones ampliamente conocidas en la técnica, p. ej., Kabat, Chothia, la base de datos internacional ImMunoGeneTics ("IMGT" disponible en la Web en ebi.ac.uk/imgt/) y AbM (véase, p. ej., Chothia y Lesk, "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia C. et al., "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions", Nature 342:877-883 (1989); Chothia C. et al., "Structural repertoire of the human VH segments", J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992). Las definiciones de los sitios de combinación antigénica también se describen en las siguientes referencias: Ruiz et al., "IMGT, the international ImMunoGeneTics database", Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); y Lefranc, M.-P. "IMGT, the international ImMunoGeneTics database", Nucleic Acids Res. 1 de enero; 29 (1):207-9 (2001); MacCallum et al., "Antibody-antigen interactions"; Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172(1996).

A no ser que se indique lo contrario, las referencias de la presente memoria a las posiciones de los aminoácidos de la cadena pesada o ligera de RFB4 se refieren a la numeración de los aminoácidos según el sistema de "Kabat y Wu", que es el sistema de numeración de anticuerpos más ampliamente usado. Véase, Kabat, E., et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Government Printing Office, n.º de publicación del NIH 91-3242 (1991). El esquema de numeración de Clothia es idéntico al esquema de Kabat, pero sitúa las inserciones realizadas en CDR-L1 y CDR-H1 en posiciones estructuralmente diferentes. Cabe señalar que el número que coincide con un residuo según el sistema de Kabat y Wu no se corresponde necesariamente con el número que se podría obtener para un residuo en una cadena pesada o ligera dada contando desde el terminal amino de esa cadena. De este modo, la posición de un residuo de aminoácido en una determinada secuencia de V_{H} o V_{L} no se refiere al número de aminoácidos de una secuencia concreta, sino que más bien se refiere a la posición designada con referencia al esquema de numeración de Kabat. Las figuras 2 y 3 muestran la correlación entre la numeración secuencial de los residuos de las cadenas ligera y pesada de RFB4, y la numeración de Kabat y Wu de esos residuos. Con el fin de abreviar, en la presente memoria, a veces se hace referencia a la numeración de "Kabat y Wu" como la numeración de "Kabat".

Las mutaciones se describen en la presente memoria en la notación convencional. De este modo, por ejemplo, el término "R490A" indica que la "R" (arginina, en el código estándar de una sola letra) de la posición 490 de la molécula a la que se hace referencia está reemplazada por una "A" (alanina en el código estándar de una sola letra). Más adelante se presenta el código estándar de una sola letra para los aminoácidos comunes.

Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo" incluye la referencia a una molécula de inmunoglobulina reactiva inmunológicamente con un determinado antígeno, e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El término también incluye formas diseñadas genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos (p. ej., anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos de heteroconjugados (p. ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos Fv monocatenarios recombinantes (scFv) y fragmentos Fv estabilizados por unión disulfuro (dsFv) (véase la patente estadounidense n.º: 5.747.654 del solicitante). El término "anticuerpo" también incluye formas de unión antigénica de anticuerpos (p. ej., Fab', F(ab')_{2}, Fab, Fv y rIgG. Véase también, "Pierce Catalog and Handbook", 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Goldsby et al., eds., Kuby, J., Immunology, IV Ed., W. H. Freeman y Co., Nueva York (2000).

Es posible generar un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un determinado antígeno mediante procedimientos recombinantes, tales como la selección de bancos de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares; véase p. ej., Huse, et al., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341: 544-546 (1989); y Vaughan, et al., Nature Biotech. 14: 309-314 (1996), o mediante la inmunización de un animal con el antígeno o con ADN que codifique el antígeno.

Comúnmente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una cadena ligera. Cada una de las cadenas pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (las regiones también se conocen como "dominios"). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Se ha definido la extensión de la región marco y de las CDR. Véase, Kabat y Wu, supra. Las secuencias de las regiones marco de las diferentes cadenas ligera o pesada se conservan relativamente dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son fundamentalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena son comúnmente denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, estando numeradas consecutivamente partiendo del terminal N, y también son comúnmente por la cadena en la que se localiza la CDR en particular. De este modo, la CDR3 de la V_{H} se ubica en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de V_{L} es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.

Las referencias a "V_{H}" o una "V_{H}" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "V_{L}" o una "V_{L}" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han unido para formar una cadena. Comúnmente, se inserta un péptido ligador entre las dos cadenas para permitir el plegamiento apropiado y la creación de un sitio de unión activo.

La expresión "enlace de tipo disulfuro" o "enlace de tipo disulfuro cisteína-cisteína" se refiere a una interacción covalente entre dos cisteínas en la que los átomos de azufre de las cisteínas son oxidados para formar un enlace de tipo disulfuro. La energía de enlace media de un enlace de tipo disulfuro es de aproximadamente 60 kcal/mol en comparación con 1-2 kcal/mol para un puente de hidrógeno.

La expresión "Fv estabilizado por unión disulfuro" o "dsFv" se refiere a la región variable de una inmunoglobulina en la que hay un enlace de tipo disulfuro entre la cadena ligera y la cadena pesada. En el contexto de esta invención, las cisteínas que forman el enlace de tipo disulfuro están dentro de las regiones marco de las cadenas del anticuerpo y sirven para estabilizar la configuración del anticuerpo. Comúnmente, el anticuerpo es diseñado genéticamente para introducir cisteínas en la región marco en posiciones en las que la sustitución no interfiera con la unión antigénica.

La expresión "péptido ligador" incluye la referencia a un péptido dentro de un fragmento de unión de anticuerpo (p. ej., fragmento Fv) que sirve para enlazar indirectamente el dominio variable de la cadena pesada con el dominio variable de la cadena ligera.

La expresión "anticuerpo parental" significa cualquier anticuerpo de interés que se vaya a mutar o variar para obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan al mismo epítopo que el anticuerpo parental, pero con mayor afinidad.

El término "punto caliente" significa una parte de una secuencia de nucleótidos de una CDR o de una región marco de un dominio variable que es un sitio de variación natural particularmente elevada. Aunque las CDR son propiamente consideradas regiones de hipervariabilidad, se ha descubierto que las mutaciones no están distribuidas igualmente por las CDR. Se han identificado sitios, o puntos calientes, concretos como estas ubicaciones que sufren mutaciones concentradas. Los puntos calientes se caracterizan por un número de características estructurales y secuencias. Estos "motivos de punto caliente" se pueden usar para identificar los puntos calientes. Dos motivos de secuencias consenso que están especialmente bien caracterizados son la secuencia tetranucleotídica RGYW y la secuencia de serina AGY, en la que R es A o G, Y es C o T y W es A o T.

Un "inmunoconjugado" es una molécula compuesta por una parte o un resto de dirección, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que conserva la capacidad de reconocimiento antigénico y una molécula efectora, tal como un resto terapéutico o un marcador detectable.

Una "inmunotoxina" es un inmunoconjugado en el que el resto terapéutico es una citotoxina.

Un "resto de dirección" es la parte de un inmunoconjugado destinada a dirigir al inmunoconjugado hacia una célula de interés. Comúnmente, el resto de dirección es un anticuerpo, un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

Un "resto tóxico" es la parte de una inmunotoxina que vuelve a la inmunotoxina citotóxica para células de interés.

Un "resto de terapéutico" es la parte de un inmunoconjugado destinada a actuar como un agente terapéutico.

La expresión "agente terapéutico" incluye cualquier número de compuestos conocidos actualmente o desarrollados posteriormente para actuar como antineoplásicos, antiinflamatorios, citocinas, antiinfecciosos, activadores o inhibidores enzimáticos, modificadores alostéricos, antibióticos u otros agentes administrados para producir un efecto terapéutico deseado en un paciente. El agente terapéutico también puede ser una toxina o un radioisótopo, siendo el efecto terapéutico deseado, por ejemplo, matar una célula cancerosa.

Un "marcador detectable" significa, con respecto a un inmunoconjugado, una parte del inmunoconjugado que tiene una propiedad que vuelve su presencia detectable. Por ejemplo, el inmunoconjugado puede estar marcado con un isótopo radiactivo que permita la detección de las células en las que está presente el inmunoconjugado en análisis inmunohistoquímicos.

La expresión "resto efector" significa la parte de un inmunoconjugado destinada a tener un efecto sobre una célula diana mediante un resto de dirección o a identificar la presencia del inmunoconjugado. De este modo, el resto efector puede ser, por ejemplo, un resto terapéutico, una toxina, un radiomarcador o un marcador fluorescente.

Las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad eficaz para" o "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye la referencia a una dosificación de un agente terapéutico suficiente para producir un resultado deseado, tal como inhibir la síntesis proteica de la célula en al menos el 50% o matar a la célula.

El término "toxina" incluye la referencia a abrina, ricina, exotoxina A de Pseudomonas (o "PE"), toxina de difteria ("DT"), toxina botulínica o toxinas modificadas de las mismas. Por ejemplo, la PE y la DT son compuestos muy tóxicos que provocan comúnmente la muerte a través de la toxicidad en el hígado. Sin embargo, es posible modificar la PE y la DT en una forma para su uso como una inmunotoxina eliminando el componente de dirección nativo de la toxina (p. ej., el dominio de la PE o la cadena B de la DT) y reemplazándolo con un resto de dirección diferente, tal como un anticuerpo.

Según lo indicado por el párrafo anterior, el término exotoxina A de Pseudomonas ("PE"), como se usa en la presente memoria, incluye la referencia a formas de PE que han sido modificadas, pero que conservan la función citotóxica. De este modo, es posible truncar la molécula de PE para proporcionar un fragmento de PE que sea citotóxico, pero que no se una a células, como en los fragmentos conocidos como PE38 y PE40, o pueda tener mutaciones que reduzcan la unión inespecífica, como en la versión denominada "PE4E", en la que cuatro residuos están mutados a ácido glutámico. Además, se puede modificar una parte de la secuencia de PE para aumentar la toxicidad, como en la forma denominada "PE38KDEL", en la que la secuencia C-terminal de la PE nativa está modificada, o la forma de la PE tratada en la presente memoria, en la que la arginina correspondiente a la posición 490 de la secuencia de PE nativa está reemplazada por alanina, glicina, valina, leucina o isoleucina.

El término "poner en contacto" incluye la referencia a la colocación en asociación física directa.

Un "plásmido de expresión" comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de interés, que está ligada operativamente a un promotor.

Como se usa en la presente memoria, "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente e incluyen la referencia a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más de los residuos de aminoácido son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales. Los términos también se aplican a polímeros que contienen sustituciones de aminoácidos conservadoras, tal que la proteína permanece funcional.

El término "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que está incorporado en una proteína, un polipéptido o un péptido (colectivamente "péptido"). El aminoácido puede ser un aminoácido natural y, a no ser que se especifique lo contrario, puede englobar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar como aminoácidos naturales.

Los aminoácidos y los análogos a los que se hace referencia en la presente memoria se describen mediante las siguientes denominaciones en abreviatura de la tabla A:

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TABLA A Nomenclatura de los aminoácidos

1

Una "sustitución conservadora", cuando describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de los aminoácidos de la proteína que no altera de manera sustancial la actividad de la proteína. De este modo, las "variaciones modificadas conservativamente" de una determinada secuencia de aminoácidos se refiere a sustituciones de esos aminoácidos que no son de una importancia fundamental para la actividad proteica o a la sustitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (p. ej., ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.), tal que las sustituciones de incluso los aminoácidos fundamentales no alteren la actividad de manera considerable. En la técnica, se conocen ampliamente tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los seis siguientes grupos de la tabla B contienen cada uno los aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:

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TABLA B

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\quad

1) Alanina (A), serina (S), treonina (T);

\quad

2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

\quad

3) Asparagina (N), glutamina (Q);

\quad

4) Arginina (R), lisina (K);

\quad

5) Isoleucina (1), leucina (L), metionina (M), valina (V); y

\quad

6) Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

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Véase también, Creighton, PROTEINS, W. H. Freeman y Compañía, Nueva York (1984).

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La expresión "sustancialmente similar" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con al menos un 90%, preferiblemente, al menos un 95% de identidad secuencial con respecto a la secuencia de referencia por una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje de identidad secuencial se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente por una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (i. e., huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que está la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que coinciden, dividiendo el número de posiciones que coinciden entre el número total de posiciones de la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad secuencial.

Los términos "conjugar", "unir", "enlazar" o "ligar" se refieren a convertir dos polipéptidos en una molécula de polipéptidos contiguos. En el contexto de la presente invención, los términos incluyen la referencia a unir un resto de anticuerpo con una molécula efectora (ME). El enlace puede ser mediante un medio químico o recombinante. El medio químico se refiere a una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora, tal que haya un enlace covalente formado entre las dos moléculas para formar una molécula.

Como se usa en la presente memoria, "recombinante" incluye la referencia a una proteína producida usando células que no tienen, en su estado nativo, una copia endógena del ADN capaz de expresar a la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque han sido modificadas genéticamente mediante la introducción de la secuencia aislada de ácidos nucleicos apropiada. El término también incluye la referencia a una célula o a un ácido nucleico o a un vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la modificación de un ácido nucleico nativo con respecto a una forma no nativa de esa célula, o que la célula es derivada de una célula así modificada. De este modo, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, expresan mutantes de genes que se encuentran en la forma nativa o expresan genes nativos
que, por el contrario, son expresados de manera anómala, son infra-expresados o no son expresados en absoluto.

Como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos" incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos bien en forma mono- o bicatenaria, y a no ser que se especifique lo contrario, engloba análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a nucleótidos naturales. A no ser que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos concreta incluye la secuencia complementaria de la misma, así como las variantes conservadoras, i. e., los ácidos nucleicos presentes en posiciones de codones tambaleantes y variantes que, cuando son traducidas en una proteína, dan como resultado una sustitución conservadora de un aminoácido.

Como se usa en la presente memoria, "que codifica" con respecto a un ácido nucleico específico incluye la referencia a ácidos nucleicos que comprenden la información para la traducción en la proteína especificada. La información se especifica mediante el uso de codones. Comúnmente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, se pueden usar variantes del código universal, tales como las presentes en algunas mitocondrias vegetales, animales y micóticas, la bacteria Mycoplasma capricolurn (Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 82: 2306-2309 (1985), o el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico se expresa usando la maquinaria de traducción de estos organismos.

La expresión "que se fusionan en marco" se refiere a unir dos o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tal que la secuencia de los ácidos nucleicos unida se traduce en una proteína monocatenaria que comprende las cadenas polipeptídicas originales.

Como se usa en la presente memoria, "expresado/a/s" incluye la referencia a la traducción de un ácido nucleico en una proteína. Las proteínas pueden ser expresadas y permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o ser secretadas en la matriz o el medio extracelular.

"Célula huésped" pretende significar un célula que puede mantener la replicación o la expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, de insecto, de anfibio o de mamífero.

La expresión "banco de despliegue en fagos" se refiere a una población de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un ADNc foráneo fusionado recombinantemente en marco con una proteína superficial. Los fagos despliegan la proteína foránea codificada por el ADNc sobre su superficie. Tras la replicación en un huésped bacteriano, comúnmente, E. coli, los fagos que contienen el ADNc foráneo de interés se seleccionan mediante la expresión de la proteína foránea sobre la superficie de los fagos.

Las expresiones "idéntico/a" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección ocular.

La expresión "sustancialmente idéntico/a", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%, más preferiblemente, el 65%, incluso más preferiblemente, el 70%, aún más preferiblemente, el 75%, incluso más preferiblemente, el 80% y, lo más preferible, el 90-95% de identidad de los nucleótidos o los residuos de aminoácido, cuando se comparan y se alinean para conseguir una correspondencia máxima, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación entre secuencias o mediante una inspección ocular. Preferiblemente, la identidad importante existe en una región de las secuencias que es de una longitud de al menos aproximadamente 50 residuos, más preferiblemente, en una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y lo más preferiblemente, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 residuos. En la realización más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las regiones codificantes.

Para la comparación de secuencias, comúnmente, una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de análisis. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de análisis y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas sub-secuenciales, en caso de que sean necesarias, y se designan los parámetros de programa del algoritmo de secuencias. Entonces, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad secuencial para la(s) secuencia(s) de análisis con respecto a la secuencia de referencia en base a los parámetros de programa designados.

El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 (1988), mediante las implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección ocular (véase, en general, "Current Protocols in Molecular Biology", F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).

Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad secuencial y la similitud entre secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschuel et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible al público en el Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (en la Web en "ncbi.nlm.nih.gov/"). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que bien coinciden con o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de las palabras vecinas ((Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales en palabras vecinas actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSP más largos que los contengan. Entonces los aciertos de palabras se extienden en ambos sentidos a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (la puntuación de recompensa para una pareja de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (la puntuación de penalización para los residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabras en cada sentido se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o a un valor menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y una matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad secuencial, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad con la que se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de análisis con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente, menor de aproximadamente 0,01 y, lo más preferiblemente, menor de aproximadamente 0,001.

Otro indicio de que dos secuencias de ácidos nucleicos o dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente de forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, según lo descrito más adelante. De este modo, por lo común, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos sólo difieren en sustituciones conservadoras. Otro indicio de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones restrictivas, según lo descrito más adelante.

El término "in vivo" incluye la referencia al interior del cuerpo del organismo a partir del cual se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significan fuera del cuerpo del organismo del que se obtuvo la célula.

La expresión "célula maligna" o "malignidad" se refiere a tumores o células tumorales que son invasivas y/o capaces de sufrir metástasis, i. e., una célula cancerosa.

Como se usa en la presente memoria, "células de mamífero" incluye la referencia a células derivadas de mamíferos incluyendo seres humanos, ratas, ratones, cerdos de guinea, chimpancés o macacos. Las células se pueden cultivar in vivo o in vitro.

La expresión "selectivamente reactivo" se refiere a, con respecto a un antígeno, a la asociación preferencial de un anticuerpo, en su conjunto o en parte, con una célula o un tejido que porte al antígeno, y no a células ni a tejidos que carezcan de ese antígeno. Por supuesto, se reconoce que se puede producir un cierto grado de interacción inespecífica entre una molécula y una célula o un tejido no diana. No obstante, la reactividad selectiva se puede distinguir como la mediada a través de un reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos selectivamente reactivos se unan a un antígeno, pueden hacerlo con baja afinidad. Por otro lado, la unión específica da como resultado una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo unido y las células que carecen del antígeno. La unión específica comúnmente da como resultado un aumento de más del doble, preferiblemente, de más de 5 veces, más preferiblemente, de más de 10 veces, y lo más preferible, de más de 100 veces de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) con una célula o un tejido que porta CD22 en comparación con una célula o un tejido que carece de CD22. La unión específica con una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que sea selectivo de su especificidad por una determinada proteína. Hay una variedad de formatos de inmunoanálisis apropiados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una determinada proteína. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA en fase sólida se usan habitualmente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lane, "ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL", Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para consultar una descripción de los formatos y de las condiciones de inmunoanálisis que se pueden usar para determinar una inmunorreactividad específica.

La expresión "condiciones inmunológicamente reactivas" incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo generado frente a un determinado epítopo se una con ese epítopo con un grado detectablemente mayor que y/o a la exclusión considerable de la unión de sustancialmente el resto de los epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión del anticuerpo y, comúnmente, son las utilizadas en los protocolos de inmunoanálisis o aquellas condiciones que se encuentran in vivo. Véase Harlow y Lane, supra, para una descripción de los formatos y las condiciones de inmunoanálisis. Preferiblemente, las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los procedimientos de la presente invención son "condiciones fisiológicas" que incluyen la referencia a condiciones (p. ej., temperatura, osmolaridad, pH) que son más comunes dentro de un mamífero vivo o de una célula de mamífero viva. Aunque se reconoce que algunos órganos están sometidos a condiciones extremas, el medio del interior del organismo e intracelular normalmente tiene un pH en torno a 7 (i. e., de un pH 6,0 a 8,0, más comúnmente, un pH de 6,5 a 7,5), contiene agua como el disolvente predominante y existe a una temperatura superior a 0ºC y menor de 50ºC. La osmolaridad está en el intervalo que mantiene la proliferación y la viabilidad celular.

Numeración de residuos de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de RFB4

Las posiciones de los residuos de aminoácido en una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo están convenientemente nombradas en la técnica mediante la numeración estándar presentada en Kabat, E., et al., "SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST", U. S. Government Printing Office, n.º de publicación del NIH 91-3242 (1991). Véase también, Johnson, G. y Wu, T., Nuc. Acids Res. 29: 205-206 (2001). En la técnica, comúnmente, se hace referencia a la base de datos de Kabat et al. como "Kabat" o "Kabat y Wu". La base de datos se mantiene actualmente en línea como un servicio de abonados y se puede encontrar entrando en www.kabatdatabase.com. Se han clonado las cadenas pesada y ligera de RFB4. Véase, Mansfield et al., Blood 90: 2020-2026 (1997). En la base de datos de Kabat, se presentan las secuencias de aminoácidos de las cadenas V_{L} y V_{H} de RFB4 y una lista de la numeración de Kabat de la posición de cada residuo de aminoácido con los números de entrada 038145 y 038146, respectivamente. La figura 2 muestra la comparación de la numeración de los aminoácidos de la cadena V_{L} de RFB4 (SEC ID N.º 2) con las posiciones de Kabat correspondientes según lo expuesto en la entrada de Kabat 038145; la figura 3 muestra la misma comparación para los aminoácidos de la cadena V_{H} de RFB4 (SEC ID N.º 4) según lo expuesto en la entrada de Kabat 038146.

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Unión de anticuerpos e inmunoanálisis A. Afinidad de unión de los anticuerpos

Los anticuerpos de esta invención se unen con sus antígenos diana con una afinidad mejor que la de los anticuerpos parentales RFB4 y BL22. Los anticuerpos son anticuerpos anti-CD22 que se unen con un epítopo extracelular de CD22. La afinidad de unión por un antígeno diana se mide o se determina comúnmente mediante análisis de anticuerpo-antígeno estándar, tales como análisis competitivos, análisis de saturación o inmunoanálisis, tales como el ELISA o RIA.

Se pueden usar tales análisis para determinar la constante de disociación del anticuerpo. La expresión "constante de disociación" se refiere a la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. La especificidad de unión entre un anticuerpo y un antígeno existe si la constante de disociación (K_{D} = 1/K, siendo K la constante de afinidad) del anticuerpo
es < 1 \muM, preferiblemente, < 100 nM y, lo más preferible, < 0,1 nM. Las moléculas de anticuerpo tendrán, comúnmente, una K_{D} en los intervalos más bajos. K_{D} = [Ab-Ag]/[Ab][Ag], siendo [Ab] la concentración en el equilibrio del anticuerpo; [Ag], la concentración en el equilibrio del antígeno y [Ab-Ag], la concentración en el equilibrio del complejo de anticuerpo-antígeno. Comúnmente, las interacciones de unión entre el antígeno y el anticuerpo incluyen asociaciones no covalentes reversibles, tales como una atracción electrostática, fuerzas de Van der Waals y puentes de hidrógeno. Este procedimiento de definición de la especificidad de unión se aplica a las cadenas pesadas y/o ligeras simples, a las CDR, a proteínas de fusión o a fragmentos de cadenas pesadas y/o ligeras que sean específicos de CD22, ya se unan solas con CD22 o en combinación.

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B. Inmunoanálisis

Es posible detectar y/o cuantificar los anticuerpos de la invención usando cualquiera de una serie de análisis de unión inmunológica ampliamente reconocidos (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168. Para consultar un resumen de los inmunoanálisis generales, véase también "METHODS IN CELL BIOLOGY", VOL. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); "BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY", VII EDICIÓN, Stites y Terr, eds. (1991). Los análisis de unión inmunológica (o inmunoanálisis) utilizan comúnmente un ligando (p. ej., CD22) para unirse específicamente con o, a menudo, inmovilizar un anticuerpo. Los anticuerpos empleados en los inmunoanálisis de la presente invención se tratan más detalladamente supra.

Los inmunoanálisis también suelen utilizar un agente de marcaje para unirlo específicamente y marcar el complejo de unión formado por el ligando y el anticuerpo. El agente de marcaje puede ser propiamente uno de los restos que comprende el complejo de anticuerpo/analito, i. e., el anticuerpo anti-CD22. Alternativamente, el agente de marcaje puede ser un tercer resto, tal como otro anticuerpo, que se una específicamente al complejo proteico de anticuerpo/CD22.

En un aspecto, se contempla un análisis competitivo en el que el agente de marcaje es un segundo anticuerpo anti-CD22 que porta un marcador. Los dos anticuerpos compiten entonces por la unión con el CD22 inmovilizado. Alternativamente, en un formato no competitivo, el anticuerpo CD22 carece de un marcador, pero hay marcado un segundo anticuerpo específico de anticuerpos de la especie de la que se derivó el anticuerpo anti-CD22, p. ej., murina, y que se une con el anticuerpo anti-CD22.

También se pueden usar como el agente marcador otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Presentan una potente reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de inmunoglobulina de una variedad de especies (véase, en general, Kronval, et al., J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973); y Akerstrom, et al., J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)).

En los análisis, pueden ser necesarias etapas de incubación y/o lavado tras cada una de las combinaciones de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato del análisis, del anticuerpo, del volumen de la solución, de las concentraciones y similares. Habitualmente, los análisis se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque se pueden realizar en un intervalo de temperaturas, tales como de 10ºC a 40ºC.

Aunque los datos de los inmunoanálisis pueden variar con el formato que se emplee en particular, el procedimiento de detección de los anticuerpos anti-CD22 en una muestra que contenga los anticuerpos comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que reaccione específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con el complejo de CD22/anticuerpo.

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Producción de inmunoconjugados

Los inmunoconjugados incluyen, pero no se limitan a, moléculas en las que hay un enlace covalente de un agente terapéutico con un anticuerpo. Un agente terapéutico es un agente con una determinada actividad biológica dirigida frente a una determinada molécula diana o una célula que porta una molécula diana. Cualquier experto en la técnica sabrá que los agentes terapéuticos puede incluir diversos fármacos, tales como vinblastina, daunomicina y similares, citotoxinas, tales como exotoxina de Pseudomonas o toxina de difteria nativas o modificadas, agentes encapsulantes (p. ej., liposomas), que contienen composiciones farmacológicas, agentes radiactivos, tales como ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, ^{3}H y ^{35}S, y otros marcadores, restos diana y ligandos.

La elección de un determinado agente terapéutico depende de la molécula o la célula diana en particular o del efecto biológico que se desee provocar. De este modo, por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una citotoxina que se use para provocar la muerte de una determinada célula diana. Por el contrario, cuando se desea producir simplemente una respuesta biológica no letal, el agente terapéutico puede ser conjugado con un agente farmacológico no letal o con un liposoma que contenga un agente farmacológico no letal.

Con los agentes terapéuticos y los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, el experto puede construir fácilmente una variedad de clones que contengan ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos que difieran en secuencia, pero que codifiquen la misma ME o secuencia de anticuerpo. Por tanto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos, y conjugados y proteínas de fusión de los mismos.

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A. Procedimientos recombinantes

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación de las secuencias apropiadas o mediante la síntesis química directa mediante procedimientos tales como el procedimiento de fosfotriéster de Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); el procedimiento de fosfodiéster de Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el procedimiento de dietilfosforamidita de Beaucage, et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981); el procedimiento de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981), p. ej., usando un sintetizador automático según lo descrito en, por ejemplo, Needham-VanDevanter, et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984); y el procedimiento en soporte sólido de la patente estadounidense n.º 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Éste se puede convertir en ADN bicatenario mediante la hibridación con una secuencia complementaria o mediante la polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como molde. Cualquier experto reconocería que aunque la síntesis química del ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante la unión de secuencias más cortas.

En una realización preferida, las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención se preparan mediante técnicas de clonación. En Sambrook, et al., "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL" (II ED.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger y Kimmel (eds.), "GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES", Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)) o Ausubel et al., (eds.), "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", Greene Publishing y Wiley-Interscience, NY (1987), se encuentran ejemplos de técnicas apropiadas de clonación y secuenciación, e instrucciones suficientes para dirigir a los expertos en muchos ejercicios de clonación. La información de los productos de los fabricantes de reactivos biológicos y equipos experimentales también proporciona información útil. Tales fabricantes incluyen la compañía química SIGMA (San Luis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., la compañía química Aldrich (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA y Applied Biosystems (Foster City, CA), así como otros muchos proveedores comerciales conocidos por cualquier experto.

Los ácidos nucleicos que codifican la ME nativa o anticuerpos anti-CD22 se pueden modificar para formar la ME, los anticuerpos o los inmunoconjugados de la presente invención. La modificación mediante mutagénesis dirigida a un sitio específico es ampliamente conocida en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican la ME o los anticuerpos anti-CD22 pueden ser amplificados mediante procedimientos in vitro. Los procedimientos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia auto-sostenida (3SR). Hay una amplia variedad de procedimientos de clonación, células huésped y metodologías de amplificación in vitro ampliamente conocidos por los expertos.

En una realización preferida, se preparan inmunoconjugados insertando el ADNc que codifica un anticuerpo scFv anti-CD22 en un vector que comprende el ADNc que codifica la ME. La inserción se hace tal que el scFv y la ME se lean en marco, es decir, en un polipéptido continuo que contenga una región de Fv funcional y una región de ME funcional. En una realización particularmente preferida, el ADNc que codifica un fragmento de toxina de difteria está ligado a un scFv, tal que la toxina se ubica en el terminal carboxilo del scFv. En una realización más preferida, el ADNc que codifica a PE está ligado a un scFv, tal que la toxina se ubica en el terminal amino del scFv.

Una vez aislados y clonados los ácidos nucleicos que codifican una ME, un anticuerpo anti-CD22 o un inmunoconjugado de la presente invención, es posible expresar la proteína deseada en una célula diseñada genéticamente de manera recombinante, tal como células bacterianas, vegetales, de levadura, de insecto y de mamífero. Se espera que los expertos en la técnica conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de proteínas, incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores, tales como líneas celulares COS, CHO, HeLa y de mieloma. No se intentarán describir detalladamente los diversos procedimientos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas. En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifiquen las proteínas aisladas de la invención se conseguirá comúnmente ligando operativamente el ADN o el ADNc a un promotor (que bien sea constitutivo o inducible) e incorporándolo después en un casete de expresión. Los casetes pueden ser adecuados para la replicación y la integración en bien procariotas o eucariotas. Los casetes de expresión más comunes contienen terminadores de la transcripción y de la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifique a la proteína. Para obtener un nivel elevado de expresión de un gen clonado, es deseable construir casetes de expresión que contengan, como mínimo, un promotor potente para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción/traducción. Para E. coli, esto incluye un promotor tal como los promotores T7, trp, lac o Lambda, un sitio de unión al ribosoma y, preferiblemente, una señal de terminación de la transcripción. Para células eucariotas, las secuencias control pueden incluir un promotor y, preferiblemente, un potenciador derivado de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus y una secuencia de poliadenilación, y pueden incluir secuencias donantes y aceptoras de empalmes. Los casetes de la invención se pueden transferir a la célula huésped elegida mediante procedimientos conocidos, tales como la transformación con cloruro de calcio o la electroporación para E. coli y el tratamiento con fosfato de calcio, la electroporación o la lipofección de células de mamífero. Las células transformadas por los casetes se pueden seleccionar por la resistencia a antibióticos conferida por los genes contenidos en los casetes, tales como genes amp, gpt, neo e hyg.

Cualquier experto reconocería que es posible hacer modificaciones a un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la presente invención (i. e., anticuerpo anti-CD22 o un inmunoconjugado formado de la combinación del anticuerpo y PE) sin disminuir su actividad biológica. Se pueden hacer algunas modificaciones para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación de la molécula diana en una proteína de fusión. Tales modificaciones son conocidas por los expertos en la técnica y incluyen, por ejemplo, codones de terminación, una metionina añadida al terminal amino para proporcionar un sitio de inicio, más aminoácidos colocados en cualquier terminal para crear sitios de restricción convenientemente ubicados, o más aminoácidos (tales como Poly(His)) para ayudar en las etapas de purificación.

Además de procedimientos recombinantes, los inmunoconjugados, la ME y los anticuerpos de la presente invención también se pueden construir en conjunto o en parte usando la síntesis de péptidos estándar. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de la presente invención de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud se puede realizar uniendo el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble, para luego añadir consecutivamente el resto de los aminoácidos en la secuencia. Barany y Merrifield, "THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SÍNTESIS", PARTE A. pp. 3-284; Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 (1963), y Stewart, et al., "SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS", II ED., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984) describen técnicas para la síntesis en fase sólida. Se pueden sintetizar proteínas de mayor longitud mediante la condensación de los terminales amino y carboxilo de los fragmentos más cortos. Los procedimientos para formar enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo terminal carboxilo (p. ej., mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-diciclohexilcarbodiimida) son conocidos por los expertos.

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B. Purificación

Una vez expresados, es posible purificar los inmunoconjugados, los anticuerpos y/o las moléculas efectoras recombinantes de la presente invención según procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la precipitación en sulfato de amonio, las columnas de afinidad, la cromatografía en columna y similares (véase, en general, R. Scopes, "PROTEIN PURIFICATION", Springer-Verlag, N. Y. (1982)). Se prefieren las composiciones sustancialmente puras de una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95%, siendo la más preferida una homogeneidad del 98 al 99% o mayor para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad, según lo deseado, si se van a usar terapéuticamente, los polipéptidos deberían estar sustancialmente libres de endotoxina.

Se han descrito procedimientos para la expresión de anticuerpos monocatenarios y/o el replegamiento en una forma activa apropiada, incluyendo anticuerpos monocatenarios de bacterias tales como E. coli, y son conocidos y aplicables a los anticuerpos de esta invención. Véase, Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) y Ward, et al., Nature 341: 544 (1989).

Habitualmente, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli o de otras bacterias se aíslan de cuerpos de inclusión y necesitan la disolución usando potentes desnaturalizantes y el posterior replegamiento. Durante la etapa de disolución, como es ampliamente conocido en la técnica, debe haber presente un agente reductor para separar los enlaces de tipo disulfuro. Un tampón ejemplar con un agente reductor es: Tris 0,1M, pH 8; guanidina 6M; EDTA 2 mM; DTE 0,3M (ditioeritritol). La reoxidación de los enlaces de tipo disulfuro puede tener lugar en presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida u oxidada, según lo descrito en Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970) y, especialmente, según lo descrito por Buchner et al., supra.

La renaturaliación se consigue comúnmente mediante la dilución (p. ej., 100 veces mayor) de la proteína desnaturalizada y reducida en tampón de replegamiento. Un tampón ejemplar es Tris 0,1M, pH 8,0; L-arginina 0,5M; glutationa oxidada 8 mM (GSSG) y EDTA 2 mM.

Como una modificación del protocolo de purificación de anticuerpos bicatenarios, se disuelven por separado las regiones de cadena pesada y ligera, y se reducen para luego combinarlas en la solución de replegamiento. Se obtiene un resultado preferido cuando se mezclan estas dos proteínas en una proporción molar tal que no se supere un exceso molar multiplicado por 5 de una proteína frente a la otra. Es deseable añadir glutationa oxidada en exceso u otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular a la solución de replegamiento una vez completado el mezclado rédox.

Exotoxina de Pseudomonas y otras toxinas

Se pueden emplear toxinas con los anticuerpos de la presente invención para producir inmunotoxinas. Las toxinas ejemplares incluyen ricino, abrina, toxina de difteria y subunidades de las mismas, así como toxinas botulínicas A a F. Estas toxinas se obtienen fácilmente de fuentes comerciales (p. ej., la compañía química Sigma, St. Luis, MO). La toxina de difteria se aísla de Corynebacterium diphtheriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de ricino). El término también hace referencia a variantes tóxicas de la misma. Por ejemplo, véanse, las patentes estadounidenses n.º 5.079.163 y 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) se da en dos formas denominadas RCA_{60} y RCA_{120} según sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543 (1972)). La cadena A es responsable de la desactivación de la síntesis proteica y de la muerte de las células. La cadena B se une al ricino en los residuos de galactosa de la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A hacia el citosol (Olsnes, et al., Nature 249:627-631 (1974) y la patente estadounidense n.º 3.060.165).

La abrina incluye lectinas tóxicas de Abrus precatorius. Los principios tóxicos, la abrina a, b, c y d, tienen un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kD, y están compuestos de dos cadenas polipeptídicas A y B ligadas mediante un enlace de tipo disulfuro. La cadena A inhibe la síntesis proteica; la cadena B (abrina b) se une a los residuos de D-galactosa (véase, Funatsu, et al., Agr. Biol. Chem. 52: 1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzymol, 50: 330-335 (1978)).

En realizaciones preferidas de la presente invención, la toxina es exotoxina A de Pseudomonas ("PE"). La exotoxina A de Pseudomonas nativa (PE) es una proteína monomérica sumamente activa (peso molecular de 66 kD) secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis proteica en células eucariotas. La secuencia de PE nativa se presenta en la SEC ID N.º 1 de la patente estadounidense n.º 5.602.095. El procedimiento de acción es la desactivación de la ribosilación del ADP del factor de elongación 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan conjuntamente para provocar la citotoxicidad. El dominio Ia (aminoácidos 1-252) media la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ribosilación del ADP del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) sigue sin estar definida, aunque se puede eliminar una gran parte del mismo, los aminoácidos 365-380, sin pérdida de citotoxicidad. Véase Siegall, et al., J. Biol Chem 264: 14256-61 (1989).

Los términos "exotoxina de Pseudomonas" y "PE", como se usan en la presente memoria, se refieren comúnmente a una PE que ha sido modificada de la proteína nativa para reducir o eliminar la toxicidad inespecífica. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, la eliminación del dominio Ia, las eliminaciones de diversos aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de un solo aminoácido y la adición de una o más secuencias en el terminal carboxilo, tal como KDEL (SEC ID N.º 5) y REDL (SEC ID N.º 6). Véase Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989). Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen aquéllos que son citotóxicos con o sin un procesamiento proteolítico o de otro tipo posterior en la célula diana (p. ej., como una proteína o una pre-proteína). Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen PE40, PE38 y sus variantes PE38QQR y PE38KDEL, y PE35, según lo tratado más adelante. En una realización preferida, el fragmento citotóxico de PE conserva al menos el 50%, preferiblemente, el 75%, más preferiblemente, al menos el 90% y, lo más preferiblemente, el 95% de la citotoxicidad de la PE nativa. En la realización más preferida, el fragmento citotóxico es más tóxico que la PE nativa.

En realizaciones preferidas, la PE se ha modificado para reducir o eliminar la unión celular inespecífica, frecuentemente, mediante la eliminación del dominio Ia, según lo enseñado en la patente estadounidense n.º 4.892.827, aunque esto también se puede conseguir, por ejemplo, mutando ciertos residuos del dominio Ia. La patente estadounidense n.º 5.512.658, por ejemplo, revela que una PE mutada en la que está presente el dominio Ia, pero en la que se han reemplazado los residuos básicos del dominio Ia en las posiciones 57, 246, 247 y 249 con residuos ácidos (ácido glutámico o "E") presenta una citotoxicidad inespecífica enormemente disminuida. Esta forma mutante de PE a veces se denomina PE4E.

PE40 es un derivado truncado de PE según lo descrito anteriormente en la técnica. Véase, Pai et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU., 88:3358-62 (1991); y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263: 9470-9475 (1988). PE35 es un fragmento carboxi-terminal de 35 kD de PE del que se han eliminado los residuos de aminoácido 1-279 y la molécula comienza con una met en la posición 280 seguida por los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE nativa. PE35 y PE40 se revelan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.º 5.602.095 y 4.892.827.

En algunas realizaciones preferidas, se emplea el fragmento citotóxico PE38. PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE, pero carece de la parte de unión celular (Hwang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987)). PE38 es una pro-proteína de PE truncada compuesta por los aminoácidos 253-364 y 381-613, que se activa hasta su forma citotóxica tras su procesamiento en una célula (véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 5.608.039 y Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333:C1-C6 (1997)). La secuencia de PE38 se puede ser fácilmente determinada por el profesional a partir de la secuencia conocida de PE, pero por comodidad, también se presenta como la SEC ID N.º 22. Los expertos sabrán que, debido a la degeneración del código genético, la secuencia de aminoácidos de PE38, de sus variantes, tales como PE38KDEL, y de otros derivados de PE tratados en la presente memoria puede ser codificada por una gran variedad de secuencias de ácidos nucleicos, pudiéndose expresar cualquiera de ellas para dar como resultado el polipéptido deseado.

Como se indica anteriormente, se puede eliminar parte o todo el dominio 1b y unir el resto de las partes con un ligador o directamente mediante un enlace peptídico. Se puede eliminar parte de la parte amino del dominio II, y el extremo C-terminal puede contener la secuencia nativa de los residuos 609-613 (REDLK (SEC ID N.º 7)), o puede contener una variación encontrada para mantener la capacidad del constructo de translocarse en el citosol, tal como REDL (SEC ID N.º 6) o KDEL (SEC ID N.º 5) y las repeticiones de estas secuencias. Véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.º 5.854.044; 5.821.238 y 5.602.095, y el documento WO 99/51643. Aunque en las realizaciones preferidas, la PE es PE4E, PE40 o PE38, en las inmunotoxinas de la presente invención, se puede usar cualquier forma de PE de la que se haya eliminado la citotoxicidad inespecífica o reducido hasta niveles en los que no se produzca una toxicidad relevante hacia células no diana, siempre y cuando permanezca capaz de translocarse y ribosilar EF-2 en una célula diana.

En realizaciones preferidas, las moléculas de PE se modifican más para que tengan una sustitución de un aminoácido alifático en lugar de la arginina normalmente presente en la posición 490 de la molécula de PE. Los aminoácidos sustitutos pueden ser, por ejemplo, G, A, V, L o I. G, A e I son los sustitutos más preferidos, siendo A el más preferido. De este modo, por ejemplo, se puede diseñar genéticamente PE40, PE38, PE38KDEL, PE38QQR, PE4E, PE37 o PE35 para que tenga una G, A o I en la posición 490 para mejorar la citotoxicidad de la molécula. En realizaciones particularmente preferidas, el residuo de la posición 490 es cambiado a una alanina. Una secuencia ejemplar, con la R en la posición 490 de PE38 mutada a alanina, se presenta como la SEC ID N.º 23.

A. Variantes modificadas conservativamente de PE

Las variantes modificadas conservativamente de PE o de fragmentos citotóxicos de la misma tienen una similitud secuencial de al menos un 80%, preferiblemente, una similitud secuencial de al menos un 85%, más preferiblemente, una similitud secuencial de al menos un 90% y, lo más preferible, una similitud secuencial de al menos un 95% a nivel de los aminoácidos con la PE de interés, tal como la PE38.

La expresión "variantes modificadas conservativamente" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellas secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias de ácidos nucleicos esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De este modo, en todas las posiciones en las hay una alanina especificada por un codón, es posible modificar el codón a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin modificar el polipéptido codificado. Tales variaciones de los ácido nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Todas las secuencias de ácidos nucleicos de la presente memoria que codifican un polipéptido también describen cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. El experto reconocerá que es posible modificar cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que comúnmente es el único codón para la metionina) para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como en las secuencias de aminoácidos, cualquier experto reconocerá que las sustituciones, las eliminaciones o las adiciones individuales realizadas en una secuencia de ácido nucleico, peptídica, polipeptídica o proteica que alteren, añadan o eliminen un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

B. Análisis de la citotoxicidad de PE

Es posible analizar el nivel deseado de citotoxicidad de las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la invención mediante análisis ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, es posible analizar fácilmente la citotoxicidad de los fragmentos citotóxicos de la PE y de las variantes modificadas conservativamente de tales fragmentos. Se puede analizar simultáneamente la citotoxicidad de un gran número de moléculas de PE candidatas mediante procedimientos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede analizar la citotoxicidad de subgrupos de las moléculas candidatas. Los subgrupos de las moléculas candidatas que reaccionan positivamente pueden subdividirse de manera continua y volverse a analizar hasta identificar el o los fragmentos citotóxicos deseados. Tales procedimientos permiten una detección rápida de grandes números de fragmentos citotóxicos o variantes conservativas de PE.

C. Otros restos terapéuticos

También se pueden usar los anticuerpos de la presente invención para dirigir cualquier número de diferentes compuestos de diagnóstico o terapéuticos hacia células que expresen a CD22 en su superficie. De este modo, se puede unir un anticuerpo de la presente invención, tal como un scFv anti-CD22, directamente o mediante un ligador con un fármaco destinado a ser administrado directamente en células que porten a CD22. Los agentes terapéuticos incluyen compuestos tales como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, aminoácidos o derivados, glicoproteínas, radioisótipos, lípidos, hidratos de carbono o virus recombinantes. Los restos terapéuticos y de diagnóstico de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos derivados para un entrecruzamiento covalente con ADN simple o en dúplex y oligonucleótidos que forman un tríplex.

Alternativamente, la molécula ligada a un anticuerpo anti-CD22 puede ser un sistema encapsulante, tal como un liposoma o una micela que contiene una composición terapéutica, tales como un fármaco, un ácido nucleico (p. ej., un ácido nucleico antisentido) u otro resto terapéutico que se prefiera proteger de la exposición directa al sistema circulatorio. Los procedimientos para preparar liposomas unidos a anticuerpos son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.957.735; y Connor et al., Pharm. Ther 28:341-365 (1985).

D. Marcadores detectables

Opcionalmente, se pueden ligar los anticuerpos de la presente invención covalente o no covalentemente a un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados para tal uso incluyen cualquier composición detectable mediante procedimientos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (p. ej., DYNABEADS), colorantes fluorescentes (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína verde fluorescente y similares); radiomarcadores (p.ej., ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P); enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, alcalina fosfatasa y otros usados comúnmente en un ELISA); y marcadores colorimétricos, tales como perlas de oro coloidal o de vidrio o plástico coloreado (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los procedimientos para detectar tales marcadores son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, es posible detectar los radiomarcadores usando una película fotográfica o contadores por centelleo; los marcadores fluorescentes se pueden detectar usando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan comúnmente proporcionando la enzima con un sustrato y detectando el producto de la reacción generado mediante la acción de la enzima en el sustrato; y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador coloreado.

E. Conjugación con el anticuerpo

En una realización no recombinante de la invención, se ligan moléculas efectoras, p. ej., restos terapéuticos, de diagnóstico o de detección, con los anticuerpos anti-CD22 de la presente invención usando una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden usar tanto medios covalentes como no covalentes con los anticuerpos anti-CD22 de la presente invención.

El procedimiento para unir una molécula efectora con un anticuerpo variará según la estructura química de la ME. Los polipéptidos contienen comúnmente una variedad de grupos funcionales; p. ej., grupos de ácido carboxílico (COOH), de amina libre (-NH_{2}) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para dar como resultado la unión de la molécula efectora.

Alternativamente, se deriva el anticuerpo para exponer o unir otros grupos funcionales reactivos. La derivación puede implicar la unión de cualquiera de entre una serie de moléculas ligadoras, tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

Un "ligador", como se usa en la presente memoria, es una molécula que se usa para unir el anticuerpo a la molécula efectora. El ligador es capaz de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molécula efectora. Los ligadores adecuados son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, ligadores de carbono de cadena lineal o ramificada, ligadores de carbono heterocíclicos o ligadores peptídicos. Cuando el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los ligadores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (p. ej., a través de un enlace de tipo disulfuro a la cisteína). Sin embargo, en una realización preferida, los ligadores se unirán a los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los aminoácidos terminales.

En algunos casos, es deseable liberar la molécula efectora del anticuerpo cuando el inmunoconjugado haya alcanzado su sitio diana. Por lo tanto, en estos casos, los inmunoconjugados comprenderán enlaces que son escindibles en las proximidades del sitio diana. La escisión del ligador para liberar la molécula efectora del anticuerpo puede ser provocada por una actividad enzimática o por condiciones a las que se someta el inmunoconjugado bien en el interior de la célula diana o en las proximidades del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor, se puede usar un ligador que sea escindible en las condiciones presentes en el sitio tumoral (p. ej., cuando se expone a enzimas asociadas a un tumor o a un pH ácido).

En vista del gran número de procedimientos que se ha publicado para unir una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, fármacos, toxinas y otros agentes con anticuerpos, el experto en la técnica podrá determinar un procedimiento adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo o a otro polipéptido.

Composiciones farmacéuticas y administración

Las composiciones de los anticuerpos y/o los inmunoconjugados de esta invención (i. e., PE ligado a un anticuerpo anti-CD22 de la invención) son particularmente útiles para una administración parenteral, tal como la administración intravenosa o la administración en una cavidad corporal.

Las composiciones para una administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo y/o el inmunoconjugado disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente, en un vehículo acuoso. Se puede usar una variedad de vehículos acuosos, p. ej., solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia no deseada. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas convencionales de esterilización ampliamente conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según lo requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la toxicidad y similares; por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de la proteína de fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará fundamentalmente en base a los volúmenes del fluido, las viscosidades, el peso corporal, y similares según el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del paciente.

De este modo, una composición de inmunotoxina farmacéutica típica de la presente invención para una administración intravenosa sería de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente al día. Se pueden usar dosis de 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente al día. Los procedimientos reales para la preparación de composiciones administrables serán conocidos y evidentes para los expertos en la técnica, y se describen más detalladamente en publicaciones tales como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", XIX ED., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1995).

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar para tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograrlo se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente. Una cantidad eficaz del compuesto es aquélla que proporciona bien un alivio subjetivo de uno o varios síntomas o una mejoría identificable objetivamente por el profesional clínico u otro observador cualificado.

Se administran una o varias administraciones de las composiciones en función de la dosificación y de la frecuencia según lo requerido y tolerado por el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar eficazmente al paciente. Preferiblemente, la dosis se administra una vez, pero se puede aplicar periódicamente bien hasta que se consiga un resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios justifiquen la interrupción de la terapia. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los síntomas o los signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable en el paciente.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada de las composiciones de los inmunoconjugados de la presente invención se pueden crear como implantes, inyecciones oleaginosas o como sistemas de partículas. Para un resumen amplio de los sistemas de administración de proteínas, véase, Banga, A. J., "THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS", Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995), incorporado en la presente memoria por referencia. Los sistemas de partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica como el núcleo central. En las microesferas la proteína terapéutica está dispersada por la partícula. Las partículas, las microesferas y las microcápsulas menores de aproximadamente 1 \mum se denominan, generalmente, nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 \mum, tal que sólo las nanopartículas se administran intravenosamente. Las micropartículas son comúnmente de aproximadamente 100 \mum de diámetro y se administran subcutáneamente o intramuscularmente. Véase, p. ej., Kreuter, J., "COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS", J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, pp. 219-342 (1994); y Tice y Tabibi, "TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY", A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, NY, pp. 315-339, (1992).

Se pueden usar polímeros para la liberación controlada por iones de las composiciones de los inmunoconjugados de la presente invención. En la técnica, se conocen diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en la liberación controlada de fármacos (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26: 537-542 (1993)). Por ejemplo, el copolímero en bloque, Polaxamer 407, se da como un líquido viscoso pero móvil a temperaturas bajas, pero forma un gel semisólido a la temperatura corporal. Ha demostrado ser un vehículo eficaz para la formulación y la liberación sostenida de la interleucina-2 recombinante y la ureasa (Johnston, et al., Pharm. Res. 9: 425-434 (1992); y Pec, et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2): 58-65 (1990)). Alternativamente, se ha usado la hidroxiapatita como un microvehículo para la liberación controlada de proteínas (Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112: 215-224 (1994)). En otro aspecto más, se usan liposomas para la liberación controlada, así como la dirección del fármaco encapsulado en un lípido (Betageri, et al., "LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS", Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la liberación controlada de proteínas terapéuticas. Véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.º 5.055.303; 5.188.837; 4.235.871; 4.501.728; 4.837.028; 4.957.735 y 5.019.369; 5.055.303; 5.514.670; 5.413.797; 5.268.164; 5.004.697; 4.902.505; 5.506.206; 5.271.961; 5.254.342 y 5.534.496.

Entre los diversos usos de las inmunotoxinas de la presente invención se incluye una variedad de afecciones patológicas provocadas por células humanas específicas que se pueden eliminar mediante la acción tóxica de la proteína de fusión. Una aplicación preferida para las inmunotoxinas de la invención es el tratamiento de células malignas que expresan a CD22. Las células malignas ejemplares incluyen aquéllas de la leucemia linfocítica crónica y la leucemia de células vellosas.

Equipos de diagnóstico y usos in vitro

En otra realización, esta invención proporciona equipos para la detección de CD22 o un fragmento inmunorreactivo del mismo (i. e., colectivamente "un proteína CD22") en una muestra biológica. Una "muestra biológica" como la usada en la presente memoria es una muestra de tejido o de fluido biológico que contiene CD22. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, tejido de biopsia, sangre y células sanguíneas (p. ej., glóbulos blancos). Preferiblemente, las células son linfocitos. Las muestras biológicas también incluyen secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas por motivos histológicos. Las muestras biológicas se obtienen comúnmente de un eucariota multicelular, preferiblemente, un mamífero tal como rata, ratón, vaca, perro, cerdo de guinea o conejo, y más preferiblemente, de un primate, tal como un macaco, un chimpancé o un ser humano. Lo más preferible es que la muestra proceda de un ser humano.

Los equipos comprenderán comúnmente un anticuerpo anti-CD22 de la presente invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD22 será un fragmento Fv anti-CD22, tal como un fragmento scFv o dsFv.

Además, los equipos incluirán comúnmente instrucciones que revelen los procedimientos de uso de un anticuerpo de la presente invención (p. ej., para la detección de células mesoteliales en una muestra). Los equipos también pueden incluir otros componentes para facilitar la aplicación particular para la que el equipo está diseñado. De este modo, por ejemplo, el equipo puede contener además medios para la detección del marcador (p. ej., sustratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtros para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios apropiados, tales como HRP de oveja anti-ratón, o similares). Los equipos pueden incluir adicionalmente tampones u otros reactivos usados habitualmente para la práctica de un determinado procedimiento. Tales equipos y los contenidos apropiados son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica.

En una realización de la presente invención, el equipo de diagnóstico comprende un inmunoanálisis. Según lo descrito anteriormente, aunque los detalles de los inmunoanálisis de la presente invención pueden variar con el formato empleado en particular, el procedimiento para detectar a CD22 en una muestra biológica comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de la presente invención que reaccione específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con CD22. Se deja que el anticuerpo se una a CD22 en condiciones inmunológicamente reactivas y se detecta directa o indirectamente la presencia del anticuerpo unido.

Debido al aumento de la afinidad de los anticuerpos de la invención, los anticuerpos serán especialmente útiles como agentes de diagnóstico y en análisis in vitro para detectar la presencia de CD22 en muestras biológicas. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar como restos de dirección de inmunoconjugados en análisis inmunohistoquímicos para determinar si una muestra contiene células que expresen a CD22. La detección de CD22 en linfocitos indicaría bien que el paciente tiene un cáncer caracterizado por la presencia de células que expresan a CD22 o que un tratamiento para tal cáncer todavía no ha sido satisfactorio en la erradicación del cáncer.

En otro conjunto de usos para la invención, se pueden usar inmunotoxinas dirigidas por anticuerpos de la invención para purgar células diana de una población de células de un cultivo. De este modo, por ejemplo, se pueden purgar las células cultivadas de células cancerosas de un paciente que tenga un cáncer que exprese a CD22 mediante la puesta en contacto del cultivo con inmunotoxinas que usen los anticuerpos de la invención como un resto de dirección.

Ejemplos Ejemplo 1

HA22 es una forma mejorada de BL22 desarrollada recientemente en la que los residuos SSY de la CDR3 de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo (H-CDR3) se mutaron a THW. HA22 se describe detalladamente en Salvatore, G. et al., Clin Cancer Res, 8 (4): 995-1002 (2002) y en la solicitud PCT/US02/30316 del solicitante, publicación internacional WO 03/027135.

Para ver si sería posible mejorar la afinidad de HA22 más, se construyó un banco de despliegue en fagos
(LibVL30/31) dirigido a un punto caliente de la CDR1 de la cadena ligera (L-CDR1) de HA22. El análisis secuencial de diez clones del banco de mutantes LibVL30/31 demostró que el punto caliente diana fue aleatorizado mediante la PCR (Tabla 1).

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TABLA 1 Análisis secuencial del banco de mutantes LibVL30/31-3

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Bioselección substractiva de bancos de despliegue en fagos y análisis FACS

Para imitar la hipermutación somática en la respuesta inmune, se rastrearon fagos de alta afinidad frente a células Daudi CD22+ y células MCF7 CD22-.

La selección substractiva se realizó en las células MCF7 negativas en CD22 y el enriquecimiento se realizó en las células Daudi. Se sedimentaron las células (1 x 10^{7}) y se volvieron a suspender en 1 ml de tampón de bloqueo frío. Se añadieron fagos (\sim1 x 10^{12}) de los bancos a la suspensión celular y se hizo girar la mezcla lentamente a 4ºC durante 90 min. En la última etapa, se lavaron las células Daudi 16 veces con PBS/EDTA/tampón de bloqueo. Cada lavado incluía una incubación durante 15 min sobre hielo. Entonces, se eluyeron los fagos unidos (pH 1,5) (Tabla 2). La duración total de la selección de la constante de disociación fue de aproximadamente 4 horas. Se usó un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de los fagos unidos para controlar el enriquecimiento de los altos aglutinantes tras cada bioselección. Que sepamos, se trata del primer informe del uso de un FACS para controlar cuantitativamente el enriquecimiento de altos aglutinantes en una mezcla de bioselección de anticuerpos de fagos policlonales. Tras la tercera serie de bioselección, se prepararon scFv monoclonales de 32 clones individuales y se analizaron en cuanto a su capacidad para unirse a CD22\beta-Fc monocatenario recombinante mediante ELISA y CD22 nativo (\alpha\beta) en células Daudi mediante citometría de flujo (Tabla 3).

TABLA 2 Enriquecimiento de fagos de unión

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Los anticuerpos de fagos individuales enriquecidos a partir de la bioselección substractiva se analizaron sobre células Daudi mediante citometría de flujo (Tabla 3).

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TABLA 3 Análisis FACS de fagos monoclonales en células Daudi y secuencias de fagos mutantes

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Cuatro anticuerpos de fagos mutantes (B5, E6, B8 y D8, sombreados) resultaron tener una afinidad de unión por las células positivas en CD22 mayor que la molécula inicial (HA22). El orden de su afinidad relativa (de mayor a menor) es B5 > E6\simD8 > B8. Cabe señalar que los aminoácidos básicos (arginina e histidina) fueron seleccionados de manera dominante entre los altos aglutinantes (sombreados).

Lo interesante es que surgen varios residuos de puntos calientes mutados en los anticuerpos desarrollados a partir de las mutaciones dobles de la primera y la segunda posición (o incluso mutaciones triples) de cada codón, algo que raramente ocurre en el proceso de hipermutación somática de las células B. Por ejemplo, el cambio de AGC-AAG (Ser-Asn) del anticuerpo de ratón nativo a CAC-GGC (His-Gly) del mutante B5 implica mutaciones puntuales de cinco nucleótidos, en las que los cuatro nucleótidos de la primera y la segunda posición están mutados. Es improbable que esas mutaciones tan espectaculares puedan tener lugar in vivo, porque está documentado que la mutagénesis de puntos calientes del procedimiento de hipermutación somática a menudo implicaba sólo la mutación puntual de un nucleótido de cada codón (también apoyado por los datos mostrados en la tabla 6). En un estudio previo, Salvatore et al., obtuvieron un alto aglutinante (HA22) con la mutación ACG-CAC-TGG (Thr-His-Trp) en el sitio AGT-AGC-TAC (Ser-Ser-Tyr) de la región H-CDR3 usando una técnica de despliegue en fagos. La única mutación doble de la primera y la segunda posición dio como resultado la presencia de histidina. Esta observación sugiere con fuerza una ventaja de la evolución in vitro de los anticuerpos basada en puntos calientes en comparación con la hipermutación somática in vivo basada en puntos calientes. Esto también puede explicar por qué algunas mutaciones de puntos calientes favorables para una afinidad de unión más elevada no ocurren in vivo.

Además de la afinidad de unión, se examinó la especificidad de los fagos mutantes midiendo su unión con células MCF7. Cuando se analizaron en células MCF7 negativas en CD22, algunos mutantes (p. ej., B5) mostraron una unión inespecífica reducida en comparación con HA22 (Tabla 4), lo que indicó que la selección substractiva puede enriquecer de mutantes que tengan una unión inespecífica más baja que la molécula inicial.

TABLA 4 Análisis FACS de fagos monoclonales en células MCF7

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Actividad citotóxica (CI_{50})

Se subclonaron moléculas de Fv monocatenario (scFv) de los fagos seleccionados en un vector de expresión de T7 en el que el scFv estaba fusionado a una versión truncada de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). Tras la expresión y la purificación, se analizaron las inmunotoxinas recombinantes en varias líneas celulares positivas en CD22 para medir la actividad citotóxica (CI_{50}). El formato de la selección substractiva desarrolló satisfactoriamente varias variantes de inmunotoxinas con aumentos del doble en la actividad (CI_{50}) en comparación con su molécula inicial (HA22) (Tabla 5) y aumentos de 8 veces (CI_{50}) en comparación con la BL22 original.

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TABLA 5 Actividad citotóxica (CI_{50}) en ng/ml de mutantes RFB4(scFv)-PE38 seleccionados en tres líneas celulares positivas en CD22 diferentes. Las células se incubaron con inmunotoxinas durante 16 h y se midió la síntesis proteica. (Nota: H11 y E12 fueron mutantes del banco de fagos LibVH30/31 dirigido a H-CDR1. NH: no realizado)

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Los puntos calientes comunes de las CDR pueden ser buenos candidatos para el desarrollo de los anticuerpos in vitro.

TABLA 6 Puntos calientes comunes y no comunes de RFB4

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Como se muestra en la tabla 6, las CDR de la cadena ligera y las regiones CDR1 y 2 de la cadena pesada contienen cinco puntos calientes de ADN. Tres de ellos son diferentes de sus secuencias de la línea germinal (denominadas a efectos de comparación secuencias "no comunes") y dos son iguales que las secuencias de la línea germinal (denominadas en la presente memoria una secuencia "común" a las dos). En este estudio, se hicieron dos bancos de despliegue en fagos. Uno, LibVL30/31 dirigido al punto caliente común de L-CDR1, AGC-AAT (Ser30-Asn31), y el otro, LibVH30/31, dirigido a H-CDR1, AGT- ATC (Ser-Ile), un punto caliente no común. Los datos muestran que LibVL30/31 produjo satisfactoriamente varios mutantes con una afinidad superior a la de la molécula inicial y las inmunotoxinas creadas a partir de ellos mostraron una mayor actividad. Pero ninguno de los aglutinantes seleccionados enriquecidos de LibVH30/31 (H11 y E12 de la tabla 5) demostraron una afinidad significativamente superior, y las inmunotoxinas creadas a partir de ellos no mostraron una mayor actividad citotóxica.

Estos resultados pueden indicar que las secuencias de los puntos calientes comunes (especialmente, para aquéllas ubicadas en la CDR1 y 2) pueden ser buenas candidatas para el desarrollo de los anticuerpos in vitro. La CDR3 tiene una gran inserción somática. El estudio anterior dirigido a un motivo de punto caliente de la CDR3 de la cadena pesada de RFB4 obtuvo un mutante (HA22) con una afinidad mayor que la del anticuerpo original. Este motivo de punto caliente (AGT-AGC-TAC o Ser-Ser-Tyr) fue encontrado en el mismo sitio en muchos anticuerpos irrelevantes (p. ej., AY182711, AF178590 del GenBank), lo que indica que el motivo de punto caliente no se desarrolló tras la inserción somática. La hipótesis también está apoyada por otros estudios de maduración de anticuerpos in vitro basada en puntos calientes (p. ej., los anticuerpos frente a la mesotelina SS y SS1 desarrollado) realizados anteriormente en nuestro laboratorio. A diferencia de los residuos de puntos calientes no comunes, los motivos de puntos calientes comunes no han sido mutados in vivo debido a (1) una posible limitación a los cambios espectaculares o (2) una baja presión de selección. Es posible que algunos puntos calientes comunes no entren en contacto directamente con el antígeno, tal que la presión de la selección no sea lo suficientemente alta para un desarrollo in vivo. Pero una selección in vitro más restrictiva y la posibilidad de que se produzcan cambios más espectaculares proporcionan unas posibilidades muy diferentes para la maduración de la afinidad de los anticuerpos.

Ejemplo 2

Este ejemplo presenta los materiales y los procedimientos de los estudios que se muestran en el ejemplo 3.

Mutagénesis de sitios específicos

Las mutaciones se introdujeron usando un procedimiento de PCR de solapamiento de dos etapas y se usó el ADN del plásmido RFB4(V_{H}-GTHW (SEC ID N.º))-PE38 como molde. Los cebadores mutagénicos que contienen los sitios mutados (letras en negrita) y los sitios de las endonucleasas de restricción de SaI I y EcoRI (subrayados) son los siguientes: Cebador A (5'-GAACCCGACGCAGCC GGCCGTATCCGCAAC-3' (SEC ID N.º 25), secuencia arriba) y el cebador B (5'-GTTGCGGATA CGGCCGGCTGCGTCGGGTTC-3' (SEC ID N.º 26), secuencia abajo) y el cebador C (5'-GCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGG-3' (SEC ID N.º 27)) y el cebador D (5'-CTTT GTTAG
CAGCCGAATTCATATTCGAT-3' (SEC ID N.º 28)).

En primer lugar, se amplificaron las reacciones PCR usando los cebadores A y D o los cebadores B y C. Los perfiles PCR para las primeras reacciones fueron los siguientes: 30 ciclos de una desnaturalización de 1 min a 95ºC; apareamiento de 1,3 min a 58ºC y una prolongación de 2 min a 74ºC, seguida por una incubación final de 5 min a 72ºC. Se combinó una parte (0,01 ml) de cada una de las primeras reacciones y se usó directamente en una segunda PCR sólo con los cebadores C y D. Los perfiles PCR para las segundas reacciones fueron los siguientes: 30 ciclos de una desnaturalización de 1 min a 96ºC; apareamiento de 1 min a 60ºC y una prolongación de 2 min a 72ºC, seguida por una incubación final de 5 min a 72ºC. Esta reacción generó un producto de 1.000 pares de bases que contenía la mutación. Entonces se clonó el ADN amplificado usando este procedimiento en el vector de clonación T/A de Invitrogen pCR II (Invitrogen, San Diego, CA) sin mayor purificación, se transformó en DH5\alpha de E. coli y se identificó usando procedimientos de rastreo con azul-blanco. Los clones positivos se secuenciaron usando los cebadores C y D. Se retiró el inserto mutado de pCR II digiriendo el plásmido con endonucleasa Sal l y EcoRI, y se ligó el fragmento a un plásmido VH-PE38 digerido de idéntica manera.

Expresión y purificación de HA22 (R490A)

Las inmunotoxinas usadas en los estudios de la presente memoria se crearon como Fv estabilizados por unión disulfuro. Se diseñan genéticamente las dos cadenas con cisteínas para permitir el enlace de tipo disulfuro, se expresan por separado en E. coli y se permite la unión antes de la purificación de los cuerpos de inclusión (en estos estudios, la cadena pesada se expresó como una proteína de fusión con el resto de toxina). En particular, las inmunotoxinas se expresaron en BL21 de E. coli (\lambdaDE3) y se acumularon en cuerpos de inclusión, según lo descrito anteriormente para otras inmunotoxinas (Reiter, Y., et al., Biochemistry, 33(18):5451-9 (1994)). Se trataron los cuerpos de inclusión con lisozima, y se lavaron mediante homogenización y centrifugación con Triton X-100 al 2,5% y NaCI 0,5M 4 veces, siguiendo con un aclarado y una homogenización y centrifugación en tampón TE sin Triton X-100 ni NaCl 4 veces. Se disolvió la proteína de los cuerpos de inclusión, se desnaturalizó y se redujo en solución de guanidina-ditioeritritol. Se combinaron soluciones reductoras que contenían 67 mg de RFB4(V_{H}-GTHW (SEC ID N.º 29))-PE38 (R490A) o 33 mg de RFB4 (V_{L}), cada una a una concentración proteica de 10 mg/ml, y luego se volvieron a naturalizar mediante la dilución entre 100 en tampón rédox que contenía L-arginina y glutationa oxidada (Mansfield, E., et al., Blood, 90 (5):2020-6 (1997)). Se volvió a plegar la proteína a 10ºC durante 40 h. Se sometió a diálisis la proteína replegada con Tris 20 mM, pH 7,4, que contenía urea 0,1M, y se eliminaron los agregados precipitados mediante centrifugación. Entonces se aplicó la proteína a 10 ml de Q-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ), que se lavó con Tris 20 mM, pH 7,4, y se eluyó con Tris 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3M. Entonces se diluyó entre 5 la proteína purificada con Q-sefarosa con Tris 20 mM, pH 7,4, y se cargó sobre una columna Mono-Q (Parmacia) de 10 ml, que se eluyó con un gradiente lineal para obtener la proteína. Luego se cargó la proteína purificada en Mono-Q concentrada en una columna de Superosa-12 (Pharmacia) y se obtuvieron 6 mg de proteína (6% de la proteína recombinante total) mediante la elución con PBS. El contenido de endotoxina final fue de 0,86 UE/mg de proteína. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un análisis de Bradford (Coomassie Plus; Pierce, Rockford, IL).

Análisis de la citotoxicidad. La citotoxicidad específica de HA22 (R490A) se determinó mediante un análisis de la inhibición de la síntesis proteica (inhibición de la incorporación de leucina marcada con tritio en la proteína celular) en placas de 96 pocillos. Se mantuvieron las células en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (SBF), 50 \mug/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y L-glutamina 2 mM. Para el análisis de la citotoxicidad, se emplacaron 1,5 x 10^{4} células en 200 \mul de medio de cultivo en placas de 96 pocillos. Para los experimentos de citotoxicidad con células Daudi, CA46, Raji, JD38 y A431, se diluyeron las inmunotoxinas en serie en PBS/ASB al 0,2%, y se añadieron 20 \mul a las células. Se incubaron las placas durante 20 h a 37ºC y luego se sometieron a pulsos con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]-Leucina en 20 \mul de PBS/ASB al 0,2% durante 4 h a 37ºC. Se calculó la media de los valores de las muestras por triplicado y se determinó la inhibición de la síntesis proteica calculando el porcentaje de incorporación en comparación con los pocillos control sin toxina añadida. Las concentraciones de inmunotoxina que redujeron la incorporación de [^{3}H]-Leucina en un 50% en relación con el cultivo control sin tratar fueron definidas como CI_{50}.

Análisis de la viabilidad celular. Se determinó la inhibición del crecimiento celular tras el tratamiento con HA22 (R490A) en análisis de WST estándar basados en la reducción de la sal de tetrazolio en formazán por las enzimas de células viables. Se midió la absorbancia en un lector de análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) a 450 nm, con la absorbancia a 650 nm para corregir el fondo, y se expresó la viabilidad como el porcentaje de controles sin tratar.

Se emplacaron células CA46 a 8.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se desarrollaron células HUVEC (células endoteliales de cordón umbilical humano) en un medio de cultivo de células endoteliales (EGM) más extracto de cerebro bovino, ambos adquiridos en Clonetics Corp. (San Diego, CA). Se sembraron las células en placas de 96 pocillos a 3.000 células/pocillo. Se diluyeron las inmunotoxinas en serie en los medios de cultivo y se añadieron 10 \mul a las células. Se incubaron las placas durante 40 h o durante 72 h (HUVEC) a 37ºC. Luego se añadieron 5 \mul de solución de WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) a cada pocillo de la placa y se incubaron las células durante 4 h a 37ºC. Se determinó la densidad óptica a 450 y 650 nm usando un lector de ELISA. Se calculó la media de los valores de las muestras por triplicado y se determinó la viabilidad calculando el porcentaje de viabilidad en comparación con los pocillos control sin toxina añadida. Para corregir la actividad de fondo, se cultivaron las células en presencia de cicloheximida (Sigma) a 10 \mug/ml. Esto se calculó usando la siguiente ecuación: (Absorbancia de las células sin inmunotoxina/Absorbancia de las células cultivadas con cicloheximida)/(Absorbancia de las células cultivadas en presencia de inmunotoxina/Absorbancia de las células cultivadas con cicloheximida).

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Preparación de SS1P (R490A)

Se construyó un mutante en 490 (R490A) mediante una mutagénesis dirigida a un sitio específico basada en la PCR. Entonces se clonó el ADN amplificado usando este procedimiento en el vector de clonación T/A de Invitrogen pCR II sin mayor purificación, se transformó en DH5\alpha de E. coli y se identificó usando procedimientos de rastreo con azul-blanco. Se retiró el inserto mutado de pCR II digiriendo el plásmido con endonucleasa Sal l y EcoRI, y se ligó el fragmento a un plásmido SSV_{H}-PE38 digerido de idéntica manera.

Las inmunotoxinas usadas en los estudios de la presente invención son dsFv en los que las dos cadenas se expresan por separado en E. coli y se permite la unión antes de la purificación de los cuerpos de inclusión (en estos estudios, la cadena pesada se expresó como una proteína de fusión con el resto de toxina). Se expresaron las inmunotoxinas en BL21 de E. coli (\lambdaDE3) y se acumularon en cuerpos de inclusión que expresaban bien SSV_{H}-PE38 (R490A) o SS1 (V_{L}), según lo descrito anteriormente para otras inmunotoxinas (Reiter, Y., et al., Biochemistry, 33(18):5451-9 (1994)).

Análisis de la citotoxicidad. Se evaluaron las citotoxicidades específicas de SS1P (R490A) y SS1P en dos líneas celulares cancerosas positivas en mesotelina A431/K5, una línea celular de carcinoma epidermoide transfectada con ADNc de mesotelina de longitud completa y A1847 usando un análisis de la inhibición de la síntesis proteica. Se emplacaron las células (1,5 x 10^{4}) en 200 \mul de medio de cultivo en placas de 96 pocillos. Tras 24 h, se diluyeron las inmunotoxinas en serie en PBS/ASB al 0,2% y se añadieron 20 \mul a las células. Se incubaron las placas durante 20 h a 37ºC y luego se sometieron a pulsos con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]-Leucina en 20 \mul de PBS/ASB al 0,2% durante 2 h a 37ºC. Se calculó la media de los valores de las muestras por triplicado y se determinó la inhibición de la síntesis proteica calculando el porcentaje de incorporación en comparación con los pocillos control sin toxina añadida. Las concentraciones de inmunotoxina que redujeron la incorporación de [^{3}H]-Leucina en un 50% en relación con el cultivo control sin tratar fueron definidas como la CI_{50}.

Análisis de la viabilidad celular. Se emplacaron células A431/K5 o A1847 a 8.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras 24 h, se diluyeron las inmunotoxinas en serie en los medios de cultivo y se añadieron 10 \mul a las células. Se incubaron las placas durante 40 h a 37ºC. Se añadieron 10 \mul de solución de WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) a 100 \mul de medio por pocillo, y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Se determinó la densidad óptica a 450 y 650 nm usando un lector de ELISA. Se calculó la media de los valores de las muestras por triplicado y se determinó la viabilidad calculando el porcentaje de viabilidad en comparación con los pocillos control sin toxina añadida.

Análisis de la toxicidad inespecífica. El día 0, se administró una sola inyección a ratones suizos hembra (5\sim6 semanas, 18\sim22 g de peso) en la vena de la cola de diversas cantidades de inmunotoxina en 0,2 ml de PBS que contenía ASH al 0,2%. Se observó la mortalidad de los animales durante 2 semanas.

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Farmacocinéticas

Ratones suizos NIH recibieron una inyección en la vena de la cola con 10 \mug de BL22 o de HA22 o de HA22 (R490A). Las muestras sanguíneas fueron extraídas de la vena de la cola en diferentes puntos temporales. La concentración de IT en circulación se determinó mediante un procedimiento de ELISA. Se usó inmunotoxina purificada para construir una curva estándar.

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Análisis ELISA

Se midieron los niveles de inmunotoxina en suero usando el siguiente ELISA.

Se revistieron placas de microvaloración con 50 \mul de proteína CD22-Fc (5 \mug/ml) en PBS a 4ºC durante una noche. Se bloquearon las placas con tampón de PBS que contenía ASB al 3% a temperatura ambiente durante 2 h, tras lo que se lavaron cinco veces en PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,05%). Se diluyeron 1/100, 1/500 y 1/1000 los patrones y las muestras en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero de ratón normal al 1%. Se añadieron 100 \mul de patrones o muestras diluidos y se incubaron en las placas de ELISA revestidas a 4ºC durante una noche. Se lavaron las placas cinco veces en PBST, siguiendo con la incubación con 50 \mul de dilución 1:250 de anticuerpo anti-PE conjugado con HRP durante 3 h a temperatura ambiente. Tras lavar cinco veces en PBST, se desarrollo el color con TMB durante 10 min y se leyó la densidad óptica (DO) a 450 y a 650 nm. Los análisis realizados durante la fase de desarrollo se realizaron por triplicado.

Actividad antitumoral

Se determinó la actividad antitumoral de las IT en ratones SCID que portaban células CA46. Se inyectaron células (1 x 10^{7}) s.c. en ratones SCID (4\sim5 semanas, peso corporal 16\sim18 g) el día 0. Se desarrollaron tumores con un tamaño de \sim100 mm^{3} en los animales el día 6 de la implantación tumoral. Comenzando el día 6, se trataron los animales con inyecciones i.v. de cada una de las IT diluidas en 0,2 ml de PBS/ASH al 0,2%. La terapia se administró una vez cada dos días (QOD x 3; los días 6, 8 y 10), y cada grupo de tratamiento constaba de ocho o diez animales. Se midieron los tumores con un capilar cada 2 ó 3 días, y se calculó el volumen del tumor usando la fórmula: volumen tumoral
(cm^{3}) = longitud x (anchura)^{2} x 0,4.

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Estadísticas

Se realizó un análisis estadístico entre dos grupos de datos, el test t de Studient de dos colas. Se consideraron como relevantes los valores P < 0,5.

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Ejemplo 3

Este ejemplo presenta los resultados de los experimentos realizados con PE con la mutación R490A.

HA22 es una inmunotoxina recombinante que tiene una alta afinidad por CD22 y es muy activa matando células de tumores malignos de células B que expresan a CD22. El objetivo del presente estudio fue crear un mutante de HA22 resistente a la digestión proteolítica y se esperaba que, por tanto, tuviera una mayor actividad antitumoral, bien debido a la menor degradación proteolítica intracelular inespecífica o a la menor degradación en la circulación. Los estudios anteriores habían mostrado que la destrucción de un sitio de digestión proteolítica producida por la eliminación de la arginina 490 del dominio 3 de la PE nativa había dado como resultado un aumento de la semivida de la PE en la circulación de los ratones. Para minimizar cualquier cambio en la estructura proteica que pudiera introducir una mutación en la posición 490, se mutó R490 a alanina en lugar de eliminarla como se había hecho anteriormente con la PE nativa (Brinkmann, U., et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 89 (7): 3065-9 (1992)).

Preparación y Caracterización de inmunotoxinas. Se construyeron y se purificaron las inmunotoxinas HA22 y HA22 (R490A), y otras inmunotoxinas, según lo descrito en los ejemplos anteriores. A efectos de los presente estudios, todas las inmunotoxinas creadas eran inmunotoxinas ligadas por enlaces de tipo disulfuro en las que la V_{L} estaba unida a VH-PE38 por un enlace tipo disulfuro. Para formar estas proteínas, se expresa cada uno de los dos componentes por separado en E. coli y se recombinan antes de la renaturalización. Entonces se purifica la inmunotoxina ligada con disulfuro renaturalizada mediante intercambio iónico (Q-Sefarosa, Mono-Q) y una cromatografía en columna de filtración sobre gel (Superosa-12). La producción final de la proteína HA22 (R490A) purificada es del 6% de la proteína inicial de los cuerpos de inclusión y la de HA22 es del 8%. La figura 4A muestra el perfil de elución de HA22 (R490A) de una columna de filtración sobre gel de Suberosa-12. El cromatograma muestra la presencia de un máximo eluyente en las fracciones 11 a 15 que es la posición esperada de una proteína con un peso molecular de 63 kDa. No se detectaron agregados de alto peso molecular. La figura 4B muestra el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la fracción máxima (fracción 12). HA22 (R490A) migra como una sola banda con el peso molecular esperado de 63 kDa en un gel no reductor. En condiciones reductoras, la banda se resuelve en dos bandas que corresponden a V_{L} y V_{H}-PE38. Esto indica que la inmunotoxina de dsFv está plegada adecuadamente en un monómero. El resto de las inmunotoxinas se prepararon de una manera similar según lo descrito anteriormente (Kreitman, R. J., et al., Int J. Cancer, 81(1):148-55 (1999)) y su pureza fue comparable a HA22
(R490A).

Citotoxicidad de HA22 (R490A). Se evaluaron las actividades citotóxicas de HA22, HA22 (R490A) y BL22 en varias líneas celulares de linfoma de células B positivas en CD22 (Daudi, CA46 y Raji) y en una línea celular de cáncer epitelial negativa en CD22 (A431) usando un análisis de inhibición de la síntesis proteica. Se compararon estos valores con la actividad de BL22, la inmunotoxina de la que se derivó HA22 (Tabla 7). Como se muestra en la figura 5 y se resume en la tabla 7, HA22 (R490A) es \sim2 veces más activa en células Daudi y CA46 que con HA22, y es 3 veces más activa en células Raji. BL22 es mucho menos activa que cualquier inmunotoxina en estas líneas celulares. También se analizaron las inmunotoxinas en la línea celular A431 negativa en CD22, y se descubrió que eran aproximadamente 1.000 veces menos tóxicas, lo que demostró que estas inmunotoxinas son bastante específicas de las células que expresan a CD22.

Análisis de la viabilidad celular. También se analizaron las actividades de las inmunotoxinas en células CA46 usando un análisis de la viabilidad celular con WST-8 como un sustrato específico (Bai, et al., Free Radic. Biol. Med 30: 555-562 (2001). Los resultados se expresan como el porcentaje de células control sin tratar (Fig. 5C). Las concentraciones de HA22 (R490A), HA22 o BL22 necesarias para provocar una inhibición del 50% (CI_{50}) de la viabilidad celular son 0,18 ng/ml; 0,32 ng/ml y 1,3 ng/ml, respectivamente. La magnitud de las diferencias en las actividades entre estas tres inmunotoxinas muestra la misma relación de dosis-respuesta que para la inhibición de los análisis de síntesis proteica descritos anteriormente.

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Para seguir evaluando la especificidad, se examinó si HA22 (R490A) podía dar como resultado la inducción de la muerte de células endoteliales. Se eligieron las células endoteliales, porque las células endoteliales no expresan a CD22, pero pueden tener un papel en los efectos secundarios tóxicos de algunas inmunotoxinas (Vitetta, E. S., Cancer J, Suplemento 6, 3: S218-24 (2000)). Se trató la línea de células endoteliales HUVEC (células endoteliales de cordón umbilical humano, comercialmente disponibles en, por ejemplo, Cambrex BioScience Baltimore Inc., Baltimore, MD) bien con HA22 (R490A), HA22, BL22, HB21 (Fv)-PE40 o LMB-7. HB21 (Fv)-PE40 se dirige al receptor de la transferrina, que es ampliamente expresado en muchos tipos de células, y se esperaba que fuera citotóxico para las células HUVEC. LMB7 se dirige al antígeno Le^{Y} de quien se ha demostrado previamente que se expresa en células HUVEC (Mansfield, E., et al., Bioconjug Chem, 7(5):557-63 (1996)). Como se muestra en la figura 6, ni HA22 (R490A) ni HA22 ni BL22 disminuyeron la viabilidad de las células HUVEC. Sin embargo, según lo esperado, tanto HB21(Fv)-PE40 como LMB7 fueron citotóxicos para las células. Estos resultados confirman además la especificidad de HA22 (R490A).

Estudios en ratones. Debido a que HA22 (R490A) era más citotóxica para las líneas celulares positivas en CD22 que HA22, se comparó su actividad antitumoral con la de HA22. Antes de hacerlo, se determinó su DL_{50} para los ratones con el fin de garantizar que la nueva inmunotoxina no tuviera una toxicidad alta para los ratones. Se administró a los grupos de ratones que constaban de 5 o más miembros una sola inyección i.v. de diversas dosis de HA22 (R490A), HA22 o BL22, y se observaron durante 2 semanas. La tabla 8 muestra los datos de toxicidad. HA22 y HA22 (R490A) tienen toxicidades muy similares para los animales con DL_{50} de aproximadamente 1,3 mg/kg. BL22 fue ligeramente más tóxica con todos los ratones, que murieron a una dosis de 1,25 mg/kg. Casi todas las muertes tuvieron lugar a las 72 h del tratamiento. Estos datos muestran que la mutación R490A tiene muy poco efecto en la toxicidad hacia los ratones.

Farmacocinéticas. Otro parámetro importante de la actividad antitumoral es el tiempo durante el que la inmunotoxina permanece en la circulación y es capaz de interactuar con las células tumorales. Para determinar el t_{1/2} de HA22 (R490A) y de otras inmunotoxinas en la circulación de los ratones, se inyectó a los ratones i.v. una sola dosis de 10 \mug de BL22, HA22 o HA22 (R490A). Las muestras sanguíneas fueron extraídas de la vena de la cola en diferentes puntos temporales tras la inyección de cada agente y se midieron los niveles de cada una de las inmunotoxinas en el plasma mediante un ELISA. La figura 7 muestra los perfiles de concentración en plasma de HA22 y HA22 (R490A) durante un período de 90 min. Cada punto temporal es la media de las muestras de cuatro animales. La semivida en plasma de HA22 es de 21,9 min, en comparación con una semivida de 18,8 min para HA22 (R490A) (Tabla 9). La semivida de BL22 es mayor, de 27,7 min. Por tanto, la mutación R490A reduce la semivida en una pequeña
cantidad.

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TABLA 7 Actividad citotóxica (CI_{50}) en ng/ml de BL22 e IT mutantes hacia diversas líneas celulares

8

Los datos de citotoxicidad se proporcionan como las CI_{50}, que son las concentraciones de inmunotoxina que provocan una inhibición del 50% en la síntesis proteica en comparación con los controles tras la incubación con células durante 24 horas.

TABLA 8 Toxicidad inespecífica en ratones de HA22 y HA22 (R490A)

9

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El día 0, se administró una sola inyección a ratones suizos hembra (5\sim6 semanas, 18\sim22 g de peso) en la vena de la cola con diversas cantidades de inmunotoxinas en 0,2 ml de PBS que contenía ASH al 0,2%. Se observó la mortalidad de los animales durante 2 semanas.

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TABLA 9 Farmacocinéticas de las inmunotoxinas en ratones

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Ejemplo 4

Este ejemplo presenta los resultados de los experimentos que investigan el efecto de las PE con mutación R490A en animales que portan xenoinjertos de tumores humanos.

Actividad antitumoral. Para determinar si la actividad citotóxica in vitro mejorada se tradujo en una mayor actividad antitumoral, se compararon HA22 (R490A) y HA22 usando xenoinjertos tumorales de células CA46 que se desarrollaban en ratones SCID. Se implantaron células CA46 (1 x 10^{7}) en matraces de ratones SCID el día 0. El día 6, cuando los tumores habían alcanzado un tamaño de \sim100 mm^{3}, se inyectó i.v. a los animales bien 300 \mug/kg (n = 10) o 150 \mug/kg (n = 8) de HA22 o de HA22 (R490A) en días alternos x 3. Como se muestra en la figura 8, el tratamiento con HA22 (R490A) o HA22 disminuyó el tamaño de los tumores en comparación con los controles. Para el día 10, los tumores de los ratones que habían recibido 300 \mug/kg de HA22 (R490A) disminuyeron hasta un tamaño de 85 mm^{3}, mientras que los ratones tratados con 300 \mug/kg de HA22 eran de un tamaño de 126 mm^{3}. El tratamiento con 150 \mug/kg de HA22 (R490A) dio como resultado tumores de una media de 358 mm^{3} para el día 18, mientras que los tumores tratados con HA22 eran significativamente mayores, de una media de 592 mm^{3} (Fig. 8A). La actividad antitumoral también dependió de la dosis; los 150 \mug/kg fueron menos eficaces que los 300 \mug/kg de ambas inmunotoxinas. Sin tratamiento, los tumores de CA46 crecieron rápidamente y alcanzaron un tamaño de más de 2.000 mm^{3} para el día 22, cuando los ratones fueron sacrificados. Se encontró una diferencia relevante en el tamaño de los tumores (P < 0,001, test t de Student) entre los ratones que recibieron HA22 y los ratones que recibieron HA22 (R490A) a 150 \mug/kg en el día 10 del tratamiento (p = 0,0006) y en el día 16 (p = 0,0003); y con el tratamiento de 300 \mug/kg el día 14 (p = 0,00068) y el día 18 (p = 0,00096).

La tabla 10 muestra la toxicidad en los animales de cada uno de estos niveles de dosificación. No hubo muertes, pero algunos perdieron peso. A 300 \mug/kg, 2 de los 10 ratones tratados con HA22 (R490A) y 3/10 ratones tratados con HA22 experimentaron una pérdida leve de peso (menor del 5%) durante los 4 días posteriores a la primera inyección. Los ratones volvieron a ganar peso a los 2 a 4 días de la última inyección, habiendo recuperado su peso corporal inicial para el día 14. No se observó una diferencia relevante en los pesos corporales entre el grupo tratado con HA22 (R490A) y el grupo tratado con HA22. Por el contrario, a la dosis de 150 \mug/kg, las curvas de peso de los grupos tratados con inmunotoxina coincidieron muy estrechamente con la del grupo control (sin tratar). De este modo, los efectos antitumorales no se debieron a la mala salud de los animales. Los datos muestran que HA22 (R490A) tiene una actividad antitumoral más potente que HA22.

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TABLA 10 Toxicidad de HA22 y HA22 (R490A) administradas a ratones SCID

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Ejemplo 5

Este ejemplo presenta los resultados de los experimentos realizados con una segunda inmunotoxina en la que la PE contiene la mutación R490A.

Inmunotoxina SS1P. La mesotelina es un antígeno expresado a un nivel elevado en los cánceres de páncreas y de ovario, y en los mesoteliomas. SS1P es una inmunotoxina basada en PE que se une a la mesotelina y mata las células que expresan la mesotelina. Para determinar si la mutación R490A también aumentaría la actividad citotóxica de una inmunotoxina diana en un cáncer epitelial, se introdujo la mutación R490A en SS1P para producir SS1P (R490A). Ambas inmunotoxinas se prepararon y se analizaron en dos líneas celulares que expresaban la mesotelina. Los datos de la Tabla 11 muestran que SS1P (490A) resultó ser significativamente más activa que SS1P en las dos líneas celulares que expresaban la mesotelina, con un aumento de aproximadamente el doble en la actividad.

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SEC ID N.º 1

\hskip0,3cm13

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SEC ID N.º 2

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\hskip0,3cm14

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SEC ID N.º 3

\hskip0,3cm15

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SEC ID N.º 4

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SEC ID N.º 5

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SEC ID N.º 6

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SEC ID N.º 7

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SEC ID N.º 8

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SEC ID N.º 9

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SEC ID N.º 10

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SEC ID N.º 11

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SEC ID N.º 12

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SEC ID N.º 13

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SEC ID N.º 14

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SEC ID N.º 15

\hskip0,4cm27

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SEC ID N.º 16

\hskip0,4cm28

SEC ID N.º 17

\hskip0,4cm29

SEC ID N.º 18

\hskip0,8cm30

SEC ID N.º 19

\hskip0,3cm31

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SEC ID N.º 20

\hskip0,4cm32

SEC ID N.º 21

\hskip0,4cm33

SEC ID N.º 22

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\hskip0,3cm34

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SEC ID N.º 23

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\hskip0,3cm35

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SEC ID N.º 24

\hskip0,3cm36

\hskip0,3cm37

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SEC ID N.º 25

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\hskip0,3cm38

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SEC ID N.º 26

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\hskip0,3cm39

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SEC ID N.º 27

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\hskip0,3cm40

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SEC ID N.º 28

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\hskip0,3cm41

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SEC ID N.º 29

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\hskip0,3cm42

Claims (35)

1. Un anticuerpo que se une específicamente a CD22, anticuerpo que comprende:

una cadena ligera variable (V_{L}) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 2 y una cadena pesada variable (V_{H}) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 4, con la condición de que:

(i)

la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_{L} se seleccionan entre HG, GR, RG y AR; y

(ii)

la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_{H} se seleccionan entre SSY, THW, YNW, TTW y STY.

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2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_{L} es HG.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_{L} es GR.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_{L} es RG.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_{L} es AR.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_{H} es THW.

8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_{H} es YNW.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_{H} es TTW.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_{H} es STY.

11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y dicha cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21.

13. El anticuerpo de cualquier reivindicación anterior, anticuerpo que se selecciona del grupo constituido por un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')_{2}.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_{L} tiene la secuencia de SEC ID N.º 20, excepto que dicha cadena V_{L} tiene una cisteína en lugar de glicina en la posición 100, y dicha cadena V_{H} tiene la secuencia de SEC ID N.º 21, excepto que la cadena V_{H} tiene una cisteína en lugar de arginina en la posición 44, siendo además dicho anticuerpo un dsFv.

15. Un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino de la reivindicación 1.

16. Una molécula quimérica que comprende un resto terapéutico o un marcador detectable conjugado o fusionado con un anticuerpo de cualquier reivindicación anterior.

17. La molécula quimérica de la reivindicación 16, en la que el resto terapéutico se selecciona del grupo constituido por una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o con una citotoxina.

18. La molécula quimérica de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en la que el resto terapéutico es una citotoxina que está conjugada con un anticuerpo y en la que la molécula quimérica es una inmunotoxina.

19. La molécula quimérica de la reivindicación 18, en la que el resto terapéutico es una citotoxina seleccionada del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, una toxina de difteria mutada, una exotoxina A de Pseudomonas mutada ("PE") y toxina botulínicas A a F.

20. La molécula quimérica de la reivindicación 19, en la que dicha PE se selecciona del grupo constituido por PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE28QQR.

21. La molécula quimérica de la reivindicación 19, en la que dicha PE mutada tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en una posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24.

22. La molécula quimérica de la reivindicación 21, en la que dicho residuo de arginina de una posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24 está reemplazado por alanina.

23. Una composición que comprende (a) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (b) una molécula quimérica que comprende un anticuerpo conjugado o fusionado con un resto terapéutico o un marcador detectable, anticuerpo que es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

24. La composición de la reivindicación 23, en la que el resto terapéutico se selecciona del grupo constituido por una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o con una citotoxina, y es opcionalmente una citotoxina seleccionada del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, una toxina de difteria mutada, una exotoxina A de Pseudomonas mutada ("PE") y toxinas botulínicas A a F.

25. La composición de la reivindicación 24, en la que dicha PE mutada tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en una posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24 y, opcionalmente, dicho residuo de arginina de la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24 está reemplazado por alanina.

26. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

27. Un vector de expresión que comprende un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

28. El vector de expresión de la reivindicación 27, en el que además dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que es un resto terapéutico o un marcador detectable, en el que dicho resto terapéutico es un fármaco o una citotoxina, y en el que además dicha citotoxina es exotoxina A de Pseudomonas, o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE").

29. Un equipo para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, equipo que comprende:

(a)

un recipiente y

(b)

un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

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30. El equipo de la reivindicación 29, en el que además dicho anticuerpo está fusionado o conjugado con un marcador detectable.

31. Uso de una molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para la fabricación de un medicamento destinado a tratar un cáncer que se caracteriza porque las células malignas expresan a CD22.

32. Uso de la reivindicación 31, en el que el cáncer se selecciona entre leucemia linfocítica crónica y leucemia de células vellosas.

33. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso como una composición farmacéutica.

34. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso en el tratamiento de un cáncer que se caracteriza porque las células malignas expresan a CD22.

35. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre leucemia linfocítica crónica y leucemia de células vellosas.