ES2255194T3

ES2255194T3 - Anticuerpos, que incluyen moleculas fv, e inmunoconjugados que presentan una afinidad de enlace elevada para la mesotelina y metodos para su utilizacion.

Info

Publication number: ES2255194T3
Application number: ES98961806T
Authority: ES
Inventors: Ira H. Pastan; Partha S. Chowdhury
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: IL135775A; DE69833459D1; AU760120B2; CA2318576A1; DE69833459T2; EP1025230A2; IL135775A0; WO1999028471A2; CA2318576C; AU1704199A; WO1999028471A3; ATE317437T1; EP1025230B1

Abstract

Anticuerpo que comprende una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL), cuyas cadenas VH y VL presentan regiones determinantes de complementariedad (CDRs) según se indica en la Figura 1 (SEC ID nº: 5).

Description

Anticuerpos, que incluyen moléculas Fv, e inmunoconjugados que presentan una afinidad de enlace elevada para la mesotelina y métodos para su utilización.

Antecedentes de la invención

En muchos tipos de células cancerígenas, se expresa la diferenciación de antígenos. Estos antígenos se han utilizado como objetivos en la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, se han utilizado con éxito CD19, CD20, CD22 y CD25 como objetivos en malignidades hematopoyéticas (Press, et al, New Eng. J. Med. 329:1219-1224 (1993); y Osterborg, et al., J. Clin. Oncol. 15:1567-1574 (1997)). Sin embargo esta terapia de cáncer objetivo no ha tenido éxito con los tumores sólidos, en gran parte debido a que los antígenos objetivo se expresan asimismo en tejidos a partir de los que aparecen tumores. De este modo, tales terapias objetivo matan células sanas además de células malignas.

En los Estados Unidos, a pesar de la terapia, se estima que 15.000 mujeres mueren de cáncer de ovario cada año. Aunque menos común que el cáncer de ovario, se conoce que los mesoteliomas son resistentes a todos los agentes quimioterapéuticos y por lo tanto poseen una tasa de mortalidad elevada. A causa de la morbilidad de estos cánceres, se necesitan nuevos enfoques terapéuticos para estas malignidades.

Común al cáncer de ovario, los cánceres de células escamosas y algunos cánceres de estómago además de los mesoteliomas es la expresión de la mesotelina en la superficie de la célula (Chang, et al., Cancer Res. 52:181-186 (1992); Chang, et al., J. Surgical Pathology 16:259-268 (1992) y Chang, et al., Nat'l Acad. Sci. USA 93:136-140 (1996)). La mesotelina es un antígeno de glicoproteína unido a GPI de 40 kD presente en la superficie de las células mesoteliales. Se sintetiza como un precursor de 69 kD que se procesa a continuación proteolíticamente. Se secreta el terminal amino de 30 kD que se ha denominado factor de potenciación megacariocito (Yamaguchi, et al., J. Biol. Chem. 269:805-808 (1994)). El terminal carboxilo de 40 kD permanece unido a la membrana como mesotelina madura (Chang, et al., Nat'l Acad. Sci. USA 93:136-140 (1996)). A diferencia de muchos antígenos de superficie celular presentes en las células cancerígenas, la forma unida a la membrana de la mesotelina no se puede detectar en la sangre de pacientes con cáncer y no se suprime por células de cultivo en un medio (Chang, et al., Cancer Res. 52:181-186(1992)). Además de las células malignas, la mesotelina se encuentra asimismo en la superficie celular de células de origen mesotelial, incluyendo cánceres de ovario. Debido a que los daños en las células de estos tejidos no llevarían a consecuencias que amenazasen la vida, la presencia de mesotelina en la superficie de células cancerígenas la hace una candidata prometedora para terapias objetivo.

Las inmunotoxinas son anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la superficie celular unidos a una mitad tóxica. En el tratamiento del cáncer, el anticuerpo se dirige preferentemente contra un antígeno de la superficie celular expresado sólo en células cancerosas. Sin embargo, si la muerte de células normales que expresan asimismo el antígeno de superficie no amenaza la vida más que la existencia de la malignidad, se pueden asimismo utilizar en la terapia de cáncer los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de superficie celular expresados sobre células no malignas. La mitad tóxica de la inmunotoxina puede ser cualquier toxina que no sea perjudicial para las células no objetivo a bajas concentraciones después de la administración sistémica. Tal toxina es la exotoxina Pseudomonas aeruginosa (PE). Estudios anteriores con la PE han demostrado que la porción activa de la proteína se compone del dominio II y III, ambos localizados en el terminal carboxilo de la toxina.

Los anticuerpos que tienen como objetivo la inmunotoxina pueden ser policlonales, monoclonales o anticuerpos recombinantes, tales como híbridos o fragmentos de regiones variables. Si el anticuerpo es no recombinante, la inmunotoxina se debe formar mediante conjugación química del anticuerpo con la mitad tóxica. Si el anticuerpo se produce de forma recombinante, el anticuerpo se puede unir a la toxina mediante enlace químico o mediante fusión recombinante. En la fusión recombinante, el ADNc que codifica el anticuerpo se inserta, en un cuadro, en un plásmido que ya contiene ANDc que codifica la toxina. Por supuesto, podría realizarse al revés también; el ADNc de la toxina se puede insertar en un plásmido que lleva ADNc que codifica el anticuerpo.

A causa del gran tamaño potencial de la inmunotoxina, a veces se desea unir sólo un fragmento de un anticuerpo a la mitad tóxica. Los fragmentos Fab, Fab' y F(ab)_{2} se pueden preparar a partir de anticuerpos policlonales, monoclonales e híbridos y a continuación unirlos a la toxina mediante enlace químico.

De forma alternativa, se puede producir un ADNc en el que las regiones variables de un anticuerpo se conecten a regiones de estructura esenciales. A continuación estos anticuerpos más pequeños se secretan como anticuerpos Fv de cadena doble o, si las regiones pesadas y ligeras se unen directamente o mediante un conector peptídico, como anticuerpos Fv de cadena simple (scFv).

Un método de creación de un scFv es a través de una biblioteca de expresiones en fago compuesta de ARNm esplénico de ratones inmunizados con un inmunógeno (Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997)). Sin embargo, si un inmunógeno de proteína se encuentra de forma natural en mamíferos pero se expresa de forma recombinante en procariotas, la proteína no poseerá el patrón de glucosilación correcto y puede no poseer la conformación correcta. Los anticuerpos desarrollados por el ratón en respuesta a este inmunógeno pueden no reconocer la proteína en su estado nativo. Una solución a este problema es inmunizar los animales con la proteína nativa preparada en células de mamífero, pero puede no ser posible la purificación a partir de las células de mamífero de cantidades suficientes de algunas proteínas, en particular proteínas de superficie celular. Otra solución, aunque no como común, es inmunizar los animales con ADNc que codifica el inmunógeno. El ADNc, bajo el control de un promotor adecuado, se introduce en el animal. Después de inyecciones de refuerzo y cuando la concentración del anticuerpo alcanza un máximo, los animales se sacrifican y se eliminan los bazos para crear la biblioteca de expresión en fago.

Chang et al (Cancer Research 52:181-186, 1992) describe las características de unión de un anticuerpo monoclonal, denominado K1, que reacciona con un antígeno de superficie celular (CAK1) encontrado en la mesotelina humana y en tumores no ováricos. Se describe asimismo una inmunotoxina compuesta de K1 y de exotoxina nativa Pseudomonas.

El documento WO92/07081 describe asimismo las características de unión del anticuerpo K1 lo que sugiere la utilización de este anticuerpo en el tratamiento y diagnóstico del cáncer.

Brinkmann et al (Int. J. Cancer, 638-644, 1997) describe la clonación de los ADNc que codifican las regiones variables de K1 y la construcción de plásmidos para la expresión de K1 recombinante (FAb).

Existe una necesidad de mejores agentes quimioterapéuticos para controlar los cánceres tales como el cáncer de ovario y los mesoteliomas, los cuales raramente se curan mediante las quimioterapias disponibles actualmente. La descripción siguiente describe dicho agente quimioterapéutico.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo antimesotelina que comprende una cadena pesada variable (V_{H}) y una cadena ligera variable (V_{L}), cuyas cadenas V_{H} y V_{L} poseen regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) según se indica en la Figura 1 (SEC ID nº: 5). Los anticuerpos descritos en la presente memoria poseen una constante de disociación inferior a 3 x 10^{-8} M y se unen específicamente a la mesotelina sobre la superficie de las células. En una forma de realización, los anticuerpos antimesotelina son un anticuerpo de cadena única que comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable. Las CDRs de los anticuerpos son como se indican en la Figura 1. En otras formas de realización, el anticuerpo se une a una molécula efectora, por ejemplo, un marcador detectable o un agente terapéutico. En una forma de realización, el agente terapéutico es una toxina, preferentemente la exotoxina Pseudomonas A o fragmentos citotóxicos de la misma.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir inmunizando un animal con el ADNc que codifica la mesotelina, preparando una biblioteca de expresión en fago a partir de ARNm aislado del bazo del animal inmunizado, seleccionando el fago que se une específicamente a la mesotelina con una constante de disociación inferior a 3 x 10^{-8} M y que se une a la mesotelina expresada sobre la superficie de las células, aislando el ácido nucleico del fago unido, introduciendo el ácido nucleico en una célula que expresa el anticuerpo mesotelina derivado del fago y aislando el anticuerpo de la célula. Se contempla además que las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo antimesotelina se fusionan en el cuadro en las secuencias de ácido nucleico que codifican la mitad tóxica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un inmunoconjugado de un anticuerpo antimesotelina con una constante de disociación inferior a 3 x 10^{-8} M y que se une específicamente a la mesotelina sobre la superficie de las células y a un agente terapéutico o a un marcador detectable. En una forma de realización, el anticuerpo antimesotelina es un anticuerpo de cadena única que comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable. Las CDRs de los anticuerpos de la presente invención son como se indican en la Figura 1. En otra forma de realización todavía, la región de cadena pesada variable y la región de cadena ligera variable se unen a través de un péptido conector. En otras formas de realización, el agente terapéutico es una toxina, preferentemente la exotoxina Pseudomonas A o fragmentos citotóxicos de la misma. Se prefiere particularmente la PE38. Todavía en otras formas de realización, la región de cadena pesada variable del anticuerpo es un péptido unido al terminal carboxilo del agente terapéutico o del marcador detectable.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a casetes de expresión que codifican un inmunoconjugado de antimesotelina recombinante o un anticuerpo antimesotelina recombinante. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo Fv de cadena única que comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable. Las CDRs del anticuerpo son como se indican en la Figura 1. En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende un marcador detectable. En otras formas de realización, el anticuerpo antimesotelina se une al agente terapéutico, preferentemente una toxina y más preferentemente una exotoxina Pseudomonas A o fragmentos citotóxicos de la misma, y más preferentemente la PE38.

Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a células huésped que comprenden casetes de expresión que codifican inmunoconjugados recombinantes o anticuerpos antimesotelina. En algunas formas de realización, las células huésped comprenden un anticuerpo Fv de cadena única antimesotelina que comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable. Las CDRs del anticuerpo son como se indican en la Figura 1. En formas de realización adicionales, la región de cadena pesada variable y la región de cadena ligera variable se unen mediante un péptido conector. El inmunoconjugado comprende un marcador detectable o un agente terapéutico unido al fragmento de antimesotelina scFv. En las formas de realización preferidas, el agente terapéutico es una toxina, más preferentemente la exotoxina Pseudomonas A o fragmentos citotóxicos de la misma, y más preferentemente la PE38.

Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un anticuerpo antimesotelina de la presente invención, para la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula maligna que expresa la mesotelina sobre su superficie celular. Tal inhibición resulta del contacto de la célula maligna con una cantidad eficaz de un inmunoconjugado recombinante que comprende un péptido tóxico unido a un anticuerpo antimesotelina que posee una constante de disociación inferior a 3 x 10^{-8} M y se une a la mesotelina expresada sobre las superficies celulares. En una forma de realización, el anticuerpo antimesotelina es un anticuerpo scFv con una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable. Las CDRs del anticuerpo son como se indican en la Figura 1. Todavía en otras formas de realización, la región de cadena pesada variable y la región de cadena ligera variable se unen mediante un péptido conector. En algunas formas de realización, el péptido tóxico es la exotoxina Pseudomonas (PE) o un fragmento citotóxico de la misma, preferentemente la PE38. En una forma de realización, la región de cadena pesada variable se une al terminal carboxilo de la toxina. El tratamiento puede resultar donde la célula maligna se ponga en contacto con el inmunoconjugado in vivo. La célula maligna, por ejemplo, puede ser una célula de ovario, escamosa, gástrica o un mesotelioma.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en un método para la detección de la presencia de mesotelina en una muestra biológica. El método comprende las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo antimesotelina que posee una constante de disociación inferior a 3 x 10^{-8} M y unirla a la mesotelina expresada en las superficies celulares, y permitiendo que el anticuerpo se una a la mesotelina bajo condiciones reactivas inmunológicamente, en las que la detección del anticuerpo unido indica la presencia de la mesotelina. El anticuerpo utilizado de la presente invención puede ser un fragmento de scFv que comprende una región pesada variable (VH) y una región ligera variable (VL). Las CDRs del anticuerpo son como se indican en la Figura 1. Se pueden utilizar asimismo los anticuerpos en los que la región V_{H} y la región V_{L} se unan mediante un péptido conector. El anticuerpo utilizado en el método se puede marcar de forma detectable o conjugar con un péptido tóxico. En el caso de este último, se detecta la presencia del inmunoconjugado utilizando anticuerpos al péptido tóxico. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar asimismo para llevar a cabo el método in vivo en un mamífero.

En un aspecto adicional todavía, la presente invención se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoconjugados de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en kits que se pueden utilizar para detectar mesotelina sobre superficies celulares.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La figura 1 contiene la secuencia de aminoácido de SS scFv (SEC ID nº: 5) según se deduce de su secuencia de nucleótido (SEC ID nº: 1). En el scFv, la V_{H} se conecta a la V_{L} mediante un péptido conector, GVGGSG_{4}SG_{4}S (SEC ID nº: 6). Se han marcado las regiones de estructura y las CDRs.

Figura 2. La figura 2 demuestra que el SS scFv de expresión en fago unido específicamente a la mesotelina (a.a. 291-606) recubrió las celdas ELISA de una manera que dependía de la dosis. Los fagos se expusieron a las celdas recubiertas con mesotelina, la subunidad p55 del receptor IL-2, albúmina de suero bovino, estreptavidina o a celdas sin recubrir. Los fagos unidos se detectaron según se ha descrito en la sección de ejemplos.

Figura 3. La figura 3 muestra que los epítopes que se unen a SS scFv y a K1 son diferentes. Las celdas recubiertas con mesotelina se incubaron con diluciones diferentes de SS scFv o de fago scFv K1 en presencia o ausencia de K1 monoclonal aislado a 1 \mug/ml. Los fagos unidos se detectaron como se ha mencionado en la sección de ejemplos.

Figura 4. La figura 4 indica la estabilidad de SS scFv-PE38 a 37ºC. Se incubó el SS scFv-PE38 (10 \mug/ml) a 37ºC durante 40,5 h y a continuación se midió su actividad citotóxica. El gráfico demuestra el porcentaje de la actividad inicial que queda después de diversos periodos de incubación.

Figura 5. La figura 5 muestra el efecto antitumor de SS scFv-PE38 en un ratón desnudo. Se inyectaron grupos de cinco animales con 1,5 x 10^{4} células A431 K5 en el día 0. Los animales se trataron intravenosamente en los días 5, 7 y 9 con 2,6 \mug (\blacklozenge) ó 4,3 \mug (\Box) de SS scFv-PE38 en Dulbecco's-PBS (DPBS) que contiene 0,2% de albúmina de suero humano (HSA). Los grupos de control tampoco recibieron el vehículo solo (\bigcirc) o 3 \mug de anti-Tac(scFv)-PE38 (\bullet).

Descripción detallada de la invención I. Resumen

La presente invención proporciona anticuerpos antimesotelina e inmunoconjugados, preferentemente inmunotoxina (IT), más preferentemente con la exotoxina Pseudomonas A o con fragmentos citotóxicos de la misma como la mitad tóxica, y más preferentemente con PE38 como la mitad tóxica unida a un anticuerpo antimesotelina, más preferentemente un anticuerpo Fv, y más preferentemente un anticuerpo scFv.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo es scFv. Muchas de las inmunotoxinas recombinantes producidas a partir de construcciones de scFv son un tercio del tamaño de los conjugados IgG-toxina química y son homogéneos en la composición. La eliminación de la porción constante de la molécula IgG de scFv resulta en una depuración más rápida de la inmunotoxina después de la inyección en animales, incluyendo primates y el tamaño más pequeño de los conjugados mejora la penetración del fármaco en tumores sólidos. Juntas, estas propiedades disminuyen los efectos secundarios asociados con la mitad tóxica reduciendo el tiempo en el que la inmunotoxina (IT) interactúa con tejidos no objetivo y tejidos que expresan niveles muy bajos de antígeno.

Los intentos anteriores para inmunizar ratones con mesotelina recombinante resultaron en anticuerpos que se unen específicamente a la mesotelina sobre las superficies celulares, pero con baja afinidad. Cuando los animales se inmunizaron con un plásmido de expresión que comprende ADNc que codifica la mesotelina humana, se obtuvieron anticuerpos que se unieron a la mesotelina de la superficie celular con una sorprendente elevada afinidad. Se encontró que las inyecciones múltiples de ADNc fueron decisivas en la consecución de estas concentraciones inusualmente elevadas. Las dificultades en la obtención de anticuerpos de elevada afinidad dirigidos contra la mesotelina, la actividad sorprendente de los anticuerpos hacia la mesotelina de la superficie celular y las propiedades farmacológicas únicas proporcionadas por las inmunotoxinas de la presente invención las hacen agentes terapéuticos elevadamente eficaces para el tratamiento de cánceres de ovario, de estómago, cánceres de células escamosas, mesoteliomas y otras células malignas que expresan la mesotelina.

II. Definiciones

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistème International de Unites (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números definidos en el intervalo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi. Los apartados proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los aspectos o formas de realización diversos de la presente invención que se pueden presentar como referencia a la especificación como un conjunto. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen de forma más completa como referencia a la especificación en su totalidad.

El término "mesotelina" incluye la referencia a la proteína mesotelina y a los fragmentos de la misma que se pueden presentar en la superficie de las células de mamífero de un mamífero tal como ratas, ratones y primates, particularmente humanos. Las secuencias preferidas de ácido nucleico y aminoácido de mesotelina son como se describen en la solicitud publicada PCT WO 97/25.068, solicitud U.S. nº 08/776.271 y solicitud provisional U.S. nº 60/010.166. Además, ver, Chang, K & Pastan, I, Int. J. Cancer 57:90 (1994); Chang, K & Pastan, I., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:136 (1996); Brinkmann U., et al., Int. J. Cancer 71:638 (1997) y Chowdhury, P.S., et al., Mol. Immunol. 34:9 (1997). La mesotelina se refiere asimismo a las proteínas o péptidos de mesotelina que permanecen como proteínas intracelulares además de proteínas extracelulares secretadas y/o aisladas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo" incluye la referencia a una molécula de inmunoglobulina reactiva inmunológicamente con un antígeno particular, e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El término incluye asimismo formas de ingeniería genética tales como anticuerpos híbridos (por ejemplo, anticuerpos de murino humanizado), anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de Fv de cadena única recombinante (scFv), fragmentos de Fv (dsFv) estabilizados con disulfuro (ver el documento U.S.S.N 08/077.252, o fragmentos de pFv (ver, solicitudes de patentes provisionales U.S. nº 60/042.350 y 60/048.848). El término "anticuerpo" incluye asimismo parátopos de anticuerpos (por ejemplo, Fab', F(ab')_{2}, Fab, Fv y rIgG. Ver asimismo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Un anticuerpo reactivo inmunológicamente con un antígeno particular se puede generar mediante métodos recombinantes tales como la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares. Ver, por ejemplo, Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan, et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996).

Típicamente, una inmunoglobulina posee una cadena pesada y una ligera. Cada cadena pesada y ligera contienen una región constante y una región variable. Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una región "de estructura" interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas asimismo regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Se han definido la extensión de la región de estructura y la de las CDRs (ver, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1987); que se incorpora en la presente memoria como referencia). Las secuencias de las regiones de estructura de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie. La región de estructura de un anticuerpo, que es la combinación de regiones de estructura de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDRs en un espacio de tres dimensiones. Las CDRs son principalmente responsables de la unión a un epítope de un antígeno. Las CDRs se refieren típicamente como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el terminal N.

La frase "Fv de cadena única" o "scFv" se refiere a un anticuerpo en el que la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo de doble cadena tradicional se han unido para formar una cadena. Típicamente, un péptido conector se inserta entre las dos cadenas para permitir un plegamiento y la creación de un sitio de unión activo adecuados.

El término "péptido conector" incluye la referencia a un péptido dentro de un fragmento de unión a un anticuerpo (por ejemplo, fragmento de Fv) que se utiliza para unir indirectamente la cadena pesada variable a la cadena ligera variable.

\newpage

El término "contactar" incluye la referencia a una colocación en asociación física directa. Con respecto a la presente invención, el término se refiere a un enlace anticuerpo-antígeno.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "antimesotelina" en referencia a un anticuerpo, incluye la referencia a un anticuerpo que se genera para la mesotelina. En formas de realización preferidas, la mesotelina es una mesotelina de primate tal como una mesotelina humana. En una forma de realización preferida particularmente, el anticuerpo se genera para la mesotelina humana sintetizada por un mamífero no primate después de la introducción en el animal de ADNc que codifica la mesotelina humana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de forma indiferente e incluyen la referencia a un polímero de residuos de aminoácido. El término se aplica a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido son un análogo químico artificial del aminoácido correspondiente que está presente en la naturaleza, además de los polímeros de aminoácidos que están presentes en la naturaleza. El término se aplica asimismo a los polímeros que contienen sustituciones conservadoras de aminoácidos de forma que la proteína permanece funcional.

El término "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora a una proteína, polipéptido o péptido ("péptido" colectivamente). El aminoácido puede ser uno que esté presente en la naturaleza y, a menos que se limite lo contrario, pueda comprender los análogos conocidos de los aminoácidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los aminoácidos que están presentes en la naturaleza.

Los aminoácidos y análogos referidos en la presente memoria se describen mediante designaciones taquigráficas según se indica en la Tabla 1 a continuación:

TABLA 1 Nomenclatura de aminoácido

Nombre	letra-3	letra-1
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparragina	Asn	N
Ácido aspártico	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Ácido glutámico	Glu	E
Glutamina	Gln	Q
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Homoserina	Hse	-
Isoleucina	Ile	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Sulfóxido de metionina	Met (O)	-
Metilsulfonio
de metionina	Met (S-Me)	-
Norleucina	Nle	-
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	S
Treonina	Thr	T
Triptófano	Trp	W
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Val	V

Una "sustitución conservadora", cuando describe a una proteína se refiere a un cambio en la composición de aminoácido de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de proteína. De este modo, las "variaciones modificadas conservadoramente" de una secuencia de aminoácido particular se refieren a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o sustituciones de aminoácidos con otros aminoácidos que poseen propiedades similares (por ejemplo, ácido, básico, cargado positiva o negativamente, polar o no polar, etc) de forma que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteren la actividad sustancialmente. Son bien conocidas en la técnica las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar. Los seis grupos siguientes en la Tabla 2 contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras para uno y otro:

TABLA 2

	1)	Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
	2)	Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
	3)	Asparragina (N), Glutamina (Q);
	4)	Arginina (R), Lisina (K);
	5)	Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
	6)	Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Ver asimismo, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Company (1984).

El término "similar sustancialmente" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de referencia durante una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la porción de una secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprende adiciones o deleciones (es decir, brechas) comparadas con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las aparecen la base de ácido nucleico o un residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que coinciden, dividiendo el número de posiciones que coinciden por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de la identidad de secuencia.

La frase "enlace disulfuro" o "enlace disulfuro cisteína-cisteína" se refiere a una interacción covalente entre dos cisteínas en las que los átomos de azufre de las cisteínas se oxidan para formar un enlace disulfuro. La energía promedio de enlace de un enlace disulfuro es aproximadamente 60 kcal/mol comparada con 1-2 kcal/mol para un enlace de hidrógeno. En el contexto de la presente invención, las cisteínas que forman el enlace disulfuro están dentro de las regiones de estructura del anticuerpo de cadena única y se utilizan para estabilizar la conformación del anticuerpo.

Los términos "conjugación", "unión", "enlace" o "conector" se refieren a la preparación de dos polipéptidos en una molécula de polipéptido contigua. En el contexto de la presente invención, los términos incluyen la referencia a la unión de una mitad del anticuerpo a una molécula efectora (EM). La unión puede ser por medio químico o recombinante. El medio químico se refiere a una reacción entre la mitad del anticuerpo y la molécula efectora de forma que exista un enlace covalente formado entre las dos moléculas para formar una molécula.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "recombinante" incluye la referencia a una proteína producida utilizando células que no poseen, en su estado nativo, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque se han alterado genéticamente mediante la introducción de la adecuada secuencia de ácido nucleico aislada. El término incluye asimismo la referencia a una célula, o a un ácido nucleico, o a un vector, que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la alteración de un ácido nucleico nativo a una forma no nativa a esa célula, o que la célula se derive de una célula así modificada. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, expresan mutantes de genes que se encuentran dentro de la forma nativa, o expresan genes nativos que se expresan anormalmente de otra forma, expresándose o no expresándose en absoluto.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluyen la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otra manera, comprende los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que hibridizan a ácidos nucleicos de una forma similar a los nucleótidos que aparecen en la naturaleza. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma además de las variantes conservadoras, es decir, ácidos nucleicos presentes en posiciones de titubeo de codones y variantes que, cuando se traducen a proteína, resultan en una sustitución conservadora de un aminoácido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "codificar" con respecto a un ácido nucleico específico, incluye la referencia a los ácidos nucleicos que comprenden la información para la traducción a la proteína específica. La información se especifica mediante la utilización de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácido se codifica por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". Sin embargo, se pueden utilizar las variantes del código universal, tal como están presentes en algunas plantas, animales y mitocondrias micóticas, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Nat'l Acad. Sci USA 82:2306-2309 (1985)), o el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico se expresa en la utilización de la maquinaria de traducción de estos organismos.

\newpage

La expresión "fusionar en el cuadro" se refiere a la unión de dos o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de forma que la secuencia de ácido nucleico unida traduce a una proteína de cadena única que comprende las cadenas de polipéptido originales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "expresado" incluye la referencia a la traducción de un ácido nucleico a una proteína. Las proteínas se pueden expresar y permanecer intracelulares, llegar a ser un componente de la membrana de superficie celular o secretarse en la matriz o medio extracelular.

Por "célula huésped" se quiere significar una célula que puede apoyar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, de insecto, de anfibio o de mamífero.

La frase "biblioteca de expresión en fago" se refiere a una población de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un ADNc foráneo fusionado en el cuadro de forma recombinante a una proteína de superficie. Los fagos expresan la proteína foránea codificada por el ADNc en su superficie. Después de la replicación en un huésped bacteriano, típicamente E. coli, los fagos que contienen el ADNc foráneo de interés se seleccionan mediante la expresión de la proteína foránea sobre la superficie de los fagos.

La "identidad de secuencia" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos incluye la referencia a los nucleótidos (o residuos) en las dos secuencias que son la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a las proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas difieren a menudo de las sustituciones de aminoácido conservadoras, en las que los residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Donde las secuencias difieren en las sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para preparar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Típicamente esto implica puntuar una sustitución conservadora como un mal emparejamiento más parcial que completo, aumentando de este modo el porcentaje de identidad de secuencia. De este modo, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservadora se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservadora se le da a una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, según el algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988), por ejemplo, según está implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA). Una indicación de que las dos secuencias de péptidos son sustancialmente similares es que un péptido sea reactivo inmunológicamente con los anticuerpos producidos para el segundo péptido. De este modo, un péptido es sustancialmente similar a un segundo péptido, por ejemplo, en el que los dos péptidos difieren sólo en una sustitución conservadora.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de aproximadamente 10 a 20 residuos en los que una secuencia se puede comparar a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen de forma óptima. Los métodos de alineación de las secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (incluyendo, pero no limitándose a CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA); el programa CLUSTAL está bien descrito en Higgins & Sharp, Gene 73:237-244 (1988) y Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucl. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992); y Pearson, et al., Meth. in Molec. Biol. 24:307-31 (1994).

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad eficaz a" o "cantidad eficaz terapéuticamente" incluyen la referencia a una dosificación de un agente terapéutico suficiente para producir un resultado deseado, tal como la inhibición de la síntesis de proteína celular de por lo menos 50%, o la muerte de la célula.

El término "agente terapéutico" incluye cualquier número de compuestos conocidos actualmente o desarrollados posteriormente para actuar como agentes antineoplásicos, antiinflamatorios, citocinas, antiinfecciosos, activadores o inhibidores de enzima, modificadores alostéricos, antibióticos u otros agentes administrados para inducir un efecto terapéutico deseado en un paciente.

El término "inmunoconjugado" incluye la referencia a una unión covalente de una molécula efectora a un anticuerpo. La molécula efectora puede ser una inmunotoxina.

El término "toxina" incluye la referencia a abrina, ricina, exotoxina Pseudomonas (PE), toxina de la difteria (DT), toxina de la botulina, o toxinas modificadas de las mismas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos elevadamente tóxicos que provocan típicamente la muerte intoxicando el hígado. PE y DT, sin embargo, se pueden modificar en una forma para su utilización como una inmunotoxina eliminando el componente objetivo nativo de la toxina (por ejemplo, el dominio Ia de PE y la cadena B de DT) y sustituyéndolo con una mitad objetivo diferente, tal como un anticuerpo.

El término "in vivo" incluye la referencia al interior del cuerpo del organismo a partir del que se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significan fuera del cuerpo del organismo a partir del que se obtuvo la célula.

La frase "célula maligna" o "malignidad" se refieren a tumores o a células de tumor que son invasivas y/o capaces de experimentar metástasis, es decir, una célula cancerígena.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las "células de mamífero" incluyen la referencia a células derivadas de los mamíferos que incluyen humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpancés o macacos. Las células se pueden cultivar in vivo o in vitro.

III. Anticuerpos antimesotelina

La presente invención proporciona los anticuerpos dirigidos a la mesotelina. La mesotelina, o CAK1, es una proteína presente en células de origen mesotelial, incluyendo, pero no limitándose a, células cancerígenas de ovario, de estómago, escamosas y mesoteliomas. Los inmunoconjugados descritos a continuación tienen como objetivo la mesotelina utilizando anticuerpos de la presente invención. Estos anticuerpos son reactivos selectivamente bajo condiciones inmunológicas a los determinantes de la mesotelina presentes sobre la superficie de las células de mamíferos y son accesibles al anticuerpo a partir del medio extracelular.

El término "reactivo selectivamente" incluye la referencia a la asociación preferencial de un anticuerpo, por completo o en parte, con una célula o tejido que contenga mesotelina y no con células o tejidos que les falte la mesotelina. Se reconoce, por supuesto, que puede ocurrir un cierto grado de interacción no específica entre una molécula y una célula o tejido no objetivos.

Sin embargo, la reactividad selectiva, se puede distinguir como la mediada por un reconocimiento específico de mesotelina. Aunque los anticuerpos reactivos se unen selectivamente a un antígeno, pueden hacerlo así con afinidad baja. Por otro lado, la unión específica resulta en una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que contienen mesotelina que entre el anticuerpo y las células unidas a las que les falta mesotelina o la unión de afinidad baja anticuerpo-antígeno. La unión específica resulta típicamente superior a 2 veces, preferentemente superior a 5 veces, más preferentemente superior a 10 veces y más preferentemente superior a 100 veces de incremento en la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que contiene mesotelina según se compara con una célula o un tejido carentes de mesotelina. La unión específica a una proteína bajo tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Son apropiados una variedad de formatos de inmunoanálisis para seleccionar anticuerpos inmunorreactivos específicamente con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA en fase sólida se utilizan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos específicamente con una proteína. Ver Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoanálisis que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica.

El término "condiciones reactivas inmunológicamente" incluye la referencia a las condiciones que permiten generar un anticuerpo para un epítope particular para unirse a ese epítope en un grado detectablemente mayor que, y/o a la exclusión sustancial de, unirse a todos los otros epítopes sustancialmente. Las condiciones reactivas inmunológicamente dependen del formato de la reacción de unión del anticuerpo y típicamente son las que se utilizan en protocolos de inmunoanálisis o las condiciones que se encuentran in vivo. Ver Harlow & Lane, supra, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoanálisis. Preferentemente, las condiciones reactivas inmunológicamente utilizadas en los métodos de la presente invención son "condiciones fisiológicas" que incluyen la referencia a las condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas dentro de un mamífero vivo o de una célula de mamífero. Mientras se reconoce que algunos órganos se someten a condiciones extremas, el entorno intraorganismo o intracelular está normalmente aproximadamente a pH 7 (es decir, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a 7,5), contiene agua como el disolvente predominante, y está presente a una temperatura superior a 0ºC e inferior a 50ºC. La osmolaridad está dentro del intervalo que sirve de apoyo a la viabilidad y proliferación
celular.

Los anticuerpos antimesotelina utilizados en la presente invención se pueden unir a moléculas efectoras (EM) mediante el carboxilo terminal de la EM, el amino terminal de la EM, mediante un residuo de aminoácido interior de la EM tal como la cisteína, o cualquier combinación de los mismos. De forma similar, la EM se puede unir directamente a las regiones pesada, ligera, Fc (región constante) o a las regiones de estructura del anticuerpo. La unión puede ocurrir mediante el terminal amino o carboxilo del anticuerpo, o mediante el residuo de aminoácido interior. Además, las moléculas EM múltiples (por ejemplo, cualquiera de 2 a 10) se pueden unir al anticuerpo antimesotelina y/o los anticuerpos múltiples (por ejemplo, cualquiera de 2 a 5) se pueden unir a una EM. Los anticuerpos utilizados en una composición de inmunoconjugado multivalente de la presente invención se pueden dirigir a los mismos o a diferentes epítopes de mesotelina.

En las formas de realización preferidas de la presente invención, el anticuerpo antimesotelina es un anticuerpo recombinante tal como un scFv o un anticuerpo Fv estabilizado con disulfuro. Los anticuerpos Fv son típicamente aproximadamente de 25 kDa y contienen un parátopo completo con 3 CDRs por cadena pesada y ligera. Si la cadena V_{H} y la cadena V_{L} se expresan de forma no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv se mantienen típicamente juntas mediante interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, de forma que se han desarrollado métodos para reticular las cadenas mediante glutaraldehído, disulfuros intermoleculares o un péptido conector.

En una forma de realización particularmente preferida, el anticuerpo es un Fv de cadena única (scFv). Las regiones V_{H} y V_{L} de un anticuerpo scFv comprenden una cadena única que se pliega para crear un parátopo similar al encontrado en los anticuerpos de cadena doble. Una vez plegado, las interacciones no covalentes estabilizan el anticuerpo de cadena única. En una forma de realización más preferida, se produce scFv de forma recombinante. Todavía en otra forma de realización preferida, la región V_{H} posee la secuencia de aminoácido según se muestran en la Figura 1. En la forma de realización más preferida, la región V_{H} posee la secuencia de ácido nucleico según se encuentra en SEC ID nº: 1. En otra forma de realización preferida, la región V_{L} posee la secuencia de aminoácido según se encuentra en la Figura 1. En una forma de realización más preferida, la región V_{L} posee la secuencia de ácido nucleico según se indica en SEC ID nº: 1. Las CDRs de diversos anticuerpos de la presente invención poseen las secuencias de aminoácido según se muestra en la Figura 1. En una forma de realización más preferida, las CDRs poseen la secuencia de ácido nucleico según se muestra en la SEC ID nº: 1. En la forma de realización más preferida, el scFv completo posee la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEC ID nº: 1. Un experto en la materia se dará cuenta de que se pueden llevar a cabo las variantes conservadoras de los anticuerpos de la presente invención. Tales variantes conservadoras utilizadas en los fragmentos de scFv retendrán los residuos de aminoácido críticos necesarios para un plegamiento y una estabilización correctos entre las regiones V_{H} y V_{L}. Las variantes modificadas conservadoramente de la secuencia prototipo de SEC ID nº: 1 poseen por lo menos 80% de similitud de secuencia, preferentemente por lo menos 85% de similitud de secuencia, más preferentemente por lo menos 90% de similitud de secuencia y más preferentemente por lo menos 95% de similitud de secuencia en el nivel de aminoácido a su secuencia
prototipo.

En algunas formas de realización de la presente invención, el anticuerpo scFv se puede unir directamente a la EM mediante la cadena ligera. Sin embargo, los anticuerpos scFv se pueden unir directamente a la EM vía su amino o carboxi terminales.

Mientras las regiones V_{H} y V_{L} de algunas formas de realización de anticuerpos se pueden unir juntas directamente, un experto en la materia apreciará que las regiones se pueden separar mediante un péptido conector que consiste en uno o más aminoácidos. Los péptidos conectores y su utilización son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Huston, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8:5879 (1988); Bird, et al., Science 242:4236 (1988); Glockshuber, et al., Biochemistry 29:1362 (1990); patente U.S. nº 4.946.778, patente U.S. nº 5.132.405 y Stemmer, et al., Biotechniques 14:256-265 (1993). Por lo general el péptido conector no poseerá actividad biológica específica más que la de unir las regiones o conservar una distancia mínima u otra relación espacial entre ellas. Sin embargo, los aminoácidos constituyentes del péptido conector se pueden seleccionar para influenciar alguna propiedad de la molécula tal como el plegamiento, carga de red, o hidrofobicidad. Los anticuerpos de cadena única Fv (scFv) incluyen opcionalmente un péptido conector de no más de 50 aminoácidos, por lo general no más de 40 aminoácidos, preferentemente no más de 30 aminoácidos y más preferentemente no más de 20 aminoácidos de longitud. En algunas formas de realización, el péptido conector es un concatémero de la secuencia Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID nº: 7) preferentemente 2, 3, 4, 5 ó 6 de tales secuencias. Sin embargo, se aprecia que se pueden llevar a cabo algunas sustituciones de aminoácido dentro del conector. Por ejemplo, se puede sustituir una valina por una glicina.

A. Producción de un anticuerpo

Los métodos para la producción de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. En resumen, un inmunógeno, preferentemente epítopes de mesotelina aislada o de mesotelina extracelular se mezclan con un adyuvante y se inmunizan los animales con la mezcla. Cuando se obtienen las concentraciones elevadas adecuadas del anticuerpo al inmunógeno, se recoge la sangre del animal y se prepara el antisuero. Si se desea, se lleva a cabo un fraccionamiento adicional del antisuero para enriquecer los anticuerpos reactivos al polipéptido. Ver, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); y Harlow & Lane, supra.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante diversas técnicas familiares a los expertos en la materia. La descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se pueden encontrar en, por ejemplo, Stites, et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en el mismo; Harlow & Lane, supra; Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2ª ed), Academic Press, Nueva York, NY (1986); Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); y particularmente (Chowdhury, P.S., et al., Mol. Immunol. 34:9 (1997)), que describe un método para la generación de anticuerpos monoclonales.

Se prefiere en la presente memoria que los anticuerpos monoclonales se preparen mediante la inmunización de un animal con una secuencia de ácido nucleico que codifique el inmunógeno deseado, en este caso, mesotelina. La inmunización con unidades de transcripción no replicadoras que codifican la proteína(s) heteróloga provoca respuestas inmunes específicas al antígeno. Después de la traducción a la proteína foránea, la proteína se procesa y se presenta al sistema inmunológico como otras proteínas celulares. A causa de su foraneidad, se prepara una respuesta inmune contra la proteína y los epítopes de péptido que se derivan de ella (Donnelly, et al., J. Immunol. Methods 176:145-152 (1994); y Boyer, et al., J. Med. Primatol. 25:242-250 (1996)). Esta técnica posee dos ventajas significativas sobre la inmunización basada en la proteína. Una es que no requiere la purificación de la proteína, que en el mejor de los casos, requiere mucho tiempo y en casos de muchas proteínas de membrana, es muy difícil. Una segunda ventaja es que ya que el inmunógeno se sintetiza en un huésped de mamífero, experimenta modificaciones posteriores a la traducción adecuadas y se pliega en una estructura nativa.

Para inmunizar con ADN que codifica la mesotelina, el ADNc que codifica la mesotelina se introduce en un plásmido de forma que la transcripción de la secuencia codificadora está bajo control de un promotor tal como el promotor CMV. El plásmido se inyecta a continuación en un animal, subcutánea, intradérmica, intraperitonealmente, etc. Como resultado, el ADNc de mesotelina se transcribe en el animal en ARNm, la mesotelina se traduce a partir de ARNm, la proteína traducida experimenta las adecuadas modificaciones posteriores a la traducción y se expresa sobre la superficie de las células que sintetizan mesotelina. El animal produce anticuerpos para la mesotelina y se monitoriza el suero para la concentración de anticuerpo.

Opcionalmente, además de la región codificadora y de los elementos reguladores, el plásmido lleva un gen de resistencia de ampicilina (Amp). Es sabido que el gen Amp posee secuencias inmunoestimuladoras para respuestas Th1 necesarias para incrementar la producción de anticuerpos (Sato, et al., Science 273:352-354 (1996)).

Los ratones se pueden inmunizar intradérmicamente con pcD3CAK1-9 que expresa la mesotelina bajo el control de un promotor CMV (Chang, et al., Nat'l Acad. Sci. USA 93:136-140 (1996)). Se prefieren particularmente los ratones balb/c porque se ha demostrado que la inmunización de ADN intradérmica induce una fuerte respuesta inmune humoral en esta cepa (Raz, et al., Proc. Nat.'l Acad. Sci. USA 93:5141-5145 (1996)).

Según se ha descrito anteriormente, en formas de realización preferidas, el anticuerpo monoclonal es un scFv. Se han descrito los métodos para la preparación de anticuerpos scFv. Ver, Huse, et al., supra; Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan, et al., supra. En resumen, el ARNm de células B se aísla y se prepara ADNc. El ADNc se amplifica mediante técnicas bien conocidas, tales como PCR, con cebadores específicos para las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas. Los productos de PCR se purifican mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa y se unen las secuencias de ácido nucleico. Si se desea un péptido conector, las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido se insertan entre las secuencias de ácido nucleico de cadena pesada y ligera. Las secuencias se pueden unir mediante técnicas conocidas en la materia, tales como la ligadura de extremos ciegos, inserción de sitios de restricción en los extremos de los productos de PCR o mediante corte y empalme por extensión de superposición (Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9 (1997)). Después de la amplificación, el ácido nucleico que codifica el scFv se inserta en un vector, otra vez mediante técnicas bien conocidas en la materia. Preferentemente, el vector es capaz de replicar en procariotas y de expresarse tanto en eucariotas como en
procariotas.

Preferentemente, los scFv se seleccionan mediante una biblioteca de expresión en fago. Después de que las concentraciones de anticuerpo para el antígeno en el animal inmunizado alcancen su máximo, se sacrifica el animal y se elimina el bazo. Se sigue el procedimiento descrito anteriormente para sintetizar scFv. Después de la amplificación mediante PCR, las secuencias de ácido nucleico scFv se fusionan en el cuadro con el gen III (gIII) que codifica la proteína de superficie menor gIIIp de los fagos filamentosos (Marks, et al., J. Biol. Chem. 267:16007-16010 (1992); Marks, et al., Behring Inst. Mitt. 91:6-12 (1992); y Brinkmann, et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995)). Los fagos expresan la proteína de fusión resultante sobre su superficie. Ya que las proteínas sobre la superficie de los fagos son funcionales, los fagos que contienen los anticuerpos que se unen a la mesotelina se pueden separar a partir de los fagos de no unión o de afinidad baja mediante inmunoplaqueteo o cromatografía de afinidad de antígeno, (McCafferty, et al., Nature 348:552-554 (1990)).

El scFv que se une específicamente a la mesotelina se puede encontrar mediante inmunoplaqueteo. El inmunoplaqueteo se lleva a cabo mediante el recubrimiento de una superficie sólida con mesotelina e incubando los fagos sobre la superficie durante un tiempo adecuado bajo condiciones adecuadas. Los fagos no unidos se separan de la superficie sólida mediante lavado y se eluyen los fagos unidos. Encontrar el anticuerpo con la afinidad más elevada viene impuesto por la eficacia del proceso de selección y depende del número de clones que se pueda seleccionar y de la rigurosidad con la que se lleve a cabo. Típicamente, la rigurosidad mayor corresponde a un inmunoplaqueteo más selectivo. Sin embargo, si las condiciones son demasiado rigurosas, los fagos no se unirán. Después de una ronda de inmunoplaqueteo, los fagos que se unen a las placas recubiertas de mesotelina se expanden en E. coli y se someten a otra ronda de inmunoplaqueteo. De esta manera, ocurre un enriquecimiento de 2000 veces en 3 rondas de inmunoplaqueteo. De este modo, incluso cuando el enriquecimiento en cada vuelta sea bajo, las rondas múltiples de inmunoplaqueteo llevarán al aislamiento del fago raro y al material genético contenido dentro que codifica la secuencia del anticuerpo de afinidad más elevada. La unión física entre el genotipo y el fenotipo proporcionada por la expresión del fago hace posible analizar cada miembro de la genoteca de ADNc para determinar su unión al antígeno, incluso con genotecas tan grandes como 100.000.000 de clones.

B. Afinidad de unión de los anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a un epítope extracelular de mesotelina. Un anticuerpo antimesotelina posee afinidad de unión para la mesotelina si el anticuerpo se une o es capaz de unirse a la mesotelina según se mida o determine mediante ensayos anticuerpo-antígeno estándares, por ejemplo, ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoanálisis estándar tales como ELISA o RIA.

\newpage

Tales ensayos se pueden utilizar para determinar la constante de disociación del anticuerpo. La expresión "constante de disociación" se refiere a la afinidad de un anticuerpo para un antígeno. La especificidad de la unión entre un anticuerpo y un antígeno existe si la constante de disociación (K_{D} = 1/K, en la que K es la constante de afinidad) del anticuerpo es < 1 \muM, preferentemente < 100 nM, y más preferentemente < 0,1 nM. Las moléculas de anticuerpo presentarán típicamente una K_{D} en los intervalos inferiores. K_{D} = [Ab-Ag]/[Ab][Ag] en la que [Ab] es la concentración en el equilibrio del anticuerpo, [Ag] es la concentración en el equilibro del antígeno y [Ab-Ag] es la concentración en el equilibrio del complejo anticuerpo-antígeno. Típicamente, las interacciones de unión entre el antígeno y el anticuerpo incluyen asociaciones no covalentes reversibles tales como la atracción electrostática, fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrógeno. Este método para la definición de especificidad de unión se aplica a las cadenas pesadas y/o ligeras únicas, CDRs, proteínas de fusión o fragmentos de cadenas pesadas y/o ligeras, que son específicas para la mesotelina si se unen a la mesotelina solas o en combinación.

C. Inmunoanálisis

Los anticuerpos se pueden detectar y/o cuantificar utilizando cualquiera de entre un número de ensayos de unión inmunológica bien reconocidos (ver, por ejemplo, patentes U.S. nº 4.366.241; nº 4.376.110; nº 4.517.288 y nº 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, ver asimismo METHODS IN CELL BIOLOGY, VOL. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7TH EDITION, Stites & Terr, eds. (1991). Los ensayos de unión inmunológica (o inmunoanálisis) utilizan típicamente un ligando (por ejemplo, mesotelina) para unirse específicamente a un anticuerpo y a menudo inmovilizarlo. Los anticuerpos utilizados en los inmunoanálisis se describen en mayor detalle supra.

Los inmunoanálisis utilizan asimismo a menudo un agente marcador para unirse específicamente al complejo y marcar la unión del complejo formado por el ligando y el anticuerpo. El agente marcador puede ser en sí mismo una de las mitades que comprende el complejo anticuerpo/analito, es decir, el anticuerpo antimesotelina. De forma alternativa, el agente marcador puede ser una tercera mitad, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al complejo anticuerpo/proteína de mesotelina.

Se contempla un ensayo competitivo en el que el agente marcador es un segundo anticuerpo antimesotelina que contiene un marcador. Los dos anticuerpos compiten a continuación por la unión a la mesotelina inmovilizada. De forma alternativa, en un formato no competitivo, el anticuerpo mesotelina carece de un marcador, pero se marca un segundo anticuerpo específico a los anticuerpos de las especies a partir de las que se deriva el anticuerpo antimesotelina, por ejemplo, murino, y que se une al anticuerpo antimesotelina.

Otras proteínas capaces de unirse específicamente a las regiones constantes de inmunoglobulina, tales como Proteína A o Proteína G se pueden utilizar asimismo como un agente marcador. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Presentan una reactividad no inmunogénica fuerte con las regiones constantes de las inmunoglobulinas de una variedad de especies (ver, en general, Kronval, et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); y Akerstrom, et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)).

Durante todos los ensayos, se pueden requerir las etapas de incubación y/o de lavado después de cada combinación de los reactivos. Las etapas de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferentemente desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, anticuerpo, volumen de la solución, concentraciones, y similares. Por lo general, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque se puedan llevar a cabo durante un intervalo de temperaturas, tal como de 10ºC a 40ºC.

Mientras los detalles de los inmunoanálisis pueden variar con el formato particular utilizado, el método para la detección de los anticuerpos antimesotelina en una muestra que contiene los anticuerpos comprende por lo general las etapas de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que reacciona específicamente, bajo condiciones reactivas inmunológicas, con el complejo mesotelina/anticuerpo.

IV. Producción de inmunoconjugados

Los inmunoconjugados incluyen, pero no se limitan a, moléculas en las que existe una unión covalente de un agente terapéutico a un anticuerpo. Un agente terapéutico es un agente con una actividad biológica particular dirigida contra una molécula objetivo particular o una célula que contiene una molécula objetivo. Un experto en la materia apreciará que los agentes terapéuticos pueden incluir diversos fármacos tales como la vinblastina, daunomicina y similares, citotoxinas tales como la exotoxina Pseudomonas o la toxina difteria nativas o modificadas, agentes encapsuladores (por ejemplo, liposomas) que contienen en si mismos composiciones farmacológicas, agentes radioactivos tales como ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, ^{3}H y ^{35}S y otros marcadores, mitades objetivo y ligandos.

La elección de un agente terapéutico particular depende de la molécula o célula objetivo particular y del efecto biológico que se desea evocar. De este modo, por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una citotoxina que se utiliza para provocar la muerte de una célula objetivo particular. A la inversa, cuando se desea simplemente invocar una respuesta biológica no letal, se puede conjugar el agente terapéutico con un agente farmacológico no letal o con un liposoma que contiene un agente farmacológico no letal.

Con los agentes terapéuticos y anticuerpos proporcionados en la presente memoria, un experto en la materia puede construir fácilmente una variedad de clones que contienen ácidos nucleicos equivalentes funcionalmente, tales como ácidos nucleicos que difieren en la secuencia pero que codifican la misma secuencia de EM o de anticuerpo.

A. Métodos recombinantes

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la presente invención se puede preparar mediante cualquier método adecuado que incluye, por ejemplo, la clonación de secuencias apropiadas o mediante síntesis química directa mediante métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); el método de fosfodiéster de Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el método de dietilfosforamidita de Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981), por ejemplo, utilizando un sintetizador automático según se ha descrito en, por ejemplo, Needham-VanDevanter, et al., Nucl. Acids. Res. 12:6159-6168 (1984); y el método de soporte sólido de la patente U.S.nº 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Éste se puede convertir en ADN bicatenario mediante la hibridización con una secuencia complementaria, o mediante la polimerización con una polimerasa de ADN utilizando el monocatenario como una plantilla. Un experto en la materia reconocería que mientras la síntesis química de ADN se limita a las secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante la unión de secuencias más cortas.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas de clonación. Ejemplos de técnicas de clonación y de secuenciación apropiadas e instrucciones suficientes para dirigir a los expertos en la materia por medio de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (2ª ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)); Berger y Kimmel (eds.) GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987)), o Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987). La información de producto de los fabricantes de reactivos biológicos y de equipo experimental proporciona asimismo información útil. Tales fabricantes incluyen a SIGMA, compañía química (Saint Louis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA, y Applied Biosystems (Foster City, CA), además de muchas otras fuentes comerciales conocidas por los expertos en la materia.

Los ácidos nucleicos que codifican la EM nativa o los anticuerpos antimesotelina se pueden modificar para formar las EM, anticuerpos, o inmunoconjugados de la presente invención. La modificación mediante mutagénesis dirigida al sitio es bien conocida en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican la EM o los anticuerpos antimesotelina se pueden amplificar mediante métodos in vitro. Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia autosostenida (3SR). Son bien conocidos por los expertos en la materia una amplia variedad de métodos de clonación, células huésped y metodologías de amplificación in vitro.

Los inmunoconjugados se pueden preparar mediante la inserción del ADNc que codifica un anticuerpo scFv antimesotelina en un vector que comprende el ADNc que codifica la EM. La inserción se lleva a cabo de forma que el scFv y la EM se lean en un cuadro, que es un polipéptido continuo que contiene una región Fv funcional y una región EM funcional. En una forma de realización particularmente preferida, el ADNc que codifica un fragmento de la toxina de la difteria se liga a un scFv de forma que la toxina se sitúe en el carboxilo terminal del scFv. En una forma de realización más preferida, el ADNc que codifica la PE se liga a un scFv de forma que la toxina se sitúe en el amino terminal del scFv.

Una vez los ácidos nucleicos que codifican una EM, un anticuerpo antimesotelina, o un inmunoconjugado de la presente invención se aíslan y se clonan, uno puede expresar la proteína deseada en una célula de ingeniería de forma recombinante tal como células de bacterias, de planta, de levadura, de insecto y de mamíferos. Se espera que los expertos en la materia conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de proteínas incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levadura, y diversas células eucarióticas elevadas tales como COS, CHO, HeLa y líneas celulares de mieloma. No se hará ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas. En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican las proteínas aisladas de la presente invención se conseguirá típicamente uniendo funcionalmente el ADN o el ADNc a un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido de una incorporación en un casete de expresión. Los casetes pueden ser adecuados para la replicación y la integración en procariotas o en eucariotas. Los casetes de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y de traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica la proteína. Para obtener un nivel de expresión elevado de un gen clonado, es deseable construir los casetes de expresión que contengan, como mínimo, un fuerte promotor para la transcripción directa, un sitio de unión de ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de transcripción/traducción. Para E. coli esto incluye un promotor tal como el T7, trp, lac, o promotores lambda, un sitio de unión de ribosoma y preferentemente una señal de terminación de transcripción. Para células eucarióticas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y preferentemente un potenciador derivado de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus y una secuencia de poliadenilación y puede incluir secuencias donadoras y aceptoras de sitio de corte y empalme. Los casetes de la presente invención se pueden transferir en la célula huésped elegida mediante métodos bien conocidos tales como la transformación de cloruro de calcio o electroporación para E. coli y tratamiento de fosfato de calcio, electroporación o lipofección para células de mamífero. Las células que se transforman mediante los casetes se pueden seleccionar por su resistencia a antibióticos conferida por los genes que contienen los casetes, tales como los genes amp, gpt, neo y hyg.

Un experto en la materia reconocería que las modificaciones se pueden realizar a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención (es decir, anticuerpo antimesotelina, PE, o un inmunoconjugado formado a partir de su combinación) sin disminuir su actividad biológica. Se pueden realizar algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula objetivo en una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida al amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli Hys) situados en el terminal para crear sitios de restricción localizados convenientemente o codones de terminación o secuencias de purificación.

Además de los métodos recombinantes, los inmunoconjugados, la EM y los anticuerpos de la presente invención se pueden construir asimismo por completo o en parte utilizando síntesis peptídica estándar. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de la presente invención menores de 50 aminoácidos de longitud se puede llevar a cabo mediante la unión del aminoácido del C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido de una adición secuencial del resto de aminoácidos en la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se han descrito por Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PARTE A. págs. 3-284; Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963) y Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ª ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III (1984). Las proteínas de mayor longitud se pueden sintetizar mediante condensación de los terminales amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Son bien conocidos por los expertos en la materia los métodos para la formación de enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo terminal carboxi (por ejemplo, mediante la utilización del reactivo de acoplamiento N, N'-diciclohexilcarbodiimida).

B. Purificación

Una vez expresados, los inmunoconjugados recombinantes, los anticuerpos, y/o las moléculas efectoras de la presente invención se pueden purificar según los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, y similares (ver, en general, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N. Y. (1982)). Se prefieren las composiciones puras sustancialmente de por lo menos 90 a 95% de homogeneidad y son más preferidas para la utilización farmacéutica del 98 a 99% o más de homogeneidad. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, si se van a utilizar terapéuticamente, los polipéptidos deberían estar sustancialmente libres de endotoxina.

Los métodos para la expresión de anticuerpos de cadena única y/o replegamiento a una forma activa adecuada, incluyendo anticuerpos de cadena única, de bacterias tales como E. coli se han descrito y son bien conocidas y son aplicables a los anticuerpos de la presente invención. Ver, Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) y Ward, et al., Nature 341:544 (1989), todos incorporados en la presente memoria como referencia.

A menudo, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli u otras bacterias se aíslan de los cuerpos de inclusión y requieren solubilización utilizando desnaturalizadores fuertes y replegamiento posterior. Durante la etapa de solubilización, tal como es bien conocido en la técnica, un agente reductor debe estar presente para separar los enlaces disulfuro. Un regulador ejemplar con un agente reductor es Tris 0,1 M, pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE 0,3 M (ditioeritritol).

La reoxidación de los enlaces disulfuro puede ocurrir en presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, según se describe en Saxena, et al., Biochemistry 9:5015-5021 (1970), incorporada en la presente memoria como referencia, y especialmente descrita por Buchner, et al., supra.

La renaturalización se lleva a cabo típicamente mediante dilución (por ejemplo, 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en el regulador de replegamiento. Un regulador ejemplar es Tris 0,1 M, pH 8,0, L-arginina 0,5 M, glutatión oxidado 8 mM (GSSG) y EDTA 2 mM.

Como modificación al protocolo de purificación de anticuerpo de doble cadena, las regiones de cadena pesada y ligera se solubilizan separadamente y se reducen y a continuación se combinan en la solución de replegamiento. Se obtiene un rendimiento preferido cuando estas dos proteínas se mezclan en una proporción molar tal que no se supere un exceso molar de 5 veces de una proteína sobre la otra. Es deseable añadir un exceso de glutatión oxidado o de otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular a la solución de replegamiento después de que se complete la redox-redistribución.

V. Exotoxina Pseudomonas y otras toxinas

Las toxinas se pueden utilizar con los anticuerpos de la presente invención para proporcionar inmunotoxinas. Las toxinas ejemplares incluyen ricina, abrina, toxina difteria y subunidades de las mismas, además de las toxinas botulínicas A hasta F. Estas toxinas están disponibles fácilmente a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La toxina de la difteria se aísla a partir de Corynebacterium diphteriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de castor). El término se refiere asimismo a variantes tóxicas de la misma. Por ejemplo, ver, patentes U.S.nº 5.079.163 y 4.689.401. La aglutinina Ricinus communis (RCA) aparece en dos formas designadas RCA_{60} y RCA_{120} según sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD respectivamente (Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543 (1972)). La cadena A es responsable de la inactivación de la síntesis de proteína y de la muerte de las células. La cadena B une la ricina a los residuos de galactosa de la superficie de la célula y facilita el transporte de la cadena A en el citosol (Olsnes, et al., Nature 249:627-631 (1974) y patente U.S. nº 3.060.165).

La abrina incluye asimismo lectinas tóxicas de Abrus precatorius. Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d poseen un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kD y se componen de dos cadenas de polipéptido A y B unidas a dos disulfuros. La cadena A inhibe la síntesis de proteínas; la cadena B (abrina-b) se une a los residuos de D-galactosa (ver, Funatsu, et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335 (1978)).

En las formas de realización preferidas de la presente invención, la toxina es la exotoxina Pseudomonas (PE). El término "exotoxina Pseudomonas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una PE nativa de longitud completa (que aparece en la naturaleza) o a una PE que se ha modificado. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, la eliminación del dominio Ia, diversas deleciones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoácido único y la adición de una o más secuencias en el carboxilo terminal tales como KDEL (SEC ID nº: 8) y REDL (SEC ID nº: 9). Ver Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264:14256 (1989). En una forma de realización preferida, el fragmento citotóxico de la PE retiene por lo menos 50%, preferentemente 75%, más preferentemente por lo menos 90% y más preferentemente 95% de la citotoxicidad de la PE nativa. En una forma de realización más preferida, el fragmento citotóxico es más tóxico que la PE nativa.

La exotoxina Pseudomonas A nativa (PE) es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por la Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteína en células eucariotas. La secuencia de la PE nativa se proporciona como SEC ID nº: 1 de la patente asignada comúnmente U.S. nº 5.602.095, incorporada en la presente memoria como referencia. El método de acción es la inactivación de la ribosilación de ADP del factor de elongación 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan de común acuerdo para causar citotoxicidad. El dominio Ia (aminoácidos 1-252) media la unión de las células. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ribosilación de ADP del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece indefinida, aunque una gran parte de ésta, aminoácidos 365-380, se puede suprimir sin pérdida de citotoxicidad. Ver Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264:14256-14261 (1989), incorporada en la presente memoria como referencia.

La PE utilizada en la presente invención incluye la secuencia nativa, los fragmentos citotóxicos de la secuencia nativa y las variantes modificadas conservadoramente de la PE nativa y sus fragmentos citotóxicos. Los fragmentos citotóxicos de la PE incluyen los que son citotóxicos con o sin procesamiento proteolítico posterior u otros procesamientos en la célula objetivo (por ejemplo, como una proteína o preproteína). Los fragmentos citotóxicos de la PE incluyen PE40, PE38 y PE35. La PE40 es un derivado truncado de la PE según se ha descrito anteriormente en la técnica. Ver, Pai, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:3358-62 (1991) y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). La PE35 es un fragmento de la PE del carboxilo terminal de 35 kD compuesto de una met en la posición 280 seguida de los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE nativa. En las formas de realización preferidas, se utiliza el fragmento citotóxico PE38. La PE38 es una pro-proteína de la PE truncada compuesta de los aminoácidos 253-364 y 381-613 que se activa a su forma citotóxica tras el procesamiento dentro de una célula (ver patente U.S. nº 5.608.039).

En una forma de realización particularmente preferida, la PE38 es la mitad tóxica de la inmunotoxina de la presente invención, sin embargo, otros fragmentos citotóxicos PE35 y PE40 se contemplan y se describen en las patentes U.S.nº 5.602.095 y 4.892.827.

A. Variantes de la PE modificadas conservadoramente

Las variantes de la PE modificadas conservadoramente o los fragmentos citotóxicos de las mismas poseen por lo menos 80% de similitud de secuencia, preferentemente por lo menos 85% de similitud de secuencia, más preferentemente por lo menos 90% de similitud de secuencia, y más preferentemente por lo menos 95% de similitud de secuencia en el nivel de aminoácido, con la PE de interés, tal como la PE38.

El término "variantes modificadas conservadoramente" se aplica a tanto a secuencias de aminoácido como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas conservadoramente se refieren a las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácido idénticas o idénticas esencialmente; o si el ácido nucleico no codifica ninguna secuencia de aminoácido, a secuencias de ácido nucleico idénticas esencialmente. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos idénticos funcionalmente codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de las variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente memoria que codifica un polipéptido describe asimismo cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina) se puede modificar para proporcionar una molécula idéntica funcionalmente. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácido, un experto en la materia reconocerá que las sustituciones individuales, deleciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, añade o suprime un aminoácido único o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramente" en la que la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

B. Ensayos de la citotoxicidad de la PE

Las exotoxinas Pseudomonas utilizadas en la presente invención se pueden ensayar para determinar un nivel de citotoxicidad deseado mediante ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Los ensayos de toxicidad ejemplares se describen en la presente memoria en, por ejemplo, el Ejemplo 2. De este modo, los fragmentos citotóxicos de la PE y las variantes modificadas conservadoramente de tales fragmentos se pueden ensayar fácilmente para determinar la citotoxidad. Un gran número de moléculas de la PE candidatas se pueden ensayar simultáneamente para determinar la citotoxicidad mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los subgrupos de las moléculas candidatas se pueden ensayar para determinar la citotoxicidad. Los subgrupos de las moléculas candidatas que reaccionan positivamente se pueden subdividir continuamente y reensayar hasta que se identifica el(los) fragmentos(s) citotóxico(s) deseado(s). Tales métodos permiten una selección rápida de un gran número de fragmentos citotóxicos o de variantes conservadoras de la PE.

C. Otras mitades terapéuticas

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar asimismo para tener como objetivo cualquier número de diagnósticos o compuestos terapéuticos diferentes de las células que expresan la mesotelina sobre su superficie. De este modo, un anticuerpo de la presente invención, tal como un scFv antimesotelina, se puede unir directamente o vía un conector a un fármaco que se administra directamente a las células que contienen mesotelina. Los agentes terapéuticos incluyen tales compuestos como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, aminoácidos o derivados, glicoproteínas, radioisótopos, lípidos, carbohidratos o virus recombinantes. Las mitades de ácido nucleico terapéutico y de diagnóstico incluyen ácidos nucleicos complementarios, oligonucleótidos derivatizados para la reticulación covalente con ADN monocatenario o bicatenario, y triple formando oligonucleótidos.

De forma alternativa, la molécula unida a un anticuerpo antimesotelina puede ser un sistema de encapsulación, tal como un liposoma o micela que contenga una composición terapéutica tal como un fármaco, un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico complementario), u otra mitad terapéutica que se protege preferentemente de la exposición directa al sistema circulatorio. Los medios para preparar liposomas unidos a los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, patente U.S. nº 4.957.735 y Connor, et al., Pharm. Ther. 28:341-365
(1985).

D. Marcadores detectables

Los anticuerpos de la presente invención se pueden unir opcionalmente de forma covalente o no covalente a un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados para tal utilización incluyen cualquier composición detectable mediante un medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, eléctrico, óptico o químico. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde y similares), radiomarcadores (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente utilizadas en ELISA) y marcadores colorimétricos tales como perlas de oro coloidal o de vidrio coloreado o de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los medios de detección de tales marcadores son bien conocidos por los expertos en la materia. De este modo, por ejemplo, los radiomarcadores se pueden detectar utilizando película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente proporcionando la enzima con un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y se detectan los marcadores colorimétricos visualizando simplemente el marcador coloreado.

E. Conjugación del anticuerpo

En una forma de realización no recombinante de la presente invención, las moléculas efectoras, por ejemplo, mitades terapéuticas, de diagnóstico o de detección se unen a los anticuerpos antimesotelina de la presente invención utilizando cualquier número de medios conocidos por los expertos en la materia. Tanto la unión covalente como la no covalente significan que se pueden utilizar con anticuerpos antimesotelina de la presente invención.

El procedimiento para la unión de una molécula efectora a un anticuerpo variará según la estructura química de la EM. Los polipéptidos contienen típicamente una variedad de grupos funcionales; por ejemplo, grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH_{2}) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado sobre un anticuerpo lo que resulta en la unión de la molécula efectora.

De forma alternativa, el anticuerpo se derivatiza para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de un número de moléculas conectoras tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

Un "conector", tal como se utiliza en la presente memoria, es una molécula que se utiliza para unir el anticuerpo a la molécula efectora. El conector es capaz de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molécula efectora. Los conectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, conectores de cadena carbonada lineal o ramificada, conectores de carbono heterocíclicos, o conectores de péptidos. Cuando el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los conectores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes por medio de sus grupos laterales (por ejemplo, por medio de una unión disulfuro a la cisteína). Sin embargo, en una forma de realización preferida, los conectores se unirán al carbono alfa de los grupos carboxilo y amino de los aminoácidos terminales.

En algunas circunstancias, se desea liberar la molécula efectora del anticuerpo cuando el inmunoconjugado ha alcanzado su sitio objetivo. Por lo tanto, en estas circunstancias, los inmunoconjugados comprenderán uniones que son escindibles en la proximidad del sitio objetivo. La escisión del conector para liberar la molécula efectora del anticuerpo se puede provocar por la actividad enzimática o condiciones en las que el inmunoconjugado se someta al interior de la célula objetivo o en la proximidad del sitio objetivo. Cuando el sitio objetivo es un tumor, se puede utilizar un conector que se escinde en las condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a enzimas asociados al tumor o a pH ácido).

En vista del gran número de métodos que se han publicado para unir una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, fármacos, toxinas y otros agentes a los anticuerpos un experto en la materia será capaz de determinar un método adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo o a otro polipéptido.

VI. Composiciones farmacéuticas y administración

El anticuerpo y/o las composiciones de inmunoconjugado de la presente invención (por ejemplo, la PE unida a un anticuerpo antimesotelina), son útiles particularmente para la administración parenteral, tal como la administración intravenosa o la administración en una cavidad corporal o en un lumen de un órgano. Por ejemplo, las malignidades ováricas se pueden tratar mediante la administración intravenosa o mediante la administración localizada en el tejido alrededor del tumor. Para tratar los mesoteliomas, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar directamente en las cavidades pleural o peritoneal.

Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo y/o un inmunoconjugado disuelto en un vehículo aceptable farmacéuticamente, preferentemente un vehículo acuoso. Se pueden utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, salino regulador y similares. Estas soluciones son estériles y por lo general están libres de sustancias no deseadas. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según se requiere para las condiciones fisiológicas aproximadas tales como el ajuste de pH y los agentes reguladores, agentes ajustadores de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de la proteína de fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionarán principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares según el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del paciente.

De este modo, una composición de inmunotoxina farmacéutica típica de la presente invención para la administración intravenosa estaría comprendida entre aproximadamente 0,1 y 10 mg por paciente y día. Se pueden utilizar las dosificaciones desde 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente y día, particularmente si el fármaco se administra en un sitio apartado y no en el sistema circulatorio o linfático, tal como en una cavidad corporal o en un lumen de un órgano. Los métodos actuales para la preparación de composiciones administrables se conocerán por o serán evidentes a los expertos en la materia y se describen en mayor detalle en publicaciones tales como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19 TH ED., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1995).

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar para tratamientos terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que sufre una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como una "dosis eficaz terapéuticamente". Las cantidades eficaces para esta utilización dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente. Una cantidad eficaz del compuesto es la que proporciona un alivio subjetivo de un(os) síntoma(s) o una mejora que se puede identificar objetivamente según la indicación de un clínico o de otro observador cualificado.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones se pueden administrar dependiendo de la dosificación y de la frecuencia según requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de la presente invención para tratar eficazmente al paciente. La dosificación se puede administrar una vez pero se puede aplicar periódicamente hasta que se consiga un resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios justifiquen la supresión del tratamiento. Por lo general, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los síntomas o signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable para el paciente.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada de las composiciones de inmunoconjugado de la presente invención se pueden hacer como implantes, inyecciones de aceite, o como sistemas particulares. Para una visión de conjunto amplia de los sistemas de administración de proteínas ver, Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Los sistemas particulados incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica como un núcleo central. En las microesferas, el terapéutico se dispersa en toda la partícula. Las partículas, microesferas y microcápsulas más pequeñas de aproximadamente 1 \mum se refieren por lo general como nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares poseen un diámetro de aproximadamente 5 \mum de forma que sólo las nanopartículas se administran intravenosamente. Las micropartículas son típicamente de aproximadamente 100 \mum de diámetro y se administran subcutánea o intramuscularmente. Ver, por ejemplo, Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter. ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, págs. 219-342 (1994); y Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, págs. 315-339, (1992).

Se pueden utilizar polímeros para una liberación controlada por ión de las composiciones de inmunoconjugado de la presente invención. Se conocen en la técnica diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su utilización en la administración de fármaco controlada (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)). Por ejemplo, el copolímero en bloque, polaxamer 407 existe como un líquido viscoso aunque móvil a temperaturas bajas pero forma un gel semisólido a temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para la formulación y la administración sostenida de la interleucina-2 recombinante y de la ureasa (Johnston, et al., Pharm. Res., 9:425-434 (1992); y Pec, et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65 (1990)). De forma alternativa, se ha utilizado hidroxiapatita como un microvehículo para la liberación controlada de proteínas (Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215-224 (1994)). En otro aspecto todavía, se utilizan los liposomas para la liberación controlada además del fármaco objetivo del fármaco de capsulado de lípido (Betageri, et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la administración controlada de las proteínas terapéuticas. Ver, por ejemplo, patentes U.S. nº 5.055.303, nº 5.188.837, nº 4.235.871, nº 4.501.728, nº 4.837.028, nº 4.957.735 y nº 5.019.369, nº 5.055.303; nº 5.514.670; nº 5.413.797; nº 5.268.164; nº 5.004.697; nº 4.902.505; nº 5.506.206, nº 5.271.961; nº 5.254.342 y nº 5.534.496, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.

Entre las diversas utilizaciones de las inmunotoxinas de la presente invención se incluyen una variedad de condiciones de enfermedades causadas por células humanas específicas que se pueden eliminar mediante la acción tóxica de la proteína de fusión. Una aplicación preferida de las inmunotoxinas de la presente invención es el tratamiento de células malignas que expresan mesotelina. Células malignas ejemplares incluyen células de cánceres de ovario, de estómago y escamosas además de mesoteliomas.

VII. Kits de diagnóstico

En otra forma de realización, la presente invención proporciona kits para la detección de mesotelina o de un fragmento inmunorreactivo de la misma, (por ejemplo, colectivamente, una "proteína de mesotelina") en una muestra biológica. Una "muestra biológica" tal como se utiliza en la presente memoria, es una muestra de tejido o fluido biológicos que contienen mesotelina. Dichos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tejido de biopsia, esputos, fluido amniótico, sangre, y células sanguíneas (por ejemplo, leucocitos). Las muestras de fluido pueden ser de algún interés, pero por lo general no se prefieren en la presente memoria ya que las concentraciones detectables de la mesotelina se encuentran raramente en tal muestra. Las muestras biológicas incluyen asimismo secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas para objetivos histológicos. Una muestra biológica se obtiene típicamente a partir de un eucariota multicelular, preferentemente un mamífero tal como rata, ratón, vaca, perro, cobaya, o conejo, y más preferentemente un primate tal como macacos, chimpancés o humanos.

Los kits comprenderán típicamente un anticuerpo antimesotelina de la presente invención. En algunas formas de realización, el anticuerpo antimesotelina incluirá un fragmento de Fv de antimesotelina; preferentemente un fragmento de scFv.

Además los kits incluirán típicamente materiales de aplicación que describen los medios de utilización de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, para la detección de células mesoteliales en una muestra). Los kits pueden incluir asimismo componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que el kit está diseñado. De este modo, por ejemplo, el kit puede contener además medios para la detección del marcador (por ejemplo, sustratos de enzimas para marcadores enzimáticos, equipos de filtrado para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios adecuados tales como anti-ratón-HRP de oveja o similares). Los kits pueden incluir además reguladores y otros reactivos utilizados de forma rutinaria para la práctica de un método particular. Dichos kits y sus contenidos adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia.

El kit de diagnóstico puede comprender un inmunoanálisis. Según se ha descrito anteriormente, aunque los detalles del inmunoanálisis pueden variar con el formato particular utilizado, el método para la detección de la mesotelina en una muestra biológica comprende por lo general las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que reacciona específicamente, bajo condiciones reactivas inmunológicamente, con la mesotelina. El anticuerpo se deja que se una a la mesotelina bajo condiciones reactivas inmunológicamente y la presencia del anticuerpo unido se detecta directa o indirectamente.

Aunque la presente invención se ha descrito en algún detalle a título de ejemplo ilustrativo con los objetivos de claridad de comprensión, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

VIII. Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de anticuerpos SS scFv Inmunización de ratones

Se inmunizaron intradérmicamente con 15 \mum del plásmido, pcD3CAK1-9, que contiene la secuencia de codificación para la mesotelina de longitud completa (Chang, et al., Nat'l Acad. Sci. USA 93:136-140 (1996)) en 0,15 M de NaCl ratones Balb/c hembra de cuatro meses de edad. Después de 3 semanas, se administraron a intervalos de tres a cinco semanas cuatro inyecciones intradérmicas de refuerzo de 15 \mug de pcD3CAK1-9. El espaciado entre las inyecciones se determinó siguiendo la concentración del anticuerpo antimesotelina en la sangre mediante ELISA. La concentración se definió como la recíproca de la dilución más elevada del antisuero que proporcionó una señal de ELISA 2-3 veces mayor que la línea de base. Se administró cada inyección de refuerzo cuando la concentración en sangre disminuyó desde un nivel de pico excepto para la última inyección que se administró cuando la concentración permaneció constante durante cinco semanas. Diez días después de la última inyección, la concentración de anticuerpo fue superior a 100.000 según se midió mediante ELISA utilizando mesotelina recombinante. En este momento, los ratones se sacrificaron y se recogieron los bazos.

Extracción de ARN y construcción inicial de la biblioteca de scFv

Estos procedimientos se llevaron a cabo según se ha descrito anteriormente (Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997)) con las modificaciones siguientes. Se utilizaron para la unión aproximadamente 150 ng de un inserto de ADN scFv en pCANTAB5E cortado por 125 ng de SfiI y de NotI y se realizó la biblioteca en células MFR' azul XL-1 en lugar de MRF' azul XL-2. La biblioteca contenía aproximadamente 9 x 10^{5} clones independientes. Se añadió glucosa a la biblioteca, que estaba en 18 ml de medio SOC hasta una concentración final de 2% (peso/volumen). Después de la incubación a 37ºC durante 90 min, se añadieron ampicilina y tetraciclina hasta concentraciones finales de 100 y de 10 \mug/ml, respectivamente. La incubación se continuó a 37ºC durante otros 90 min y los cultivos se almacenaron como reservas de glicerina.

Caracterización del clon seleccionado

Los fagos recombinantes se rescataron mediante la superinfección con el fago auxiliar M13KO7 y se analizaron para determinar la unión a la mesotelina recombinante (a.a. 291-606). La figura 2 demuestra que los fagos se unen a la mesotelina en una forma que depende de la concentración y no mostró ninguna unión a las celdas ELISA que estaban sin recubrir o estaban recubiertas con varias proteínas de control. Esto indicó que la expresión en fago de un anticuerpo scFv antimesotelina (SS scFv) fue específico a la mesotelina. Para determinar si el fago SS scFv se unió a un epítope diferente a la mesotelina que el MAb K1 (ver Chang, et al., Int'l J. Cancer 57:90 (1994)), se llevó a cabo una competición ELISA. Como control positivo, se ensayó en paralelo la inhibición de la unión de un fago K1 mediante K1 IgG aislada y purificada. Según se muestra en la Fig. 3, la unión del fago SS scFv fue inhibida solo ligeramente por K1 IgG y no hubo concentración que dependiese de la inhibición, mientras que la unión del fago K1 se redujo principalmente por K1 IgG. Esto indicó que el epítope al que se dirige SS scFv es diferente del de K1.

Transferencia de la biblioteca de XL-1 de E. coli a la cepa TG1

Durante el proceso de inmunoplaqueteo y de reamplificación en XL-1 (ver infra), se observó la deleción frecuente de las secuencias scFv del fagómido. Por lo tanto se transfirió la biblioteca a la cepa TG-1 para el inmunoplaqueteo. En primer lugar, los fagos recombinantes precipitados en polietilenglicol (PEG) se rescataron de un agrupamiento de reservas de glicerina de la biblioteca en XL-1. Las células TG1 (50 ml) a una OD_{600 nm} de 0,55 en 2XYT se infectaron con los fagos rescatados a una multiplicidad de infección (m.o.i) de cinco. La incubación se llevó a cabo a 37ºC durante 30 minutos agitando a 110 rpm y a continuación durante 30 min a 250 rpm. Se añadió ampicilina (100 \mug/ml) y el cultivo se incubó adicionalmente durante 30 minutos más a 37ºC y a 250 rpm. Las partículas del fagómido recombinante se rescataron con M13KO7 según se ha descrito (Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997)) excepto por el hecho de que el rescate fue a 37ºC y a 30ºC en cultivos separados. Los fagos precipitaron tres veces en PEG (Lin, et al., J. Biol. Chem. 255:10331-10337 (1980)) antes de utilizarse para el inmunoplaqueteo en la mesotelina recombinante (a.a. 291-606).

Inmunoplaqueteo de la biblioteca

Se preparó la mesotelina recombinante según se ha descrito por Chowdhury, et al., Mol. Immunol. 34:9-20 (1997). Se llevó a cabo el inmunoplaqueteo a 37ºC para seleccionar un scFv que fuese estable a esta temperatura.

Procedimiento 1 (inmunoplaqueteo directo): Se recubrieron con 1,5 ml de mesotelina recombinante a 5 \mug/ml (125 nM) en regulador de bicarbonato 50 mM a pH 9,4 celdas de 35 mm de diámetro de placas de calidad de cultivo de tejido y se bloquearon con leche no grasa al 3% en PBS que contenía Tween 20 (TPBS) al 0,05%. En la primera ronda de inmunoplaqueteo, se añadieron 2 x 10^{11} colonias formadoras. Después de 2 horas a 37ºC y después de 20 rondas de lavados con TPBS y PBS quedaron en la placa 7 x 10^{4} fagos. Los fagos unidos se eluyeron con 1 ml de HCl 50 mM, pH 1,3 durante 10 minutos a 37ºC. Después de la neutralización con regulador Tris, se utilizó una alícuota del eluído para la valoración sobre las placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 2%. El resto se utilizó para infectar 10 ml de celdas de TG1 de E. coli que crecieron hasta OD_{600} de 0,3 en 2XYT. Durante esta fase de infección, se añadió glucosa al cultivo hasta una concentración final de 2%. El cultivo se incubó a 37ºC durante 30 minutos agitando a 110 rpm y a continuación durante 30 min a 250 rpm. Se añadió ampicilina hasta una concentración final de 100 \mug/ml y se incubó el cultivo durante 30 min más a 37ºC con agitación a 250 rpm y seguido de la adición de M13KO7 a una m.o.i de 15. Se incubó el cultivo durante 60 min a 37ºC con agitación a 110 rpm durante los primeros 30 min y a continuación a 250 rpm. Las celdas se granularon y se resuspendieron en 20 ml del medio 2 x YT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de canamicina. El cultivo se incubó a 37ºC con agitación a 250 rpm durante toda la noche. Los fagos rescatados en el medio de cultivo se precipitaron en PEG, se valoraron y se utilizaron para la siguiente ronda de inmunoplaqueteo. Después de la tercera ronda de inmunoplaqueteo, se seleccionaron diez clones al azar y se analizaron minipreparaciones de ADN para determinar la huella genética de BstN1 y el análisis de la secuencia de nucleótidos.

Procedimiento 2 (inmunoplaqueteo de constante de disociación): se siguió el método descrito anteriormente excepto por el hecho de que después de lavar las partículas de los fagos no unidos se incubaron las placas a 37ºC en PBS durante 2 h adicionales antes de eluir los fagos unidos para seleccionar los fagos que tendrían una constante de disociación más lenta.

Resultados

La valoración de los fagos eluídos a partir de tanto el inmunoplaqueteo directo como el del reducido mostró que había un enriquecimiento de 1000 a 2000 veces en el número de fagos eluídos entre la primera y la tercera ronda de inmunoplaqueteo (Tabla 1).

TABLA 1 Enriquecimiento de los fagos de antimesotelina durante tres rondas de inmunoplaqueteo a 37ºC utilizando la selección directa o de constante de disociación

Ronda de inmunoplaqueteo	Nº de entrada de	Nº de uniones de	Nº de fago positivo
(selección)	fago	fago	de mesotelina
			/Nº ensayado
1	Directa	2 x 10^{11}	7 x 10^{4}	0/48
	De constante	2 x 10^{11}	2 x 10^{4}	0/48
	de disociación
2	Directa	7 x 10^{10}	8 x 10^{4}	2/48
	De constante	3 x 10^{10}	8 x 10^{3}	1/48
	de disociación
3	Directa	1 x 10^{10}	6 x 10^{6}	32/48
	De constante	3 x 10^{9}	4 x 10^{5}	30/48
	de disociación

Después de cada ronda de inmunoplaqueteo, los fagos recombinantes se rescataron de 48 colonias de fagómidos individuales seleccionadas al azar. Inicialmente, no se detectó ningún clon positivo de mesotelina entre las colonias seleccionadas al azar a partir de la biblioteca sin inmunoplaqueteo. Además no hubo nada en el eluído después de la primera ronda de inmunoplaqueteo (ver Tabla 1). En el eluído después de la segunda ronda de inmunoplaqueteo, hubo 1 a 2 clones positivos de mesotelina de los 48 ensayados. En el tercer eluído el número incrementó hasta aproximadamente 30/48. La huella genética de BstN1 de seis clones positivos demostró que el patrón de restricción fue idéntico para todos los clones. La secuenciación de ADN de seis clones de cada grupo después de las tres rondas de inmunoplaqueteo reveló que los clones positivos obtenidos eran idénticos en su secuencia de nucleótidos.

Se llevó a cabo un proceso de selección similar utilizando fagos crecidos y seleccionados a 30ºC y se obtuvo el mismo clon. El clon único scFv capaz de unirse a la mesotelina se denominó SS scFv. La secuencia de aminoácido obtenida de la traducción de la secuencia de nucleótido de SS scFv se muestra en la Figura 1. La secuencia de nucleótido se ha depositado en la base de datos de GenBank con el número de registro de entrada AF035617. Según la clasificación de Kabat, el V_{H} pertenece al subgrupo IIA y a la familia V y la V_{L} pertenece al subgrupo VI y a la familia XI.

Ejemplo 2 Análisis de SS scFv

Se analizó SS scFv para determinar si sería un candidato como mitad objetivo de una inmunotoxina. Anteriormente, se encontró que los anticuerpos monoclonales de murino producidos para la mesotelina recombinante (aislada de cuerpos de inclusión de bacterias) se unían a la mesotelina recombinante pero no se unían a la mesotelina nativa derivada de células de mamífero con una afinidad elevada. Se llevó a cabo una biblioteca de expresión en fago a partir de ARNm esplénico de los ratones inmunizados y se descubrió que los scFv se unieron a la mesotelina recombinante. Sin embargo, las inmunotoxinas preparadas a partir de estos anticuerpos no mataron las células que expresaron la mesotelina. Se desarrolló la hipótesis de que estos anticuerpos tenían una afinidad baja hacia la mesotelina humana según se descubrió en las superficies de las células. Además, otro anticuerpo de murino para la mesotelina, K1, se acopló a PE40. Esta inmunotoxina tampoco logró matar las células que expresan la mesotelina (Chang, et al., Cancer Res. 52:181 (1992)).

Ensayos de unión

La unión del fago a la mesotelina se ensayó mediante el inmunoanálisis ligado a enzima (ELISA). (A) Se recubrieron con 200 ng de mesotelina (a.a. 291-606), BSA, la subunidad p55 del receptor IL-2 o estreptavidina en 100 \mul de regulador de bicarbonato, pH 9,4, las celdas de placas de IMMUNOLON-4® durante toda la noche a 4ºC. Las celdas se bloquearon con leche no grasa al 3% en TPBS durante 60 min. Se aplicaron 100 \mul de solución bloqueadora que contenía diversos números de fago a cada celda y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Después del lavado con TPBS, los fagos unidos se detectaron con un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP durante 60 min a 37ºC. Después del lavado con TPBS y PBS, las celdas ELISA se desarrollaron con 100 \mul de sustrato BM-Blue (Boehringer-Mannheim) para HRP. El desarrollo del color se detuvo después de 2 minutos con 100 \mul de H_{2}SO_{4} 2 N y se tomaron las lecturas O.D. a 450 nm.

(B) Competición ELISA- La competición ELISA se llevó a cabo sobre mesotelina recombinante inmovilizada según se ha descrito anteriormente excepto por el hecho de que 100 \mul de diversas diluciones de SS scFv del sobrenadante del cultivo TG1 o partículas de fagómido recombinantes K1 scFv se utilizaron directamente en un ELISA con o sin 1,0 \mug de K1 IgG.

Examen de inmunofluorescencia de células vivas

Para determinar si el anticuerpo seleccionado mediante el inmunoplaqueteo sobre mesotelina recombinante (a.a. 291-606) unido a la mesotelina se expresó en la superficie de la célula de mamífero, se llevó a cabo un ensayo de inmunofluorescencia con células positivas a la mesotelina. NIH 3T3 es una línea de células de fibroblasto de ratón suizo. La NIH 3T3K20 se transfecta de forma estable con un vector de expresión eucariótico (pcADN3) que contiene el gen de mesotelina de longitud completa (pcD3CAK1-9). El A431 es un carcinoma epidermoide cervical y el A431-K5 se transfecta de forma estable con pcD3CAK1-9. Se han descrito anteriormente otras líneas de células (Chang, et al., Cancer Res. 52:181-186 (1992); y Reiter, et al., Biochemistry 33:5451-5459 (1994)).

Las células crecieron en discos de cultivo de tejido de 35 mm. Las células se lavaron con DPBS que contenía Ca^{2+} y Mg^{2+} (DPBS^{++}) y se enfriaron sobre hielo. Las células se bloquearon con BSA al 0,2% en DPBS^{++} a 4ºC y se expusieron a 10^{11} partículas de fago seleccionadas mediante inmunoplaqueteo o fagos anti-Tac, que expresan un scFv en la subunidad p55 del receptor IL-2, durante 60 minutos a 4ºC. Los fagos unidos se detectaron con un Mab de ratón a gVIIIp de fago M13 como el primer anticuerpo seguido por un anti-ratón-IgG de cabra acoplado a rodamina como el anticuerpo detector. Después del lavado, las células se fijaron en formaldehído al 3,7% y se montaron in situ bajo tiras cubiertas en glicerina regulada.

La Figura 4 muestra que los fagos que expresan SS scFv no se unieron a las células NIH 3T3 negativas a mesotelina sino que se unieron fuertemente a las células NIH 3T3 K20. Un fago de control que expresó en scFv anti-Tac no se unió tampoco a estas líneas celulares. Estos resultados indican que SS scFv se une específicamente a la mesotelina de la superficie de la célula.

Ejemplo 3 Síntesis de la exotoxina Pseudomonas aeruginosa Construcción de un plásmido para la expresión y purificación de la inmunotoxina SS(scFv) PE38

Para determinar si el SS scFv podría tener como objetivo un agente citotóxico a las células positivas a la mesotelina, se construyó una inmunotoxina recombinante mediante la fusión de SS scFv a PE38, una forma truncada de la exotoxina Pseudomonas A. En esta construcción, el SS scFv sustituyó el dominio de unión de la PE y se tuvo como objetivo la toxina a las células a las que se unió SS scFv, es decir, células que expresan mesotelina.

La forma scFv del vector fagómido pPSC7-1 fue amplificado por PCR utilizando parejas de cebadores New G2 Ndel

5'-TAAGAAGGAGATATACATATGCAGGTACAACTGCAGCAGTCTGGG-3' (SEC ID nº: 3) como el cebador posterior y New G2 HindIII 5'-GCCCTCGGGACCTCCGGAAGCTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3' (SEC ID nº: 4) como el cebador anterior. Estos cebadores introdujeron un sitio NdeI y uno HindIII en los extremos 5' y 3' de SS scFv. Después de la purificación en gel de agarosa, el producto de PCR se digerió con NdeI y HindIII y se unió en el fragmento bp 4180 de pUL17 (Benhar, et al., Bioconjugate Chem. 5:321-326 (1994)) obtenido mediante el corte con los mismos enzimas. El plásmido que resultó, pPSC 7-2, tuvo el SS scFv fusionado en el cuadro con el dominio II y III de la exotoxina Pseudomonas A (SEC ID nº: 2). Se transformaron las E. coli competentes y se encontraron las proteínas
recombinantes en los cuerpos de inclusión (Brinkmann, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616-8620 (1991)).

Después de la renaturalización de los cuerpos de inclusión, el SS scFv-PE38 se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico y de tamaño de exclusión. La inmunotoxina recombinante eluyó como un monómero de la columna de filtración de gel TSK y migró como una banda única de aproximadamente 67 kD mediante SDS-PAGE. Calculando a partir de las proteínas del cuerpo de inclusión sometidas al replegamiento, el rendimiento de la proteína fue de aproximadamente 12%.

Ejemplo 4 Actividad in vitro de SS scFv-PE38 Ensayos de unión

Las características de unión de la inmunotoxina se determinaron mediante la resonancia de plasmón de superficie (Brinkmann, et al., Int. J. Cancer 71:638-644 (1997)). La mesotelina recombinante (a.a. 291-606) se acopló al microcircuito sensor CM5 BIACore y se hicieron pasar sobre el microcircuito 25 \mug/ml de una solución de la inmunotoxina. Se encontró que k_{on} fue 1,68 x 10^{5} M^{-1} seg^{-1}. El k_{off} se encontró que fue 1,83 x10^{3} seg^{-1}. La constante de disociación o k_{d} calculada a partir de estos datos fue 11 nM.

Ensayos de citotoxicidad

La capacidad del SS scFv-PE38 para inhibir la síntesis de proteína se utilizó como una medida de su efecto citotóxico (Chaudhary, et al., Nature 339:394-397 (1989)). Para determinar si el SS scFv se podría interiorizar de forma que la toxina pudiese matar las células objetivo, se expusieron células positivas a mesotelina y negativas a mesotelina a la inmunotoxina durante 20 horas en presencia de ^{3}H-leucina y se determinó la incorporación de ^{3}H. En células A431-K5, que expresan mesotelina, la cantidad de la inmunotoxina requerida para inhibir la síntesis de proteína al 50% o IC_{50} se encontró que fue 0,5 ng/ml (Tabla 2), mientras que en las células ATAC4, que expresan la subunidad p55 del receptor IL-2, el IC_{50} fue 400 ng. En células A431 no transfectadas, se encontró que el IC_{50} fue 450 ng/ml. De este modo, la actividad citotóxica de SS scFv-PE38 se encontró que era elevadamente específica.

TABLA 2 Citotoxicidad de SS scFv-PE38 en líneas celulares de cáncer humano

Línea celular	Origen	[K1 o SS] reactividad por IF	IC_{50} ng/ml
A431	Carcinoma epidermoide	-	450
A431 K5	Mesotelina A431transfectada	++++	0,5
ATAC-4	A431 transfectada p55	-	400
AGS	Adenocarcinoma gástrico	++	6
N87	Adenocarcinoma gástrico	++	6
A1847	Adenocarcinoma ovárico	++/het	16
JD38	Linfoma de Burkitt	-	>1000
Raji	Linfoma de Burkitt	-	>1000
HUT 102	Leucemia de células T	-	>1000

La inmunotoxina recombinante se ensayó asimismo con diversas líneas celulares negativas al antígeno (HUT102, Raji y JD38) y mostró muy poca actividad citotóxica (IC_{50}>1.000 ng/ml). Sin embargo, con la línea celular de cáncer de ovario positiva a mesotelina A1847, se encontró que el IC_{50} fue 16 ng/ml. Dos líneas celulares de carcinoma gástrico, AGS y N87, que expresan la mesotelina eran sensibles al SS scFv-PE38 con un IC_{50} de 6 ng/ml. Estos estudios indicaron que cantidades suficientes de SS scFv-PE38 se interiorizaron para matar líneas celulares positivas a mesotelina.

Ensayos de estabilidad

Para ser útil en la terapia dirigida a un objetivo, un scFv debe ser estable durante muchas horas a 37ºC mientras penetra en el interior de los tumores (Brinkmann, et al., Biochem. Biophys. Acta 1198:27-45 (1994)). La estabilidad de la inmunotoxina SS scFv-PE38 se analizó midiendo la actividad citotóxica de alícuotas de una reserva de 10 \mug/ml en albúmina de suero humano al 0,2% (HSA) en DPBS^{++} después de la incubación a 37ºC durante periodos de tiempo variados. Al final de la incubación, las muestras se almacenaron a -80ºC y se ensayaron para determinar su actividad citotóxica en células A431-K5.

La Figura 4 muestra que continuando la incubación a 37ºC hasta 40,5 horas, no hubo apenas ningún cambio en la actividad citotóxica de la inmunotoxina, indicando que la molécula fue muy estable a temperatura fisiológica.

Ejemplo 5 Actividad antitumor de SS scFv-PE38 in vivo

Se ensayó el SS scFv-PE38 por su capacidad para inhibir el crecimiento o causar regresión de xenoinjertos de tumor subcutáneo en ratones desnudos. Esto se llevó a cabo mediante la inyección subcutánea de 1,5 x 10^{6} células A431-K5 en ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad en el día 0. El tratamiento se inició en el día 4 cuando los tumores midieron aproximadamente 50 mm^{3}. Los animales se trataron intravenosamente con tres dosis de 2,6 ó 4,3 \mug de SS scFv-PE38 en los días 5, 7 y 9. El grupo de control recibió anti-Tac(scFv)-PE38, que había demostrado anteriormente que producía regresión completa de tumores que expresan el receptor IL-2 (Reiter, Y., et al., Int. J. Cancer 58:142 (1994)) pero que no es citotóxico a las células A431-K5, o al vehículo (HSA 0,2% en DPBS). Cada grupo se componía de cinco animales.

La Figura 5 indica que a diferencia de los grupos de control, en ambos grupos de ratones de tratamiento de dosificación se observó la regresión del tumor.

Claims

1. Anticuerpo que comprende una cadena pesada variable (V_{H}) y una cadena ligera variable (V_{L}), cuyas cadenas V_{H} y V_{L} presentan regiones determinantes de complementariedad (CDRs) según se indica en la Figura 1 (SEC ID nº: 5).

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo Fv de cadena única (scFv), preferentemente en el que dicha V_{L} se conjuga con dicha V_{H} mediante un péptido conector, opcionalmente en el que dicho péptido conector posee una secuencia tal como se ha representado en la Figura 1 (SEC ID nº: 5).

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo Fv estabilizado con disulfuro (dsFv).

4. Anticuerpo que comprende una cadena pesada variable (V_{H}) que presenta regiones determinantes de complementariedad (CDRs) según se indica en la Figura 1 (SEC ID nº: 5).

5. Anticuerpo que comprende una cadena ligera variable (V_{L}) que presenta regiones determinantes de complementariedad (CDRs) según se indica en la Figura 1 (SEC ID nº: 5).

6. Anticuerpo según la reivindicación anterior, en el que dicho anticuerpo se marca de forma detectable.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico, preferentemente en el que dicho agente terapéutico es una toxina, por ejemplo, una exotoxina Pseudomonas (PE) o un fragmento citotóxico de la misma.

8. Composición que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente y un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo según la reivindicación 6 ó 7.

9. Casete de expresión que codifica un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Casete de expresión que codifica un inmunoconjugado recombinante según la reivindicación 6 ó 7.

11. Célula huésped que comprende un casete de expresión según la reivindicación 9 ó 10.

12. Utilización de un anticuerpo de antimesotelina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento de una célula maligna que expresa mesotelina en su superficie celular.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que dicha célula maligna se selecciona de entre el grupo de malignidades constituido por mesoteliomas, cáncer de ovario, cáncer de estómago y cáncer de células escamosas.