ES2332592T3 - Modulos de union a carbohidratos. - Google Patents

Abstract

Módulo de unión a carbohidratos que es (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, donde la secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 50% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2 o (c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 bajo condiciones de astringencia media o (d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótidos aislada cuya molécula de polinucleótidos se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

Description

Módulos de unión a carbohidratos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a módulos de unión a carbohidratos no catalíticos (CBM) de una familia nueva de CBM's. Un CBM de la invención fue descubierto fijado a un polipéptido de familia 61 de glicosil hidrolasa (GH61) y demostró tener poca homología con CBM's conocidos lo que indica que es el primer elemento conocido por una familia nueva de CBM's. La presente invención además se refiere a CBM's que preferiblemente presentan afinidad de enlace a celulosa; a un método para producir CBM's de este tipo; y a métodos para usar CBM's de este tipo en la industria textil, de detergentes y de tratamiento de fibras de celulosa, para la purificación de polipéptidos, inmovilización de enzimas activas, cocción, fabricación de biocombustible, modificación de paredes celulares vegetales.

Antecedentes de la invención

Un módulo de unión a carbohidratos (CBM) es definido como una secuencia de aminoácidos contigua dentro de una enzima activa de carbohidratos con un pliegue específico que tiene actividad de unión a carbohidratos. El requisito de CBM's existentes como módulos dentro de enzimas más grandes sitúa a esta clase de proteínas de unión a carbohidratos aparte de otras proteínas de unión a azúcar no catalíticas tales como lectinas y proteínas de transporte de azúcar.

Los CBM's fueron previamente clasificados como dominios de unión a la celulosa (CBD's) basándose en el descubrimiento inicial de diferentes módulos que se unen a la celulosa (Tomme et al. (1989) FEBS Lett. 243, 239-243; Gilkes et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 10401-10407). No obstante, se está descubriendo continuamente que módulos adicionales en enzimas activas sobre carbohidratos se unen a carbohidratos distintos de celulosa y sin embargo reúnen los criterios de CBM's.

La clasificación precedente de los dominios de unión a la celulosa se basó en la similitud de aminoácidos. Agrupamientos de CBD's fueron denominados "Tipos" y numerados con números romanos (p. ej. CBD's de tipo I o tipo II). Continuando con la clasificación de glucósido hidrolasa, estos agrupamientos son entonces llamados familias y numerados con números árabes. Las Familias 1 a 13 equivalen a los tipos I a XIII (Tomme et al. (1995) en Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler & Penner eds.) 142-163, American Chemical Society, Washington).

Actualmente los CBM's conocidos son clasificados en familias 1-6 y 8-33. Muchos CBM's clasificados son de origen bacteriano, y los módulos de unión a carbohidratos fúngicos conocidos son principalmente clasificados en la familia CBM1. No obstante, representantes de CBM's fúngicos son también descubiertos en CBM13, CBM18, CBM19, CBM20 y CBM24. Hasta ahora, sólo los módulos de unión a carbohidratos fúngicos de CBM1 fueron conocidos para unirse a la celulosa cristalina. Los CBM's fúngicos de familias CBM13, CBM18, CBM19, CBM20 y CBM24 han sido mostrados para unirse a sustratos tales como quitina, almidón y mutano. No obstante, también los módulos de unión a carbohidratos fúngicos de CBM1 se unen muy bien a quitina.

Varias celulasas fúngicas han demostrado contener un CBD de la familia CBM1 que consiste en 36 residuos aminoácidos. Ejemplos de enzimas conocidos para contener este dominio son:

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Endoglucanasa I (gen egl1) de Trichoderma reesei.

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Endoglucanasa II (gen egl2) de Trichoderma reesei.

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Endoglucanasa V (gen egl5) de Trichoderma reesei.

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Exocelobiohidrolasa I (gen CBHI) de Humicola grisea, Neurospora crassa, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei, y Trichoderma viride.

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Exocelobiohidrolasa II (gen CBHII) de Trichoderma reesei.

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Exocelobiohidrolasa 3 (gen cel3) de Agaricus bisporus.

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Endoglucanasas B, C2, F y K de Fusarium oxysporum.

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El dominio CBD se encuentra bien en el N-terminal (Cbh-II o egl2) o en la extremidad C-terminal (Cbh-I, egl1 o egl5) de estas enzimas. Hay cuatro residuos de cisteína conservados en este tipo de dominio CBD, todos los cuales están implicados en enlaces de disulfuro. (Prosite, Swiss Institute of Bioinformatics).

Otras enzimas que comprenden un CBD están descritas en Bourne et al.,(2001) Current opinion in structural biology, 11: 593-600.

Una secuencia de ADN que codifica un CBD de un organismo dado puede ser obtenida de forma convencional usando técnicas de PCR, y, también basándose en el conocimiento actual; es posible descubrir secuencias homólogas de otros organismos.

Está contemplado que CBD's nuevos pueden ser descubiertos clonando celulasas, xilanasas u otras enzimas degradadoras de la pared celular vegetal y midiendo la unión a p. ej. celulosa. Si la actividad enzimática está unida a Avicel según las condiciones estándares descritas abajo, puede ser asumido que parte de un gen codifica para un dominio de unión.

Ejemplos de polipéptidos tipo CBM's obtenibles de plantas son las expansinas. Las expansinas no son CBM's per se porque éstas no se encuentran codificadas en la misma secuencia de aminoácidos con una actividad enzimática. No obstante, se ha observado que dominios de CBM aislados pueden tener actividad tipo expansina en celulosa (Levy y Shoseyov, 2002 supra). Din et al. (Bio/Technology 9 (1991) 1096-1099) han proporcionado que cenA de CBD de endoglucanasa A de Cellulomonas fimi es capaz de actividad de rotura no hidrolítica de fibras celulósicas dando como resultado la liberación de pequeñas partículas. Además, se demostró que cenA de CBD podría prevenir la floculación de celulosa microcristalina bacteriana (Gilkes et al. (1993) Int. J. Biol. Macromol. 15:347-351). Fenómenos similares fueron observados para otros CBD's (Krull et al. (1988) Biotechnol. Bio-eng. 31:321-327; Banka et al. (1998) World J. Microbiol. Biotechnol. 14:551-558; Gao et al. (2001) Acta Biochim. Biophys. Sin. 33:13-18).

CBM's son conocidos para ser usados en aplicaciones tan diversas como lavado, tratamiento de textiles, eliminación de placa dental, purificación de polipéptidos, inmovilización de enzimas activas, modificación de materia celulósica, panadería, fabricación de biocombustible, modificación de paredes celulares vegetales.

Resumen de la invención

Los inventores han descubierto ahora un módulo de unión a carbohidratos (CBM) obtenible del hongo Pseudoplectania nigrella que tiene afinidad de unión a celulosa, este CBM nuevo fue descubierto unido a una enzima perteneciente a la familia 61 de las glicosil hidrolasas (GH61). El nuevo CBM (llamado CBMX) demostró tener afinidad a Avicel® y no tiene homología observable (debajo del 20%) a CBM's conocidos. Asímismo, ninguna de las posiciones de los residuos de cisteína descubiertos en el CBM de la invención corresponden a las posiciones de los residuos de cisteína bien conservados en la familia CBM1 anteriormente descrita. Esto indica que el CBM de la invención es el primer elemento conocido de una familia nueva de CBM's.

Aparte de los CBM's fúngicos de familia CBM1 que tiene afinidad de unión a la celulosa, el CBM de la invención es el primer CBM fúngico conocido que muestra tener afinidad de unión a la celulosa. Los inventores han logrado la clonación y expresión de un CBM unido a una enzima de la familia GH61. Además, los inventores han expresado el dominio sólo, sin la enzima GH61 y demostró que el CBM sólo puede unirse a celulosa, tal como Avicel.

Dicho dominio de CBM es codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 y tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2. Las posiciones 1-33 de la SEC ID NO:2 constituye un péptido señal y una región N-terminal de la enzima GH61.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un CBM de una familia nueva de CBM's cuyo CBM es un módulo de unión a carbohidratos es decir (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, dicha secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de SEC ID NO:1 o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una identidad del 50% con las posiciones 34- 174 de la SEC ID NO:2 o (c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 bajo condiciones de astringencia media o (d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótido aislada dicha molécula de polinucleótido se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

En otros aspectos, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un segmento de ADN es decir p. ej. una molécula de polinucleótido de la invención; una célula que comprende el segmento de ADN o el vector de expresión, y un método para producir un polipéptido de CBM, dicho método comprende cultivar la célula bajo condiciones que permiten la producción del CBM, y recuperar el CBM del cultivo. El nuevo CBM de la presente invención es útil para lavado, tratamiento de textiles, purificación de polipéptidos, inmovilización de enzimas activas, modificación de material celulósico, panadería, fabricación de biocombustible, modificación de paredes celulares vegetales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a módulos de unión a carbohidratos no catalíticos (CBM) obtenibles del hongo Pseudoplectania nigrella y perteneciente a una familia nueva de CBM's fúngicos. El CBM de la invención fue descubierto en asociación con una proteína perteneciente a la familia 61 de las glicosil hidrolasas. El CBM de la invención es codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 y tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO: 2. Dicho CBM preferiblemente presenta afinidad de unión a celulosa. La presente invención se refiere a un método para producir CBM's de este tipo; y a métodos para usar CBM's de este tipo en aplicaciones de lavado, para tratamiento de textiles, purificación de polipéptidos, inmovilización de enzimas activas, modificación de material celulósico, panadería, fabricación de biocombustible, modificación de paredes celulares vegetales.

Los inventores han logrado la clonación y expresión de un CBM unido a una enzima de la familia GH61. Además, los inventores han expresado el dominio sólo, sin la enzima GH61 y han demostrado que el CBM sólo puede unirse a la celulosa. Por consiguiente, la invención se refiere a un CBM de una familia nueva de CBM's donde el CBM es (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, dicha secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, preferiblemente al menos 60% de identidad, más preferiblemente al menos un 70% de identidad, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 97% de identidad, más preferiblemente al menos 98% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 99% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1; (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 50% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2, más preferiblemente al menos un 60% de identidad, más preferiblemente al menos 70% de identidad, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 97% de identidad, más preferiblemente al menos 98% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 99% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2; (c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibrida a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 preferiblemente bajo condiciones de astringencia media, más preferiblemente al menos bajo condiciones de astringencia media/alta, más preferiblemente al menos bajo condiciones de astringencia alta, incluso más preferiblemente al menos bajo condiciones de astringencia muy alta; (d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótido aislado dicha molécula de polinucleótidos se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada preferiblemente bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

Hibridación

Condiciones adecuadas experimentales para determinar la hibridación a astringencia alta a muy alta entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica prehumedecer el filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridarse en 5 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) durante 10 min, y prehibridación del filtro en una solución de 5 X SSC, 5 x Solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989 supra), 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma del salmón desnaturalizado y sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989 supra), seguido de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda de cebado aleatorio (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13), marcada en 32P-DCTP (actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS a al menos 55ºC (astringencia baja), más preferiblemente al menos 60ºC (astringencia media), aún más preferiblemente al menos 65ºC (astringencia media/alta), incluso más preferiblemente al menos 70ºC (astringencia alta), e incluso más preferiblemente al menos 75ºC (astringencia muy alta).

Alineamiento e identidad de secuencias

Las secuencias de nucleótidos pueden ser alineadas con la aplicación AlignX del programa Vector NTI Suite 7.0 (Informax, un subsidiario de Invitrogen Inc.) usando los ajustes por defecto, que emplean un algoritmo ClustalW modificado (Thompson et al. (1994) Nuc. Acid Res. 22:4673-4680), la matriz de puntuación swgapdnarnt, una penalización por abertura de espacio de 15 y una penalización por extensión de espacio de 6.66.

Las secuencias de aminoácidos pueden ser alineadas con la aplicación AlignX del programa Vector NTI Suite v8 (Informax, un subsidiario de Invitrogen Inc) usando ajustes por defecto, que emplean un algoritmo modificado ClustalW (Thompson, et al. (1994) supra), la matriz de puntuación blosum62mt2, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.1.

En una investigación de Smith-Waterman (Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197), generalmente considerada muy sensible, dos proteínas registraron cierta similitud a nivel de los aminoácidos. El primero fue FIG2 de Saccharomyces cerevisiae (Swiss-Prot No. p25653). La puntuación de Smith-Waterman fue 162, y mostró un 28,7% de identidad sobre un recubrimiento de 143 pares de bases. Explicación de homología: tanto el CBM de la invención como FIG2 son muy ricos en treonina-serina. La región de similitud entre las dos proteínas está considerada altamente glicosilada en FIG2. Podría ser que las similitudes del modelo en esta región tuvieran más relación con la glicosilación que las similitudes funcionales reales. La segunda proteína que muestra cierta similitud fue una proteína hipotética de Arthrobacter nicotinovorans (SPTREMBL:Q8GAM3). La proteína tiene una puntuación Smith-Waterman de 138 y fue idéntica en un 30.5% en un recubrimiento de 128 aminoácidos. La homología es más bien baja en general. Es dudoso que estas dos proteínas estén bien evolucionalmente o funcionalmente relacionadas.

Tamaño y estructura 3D

El CBM de la invención tiene seis repeticiones de fenilalanina en una separación que de forma potencial las pondría en la misma superfície de una estructura de orden más alto tal como un beta barril o alfa hélice. Las estructuras tridimensionales de elementos representativos de las familias 1-6 de CBM, 9 y 15 han sido resueltos por cristalografía de rayos X y RMN y según Levy and Shoseyov (Biotechnology Advances 20 (2002) 191-213, los datos de estas estructuras indican que CBD de distintas familias son estructuralmente similares y que su capacidad para enlazar celulosa puede ser atribuida, al menos en parte, a varios aminoácidos aromáticos que componen su superficie hidrofóbica. Los presentes inventores en consecuencia desean señalar diferentes residuos de fenilalanina y su importancia para la capacidad del CBM de la invención para unirse a celulosa. A continuación hay subregiones del CBM con los residuos marcados:

VPNFTATDVPTFTATDIPTFTATDVPIFTKKPQQPS (posiciones 64-99 de SEC ID NO:2), y más lejos hacia el C-término SVSFVAKPSAFIPKPSA (posiciones 110-126 de la SEC ID NO:2).

El CBM expresado o polipéptido conteniendo CBM de la invención tiene un peso molecular (PM) que es igual a o superior a aproximadamente 15 kD en una forma no glicosilada. La mayoría de las proteínas que se unen a Avicel aparecieron como una banda ancha de peso molecular 35-45 kDa, que es considerablemente superior que el 15 kDa de la parte de la proteína del módulo de unión a carbohidratos. El peso molecular alto y heterogéneo es probablemente debido a la heterogeneidad en O y N-glicosilación de la parte N-terminal de la proteína. Para CBMX expresado heterólogamente en Aspergillus oryzae el tamaño de CBMX puede variar de 14 kDa hasta casi 70 kDa debido a glicosilación heteróloga de la proteína. Además, secuenciación N-terminal de la banda de 35-45 kDa dió exclusivamente la secuencia SFSSSGT (posiciones 47-53 de la SEC ID NO:9) indicando que la heterogeneidad en la secuencia de aminoácidos N-terminal no está presente.

Preferiblemente, el peso molecular del CBM de la invención en una forma no glicosilada es igual a o inferior a aproximadamente 70 kD, más preferiblemente igual a o inferior a 50 kD, más preferiblemente igual a o inferior a aproximadamente 40 kD o 30 kD, incluso más preferiblemente igual a o inferior a aproximadamente 25 kD, incluso más preferiblemente igual a o inferior a aproximadamente 20 kD, incluso más preferiblemente igual a o inferior a aproximadamente 15 kD.

Módulos de unión a carbohidratos

Aunque varios tipos de módulos de unión a carbohidratos han sido descritos en la patente y bibliografía científica, la mayoría de los mismos, muchos de los cuales derivan de enzimas celulolíticas, son comúnmente referidos como dominios de unión a la celulosa (CBD); un CBM típico será por lo tanto uno que se origina en una celulasa y que se enlaza preferentemente a celulosa y/o a fragmentos de poli o de oligosacáridos de la misma.

Los módulos de unión a celulosa (y de unión a otros carbohidratos) son secuencias de aminoácidos de polipéptidos que ocurren como partes íntegras de polipéptidos grandes o proteínas que consisten en dos o más regiones de secuencias de aminoácidos de polipéptidos, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) que normalmente comprenden un dominio catalítico que contiene el sitio activo para hidrólisis del sustrato y un dominio de unión a carbohidratos para unirse al sustrato de los carbohidratos en cuestión. Enzimas de este tipo pueden comprender más de un dominio catalítico y uno, dos o tres dominios de unión a carbohidratos, y pueden además comprender una o más regiones de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que enlazan el(los) dominio(s) de unión a carbohidratos con el dominio(s) catalítico, una región de este tipo normalmente se denomina un "enlazador".

En el complejo de proteínas, normalmente una enzima hidrolítica, un CBM está localizado bien en el terminal N o C o es interno. Un CBM monomérico normalmente consiste en más de aproximadamente 30 y menos de aproximadamente 250 residuos aminoácidos. Por ejemplo, un CBM clasificado en la familia I consiste en 33-37 residuos aminoácidos; un CBM clasificado en la familia IIa consiste en 95-108 residuos aminoácidos; y un CBM clasificado en la familia VI consiste en 85-92 residuos aminoácidos. Por consiguiente, el peso molecular de un CBM monomérico normalmente estará en la gama de aproximadamente 4 kD a aproximadamente 40 kD, y normalmente debajo de aproximadamente 35 kD. CBM's puede ser útil como un único polipéptido de dominio o como un dimero, un trímero, o un polímero; o como una parte de un híbrido de proteína.

Ejemplos de enzimas hidrolíticas que comprenden un módulo de unión a carbohidratos son celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas, amilasas, glucoamilasas, mutanasas y quitinasas. CBM's han sido mostrados para enlazarse con carbohidratos tales como celulosa, xilano, almidón, quitina, manano, beta-glucanos, mutano y ciclodextrinas. CBM's han sido descubiertos en plantas y algas, p. ej. en el alga rojo Porphyra purpurea en forma de una proteína de unión a polisacáridos no hidrolítica (véase Tomme et al. (1996) Cellulose-Binding Domains, Classification and Properties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, Saddler & Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618).

Lavado

La presente invención por lo tanto se refiere, entre otras cosas, a un proceso para eliminación o blanqueamiento de suciedad o manchas presentes en tejido celulósico o textil, donde el tejido o textil es puesto en contacto en medio acuoso con una enzima modificada (híbrido enzimático) que comprende una secuencia de aminoácidos catalíticamente (enzimáticamente) activos de una enzima no celulolítica enlazada a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, tales como un CBD.

Manchas

Suciedad o manchas que pueden ser eliminadas según la presente invención incluyen aquellas ya mencionadas arriba, es decir suciedad o manchas originadas de, por ejemplo, almidón, proteínas, grasas, vino tinto, fruta (tal como grosella negra, cereza, fresa o tomate, en particular salsa de tomate ketchup o de espaguetis), verduras (tal como zanahoria o remolacha), té, café, especies (tal como curry o pimentón), fluidos corporales, hierba, o tinta (p. ej. de bolígrafos o plumas estilográficas). Otros tipos de suciedad o manchas que son objetivos apropiados para eliminación o blanqueamiento conforme a la invención incluyen sebo, tierra (es decir, tierra), arcilla, aceite y pintura. Un proceso para eliminación o blanqueamiento de suciedad o manchas presentes en tejido celulósico está descrito en WO 97/28243. El proceso comprende contactar una tela con un medio acuoso que comprende una enzima modificada, dicha enzima es una secuencia de aminoácidos catalíticamente activa de una enzima no celulolítica que está enlazada a una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de unión a la celulosa.

Es un objeto de la presente invención el hecho de usar el CBM de la SEC ID NO:2 en un proceso para eliminación o blanqueamiento de suciedad o manchas presentes en tejido celulósico como se describe en WO 97/28243.

Tejido celulósico

El término "tejido celulósico" se destina a indicar cualquier tipo de tejido, en particular tejido tejido, obtenido a partir de un material conteniendo celulosa, tal como algodón, o de un material derivado de celulosa (preparado, p. ej., de pulpa de madera o de algodón).

En el contexto presente, el término "tejido" se destina a incluir prendas y otros tipos de tejidos procesados, y se usa de forma intercambiable con el término "tela".

Ejemplos de tejido celulósico fabricado a partir de fibra celulósica de origen natural son algodón, ramio, yute y tejido de lino. Ejemplos de tejidos celulósicos hechos de fibras celulósicas artificiales son tejidos de viscosa (rayón) y liocel (p. ej. TencelTM); también son relevantes en el contexto de la invención todas las mezclas de fibras celulósicas (tales como viscosa, liocel, algodón, ramio, yute o lino) con otras fibras, p. ej. con fibras de pelo animal tal como lana, alpaca o pelo de camello, o con fibras poliméricas tales como fibras de poliéster, poliacrílicas, de poliamida o de poliacetato.

Ejemplos específicos de tejido celulósico mezclado son mezclas de viscosa/algodón, mezclas de liocel/algodón (p. ej. mezclas de Tencel^{TM}/algodón ), mezclas de viscosa/lana, mezclas de liocel/lana, mezclas de algodón/lana, mezclas de algodón/poliéster, mezclas de viscosa/algodón/poliéster, mezclas de lana/algodón/poliéster, y mezclas de lino/algodón.

Híbridos enzimáticos

Números de clasificación enzimática (números EC) a los que se hace referencia en la presente solicitud de patente son conformes a las Recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, Academic Press Inc., 1992.

Una enzima modificada (híbrido enzimático) para el uso conforme a la invención comprende una secuencia de aminoácidos enzimáticamente activa de una enzima no celulolítica (es decir, una secuencia de aminoácidos catalíticamente activa de una enzima distinta de una celulasa) útil en relación con la limpieza de tejido o textil, normalmente la eliminación o blanqueamiento de suciedad o manchas de tejidos o textiles en procesos de lavado. Enzimas preferidas son seleccionadas del grupo que consiste en amilasas (p. ej. \alpha-amilasas, EC 3.2.1.1), proteasas (es decir, peptidasas, EC 3.4), lipasas (p. ej. lipasas de triacilglicerol, EC 3.1.1.3) y oxidorreductasas (p. ej. peroxidasas, EC 1.11.1, tales como aquellas clasificadas bajo EC 1.11.1.7; u oxidasas oxidantes de fenol, tales como lacasas, EC 1.10.3.2, u otras enzimas clasificadas bajo EC 1.10.3), fusionadas (enlazadas) a una secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a celulosa. La secuencia de aminoácidos catalíticamente activa en cuestión puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos entera total, o sustancialmente entera de la de la enzima madura en cuestión, o puede consistir en una parte de la secuencia entera que retiene sustancialmente las mismas propiedades enzimáticas que la secuencia entera.

Enzimas modificadas del tipo en cuestión, al igual que descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, son conocidas en la técnica (véase, p. ej., WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782). Éstas pueden ser preparadas transformando en una célula huésped un constructo de ADN comprendiendo al menos un fragmento de ADN que codifica el CBM ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica la enzima de interés, y creciendo la célula huésped transformada para expresar el gen fusionado. Un tipo de producto recombinante (híbrido enzimático), pertinente pero no limitativo, obtenible de esta manera, frecuentemente referido en la técnica como una "proteína de fusión", puede ser descrito por una de las siguientes fórmulas generales:

A-CBM-MR-X-B

A-X-MR-CBM-B

En estas fórmulas, CBM es una secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos el módulo de unión a carbohidratos (CBM) per se.

MR (la región media; un enlazador) puede ser una unión, o un grupo de enlace comprendiendo de 1 a aproximadamente 100 residuos aminoácidos, en particular de 2 a 40 residuos aminoácidos, p. ej. de 2 a 15 residuos aminoácidos. MR puede, en principio, de forma alternativa ser un enlazador no aminoácido.

X es una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia mencionada arriba, enzimáticamente activa de residuos aminoácidos de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que codifica la enzima no celulolítica de interés.

Las fracciones A y B son independientemente opcionales. Cuando están presentes, una fracción A o B constituye una extensión terminal de una fracción CBM o X, y normalmente comprende uno o más residuos aminoácidos.

Por lo tanto, entre otras cosas, será aparente a partir de lo anterior que un CBM en un híbrido enzimático del tipo en cuestión puede ser posicionado C-terminalmente, N-terminalmente o internamente en el híbrido enzimático. Correspondientemente, una fracción X en un híbrido enzimático del tipo en cuestión puede ser situada N-terminalmente, C-terminalmente o internamente en el híbrido enzimático.

Híbridos enzimáticos de interés en el contexto de la invención incluyen híbridos enzimáticos que comprenden más de un CBM, p. ej. de manera que dos o más CBM's se enlacen directamente entre sí, o se separen entre sí mediante secuencias de separador o de enlazador, que consisten normalmente de una secuencia de residuos aminoácidos de longitud apropiada. Dos CBM's en un híbrido enzimático del tipo en cuestión pueden, por ejemplo, también ser separados entre sí mediante una fracción MR-X tal como se ha definido anteriormente.

Una cuestión muy importante en la construcción de híbridos enzimáticos del tipo en cuestión es la estabilidad hacia la degradación proteolítica. Proteínas de bi y multi-dominio son particularmente susceptibles hacia el seccionamiento proteolítico de regiones del enlazador que conectan los dominios. Las proteasas que provocan este seccionamiento pueden, por ejemplo, ser subtilisinas, que son conocidas por presentar frecuentemente amplias especificidades de sustrato (véase, p. ej.: Grøn et al. (1992) Biochemistry 31:6011-6018 ; Teplyakov et al. (1992) Protein Engineering 5:413-420).

La glicosilación de residuos del enlazador en eucariotas es una de las vías de la naturaleza para prevenir la degradación proteolítica. Otra es emplear aminoácidos que son menos favorecidos por las proteasas circundantes. La longitud del enlazador también juega un papel con respecto a la accesibilidad por proteasas. Qué "solución" es óptima depende del entorno donde el híbrido enzimático debe funcionar. Cuando se construyen moléculas de híbridos enzimáticos nuevas, la estabilidad del enlazador por lo tanto se vuelve un asunto de gran importancia.

Celulasas (genes de celulasa) útiles para la preparación de CBM's

Técnicas adecuadas para aislar un gen de celulasa son conocidas en la técnica. En el contexto presente, los términos "celulasa" y "enzima proteolítica" se refieren a una enzima que cataliza la degradación de celulosa a glucosa, celobiosa, triosa y/u otros celo-oligosacáridos.

Celulasas preferidas (es decir, celulasas comprendiendo CBM's preferidos) en el contexto presente son celulasas microbianas, particularmente celulasas bacterianas o fúngicas. Endoglucanasas, sobre todo endo-1,4-\beta-glucanasas (EC 3,2,1,4), particularmente monocomponentes (recombinantes) endo-1,4-\beta-glucanasas, son una clase preferida de celulasas.

Ejemplos útiles de celulasas bacterianas son celulasas derivadas de o producibles por bacterias del grupo que consiste en Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Clostridium, Microspora, Thermotoga, Caldocellum y Actinomycetes tales como Streptomyces, Termomonospora y Acidothemus, en particular del grupo que consiste en Pseudomonas cellulolyticus, Bacillus lautus, Cellulomonas fimi, Clostridium Thermocellum, Microspora bispora, Termomonospora fusca, Termomonospora cellulolyticum y Acidothemus cellulolyticus.

La celulasa puede ser una celulasa ácida, neutra o alcalina, es decir presentando un máximo actividad celulolítica en la gama ácida, neutra o alcalina, respectivamente.

Una celulasa útil es una celulasa ácida, preferiblemente una celulasa ácida fúngica, que es derivada de o producible por hongos del grupo de géneros que consisten en Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Phanaerochaete, Neurospora, Neocallimastix y Botrytis.

Una celulasa ácida preferida es una derivada de o producible por hongos del grupo de especies que consisten en Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Myrothecium verrucaria, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Phanaerochaete chrysosporium, Neurospora crassa, Neocallimastix partriciarum, Pseudoplectania nigrella y Botrytis cinerea.

Otra celulasa útil es una celulasa neutra o alcalina, preferiblemente una celulasa fúngica neutra o alcalina, que está derivada de o es producible por hongos del grupo de géneros que consisten en Aspergillus, Penicillium, Myceliophthora, Humicola, Irpex, Fusarium, Stachybotrys, Scopulariopsis, Chaetomium, Mycogone, Verticillium, Myrothecium, Papulospora, Gliocladium, Cephalosporium, Pseudoplectania nigrella y Acremonium.

Una celulasa preferida alcalina es una derivada de o producible por hongos del grupo de especies que consisten en Humicola insolens, Fusarium oxysporum, Myceliopthora thermophila, Penicillium janthinellum y Cephalosporium sp., preferiblemente del grupo de especies que consisten en Humicola insolens DSM 1800, Fusarium oxysporum DSM 2672, Myceliopthora thermophila CBS 117.65, y Cephalosporium sp. RYM-202.

Otros ejemplos de celulasas útiles son variantes de celulasas madres de origen fúngico o bacteriano, p. ej. variantes de una celulasa madre derivable de una cepa de una especie dentro de uno de los géneros fúngicos de Humicola, Trichoderma o Fusarium.

Enzimas amilolíticas

Amilasas (p. ej. \alpha- o \beta-amilasas) que son apropiadas como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes modificados química o genéticamente de amilasas de este tipo están incluidos a este respecto. \alpha-amilasas pertinentes incluyen, por ejemplo, \alpha-amilasas obtenibles de especies de Bacillus, en particular una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1296839. Amilasas pertinentes comercialmente disponibles incluyen Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® y BAN® (todas disponibles por Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), y Rapidase^{TM} y Maxamyl^{TM} P (disponible por DSM, Holanda).

Otras enzimas amilolíticas útiles son C GTasas (ciclodextrina glucanotransferasas, E C 2.4.1.19), p. ej. aquellas obtenibles de especies de Bacillus, Thermoanaerobactor o Thermoanaero-bacteria.

Enzimas proteolíticas

Proteasas (peptidasas) que son apropiadas como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen aquellos de origen animal, vegetal o microbiano. Proteasas de origen microbiano son preferidas. Mutantes modificados química o genéticamente de proteasas de este tipo son incluidos a este respecto. La proteasa puede ser una serina proteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270.

Enzimas proteásicas pertinentes disponibles comercialmente incluyen Alcalase®, Savinase® y Esperase® (todos disponibles de Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), Maxatase^{TM}, Maxacal^{TM}, Maxapem^{TM} y Properase^{TM} (disponible de DSM, Holanda), Purafect^{TM} y Purafect^{TM} OXP (disponible por Genencor International, USA), y Opticlean^{TM} y Optimase^{TM} (disponible por Solvay Enzymes).

Enzimas lipolíticas

Enzimas lipolíticas (lipasas) que son apropiadas como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen aquellos de origen bacteriano o fúngico. Mutantes modificados química o genéticamente de lipasas de este tipo son incluidos a este respecto.

Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa de Humicola lanuginosa, p. ej. como se describe en EP 258 068 y EP 305 216; una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej. como se describe en EP 238 023; una lipasa de Candida, tal como una lipasa de C. antarctica, p. ej. la lipasa A o B de C. antarctica o descrita en EP 214 761; una lipasa de Pseudomonas, tal como una de aquellas descritas en EP 721 981 (p. ej. una lipasa obtenible de una cepa SD705 de Pseudomonas sp. que tiene el número de acceso de depósito FERM BP-4772), en PCT/JP96/00426, en PCT/JP96/00454 (p. ej. una lipasa de P. solanacearum), en EP 571 982 o en WO 95/14783 (p. ej. una lipasa de P. mendocina), una lipasa de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes, p. ej. como se describe en EP 218 272, una lipasa de P. cepacia, p. ej. como se describe en EP 331 376, una lipasa de P. stutzeri, p. ej. como se describe en GB 1,372,034, o una lipasa de P. fluorescens; una lipasa de Bacillus, p. ej. una lipasa de B. subtilis (Dartois et al. (1993) Biochemica et Biophysica Acta 1131: 253-260), una lipasa de B. stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B. pumilus (WO 91/16422).

Además, varias lipasas clonadas pueden ser útiles, incluyendo la lipasa de Penicillium camembertii descrita por Yamaguchi et al. (1991) en Gene 103:61-67, la lipasa de Geotricum candidum (Schimada et al. (1989) J. Biochem. 106:383-388), y diferentes lipasas de Rhizopus tales como una lipasa de R. delemar (Hass et al. (1991) Gene 109:117- 113), una lipasa de R. niveus (Kugimiya et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719) y una lipasa de R. oryzae.

Otros tipos útiles de forma potencial de enzimas lipolíticas incluyen cutinasas, p. ej. una cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina como se describe en WO 88/09367, o una cutinasa derivada de Fusarium solani f. pisi (descrita, p. ej., en WO 90/09446).

Lipasas adecuadas comercialmente disponibles incluyen Lipolase® y Lipolase Ultra® (disponible por Novozymes A/S), M1 Lipase^{TM}, Lumafast^{TM} y Lipomax^{TM} (disponible por DSM, Holanda) y Lipase P "Amano" (disponible por Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).

Oxidorreductasas

Oxidorreductasas que son apropiadas como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen peroxidasas (EC 1.11.1) y oxidasas, tales como lacasas (EC 1.10.3.2) y determinadas enzimas relacionadas.

Peroxidasas

Peroxidasas (EC 1.11.1) son enzimas que actúan en un peróxido (p. ej. peróxido de hidrógeno) como aceptor. Peroxidasas muy adecuadas son aquellas clasificadas bajo EC 1.11.1.7, o cualquier fragmento derivado de las mismas, presentando actividad peroxidasa. Derivados sintéticos o semisintéticos de los mismos (p. ej. con sistemas de anillo de porfirina, o microperoxidasas, cf., por ejemplo, US 4,077,768, EP 537 381, WO 91/05858 y WO 92/16634) pueden también ser de valor en el contexto de la invención.

Peroxidasas muy adecuadas son peroxidasas obtenibles de plantas (p. ej. peroxidasa de rábano o peroxidasa de soja) o de microorganismos, tales como hongos o bacterias. En este aspecto, algunos hongos preferidos incluyen cepas de la subdivisión Deuteromycotina, de clase Hyphomycetes, p. ej. Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium o Dreschlera, en particular Fusariumoxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichodemma resii, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia allí o Dreschlera halodes.

Otros hongos preferidos incluyen cepas pertenecientes a la subdivisión Basidiomycotina, de clase Basidiomycetes, p. ej. Coprinus, Phanerochaete, Coriolus o Trametes, en particular Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (e.g. NA-12) o Trametes versicolor (e.g. PR4 28-A).

Otros hongos preferidos incluyen cepas de la subdivisión Zygomycotina, de clase Mycoraceae, p. ej. Rhizopus o Mucor, en particular Mucor hiemalis.

Algunas bacterias preferidas incluyen cepas del orden Actinomycetales, p. ej. Streptomyces spheroides (ATTC 23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) o Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium.

Otras bacterias preferidas incluyen Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) o Pseudomonas fluorescens (NRRL B-11).

Otras bacterias preferidas incluyen cepas de Myxococcus, p. ej. M. virescens.

Otras fuentes potenciales de peroxidasas útiles particulares son catalogadas en Saunders et al. (1964) Peroxidase, 41-43 Londres.

La peroxidasa puede además ser una que es producible por un método comprendiendo el cultivo de una célula huésped - transformada con un vector de ADN recombinante que lleva una secuencia de ADN que codifica dicha peroxidasa al igual que las funciones codificantes de las secuencias de ADN que permiten la expresión de la secuencia de ADN que codifica la peroxidasa - en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión de la peroxidasa, y la recuperación de la peroxidasa del cultivo.

Una peroxidasa producida por recombinación adecuada es una peroxidasa derivada de Coprinus sp., en particular C. macrorhizus o C. cinereus según WO 92/16634, o una variante de las mismas, p. ej. una variante como se describe en WO 94/12621.

Oxidasas y enzimas relacionadas

Oxidasas preferidas en el contexto de la presente invención son oxidasas clasificadas bajo EC 1.10.3, que son oxidasas que utilizan oxígeno molecular como un aceptor (es decir, enzimas que catalizan reacciones de oxidación donde el oxígeno molecular funciona como agente oxidante).

Como se ha indicado anteriormente, las lacasas (EC 1.10.3.2) son oxidasas muy adecuadas en el contexto de la invención. Ejemplos de otras oxidasas útiles en el contexto de la invención incluyen las oxidasas de catecol (EC 1.10.3.1) y oxidasas de bilirrubina (EC 1.3.3.5). Además, enzimas útiles relacionadas incluyen monofenol monooxigenasas (EC 1.14.18.1).

Las lacasas son obtenibles de una variedad de plantas y fuentes microbianas, sobre todo de bacterias y hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), y ejemplos adecuados de lacasas son descubiertos entre aquellos obtenibles de hongos, incluyendo lacasas obtenibles de cepas de Aspergillus, Neurospora (p. ej. N. crassa) Podospora, Botrytis, Collybia, Forres, Lentinus, Pleurotus, Trametes (p.ej. T. villosa o T. versicolor [algunas especies/cepas de Trametes siendo conocidas por diferentes nombres y/o han sido clasificadas previamente dentro de otros géneros; p. ej. Trametes villosa = T. pinsitus = Poliporus pinsitis (también conocidas como P. pinsitus o P. villosus) = Coriolus pinsitus], Polyporus, Rhizoctonia (p.ej. R. solani), Coprinus (e.g. C. plicatilis o C. cinereus), Psatyrella, Myceliophthora (p.ej. M. thermophila), Schytalidium, Phlebia (p. ej. P. radita; véase WO 92/01046), Coriolus (p. ej. C. hirsutus; véase JP 2-238885), Pyricularia o Rigidoporus.

Lacasas preferidas en el contexto de la invención incluyen lacasa obtenible de especies/cepas de Trametes (p. ej. T. villosa), Myceliophthora (p. ej. M. thermophila), Schyitalidium o Poliporus.

Otras enzimas

Otras clases de enzimas que son apropiadas como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la presente invención incluyen pectinasas tales como pectato liasa (EC 4,2,2,2), pectina liasa (EC 4,2,2,10), ramnogalacturonano liasa (EC no definida), endo-1,4-galactanasa (EC 3,2,1,89), xiloglucanasa (EC no definida), xilanasa (EC 3,2,1,8), arabinanasa (EC 3,2,1,99), alfa-L-arabinofuranosidasa (EC 3,2,1,55), manano endo-1,4-manosidasa (EC 3,2,1,78), beta-manosidasa (EC 3,2,1,25), beta-1,3-1,4-glucanasa (EC 3,2,1,73), ramnogalacturonano hidrolasa, sialidasa poligalacturonasa (EC 3,2,1,67), ramnogalacturonasa (EC no definida) celulasa (EC 3,2,1,4), glucano 1,3-beta-glucosidasa (EC 3,2,1,58), Liqueninasa (EC 3,2,1,73), glucano endo-1,6-beta-glucosidasa (EC 3,2,1,75), manano endo-1,4-beta-manosidasa (EC 3,2,1,78), endo-1,4-beta-xilanasa (EC 3,2,1,8), celulosa 1,4-celobiosidasa (EC 3,2,1,91), celobiohidrolasa (EC 3,2,1,91). (poligalacturonasas (EC 3,2,1,15). Enzimas acetil y metil esterasas tales como: metil ramnogalacturonano esterasa, ramnogalacturonano acetil esterasa, pectina metilesterasa (EC 3,1,1,11), pectina acetilesterasa (EC no definida), xilano metil esterasa, xilano acetil esterasa (EC 3,1,1,72), feruloil esterasa (EC 3,1,1,73), cinamoil esterasa (EC 3,1,1,73).

Detergentes

El CBM de la invención puede ser añadido a un detergente para lavar textil, tal como un detergente de lavado o un detergente para lavar superficies duras, tal como un detergente de lavavajillas. Una composición detergente que comprende el CBM de la invención pueden además comprender una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, celulasas (endo-glucanasas), beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, alfa-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, otras mananasas, pectina metilesterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas de las mismas.

Además, una composición detergente conforme a la invención puede contener componentes detergentes comunes tales como por ejemplo un tensioactivo, un constructor, un blanqueador, un supresor de espuma como se describe en WO 99/27082.

Tratamiento de textiles

Durante la tejedura de los tejidos, los hilos son expuestos a tensión mecánica considerable. Para prevenir la rotura, estos son normalmente reforzados mediante el revestimiento (encolado) con una sustancia gelatinosa llamada "cola".

El agente de encolado más común es almidón en forma nativa o modificada. No obstante, otras sustancias poliméricas, por ejemplo poli-vinilalcohol (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), ácido poliacrílico (PAA) o derivados de celulosa [p. ej. carboxi-metilcelulosa (CMC), hidroxietilcelulosa, hidroxipropil celulosa o metilcelulosa] pueden también ser abundantes en la cola. Cantidades pequeñas de, p. ej., grasas o aceites pueden también ser añadidos a la cola como un lubricante.

Como consecuencia de la presencia de cola, los hilos del tejido no son capaces de absorber agua, agentes de acabado u otras composiciones (p. ej. composiciones de blanqueamiento, coloración o resistentes a las arrugas) a un grado suficiente. El acabado uniforme y duradero del tejido puede así ser conseguido sólo después de la eliminación de la cola del tejido; un proceso de eliminación de cola para este propósito es conocido como un proceso de "desencolado".

En casos donde la cola comprende un almidón, el tratamiento de desencolado puede ser realizado usando una enzima degradadora de almidón (p. ej. una amilasa). En casos donde la cola comprende grasa y/o aceite, el tratamiento de desencolado puede comprender el uso de una enzima lipolítica (una lipasa). En casos donde el tamaño comprende una cantidad significante de carboximetilcelulosa (CMC) u otros derivados de celulosa, el tratamiento de desencolado puede ser realizado con una enzima celulolítica, bien sola o en combinación con otras sustancias, opcionalmente en combinación con otras enzimas, tales como amilasas y/o lipasas.

Es un objeto de la presente invención conseguir un rendimiento de la enzima mejorada bajo condiciones de desencolado modificando la enzima para alterar (aumentar) la afinidad de la enzima al tejido celulósico, por lo cual la enzima modificada entra en contacto más cercano con el agente de encolado en cuestión.

La presente invención por tanto se refiere, entre otras cosas, a un proceso para desencolar tejido celulósico o textil, donde el tejido o textil es tratado (normalmente contactado en medio acuoso) con una enzima modificada (híbrido enzimático) que comprende una secuencia de aminoácidos catalíticamente (enzimáticamente) activa de una enzima, en particular de una enzima no celulolítica, enlazada a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos, tal como el CBM de la SEC ID NO: 2. Este proceso está descrito con más detalle en WO 97/28256.

El término "desencolado" se destina a ser entendido en una manera convencional, es decir la eliminación de un agente de encolado del tejido.

Descrudado

El proceso de descrudado retira material no celulósico de la fibra de algodón, especialmente la cutícula (que consiste principalmente en ceras) y pared celular primaria (que consiste principalmente en pectina, proteína y xiloglucano) antes del blanqueamiento y coloración del textil. Una eliminación de cera apropiada es necesaria para obtener una alta humectabilidad, siendo una medida para obtener una buena coloración. La eliminación de la pared celular primaria mejora la eliminación de la cera y asegura una coloración aún mayor. Además esto mejora la blancura en el proceso de blanqueamiento.

Los CBM's de familia CBM1 son conocidos por meterse en celulosa cristalina como expansinas y swoleninas, y ayudan en la liberación de componentes sin celulosa o contaminantes de textiles. La accesibilidad del colorante puede ser aumentada tratando el textil con CBM's. Los CBM's de la invención tienen propiedades similares a los CBM's de familia CBM1. Por consiguiente, los CBM's de la invención pueden ser usados para eliminar material no celulósico de la fibra de algodón en el proceso de descrudado.

Marcas de afinidad

CBM's que se unen reversiblemente a carbohidratos son útiles para separación y purificación de polipéptidos meta. CBM's de familia 1 se unen reversiblemente a celulosa cristalina y son marcas útiles para cromatografía de afinidad.

Es un objeto de la presente invención de conseguir separación mejorada y purificación de polipéptidos objetivo usando CBM's como marcas de afinidad como se describe por Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-533 y US 5,670,623.

Inmovilización de moléculas

Algunos CBM's se unen irreversiblemente a celulosa y pueden ser usados para inmovilización de moléculas tales como metalotioneínas, fitoquelatinas o enzimas. Tal inmovilización es útil en p. ej. eliminación de contaminaciones de metales pesados del medio ambiente, donde los iones de metales pesados se enlazan con biosorbentes de polipéptidos tales como metalotioneínas o fitoquelatinas, y el complejo de metal pesado-biosorbente-CBM es irreversiblemente inmovilizado por la unión del CBM a un material de carbohidrato (Xu et al. (2002) Biomacromolecules 3:462-465. Es un objeto de la presente invención conseguir la inmovilización de moléculas tales como metalotioneínas, fitoquelatinas o enzimas usando el CBM de la SEC ID NO:2 como proteínas de fusión. Además, un método para eliminar contaminantes tales como metales pesados del medio ambiente, por inmovilización con CBM's es un objeto de la presente invención.

Conjugados de CBM

Un conjugado de dominio de unión a carbohidratos, tal como un conjugado de CBD, comprende al menos dos CBD fijados a un polisacárido. El polisacárido puede ser capaz de unirse a celulosa, y es convenientemente goma garrofin. Los conjugados de CBD son capaces de aumentar la resistencia de material celulósico tal como tejido reticulando fibras como se describe en GB 2376017 de Unilever. Es un objeto de la presente invención aumentar la resistencia y desgaste del tejido reticulando fibras usando el CBM de la SEC ID NO:2.

Los conjugados de CBD pueden también ser usados como vehículos de entrega para depositar materiales en textiles en cualquier fase del proceso de lavado. Esta aplicación última puede ser conseguida por el revestimiento del agente de beneficio, bien directamente por medios químicos o indirectamente por medio de un compuesto asociado al agente de beneficio p. ej. una cápsula como se describe en GB 2376017 de Unilever. Ejemplos de estos agentes de beneficio son agentes suavizantes, agentes de acabado, agentes protectores, fragancias tales como perfumes y agentes blanqueadores.

Ejemplos de agentes suavizantes son arcillas, agentes tensioactivos catiónicos o compuestos de silicio. Ejemplos de agentes de acabado y agentes de protección son lubricantes poliméricos, agentes antisuciedad, agentes de liberación de suciedad, agentes fotoprotectores tales como pantallas solares, agentes anti-estáticos, agentes de fijación de colorante, agentes anti-bacterianos y agentes anti-fúngicos. Las fragancias o perfumes pueden ser encapsulados, p. ej. en látex o microcápsulas o coacervatos basados en gelatina. Es un objeto de la presente invención usar el CBM de la SEC ID NO:2 como un vehículo de entrega para depositar materiales sobre los textiles en el proceso de lavandería.

Panadería

Se sabe que la adición de CBM's a xilanasas o amilasas u otras enzimas activas de panadería, puede suponer un mejor rendimiento en procesos de panadería que las enzimas sin CBM's. En WO 98/16112 se describe cómo enzimas de antiendurecimiento tales como enzimas amilolíticas fueron fusionadas a un CBD y usadas para retardar el endurecimiento y envejecimiento del pan horneado. Es un objeto de la presente invención fusionar el CBM de la SEC ID NO:2 con enzimas amilolíticas y usarlo para retardar el endurecimiento y envejecimiento del pan horneado como se describe en WO 98/16112.

Uso de CBM's para la producción de bioetanol

Etanol puede ser producido de desechos agrícolas o biomasa (biocombustible). Los componentes convertibles de etanol de muchos tipos de biomasa (por ejemplo, rastrojos de maíz, pulpa de madera y paja de trigo) consiste ampliamente en celulosa cristalina. Celulosa cristalina es naturalmente resistente a la degradación enzimática porque las fibrillas de celulosa son envueltas de forma ajustada entre sí creando así un problema de accesibilidad para enzimas degradadoras de celulosa. Varios métodos para abrir la estructura de celulosa cristalina en biomasa están siendo investigados: pretratamiento ácido con explosión de vapor es un método bien estudiado (Bura et al. (2002) Appl Biochem Biotechnol. 98-100:59-72). Oxidación húmeda es otro método descrito por Naito et al. (2001) Journal of Chemical Engineering of Japan, 34(12)1545-1548.

Hay una clara evidencia de que los dominios de unión a celulosa solos pueden alterar las características de celulosa cristalina (Shoseyov et al. (2002) Proceedings of the 223th American Chemical Society National Meeting. Orlando Florida, EEUU. Es un objeto de la presente invención usar el CBM de la invención para rotura de la naturaleza microcristalina de las microfibrillas de celulosa encontradas en la biomasa para la producción de biocombustible para aumentar la accesibilidad de enzimas degradadoras de celulosa a la biomasa.

Modificación de paredes celulares vegetales

Mediante la introducción de un gen que codifica un CBM tal como un CBD en plantas o microorganismos es posible expresar proteínas de CBD dentro de la pared celular del microorganismo o tejido vegetal. Las proteínas de CBD han sido mostradas para enlazarse con fibras de celulosa recién sintetizadas en paredes celulares vegetales, y esta interferencia físico- mecánica desacopla la síntesis de celulosa por las subunidades de los complejos de enzima celulosa sintasa. Esto resulta en un nivel aumentado de síntesis del polímero de celulosa, calidades poliméricas mejoradas y biomasa mejorada. El nivel aumentado de síntesis de celulosa en la pared celular conduce a una producción de celulosa mejorada, biomasa superior en el nivel de la planta, propiedades de fibra mejorada y pueden aumentar la resistencia a la tensión biótica y abiótica. Un gen de codificación de CBD puede ser insertado en especies de silvicultura de madera dura y pueden ser demostrados aumentos de volumen sustancial posteriores con mejoras en la densidad de la madera y propiedades de la fibra. Estas mejoras llevarán a término el papel final, presentando índices mejorados de tensión, de desgarre y reventón (US 6,184,440).

Es un objeto de la presente invención insertar la secuencia de ADN que codifica la SEC ID NO:1 en una planta para alterar las membranas celulares de dicha planta, dando como resultado crecimiento y biomasa mejorados, producción de celulosa aumentada, propiedades de fibra mejorada, digestibilidad mejorada por el ganado, y propiedades de rendimiento aumentadas como se describe en US 6,184,440.

Composición de CBM

Cuando se usa para las aplicaciones anteriormente descritas, el CBM de la invención puede formar parte de una composición hecha para la aplicación específica. Componentes adicionales en composiciones de este tipo comprenden un compuesto portador, y una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, celulasas, beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, alfa-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, otras mananasas, pectina metilesterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas de las mismas.

Expresión del CBM de la invención Constructos de ácidos nucleicos comprendiendo secuencias de nucleótidos

La presente invención se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de la invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un CBM de la invención puede ser manipulada en una variedad de vías para proporcionar la expresión del CBM. Manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinantes son bien conocidos en la técnica.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales, que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y pueden ser obtenidos de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y gen beta-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al. (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al. (1983) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American (1980) 242:74-94 ; y en Sambrook et al. (1989) supra.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa ácido estable de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, promotores útiles son obtenidos de los genes para enolasa (ENO- 1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al. (1992) Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control puede también ser una secuencia del terminador de la transcripción adecuado, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el CBM. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención. Terminadores preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al. (1992) supra.

La secuencia de control puede también ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia guía que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención. Líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Secuencias líderes adecuadas para células huéspedes de levadura son obtenidas de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de nucleótidos y que, cuando es transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman (1995) Molecular Cellular Biology 15:5983-5990.

La secuencia de control puede también ser una región de codificación del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el CBM codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una región codificante del péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el CBM segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es extranjera a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal extranjera puede ser requerida cuando la secuencia codificante no contiene naturalmente una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal extranjera puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para aumentar la secreción del CBM. No obstante, cualquier región codificante del péptido señal que dirige el CBM expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención. La región codificante del péptido señal nativo del CBM de la presente invención es nucleótidos 10 a 69 de la SEC ID NO:1 que codifican los aminoácidos 1 a 20 de SEC ID NO:2.

Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Péptidos señales adicionales están descritos por Simonen y Palva (1993) Microbiological Reviews 57:109-137.

Regiones codificantes del péptido señal eficaces para células huéspedes filamentosas fúngicas son las regiones codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, lipasa de Candida antarctica y lipasa de Humicola lanuginosa.

Péptidos señales útiles para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes del péptido señal útiles están descritas por Romanos et al. (1992) supra.

La secuencia de control puede también ser una región codificante del propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un CBM. El polipéptido resultante puede ser denominado un pro-CBM o propolipéptido. Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido a un polipéptido maduro activo por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido puede ser obtenida de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Cuando tanto el péptido señal como las regiones del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

En levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 pueden ser usados. En hongos filamentosos, el promotor TAKA de alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser usados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato-reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido sería operativamente enlazada con la secuencia reguladora.

Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden el constructo de ácidos nucleicos de la invención. Los diferentes nucleótidos y secuencias de control anteriormente descritos pueden ser unidos entre sí para producir un vector de expresión recombinante, que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir para la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en estos sitios. De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser expresada mediante la inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante está localizada en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueden provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial.

El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que al introducirse en la célula huésped, es integrado en el genoma y replicado con el(los) cromosoma(s) donde ha sido integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón puede ser usado.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a los biocidas o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a los antibióticos tal como resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa),niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Preferido para el uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de nucleótidos adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped a una(s) ubica-
ción(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración a una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de nucleótidos, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible 800 a 1.500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia blanco correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. En cambio, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 permitiendo la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAM81 permitiendo la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que haga su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, p. ej., Ehrlich (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

Más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Un aumento en el número de copias de la secuencia de nucleótidos puede ser obtenido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de nucleótidos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto las copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, pueden ser seleccionadas cultivando las células en la presencia del agente apropiado seleccionable. Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por un experto en la técnica (véase p. ej. Sambrook et al. (1989) supra).

Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos, nucleicos

La presente invención también se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención, que son ventajosamente usados en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se ha descrito anteriormente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, tal como un microorganismo procariota o uno no unicelular, tal como un eucariota. Células unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero no limitadas a, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis. En otra forma de realización preferida, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación del protoplasto (véase, p. ej., Chang y Cohen (1979) Molecular General Genetics 168:111-115 ), usando células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizin (1961) Journal of Bacteriology 81:823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson (1971) Journal of Molecular Biology 56:209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower (1988) Biotechniques 6:742- 751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne (1987) Journal of Bacteriology 169:5771-5778).

La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o fúngica. En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al. (1995) En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a Edición, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que el Oomycota (como se cita en Hawkswort et al. (1995) supra) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al. (1995) supra). En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporogénea (Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura de los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biología y Actividades de la Levadura (Skinner, Passmore and Davenport, eds, (1980) Soc. App. Bacteriol. Serie de simposio
nº. 9).

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia. En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromices lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

En otra forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula micótica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al. (1995) supra. Los hongos filamentosos son caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de una especie de, pero sin limitarse a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En una forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En una forma de realización incluso más preferida, la célula madre filamentosa fúngica es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov. tal como Fusarium venenatum depositada bajo Nos. CBS 458.93, CBS 127.95, CBS 128.95, CBS 148.95). En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de protoplastos, y la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al. (1984) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium están descritos por Malardier et al. (1989) Gene 78:147-156 y WO 9 6/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson y Simon, eds, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194:182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al. (1983) Journal of Bacteriology 153:163 ; y Hinnen et al. (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920.

Procesos para preparar CBM's funcionales

La presente invención también se refiere a métodos para producir un CBM de la presente invención comprendiendo (a) cultivar una cepa, que en su forma de tipo salvaje sea capaz de producir el CBM; y (b) recuperar el CBM. Preferiblemente, la cepa es un hongo, más preferiblemente del género Humicola, particularmente Humicola insolens o Coprinus, tal como Coprinus cinereus o Thielavia tal como Thielavia terrestris o Aspergillus tal como Aspergillus oryzae.

La presente invención también se refiere a un método para la producción de un polipéptido de CBM, el método que incluye las etapas de

- crecer bajo condiciones para sobreproducir CBM's en un células huéspedes de Aspergillus de un medio nutritivo que han sido transformadas con un cassette de expresión que incluye, como componentes unidos operativamen-
te,

a)

una región reguladora de iniciación transcripcional y traduccional,

b)

una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de CBM,

c)

una región reguladora de la terminación transcripcional y traduccional, donde las regiones reguladoras son funcionales en el huésped, y

d)

un gen marcador de la selección para selección de células huéspedes transformadas; y recuperación del polipéptido de CBM.

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En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del CBM usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en matraz vibrante, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en flujo discontínuo, o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el CBM es segregado en el medio nutritivo, el CBM puede ser recuperado directamente del medio. Si el CBM no es segregado, éste puede ser recuperado de lisatos celulares.

El CBM producido puede ser detectado usando métodos conocidos en la técnica y modificaciones de los mismos que son específicos para el CBM. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos o la determinación de unión a un sustrato de carbohidrato, tal como Avicel.

El CBM resultante puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el CBM puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitados a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, cromatografía (p. ej., por intercambio iónico, por afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque, y por exclusión de tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej. precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, p. ej. Protein Purification, Janson and Ryden, eds (1989) VCH Publishers, New York).

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Materiales y métodos Determinación de la actividad de CBM

Una secuencia de ADN que codifica un CBM de un organismo dado puede ser obtenida de forma convencional usando técnicas PCR, y, también basándose en el conocimiento actual es posible descubrir secuencias homólogas a partir de otros organismos. Está contemplado que CBM's nuevos pueden ser descubiertos clonando enzimas degradadoras de carbohidratos tales como celulasas, xilanasas u otras enzimas degradadoras paredes celulares vegetales y mide la unión al carbohidrato blanco. Generalmente ha sido asumido, que si la actividad enzimática se enlaza al producto de celulosa cristalina Avicel® parte del gen codifica para un dominio de unión a la celulosa. La unión a Avicel® es evaluada según las condiciones estándares descritas más abajo.

La afinidad a la celulosa puede ser medida usando 10 g de Avicel® en una mezcla tamponada de 500 ml (tampón: 0.1 fosfato sódico, pH 7.5) que es agitada lentamente usando una cuchara y dejada hincharse durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Luego la enzima se añade en una proporción de 1 parte de dominio de unión a la celulosa a 150 partes de Avicel®. Esto se hace en hielo dando una unión óptima en 5 a 10 minutos. El Avicel® puede después ser lavado y aplicado directamente a SDS-PAGE para visualización de las proteínas enlazadas (puesto que el uso de SDS y cocción liberará las proteínas unidas). De forma alternativa, la mezcla es envuelta en una columna y lavada. La proteína unida es eluida, bien en agua ionizada o en un tampón de pH elevado tal como trietilamina (pH 11.2, 1% solución), donde la proteína eluida por el pH es rápidamente ajustada a neutra.

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Métodos generales de bioloqía molecular

Manipulaciones y transformaciones del ADN son realizadas usando métodos estándares de biología molecular como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1995); Harwood and Cutting (Eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley and Sons (1990).

Enzimas para manipulaciones del ADN fueron usadas según las especificaciones de los proveedores.

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Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión de Aspergillus para un dominio de CBM de Pseudoplectania nigrella, dominio que fue segregado con una enzima de la familia GH61

Constructos de expresión de la SEC ID NO:1 fueron creados por dos procedimientos de clonación diferentes. El primer procedimiento (a) usa PCR inversa para eliminar el núcleo enzimático de la enzima de la familia GH61 obtenida de Pseudoplectania nigrella. La ligadura del producto resultó en un plásmido conteniendo la señal de secreción nativa de la enzima GH61, fusionada en marco al ADN que codifica el módulo de unión a carbohidratos. El segundo método (b) seguido para sobreexpresión recombinante del CBM de la invención fue clonar el ADN que codificaba el dominio de CBM en un vector que contiene un péptido señal de lipasa de Candida.

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A - PCR inversa

Cebadores NP887U1 y NP887D1 fueron sintetizados como cebadores fosforilados en 5'. La amplificación de ADN plásmido que codifica el marco de lectura abierto completo (ORF) de la enzima de la familia GH61 fue usada como molde. El OFR puede ser obtenido de la cepa depositada CBS 444.97 usando los cebadores NP887U1 y NP887D1. Aproximadamente 100 nanogramos de ADN fueron usados como molde en una reacción de PCR con los dos cebadores A y B.

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El protocolo seguido fue el protocolo básico de la mutagénesis por PCR Excite como se describe en el manual de usuario de Stratagene (EEUU) número de catálogo 200502.

\vskip1.000000\baselineskip

Componente

dH_{2}O

32, 75 \mul

Tampón 10X pfuUltra

5,0 \mul

dNTPs (10 mM materia prima)

1,25 \mul

NP887U1 (100 pMol/\mul)

5,0 \mul

NP887D1 (100 pMol/\mul)

5,0 \mul

\newpage

1 \mul de PfuUltra (Stratagene, EEUU) fue añadido a la reacción y luego la muestra fue colocada en un variador térmico según las condiciones siguientes:

95 grados Celsius

2 min

seguido de 20 ciclos de 95 grados Celsius

2 minutos

55 grados Celsius

30 segundos

72 grados Celsius

7 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

5 \mul de la reacción PCR fue eliminada para análisis de gel de agarosa para confirmar la amplificación de una banda del tamaño previsto (aprox. 6 kb). A los 45 \mul restantes, 40 unidades de enzima de restricción Dpnl fueron añadidas. La muestra fue retornada al variador térmico e incubada a 37 grados Celsius durante 30 minutos seguido de 65 grados Celsius durante 30 minutos.

La muestra tratada fue purificada por el equipo de purificación de columnas GFX según las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, EEUU).

muestra de PCR tratada

9 \mul

10X tampón de unión

1 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

0.5 \mul de T4 ADN-ligasa de New England Biolabs (aprox. 200 unidades NEB de extremidad cohesiva).

La ligadura fue realizada a 17 grados Celsius durante toda la noche y luego transformada en células químicamente competentes TOP10 según las instrucciones del fabricante. La transformación fue colocada en placas en LB agar con 50 mg/litros de ampicilina. Once de las cien colonias diferentes que crecieron fueron puestas en columnas miniprep (columnas Qiaspin®, Qiagen Ltd.) y el ADN cortado con EcoRI y NotI para liberar el inserto. Ocho de los once plásmidos tuvieron un inserto del tamaño correcto (aprox. 700 bp). El inserto fue secuenciado para estos plásmidos que contienen insertos. Las colonias fueron secuenciadas con cebador de vector PNA2I (5'-GTT TCC AAC ATC ATT TAC CTC-3' SEC ID NO:5). Se determinó que ningún error fue introducido en ninguna de las secuencias de inserto como resultado de PCR. De los ocho plásmidos pCBMX-K1 fue elegido para una preparación de plásmido de escala media JetStar® (GENOMED, Alemania) de 100 \mul de plásmido crecido en LB ampicilina conteniendo células de E. coli.

La secuencia de ADN de la construcción de fusión de pCBMX-K1, y la secuencia de aminoácidos correspondiente, están mostradas en la SEC ID NO:1 y la SEC ID NO:2, respectivamente.

Transformación del constructo pCBMX-K1 en Aspergillus oryzae

El ADN de la SEC ID NO:1 fue transformado en una cepa de Aspergillus oryzae JAL355 (descrita en la solicitud de patente internacional WO 01/98484A1). Transformantes de la SEC ID NO:1 fueron reaislados dos veces bajo condiciones selectivas y no inductivas en placas mínimas de Cove (Cove (1966) Biochim. Biophys. Acta 133:51-56) con 1 M de sacarosa como fuente de carbono y 10 mM de nitrato. Para evaluar la expresión de la SEC ID NO:1, los transformantes fueron dejados crecer durante 3 días y 4 días a 30 grados Celsius en tubos con 10 ml de YPM (2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% maltosa). Los sobrenadantes fueron dejados fluir en NuPage® 10% geles Bis-tris SDS (Invitrogen, EEUU) según fue recomendado por el fabricante. Todos los aislados de Aspergillus crecieron bien incluso cuando fueron inducidos para la expresión del ADN de SEC ID NO:1.

B - Construcción v expresión de CBM usando un péptido señal de lipasa de Candida antarctica

El segundo método seguido para sobreexpresión recombinante del dominio de CBM de la invención fue clonar el dominio de CBM en un vector especialmente preparado conteniendo los elementos reguladores de Aspergillus necesarios (promotor, terminador, etc.) y un péptido señal con sitio de seccionamiento de señal de un gen de lipasa segregado de Candida antartica. La clonación del producto de PCR que consiste en el dominio de CBM en el vector permite una fusión en marco del dominio de CBM con el péptido señal. La expresión del constructo en Aspergillus oryzae debería resultar en una secreción eficaz de la enzima debida a la presencia de la señal de secreción proporcionada y sitio de seccionamiento. El vector usado, pDau109 es un derivado de pJAL721, que está descrito en WO 03/008575.

El plásmido pDau109 difiere de pJaL721 en que el gen de resistencia a la ampicilina ha sido insertado en el marcador seleccionable de pyrG. Las mejoras hechas en el vector pDau109 son primero, el marcador de selección URA3 de E. coli que ha sido sustituido por un gen URA3 interrumpido por la inserción del gen de beta lactamasa de E. coli de resistencia a la ampicilina. Esta característica permite la selección superficial de clones positivos recombinantes de E. coli usando cepas comercialmente disponibles y altamente competentes en placas de LB ampicilina usadas comúnmente. Además el gen de resistencia a la ampicilina puede ser eliminado totalmente usando los dos sitios flanqueantes NotI restaurando un marcador de selección funcional URA3. Además, pDau109 tiene una secuencia señal (aminoácidos 1-57 de la SEC ID NO:9) de lipasa de Candida antarctica (SWALL:LIPB_CANAR) y sitio de seccionamiento introducido después del promotor fúngico donde varios lugares de clonación convenientes están disponibles para fusiones en marco de una región de codificación suministrada con la señal de secreción de C. antarctica. Específicamente, pDau109 tiene 8 sitios de restricción únicos que pueden utilizarse para insertar un ADNc (BstXI-FspI-SpeI-NruI-XcmI-HindIII-XhoI). Métodos estándares fueron usados para modificación de pJaL724 en pDau109.

El plásmido de pDau109 fue preparado por preparación de plásmidos Qiagen® midi (Qiagen) en escala media de 100 mls de plásmido crecido en LB ampicilina que contiene células de E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

Generación del dominio CBM con sitios HindIII

Los cebadores siguientes fueron usados en una reacción de PCR estándar, los sitios de restricción HindIII introducidos para fines de clonación están subrayados:

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3

\vskip1.000000\baselineskip

Plásmido NP887-1 que codifica la región de codificación de GH61 fue usado como molde de PCR.

pNP887 ADN (100 ng)

1 \mul

10X tampón ProofStart

5 \mul

dNTP 20 mM

0.75 \mul

NP887Dau1 (100 pMol/\mul)

0.5 \mul

NP887Dau2 (100 pMol/\mul)

0.5 \mul

H_{2}O

41.25 \mul

ADN polimerasa ProofStart® (Qiagen Ltd)

1 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

La muestra fue transferida a un variador térmico y se efectuó el programa siguiente:

95 grados Celsius

5 min

\vskip1.000000\baselineskip

Luego 20 ciclos de

94 grados Celsius

30 segundos

60 grados Celsius

30 segundos

72 grados Celsius

1 minuto.

\vskip1.000000\baselineskip

Cinco \mul de la reacción de PCR fue inspeccionada en un gel de agarosa y fue observada una banda correspondiente al tamaño correcto (aprox. 500 bp). Los 45 \mul restantes de muestra fueron purificados por el método de purificación de GFX (Amersham Biosciences). La muestra fue luego cortada con HindIII bajo condiciones estándares (40 unidades/\mug de ADN, 37 grados Celsius) durante toda la noche. El fragmento tratado (NP887-CBM) fue una vez más purificado en GFX y almacenado a -20 grados Celsius hasta su uso posterior.

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Preparación de pDau109

ADN del plásmido pDau109 fue cortado con HindIII durante cuatro horas bajo condiciones estándares. 10 unidades de fosfatasa alcalina de camarón fueron añadidas a la reacción y la incubación a 37 grados Celsius continuó durante 2 horas adicionales. La muestra fue luego tratada con calor a 65 grados Celsius durante 20 minutos para inactivar la enzima. El plásmido tratado fue purificado en GFX y almacenado a -20 grados Celsius hasta su uso posterior.

Libración {}\hskip5cm

Vector pDau HindIII*

1 \mul (aprox. 90 ng)

NP887-CBM PCR frag-HindIII

7 \mul

Tampón de T4 ADN ligasa (NEB)

1 \mul

T4 ADB ligasa NEB

0.3 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

La ligadura fue realizada a 16 grados Celsius durante toda la noche y luego almacenados a -20 grados Celsius hasta que se usó.

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Transformación

La ligadura fue realizada a 16 grados Celsius durante toda la noche y luego transformados en células químicamente competentes TOP10 según las instrucciones del fabricante. La transformación fue colocada en placas en LB agar con 50 mg/litros de ampicilina. Doce de las cien colonias diferentes que crecieron fueron puestas en columnas miniprep (columnas Qiaspin®, Qiagen Ltd.) y el ADN cortado con HindIII para liberar el inserto. Cuatro de los doce plásmidos tuvieron un inserto del tamaño correcto (aprox. 500 bp). Los plásmidos que contenían insertos fueron secuenciados con el cebador de vector PNA2I (SEC ID NO:5) para determinar la integridad y orientación del inserto. Fue determinado que ningún error fue introducido en ninguna de las secuencias del inserto como resultado de la PCR. El plásmido pCBMX-S1 resultó no tener errores y en la orientación correcta y fue en consecuencia elegido para una preparación de plásmido de escala media Qiagen® midi (Qiagen) de 100 \mul de plásmido crecido con LB ampicilina que contiene células de E. coli. La secuencia de ADN del constructo de fusión pCBMX-S1, y la secuencia de aminoácidos correspondiente, están mostradas en la SEC ID NO:8 y SEC ID NO:9, respectivamente.

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Transformación del constructo pCBMX-S1 en Aspergillus oryzae

El constructo de fusión pCBMX-S1 (SEC ID NO:8) fue transformado en la cepa BECh2 de Aspergillus oryzae, que fue construida como se describe en WO 00/39322 (BECh2 es derivada de la cepa JaL228 de Aspergillus oryzae, que es construida basándose en la cepa IFO 4177 de Aspergillus oryzae depositada como se describe en WO 98/12300).

Medios de transformación medios AMDS:

Agarosa

20 g

sal de Cove

20 ml (Cove (1966) supra)

Sacarosa

342 g

dH2O

a 100 ml

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autoclave a 121 grados Celsius durante 20 minutos permiten enfriamiento después añadir:

1 M de acetamida

10 ml

1 M de CsCl

15 ml

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Medios AMDS para reaislamiento de transformantes: igual que antes pero sin añadir CsCl y añadiendo 1000 \mul de triton-X100 por 1000 ml de medios. Transformantes de pCBMX-S1 fueron reaislados dos veces en medios de sacarosa de Cove (Cove (1966) Biochim. Biophys. Acta 133:51- 56) con 1 M de sacarosa como fuente de carbono y 10 mM de nitrato. Para evaluar la expresión del constructo de fusión pCBMX-S1, que contiene la secuencia señal de lipasa de Candida antarctica (SWALL:LIPB_CANAR) y el polipéptido CBM de P. nigrella de la invención (SEC ID NO:8), 23 transformantes fueron dejados crecer durante 3 días y 4 días a 30 grados Celsius en tubos con 10 ml de YPG (2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% glucosa). Los sobrenadantes fueron dejados fluir en geles NuPage® al 10% de Bis-tris SDS (Invitrogen, EEUU) según fue recomendado por el fabricante. La coloración del gel naranja de SYPRO® fue usaa según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, EEUU). Tres de los aislados revelaron una banda difusa entre 35-45 kDa en el gel SDS. Estos fueron analizados adicionalmente con diferentes fermentaciones de medios en matraces vibrantes de 150 ml. Los matraces de Erlenmeyer de 1000 ml con deflectores laterales fueron usados con 150 mls de cada uno de 4 medios diferentes:

YPM: 2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% maltosa

YPG: 2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% glucosa

DAP2C: Para medios de 1 litro; MgSO4.7H2O (Merck 5886) 11 g, KH2PO4 (Merck 4873) 1 g, ácido cítrico (Merck 244) 2 g, maltodextrina (Roquette), K3PO4.H2O 5.2 g, extracto de levadura (Difco 0127) 0.5 g, metales de espora AMG 0.5 mls (cloruro de Zink : Merck 8816, 6.8 g; Sulfato de cobre: Merck 2790, 2.5 g; cloruro de níquel: Merck 6717, 0.24 g; sulfato de hierro: Merck 3965, 13.9 g; sulfato de manganeso: Merck 5941, 8.45 g; Ácido cítrico: Merck 0244, 3 g), Pluronic® PE 6100 (BASF).

FG4P: 3% de harina de soja (SFK 102-2458), 1.5% maltodextrina (Roquette), 0.5% de Peptona bacto (Difco 0118), 1.5% KH2PO4 (Merck 4873), 0.2 mls/litro Pluronic® PE 6100 (BASF).

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Un inóculo pesado de varios miles de esporas fue usado para cada uno y los frascos de agitación fueron agitados en un agitador orbital a 150 r.p.m. a 30 grados C.

Los aislados de Aspergillus crecieron bien incluso cuando se indujo la expresión del polipéptido de CBM de la invención.

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Ejemplo 2 Purificación de la SEC ID NO:9 de la expresión de la SEC ID NO:8 en Aspergillus

La cepa de Aspergillus oryzae descrita en el Ejemplo 1 B que expresa el CBM (CBMX) de GH61 de Pseudoplectania nigrella con el péptido señal de lipasa de Candida antarctica fue crecida en frascos de agitación. Aproximadamente 1 litro de caldo de cultivo fue filtrado de forma estéril y el filtrado fue cargado en una columna que contenía 50 g de Avicel. Proteínas sin unión y con unión débil fueron eliminadas mediante lavado con agua Milli-Q®. Proteínas con afinidad para Avicel fueron eluidas con 0.1 M tris, pH 11.5. Inmediatamente después de elución, pH de esta fracción de unión a Avicel fue ajustado a 7.5, y la fracción fue concentrada usando una célula Amicon® (Millipore®, EEUU) con una membrana con un corte de 6 kDa. En SDS-PAGE la mayoría de las proteínas que se unen a Avicel aparecieron como una banda ancha de peso molecular 35-45 kDa, que es considerablemente superior que el peso molecular de la parte de la proteína del módulo de unión a carbohidratos. El peso molecular alto y heterogéneo es probablemente debido a heterogeneidad en O y N-glicosilación de la parte N-terminal de la proteína. La secuenciación N-terminal de la banda de 35-45 kDa dió exclusivamente la secuencia SFSSSGT (posiciones 47-53 de la SEC ID NO:9) indicando que la heterogeneidad en la secuencia de aminoácidos N-terminal no está presente.

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Ejemplo 3 Especificidad de unión de CBMX purificado

El dominio de unión a carbohidratos con afinidad para Avicel y purificado como se describe en el Ejemplo 2 (CBMX) fue estudiado adicionalmente. 50 \mul de CBMX purificado fueron mezclados con 500 \mul de tris20 mM, pH 7.5 conteniendo una cantidad variable de Avicel (0-100 mg/ml) en un tubo de Eppendorf. Después de 4 horas de incubación a la temperatura ambiente con agitación, las muestras fueron centrifugadas. 200 \mul de sobrenadante fueron transferidos al pocillo de una placa de microtitulación (Costar, placa UV) y la absorbencia fue leída a 280 nm en un lector de placas de microtitulación (SpectraMax® Plus, Molecular Devices). Los resultados en Tabla 1 indican que la gran mayoría de la proteína se enlaza a las concentraciones máximas de Avicel.

TABLA 1 Unión de CBMX a Avicel. A280: Absorbencia a 280 nm de 200 \mul sobrenadante en placa de microtitulación con absorbencia de tampón y Avicel sustraído

6

Experimentos con período de incubación más corto (15 min a 1 hora) dieron una unión menos completa.

Un estudio de unión similar fue realizado con PASC (celulosa Hinchada con ácido fosfórico: A 5 g de Avicel humedecido con agua se añaden 150 ml de ácido orto-fosfórico 85 enfriado en hielo. Después de 1 hora de agitación en baño de hielo, se añaden 500 ml de acetona fría. La suspensión es filtrada y lavada, primero con acetona y luego con agua). 50 \mul de CBMX purificado fueron mezclados con 500 \mul de tris 20 mM, pH 7.5 conteniendo una cantidad variable de PASC (0-10 mg/ml) en un tubo de Eppendorf. Las muestras fueron incubadas 4 horas a la temperatura ambiente con agitación. Después del centrifugado, 200 \mul de sobrenadante fueron transferidos al pocillo de una placa de microtitulación y la absorbencia fue leída a 280 nm. Los resultados en la Tabla 2 muestran que el aumento de la cantidad de PASC reduce la cantidad de absorbencia de CBMX en el sobrenadante, es decir CBMX tiene afinidad para PASC.

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TABLA 2 Unión de CBMX a PASC. A280: Absorbencia a 280 nm de 200 \mul de sobrenadante en placa de microtitulación con absorbencia de tampón sustraído

7

La afinidad de CBMX para varios carbohidratos solubles fue evaluada en un ensayo de competición mezclando 100 \mul de CBMX tanto con Avicel (400 \mul 50 mg/ml en 20 mM tris, pH 7.5) como con el carbohidrato soluble (disuelto en 500 \mul de tris 20 mM, pH 7.5). Como referencias, muestras sin CBMX o carbohidrato soluble añadido fueron usadas. Si CBMX tiene afinidad para el carbohidrato soluble debe ser capaz de tener CBMX en solución que puede ser medido como aumento de absorbencia a 280 nm en comparación con la muestra sin carbohidrato soluble añadido. Después de 4 horas de incubación a la temperatura ambiente con agitación, las muestras fueron centrifugadas y la absorbencia a 280 nm fue leida usando 200 \mul de sobrenadante en el pocillo de una placa de UV de microtitulación. Carbohidratos evaluados solubles fueron \beta-glucano de cebada, (Megazyme, baja viscosidad), liquenano, (Megazyme, musgo islandés), CMC (carboximetilcelulosa 7LF, Hercules, EEUU), xiloglucano, (Megazyme, amiloide, de semilla tamarinda), galactano de lupino (Megazyme) y goma garrofin (Sigma, G-0753).

A partir de los resultados en la Tabla 3 se puede observar que beta-glucano y CMC son capaces de mantener casi todos los CBMX en solución. También la goma garrofin mantiene la mayoría en solución, mientras que el xiloglucano y galactano resultan en aproximadamente la mitad del CBMX en solución. La adición de liquenano no resulta en ningún aumento en CBMX en solución. Estos resultados indican afinidad de CBMX para beta-glucano, CMC y goma garrofin y hasta cierto punto también para xiloglucano y galactano, mientras que ninguna afinidad para liquenano pudo ser detectada.

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TABLA 3 Ensayo de unión de competición con CBMX, Avicel (20 mg/ml) y carbohidratos solubles. Concentración de carbohidrato: concentración de carbohidrato soluble durante incubación con CBMX y Avicel. Diferencia en A280: diferencia en absorbencia a 280 nm entre muestras con y sin CBMX añadido

8

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patentes citados en la descripción

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<110> Novozymes A/S

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<120> Módulo de unión a carbohidratos fúngicos

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<130> 10499.000-DK

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<160> 9

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<170> Versión de patentIn 3.2

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<210> 1

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<211> 629

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<212> ADN

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<213> Pseudoplectania nigrella

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<220>

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<221> CDS

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<222> (10)..(531)

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<400> 1

9

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<210> 2

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Pseudoplectania nigrella

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<400> 2

\hskip1cm

10

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<210> 3

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Pseudoplectania nigrella

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<220>

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<221> característica_misc cebador NP887U1

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<222> (1)..(31)

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacatcgttg acggagagtc cgtagacacg a

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Pseudoplectania nigrella

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<220>

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<221> característica_misc cebador NP887D1

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<222> (1)..(34)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatcctccg gcacctccaa tgacaaggcc gtcg

\hfill

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> cebador PNA2I

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> característica_misc cebador PNA2I

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<222> (1)..(21)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttccaact caatttacct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> cebador NP887Dau1

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<220>

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<221> característica_misc cebador NP887Dau1

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<222> (1)..(32)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaagcttt tcatcctccg gcacctccaa tg

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> cebador N887Dau2

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<220>

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<221> característica_misc cebador NP887Dau2

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<222> (1)..(32)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaagctta atcttactcc atctcacctc cc

\hfill

32

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<210> 8

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<211> 573

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<212> ADN

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<213> Pseudoplectania nigrella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (570)

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<223> Posiciones 1-57 péptido señal de Candida lipasa, posiciones 58-147 secuencia de lipasa de candida, posiciones 148-570 polipéptido CBM de P. nigrella.

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<400> 8

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11

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<210> 9

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<211> 190

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<212> PRT

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<213> Pseudoplectania nigrella

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<400> 9

\hskip1cm

12

Claims (22)

1. Módulo de unión a carbohidratos que es

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, donde la secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 o

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 50% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2 o

(c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 bajo condiciones de astringencia media o

(d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótidos aislada cuya molécula de polinucleótidos se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

2. Molécula de polinucleótido aislada codificando un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:1 desde el nucleótido 109 hasta el nucleótido 531;

(b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que es más de un 50% idéntico a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2; o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a carbohidratos;

(c) moléculas complementarias para (a) o (b); y

(d) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b).

3. Molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos cuya molécula de polinucleótido se hibrida a una sonda de ADN bicatenaria desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

4. Molécula de polinucleótido aislada según la reivindicación 2 que es aislada de o producida basándose en una biblioteca de ADN de un procariota, tal como una bacteria o un eucariota, tal como un hongo o levadura.

5. Constructo polinucleótido que comprende la molécula de polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

6. Constructo polinucleótido según la reivindicación 5 que comprende una o más secuencias de control, tal como un promotor, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, un péptido señal, un propéptido y una secuencia del terminador de transcripción.

7. Vector de expresión que comprende los elementos siguientes operativamente enlazados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:1 de nucleótidos 109-531, (b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos que son más de un 50% idénticas a la secuencia de aminoácidos de la posición 34-174 de SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a carbohidratos; y (c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b); y un terminador de la transcripción.

8. Célula cultivada en la que ha sido introducido un vector de expresión según la reivindicación 7, donde dicha célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

9. Método para producir un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos comprendiendo el cultivo de una célula según la reivindicación 8, por la cual dicha célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN; y recuperar el polipéptido.

10. Composición que comprende un módulo de unión a carbohidratos según la reivindicación 1 o 2.

11. Composición según la reivindicación 10 comprendiendo además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, celulasas, beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, alfa-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, otras mananasas, pectina metil-esterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas derivadas.

12. Método para degradar biomasa con celulosa, donde la biomasa es tratada con una cantidad eficaz del módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de reivindicaciones 1 o 2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11.

13. Endoglucanasa híbrida, que presenta actividad endo-beta-1,4-glucanasa que comprende un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y un dominio catalítico.

14. Composición que comprende un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endo-glucanasa híbrida según la reivindicación 13.

15. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endo-glucanasa híbrida según la reivindicación 13 en una composición detergente.

16. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endoglucanasa híbrida según la reivindicación 13 en procesos de acabado textil.

17. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para purificación de polipéptidos.

18. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para inmovilización de enzimas activas.

19. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para panadería.

20. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para fabricación de biocombustible.

21. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para modificación de paredes celulares vegetales.

22. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para tratamiento de fibras de celulosa.