ES2321088T3 - Anticuerpos dirigidos frente a la hormona paratiroidea (pth) y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo, que se une a la hormona paratiroidea humana (PTH), en el que el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4.

Description

Anticuerpos dirigidos frente a la hormona paratiroidea (PTH) y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se refieren a anticuerpos dirigidos frente al antígeno hormona paratiroidea (PTH) y a usos de tales anticuerpos. En particular, según las realizaciones de la invención descrita en el presente documento, se proporcionan anticuerpos monoclonales completamente humanos (AcM) dirigidos frente al antígeno PTH. Se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican para y secuencias de aminoácidos que comprenden moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias que corresponden a secuencias de cadena pesada y ligera contiguas que abarcan las regiones de entramado y/o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), específicamente desde FR1 hasta FR4 o desde CDR1 hasta CDR3. Los anticuerpos de la invención encuentran uso como elementos de diagnóstico y de tratamiento para enfermedades asociadas con la producción en exceso de PTH.

Descripción de la técnica relacionada

Las glándulas paratiroideas son parte del sistema endocrino y producen hormona paratiroidea (PTH). La PTH regula los niveles de calcio, fósforo y magnesio en el torrente circulatorio, manteniendo un equilibrio apropiado de estas sustancias, lo que es esencial para una mineralización ósea normal. La producción crónica, excesiva de PTH se conoce como hiperparatiroidismo (HPT). La producción en exceso de hormona paratiroidea conduce a una elevación del nivel de calcio en sangre y a una disminución del nivel de fosfato en sangre. Se elimina calcio de los huesos y aumenta la absorción de calcio a partir del tubo digestivo (TD). Los riñones intentan compensar el aumento de nivel de calcio en sangre secretando calcio en exceso en la orina, lo que puede dar como resultado la formación de cálculos renales. Los efectos del aumento de los niveles de PTH se observan no sólo en los riñones, sino también en el esqueleto, el estómago y los intestinos, el sistema nervioso y los músculos (R.S. Cotran et al., eds., Robbins Pathologic Basis of Disease 1246-47 (4ª ed., W.B. Saunders Co., Filadelfia 1989).

En el hiperparatiroidismo primario, el aumento de la secreción de PTH se produce debido a la presencia de un tumor, un adenoma paratiroideo (\sim80%), o menos comúnmente por hiperplasia de las glándulas paratiroideas (\sim15%) o carcinoma (\sim5%). Como resultado de la elevación de los niveles de calcio en sangre, los síntomas pueden incluir cálculos renales, dolor de huesos, fatiga, anorexia, nauseas y vómitos (L.M. Tierney, Jr., et al., eds., Current Medical Diagnosis and Treatment 1001-02 (35ª ed., Appleton & Lange, Stamford, CT 1996)). El tratamiento médico actual del HPT primario no es satisfactorio debido a que actualmente no hay agentes que puedan producir un bloqueo sostenido de la liberación de PTH por las glándulas paratiroideas. La extirpación quirúrgica de parte de o todas las glándulas paratiroideas es el tratamiento preferido, aunque posoperatoriamente pueden producirse complicaciones tales como daño al nervio laríngeo e hipercalcemia prolongada.

En el hiperparatiroidismo secundario, la producción en exceso de PTH es normalmente un resultado de o bien deficiencias de vitamina D (raquitismo y osteomalacia) o bien insuficiencia renal crónica (IRC). Cuando el HPT secundario se debe a insuficiencia renal, la patología se caracteriza por hipocalcemia e hiperfosfatemia y por una incapacidad relativa de responder a la PTH. Esta resistencia a la función de la PTH conduce a hiperplasia de las glándulas paratiroideas y a una producción excesiva de PTH a medida que las glándulas intentan restablecer la normocalcemia y normofosfatemia. La resistencia a los niveles de PTH se debe a un fallo para producir calcitriol (forma activa de la vitamina D) en los riñones y a un fallo para excretar fosfato a través de los riñones. El calcitriol actúa directamente sobre las glándulas paratiroideas para inhibir la producción de PTH y el TD para promover la absorción de calcio. Por tanto, la pérdida de calcitriol conduce a niveles de PTH en suero aumentados. Niveles altos de fosfato actúan también directamente sobre el tejido paratiroideo para inducir la expresión de la PTH y pueden interaccionar directamente con el calcio para mantener la hipocalcemia. La pérdida de estos mecanismos de retroalimentación negativa explica la mayor parte de la resistencia a la PTH observada en la IRC (Fauci, A.S. et al., eds., Harrison's Principles of Internal Medicine 2214-47 (14ª ed., McGraw-Hill Co. 1998)). En el HPT secundario grave, niveles extremadamente altos de PTH superan la resistencia del hueso a la hormona, dando como resultado altos niveles de calcio y fosfato en suero que pueden provocar calcificación difusa en la piel, tejidos blandos y arterias (calcifilaxis). Tal calcificación puede dar como resultado necrosis isquémica dolorosa de la piel y gangrena, arritmias cardiacas e insuficiencia pulmonar (Tierney et al., citado anteriormente en el 3º párrafo).

Actualmente, el HPT secundario se trata médicamente con agentes de unión de fosfato tales como carbonato de calcio y con niveles suprafisiológicos de análogos de vitamina D tales como calcitriol y doxercalciferol. No todos los pacientes responden al calcitriol y la hipercalcemia es una complicación común del tratamiento (Felsenfeld, A.J., J. Am. Soc. Nephrology 8(6):993-1004 (1997)). Los calcimiméticos, diseñados como moduladores alostéricos del receptor de calcio, están también en desarrollo clínico como un posible tratamiento.

La PTH es un péptido de 84 aminoácidos secretado a partir de las glándulas paratiroideas. Se conoce su secuencia de aminoácidos (Keutman, H.T. et al., Biochemistry 17:5723-29 (1978)) y la secuencia de nucleótidos del gen relacionado (Hendy et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:7365-69 (1981)). La PTH actúa a través del receptor de PTH/proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) para promover la resorción ósea y disminuir la excreción de calcio. La hormona paratiroidea humana (hPTH) circula como hPTH1-84 sustancialmente intacta y fragmentos de la misma. Se cree que hPTH1-84 de longitud completa y el fragmento hPTH1-34 son biológicamente activos, mientras que se cree que el fragmento hPTH35-84 es inactivo. Los fragmentos que carecen del extremo N-terminal de la PTH (hPTH7-84 o hPTH7-34) no sólo son inactivos, sino que también pueden inhibir la PTH biológicamente activa in vivo (Horiuchi et al., Science 220:1053-55 (1983)).

Lindall, en la patente estadounidense número 4.341.755, describe un radioinmunoensayo de anticuerpos de PTH en suero de mamífero. Se utilizó en el ensayo un anticuerpo de pollo con alta afinidad por la parte 65-84 de la PTH humana. Adermann et al., en la patente estadounidense número 6.030.790, da a conocer anticuerpos policlonales preparados inyectando a animales indeterminados diversos fragmentos de hPTH1-37, que son útiles en ensayos de PTH biológicamente activa. Japan Tobacco, Inc., en la solicitud de patente japonesa número JP 98337263, presentada el 27 de noviembre de 1998, da a conocer anticuerpos monoclonales humanos con reactividad frente a la PTH humana o sus fragmentos. Sin embargo, los anticuerpos dados a conocer no parecen ser terapéuticamente útiles, probablemente debido al hecho de que las afinidades de tales anticuerpos por la PTH humana son insuficientes.

Se conoce un anticuerpo inhibidor de la PTH dirigido frente a un epítopo de la PTH(25-34) humana de Nussbaum et al (Nussbaum et al., "Monoclonal antibodies directed against the biologically active region of parathyroid hormone", WPI World Patent Inf, (1982)). El documento US6030790 da a conocer anticuerpos dirigidos frente a la PTH(18-34) humana.

Los obstáculos para desarrollar un anticuerpo monoclonal o policlonal frente a la PTH para aplicaciones terapéuticas se han descrito y se han atribuido a una inmunogenicidad y afinidad inadecuadas (Bradwell, A.R. et al., Lancet 353:370-73 (1999)). Bradwell et al. inmunizaron de manera satisfactoria a un paciente a un paciente que padecía carcinoma paratiroideo con PTH y el paciente produjo autoanticuerpos frente a la PTH. Sin embargo, debido a la necesidad clínica de titular la PTH respecto a un intervalo objetivo individual en la población de pacientes hiperparatiroideos, un enfoque de inmunización clínica no sería generalmente aplicable dada la heterogeneidad de las respuestas inmunitarias y la necesidad de romper la tolerancia a un antígeno propio. Por tanto, se mantiene la necesidad no satisfecha de un anticuerpo anti-PTH terapéuticamente útil.

Sumario de la invención

La invención descrita en el presente documento se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a la PTH y afectan a la función de la PTH. Por consiguiente, las realizaciones de la invención proporcionan anticuerpos anti-PTH humana y preparaciones de anticuerpos anti-PTH con propiedades deseables desde perspectivas terapéuticas y de diagnóstico. En particular, una realización de la invención proporciona anticuerpos anti-PTH que tienen características que proporcionan utilidad terapéutica, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, fuerte afinidad de unión por PTH, la capacidad de neutralizar PTH in vitro y la capacidad de producir neutralización prolongada de PTH in vivo.

Una realización de la invención es un anticuerpo monoclonal humano aislado que tiene una secuencia de región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 4.

Otra realización de la invención es un anticuerpo anti-PTH de alta afinidad aislado. En una realización adicional de la invención, una única dosis de tal anticuerpo de alta afinidad produce una reducción de los niveles de PTH no unida en suero desde niveles hipertiroideos hasta un nivel normal o casi normal durante de 24 a 36 horas, preferiblemente de 48 a 60 horas, más preferiblemente de 72 a 84 horas. Otra realización de la invención es un anticuerpo anti-PTH que reduce el nivel de PTH no unida en ratas Sprague-Dawley normales que recibieron 50 \mug/kg/día de PTH (1-34) humana mediante bomba osmótica subcutánea Alzet en al menos el 50% durante al menos 48 horas tras una única dosis intravenosa de 3 mg/kg de anticuerpo, tal como se mide mediante ensayo directo o mediante un biomarcador de bioactividad de la PTH.

Una realización adicional de la invención es un anticuerpo que compite de manera cruzada por la unión a la PTH con los anticuerpos completamente humanos de la invención. En otra realización de la invención, el anticuerpo completamente humano es el AcM 183 anti-PTH.

Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se basan en la generación e identificación de anticuerpos aislados que se unen específicamente a la PTH. La PTH se expresa a niveles elevados en el hipertiroidismo. La inhibición de la actividad biológica de la PTH puede retrasar la evolución de los síntomas provocados por hipertiroidismo primario e hipertiroidismo secundario.

Por consiguiente, una realización de la invención descrita en el presente documento proporciona anticuerpos aislados, o fragmentos de esos anticuerpos, que se unen a la PTH. Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ser ventajosamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, quiméricos y/o humanos. Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento también proporcionan células para producir estos anticuerpos.

Se apreciará que las realizaciones de la invención no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PTH puede ser un anticuerpo de longitud completa (que tiene, por ejemplo, una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o a partir de una célula producida de manera recombinante que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican para el anticuerpo.

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para cualquiera de tales anticuerpos anti-PTH, una célula huésped transformada con cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico. Además, una realización de la invención es un método de producción de un anticuerpo anti-PTH mediante el cultivo de células huésped en condiciones en las que se expresa una molécula de ácido nucleico para producir el anticuerpo seguido por la recuperación del anticuerpo.

Una realización adicional de la invención incluye un método de producción de anticuerpos de alta afinidad frente a la PTH inmunizando un mamífero con PTH humana o un fragmento de la misma y una o más secuencias ortólogas de fragmentos de la misma.

Otras realizaciones de la invención incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz del anticuerpo de la invención en mezcla con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Aún en otras realizaciones, el anticuerpo anti-PTH o fragmentos del mismo se conjuga con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser una toxina o un radioisótopo. Preferiblemente, tales anticuerpos pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo primario y secundario.

En otra realización, la invención incluye un kit de ensayo para la detección de la PTH en células o tejidos de mamífero para detectar hiperparatiroidismo, que comprende un anticuerpo que se une a la PTH y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, si está presente. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo que se une a la PTH está etiquetado. En otra realización, el anticuerpo es un primer anticuerpo no etiquetado y el medio para indicar la reacción comprende un segundo anticuerpo etiquetado que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Preferiblemente, el anticuerpo está etiquetado con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radiopaco.

En otra realización, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente, que comprende una composición que contiene un anticuerpo anti-PTH, y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede usarse para tratar hiperparatiroidismo caracterizado por la sobreexpresión de PTH. Preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un ser humano, recibe el anticuerpo anti-PTH. En una realización preferida, se tratan el hiperparatiroidismo primario y el secundario.

Adicionalmente, pueden usarse los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, y fragmentos y variantes de los mismos, a modo de ejemplo no limitativo, (a) para dirigir la biosíntesis de proteínas, polipéptidos, fragmentos y variantes codificados como productos génicos recombinantes o heterólogos, (b) como sondas para la detección y la cuantificación de los ácidos nucleicos dados a conocer en el presente documento, (c) como moldes de secuencia para preparar moléculas antisentido y similares. Tales usos se describen más completamente en la siguiente
descripción.

Además, las proteínas y los polipéptidos descritos en el presente documento, y fragmentos y variantes de los mismos, pueden usarse de formas que incluyen (a) servir como inmunógeno para estimular la producción de un anticuerpo anti-PTH, (b) un antígeno de captura en un ensayo inmunogénico para un anticuerpo de este tipo, (c) como diana para seleccionar sustancias que se unan a un polipéptido de PTH descrito en el presente documento y (d) una diana para un anticuerpo específico de PTH de modo que el tratamiento con el anticuerpo afecte a la función molecular y/o celular mediada por la diana.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PTH se administra seguido por un agente de aclaramiento para eliminar el anticuerpo circulante de la sangre.

En alguna realización, los anticuerpos anti-PTH pueden modificarse para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En una realización, el anticuerpo anti-PTH puede modificarse, tal como mediante una sustitución de aminoácidos, para alterar el aclaramiento del anticuerpo. Por ejemplo, ciertas sustituciones de aminoácidos pueden acelerar el aclaramiento del anticuerpo del organismo. Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos pueden ralentizar el aclaramiento del anticuerpo del organismo. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PTH puede alterarse de manera que se elimina menos rápidamente del organismo.

Aún otra realización es el uso de un anticuerpo anti-PTH en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tales como hiperparatiroidismo. En una realización, la enfermedad es hipertiroidismo primario. En una realización alternativa, la enfermedad es hiperparatiroidismo secundario. Todavía otra realización es el uso de un anticuerpo anti-PTH en la preparación de un medicamento para reducir el nivel de PTH circulante en un animal.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra datos de neutralización para AcM 183 anti-PTH tal como se determinan mediante el ensayo de movilización de calcio en un lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR).

La figura 2 es un gráfico que muestra la neutralización de PTH humana in vivo mediante AcM 183 anti-PTH tal como se mide mediante el inverso de la respuesta hipercalcémica a PTH humana infundida (34 meros) en ratas.

La figura 3 es una alineación de la secuencia de aminoácidos de regiones variables de la cadena pesada de AcM anti-PTH generados según la invención con sus secuencias de región variable de la línea germinal asociadas.

La figura 4 en una alineación de aminoácidos de regiones variables de la cadena ligera de AcM anti-PTH generados según la invención con sus secuencias de región variable de la línea germinal asociadas.

Descripción detallada de la realización preferida

Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se refieren a anticuerpos anti-PTH completamente humanos y a sus usos. Tales anticuerpos completamente humanos tienen la ventaja de perfiles farmacocinéticos y de seguridad mejorados en relación con anticuerpos que contienen secuencias no humanas y, por consiguiente, no se prevé inmunogenicidad en seres humanos. A través del uso de una estrategia de inmunización de antígeno doble combinada con la tecnología de selección descrita en el presente documento, se han descubierto anticuerpos monoclonales con afinidad poco común y duración de la acción prolongada in vivo que tienen utilidad en aplicaciones terapéuticas. Adicionalmente, los estudios de neutralización in vivo proporcionados en el presente documento demuestran que para que un anticuerpo anti-PTH sea sumamente viable de manera terapéutica, debe poseer alta afinidad, preferiblemente en el intervalo nanomolar y más preferiblemente en el intervalo picomolar. Se ha encontrado que los anticuerpos anti-PTH de la invención descrita en el presente documento se unen preferente y específicamente a la PTH.

Por consiguiente, las realizaciones de la invención proporcionan anticuerpos aislados, o fragmentos de esos anticuerpos, que se unen a la PTH. Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ser ventajosamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, quiméricos y/o humanos. Las realizaciones de la invención también proporcionan células para producir estos anticuerpos.

Además, las realizaciones de la invención proporcionan el uso de estos anticuerpos como elemento de diagnóstico o de tratamiento para la enfermedad. Por ejemplo, las realizaciones de la invención proporcionan métodos y anticuerpos para inhibir la expresión de PTH asociada con hiperparatiroidismo. Preferiblemente, los anticuerpos se usan para tratar hipertiroidismo primario y secundario. En asociación con tal tratamiento, se proporcionan artículos de fabricación que comprenden anticuerpos de la invención descrita en el presente documento. Adicionalmente, se proporciona un kit de ensayo que comprende anticuerpos según la invención descrita en el presente documento para detectar hipertiroidismo.

Los anticuerpos de la invención descrita en el presente documento, tales como el anticuerpo AcM 183 anti-PTH, poseen alta afinidad, potencial de neutralización significativo y semivida sostenida y duración de la acción prolongada. Los anticuerpos anti-PTH según la invención descrita en el presente documento, tales como el anticuerpo AcM 183 anti-PTH, reducen el nivel de PTH no unida en ratas Sprague-Dawley normales que recibieron 50 \mug/kg/día de PTH(1-34) humana mediante bomba osmótica subcutánea Alzet en al menos el 50% durante al menos 48 horas tras una única dosis intravenosa de 3 mg/kg de anticuerpo, tal como se mide mediante ensayo directo o mediante un biomarcador de bioactividad de la PTH.

Por consiguiente, los anticuerpos de la invención descrita en el presente documento poseen utilidades terapéuticas. Por ejemplo, una única dosis de anticuerpos según la invención, tales como el anticuerpo AcM 183 anti-PTH, producirá una reducción de los niveles de PTH no unida en el suero de un paciente desde niveles hipertiroideos hasta un nivel normal o casi normal durante de 24 a 36 horas, preferiblemente de 48 a 60 horas y más preferiblemente de 72 a 84 horas. De manera similar, la administración de al menos una dosis de un anticuerpo anti-PTH de la invención, tal como el anticuerpo AcM 183 anti-PTH, puede reducir los niveles de PTH circulante en un paciente en aproximadamente el 25%, preferiblemente en aproximadamente el 50% y más preferiblemente en aproximadamente el 75% en relación con los niveles antes de la administración y preferiblemente se mantiene tal reducción durante un periodo de aproximadamente 24 a 36 horas, preferiblemente durante un periodo de aproximadamente 48 a 60 horas y más preferiblemente durante un periodo de aproximadamente 72 a 84 horas.

Se proporcionan a continuación en detalle adicional características, realizaciones y similares adicionales en lo que se refiere a los anticuerpos de la invención.

Lista de secuencias

En la lista de secuencias se proporcionan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera de anticuerpos anti-PTH humanos representativos, cuyo contenido se resume en la tabla 1 a continuación.

TABLA 1

1

2

3

4

5

Definiciones

A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la invención descrita en el presente documento deben tener los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares deben incluir los plurales y los términos plurales deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnica de cultivo de células y tejidos, biología molecular e hibridación y química de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos descritas en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se usan técnicas convencionales para síntesis de oligonucleótidos y ADN recombinante, y para la transformación y el cultivo de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o tal como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Los procedimientos y técnicas anteriores se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y tratan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnicas y procedimientos de laboratorio de la química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se usan técnicas convencionales para la síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración y tratamiento de pacientes.

Tal como se utiliza según la presente descripción, debe entenderse que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

La expresión "polinucleótido aislado" tal como se usa en el presente documento debe significar un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (I) no está asociado con toda o una parte de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está operativamente unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

La expresión "proteína aislada" a la que se hace referencia en el presente documento significa una proteína de origen sintético, ARN recombinante o ADNc o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza.

El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptido. Por tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género polipéptido. Polipéptidos preferidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas mediante combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.

La expresión "que se produce de manera natural", tal como se usa en el presente documento, tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueda encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otra forma, se produce de manera natural.

La expresión "operativamente unido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a que las posiciones de componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera prevista. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante está ligada de modo que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión "secuencia de control", tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión de ribosomas y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y una secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión.

El término "polinucleótido", tal como se hace referencia en el presente documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, o bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o bien una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.

El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos que se producen de manera natural y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótido que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y lo más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son normalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos o bien sentido o bien antisentido.

La expresión "nucleótidos que se producen de manera natural" a la que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados" a la que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces oligonucleotídicos" a la que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Véase por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. patente estadounidense número 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección, si se desea.

La expresión "se hibrida selectivamente" se refiere en el presente documento a unirse de manera específica y detectable. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos según la invención se hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectivas tal como se conoce en la técnica y se trata en el presente documento. Generalmente, la homología de la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos del 80%, y más normalmente tendrá preferiblemente homologías crecientes de al menos el 85%, 90%, 95%, 99% y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando se alinean las dos secuencias para obtener un apareamiento máximo. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que están apareándose) para maximizar el apareamiento; se prefieren longitudes de hueco de 5 o menos, siendo más preferidas de 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se usa el término en el presente documento, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o más. Véase M.O. Dayhoff, en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, 101-110 y suplemento 2 al vol. 5, 1-10 (National Biomedical Research Foundation 1972). Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en más de o igual al 50% cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN. La expresión "corresponde a" se usa en el presente documento para decir que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente de manera evolutiva) a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En contraposición, la expresión "complementario a" se usa en el presente documento para decir que la secuencia complementaria es homóloga a toda o a una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una "GTATA".

Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de aminoácidos o polinucleótido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa proporcionada en una lista de secuencias o puede comprender una secuencia génica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 nucleótidos de longitud. Dado que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos (1) pueden comprender cada uno una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de aminoácidos o de polinucleótido completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de aminoácidos o de polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan normalmente comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótido contiguas o 6 aminoácidos en los que una secuencia de polinucleótido o una secuencia de aminoácidos puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y en los que la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. Puede realizarse la alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics Software Package versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks o MacVector), o mediante inspección; y se selecciona la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generada mediante los diversos métodos.

La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de aminoácidos o de polinucleótido son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido o residuo a residuo) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo o base de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. La expresión "identidad sustancial", tal como se usa en el presente documento, indica una característica de una secuencia de aminoácidos o de polinucleótido, en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 85 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos del 90 al 95 por ciento, más normalmente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en los que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que ascienden al 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª ed., Golub, E.S. y Gren, D.R. eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 1991). También pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la invención descrita en el presente documento estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha-, \alpha-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N,N,N-trimetil-lisina, \varepsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \sigma-N-metilarginina y otros iminoácidos y aminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección a mano izquierda es la dirección del extremo amino terminal y la dirección a mano derecha es la dirección del extremo carboxilo terminal, según la convención y el uso convencional.

De manera similar, a menos que se especifique lo contrario, el extremo a mano izquierda de secuencias de polinucleótido monocatenarias es el extremo 5'; la dirección a mano derecha de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en el sentido de 5'"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en el sentido de 3'".

Tal como se aplica a los polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxiladas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.

Tal como se trata en el presente documento, se contempla que variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos estén abarcadas por la invención descrita en el presente documento, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, 90%, 95% y lo más preferiblemente el 99%. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones conservativas son aquéllas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia alifática-hidroxilada; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio de entramado. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácidos da como resultado un péptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. en el presente documento se describen ensayos en detalle. Los expertos habituales en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Se producen fragmentos o análogos de los extremos amino y carboxilo terminales preferidos cerca de los límites de dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos en bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína pronosticados que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según la invención.

Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad de proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad de oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta a la secuencia de péptidos que se produce de manera natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se produce de manera natural (preferiblemente en la parte del polipéptido fuera del/de los dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, ni perturbar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza a la secuencia original). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York 1984); Introduction to Protein Structure (Branden, C. and Tooze, J. eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. 1991); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

La expresión "fragmento de polipéptido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción en el extremo amino-terminal y/o carboxilo-terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se produce de manera natural deducida de, por ejemplo, una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos normalmente son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente de al menos 50 aminoácidos de longitud e incluso más preferiblemente de al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que constan de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a una PTH, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión a PTH apropiada o (3) capacidad para inhibir el crecimiento de células que expresan PTH in vitro o in vivo. Normalmente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución de aminoácido conservativa (o adición o deleción) con respecto a la secuencia que se produce de manera natural. Los análogos normalmente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido que se produce de manera natural de longitud completa.

Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS pág. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular informatizado. Pueden usarse miméticos de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

"Anticuerpo" o "péptido(s) de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o a un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante o mediante la escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contrarreceptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrarreceptor en al menos aproximadamente el 20%, 40%, 60% u 80%, y más habitualmente en más de aproximadamente el 85% (tal como se mide en un ensayo de unión competitivo in vitro).

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína que puede realizar la unión específica a un receptor de célula T o inmunoglobulina. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es \leq 1 \muM, preferiblemente \leq 100 nM y lo más preferiblemente \leq 10 nM.

El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.

"Activo" o "actividad" para los fines en el presente documento, se refiere a forma(s) de polipéptido de PTH que conservan una actividad biológica y/o inmunológica de polipéptidos de PTH nativos o que se producen de manera natural, en los que actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) producida por un polipéptido de PTH nativo o que se produce de manera natural distinta a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo frente a un epítopo antigénico presente en un polipéptido de PTH nativo o que se produce de manera natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo frente a un epítopo antigénico presente en un polipéptido de PTH nativo o que se produce de manera natural.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en los que el objetivo es prevenir o ralentizar (aliviar) el estado o trastorno patológico objetivo. Los que necesitan tratamiento incluyen aquéllos que ya tienen el trastorno, así como aquéllos propensos a tener el trastorno o aquéllos en los que ha de prevenirse el trastorno.

"Mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, otros primates, tales como monos, chimpancés y gorilas, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, para deportes, para laboratorio o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, roedores, etc. Para los fines de tratamiento, el mamífero es preferiblemente un ser humano.

"Vehículos", tal como se usa en el presente documento, incluyen vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se está exponiendo a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una disolución acuosa de pH tamponado. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un único sitio de unión a antígenos; y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento "F(ab')_{2}" que tiene dos sitios de combinación con antígeno y que todavía puede reticular antígenos.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígenos completo del anticuerpo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en la que interaccionan las tres CDR de cada dominio variable para definir un sitio de unión a antígenos en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígenos. Sin embargo, por ejemplo, incluso un único dominio variable (por ejemplo, la parte VH o VL del dímero Fv o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) puede tener la capacidad para reconocer y unirse a antígenos, aunque posiblemente, a una menor afinidad que la del sitio de unión completo.

Un fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' en la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

"Fase sólida" significa una matriz no acuosa a la que pueden adherirse los anticuerpos descritos en el presente documento. Ejemplos de fases sólidas englobadas en el presente documento incluyen aquéllas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcohol vinílico) y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, las fases sólidas pueden comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la patente estadounidense número 4.275.149.

El término "liposoma" se usa en el presente documento para indicar una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que son útiles para el suministro de un fármaco (tal como un polipéptido de PTH o un anticuerpo del mismo) a un mamífero. Los componentes de los liposomas se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos en las membranas biológicas.

El término "molécula pequeña" se usa en el presente documento para describir una molécula con un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radioetiquetado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o el marcador también pueden ser terapéuticos. En la técnica se conocen y pueden usarse diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glicoproteínas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{15}N, ^{35}S, ^{90}Y, ^{99}Tc, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido-fósforo), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa del rábano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos de biotinilo quimioluminiscentes, epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un grupo indicador secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, las etiquetas están unidas mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

La expresión "fármaco o agente farmacéutico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición o compuesto químico que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. En el presente documento, se usan otros términos de química según el uso convencional en la técnica, tal como se explica a modo de ejemplo en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Therms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente pura" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, partiendo de una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (partiendo de una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta obtener la homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios.

Estructura de los anticuerpos

Se sabe que la unidad estructural básica de los anticuerpos comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de los antígenos. La parte carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión a anticuerpos. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones de entramado (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, denominadas también regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones de entramado, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Secuencias de proteínas de interés inmunológico (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. 1991) (1987), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-83 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-21 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un proceso que requiere relativamente mucha mano de obra en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y los rendimientos y el grado de pureza generalmente son inferiores para los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab' y Fv).

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos

Los anticuerpos humanos evitan ciertos problemas asociados con los anticuerpos que presentan regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de tales proteínas derivadas de ratón o rata puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria frente al anticuerpo por parte del paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de ratón o rata, pueden generarse anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de la función del anticuerpo humano en un roedor de modo que el roedor produce anticuerpos completamente humanos.

Anticuerpos humanos

Un método para generar anticuerpos completamente humanos es a través del uso de cepas de ratón XenoMouse® que se han modificado por ingeniería genética para que contengan genes de la cadena pesada y de la cadena ligera humanas dentro de su genoma. Por ejemplo, en Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) se describe un ratón XenoMouse® que contiene fragmentos de configuración de línea germinal de 245 kb y 190 kb de tamaño del locus de la cadena pesada y el locus de la cadena ligera kappa humanos. El trabajo de Green et al. se extendió a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la utilización de fragmentos de YAC de configuración de línea germinal, con dimensiones de orden mega de los loci de cadena pesada y los loci de cadena ligera kappa humanos, respectivamente. Véase, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56 (1997) y la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996. Además, se han generado ratones XenoMouse® para que contengan el locus entero de la cadena ligera lambda (solicitud de patente estadounidense con número de serie 60/334.508, presentada el 30 de noviembre de 2001). Y se han generado ratones XenoMouse® que producen múltiples isotipos (véase, por ejemplo, el documento WO 00/76310). Las cepas de XenoMouse® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).

La producción de ratones XenoMouse® se trata y se perfila adicionalmente en las solicitudes de patente estadounidense con números de serie 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996 y 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las patentes estadounidenses números 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598 y las patentes japonesas números 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véanse también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med., 188:483-495 (1998). Véase también la patente europea número EP 463.151 B1, concesión publicada el 2 de junio de 1996, la solicitud de patente internacional número WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional número WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, el documento
WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, el documento WO 00/76310, publicado el 21 de diciembre de 2000.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, se imita el locus exógeno de Ig a través de la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, se forman uno o más genes de V_{H}, uno o más genes de D_{H}, uno o más genes de J_{H}, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente, una región constante gamma) en un constructo para su inserción en un animal. Este enfoque se describe en la patente estadounidense número 5.545.807 concedida a Surani et al. y en las patentes estadounidenses números 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 concedidas cada una a Lonberg y Kay, en las patentes estadounidenses números 5.591.669 y 6.023.010 concedidas a Krimpenfort y Berns, en las patentes estadounidenses números 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 concedidas a Berns et al. y en la patente estadounidense número 5.643.763 concedida a Choi y Dunn y en las solicitudes de patente estadounidenses de GenPharm International con números de serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994. Véanse también la patente europea número 546.073 B1, las solicitudes de patente internacional números WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente estadounidense número 5.981.175. Véanse además Taylor et al., (1992), Chen et al., (1993), Tuaillon et al., (1993), Choi et al., (1993), Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

Kirin ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que se han introducido, través de fusión de microcélulas, grandes trozos de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea números 773.288 y 843.961.

Lidak Pharmaceuticals (ahora Xenorex) también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos en ratones SCID modificados mediante la inyección de leucocitos periféricos maduros no malignos procedentes de un donante humano. Los ratones modificados muestran una respuesta inmunitaria característica del donante humano con la estimulación con un inmunógeno, que consiste en la producción de anticuerpos humanos. Véanse las patentes estadounidenses números 5.476.996 y 5.698.767.

Las respuestas de los anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o por lo demás, humanizados. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se espera que se observen ciertas respuestas de anticuerpos humanos anti-quimérico (HACA), particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. Por tanto, sería deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos frente a PTH con el fin de invalidar las preocupaciones y/o los efectos de la respuesta de HAMA o HACA.

Tecnologías de presentación y humanización

Tal como se trató anteriormente en relación con la generación de anticuerpos humanos, surgen ventajas de producir anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Hasta cierto punto, esto puede llevarse a cabo en relación con técnicas de humanización y técnicas de presentación usando las bibliotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos murinos o los anticuerpos de otras especies pueden humanizarse o primatizarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Winter y Harris, Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et al., Crit, Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede modificarse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1, CH2, CH3, bisagra y/o el dominio de entramado por la secuencia humana correspondiente (véanse el documento WO 92/02190 las patentes estadounidenses números 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). Además, se conoce en la técnica el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes inmunoglobulina quiméricos (Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987) y J. Immunol. 139:3521 (1987)). Se aísla ARNm de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se usa para producir ADNc. El ADNc de interés puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202). Alternativamente, se prepara una biblioteca y se examina para aislar la secuencia de interés. Entonces se fusiona la secuencia de ADN que codifica para la región variable del anticuerpo con las secuencias de la región constante humana. Las secuencias de los genes de las regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", N.I.H. publicación número 91-3242 (1991). Los genes de la región C humana ya están disponibles a partir de clones conocidos. La elección del isotipo estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como la fijación del complemento o la actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los isotipos preferidos son IgG1, IgG3 e IgG4. Puede usarse cualquiera de las regiones constantes de la cadena ligera humana, kappa o lambda. Entonces se expresa el anticuerpo humanizado, quimérico mediante métodos
convencionales.

Pueden prepararse fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, F(ab')_{2} y Fab mediante la escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante la escisión química o por proteasas. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica para una parte del fragmento F(ab')_{2} incluiría secuencias de ADN que codifican para el dominio CH1 y para la región bisagra de la cadena H, seguido por un codón de terminación de la traducción para dar la molécula truncada.

Pueden usarse secuencias consenso de las regiones H y L J para diseñar oligonucleótidos para su uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para la posterior unión de segmentos de la región V a segmentos de la región C humana. Puede modificarse el ADNc de la región C mediante mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YAC, episomas derivados del VEB, y similares. Un vector conveniente es uno que codifica para una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados modificados por ingeniería genética de modo que pueda insertarse y expresarse fácilmente cualquier secuencia VH o VL. En tales vectores, habitualmente se produce corte y empalme entre el sitio donador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que se producen dentro de los exones CH humanos. Se produce poliadenilación y terminación de la transcripción en sitios de cromosoma nativos en el sentido de 3' de las regiones codificantes. El anticuerpo quimérico resultante puede unirse a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTR retrovirales, por ejemplo, el promotor temprano de SV-40, (Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), la LTR del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., P.N.A.S. 79:6777 (1982)) y la LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al., Cell 41:885 (1985)). Además, se apreciará que pueden usarse promotores de Ig nativos y similares.

Además, pueden generarse anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies a través de tecnologías de tipo presentación incluyendo, sin limitación, presentación en fagos, presentación en retrovirus, presentación en ribosomas y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en la técnica y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración adicional, tal como maduración de la afinidad, ya que tales técnicas se conocen bien en la técnica. Wright y Harris, citado anteriormente, Hanes y Plucthau, PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (presentación en ribosomas), Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1988) (presentación en fagos), Scott, TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Res. 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell y McCafferty, TIBTECH 10:80-84 (1992) y la patente estadounidense número 5.733.743. Si se utilizan tecnologías de presentación para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos pueden humanizarse tal como se describió anteriormente.

Usando esas técnicas, pueden generarse anticuerpos frente a células que expresan PTH, la propia PTH, formas de PTH, epítopos o péptidos de los mismos y bibliotecas de expresión para los mismos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.703.057) que después pueden examinarse tal como se describió anteriormente para determinar las actividades descritas anteriormente.

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos según la invención se prepararon a través de la utilización de la tecnología de XenoMouse®, tal como se describe más adelante. Tales ratones pueden producir entonces anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina humanos y son deficientes en la producción de anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr los mismos se dan a conocer en las patentes, solicitudes y bibliografía dada a conocer en la sección anterior, en el presente documento. En particular, sin embargo, una realización preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de los mismos se da a conocer en la solicitud de patente estadounidense número 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y en las solicitudes de patente internacional números WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), cuya descripción se incorpora al presente documento como
referencia.

Los anticuerpos, tal como se describen en el presente documento, son anticuerpos neutralizantes de alta afinidad frente a la PTH humana. Además, en algunas realizaciones, los anticuerpos establecen reacciones cruzadas con la PTH de rata. Históricamente se han usado varios métodos diferentes para generar anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales frente al extremo N-terminal de la PTH humana. Estos enfoques han incluido inmunizar con la PTH humana (hPTH) de longitud completa o la PTH bovina (bPTH) (Vieira et al., Braz. J Med. Biol. Res. 21:1005-1011 (1988)), con péptidos sintéticos de la PTH (1-34 ó 1-37) humana (Visser et al., Acta Endocrinol. 90:90-102 (1979)); Logue et al., J. Immunol. Methods 137:159-66 (1991)), y con péptidos antigénicos múltiples (MAP) de hPTH (1-10), hPTH (9-18) y PTH (24-37) (Magerlein et al., Drug Res. 48:783-87 (1998)). Estos enfoques no produjeron anticuerpos adecuados para agentes terapéuticos humanos. (Véase la sección titulada "Formulaciones y administración terapéutica" en el presente documento para comprobar los criterios terapéuticos.) Los anticuerpos de alta afinidad frente a hPTH son difíciles de preparar debido a la tolerancia de las células B al péptido. Sin embargo, Bradwell et al., (1999) han demostrado que la inmunización con una mezcla de MAP de la PTH (1-34) humana y de la PTH (1-34) bovina seguido por una mezcla de MAP humanos y bovinos dirigidos contra la hPTH (51-84) y la bPTH (51-86) son eficaces a la hora de cambiar la tolerancia de las células B a la PTH en un paciente humano con un tumor paratiroideo inoperable.

El enfoque descrito en el presente documento se diseñó para superar la tolerancia de las células B a la hPTH, así como para producir un anticuerpo monoclonal completamente humano adecuado para el uso terapéutico y de diagnóstico. Se inmunizaron animales XenoMouse® con péptidos sintéticos de PTH (PTHh (1-34) y PTHr (1-34)), ya que se han usado satisfactoriamente péptidos sintéticos para generar anticuerpos específicos frente a la PTH humana endógena (Visser et al., (1979)). Además, dado que el extremo N-terminal de la PTH murina está altamente conservado con respecto a la PTH humana (85% de identidad) y la PTH de rata (91%), se usó la combinación de los péptidos como un inmunógeno para cambiar la tolerancia de las células B a la PTH murina a través de mimetismo molecular, permitiendo de ese modo la generación de anticuerpos humanos anti-PTH humana de alta afinidad. Estos péptidos se acoplaron a la hemocianina de lapa californiana y se emulsionaron en adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund para potenciar la inmunogenicidad de estas proteínas.

Tras la inmunización, se recuperaron las células linfáticas (tales como las células B) de los ratones que expresaban anticuerpos, y tales líneas celulares recuperadas se fusionaron con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Se examinaron y se seleccionaron tales líneas celulares de hibridoma para identificar líneas celulares de hibridoma que produjeran anticuerpos específicos frente al antígeno de interés. En el presente documento, se describe la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos frente a PTH. Además, se proporciona una caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo análisis de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.

Alternativamente, en lugar de fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas, las células B pueden someterse a ensayo directamente. Por ejemplo, las células B CD19+ pueden aislarse a partir de ratones XenoMouse® hiperinmunes y puede permitirse que proliferen y se diferencien para dar células plasmáticas que secretan anticuerpos. Entonces se examinan los anticuerpos de los sobrenadantes de las células mediante ELISA para determinar la reactividad frente al inmunógeno de PTH. También se examinan los sobrenadantes para determinar la inmunorreactividad frente a fragmentos de PTH para mapear adicionalmente el epítopo de diferentes anticuerpos y con PTH de rata para determinar la reactividad cruzada de las especies. Entonces se aíslan células plasmáticas individuales que secretan anticuerpos con las especificidades deseadas usando un ensayo de placa hemolítica específico para PTH (Babcook et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). Las células seleccionadas como objetivo para la lisis son preferiblemente glóbulos rojos de oveja (SRBC) recubiertos con el antígeno de PTH. En presencia de un cultivo de células B que contiene células plasmáticas que secretan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica lisis mediada por PTH específica de los glóbulos rojos de oveja que rodean a la célula plasmática de interés. Puede aislarse la célula plasmática individual específica de antígeno en el centro de la placa y puede aislarse la información genética que codifica para la especificidad del anticuerpo de la célula plasmática individual. Como alternativa al cultivo de células B, pueden aislarse células plasmáticas específicas de antígeno directamente de linfocitos o esplenocitos CD138+ de animales hiperinmunes. Independientemente del método de aislamiento, puede clonarse el ADN que codifica para las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo tras llevar a cabo PCR con transcriptasa inversa. Tal ADN clonado puede insertarse entonces adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferiblemente un casete de vector tal como un pcDNA conteniendo más preferiblemente tal vector pcDNA los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina. El vector generado puede transfectarse entonces en células huésped, preferiblemente en células CHO, y pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. A continuación se describe el aislamiento de múltiples células plasmáticas individuales que producen anticuerpos específicos frente a PTH. Además, puede aislarse el material genético que codifica para la especificidad del anticuerpo anti-PTH, introducido en un vector de expresión adecuado que entonces puede transfectarse en células huésped.

En general, los anticuerpos producidos mediante las líneas celulares mencionadas anteriormente presentaban cadenas pesadas de IgG2 completamente humanas con cadenas ligeras kappa humanas. Los anticuerpos presentaban altas afinidades, presentando normalmente una constante de disociación (K_{D}) de desde aproximadamente 10^{-6} hasta aproximadamente 10^{-12} M, cuando se miden mediante cualquiera de fase sólida y fase en disolución. Se prefieren los anticuerpos que presentan una K_{D} de desde al menos 10^{-9} M, siendo altamente preferidos los anticuerpos que presentan K_{D} de 10^{-10}, 10^{-11} ó 10^{-12} M. Debido a la cinética de las interacciones de los anticuerpos monoclonales con antígenos secretados, la eficacia de la unión se reduce enormemente cuando la K_{D} del anticuerpo supera la concentración del antígeno. Para suprimir eficazmente los niveles del antígeno, la K_{D} del anticuerpo debe ser inferior a la concentración del antígeno.

En lo que respecta a la importancia de la afinidad para la utilidad terapéutica de los anticuerpos anti-PTH, se entenderá que pueden generarse anticuerpos anti-PTH, por ejemplo, de manera combinatoria, y que pueden evaluarse tales anticuerpos para determinar la afinidad de unión. Un enfoque que puede utilizarse es tomar el ADNc de la cadena pesada de un anticuerpo, preparado tal como se describió anteriormente y que se ha encontrado que tiene buena afinidad para la PTH, y combinarlo con el ADNc de la cadena ligera de un segundo anticuerpo, preparado tal como se describió anteriormente y que también se ha encontrado que tiene buena afinidad para la PTH, para producir un tercer anticuerpo. Las afinidades de los terceros anticuerpos resultantes pueden medirse tal como se describe en el presente documento y pueden aislarse y caracterizarse aquéllos con constantes de disociación deseables. Por ejemplo, basándose en la alta afinidad de unión de los anticuerpos AcM 183 anti-PTH y AcM 168 anti-PTH, puede unirse el ADNc de la cadena pesada del AcM 168 anti-PTH al ADNc de la cadena ligera del AcM 183 anti-PTH y el anticuerpo resultante puede someterse a ensayo para determinar la unión. Alternativamente, puede usarse la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente como una herramienta para ayudar en la generación de una cadena pesada que cuando se aparea con la cadena ligera mostrará una alta afinidad por la PTH, o viceversa. Por ejemplo, puede expresarse la cadena ligera o la región variable de la cadena ligera del AcM 183 anti-PTH con una biblioteca de cadenas pesadas o de regiones variables de cadenas pesadas. Estas regiones variables de cadenas pesadas en esta biblioteca podrían aislarse de animales no tratados, aislarse de animales hiperinmunes, generarse artificialmente a partir de bibliotecas que contienen secuencias variables de cadenas pesadas que difieren en las regiones CDR o generarse mediante cualquier otro método que produzca diversidad dentro de las regiones CDR de cualquier gen de las regiones variables de las cadenas pesadas (tales como mutagénesis al azar o dirigida). Estas regiones CDR, y en particular CDR3, pueden tener una longitud o una identidad de secuencia significativamente diferente de la cadena pesada apareada inicialmente con el AcM 183 anti-PTH. La biblioteca resultante podría examinarse entonces para determinar la unión de alta afinidad a PTH para generar una molécula de anticuerpo terapéuticamente relevante con propiedades similares a las del AcM 183 anti-PTH (alta afinidad y neutralización). Puede usarse un proceso similar usando la cadena pesada o la región variable de la cadena pesada para generar una molécula de anticuerpo terapéuticamente relevante con una región variable de cadena ligera única. Además, entonces puede usarse la región variable de la cadena pesada, o la región variable de la cadena ligera novedosas, de una manera similar tal como se describió anteriormente para identificar una región variable de la cadena ligera, o una región variable de la cadena pesada novedosas, lo que permite la generación de una molécula de anticuerpo novedosa.

Otro enfoque combinatorio que puede utilizarse es realizar la mutagénesis en las cadenas pesadas y/o ligeras de la línea germinal que se demuestra que se utilizan en los anticuerpos según la invención descrita en el presente documento, particularmente en las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las afinidades de los anticuerpos resultantes pueden medirse tal como se describe en el presente documento y pueden aislarse y caracterizarse aquéllos con constantes de disociación deseables. Con la selección de un agente de unión preferido, puede usarse la secuencia o las secuencias que codifica(n) para el mismo para generar anticuerpos recombinantes tal como se describió anteriormente. Los expertos en la técnica conocen métodos apropiados de realizar mutagénesis en un oligonucleótido e incluyen mutagénesis química, por ejemplo, con bisulfito de sodio, incorporación errónea enzimática y exposición a radiación. Se entiende que la invención descrita en el presente documento engloba anticuerpos con identidad sustancial, tal como se define en el presente documento, con respecto a los anticuerpos expuestos explícitamente en el presente documento, ya se hayan producido por mutagénesis o mediante cualquier otro medio. Además, en las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se incluyen anticuerpos con sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, tal como se define en el presente documento, realizadas en los anticuerpos expuestos explícitamente en el presente documento.

Otro enfoque combinatorio que puede usarse es expresar las regiones CDR, y en particular CDR3, de los anticuerpos descritos anteriormente en el contexto de las regiones de entramado derivadas de otros genes de la región variable. Por ejemplo, podrían expresarse CDR1 (GYSFTSYWIG (SEQ ID NO: 89)), CDR2 (IISPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 90)) y CDR3 (QGDYVWGSYDS (SEQ ID NO: 91)) de la cadena pesada del AcM 183 anti-PTH en el contexto de las regiones de entramado de otros genes variables de la cadena pesada. De manera similar, podrían expresarse CDR1 (KSSQSLLDSDGKTYLY (SEQ ID NO: 92)), CDR2 (EVSNRFS (SEQ ID NO: 93)) y CDR3 (MPSIHLWT (SEQ ID NO: 94)) de la cadena ligera del AcM 183 anti-PTH en el contexto de las regiones de entramado de otros genes variables de la cadena ligera. Además, podrían expresarse las secuencias de la línea germinal de estas regiones CDR en el contexto de otros genes de la región variable de la cadena pesada o ligera (por ejemplo, CDR2 de la cadena pesada: IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 95)). Los anticuerpos resultantes pueden someterse a ensayo para determinar la especificidad y la afinidad y pueden permitir la generación de una molécula de anticuerpo
novedosa.

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Además, puede crearse una CDR3 de cadena ligera con la capacidad para interaccionar con la PTH de la región D 21-10 de la línea germinal. Un marco de lectura de la forma de línea germinal de esta región D codifica para la región de unión central de CDR3 (YYDYVWGSYAYT (SEQ ID NO: 96)) tal como está subrayado. Podría expresarse la secuencia central subrayada, o fragmentos de la misma, con aminoácidos flanqueantes aleatorios para generar una CDR3 novedosa con especificidad similar a la CDR3 identificada en el AcM 183 anti-PTH. La nueva cadena pesada podría generar un anticuerpo con propiedades de unión similares o mejoradas en comparación con el AcM 183 anti-PTH original. También se podría mutar esta región D que codifica para CDR3 para generar un anticuerpo funcionalmente equivalente a AcM 183 anti-PTH. Por ejemplo, el ácido aspártico ("D") de la secuencia (DYVWGSY (SEQ ID NO: 97)) puede mutarse a cualquier otro aminoácido y cuando se aparea con una cadena ligera relevante, puede someterse a ensayo el nuevo anticuerpo para determinar la especificidad y la alta afinidad. De manera similar, pueden añadirse y/o eliminarse los aminoácidos codificados en la CDR3 de la cadena ligera alterando ligeramente la unión de la región V y la región J, así como alterando el número y la identidad de los nucleótidos usados para unir estos dos segmentos de cadena ligera.

En la realización preferida, las propiedades del AcM 183 anti-PTH incluyen, por ejemplo, la alta afinidad del anticuerpo por la PTH (K_{D} de 10^{-10} o mejor), la especificidad por un epítopo neutralizante en el extremo N-terminal de la PTH humana o proteínas ortólogas, la capacidad para neutralizar el flujo de calcio en las células que responden a PTH y la capacidad para inhibir la hipercalcemia en ratas a las que se ha infundido PTH humana. Los ejemplos son ilustrativos de los muchos medios posibles según la técnica actual de usar las secuencias de la invención para ayudar en la generación de un anticuerpo con propiedades similares al AcM 183 anti-PTH. Se considera que cualquier mejora a la técnica actual o cualquier generación de anticuerpos únicos a través de tecnología futura o convencional con las propiedades mencionadas anteriormente atribuibles al AcM 183 anti-PTH es "funcionalmente equivalente" al AcM 183 anti-PTH y por tanto, se incluye en las realizaciones de la invención descrita en el presente documento.

Tal como se apreciará, los anticuerpos según la invención descrita en el presente documento pueden expresarse en diversas líneas celulares. Pueden usarse secuencias que codifican para anticuerpos particulares para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o el vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo en las patentes estadounidenses números 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del huésped que va a transformarse. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por Polybrene, fusión con protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Se conocen bien en la técnica las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para su expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen niveles de expresión altos y producen anticuerpos con propiedades de unión a PTH constitutiva.

Mapeo de epítopos Análisis de inmunotransferencia

La unión de los anticuerpos descritos en el presente documento a PTH puede examinarse mediante varios métodos. Por ejemplo, puede someterse la PTH a SDS-PAGE y analizarse mediante inmunotransferencia. La SDS-PAGE puede llevarse a cabo o bien en ausencia o bien en presencia de un agente reductor. Tales modificaciones químicas pueden dar como resultado la metilación de residuos de cisteína. En consecuencia, es posible determinar si los anticuerpos anti-PTH descritos en el presente documento se unen a un epítopo lineal en PTH.

Desorción/ionización por láser de superficie mejorado

El mapeo de epítopos del epítopo para los anticuerpos anti-PTH descrito en el presente documento también puede realizarse usando SELDI. Se usan matrices de SELDI ProteinChip® para definir sitios de interacción proteína-proteína. Los antígenos se capturan específicamente con anticuerpos inmovilizados covalentemente en una superficie de matriz ProteinChip mediante una incubación y lavado iniciales. Los antígenos unidos pueden detectarse mediante un procedimiento de desorción inducida por láser y pueden analizarse directamente para determinar su masa. Tales fragmentos del antígeno que se unen se denominan el "epítopo" de una proteína.

El procedimiento de SELDI permite que se detecten directamente componentes individuales dentro de composiciones moleculares complejas y que se mapeen cuantitativamente con respecto a otros componentes de una manera rápida, sumamente sensible y ampliable. SELDI utiliza una matriz diversa de químicas de superficie para capturar y presentar grandes números de moléculas de proteína individuales para su detección mediante un procedimiento de desorción inducida por láser. El éxito del procedimiento SELDI se define en parte por la miniaturización y la integración de múltiples funciones, cada una dependiente de tecnologías diferentes, sobre una superficie ("chip"). Los biochips de SELDI y otros tipos de sondas de SELDI son superficies "mejoradas" de manera que se convierten en agentes participantes activos en la captura, purificación (separación), presentación, detección y caracterización de las moléculas objetivo individuales (por ejemplo, proteínas) o de la población de moléculas que va a evaluarse.

Un único biochip de proteínas de SELDI, cargado con sólo la muestra original, puede leerse miles de veces. Los biochips de proteínas de SELDI de LumiCyte contienen hasta 10.000 ubicaciones de acoplamiento de proteínas direccionables por 1 centímetro cuadrado. Cada ubicación puede revelar la presencia de docenas de proteínas individuales. Cuando se compara la información de la composición de proteínas para cada ubicación y se combinan conjuntos de información únicos, el mapa de composición resultante revela una imagen con conjuntos de características que se usan colectivamente para definir patrones específicos o "huellas" moleculares. Diferentes huellas pueden asociarse con diversos estadios de salud, con el comienzo de una enfermedad o con la regresión de la enfermedad asociada con la administración de agentes terapéuticos apropiados.

El procedimiento de SELDI puede describirse en más detalle en cuatro partes. Inicialmente, se captura o se "acopla" una o más proteínas de interés en la matriz ProteinChip, directamente del material fuente original, sin preparación de la muestra y sin etiquetado de la muestra. En una segunda etapa, se mejora la razón "señal-ruido" reduciendo el "ruido" químico y biomolecular. Tal "ruido" se reduce a través de la retención selectiva de la molécula objetivo en el chip eliminando por lavado los materiales no deseados. Además, una o más de la(s) proteína(s) objetivo que se capturan se leen mediante un procedimiento rápido, sensible, inducido por láser (SELDI) que proporciona información directa acerca de la molécula objetivo (peso molecular). Finalmente, puede caracterizarse in situ la proteína objetivo en cualquiera de una o más ubicaciones dentro de la matriz llevando a cabo una o más reacciones de unión sobre el chip o de modificación para caracterizar la estructura y la función de la proteína.

Presentación en fagos

El epítopo para los anticuerpos anti-PTH descrito en el presente documento puede determinarse exponiendo la matriz ProteinChip a una biblioteca combinatoria de 12 meros peptídicos aleatorios presentados en un fago filamentoso (New England Biolabs).

La presentación en fagos describe una técnica de selección en la que se expresa un péptido como una fusión con una proteína de la envuelta de un bacteriofago, dando como resultado la presentación de la proteína fusionada sobre la superficie del virión. Se lleva a cabo la selección mediante la incubación de una biblioteca de péptidos presentados en fagos con una placa o un tubo recubierto con la molécula objetivo, eliminando por lavado el fago unido y eluyendo el fago unido específicamente. Entonces se amplifica el fago eluido y se pasa a través de ciclos adicionales de unión y amplificación para enriquecer el conjunto en favor de las secuencias de unión. Tras tres o cuatro rondas, se somete a prueba adicionalmente la unión de clones individuales para determinar la unión mediante ensayos de ELISA en fagos realizados en pocillos recubiertos con anticuerpos y se caracterizan mediante la secuenciación de ADN específica de los clones positivos.

Tras múltiples rondas de tal selección frente a los anticuerpos anti-PTH descritos en el presente documento, el fago unido puede eluirse y someterse a estudios adicionales para la identificación y la caracterización del péptido unido.

Uso de diagnóstico

Los anticuerpos según la invención descrita en el presente documento son útiles para ensayos de diagnóstico y, particularmente, para ensayos in vitro, por ejemplo, para su uso en la determinación del nivel de PTH circulante en el torrente circulatorio. Es posible determinar la presencia y/o la gravedad de hiperparatiroidismo en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno de PTH. Se toman muestras del paciente, preferiblemente sangre, y más preferiblemente suero sanguíneo, de sujetos en los que se ha diagnosticado que están en diversos estadios en evolución del hiperparatiroidismo, y/o en diversos puntos en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Se determina la concentración del antígeno de PTH presente en las muestras de sangre usando un método que determina específicamente la cantidad del antígeno que está presente. Un método de este tipo incluye un método de ELISA en el que, por ejemplo, pueden inmovilizarse convenientemente los anticuerpos de la invención en una matriz insoluble, tal como una matriz polimérica. Usando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para niveles conocidos de evolución o tratamiento, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada nivel.

Con el fin de determinar el grado de hiperparatiroidismo en un sujeto en estudio, o de caracterizar la respuesta del sujeto a un ciclo de la terapia, se extrae una muestra de sangre del sujeto y se determina la concentración del antígeno de PTH presente en la muestra. La concentración así obtenida se usa para identificar en qué intervalo de concentraciones se encuentra el valor. El intervalo así identificado se correlaciona con un nivel de evolución de la enfermedad o con un nivel de tratamiento identificado en las diversas poblaciones de sujetos diagnosticados, proporcionando de ese modo un nivel en el sujeto en estudio.

La amplificación y/o la expresión génica pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern convencionales para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda etiquetada apropiadamente, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, pueden etiquetarse los anticuerpos y puede llevarse a cabo el ensayo en el se une el dúplex a una superficie, de manera que con la formación del dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, para detectar cualitativa o cuantitativamente la expresión de proteínas de PTH. Tal como se observó anteriormente, el anticuerpo está equipado preferiblemente con una etiqueta detectable, por ejemplo fluorescente, y puede monitorizarse la unión mediante microscopía óptica, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas son particularmente adecuadas si el gen amplificado codifica para una proteína de la superficie celular, por ejemplo, para un factor de crecimiento. Tales ensayos de unión se llevan a cabo tal como se conoce en la técnica.

La detección in situ de la unión del anticuerpo a la proteína de PTH puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica. Para este fin, se extrae una muestra de tejido del paciente y se aplica a ella un anticuerpo etiquetado, preferiblemente recubriendo con el anticuerpo una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto génico de marcador en el tejido examinado. Resultará evidente para los expertos en la técnica que se dispone fácilmente de una amplia variedad de métodos histológicos para la detección in situ.

Uno de los métodos cuantitativos más sensibles y más flexibles para cuantificar la expresión génica diferencial es RT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de la muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNm relacionados estrechamente y para analizar la estructura del ARN.

La primera etapa es el aislamiento del ARNm de una muestra objetivo. El material de partida normalmente es ARN total aislado de un tejido enfermo y correspondiente a tejidos normales, respectivamente. Por tanto, puede extraerse el ARNm, por ejemplo, de muestras congeladas o guardadas incluidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina) de tejido enfermo para su comparación con tejido normal del mismo tipo. Los métodos para la extracción de ARNm se conocen bien en la técnica y se dan a conocer en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los métodos para la extracción de ARN de tejidos incluidos en parafina se dan a conocer, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest., 56:A67 (1987), y De Andrés et al., BioTechniques, 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento del ARN puede llevarse a cabo usando un kit de purificación, un conjunto de tampón y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, puede aislarse el ARN total de células en cultivo usando minicolunmas Qiagen RNeasy. Puede aislarse el ARN total de muestras de tejido usando RNA Stat-60 (Tel-Test).

Dado que el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en el análisis de expresión génica diferencial mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN en ADNc, seguido por su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas más comúnmente con la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa normalmente se ceba usando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo de los perfiles de expresión. Por ejemplo, puede realizarse la transcripción inversa del ARN extraído usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces puede usarse el ADNc derivado como molde en la reacción PCR posterior.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, normalmente emplea la Taq ADN polimerasa, que tiene actividad nucleasa en sentido 5'-3' pero carece de actividad endonucleasa en sentido 3'-5'. Por tanto, la PCR de TaqMan utiliza normalmente la actividad nucleasa en sentido 5' de Taq o Tth polimerasa para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa en sentido 5' equivalente. Se usan dos cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no puede extenderse mediante la enzima Taq ADN polimerasa, y se etiqueta con un colorante fluorescente indicador y un colorante fluorescente extintor. Cualquier emisión inducida por láser a partir del colorante indicador se extingue mediante el colorante de extinción cuando los dos colorantes se ubican cercanos entre sí cuando están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en disolución, y la señal del colorante indicador liberado está libre del efecto de extinción del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante indicador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR de TaqMan puede realizarse usando equipos comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, el sistema de detección de secuencias ABI PRIZM 7700TM (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, se lleva a cabo el procedimiento de nucleasa en sentido 5' en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el sistema de detección de secuencias ABI PRIZM 7700TM. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo acoplado por carga (DAC), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos, y se detecta en el DAC. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de nucleasa en sentido 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Tal como se trató anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra por primera vez la señal fluorescente como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct). Los valores de \DeltaCt se usan como medición cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico cuando se compara la expresión de ARN en una célula de un tejido enfermo con la de una célula normal.

Para minimizar errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR se realiza habitualmente usando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN más frecuentemente usado para normalizar patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento de la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y \beta-actina.

También puede identificarse la expresión génica diferencial, o confirmarse usando la técnica de micromatriz. En este método, se siembran en placa secuencias de nucleótidos de interés, o se alinean, sobre un sustrato de microchip. Entonces se hibridan las secuencias alineadas con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés.

En una realización específica de la técnica de micromatriz, los insertos amplificados por PCR de clones de ADNc se aplican a un sustrato en una matriz densa. Preferiblemente, se aplican al sustrato al menos 10.000 secuencias de nucleótidos. Los genes microalineados, inmovilizados sobre el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc etiquetadas de manera fluorescente a través de la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa del ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc etiquetadas aplicadas al chip se hibridan de manera selectiva con cada punto de ADN sobre la matriz. Tras un lavado riguroso para eliminar las sondas no específicamente unidas, se escanea el chip mediante microscopía láser confocal. La cuantificación de la hibridación de cada elemento alineado permite la evaluación de la abundancia de ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas con la matriz sondas de ADNc etiquetadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN. Por tanto, la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondiente a cada gen especificado se determina simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación proporciona una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para gran número de genes. Se ha mostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos poco comunes, que se expresan a pocas copias por célula, y que detectan de manera reproducible al menos aproximadamente diferencias de dos veces en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(20) L106-49). La metodología de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de micromatriz se conocen bien en la técnica.

Antagonistas y agonistas de PTH

Las realizaciones de la invención descrita en el presente documento están relacionadas también con variantes de una proteína de PTH que funciona o bien como agonistas de PTH (miméticos) o bien como antagonistas de PTH. Pueden generarse variantes de una proteína de PTH mediante mutagénesis, por ejemplo, truncamiento o mutación puntual diferenciada de la proteína de PTH. Un agonista de la proteína de PTH puede conservar sustancialmente las mismas, o un subconjunto de, las actividades biológicas de la forma que se produce de manera natural de la proteína de PTH. Un antagonista de la proteína de PTH puede inhibir una o más de las actividades de la forma que se produce de manera natural de la proteína de PTH mediante, por ejemplo, la unión competitiva a un miembro en sentido 3' o sentido 5' de una cascada de señalización celular que incluye la proteína de PTH. Por tanto, pueden provocarse efectos biológicos específicos mediante tratamiento con una variante de función limitada. En una realización, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que se produce de manera natural de la proteína tiene menos efectos secundarios en un sujeto en relación con el tratamiento con la forma que se produce de manera natural de la proteína de PTH.

Pueden identificarse variantes de la proteína de PTH que funcionan o bien como agonistas de PTH (miméticos) o bien como antagonistas de PTH examinando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de la proteína de PTH para detectar actividad antagonista o agonista de proteína. En una realización, se genera una biblioteca abigarrada de variantes de PTH variantes mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y se codifica mediante una biblioteca de genes abigarrada. Puede producirse una biblioteca abigarrada de variantes de PTH mediante, por ejemplo, ligamiento enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de modo que puede expresarse un conjunte degenerado de posibles secuencias de PTH como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para presentación la en fagos) que contiene el conjunto de secuencias de PTH en el mismo. Existe una variedad de métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de posibles variantes de PTH a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. Puede realizarse la síntesis química de una secuencia génica degenerada en un sintetizador de ADN automático, y entonces ligarse el gen sintético en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican para el conjunto deseado de posibles secuencias de variantes de PTH. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakura et al., Science 198:1056 (1984); Ike et al., Nucl. Acid Res. 11:477 (1983).

Criterios adicionales para agentes terapéuticos de anticuerpos

Tal como se trata en el presente documento, la función del anticuerpo frente a PTH parece importante para al menos una parte de su modo de funcionamiento. Por función, se quiere decir, a modo de ejemplo, la actividad del anticuerpo anti-PTH en la unión a PTH. Por consiguiente, en ciertos sentidos, puede ser deseable en relación con la generación de anticuerpos como candidatos terapéuticos frente a PTH que los anticuerpos puedan fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por ejemplo, puede hacerse que los anticuerpos anti-PTH según realizaciones de la invención descrita en el presente documento puedan tener una función efectora, incluyendo CDC y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Existen varios isotipos de anticuerpos que pueden realizar lo mismo, incluyendo, sin limitación, los siguientes: IgM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgM humana, IgG1 humana e IgG3 humana. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan presentar inicialmente un isotipo de este tipo sino que, más bien, el anticuerpo a medida que se genera puede presentar cualquier isotipo y puede cambiarse el isotipo del anticuerpo después usando técnicas convencionales que se conocen bien en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.816.397 y la patente estadounidense número 6.331.415), técnicas de fusión célula-célula (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.916.771 y 6.207.418),
entre otras.

En la técnica de fusión célula-célula, se prepara una línea celular de mieloma u otra que presenta una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otra línea celular de mieloma u otra que presenta la cadena ligera. Tales células pueden, después, fusionarse y puede aislarse una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

A modo de ejemplo, ciertos anticuerpos anti-PTH de la invención descrita en el presente documento son anticuerpos IgG2 humanos anti-PTH. Si un anticuerpo de este tipo presentara la unión deseada a la molécula de PTH, podría cambiarse fácilmente de isotipo para generar un isotipo de IgM humana, IgG1 humana o IgG3 humana, presentando aún la misma región variable (que define la especificidad de anticuerpo y parte de su afinidad).

Por consiguiente, a medida que se generan candidatos de anticuerpo que satisfacen los atributos "estructurales" deseados tal como se trató anteriormente, pueden dotarse en general de ciertos atributos "funcionales" alternativos a través del cambio de isotipo.

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Diseño y generación de otros agentes terapéuticos

Según realizaciones de la invención descrita en el presente documento y basadas en la actividad de los anticuerpos que se producen y se caracterizan en el presente documento con respecto a PTH, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de restos de anticuerpo. Tales modalidades incluyen, sin limitación, agentes terapéuticos de anticuerpos avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas y agentes terapéuticos radioetiquetado, generación de agentes terapéuticos de péptidos, terapias génicas, particularmente anticuerpos intracelulares, agentes terapéuticos antisentido y moléculas pequeñas.

En relación con la generación de agentes terapéuticos de anticuerpos avanzados, en los que la fijación de complemento es un atributo deseable, puede ser posible eludir la dependencia del complemento para destruir células a través del uso de anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas o radioetiquetas, por ejemplo.

Por ejemplo, en relación con los anticuerpos biespecíficos, pueden generarse anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad para PTH y otro frente a una segunda molécula que se conjugan entre sí, (ii) un único anticuerpo que tiene una cadena específica para PTH y una segunda cadena específica para una segunda molécula o (iii) un anticuerpo de una única cadena que tiene especificidad para PTH y la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que se conocen bien por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véase por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, citado anteriormente. y en relación con (iii) véase por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Supl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad puede hacerse para los receptores de activación de la cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (véase por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)).

En relación con las inmunotoxinas, pueden modificarse anticuerpos para que actúen como inmunotoxinas utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la patente estadounidense número 5.194.594. En relación con la preparación de anticuerpos radioetiquetados, tales anticuerpos modificados pueden prepararse también fácilmente utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Junghans et al. en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2ª edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes estadounidenses números 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471, y 5.697.902.

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Formulaciones y administración terapéutica

Pueden usarse anticuerpos anti-PTH biológicamente activos según la invención descrita en el presente documento en una formulación o preparación farmacéutica estéril para reducir el nivel de PTH en suero tratando de ese modo de manera eficaz estados patológicos en los que, por ejemplo, la PTH en suero está elevada de manera anómala. Tales estados incluyen, por ejemplo, hiperparatiroidismo, tal como hiperparatiroidismo primario, secundario y terciario, hipercalcemia e hiperfosfatemia. El anticuerpo anti-PTH presenta preferiblemente una afinidad adecuada para suprimir de manera potente la PTH hasta dentro del intervalo terapéutico objetivo, y preferiblemente tiene una duración de acción adecuada para permitir una dosificación poco frecuente. En el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario en pacientes sometidos a hemodiálisis, la PTH debe suprimirse preferiblemente mediante la administración del anticuerpo con una duración mínima de al menos dos días para proporcionar una eficacia continua entre las sesiones de diálisis, que se producen tres veces a la semana. Tal duración de la acción permite la dosificación intravenosa en el momento de la hemodiálisis, lo que dará como resultado mayores cumplimiento y comodidad para los pacientes y profesionales sanitarios. En otras poblaciones de pacientes con hiperparatiroidismo, una duración de la acción prolongada superior a dos días, preferiblemente de tres a cinco días, más preferiblemente de siete a diez días, permitirá programas de dosificación menos frecuentes y más convenientes por vías parenterales alternativas tales como inyección subcutánea o intramuscular.

La preferencia por una alta afinidad y duración de la acción prolongada se extiende a todos los estados de hiperparatiroidismo, tales como hiperparatiroidismo primario, hiperparatiroidismo secundario e hiperparatiroidismo terciario. Una duración de la acción prolongada conveniente es una que supera preferiblemente dos días, preferiblemente una que supera de cinco a siete días, más preferiblemente una que supera diez días, tras una única dosis del anticuerpo. Un anticuerpo preferido de la invención tiene una K_{D} de 10^{-10} M, una semivida que supera los 1,5 días, preferiblemente de 2 a 4 días, más preferiblemente de 6 a 10 días y suprime los niveles de PTH circulante en más del 50%, preferiblemente en más del 60%, 65% o el 70%, más preferiblemente en más del 75%, 80% o el 85%. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo que muestra una supresión superior al 75% durante más de 1,5 días.

Los anticuerpos anti-PTH biológicamente activos de la presente invención pueden emplearse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, el tratamiento actual aprobado para el hiperparatiroidismo secundario debido a insuficiencia renal crónica (IRC) consiste en (1) calcitriol (forma activa de la vitamina D) y análogos, que actúan para promover la absorción de calcio en el tubo digestivo, (2) carbonato de calcio con las comidas para unirse a fosfato y prevenir su absorción en el intestino y (3) otros agentes de unión a fosfato. Una de las principales causas de hiperparatiroidismo secundario en IRC es los altos niveles de fosfato en suero que actúan directamente sobre las glándulas paratiroideas haciendo que produzcan PTH. Los niveles de fosfato aumentan debido a una excreción de fosfato inadecuada debido a la insuficiencia renal. Los tratamientos actuales mencionados anteriormente actúan para prevenir la resorción ósea y podrían usarse en combinación con los anticuerpos de la invención descrita en el presente documento en un régimen terapéutico.

Cuando se usa para administración in vivo, la formulación de anticuerpos debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o tras la liofilización y reconstitución. El anticuerpo se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en disolución. Las composiciones de anticuerpos terapéuticas se colocan generalmente en un envase que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, un vial o una bolsa de disolución intravenosa que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración de anticuerpo es según métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, inhalación o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida tal como se indica más adelante. El anticuerpo se administra preferiblemente de manera continua mediante infusión o mediante inyección en bolo.

Una cantidad eficaz de anticuerpo que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. El progreso de este tratamiento se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en el presente documento.

Los anticuerpos según la invención pueden prepararse en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse por vía intravenosa o a través de la nariz o el pulmón, preferiblemente como un aerosol (liofilizado) en polvo o líquido. La composición puede administrarse también por vía parenteral o por vía subcutánea según se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril, estar libre de pirógenos y en una disolución aceptable para vía parenteral prestando la debida consideración al pH, la isotonicidad y la estabilidad. Los expertos en la técnica conocen estas condiciones.

En resumen, las formulaciones de dosificación de los compuestos de la invención descrita en el presente documento se preparan para su almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Pueden formularse composiciones estériles para inyección según la práctica farmacéutica convencional tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA 1990). Por ejemplo, puede desearse la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que se produce de manera natural como aceite de sésamo, cacahuete o semilla de algodón o vehículo graso sintético como oletao de etilo o similares. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y similares según la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos, películas o microcápsulas conformados. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) tal como se describe por Langer et al., J. Biomed Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense número 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma etilo (Sidman et al., Biopolimers, 22:547-56 (1983)), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., citado anteriormente), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP 133.988).

Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el organismo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden preverse estrategias razonables para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio de disulfuros, la estabilización puede conseguirse modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Las composiciones de liberación sostenida incluyen también anticuerpos atrapados en liposomas de la invención. Los liposomas que contienen tales anticuerpos se preparan mediante métodos conocidos per se: patente estadounidense número DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82:3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-34 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses números 4.485.045 y 4.544.545; y documento
EP 102.324.

La dosificación de la formulación de anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico encargado teniendo en cuenta diversos factores que se sabe que modifican la acción de los fármacos incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento y la vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Las dosificaciones terapéuticamente eficaces pueden determinarse o bien mediante métodos in vitro o bien in vivo.

Una cantidad eficaz del anticuerpo de la invención que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Las concentraciones de dosificación deseables incluyen 0,001 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg y 100 mg/kg o más. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. El progreso de este tratamiento se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o tal como se describe en el presente
documento.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados conseguidos, se proporcionan sólo para fines ilustrativos y no han de interpretarse como limitativos de la invención descrita en el presente documento.

Ejemplo 1 Preparación de antígeno de PTH

Se usaron los siguientes péptidos de PTH en los experimentos descritos en el presente documento.

200

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Estos péptidos se adquirieron de Bachem California Inc., Torrance, CA. PTH (1-84) de Cynomolgus se adquirió también de CS Bio Company, Inc., San Carlos, CA.

Preparación de antígeno. Se preparó el antígeno usado para la inmunización de animales XenoMouse® tal como sigue. Se mezcló PTH1-34 humana (500 mcg) con PTHL-34 de rata (500 mcg) y se disolvió en 500 mcl de tampón de conjugación (MES 0,1 M, NaCl 0,9 M, pH 4,7). Se disolvieron dos miligramos de hemocianina de lapa californiana (KLH; Pierce, Rockford, IL) en 200 mcl de agua destilada y entonces se añadieron a la mezcla de PTH. Se reticularon PTH y KLH mediante la adición de 50 mcl de una disolución madre de 10 mg/ml de clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, Pierce, Rockford, IL) e incubación de la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente. Se eliminó la EDC sin reaccionar mediante diálisis durante la noche a través de una membrana de punto de corte de 1 kDa frente a PBS pH 7,4.

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Ejemplo 2 Anticuerpos anti-PTH Generación de anticuerpos

Inmunización de animales. Se desarrolló anticuerpo monoclonal frente a PTH mediante inmunización secuencial de ratones XenoMouse® (XenoMouse® XG2, Abgenix, Inc. Fremont, CA). Se usaron como antígeno PTH de rata y humana de 34 meros sintéticas (50/50) acopladas a KLH tal como se describió anteriormente. La inmunización inicial fue con 10 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón. Se realizaron inmunizaciones de recuerdo posteriores en primer lugar con 10 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón, seguido de tres inyecciones con 10 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con IFA, y entonces una inmunización de recuerdo final de 10 \mug de antígeno mezclado 1:1 v/v con IFA por ratón. En particular, se inmunizó cada ratón en la base de la cola mediante inyección subcutánea. Se inmunizaron los animales en los días 0, 14, 28, 42 y 54. Se extrajo la sangre de los animales en el día 49 para obtener sueros para la selección de recogida tal como se describe a continuación.

Selección de animales para la recogida. Se determinaron los títulos de anticuerpos anti-PTH mediante ELISA. Se aplicó PTH (84 meros; 1 \mug/ml) sobre placas de 96 pocillos de poliestireno de unión Costar Labcoat Universal (Coming, Acton, MA) durante la noche a cuatro grados. Se eliminó la disolución que contenía PTH sin unir y se trataron las placas con luz UV (365 nm) durante 4 minutos (4000 microjulios). Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se valoraron sueros de XenoMouse® de los animales inmunizados con PTH, o animales de XenoMouse® sin tratar, en leche al 2%/PBS a diluciones 1:2 por duplicado a partir de una dilución inicial 1:100. El último pocillo se dejó como blanco. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se añadió un anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa del rábano específico de Fc (HRP, Pierce, Rockford, IL) anti-IgG humana a una concentración final de 1 \mug/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se revelaron las placas con la adición de sustrato cromogénico TMB (Gaithersburg, MD) durante 30 minutos y se detuvo el ELISA mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Se determinó el título específico de los animales XenoMouse® individuales a partir de la densidad óptica a 450 nm y se muestran en la tabla 2. El título representa la dilución recíproca del suero y por tanto, cuanto más alto es el número, mayor es la respuesta inmunitaria humoral frente a PTH.

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TABLA 2

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Se seleccionaron animales XenoMouse® (M469-4, M469-6, M469-8 y M469-9) para la recogida basándose en los datos de serología de la tabla 2.

Cultivo y selección de células B. Se cultivaron células B de los animales de los que se recogió y se aislaron aquéllos que secretaban anticuerpos específicos frente a PTH tal como se describe en Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-48 (1996). Se usó ELISA, realizado tal como se describió anteriormente, para identificar pocillos específicos de PTH primarios. Se examinaron cien placas cultivadas a 500, 250, 125 ó 50 células/pocillo con respecto a PTH para identificar los pocillos específicos de antígeno y 98 pocillos mostraron DO significativamente por encima del fondo (0,1), de lo que se muestra una muestra representativa en la tabla 3.

TABLA 3

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Estos datos indicaban una frecuencia muy baja de resultados positivos e indicaban que los pocillos eran monoclonales para la especificidad de antígeno a todas las diluciones celulares. Se volvieron a examinar estos 98 pocillos positivos con respecto al antígeno (tabla 4) y se encontró que sólo que 48 pocillos se repetían como pocillos claramente específicos de antígeno. Se analizaron estos 48 pocillos para determinar la unión a o bien hPTH7-84 o bien hPTH18-48. Se deseaban anticuerpos específicos frente a hPTH7-34 ya que era improbable que éstos establecieran reacciones cruzadas con PTHrp humana. Se identificó un total de 14 pocillos con reactividad o bien por hPTH7-84 o bien por PTH18-48 y se analizaron posteriormente estos pocillos para determinar la afinidad relativa usándolos en análisis de ELISA de antígeno limitante tal como se describe a continuación. El pocillo 292A10 era la fuente de AcM 183 anti-PTH. Este pocillo se unía de manera adecuada a PTH 1-84 humana (DO 1,4), PTH 7-84 humana (DO 1,95), PTH 18-48 humana (DO 3,26) y PTH 1-84 de rata (DO 0,66). Estos datos eran cualitativos y eran útiles para indicar que este anticuerpo se une a PTH entre los aminoácidos 18 y 34 (ya que el inmunógeno era sólo el fragmento N-terminal 1-34) y que este anticuerpo podía unirse a PTH de rata.

Análisis de antígeno limitante. El análisis de antígeno limitante es un método que clasifica la afinidad de los anticuerpos específicos de antígeno en los sobrenadantes de cultivo de células B en relación con todos los otros anticuerpos específicos de antígeno. El concepto es que en presencia de un recubrimiento muy bajo de antígeno, sólo los anticuerpos de mayor afinidad podrán unirse a cualquier nivel detectable en equilibrio. (Véase, por ejemplo, el documento U.S.S.N. 60/337.250, presentado el 3 de diciembre de 2001.) Se unió PTH biotinilada a placas de estreptavidina a 25 ng/ml durante 30 minutos a temperatura ambiente en placas de cultivo de 96 pocillos. Se lavó cada placa 5 veces con dH_{2}O, antes de añadirse 40 \mul de leche al 1% en PBS con azida de sodio al 0,05% a la placa, seguido de 10 \mul de sobrenadante de células B añadido a cada pocillo. Tras 18 horas a temperatura ambiente en un agitador, se lavaron de nuevo las placas 5 veces con dH_{2}O. A cada pocillo se le añadieron 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-(Fc)-HRP humano a 1 \mug/ml. Tras 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo las placas 5 veces con dH_{2}O y se añadieron 50 \mul de sustrato TMB a cada pocillo. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 \mul de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo y se leyeron las placas a 450 nm de longitud de onda dando los resultados mostrados en la tabla 4.

La cuantificación del anticuerpo específico de antígeno en los sobrenadantes de cultivo de células B ha indicado los intervalos de concentración de desde 10 ng/ml hasta 500 ng/ml. Ya que es difícil determinar la concentración de anticuerpo específico de antígeno en cada pocillo específico de antígeno, se compararon los resultados generados a partir del análisis de antígeno limitante con una valoración de anticuerpos recombinantes a concentraciones comparables (de 2 ng/ml a 100 ng/ml). En este ensayo, menos de la mitad de los anticuerpos podían proporcionar una unión detectable y el pocillo 292A10 (AcM 183 anti-PTH) era claramente superior tal como se midió mediante D.O. con respecto a los otros sobrenadantes de cultivo y anticuerpos recombinantes a todas las concentraciones (tabla 4).

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TABLA 4

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Ensayo de placa hemolítica específica de PTH. Se necesitaron varios reactivos especializados para realizar el ensayo. Estos reactivos se prepararon tal como sigue.

Biotinilación de glóbulos rojos de oveja (SRBC). Se almacenaron SRBC en medios RPMI como una disolución madre al 25%. Se obtuvo un sedimento de células empaquetadas de SRBC de 250 \mul tomando alícuotas de 1,0 ml de la disolución madre en un tubo Falcon de 15 ml, separando por centrifugación las células y retirando el sobrenadante. Entonces se resuspendió el sedimento celular en 4,75 ml de PBS a pH 8,6 en un tubo de 50 ml. En un tubo de 50 ml separado, se añadieron 2,5 mg de sulfo-NHS-biotina a 45 ml de PBS a pH 8,6. Una vez se había disuelto completamente la biotina, se añadieron 5 ml de SRBC y se rotó el tubo a TA durante 1 hora. Se centrifugaron los SRBC a 3000 g durante 5 min., se retiró el sobrenadante y 25 ml de PBS a pH 7,4 como lavado. Se repitió el ciclo de lavado 3 veces, entonces se añadieron 4,75 ml de medio para células inmunitarias (RPMI 1640 con FCS al 10%) a los 250 \mul de sedimento de SRBC biotinilados (B-SRBC) para resuspender suavemente los B-SRBC (disolución madre de B-SRBC al 5%). La disolución madre se almacenó a 4ºC hasta que se necesitó.

Recubrimiento con estreptavidina (SA) de B-SRBC. Se transfirió un ml de la disolución madre de B-SRBC al 5% en un tubo Eppendorf nuevo. Se sedimentaron las células B-SRBC con una centrifugación por pulsos a 8000 rpm (6800 rcf) en microcentrífuga, se retiró el sobrenadante, se resuspendió el sedimento en 1,0 ml de PBS a pH 7,4, y se repitió la centrifugación. Se repitió el ciclo de lavado 2 veces, entonces se resuspendió el sedimento de B-SRBC en 1,0 ml de PBS a pH 7,4 dando una concentración final del 5% (v/v). Se añadieron 10 \mul de una disolución madre de estreptavidina 10 mg/ml (CalBiochem, San Diego, CA) y se mezcló el tubo y se rotó a TA durante 20 min. Se repitieron las etapas de lavado y se resuspendieron los SA-SRBC en 1 ml de PBS a pH 7,4 (5% (v/v)).

Recubrimiento con PTH 1-34 humana de SA-SRBC. Se recubrieron los SA-SRBC con PTH 1-34 humana biotinilada a 10 \mulg/ml, se mezclaron y rotaron a TA durante 20 min. Se lavaron los SRBC dos veces con 1,0 ml de PBS a pH 7,4 tal como anteriormente. Se resuspendieron los SRBC recubiertos con PTH en RPMI (+ FCS al 10%) hasta una concentración final del 5% (v/v).

Determinación de la calidad de PTH-SRBC mediante inmunofluorescencia (IF). Se añadieron 10 \mul de SA-SRBC al 5% y 10 \mul de SRBC recubiertos con PTH al 5% cada uno a un tubo Eppendorf de 1,5 ml nuevo separado que contenía 40 \mul de PBS. Se añadió un anticuerpo humano anti-PTH control a cada muestra de SRBC a 45 \mug/ml. Se rotaron los tubos a TA durante 25 min., y entonces se lavaron las células tres veces con 100 \mul de PBS. Se resuspendieron las células en 50 \mul de PBS y se incubaron con 2 mcg/ml de anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG humana conjugado con Alexa488 (Molecular Probes, Eugene, OR). Se rotaron los tubos TA durante 25 min., y entonces se lavaron con 100 \mul de PBS y se resuspendieron las células en 10 \mul de PBS. Se colocaron por puntos 10 \mul de las células teñidas sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio, se cubrió con un cubreobjetos de vidrio, se observó bajo luz fluorescente y se puntuó en una escala arbitraria de 0-4.

Preparación de células plasmáticas. Se recogió el contenido de un único pocillo de microcultivo que se había identificado previamente mediante diversos ensayos que contenía un clon de células B que secretaba la inmunoglobulina de interés. Usando una pipeta Pipettman de 100-1000 \mul, se recuperó el contenido del pocillo añadiendo RPMI a 37ºC (+ FCS al 10%). Se resuspendieron las células pipeteando y entonces se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml nuevo (volumen final de aproximadamente 500-700 \mul). Se centrifugaron las células en una microcentrífuga a 1500 rpm (240 rcf) durante 2 minutos a temperatura ambiente, entonces se rotó el tubo 180 grados y se centrifugó de nuevo durante 2 minutos a 1500 rpm. Se retiró el medio congelado y se resuspendieron las células inmunitarias en 100 \mul de RPMI (FCS al 10%), entonces se centrifugaron. Se repitió este lavado con RPMI (FCS al 10%) y se resuspendieron las células en 60 \mul de RPMI (FCS) y se almacenaron sobre hielo hasta que estuvieran listas para su uso.

Ensayo en placa. Se prepararon portaobjetos de vidrio (2 x 3 pulgadas) por adelantado con bordes de silicona y se dejaron endurecer durante la noche a TA. Antes de su uso se trataron los portaobjetos con aproximadamente 5 \mul de SigmaCoat (Sigma, Oakville, ON) pasado de manera uniforme sobre la superficie de vidrio, se dejó secar y entonces se limpió vigorosamente. A una muestra de 60 \mul de células se le añadieron 60 \mul de cada uno de SRBC recubiertos con PTH (disolución madre al 5% v/v), 4x disolución madre de complemento de cobaya (Sigma, Oakville, ON) preparada en RPMI (FCS) y 4x disolución madre de sueros de potenciación (1:900 en RPMI (FCS)). Se colocó por puntos la mezcla (3 - 5 \mul) sobre los portaobjetos preparados y se cubrieron los puntos con aceite de parafina sin diluir. Se incubaron los portaobjetos a 37ºC durante un mínimo de 45 minutos.

Resultados del ensayo en placa. El recubrimiento de los glóbulos rojos de oveja con PTH 1-34 humana funcionó muy bien. Se determinó de manera cualitativa mediante microscopía inmunofluorescente que el recubrimiento era muy alto (4/4) usando un anticuerpo anti-PTH humano control para detectar el recubrimiento en comparación con un reactivo de detección secundario solo (0/4). No se detectó ninguna señal usando un anticuerpo anti-PTH humano control en glóbulos rojos que se habían recubierto sólo con estreptavidina (0/4). Entonces se usaron estos glóbulos rojos para identificar células plasmáticas específicas de antígeno del pocillo 292A10 (véase la tabla 5). Tras la micromanipulación para recuperar las células plasmáticas específicas de antígeno, se recuperaron los genes que codificaban para los genes de la región variable mediante RT-PCR en una célula plasmática individual.

TABLA 5

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Expresión, purificación y caracterización de AcM 183 anti-PTH

Expresión. Tras el aislamiento de las células plasmáticas individuales, se extrajo ARNm y se realizó PCR con transcriptasa inversa para generar ADNc. Se amplificó de manera específica el ADNc que codificaba para las cadenas ligera y pesada variables usando la reacción en cadena de la polimerasa. Se clonó la región de cadena pesada variable en un vector de expresión de IgG2. Se generó este vector mediante clonación del dominio constante de IgG2 humana en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON). Se clonó la región de cadena ligera variable en un vector de expresión de IgK. Se generó este vector mediante clonación del domino constante de IgK humana en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON). Entonces se colipofectaron los vectores de expresión de la cadena pesada y la cadena ligera en una placa de 60 mm de células embrionarias humanas de riñón 293 confluentes al 70% y se dejó que las células transfectadas secretaran un anticuerpo recombinante con especificidad idéntica a la de la célula plasmática original durante 24 horas. Se recogió el sobrenadante (3 ml) de las células HEK 293 y se demostró la secreción de un anticuerpo intacto (AcM 183 anti-PTH) con un ELISA de tipo sándwich para detectar de manera específica IgG humana (tabla 7). Se evaluó la especificidad de AcM 183 anti-PTH a través de la unión del anticuerpo recombinante frente a PTH usando ELISA (tabla 6). También se demostró la capacidad de este anticuerpo para unirse a PTH de rata usando un método de ELISA (tabla 7) tal como se mide mediante D.O.

TABLA 6

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TABLA 7

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Las pruebas de ELISA de secreción se realizaron tal como sigue. Se recubrieron las placas control con anticuerpo de cabra anti-IgG humana H+L 2 mg/ml durante la noche tal como para las placas de unión. Se aplicó PTH humana o de rata (84 meros; 1 \mug/ml) sobre placas de 96 pocillos de poliestireno de unión Costar Labcoat Universal y se mantuvo durante la noche a cuatro grados. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se valoraron los anticuerpos recombinantes 1:2 para 7 pocillos a partir del sobrenadante de minilipofección sin diluir. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se añadió un anticuerpo de cabra conjugado con HRP específico de Fc anti-IgG humana a una concentración final de 1 \mug/ml durante 1 hora a TA para la secreción y los dos ensayos de unión. Se lavaron las placas cinco veces con dH_{2}O. Se revelaron las placas con la adición de TMB durante 30 minutos y se detuvo el ELISA mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Se analizó cada placa de ELISA para determinar la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm.

Purificación de AcM 183 anti-PTH. Para la producción a mayor escala de AcM 183 anti-PTH, se lipofectaron los vectores de expresión de las cadenas ligera y pesada (2,5 \mug de cada cadena/placa) en diez placas de 100 mm que eran confluentes al 70% con las células HEK 293. Se incubaron las células transfectadas a 37ºC durante 4 días, se recogió el sobrenadante (6 ml) se sustituyó por 6 ml de medio nuevo. En el día 7, se retiró el sobrenadante y se reunió con la recogida inicial (total de 120 ml de las 10 placas). Se purificó el anticuerpo AcM 183 anti-PTH a partir del sobrenadante usando una cromatografía de afinidad en proteína A-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (1 ml). Se eluyó el anticuerpo de la columna de proteína A con 500 mcl de glicina 0,1 M pH 2,5. Se dializó el eluato en PBS pH 7,4 y se esterilizó mediante filtración. Se analizó el anticuerpo mediante SDS-PAGE no reductora para evaluar la pureza y el rendimiento.

Se han preparado depósitos de ADN de plásmido que codifica para la cadena pesada y la cadena ligera de AcM 183 anti-PTH, bajo las condiciones del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 1080 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, con el número de depósito ATCC PTA-4311 para la cadena pesada y PTA-4310 para la cadena ligera. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en el presente documento es inadecuada para permitir la práctica de cualquier realización de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni ha de interpretarse como limitativo del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Se retirarán todas las restricciones sobre el acceso a los depósitos según se requiera por la legislación y/o regulaciones aplicables.

Fallo de AcM 183 anti-PTH en la unión a péptido relacionado con PTH (1-34). Se evaluó indirectamente la capacidad de AcM 183 anti-PTH para unirse a proteína relacionada con PTH (PTHrP) a través de su capacidad para unirse a PTH 1-34 humana en presencia de niveles de saturación de péptido relacionado con PTH con respecto a una valoración 3-log. Se unió la PTH 1-34 humana biotinilada a placas de estreptavidina a 1 \mug/ml durante 30 minutos a TA. Se lavaron las placas 5 veces con dH_{2}O. Entonces se valoró AcM 183 anti-PTH 1:2 a partir de 1 \mug/ml en presencia o ausencia de proteína relacionada con PTH 1-34 5 \mug/ml. Entonces se transfirió el anticuerpo valorado a la placa recubierta con PTH 1-34 humana y se dejó unir durante 1 hora a TA. Tras lavar las placas 5 veces con dH_{2}O, se añadieron 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-(Fc)-HRP humano a 1 \mug/ml a cada pocillo y se mantuvieron las placas 1 hora a TA. Tras lavar las placas 5 veces con dH_{2}O, se añadieron 50 \mul de sustrato TMB a cada pocillo. Para detener la reacción, se añadieron 50 \mul de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo. Se leyeron las placas a 450 nm de longitud de onda. No había nada de inhibición de la unión de AcM 183 anti-PTH a PTH 1-34 humana incluso a AcM 183 anti-PTH 1 ng/ml en presencia de PTHrp 5000 ng/ml tal como se muestra en la tabla 8.

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TABLA 8

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Análisis cinéticos. Se evaluaron las mediciones cinéticas del anticuerpo anti-PTH (AcM 183 anti-PTH) usando la tecnología KinExA. Este método implica la determinación basada en disolución de mediciones formales de afinidad en equilibrio. Se usó el análisis de curva doble con dos concentraciones de anticuerpo conocidas y una concentración de antígeno desconocida para determinar las mediciones de K_{D} en 34 meros de ser humano, 84 meros de ser humano, 84 meros de Cynomolgus y 84 meros de rata. Se determinó que la K_{D} era de aproximadamente 10-30 pM para la PTH (1-84 ó 1-34) humana sintética y PTH (1-84) de Cynomolgus (CS Bio Company, Inc., San Carlos, CA) a temperatura ambiente. La K_{D} de AcM 183 anti-PTH era inferior (3000 pM) para la PTH 1-84 de rata sintética a temperatura ambiente.

También se determinó la afinidad de AcM 183 anti-PTH por la PTH humana en el suero reunido de pacientes sometidos a hemodiálisis con enfermedad renal en estadio final. Se determinó la afinidad de unión usando un análisis de Scatchard basado en inmunoensayo. La afinidad de unión para PTH humana endógena era de 60 pM, lo que concuerda con la alta afinidad observada para la PTH humana sintética usando la tecnología KinExA.

También se determinó la afinidad (K_{D}) de otros anticuerpos monoclonales específicos de PTH (tabla 9). Se encontró que estos anticuerpos tenían una afinidad significativamente inferior (350 - 5000 pM) que AcM 183 anti-PTH (80 pM) tal como se determinó usando la tecnología BiaCore (Amersham Pharmacia). También se encontró que con la mayoría de estos anticuerpos recombinantes se podía mapear un epítopo o una region similar en la PTH contenida dentro de los aminoácidos (18-34) que AcM 183 anti-PTH (tabla 10). Se ha mostrado que esta región o este epítopo están implicados en la unión al receptor y, como tal, los anticuerpos frente a este epítopo tienen una fuerte posibilidad de presentar actividad de neutralización (Duvos et al., Bone, (1995) 17:403-406).

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TABLA 9

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TABLA 10

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Pueden calcularse constantes cinéticas adicionales a partir de los datos de BiaCore usando los métodos descritos en su bibliografía de producto. Una constante de velocidad de unión (k_{a}) es el valor que representa la fuerza (el alcance) de la unión de un anticuerpo con un antígeno diana tal como se calcula basándose en la cinética de la reacción antígeno-anticuerpo. Una constante de velocidad de disociación (k_{d}) es el valor que representa la fuerza (el alcance) de la disociación de este anticuerpo monoclonal del antígeno diana tal como se calcula basándose en la cinética de la reacción antígeno-anticuerpo. La constante de disociación (K_{D}) es el valor obtenido dividiendo el valor de la constante de velocidad de disociación (k_{d}) entre la constante de velocidad de unión (k_{a}). Se usaron estas constantes como indicadores que representan la afinidad de los anticuerpos por el antígeno y la actividad de neutralización del antígeno. Se calcularon los valores para k_{a} y k_{d} para los anticuerpos mostrados en la tabla 10 y se facilitan en la
tabla 11.

TABLA 11

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18

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Neutralización in vitro de la bioactividad de PTH con AcM 183 anti-PTH. La PTH suministra su señal biológica a células que responden a través de los 34 aminoácidos N-terminales. AcM 183 anti-PTH se une a los aminoácidos 18-34 y por tanto puede ser capaz de inhibir la actividad biológica. Como sistema modelo se usó la línea celular osteoblástica de rata UMR-106. La PTH humana y de rata se unen a las células UMR-106 y activan el receptor de PTH. Tras la activación, el receptor aumenta el nivel de calcio intracelular. Se monitorizó el calcio intracelular mediante el cambio de la fluorescencia en células cargadas con un colorante fluorescente sensible al calcio, que se midió mediante lector de placas de imágenes fluorescentes (FLIPR). Para determinar si el AcM 183 anti-PTH podía neutralizar el efecto de la PTH, se incubó previamente el anticuerpo con PTH y se detectó mediante FLIPR su efecto sobre la entrada de calcio inducida por PTH en las células UMR-106. AcM 183 anti-PTH bloqueaba la entrada de calcio inducida por 200 nM de PTH 1-34 humana de una manera dependiente de la dosis. El valor de CI_{50} para AcM 183 anti-PTH era de aproximadamente 100 nM tal como se demuestra en la figura 1.

Neutralización in vivo de la bioactividad de la PTH con AcM 183 anti-PTH. Se evaluó la capacidad de AcM 183 anti-PTH para neutralizar la PTH humana in vivo infundiendo la PTH humana de 34 meros sintética en ratas y administrando posteriormente AcM 183 anti-PTH o PBS. Se administró el 34 mero por vía subcutánea a través de una bomba osmótica durante una semana (50 mcg/kg/día) comenzando el día 1 del estudio. Se usó la respuesta hipercalcémica frente a la PTH infundida como biomarcador para evaluar la neutralización de la bioactividad de la PTH por el anticuerpo anti-PTH. Se administró AcM 183 anti-PTH (3 ó 10 mg/kg) o un anticuerpo control de isotipo coincidente (PK 16.3.1, 10 mg/kg) el día 3 del estudio después de que se hubiera desarrollado hipercalcemia grave en las ratas. AcM 183 anti-PTH revertía los efectos hipercalcémicos de la PTH infundida durante todo el transcurso del experimento a ambos niveles de dosis (figura 2).

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Ejemplo 3 Análisis estructural de anticuerpos anti-PTH

Se secuenciaron las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables para los anticuerpos mostrados en la tabla 1 anterior para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para todos los anticuerpos anti-PTH se muestra en la lista de secuencias presentada junto con el presente documento, incluyendo las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para cada combinación de cadena gamma y kappa.

Se analizaron las secuencias de nucleótidos de cadena pesada variable para determinar la familia VH, la secuencia de la región D y la secuencia de la región J. Entonces se tradujeron las secuencias para determinar la secuencia primaria de aminoácidos y se compararon con las secuencias de la región VH, D y J de la línea germinal para evaluar las hipermutaciones somáticas. Las secuencias primarias de aminoácidos de todas las cadenas pesadas anti-PTH se muestran en la figura 3. Las secuencias de la línea germinal se muestran arriba y las mutaciones se indican con la nueva secuencia de aminoácidos. Los aminoácidos de la secuencia que eran idénticos a los de la secuencia de la línea germinal indicada se indican con un guión (-). Se analizó la cadena ligera de manera similar para determinar las regiones V y J y para identificar cualquier mutación somática a partir de las secuencias de cadena ligera de la línea germinal (figura 4).

Ejemplo 4 Uso de anticuerpos anti-PTH como agente de diagnóstico Detección de antígeno de PTH en una muestra

Puede desarrollarse un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la detección de antígeno de PTH en una muestra. En el ensayo, se adsorben pocillos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 384 pocillos, durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal dirigido frente al antígeno. El anticuerpo inmovilizado sirve como anticuerpo de captura para cualquier antígeno que pueda estar presente en una muestra de prueba. Se enjuagan los pocillos y se tratan con un agente de bloqueo tal como albúmina o proteína de la leche para evitar la adsorción no específica del analito.

Posteriormente se tratan los pocillos con una muestra de prueba de la que se sospecha que contiene el antígeno, o con una disolución que contiene una cantidad patrón del antígeno. Una muestra de este tipo puede ser, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto del que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante que se consideran diagnóstico de patología.

Tras eliminar enjuagando la muestra de prueba o el patrón, se tratan los pocillos con un segundo anticuerpo anti-PTH monoclonal totalmente humano que se etiqueta mediante conjugación con biotina. El anticuerpo anti-PTH etiquetado sirve como anticuerpo de detección. Tras eliminar enjuagando el segundo anticuerpo en exceso, se tratan los pocillos con peroxidasa del rábano conjugada con avidina (HRP) y un sustrato cromogénico adecuado. Se determina la concentración del antígeno en las muestras de prueba mediante comparación con una curva patrón desarrollada a partir de las muestras patrón.

Este ensayo ELISA proporciona un ensayo sumamente específico y muy sensible para la detección del antígeno de PTH en una muestra de prueba.

Determinación de la concentración de PTH en la muestra de un paciente

Se desarrolla un ELISA tipo sándwich para cuantificar los niveles de PTH en suero de sangre humana. Los dos anticuerpos monoclonales anti-PTH usados en el ELISA tipo sándwich reconocen epítopos diferentes sobre la molécula de PTH. Se realiza el ELISA tal como sigue: se aplican 50 \mul de anticuerpo de captura anti-PTH en tampón de recubrimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, pH 9,6) a una concentración de 2 \mug/ml sobre placas de ELISA (Fisher). Tras la incubación a 4ºC durante la noche, se tratan las placas con 200 \mul de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%, timerosal al 0,01% en PBS) durante 1 h a 25ºC. Se lavan las placas (3x) usando Tween 20 al 0,05% en PBS (tampón de lavado, WB). Se diluyen sueros normales o de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) en tampón de bloqueo que contiene suero humano al 50%. Se incuban las placas con muestras de suero durante la noche a 4ºC, se lavan con WB y entonces se incuban con 100 \mul/pocillo de anticuerpo de detección anti-PTH biotinilado durante 1 h a 25ºC. Tras el lavado, se incuban las placas con HRP-estreptavidina durante 15 min., se lavan tal como anteriormente y entonces se tratan con 100 \mul/pocillo de o-fenilendiamina en H_{2}O_{2} (disolución de revelado de Sigma) para la generación de color. Se detiene la reacción con 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} (2 M) y se analiza usando un lector de placas de ELISA a 492 nm. Se calcula la concentración de antígeno de PTH en muestras de suero mediante comparación con diluciones de antígeno de PTH purificado usando un programa de ajuste de curvas de cuatro parámetros.

Ejemplo 5 Uso de anticuerpos anti-PTH para tratar el hiperparatiroidismo secundario

Para determinar los efectos in vivo del tratamiento con anticuerpos anti-PTH en pacientes humanos con hiperparatiroidismo secundario, se incluyen en un estudio varios pacientes humanos con enfermedad renal en estadio final. Los pacientes seleccionados se someten a diálisis durante al menos cuatro meses antes de la inclusión. Cada uno de los pacientes tiene antecedentes de valores de PTH en suero elevados superiores a 400 pg/ml cuando no recibían tratamiento.

Se inyectó a los pacientes durante una cierta cantidad de tiempo una cantidad eficaz de anticuerpo anti-PTH o placebo que contenían excipientes similares a los usados para formular el anticuerpo anti-PTH. A tiempos periódicos durante el tratamiento, se monitorizan los pacientes para determinar los niveles de calcio, fósforo, osteocalcina, fosfatasa alcalina ósea, PTH activa no unida, PTH total (anticuerpo unido y no unido) en suero y la densidad mineral ósea del radio, la cadera y la columna vertebral.

El análisis de los datos clínicos muestra que el anticuerpo anti-PTH reduce significativamente el nivel de PTH activa circulante tal como se determinó en el ejemplo anterior. Los pacientes tratados muestran también disminuciones significativas en los niveles en suero de osteocalcina y fosfatasa alcalina ósea. Los pacientes tratados pueden demostrar reducciones transitorias en el calcio en suero tras la primera dosis o con aumento de la dosis. Con el tiempo, aumentará la densidad mineral ósea del radio, la cadera y la columna vertebral en comparación con el nivel inicial de pacientes sin tratar. Por el contrario, los pacientes tratados con placebo mantienen niveles aumentados de PTH circulante, y densidad mineral ósea persistente o decreciente.

<110> Abgenix, Inc.

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Roskos, Lorin

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Foltz, Ian

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King, Chadwick

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<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS FRENTE A LA HORMONA PARATIFOIDEA (PTH) Y USOS DE LOS MISMOS

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<130> ABGENIX.092VPC

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<160> 97

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 360

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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19

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<210> 2

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<211> 120

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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20

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<210> 3

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<211> 333

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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21

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<210> 4

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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22

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<210> 5

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<211> 351

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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23

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<210> 6

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

24

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<210> 7

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<211> 337

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

25

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<210> 8

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

26

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<210> 9

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<211> 352

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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27

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<210> 10

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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28

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<210> 11

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<211> 337

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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30

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<210> 12

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

31

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<210> 13

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<211> 352

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 337

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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34

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<210> 16

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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35

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<210> 17

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<211> 352

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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36

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<210> 18

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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37

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<210> 19

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<211> 337

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

Claims (10)

1. Anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo, que se une a la hormona paratiroidea humana (PTH), en el que el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4.

2. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, es un anticuerpo completo.

3. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, es un fragmento de unión de un anticuerpo.

4. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Uso del anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hiperparatiroidismo.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que el hiperparatiroidismo es hiperparatiroidismo primario.

7. Uso según la reivindicación 5, en el que el hiperparatiroidismo es hiperparatiroidismo secundario.

8. Anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el tratamiento de hiperparatiroidismo.

9. Anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo según la reivindicación 8, en el que el hiperparatiroidismo es primario.

10. Anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión del mismo según la reivindicación 8, en el que el hiperparatiroidismo es hiperparatiroidismo secundario.