ES2316151T3 - Retrovirus del grupo de vih y su uso. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN NUEVO INMUNOVIRUS CON LA DENOMINACION MVP2901/94, QUE SE HA DEPOSITADO EN LA COLECCION EUROPEA DE CULTIVOS CELULARES ANIMALES (CECCA) CON EL NUMERO V 95012601. TAMBIEN SE DESCRIBEN LOS ANTIGENOS CARACTERISTICOS OBTENIDOS, QUE SE PUEDEN UTILIZAR PARA DEMOSTRAR LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS CONTRA RETROVIRUS, LOS CUALES ESTAN RELACIONADOS CON ENFERMEDADES DEL SISTEMA INMUNE, ASI COMO LAS SECUENCIAS PARCIALWA DEL ADN Y AMINOACIDOS DEL VIRUS.

Description

Retrovirus del grupo de VIH y su uso.

La presente invención se refiere a un nuevo retrovirus del grupo de VIH que se designa actualmente más precisamente como subtipo O de VIH. Se describe un procedimiento para el cultivo del retrovirus. La invención se refiere además a la obtención de este retrovirus así como al uso del virus con fines medicinales, para diagnóstico y en la preparación de vacunas.

Los retrovirus que pertenecen al grupo denominado VIH conducen en las personas infectadas por ellos a síntomas de enfermedad que se resumen en el término colectivo inmunodeficiencia o SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida).

Los estudios epidemiológicos prueban que el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) representa el agente etiológico de la inmensa mayoría de los casos de SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Un retrovirus aislado y caracterizado de un paciente en 1983 recibió la referencia VIH-1 (Barré-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871 [1983]). Se describe una variante de VIH-1 en el documento WO 86/02383.

Se identificó un segundo grupo de virus de inmunodeficiencia humana en 1985 en África Occidental (Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 [1986]) y se designó como virus de la inmunodeficiencia de tipo 2 (VIH-2) (documento EP-A-0.239.425). Los retrovirus VIH-2 se diferencian claramente de VIH-1, pero presentan también una conexión con los virus de inmunodeficiencia de simios (SIV-2). Como el VIH-1, también el VIH-2 conduce a una sintomatología de SIDA.

Por ANT70 (J. Vir., 1994, Vol. 68, Nº 3, pág. 1586-1596) y MVP-5180/91 (J. Vir., 1994, Vol. 68, Nº 3, pág. 1581-1585) se han descrito recientemente virus de IH novedosos que no pueden clasificarse en los subtipos de VIH-1 A-F. Debido a las claras diferencias estructurales con las cepas de VIH-1 conocidas, se han combinado ambos aislamientos temporalmente en el subtipo O (G. Myers, Base de datos de Los Álamos), aunque se diferencian claramente entre sí en la secuencia nucleotídica genómica.

Es una característica de los virus de inmunodeficiencia humana que presentan una alta variabilidad, que complica claramente la comparabilidad de los distintos aislamientos. En la comparación de diversos aislamientos de VIH-1, aparecen por ejemplo en algunas regiones del genoma altas variabilidades, mientras que otras regiones del genoma se presentan comparativamente conservadas (Benn, S. et al. Science 230, 949-951 [1985]). Ha podido observarse un muy alto polimorfismo también para VIH-2 (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]). La mayor estabilidad genética la poseen regiones de los genes gag y pol, que codifican proteínas estructurales y enzimáticas esenciales. En contraposición con esto, algunas regiones del genenv, así como los genes (vif, vpr, tat, rev, nef), que codifican proteínas reguladoras, presentan un alto grado de variabilidad.

Ha podido mostrarse también que los antisueros contra VIH-1 reaccionan de forma cruzada también con productos génicos de gag y pol de VIH-2, aunque sólo presentaban bajas homologías de secuencia. Igualmente, la hibridación entre ambos de estos virus era poco significativa, si se empleaban condiciones no muy poco rigurosas (Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695 [1986]).

Debido a la amplia difusión de los retrovirus del grupo VIH y al hecho de que entre el momento de la infección y el momento en que son observables síntomas inequívocos de alteraciones patológicas hay un intervalo de pocos a muchos años (2-20), es de gran importancia epidemiológica determinar la infección con retrovirus del grupo VIH lo antes posible y sobre todo fiablemente. Esto desempeña un papel no sólo en el diagnóstico de pacientes que presentan señales de inmunodeficiencia, sino aún más en el análisis de donantes de sangre. Se ha apuntado que, con el uso de retrovirus o componentes de los mismos de tipos VIH-1 o VIH-2, puede conducirse en sistemas de detección en muchos sueros a detecciones nulas o sólo débiles de anticuerpos aunque los pacientes de los que proceden los sueros presenten señales de inmunodeficiencia. Con la ayuda del retrovirus según la invención del grupo VIH, es posible en determinados casos dicha detección.

Particularmente para el diagnóstico, la diferenciación genotípica de los virus VIH representa un problema considerable. En el caso de virus VIH-1, se deduce que se modifica un nucleótido por genoma por ciclo de replicación.

Debido a esta variabilidad genética, los virus VIH pueden responder de forma extraordinariamente flexible a la presión de selección in vivo y producir de forma extremadamente rápida mutantes que son resistentes frente a principios activos farmacológicos o que pueden atacar a individuos que han configurado una cierta protección inmunitaria (Sharp et al., "Origins and diversity of human immunodeficiency viruses", AIDS 1994, Vol. 8, Supl. 1; S. 27-S 42).

Para impedir la propagación de infecciones, particularmente en transfusiones de sangre, pero también en donaciones de órganos, debe poder determinarse una infección por un virus VIH con una seguridad lo más cercana posible a un 100%. Por tanto, es necesario detectar diagnósticamente también aquellas infecciones que están causadas por un virus que actualmente sólo está difundido en determinadas regiones geográficas pero que, a menos que se tomen medidas de precaución adecuadas, pueden difundirse sin más también a Europa o los Estados Unidos de América.

Se describen el aislamiento y la caracterización de un nuevo virus de inmunodeficiencia humana, en adelante designado como MVP-2901/94, que se aisló en 1994 en linfocitos periféricos de una paciente de 24 años de Camerún que presentaba señales de inmunodeficiencia. Geográficamente, este retrovirus procede de una región de África que está localizada entre África Occidental con infección de virus VIH-2 y VIH-1 endémica y África Oriental con una difusión casi exclusivamente de VIH-1. Es por tanto objeto de la presente invención un nuevo retrovirus del subtipo O de VIH que se designa como MVP-2901/94, así como secuencias de ADN y secuencias aminoacídicas derivadas del mismo y kits de ensayo que contienen éstas.

El MVP-2901/94 puede propagarse en las líneas celulares MT2 y Jurkat. Se describen con detalle el aislamiento y reproducción de virus en el libro "Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991".

Para una mejor comprensión de las diferencias del virus MVP-2901/94 según la invención con los retrovirus VIH-1 y VIH-2, debe ilustrarse en primer lugar brevemente la configuración de los retrovirus causantes de la inmunodeficiencia. En el interior del virus se encuentra el ARN en un núcleo en forma de cono que está constituido por unidades proteicas que portan la referencia p24 (p de proteína). Este núcleo interno está recubierto por una cubierta proteica que está configurada por la proteína p17 (núcleo externo) y está recubierta por una cubierta glucoproteica que contiene, además de lípidos que proceden de las células hospedadoras, la proteína transmembrana gp41 y la proteína de cubierta 120 (gp120). Esta gp realiza entonces un enlace con los receptores CD-4 de las células hospedadoras.

Hasta donde es conocido, el ARN de los virus VIH presenta las siguientes regiones génicas, representadas simplificadas: en ambos extremos las denominadas repeticiones terminales largas (LTR) y las siguientes regiones génicas gag, pol, env y nef. El gen gag codifica entre otras las proteínas de núcleo p24 y p17, el gen pol codifica la transcriptasa inversa, la proteasa, la ARNasa H y la integrasa, y el gen env codifica las glucoproteínas gp41 y gp120 de la cubierta vírica. El gen nef codifica una proteína con función reguladora. Se muestra en la Figura 1 una disposición esquemática del genoma de retrovirus de tipo VIH.

Es un procedimiento aplicable muy versátilmente de la ingeniería genética la denominada PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en la que los componentes necesarios para la práctica del procedimiento pueden adquirirse comercialmente. Con este procedimiento, es posible amplificar secuencias de ADN si las regiones de ADN de la secuencia a amplificar son conocidas. Deben sintetizarse entonces fragmentos de ADN complementario cortos (oligonucleótidos: cebadores) que se unan a una región corta de la secuencia de ácido nucleico a amplificar. Para la práctica del ensayo, se combinan ácidos nucleicos de VIH con los cebadores en una mezcla de reacción que contiene adicionalmente una polimerasa y trifosfatos de nucleótidos. La polimerización (síntesis de ADN) se lleva a cabo durante un tiempo determinado y entonces se separan las cadenas de ácido nucleico mediante calentamiento. Después de enfriar, se inicia entonces de nuevo la polimerización. Por tanto, si en los retrovirus según la invención se trata de un virus VIH-1 o VIH-2, entonces deberían poder amplificarse los ácidos nucleicos usando cebadores que estén conservados dentro de las secuencias conocidas de los virus VIH-1 y VIH-2. Dichos cebadores se han especificado parcialmente (Lauré, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 para pol 3 y pol 4 u Ou C.Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 para sk 38/39, sk 68/69).

Sin embargo, estos cebadores no son capaces de amplificar ADN del aislado de VIH MVP-5180/91 (J. Vir., 1994, Vol. 68, nº 3, pág. 1581-1585). El uso de este cebador no conducía igualmente a una amplificación de ADN del aislado MVP-2901/94, lo que hablaba también de una fuerte divergencia de este aislamiento de la secuencia consenso de VIH-1. Por tanto, deberían construirse nuevos cebadores distintos derivados de secuencias conocidas conservadas lo más posible y utilizarse en todas las combinaciones posibles con variación de las condiciones de reacción. Sorprendentemente, resultó que la combinación de los cebadores 212 y 412 derivados de la secuencia del aislado MVP-5180/94 en las condiciones de reacción indicadas en el ejemplo 4 posibilitaba una amplificación del ADN de MVP-2901/94 y por tanto permitía un primer acceso a la secuencia del aislado.

(SEC ID Nº 1)

1

(SEC ID Nº 2)

2

Después de descifrar, como sucede aquí, una región parcial de la secuencia de un virus de IH, puede clonarse y secuenciarse el genoma completo del virus según procedimientos estándar conocidos de la biología molecular.

1) Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la clonación de un ADNc del siguiente modo: el virus se precipita de una cantidad de cultivo correspondientemente grande (aproximadamente 1 l) y se recoge en solución de sal común tamponada con fosfato. Se realiza entonces una sedimentación mediante un colchón de sacarosa (al 20%). El sedimento celular puede suspenderse en cloruro de guanidinio 6 M en ditiotreitol 20 mM y 0,5% de Nonidet P 40. Se añade CsCl hasta una concentración 2 M y se aplica la solución que contiene virus fragmentado sobre un colchón de cloruro de cesio. Se sedimenta entonces el ARN vírico mediante centrifugación, se disuelve, se extrae con fenol y se precipita con etanol y cloruro de litio. Con la ayuda de un cebador oligo(dT), se lleva a cabo la síntesis de la primera cadena de ADNc del ARN vírico o partes del mismo. La síntesis puede llevarse a cabo añadiendo transcriptasa inversa usando un kit obtenible comercialmente. Para la síntesis de la segunda cadena, se digiere la cadena de ARN del híbrido ARN/ADN con ARNasa H y se sintetiza la segunda cadena utilizando ADN polimerasa I de E. coli. Con la ayuda de ADN polimerasa T4, pueden producirse entonces extremos romos y unirse estos con engarces adecuados para sitios de corte de restricción. Después de la digestión de restricción con las endonucleasas de restricción adecuadas, se aísla el fragmento de ADNc de un gel de agarosa y se liga con un vector cortado anteriormente de modo adecuado. El vector con el inserto de ADNc puede usarse entonces para la transformación de células E. coli competentes. Las colonias obtenidas se transfieren entonces a membranas, se lisan y se desnaturalizan y finalmente se localizan mediante hibridación los ácidos nucleicos marcados con digoxigenina o biotina. Después de la preparación por ingeniería genética del correspondiente ADNc, es posible un aislamiento de los fragmentos de ADN deseados que proceden del retrovirus. Mediante el ensamblaje de estos fragmentos en vectores de expresión adecuados, puede expresarse entonces la proteína o fragmento de proteína deseado y utilizarse para los ensayos de diagnóstico.

2) Como alternativa a los procedimientos indicados, puede clonarse el ácido nucleico del virus de inmunodeficiencia con la ayuda de tecnología de PCR. Para ello, deben identificarse respectivamente cebadores de la región de secuencia aún desconocida que sean capaces de posibilitar una amplificación del ADN del aislamiento en combinación con cebadores derivados de la parte conocida de la secuencia.

3) Otra posibilidad, a partir del tramo de secuencia conocido del virus a clonar, es la clonación del ADN genómico provírico del virus. Para ello, se purifica en primer lugar ADN genómico de una línea celular infectada según procedimientos estándar. El ADN provírico integrado en el genoma hospedador puede clonarse entonces después de la creación y cribado de una genoteca. Para ello, se fragmenta parcialmente el ADN genómico, se aísla la fracción de los fragmentos de una longitud de 10-25 kb y se clona en un sistema vector que pueda incorporar fragmentos de esta longitud, como cósmidos o fagos lambda. Se transforma la mezcla de fragmentos genómicos mediante el sistema vector seleccionado en una cepa de E. coli. Mediante hibridación con un fragmento parcial de ADN presente clonado del virus buscado, que está marcado radiactivamente o de otro modo, pueden identificarse y aislarse vectores que contienen el genoma vírico (cribado en placa o colonia). Por tanto, se pone entonces a disposición el genoma vírico para un análisis de secuencia y una expresión de sus proteínas.

Entre los distintos aislados víricos, puede expresarse la similitud mediante el grado de homología de las secuencias de ácido nucleico o proteína. Una homología de un 50% significa, por ejemplo, que coinciden 50 de 100 posiciones nucleotídicas o aminoacídicas en las secuencias. La homología de proteínas se determina mediante análisis de secuencia. Las secuencias de ADN homólogas pueden establecerse también mediante la técnica de hibridación

Es por tanto objeto de la presente invención un virus de inmunodeficiencia del grupo de VIH que se ha depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) con el número V 95012601 con la referencia MVP-2901/94. El día de depósito es el 26 de enero de 1995.

Para la caracterización inmunológica del virus, son decisivos aquellos epítopes que causan una producción reforzada de anticuerpos en personas infectadas y que son adecuados por tanto para clasificar los virus en distintas subclases y subtipos. Se trata por tanto a este respecto particularmente no de aquellos epítopes que se proporcionan también en virus de los grupos VIH-1 y/o VIH-2, sino de aquellos epítopos que aparecen sólo en el virus depositado según la invención y en aquellas variantes que pertenecen al estrecho grupo del virus MVP-2901/94. Las propiedades morfológicas e inmunológicas del virus se reflejan también en la región relevante de diagnóstico de la proteína de cubierta.

El virus de inmunodeficiencia según la invención presenta una secuencia de ARN que es complementaria de la secuencia de ADN de la Tabla 1 y una homología con la secuencia de la Tabla 1 de al menos un 85%.

Es también objeto de la presente invención un ADNc que es complementario del ARN del virus de inmunodeficiencia MVP-2901/94 depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) con el nº V 95012601 o de un virus según la invención según la reivindicación 1.

Este ADNc se presenta en una forma de realización preferida en forma de ADN recombinante.

La invención comprende también antígenos que se preparan usando el ADNc según la invención o el ADN recombinante o usando la estructura aminoácida que puede derivarse de su ADNc. A este respecto, el antígeno es una proteína o péptido.

Los antígenos según la invención presentan una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada en la Tabla 1.

En una forma de realización especialmente preferida, el antígeno según la invención muestra una secuencia de aminoácidos NQQLLNLWGCKGKLICYTSVKWN.

La presente invención comprende también antígenos que se preparan a partir de un virus de inmunodeficiencia según la reivindicación 1 y se presentan, por ejemplo, en forma de preparaciones víricas purificadas. Se prefiere preparar el antígeno según la invención recombinantemente, pero también es posible preparar sintéticamente el antígeno, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida.

La invención comprende también kits de ensayo para la detección de anticuerpos contra virus causantes de la inmunodeficiencia que presentan al menos un antígeno según la invención.

En los kits de ensayo, puede tratarse de transferencia Western, ensayos ELISA o ensayos de detección de anticuerpo por fluorescencia. Para el diagnóstico de virus y particularmente de virus VIH, se ha apuntado en los últimos tiempos que son muy sensibles y eficaces aquellos procedimientos en los que se lleva a cabo una propagación (amplificación) de los ácidos nucleicos víricos o de una región especial de los mismos.

Pertenece a los procedimientos de detección conocidos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como alternativa a ella, puede usarse también la reacción en cadena de la polimerasa competitiva en la detección de infecciones por VIH (por ejemplo, AIDS (1993), 7, Supl. 2; S. 65 - S. 71).

Otro procedimiento de detección que ha ganado importancia en los últimos tiempos precisamente en el diagnóstico de VIH es el procedimiento NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico). Este procedimiento se describe, por ejemplo, en AIDS 1993, 7 (Supl. 2): S.107-S.110. En este procedimiento, se amplifica el ARN monocatenario o también el ADN bicatenario con la ayuda de ARN polimerasa T7 y a continuación se detecta.

Un procedimiento adicional para la detección de virus VIH es la detección con amplificación de señal con la ayuda de ADN ramificado. Este se describe, por ejemplo, en AIDS 1993, 7 (Supl. 2): S.11-S.14. En este procedimiento, hibrida el ácido nucleico vírico en muestras que están unidas a una fase sólida. Además, hibrida con la muestra una molécula detectora (estructuras de ADN ramificado) y se detecta entonces enzimáticamente.

En el procedimiento anterior, es común utilizar determinadas regiones de ácido nucleico en el procedimiento de detección que sean específicas del virus a detectar. En este procedimiento de detección, se seleccionan determinados fragmentos de ácido nucleico cortos, en los que se trata particularmente de fragmentos de ADN, y se utilizan en el procedimiento de detección.

Pueden usarse el virus de inmunodeficiencia según la invención, el ADNc según la invención, así como los antígenos para la detección de retrovirus que causan inmunodeficiencia.

Pueden usarse particularmente los antígenos según la invención para la preparación de vacunas.

Son también objeto de la invención ácidos ribonucleicos que codifican un virus según la invención.

En el marco de la presente invención, se ha secuenciado una parte de la proteína de cubierta que es de especial relevancia para el diagnóstico. Se trata a este respecto de una región de cubierta que comprende la zona del denominado bucle V3; la región secuenciada en el marco de la presente invención se extiende hasta la denominada región gp41.

En el marco de la presente invención, se ha secuenciado en primer lugar una parte de la proteína de cubierta y comprobado que esta secuencia presenta sólo una homología relativamente baja con las secuencias correspondientes de virus de tipo VIH. Referido particularmente a la región gp41, se ha edtablecido una homología de como máximo un 79,1% a nivel nucleotídico mediante una comparación con secuencias de VIH, que se ha llevado a cabo con la ayuda de bancos de datos.

El virus según la invención se diferencia por su secuencia de virus anteriormente conocidos. Son por tanto objeto de la presente invención aquellos virus así como las correspondientes secuencias de ADN o aminoácidos que corresponden en gran medida a la secuencia del virus según la invención, en los que el grado de desviación se comprueba mediante el grado de homología. Una homología de, por ejemplo, más de un 85%, significa por tanto que se comprenden aquellas secuencias que presentan al menos 85 a 100 nucleótidos o aminoácidos de los mismos nucleótidos o aminoácidos, mientras que el resto puede ser distinto. En la comprobación de la homología, se enfrentan ambas secuencias de modo que ajusten entre sí lo más posible todos los nucleótidos o aminoácidos correspondientes.

Mediante la secuencia aislada, pueden construirse y sintetizarse epítopos inmunodominantes (péptidos). Ya que la secuencia de ácido nucleico del virus es conocida, el experto puede derivar de ella la secuencia de aminoácidos. Se da una región parcial de la secuencia de aminoácidos en la Tabla 1. Se dan a conocer por tanto también antígenos, es decir, proteínas, oligo- o polipéptidos, que pueden prepararse con la ayuda de la información dada a conocer en la Tabla 1. Estos antígenos, proteínas, polipéptidos y oligopéptidos presentan secuencias aminoacídicas que se dan en la Tabla 1. Los antígenos o péptidos pueden presentarse secuencias parciales relativamente cortas de una secuencia de aminoácidos que se reproducen en la Tabla 1. Esta secuencia de aminoácidos es al menos de 10 aminoácidos, preferiblemente de al menos 20 y con especial preferencia de al menos 25 aminoácidos de longitud. Pueden prepararse estos péptidos no sólo con la ayuda de tecnología recombinante, sino también mediante procedimientos sintéticos. Es un modo de preparación adecuado la síntesis en fase sólida de tipo Merrifield. Puede encontrarse una descripción adicional de esta técnica y otros procedimientos conocidos en el estado de la técnica en la bibliografía, por ejemplo, M. Bodansky, et al., "Peptide Synthesis", John Weeley & Sons, 2ª edición 1976.

En los ensayos de diagnóstico, se combina una muestra de suero de la persona a examinar con las cadenas proteicas de una o varias proteínas o glucoproteínas (que pueden expresarse en líneas celulares eucarióticas), o partes de las mismas, que proceden de MVP-2901/94. Los procedimientos de ensayo preferidos incluyen procedimientos de ensayo de inmunofluorescencia o inmunoenzimáticos (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia).

En los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), puede unirse, por ejemplo, antígeno que procede de MVP-2901/94, o una variante del mismo, a las paredes de placas de microvaloración. La dosificación usada a este respecto depende esencialmente del sistema de ensayo y del tratamiento de las placas de microvaloración. Se añaden entonces suero o diluciones de suero que proceden de la persona a examinar a las depresiones de la placa de microvaloración. Después de un tiempo de incubación determinado, se lava la placa y se detectan los inmunocomplejos específicos mediante anticuerpos que se unen específicamente a inmunoglobulina humana y que se han unido previamente a una enzima, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc. o con un antígeno marcado enzimáticamente. Estas enzimas pueden transformar un sustrato incoloro en un producto fuertemente coloreado, y por la potencia de la coloración puede leerse entonces la presencia de anticuerpos específicos anti-VIH. Es una posibilidad adicional de uso del virus según la invención en sistemas de ensayo el uso en transferencias Western.

Aunque la preparación de vacunas contra enfermedades inmunodeficientes se ha probado excepcionalmente difícil, pueden usarse sin embargo también este virus o partes del mismo, es decir epítopos inmunodominantes e inductores de la inmunidad celular, o antígenos preparados por ingeniería genética, para el desarrollo y preparación de vacunas.

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Ejemplo 1 Cultivo del virus

Se aisló el virus de inmunodeficiencia según la invención MVP-2901/94 a partir de sangre de una paciente con señales de inmunodeficiencia. Para ello, se estimularon con fitohemaglutinina células mononucleares periféricas (linfocitos de sangre periférica, PBL) y linfocitos periféricos de la sangre (PBL) de un donante no infectado con VIH y se mantuvieron en cultivo. Se usó para ello el medio habitual RPMI 1640 con suero fetal de ternero al 10%. Se describen las condiciones de cultivo en Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161 (1990) pág. 706-710. No se observó formación de células gigantes. Se determinó la producción de virus de IH mediante la determinación del antígeno p24 con la ayuda del ensayo comercialmente adquirible de Abbott. Un ensayo adicional para la determinación del crecimiento del virus era el ensayo que usaba transcriptasa inversa unida a partículas (Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pág. 347-356). Se determinó por tanto el crecimiento del virus mediante las actividades enzimáticas en el sobrenadante de cultivo una a dos veces por semana, para vigilar la producción de virus. Se añadieron una vez por semana nuevos linfocitos de donante.

Después de haber podido comprobar la propagación de virus de IH, se infectaron linfocitos periféricos recientes de sangre (PBL) de donantes sanos no infectados por VIH con el sobrenadante del primer cultivo. Se repitió esta etapa y se infectaron entonces células MT2 o Jurkat con el sobrenadante. De este modo, era posible una producción permanente de virus de inmunodeficiencia.

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Ejemplo 2 Aislamiento de ADN, amplificación y caracterización estructural de tramos de genoma del aislamiento de VIH MVP-2901/94 (que codifica gp41)

Se aisló ADN genómico de linfocitos sanguíneos infectados por MVP-2901/94 según procedimientos estándar ("Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience, 1994).

Para la caracterización de regiones de genoma del aislamiento MVP-2901/94, se llevaron a cabo experimentos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con pares de cebadores de la región de proteína de cubierta gp41. Se llevó a cabo la PCR (Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988) con las siguientes modificaciones:

Para la amplificación de regiones de ADN específicas de VIH, se pipetearon 5 \mul (200 \mug/ml) de ADN genómico de linfocitos sanguíneos infectados por MVP-2901/94 en una preparación de reacción de 100 \mul (dNTP 0,25 mM,
1 \muM de cada cebador, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,001% de gelatina, 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer)) y se amplificaron según el siguiente programa de temperaturas: 1. desnaturalización inicial: 3 min a 95ºC, 2. amplificación: 90 s a 94ºC, 60 s a 56ºC, 90 s a 72ºC (30 ciclos).

Los cebadores usados para la PCR y la secuenciación de nucleótidos se sintetizaron en el sintetizador oligonucleotídico 8750 de la compañía Biosearch, presentando los cebadores las siguientes secuencias:

(SEC ID Nº 3-9)

3

Después de que no fuera posible la amplificación del aislado con los cebadores descritos en la bibliografía (Lauré, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 para pol 3 y pol 4 u Ou C.Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 para sk 38/39, sk 68/69), se construyeron nuevos cebadores derivados de secuencias conocidas lo más conservadas posible y se utilizaron en todas las combinaciones concebibles con variación de las condiciones de reacción. Sorprendentemente, resultó que la combinación de los cebadores 212 y 412 derivados de la secuencia del aislado MVP-5180/94 en las condiciones de reacción anteriormente indicadas posibilitaban una amplificación del ADN de MVP-2901/94 y por tanto permitían un primer acceso a la secuencia del aislamiento.

Mediante la secuenciación del primer amplificado, pudieron diseñarse los cebadores 425 y 431 específicos de MVP-2901/94. Para expandir adicionalmente la región ahora conocida, se diseñaron nuevos cebadores según los criterios citados anteriormente y se utilizaron en combinación con el cebador 425 o 431. Se consiguió entonces una expansión en la dirección 3' con el cebador 214 derivado de MVP-5180/91 en combinación con 425, y una expansión en la dirección 5' con la combinación 431/438 y 431/447, derivando los cebadores 438 y 447 de regiones conservadas en la mayoría de subtipos de VIH-1.

Se separó el ADN amplificado sobre gel de agarosa "Nusieve" al 3% (compañía Biozyme), se cortó el fragmento amplificado y se mezcló con el mismo volumen de tampón (1 x TBE (Trisborato 0,09 M, EDTA 0,002 M, pH 8,0)). Después de la incubación de la mezcla de ADN-agarosa durante 10 minutos a 70ºC y posterior extracción con fenol, se precipitó el ADN de la fase acuosa mediante la adición de 1/10 vol de NaAc 3 M, pH 5,5 y 2 vol de etanol a -20ºC durante 15 minutos, y a continuación se sedimentó en una centrífuga Eppendorf (13.000 rpm, 10 min, 4ºC). Se secó el ADN sedimentado, se recogió en agua y después de la determinación fotométrica de la concentración de ADN a 260 nm en espectrofotómetro (compañía Beckman), se secuenció según el procedimiento de Sanger (F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463, 1977). En lugar de secuenciación con ADN polimerasa Klenow, se llevó a cabo la reacción de secuenciación con un kit de la compañía Applied Biosystems ("Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing", Nº art.: 401150). Como cebador, se utilizaron en reacciones de secuenciación separadas respectivamente uno de los cebadores usados para la PCR (respectivamente 1 \muM). El análisis de la reacción de secuenciación se realizó en el dispositivo secuenciador de ADN 373A (Applied Biosystems) según las especificaciones del fabricante del dispositivo.

Se representan en la Tabla 1 la secuencia nucleotídica de la región de ADN amplificada y la secuencia de aminoácidos derivada de la misma (SEC ID Nº 10).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

4

5

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Ejemplo 3 Diferenciación del aislado MVP-2901/94 de otros aislados de VIH

Se analizó la secuencia nucleotídica encontrada de la Tabla 1 con las secuencias homólogas en el banco de datos GENEBANK (publicación 83, junio de 1994), así como el banco de datos EMBL (publicación 38, marzo de 1994), y la secuencia de proteína derivada de la misma con el banco de datos de proteínas SWISSPROT (publicación 28, febrero de 1994) con la ayuda del programa informático GCG (Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin EE.UU. versión 7.1, marzo de 1992). En estos bancos de datos, están contenidas la mayoría de las secuencias nucleotídicas conocidas hasta julio de 1994 de virus de inmunodeficiencia de origen humano y de aislamientos de primates.

La secuencia nucleotídica de la Tabla 1 muestra en el mejor caso un 79,6% de homología con un aislado de subtipo O de VIH-1. La mejor homología con otro subtipo de VIH-1 asciende a un 59,6%. Con aislados de VIH-2, el ADN de la Tabla 1 es homólogo en el mejor caso un 51,6%.

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La secuencia de aminoácidos de la Tabla 1 es homóloga en el mejor caso un 72,7% con el tramo de proteína de cubierta correspondiente de un representante del subtipo O de VIH-1 y en el mejor caso un 52,1% con el aislado VIH-1-Mal de VIH-1. Con proteínas de cubierta de VIH-2, la homología con la secuencia de aminoácidos de la Tabla 1 asciende en el mejor caso a un 37,0% (aislado HIV2ROD).

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TABLA 2 Comparación de homología de MVP-2901/94 a nivel nucleotídico y proteico con otros aislamientos de VIH

6

Debido a la comparación de homología, el aislamiento MVP-2901/94 es el más similar a ambos aislados temporalmente designados como subtipo O de VIH-1 MVP-5180/91 y ANT70. No obstante, corresponde a ambos aislados un nivel relativamente alto de heterología de secuencia de al menos un 20,9% a nivel nucleotídico y al menos un 27,3% a nivel proteico.

En la región de ENV, se trata de la región relevante para diagnóstico de la proteína de cubierta, que se da en la Tabla 1 tanto como secuencia nucleotídica como secuencia de aminoácidos.

Ejemplo 4 Datos serológicos de MVP-2901/94

Para la valoración de la importancia de este virus para diagnóstico sérico, se analizó una muestra de suero de pacientes infectados con 2901 en distintos ensayos de cribado anti-VIH-1/2 comerciales.

En la Tabla 3, se representan los resultados de estos análisis.

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TABLA 3

7

Se deduce de la Tabla 3 que ninguno de los kits de ensayo obtenibles comercialmente incluye esta muestra. En cambio, en caso de utilizar un ELISA novedoso en el que se emplea como antígeno en fase sólida un péptido (NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN) que corresponde a la secuencia de 2901 con la excepción de un aminoácido (NQQRL en lugar de NQQLL) y como reactivos líquidos los reactivos anti VIH-1/2 de Enzygnost, se incluye seguro la muestra. Las transferencias Western obtenibles comercialmente como, por ejemplo, de la compañía Pasteur, no incluyen esta muestra MVP2901/94 (sin figura). Dichas transferencias Western proporcionarían por tanto muy probablemente un resultado falso negativo con muestras basadas en infección por MVP2901/94.

Es una región especialmente preferida de la secuencia de aminoácidos representada en la Tabla 1 la región que empieza con la secuencia de aminoácidos NQQLL... (esta región empieza aproximadamente en el nucleótido 1010 según la numeración usada en la Tabla 1.

El ejemplo 4 prueba también que para la evaluación de diagnóstico de la divulgación de la presente invención pueden llevarse a cabo alteraciones insignificantes en la secuencia de aminoácidos sin que se influya desventajosamente en la validez diagnóstica de un ensayo correspondiente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Behringwerke Aktiengesellschaft

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Postfach 11 40

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

LOCALIDAD: Marburg

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(E)

PAÍS: Alemania

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 35001

\vskip0.800000\baselineskip

TÍTULO DE LA SOLICITUD: Retrovirus del grupo de VIH y su uso (MVP-2901/94)

\vskip0.800000\baselineskip

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.800000\baselineskip

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PADAT Sequenzmodul versión 1.0

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 2:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 4:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 5:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 6:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 7:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 8:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 9:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1070 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 10:

17

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1070 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 11:

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC: Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 356 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interior.

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 12:

20

21

22

Claims (10)

1. Virus de inmunodeficiencia del grupo VIH, que se ha depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) con el número V 95012601 con la referencia MVP-2901/94, y que presenta una secuencia de ARN que es complementaria de la secuencia de ADN de la Tabla 1 y presenta una homología con la secuencia de la Tabla 1 de al menos un 85%.

2. ADNc que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 10 o su complemento.

3. ADN recombinante, caracterizado porque presenta el ADNc según la reivindicación 2.

4. Antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 12.

5. Kit de ensayo para la detección de anticuerpos contra virus causantes de inmunodeficiencia, caracterizado porque presenta un antígeno según la reivindicación 4.

6. Kit de ensayo según la reivindicación 5, caracterizado porque es una transferencia Western

7. Kit de ensayo según la reivindicación 5, caracterizado porque es un ensayo ELISA o un ensayo de detección de anticuerpo por fluorescencia.

8. Uso de un virus de inmunodeficiencia según la reivindicación 1 o un ADNc según la reivindicación 2 y/o un antígeno según la reivindicación 4 para la detección de retrovirus que causan inmunodeficiencia.

9. Uso de un retrovirus según la reivindicación 1, un ADNc según la reivindicación 2 y/o un antígeno según la reivindicación 4 para la preparación de vacunas

10. Ácido ribonucleico, caracterizado porque codifica el virus de inmunodeficiencia según la reivindicación 1 y presenta una secuencia de ARN que es complementaria de la secuencia de ADN de la Tabla 1 y presenta una homología con la secuencia de la Tabla 1 de al menos un 85%.