KR100216417B1

KR100216417B1 - Hiv 군으로부터의 레트로비루스(mvp-2901/94) 및 그것의 사용

Info

Publication number: KR100216417B1
Application number: KR1019960003644A
Authority: KR
Inventors: 하우저 한스-페터; 크나프 슈테판; 브루스트 슈테판; 게. 귀르틀러 루쯔; 에베를레 요제프; 카프튀 라자레; 아쳉귀 제켕 레오폴드
Original assignee: 파이트 게, 부크 하; 다데 베링 마르부르크 게엠베하
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-15
Publication date: 1999-08-16
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: ATE412736T1; EP0727483B1; JP2006008653A; ES2316151T3; AU4554596A; DE19505262C2; JPH08280389A; EP0727483A3; PT727483E; EP0727483A2; JP3759226B2; US6162631A; US5798205A; DE19505262A1; CA2169603C; ZA961174B; JP3851480B2; KR960031609A; DK0727483T3; JP2000230930A

Abstract

MVP-2901/94라는 명치을 갖고 번호 V 95012601 하에 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)에 기탁된 새로운 면역결핍비루스를 개시한다. 비루스로부터 얻을 수 있고 면역결핍질병과 관련된 레트로비루스에 대한 항체를 검색하기 위해 사용될 수 있는 특징적 항원을 또한 개시하며, 이 항원은 비루스의 부분적 DNA 및 아미노산 서열이다.

Description

HIV군으로부터의 레트로비루스(MVP-2901/94) 및 그것의 사용

재 l도는 HIV타입의 레트로비루스의 게놈배열를 도표식으로 도시한다.

본 발명은 현재 더 정확하게는 HIV서브타입 0로 명명되는 HIV군으로부터의 새로운 레트로비루스에 관한 것이고, 상기 비루스의 본질적인 성질을 갖고 있는 변종(varients) 또는 부분(parts)에 관한 것이다.

레트로비루스를 배양하기 위한 공정이 기술된다. 더욱이 본 발명은 이 레트로비루스의 분리(isolation)에 관한 것이고, 의약목적, 진단 및 백신의 제조를 위한 비루스, 그것의 부분 또는 추출물의 사용에 관한 것이다.

그것들에 의해 감염된 인간에서, 소위 HIV군에 속하는 레트로비루스는 집합적용어인 면역결핍 또는 AIDS(후천성 면역결핍증)로 요약되는 질병증상을 초래한다.

전염병학 연구는 인간 면역결핍비루스(HIV)가 거의 대부분의 AIDS(후천성 면역결핍증)경우에 대한 병인(etiological)제라는 것을 입증했다.

환로로부터 분리되는 1983년에 특성지어진 레트로비루스는 HIV-1이라고 명명되었다(Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871[1983]). HIV-1의 변종은 WO 86/02383에 기술되어 있다.

인간명역결핍 비루스의 두번째군이 1985년 West Africa에서 동정되었으며(Clavel, F. et al., Science 233, 343-346[1986]), 인간면역결핍 비루스 타입 2(HIV-2)라고 명명되었다(EP-A-0 239 425). HIV-2 레ㅡ로비루스는 HIV-1과는 명백히 다르나, 원숭이 면역결핍 비루스(SIV-2)와 또한 관련되어 있다. HIV-1과 같이, HIV-2도 또한 AIDS 증상을 초래한다.

ANT 70(J, Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1586-1596) 및 MVP-5180/91(J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1581-1585)에 의해 나타낸 바와같이, 새로운 HI 비루스는 최근 HIV-1서브타입 A-F로 분류될 수 없다고 기술되었다. 그것들의 기지의 HIV-1 균주와는 다른 명백한 구조적 차이때문에, 비록 그것들이 그것들의 게놈 뉴클레오티드 서열은 서로 명백히 다르지만, 둘다의 분리물은 함께 서브타입 0아래로 잠정적으로 분류되었다(G. Myers, Los Alamos Data Base).

인간면역결핍 비루스가 서로다른 분리물의 비교성을 현저히 복합하게 만드는 고도의 변이성을 나타낸다는 것이 그것드의 특성이다. 서로다른 HIV-1분리물을 비교했을때, 다른 게놈영역은 비교적 잘 보존되는 반면, 게놈의 일부영역에서는 고도의 변이성이 발견되었다(Benn, S. et al., Science 230, 949-951[1985]). HIV-2는 또한 고도의 다형성(polymorphism)을 나타내는 것으로 보고되었다(Clavel, F. et al, Nature 324, 691-695[1986]).

구조적으로 효소적으로 필수적인 단백지을 암호화하는 gag 및 pol유전자의 영역은 가장 큰 유전적 안정성을 가진다. 이와 대조적으로 env유전자 및 또한 조절단배질을 암호화하는 유전자(vif, vpr, tat, rev, nef)의 약간의 영역은 고도의 변이성을 나타낸다.

더욱이 비록 단지 낮은 서열상동성만이 존재하지만, HIV-1에 대한 항혈청(antisera)도 또한 HIV-2 gag 및 pol유전자 산물과 교차반응한다는 것이 입증되었다. 만약 매우 낮은 긴축성(stringency)의 조건이 사용되지 않았다면, 이들 두가지 비루스 사이의 혼성화(hybridization) 는 크게 중요하지 않은 것같다(Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695[1986]).

HIV군으로 부터의 레트로비루스의 넓은 분포 때문에 그리고 감염의 시점 및 병리학적 변화의 명확한 증상이 인식되는 시점사이에 적은 년수부터 많은 년수까지의(2-20)기간이 경과한다는 사실때문에, 가능한한 이른 시기에 특히 믿을만한 방법으로 HIV군의 레트로비루스에 으한 감염을 확인하는 것이 전염벙리학적으로 매우 중요하다. 이것은 면역결핍의 신호를 나타내는 환자의 진단에서 뿐만아니라, 더 중요하게는 혈액공여자의 스크리닝(screening)에서도 중요하다. HIV-1 또는 HIV-2 타입과 레트로비루스 또는 그것의 성분이 검출시스템에서 사용되었을때, 비록 면역결핍의 신호는 혈청이 유래된 환자에서 발생하지만, 항체는 검출될 수 없거나 약간의 혈청에서 단지 약하게 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

일정한 경우에, 본 발명에 따른 HIV군 레트로비루스를 사용하면 그러면 검출이 가능하다. HIV비루의 유전형 다양성은 특히 진단에 대한 중요한 문제점을 제공한다.

HIV-1 비루스의 경우에, 각각의 복제사이클에서 게놈당 한개의 뉴클레오티드가 변화된다는 것이 가정된다. 이 유전적 변이성의 결과로서, HIV 비루스는 생체내(in-vivo) 선택압력에 뛰어나게 유연한 방식으로 응답할 수 있고, 약학제에 저항성이거나 일정한 정도의 면역학적 방어를 확립한 개체를 공격할 수 있는 돌연변이체를 매우 신속히 발생시킬 수 있다(Sharp et al., Origins and diversity of human immunodeficiency viruses, AIDS 1994, vol. 8, Suppl, 1; S 27-S 42).

감염의 확산을 방지하기 위해, 특히 헌혈에 관련하여 뿐만아니라, 장기제공에 관련하여 가능하면 100% 확실성으로 HIV비루스에 의해 감염을 확인하는 것이 가능해야 한다.

이러한 이유로 비록 현재 단지 일정한 지리적 영역내에서만 분포하지만, 만약 적당한 예방적 수단이 적용되지 않으면 어려움 없이 유럽 또는 미합중국에 확산될 수 있는 비루스에 의한 상기 감염을 검출하는 것이 또한 진단적으로 필요하다.

면역결핍의 신호를 보이는 Cameroons태생의 24세의 여성환자의 말초임파구로부터 1994년에 분리되었던 새로운 인간면역결핍 비루스(이하 MVP-2901/94로 명명)의 분리 및 특성에 대한 기술이 주어진다. 지리학적 관점에서, 이 레트로비룻는 West Africa (여기서 HIV-2 및 HIV-1비루스에 의한 감염은 지방병이다) 및 East Africa(여기서 확산되는 것은 거의 독점적으로 HIV-1이다) 의사이에 위치한 아프리카의 지역으로부터 유래되었다.

결과적으로 본 발명은 HIV서브타입 0군의 새로운 레트로비루스(MVP-2901/94로 명명)에 관한 것이고, 그것의 변종에 관한 것이고, 그것으로부터 유래된 DNA서열, 아미노산서열 및 구성 성분서열에 관한 것이고, 후자를 함유하는 시험키트에 관한 것이다.

MVP-2901/94는 MT2 및 Jurkat 세포주에서 번식될 수 있다.

비루스의 분리 및 번식은 Viral Quantitation in HIV Infection, Editor Jean-Marie Andrieu, John Libbey Eurotext, 1991이라는 책에 상세히 기술되어 있다. 상기 책에 기술된 절차적 방법은 본 출원의 개시에 참고문헌으로 포함된다.

본 발명에 따른 MVP-2901/94비루스와 HIV-1 및 HIV-2 레트로비루스 사이의 차이점을 더 잘 이해시키기 위해, 면역결핍을 초래하는 레트로비루스의 구조를 우선 간략하게 설명할 것이다. 비루스의 중앙에는 RNA가 명칭 p24(p는 단백질을 의미)를 수반하는 단백질 소단위체로 모여서 이루어진 원뿔형코어에 위치한다. 이 내부코어는 단백질 p17(외부코어)로 이루어진 단백질 외피로 그리고 숙주세포부터 유래된 지질과 더불어 막통과 단백질 gp41 및 외피단백질 120(gp120)을 함유하는 당단백질 외피로 둘러싸여 있다.

알려진 바로는 HIV 비루스의 RNA는 단순화된 방식으로 도시하여 다음 유전자 영역을 포함한다. 각 단말에 소위 긴 말단반복서열(LTR)과 함께 gag, pol, env 및 nef유전자영역, gag 유전자는 특히 코어단백질 p24 및 p17을 암호화하고, pol 유전자는 역전사효소, 프로테아제, RNAse H 및 인테그라제를 암호화하고, env 유전자는 비루스외피의 당단백질 gp41 및 gp120을 암호화한다. nef 유전자는 조절기능을 갖는 단백질을 암호화한다.

HIV 타입의 레트로비루스의 게놈배열은 제1도에 도표식으로 도시한다.

소위 PCR(중합효소 연쇄반응)은 다양한 가능한 용도를 가지는 요전적 조작 방법이 되었고, 그 방법을 실행하기 위해 필요한 구성성분은 상업적으러 구입할 수 있다.

만약 증폭될 서열의 DNA영역이 알려져 있다면, 이 방법을 사용하여 DNA 서열을 증폭하는 것이 가능하다. 증폭될 핵산서열의 짧은영역에 어닐링(annealing)하는 짧은 상보적 DNA단편(올리고뉴클레이오티드=프라이머)을 합성해야 한다. 시험을 수행하기 위해, HIV 핵산을 프라이머와 함께 중합효소 및 뉴클레이오시드트리포스페이트를 부가적으로 함유하는 반응혼합물에 도입한다.

중합반응(DNA합성)을 한정된 시간동안 수행하고, 그 다음 핵산가닥을 가열에 의해 분리 시킨다. 냉각후에 그다음 중합반응을 한번 더 수행한다. 그러므로 만약 본 발명에 따른 레트로비루스가 HIV-1 또는 HIV-2비루스이라면, HIV-1 및 HIV-2 비루스의 기지서열내에 보존되느 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭하는 것이 가능할 것이다.

이 타입의 몇몇 프라이머는 이미 기술되었다(Laure, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 for pol 3 and 4, 및 Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297 for sk 38/39, sk 68/69).

그러나 이들 프라이머는 MVP-5180/91 HIV분리물로 부터 DNA를 증촉할 수 없다(J. Vir, 1994, vol, 68, no. 3, pp. 1581-1585). 이들 프라이머의 사용은 마찬가지로 MVP-2901/94 분리물로부터 DNA를 증폭하지 못했으며, 이는 이 분리물로 또한 HIV-1공통 서열로부터 강하게 분화된다는 견해는 뒷받침한다. 그러므로 기지의 서열로 부터 유래되고 가능한한 강하게 보존된 매우 다양한 새로운 프라이머를 구성하는 것과 반응조건을 바꿔가면서 가능한한 많은 조합으로 그것들을 사용하는 것이 필요했다.

놀랍게도 실시예 4에 주어진 반응조건하에 MVP-5180/91분리물의 서열로부터 유래된 프라이머 212 및 412의 조합을 사용하면, MVP-2901/94의 DNA를 증폭하여 분리물의 서열로의 첫번째 리드를 얻는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다.

(Seq. ID No. 1)

5' 3'

212 AGT GCA GCA GGT AGG ACT ATG

(Seq. ID No. 2)

5' 3'

412 GTT CCA TTT TAG TGA TGT GTA

일단 HI 비루스의 서열의 구성영역이 암호해석되면, 본 경우에서와 마찬가지로 비루스의 전체게놈으 주지의 표준분자 생물학적 방법을 사용하여 클로닝(cloning) 및 시퀀싱(sequencing)할 수 있다.

1) 이것은 예를들면 다음방법으로 cDNA를 클로닝함으로써 성취할 수 있다. 비루스를 적당한 크기의 배양 볼륨(약 11)으로부터 침전시키고, 포스페이트-버퍼된 염화나트륨용액에 재현탁시킨다. 그다음 그것을(20%) 스크로스 쿠션을 통해 펠릿으로 만든다.

비루스 펠릿을 20mM 디티오트레이톤 및 0.5% Nonidet p40중의 6M 염화콰니디늄에 현탁할 수 있다.

CaCl을 2몰의 농도가 되도록 첨가하고, 분쇄될 비루스를 함유하는 용액을 염화세시움 쿠션상에 로딩한다. 그다음 비루스 RNA를 원심분리에 의해 펠릿으로 만들고, 용해시키고, 페놀로 추출한 후 에탄올 및 염화리튬으로 침전시킨다. 1차 cDNA가닥의 합성은 올리고(dT)프라이머를 사용하여 비루스 RNA또는 그것의 부분에 대해 수행한다.

역전사효소가 첨가되는 합성은 상업적으로 구할 수 있는 키트를 사용하여 수행할 수 있다.

2 차가닥의 합성을 위해 RNA/DNA 혼성체의 RNA가닥을 RNase H 로 분해(digestion)하고, E.coli DNA 중합효소 I을 사용하여 2차가닥을 합성한다. 그다음 비접착(blunt) 말단은 T4 DNA중합효소를 사용하여 생산할 수 있고, 이들 말단을 제한 절단부위를 위한 적합한 링커(linker)에 결합시킬 수 있다.

적당한 제한효소로 제한분해시킨후에, cDNA단편을 아가로스겔로부터 분리하고, 적합한 방식으로 이미 절단된 벡터(vector)에 라이게이션(ligation)시킨다. 그다음 cDNA 삽입체를 함유하는 벡터를 컴피턴트(competent)E. coli세포를 형질전환시키기 위해 사용할 수 있다.

그다음 결과의 콜로니를 막으로 옮기고, 용해(lysis) 및 변성(denaturation)시키고, 마지막으로 딕옥시게닌 또는 비오틴으로 표지환된 핵산으로 혼성화함으로써 검출한다.

일단 대응하는 cDNA가 유전적 조자에 의해 제조되면, 레트로비루스로부터 유래된 원하는 DNA 단편을 분리하는 것이 가능하다. 그다음 이들 단편을 적합한 발현벡터에 통합시키면, 원하는 단백질 또는 단백질 단편을 발현하고 진단적 시험을 위해 사용하는 것을 가능하게 만든다.

2) 상기 방법과 선택적으로, 면역결핍 비루스의 핵산을 PCR기술의 도움으로 클로닝할 수 있다. 이것을 하기 위해서는 각 경우에 서열의 기지 부분으로 부터 유래된 프라이머와 조합하여 분리물의 DNA증폭을 가능하게 해줄 수 있는 프라이머를 서여의 아직 미지영역으로 부터 동정하는 것이 필요하다.

3) 기지의 서열 절편으로부터 진행함으로써 비루스를 클로닝하는 또다른 기능성은 비루스의 프로비루스 게놈 DNA를 클로닝하는 것이다. 이 목적을 우선 감염된 세포주로부터의 게놈 DNA를 표준방법에 의해 정제한다. 그다음 게놈 라이브러리를 구성 및 스크리닝한 후에 숙주게놈에로 통합된 프로비루스 DNA를 클로닝할 수 있다. 이를 위하여 게놈 DNA를 부분적으로 단편화하고, 약 10-25kb의 길이의 단편을 함유하는 분획(fraction)을 분리하고, 이 길이의 단편을 수용할 수 있는 코스미드 또한 λ파지와 같은 벡터시스템에로 클로닝한다. 선택된 벡터시스템을 사용하여 게놈단편의 혼합물을 E. coli균주에로 형질전환시킨다. 그다음 비루스 게놈을 함유하는 벡터를 방사성 또는 몇몇 다른 방법으로 표지화된 원하는 비루스의 클로화된 DNA단편으로 혼성화함으로써 동정하고, 이어서 분리한다(플라크 스크리닝 또는 콜로니 스크리닝). 그것에 의해 비루스게놈은 서열분석을 위해 그리고 그것의 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있게 된다.

서로다른 비루스 분리물사이의 유사성을 핵산 또는 단백질 서열들 사이의 상동성의 정도에 의해 표현할 수 있다. 예를드어 50% 상동성은 서열에서 100개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치중에 50개가 서로 일치하는 것을 의미한다.

단백질의 상동성은 서열분석에 의해 결정한다.

상동적 DNA서열은 또한 혼성화 기술에 의해 동정할 수 있다.

그러므로 본 발명은 번호 V95012601하에 European Collection of Anima Cell Cultures (ECACC)에 기탁되고 MVP-2901/94라고 명명된 레트로비루스의 형태학적 및 면역학적 성질과 일치하는 성질들을 나타내는 HIV군의 면역결핍비루스 또는 이 비루스의 변종에 관한 것이다.

기탁일자는 1995. 1. 26 이다.

면역결핍 비루스의 본질적인 형택학적 및 역학적 성지은 비루스의 면역학적 특성에 결정적으로 중요한 구조들을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 문맥에서 감염된 인간에서 항체의 증폭된 생산을 일으키고 비루스를 서로다른 서브클래스 및 서브 타입으로 나누기에 적합한 에피토프(epitopes)는 특히 중요하다. 결과적으로 이 문맥에서 중요한 에피토프는 구체적으로 HIV-1 및/또는 HIV-2군의 비루스에도 또한 존재하는 것이 아니라, 오히려 본 발명에 따른 기탁된 비루스와 MVP-2901/94비루스의 좁은 군에 속하는 변종에만 발생하는 에피토프이다. 비루스의 형택학적 면역학적 성질은 외피단백질의 진단관련 영역에 또한 반영된다.

본 발명은 또한 전체 게놈에 기초하여 기탁된 비루스의 RNA와 적어도 75%상동성을 갖는 RNA서열을 나타내는 면역결핍 비루스를 포함한다.

바람직한 면역결핍 비루스는 전체게놈에 기초하여 기탁된 비루스의 RNA와 적어도 85%, 특히 바람직하게는 적어도 90%상동성을 갖는 RNA서열은 나타내는 것이다. 매우 특히 바람직한 면역결핍 비루스는 전체게놈에 기초하여 기탁된 비루스의 RNA와 92% 또는 95%까지 상동성을 갖는 것이다.

본 발명에 따른 면역결핍 비루스는 표 1에서의 DNA서열과 상보적이고 표 1에서의 이 서열과 적어도 75% 상동성을 갖는 RNA서열을 나타낸다. 바람직한 형태로는 본 발명에 따른 면역결핍 비루스는 표 1에서의 DNA서열에 상보적이고 표 1에서의 서열과 적어도 85%상동성으로 갖는 RNA 서열을 나타낸다. 이러한 문맥에서 서열의 상동적 부분은 적어도 길이로 50 뉴클레오티드이고 바람직한 구체예에서는 적이도 길이로 100 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 면역결핍 비루스는 표 1에 도시된 서열에 상보적이거나, 진단관련 영역에 기초하여 표 1에 주어진 서열로부터 뉴클레오티드레벨로 최대 20%, 단백질레벨로 25%의 차이점을 가지며 이 서열과 상동적인 서열 또는 구성(constituent) 서열을 나타낸다.

바람직한 구체예에서 진단관련 영역에 기초하여 표 1에 주어진 서열로부터의 차이점은 뉴클레오티드레벨로 최대 10%이고 단백질 레벨로 15%이다.

본 발명은 또한 번호 V 95012601 하에 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)에 기탁된 면역결핍 비루스 MVP-2901/94 또는 본 발명에 따른 비루스의 RNA또는 그것의 부분에 상보적인 cDNA에 관한 것이다.

바람직한 구체예에서, 이 cDNA는 제조합 DNA의 형태로 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 cDNA 또는 재조합 DNA를 사용하거나 그것의 cDNA로부터 추론될 수 있는 아미노산 구조를 사용하여 제조된 항원을 포함한다. 이러한 문맥에서, 항원은 단백질 또는 펩티드이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원은 표 1에 도시된 아미노산 서열 또는 그것의 구성서열에 일치하는 아미노산 서열을 나타낸다.

바람직하게는, 항원은 표 1에서의 아미노산 서열로 부터 선택된 적어도 10 아미노산, 특히 바람직하게는 적어도 20 아미노산을 갖는 구성서여을 나타낸다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항원은 NQQLLNLWGCKGKLICYTSVKWN의 아미노산 서열 또는 적어도 10 연속적 아미노산을 갖는 그것의 구성서열을 나타낸다.

본 발명은 또한 예를들어 정제된 비루스 조제의 형태로 제1항 내지 제10항중의 어느 한항에 따른 면역결핍 비루스로부터 제조되는 항원을 포함된다. 본 발명에 따른 항원은 바람직하게는 제조합 방법에 의해 제조된다. 그러나 예를들어 고체상 합성에 의해, 합성적으로 항원을 제조하는 것도 가능하다.

본 발명은 또한 면역결핍을 초래하고 적어도 한가지의 본 발명에 따른 항원을 함유하는 비루스에 대한 항체를 검출하기 위한 시험키트를 포함한다.

시험키트는 웨스턴브럿, ELISA 시험 또는 형광항체 검출시험에 기초할 수 있다.

최근에 비루스핵산 또는 그것의 특정영역이 증폭되는 방법이 비루스 특히 HIV비루스를 진단하기에 매우 민감하고 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

알려진 검출방법중의 한가지는 중합효소 연쇄반응(PCR)이다.

이와 선택적으로, 경쟁적 중합효소 연쇄반응도 또한 HIV감염의 검색을 위해 사용될 수 있다(예를들면 AIDS(1993), 7, Suppl. 2; 65-S 71).

특히 HIV진단에 관련하여 중요한 최근에 얻어진 또다른 검색방법은 NASBA(핵산서열-기초증폭)방법이다. 이 방법은 예를들어 AIDS 1993. 7(Suppl. 2): S 107-S 110에 기술되어 있다. 이 방법에서는 단일-가닥 RNA 또는 이중-가닥 DNA를 T7 RNA 중합효소로 증폭한 다음 검색한다.

HIV 비루스의 검색을 위한 또다른 방법은 분지(branched)DNA를 사용한 신호증폭의 수단에 의한 검색방법이다. 이 방법은 예를들어 AIDS 1993, 7(Suppl. 2): S11-S14 에 기술되어 있다. 이 방법에서는 비루스 핵산을 고체상에 결합된 프로브에 혼성화 한다. 더욱이 검색분자(분지 DNA구조)를 프로브에 혼성화된 다음 효소적으로 검색한다.

상기 방법에 공통적인 특징은 검색될 비루스에 특이적인 한정된 핵산영역을 검색방법에 사용한다는 것이다. 이들 검색방법에서는 구체적으로 DNA단편인 한정된 짧은 핵산단편을 선택하고 검색방법에 사용한다.

그러므로 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산과 일치하거나 이 핵산에 상보적인 서열을 나타내는 핵산단편에 관한 것이다.

예를들어 프라이머가 될 수 있는 이들 핵산단편은 일반적으로 적어도 15, 바람직하게는 적어도 25, 특히 바람직하게는 적어도 35 뉴클레오티드의 길이를 가진다.

이들 핵산단편은 본 발명에 따라서 HIV비루스의 검색방법에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 면역결핍 비루스의 본 발명에 따른 cDNA 및 항원은 면역결핍을 초래하는 레트로비루스를 검색하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항원은 구체적으로 백신을 제조하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 비루스를 암호화하는 리보핵산에 관한 것이다.

본 발명의 범위내에서, 특히 진단에 관련된 외피단백질의 부분을 시퀀싱했다.

이 부분은 소위 V3 고려의 지역을 둘러싸는 외투(envelope)영역이며, 본 발명의 범위내에서 시퀀싱된 영역은 소위 gp41 영역에까지 확장한다.

본 발명의 범위내에서, 외피단백질의 부분을 우선 시퀀싱했고, 이 서열이 HIV타입의 비루스의 대응서열과 오직 비교적 낮은 정도의 상동성만을 나타낸다는 것을 확립했다. 데이타베이스를 사용하여 수행한 HIV서열과의 비교는 gp41 영역이 구체적으로 뉴클레오티드레벨로 최고 79.1% 상동적이다는 것을 가리켰다.

본 발명에 따른 비루스의 서열은 기지 비루스의 서열과 다르다.

그러므로 본 발명은 상동성의 정도에 의해 결정된 오차의 정도로 본 발명에 따른 비루스의 서열과 실질적으로 일치하는 비루스 및 대응하는 DNA 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 그러므로 예를들어 85%이상의 상동성은 100뉴클레오티드 또는 아미노산중의 적어도 85 개는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산인 서열을 포함하는 반면, 나머지는 다르다는 것을 표시하다. 상동성을 확립할때에는 두가지 서열을 가능한 최다수의 서로 일치하는 뉴클레오티드 또는 아미노산들이 서로 부합하는 방식으로 정렬한다.

분리된 서열의 기초위에서, 면역우성 에피토프(펩티드)를 조제하고 합성할 수 있다.

비루스의 핵산서열이 주지되었기 때문에 당업계의 숙련자는 이것으로부터 아미노산 서열을 추론할 수 있다.

아미노산 서열의 구성영역은 표 1에 주어진다. 그러므로, 본 발명는 또한 표 1에 개시된 정보를 사용하여 제조될 수 있는 항원, 즉 단백질, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.

이들 항원, 단백질, 폴리펩티드 및 올리고펩티드는 표 1에 주어진 아미노산 서열은 나타낸다. 항원 또한 펩티드는 표 1에 재생된 아미노산 서열의 상대적으로 짧은 구성서열을 나타낼 수 있다. 이 아미노산 서열은 적어도 10 아미노산, 바람직하게는 적어도 20 특히 바람직하게는 적어도 25 아미노산의 길이이다.

재조합 기술을 사용해서 뿐만아닐, 이들 펩티드는 합성방법에 의해서도 제조될 수 있다. 적합한 제조루트는 Merrifield 타입의 고체상 합성이다. 이 기술 및 당업계에 주지된 다른방법의 더 이상의 설명은 논문, 예를들면 M. Bodansky, et al., Peptide Synthesis, John Wiley Sons, 2nd Edistion 1976 에서 찾을 수 있다.

진단시험에서는 조사될 인간으로부터의 혈청샘플을 가져다가 MVP-2901/94로부터 유래된 한개 이상의 단백질 당단백질의 단백사슬(진핵세포주에서 발현가능함) 또는 그것의 부분과 접촉시킨다. 바람직한 시험방법은 며역형광적 또는 면역효소적 시험방법(예를들면 ELISA 및 면역-블롯)을 포함한다.

면역효소시험(ELISA) 시험에서, MVP-2901/94 또는 그것의 변종으로 부터 유래된 항원은 예를들어 미세적정(microtiter)플레이트의 웰에 결합될 수 있다. 이러한 문맥에서 사용된 투여량은 본질적으로 시험시스템 및 미세적정 플레이트의 처리에 의존한다.

그다음 조사될 인간으로 부터 유래된 혈청 또는 혈청희석물을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가한다. 한정된 배양기간후에, 플레이트를 세척하고, 인간면역글로블린에 특이적으로 결합하고, 이미 양고추냉이 퍼록시다제, 알칼리성 포스파타제등과 같은 효소 또는 효소-표지화된 항원에 연결된 항체로 특이적 면역복합체를 검색한다. 이들 효소는 무색 기질을 높은 유색 산물로 전환시킬 수 있고, 그다음 특이적 항-HIV항체의 존재는 색의 농도로 부터 결정할 수 있다. 시험시스템에서 본 발명에 따른 비루스를 위한 또다른 가능한 용도는 웨스턴 블롯에서의 그것의 사용이다.

비록 면역결핍 질병에 대항하는 백신을 제조하는 것이 매우 어렵다고 밝혀졌지만, 그럼에도 불구하고 이 비루스는 또는 그것의 부분, 즉 면역우성 에피토프 및 세포면적의 유도인자 또는 재조합적으로 제조된 항원은 또한 백신을 개발하고 제조하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 1(비루스의 배양)

본 발명에 따른 면역결핍 비루스인 MVP-2901/94를 면역결핍의 신호를 나타내는 여성환자의 혈액으로부터 분리했다.

이를 위해서 HIV로 감염되지 않은 공여자의 혈액(PBL)으로 부터의 말초단핵세토(말초혈임파구, PBL) 및 말초임파구를 피토헤마글루티닌으로 자극하고 배양물에 유지시켰다.

이를 위해서 10%태아 소 혈청을 함유하는 통상의 배지 PRMI 1640을 사용했다.

배지조건은 Landay A. et al., J. Inf. Dis., 161(1990)pp. 706-710에 기술되어 있다.

거대세포의 형성은 관찰되지 않았다. HI비루스의 생산은 Abbott 으로 부터 사업적으로 구할 수 있는 시험키트를 사용하여 p24항원을 측정함으로써 결정했다.

비루스의 성장을 결정하기 위해 사용된 또다른 시험은 입자-결합 역전사효소를 사용한 시험이었다(Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp. 347-356)

결과적으로 비루스 생산을 모니터하기위해, 배양 상청액에서의 효소활성에 기초하여 1주일에 한번 또는 두번씩 비루스의 성장을 결정했다. 새로운 공여자 임파구는 1주일에 한번씩 첨가했다.

일단 HI 비루스 증식이 확립되면, HIV로 감염되지 않은 건강한 공자의 혈액(PBL)으로 부터의 신선한 말초임파구를 1차 배양물로 부터의 상청액으로 감염시켰다. 이 단계를 반복한 다음, MT2 또는 Jurkat 세포를 상청액으로 감염시켰다. 이 방법으로 영구적 기초위에 면역결핍 비루스르 생산하는 것이 가능했다.

실시예 2

(HIV분리물 MVP-2901/94의 게놈의 절편(gp41을 암호화)의 DNA분리, 증폭 및 구조적 특성 지움)

게놈 DNA을 표준방법을 사용하여 MVP-2901/94 감염된 혈액임파구로부터 분리했다(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 1994).

MVP-2901/94분리문의 게놈의 영역을 특성짓기 위해, gp41외피단백질 영역으로 부터의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR(중합효소 연쇄반응) 실험을 수행했다. PCR(Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988)을 다음 변형으로 수행했다.

HIV-특이적 DNA영역의 증폭을 위해, MVP-2901/94 감염된 혈액임파구로부터의 5μl(200μg/ml)의 게놈DNA를 100μl 반응혼합물(0.25mM dNTP, 각 프라이머당 1μM, 10mM 트리스/HCL, pH 8.3, 50mM kCl, 1.5mM MgCl₂, 0.001%겔라틴, 2.5 유니트의 Taq 중합효소(Perkin Elmer)) 에로 피펫팅(pipetting)하고, 다음 온도 프로그램에 따라 증폭했다.

1. 초기변성: 3분, 95℃

2. 증폭: 90초, 94℃, 60초. 56℃, 90초. 72℃(30 사이클)

PCR 및 뉴클레오티드 시퀀싱을 위해 사용되는 프라이머를 Biosearch 8750 올리고뉴클레오티드 합성기(synthesizer)에서 합성했고, 프라이머를 다음 서열을 나타냈다.

(Seq. ID No. 3-9)

5' 3'

212 AGT GCA GCA GGT AGC ACT ATG

214 TTT AGT TAT GTC AAA CCA ATT C

412 GTT CCA TTT TAC TGA TGT GTA

425 TCG GTA CGA ACC CAC TCA T

431 ACT ATA CCC CTC ATT AAT GA

438 AAC TGT CAT GGA GAA TTC TTT TA

447 AGT GAT TAC TTG TAC ACA TGG

논문(Laue, F. et al., Lancet ii, (1988) 538-541 for pol 3 and pol 4, 및 Ou C. Y. et al., Science 239 (1998)295-297 for sk 38/39 and sk 68/69)에 기술된 프라이머를 사용하여 분리물을 증폭하는 것이 불가능하기 때문에, 기지서열로 부터 유래되고 가능한한 강하게 보존된 매우 다양한 새로운 프라이머를 구성하고, 반응조건을 바꿔가면서 모든 생각가능한 조합으로 사용했다. 놀랍게도 MVP-5180/91분리물의 서열로 부터 유래된 프라이머 212 및 412의 조합은 MVP-2901/94의 DNA가 증포되도록 만들고, 그것에 의해 분리물의 서열에로의 초기 리드를 제공하나는 것이 밝혀졌다.

1차 증포된 샘플을 시퀀싱한 결과로서, MVP-2901/94 특이적 프라이머 425 및 431을 고안하는 것이 가능했다. 또한 현재 알려진 영역을 확장하기 위해, 새로운 프라이머를 상기 기준에 따라 고안했고, 프라이머 425 또는 프라이머 431과의 조합으로 사용했다. 그다음 3' 방향으로의 확장은 프라이머 425와 조합하여 MVP-5180/91 유래된 프라이머 214를 사용하여 성취했고, 5'방향으로의 확장은 대부분의 HIV-1서브타입에서 보존된 영역으로부터 유래된 프라이머 438 및 447과 조합 431/438 및 431/447을 사용하여 성취했다.

증폭된 DNA를 3% Nusieve 아가로스겔(Biozyme제)을 사용하여 분별했고, 증폭된 단편을 절단후 동일 부피의 버퍼(1×TBE(0.09m 트리스/보레이트, 0.002M EDTA, pH 8.0))로 처리했다. DNA/아가로스 혼합물을 10분동안 70℃에 배양하고 이어서 페놀로 그것을 추출한후, 1/10vol 의 3M NaAc, pH 5.5및 2vol 의 에탄올을 첨가함으로써 수상으로 부터 -20℃에서 15'동안 DNA를 침전시킨 다음, Eppendorf 원심분리기(13000rpm, 4℃, 10')에서 펠리화했다. 펠릿화된 DNA를 건조하고 물에 담근다음, DNA 농도를 Beckman 분광광도계에서 260nm로 광도측정법으로 결정한 후, Sanger(F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463, 1977)방법에 의해 시퀀싱했다. Klenow DNA중합효소로 시퀀싱하는 대신에, Applied Biosystems 로부터의 키트(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, Order No.:401150)를 사용하여 시퀀싱 반응을 수행했다. PCR을 위해 사용된 프라이머중의 한가지를 각각의 경우에 분리된 시퀀싱 반응에서 프라이머로서 사용했다(각 경우에 1μM). 시퀀싱 반응은 제조자의 지시서에 따라 Applied Biosystems 373A DNA sequencer 에서 분석했다.

증폭된 DNA영역의 뉴클레오티드 서열 및 그것으로 부터 추론된 아미노산 서열이 표 1(Seq. ID No.:10)에 도시되어 있다.

실시예 3

(다른 HIV분리물로 부터 MVP-2901/94분리물의 구별)

밝혀지고 표 1에 도시된 뉴클레오티드서열은 GENEBANK 데이타베이스(Release 83, 1994년 6월) 및 EMBL 데이타베이스(Release 38, 1994년 3월)에서 상동적 서열에 대해 시험한 반면에, 그것으로부터 추출된 단백질 서열은 GCG 컴퓨터 프로그램(Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin USA, version 7.1, 1993년 3월)을 사용하여 SWISSPROT단백질 데이타베이스(Release 28, 1994년 2월)로 시험했다. 인간유래의 면역결핍 비루스에 대해 그리고 영장류로 부터의 분리물에 대해 1994년 7월에 알려진 대부분의 뉴클레오티드 서열은 이들 데이타 베이스에 수록되어 있다.

최고의 예로서, 표 1에서의 뉴클레오티드 서열은 HIV-1서브타입 0분리물과 79.6%의 상동성을 나타낸다. 또다른 HIV-1서브타입과의 최고의 상동성은 59.6%이다. 최고로서 표 1에서의 DNA는 HIV-2분리물과 51.6$%상동적이다. 최고의 예로서 표 1에서의 아미노산 서열은 HIV-1 서브타입 0의 표본의 대응하는 외피단백질 절편과 72.7%상동성을 나타내고, 최고의 예로서 HIV-1 분리물 HIV-1-Mal과 52.1% 상동성을 나타낸다. 표 1에서의 아미노산 서열은 최고로 HIV-2 외피단백질(HIV-2 ROD분리물)과 37.0% 상동적이다.

표 2

뉴클레오티드 및 단백질 레벨로 MVP-2901/94 및 다른 HIV분리물 사이의 상동성의 비교

상동성 비교에 기초하여 MVP-2901/94 분리물은 잠정적으로 HIV-1서브타입 0라고 명명되었던 두가지 분리물 MVP-5180/91 및 ANT 70과 가장 유사하다. 그럼에도 불구하고 두가지 분리물에 관하여 뉴클레오티드레벨로 적어도 20.9%, 단백질레벨로 적어도 27.3%의 비교적 높은 서열 이종성이 존재한다.

그러므로 본 발명은 재조합적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있고, 표 1에 주어진 서열 또는 적어도 10 연속 아미노산, 바람직하게는 20, 특히 바람직하게는 25 연속 아미노산을 갖는 구성서열은 나타내는 펩티드에 관한 것이다.

그러므로 본 발명은 진단관련 유전자 좌(locus)에 기초하여 %값으로 표시된 표 3에 주어진 최대비율이 서로 다르도록 표 1에 도시된 서열과 상동성을 나타내는 비루스 그것의 DNA서열, 아미노산 서열 및 구성서열에 관한 것이다.

표 3

단백질서열의 최대 차이로 발현되는 유전자 좌에 기초한 상동성

유전자 좌 차이 바람직한차이 특히바람직한 차이

ENV 25% 15% 10%

ENV영역은 뉴클레오티드서열 및 아미노산 서열 둘다로서 표 1에 주어진 외피단백질이 진단관련영역이다.

3에 %로 주어진 상동성 값은 표 1에 따른 단백질 서열을 또다른 비루스로 부터의 서열과 비교했을때 상기 %에 대응하는 서열의 최대비율이 서로 ㄷ르도록 허용한다는 것을 의미한다.

실시예 4(MVP-2901/94에 관한 혈청학적 데이타)

혈청진단법에 대한 이 비루스의 중요성을 평가히기 위해, 2901로 감염된 환자로부터의 혈청 샘플을 다양한 상업적 항-HIV-1/2스크리닝시험으로 시험했다.

이들 조사의 결과는 표 4에 나타낸다.

0.D//차단 비율로의 값

상업적으로 구할 수 있는 시험키트중 어느 것도 이 샘플을 검색하지 못한다는 것이 표 4로 부터 명백하다. 만약 대조적으로 고체상 항원으로서 한개의 아미노산 (NQQLL 대신 NQQRL)을 제외하고 2901 서열과 일치하는 펩티드(NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN)를 사용하고, 액체시약으로서 Enzygnost 항-HIV-1/2시약을 사용하는 새로운 ELISA를 사용하면, 샘플이 확실히 검색된다. 예를들어 Pasteur로부터의 것과 같은 상업적으로 구할 수 있는 웨스턴 블롯을 이 MVP 2901/94샘플(도시되지 않음)을 검색하지 못한다. 그러므로 그러한 웨스턴 블롯은 아마도 MVP 2901/94감염으로부터 유래된 샘플에 틀린 부정적 결과를 줄것이다.

표 1에 도시된 아미노산서열중 특히 바람직한 영역은 아미노산 서열 NQQLL…로 시작하는 영역(이 영역은 표 1에 사용된 번호에 따라 대략 뉴클레오티드 1010에 시자함)이다.

실시예 4는 또한 본 발명의 개시를 진단적으로 개발하기 위해, 대응하는 시험의 진단적 관련성에 유해한 효과를 갖지 않고 아미노산 서여의 미세변화를 반들 수 있다는 것을 증명한다.

Claims

수탁번호 V95012601로 ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁되고 MVP-2910/94로 명명된 레트로비루스의 형태학적 및 면역학적 성질과 일치하는 성질들을 나타내는 HIV군의 면역결핍비루스.
제1항에 있어서, 전체 게놈을 기준으로 기탁된 비루스의 RNA와 적어도 90%상동성을 갖는 RNA서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역결핍비루스.
제1항 또는 제2항에 있어서, 표 1에서의 DNA서열과 상보적이고 표 1에서의 이서열과 적어도 90% 상동성을 갖는 RNA서열을 나타내는 것을 특징으로 하ㅡㄴ 면역결핍비루스.
제3항에 있어서, 서열의 상동적 부분은 길이가 적어도 50 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 면역결핍비루스.
제4항에 있어서, 서열의 상동적 부분은 길이가 적어도 100뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 면역결핍비루스.
제1항 또는 제2항에 있어서, 표 1에 도시된 서열에 상보적이거나, 진단관련 영역을 기준으로 표 1에 주어진 서열로부터 뉴클레오티드 레벨로 최대 10%, 단백질 레벨로 최대 15%이 차이점을 가지며 이 서열과 상동적인 서열 또는 구성서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역결핍비루스.
수탁번호 V 95012601로 ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures에 기탁된 면역결핍비루스 MVP-2901/94 또는 제1항 또는 제4항에 따른 비루스의 RNA 또는 그것의 부분에 상보적인 cDNA.
제7항에 따른 cDNA를 나타내는 재조합 DNA.
제7항에 따른 cDNA 또는 제8항에 따른 재조합 DNA를 사용하거나 그것의 cDNA로부터 추론될 수 있는 아미노산 구조를 사용하여 제조된 항원.
제9항에 있어서, 단백질 또는 펩티드인 것을 특징으로 항원.
제9항에 있어서, 표 1에 도시된 아미노산 서열 또는 그것의 구성서열과 일치하는 아미노산 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 항원.
제11항에 있어서, 상기 구성서열이 적어도 10 아미노산을 가지는 것을 특징으로 하는 항원.
제11항에 있어서, 상기 구성서열이 적어도 20 아미노산을 가지는 것을 특징으로 하는 항원.
제11항 또는 제12항에 있어서, NQQLLNLWGCKGKLICYTSVKWN의 아미노산 서열 또는 적어도 10 연속적 아미노산을 갖는 그것의 구성서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 항원.
제1항 또는 제2항에 따른 면역결핍비루스로부터 제조된 항원.
제9항에 있어서, 재조합적으로 제조된 것을 특징으로 하는 항원.
제9항에 있어서, 합성적으로 제조된 것을 특징으로 하는 항원.
면역결핍을 초래하고 제9항에 따른 항원을 함유하는 비루스에 대한 항체를 검출하기 위한 시험키트.
제18항에 있어서, 웨스턴 블롯인 것을 특징으로 하는 시험키트.
제18항에 있어서, ELISA 시험 또는 형광항체 검색시험인 것을 특징으로 하는 시험키트.
면역결핍을 초래하는 레트로비루스를 검색하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항에 따른 면역결핍비루스는 또는 제7항에 따른 cDNA 및/또는 제9항에 따른 항원.
백신을 제조하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항에 따른 레트로비루스 또는 제7항에 따른 cDNA 및/또는 제13항에 따른 항원.
제1항 또는 제2항에 따른 면역결핍비루스를 암호화하는 리보핵산.
적어도 15 염기의 길이와 제7항에 따른 DNA서열과 일치하거나 이 서열에 상보적인 서열을 나타내는 핵산단편.
제24항에 있어서, DNA 단편인 것을 특징으로 하는 핵산단편.
비루스핵산을 증폭하고 프라이머를 사용하여 검색하는 진단검색방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 제24항 또는 제25항에 따른 핵산단편.
제26항에 있어서, 핵산단편을 사용하여 비루스핵산을 고체상을 결합한 다음 검색하는 것을 특징으로 하는 핵산단편.