ES2289192T3 - Microporacion de tejido para suministro de agentes bioactivos. - Google Patents

Abstract

Un sistema para suministrar un permeante a un organismo que comprende: medios para destruir la piel del organismo en un área seleccionada para formar una pluralidad de microporos, teniendo cada microporo 1-1000 µm de diámetro y extendiéndose hasta una profundidad deseada por debajo de una capa epidérmica de la piel, comprendiendo dichos medios de destrucción una sonda calentada eléctricamente (186) en comunicación operativa con unos medios para modular la temperatura de dicha sonda calentada eléctricamente, entre un estado de temperatura elevada y un estado de temperatura reducida (178), estando colocada dicha sonda calentada eléctricamente en contacto directo con una zona del área seleccionada de la piel; un depósito (308) que contiene el permeante, estando dimensionado dicho depósito para su colocación cubriendo la pluralidad de microporos formados; en el que, en el estado de temperatura elevada, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere conductivamente energía térmica hasta la zonade la piel en contacto, hasta elevar la temperatura de la piel subyacente a la zona de contacto para destruir una zona de la piel hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica, y en el que, en el estado de temperatura reducida, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere menos energía térmica a la piel que la que se requiere para destruir la zona de piel; y medios de control de la impedancia para ajustar el cambio en impedancia eléctrica de dicha sonda calentada eléctricamente en respuesta a la temperatura de dicha sonda calentada eléctricamente, estando acoplados operativamente dichos medios de control de la impedancia a dichos medios de modulación, para modular la corriente suministrada a dicha sonda calentada eléctricamente, de forma que la sonda calentada eléctricamente se mantiene en el estado de temperatura elevada durante un espacio de tiempo deseado.

Description

Microporación de tejido para suministro de agentes bioactivos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general al campo del suministro transmembranar de fármacos o moléculas bioactivas a un organismo. Más particularmente, esta invención se refiere a un sistema mínimamente invasivo o no invasivo, para suministrar un permeante a un organismo incrementando la permeabilidad de la piel, membrana mucosa o capa externa de una planta, a través de la microporación en esta membrana biológica.

El estrato córneo es particularmente responsable de las propiedades de barrera bien conocidas de la piel. Por tanto, es esta capa la que presenta la mayor barrera al flujo transdérmico de fármacos u otras moléculas hacia el cuerpo y de los analitos al exterior del cuerpo. El estrato córneo, la capa externa córnea del cuerpo, es una estructura compleja de remanentes celulares queratinizados compactos, separados por dominios lipídicos. Comparado con la mucosa gástrica u oral, el estrato córneo es mucho menos permeable a moléculas, bien externas o internas al cuerpo. El estrato córneo está formado por queratinocitos, que comprenden la mayoría de las células epidérmicas, que pierden sus núcleos y se transforman en corneocitos. Estas células muertas forman el estrato córneo, que tiene un grosor de sólo aproximadamente 10-30 \mum y, según se indicó anteriormente, es una membrana impermeable muy resistente que protege el cuerpo de la invasión de sustancias exteriores y la migración hacia el exterior de fluidos y moléculas disueltas. El estrato córneo se renueva continuamente por desprendimiento de las células córneas durante la descamación y la formación de nuevas células córneas mediante el proceso de queratinización.

Debajo del estrato córneo está la capa de células viables de la epidermis y la dermis, o capa de tejido conectivo. Estas capas forman conjuntamente la piel. La microporación en estas capas subyacentes (la capa de células viables y la dermis) no se ha usado previamente pero puede incrementar el flujo transdérmico. Más profundas en la dermis están las estructuras subyacentes del cuerpo, incluyendo grasa, músculo, hueso, etc.

La microporación en la membrana mucosa no se usado previamente. La membrana mucosa carece normalmente de estrato córneo. La capa más superficial es la capa epitelial que consiste en numerosas capas de células viables. Más profunda respecto a la capa epitelial está la lámina propia, o la capa de tejido conectivo.

La microporación en plantas ha estado limitada previamente a seleccionar aplicaciones en células individuales en instalaciones de laboratorios. Los organismos vegetales tienen generalmente capas externas duras para proporcionar resistencia a los elementos y la enfermedad. La microporación en esta capa externa dura de las plantas permite el suministro de sustancias útiles para la introducción en la planta, como para conferir la característica deseada a la planta o para la producción de una sustancia deseada. Por ejemplo, se puede tratar una planta, de forma que cada célula de la planta exprese un péptido particular y útil, como una hormona o insulina humana.

El flujo de un fármaco o analito a través de la membrana biológica se puede incrementar cambiando, bien la resistencia (el coeficiente de difusión) o el gradiente de potencial (el gradiente para difusión). El flujo se puede incrementar mediante el uso de los denominados potenciadores de penetración o químicos. Los potenciadores químicos se conocen bien en la técnica y se proporcionará a continuación una descripción más detallada.

Otro método para incrementar la permeabilidad de la piel a los fármacos es la iontoforesis. La iontoforesis implica la aplicación de un campo eléctrico externo y el suministro tópico de una forma ionizada de fármaco o un fármaco desionizado transportado con el flujo de agua asociado con el transporte de iones (electro-ósmosis). Aunque el incremento de la permeación con la iontoforesis ha sido efectivo, el control del suministro de fármacos y el deterioro irreversible de la piel son problemas asociados con la técnica.

La energía sónica se ha usado también para incrementar la permeabilidad de la piel y las membranas sintéticas a los fármacos y otras moléculas. Los ultrasonidos se han definido como ondas de presión mecánica con frecuencias superiores a 20 kHz, H. Lutz et al., Manual of Ultrasound 3-12 (1984). La energía sónica se genera haciendo vibrar un cristal piezoeléctrico u otro elemento electromecánico haciendo pasar una corriente alterna a través del material, R. Brucks et al., 6 Pharm. Res. 697 (1989). El uso de energía sónica para incrementar la permeabilidad de la piel a las moléculas de fármaco se ha denominado sonoforesis o fonoforesis.

Aunque se ha confirmado que el incremento de la permeabilidad de la piel debería teóricamente hacer posible transportar moléculas desde el interior del cuerpo a través de la piel hacia el exterior del cuerpo, para recogida o supervisión, no se han descrito métodos realizables en la práctica. La patente de EE.UU. Nº 5.139.023 de Stanley et al., describe un aparato y método para supervisión no invasiva de la glucosa sanguínea. En esta invención, se usan potenciadores de permeación química para incrementar la permeabilidad del tejido mucoso o la piel a la glucosa. La glucosa se difunde entonces pasivamente a través del tejido mucoso o la piel y se captura en un medio receptor. La cantidad de glucosa en el medio receptor se mide y correlaciona para determinar la concentración de glucosa sanguínea. Sin embargo, según se enseña en Stanley et al., este método es mucho más eficiente cuando se usa sobre el tejido mucoso, como en el tejido bucal, lo cual hace que se recojan cantidades detectables de glucosa en el medio receptor, después de un tiempo muerto de aproximadamente 10-20 minutos. Sin embargo, el método enseñado por Stanley et al. produce un tiempo muerto extremadamente largo, que varía de 2 a 24 horas dependiendo de la composición química potenciadora usada, antes de que se puedan detectar cantidades de glucosa detectables difundiéndose a través de la piel humana (epidermis separada térmicamente) in vitro. Estos tiempos muertos se pueden atribuir a la cantidad de tiempo requerida para que los potenciadores de la permeación química difundan rápidamente a través de la piel e incrementen la permeabilidad de la barrera del estrato córneo, así como a la cantidad de tiempo requerida para que la glucosa se difunda pasivamente a través de la piel hacia el exterior. Por tanto, Stanley et al., claramente no enseña un método para transportar glucosa sanguínea u otros analitos no invasivamente a través de la piel, de una forma que permita la supervisión rápida, según se requiere para la supervisión de la glucosa sanguínea de pacientes diabéticos y para muchos otros analitos corporales, como electrolitos sanguíneos.

Aunque se conoce el uso de energía sónica para suministro de fármacos, los resultados han sido muy desalentadores, ya que el incremento de la permeabilidad ha sido relativamente bajo. No hay consenso sobre la eficacia de la energía sónica para incrementar el flujo de fármacos a través de la piel. Aunque algunos estudios describen el éxito de la sonoforesis, J. Davick et al., 68 Phys. Ther. 1672 (1988); J. Griffin et al., 47 Phys. Ther. 594(1967); J. Griffin & J. Touchstone, 42 Am. J. Phys. Med. 77 (1963); J. Griffin et al., 44 Am. J. Phys., Med. 20(1965); D. Levy et al., 83 J. Clin. Invest. 2074); D. Bommannan et al. 9 Pharm. Res. 559 (1992), otros han obtenido resultados negativos, H. Benson et al., 69 Phys. Ther. 113 (1998); J. MecElnay et al., 20 Br. J. Clin. Pharmacol. 4221(1985); H. Pratzel et al., 13 J. Rheumatol. 1122 (1986). Los sistemas en los que se empleaba piel de roedor mostraban los resultados más prometedores, mientras que los sistemas en los que se empleaba piel humana han mostrado en general resultados desalentadores. Es bien conocido para los expertos en la técnica que la piel de los roedores es mucho más permeable que la piel humana y, consecuentemente, los resultados anteriores no enseñan al experto en la técnica cómo utilizar de forma efectiva la sonoforesis aplicada al suministro y/o el control transdérmicos a través de la piel humana.

En las solicitudes en tramitación junto con la presente, de N^{os} de serie 08/152.442 presentada el 15 de noviembre de 1993, actualmente patente de EE.UU. Nº 5.458.140, y en el Nº de serie 08/152.174 presentada el 8 de diciembre de 1993, actualmente patente de EE.UU. Nº 5.445.611, se describe y reivindica una mejora significativa en el uso de la energía ultrasónica en el control de analitos y también en el suministro de fármacos al cuerpo. En estas invenciones se consigue el muestreo transdérmico de un analito o el suministro transdérmico de fármacos, mediante el uso de energía sónica que se modula en intensidad, fase o frecuencia, o una combinación de estos parámetros, asociado con el uso de potenciadores de permeación químicos. También se describe el uso de energía sónica, opcionalmente con modulaciones de frecuencia, intensidad y/o fase, para impulsar y/o bombear moléculas de forma controlable a través del estrato córneo vía perforaciones introducidas mediante punción con agujas, chorro hidráulico, láser, electroporación u otros métodos.

La microporación (es decir, formación de microporos) en el estrato córneo para incrementar el suministro de fármacos, ha sido el objeto de diversos estudios, y ha producido la concesión de patentes para tales técnicas.

Jacques et al., 88 J. Invest. Dermatol. 88-93 (1987), enseña un método de administración de un fármaco destruyendo el estrato córneo de una región de la piel, usando luz láser pulsada de longitud de onda, longitud de pulso, energía de pulso, número de pulsos y velocidad de repetición de pulsos suficiente para destruir el estrato córneo, sin dañar significativamente la epidermis subyacente y, a continuación, aplicar el fármaco a la región de la destrucción. Este trabajo originó la concesión de la patente de EE.UU. 4.775.361 a Jacques et al. La destrucción de la piel a través del uso de irradiación con láser-ultravioleta había sido descrita anteriormente por Lane et al., 121 Arch. Dermatol. 609-617 (1985). Jacques et al. se restringe al uso de pocas longitudes de onda de luz y láseres caros.

Tankovich, patente de EE.UU. Nº 5.165.418 (de aquí en adelante, "418 de Tankovich"), describe un método para obtener una muestra sanguínea irradiando piel humana o animal con uno o más pulsos de láser de energía suficiente para producir la vaporización del tejido de la piel, produciendo un orificio en la piel que se extiende a través de la epidermis, y cortando al menos un vaso sanguíneo, haciendo que se expulse una cantidad de sangre a través del orificio, de forma que se pueda recoger. La 418 de Tankovich es, por tanto, inadecuada para la permeabilización no invasiva o mínimamente invasiva del estrato córneo, de forma que se pueda suministrar un fármaco al cuerpo o que se pueda analizar un analito procedente del cuerpo.

La patente de EE.UU. Nº 5.423.803 de Tankovich et al. (de aquí en adelante "803 de Tankovich"), describe un método de eliminación por láser de células cutáneas epidérmicas superficiales en piel humana, para aplicaciones cosméticas. El método comprende la aplicación de un "contaminante" absorbedor de luz a las capas externas de la epidermis, y forzar parte de este contaminante hacia el interior o a través de los espacios intercelulares en el estrato córneo, e iluminar la piel infiltrada con pulsos de luz láser de intensidad suficiente, de forma que la cantidad de energía absorbida por el contaminante hará que el contaminante explote con suficiente energía para desgarrar algunas de las células cutáneas epidérmicas. La 803 de Tankovich enseña además que debería existir una absorción elevada de energía por el contaminante a la longitud de onda del haz láser, que el haz láser tiene que ser un haz pulsado de menos de 1 \mus de duración, que el contaminante tiene que forzarse hacia el interior o a través de las capas superiores de la epidermis, y que el contaminante tiene que explotar con suficiente energía para desgarrar células epidérmicas tras la absorción de energía láser. Esta invención tampoco describe o sugiere un método de suministro de fármacos o recogida de analitos.

Raven et al., WO 92/00106, describe un método para eliminar selectivamente tejido enfermo de un cuerpo, administrando a un tejido seleccionado un compuesto que es muy absorbedor de radiación infrarroja de longitud de onda 750-860 nm e irradiando la región con radiación infrarroja correspondiente, a una potencia suficiente para producir la vaporización térmica del tejido al que se administró el compuesto, pero insuficiente para producir vaporización del tejido al que no se había administrado el compuesto. El compuesto absorbedor debería ser soluble en agua o suero, por ejemplo verde de indocianina, clorofila, porfirinas, compuestos que contengan hemo, o compuestos que contengan una estructura polieno, y los niveles de potencia están en el intervalo de 50-1000 W/cm^{2} o incluso superiores.

Konig et al., DD 259351, enseña un procedimiento para el tratamiento térmico de tejido tumoral, que comprende depositar un medio en el tejido tumoral, que absorbe la radiación en la región espectral del rojo y/o próxima al rojo, e irradiar el tejido infiltrado con una longitud de onda apropiada de luz láser. Los medios absorbedores pueden incluir azul de metileno, porfirina reducida o sus agregados, y azul de ftalocianina. Se ejemplifica el azul de metileno, que absorbe fuertemente a 600-700 nm, y un láser de kriptón que emite a 647 y 676 nm. El nivel de potencia debería ser al menos 200 mW/cm^{2}.

Se ha demostrado que separando el estrato córneo de una pequeña área de la piel, con la aplicación y eliminación repetida de papel celo a la misma localización, se pueden recoger cantidades arbitrarias de fluido intersticial, que se puede analizar después para diversos analitos de interés. De forma similar la piel "separada con celo" se ha demostrado que es permeable al suministro transdérmico de compuestos hacia el interior del cuerpo. Desafortunadamente, la "separación con celo" deja una rozadura abierta que tarda semanas en cicatrizar y, por esto, así como por otras razones, no se considera una práctica aceptable para incrementar el transporte transcutáneo en aplicaciones amplias.

Según se analizó anteriormente, se ha demostrado que los láseres pulsados, como el láser excímer funcionando a 193 nm, el láser de erbio funcionando cerca de 2,9 \mum o el láser de CO_{2} funcionando a 10,2 \mum, se pueden usar para originar de forma efectiva pequeños orificios en el estrato córneo humano. Estas técnicas de destrucción por láser ofrecen el potencial de un método selectivo y potencialmente no traumático para abrir un orificio de suministro y/o muestreo a través del estrato córneo. Sin embargo, debido a los costes prohibitivos asociados con estas fuentes de luz, no han existido productos comerciales basados en este concepto. La invención descrita en este momento permite producir la microdestrucción deseada de la membrana biológica con fuentes de energía de coste muy bajo, proporcionando un sistema para conducir directamente la energía térmica hacia el interior o a través de la membrana biológica con resolución espacial y temporal definida muy precisamente.

A la vista de los problemas y/o deficiencias anteriores, el desarrollo de un sistema para incrementar de forma segura la permeabilidad de la membrana biológica, para el control mínimamente invasivo o no invasivo de los analitos del cuerpo en un marco temporal más rápido, sería un avance significativo en la técnica. Otro avance significativo en la técnica sería proporcionar un sistema para incrementar de forma mínimamente invasiva o no invasiva la velocidad de flujo transmembranar de un fármaco hacia el interior de un área seleccionada de un organismo.

Se están realizando avances significativos en el suministro de fármacos y otros compuestos, a través del uso de diversas técnicas que incrementan la permeabilidad de una membrana biológica, tal como la piel o la membrana mucosa. Se han realizado avances incluso más prometedores a través de técnicas para crear microporos, según se describe en las aplicaciones mencionadas anteriormente.

No obstante, es deseable mejorar en estas tecnologías, formando microporos a profundidades seleccionadas en la membrana biológica y para suministrar compuestos tanto grandes como pequeños, en términos de peso molecular y tamaño, a través de los microporos hacia el interior del cuerpo.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un sistema para suministrar un permeante hacia el interior de un organismo, que comprende:

medios para destruir la piel del organismo en un área seleccionada para formar una pluralidad de microporos, teniendo cada microporo 1-1000 \mum de diámetro y extendiéndose hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica de la piel, comprendiendo dichos medios de destrucción un elemento sólido calentado eléctricamente (186-Figura 5), en comunicación operativa con medios para modular la temperatura de dicho elemento sólido entre un estado de temperatura elevada y un estado de temperatura reducida (178-Figura 5), estando colocado dicho elemento sólido en contacto directo con una parte del área seleccionada de la piel;

un depósito (308-Figura 28) que contiene el permeante, estando dimensionado dicho depósito para colocarlo cubriendo la pluralidad de microporos formados;

en el que, en el estado de temperatura elevada, dicho elemento sólido transfiere de forma conductiva energía térmica hasta la porción de contacto de la piel para elevar la temperatura de la piel subyacente a la porción de contacto, destruyendo una porción de la piel hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica y, en el que, en el estado de temperatura reducida, dicho elemento sólido transfiere de forma conductiva menos energía térmica a la piel que la que se requiere para destruir la piel; y

medios de control de la impedancia para determinar el cambio en impedancia eléctrica de dicho elemento sólido en respuesta a la temperatura de dicho elemento sólido, estando dichos medios de control de la impedancia ligados operativamente a dichos medios de modulación, para modular la corriente suministrada a dicho elemento sólido, de forma que dicho elemento sólido se mantiene en el estado de temperatura

\hbox{elevada durante un período  de tiempo deseado.}

En una realización, la capa epidérmica es la capa del estrato córneo de la piel.

En otra realización, la profundidad de los microporos se extiende al menos hacia el interior de la capa de células viables de la piel.

En ciertas realizaciones, la profundidad del microporo está entre aproximadamente 100 micrones y aproximadamente 300 micrones, entre aproximadamente 180 micrones y aproximadamente 300 micrones, entre aproximadamente 20 micrones y aproximadamente 100 micrones, o superior a aproximadamente 110 micrones.

En una realización, dichos medios de modulación comprenden un circuito cerrado de modulación de corriente (174, 178-Figura 5), que modula la corriente suministrada a dicho elemento sólido, de forma que dicho elemento sólido se mantiene sustancialmente en el estado de temperatura elevado durante menos de aproximadamente 20 milisegundos, para reducir la sensación para el organismo y minimizar el volumen de tejido al que le está afectando la energía térmica transferida.

Preferiblemente, en el estado de temperatura reducida, el circuito cerrado de modulación de corriente elimina la corriente de dicho elemento sólido.

En otra realización, dichos medio de modulación comprenden un campo magnético modulador, alimentándose dicho campo magnético selectivamente para producir corrientes eléctricas inducidas dentro de dicho elemento sólido, de forma que el elemento sólido se mantiene sustancialmente en el estado a temperatura elevada durante menos de aproximadamente 20 milisegundos, para reducir la sensación al organismo y minimizar el volumen de tejido al que le está afectando la energía térmica transferida.

En una realización, el sistema de la invención comprende además medios para detectar cuando la destrucción de la piel ha formado la pluralidad de microporos hasta la profundidad deseada en la piel.

En una realización preferida, dichos medios de detección comprenden un medio para medir los cambios en la impedancia eléctrica de la piel a medida que se forma la pluralidad de microporos (250-Figura 7). En una realización, la impedancia eléctrica que se está midiendo es una impedancia compleja.

En una realización, el sistema de la invención comprende además medios para enfriar el área seleccionada de la piel, de forma que el área seleccionada está en un estado enfriado.

En una realización, el permeante se selecciona del grupo formado por un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un antígeno vacunal, un analgésico, un fármaco de molécula pequeña. En una realización, el ácido nucleico es DNA o RNA.

En otra realización, el permeante se selecciona del grupo formado por insulina, interferón, un aditivo y heparina.

En otra realización más, el permeante tiene un peso molecular de al menos 10.000.

En ciertas realizaciones, el permeante está asociado con un vehículo. En una realización, el vehículo comprende liposomas. En otra realización, el vehículo comprende complejos lipídicos. En otra realización más, el vehículo comprende micropartículas. En una realización adicional, el vehículo comprende compuestos de polietilenglicol. En una realización más, el vehículo comprende una matriz polímera; preferiblemente, la matriz polímera es bioerosionable.

En una realización, el permeante comprende una formulación seca; preferiblemente, la formulación seca es un polvo.

En una realización, la sustancia bioactiva se selecciona del grupo formado por péptidos, proteínas, analgésicos, antigenos vacunales, DNA o RNA.

En una realización, el vehículo es una micropartícula; preferiblemente, las micropartículas comprenden una sustancia bioactiva. En una realización, la sustancia bioactiva se selecciona del grupo formado por péptidos, proteínas, analgésicos, antígenos vacunales, DNA o RNA. En ciertas realizaciones, el DNA o RNA está desnudo, fragmentado, acoplado a un plásmido, acoplado a un vector vírico, encapsulado o acoplado a otra sustancia.

En una realización, el sistema de la invención comprende además medios para detectar cuando la destrucción de la piel ha formado al menos un microporo de la profundidad deseada en la piel, en el que dichos medios de detección comprenden medios para medir cambios en la impedancia eléctrica de la piel, como la formación de al menos un microporo (250-Figura 7), y en el que dichos métodos de detección están acoplados operativamente a los medios de destrucción para discontinuar la destrucción de la piel cuando el microporo alcanza la profundidad deseada.

En una realización preferida, la impedancia eléctrica que se está midiendo es una impedancia compleja. En una realización más preferida, la impedancia compleja se mide a una frecuencia seleccionada para destacar las propiedades de impedancia de los tejidos seleccionados.

En una realización, dichos medios de destrucción comprenden un elemento sólido en comunicación operativa con medios para modular la temperatura de dicho elemento sólido entre un estado de temperatura elevada y un estado de temperatura reducida, estando colocado dicho elemento sólido en contacto directo con una porción del área seleccionada de la piel, en la que, en el estado de temperatura elevada dicho elemento sólido transfiere energía térmica conductivamente hasta la porción de contacto de la piel, para elevar suficientemente la temperatura de la piel subyacente a la porción de contacto, destruyendo una porción de la piel hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica y en la que, en el estado de temperatura reducida, dicho elemento sólido transfiere conductivamente menos energía térmica a la piel que la que se requiere para destruir la porción de la piel.

En otra realización, los medios de destrucción comprenden medios para aplicar ráfagas o pulsos cortos de corriente eléctrica a la piel para formar los microporos.

Los siguientes métodos no son parte de la invención reivindicada, pero sirven para ilustrar la invención.

Un método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante hacia el interior de una zona seleccionada de un organismo puede comprender las etapas de incrementar la permeabilidad de dicha zona seleccionada del organismo a dicho permeante, mediante (a) poración en una membrana biológica en dicha zona seleccionada por medios que formen un microporo en dicha membrana biológica, reduciendo así las propiedades de barrera de dicha membrana biológica al flujo de dicho permeante, y (b) puesta en contacto de la zona seleccionada en el que se ha formado el poro, con una composición que comprende una cantidad efectiva de dicho permeante, en donde la velocidad de flujo transmembranar de dicho permeante hacia el interior del organismo se incrementa.

El método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar puede comprender además aplicar a dicha zona de dicho organismo un potenciador para incrementar el flujo de dicho permeante hacia el interior de dicho organismo. Dicho potenciador comprende energía sónica y, más específicamente, dicha energía sónica se aplica a dicha zona a una frecuencia en el intervalo de aproximadamente 10 Hz a 1000 MHz, y dicha energía sónica se modula mediante un elemento seleccionado del grupo que consiste en modulación de frecuencia, modulación de amplitud, modulación de fase y sus combinaciones. Alternativamente, dicho potenciador comprende un campo electromagnético y, más específicamente, iontoforesis o un campo magnético o una fuerza mecánica, potenciador químico o potenciador térmico. Adicionalmente, se puede aplicar cualquiera de los métodos de incremento sónico, electromagnético, mecánico, térmico o químico en cualquiera de sus combinaciones, para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de dicho permeante hacia el interior o a través de dicho microporo.

Un método para incrementar adicionalmente la velocidad de flujo transmembranar puede emplear un potenciador, en el que se aplican dichos potenciadores en dicha zona, de forma que se incremente la velocidad de flujo del permeante hacia el interior de los tejidos que rodean el microporo. Dicho potenciador puede comprender energía sónica. Además, la citada energía sónica se aplica a dicha zona a una frecuencia en el intervalo de aproximadamente 10 Hz a 1000 MHz, en el que dicha energía sónica se modula mediante un elemento seleccionado del grupo que consiste en modulación de frecuencia, modulación de amplitud, modulación de fase y sus combinaciones. Alternativamente, dicho potenciador comprende energía sónica o térmica, electroporación, iontoforesis, potenciadores químicos, fuerza mecánica o un campo magnético, o cualquiera de sus combinaciones.

El método para mejorar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, puede comprender además aplicar a dicha zona de dicho organismo un potenciador, en el que se puede aplicar cualquiera de los métodos de energía sónica o térmica, electroporación, iontoforesis, potenciadores químicos, fuerza mecánica o un campo magnético en cualquiera de sus combinaciones, comprendiendo el método adicionalmente combinar energía sónica o térmica, electroporación, iontoforesis, potenciadores químicos, fuerza magnética o un campo magnético, para incrementar la velocidad de flujo del permeante hacia el interior de los tejidos que rodean al microporo. En el método para mejorar adicionalmente la velocidad de flujo transmembranar en la capa externa y debajo de la misma, dicha poración de dicha membrana biológica en dicha zona, se logra seleccionando del grupo que consiste en (a) destruir la membrana biológica poniendo en contacto dicha zona, de hasta aproximadamente 100 \mum de ancho, de dicha membrana biológica con una fuente de calor de forma que se forma un microporo en dicha zona de dicha membrana biológica; (b) perforar dicha membrana biológica con una microlanceta calibrada para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro; (c) destruir la membrana biológica mediante un haz de energía sónica sobre dicha membrana biológica de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro; (d) perforar hidráulicamente dicha membrana biológica con un chorro de fluido a alta presión, para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro y (e) perforar dicha membrana biológica con pulsos cortos de electricidad para formar un microporo de hasta 1000 \mum de diámetro. Además, dicha formación de poros se puede lograr poniendo en contacto dicha zona, hasta aproximadamente 1000 \mum de ancho, con una fuente de calor, para transferir conductivamente una cantidad efectiva de energía térmica a dicha zona, de forma que la temperatura de parte del agua y otras sustancias vaporizables en dicha zona se eleva por encima de su punto de vaporización, creando un microporo hasta una profundidad seleccionada en la membrana biológica, en dicha zona, de forma que la temperatura de parte del tejido en dicha zona se eleva hasta el punto en que se produce la descomposición térmica, creando un microporo hasta una profundidad seleccionada en la membrana biológica, en dicha zona. Adicionalmente, el método de poración de dicha membrana biológica en dicha zona, puede comprender además tratar al menos dicha zona con una cantidad efectiva de una sustancia que presenta suficiente absorción a través del intervalo de emisión de una fuente de luz pulsada y enfocando la salida de una serie de pulsos procedentes de dicha fuente de luz pulsada sobre dicha sustancia, de forma que dicha sustancia se calienta suficientemente para transferir de forma conductiva una cantidad efectiva de energía térmica a dicha membrana biológica, para elevar la temperatura creando así un microporo. Dicha fuente de luz pulsada emite a una longitud de onda que no se absorbe significativamente por dicha membrana biológica. Dicha fuente de luz pulsada puede ser un diodo láser que emite en el intervalo de aproximadamente 630 a 1550 nm, dicha fuente de luz pulsada puede ser un oscilador paramétrico óptico bombeado por un diodo láser, que emite en el intervalo de aproximadamente 700 y 3000 nm, dicha fuente de luz pulsada puede ser un elemento seleccionado del grupo formado por lámparas de arco, bombillas incandescentes y diodos emisores de luz. El método puede comprender además proporcionar un sistema detector para determinar cuando el microporo en la membrana biológica ha alcanzado las dimensiones deseadas, incluyendo anchura, longitud y profundidad y, además, en el que dicho sistema detector comprende medios de recogida de luz para recibir la luz reflejada desde dicha zona y enfocar dicha luz reflejada sobre un detector para recibir dicha luz, y enviar una señal a un controlador en el que dicha señal indica una cualidad de dicha luz, y un controlador acoplado a dicho detector y a dicha fuente de luz para recibir dicha señal y para desconectar dicha fuente de luz cuando se recibe una señal preseleccionada o, alternativamente, un sistema de medición de impedancia eléctrica que puede detectar los cambios en la impedancia de la membrana biológica a diferentes profundidades en el

\hbox{organismo, a medida que se forma el
microporo.}

El método de mejora de la velocidad de flujo transmembranar en la capa externa y debajo de la misma, puede comprender además enfriar dicha zona y tejidos adyacentes, de forma que dicha zona y tejidos adyacentes estén en un estado enfriado. Dichos medios de enfriamiento comprenden un dispositivo Peltier.

El método para incrementar el flujo transmembranar en y debajo de la capa externa puede comprender además, previamente a la poración de dicha zona, la iluminación de al menos dicha zona con luz, de forma que dicha zona se esterilice.

El método para incrementar el flujo transmembranar en y debajo de la capa externa puede comprender además poner en contacto dicha zona con un elemento sólido, en el que dicho elemento sólido funciona como una fuente de calor para transferir conductivamente una cantidad efectiva de energía térmica a dicha membrana biológica para elevar la temperatura, para crear de esta forma un microporo. Además, dicha fuente de calor se construye para modular la temperatura de dicha zona hasta una temperatura superior a 100ºC, en aproximadamente de 10 nanosegundos a 50 milisegundos y, después, restituir la temperatura de dicha zona hasta aproximadamente la temperatura ambiente, en aproximadamente de 1 milisegundo a 50 milisegundos y en la que se repite un ciclo de incremento de la temperatura y restitución a la temperatura ambiente una o más veces, efectivo para formar poros en la membrana biológica hasta la profundidad deseada. El método puede emplear una fuente de calor, en la que dicha restitución hasta aproximadamente la temperatura ambiente de dicha zona se realiza retirando dicha fuente de calor del contacto con dicha zona y, en la que los parámetros de modulación se seleccionan para reducir la sensación para el sujeto animal.

El método para incrementar las velocidades de flujo transmembranar usando una fuente de calor y un sistema detector, puede comprender adicionalmente medios para controlar la impedancia eléctrica entre dicho elemento sólido y dicho organismo a través de dicha zona y tejidos adyacentes, y medios para avanzar la posición de dicho elemento sólido, de forma que dicha formación de poros se produce con un cambio concomitante en impedancia, dichos medios de avance, hacen avanzar el elemento sólido, de forma que el elemento sólido está en contacto con dicha zona durante el calentamiento del elemento sólido, hasta que se obtiene la impedancia seleccionada. Además, el método puede comprender adicionalmente medios para retirar dicho elemento sólido del contacto con dicha zona, en el que dichos medios de control son capaces de detectar un cambio en impedancia asociado con la puesta en contacto con una capa seleccionada que subyace a la superficie de dicha zona, y enviar una señal a dichos medios de retirada, para retirar dicho elemento sólido del contacto con dicha zona.

El método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar puede usar un elemento sólido en el que dicho elemento sólido se calienta suministrando una corriente eléctrica a través de un elemento de calentamiento óhmico y, además, en el que dicho elemento sólido se forma de manera que contiene un componente eléctricamente conductivo y la temperatura de dicho elemento sólido se modula haciendo pasar una corriente eléctrica modulada a través de dicho elemento conductivo. Adicionalmente, dicho elemento sólido se puede colocar en un campo magnético modulable, en el que la excitación del campo magnético produce corrientes eléctricas inducidas suficientes para calentar el elemento sólido.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar, dicha poración se puede lograr perforando dicha zona con una microlanceta calibrada, hasta formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro mediante un haz de energía sónica dirigido sobre dicha zona, para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro, perforando hidráulicamente dicha membrana biológica con un chorro de fluido a alta presión hasta formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro o, alternativamente, perforando dicha membrana biológica con pulsos cortos de electricidad hasta formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, dicho permeante puede comprender un ácido nucleico. Más específicamente, dicho ácido nucleico comprende DNA o el ácido nucleico comprende RNA.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, el microporo en la membrana biológica se puede extender hacia el interior de una parte de la capa externa de la membrana biológica que varía de 1 a 30 micrones de profundidad, se extiende a través de la capa externa de la membrana biológica variando entre 10 y 200 micrones de profundidad, o se extiende a través de la capa de tejido conectivo de la membrana biológica, variando entre 1000 y 10000 micrones de profundidad.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, el microporo puede penetrar la membrana biológica hasta una profundidad determinada, para facilitar la actividad deseada del permeante seleccionado.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, el permeante puede comprender un polipéptido, incluyendo el caso en el que el polipéptido es una proteína o péptido, y además incluyendo el caso en el que el péptido comprende insulina o un factor de liberación; un carbohidrato, incluyendo el caso en el que el carbohidrato comprende una heparina; un analgésico, incluyendo el caso en el que el analgésico compren de un opiáceo; una vacuna; o un esteroide.

En el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, el permeante puede estar asociado con un vehículo. El vehículo puede comprender liposomas; complejos lipídicos; micropartículas; o compuestos de polietilenglicol. Más específicamente, el método en el que el permeante es una vacuna puede estar combinado con el método en el que el permeante está asociado con un vehículo.

Además, en el método para incrementar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante, el permeante puede comprender una sustancia que tiene la capacidad de cambiar su respuesta detectable a un estímulo cuando se encuentra en las proximidades de un analito presente en el organismo.

Un objeto de la invención es proporcionar un sistema para controlar las velocidades de flujo transmembranar de fármacos u otras moléculas hacia el interior del cuerpo y, si se desea, hacia la corriente sanguínea, a través de perforaciones diminutas en la membrana biológica, incluyendo el estrato córneo u otras capas de la piel, o en la mucosa o capas externas de una planta.

Otro objeto adicional de la invención es proporcionar un sistema de suministro de fármacos hacia el interior del cuerpo a través de microporos en la membrana biológica, en combinación con energía sónica, potenciadores de permeación, gradientes de presión, energía electromagnética, energía térmica y análogos.

Un objeto de la invención es minimizar las propiedades de barrera de la membrana biológica usando la poración, para recoger analitos procedentes del interior del cuerpo de forma controlable, a través de perforaciones en la membrana biológica, para permitir el control de estos analitos.

También se describe un método para controlar analitos seleccionados en el cuerpo a través de microporos en la membrana biológica, en combinación con energía sónica, potenciadores de permeación, gradientes de presión, energía electromagnética, energía mecánica, energía térmica y análogos.

Estos y otros objetos se pueden conseguir proporcionando un método para controlar la concentración de un analito en el cuerpo de un individuo, que comprende las etapas de incrementar la permeabilidad de la membrana biológica de un área seleccionada de la superficie del cuerpo del individuo al analito, mediante

(a) poración de la membrana biológica del área seleccionada, formando un microporo en la membrana biológica, opcionalmente sin causar daño grave a los tejidos subyacentes, reduciendo así las propiedades de barrera de la membrana biológica a la extracción del analito;

(b) recogida de una cantidad seleccionada del analito; y

(c) cuantificación del analito recogido.

En una realización preferida, el método comprende además la aplicación de energía sónica al área seleccionada en la que se han formado los poros, a una frecuencia en el intervalo de aproximadamente 5 kHz a 100 MHz, en el que la energía sónica se modula mediante un elemento seleccionado del grupo formado por modulación de frecuencia, modulación de amplitud, modulación de fase y sus combinaciones. En otra realización preferida, el método comprende poner en contacto el área seleccionada del cuerpo del individuo con un potenciador químico, con la aplicación de energía electromagnética, térmica, mecánica o sónica, para incrementar más la extracción del analito.

La poración de la membrana biológica se consigue por medios seleccionados del grupo que consiste en (a) destruir la membrana biológica poniendo en contacto un área seleccionada de, como máximo aproximadamente 1000 \mum de ancho, de la membrana biológica, con una fuente de calor, de forma que la temperatura del agua ligada al tejido y otras sustancias vaporizables en el área seleccionada, se eleva por encima del punto de vaporización del agua y otras sustancias vaporizables, eliminando por tanto la membrana biológica en el área seleccionada; (b) perforar la membrana biológica con una microlanceta calibrada para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro; (c) destruir la membrana biológica enfocando un haz de energía sónica enfocado de forma precisa, sobre el estrato córneo; (d) perforar hidráulicamente la membrana biológica con un chorro a alta presión de un fluido, para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro y (e) perforar la membrana con pulsos cortos de electricidad, para formar un microporo de hasta aproximadamente 1000 \mum de diámetro.

Una realización preferida de destrucción térmica de la membrana biológica comprende tratar al menos el área seleccionada con una cantidad efectiva de un colorante que exhibe una absorción intensa a través del intervalo de emisión de una fuente de luz pulsada, y dirigir la salida de una serie de pulsos procedentes de la fuente de luz pulsada sobre el colorante, de forma que el colorante se caliente suficientemente para transferir calor conductivamente al estrato córneo para elevar la temperatura del agua ligada al tejido y otras sustancias vaporizables en el área seleccionada por encima del punto de vaporización del agua y de otras sustancias vaporizables. Preferiblemente, la fuente de luz pulsada emite a una longitud de onda que no se absorbe significativamente por la piel. Por ejemplo, la fuente de luz pulsada puede ser un diodo láser emitiendo en el intervalo de aproximadamente 630 a 1550 nm, un oscilador paramétrico óptico bombeado por diodo láser que emite a una longitud de onda en el intervalo de aproximadamente 700 a 3000 nm, o un elemento seleccionado del grupo formado por lámparas de arco, bombillas incandescentes y diodos emisores de luz. También se puede proporcionar un sistema de detección, para determinar cuándo se han superado las propiedades de barrera del estrato córneo. Un sistema de detección preferido comprende medios de recogida de luz para recibir la luz reflejada del área seleccionada, y enfocar la luz reflejada sobre un fotodiodo, un fotodiodo para recibir la luz enfocada y enviar una señal a un controlador, en el que la señal indica la calidad de la luz reflejada, y un controlador acoplado al fotodiodo y a la fuente de luz pulsada para recibir la señal y para desconectar la fuente de luz pulsada cuando se recibe una señal preseleccionada.

En otra realización preferida, el método comprende además enfriar el área seleccionada de la membrana biológica y tejidos adyacentes con medios de enfriamiento, de forma que dicha área seleccionada y tejidos adyacentes están en un estado o condición seleccionado enfriado, estable, previamente, durante y/o después de la formación de poros.

En otra realización preferida adicional, el método comprende destruir la membrana biológica, de forma que el fluido intersticial exude desde los microporos, recoger el fluido intersticial, y analizar el analito en el fluido intersticial recogido. Una vez recogido el fluido intersticial, el microporo se puede sellar aplicando una cantidad efectiva de energía procedente del diodo láser o de otra fuente de luz, de forma que se produzca la coagulación del fluido intersticial que queda en el microporo. Preferiblemente, se aplica vacío al área seleccionada en la que se forman los poros, para mejorar la recogida de fluido intersticial.

En otra realización preferida adicional, el método comprende, previamente a la formación de poros en la membrana biológica, iluminar al menos el área seleccionada con luz, de forma que el área seleccionada iluminada con la luz se esteriliza.

Otro método preferido de formación de poros en la membrana biológica, comprende poner en contacto el área seleccionada con un elemento sólido, de forma que la temperatura del área seleccionada se incrementa desde temperatura ambiente hasta más de 100ºC, en aproximadamente 10 nanosegundos a 50 ms y, después, restituir la temperatura del área seleccionada hasta aproximadamente temperatura ambiental de la piel, en aproximadamente 1 a 50 ms, en el que este ciclo de incremento de la temperatura y restitución hasta aproximadamente la temperatura ambiente, se repite un número de veces efectivo para reducir las propiedades de barrera de la membrana biológica. Preferiblemente, la etapa de restituir hasta aproximadamente la temperatura ambiente se realiza extrayendo el elemento sólido del contacto con la membrana biológica. Se prefiere también proporcionar medios para controlar la impedancia eléctrica entre el elemento sólido y el cuerpo, a través del área seleccionada de la membrana biológica y tejidos adyacentes, y medios para hacer avanzar la posición del elemento sólido de forma que, a medida que se produce la destrucción con una reducción concomitante de la resistencia, el medio de avance hace avanzar el elemento sólido, de forma que el elemento sólido esté en contacto con la membrana biológica durante el calentamiento del elemento sólido. Además, se prefiere también proporcionar medios para extraer el elemento sólido del contacto con la membrana biológica, en los que los medios de control son capaces de detectar un cambio en la impedancia asociado con la puesta en contacto con una capa subyacente a la membrana biológica o una de sus capas, y enviar una señal a los medios de extracción, para extraer el elemento sólido del contacto con la membrana biológica. El elemento sólido se puede calentar mediante un elemento óhmico de calentamiento, puede tener un circuito cerrado de corriente con un punto de alta resistencia, en el que el punto de alta resistencia se modula haciendo pasar una corriente eléctrica modulada a través de dicho circuito cerrado para efectuar el calentamiento. o se puede situar en un campo magnético alternante modulable de una espira de excitación, de forma que, la activación de la espira de excitación con corriente alterna produce corrientes de inducción suficientes para calentar el elemento sólido mediante pérdidas óhmicas internas.

Un método para mejorar la velocidad de flujo transmembranar de un permeante activo hacia el interior de un área seleccionada del cuerpo, que comprende las etapas de incrementar la permeabilidad de la capa de membrana biológica del área seleccionada de la superficie del cuerpo al permeante activo mediante:

(a) formar poros en la membrana biológica del área seleccionada mediante medios que formen un microporo en la membrana biológica, opcionalmente sin producir daños graves a los tejidos subyacentes y reduciendo, de este modo, las propiedades de barrera de la membrana biológica al flujo del permeante activo; y

(b) poner en contacto el área seleccionada en la que se han formado poros, con una composición que comprende una cantidad efectiva del permeante, de forma que se incremente el flujo de permeante hacia el interior del cuerpo.

En una realización preferida, el método comprende además aplicar energía al área seleccionada en la que se han formado poros, durante un tiempo y a una intensidad y frecuencia efectivas para crear un efecto de corriente de fluido y, de este modo, incrementar la velocidad de flujo transmembranar del permeante hacia el interior del cuerpo.

Un método para aplicar un tatuaje a un área seleccionada de piel sobre la superficie del cuerpo de un individuo, puede comprender las etapas de:

(a) formar poros en el estrato córneo del área seleccionada mediante medios que forman un microporo en el estrato córneo, opcionalmente sin producir daños graves a los tejidos subyacentes y reduciendo, de este modo, las propiedades de barrera del estrato córneo al flujo de un permeante; y

(b) poner en contacto el área seleccionada en la que se han formado poros con una composición que comprende una cantidad efectiva de tinta para tatuar, de forma que se incremente el flujo de dicha tinta hacia el interior del
cuerpo.

Un método para reducir el retraso temporal en la difusión de un analito desde la sangre de un individuo al fluido intersticial de dicho individuo, en un área seleccionada de membrana biológica, puede comprender aplicar medios de enfriamiento a dicha área seleccionada de piel.

Un método para reducir la evaporación de fluido intersticial y su presión de vapor, en el que dicho fluido intersticial se está recogiendo de un microporo en un área seleccionada de la membrana biológica de un individuo, puede comprender aplicar medios refrigerantes a dicha área seleccionada de membrana biológica.

Según más realizaciones adicionales, se describe un método para suministrar sustancias bioactivas hacia el interior del cuerpo, a través de microporos formados a profundidades seleccionadas en una membrana biológica, como la piel o la membrana mucosa, o la capa externa de una planta. El método implica formar poros en una capa externa de la membrana biológica, a través de cualquiera de las técnicas de formación de poros conocidas en la técnica, pero hasta una profundidad suficiente y deseada en el interior o a través de la membrana biológica, y poner en contacto la zona en la que se han formado los poros, con una cantidad efectiva de la sustancia bioactiva de peso y tamaño moleculares bajos o elevado. Este proceso se puede mejorar aplicando medidas adicionales de mejora de la permeación, bien antes, durante o después de que se suministre la sustancia bioactiva. Por ejemplo, se pueden aplicar energía sónica, iontoforesis, campos magnéticos, electroporación, potenciadores de permeación, medidas de presión osmótica y presión atmosférica, a la zona en la que se han formado los poros, para mejorar la permeabilidad de las capas situadas por debajo de la capa externa de la membrana biológica.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Fig. 1 muestra una representación esquemática de un sistema para suministrar luz de diodo láser y controlar el progreso de poración.

Fig. 2 muestra una representación esquemática de un sistema de retroalimentación de circuito cerrado para controlar la poración.

Fig. 3A muestra una representación esquemática de un sistema óptico de formación de poros, que comprende un dispositivo de enfriamiento.

Fig. 4 muestra una representación esquemática de un dispositivo de calentamiento óhmico con un actuador mecánico.

Fig. 5 muestra una representación esquemática de un dispositivo de calentamiento de circuito de corriente de elevada resistencia.

Fig. 6 muestra una representación esquemática de un dispositivo para modular el calentamiento, usando calentamiento inductivo.

Fig. 7 muestra una representación esquemática de un monitor de impedancia de circuito cerrado, usando cambios en la impedancia para determinar la extensión de la poración.

Figs. 8A-D muestran secciones transversales de piel humana tratada con ftalocianina de cobre y luego sometidas, respectivamente, a 0, 1, 5 y 50 pulsos de luz de 810 nm, con una densidad de energía de 4000 J/cm^{2} para un período de pulso de 20 ms.

Figs. 9-11 muestran representaciones gráficas de la distribución de temperatura durante los sucesos de poración térmica simulada, usando poración óptica.

Figs. 12 y 13 muestran representaciones gráficas de la temperatura en función del tiempo en el estrato córneo y la epidermis viable, respectivamente, durante sucesos de poración térmica simulada, usando poración óptica.

Figs. 14-16 muestran representaciones gráficas de distribución de temperatura, temperatura en función del tiempo en el estrato córneo, y temperatura en función del tiempo en la epidermis viable, respectivamente, durante sucesos de poración térmica simulada, usando poración óptica, en la que el tejido se enfriaba antes de la poración.

Figs. 17-19 muestran representaciones gráficas de distribución de temperatura, temperatura en función del tiempo en el estrato córneo, y temperatura en función del tiempo en la epidermis viable, respectivamente, durante sucesos de poración térmica simulada, en los que el tejido se calentaba con un hilo caliente.

Figs. 20-22 muestran representaciones gráficas de distribución de temperatura, temperatura en función del tiempo en el estrato córneo, y temperatura en función del tiempo en la epidermis viable, respectivamente, durante sucesos de poración térmica simulada, en los que el tejido se calentaba con un hilo caliente y el tejido se enfriaba antes de la poración.

Figs. 23 y 24 muestran representaciones gráficas de distribución de temperatura y temperatura en función del tiempo en el estrato córneo, respectivamente, durante sucesos de poración térmica simulada, en los que el tejido se calienta ópticamente según los parámetros de funcionamiento de la 803 de Tankovich.

Fig. 25 muestra una representación gráfica de las concentraciones de glucosa sanguínea (*) y del fluido intersticial (ISF), en función del tiempo.

Fig. 26 muestra un diagrama de dispersión de la diferencia de duración entre los datos de glucosa ISF y glucosa sanguínea de la Fig. 25.

Fig. 27 muestra un histograma de la desviación relativa de las concentraciones de glucosa ISF respecto a las sanguíneas, procedentes de la Fig. 25.

Fig. 28 muestra una sección transversal de un aparato de suministro ilustrativo para suministrar un fármaco a un área seleccionada en la piel de un individuo.

Figs. 29A-C muestran representaciones gráficas de áreas de piel afectadas por el suministro de lidocaína a áreas seleccionadas en la que se han formado poros en el estrato córneo (Figs. 29A-B), o no (Fig. 29C).

Fig. 30 muestra un diagrama que compara la cantidad de fluido intersticial recogida de los microporos sólo con succión (), y con una combinación de succión y ultrasonidos (*).

Figs. 31, 32 y 33 muestran una vista en perspectiva de un aparato transductor de ultrasonidos/vacío para recoger el fluido intersticial, una vista de una sección transversal del mismo aparato y una vista esquemática de una sección transversal del mismo aparato, respectivamente.

Figs. 34A-B muestran una vista superior de un transductor ultrasónico portátil y una vista lateral de su extremo espatulado, respectivamente.

Fig. 35 es una representación gráfica que muestra los efectos de incremento de la microporación en el suministro transdérmico de testosterona.

Descripción detallada de una realización preferida

Hay que entender que esta invención no está limitada a las configuraciones particulares, etapas de procedimiento y materiales descritos aquí, ya que tales configuraciones, etapas de procedimiento y materiales pueden variar algo. También hay que entender que la terminología empleada aquí se usa sólo para el propósito de describir realizaciones particulares, y no está destinada a ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Hay que destacar que, según se usan aquí, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a un método para el suministro de "un fármaco" incluye la referencia al suministro de una mezcla de dos o más fármacos, la referencia a "un analito" incluye la referencia a uno o más de tales analitos, y la referencia a un "potenciador de la permeación" incluye la referencia a una mezcla de dos o más potenciadores de la permeación o técnicas tales como una combinación de ultrasonidos y electroporación.

Por tanto, según se usa aquí, la forma en singular se puede usar de forma intercambiable con la forma en plural, y viceversa, es decir: "capa" podría significar capas, o "capas" podría significar capa.

Según se usa aquí, "incluyendo" o "incluye" o análogos, significa incluyendo, sin limitación.

Al describir y reivindicar la presente invención, la siguiente terminología se usará según las definiciones establecidas anteriormente.

Según se usa aquí "organismo" significa el animal o planta completa sobre el que se actúa mediante los métodos aquí descritos.

\newpage

Según se usa aquí, "poración", "microporación", o cualquier término similar, significa la formación de un pequeño orificio o poro hasta una profundidad deseada, en el interior o a través de la membrana biológica, como la piel o la membrana mucosa, o la capa externa de un organismo, para reducir las propiedades de barrera de esta membrana biológica al paso de analitos desde debajo de la superficie, para el análisis del paso de permeantes o fármacos hacia el interior del cuerpo para propósitos seleccionados, o para ciertos procedimientos médicos o quirúrgicos. El procedimiento de microporación al que se hace referencia aquí, se distingue de los orificios formados por electroporación principalmente por las dimensiones mínimas de los microporos, que deben ser no inferiores a 1 micrón de ancho y al menos 1 micrón de profundidad, mientras que los orificios formados por electroporación son típicamente sólo de unos pocos nanómetros en cualquier dimensión. No obstante, la electroporación es útil para facilitar la absorción de permeantes seleccionados por los tejidos elegidos como objetivo, por debajo de las capas externas de un organismo, después de que el permeante haya pasado a través de los microporos hacia el interior de estas capas más profundas del tejido. Preferiblemente, el orificio o microporo no será superior a aproximadamente 1 mm de diámetro y, más preferiblemente, no superior a aproximadamente 300 \mum de diámetro, y se extenderá hasta una profundidad seleccionada, según se describe aquí más adelante.

Según se usa aquí, "microporo" o "poro" significa un orificio formado mediante el método de microporación.

Según se usa aquí "destrucción" significa la eliminación controlada de material que puede incluir células u otros componentes que comprenden alguna parte de una membrana o tejido biológico, producida por cualquiera de los siguientes: energía cinética liberada cuando alguno o todos los componentes vaporizables de tal material se han calentado hasta el punto en el que se produce la vaporización y la rápida expansión de volumen resultante, debida a este cambio de fase hace que este material, y posiblemente algún material adyacente, se elimine de la zona de destrucción; descomposición térmica, mecánica o sónica de parte o todo el tejido en la zona de poración.

Según se usa aquí, la destrucción de un tejido o perforación de un tejido se puede lograr utilizando la misma fuente de energía.

Según se usa aquí, "tejido" significa cualquier componente de un organismo, incluyendo pero no limitado a, células, membranas biológicas, hueso, colágeno, fluidos y análogos, que comprenden alguna parte del organismo.

Según se usa aquí, "sónico" o "acústico" son intercambiables y cubren el espacio de frecuencias de 0,01 Hz y superiores.

Según se usa aquí, "ultrasónico" describe un subconjunto de sónico que comprende frecuencias superiores o iguales a 20.000 Hz, sin límite superior.

Según se usa aquí, "perforación" o "microperforación" significa el uso de medios mecánicos, hidráulicos, sónicos, electromagnéticos o térmicos para perforar total o parcialmente una membrana biológica como la piel o las capas mucosas de un animal, o las capas de tejido externo de una planta

En la medida en que la "destrucción" y la "perforación" logran el mismo propósito que la formación de poros, es decir, la creación de un orificio o poro en la membrana biológica, opcionalmente sin ningún daño significativo a los tejidos subyacentes, estos términos se pueden usar de manera intercambiable. Según se usa aquí "mejora de la penetración" o "mejora de la permeación" significa un incremento en la permeabilidad, mediante la utilización de un potenciador de permeación de una membrana biológica, como la piel o la membrana mucosa o bucal, o una capa de tejido externo de una planta para una sustancia bioactiva, fármaco, analito, colorante, tinte, micropartícula, microsfera, compuesto u otra formulación química (también denominada "permeante"), es decir, de forma que se incremente la velocidad a la que una sustancia bioactiva, fármaco, analito, colorante, micropartícula, compuesto u otra formulación química permea la membrana biológica y facilita la extracción de analitos hacia el exterior, a través de la membrana biológica, o el suministro de sustancias a través de la membrana biológica y hacia el interior de los tejidos subyacentes. La permeación mejorada realizada a través del uso de tales potenciadores se puede observar, por ejemplo, observando la difusión de un colorante, como un permeante, a través de la piel humana o animal, usando un aparato de
difusión.

Según se usa aquí, "potenciador de penetración", "potenciador de permeación", "potenciador" y análogos, incluye todas las sustancias y técnicas que incrementan el flujo de un permeante, analito u otra molécula a través de la piel, y está limitado sólo por funcionalidad. En otras palabras, todos los compuestos que alteran la envuelta celular y los disolventes y técnicas físicas como la electroporación, iontoforesis, campos magnéticos, energía sónica, energía térmica o presión o manipulación mecánica, como un masaje local de la zona y cualquier sustancia química potenciadora, están destinados a estar incluidos.

Según se usa aquí, "potenciador químico" significa una sustancia que incrementa el flujo de un permeante o analito u otra sustancia, a través de una membrana biológica, y está limitado sólo por función.

Según se usan aquí, "colorante", "tinte", y análogos, se deben usar de forma intercambiable y se refieren a un cromóforo biológicamente adecuado que presenta una absorción adecuada sobre parte o todo el intervalo de emisión de una fuente de luz pulsada usada para destruir los tejidos, para formar poros en su interior.

Según se usa aquí, "transdérmico" o "percutáneo" o "transmembranar" o "transmucoso" o "transbucal", significa el paso de un permeante hacia el interior o a través de la membrana o tejido biológico, para lograr concentraciones sanguíneas o concentraciones tisulares terapéuticas efectivas de un fármaco, o en paso de una molécula presente en el cuerpo ("analito") hacia el exterior, a través de la membrana biológica o tejido, de forma que la molécula de analito se puede recoger sobre el exterior del cuerpo.

Según se usa aquí, el término "sustancia bioactiva", "permeante", "fármaco" o "sustancia farmacológicamente activa" o "sustancia suministrable", o cualquier otro término análogo, significa cualquier material o compuesto químico o biológico, adecuado para el suministro mediante los métodos previamente conocidos en la técnica y/o mediante los métodos enseñados en la presente invención, que induce un efecto deseado, como un efecto biológico o farmacéutico, el cual puede incluir, pero no está limitado a (1) producir un efecto profiláctico sobre el organismo y evitar un efecto biológico no deseado, como evitar una infección, (2) aliviar un estado producido por una enfermedad, por ejemplo, aliviar el dolor o inflamación producido como resultado de una enfermedad, (3) bien aliviar, reducir, o eliminar completamente la enfermedad del organismo, y/o (4) la colocación en las capas de tejido viable del organismo de un compuesto o formulación que puede reaccionar, opcionalmente de forma irreversible, a los cambios en la concentración de un analito particular y, al producir esto, causar un cambio detectable en la respuesta mensurable de este compuesto o formulación a la aplicación de energía a este área, que puede ser electromagnética, mecánica o acústica. El efecto puede ser local, como proporcionar un efecto anestésico local, o puede ser sistémico. Esta invención no se dirige a nuevos permeantes o a nuevas clases de sustancias activas distintas de las empleadas en virtud de la técnica de microporación, aunque se pueden usar ahora sustancias no usadas típicamente para suministro transdérmico, transmucoso, transmembranar o transbucal. Más bien se dirige al modo de suministro de sustancias bioactivas o permeantes que existen en la técnica, o que se pueden establecer más tarde como sustancias activas y que son adecuadas para el suministro mediante la presente invención.

Tales sustancias incluyen clases amplias de compuestos suministrados normalmente al interior del organismo, incluyendo a través de superficies y membranas corporales, incluyendo piel, así como mediante inyección, incluyendo métodos de aguja, hidráulicos o de hipervelocidad. En general, esto incluye pero no está limitado a: polipéptidos, incluyendo proteínas y péptidos (p.ej., insulina); factores de liberación, incluyendo la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH); carbohidratos (p.ej., heparina); ácidos nucleicos; vacunas; y sustancias farmacológicamente activas, como antinfecciosos, p.ej. sustancias antibióticas y antivíricas; analgésicos y combinaciones de analgésicos; anoréxicos; antihelmínticos; antiartríticos; sustancias antiasmáticas; anticonvulsivos; antidepresivos; sustancias antidiabéticas; antidiarreicos; antihistamínicos; antinflamatorios; preparaciones antimigraña; antinauseosos; antineopásicos; antiparkinsonianos; antipruríticos; antipsicóticos; antipiréticos; antiespasmódicos; anticolinérgicos; simpatomiméticos; derivados de xantina; preparaciones cardiovasculares, incluyendo bloqueadores de canales de potasio y calcio, bloqueadores beta, bloqueadores alfa, y antiarrítmicos; hipotensores; diuréticos y antidiuréticos; vasodilatadores incluyendo coronarios, periféricos y cerebrales; estimulantes del sistema nervioso central; vasoconstrictores; preparaciones contra la tos y el catarro, incluyendo descongestivos; hormonas, como estradiol, testosterona, progesterona y otros esteroides y derivados y análogos, incluyendo corticosteroides; hipnóticos; inmunosupresores; relajantes musculares; parasimpatolíticos; psicoestimulantes; sedantes; y tranquilizantes. Mediante el método de la presente invención, se pueden suministrar tanto permeantes no ionizados como ionizados, así como permeantes de cualquier peso molecular, incluyendo sustancias con pesos moleculares que varían desde menos de 50 Daltons hasta más de 1.000.000 de Daltons.

Según se usa aquí, una cantidad "efectiva" de un permeante significa una cantidad suficiente de un compuesto para proporcionar el efecto local o sistémico deseado y funcionar en una relación beneficio/riesgo razonable, al ejecutar cualquier tratamiento. Una cantidad "efectiva" de un potenciador, según se usa aquí, significa una cantidad seleccionada de forma que se proporcione un incremento deseado en la permeabilidad del tejido y la profundidad de penetración deseada, velocidad de administración y permeante suministrado.

Según se usan aquí, "portadores" o "vehículos" se refieren a materiales portadores sin actividad farmacológica significativa en las cantidades usadas normalmente, que son adecuados para administración con otros permeantes, e incluyen cualquier material conocido en la técnica, p.ej., cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizador, microsferas, liposomas, micropartículas, complejos lipídicos, o análogos, que sea suficientemente atóxico en las cantidades empleadas y no interaccione con el fármaco a administrar de forma deletérea. Ejemplos de vehículos adecuados para el uso en esta invención incluyen agua, tampones, aceite mineral, silicona, geles inorgánicos u orgánicos, emulsiones acuosas, azúcares líquidos, lípidos, micropartículas, ceras, vaselina, y una diversidad de otros aceites y materiales polímeros.

Según se usa aquí, una "membrana biológica" significa un material de tejido presente en un organismo vivo, que separa un área del organismo de otra y, en muchos casos, separa el organismo de su medio exterior. La piel y las membranas mucosa y bucal están, por tanto, incluidas, así como las capas externas de una planta. Asimismo, las paredes de una célula o un vaso sanguíneo se incluirían en esta definición.

Según se usa aquí, "membrana mucosa" o "mucosa" se refiere a los recubrimientos epiteliales de la boca, nasofaringe, garganta, tracto respiratorio, tracto urogenital, ano, ojo, intestino y todas las demás superficies accesibles a través de un dispositivo endoscópico, como la vejiga, colon, pulmón, vasos sanguíneos, corazón y análogos.

Según se usa aquí, la "membrana bucal" incluye la membrana mucosa de la boca.

Según se usa aquí, "capa externa" y "capa de tejido conectivo" son partes de la membrana biológica y tienen los siguientes significados. "Capa externa" significa todo o parte de la epidermis de la piel o el recubrimiento epitelial de la membrana mucosa o la capa externa de una planta. La porción más superficial de la epidermis animal es el estrato córneo, como se sabe bien en la técnica. La porción más profunda de la epidermis se denomina, para simplicidad, la "capa celular viable", a partir de aquí. Por debajo de la capa externa está la "capa de tejido conectivo". La capa de tejido conectivo significa la dermis en la piel o la lámina propia en la membrana mucosa, u otros tejidos subyacentes en plantas o animales.

Según se usa aquí, "organismo" o "individuo" o "sujeto" o "cuerpo", se refiere a cualquiera entre un ser humano, animal o planta, a los que se pueda aplicar la invención.

Según se usa aquí, "analito" significa cualquier material o compuesto químico o biológico adecuado para pasar a través de una membrana biológica mediante la tecnología enseñada en la presente invención, o mediante la tecnología previamente conocida en la técnica, o del que un individuo puede querer saber la concentración o actividad dentro del cuerpo. La glucosa es un ejemplo específico de un analito, porque es un azúcar adecuado para el paso a través de la piel, y los individuos, por ejemplo aquellos que tienen diabetes, pueden querer conocer sus concentraciones de glucosa sanguínea. Otros ejemplos de analitos incluyen, pero no están limitados a, compuestos tales como sodio, potasio, bilirrubina, urea, amoníaco, calcio, plomo, hierro, litio, salicilatos, anticuerpos, hormonas o una sustancia suministrada exógenamente, y análogos.

Según se usa aquí, "hacia el interior" o "en" una membrana biológica o una de sus capas, incluye la penetración en o a través de sólo una o más capas (p.ej., todo o parte del estrato córneo o la capa externa entera de la piel o una de sus partes).

Según se usa aquí, "a través" de una membrana biológica o una de sus capas significa a través de la profundidad completa de la membrana biológica o su capa.

Según se usa aquí, "velocidad de flujo transdérmico" es la velocidad de paso de cualquier analito hacia el exterior a través de la piel de un sujeto, o la velocidad de paso de cualquier sustancia bioactiva, fármaco, sustancia farmacológicamente activa, colorante, partícula o pigmento, en y a través de la piel que separa el organismo de su medio externo. "Velocidad de flujo transmucoso" y "velocidad de flujo transbucal", se refiere a tal paso a través de las membranas mucosa y bucal y "velocidad de flujo transmembranar" se refiere a tal paso a través de cualquier membrana biológica.

Según se usan aquí, "transdérmico", "transmucoso", "transbucal" y "transmembranar", se pueden usar de forma intercambiable, según sea apropiado en su contexto de uso.

Según se usan aquí, los términos "amplitud de intensidad", "intensidad" y "amplitud", se usan como sinónimos y se refieren a la cantidad de energía que se está produciendo mediante un sistema de energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética.

Según se usa aquí, "modulación de frecuencia" o "barrido" significa una variación continua, gradual o escalonada en la frecuencia de una energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética, en un período determinado de tiempo. Una modulación de frecuencia es una variación gradual o escalonada en frecuencia, en un período de tiempo determinado, por ejemplo 5,4-5,76 MHz en 1 s, o 5-10 MHz en 0,1 s, o 10-5 MHz en 0,1 s, o cualquier otro intervalo de frecuencias o período de tiempo que sea apropiado para una aplicación específica. Una modulación compleja puede incluir la variación, tanto de la frecuencia como de la intensidad, simultáneamente. Por ejemplo, las Figs. 4A y 4B de la patente de EE.UU. Nº 5.458.140 podrían, respectivamente, representar las modulaciones de amplitud y frecuencia que se están aplicando simultáneamente a un transductor de energía sónica individual.

Según se usa aquí, "modulación de amplitud" significa una variación continua, gradual o escalonada en la amplitud o intensidad de una energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética, en un período de tiempo determinado.

Según se usa aquí, "modulación de fase" significa que la sincronización de una energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética se ha cambiado en relación con su estado inicial. Un ejemplo se muestra en la Fig. 4C de la patente de EE.UU. Nº 5.458.140. La frecuencia y amplitud de la señal pueden permanecer idénticas. Una modulación de fase se puede ejecutar con un retraso variable, de forma que la señal se retrase o avance selectivamente en referencia a su estado previo, o a otra señal.

Según se usan aquí, "señal" o "energía" se pueden usar como sinónimos. La energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética, en sus diversas aplicaciones, como con modulación de frecuencia, intensidad o fase, o sus combinaciones, y el uso de potenciadores químicos combinados con energía sónica, térmica, mecánica o electromagnética, según se describe aquí, pueden variar a través de un intervalo de frecuencias de entre aproximadamente 0,01 Hz hasta 1000 MHz, prefiriéndose un intervalo de entre aproximadamente 0,1 Hz y 30 MHz.

Según se usa aquí, medios "no invasivos" significa que no requieren la entrada de una aguja, catéter u otro instrumento invasivo en una parte del sujeto, incluyendo la piel o una membrana mucosa.

Según se usa aquí, "mínimamente invasivo" y "no invasivo" son sinónimos.

Según se usa aquí, "micropartículas" o "microsferas" o "nanopartículas" o "nanosferas" o "liposomas" o "complejos lipídicos", se pueden usar de forma intercambiable.

Medios para formación de poros en la membrana biológica

La formación de un microporo en la membrana biológica se puede lograr mediante diversos medios del estado de la técnica, así como de ciertos medios descritos aquí, que son mejoras de los mismos. Aunque las siguientes técnicas y ejemplos se realizan con respecto a la poración de la membrana biológica, se debería entender que las mejoras descritas aquí, también se aplican a la poración de la membrana mucosa o bucal de las capas externas de una planta.

El uso de destrucción por láser, según se describió por Jacques et al en la patente de EE.UU. 4.775.361, y por Lane et al., más arriba, proporcionan ciertamente un medio para destruir el estrato córneo usando un láser excímer. A 193 nm de longitud de onda y 14 ns de amplitud de pulso, se descubrió que, aproximadamente de 0,24 a 2,8 \mum de estrato córneo se podían eliminar mediante cada pulso láser a una exposición radiante de entre aproximadamente 70 y 480 mJ/cm^{2}. A medida que se incrementa la energía del pulso, se elimina más tejido del estrato córneo y se requieren menos pulsos para la poración completa de esta capa. El umbral menor de exposición radiante que se tiene que absorber por el estrato córneo dentro del límite del tiempo de relajación térmica, para producir microexplosiones adecuadas que produzcan la destrucción del tejido, es aproximadamente 70 mJ/cm^{2} en un tiempo de 50 milisegundos (ms). En otras palabras, se tiene que suministrar un total de 70 mJ/cm^{2} en una intervalo de tiempo de 50 ms. Esto se puede realizar mediante un pulso único de 70 mJ/cm^{2}, o en 10 pulsos de 7 mJ/cm^{2}, o con una iluminación continua de 1,4 vatios/cm^{2}, durante el tiempo de 50 ms. El límite superior de exposición radiante es el que destruirá el estrato córneo sin dañar el tejido subyacente, y se puede determinar empíricamente a partir de la fuente de luz, longitud de onda de la luz, y otras variables comprendidas en la experiencia y conocimiento de un experto en esta técnica.

Mediante "suministro", en el contexto de la aplicación de energía, se indica que la cantidad de energía fijada se absorbe por el tejido a destruir. A la longitud de onda de 193 nm, se produce esencialmente una absorción del 100% en el interior de los primeros 1 o 2 \mum del tejido del estrato córneo. Asumiendo que el estrato córneo tenga aproximadamente 20 \mum de grosor, a las longitudes de onda mayores, como a 670 nm, sólo aproximadamente 5% de la luz incidente se absorbe en la capa de 20 \mum. Esto significa que aproximadamente 95% del haz de potencia elevada pasa al interior de los tejidos subyacentes al estrato córneo, en los que probablemente producirá un daño significativo. En el contexto de suministro de una sustancia bioactiva, el término significa proporcionar la sustancia bioactiva a la localización deseada.

El ideal es usar sólo tanta potencia como sea necesaria para perforar la membrana biológica u otras capas de piel, mucosa o tejido seleccionados, sin producir sangrado, daño térmico u otro daño inaceptable a los tejidos subyacentes y adyacentes desde los que se extraen los analitos o se suministran los permeantes.

Sería beneficioso usar fuentes de energía más económicas que la energía procedente de láseres excímer. Los láseres excímer, que emiten luz a longitudes de onda en la región UV lejana, son mucho más caros en cuanto a funcionamiento y mantenimiento que, por ejemplo, los láseres de diodo que emiten luz a longitudes de onda en las regiones visible e IR (600 a 1800 nm). Sin embargo, a longitudes de onda mayores, la membrana biológica se hace progresivamente más transparente y la absorción se produce principalmente en los tejidos subyacentes.

La presente invención facilita un método rápido y mínimamente traumático para eliminar la función de barrera de la membrana biológica, para facilitar el transporte transmembranar de sustancias hacia el interior del cuerpo cuando se aplican tópicamente, o para acceder a los analitos en el interior del cuerpo para el análisis. El método utiliza un procedimiento que comienza con la aplicación por contacto de una fuente de calor de pequeña área, al área elegida como objetivo de la membrana biológica.

La fuente de calor tiene que tener varias propiedades importantes, como se describirá a continuación. Primero, la fuente de calor tiene que estar dimensionada de forma que el contacto con la membrana biológica se restrinja a una pequeña área, típicamente aproximadamente de 1 a 1000 \mum de diámetro. Segundo, tiene que tener la capacidad de modular la temperatura de la membrana biológica en el punto de contacto, desde temperatura superficial ambiente hasta superior al punto de vaporización de una cantidad suficiente de los componentes en la membrana biológica, y luego volver hasta aproximadamente la temperatura ambiente, con tiempos de ciclo para minimizar el daño colateral a los tejidos viables y el traumatismo al sujeto. Esta modulación se puede crear electrónica, mecánica o químicamente.

Adicionalmente, para aplicaciones seleccionadas, se puede facilitar una característica limitativa de la profundidad inherente al proceso de microporación, si la fuente de calor tiene, tanto una masa térmica suficientemente pequeña, como una fuente de energía limitada para elevar su temperatura, de forma que cuando se coloca en contacto con tejidos con más de 30% de contenido de agua, la dispersión térmica en estos tejidos sea suficiente para limitar la temperatura máxima de la fuente de calor hasta menos de 100ºC. Esta característica, detiene efectivamente el proceso de vaporización térmica, una vez que la sonda térmica ha penetrado a través del estrato córneo al interior o a través de las capas inferiores de la epidermis.

Sin embargo, si uno utiliza una sonda térmica que puede continuar suministrando suficiente energía al interior o a través de las capas de tejido viables hidratadas por debajo de la capa externa de la membrana biológica, el proceso de poración puede continuar en el interior del cuerpo hasta una profundidad seleccionada, penetrando a través de las capas más profundas, incluyendo, p.ej., en el caso de la piel, a través de la epidermis, la dermis y en las capas subcutáneas inferiores, si se desea. La preocupación cuando se diseña un sistema para crear un microporo que se extiende alguna distancia en el interior o a través de los tejidos viables por debajo del estrato córneo, la membrana mucoso o bucal, es principalmente cómo minimizar el daño al tejido adyacente y la sensación para el sujeto durante el proceso de poración. Experimentalmente, se ha demostrado que si la sonda térmica usada es un elemento sólido calentado eléctrica u ópticamente, con el extremo de la sonda calentada activa definido físicamente para no tener más de unos pocos cientos de micrones de ancho y sobresaliendo como máximo unos pocos milímetros desde la base de soporte, un sólo pulso o múltiples pulsos de corriente pueden suministrar suficiente energía térmica hacia el interior o a través del tejido para permitir que la destrucción penetre tan profundo como permita el diseño físico, por ejemplo, hasta que la base de soporte actúe como componente para limitar la extensión de la penetración en o a través del tejido, restringiendo esencialmente la profundidad hasta la que puede penetrar la sonda térmica en un microporo para ponerse en contacto con tejido sin tratar, sin formación de poros. Si las propiedades eléctricas y térmicas de dicha sonda térmica, cuando está en contacto con los tejidos, permiten que el pulso de energía module la temperatura de dicha sonda con suficiente rapidez, este tipo de poración en el tejido profundo se puede conseguir esencialmente sin dolor para el sujeto. Los experimentos han demostrado que, si la cantidad requerida de energía térmica se suministra a la sonda en menos de, aproximadamente, 20 milisegundos, el procedimiento es indoloro. Inversamente, si el pulso de energía se tiene que extender más allá de, aproximadamente, 20 milisegundos, la sensación para el sujeto se incrementa rápidamente y de forma no lineal, a medida que se extiende la amplitud del pulso.

Se puede construir un diseño de sonda calentada eléctricamente, que soporte este tipo de formación de poros profundos seleccionados, curvando un hilo de volframio de 50 a 150 micrones de diámetro en forma de una acodadura puntiaguda, formando un codo próximo a 180 grados, con un radio interno mínimo en este punto. Este trozo de hilo conformado como una "V" en miniatura, se puede montar de forma que la punta de la "V" se extiende alguna distancia hacia fuera de la pieza de soporte, que tiene electrodos de cobre depositados sobre la misma. La distancia a la que el hilo se extiende hacia el exterior desde el soporte definirá la distancia de penetración máxima en o a través del tejido, cuando el hilo se calienta. Cada pata de la "V" de volframio se unirá a uno de los electrodos sobre el vehículo de soporte que puede conectarse, a su vez, al circuito de corriente pulsante. Cuando la corriente se suministra al hilo de una forma controlada apropiadamente, el hilo se calentará rápidamente hasta la temperatura deseada, para efectuar el proceso de destrucción térmica en un único pulso o en múltiples pulsos de corriente. Controlando la impedancia dinámica de la muestra y conociendo el coeficiente de resistencia frente a la temperatura del elemento de volframio, se puede establecer fácilmente un control de circuito cerrado de la temperatura del punto de contacto. Asimismo, controlando dinámicamente la impedancia a través del cuerpo desde el punto de contacto de la sonda y un segundo electrodo colocado separado a cierta distancia, se puede estimar la profundidad del poro, basada en las diferentes propiedades de impedancia del tejido a medida que uno penetra más profundamente en el cuerpo.

Se puede construir un diseño de sonda calentada ópticamente, que soporta este tipo de poración de profundidad deseada, cogiendo una fibra óptica y colocando sobre un extremo una punta formada por un capuchón o recubrimiento sólido. Se puede acoplar una fuente de luz, como un diodo láser, al otro extremo de la fibra. La cara de la punta enfrentada a la fibra tiene que tener un coeficiente de absorción suficientemente elevado a través del intervalo de longitudes de onda emitidas por la fuente de luz, para que cuando los fotones alcancen el extremo de la fibra y golpeen esta cara, algunos de ellos se absorban y, consecuentemente, hagan que la punta se caliente. El diseño específico del conjunto de esta punta, fibra y fuente pueden variar ampliamente, aunque las fibras con diámetros gruesos de 50 a 1000 micrones de ancho son artículos de uso común hoy en día, y las fuentes que emiten hasta miles de vatios de energía óptica son, de forma similar, de uso común. La punta que forma la sonda térmica real se puede fabricar de un material con un punto de fusión elevado como volframio, y unirse a la fibra mecanizándola para permitir la inserción de la fibra en un diámetro cilíndrico en el extremo de la fibra. Si el extremo distal de la punta se ha fabricado para limitar la difusión térmica fuera de esta punta y el retroceso al cilindro de soporte que une la punta a la fibra dentro del marco de tiempo de las amplitudes de pulso usadas, los fotones incidentes sobre esta punta elevarán la temperatura rápidamente, tanto en la cara de la fibra como en la cara de contacto que está situada contra la superficie de los tejidos. La colocación del conjunto de la fibra/punta sobre la superficie del tejido se puede lograr con un mecanismo simple, diseñado para mantener la punta contra la superficie bajo alguna tensión de muelle, de forma que a medida que el tejido de debajo se destruye, la punta misma avanzará hacia el interior del tejido. Esto permite que el proceso de destrucción térmica continúe hacia el interior o a través del tejido, siempre que uno lo desee. Una característica adicional de este diseño de sonda calentada ópticamente es que, controlando la energía radiada del cuerpo negro desde el extremo calentado que se recoge por la fibra, se puede efectuar un control de circuito cerrado muy simple de la temperatura del extremo. Asimismo, según se describió anteriormente, controlando dinámicamente la impedancia a través del cuerpo desde el punto de contacto de la sonda y un segundo electrodo colocado a alguna distancia, se puede determinar la profundidad del poro, basándose en las propiedades de impedancia diferentes del tejido, a medida que uno penetra más profundamente en el cuerpo. La relación entre la amplitud del pulso y la sensación para este diseño, es esencialmente la misma que para la sonda calentada eléctricamente, descrita anteriormente.

La impedancia se puede usar para determinar la profundidad de un poro fabricado por cualquier medio. Se puede usar como entrada para un sistema de control para fabricar poros de profundidad seleccionada. La impedancia medida puede ser la impedancia compleja medida a una frecuencia seleccionada para destacar las propiedades de impedancia de los tejidos seleccionados en un organismo seleccionado.

Una característica adicional es el gran incremento de eficiencia que se puede alcanzar combinando la poración de las capas externas de la membrana biológica, con otras técnicas de mejora de la permeación que se pueden optimizar en la actualidad para funcionar sobre las diversas barreras, para el suministro efectivo del compuesto deseado hacia el interior o a través de los espacios internos que necesite atravesar para ser efectivo biológicamente. En particular, si uno está suministrando un compuesto de DNA, bien desnudo, fragmentado, encapsulado o acoplado a otra sustancia, se desea a menudo introducir el DNA en las células vivas sin matar la célula, para permitir la absorción deseada y el funcionamiento posterior de la terapia. Se conoce bien en la técnica que la electroporación, iontoforesis y ultrasonidos pueden producir la formación de orificios, temporalmente, en las membranas celulares y otras membranas de tejidos internos. Habiendo roto el estrato córneo o la capa mucosa o capa externa de una planta, y si se desea penetrar en la epidermis o dermis, o más profundamente en el interior de una planta, se pueden usar entonces electroporación, iontoforesis, campos magnéticos y energía sónica, con parámetros que se pueden diseñar para actuar selectivamente sobre estas barreras de tejidos subyacentes. Por ejemplo, para cualquier medio de incremento de la energía electromagnética o sónica, la acción específica de incremento se puede diseñar para enfocarse sobre cualquier parte del poro, p.ej., sobre el fondo del poro mediante el diseño de los medios de enfoque empleados, como el diseño de los dispositivos de formación de los electrodos, del campo sónico y magnético y análogos. Alternativamente, el incremento se puede enfocar más generalmente sobre el poro entero o sobre el área que rodea al poro. En el caso de la electroporación, en el que se usan normalmente pulsos superiores a entre 50 y 150 voltios para realizar la electroporación del estrato córneo o la capa mucosa, en el medio que presentamos serán suficientes pulsos de sólo unos pocos voltios para realizar la electroporación de la célula, capilar u otras membranas en el tejido elegido como objetivo. Esto se debe principalmente a la reducción drástica del número de capas aislantes presentes entre los electrodos, una vez que la superficie externa de la membrana biológica se ha perforado. De forma similar, se puede demostrar que la iontoforesis es efectiva para modular el flujo de un medio fluido que contiene DNA, a través de los microporos con cantidades muy pequeñas de corriente, debido a la reducción drástica de la impedancia física al flujo del fluido a través de estas capas en las que se han formado poros.

Mientras que se han usado previamente los ultrasonidos para acelerar la permeación del estrato córneo o la capa mucosa, eliminando esta barrera a través de los microporos se ha creado la oportunidad de utilizar la energía sónica para permeabilizar la célula, capilar u otras estructuras en el tejido elegido como objetivo. Como en los casos de electroporación e iontoforesis, hemos demostrado que los niveles de energía sónica precisos para efectuar una mejora notable en el flujo transmembranar de una sustancia, son mucho más bajos que cuando el estrato córneo o las capas mucosas se dejan intactos. El modo de funcionamiento de todos estos métodos activos, electroporación, iontoforesis, campos magnéticos, fuerzas mecánicas o ultrasonidos, cuando se aplican solos o en combinación, después de realizar la poración en la membrana biológica, es muy similar a los parámetros usados típicamente en aplicaciones in vitro, en las que membranas celulares individuales se están perforando para el suministro de una sustancia.

Con la fuente de calor colocada en contacto con la superficie de la membrana biológica, se establece un ciclo a través de una serie de una o más modulaciones de temperatura, desde un punto inicial a temperatura ambiente, hasta una temperatura máxima en exceso de 123ºC, y de nuevo hasta una temperatura superficial ambiente. Para minimizar o eliminar la percepción sensorial del proceso de microporación por el animal, estos pulsos se limitan en duración, y el distanciamiento entre pulsos es suficientemente largo para permitir el enfriamiento de las capas de tejido viables en la membrana biológica y, más particularmente, de los tejidos inervados, para conseguir una temperatura promedio en los tejidos inervados de menos de aproximadamente 45ºC. Estos parámetros están basados en las constantes temporales térmicas de los tejidos epidérmicos viables de la piel humana (aproximadamente 30-80 ms), localizados entre la sonda térmica y el tejido inervado en la dermis subyacente. El resultado de esta aplicación de energía térmica pulsada es que se conduce suficiente energía hacia el interior o a través del estrato córneo, dentro del pequeño punto elegido como objetivo, de forma que la temperatura de este volumen de tejido se eleva suficientemente por encima del punto de vaporización del contenido de agua ligada al tejido en el estrato córneo. A medida que la temperatura se incrementa por encima de 100ºC, el contenido de agua del estrato córneo (típicamente de 5% a 15%) en este punto localizado, se induce a vaporizarse y expandirse muy rápidamente, produciendo una eliminación dirigida por el vapor de aquellos corneocitos en el estrato córneo localizados en las proximidades de este suceso de vaporización. La patente de EE.UU. Nº 4.775.361 enseña que una temperatura del estrato córneo de 123ºC representa un umbral en el cual se produce este tipo de vaporización instantánea. A medida que se aplican pulsos posteriores de energía térmica, se eliminan capas adicionales del estrato córneo hasta que se forma un microporo a través del estrato córneo, hacia la siguiente capa inferior de la epidermis, el estrato lúcido. Limitando la duración del pulso térmico hasta menos de una constante temporal térmica de la epidermis y permitiendo que cualquier energía térmica conducida al interior o a través de la epidermis se disipe durante un tiempo suficientemente largo, la elevación de temperatura de las capas viables de la epidermis es mínima. Esto permite que se produzca el proceso de microporación completo sin ninguna sensación para el sujeto y sin daño para los tejidos subyacentes ni circundantes. Si la sonda térmica puede alcanzar temperaturas superiores a 300ºC, parte de la poración se puede deber a la descomposición térmica directa del tejido.

En un método de creación de orificios microscópicos, es decir microporos, de aproximadamente 1 a 100 \mum de ancho, indoloro o con escasa sensación, en una membrana biológica de un organismo, la clave para realizar con éxito este método es la creación de una fuente de energía térmica apropiada, o sonda térmica, que se mantiene en contacto con la membrana biológica. El principal desafío técnico para fabricar una sonda térmica apropiada es diseñar un dispositivo que produzca el contacto deseado con la membrana biológica y que se pueda modular a una frecuencia suficientemente alta.

Es posible fabricar una sonda térmica apropiada poniendo en contacto la membrana biológica con un compuesto absorbedor de luz adecuado, como un colorante o tinte, o cualquier película fina o sustancia seleccionada debido a su capacidad para absorber luz a la longitud de onda emitida por una fuente de luz seleccionada. En este caso, la fuente de luz seleccionada puede ser un diodo láser que emite a una longitud de onda que no se absorbería normalmente por la membrana biológica. Enfocando la fuente de luz hacia una pequeña zona de la capa tópica del colorante, tinte, película fina o sustancia, la temperatura del área elegida como objetivo se puede modular variando la intensidad del flujo de luz enfocado sobre ella. Es posible utilizar la energía de fuentes láser que emiten a una longitud de onda más larga que un láser excímer, aplicando primero tópicamente al estrato córneo un compuesto absorbedor de luz adecuado, como un colorante, tinte, película fina o sustancia seleccionada, debido a su capacidad para absorber luz a la longitud de onda emitida por la fuente láser. Se puede aplicar el mismo concepto a cualquier longitud de onda y sólo se tiene que elegir un colorante o tinte y una longitud de onda óptica apropiados. Sólo se tiene que consultar cualquier manual de referencia para descubrir cuáles son los colorantes apropiados y la longitud de onda de la absorbancia máxima de ese colorante. Una de tales referencias es Green, The sigma-Aldrich handbook of stains, dyes and indicators, Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, Wisconsin (1991). Por ejemplo, la ftalocianina de cobre (Pigment Blue 15; CPC) absorbe a aproximadamente 800 nm; el ácido tetrasulfónico de ftalocianina de cobre (Acid Blue 249) absorbe a aproximadamente 610 nm; el verde de indocianina absorbe a aproximadamente 775 nm; y la criptocianina absorbe a aproximadamente 703 nm. El CPC es particularmente adecuado para esta realización por las siguientes razones: es un compuesto muy estable e inerte, ya aprobado por la FDA para uso como colorante en suturas implantables; absorbe muy intensamente a longitudes de onda de 750 nm a 950 nm, que coinciden con numerosos emisores en estado sólido de bajo coste, como diodos láser y LEDs y, además, este área de banda de longitud de onda óptica, de forma similar, no se absorbe directamente por los tejidos de la piel en ninguna cantidad significativa; el CPC tiene un punto de vaporización elevado (>550ºC al vacío) y cambia directamente desde fase sólida hasta fase de vapor, sin ninguna fase líquida; el CPC tiene una constante de difusividad térmica relativamente baja, permitiendo que la energía lumínica enfocada sobre él, caliente selectivamente sólo el área directamente en el punto focal, con una dispersión lateral muy pequeña del foco caliente hacia el CPC circundante, ayudando así a la definición espacial de la sonda térmica de contacto.

El propósito de esta descripción no es hacer un listado exhaustivo de colorantes, tintes, películas o sustancias apropiados, porque esto se podría determinar fácilmente por un experto en la técnica a partir de los datos actualmente disponibles.

Lo mismo se aplica para cualquier fuente de luz pulsada particular deseada. Por ejemplo, este método se puede realizar con una lámpara incandescente enfocada, accionada mecánicamente, como fuente de luz pulsada. Diversa literatura de catálogos y ventas muestra numerosos láseres que funcionan en el intervalo de UV cercano, visible e IR cercano. Láseres representativos son el modelo PLP-02 de Hammamatsu Photonic Systems, que actúa a una potencia de salida de 2x10^{-8} J, a una longitud de 415 nm; el modelo PLP-05 de Hammamatsu Photonic Systems que funciona a una potencia de salida de 15 J, a una longitud de onda de 685 nm; la serie de láser pulsado SDL-3250 de SDL, Inc., que actúa a una potencia de salida de 2x10^{6} J, a una longitud de onda de aproximadamente 800-810 nm; el modelo SDL-8630 de, SDL, Inc. que funciona a una potencia de salida de 500 mW, a una longitud de onda de aproximadamente 670 nm; el modelo AR-081-15000 de Uniphase Laser, que funciona a una potencia de salida de 15000 mW, a una longitud de onda de 790-830 nm; el modelo TOLD9150 de Toshiba America Electronic que funciona a una potencia de salida de 30 mW, a una longitud de onda de 690 nm; y el modelo Diolite 800-50 de, LiCONIX, que funciona a una potencia de 50 mW, a una longitud de onda de 780 nm.

Una fuente de luz láser pulsada puede emitir radiación a través de un amplio intervalo de longitudes de onda, variando entre aproximadamente 100 nm y 12.000 nm. Los láseres excímer emitirán típicamente a través de un intervalo de entre aproximadamente 100 y 400 nm. Los láseres excímer comerciales están disponibles actualmente con longitudes de onda en el intervalo de aproximadamente 193 nm y 350 nm. Preferiblemente, un diodo láser tendrá un intervalo de emisión de entre aproximadamente 380 y 1550 nm. Un diodo láser de frecuencia duplicada tendrá un intervalo de emisión entre aproximadamente 190 y 775 nm. Se pueden utilizar longitudes de onda mayores de entre aproximadamente 1300 y 3000 nm, usando un oscilador paramétrico óptico bombeado por diodo láser. Se espera, dada la gran cantidad de investigación que se está produciendo en tecnología láser, que estos intervalos se expandan con el tiempo.

La energía suministrada o absorbida no se tiene que obtener de un láser, ya que se puede usar cualquier fuente de luz, bien sea de un láser, una lámpara de arco corto como una lámpara de destellos de xenon, una lámpara incandescente, un diodo emisor de luz (LED), el sol, o cualquier otra fuente. Por tanto, el instrumento particular usado para suministrar radiación electromagnética es menos importante que la longitud de onda y energía asociada con el mismo. Se puede considerar cualquier instrumento capaz de suministrar la energía necesaria a las longitudes de onda adecuadas, es decir, en el intervalo de aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 12.000 nm. La característica esencial es que la energía se tiene que absorber por el compuesto absorbedor de luz, para producir su calentamiento localizado, seguido de conducción de suficiente calor al tejido a destruir, dentro de la dimensión temporal permitida.

En una realización ilustrativa, la propia sonda está formada por una capa fina, preferiblemente de aproximadamente 5 a 1000 \mum de grosor, de una sustancia sólida no biológicamente activa, colocada en contacto con un área seleccionada de la piel de un individuo, que es suficientemente grande para cubrir la zona en la que se va a crear un microporo. La formulación específica del compuesto químico se elige de forma que presente una absorción elevada a lo largo del intervalo espectral de una fuente de luz seleccionada para proporcionar energía al compuesto absorbedor de luz. La sonda puede ser, por ejemplo, una lámina de un compuesto sólido, una película tratada con un compuesto absorbedor de luz adecuado, o recubierta con el mismo o que lo contiene, o una aplicación directa del compuesto absorbedor de luz a la piel, como precipitado o como suspensión en un vehículo. Independientemente de la configuración de la sonda térmica absorbedora de luz, tiene que presentar un coeficiente de difusión térmica lateral suficientemente bajo, de forma que cualquier elevación local de temperatura permanezca suficientemente definida espacialmente, y el modo dominante de pérdida de calor será preferiblemente mediante conducción directa en la membrana biológica, a través del punto de contacto entre la piel y la sonda.

La modulación de temperatura requerida de la sonda se puede lograr enfocando una fuente de luz sobre la capa de la sonda, y modulando la intensidad de esta fuente de luz. Si la energía absorbida en el área iluminada es suficientemente elevada, hará que la capa de la sonda se caliente. La cantidad de energía suministrada y, posteriormente, tanto la velocidad de calentamiento como la temperatura máxima de la capa de la sonda en el punto focal, se pueden modular fácilmente variando la amplitud del pulso y la potencia máxima de la fuente de luz. En esta realización, sólo es el pequeño volumen de capa de la sonda calentado por la energía óptica incidente enfocada, el que forma la sonda térmica. El material adicional de la capa de esta sonda que se podría haber aplicado sobre un área mayor que la zona real de poración, es accesorio. Usando un compuesto absorbedor de luz en fase sólida con un punto de fusión relativamente elevado, como la ftalocianina de cobre (CPC), que permanece en su fase sólida hasta una temperatura superior a 550ºC, la sonda térmica se puede llevar rápidamente hasta una temperatura de varios cientos de ºC, y permanecer aún en contacto con la membrana biológica, permitiendo que esta energía térmica se conduzca al interior o a través del estrato córneo. Además, esta realización comprende elegir una fuente de luz con un espectro de emisión en el que muy poca energía se absorbería normalmente en los tejidos de la membrana biológica.

Una vez que el área elegida como objetivo tiene la capa de la sonda absorbedora de luz colocada en contacto con ella, la sonda térmica se forma cuando la fuente de luz se activa con la curvatura focal del haz colocada para coincidir con la superficie del área tratada. La densidad de energía de luz en la curvatura focal y la cantidad de absorción que se produce en el compuesto absorbedor de luz, se determinan para que sean suficientes para llevar la temperatura del compuesto absorbedor de luz, dentro del área de la pequeña zona definida por el foco de la fuente de luz, hasta más de 123ºC, en unos pocos milisegundos. A medida que aumenta la temperatura de la sonda térmica, la conducción en la membrana biológica o a través de la misma suministra energía hacia el interior o a través de estos tejidos, elevando la temperatura local de la membrana biológica. Cuando se ha suministrado suficiente energía al interior de esta pequeña área de la membrana biológica o a través de la misma, para hacer que la temperatura local se eleve por encima del punto de ebullición de parte del agua y otros componentes vaporizables contenidos en estos tejidos, se produce una vaporización instantánea de este material, eliminando cierta parte de la membrana biológica en esta localización, y formando un microporo.

Encendiendo y apagando la fuente de luz, se puede modular rápidamente la temperatura de la sonda térmica y se puede lograr la destrucción selectiva de estos tejidos, permitiendo crear un orificio dimensionado muy precisamente, que puede penetrar selectivamente sólo a través de los primeros 10 a 30 micrones de la membrana biológica, o se puede hacer más profundo.

Una característica adicional de esta realización es que, eligiendo una fuente de luz de la que se absorbería normalmente muy poca energía por la membrana biológica o los tejidos subyacentes, y diseñando la óptica de enfoque y suministro para que tenga una apertura numérica suficientemente elevada, la pequeña cantidad de luz suministrada que no se absorbe por la propia sonda térmica, diverge rápidamente a medida que penetra profundamente en el cuerpo. Debido a que hay muy poca absorción a las longitudes de onda suministrada, no se suministra esencialmente ninguna energía a la membrana biológica directamente desde la fuente de luz. Esta dilución tridimensional de energía acoplada en los tejidos, debida a la divergencia del haz y al bajo nivel de absorción en el tejido sin tratar, produce una interacción completamente benigna entre el haz de luz y los tejidos, sin que se produzca daño por ello.

Se puede usar un diodo láser como fuente de luz con una longitud de onda de emisión de 800 \pm 30 nm. Se puede formar una sonda térmica mediante aplicación tópica de una cinta adhesiva transparente que se ha tratado sobre la cara adhesiva con una zona de 0,5 cm formada de un depósito de ftalocianina de cobre (CPC) molida finamente. La CPC muestra coeficientes de absorción extremadamente elevados en el intervalo espectral de 800 nm, absorbiendo típicamente más de 95% de la energía radiante de un diodo láser.

La Fig. 1 muestra un sistema 10 para suministrar luz desde tal diodo láser hasta un área seleccionada de la membrana biológica de un individuo y para controlar el progreso del proceso de poración. El sistema comprende un diodo láser 14, acoplado a un controlador 18, que controla la intensidad, duración y separación de los pulsos de luz. El diodo láser emite un haz 22 que se dirige hacia una lente o lentes de captación 26, que enfocan el haz sobre un espejo 30. El haz se refleja después mediante el espejo hasta una lente o lentes del objetivo 34, que enfoca el haz en un punto preseleccionado 38. Este punto preseleccionado corresponde con el plano de una plataforma xyz 42 y su orificio de objetivo 46, de forma que se puede irradiar un área seleccionada de una membrana biológica de un individuo. La plataforma xyz está conectada con el controlador, de forma que se puede controlar la posición de la plataforma xyz. El sistema comprende también un sistema de control que comprende una cámara CCD 50, acoplada a un monitor 54. La cámara CCD está alineada confocalmente con la lente del objetivo, de forma que se puede controlar el progreso del proceso de poración visualmente sobre el monitor.

Se describe un sistema de fotodiodos sensores y sistemas ópticos de captación que se han alineado confocalmente con la fuente de luz de destrucción. La Fig. 2 muestra un sistema sensor 60 para uso en esta realización. El sistema comprende una fuente de luz 64 para emitir un haz de luz 68, que se dirige a través de un sistema óptico de emisión 72 que enfoca el haz en un punto preseleccionado 76, como la superficie de la piel de un individuo 80. Una parte de la luz que se pone en contacto con la piel se refleja, y otra luz se emite desde el área irradiada. Una parte de esta luz reflejada y emitida pasa a través de un filtro 84 y luego a través de un sistema de captación óptica 88, que enfoca la luz sobre un fotodiodo 92. Un controlador 96 se acopla tanto al diodo láser como al fotodiodo para controlar, respectivamente, la salida del diodo láser, y detectar la luz que alcanza el fotodiodo. Sólo partes seleccionadas del espectro emitido desde la piel pasan a través del filtro. Analizando los cambios en la luz reflejada y emitida desde el área elegida como objetivo, el sistema tiene la capacidad de detectar cuando se ha roto el estrato córneo, y esta retroalimentación se usa luego para controlar la fuente de luz, desactivando los pulsos de luz cuando se logra la microporación del estrato córneo. Empleando este tipo de sistema de retroalimentación de circuito cerrado activo, se obtiene un dispositivo aplicable universalmente, autorregulable, que produce microporos dimensionados uniformemente en el estrato córneo, con requerimientos de energía mínimos, independientemente de las variaciones entre un individuo y el siguiente.

Se puede incorporar un dispositivo refrigerante en la superficie de contacto del sistema con la piel. La Fig. 3A muestra una representación esquemática ilustrativa del mismo. En este sistema 100, una fuente de luz 104 (acoplada a un controlador 106) emite un haz de luz 108, que pasa a través de un sistema óptico de emisión 112 y es enfocado por el mismo. El haz es enfocado por el sistema óptico de emisión hacia un punto preseleccionado 116, como un área seleccionada de la piel de un individuo 120. Un dispositivo refrigerante 124, como un dispositivo de Peltier u otro medio de enfriamiento, se pone en contacto con la piel para enfriar su superficie. En una realización preferida del dispositivo refrigerante 124 (Fig. 3B), hay un orificio central 128, a través del cual pasa el haz de luz enfocada para ponerse en contacto con la piel. Haciendo referencia de nuevo a la Fig. 3A, se coloca también preferiblemente un disipador de calor 132 en contacto con el dispositivo refrigerante. Proporcionando un dispositivo refrigerante con un pequeño orificio en su centro, coincidente con el foco de la luz, los tejidos en el área general donde se van a formar los poros se pueden enfriar hasta entre 5ºC y 10ºC. Esta refrigeración permite un margen de seguridad superior para que funcione el sistema, en cuanto a que las sensaciones potenciales para el usuario y la posibilidad de cualquier daño colateral a la epidermis directamente debajo de la zona de poración, se reducen significativamente respecto a la realización no refrigerada. Adicionalmente, para aplicaciones de control, la refrigeración minimiza la evaporación de fluido intersticial y puede proporcionar también propiedades físicas ventajosas, como tensión superficial reducida de tal fluido intersticial. Más aún, se sabe que la refrigeración del tejido produce un incremento localizado en el flujo sanguíneo en tal tejido refrigerado, favoreciendo así la difusión de analitos desde la sangre hacia el fluido intersticial y favoreciendo la difusión de los permeantes suministrados fuera de la zona del poro o hacia el interior del tejido subyacente al poro.

El método se puede aplicar también para otras técnicas de microcirugía en las que el compuesto absorbedor de luz/sonda térmica se aplica al área a destruir, y luego la fuente de luz se usa para modular selectivamente la temperatura de la sonda en la zona seleccionada elegida como objetivo, afectando a los tejidos a través del proceso de vaporización-destrucción producido.

La fuente de luz se puede usar para ayudar a sellar el microporo una vez que ha pasado su utilidad. Específicamente, en el caso de control para un analito interno, se crea un microporo y se extrae cierta cantidad de fluido intersticial a través de este orificio. Una vez que se ha recogido una cantidad suficiente de fluido intersticial, la fuente de luz se reactiva a un nivel de potencia reducido, para facilitar la agrumación o coagulación del fluido intersticial dentro del microporo. Forzando la coagulación o agrumación del fluido en el poro, este orificio en el cuerpo se sella efectivamente, reduciendo así el riesgo de infección. Asimismo, el uso de la propia fuente de luz, tanto para la formación del microporo como para su sellado, es un procedimiento inherentemente estéril, sin ninguna penetración física en el cuerpo por ningún dispositivo o aparato. Además, el choque térmico inducido por la energía lumínica mata cualquier microbio que puedan estar presentes en la zona de destrucción.

Este concepto de esterilización óptica se puede extender para incluir una etapa adicional en el proceso en el que la fuente de luz se aplica primero de manera desenfocada, cubriendo el área elegida como objetivo con un área iluminada que se extiende 100 \mum o más por encima del tamaño real del microporo a producir. Seleccionando el área sobre la cual se tiene que aplicar el haz desenfocado, la densidad de flujo se puede reducir correspondientemente hasta un nivel muy por debajo del umbral de destrucción, pero suficientemente elevado para esterilizar efectivamente la superficie de la piel. Después de una exposición suficientemente larga del área mayor al haz esterilizante, bien en una etapa continua o en una serie de pulsos, el sistema se configura a continuación en el modo de destrucción enfocado de modo preciso y comienza el proceso de microporación óptica.

La sonda térmica requerida se puede crear a partir de un elemento sólido, como un hilo de pequeño diámetro. Según se describió previamente, la superficie de contacto de la sonda térmica tiene que permitir que su temperatura se module desde temperatura ambiente de la membrana biológica, hasta temperaturas superiores a 123ºC, en el tiempo requerido permitido de, preferiblemente, entre aproximadamente 1 microsegundo hasta 50 milisegundos a la temperatura elevada (tiempo de encencido) y al menos 1 a 50 ms a la temperatura baja (tiempo de enfriamiento). En particular, la capacidad de modular la temperatura hasta una temperatura superior a 150ºC durante un tiempo de calentamiento de alrededor de 5 ms y un tiempo de enfriamiento de 50 ms produce una destrucción térmica muy efectiva con escasa o ninguna sensación para el individuo.

Se pueden aplicar con éxito varios métodos para modular las temperaturas del área de contacto de la sonda térmica del elemento sólido. En una realización de la invención, se puede llevar un trozo corto de hilo hasta la temperatura elevada deseada mediante un elemento de calentamiento externo, como un elemento de calentamiento óhmico usado en el extremo de un soldador de cobre. La Fig. 4 muestra un dispositivo de calentamiento óhmico 140 con un actuador mecánico. El dispositivo de calentamiento óhmico comprende una fuente de calor óhmico 144, acoplada a una sonda térmica de elemento sólido 148. La fuente de calor óhmico está acoplada también a través de un montaje aislante 152, a un dispositivo de modulación mecánica 156, como un solenoide. En esta configuración se puede alcanzar una condición de estado estable, en la que el extremo de la sonda de elemento sólido se estabilizará a cierta temperatura de equilibrio, definida por los parámetros físicos de la estructura, es decir, la temperatura de la fuente de calor óhmico, la longitud y diámetro del elemento sólido, la temperatura del aire que rodea al elemento sólido, y el material del que está formado el elemento sólido. Una vez conseguida la temperatura deseada, se efectúa la modulación de la temperatura del área seleccionada de la membrana biológica de un organismo 160, a través del dispositivo de modulación mecánica, para situar alternativamente el extremo caliente del hilo en contacto con la membrana biológica durante, preferiblemente, un tiempo de calentamiento de 5 ms, y luego retirarlo al aire durante, preferiblemente, un tiempo de enfriamiento de 50 ms.

Otra realización de la invención (Fig. 5), muestra un dispositivo 170, que comprende una fuente de corriente 174 acoplada a un controlador 178. La fuente de corriente está acoplada a un circuito cerrado de corriente 182, que comprende un elemento sólido 186 conformado en una estructura, de forma que presenta un punto de resistencia elevado. Preferiblemente, el elemento sólido está soportado sobre un montaje 190, y un aislante 194 separa las diferentes partes del circuito de corriente. La modulación de temperatura deseada se logra luego modulando meramente la corriente a través del elemento sólido. Si la masa térmica del elemento sólido está dimensionada apropiadamente y la disipación de calor proporcionada por los electrodos que lo conectan a la fuente de corriente es suficiente, los tiempos de calentamiento y enfriamiento del elemento sólido se pueden lograr en unos pocos milisegundos. La puesta en contacto del elemento sólido con un área seleccionada de la membrana biológica 198, calienta la membrana biológica para lograr la destrucción deseada.

En la Fig. 6 se muestra aún otro ejemplo ilustrativo, no según la invención, de poración de la membrana biológica con una sonda térmica de elemento sólido. En este sistema 200, el elemento sólido 204 se puede colocar en un campo magnético alternante modulable, formado por una espira de alambre 208, la espira de excitación. Incrementando la energía de la corriente alternante en la espira de excitación mediante un controlador 212 acoplado a la misma, se pueden inducir corrientes inducidas de intensidad suficiente en la sonda térmica de elemento sólido, que se calentará directamente a través de las pérdidas óhmicas internas. Esto es esencialmente una versión en miniatura de un sistema de calentamiento inductivo usado normalmente para el tratamiento térmico de los extremos de herramientas o para inducir la desgasificación de los electrodos en tubos de vacío o lámparas destellos. La ventaja del método de calentamiento inductivo es que la energía suministrada a la sonda térmica de elemento sólido se puede controlar estrechamente y modularse fácilmente a través del control electrónico de la espira de excitación, sin ninguna conexión eléctrica directa con la propia sonda térmica. Si la masa térmica de la sonda térmica de elemento sólido y la masa térmica de la membrana biológica en contacto con el extremo de la sonda son conocidas, el control de la energía inductiva suministrada puede permitir un control preciso de la temperatura en el punto de contacto 216 con la membrana biológica 220. Debido a que el tejido de la membrana biológica es esencialmente amagnético a las frecuencias más bajas a las que se puede lograr el calentamiento inductivo, si en la espira de excitación se usan frecuencias seleccionadas apropiadamente, entonces este campo electromagnético alternante no producirá ningún efecto sobre los tejidos del organismo.

Si se emplea una modulación de contacto controlada mecánicamente, se puede obtener una característica adicional incorporando un sistema sencillo de control de circuito cerrado, en el que se controla la impedancia eléctrica entre el extremo de la sonda y la piel del sujeto. De esta manera, la sonda se puede poner en contacto con la piel del sujeto, indicado por la reducción por etapas de la resistencia una vez realizado el contacto, y luego mantenerse allí durante el tiempo de calentamiento deseado, después de lo cual se puede retirar. Varios tipos de actuadores lineales son adecuados para esta forma de control de circuito cerrado, como un mecanismo de sonido a bobina, un solenoide simple, un sistema rotativo con una palanca o balancín, y análogos. La ventaja es que, a medida que progresa la destrucción térmica, puede avanzar de forma similar la posición del extremo de la sonda térmica en la membrana biológica, asegurando siempre un buen contacto para facilitar la transferencia eficiente de la energía térmica requerida. Asimismo, para la poración en la piel, se puede usar el cambio en las propiedades de conductividad del estrato córneo y la epidermis, para proporcionar una verificación elegante de circuito cerrado de que se ha completado el proceso de poración, es decir, cuando la resistencia indica que se ha alcanzado la epidermis, es el momento de detener el proceso de poración. Asimismo, se pueden usar cambios similares de impedancia para controlar la profundidad de penetración a otras capas.

La Fig. 7 muestra un ejemplo ilustrativo de tal monitor de impedancia de circuito cerrado. En este sistema 230, hay una fuente de calor óhmico 234, acoplada a una sonda térmica de hilo 238. La fuente de calor está montada a través de un montaje aislante 242 sobre un modulador mecánico 246. Un controlador 250 está acoplado al hilo y a la piel 254, donde el controlador detecta cambios en impedancia en el área seleccionada de la piel 258. Cuando se obtiene un nivel predeterminado, el controlador detiene el proceso de poración.

De forma similar a los medios hidráulicos de poración, están las microlancetas, adaptadas sólo para penetrar en el estrato córneo con los propósitos de administrar un permeante, como un fármaco, a través del poro formado, o de extraer un analito a través del poro para análisis. Tal dispositivo se considera que es "mínimamente invasivo", comparado con los dispositivos y/o técnicas que son no invasivas. El uso de microlancetas que penetran por debajo del estrato córneo para extraer sangre es bien conocido. Tales dispositivos están disponibles comercialmente de fabricantes como Becton-Dickinson y Lifescan, y se pueden utilizar controlando la profundidad de penetración. Como ejemplo de un dispositivo de microlanceta para recoger fluidos corporales, se hace referencia a Erickson et al., solicitud internacional de patente PCT publicada WO 95/10223 (publicada el 20 de abril de 1995). Esta solicitud muestra un dispositivo para penetración en o a través de la capa dérmica de la piel, sin penetración en los tejidos subcutáneos, para recoger fluidos corporales para control, como para las concentraciones de glucosa sanguínea.

La poración de una membrana biológica se puede lograr también usando medios sónicos. La poración por medios sónicos es una variación de los medios ópticos descritos anteriormente excepto porque, en vez de usar una fuente de luz, se suministra al área del estrato córneo a destruir un haz de energía sónica enfocado muy precisamente. Se requieren los mismos niveles de energía sónica, es decir, se tiene que absorber aún un umbral de 70 mJ/cm^{2}/50 ms. Se pueden usar los mismos transductores ultrasónicos enfocados, pulsados, descritos en las solicitudes originales de N^{os} de serie 08/152.442 (actualmente patente de EE.UU. Nº 5.458.140) y 08/152.174 (actualmente patente de EE.UU. Nº 5.445.611) para suministrar las densidades de energía requeridas para la destrucción, que los usados en el suministro de energía sónica que se modula en intensidad, fase o frecuencia, o una combinación de estos parámetros, para el muestreo transdérmico de un analito o el suministro transdérmico de fármacos. Esto tiene la ventaja de permitir el uso del mismo transductor para impulsar un fármaco a través del estrato córneo o impulsar un fluido corporal hasta la superficie para su análisis, y usarlo para crear primero un microporo.

Adicionalmente, se puede aplicar electroporación o ráfagas o pulsos cortos de corriente eléctrica al estrato córneo, con suficiente energía para formar microporos. La electroporación se conoce en la técnica para producir poros en membranas biológicas y están disponibles en el comercio instrumentos de electroporación. Por tanto, una persona experta en esta técnica puede seleccionar un instrumento y condiciones para su uso, sin experimentación innecesaria según las directrices proporcionadas aquí.

Los microporos producidos en la membrana biológica mediante los métodos descritos anteriormente, permiten elevadas velocidades de fluencia de compuestos terapéuticos de distintos pesos moleculares destinados a suministrarse transmembranarmente. Además, estos orificios no traumáticos en el cuerpo permiten el acceso de diversos analitos al interior del cuerpo, que se pueden analizar para determinar sus concentraciones internas.

Ejemplo 1

En este ejemplo, se prepararon muestras cutáneas como sigue. Se separó la membrana epidérmica de la piel completa de un cadáver humano mediante el método de separación térmica de Klingman y Christopher, 88 Arch. Dermatol. 702 (1963), que implicaba la exposición del grosor total de la piel a una temperatura de 60ºC durante 60 segundos, tiempo después del cual el estrato córneo y parte de la epidermis (la membrana epidérmica) se desprendían cuidadosamente de la dermis.

Ejemplo 2

Las muestras de estrato córneo separadas térmicamente, preparadas según el procedimiento del Ejemplo 1, se cortaron en secciones de 1 cm^{2}. Estas pequeñas muestras se unieron luego al cubre de vidrio de un portaobjetos, colocándolas sobre el portaobjetos y aplicando un disco recubierto en su dorso por un adhesivo sensible a la presión con un orificio de 6 mm en el centro sobre la muestra de piel. A continuación, las muestras estaban listas para el ensayo experimental.

En algunos casos, las muestras de piel se hidrataban, dejándolas sumergirse durante varias horas en una solución de fosfato tamponada neutra o en agua pura.

Como prueba de estas muestras de piel sin tratar, se aplicaron a la muestra las salidas de varios diodos láser infrarrojos diferentes, que emitían aproximadamente a 810, 905, 1480 y 1550 nanómetros. Los medios ópticos emisores se diseñaron para producir una curvatura focal de 25 \mum de ancho, con un objetivo final que tiene una apertura numérica de 0,4. Se midió la potencia total suministrada al punto focal, que estaba entre 50 y 200 milivatios para los diodos láser de 810 y 1480 nm, que eran capaces de funcionar en forma de onda continua (CW). Los diodos láser de 905 y 1550 nm se diseñaron para producir pulsos de potencia máxima elevada, aproximadamente de 10 a 200 nanosegundos de duración, con índices de repetición de hasta 5000 Hz. Para los láseres pulsados se midió que los niveles de potencia máxima eran 45 vatios a 905 nm y 3,5 vatios a 1550 nm.

Bajo estas condiciones de funcionamiento, no existía un efecto aparente sobre las muestras de piel procedentes de ninguno de los láseres. El área elegida como objetivo se iluminaba continuamente durante 60 segundos y luego se examinaba microscópicamente, sin revelar ningún defecto visible. Además, la muestra se colocaba en una célula de Franz modificada, usada típicamente para analizar sistemas de suministro transdérmico basados en potenciadores de permeación química, y la conductividad de un lado de la membrana al otro se midió, tanto antes como después de la irradiación por láser, y no mostraba ningún cambio. Basándose en estos análisis que se realizaban sobre muestras de piel de cuatro donadores diferentes, se concluyó que a estas longitudes de onda, el acoplamiento de la energía óptica en o a través del tejido cutáneo era tan pequeño, que no era detectable ningún efecto.

Ejemplo 3

Para evaluar la sensación potencial para un sujeto vivo cuando se iluminaba con energía óptica en las condiciones del Ejemplo 2, se usaron seis voluntarios y se aplicó la salida de cada fuente de láser a las yemas de sus dedos, antebrazos, y el dorso de sus manos. En los casos de láseres de 810, 905 y 1550 nm, el sujeto era incapaz de sentir cuando el láser estaba encendido o apagado. En el caso del láser de 1480 nm, existía alguna sensación durante la iluminación por el láser de 1480 nm funcionando a 70 mW CW, y después de un rato corto, se formaba una ampolla pequeñita bajo la piel, debido a la absorción de la radiación de 1480 nm por una de las bandas de absorción de agua. Aparentemente, la cantidad de energía absorbida era suficiente para inducir la formación de la ampolla, pero no era suficiente para producir la eliminación por destrucción del estrato córneo. Asimismo, la absorción de la luz de 1480 nm se producía predominantemente en los tejidos más profundos, totalmente hidratados (85% a 90% de contenido de agua) de la epidermis y dermis, no en el tejido relativamente seco (10% a 15% de contenido de agua) del estrato córneo.

Ejemplo 4

Habiendo demostrado la carencia de efecto sobre la piel en su estado natural (Ejemplo 3), se evaluó una serie de compuestos químicos para la efectividad en la absorción de la energía lumínica y la transferencia posterior de esta energía absorbida, vía conducción, en o a través del tejido del estrato córneo elegido como objetivo. Los compuestos ensayados incluían tinta china; negro indeleble de la marca "SHARPIE", rotuladores marcadores azul y rojo; azul de metileno; rojo fucsia; epolita nº 67, un compuesto absorbedor desarrollado para moldearse en lentes de policarbonato para gafas protectoras de láser; tintura de yodo; completo de yodo-poli(vinil-pirrolidona) ("BETADINE"); ftalocianina de cobre; y tinta de impresoras.

Usando ambos diodos láser CW descritos en el Ejemplo 2, se observaron resultados de destrucción positivos sobre las muestras in vitro de estrato córneo separado térmicamente, preparado según el Ejemplo 1 cuando se usaban todos estos productos, sin embargo algunos funcionaban mejor que otros. En particular, la ftalocianina de cobre (CPC) y la epolita nº 67 eran algunos de los más efectivos. Una razón probable para el funcionamiento superior de la CPC, es su elevado punto de ebullición, superior a 500ºC, y el hecho de que mantiene su fase sólida hasta esta temperatura.

Ejemplo 5

Como la ftalocianina de cobre ha sido ya aprobada por la FDA para uso en suturas implantables, y está listada en el índice Merck como una molécula bastante benigna y estable en relación con la biocompatibilidad humana, la siguiente etapa realizada fue combinar la aplicación tópica de la CPC y la fuente de luz enfocada a la piel de voluntarios humanos sanos. Se preparó una suspensión de CPC triturada finamente en alcohol isopropílico. El método de aplicación usado fue agitar la solución y luego aplicar una pequeña gota en la zona elegida como objetivo. A medida que el alcohol se evaporaba, se quedaba un recubrimiento fino y uniforme de la CPC en fase sólida sobre la superficie de la piel.

El aparato mostrado en la Fig. 1 se aplicaba entonces a la zona, en la que la CPC se había depositado tópicamente sobre la piel, colocando el área seleccionada de la piel del individuo contra una placa de referencia. La placa de referencia consiste en una ventana de vidrio fino, aproximadamente de 3 cm x 3 cm, con un orificio de 4 mm en el centro. El área cubierta por la CPC se colocó de tal forma que estuviese dentro del orificio central. A continuación, se usó un microscopio de vídeo confocal (Fig. 1) para enfocar la superficie de la piel de forma precisa. La colocación de la piel para lograr el enfoque más preciso sobre el sistema de vídeo, también la colocaba de forma que el punto focal del sistema láser fuese coincidente con la superficie de la piel. El operador activaba luego los pulsos de luz láser, observando simultáneamente los efectos en la zona elegida como objetivo sobre el monitor de vídeo. La cantidad de penetración se estimaba visualmente por el operador, calibrando la cantidad de desenfoque del punto de láser en el microporo, a medida que se incrementaba la profundidad del microporo, y esto se puede corregir dinámicamente por el operador, esencialmente siguiendo la superficie destruida hacia abajo en los tejidos, moviendo la posición de la fuente de cámara/láser a lo largo del eje "z", en la piel. En el punto en el que se había eliminado el estrato córneo hasta la epidermis, la apariencia de la base del orificio cambiaba perceptiblemente, haciéndose muy húmeda y reluciente. Al observar este cambio, el operador desactivaba el láser. En muchos casos, dependiendo del estado de hidratación del sujeto, así como otras condiciones fisiológicas, se producía una salida notable de fluido intersticial, como respuesta a la función de barrera del estrato córneo que se estaba eliminando sobre esta pequeña área. El sistema de vídeo se usaba para grabar este registro visual de la accesibilidad de fluido intersticial en la zona de poración.

Ejemplo 6

Se siguió el procedimiento del Ejemplo 5, excepto porque la CPC se aplicaba a una cinta adhesiva transparente, que se adhería luego a una zona seleccionada sobre la piel de un individuo. Estos resultados eran sustancialmente similares a los del Ejemplo 5.

Ejemplo 7

Se realizaron experimentos de histología sobre piel de cadáveres, según métodos bien conocidos en la técnica para determinar los parámetros de umbral de destrucción para mezclas de colorantes determinadas y la información del daño colateral. La superficie superior de la muestra de piel se trató con una solución de ftalocianina de cobre (CPC) en alcohol. Una vez que se evaporaba el alcohol, se distribuía una capa tópica de CPC en fase sólida sobre la superficie de la piel con un grosor medio de 10 a 20 \mum. La Fig. 8A muestra una sección transversal del grosor total de la piel antes de la aplicación de láser, en la que se muestran la capa de CPC 270, el estrato córneo 274, y las capas epidérmicas subyacentes 278. La Fig. 8B muestra la muestra después de que se aplicase un único pulso de luz de 810 nm a un círculo de 80 \mum de diámetro con una densidad de energía de 4000 J/cm^{2}, durante un período de pulso de 20 ms. Merece la pena destacar que existía aún una cantidad significativa de CPC presente sobre la superficie del estrato córneo incluso en el medio del cráter destruido 282. También es necesario destacar que las mediciones de laboratorio indican que sólo aproximadamente 10% de la energía lumínica incidente en la CPC se absorbe realmente, siendo el 90% restante reflejada o retrodispersada. Por tanto, el flujo de energía efectiva que se suministraba a la capa de colorante, que podría causar el calentamiento deseado, es sólo aproximadamente 400 J/cm^{2}. 8C representa la muestra después de que se aplicasen 5 pulsos de 810 nm de luz, siendo eliminada la barrera del estrato córneo sin dañar el tejido subyacente. Estos resultados son una buena representación del funcionamiento de la destrucción térmica modulada ópticamente "ideal". La Fig. 8D representa la muestra después de que se aplicasen 50 pulsos. El tejido dañado 286 estaba presente en las capas epidérmicas, debido a la carbonización del tejido no destruido y a la desnaturalización térmica del tejido subyacente. Las Figs. 8A-8C muestran separaciones entre el estrato córneo y las capas epidérmicas subyacentes, debido a un artefacto de deshidratación, congelación y preparaciones para formación de imágenes.

Ejemplo 8

Para examinar los detalles del mecanismo de destrucción térmica, se construyó un modelo matemático de los tejidos cutáneos, sobre el cual se podían ensayar varias realizaciones diferentes del método de destrucción térmica. Este modelo contabiliza la distribución de temperatura en un medio estratificado semiinfinito con una entrada de flujo térmico especificada localmente sobre la superficie y eliminación de calor desde la superficie hasta alguna distancia, es decir, se aplica convección entre los dos. La ecuación de difusión dependiente del tiempo, de simetría axial, se resuelve en coordenadas cilíndricas, usando el método implícito de dirección alternante (ADI). (Nota: la constante de temperatura B.C. se aplica sobre el límite inferior para servir como z->inf; y el flujo térmico radial cero se aplica sobre el límite radial max. para servir como r->inf). Las capas son paralelas a la superficie y se definen como: (1) colorante; (c) estrato córneo; (3) epidermis subyacente; y (4) dermis. La profundidad en el medio semiinfinito y las propiedades térmicas, densidad (rho), calor específico (c) y conductividad (k), se tienen que especificar para cada capa.

Primero, el coeficiente de transferencia térmica, h, sobre la piel se calcula basado en la distribución de temperatura "estable", "1-D", determinada mediante la temperatura del aire ambiental, la temperatura de la superficie cutánea y la temperatura de la dermis. Se asume que no hay colorante presente y se proporciona "h" sobre la superficie de la piel. El programa permite entonces usar esta "h" sobre la superficie de la capa de colorante o introduce otra "h" deseada para la superficie del colorante. A continuación, se calcula la distribución de temperatura "estable" a través de todas las capas (incluyendo la capa de colorante), usando la "h" especificada en la superficie del colorante. Esta distribución de temperatura es la condición inicial para el problema de calentamiento dependiente del tiempo. Este constituye la m inicial del "archivo-m". A continuación, el programa resuelve la distribución de temperatura dependiente del tiempo poniendo en marcha el tiempo, calculando y mostrando el campo de temperatura en cada etapa.

Cada realización del método aquí descrito, para el cual se han recogido datos empíricos, se ha modelado para al menos un conjunto de parámetros operativos, mostrando cómo la destrucción del estrato córneo se puede conseguir de una forma precisa y controlable. El resultado de las simulaciones se presenta gráficamente en dos formatos diferentes: (1) una vista transversal de la piel que muestra las diferentes capas de tejido con tres isotermas representadas en la parte superior de esta vista, que definen tres umbrales de temperatura críticos, y (2) dos gráficos diferentes de temperatura frente a tiempo, uno para el punto en el medio del estrato córneo, directamente debajo de la zona elegida como objetivo, y el segundo para el punto en las proximidades de las capas de células viables de la epidermis y la parte inferior del estrato córneo. Estos gráficos muestran cómo la temperatura en cada punto varía con el tiempo a medida que se aplican los pulsos de calor, como si uno pudiese implantar un termopar microscópico en los tejidos. Además, la aplicación de este modelo permite la investigación de los límites paramétricos dentro de los cuales se puede emplear el método, para fijar los límites externos para dos aspectos importantes de funcionamiento del método. Primero, los casos generales son casos presentados que definen la envolvente dentro de la que se puede emplear el método sin producir dolor o daño tisular no deseado.

Para cualquier fuente de calor dada, según se describe en las diversas realizaciones diferentes de la invención, hay un punto en el que el efecto sobre los tejidos cutáneos del sujeto se torna no óptimo, porque el sujeto percibe una sensación de dolor, o porque las células viables en la epidermis y/o dermis subyacentes soportan temperaturas que, si se mantienen durante una duración suficientemente prolongada, producirán daños a estos tejidos. Consecuentemente, se realizó una simulación de ensayo usando la realización de colorante de ftalocianina de cobre (CPC) tópico calentado ópticamente como método de línea de base, para establecer cómo las constantes temporales térmicas de las diferentes capas de tejido cutáneo definen esencialmente un intervalo temporal en el que el método se puede emplear sin dolor o daño a las capas de tejido adyacentes.

Las Figs. 9 y 10 muestran vistas transversales esquemáticas de la piel y la capa de colorante tópico. En cada figura, se representan tres isotermas distintas: (1) 123ºC, el punto en el que la vaporización del agua contenida en el tejido produce la destrucción del tejido; (2) 70ºC, el punto en el que las células viables se dañarán si esta temperatura se mantiene durante varios segundos; y (3) 45ºC, el punto promedio en el cual se percibirá una sensación de dolor por el sujeto. Este umbral del dolor se describe en varios textos de fisiología básicos, pero la experiencia demuestra que este umbral es, en cierto modo, subjetivo. De hecho, en análisis repetidos sobre el mismo individuo, diferentes zonas de poración contenidos en de unos pocos milímetros entre sí, pueden mostrar cantidades de sensación significativamente distintas, posiblemente debido a la proximidad de una terminación nerviosa en relación con la zona de poración.

Las dimensiones en los gráficos muestran las diferentes capas del colorante y la piel, según se miden en m, definidas por límites planos. Aunque que los tejidos cutáneos reales tienen límites mucho más replegados, en un sentido promedio para las dimensiones implicadas, el modelo proporciona una buena aproximación de los gradientes térmicos presentes en los tejidos reales. Las dimensiones usadas en esta, y todas las simulaciones posteriores, para los grosores de la capa de colorante CPC y las diversas capas cutáneas son como sigue: colorante, 10 m; estrato córneo, 30 m; epidermis subyacente, 70 m; y dermis, 100 m.

Las condiciones adicionales impuestas sobre el modelo para esta simulación particular, se muestran en las siguientes tablas:

TABLA 1

100

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TABLA 2

102

Cuando se realizan estas simulaciones, se imponen las siguientes asunciones conservativas:

1. Aunque cierta parte del estrato córneo se pueda mostrar que tiene una temperatura que ya excede del umbral de destrucción para vaporización térmica del contenido de agua, este suceso no se modela, y la pérdida posterior de energía térmica en los tejidos debida a esta vaporización no se factoriza en la simulación. Esto producirá una ligera elevación en las temperaturas mostradas en los tejidos subyacentes desde este punto en adelante, en la realización de la simulación.

2. De forma similar, cuando alguna parte de la capa de colorante de ftalocianina de cobre (CPC) se muestra que ha alcanzado su punto de vaporización de 550ºC, este suceso no se modela, sino que la temperatura se limita todo lo posible a este nivel. Esto producirá también una ligera elevación de las temperaturas posteriores en las capas subyacentes, a medida que la simulación progresa.

Incluso con estas simplificaciones usadas en el modelo, la correlación entre el funcionamiento predicho y el funcionamiento observado empíricamente, basado tanto en estudios clínicos como en estudios histológicos sobre las muestras de tejido donador, es notable. Los datos claves a destacar en las Figs. 9 y 10, son el espacio de tiempo en el que se aplica el pulso térmico, y la localización de las tres temperaturas de umbral diferentes mostradas por las isotermas.

En la Fig. 9, con una longitud de pulso de 21 milisegundos, la isoterma de 70ºC justo cruza el límite que separa el estrato córneo y la capa de células viables en la epidermis. Los estudios in vitro sobre muestras de piel de donador bajo estas condiciones, cincuenta pulsos de energía térmica suministrados con una separación de 50 milisegundos entre sí, producen un daño detectable a esta capa superior de células vivas (véase Fig. 8D). Sin embargo, también se mostró en estudios in vitro, que cinco pulsos de energía térmica con estos mismos parámetros de funcionamiento, no producían ningún daño significativo a estos tejidos. Parece razonable que, aunque se haya podido exceder el umbral de daño nominal, al menos en un sentido transitorio, esta temperatura se tiene que mantener durante cierto período de tiempo acumulativo para causar realmente cualquier daño a las células. No obstante, la información básica presentada por la simulación es que, si uno mantiene el "tiempo de calentamiento" del pulso térmico a menos de 20 milisegundos con una densidad de flujo de 400 Julios/cm^{2}, entonces las células vivas en la epidermis subyacente no soportarán ningún daño, aunque la isoterma del umbral de destrucción se haya trasladado bien en o a través del estrato córneo. En otras palabras, usando una fuente de energía térmica de densidad de flujo reducida, modulada de forma que el "tiempo de calentamiento" sea adecuadamente corto, la destrucción del estrato córneo se puede conseguir sin ningún daño a las células adyacentes en la epidermis subyacente (véase Fig. 8C). Esto es posible, en gran parte, debido a las difusividades térmicas significativamente diferentes de estas dos capas de tejido. Es decir, el estrato córneo, que contiene sólo aproximadamente de 10% a 20% de contenido de agua, tiene una constante de conductividad térmica mucho menor, 0,00123 J/(S*cm*K), que la de la epidermis, de 0,00421J/S*cm*K). Esto permite que la temperatura aumente en el estrato córneo, manteniendo simultáneamente una definición espacial restringida, hasta el punto en el que se producirá la destrucción.

En la Fig. 10, el mismo escenario de simulación iniciado en la prueba de punto crítico de umbral de daño ilustrado en la Fig. 9, se realiza más adelante en el tiempo. Manteniendo el pulso térmico durante 58 milisegundos a la misma intensidad de flujo de 400 Julios/cm^{2} dentro del círculo de 60 \mum de diámetro de colorante que se está calentando, la isoterma sensorial del dolor a 45ºC, justo entra en la capa de piel inervada que comprende la dermis. Además, la isoterma de umbral de daño se mueve significativamente más adelante en la capa epidérmica que donde se mostraba que se encontraba en la Fig. 9. Relacionando esta simulación con los numerosos estudios clínicos llevados a cabo con este método, se obtiene una verificación excelente de la precisión del modelo, porque el modelo muestra casi exactamente la duración de "tiempo de calentamiento" en el que la sonda térmica se puede aplicar a la piel antes de que el individuo la perciba. En pruebas clínicas, se usó un generador de pulsos controlable para fijar el "tiempo de calentamiento" y el "tiempo de enfriamiento" de una serie de pulsos lumínicos aplicados a la capa tópica de colorante de ftalocianina de cobre (CPC) sobre la piel. Mientras que se mantenía un "tiempo de enfriamiento" constante de 80 milisegundos, el "tiempo de calentamiento" se incrementaba gradualmente hasta que el sujeto describía una sensación de "dolor" ligera. Sin excepción, todos los sujetos implicados en estos estudios describían el primer "dolor" en un "tiempo de calentamiento" de entre 45 y 60 milisegundos, muy próximo al predicho por el modelo. Además, la variabilidad entre zonas mencionada previamente en cuanto a la sensación de "dolor" se percibía en estos estudios clínicos. Consecuentemente, lo que se describe como "dolor" es el punto en el que se percibe por primera vez una sensación no ambigua. En una zona esto se puede describir como dolor, mientras que en una zona adyacente el mismo sujeto lo puede describir como meramente "perceptible".

Un elemento de esta investigación clínica es el descubrimiento de que, incluso en la misma zona, un tren de pulsos térmicos no uniforme puede jugar con la neuropercepción psico-fisiológica del sujeto, produciendo una reducción genuina en la sensación percibida. Por ejemplo, se puede usar una serie de pulsos térmicos de menor longitud para saturar las neuronas en el área, empobreciendo momentáneamente los neurotransmisores disponibles en esta unión sináptica y, por tanto, limitando la capacidad de enviar un mensaje de "dolor". Esto permite entonces que un pulso más largo a continuación de estos pulsos cortos sea menos perceptible que si éste se aplicase al principio de la secuencia. Consecuentemente, se llevó a cabo una serie de experimentos con algunos trenes de pulsos creados arbitrariamente, y los resultados eran coherentes con esta hipótesis. Una analogía para esta situación se podría encontrar en la percepción cuando uno entra por primera vez en un baño muy caliente que es dolorosa al principio, pero rápidamente se hace tolerable a medida que uno se aclimata a la sensación de calor.

Ejemplo 9

Un objeto de esta invención es conseguir una microporación indolora del estrato córneo, sin causar ningún daño significativo a los tejidos viables adyacentes. Según se describe en la simulación ilustrada en el Ejemplo 8 y en las Figs. 9-10, parece existir un límite para cualquier densidad de flujo de energía térmica en el punto elegido como objetivo de destrucción, en el cual la microporación se puede conseguir de una manera indolora y no traumática. Tanto los estudios in vivo como in vitro han mostrado que éste es el caso, y esto ha permitido el desarrollo a través de métodos empíricos, de algunos parámetros operativos que parecen funcionar muy bien. El siguiente conjunto de simulaciones muestra cómo funciona el método cuando se usan estos parámetros específicos.

En el primer caso, se aplica a la piel cubierta por CPC un tren de diez pulsos, 10 milisegundos de "tiempo de calentamiento" separados por 10 milisegundos de "tiempo de enfriamiento". La Fig. 11 muestra la distribución final de temperatura en los tejidos cutáneos, inmediatamente después de que este tren de impulsos haya terminado. Según se puede observar, las isotermas que representan los tres umbrales de temperatura críticos muestran que se ha conseguido la destrucción del estrato córneo, sin ninguna sensación presente en los nervios de la capa dérmica y muy escaso cruce del umbral de daño hacia el interior o a través de las células viables de la epidermis subyacente. Según se mencionó previamente, parece que para producir realmente un daño celular permanente, las células epidérmicas tienen que, no sólo calentarse hasta un cierto punto, sino que tienen que mantenerse asimismo a esta temperatura durante cierto período de tiempo, que se cree generalmente que es aproximadamente cinco segundos. Las Figs. 12 y 13 muestran la temperatura del estrato córneo y la epidermis viable, respectivamente, en función del tiempo, mostrando el calentamiento durante el "tiempo de calentamiento" y el enfriamiento durante el "tiempo de enfriamiento" para los diez ciclos completos. En relación con esta simulación para los estudios llevados a cabo in vivo, hay que destacar que en más de 90% de los intentos de poración con los parámetros del sistema fijados para optimizar la simulación, se consiguió una poración efectiva del estrato córneo sin dolor para el sujeto, y en un examen microscópico posterior de la zona de poración varios días más tarde, no se evidenciaba ningún daño perceptible de los tejidos. Los estudios in vitro realizados en muestras de piel de donador de grosor total, eran también coherentes con la predicción de comportamiento del modelo.

Ejemplo 10

Al llevar a cabo tanto los estudios empíricos in vivo como estas simulaciones, parece que el preenfriamiento de la piel ayuda a optimizar el proceso de microporación para reducir la probabilidad de dolor o daño en los tejidos adyacentes. En la práctica, esto se puede conseguir fácilmente usando una simple placa fría colocada contra la piel previamente al proceso de poración. Por ejemplo, aplicando una placa de Peltier enfriada al círculo de 1 cm de diámetro que rodeaba la zona de poración elegida como objetivo, con la placa mantenida a aproximadamente 5ºC durante unos pocos segundos, se reduce significativamente la temperatura de los tejidos. En las Figs. 3A-B se muestra una ilustración esquemática de un dispositivo experimental usado para este propósito en el laboratorio. Aplicando exactamente el mismo tren de pulsos de diez pulsos usado en la prueba ilustrada en el Ejemplo 9, se puede observar, comparando Fig. 11 con Fig. 14, Fig. 12 con Fig. 15 y Fig. 13 con Fig. 16, cuánta mejora se puede realizar en el control de la penetración de temperatura en o a través de los tejidos cutáneos. Nuevamente, la difusividad térmica y el calor específico relativamente bajos del estrato córneo, en comparación con la epidermis y la dermis, son ventajosos. Una vez enfriados, los tejidos altamente hidratados de la epidermis y dermis requieren una entrada de energía térmica mucho mayor para elevar sus temperaturas, mientras que el estrato córneo, con su composición relativamente seca, se puede calentar rápidamente hasta el umbral de destrucción.

Ejemplo 11

Una vez que se ha entendido el mecanismo básico de conducción térmica para suministro de la energía al interior o a través de los tejidos cutáneos subyacente a la destrucción y microporación indolora efectiva del estrato córneo, se pueden concebir varios métodos específicos diferentes para conseguir las modulaciones de temperatura rápidas requeridas del punto de contacto, como las realizaciones de hilo caliente ilustradas en las Figs. 4-7.

Una realización básica, según se describe aquí, usa un elemento de calentamiento óhmico (Fig. 4), como el extremo de un pequeño soldador sin cables, con un hilo dimensionado adecuadamente, relativamente no reactivo, enrollado en torno al mismo con una pequeña cantidad de hilo que se deja sobresalir hacia afuera del cuerpo del calentador. Cuando se aplica electricidad con una fuente de corriente constante, el calentador alcanzará cierta temperatura y, en unos pocos segundos, alcanzará un estado de equilibrio con las pérdidas de convección al aire circundante. De forma similar, el hilo, que es una parte de este sistema térmico, alcanzará un estado de equilibrio, de forma que el extremo más externo del hilo se puede incrementar hasta casi cualquier temperatura arbitraria, hasta aproximadamente 1000ºC, con estos tipos de componentes. El extremo se puede dimensionar para proporcionar exactamente la dimensión de microporo deseada.

En el laboratorio, se han utilizado hilos de volframio con un diámetro de 80 \mum unidos al extremo reemplazable de un soldador sin cables "WAHL" con aproximadamente 2 mm de hilo sobresaliendo del extremo. Con un termopar, la temperatura del extremo se ha medido en su estado estable, y se ha detectado que, variando los parámetros de corriente constante, se pueden conseguir fácilmente temperaturas de estado estable superiores a 700ºC. Para conseguir la modulación deseada, se acopló al extremo un actuador electromecánico de respuesta rápida, de masa pequeña, de forma que la posición del hilo se podía convertir linealmente más de 2 mm a una velocidad máxima de 200 Hz. Luego, montando el aparato entero sobre un escenario de precisión, este extremo vibratorio se podría poner en contacto, de forma muy controlable, con la superficie de la piel, de forma que estuviese en contacto sólo durante menos de 10 milisegundos cada vez, el "tiempo de calentamiento", mientras que se podría conseguir un "tiempo de enfriamiento" de períodos arbitrariamente largos, fijando el generador de pulsos consecuentemente. Estos estudios in vivo mostraban que la poración se podía conseguir realmente antes de que el sujeto en el que se estaban formando los poros supiese incluso que el extremo del hilo se estaba poniendo en contacto con la piel.

Para comparar el funcionamiento de esta realización con la realización del colorante CPC tópico calentado ópticamente, se realizaron las siguientes simulaciones, según el procedimiento del Ejemplo 8. Esencialmente, sólo variando las condiciones iniciales, la realización del hilo caliente se puede realizar con el idéntico código de simulación. Debido a que el contacto con el hilo se produce esencialmente de forma instantánea, no existe ningún incremento de calor dependiente del tiempo en la capa de colorante CPC y, cuando el hilo se elimina físicamente del contacto con la piel, no existe ningún calor residual restante sobre la superficie, como se produce con la capa de colorante CPC calentado. Asimismo, como el propio hilo define el área elegida como objetivo para destrucción/microporación, no debería haber ninguna difusión lateral de energía térmica antes de su aplicación al estrato córneo. Los funcionamientos comparativos de la realización del "hilo caliente" se muestran en las Figs. 17-19.

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Ejemplo 12

En este ejemplo, se siguió el procedimiento del Ejemplo 11, excepto porque la piel se preenfrió según el procedimiento del Ejemplo 10. De forma similar, el preenfriamiento de la zona elegida como objetivo produce resultados positivos análogos a la realización del "hilo caliente". Los resultados de la simulación preenfriada del enfoque del "hilo caliente" se muestran en las Figs. 20-22.

Ejemplo 13

Según se analizó en la introducción de antecedentes de esta descripción, la patente de Tankovich 803 parece a primera vista que es similar a la invención aquí reivindicada. En este ejemplo, el modelo de simulación se estableció con los parámetros operativos especificados en la 803 de Tankovich, es decir, una amplitud de pulso de 1 s y un nivel de potencia de 40.000.000 W/cm^{2}. Las Figs. 23 y 24 muestran que, bajo estas condiciones, ninguna parte del estrato córneo alcanza el umbral para la vaporización instantánea del agua, 123ºC, y, por tanto, no se produce la destrucción/microporación del estrato córneo. En la práctica, la aplicación de este tipo de pulso de potencia máxima elevada y corta duración, a la capa de colorante tópica, vaporiza meramente el colorante hacia el exterior de la superficie de la piel, sin ningún efecto sobre la piel. Este ejemplo, por tanto, demuestra que las condiciones especificadas por la 803 de Tankovich no son operativas en la invención aquí reivindicada.

Ejemplo 14

En este ejemplo, el fluido intersticial obtenido después de la poración de la piel según el procedimiento del Ejemplo 6, se recogió y analizó para determinar su concentración de glucosa. Los datos se obtuvieron en cuatro sujetos no diabéticos y seis sujetos diabéticos de tipo I sometidos a una prueba de sobrecarga de glucosa. Las edades de los sujetos variaban entre 27 y 43. La finalidad del estudio era examinar la utilidad del método para recoger de forma indolora suficiente fluido intersticial (ISF) de los sujetos para permitir que las muestras de ISF se analizasen para el contenido de glucosa, y luego comparar estas concentraciones con la concentración de glucosa presente en la sangre total del sujeto.

A todos los sujetos se les realizaban las pruebas de glucosa ISF y en sangre con el sistema "ELITE" de Miles-Bayer. Los diez sujetos sufrían idénticos protocolos de medición, realizándose los ajustes en relación con la sobrecarga de glucosa e inyección de insulina para aquellos sujetos con diabetes dependiente de insulina.

El diseño básico del estudio era reclutar un número modesto de voluntarios, algunos con diabetes y algunos sin diabetes, de los que se extraían una serie de parejas de muestras de ISF y sangre total cada 3 a 5 minutos, a lo largo de las 3 a 4 horas de duración del período de estudio. Tanto las muestras de sangre como de ISF se analizaron para glucosa, y se determinó la relación estadística entre las concentraciones de glucosa sanguínea y el fluido intersticial. Para examinar el retraso temporal hipotético de las concentraciones de glucosa del ISF, comparadas con las concentraciones de glucosa de la sangre total, se indujo a los sujetos de estudio a mostrar un cambio dinámico y significativo en sus concentraciones de glucosa. Esto se consiguió haciendo ayunar a cada sujeto durante 12 horas antes de empezar la prueba y, luego, dando al sujeto una sobrecarga de glucosa después de que se hubiesen establecido sus concentraciones de glucosa de línea de base, a través de una batería de tres concentraciones de glucosa sanguínea y de ISF en ayunas. Una vez que se habían establecido las concentraciones de línea de base, se proporcionó a los sujetos una sobrecarga de glucosa en forma de un zumo dulce basado en las siguientes directrices:

i. Para los sujetos testigo, la sobrecarga de glucosa se calculó basada en 0,75 gramos de glucosa por 0,45 kg (una libra) de peso corporal.

ii. Para los sujetos con diabetes dependiente de insulina, la sobrecarga de glucosa era de 50 gramos de glucosa. Además, inmediatamente después de tomar la sobrecarga de glucosa, los sujetos diabéticos se inyectaban su dosis matutina normal de insulina de acción rápida. En el caso en que el sujeto diabético presente concentraciones de glucosa en ayunas superiores a 300 mg/dl, se les pidió que se inyectasen su insulina primero, y la sobrecarga de glucosa se les proporcionó una vez que sus concentraciones de glucosa sanguínea se habían reducido hasta menos de
120 mg/dl.

A cada sujeto reclutado se le proporcionó inicialmente una descripción completa del estudio en el documento de "consentimiento informado", que se requirió que entendiesen y firmasen antes de inscribirse oficialmente en el programa. Tras la aceptación, completaron un cuestionario de su historial médico. El procedimiento clínico detallado llevado a cabo fue:

(a) Sujeto en ayunas desde las 9:00 p.m. la noche antes de la visita del estudio, consumiendo sólo agua. No se permitieron cafeína, cigarros, ni zumo de fruta durante este período.

(b) El sujeto llega a las instalaciones de prueba alrededor de las 9:00 a.m. del día siguiente.

(c) Se hizo sentarse al sujeto en una silla reclinable proporcionada para que el sujeto se relajase durante el procedimiento de estudio.

(d) Se tomaron muestras de sangre total e ISF a intervalos entre tres y cinco minutos, comenzando tras la llegada del sujeto y continuando durante las siguientes tres a cuatro horas. La duración durante la que se recogieron los datos se basaba en cuándo las concentraciones de glucosa sanguínea habían vuelto a su intervalo normal y se habían estabilizado tras la sobrecarga de glucosa. Las muestras de ISF se recogían usando poración óptica, método de bombeo de ISF, descrito con más detalle más adelante. Cada muestra de ISF era aproximadamente de 5 \mul de volumen, para asegurar un buen relleno de la banda de prueba ELITE. Las muestras de sangre se obtenían a través de una lanceta de punción digital convencional. Tanto las muestras de ISF como sanguíneas se probaban inmediatamente para glucosa con el sistema de glucómetro doméstico ELITE de Miles-Bayer. Para mejorar la estimación de las concentraciones de glucosa sanguíneas "verdaderas", se realizaron dos pruebas ELITE separadas en cada muestra de pinchazo de dedo.

(e) Para facilitar la recogida continua del ISF de la misma zona a lo largo de la fase completa de recogida de datos para un individuo dado, se creo una matriz de 5 por 5 de veinticinco microporos, sobre el antebrazo superior del sujeto, siendo cada microporo entre 50 y 80 \mum de ancho y estando espaciados entre sí 300 \mum. Se sujetó al antebrazo del sujeto un disco de teflón de 30 \mum de diámetro con un orificio de 6 mm en el centro, con un adhesivo sensible a la presión, y se colocó de forma que el orificio central de 6 mm se localizaba sobre la matriz de microporos de 5 por 5. Esta unión permitía un método conveniente mediante el que se podía conectar una pequeña tubería de succión, aplicando un ligero vacío (25 a 30 cm de Hg) al área en la que se formaban los poros, para inducir al ISF a que fluyese hacia fuera del cuerpo a través de los microporos. En la parte superior del disco de teflón se montó una cubierta transparente de vidrio claro, permitiendo al operador observar directamente la piel en la que se formaban los microporos por debajo de la misma. Cuando se formaba un glóbulo de 5 \mul de ISF sobre la superficie de la piel, esto se podía constatar fácilmente mediante control visual de la zona a través de esta cubierta transparente. Este nivel de vacío creaba un gradiente de presión nominal de aproximadamente 3515,5 kg/m^{2}. Sin los microporos, no se podría extraer ningún ISF en absoluto del cuerpo del sujeto usando sólo el ligero vacío.

(f) Una vez extraídos los tres primeros pares de muestras, se le proporcionaba al sujeto una sobrecarga de glucosa en forma de zumo de naranja muy endulzado. La cantidad de glucosa proporcionada era de 0,75 gramos por 0,45 kg de peso corporal para los sujetos no diabéticos y 50 gramos para los sujetos diabéticos. Los sujetos diabéticos se administraban también un pinchazo de insulina de acción rápida, (regular) con la dosificación calculada apropiadamente, basada en esta concentración de glucosa de 50 gramos concurrente con la ingestión de la sobrecarga de glucosa. Con el retraso normal de 1,5 a 2,5 horas entre la recepción de una inyección de insulina y el efecto máximo de la inyección, se esperaba que los sujetos diabéticos presentasen un aumento ascendente de sus concentraciones de glucosa sanguínea hasta 300 mg/dl, y luego un descenso rápido nuevamente hacia el intervalo normal, a medida que la insulina produce su efecto. Se esperaba que los sujetos no diabéticos presentasen los perfiles de prueba de tolerancia a la glucosa estándar, mostrando típicamente un máximo en las concentraciones de glucosa sanguínea entre 150 mg/dl y 220 mg/dl entre 45 minutos y 90 minutos después de administrar la sobrecarga de glucosa, y luego un descenso rápido de nuevo hasta sus concentraciones de línea de base normales durante la siguiente hora más o menos.

(g) Después de la administración de la sobrecarga de glucosa o de la sobrecarga de glucosa y la inyección de insulina, se extraían simultáneamente de los sujetos las muestras de ISF y sangre total de pinchazo de dedo a intervalos de cinco minutos durante las siguientes tres a cuatro horas. El muestreo terminó cuando las concentraciones de glucosa sanguíneas en tres muestras sucesivas indicaban que la glucosa del sujeto se había estabilizado.

Después del examen de los datos, se hacían aparentes varias características. En particular, para cualquier lote específico de tiras de prueba ELITE, existe una desviación marcada en la salida mostrada en el glucómetro en mg/dl de glucosa, comparada con la concentración indicada en la sangre. Se podría esperar una lectura elevada, debido a la carencia de hematocrito en el ISF y a las diferencias normales en las concentraciones de electrolito entre el ISF y la sangre completa. Independientemente de las razones subyacentes a esta desviación en la salida, se determinó a través de comparación con una prueba de referencia, que las concentraciones de glucosa del ISF están relacionadas linealmente con los valores producidos por el sistema ELITE, con los coeficientes de escala constantes para cualquier lote específico de tiras ELITE. Consecuentemente, para la comparación de las concentraciones de glucosa del ISF frente a las mediciones de sangre completa, se aplicó una corrección lineal de primer orden a los datos del ISF, como sigue: ISF_{glucosa} = 0,606 * ISF_{ELITE} + 19,5.

Esta reducción a escala de la salida del glucómetro ELITE, cuando se usa para medir las concentraciones de glucosa del ISF, permite examinar, a través del conjunto completo de datos, los factores de error asociados con el uso del ISF para estimar las concentraciones de glucosa sanguínea. Por supuesto, incluso sin ninguna reducción a escala lineal en absoluto, las correlaciones entre los valores de glucosa del ISF y las concentraciones de glucosa sanguínea son las mismas que en la versión reducida a escala.

Basándose en la mayoría del conjunto de literatura publicada sobre el objeto de glucosa del ISF, así como en datos preliminares, se esperaba originalmente observar un retraso de 15 a 20 minutos entre las concentraciones de glucosa del ISF y las presentadas en la sangre completa procedente de un pinchazo del dedo. Esto no es lo que mostraron los datos cuando se analizaron. Específicamente, cuando el conjunto de datos de cada individuo se analiza para determinar la desviación temporal requerida para conseguir la correlación máxima entre las concentraciones de glucosa del ISF y las concentraciones de glucosa sanguínea, se descubrió que el peor caso de retraso temporal para este conjunto de sujetos era sólo de 13 minutos, y el tiempo promedio de retraso era sólo de 6,2 minutos, con varios sujetos que mostraban un ajuste temporal que era casi instantáneo (aproximadamente 1 minuto).

Basándose en la cantidad mínima de retraso observada en este conjunto de datos, el gráfico mostrado en la Fig. 25 presenta las diez pruebas de sobrecarga de glucosa, concatenadas una tras otra en una escala de tiempo extendida. Los datos se presentan sin ninguna desviación temporal en absoluto, mostrando el elevado nivel de ajuste entre las concentraciones de glucosa del ISF y de la sangre, tratándose el conjunto completo de datos clínicos exactamente de la misma manera. Si el conjunto completo de datos se desvía en su totalidad para encontrar la mejor estimación temporal, la correlación entre las concentraciones de glucosa del ISF y de la sangre alcanza el máximo con un retraso de dos (2) minutos a un valor r de r=0,97. Esta es sólo una mejora trivial de la correlación no desviada r=0,964. Por tanto, para el resto del análisis, los valores del ISF se tratan sin imponer sobre los mismos una desviación temporal. Es decir, cada conjunto de concentraciones de glucosa sanguínea y del ISF se trata como pares de datos recogidos simultáneamente.

Una vez que las lecturas del ISF de ELITE no desviadas se habían reducido a escala para reflejar la glucosa proporcional presente en el ISF, era posible examinar el error asociado con estos datos. El método más simple para ello es asumir que el promedio de las dos lecturas de glucosa sanguínea de pinchazo del dedo es, de hecho, el valor absolutamente correcto y, a continuación, comparar meramente los valores del ISF reducidos a escala con estos valores de glucosa sanguínea promedio. Estos datos son como sigue: desviación estándar sangre-ISF, 13,4 mg/dl; coeficiente de varianza de ISF, 9,7%; desviación estándar de los dos ELITES, 8,3 mg/dl; y coeficiente de varianza de la sangre (Miles), 6%.

Como muestran estos datos, la medición basada en la sangre ya contiene un factor de error. En efecto, los datos de funcionamiento del fabricante indican que el sistema ELITE tiene un coeficiente de varianza nominal (CV) de entre 5% y 7%, dependiendo de las concentraciones de glucosa y de la cantidad de hematocrito en la sangre.

Un vistazo adicional al factor diferencial entre la glucosa del ISF y la glucosa sanguínea se muestra en forma de un gráfico de dispersión en la Fig. 26. En esta figura, se muestran también para referencia los límites superior e inferior del intervalo de confianza del 90%. Es interesante destacar que, con sólo dos excepciones, todos los datos en el intervalo de concentraciones de glucosa sanguínea inferiores a 100 mg/dl se incluyen entre estos topes de error del intervalo de confianza del 90%. Esto es importante, ya que las consecuencias de pasar por alto una tendencia hacia la hipoglucemia serían muy significativas para el usuario diabético. Es decir, sería mucho mejor predecir por defecto las concentraciones de glucosa entre 40 y 120 mg/dl, que predecirlas por exceso.

Esencialmente, si uno asume que el error de la prueba básica cuando se usa el sistema ELITE sobre el ISF, es comparable con el error de la prueba asociado con el uso de ELITE sobre sangre completa, entonces la desviación de la glucosa del ISF respecto a la glucosa sanguínea, se puede describir como:

ISF_{desviación}=[(ISF_{real})^{2} - (ISF_{real})^{2}]^{1/2}.

Aplicando esta ecuación a los valores mostrados anteriormente, uno puede resolver el valor "verdadero" estimado del factor de error del ISF:

ISF_{real}=[(ISF_{desviación})^{2} - (\text{sanguíneo})_{real})^{2}]^{1/2}.

O, resolviendo la ecuación,

ISF_{real}=[(13.4)^{2} - (8.3)^{2}]^{1/2}=10.5\ mg/dl

En la Fig. 27 se muestra un histograma de la desviación relativa de las concentraciones de glucosa del ISF respecto a las sanguíneas.

Suministro de fármacos a través de poros en la membrana biológica

La presente invención también incluye un método para el suministro de fármacos, incluyendo fármacos actualmente suministrados transmembranarmente, a través de microporos en el estrato córneo u otra membrana biológica. En una realización ilustrativa de la invención, el suministro se consigue colocando la solución en un recipiente sobre la zona de poración. En otra realización ilustrativa, se usa energía sónica con o sin gradiente de presión, para incrementar más el suministro. La energía sónica se puede aplicar según los parámetros transdérmicos tradicionales, o utilizando efectos de flujo acústico, que se describirán momentáneamente, para impulsar la solución de suministro a través de la membrana biológica en la que se han formado poros.

Ejemplo 15

Este ejemplo muestra el uso de poración en el estrato córneo para el suministro de lidocaína, un analgésico tópico. La solución de lidocaína contenía también una formulación potenciadora de la permeación química, diseñada para incrementar su difusión pasiva a través del estrato córneo. En la Fig. 28 se muestra un plano de un aparato de suministro ilustrativo 300, en el que el aparato comprende una carcasa 304 que incluye un depósito 308 para albergar una solución que contiene el fármaco 312. La parte superior de la carcasa comprende un transductor ultrasónico 316 para proporcionar energía sónica destinada a ayudar al transporte de la solución que contiene el fármaco a través de los microporos 320, hacia el interior del estrato córneo 324. Una salida 328 en el transductor ultrasónico permite la aplicación de presión al mismo para ayudar más al transporte de la solución que contiene el fármaco a través de los microporos en el estrato córneo. El aparato de suministro se aplica a un área seleccionada de la piel de un individuo, de forma que se coloca sobre al menos uno, y preferiblemente una pluralidad, de microporos. Una capa adhesiva 332, unida a una parte inferior de la carcasa, permite al aparato adherirse a la piel, de forma que la solución que contiene fármaco albergada en el depósito, está en comunicación líquida con los microporos. El suministro del fármaco a través de los microporos produce el transporte hacia el interior de la epidermis 336 y la dermis 340 subyacentes.

Se analizaron cinco sujetos para la efectividad del suministro del fármaco, usando poración junto con ultrasonidos. El experimento usaba dos zonas sobre el antebrazo izquierdo de los sujetos, separadas entre sí aproximadamente 7 cm, a igual distancia entre el pulgar y el brazo. La zona cercana al pulgar se denominará zona 1, y la zona más lejana al pulgar se denominará zona 2. La zona 1 se usó como testigo en el que la solución de lidocaína y potenciador se aplicaban usando un aparato de suministro idéntico 300, pero sin ninguna microporación del estrato córneo ni energía sónica. En la zona 2 se formaron poros con 24 orificios separados entre sí por 0,8 milímetros en una rejilla contenida en un círculo de 1 cm de diámetro. Los microporos en la zona 2 se produjeron según el procedimiento del Ejemplo 6. Se aplicaron lidocaína y ultrasonidos de nivel bajo. Las aplicaciones de ultrasonidos se realizaron con un sistema transductor ultrasónico Zevex fabricado según necesidades, fijado en modo de ráfagas con entradas de 0,4 voltios entre máximo y máximo, produciéndose un recuento de 1000 ráfagas a 10 Hz con una frecuencia fundamental de 65,4 kHz, es decir, una señal modulada de pulso con el transductor activado para ráfagas de 15 milisegundos, y luego apagado para los siguientes 85 milisegundos. La salida medida del amplificador al transductor era de 0,090 vatios RMS.

Tras la aplicación de la lidocaína, se realizaron mediciones de sensación friccionando un hilo de calibre 30 a lo largo de la zona de prueba. Se ejecutaron experimentos en ambas zonas, en la zona 1 durante intervalos de 10 a 12 minutos de duración, y en la zona 2 durante dos intervalos de 5 minutos de duración, aplicados serialmente a la misma zona. Ambas zonas se valoraron para entumecimiento, usando una escala de 10 a 0, en la que 10 indicaba ningún entumecimiento y 0 indicaba entumecimiento completo, según se describía por los sujetos analizados. El siguiente sumario de resultados es para los 5 sujetos.

La zona testigo, zona 1, presentaba de escaso a ningún entumecimiento (escala de 7 a 10) entre 10 y 12 minutos. Aproximadamente a los 20 minutos se observaba algún entumecimiento (escala 3) en la zona 1, a medida que la solución permeaba completamente el estrato córneo. La zona 1 se limpiaba una vez completada la aplicación de lidocaína. La zona 2 presentaba un entumecimiento prácticamente completo (escala de 0 a 1) en el círculo de 1 cm que contenía las poraciones. En el exterior del círculo de 1 cm de diámetro, el entumecimiento descendía casi linealmente hasta 1 en un círculo de 2,5 cm de diámetro, sin ningún entumecimiento fuera del círculo de 2,5 cm de diámetro. La valoración de la zona 2 después de la segunda aplicación producía un círculo ligeramente mayor totalmente entumecido de aproximadamente 1,2 cm de diámetro, descendiendo el entumecimiento linealmente hasta 1 en un patrón oval irregular con un diámetro de 2 a 2,5 cm, perpendicular al antebrazo, y un diámetro de 2 a 6 cm paralelo al antebrazo. En el exterior del área no se percibía ningún entumecimiento. En las Figs. 29A-C, se muestra una representación gráfica de resultados ilustrativos obtenidos en un sujeto típico. Las Figs. 29A y 29B muestran los resultados obtenidos en la zona 2 (con poración) después de 5 y 10 minutos, respectivamente. La Fig. 29C muestra los resultados obtenidos en la zona 1 (testigo sin poración).

Energía sónica y potenciadores para incrementar el flujo transdérmico

Se puede utilizar la física de los campos de energía sónica creados por transductores sónicos en un método mediante el cual se puede modular la frecuencia sónica, para mejorar las velocidades de flujo conseguidas mediante otros métodos. Según se muestra en la Fig. 1 de la patente de EE.UU Nº 5.445.611, la distribución de energía de un transductor sónico, se puede dividir en campos cercanos y lejanos. El campo cercano, caracterizado por la longitud N, es la zona desde el primer mínimo de energía hasta el último máximo de energía. La zona distal respecto al último máximo es el campo lejano. El patrón del campo cercano (N) está dominado por un gran número de valores máximos y nulos de presión local muy próximos. La longitud de la zona del campo cercano, N, es una función de la frecuencia, tamaño y forma de la cara del transductor, y la velocidad del sonido en el medio a través del que viaja el ultrasonido. Para un transductor individual, las variaciones de intensidad en su intervalo de funcionamiento normal, no afectan a la naturaleza de la distribución de la energía sónica más que de forma lineal. Sin embargo, para un sistema con transductores múltiples, todos modulados tanto en frecuencia como en amplitud, las intensidades relativas de los transductores separados afectan a la distribución de energía en el medio sónico, independientemente de que sea piel u otro medio.

Cambiando la frecuencia de la energía sónica en una cantidad pequeña, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 1 a 20%, el patrón de valores máximos y nulos permanece relativamente constante, pero la longitud N de la zona del campo cercano cambia en proporción directa a la frecuencia. Cambios mayores de la frecuencia, es decir un factor de 2 o más, producirán lo más probablemente un conjunto diferente de resonancias o modos vibracionales en el transductor, produciendo un patrón de energía del campo cercano significativa e impredeciblemente diferente. Por tanto, con un cambio pequeño en la frecuencia sónica, el patrón complejo de valores máximos y nulos se comprime o expande de forma similar a un acordeón. Seleccionando la dirección de la modulación de frecuencia, se puede controlar la dirección de desviación de estos valores máximos de presión local. Aplicando energía sónica a la superficie de la piel, la modulación selectiva de la frecuencia sónica controla el movimiento de estos valores máximos de presión local a través de la piel, bien hacia el interior del cuerpo o hacia la superficie del cuerpo. Una modulación de frecuencia de elevada a baja conduce los valores máximos de presión hacia en interior del cuerpo, mientras que una modulación de frecuencia de baja a elevada impulsa los valores máximos de presión desde el interior del cuerpo hacia la superficie y a través de la piel hasta el exterior del cuerpo.

Asumiendo parámetros típicos para esta aplicación de, por ejemplo, un transductor sónico de 1,27 cm de diámetro, una frecuencia de funcionamiento nominal de 10 MHz, y una impedancia acústica similar a la del agua, una modulación de frecuencia de 1 MHz produce un movimiento de aproximadamente 2,5 mm de los valores máximos y nulos del patrón de energía del campo cercano en las proximidades del estrato córneo. Desde la perspectiva de extracción transdérmica y/o transmucosa de analitos, este grado de acción proporciona acceso al área muy por debajo del estrato córneo, e incluso de la epidermis, dermis, y otros tejidos por debajo de los mismos. Para cualquier transductor determinado, puede existir un intervalo óptimo de frecuencias en el que esta modulación de frecuencias tiene la máxima efectividad.

El flujo de un fármaco o analito a través de la piel se puede incrementar también cambiando, bien la resistencia (el coeficiente de difusión) o la fuerza directriz (el gradiente de difusión). El flujo se puede incrementar mediante el uso de los denominados potenciadores de penetración o químicos.

Los potenciadores químicos comprenden dos categorías principales de componentes, es decir, compuestos disgregadores de la envuelta y disolventes o sistemas binarios que contienen tanto compuestos disgregadores de la envuelta celular, como disolventes.

Los compuestos disgregadores de la envuelta celular se conocen en la técnica por ser útiles en preparaciones farmacéuticas tópicas y funcionan también en la extracción de analitos a través de la piel. Se piensa que estos compuestos ayudan a la penetración en la piel disgregando la estructura lipídica de las envueltas celulares del estrato córneo. En la solicitud de patente europea 43.738, publicada el 13 de junio de 1982, se describe una lista completa de estos compuestos. Se cree que cualquier compuesto disgregador de la envuelta celular es útil para los propósitos de esta invención.

Disolventes adecuados incluyen agua; dioles, como propilenglicol y glicerol; mono-alcoholes, como etanol, propanol y alcoholes superiores; DMSO; dimetil-formamida; N,N-dimetil-acetamida; 2-pirrolidona; N-(2-hidroxi-etil)pirrolidona, N-metil-pirrolidona, 1-dodecil-aza-cicloheptan-2-ona y otras alquil-aza-cicloalquil-2-onas (azonas) n-sustituidas y análogos.

La patente de EE.UU: 4.537.776, de Cooper, concedida el 27 de agosto de 1985, contiene un excelente sumario de la técnica previa e información de antecedentes que detalla el uso de ciertos sistemas binarios para el incremento de permeante.

De forma similar, la solicitud de patente europea 43.738, a la que se hizo referencia anteriormente, enseña a usar dioles seleccionados como disolventes junto con una categoría amplia de compuestos disgregadores de la envuelta celular, para el suministro de compuestos lipófilos, farmacológicamente activos.

En la solicitud de patente inglesa GB 2.153.223 A, publicada el 21 de agosto de 1985, se describe un sistema binario para incrementar la penetración de metoclopramida, que consiste en un éster de alcohol monovalente de un ácido alifático monocarboxílico C8-32 (insaturado y/o ramificado si es C18-32) o un monoalcohol alifático C6-24 (insaturado y/o ramificado si es C14-24) y un compuesto N-cíclico como 2-pirrolidona, N-metil-pirrolidona y análogos.

En la patente de EE.UU. 4.973.468, se describen combinaciones de potenciadores que consisten en éter monoetílico o monometílico de dietilen-glicol con monolaurato y metil-laurato de propilen-glicol, que incrementan el suministro transdérmico de esteroides, como progesteronas y estrógenos. En la patente de EE.UU. 4,820.720, se muestra un potenciador dual que consiste en monolaurato de glicerol y etanol, para el suministro transdérmico de fármacos. La patente de EE.UU. 5.006.342, enumera numerosos potenciadores para la administración transdérmica de fármacos, consistentes en ésteres de ácidos grasos o éteres de alcoholes grasos de alcanodioles C_{2} a C_{4}, en los que cada porción de ácido graso/alcohol del éster/éter es de aproximadamente 8 a 22 átomos de carbono. La patente de EE.UU. 4.863.970, muestra composiciones potenciadoras de penetración para aplicación tópica, que comprenden un permeante activo contenido en un vehículo potenciador de penetración, que contiene cantidades específicas de uno o más compuestos disgregadores de la envuelta celular, como ácido oleico, alcohol oleílico, y ésteres de glicerol de ácido oleico; un alcanol C_{2} o C_{3} y un diluyente inerte, como agua.

Otros potenciadores químicos, no asociados necesariamente con sistemas binarios, incluyen DMSO o soluciones acuosas de DMSO, como se enseña en la patente de EE.UU. 3.551.554 de Herschler; patente de EE.UU. 3.711.602 de Herschler y patente de EE.UU. 3.711.606 de Herscher, y las azonas (alquil-aza-cicloalquil-2-onas n-sustituidas), como se destacó en la patente de EE.UU. 4.557.943 de Cooper.

Algunos sistemas potenciadores químicos pueden poseer efectos secundarios negativos, como toxicidad e irritación cutánea. La patente de EE.UU. 4.855.298. describe composiciones para reducir la irritación cutánea producida por composiciones que contienen un potenciador químico que tienen propiedades de irritación cutánea, con una cantidad suficiente de glicerina para proporcionar un efecto antiirritativo.

Debido a que la combinación de la microporación del estrato córneo y la aplicación de energía sónica, acompañada por el uso de potenciadores químicos, puede producir una velocidad incrementada de extracción de analitos o suministro de permeante a través del estrato córneo, el vehículo de transporte específico y particularmente el potenciador químico utilizado, se pueden seleccionar de una larga lista de vehículos de la técnica previa, algunos de los cuales se mencionaron anteriormente. No se piensa que sea necesario detallar o enumerar específicamente lo que está disponible fácilmente en la técnica. La invención no se dirige al uso de potenciadores químicos en sí, y se cree que todos los potenciadores químicos, útiles en el suministro de fármacos a través de la piel, funcionarán con colorantes en la microporación óptica, y también con energía sónica para efectuar una extracción mensurable de analitos desde debajo y a través de la superficie de la piel, o el suministro de fármacos a través de la superficie de la piel.

Ejemplo 16

Se analizaron la energía sónica modulada y los potenciadores químicos para su capacidad de controlar el flujo transdérmico sobre muestras de piel de cadáveres humanos. En estas pruebas, la membrana epidérmica se había separado de la piel completa del cadáver mediante el método de separación térmica del Ejemplo 1. La membrana epidérmica se cortó y colocó entre las dos mitades de la célula de permeación, con el estrato córneo enfrentado al compartimiento superior (donador) o al compartimiento inferior (receptor). Se usaron células de Franz modificadas para contener la epidermis, según se muestra en la Fig. 2 de la patente de EE.UU. Nº 5.445.611. Cada célula de Franz consiste en una cámara superior y una cámara inferior que se mantienen juntas mediante una o más mordazas. La cámara inferior tiene una entrada de muestreo a través de la que se añaden o eliminan los materiales. Cuando las cámaras superior e inferior se fijan entre sí, una muestra de estrato córneo se mantiene entre las mismas. La cámara superior de cada célula de Franz se modifica para permitir la colocación de un transductor de ultrasonidos en 1 cm de la membrana del estrato córneo. Se usó una solución de azul de metileno como molécula indicadora para valorar la permeación del estrato córneo. Se obtuvo un registro visual de cada experimento en una banda magnética con el tiempo grabado, con una cámara de vídeo y una grabadora de vídeocasete (no mostradas). Adicionalmente, se extrajeron muestras para medición con un espectrómetro de absorción, para cuantificar la cantidad de colorante que había atravesado la membrana del estrato córneo durante un experimento. Los potenciadores químicos adecuados para el uso podrían variar entre un amplio intervalo de disolventes y/o compuestos disgregadores de la envuelta celular, según se indicó anteriormente. El potenciador específico utilizado fue: etanol/glicerol/agua/monooleato de glicerol/metil-laurato, en proporciones de volumen 50/30/15/2,5/2,5. El sistema para producir y controlar la energía sónica incluía un generador de formas de onda aleatorias (Standford Research Systems modelo DS345), un amplificador de 0,30 MHz y 20 vatios, y dos transductores de inmersión de ultrasonidos no enfocados que tenían resonancias máximas a 15 y 25 MHz, respectivamente. Se prepararon seis células simultáneamente para probar las muestras de estrato córneo del mismo donador. Una vez instaladas las muestras de estrato córneo, se dejaron hidratar con agua destilada durante al menos 6 horas, antes de realizar cualquier prueba.

Ejemplo 17

Efectos de la energía sónica sin potenciadores químicos

Según se indicó anteriormente en el Ejemplo 16, la epidermis separada por calor se colocó en las células de Franz con la cara epidérmica hacia arriba, y la cara del estrato córneo hacia abajo, a menos que se indique otra cosa. Las cámaras inferiores se rellenaron con agua destilada, mientras que las cámaras superiores se rellenaron con solución concentrada de azul de metileno en agua destilada.

Epidermis separada por calor: Inmediatamente después de rellenar las cámaras superiores con solución de azul de metileno, se aplicó energía sónica a una de las células con el transductor sumergido totalmente. Esta orientación correspondería, por ejemplo, a tener el transductor en la cara opuesta de un pliegue de piel, o hacer que la energía sónica se reflejase hacia el exterior de una placa reflectora colocada de forma similar y usada para "impulsar" el analito fuera de la otra cara del pliegue hacia el interior de un dispositivo de recogida. Las características de regulación de energía sónica se fijaron inicialmente a la frecuencia de funcionamiento nominal de 25 MHz, con una intensidad equivalente a una forma de onda de entrada de 20 voltios entre máximo y máximo (P-P). Esto corresponde aproximadamente a 1 vatio de potencia de entrada promedio al transductor y, de forma similar, asumiendo el valor nominal del fabricante para una eficiencia de conversión de 1% para este transductor particular, una potencia de salida sónica de alrededor de 0,01 vatios sobre la superficie de 0,78 cm^{2} del área activa, o una intensidad sónica de 0,13 vatios/cm^{2}. A otras tres células testigo distintas no se les aplicaba energía sónica. Después de 5 minutos se desconectaba la energía sónica. No se observaba ninguna indicación visual de flujo de colorante a través del estrato córneo durante este intervalo en ninguna de las células, indicando niveles inferiores a aproximadamente 0,0015% (v/v) de solución de colorante, en 2 ml de medio receptor.

El análisis de estas mismas 3 células testigo y 1 célula experimental continuó como sigue. La intensidad de energía sónica se incrementó hasta la salida máxima posible disponible del equipo director de una entrada de 70 voltios entre pico y pico, entrada de potencia promedio de 12 vatios o (0,13 vatios/cm^{2} de intensidad de salida sónica). Asimismo, la frecuencia se fijó para modular o barrer de 30 MHz a 10 MHz. Este barrido de 20 MHz se realizó diez veces por segundo, es decir, una velocidad de barrido de 10 Hz. A estos niveles de potencia de entrada, era necesario controlar el transductor de energía sónica para evitar el sobrecalentamiento. Se aplicó un termopar de contacto al cuerpo del transductor, y la potencia se sometió a ciclos de encendido y apagado para mantener la temperatura máxima del transductor por debajo de 42ºC. después de aproximadamente 30 minutos de funcionamiento cíclico a una potencia máxima, a un ciclo de funcionamiento de aproximadamente 50%, 1 minuto encendido y 1 minuto apagado, no había aun ninguna permeación detectable del estrato córneo por el colorante azul de metileno.

A continuación, se fijó al transductor de energía sónica un revestimiento de agua refrigerante para permitir una activación extendida al nivel de energía máximo. Usando los mismos 3 testigos y 1 célula experimental, se aplicó energía sónica a una potencia máxima durante 12 horas a la célula experimental. Durante este tiempo, la temperatura del fluido en la cámara superior aumentó sólo hasta 35ºC, sólo ligeramente por encima de los aproximadamente 31ºC de temperatura normal del estrato córneo in vivo. No se observó ninguna evidencia visual aparente de flujo de colorante a través del estrato córneo en ninguna de las cuatro células, tras 12 horas de energía sónica aplicada según se describió anteriormente.

Ejemplo 18

Efectos de la energía sónica sin potenciadores químicos

Estrato córneo perforado: Se prepararon seis células, según se describió anteriormente en el Ejemplo 16. Las mordazas que sujetaban las cámaras superior e inferior de las células de Franz se apretaron más de la medida requerida para sellar normalmente el compartimiento superior del compartimiento inferior, y hasta el punto de introducir artificialmente perforaciones y poros en las muestras epidérmicas separadas por calor. Cuando la solución de colorante se añadió a la cámara superior de cada célula, se produjeron inmediatamente indicaciones de escape de colorante en las cámaras inferiores, a través de las perforaciones formadas en el estrato córneo. Tras la aplicación de energía sónica a las células en las que se había perforado de esta forma el estrato córneo con pequeños poros, se observó un rápido incremento en el transporte de fluido a través de un poro en el estrato córneo. La velocidad de transporte de las moléculas de colorante indicador estaba directamente relacionada con la aplicación o no de energía sónica. Es decir, la aplicación de energía sónica causaba un pulso inmediato (tiempo de retraso aproximadamente <0,1 segundos) de las moléculas indicadoras a través de los poros en el estrato córneo. Este pulso de moléculas indicadoras cesaba inmediatamente después de desconectar la energía sónica (un retraso de apagado de aproximadamente < 0,1 segundos). El pulso se podría repetir según se describió.

Ejemplo 19

Efectos de la energía sónica y los potenciadores químicos

Se usaron dos formulaciones de potenciadores químicos diferentes. El potenciador químico uno o CE1 era una mezcla de etanol/glicerol/agua/monooleato de glicerol/laurato de metilo en las proporciones de volumen 50/30/15/2,5/2,5. Estos son componentes generalmente considerados como seguros, es decir, GRAS, por la FDA, para uso como excipientes farmacéuticos. El potenciador químico dos o CE2 es una formulación experimental que se demuestra que es muy efectiva para incrementar el suministro transdérmico de fármacos, pero considerado generalmente muy irritante para aplicaciones de suministro transdérmico a largo plazo. CE2 contenía etanol/glicerol/agua/lauradona/laurato de metilo en las proporciones de volumen 50/30/15/2,5/2,5. La lauradona es el éster laurílico (dodecilo) del ácido 2-pirrolidona-5-carboxílico ("PCA") y se denomina también lauril-PCA.

Se prepararon seis células de Franz como anteriormente (Ejemplo 16), salvo porque la epidermis separada por calor se instaló con la capa epidérmica hacia abajo, es decir, la cara del estrato córneo hacia arriba. La hidratación se estableció exponiendo cada muestra a agua destilada durante la noche. Para empezar el experimento, el agua destilada en las cámaras inferiores se reemplazó con solución de colorante azul de metileno en las seis células. Las cámaras superiores se rellenaron con agua destilada y las células se observaron durante aproximadamente 30 minutos, confirmando que no había ningún paso de colorante, para asegurar que no había ninguna perforación de poro en ninguna de las células. Cuando no se encontró ninguna, el agua destilada de las cámaras superiores se extrajo de cuatro de las células. Las otras dos células servían como testigos de agua destilada. Las cámaras superiores de dos de las células experimentales se rellenaron a continuación con CE1 y las otras dos células experimentales se rellenaron con CE2.

La energía sónica se aplicó inmediatamente a una de las dos células CE2. Se usó un transductor de 25 MHz con una frecuencia que barría cada 0,1 segundos de 10 MHz a 30 MHz, a una intensidad máxima de 0,13 vatios/cm^{2}. Después de aplicar 10-15 minutos de energía sónica a un ciclo de funcionamiento de 50%, se detectó visualmente el flujo de colorante. No se detectó flujo de colorante en las otras cinco células.

A continuación se aplicó energía sónica a una de las dos células que contenían CE1 con las mismas características de regulación. El colorante comenzó a aparecer en la cámara superior en 5 minutos. Por tanto, la energía sónica junto con un potenciador químico, incrementaba significativamente la velocidad de flujo transdérmico de un colorante marcador a través del estrato córneo, reduciendo asimismo el tiempo de retraso.

Ejemplo 20

Efectos de la energía sónica y los potenciadores químicos

Se prepararon formulaciones de los dos potenciadores químicos, CE1 y CE2, menos la glicerina, y estas nuevas formulaciones, denominadas CE1MG y CE2MG, se probaron como anteriormente. La glicerina se sustituyó por agua, de forma que las proporciones de los otros componentes permanecieron invariables. Se prepararon tres células en células de Franz modificadas con la cara epidérmica de las muestras de epidermis separada por calor hacia la cara superior de las cámaras. Estas muestras se hidrataron luego en agua destilada durante 8 horas. Después de la etapa de hidratación, el agua destilada en las cámaras superiores se reemplazó, bien con CE1MG o CE2MG, y la cámara superior se rellenó con la solución de colorante. Se aplicó energía sónica a cada una de las tres células
secuencialmente.

Tras la aplicación de energía sónica de frecuencia modulada, pulsada, durante una duración total inferior a 10 minutos, se observó un incremento significativo en la permeabilidad de las muestras de estrato córneo. La permeabilidad del estrato córneo se alteró de manera relativamente uniforme a través del área expuesta tanto al potenciador químico como a la energía sónica. No se observaron perforaciones en forma de poros a través de las que el colorante pudiese atravesar el estrato córneo. La velocidad de flujo transdérmico se podía controlar instantáneamente conectando o desconectando la energía sónica. La desconexión de la energía sónica parecía reducir instantáneamente la velocidad de flujo transdérmico, de forma que ningún colorante se transportaba activamente de forma visible a través de la muestra de piel; presumiblemente, la velocidad se reducía a la de la difusión pasiva. La conexión de la energía sónica de nuevo reanudaba instantáneamente la velocidad de flujo de nivel elevado. El modo modulado parecía proporcionar un incremento pulsátil regular en la velocidad de flujo transdérmico a la velocidad modulada. Cuando la energía sónica se fijaba a una frecuencia constante, el incremento máximo en la velocidad de flujo transdérmico para esta configuración parecía producirse a aproximadamente 27 MHz.

Habiendo obtenido los mismos resultados con las tres muestras, las células se drenaron a continuación de todos los fluidos y se lavaron con agua destilada sobre ambas caras del estrato córneo. Las cámaras inferiores se rellenaron a continuación inmediatamente con agua destilada, y las cámaras superiores se volvieron a rellenar con la solución de colorante. Las células se observaron durante 30 minutos. No se observaban orificios en las muestras de estrato córneo y no se detectaba una gran cantidad de colorante en las cámaras inferiores. Una pequeña cantidad de colorante se hizo visible en las cámaras inferiores, probablemente debido al colorante y potenciador atrapados en las muestras de piel, procedentes de sus exposiciones previas. Después de 12 horas adicionales, la cantidad de colorante detectada era todavía muy pequeña.

Ejemplo 21

Efectos de la energía sónica y los potenciadores químicos

Estrato córneo perforado: Se prepararon tres células con muestras de epidermis separada por calor con la cara epidérmica hacia la cara superior de la cámara, procedentes del mismo donador que en el Ejemplo 16. Las muestras se hidrataron durante 8 horas y luego se reemplazó el agua destilada en las cámaras inferiores, bien con CE1MG o CE2MG. Las cámaras superiores se rellenaron a continuación con la solución colorante. Las perforaciones en forma de poro en las muestras del estrato córneo permitieron al colorante filtrarse a través de las muestras de estrato córneo, hacia el interior de las cámaras subyacentes que contenían potenciador. Se aplicó energía sónica. Inmediatamente después de la aplicación de la energía sónica, las moléculas de colorante se impulsaban rápidamente a través de los poros. Según se mostró anteriormente, el flujo rápido de colorante a través de los poros se correlacionó directa e inmediatamente con la aplicación de la energía sónica.

Ejemplo 22

Efectos de la energía sónica y los potenciadores químicos

Se probó un transductor de energía sónica de bajo coste, TDK Nº NB-58S-01 (TDK Corp.), en cuanto a su capacidad para incrementar las velocidades de flujo transdérmico. La respuesta máxima de este transductor se determinó que era aproximadamente 5,4 MHz, produciéndose otros máximos locales a aproximadamente 7 MHz, 9 MHz, 12,4 MHz y 16 MHz.

Este transductor TDK se probó a continuación a 5,4 MHz en cuanto a su capacidad para incrementar la velocidad de flujo transdérmico conjuntamente con CE1MG. Se prepararon tres células con la cara epidérmica hacia la cámara inferior, después se hidrataron las muestras de piel durante 8 horas. La solución colorante se colocó en la cámara inferior. El transductor se colocó en la cámara superior, sumergido en CE1MG. Usando frecuencias de barrido de 5,3 a 5,6 MHz como activación de energía sónica, se movieron cantidades significativas de colorante a través del estrato córneo y se detectaron en el pocillo de recogida de la célula en 5 minutos. Se produjo un calentamiento local, alcanzando el transductor una temperatura de 48ºC. En un testigo que usaba CE1MG sin energía sónica, una exposición de 24 horas producía menos colorante en el pocillo de recogida, que una exposición de 5 minutos con energía
sónica.

Este ejemplo demuestra que un transductor de energía sónica de bajo coste a frecuencia baja, puede afectar enormemente a la velocidad de flujo transdérmico, cuando se usa conjuntamente con un potenciador químico apropiado. Aunque una energía sónica de mayor frecuencia concentraría teóricamente más energía en el estrato córneo, cuando se usa con un potenciador químico la energía sónica modulada de frecuencia inferior puede acelerar la velocidad de flujo transdérmico, haciendo la tecnología útil y práctica.

Ejemplo 23

Demostración de la migración de moléculas a través de la piel humana: Se repitieron las pruebas con el transductor de TDK y CE1MG descritas anteriormente, a aproximadamente 12,4 MHz, uno de los máximos resonantes locales más elevados para el transductor, con un barrido de frecuencia a una velocidad de 2 Hz desde 12,5 a 12,8 MHz y una densidad de energía sónica inferior a 0,1 W/cm^{2}. La cara epidérmica de la epidermis separada por calor estaba hacia abajo, la solución de colorante estaba en la cámara inferior, y la solución potenciadora y la energía sónica se colocaban en la cámara superior. En 5 minutos, una cantidad significativa de colorante se había movido a través del estrato córneo hacia el interior del pocillo de recogida. El calentamiento óhmico en el transductor era significativamente inferior que cuando el mismo transductor se hacía funcionar a 5,4 MHz, produciendo un incremento en la temperatura del potenciador químico hasta sólo aproximadamente 33ºC.

Incluso a estos niveles de eficiencia bajos, los resultados obtenidos con CE1MG y energía sónica procedente del transductor de TDK eran notables en la dirección de determinación. Las Figs. 3A y 3B de la patente de EE.UU. Nº 5.445.611 muestran gráficos de datos obtenidos de tres células separadas con la velocidad de flujo medida en la dirección de determinación. Incluso en el punto temporal de 5 minutos, estaban presentes cantidades fácilmente medibles del colorante en el potenciador químico sobre el exterior del estrato córneo, indicando transporte desde la cara epidérmica a través del estrato córneo hasta el área "exterior" de la muestra de piel.

Para optimizar el uso de la energía sónica o del enfoque energía sónica/potenciador químico, para recoger y supervisar analitos del cuerpo, se requieren medios para analizar la cantidad de analito de interés. Un sistema de ensayo que realiza múltiples lecturas mientras que la unidad está en el proceso de extraer analitos mediante energía sónica, con o sin potenciadores químicos, hace innecesario estandarizar a través de una amplia población de base y normalizar para diferentes características de piel y velocidades de flujo. Representando gráficamente dos o más puntos de datos en el tiempo a medida que la concentración de analito en el sistema de recogida se va incrementando, se puede aplicar un algoritmo que se adapte a la curva para determinar los parámetros que describen la curva en relación con la extracción de analito o la velocidad de flujo hasta el punto en el que se alcanza el equilibrio, estableciendo así la medida de la concentración del intervalo. La forma general de esta curva es invariable de un individuo a otro; sólo cambian los parámetros. Una vez que se han establecido estos parámetros, la resolución para la solución del estado de equilibrio (es decir, el tiempo es igual a infinito) de esta función, es decir, cuando se ha establecido el equilibrio total, proporciona la concentración del analito en el cuerpo. Por tanto, este enfoque permite realizar mediciones hasta el nivel deseado de precisión en la misma cantidad de tiempo para todos los miembros de una población, independientemente de las variaciones individuales en la permeabilidad cutánea.

Existen actualmente varias técnicas de detección que son adaptables para esta aplicación. Véase, D.A. Christensen, en 1648 Procedings of Fiber Optic, Medical and Fluorescent Sensors and Applications 223-26 (1992). Un método implica el uso de un par de fibras ópticas que se colocan juntas entre sí, de una manera aproximadamente paralela. Una de las fibras es una fibra fuente, a través de la que se conduce la energía lumínica. La otra fibra es una fibra de detección, conectada a un diodo fotosensible. Cuando se conduce luz a través de la fibra fuente, una parte de la energía lumínica, la onda evanescente, está presente en la superficie de la fibra, y una parte de esta energía lumínica se recoge por la fibra de detección. La fibra de detección conduce la energía de la onda evanescente capturada al diodo fotosensible, que la mide. Las fibras se tratan con un aglutinante, para atraer y unir el analito que se va a medir. A medida que las moléculas de analito se unen a la superficie (p.ej. el analito de glucosa se une a las lectinas inmovilizadas, como concanavalina A, o a anticuerpos anti-glucosa inmovilizados), la cantidad de acoplamiento de onda evanescente entre las dos fibras cambia, y la cantidad de energía capturada por la fibras de detección y medida por el diodo también cambia. Varias mediciones de la energía de la onda evanescente detectada a lo largo de períodos de tiempo cortos, soportan una determinación rápida de los parámetros que describen la curva de equilibrio, haciendo posible así el cálculo de la concentración del analito en el cuerpo. Los resultados experimentales, que muestran un flujo medible en 5 minutos (Figs 3A y 3B de la patente de EE.UU. Nº 5.445.611) con este sistema, sugieren que los datos suficientes para una lectura final precisa se recogen en 5 minutos.

En su realización más básica, se puede utilizar un dispositivo para la aplicación de energía sónica y recogida de analito, que comprende una almohadilla absorbente, bien de material natural o sintético, que sirve como depósito para el potenciador químico, si se usa, y para recibir el analito procedente de la superficie de la piel. La almohadilla o depósito se mantiene en su sitio, bien pasivamente o ayudado por medios de retención apropiados, como una tira de cierre o tira adhesiva, sobre el área seleccionada de la superficie de la piel.

Se coloca un transductor de energía sónica de forma que la almohadilla o depósito esté entre la superficie de la piel y el transductor, y se mantenga en su sitio mediante medios apropiados. Se acopla una fuente de potencia al transductor y se activa mediante medios de interruptor o mediante otros medios adecuados. El transductor se activa para suministrar energía sónica modulada en frecuencia, fase o intensidad, según se desee, para suministrar el potenciador químico, si se usa, desde el depósito a través de la superficie de la piel, seguido de recogida del analito desde la superficie de la piel al interior del depósito. Después del período de tiempo deseado, fijo o variable, el transductor se desactiva. La almohadilla o depósito, que ahora contiene el analito de interés, se puede eliminar para cuantificar el analito, por ejemplo, mediante un laboratorio que utiliza varios análisis químicos convencionales, o mediante un dispositivo portátil. Alternativamente, el mecanismo para cuantificar el analito se puede construir en el interior del dispositivo usado para la recogida del analito, bien como una parte integral del dispositivo o como un anexo. Los dispositivos para controlar un analito se describen en la patente de EE.UU. Nº 5.458.140.

Ejemplo 24

Un método alternativo para la detección de un analito, como glucosa, tras la recogida de la muestra a través de la superficie de la piel en la que se han formado poros, según se describió anteriormente, se puede conseguir a través del uso de medios enzimáticos. Existen varios métodos para la medición de glucosa en una muestra biológica. Un método implica la oxidación de glucosa en la muestra con glucosa-oxidasa, para producir glucono-lactona y peróxido de hidrógeno. En presencia de un cromógeno incoloro, el peróxido de hidrógeno se convierte a continuación mediante peroxidasa, en agua y un producto coloreado.

Glucosa \xrightarrow{glucosa-oxidasa} gluconolactona + H_{2}O_{2}

2H_{2}O_{2} + cromógeno \longrightarrow H_{2}O + producto\ coloreado

La intensidad del producto coloreado será proporcional a la cantidad de glucosa en el fluido. Este color se puede determinar a través del uso de métodos convencionales de absorbancia o reflectancia. Mediante calibrado con concentraciones conocidas de glucosa, la cantidad de color se puede usar para determinar la concentración de glucosa en el analito recogido. Ensayando para determinar la relación, uno puede calcular la concentración de glucosa en la sangre del sujeto. Esta información se puede usar luego de la misma forma que la información obtenida de una prueba de glucosa procedente de un pinchazo en el dedo. Los resultados pueden estar disponibles en un tiempo de cinco a diez minutos.

Ejemplo 25

Cualquier sistema que use una representación visual o lectura de concentración de glucosa indicará a un especialista o paciente la necesidad de administración de insulina u otra medicación apropiada. En cuidados intensivos u otras situaciones en las que se desea un control constante y se necesita realizar acciones correctivas casi simultáneamente, el dispositivo de visualización se puede conectar con medios de señalización apropiados, que activan la administración de insulina u otra medicación de forma apropiada. Por ejemplo, existen bombas de insulina que se implantan en el peritoneo u otra cavidad corporal, que se pueden activar como respuesta a estímulos externos o internos. Alternativamente, utilizando las velocidades de flujo transdérmico incrementadas, posibles con la microporación del estrato córneo y otras técnicas descritas en esta invención, se podría aplicar un sistema de suministro de insulina transdérmico, con control de las velocidades de flujo moduladas mediante la señal procedente del sistema detector de glucosa. De esta forma, puede estar disponible un sistema de control biomédico completo, que no sólo controla y/o diagnostica una necesidad médica, sino que proporciona simultáneamente una acción correctiva.

Se podrían proporcionar sistemas de control biomédico de un tipo similar en otras situaciones, como mantener los equilibrios de electrolito correctos o administrar analgésicos como respuesta a un parámetro de analito medido, como las prostaglandinas.

Ejemplo 26

De forma similar al sonido audible, las ondas sónicas pueden sufrir reflexión, refracción y absorción cuando encuentran otro medio con propiedades diferentes [D. Bommannan et al., 9 Pharm. Res. 559 (1992)]. Los reflectores o lentes se pueden enfocar o controlar de otra manera la distribución de energía sónica en un tejido de interés. Para muchas localizaciones en el cuerpo humano, se puede encontrar un pliegue de carne que pueda soportar este sistema. Por ejemplo, un lóbulo de la oreja es una localización conveniente que permitiría el uso de un reflector o lente para ayudar a ejercer un control direccional (p.ej., "impulso" de analitos o permeantes a través del estrato córneo en el que se han formado poros), similar al que se realiza cambiando la frecuencia e intensidad sónicas.

Ejemplo 27

Se pueden usar múltiples transductores de energía sónica para dirigir selectivamente la dirección del flujo transdérmico a través del estrato córneo en el que se han formado poros, bien hacia el interior del cuerpo o desde el cuerpo. Un pliegue de la piel, como un lóbulo de la oreja permite que los transductores se localicen en sendas caras del pliegue. Los transductores se pueden activar selectivamente o en fase, para incrementar el flujo transdérmico en la dirección deseada. Se puede construir un conjunto de transductores o un circuito acústico para usar tipos de sistemas en fase, similares a aquellos desarrollados para sistemas de comunicación por radar y microondas, para dirigir y enfocar la energía sónica hacia el interior del área de interés.

Ejemplo 28

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que las muestras de epidermis separada por calor se tratan primero con un láser excímer (p.ej. modelo EMG/200 de Lambda Physik; 193 nm de longitud de onda, 14 ns de amplitud de pulso) para destruir el estrato córneo, según el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. Nº 4.775.361.

Ejemplo 29

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que las muestras de epidermis separadas por calor se tratan primero con yoduro de 1,1'-dietil-4,4'-carbocianina (Aldrich, _{max} = 703 nm) y luego se suministra un total de 70 mJ/cm^{2}/50 ms a la muestra tratada con colorante, con un modelo de láser de diodo TOLD9150 (Toshiba America Electronic, 30 mW a 690 nm) para destruir el estrato córneo.

Ejemplo 30

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 29, con la excepción de que el colorante es verde de indocianina (Sigma, Nº de catálogo I-2633; _{max} = 775 nm) y el láser es un modelo Diolite 800-50 (LiCONiX, 50 mW a 780 nm).

Ejemplo 31

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 29, con la excepción de que el colorante es azul de metileno y el láser es un modelo SDL-8630 (SDL Inc.; 500 mW a 670 nm).

Ejemplo 32

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 29, con la excepción de que el colorante está contenido en una solución que comprende un potenciador de permeación, p.ej. CE1.

Ejemplo 33

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 29, con la excepción de que se suministra al estrato córneo el colorante y una solución que contiene un potenciador, con ayuda de la exposición a ultrasonidos.

Ejemplo 34

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 31, con la excepción de que la fuente de luz pulsada es una lámpara de arco corto que emite a lo largo del amplio intervalo de 400 a 1100 nm, pero tiene un filtro de paso de banda colocado en el sistema para limitar la salida a la región de longitud de onda de aproximadamente 650 a 700 nm.

Ejemplo 35

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que las muestras de epidermis separadas por calor se perforan primero con una microlanceta (Becton Dickinson) calibrada, para producir un microporo en el estrato córneo sin alcanzar al tejido subyacente.

Ejemplo 36

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que las muestras de epidermis separadas por calor se tratan primero con energía sónica enfocada en el intervalo de 70-480 mJ/cm^{2}/50 ms, para destruir el estrato córneo.

Ejemplo 37

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que el estrato córneo se perfora primero hidráulicamente con un chorro de fluido a alta presión, para formar un microporo de hasta aproximadamente 100 \mum de diámetro.

Ejemplo 38

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 19, con la excepción de que el estrato córneo se perfora primero con pulsos cortos de electricidad para formar un microporo de hasta aproximadamente 100 \mum de diámetro.

Ejemplo 39

Flujo acústico

Se describirá a continuación un nuevo mecanismo y aplicación de energía sónica en el suministro de sustancias terapéuticas al interior del cuerpo y/o la recogida de fluidos del interior del cuerpo en un depósito externo, a través de microporaciones formadas en la membrana biológica. Un aspecto adicional de esta invención es la utilización de energía sónica para crear un efecto de flujo acústico sobre los fluidos que fluyen alrededor y entre las células intactas en los tejidos viables por debajo de la capa externa de un organismo, como la epidermis y dermis de la piel humana. El flujo acústico es un modo bien documentado mediante el que la energía sónica puede interaccionar con un medio fluido. Nyborg, Physical Acoustics Principles and Methods, págs. 265-331, Vol II-parte B, Academic Press, 1965. El primer análisis teórico del fenómeno del flujo acústico lo proporcionó Rayleigh (1884, 1945). En un tratamiento extensivo del problema, Longuet-Higgins (1953-1960) ha proporcionado un resultado aplicable al flujo bidimensional, que produce la cuasi-adyacencia de cualquier superficie cilíndrica vibratoria. Nyborg (1958) desarrolló una aproximación tridimensional para una superficie arbitraria. Según se describió por Fairbanks et al., 1975 Ultrasonics Symposium Proceedings, IEEE, Nº de catálogo 75, CHO 994-4SU, la energía sónica y los fenómenos de flujo acústico pueden ser de gran utilidad para acelerar el flujo de un fluido a través de un medio poroso, mostrando incrementos mensurables en las velocidades de flujo de hasta 50 veces respecto a las velocidades posibles pasivamente o aplicando sólo gradientes de presión.

Todos los esfuerzos previos de suministro transdérmico o extracción utilizando ultrasonidos, se han enfocado en métodos de interacción entre la energía sónica y los tejidos cutáneos, diseñados para permeabilizar la capa del estrato córneo. Se ha hipotetizado que el modo exacto de interacción implicado se debe exclusivamente a la elevación local de la temperatura en la capa SC y la fusión resultante de los dominios lipídicos en los espacios intercelulares entre los corneocitos. Srinivasan et al. Otros investigadores han sugerido que las microcavitaciones y/o el cizallamiento de las estructuras en el estrato córneo, abren canales a través de los que los fluidos pueden fluir más fácilmente. En general, el diseño de los sistemas sónicos para el incremento de las velocidades de flujo transdérmico, se ha basado en el descubrimiento temprano de que la aplicación de una unidad de ultrasonidos terapéuticos existente, diseñada para producir un efecto de "calentamiento profundo" sobre el sujeto, cuando se usa conjuntamente con una aplicación tópica de una preparación gelificada o líquida que contiene el fármaco a suministrar al interior del cuerpo, podría producir un incremento cuantificable en la velocidad de flujo del fármaco hacia el interior del cuerpo. En el contexto del método enseñado aquí para crear microporos en esta membrana biológica, el uso de energía sónica se puede considerar ahora en un sentido totalmente nuevo y diferente que los conceptos de sonoforesis definidos clásicamente.

Basándose en el descubrimiento experimental mencionado en las patentes de EE.UU. 5.458.140 y 5.445.611, de que cuando existía o se creaba un pequeño orificio en el estrato córneo (SC) en las células de Franz usadas en los estudios in vitro, la aplicación de un transductor ultrasónico dirigido de forma apropiada al depósito de fluido sobre cada cara de la muestra SC en la que se habían formado poros podía generar un suceso de "flujo acústico", en el que se podían bombear grandes velocidades de flujo de fluido a través de esta membrana en la que se habían formado poros.

Con el método enseñado aquí para crear microporaciones controladas en la membrana biológica de un organismo, la aplicación del modo de flujo fluido de interacción fluido/energía sónica a la inducción de fluido hacia el interior o hacia el exterior del organismo se puede explorar ahora de forma práctica. Por ejemplo, estudios clínicos han demostrado que, haciendo una serie de microporos de 80 \mum de diámetro en un cuadrado de 400 \mum, y aplicando luego una succión suave (25-30 cm de Hg) a este área, se puede inducir aproximadamente a 1 \mul de fluido intersticial, en promedio, a abandonar el cuerpo para la recogida en una cámara externa. Añadiendo un transductor sónico pequeño, de baja potencia a este sistema, configurado de forma que genere activamente ondas de presión circulares concéntricas convergentes hacia el interior en los 2 a 6 mm de tejido que rodea a la zona de poración, se ha demostrado que esta velocidad de flujo ISF se puede incrementar en un 50%.

Liberándonos del deseo de crear alguna forma de absorción directa de energía sónica en los tejidos cutáneos (como se requiere para producir calentamiento), se pueden determinar frecuencias de energía sónica para las que los tejidos cutáneos son virtualmente transparentes, es decir en la región de frecuencia muy baja de 1 kHz a 500 kHz. Incluso a algunas de las frecuencias inferiores ensayadas, se podían observar efectos de flujo acústico significativos, usando un microscopio para observar una prueba in vivo, en la que la piel del sujeto se sometía a microporación y el ISF se inducía a salir del cuerpo y se recogía sobre la superficie de la piel. La activación del transductor sónico mostraba indicaciones visuales considerables de la cantidad de flujo acústico, a medida que pequeños trozos de materia particulada se transportaban junto con el ISF, cuando éste se arremolinaba alrededor. La magnitud típica de movimiento presentado se puede describir como sigue: para un depósito circular de ISF de 3mm de diámetro sobre la superficie de la piel, se podía observar una partícula visual individual que completaba aproximadamente 3 órbitas completas por segundo. Esto se equipara a una velocidad de fluido lineal de más de 2,5 mm/segundo. Toda esta acción se demostraba con niveles de potencia sónica en los tejidos de menos de 100 mW/cm^{2}.

Aunque uno puede observar fácilmente la superficie superior de la piel y la actividad fluida sobre la misma, valorar lo que está sucediendo dinámicamente en el interior de las capas del tejido cutáneo en respuesta al acoplamiento de energía sónica al interior de estos tejidos, es mucho más difícil. Uno puede asumir que, si tales velocidades de fluido grandes (p.ej. >2,5 mm/s) se pueden inducir tan fácilmente sobre la superficie, entonces también se podría percibir algún incremento detectable en el flujo de fluido en los canales intercelulares presentes en los tejidos dérmicos viables, en respuesta a esta entrada de energía sónica. Actualmente, se ha cuantificado un incremento en el ISF recogido a través de un conjunto dado de microporaciones, cuando se aplicaba una energía sónica de frecuencia baja al área en un círculo que rodeaba las zonas de poración. En este experimento, se alternaba una técnica de recogida de ISF basada solamente en una succión suave (25 a 30 cm de Hg), con el uso de exactamente el mismo aparato pero con el transductor sónico acoplado. Durante una serie de 10 períodos de recogida de dos minutos, cinco con mera succión y cinco con succión y energía sónica activa, se observaba que, activando la fuente de energía sónica, se podía recoger aproximadamente 50% más de ISF durante el mismo período de tiempo. Estos datos se muestran en la Fig. 30. Este incremento en la velocidad de flujo de ISF se detectó sin un incremento descrito en la sensación procedente del sujeto ensayado, debido a la energía sónica. El aparato usado para este experimento se ilustra en Figs. 31-33. El sistema transductor de las Figs. 31-33 comprende un cilindro de pared gruesa de material piezoeléctrico, con un diámetro interno de aproximadamente 8 mm y un grosor de pared de 4 mm. El cilindro se ha polarizado de forma que, cuando se aplica un campo eléctrico a través de las superficies metalizadas del diámetro externo e interno, el grosor de la pared del cilindro se expande o contrae como respuesta a la polaridad del campo. En la práctica, esta configuración produce un dispositivo que comprime rápidamente el tejido que se ha succionado hacia el interior del orificio central, produciendo un efecto de flujo acústico radial hacia el interior sobre aquellos fluidos presentes en estos tejidos. Este flujo acústico hacia el interior es responsable de llevar más ISF a la localización de las microporaciones en el centro del orificio, donde puede abandonar el cuerpo para la recogida externa.

Se construyó y probó un dispositivo similar mostrado en Fig. 34A-B, y produjo resultados iniciales similares. En la versión de la Fig. 34A-B, se modificó un transductor ultrasónico construido por Zevex, Inc. Salt Lake City, Utah, añadiéndole una extensión espatulada a la bocina sónica. En el extremo espatulado de 0,5 mm de grosor de esta extensión se colocó un orificio de 4 mm. Cuando se activaba, el principio de movimiento era longitudinal a lo largo de la longitud de la espátula, produciendo un movimiento rápido de vaivén. La perturbación física de la espátula metálica, producida por la colocación del orificio de 4 mm, producía un comportamiento de desplazamiento grande muy activo, pero caótico, en este punto. Durante el uso, la piel del sujeto se succionaba hacia el interior de este orificio, y la energía sónica se conducía al interior de la piel, de forma similar a la ilustrada en Fig. 33.

El aspecto nuevo de esta nueva aplicación de ultrasonidos reside en las siguientes áreas básicas:

1. Ya no se necesita que la función de la energía sónica este enfocada en la permeabilización de la membrana de la barrera del estrato córneo, según se enseñó por Langer, Kost, Bommannan y otros.

2. Se puede utilizar un sistema de frecuencia mucho más baja, que tiene una absorción muy escasa en los tejidos cutáneos, aunque puede crear aun el fenómeno de flujo fluido deseado en los pasadizos intercelulares, entre las células epidérmicas que contienen el fluido intersticial.

3. El modo de interacción con los tejidos y fluidos en su interior es el denominado modo "flujo", reconocido en la literatura sónica como un modo único y diferente de las interacciones vibratorias clásicas, capaces de cizallar las membranas celulares y acelerar el proceso de difusión pasiva.

Optimizando la configuración geométrica, frecuencia, potencia y modulaciones aplicadas al transductor sónico, se ha demostrado que se pueden conseguir incrementos significativos en el flujo de fluido a través de las zonas de la piel en las que se han formado poros. La optimización de estos parámetros se diseña para explotar las no linealidades que gobiernan las relaciones de flujo fluido en este medio a escala microscópica. Usando frecuencias inferiores a 200 kHz, se pueden observar grandes efectos fluídicos, sin ningún calentamiento detectable u otras interacciones de tejido negativas. Los niveles de potencia sónica requeridos para producir estos efectos mensurables son muy bajos, con niveles de potencia promedio típicamente inferiores a 100 milivatios/cm^{2}.

Por tanto, los ejemplos anteriores son representativos de sistemas que se pueden emplear en la utilización de energía sónica, o de energía sónica y potenciadores químicos, en la recogida y cuantificación de analitos para propósitos diagnósticos y para el suministro transmembranar de permeantes. La poración de la membrana biológica, seguida por el uso apropiado de energía sónica, particularmente cuando está acompañado por el uso de potenciadores químicos, permite la determinación transmembranar no invasiva o mínimamente invasiva de analitos, o el suministro de permeantes a través del estrato córneo. Hay numerosas técnicas de poración y sistemas potenciadores, algunos de los cuales pueden funcionar mejor que otros, para la detección y extracción de ciertos analitos o el suministro de permeantes a través del estrato córneo. Sin embargo, con las directrices presentadas aquí y un cierto grado de experimentación para obtener una poración óptima, potenciadores, o tiempo intensidad y frecuencia óptima de la energía sónica aplicada, así como modulación de frecuencia, amplitud y fase de la energía sónica aplicada, se pueden llevar a cabo fácilmente por los expertos en la técnica. Por tanto, la invención está limitada en su alcance sólo por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes funcionales.

Avances y mejoras adicionales

Se han realizado avances y mejoras de las técnicas de microporación, especialmente adecuados para, pero no limitados a, aplicaciones de suministro. Un avance es formar poros, usando cualquiera de las técnicas de microporación mencionadas anteriormente, hasta una profundidad deseada en el interior o a través de las membranas biológicas, incluyendo la piel, la membrana mucosa o la capa externa de una planta, particularmente para el suministro de un fármaco o sustancia bioactiva al interior del cuerpo. Otro avance es suministrar sustancias bioactivas al interior del organismo, a través de microporos formados en la membrana biológica. Otro avance adicional es aplicar medidas de mejora de la permeación, antes, durante o después de la microporación, de forma que se incremente la permeabilidad de las capas en la piel o mucosa en las que se forman los microporos, cuando se suministran sustancias como fármacos o sustancias bioactivas, a su interior o a través de las mismas.

El microporo formado en la membrana biológica se puede extender hasta una profundidad seleccionada. Un microporo que se extiende hacia el interior de la epidermis puede penetrar sólo en el estrato córneo o en profundidades seleccionadas en el interior de la capa de células viables o en la capa subyacente de tejido conectivo. De forma similar, si se forma en la membrana mucosa, el microporo puede penetrar sólo en la parte superficial de la capa epitelial o en profundidades seleccionadas en el revestimiento epitelial o la lámina propia subyacente, y en el tejido situado debajo. La profundidad del microporo en cada caso se puede

\hbox{extender a través de la  profundidad completa de la
membrana biológica.}

Como ejemplo de microporación hasta una profundidad seleccionada, si uno utiliza una sonda térmica que pueda continuar suministrando energía suficiente al interior o a través de las capas de células viables totalmente hidratadas por debajo del estrato córneo, el proceso de poración puede continuar hacia el interior del cuerpo hasta profundidades seleccionadas, penetrando a través de la epidermis, la dermis y hacia el interior o a través de las capas subcutáneas situadas debajo, si se desea. El interés cuando se diseña un sistema para crear un microporo que se extiende alguna distancia hacia el interior o a través de los tejidos viables en la epidermis o dermis, o el recubrimiento epitelial o la lámina propia, es cómo minimizar el daño al tejido adyacente y la sensación para el sujeto durante el proceso de poración.

Experimentalmente, hemos demostrado que si la sonda térmica usada es un elemento sólido calentado eléctrica u ópticamente, con el extremo de la sonda calentado, activo, definido físicamente para que no tenga más de unos pocos cientos de micrones de anchura y sobresalga unos pocos milímetros de la base de soporte, un pulso único o múltiples pulsos de corriente pueden suministrar bastante energía térmica al interior del tejido para permitir que la destrucción penetre tan profunda como permita el diseño físico, es decir, hasta que la base de soporte limite la extensión de la penetración hacia el interior o a través del tejido. Si las propiedades eléctricas y térmicas de dicha sonda térmica, cuando está en contacto con los tejidos, permiten que el pulso de energía module la temperatura de dicha sonda suficientemente rápido, este tipo de poración del tejido profundo se puede conseguir esencialmente sin ningún dolor para el sujeto. Los experimentos han demostrado que, si se suministra la cantidad de energía térmica requerida a la sonda, en menos de aproximadamente 20 milisegundos (20-50 ms), el procedimiento es indoloro. A la inversa, si el pulso de energía se tiene que extender durante más de aproximadamente 20 milisegundos (20-50 ms), la sensación para el sujeto aumenta rápida y no linealmente, a medida que se extiende la amplitud del pulso.

De forma similar, se puede construir un diseño de sonda calentada eléctricamente, que soporta este tipo de poración a profundidad seleccionada, curvando un hilo de volframio de 50 a 150 micrones de diámetro en una acodadura aguda, formando una acodadura próxima a 180 grados, con un radio interno mínimo en este punto. Esta pieza en forma de "V" en miniatura se puede montar de forma que esta "V" se extiende separada a cierta distancia de una pieza de soporte que tiene electrodos de cobre depositados sobre la misma. La distancia a la que se extiende el hilo hacia afuera del soporte definirá la distancia de penetración máxima en el tejido cuando se calienta el hilo. Cada extremo de la "V" de volframio se unirá a uno de los electrodos sobre el vehículo de soporte, que se puede conectar, a su vez, al circuito de corriente pulsante. Cuando la corriente se suministra al hilo de una forma controlada apropiadamente, el hilo se calentará rápidamente hasta la temperatura deseada, para efectuar el proceso de destrucción térmica en un solo pulso o en múltiples pulsos de corriente. Controlando la impedancia dinámica de la sonda y conociendo el coeficiente de resistencia frente a la temperatura del elemento de volframio, se puede establecer fácilmente un control de circuito cerrado de la temperatura del punto de contacto. Asimismo, controlando dinámicamente la impedancia a través del cuerpo desde el punto de contacto de la sonda y desde un segundo electrodo separado a alguna distancia, se puede determinar la profundidad del poro basándose en las diferentes propiedades de impedancia del tejido, a medida que uno penetra más profundamente en el cuerpo. Una vez que se han determinado rutinariamente las propiedades de impedancia de un tejido seleccionado de un organismo seleccionado, este parámetro se puede usar para determinar la profundidad del poro y se puede usar en un sistema de control para controlar la profundidad del
poro.

Análogamente, se puede construir una realización de un diseño de sonda calentada ópticamente que soporte este tipo de poración de profundidad seleccionada, cogiendo una fibra óptica y colocando sobre un extremo una punta formada por un capuchón o recubrimiento sólido. Una fuente de luz, como un diodo láser, se acoplará al interior del otro extremo de la fibra. La cara de la punta enfrentada a la fibra tiene que tener un coeficiente de absorción suficientemente elevado a lo largo del intervalo de longitudes de onda emitidas por la fuente de luz, para que cuando los fotones alcancen el extremo de la fibra y golpeen esta cara, algunos de ellos se absorban y, consecuentemente, hagan que la punta se caliente. El diseño específico de esta punta, fibra y conjunto de la fuente pueden variar ampliamente, sin embargo las fibras con diámetros transversales totales de 50 a 1000 micrones son artículos convencionales hoy en día, y las fuentes que emiten hasta miles de vatios de energía óptica son, de forma similar, convencionales. La punta que forma la sonda térmica real se puede fabricar de un material con elevado punto de fusión, como volframio y unirse a la fibra mecanizándolo de forma que permita la inserción de la fibra en el interior del diámetro interior cilíndrico en el extremo de la fibra. Si el extremo distal de la punta se ha fabricado para limitar la difusión térmica hacia el exterior de esta punta y devolverla al cilindro de soporte que une la punta a la fibra, en el marco de tiempo de las amplitudes de pulso óptico empleadas, los fotones incidentes en esta punta elevarán la temperatura rápidamente, tanto en la cara de la fibra como en la cara de contacto que está colocada contra la superficie de los tejidos. La colocación del sistema fibra/punta sobre la superficie del tejido, se puede conseguir con un mecanismo simple, diseñado para mantener la punta contra la superficie, bajo alguna tensión de resorte, de forma que, a medida que el tejido situado debajo se destruye, la propia punta avanzará hacia el interior del tejido. Esto permite que el proceso de destrucción térmica continúe hacia el interior o a través del tejido, en la medida en que uno lo desee. Una característica adicional del diseño de esta sonda calentada ópticamente es que, controlando la energía radiada del cuerpo negro desde la punta calentada, que se recoge por la fibra, se puede efectuar un control de circuito cerrado muy simple de la temperatura de la punta. Asimismo, según se describió anteriormente, controlando dinámicamente la impedancia a través del cuerpo desde el punto de contacto de la sonda y desde un segundo electrodo separado a alguna distancia, se puede estimar la profundidad del poro, basándose en las diferentes propiedades de impedancia del tejido, a medida que uno penetra más profundamente en el cuerpo. La relación entre amplitud del pulso y sensación, para este diseño, es esencialmente la misma que para la sonda calentada eléctricamente descrita anteriormente.

Por ejemplo, se sabe que algunas aplicaciones de vacunas son más efectivas si se suministran en la capa dérmica, de forma que estén en las proximidades de las células de Langerhan's o dendríticas, u otras células importantes para esta respuesta inmunológica. Esto implicaría una profundidad de poración diseñada para pasar a través de la epidermis, la cual, en la mayoría de los casos, sería una profundidad de aproximadamente 180 micrones a 250 micrones.

Como otro ejemplo, cuando se suministran algunas proteínas y péptidos, es deseable minimizar la respuesta inmunológica al permeante en la zona de la administración y, al mismo tiempo, eludir las zonas activas para proteasa en los tejidos cutáneos. En este caso, se puede desear un poro incluso más profundo, que llegue incluso a una profundidad de 300 micrones en el interior de la piel.

Alternativamente, puede ser deseable dejar una capa mínimamente gruesa de estrato córneo intacto, para minimizar la absorción inicial rápida de un permeante, y para proporcionar cierta retención de la función de barrera del estrato córneo, para proporcionar una liberación controlada durante un período más largo de tiempo.

El gran incremento de eficiencia se puede conseguir combinando la poración en las capas de la membrana biológica con otras técnicas de incremento de la permeación, que pueden ahora optimizarse para funcionar sobre las diversas barreras, para efectuar el suministro del compuesto deseado a los espacios internos, según sea necesario para la bioefectividad. En particular, si uno está suministrando un compuesto de ácido nucleico, bien desnudo, fragmentado, encapsulado o acoplado a otra sustancia, se desea a menudo introducir el ácido nucleico en las células vivas sin matar la célula, para permitir la absorción deseada y el funcionamiento posterior de la terapia. La aplicación de electroporación, iontoforesis, campos magnéticos y energía térmica y sónica, puede hacer que se formen orificios, temporalmente, en las membranas celulares y otros tejidos internos. Debido a que hemos mostrado cómo romper el estrato córneo o la capa epitelial de la membrana mucosa o la capa externa de una planta y, si se desea, la epidermis o la dermis o tejidos más profundos en el interior de una planta, se pueden usar ahora la electroporación, iontoforesis, campos magnéticos y energía térmica y sónica, con parámetros que se pueden adaptar para actuar selectivamente sobre estas barreras de tejido subyacentes y permeabilizar la membrana celular, capilar, u otras membranas en el tejido elegido como objetivo. La electroporación, iontoforesis, campos magnéticos, y energía térmica y sónica, no eran aplicables previamente para este uso.

En el caso de la electroporación, en la que se usan rutinariamente pulsos que superiores a entre 50 y 150 voltios, para formar poros por electroporación en el estrato córneo, la capa externa de la membrana mucosa o la capa externa de una planta, en el entorno que presentamos son suficientes pulsos de unos pocos voltios o menos para formar poros por electroporación en la membrana celular, capilar u otras membranas en el tejido elegido como objetivo. Esto se debe principalmente a la reducción espectacular en el número de capas aislantes presentes entre los electrodos, una vez que se ha abierto la piel, la capa mucosa o la capa externa de una planta.

De forma similar, se puede demostrar que la iontoforesis es efectiva para modular el flujo de un medio fluido que contiene el ácido nucleico a través de los microporos, con cantidades muy pequeñas de corriente, debido a la reducción espectacular de la impedancia física al flujo fluido a través de estas capas con poros formados.

En el caso de la energía sónica, mientras que se ha usado la energía sónica clásica para acelerar la permeación del estrato córneo o la capa mucosa, eliminando esta barrera, se puede usar ahora la energía sónica para permeabilizar la membrana celular, capilar u otras membranas en el tejido elegido como objetivo. Como en los casos de la electroporación y la iontoforesis, hemos demostrado que los niveles de energía sónica precisos para efectuar una mejora notable en el flujo transmembranar de una sustancia, son mucho más reducidos que cuando las capas de la piel o mucosa se dejan intactos. Otras medidas de incremento de la permeación implican cambiar la presión osmótica o la presión física en la zona en la que se han formado los microporos, por ejemplo aplicando una presión neumática suave al depósito de permeante, para forzar un flujo fluido particular hacia el interior del organismo, a través de los microporos.

El modo de funcionamiento de todos estos métodos activos, electroporación, iontoforesis, energía magnética, térmica o sónica, cuando se aplican solos o en combinación, después de efectuar la poración en la piel, la capa mucosa o la capa externa de una planta, tiene la ventaja de ser susceptible de usar parámetros usados típicamente en aplicaciones in vitro, en las que membranas de células individuales se abren para el suministro de una sustancia. Ejemplos de estos parámetros son bien conocidos en la literatura. Por ejemplo, Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Los microporos producidos en la membrana biológica permiten suministrar transdérmica, transmucosa o transmembranarmente índices de flujo elevados de compuestos terapéuticos de pesos moleculares elevados (así como pequeños). Además, estos orificios microscópicos, no traumáticos en el cuerpo permiten el acceso de diversos analitos al interior del cuerpo, que se pueden analizar para determinar sus concentraciones internas.

Suministro de sustancias bioactivas

Otro avance adicional de la presente invención implica el uso de poración en la membrana biológica para el suministro de una sustancia bioactiva, p.ej., polipéptidos, incluyendo proteínas y péptidos (p.ej., insulina); factores de liberación, incluyendo LHRH; carbohidratos (p.ej., heparina); ácidos nucleicos; vacunas; y sustancias farmacológicamente activas, como antiinfecciosos, p.ej. antibióticos y antivíricos; analgésicos y combinaciones de analgésicos; anoréxicos; antihelmínticos; antiartríticos; antiasmáticos; anticonvulsivos; antidepresivos; antidiabéticos; antidiarreicos; antihistaminas; antiinflamatorios; preparaciones antimigraña; antinauseosos; antineoplásicos; antiparkinsonianos; antipruríticos; antipsicóticos; antipiréticos; antiespasmódicos; anticolinérgicos; simpatomiméticos; derivados de xantina; preparaciones cardiovasculares, incluyendo bloqueantes de canales de potasio y calcio, betabloqueantes, alfabloqueantes y antiarrítmicos; antihipertensivos; diuréticos y antidiuréticos; vasodilatadores, incluyendo los generales, coronarios, periféricos y cerebrales; estimulantes del sistema nervioso central; vasoconstrictores; preparaciones contra la tos y el catarro, incluyendo descongestivos; hormonas, como estradiol, testosterona, progesterona y otros esteroides, derivados y análogos, incluyendo corticoesteroides; hipnóticos; inmunosupresores; relajantes musculares; parasimpatolíticos; psicoestimulantes; sedantes; y tranquilizantes. Mediante el método de la presente invención se pueden suministran fármacos ionizados y no ionizados, así como fármacos de peso molecular elevado, medio o bajo.

Se puede usar el suministro de DNA y/o RNA para conseguir la expresión de un polipéptido, estimular una respuesta inmunológica, o para inhibir la expresión de un polipéptido, a través del uso de un ácido nucleico "antisentido", especialmente un RNA antisentido. El término "polipéptido" se usa aquí sin pretender ninguna limitación de tamaño, a menos que se indique un tamaño particular, e incluye péptidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas. Entre los polipéptidos típicos que se pueden expresar están aquellos seleccionados del grupo que consiste en oxitocina, vasopresina, hormona adrenocorticotrópica, factor de crecimiento epidérmico, prolactina, hormona liberadora de la hormona luteinizante, hormona de crecimiento, factor liberador de hormona de crecimiento, factores de crecimiento análogos a insulina, insulina, eritropoyetina, proteínas de la obesidad, como leptina, somatostatina, glucagón, factores insulinotrópicos análogos a glucagón, hormona paratiroidea, interferon, gastrina, interleuquina-2 y otras interleuquinas y linfoquinas, tetragastrina, pentagastrina, urogastroína, secretina, calcitonina, encefalinas, endorfinas, angiotensinas, renina, bradiquinina, bacitracinas, polimixinas, colistinas, tirocidina, gramicidinas y análogos sintéticos, sus modificaciones y fragmentos farmacológicamente activos, anticuerpos monoclonales y vacunas. Este grupo no se considera limitativo; la única limitación al fármaco peptídico o proteico que se puede expresar es de funcionalidad. El suministro de DNA y/o RNA es útil en terapia génica, vacunación y cualquier situación terapéutica en la que se deba administrar un ácido nucleico o un polipéptido in vivo. P.ej., patente de EE.UU. Nº 5.580.859.

Un método para obtener la administración a largo plazo de un polipéptido, puede comprender formar poros en la membrana biológica y, a continuación, suministrar un DNA que codifique un polipéptido a través de los poros en la membrana biológica, con lo que el tejido absorbe el DNA y produce el polipéptido durante al menos un mes, y más preferiblemente al menos 6 meses. Un método para obtener la expresión transitoria de un polipéptido, puede comprender formar poros en la membrana biológica y, a continuación, suministrar un RNA o DNA que codifique el polipéptido a través de los poros de la membrana biológica, con lo que las células del tejido (p.ej., la piel, la membrana mucosa, los capilares o el tejido subyacente), absorben el RNA o DNA, y producen el polipéptido durante menos de aproximadamente 20 días, usualmente menos de aproximadamente 10 días y, a menudo, menos de aproximadamente 3-5 días. Las células que absorben el RNA o DNA podrían incluir las células de la membrana biológica, el tejido subyacente u otro tejido elegido como objetivo, alcanzado mediante los capilares.

El DNA y/o RNA pueden ser ácido nucleico desnudo, opcionalmente en un vehículo o portador y/o pueden estar contenidos en microsferas, liposomas y/o asociados con proteínas facilitadoras de la transfección, micropartículas, complejos lipídicos, partículas víricas, lípidos neutros o cargados, carbohidratos, fosfato cálcico u otras sustancias precipitantes, y/o otras sustancias para estabilizar el ácido nucleico. El ácido nucleico puede estar contenido en un vector vírico que, bien se integra en el cromosoma o no se integra, en un plásmido, o como un polinucleótido desnudo. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido o, alternativamente, puede codificar un RNA antisentido, por ejemplo para inhibir la traducción de un polipéptido seleccionado en una célula. Cuando el ácido nucleico es DNA, puede ser una secuencia de DNA que no es autorreplicativa por sí sola, pero se inserta en un plásmido, el cual comprende además un replicador. El DNA puede contener también un promotor transcripcional, como el promotor CMV IEP, que es funcional en seres humanos. El DNA puede codificar también una polimerasa para transcribir el DNA. En una realización preferida, el DNA codifica un polipéptido y una polimerasa para transcribir el DNA. El DNA se puede suministrar junto con la polimerasa o con un RNAm que codifique para la misma, el cual se traduce en la célula. En esta realización, el DNA es preferiblemente un plásmido, y la polimerasa es preferiblemente una polimerasa de un fago, como la polimerasa T7, en la que el gen de la polimerasa T7 debería incluir un promotor de T7.

El método se puede usar para tratar una enfermedad asociada con una deficiencia, ausencia o mutación de un polipéptido específico. El método prevé la inmunización de un individuo, donde tal individuo puede ser un ser humano o un animal, que comprende suministrar un DNA y/o RNA al individuo, donde el DNA y/o RNA codifica un producto de traducción inmunogénico, que provoca una respuesta inmunológica frente al inmunógeno. El método se puede usar para provocar una respuesta inmunológica humoral, una respuesta inmunológica celular, o una mezcla de ambas.

Ejemplo 40

Este ejemplo ilustrativo muestra la preparación y suministro de un RNAm. En general, debería ser obvio que, al poner en práctica la invención, se puede construir fácilmente un plásmido adecuado para la transcripción in vitro del RNAm por los técnicos medios en la materia, con un número virtualmente ilimitado de DNAc. Tales plásmidos pueden comprender ventajosamente un promotor para una RNA-polimerasa seleccionada, seguido por una región no traducida en posición 5', una región no traducida en posición 3', y un molde para una sección de poliadenilato. Debería existir un único sitio de restricción entre estas regiones no traducidas en 5' y 3', para facilitar la inserción de cualquier DNAc seleccionado en el plásmido. Luego, después de clonar el plásmido que contiene el gen seleccionado, el plásmido se linealiza mediante digestión de la región de poliadenilación y se transcribe in vitro para formar tránscritos de RNAm. Estos tránscritos se proporcionan preferiblemente con una protección terminal en 5'. Alternativamente, se puede usar una secuencia no traducida en 5' como EMC, que no requiere una protección en 5'.

El vector de clonación SP6 disponible fácilmente, pSP64T, proporciona regiones flanqueantes del gen de globina de Xenopus, un RNAm traducido eficientemente. Cualquier DNAc que contenga un codón de iniciación se puede introducir en este plásmido, y se puede preparar RNAm del DNA molde resultante. Este plásmido particular se puede digerir con BglII, para insertar cualquier DNAc seleccionado, que codifique un polipéptido de interés. Aunque se pueden obtener buenos resultados con pSP64T, cuando se linealiza y luego se transcribe con RNA-polimerasa SP6, es preferible usar las secuencias flanqueantes de globina de Xenopus de pSP64T, con la RNA-polimerasa del fago T7. Esto se logra purificando un fragmento HindIII/EcoRI de 150 pb de pSP64T, e insertándolo en un fragmento HindIII/EcoRI linealizado de aproximadamente 2,9 kb de pIBI131 (disponible comercialmente de International Biotechnologies, Inc., New Haven, Conn.) con ligasa de T4. El plásmido resultante, pXBG, está adaptado para recibir cualquier gen de interés en un solo sitio BglII, situado entre las dos secuencias de globina de Xenopus, y para la transcripción del gen seleccionado con polimerasa T7.

Un gen marcador conveniente para demostrar la expresión in vivo de polinucleótidos exógenos es el de cloramfenicol-acetil-transferasa, CAT. El gen CAT del fragmento pequeño BamHI/HindIII de pSV2-CAT (ATCC Nº 37155) y el pXBG digerido con BglII, se incuban ambos con el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa de E. Coli, para generar extremos romos, y después se ligan con DNA-ligasa T4, para formar pSP-CAT. Este plásmido se digiere luego con PstI y HindIII, y se purifica el pequeño fragmento, que comprende el gen CAT entre las secuencias flanqueantes de globina en 5' y 3' de pSP64T. El plásmido pIBI131 que contiene el promotor de T7, se digiere también con PstI y HindIII, y el fragmento largo se purifica. Este fragmento se liga después al fragmento que contiene el gen CAT, con DNA-ligasa T4, para formar el plásmido pT7CAT-An.

El DNA plasmídico pT7CAT-An, se purifica según métodos bien conocidos en la técnica, p.ej., patente de EE.UU. Nº 5.580.859. El DNA plasmídico purificado resultante se linealiza a continuación aguas abajo de la región de poliadenilato con un exceso de PstI, y el DNA linealizado resultante se purifica y transcribe a continuación in vitro, según el método del Ejemplo 5 de la patente de EE.UU. Nº 5.580.859, el cual es suficientemente puro para el suministro según la presente invención.

El RNAm purificado, se suministra formando poros en una zona seleccionada de un individuo, según los procedimientos de microporación con una profundidad de poro seleccionada, que optimiza la bioactividad y el suministro de una cantidad efectiva de RNAm a tal zona, de forma que el RNAm pasa a través de la piel o la membrana mucosa al interior del tejido subyacente, donde el RNAm se absorbe por las células. Este suministro a través del estrato córneo o la membrana mucosa, en los que se han formado poros, se puede facilitar con energía sónica y/o usar energía sónica según el procedimiento del Ejemplo 15 y/o con electroporación para incrementar la absorción celular, y/o con un diferencial de presión para inducir el flujo a través de los poros en la piel o la membrana mucosa. Además, el suministro se puede facilitar colocando el RNAm en una solución transportadora, como un complejo lipídico cargado positivamente o liposoma, para incrementar la difusión del RNAm a través de los poros hacia el interior del cuerpo, o para facilitar la absorción del RNAm hacia el interior de las células.

Ejemplo 41

Este ejemplo muestra la inmunización de un individuo con RNAm que codifica la proteína gp120 del VIH. El RNAm se prepara según el procedimiento del Ejemplo 40, excepto porque el gen para gp120 (pIIIenv3-1 del AIDS Research and Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Disease, Rockville, MD) se inserta en el plásmido pXBG del Ejemplo 40. El RNAm que contiene el gen gp120 se suministra según el procedimiento del Ejemplo 40.

Ejemplo 42

Este ejemplo muestra la inmunización de un individuo con DNA que codifica la proteína gp120 del VIH. El gen gp120 se inserta en un adenovirus recombinante según el procedimiento de P. Muzzin et al., Correction of obesity and diabetes in genetically obese mice by leptin gene therapy, 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14804-14808 (1996); G. Chen et al., Disappearance of body fat in normal rats induced by adenovirus-mediated leptin gene therapy, 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14795-99 (1996). El DNA resultante se suministra según el procedimiento del Ejemplo 41.

Ejemplo 43

En este ejemplo, se sigue el procedimiento del Ejemplo 42, excepto porque el el DNA que codifica la proteína gp120 se sustituye por el DNA que codifica la glicoproteína D de HSV-2 y, adicionalmente, se combina con una cantidad efectiva de la glicoproteína D.

Ejemplo 44

En este ejemplo, se suministra en un vector plasmídico apropiado un ácido nucleico que codifica la proteína de la obesidad leptina, como un DNAc de una leptina humana o de leptina de rata, C. Guoxun et al., Disappearance of body fat in normal rats induced by adenovirus-mediated leptin, 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14795-99 (1996), o un DNAc de leptina de ratón, P. Muzzin et al., Correction of obesity and diabetes in genetically obese mice by leptin gene therapy, 93, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14804-14808 (1996). El vector de expresión de mamífero, pEUK-C1 (Clontech, Palo Alto, Calif.) está diseñado para la expresión transitoria de genes clonados. Este vector es un plásmido de 4,9 kb, que comprende un origen de replicación pBR322, y un marcador de resistencia a ampicilina para propagación en bacterias, y también comprende el origen de replicación de SV40, el promotor tardío de SV40, y la señal de poliadenilación tardía de SV40 para replicación y expresión de un gen seleccionado en una célula de mamífero. Localizado entre el promotor tardío de SV40 y la señal de poliadenilación tardía de SV40, está un sitio de clonación múltiple (MCS) de sitios de restricción únicos XhoI, XbaI, SmaI, SacI y BamHI. Los fragmentos de DNA clonados en el MCS se transcriben en RNA a partir del promotor tardío de SV40, y se traducen desde el primer codón ATG en los fragmentos clonados. Los tránscritos de DNA clonado se escinden y poliadenilan usando las señales de procesamiento de SV40 VPI. El gen de leptina se clona en el MCS de pEUK-C1, usando técnicas bien conocidas en la técnica, p.ej., J. Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (2ª edición, 1989), incorporado aquí mediante referencia. El plásmido resultante se suministra a un individuo humano o animal después de la poración de la piel o la membrana mucosa, según el procedimiento descrito anteriormente en los ejemplos previos.

Ejemplo 45

Suministro de heparina. Las heparinas son sustancias terapéuticas útiles en las que el mantenimiento de un nivel equivalente a una infusión intravenosa de aproximadamente 1000 a 5000 UI por hora, inyecciones subcutáneas dos veces al día de 5000-1000 UI de heparina, o 1500-6000 UI de heparinas de peso molecular bajo, es una dosificación clínica típica. Normalmente, la heparina no se consideraría un buen candidato para un sistema de suministro transdérmico, debido a su resistencia relativamente elevada a atravesar la piel, debido principalmente al peso molecular, 5000 a 30000 Da, de la sustancia. Con las técnicas de microporación descritas aquí, se conseguía fácilmente una velocidad de flujo significativa de heparina cuando se administraba una cantidad suficiente de heparina, p.ej. desde un depósito de suministro unido a la superficie de la piel en la que se situaban los microporos. Se aplicaba una solución de heparina a la piel en la que se habían formado poros hasta una profundidad de aproximadamente 100 \mum, permitiendo la difusión pasiva o acoplada con iontoforesis (aproximadamente 1 mA/cm^{2}), que se aplicaba durante un período de tiempo suficiente para transportar la heparina a través de los microporos hacia el interior de los tejidos subyacentes. Se observaba evidencia del suministro de heparina por el incremento de la dilatación y permeabilidad capilares, según se evidenciaba mediante el examen microscópico de la zona in vivo, tanto para el suministro pasivo como incrementado iontoforéticamente. Además de mostrar un flujo de heparina significativo usando la difusión pasiva como fuerza directriz principal, la heparina, siendo un compuesto altamente cargado, es un candidato natural para el acoplamiento de un campo eléctrico con los microporos, para permitir una velocidad de flujo controlable activamente y velocidades de flujo mayores que las posibles a través del mismo número de microporos con el método de difusión pasiva. Se llevó a cabo un experimento en el que se preparó una zona en el antebrazo palmar de un voluntario masculino sano, creando una matriz de 36 microporos dentro de un área de 1 cm cuadrado. Se unió a la zona un pequeño depósito que contenía una solución de heparina sódica y el electrodo negativo para un sistema iontoforético. El electrodo positivo se unió a la piel del sujeto, separado a alguna distancia, usando un electrodo de hidrogel, obtenido de Iomed, un suministrador comercial de sistemas iontoforéticos. El sistema se hizo funcionar durante diez minutos a 0,2 miliamperios por mg/dl al principio, hasta 67 mg/dl durante un ciclo de diez minutos, volviendo después hasta 100 en otros diez minutos adicionales, hipotetizando que se debía a la puesta en marcha del sistema contrarregulador del sujeto y la compensación de la insulina suministrada. Una repetición de este procedimiento con la adición de ultrasonidos funcionando a 44 kHz y 0,2 vatios/cm^{2} indicaba un suministro más rápido de la insulina, como se evidenció mediante las concentraciones de glucosa del sujeto, que cayeron desde 109 mg/dl hasta 78 mg/dl, menos de 30 minutos después de que comenzase el suministro. Como en el caso del Ejemplo 45, para el suministro de heparina, se puede acoplar con los microporos un sistema iontoforético de corriente baja, para facilitar una velocidad de flujo mayor y proporcionar la capacidad de modular esta velocidad de flujo variando la corriente, permitiendo un suministro de tipo a medida del sistema a construir. Los trabajos previos con insulina han mostrado típicamente que se requieren corrientes iontoforéticas relativamente elevadas para superar las fuertes propiedades de barrera del estrato córneo intacto. Formando poros en el estrato córneo o la mucosa y fijando opcionalmente los parámetros de poración para fabricar un poro más profundo en el interior o a través de la membrana biológica elegida como objetivo, se requiere una densidad de corriente inferior para producir las velocidades de flujo de insulina deseadas.

De forma similar, para formulaciones de insulina poco cargadas o sin cargar, se puede efectuar un incremento de flujo activo a través de los microporos, acoplando un campo sónico o sonoforesis, que puede incluir frecuencias descritas normalmente como ultrasónicas, para ayudar a impulsar la insulina a través de los tejidos. Una característica adicional del campo sónico es su capacidad de incrementar la permeabilidad de las diversas barreras en los tejidos viables, dejando que la insulina alcance un volumen mayor de tejido sobre el que se puede producir la absorción deseada en la corriente sanguínea. La modulación de la energía sónica se ha demostrado que es muy efectiva en la modulación del flujo total de un compuesto a través de los microporos hacia el interior o a través de los tejidos más profundos, proporcionando un segundo medio para desarrollar un sistema de suministro de inyección instantánea.

Las vías exactas de absorción de insulina cuando se suministra una inyección subcutánea son aún un tema de debate. Una de las razones de que esto no esté claro todavía son los niveles ampliamente variables de biodisponibilidad demostrada dentro de una población, o incluso del mismo sujeto, sobre una base de inyección por inyección. Una vía hipotetizada es la absorción directa a través de los capilares hacia la corriente sanguínea. Un método para favorecer este proceso es acoplar la electroporación con la poración superficial, en el que la electroporación se ha optimizado específicamente para funcionar en la región de las membranas endoteliales capilares, creando temporalmente un gran número de orificios para incrementar esta absorción directa. Al igual que con la iontoforesis y sonoforesis descritas previamente, los niveles de amplitud de voltaje total del sistema de electroporación requerido para efectuar este tipo de electroporación dentro de estas capas de tejido subyacentes a la superficie externa, son, a menudo, inferiores que las requeridas para penetrar a través de una superficie externa intacta, debido a la reducción de la impedancia bruta de la capa externa de la membrana biológica.

Ejemplo 47

Suministro de micropartículas: El uso de liposomas, complejos lipídicos, microsferas incluyendo nanosferas, compuestos pegilados (compuestos combinados con polietilenglicol) y otras micropartículas como parte de un sistema de suministro de fármacos, está bien desarrollado para muchas aplicaciones específicas diferentes. En particular, cuando se trata con un compuesto que se rompe fácilmente mediante los componentes endógenos contenidos en los tejidos corporales, como las enzimas proteasa, nucleasa o carbohidrasa, en la piel, tejidos, macrófagos u otras células presentes en la corriente sanguínea o la linfa, se pueden obtener frecuentemente incrementos en la biodisponibilidad y/o liberación prolongada, utilizando una de estas técnicas. Actualmente, una vez que uno ha aplicado una de estas técnicas, la formulación se suministra generalmente a través de algún tipo de inyección. La presente invención, creando microporos a través de una membrana biológica (p.ej., la piel o una membrana mucosa) y en el interior del cuerpo hasta una profundidad seleccionada, permite que este tipo de micropartícula se suministre a través de la piel o la mucosa. Según se describió en el ejemplo anterior de la insulina, se pueden combinar la microporación, electroporación, iontoforesis, energía sónica o potenciadores, así como estimulación mecánica de la zona, como presión o masaje, en cualquier combinación, para incrementar el suministro y/o absorción de una formulación específica. En el caso de algunas micropartículas obtenidas mediante ingeniería genética, los poros pueden tener una profundidad óptima, diseñada para rodear ciertas zonas biológicamente activas o colocar la partícula dentro de la zona elegida. Para algunos sistemas de suministro de micropartículas, la energía incidente sobre las partículas después de que se han suministrado al interior o a través de los tejidos bajo la superficie, se puede usar para desencadenar la liberación acelerada del compuesto activo, permitiendo así el control externo de la velocidad de flujo de la sustancia terapéutica.

Ejemplo 48

Micropartículas para control de analito implantable: Otra aplicación de las micropartículas es suministrar una partícula no como sustancia terapéutica, sino como vehículo de un compuesto de sonda que se podría interrogar de forma no invasiva, por ejemplo, mediante radiación electromagnética procedente de un sistema de lectura externo para obtener información relativa a las concentraciones de un analito específico en el cuerpo. Un ejemplo es incorporar en una microsfera porosa un compuesto fluoróforo específico de glucosa, el cual, dependiendo de las concentraciones de glucosa presentes en los tejidos circundantes, alteraría su respuesta fluorescente, bien en amplitud, longitud de onda o vida de fluorescencia. Si el fluoróforo se diseñaba para ser activo con una longitud de onda de activación que variaba de 700 nm a 1500 nm, se podría utilizar una fuente de luz infrarroja de bajo coste, como un LED o diodo láser para estimular su respuesta fluorescente, que estaría de forma similar en este intervalo de 700 nm a 1500 nm. A estas longitudes de onda, los tejidos de la piel y la mucosa absorben muy poco y permitirían construir un sistema simple de esta manera.

La glucosa es un analito candidato, para el cual se han desarrollado sondas de fluorescencia de tiempo de vida experimental y se han incorporado en implantes polímeros insertados subcutáneamente, que se han interrogado con éxito a través de la piel con métodos de simulación y detección óptica. Se requeriría meramente la reformulación de estos implantes experimentales en micropartículas dimensionadas adecuadamente para permitir el suministro hacia el interior o a través de las capas de tejido viables, mediante los microporos. Sin embargo, cualquier analito se podría elegir como objetivo, y el método de interrogación de las micropartículas suministradas podría ser a través del campo magnético o eléctrico, más que de la energía óptica.

Ejemplo 49

Suministro de una vacuna

Se prepara una vacuna bacteriana, vírica, de toxoides o mixta, en forma de sólido, líquido, suspensión o gel, según se requiera. Esta formulación podría incluir uno cualquiera o una combinación de péptidos, proteínas, carbohidratos, DNA, RNA, microorganismos enteros, aditivos, vehículos y similares. Se formaron poros en una zona seleccionada de un individuo (piel o membrana mucosa), según los procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 45, y se aplicó la vacuna a la zona en la que se formaron los poros. La profundidad de los microporos puede depender del tipo de vacuna suministrada. Este suministro se puede favorecer con electroporación, iontoforesis, energía magnética o sónica, potenciadores, así como estimulación mecánica de la zona, como presión o masaje según los procedimientos descritos anteriormente y/o el uso de electroporación, iontoforesis, energía magnética o sónica, potenciadores, así como estimulación mecánica de la zona, como presión o masaje, para incrementar la absorción celular. Se pueden suministrar dosis adicionales o de refuerzo de la misma forma, para conseguir la inmunización del individuo.

Ejemplo 50

Suministro de testosterona: Se usó un parche de testosterona disponible comercialmente, el parche Androderm® de TheraTech, Inc., en una serie de experimentos para evaluar los beneficios de la microporación en lo que respecta al suministro de este permeante. Un sujeto masculino hipergonádico sufrió una terapia de Androderm durante dos días, después de lo cual se extrajo una serie de muestras de sangre venosa durante el período posterior de 24 horas, para establecer las concentraciones de testosterona de la línea de base de este sujeto. A continuación se instalaron dos parches de Androderm de 2,5 mg, según se recomendaba por el fabricante, y se extrajo un conjunto similar de muestras de sangre venosa para medir las concentraciones de testosterona cuando el único método de incremento del flujo transdérmico usado eran los potenciadores de permeación química contenidos en el parche. Después de dos días más de período de lavado, se instalaron de forma similar dos parches de Androderm de 2,5 pero, previamente a la instalación, se formaban poros en la superficie de la piel, en las zonas elegidas como objetivo con 72 microporos por zona, midiendo cada poro aproximadamente 80 \mum de anchura y 300 \mum de longitud y se extendían hasta una profundidad de 80 a 120 \mum. Para la fase de suministro con poración se extrajo un conjunto similar de muestras de sangre venosa para medir la testosterona. Los datos de estos tres períodos de veinticuatro horas se muestran en la Fig. 35, titulada "Efectos de la microporación sobre el suministro transdérmico de testosterona". Una característica a destacar de estos datos es que, cuando están presentes las microporaciones, las concentraciones de testosterona en la sangre del sujeto se elevan mucho más rápidamente, precediendo esencialmente al límite ascendente del ciclo sin poración en más de cuatro horas. Observando la pendiente y el área bajo la curva, se puede calcular que se producía un incremento de más de tres veces en la velocidad de flujo, debido a las microporaciones durante las primeras cuatro horas.

Ejemplo 51

Suministro de Alprostadil: El Alprostadil, o PGE1, es una prostaglandina usada terapéuticamente para tratar la disfunción eréctil masculina a través de su comportamiento como vasodilatador. El modo de suministro estándar para este fármaco es una inyección directa en la base del pene o a través un supositorio insertado en la uretra. Se realizó una serie de experimentos con dos voluntarios masculinos sanos. Cada sujeto tenía una zona de 1 cm cuadrado en la base del tronco del pene preparada mediante formación de 12 a 36 microporos en este área, con los parámetros de poración térmica fijados para crear poros de aproximadamente 100 micrones de profundidad, medida desde la superficie de la piel. Se colocó una solución concentrada de alprostadil en un pequeño depósito de un parche colocado sobre la zona de poración, luego se colocó un transductor ultrasónico en la superficie del depósito y se activó, y se registraron las respuestas eréctiles y otras respuestas clínicas en cinta de vídeo. Ambos sujetos desarrollaron una cantidad significativa de congestión del pene, estimada como la consecución de 70% o más de una erección completa, a la dosis aplicada. Además, se observó un flujo malar rápido hasta las concentraciones sistémicas del fármaco suministrado. Durante un período de suministro de 30 a 60 minutos, ambos sujetos desarrollaron un flujo malar rápido profundo que se extendía desde la cara, cuello, pecho y brazos. Tanto la respuesta eréctil como el flujo malar rápido proporcionan evidencia del suministro de una cantidad clínicamente activa del fármaco, un vasodilatador bien conocido.

Ejemplo 52

Suministro de interferón: Los interferones son proteínas de aproximadamente 17-22.000 de peso molecular, que se administran clínicamente para tratar diversas enfermedades, como infecciones víricas (p.ej. hepatitis B y C), enfermedades inmunológicas (como esclerosis múltiple), y cánceres (p.ej., leucemia por tricoleucitos). Debido a su naturaleza proteica, los interferones se tienen que administrar actualmente mediante inyección, ya que no se pueden suministrar oralmente y son demasiado grandes para los métodos de suministro transdérimicos o transmucosos tradicionales. Para demostrar el suministro de un interferón a través de la técnica de microporación, se aplica una alícuota de 100 microlitros de solución de alfa-interferón que contiene interferón con una actividad específica de 100 millones de unidades internacionales de interferón por mg disuelto en 1 ml de solución de suministro, a un área de 1 cm cuadrado de piel con poros formados hasta una profundidad de 150-180 \mum, siendo deficiente por tanto en lecho capilar, sobre el muslo de un sujeto humano sano. Se realizaron las pruebas usando, bien puramente difusión pasiva y con la aplicación de energía sónica a la región a una amplitud suficiente, y modulación de la misma para acelerar la migración del interferón a través de los poros hacia el interior o a través de los tejidos subyacentes, sin producir calentamiento deletéreo de la solución de interferón. Se realizan extracciones de sangre venosa a diversos intervalos de tiempo para ambas pruebas, y se ensayan para las concentraciones de interferón, usando radioinmunoensayo y bioensayo. Se detecta el interferón en el suero durante el período de tiempo de 4 horas analizado. Las concentraciones de interferón para el experimento de suministro incrementado mediante energía sónica se detectaron antes que para el experimento pasivo. En otro experimento, el interferón se administra en forma de polvo seco directamente a los microporos en el área de la piel en la que se han formado poros. El interferón se detecta en el suero usando las mismas técnicas descritas anteriormente. En otra prueba, la solución de interferón se aplica en un gel, con o sin una película de soporte, al tejido de la mucosa bucal en el que se han formado poros. La sangre venosa se extrae y analiza para las concentraciones de interferón. El interferón se detecta en el suero durante el período de tiempo de 3 horas analizado. En otro experimento, el interferón se incorpora en un comprimido que contiene una matriz bioerosionable, con una matriz de polímero mucoadherente que proporciona el contacto del comprimido a través del área de la mucosa bucal en la que se han formado poros. El interferón se detecta en el suero usando las mismas técnicas descritas anteriormente.

Ejemplo 53

Suministro de morfina: Se aplica una solución de morfina a un área en la que se han formado poros sobre el antebrazo palmar de sujetos humanos. Se usa un gradiente de presión positiva para proporcionar una velocidad de suministro basal de la morfina al interior del cuerpo, según se determinó mediante el análisis de extracciones de sangre venosa a intervalos de tiempo apropiados, para la presencia de morfina. Se consigue una concentración basal de morfina de aproximadamente 3-6 ng/ml. Bajo demanda, se aplica una inyección instantánea a presión adicional, para producir un pico en el suministro de morfina. La inyección instantánea a presión adicional se consigue en una prueba mediante el uso de ultrasonidos, o, en otro experimento, mediante el uso de un pico de presión. Este tipo de suministro, en el que se aplica de forma continua una concentración basal de morfina, con picos en el suministro de morfina periódicamente bajo demanda, es útil para tratar el dolor crónico e intercurrente.

Ejemplo 54

Suministro de un DNA resistente a una enfermedad, a una planta: Se forman microporos en las semillas de una planta de maíz seleccionada. Las semillas se colocan en una solución de una formulación de permeante que contiene DNA que codifica proteínas de resistencia a una enfermedad. Se usa opcionalmente energía sónica para favorecer el suministro del DNA a las semillas de maíz. Las semillas se germinan y hacen crecer hasta la madurez. Las semillas resultantes de las plantas de maíz maduras llevan ahora el gen resistente a la enfermedad.

Ejemplo 55

Suministro de DNA a una planta: Se forman microporos en las semillas de una remolacha azucarera. Las semillas se colocan en una solución de una formulación permeante que contenía DNA que codifica la hormona de crecimiento humana. Se pueden usar electroporación, iontoforesis, energía sónica, potenciadores, así como la estimulación mecánica de la zona, como presión, para favorecer el suministro del DNA a las semillas. Las semillas se hacen germinar y crecer hasta la madurez. La planta de remolacha madura resultante se puede recolectar entonces y extraerse la hormona de crecimiento humana para su posterior purificación y uso clínico.

Ejemplo 56

Se realizó un experimento en el que se aplicaban partículas de dextrano fluorescentes, de peso molecular aproximadamente 10.000 Daltons, en una solución acuosa, mediante un parche con depósito sobre un cm cuadrado de piel sobre el antebrazo palmar de un sujeto humano, en el que se formaron 36 microporos que se extendían aproximadamente a una profundidad de 80 \mum. El parche con depósito se mantuvo en su sitio durante 5 minutos. Se obtuvo una imagen de la zona en la que se formaban los poros y el área circundante con un vídeomicroscopio fluorescente, para evaluar la penetración del permeante en el tejido. La fluorescencia mostraba que en 5 minutos, se producía una permeación de dextrano significativa, separada más de 2 mm del microporo más próximo. El sistema de ensayo de vídeo usado 10 minutos después, mostraba una difusión mayor, de forma que el flujo de fluido fluorescente se extendía 10 mm desde los poros. El experimento proporciona una evidencia clara de que esta técnica permite el suministro de permeantes con pesos moleculares de 10.000.

Claims (37)

1. \global\parskip0.910000\baselineskip

   1. Un sistema para suministrar un permeante a un organismo que comprende:

   medios para destruir la piel del organismo en un área seleccionada para formar una pluralidad de microporos, teniendo cada microporo 1-1000 \mum de diámetro y extendiéndose hasta una profundidad deseada por debajo de una capa epidérmica de la piel, comprendiendo dichos medios de destrucción una sonda calentada eléctricamente (186) en comunicación operativa con unos medios para modular la temperatura de dicha sonda calentada eléctricamente, entre un estado de temperatura elevada y un estado de temperatura reducida (178), estando colocada dicha sonda calentada eléctricamente en contacto directo con una zona del área seleccionada de la piel;

   un depósito (308) que contiene el permeante, estando dimensionado dicho depósito para su colocación cubriendo la pluralidad de microporos formados;

   en el que, en el estado de temperatura elevada, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere conductivamente energía térmica hasta la zona de la piel en contacto, hasta elevar la temperatura de la piel subyacente a la zona de contacto para destruir una zona de la piel hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica, y en el que, en el estado de temperatura reducida, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere menos energía térmica a la piel que la que se requiere para destruir la zona de piel; y

   medios de control de la impedancia para ajustar el cambio en impedancia eléctrica de dicha sonda calentada eléctricamente en respuesta a la temperatura de dicha sonda calentada eléctricamente, estando acoplados operativamente dichos medios de control de la impedancia a dichos medios de modulación, para modular la corriente suministrada a dicha sonda calentada eléctricamente, de forma que la sonda calentada eléctricamente se mantiene en el estado de temperatura elevada durante un espacio de tiempo deseado.
2. 2. El sistema de la reivindicación 1, en el que la capa epidérmica es la capa del estrato córneo de la piel.
3. 3. El sistema de la reivindicación 1, en el que la profundidad de los microporos se extiende al menos hacia el interior de la capa de células viables de la piel.
4. 4. El sistema de la reivindicación 1, en el que la profundidad del microporo está entre aproximadamente 100 micrones y aproximadamente 300 micrones.
5. 5. El sistema de la reivindicación 1, en el que la profundidad del microporo está entre aproximadamente 180 micrones y aproximadamente 300 micrones.
6. 6. El sistema de la reivindicación 1, en el que la profundidad del microporo esta entre aproximadamente 20 micrones y aproximadamente 100 micrones.
7. 7. El sistema de la reivindicación 1, en el que la profundidad del microporo es superior a aproximadamente 110 micrones.
8. 8. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos medios de modulación comprenden un bucle de corriente modulador (182), que modula la corriente suministrada a dicha sonda calentada eléctricamente, de forma que dicho elemento sólido se mantiene sustancialmente en el estado de temperatura elevada durante menos de aproximadamente 20 milisegundos, para reducir la sensación para el organismo y minimizar el volumen de tejido afectado por la energía térmica transferida.
9. 9. El sistema de la reivindicación 8, en el que, en el estado de temperatura reducida, el bucle de corriente moduladora elimina corriente de dicha sonda calentada eléctricamente.
10. 10. El sistema de la reivindicación 1, en el que dichos medios de modulación comprenden un campo magnético modulador, excitándose selectivamente el campo para producir corrientes eléctricas inducidas en dicha sonda calentada eléctricamente, de forma que dicha sonda calentada eléctricamente se mantiene sustancialmente en el estado de temperatura elevada durante menos de aproximadamente 20 milisegundos, para reducir la sensación para el organismo y minimizar el volumen de tejido afectado por la energía térmica transferida.
11. 11. El sistema de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medios para detectar cuándo la destrucción de la piel ha formado la pluralidad de microporos hasta la profundidad deseada en la piel.
12. 12. El sistema de la reivindicación 11, en el que dichos medios de detección comprenden un medio para medir los cambios en la impedancia eléctrica de la piel, a medida que se forma la pluralidad de microporos.
13. 13. El sistema de la reivindicación 12, en el que la impedancia eléctrica que se está midiendo es una impedancia compleja.
14. 14. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además medios para enfriar el área seleccionada de la piel, de forma que el área seleccionada esté en un estado enfriado.
15. 15. El sistema de la reivindicación 1, en el que el permeante se selecciona del grupo formado por un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un antígeno vacunal, un analgésico y un fármaco de molécula pequeña.
16. 16. El sistema de la reivindicación 15, en el que el ácido nucleico es DNA o RNA.
17. 17. El sistema de la reivindicación 1, en el que el permeante se selecciona del grupo que consiste en insulina, interferón, un aditivo y heparina.
18. 18. El sistema de la reivindicación 1, en el que el permeante tiene un peso molecular de al menos 10.000.
19. 19. El sistema de la reivindicación 1, en el que el permeante está asociado con un vehículo.
20. 20. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo comprende liposomas.
21. 21. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo comprende complejos lipídicos.
22. 22. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo comprende micropartículas.
23. 23. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo comprende compuestos de polietilenglicol.
24. 24. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo comprende una matriz polímera.
25. 25. El sistema de la reivindicación 24, en el que la matriz polímera es bioerosionable.
26. 26. El sistema de la reivindicación 1, en el que el permeante comprende una formulación seca.
27. 27. El sistema de la reivindicación 26, en el que la formulación seca es un polvo.
28. 28. El sistema de la reivindicación 27, en el que la sustancia bioactiva se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, analgésicos, antígenos vacunales, DNA o RNA.
29. 29. El sistema de la reivindicación 19, en el que el vehículo es una micropartícula.
30. 30. El sistema de la reivindicación 29, en el que las micropartículas comprenden una sustancia bioactiva.
31. 31. El sistema de la reivindicación 30, en el que la sustancia bioactiva se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, analgésicos, antígenos vacunales, DNA o RNA.
32. 32. El sistema de la reivindicación 30, en el que el DNA o RNA está desnudo, fragmentado, acoplado a un plásmido, acoplado a un vector vírico, encapsulado, o acoplado a otra sustancia.
33. 33. El sistema de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente

    medios para detectar cuándo la destrucción de la piel ha formado al menos un microporo hasta la profundidad deseada en la piel (250),

    en el que dichos medios de detección comprenden un medio para medir cambios en la impedancia eléctrica de la piel a medida que se forma al menos un microporo, y en el que dichos medios de detección están acoplados operativamente a los medios de destrucción, para discontinuar la destrucción de la piel cuando el microporo alcanza la profundidad deseada.
34. 34. El sistema de la reivindicación 33, en el que la impedancia eléctrica que se está midiendo es una impedancia compleja.
35. 35. El sistema de la reivindicación 34, en el que la impedancia compleja se mide a una frecuencia seleccionada para resaltar las propiedades de impedancia de los tejidos seleccionados.
36. 36. El sistema de la reivindicación 33, en el que dichos medios de destrucción comprenden una sonda calentada eléctricamente (186), en comunicación operativa con medios para modular la temperatura de dicha sonda calentada eléctricamente entre un estado de temperatura elevada y un estado de temperatura reducida, estando colocada dicha sonda calentada eléctricamente en contacto directo con una zona del área seleccionada de la piel, en el que, en el estado de temperatura elevada, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere conductivamente energía térmica a la zona de contacto de la piel, para elevar suficientemente la temperatura de la piel subyacente a la porción de contacto, para destruir una parte de la piel hasta una profundidad deseada por debajo de la capa epidérmica y, en el que, en el estado de temperatura reducida, dicha sonda calentada eléctricamente transfiere conductivamente menos energía eléctrica a la piel, que la que se requiere para destruir la zona de la piel.
37. 37. El sistema de la reivindicación 33, en el que los medios de destrucción comprenden un medio para aplicar ráfagas o pulsos cortos de corriente eléctrica a la piel para formar los microporos.