JP2001512329A - 生物活性薬剤送達のための組織微穿孔 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物の皮膚もしくは粘膜または植物の外層を含む生体膜の、浸透性物質に対す浸透率を増強する方法が、選択された深度の微細穿孔化、ならびに必要に応じて、１つ以上の音波、電磁性、機械、および熱エネルギー、および化学的エンハンサーを利用して記載される。微細穿孔は、生体膜において選択された深度の微細穿孔を形成して達成され、そして穿孔部位は、浸透性物質と接触される。さらなる浸透増強測定は、微細穿孔を介する生物へのならびに生物内の標的組織への浸透性物質の両方の流動速度を増強するように部位に適用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 生物活性薬剤送達のための組織微穿孔 発明の背景 本発明は、一般には、薬物または生物活性分子の生物への経膜送達の分野に関 する。より詳細には、本発明は、皮膚、粘膜または植物の外層の微細穿孔により この生体膜の透過性を増加させる、最小限の侵襲から非侵襲である方法に関し、 これは、生物内への、および一旦生物内へ入るとその内部の組織の選択された領 域内への生物活性分子の流動速度を選択的に増強するために、音波エネルギー、 電磁気的、および温度エネルギー、化学的浸透エンハンサー、圧力などと組合さ れ得る。 角質層は、皮膚の周知の障壁特性を主に担う。従って、この層が、薬物または 他の分子の身体内への経皮流動および分析物の身体外への経皮流動に対する最大 の障壁を提示する。皮膚の外側の角質の層である角質層は、脂質ドメインにより 分離された緻密に角質化した細胞残遺物の複雑な構造である。口腔粘膜または胃 粘膜に比較して、角質層は身体に対して外部または内部いずれかの分子に対して もかなり浸透性が劣る。角質層はケラチノサイトから形成される。ケラチノサイ トは、表皮細胞の大部分を構成し、核を失い、そして角質細胞になる。これらの 死んだ細胞は、わずか約10〜30μmの厚みを有し、上記のように、非常に耐性の 防水性の膜である、角質を構成する。この膜は、外部の物質による侵襲から身体 を保護し、そして流体および溶解した分子の外向きの移動を防ぐ。角質層は、剥 離の間の角質細胞の脱落および角質化プロセスによる新たな角質細胞の形成によ り間断なく再生される。 角質層の下は、表皮の生存細胞層および真皮または結合組織層がある。これら の層は共に皮膚を形成する。これら下の層（生存細胞層および真皮）の微細穿孔 は以前は使用されなかったが、経皮流動を増強し得る。真皮の深部には身体の基 礎をなす構造があり、脂肪、筋肉、骨などを含む。 粘膜の微細穿孔は以前は使用されなかった。粘膜は一般に角質層を欠く。最も 表面の層は、生存細胞の多くの層からなる上皮層である。上皮層の深部には固有 層または結合組織層がある。 植物の微細穿孔は、実験室設定における個々の細胞への選択された適用に以前 は制限されてきた。植物という生物は、一般に、自然力および疾患に対する耐性 を提供する堅固な外部層を有する。植物のこの堅固な外部層の微細穿孔は、植物 中への導入に有用な物質の送達（例えば、植物に所望の形質を付与するため、ま たは所望される物質の産生のため）を可能にする。例えば、植物の各々の細胞が 特定かつ有用なペプチド（例えば、ホルモンまたはヒトインシュリン）を発現す るように、植物は処置され得る。 生体膜を横切る薬物または分析物の流動性は、抵抗（拡散係数）または駆動力 （拡散のための勾配）のいずれかを変化させることにより増加され得る。流動性 は、いわゆる浸透エンハンサーまたは化学的エンハンサーの使用により増強され 得る。化学的エンハンサーは、当該分野で周知であり、そしてより詳細な記載を 以下に記す。 薬物に対する皮膚の浸透性を増加する別の方法は、イオン導入法（イオントホ レシス）である。イオン導入法は、外部電場の適用およびイオン化形態の薬物ま たはイオン輸送に伴う水の流動と伴に運搬される非イオン化薬物の局所送達（電 気浸透）を含む。イオン導入法による浸透増強は効果的であったが、薬物送達の 制御および不可逆的な皮膚の損傷がこの技術に伴う問題である。 音波エネルギーもまた、薬物および他の分子に対する皮膚および合成膜の浸透 性を増強させるために使用されてきた。超音波は、20kHzより大きい周波数を有 する機械的な圧力の波として定義されてきた(H．Lutzら、Mannual of Ultrasoun d 3-12(1984))。音波エネルギーは、圧電結晶または他の電気機械的素子に交流 電流を通過させることによってこの物質を振動させることにより生成される(R． Brucksら、6 Pharm ．Res．697(1989))。薬物分子に対する皮膚の浸透性を増加さ せるための音波エネルギーの使用は、音波泳動法（ソノホレシスまたはホノソレ シス）と名付けられている。 皮膚の浸透性を増強することにより、理論的には、回収またはモニタリングの ために、身体内から皮膚を通して身体外に分子を輸送することを可能にするはず であると考えられてきたが、実施可能な方法は開示されていない。Stanleyらの 米国特許第5,139,023号は、非侵襲的な血中グルコースモニタリングのための装 置および方法を開示する。この発明では、グルコースに対する粘膜組織または皮 膚の浸透性を増加させるために化学的浸透エンハンサーが使用される。次いで、 グルコースは、粘膜組織または皮膚を通して受動的に拡散し、そして受容媒体中 に捕捉される。受容媒体中のグルコースの量が測定され、そして血中グルコース レベルを決定するために相関付けられる。しかし、Stanleyらにおいて教示され るように、この方法は、粘膜組織（例えば、頬側組織）において用いられる場合 、より一層効果的であり、検出可能な量のグルコースが、約10〜20分の遅延時間 後に受容媒体に回収される。しかし、Stanleyらにより教示される方法は、検出 可能な量のグルコースが、インビトロでヒト皮膚（熱分離された表皮）を通して 拡散して検出され得る前に、用いられる化学的増エンハンサー組成物に依存して 、２〜24時間の範囲に及ぶ非常に長い遅延時間を生じる。これらの長い遅延時間 は、皮膚を通して受動的に拡散し、かつ障壁角質層の浸透性を増強するために化 学的浸透エンハンサーが必要とする時間の長さ、ならびに皮膚を通して受動的に 拡散するためにグルコースが必要とする時間の長さに起因し得る。従って、Stan leyらは、明らかに、糖尿病患者の血中グルコースモニタリングのためおよび血 中電解質のような多くの他の身体内分析物のモニタリングのために要求されるよ うな迅速なモニタリングを可能にする様式で、皮膚を通して血中グルコースまた は他の分析物を非侵襲的に輸送するための方法を教示していない。 薬物送達のための音波エネルギーの使用が知られているが、多くは浸透性の増 強が比較的低かった点において期待に反する結果となっている。皮膚を横切る薬 物流動を増加させるための音波エネルギーの効力に関する意見の一致はない。い くつかの研究が音波泳動法の成功を報告している(J．Davickら、68Phys．Ther． 1672(1988);J．Griffinら、47Phys．Ther．594(1967);J．GriffinおよびJ．Touc hstone，42 Am．J．Phys．Med．77(1963);J．Griffinら、44Am．J．Phys．Med． 20(1965);D．Levyら、83 J．Clin．Invest．2074;D．Bommannanら、9 Pharm．Re s．559(1992))が、他は否定的な結果を得ている(H．Bensonら、69Phys．Ther．1 13(1988);J．McElnayら、20Br．J．Clin．Pharmacol．4221 (1985);H．Pratzelら、13 J．Rheumatol．1122(1986))。齧類の皮膚が用いられ た系は、最も期待できる結果を示したが、ヒト皮膚が用いられた系は、一般に, 期待に反する結果を示している。齧歯類の皮膚はヒト皮膚よりもずっと浸透性が 高いことが当業者に周知であり、従って上記の結果は、ヒト皮膚を通じる経皮的 送達および/またはモニタリングに適用される場合の、音波泳動法の効果的な利 用法を当業者に教示していない。 分析物のモニタリング、およびまた身体への薬物送達における超音波エネルギ ーの使用における有意な改善が、同時係属中の1993年11月15日に出願された米国 特許出願第08/152,442号（現在の米国特許第5,458,140号）、および1993年12月 ８日に出願された米国特許出願第08/152,174号（現在の米国特許第5,445,611号 ）に開示されそして特許請求の範囲に記載される（これら両方とも本明細書中に 参考として援用される）。これらの発明において、分析物の経皮サンプリングま たは薬物の経皮送達は、強度、位相、もしくは周波数、またはこれらパラメータ ーの組合せにおいて調整される音波エネルギーの、化学的浸透エンハンサーの使 用と組み合わた使用により達成される。ニードル穿孔、水力学的噴射、レーザー 、エレクトロポレーション、または他の方法により導入される穿孔を介して角質 層を通して制御可能に分子を押し込み、そして/または汲み上げるために、必要 に応じて、周波数、強度、および/または位相を調整する音波エネルギーの使用 もまた開示される。 薬物の送達を増強するための角質層における微細孔の形成（すなわち、微細穿 孔）は、種々の研究の主題であって、そしてこのような技術の特許の発行に至っ た。 Jacquesら（88 J ．Invest．Dermatol．88-93(1987)）は、下にある表皮を有意 に損傷することなく角質層を切除するために十分な波長、パルス長、パルスエネ ルギー、パルス数、およびパルス反復率を有するパルスレーザー光を用いて皮膚 のある領域の角質層を切除し、次いで切除した領域に薬物を付与することにより 薬物を投与する方法を教示する。この研究は、Jacquesらへの米国特許第4,775,3 61号の発行に至った。紫外レーザー照射の使用による皮膚の切除は、Laneら、12 1 Arch．Dermatol．609-617(1985)によってより以前に報告された。Jacquesら は、光の少数の波長および高価なレーザーの使用に制限される。 Tankovich（米国特許第5,165,418号（以下、「Tankovich'418」））は、皮膚 組織を蒸発させるに十分なエネルギーの１つ以上のレーザーパルスをヒトまたは 動物の皮膚に照射して皮膚に表皮を通して伸びる穴を開け、そして少なくとも１ つの血管を切断し、所定量の血液がその穴を通してそれが回収され得るように放 出させることにより血液サンプルを得る方法を開示する。従って、Tankovich'41 8は、薬物が身体に送達され得るかまたは身体からの分析物が分析され得るよう な、角質層の非侵襲性または最小限侵襲性である浸透化処理としては不適切であ る。 Tankovichら、米国特許第5,423,803号（以下、「Tankovich'803」）は、美容 的適用にためのヒト皮膚における表在性表皮皮膚細胞のレーザー除去法を開示す る。この方法は、表皮外層に光吸収性「混入物質」を付与する工程、およびこの 混入物質のある量を角質層の細胞内空間中にもしくはこれを通じて押し入れる工 程、ならびに、混入物質により吸収されたエネルギーの量がいくつかの表皮皮膚 細胞を引き剥がすに十分なエネルギーで混入物質を爆発させる十分な強度のレー ザー光のパルスを浸潤された皮膚に照射する工程を包含する。Tankovich'803は さらに、レーザービームのその波長において混入物質によるエネルギーの高い吸 収があるべきであること、レーザービームが１μsより短い持続時間のパルスビ ームでなければならないこと、混入物質が表皮の上層中にもしくはこれを通じて 押し入れられねばならないこと、および混入物質がレーザーエネルギーの吸収に より表皮細胞を引き剥がすに十分なエネルギーで爆発しなければならないことを 教示する。この発明もまた、薬物送達または分析物回収の方法を開示も示唆もし ていない。 RavenらのWO92/00106は、波長750〜860nmの赤外線に対して高度に吸収性であ る化合物を、選択された組織に投与し、そしてその領域に、対応する赤外線を、 化合物が投与された組織の熱気化が起こるに十分であるが化合物が投与されなか った組織の気化が起こるには不十分なパワーで照射することにより、身体から非 健康的な組織を選択的に除去する方法を記載する。この吸収性化合物は、（例え ば、インドシアニングリーン、クロロフィル、ポルフィリン、ヘム含有化合物、 またはポリエン構造を含む化合物のように）水または血清に可溶であるべきであ り、そしてパワーレベルは、50〜1000W/cm²の範囲にあるかまたはこれよりさら に高い。 KonigらのDD259351は、赤外および/または近赤外スペクトル領域において放射 を吸収する媒体を腫瘍組織中に沈着させる工程、および浸潤された組織に適切な 波長のレーザー光を照射する工程を包含する腫瘍組織の熱処理のためのプロセス を教示する。吸収性媒体は、メチレンブルー、還元ポルフィリンまたはその凝集 体、およびフタロシアニンブルーを含み得る。600〜700nmに強い吸収のあるメチ レンブルー、および647nmおよび676nmで発光するクリプトンレーザーが例示され る。パワーレベルは、少なくとも200mW/cm²であるべきである。 同じ部位へセロハンテープの付与および除去を繰り返すことによって、角質層 を、皮膚の小さい領域からはぎ取ることにより、任意の量の間質液を容易に回収 し得、この間質液は次いで多数の目的の分析物についてアッセイされ得ることが 示されている。同様に、「テープをはぎ取られた」皮膚はまた、化合物の身体内 への経皮送達に対して浸透性であることが示されている。不運にも、「テープは ぎ取り」は、開放性のただれを残し、これは治癒するのに何週間もかかり、そし てこの理由および他の理由により、広範な適用における経皮的輸送を増強するた めに受容可能な実施であるとは考えられていない。 上記のように、パルスレーザー（例えば、193nmで作動するエキシマーレーザ ー、2.9μm近くで作動するエルビウムレーザー、または10.2μmで作動するCO₂レ ーザー）は、ヒトの角質層に小さな穴を効果的に切除するために用いられ得るこ とが示されてきた。これらのレーザー切除技術は、送達穴および/またはサンプ リング穴を角質層を通して開けるための選択的でそして潜在的に非外傷性の方法 に対する可能性を提供する。しかし、これらの光源に関連する法外に高いコスト のために、この概念に基づいて開発された市販の製品は存在していない。本明細 書中で開示される発明は、非常に緊密に規定された空間的および時間的解像度で 生体膜中にもしくはこれを通して熱エネルギーを直接伝導する方法を規定するこ とにより、非常に低コストのエネルギー源を用いて生体膜の所望の微小切除を作 製することを可能にする。 前述の問題および/または欠陥を考慮すると、より迅速な時間フレームで身体 の分析物を最小限侵襲的または非侵襲的にモニタリングするために生体膜の浸透 性を安全に増強する方法の開発は、当該分野において著しい進歩であり得る。生 物の選択された領域中に薬物への経皮流動速度を最小限侵襲的にまたは非侵襲的 に増強する方法を提供することは、当該分野における別の著しい進歩であり得る 。 薬物および他の化合物の送達における著しい発展は、生体膜（例えば、皮膚ま たは粘膜）の浸透性を増加させる種々の技術の使用を通じてなされている。より 一層見込みのある進歩は、前記した出願で開示されるように、微細孔を作製する ための技術を通じてなされた。 それにもかかわらず、生体膜の選択された深部での微細孔を形成することによ ってこれらの技術を改良すること、および分子量およびサイズに関して小さな化 合物および大きな化合物の両方を、微細孔を通じて身体内へ送達することが所望 される。 発明の要旨 本発明は、生物の選択された部位への浸透物の経膜流動速度を増強するための 方法を提供する。この方法は、（ａ）生体膜に微細孔を形成する手段により、選 択された部位で生体膜を穿孔し、これにより浸透物の流動性に対する生体膜の障 害特性を減少させること、および（ｂ）穿孔された選択部位と有効量の透過物を 含む組成物とを接触させ、これにより生物内への浸透物の経膜流動速度が増強さ れることによりにより浸透物に対する生物の選択された部位の浸透性を増強する 工程を包含する。 本発明は、生物中への浸透物の流動性を増加させるためのエンハンサーを生物 の部位へ適用する工程をさらに含む、経膜流動速度を増強する方法をさらに提供 する。本発明はまた、エンハンサーが音波エネルギーを含む方法、そしてより詳 細には、音波エネルギーが約10Hzから1000MHzの範囲の周波数で部位に適用され 、そしてその音波エネルギーは、周波数変調、振幅変調、位相変調、およびそれ らの組合せからなる群から選択されるメンバーにより調整される方法を提供する 。あるいは、エンハンサーは、電磁場（より詳細にはイオン導入法）または磁場 、 または機械的な力、化学的エンハンサー、また熱エンハンサーを含む。さらには 、本発明は音波増強、電磁場増強、機械的増強、熱増強、または化学的増強のい ずれかが、それらの任意の組合せで、微細孔中へのまたは微細孔を通じての浸透 物の経膜流動速度を増加させるために、適用され得る方法をさらに提供する。 本発明はまた、エンハンサーを用いて経膜流動速度をさらに増強する方法を提 供し、ここで、部位でのエンハンサーは、微細孔周辺の組織への浸透物の流動速 度を増加させるために適用される。このエンハンサーは音波エネルギーを含み得 る。さらに、音波エネルギーは、約10Hzから1000MHzの範囲の周波数で部位に適 用され、そして音波エネルギーは、周波数変調、振幅変調、位相変調、およびそ れらの組合せからなる群から選択されるメンバーにより調整される。あるいは、 エンハンサーは、音波もしくは熱エネルギー、エレクトロポレーション、イオン 導入、化学的エンハンサー、機械力、または磁場、あるいはこれらの任意の組合 せを含む。 本発明は、生物の該部位へのエンハンサーの適用をさらに含む、浸透物の経膜 流動速度を増強する方法をさらに含み、ここで音波もしくは熱エネルギー、エレ クトロポレーション、イオン導入法、化学的エンハンサー、機械力、または磁場 の方法の任意の方法が、これらの任意の組合せ（音波もしくは熱エネルギー、エ レクトロポレーション、イオン導入法、化学的エンハンサー、機械力、または磁 場を組み合わせる方法をさらに含む）で、微細孔周辺の組織への浸透物の流動速 度を増強するためにこれらの任意の組合せが適用され得る。 本発明はまた、外層内および外層下で経膜流動速度をさらに増強する方法を含 み、ここで、部位での生体膜の穿孔は、以下からなる群から選択される手段によ り達成される：（ａ）微細孔が生体膜に部位で形成されるように、生体膜の部位 （約1000μmまでにわたって）を熱源に接触させることによる生体膜の除去；（ ｂ）直径約1000μmまでの微細孔を形成するために、目盛りが付けられたマイク ロランセットを使用した生体膜の剌孔形成；（ｃ）直径約1000μmまでの生体膜 上への音波エネルギーのビームによる、の生体膜の除去；（ｄ）直径約1000μm までの微細孔を形成するために流体の高圧噴射を使用した、生体膜の力学的刺孔 ；および（ｅ）直径約1000μmまでの微細孔を形成するために短い電気パルス を使用した生体膜の刺孔。さらに、本発明は、部位へ効果的な量の熱エネルギー を伝導的に転移させるために、熱源を部位と（約1000μmまでにわたる）に接触 させ、その結果、該部位のいくらかの水および他の気化性物質の温度がそれらの 沸点を超えて上昇し、生体膜の該部位に選択された深さに微細孔を形成すること により穿孔を達成する方法を含み、または、部位へ効果的な量の熱エネルギーを 伝導的に転移させるために熱源を部位（約1000μmまでにわたって）接触させ、 その結果、該部位のいくつかの組織の温度が、熱分解を生じる温度まで上昇し、 生体膜の該部位に選択された深さに微細孔を形成することにより穿孔を達成する 方法を含む。さらには、本発明は、これは、パルス光源の発光範囲にわたって十 分な吸光を示す有効量の物質で少なくとも該部位を処理する工程、およびパルス 光源からの一連のパルス出力を物質に集中させ、その結果、物質を、有効量の熱 エネルギーを生体膜に伝導的に転移させて温度を上昇させるに十分に加熱し、こ れにより微細孔を作製する工程をさらに包含する、該部位で生体膜を穿孔する方 法を含む。本発明はまた、パルス光源が、生体膜により有意に吸収されない波長 で発光する方法を含む。本発明は、パルス光源が約630〜1550nmの範囲で発光す るレーザーダイオードである方法、パルス光源が約700nm〜3000nmの範囲で発光 するレーザーダイオードポンピング光学パラメトリック発振機である方法、パル ス光源が、アークランプ、白熱ランプ、および発光ダイオードからなる群から選 択される部品である方法をさらに含む。本発明はまた、生体膜の微細孔がいつ所 望の大きさ（幅、長さ、および深さを含む）に達したかを決定するための検知シ ステムを提供する工程をさらに含む方法、そしてさらに、検知システムは、該部 位からの反射光を受容し、そして反射光を、光を受容し信号をコントローラー（ ここで、信号は光量を表示する）に送るための検出器に集中させるための光収集 手段、および信号を受容しそして予め選択された信号を受容した場合に光源を停 止させるために、検出器および光源に接続されたコントローラー、あるいは、微 細孔が形成された場合の、生物内の異なる深さでの生体膜の電気インピーダンス の変化を検出し得る電気インピーダンス計測システムを含む。 本発明はまた、前記部位および隣接組織を冷却することをさらに含む、外層の 中および真下の経膜流動速度を増強させるための方法を提供し、その結果、前記 部位および隣接組織が冷却状態となる。前記冷却手段は、ペルチェ素子(Peltier device)を含む。 本発明はまた、前記部位を穿孔する前に、少なくとも前記部位が滅菌されるよ うな光を使用して前記部位を照射することをさらに含む、外層の中および真下の 経膜流動を増強させるための方法を包含する。 本発明はまた、前記部位を固体エレメント（ここで、前記固体エレメントは、 有効量の熱エネルギーを前記生体膜へと伝導的に移して温度を上昇せ、それによ りマイクロプレートを作成する熱供給源として機能する）と接触させることをさ らに含む、外層の中および真下の経膜流動を増強させるための方法を包含する。 さらに、前記熱供給源は、前記部位の温度を約１０ナノ秒から５０ミリ秒以内に １００℃を超えるまでに、調節し、次いで、約１ミリ秒から５０ミリ秒以内のお およその周囲温度まで前記部位の温度を回復するために構築され、そしてこの昇 温サイクルおよび周囲温度までの回復サイクルは、所望の深さまで生体膜を穿孔 するために有効に１回以上繰り返される。本発明はさらに、前記部位のおおよそ の周囲温度までの前記回復が、前記部位との接触からの前記熱供給源の除去によ り実施され、そしてこの調節パラメーターが、動物被験体への感覚を減少させる ために選択される、熱供給源の使用方法を含む。 本発明は、前記部位および隣接組織を通して前記固体エレメントと前記生物体 との間の電気的インピーダンスをモニタリングするための手段、およびインピー ダンスにおいて付随する変化を生じる前記穿孔のような前記固体エレメントの位 置を前進させるための手段を提供することをさらに含む、熱供給源および検出シ ステムを使用して経膜流動速度を増強させるための方法を包含し、前記前進手段 は、選択されたインピーダンスが得られるまで、固体エレメントの加熱中に固体 エレメントが前記部位と接触するように固体エレメントを前進させる。さらに、 本発明は、前記固体エレメントを前記部位との接触から除去する手段をさらに含 み、ここで前記モニタリング手段は前記部位の表面の下にある選択された層を接 触させることに関連して、インピーダンスの変化を検出し得、そして前記固体エ レメントを前記部位との接触から除去するために前記除去手段に信号を送り得る 。 固体エレメント（ここで前記固体エレメントは、オームの加熱エレメントを通 して電流を送達することにより加熱され、そして、さらに、ここで前記固体エレ メントは、それが前記固体エレメントが電気伝導成分および前記固体エレメント の温度を含むように形成される）を使用して経膜流動速度を増強させるための方 法は、前記導電性エレメントを通して調整された電流を通過させることにより調 整される。さらに、本発明は、前記固体エレメントが、調整可能な磁場中に位置 づけされる方法を包含し、ここで磁場に電気を加えることで、固体エレメントを 加熱するために充分な電気的渦電流を生じる。 本発明はまた、直径約１０００μｍまでの微細穿孔を形成するために更正され たミクロ皮針による前記部位の穿刺により、直径約１０００μｍまでの微細穿孔 を形成するために前記部位へ向けられる音波エネルギーの電子線により、直径約 １０００μｍまでの微細穿孔を形成するために、高圧ジェットの液体による前記 生体膜の水力学的な穿刺により、またはあるいは、直径約１０００μｍまでの微 細穿孔を形成するために電気的短波動による前記生体膜の穿刺により穿孔が達成 される経膜流動速度を増強させる方法を含有する。 本発明は、浸透性物質の経膜流動速度を増強させる方法をさらに含み、ここで 前記浸透性物質は核酸を含む。より詳細には、本発明は、前記核酸がＤＮＡを含 むかまたは前記核酸がＲＮＡを含む方法を含有する。 本発明は、生体膜中の微細穿孔が、深さ１から３０ミクロンの範囲で生体膜の 外層部まで広がり、深さ１０から２００ミクロンの範囲で生体膜の外層部を通し て広がり、深さ１００から５０００ミクロンの範囲で生体膜の接合組織層まで広 がり、または深さ１０００から１００００ミクロンの範囲で生体膜の接合組織層 を通して広がる浸透性物質の経膜流動速度を増強させる方法をさらに包含する。 本発明は、微細穿孔が、選択される浸透性物質の所望の活性を促進するために 決定された深さまで生体膜を浸透する、浸透性物質の経膜流動速度を増強させる 方法をさらに含有する。 本発明は、浸透性物質の経膜流動速度を増強させる方法をさらに包含し、ここ で、浸透性物質がポリペプチドを含み、ここでポリペプチドはタンパク質または ペプチドであり、そしてここでポリペプチドはさらに以下を含む：インシュリン または放出因子；炭水化物（ここで炭水化物はヘパリンを含む）；鎮痛剤（鎮痛 剤はオピエート；ワクチン；またはステロイドを含む）。 本発明は、浸透性物質（浸透性物質はキャリヤー(carrier)に結合する）の経 膜流動速度を増強させるための方法をさらに包含する。本発明は、キャリヤーが リポソーム；脂質複合体；微細粒子；またはポリエチレングリコール化合物を含 む方法をさらに包含する。より詳細には、本発明は、浸透性物質が、浸透性物質 がキャリヤーと結合する方法との組合せのワクチンである方法をさらに包含する 。 本発明は、浸透性物質が生物体中に存在する分析物の近傍中の場合、刺激物に 対するその検出し得る応答を変化させる能力を有する物質を含む、浸透性物質の 経膜流動速度を増強させる方法をさらに包含する。 本発明の目的は、生体膜（角質層または皮膚の別の層を含む）、または植物の 粘膜または外層中の微小穿孔を通して身体内への、所望であれば、血流への、薬 物または他の分子の経膜流動速度を制御するための方法を提供することである。 音波エネルギー、浸透エンハンサー、圧力勾配、電磁気エネルギー、熱エネル ギーなどとを組み合せて、生体膜の穿孔を通して身体内へ薬物を送達する方法を 提供することは、本発明のさらに他の目的である。 本発明の目的は、生体膜の穿孔を通して身体内から分析物を制御可能に回収す るために穿孔を使用して生体膜の障壁特性を最小化し、これらの分析物のモニタ リングを可能にすることである。 音波エネルギー、浸透エンハンサー、圧力勾配、電磁気エネルギー、力学的エ ネルギー、熱エネルギーなどとを組み合せて、生体膜中の微細穿孔を通して体内 の選択された分析物をモニタリングする方法を提供することもまた、本発明の目 的である。 これらおよび他の目的は、個体の身体内の分析物の濃度をモニタリングするた めの方法を提供することにより達成され得る。この方法は、個体の身体表面の選 択された領域の生体膜の分析物に対する浸透性を、以下の手段により増強する工 程を包含する。 （a）下にある組織に重大な損傷を任意に起こさずに生体膜に微細穿孔を形成 し、それによって生体膜の分析物の回収に対する障壁特性を減少することにより 、選択された領域の生体膜を穿孔する工程； （b）分析物の選択された量を回収する工程；および （c）回収された分析物を定量する工程。 １つの別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、約５kHzから100MHz の範囲にある周波数で音波エネルギーを穿孔された選択領域に適用する工程をさ らに包含する。ここで、この音波エネルギーは、周波数変調、振幅変調、位相変 調、およびこれらの組合せからなる群より選択されるメンバーによって変調され る。別の好ましい実施態様では、本発明の方法は、個体の身体の選択された領域 を磁気エネルギ、熱エネルギー、力学的エネルギー、または音波エネルギーの適 用とともに化学的エンハンサーと接触させ、分析物回収をさらに増強する工程を さらに包含する。 生体膜の穿孔は、（a）約1000μmまでを横切って、生体膜の選択された領域を 、選択された領域において組織に結合した水および他の気化し得る物質の温度が 、水および他の気化し得る物質の沸点を超えて上昇し、それによって選択された 領域中の生体膜を除去するように熱供給源と接触させることにより生体膜を切除 する工程；（b）直径約1000μmまでの穿孔を形成するように較正された微小ラン セットで生体膜を穿孔する工程；（c）生体膜を、密接に焦点を合わせられた音 波エネルギーのビームを角質層上に焦点を合わせることにより切除する工程；（ d）流体の高圧ジェットで生体膜を水力学的に穿孔し、直径約1000μmまでの穿孔 を形成する工程、および（e）電気の短いパルスで生体膜を穿孔し、直径約1000 μmまでの穿孔を形成する工程、からなる群より選択される手段により達成され る。 生体膜を熱で切除する１つの好ましい実施態様は、少なくとも選択された領域 を、パルス光源の発光範囲にわたって強い吸収を示す有効量の色素で処置する工 程、およびパルス光源からの一連のパルスの出力を、色素上に、この色素が熱を 角質層に伝導的に移すために十分に加熱され、選択された領域で組織に結合した 水および他の気化し得る物質の温度を水および他の気化し得る物質の沸点を超え て上昇するように焦点を合わせる工程を包含する。好ましくは、パルス光源は、 皮膚により有意に吸収されない波長を放射する。例えば、パルス光源は、約630 から1550nmの範囲で発光するレーザーダイオード、約700nmと3000nmの範囲で発 光する光学パラメトリックス発振器で駆動されるレーザーダイオード、またはア ークランプ(arc lamp)、白熱電球、および発光ダイオードからなる群から選択さ れるメンバーであり得る。角質層の障壁性質が克服された場合、測定用の検出シ ステムもまた提供され得る。１つの好ましい検出システムは、選択された領域か ら反射された光を受け取りそして発光ダイオード上に反射された光の焦点を合わ せるための光収集手段、焦点を合わせられた光を受け取りそしてコントローラー に信号を送る発光ダイオードであって、シグナルが反射された光の質を示す、発 光ダイオード、および信号を受け取りそして予め選択されたシグナルが受け取ら れると、パルス光源を遮断するための発光ダイオードならびにパルス供給源に接 続されたコントローラーを備える。 別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、生体膜および隣接組織の選 択された領域を、穿孔の前、間、および／または後に、上記選択された領域およ び隣接組織が選択された冷却された定常状態条件であるように冷却手段で、冷却 する工程をさらに包含する。 なお別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、間質液が微細穿孔から 滲出するように生体膜を切除する工程、この間質液を回収する工程、および回収 された間質液中で分析物を分析する工程を包含する。間質液を回収した後、微細 穿孔は、レーザーダイオードまたは他の光源から有効量のエネルギーを、微細穿 孔中に残存する間質液が凝固させられるように付与することにより塞がれ得る。 好ましくは、真空が、間質液の回収を増強するために穿孔された選択された領域 に適用される。 なお別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、生体膜を穿孔する前に 、少なくとも選択された領域を光で照射し、この光で照射された選択された領域 が滅菌される工程を包含する。 生体膜を穿孔する別の好ましい方法は、選択された領域と、固体エレメントと を、選択された領域の温度が周囲温度から100℃を超えるまで約10〜50ms以内に 上昇するように接触させる工程、および次いで選択された領域の温度をほぼ周囲 温度まで約1〜50ms以内に戻す工程を包含し、ここで温度を上昇させる工程およ びほぼ周囲温度に戻す工程のこのサイクルは生体膜の障壁特性を減少させるため に効果的である複数回繰り返される。好ましくは、ほぼ周囲温度までに戻す工程 は、固体エレメントを生体膜との接触から引き離すことにより行われる。固体エ レメントと身体との間の電気的インピーダンスを、生体膜の選択された領域およ び隣接組織を通してモニタリングするための手段、および切除が抵抗の減少と同 時に起こるように固体エレメントの位置を進行させるための手段を提供すること もまた好ましい。ここでこの進行させるための手段は、固体エレメントの加熱の 間に固体エレメントが生体膜と接触するように固体エレメントを進行させる。さ らに、固体エレメントを生体膜との接触から引き離すための手段を提供すること もまた好ましく、ここで、モニタリング手段は、生体膜の下にある層またはその 層との接触に関連するインピーダンスの変化を検出し得、そして固体エレメント を生体膜との接触から引き離すための引き離し手段に、信号を送り得る。固体エ レメントは、オーム発熱エレメントにより加熱され得、高い抵抗点を有する電流 ループを有し得、ここで高い抵抗点の温度が、変調された電流を上記電流ループ を通して通過させて熱をもたらすことにより変調され、または励起コイルの変調 可能な交流磁場に、電流波腹点に交流を通過することにより固体エレメントを内 部のオーム損失により加熱するに十分な渦電流を発生するように配置され得る。 身体の選択された領域への活性な浸透物の経皮流動速度を増強する方法であっ て、以下の工程により、身体表面の選択された領域の生体膜層の活性な透過物に 対する浸透性を増大する工程を包含する。 （a）下にある組織に重大な損傷を任意に起こさずに生体膜に微細穿孔を形成 し、そしてそれにより活性な浸透物の流動性に対する生体膜の障壁特性を減少さ せる手段により、選択された領域の生体膜を穿孔する工程；および （b）穿孔された選択領域を、有効量の浸透物を含む組成物と、浸透物の身体 への流動性が増強されるように接触させる工程。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、穿孔された選択領域に流体のス トリーミング（streaming）効果を作成するのに効果的な時間および強度および 周波数でエネルギーを適用し、それにより浸透物の身体への経皮流動速度を増強 する工程をさらに包含する。 個体の身体表面の選択された皮膚領域に入れ墨(tatoo)を適用するための方法 がまた提供され、この方法は以下の工程： （a）下にある組織に重大な損傷を有意に起こさずに角質層に微細穿孔を形成 し、そしてそれにより浸透物の流動性に対する角質層の障壁特性を減少させる手 段により、選択された領域の角質層を穿孔する工程；および （b）インクの身体への流動性が増強するように、穿孔された選択領域を、有 効量の入れ墨用インクを含む組成物と接触させる工程、 を包含する。 個体の血液から、生体膜の選択された領域中の上記個体の間質液への分析物の 拡散において時間的な遅れを減少させるための方法がなおさらに提供され、この 方法は、冷却手段を上記選択された皮膚領域に適用する工程を包含する。 間質液の蒸発およびその蒸気圧を減少させる方法が、なおさらに提供され、こ こで上記間質液は個体の生体膜の選択された領域における微細穿孔から回収され 、上記選択された生体膜領域に冷却手段を適用する工程を包含する。 なおさらなる実施態様によれば、本発明は、皮膚または粘膜または植物の外層 のような生体膜中に選択された深さで形成される微細穿孔を通して身体へ生物活 性剤を送達するための方法に関する。本発明の方法は、当該分野で公知である任 意の穿孔技術による、生体膜の外層の穿孔を含むが、生体膜へのまたは生体膜を 通って、十分なそして所望である深さまでの穿孔を含み、そして低分子量または 高分子量およびサイズの有効量の生物活性剤により、穿孔された部位と接触する 工程を含む。このプロセスは、生物活性剤が送達される前、間、または後のいず れかのさらなる透過増強測定の適用により増強され得る。例えば、音波エネルギ ー、イオントフォレシス、磁場、エレクトロポレーション、化学的浸透エンハン サー、浸透圧および大気圧測定は、生体膜の外層の下層の透過度を増強するため に穿孔部位へ適用され得る。 図面のいくつかの図の簡単な説明 図１は、レーザーダイオード光を送達し、そして穿孔の進行をモニタリングす るためのシステムの概略を示す。 図２は、穿孔をモニタリングするための閉ループフィードバックシステムの概 略を示す。 図3Aは、冷却デバイスを備える光学的穿孔システムの概略を示す。 図3Bは、図3Bに従う例示的な冷却デバイスの概略の平面図を示す。 図４は、機械的アクチュエーターを有するオーム加熱デバイスの概略を示す。 図５は、高抵抗電流ループ加熱デバイスの概略を示す。 図６は、誘導性加熱を用いる加熱を変調するためのデバイスの概略を示す。 図７は、インピーダンスの変化を使用して穿孔の程度を決定する、閉ループイ ンピーダンスモニターの概略を示す。 図8A〜Dは、フタロシアニン銅で処理をし、次いで、20msのパルス周期の間に4 000J/cm²のエネルギー密度で、それぞれ、０、１、５、および50パルスの810nm 光を受けたヒト皮膚の断面を示す。 図９〜11は、光学的穿孔を用いるシュミレートされた熱穿孔事象の間の温度分 布のグラフ表示を示す。 図12および13は、光学的穿孔を用いるシュミレートされた熱穿孔事象の間の、 角質層および生存表皮のそれぞれにおける時間の関数としての温度のグラフ表示 を示す。 図14〜16は、組織が穿孔前に冷却された光学的穿孔を用いるシュミレートされ た熱穿孔事象の間の、それぞれ、温度分布、角質層における時間の関数としての 温度、および生存表皮における時間の関数としての温度のグラフ表示を示す。 図17〜19は、組織が熱ワイヤで加熱されたシュミレートされた熱穿孔事象の間 の、それぞれ、温度分布、角質層における時間の関数としての温度、および生存 表皮における時間の関数としての温度のグラフ表示を示す。 図20〜22は、穿孔前に、組織が熱ワイヤで加熱され、そして組織が冷却された シュミレートされた熱穿孔事象の間の、それぞれ、温度分布、角質層における時 間の関数としての温度、および生存表皮における時間の関数としての温度のグラ フ表示を示す。 図23および24は、組織がTankovich'803の操作パラメーターに従って光学的に 加熱されるシュミレートされた熱穿孔事象の間の、それぞれ、温度分布および角 質層における時間の関数としての温度のグラフ表示を示す。 図25は、時間の関数として間質液(ISF;)および血液（^*）のグルコースレベル のグラフ表示を示す。 図26は、図25のISFグルコースデータと血液グルコースデータとの間の異なる 期間の分散プロット表示を示す。 図27は、図25からの血液グルコースレベルに対するISFの相対偏差のヒストグ ラムを示す。 図28は、個体の皮膚上の選択された領域へ薬物を送達するための例示的な送達 装置の断面を示す。 図29A〜Cは、選択された領域へのリドカインの送達により影響される皮膚の領 域のグラフ表示を示す。ここで、角質層は、穿孔されるか（図29A〜B）または穿 孔されていない(図29C)。 図30は、吸引単独（）ならびに吸引および超音波の組合せ（^*）により微細穿 孔から採集した間質液の量を比較するプロットを示す。 図31、32、および33は、それぞれ、間質液を採集するための超音波トランスデ ューサー/真空装置の斜視図、同じ装置の断面図、および同じ装置の断面概略図 を示す。 図34A〜Bは、それぞれ、手で握れる大きさの超音波トランスデューサーの平面 図およびそのへら状端部の側面図を示す。 図35は、テストステロンの経皮送達における微細穿孔効果の増強を示すグラフ 表示である。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、本明細書中で開示される特定の構成、プロセス工程、および材料に 限定されないことを理解すべきである。なぜなら、このような構成、プロセス工 程、および材料は、多少変更し得るからである。また、本明細書中で使用される 用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のために使用され、そして限定する ことを意図せず、なぜなら、本発明の範囲は、添付の請求の範囲およびその等価 物よりのみ制限されることも理解すべきである。 本明細書および添付の請求の範囲に使用される場合、単数形「a」、「an」、 および「the」は、文脈が明らかに単数であることを示さない限り、複数の対象 を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「薬物（単数）」の送 達方法に対する言及は、２つ以上の薬物の混台物の送達に対する言及を含み、「 分析物（単数）」に対する言及は、１つ以上のこのような分析物に対する言及を 含み、そして「浸透エンハンサー」に対する言及は、２つ以上の浸透エンハンサ ーまたは超音波およびエレクトロポレーションのような技術の混合物に対する言 及を含む。 従って、本明細書中に記載される場合、単数形は複数形と交換可能に使用され 得、そしてその反対もまた同様であり、すなわち「層（単数）」は複数の層を意 味することが可能であり、「層（複数）」は単数の層を意味することが可能であ る。 本明細書中で用いられる場合、「含むこと(including)」または「含む(includ es)」などは含むことを意味し、制限を意味しない。 本発明に記載されている、および請求されている以下の専門用語は、以下に記 載される定義に従って使用される。 本明細書中に用いられる場合、「生物」は、本明細書中に記載される方法によ って作用を受ける動物全体または植物全体を意味する。 本明細書中に用いられる場合、「穿孔」、「微細穿孔」、または任意のこのよ うな類似の用語は、分析のために表面の下から分析物を通過させるため、または 選択された目的のために体内に透過性物質もしくは薬物を通過させるため、ある いは特定の医学的または外科的手順のために、生体膜の障壁特性を減少させるた めに皮膚または粘膜あるいは生物の外層のような生体膜内に、またはこれらを通 る、所望の深さに小さな穴または孔を形成させることを意味する。本明細書中に いう微細穿孔プロセスとは、エレクトロポレーションによって形成される開口と 主に微細孔の最少の大きさにより区別される。一方、エレクトロポレーションに よって形成される開口は、代表的に、どの寸法もほんの数nmである幅１ミクロン 以上、そして少なくとも１ミクロンの深さである。それにもかかわらず、エレク トロポレーションは、透過性物質が微細孔を通って組織のこれらのより深い層へ と通過した後、生物の外層の下への、標的組織による選択された透過性物質の取 り込みを容易にするのに有用である。好ましくは、穴または微細孔は直径約1mm 以下であり、そしてより好ましくは直径約300μm以下であり、そして以下に記載 されるように選択された深さに達する。 本明細書中に用いられる場合、「微細孔」または「孔」は、微細穿孔方法によ って形成された開口を意味する。 本明細書に使用される場合、「切除」は、細胞、または生体膜または組織のい くつかの部分を含む他の成分を含み得る物質の、以下のいずれかによって引き起 こされる制御された除去を意味する：このような物質の蒸発性成分のいくらかま たは全てが、気化が生じる点まで加熱され、そしてこの相転移に起因する、得ら れた迅速な体積膨張によって、この物質およびおそらくいくらかの隣接する物質 が切除部位から除去される場合に放出される、運動エネルギー；穿孔部位での、 組織のいくらかまたは全ての熱分解、機械的分解、または音波分解。 本明細書中に使用される場合、組織の切除または組織の穿刺は同じエネルギー 供給源の利用により達成され得る。 本明細書中に使用される場合、「組織」は、細胞、生体膜、骨、コラーゲン、 体液、および生物のある部分を含むものを含むがこれらに制限されない、生物の 成分を意味する。 本明細書中に使用される場合、「音波（sonic）」または「音響（acoustic） 」は相互交換可能であり、そして0.01Hz以上の振動数範囲にわたる。 本明細書中に使用される場合、「超音波」とは、20,000Hz以上の上限のない振 動数を含む音波の部分集合をいう。 本明細書中に使用される場合、「穿刺」または「微細穿刺」は、動物の皮膚も しくは粘膜層または植物の組織外層のような生物学的な膜の全体にまたは部分的 に穴を開けるための機械的手段、水力学的手段、音波手段、電磁的手段、または 熱的手段の使用を意味する。 「切除」および「穿刺」は、同じ穿孔という目的、すなわち、必要に応じて内 在組織に有意に損傷を有することなく、生物学的な膜中に穴または孔を作製する ことを達成という範囲で、これらの用語は相互交換可能に用いられ得る。 本明細書中に使用される場合、「透過（penetration）増強」または「浸透（p ermeation）増強」は、生物活性薬剤、薬物、分析物、色素(dye)、染料(stain) 、微粒子、ミクロスフェア、化合物、または他の化学的処方物（「透過性物質」 とも呼ばれる）に対する、皮膚もしくは粘膜もしくは頬膜または植物の組織外層 のような生物学的な膜の浸透エンハンサー使用による浸透性（すなわち、生物活 性薬剤、薬物、分析物、染料、微粒子、ミクロスフェア、化合物、または他の化 学的処方物が生物学的な膜を浸透し、そして生体膜を通る分析物の回収または生 体膜を通り、かつ内在組織への物質の送達を容易にする速度を増加するため）の 増加を意味する。このようなエンハンサーの使用によってもたらされる増強され た浸透は、例えば、拡散用の器具を用いた動物皮膚またはヒト皮膚を通る、透過 性物質としての色素の拡散を観察することにより観察され得る。 本明細書中に使用される場合、「透過エンハンサー」「浸透エンハンサー」「 エンハンサー」などは、透過性物質、分析物、または他の分子の、皮膚を横切る 流動性を増加させる全ての物質および技術を含み、そしてこれは機能性によって のみ限定される。言い換えると、全ての細胞包膜傷害性化合物および溶媒ならび にエレクトロポレーション、イオン導入法、磁場、音波エネルギー、熱エネルギ ー、またはその部位への局所的なマッサージのような機械的な圧力もしくは機械 的な操作のような物理的技術ならびに任意の化学的エンハンサーが包含されるこ とが意図される。 本明細書中に使用される「化学的エンハンサー」は、透過性物質または分析物 の流動性を増加させる物質、または生物学的な膜を横切る他の物質を意味し、そ してこれは機能によってのみ限定される。 本明細書中に使用する「色素」「染料」などは、相互変換可能に使用され、そ して組織を切除してその中に微細穿孔を形成するために使用されるパルス光源の 発光範囲のいくらかまたは全てにわたって適切な吸収を示す、生物学的に適切な 発色団をいう。 本明細書中に使用する「経皮（transdermal）」もしくは「経皮(percutaneous )」または「経膜（transmembrane）」もしくは「経粘膜（transmucosal）」もし くは「経頬（transbuccal）」は、薬物の有効な治療血中レベルまたは組織レベ ルを達成するための生体膜または組織中への、もしくはそれを通る透過性物質 の通過、または分析物分子が体外で回収され得るように、生体膜もしくは組織を 通って、体内に存在する分子（「分析物」）の外への通過を意味する。 本明細書中に用いられる場合、「生物活性薬剤」、「透過性物質」、「薬物」 もしくは「薬理学的に活性な薬剤」または「送達可能な物質」または他の類似の 用語は、以前から当該分野で公知である方法、および／あるいは本発明中で教示 される方法による送達に適切な、任意の化学的または生物学的な物質もしくは化 合物を意味し、これは生物学的効果、または薬理学的効果のような所望の効果を 含み、これは（１）生物に対して予防効果を有し、そして所望でない生物学的効 果を妨げること（例えば、感染を妨げること）、（２）疾患により引き起こされ る状態を軽減すること（例えば、疾患の結果として引き起こされる疼痛または炎 症を軽減すること）、（３）生物から疾患を軽減すること、低減すること、また は完全に排除することのいずれか、および/または（４）必要に応じて、可逆的 な様式で、特定の分析物の濃度の変化に反応し得、そしてこのようにする際、こ の領域への、電磁的、機械的、または音波的であり得るエネルギーの適用に対す る、この化合物または処方物の測定可能な応答の検出可能な移動を引き起こし得 る化合物または処方物の、生物の生存可能な組織層内への配置を含むが限定しな い。この効果は、局部麻酔効果を提供するように局所的または全身性であり得る 。本発明は、微細穿孔技術によるもの以外は新規透過性物質または新たな活性薬 剤クラスには関しない。しかし、経皮、経粘膜、経膜、または経頬送達に代表的 に用いられない物質が今や使用可能であり得る。むしろ、本発明は当該分野に存 在するか、または活性薬剤として後に確立され得、かつ本発明による送達に適し た生物活性薬剤または透過性物質の送達の態様に関する。 このような物質は、生物に正常に、送達（皮膚を含む、身体表面および膜を介 して、ならびに注入（針の、水力学的もしくは超過速度(hypervelocity)の方法 を含む）による送達を含む）される広範なクラスの化合物を包含する。一般に、 これは、以下のものを含むが、これらに限定されない：ポリペプチド（タンパク 質およびペプチド（例えば、インスリン）を含む）；放出因子（黄体形成ホルモ ン放出ホルモン(LHRH)を含む）；炭水化物（ヘパリンを含む）；核酸；ワクチン ；および抗感染薬（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤）のような薬理学的 に活性な薬剤；鎮痛薬および鎮痛薬の組合せ；食欲抑制薬；駆虫薬；抗関節炎薬 ；抗喘息剤；抗痙攣薬；抗鬱薬；抗糖尿病剤；止瀉薬；抗ヒスタミン薬；抗炎症 剤；抗片頭痛製剤；制吐薬；抗悪性腫瘍薬；抗パーキンソン薬；止痒薬；抗精神 病薬；解熱薬；鎮痙薬；抗コリン薬；交感神経模倣薬；キサンチン誘導体；心血 管製剤（カリウムチャンネルブロッカーおよびカルシウムチャンネルブロッカー 、βブロッカー、αブロッカーならびに抗不整脈薬を含む）；降圧薬；利尿薬お よび抗利尿薬；血管拡張薬（全身冠状血管拡張薬、末梢血管拡張薬、大脳血管拡 張薬を含む）；中枢神経系興奮薬；血管収縮薬；咳および風邪の製剤（鬱血除去 薬を含む）；エストラジオール、テストステロン、プロゲステロンおよび他のス テロイドのようなホルモンならびに誘導体および類似体（副腎皮質ステロイドを 含む）；催眠薬；免疫抑制薬；筋弛緩薬；副交感神経遮断薬；覚醒剤；鎮静薬； および精神安定薬。本発明の方法により、イオン化および非イオン化浸透性物質 の両方が送達され得、同様に、50ダルトン未満から1,000,000ダルトンより大き い範囲の分子量の物質を含む任意の分子量の浸透性物質が送達され得る。 本明細書中に使用する、浸透性物質の「有効」量は、所望の局所的または全身 的効果、および任意の処置に伴う合理的な利益/危険比での実行を提供するため に十分な量の化合物を意味する。本明細書中に使用する、エンハンサーの「有効 」量は、組織浸透性における所望の増加および所望の透過の深さ、投与の速度、 および送達される浸透性物質の量を提供するために選択された量を意味する。 本明細書中に使用する、「キャリア」または「ビヒクル」とは、他の浸透性物 質との投与に適切である使用量で有意の薬理学的活性を有さないキャリア材料を いい、そして当該分野で公知の任意のこのような物質（例えば、任意の液体、ゲ ル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、ミクロスフェア、リポソーム、マイクロパー ティクル(microparticles)、脂質複合体など）を含む。これは、使用および投与 される量で十分に非毒性であり、そして投与される薬物と有害な様式で相互作用 しない。本明細書中における使用に適切なキャリアの例として、水、緩衝液、鉱 物油、シリコーン、無機ゲルもしくは有機ゲル、水性エマルジョン、液糖、脂質 、マイクロパーティクル、蝋、ワセリン(petroleum jerry)、ならびに種々の他 の油およびポリマー材料が挙げられる。 本明細書中に使用する、「生体膜」は、生物のある領域を別の領域から隔離し 、そして多くの例では、生物をその外環境から隔離する、生物内に存在する組織 物質を意味する。従って、皮膚および粘膜および頬膜ならびに植物外層が含まれ る。また、細胞壁もしくは血管がこの定義内に含まれる。 本明細書中に使用する、「粘膜」もしくは「粘膜(mucosa)」とは、口、鼻咽頭 、咽喉、気道、尿生殖器管、肛門、眼、腸の上皮内層および膀胱、結腸、肺、血 管、心臓などのような内視鏡的装置により受容可能な他の全ての表面をいう。 本明細書中に使用する、「頬膜」は、口の粘膜を示す。 本明細書中に使用する、「外層」および「結合組織層」は、生体膜の部分であ り以下の意味を有する。「外層」は、皮膚の表皮もしくは粘膜の上皮内層もしく は植物の外層の全てまたは部分を意味する。当該分野で周知であるように、ほと んどの動物上皮の表在部分は角質層である。上皮のより深部は、本明細書中以後 で簡単に「生存細胞層」と呼ぶ。外層の下は「結合組織層」である。結合組織層 は皮膚の真皮、もしくは粘膜内の固有層、もしくは植物または動物の他の下層組 織を意味する。 本明細書中に使用する、「生物」もしくは「個体」もしくは「被験体」もしく は「身体」とは、本発明が適用され得る、任意のヒト、動物もしくは植物をいう 。 本明細書中に使用する、「分析物」は、本発明において教示される技術により または当該分野において既に公知の技術により生体膜を通る通過に適切な化学的 または生物学的な物質もしくは化合物であって個体が身体内のその濃度または活 性を知ることを所望し得る任意の物質もしくは化合物を意味する。グルコースは 皮膚を通る通過に適切な糖であるので、分析物の特定の例であり、そして個体、 例えば、糖尿病を患う個体は、その血液グルコースレベルを知ることを所望し得 る。分析物の他の例として、ナトリウム、カリウム、ビリルビン、尿素、アンモ ニア、カルシウム、鉛、鉄、リチウム、サリチル酸、抗体、ホルモンもしくは外 因性送達物質などのような化合物が挙げられるが、これらに限定されない。 本明細書中に使用する、生体膜もしくは層自体の「中へ」もしくは「中」は、 １つ以上の層（例えば、角質層の全体もしくは部分または皮膚の外層全体もしく はその一部）のみへの浸透もしくは通過を示す。 本明細書中に使用する、生体膜もしくは層自体の「通る」は、生体膜もしくは その層の奥行全体の通ることを意味する。 本明細書中に使用する、「経皮流動速度」は、被験体の皮膚を通る、外への任 意の分析物の通過の速度、または被験体の皮膚（外部環境から生物を隔離する） 内のおよび皮膚を通る、任意の生物活性剤、薬物、薬理学的に活性な薬剤、色素 (dye)、粒子または色素(pigment)の通過速度である。「経粘膜流動速度」および 「経口流動速度」とは、粘膜および頬膜を通るこのような通過をいい、そして「 経膜流動速度」とは、任意の生体膜を通るこのような通過をいう。 本明細書中に使用する、「経皮的」、「経粘膜的」、「経頬的」および「経膜 的」は、それらの使用の情況で適切なように相互に交換可能に使用し得る。 本明細書中に使用する、「強度振幅」、「強度」および「振幅」は同義的に使 用され、そして音波、熱、機械もしくは電磁エネルギーシステムにより生成され るエネルギー量をいう。 本明細書中に使用する、「周波数変調」または「掃引」は、所定の時間期間に おける音波、熱、機械もしくは電磁エネルギーの周波数における、連続的な、勾 配的または段階的な変化を意味する。周波数変調は、所定の時間期間における周 波数の勾配的または段階的な変化、例えば、１秒間に5.4〜5.76MHz、または0.1 秒間に５〜10MHz、または0.1秒間に10〜５MHz、あるいは特定の用途に適切な任 意の他の周波数範囲または時間期間である。複合変調は、同時に周波数および強 度の両方の変化を含み得る。例えば、米国特許第5,458,140号の図4Aおよび4Bは 、それぞれ、単一の音波エネルギートランスデューサーに対して同時に適用され る振幅および周波数の変調を表し得る。 本明細書中に使用する、「振幅変調」は、所定の時間期間における音波、熱、 機械もしくは電磁エネルギーの振幅もしくは強度における、連続的な、勾配的な または段階的な変化を意味する。 本明細書中に使用する、「位相変調」は、音波、熱、機械もしくは電磁エネル ギーもしくはシグナルの（その初期状態から相対的に変化する）タイミングを意 味する。例を米国特許第5,458,140号の図4Cに示す。シグナルの周波数および振 幅は同一のままであり得る。位相変調は、その以前の状態または別のシグナルを 参照して時間的に、そのシグナルを選択的に遅らせるかまたは進ませるような可 変の遅滞と共に実行され得る。 本明細書中に使用する、「シグナル」もしくは「エネルギー」は同義で使用さ れ得る。本明細書中に述べるように、音波、熱、機械もしくは電磁エネルギーと 、周波数、強度または位相変調あるいはその組合せ、および音波、熱、機械もし くは電磁エネルギーと組み合わせた化学的エンハンサーの使用を用いる種々の適 用において、約0.01Hz〜1000MHzの間の周波数範囲にわたって変化し得、約0.1Hz と30MHzとの間の範囲が好適である。 本明細書中に使用する、「非侵襲性」は、被験体の一部分（皮膚もしくは粘膜 を含む）へ、針、カテーテル、または他の侵襲性医療器具の侵入を必要としない ことを意味する。 本明細書中に使用する、「最小侵襲性および「非侵襲性」は、同義である。 本明細書中に使用する、「マイクロパーティクル」もしくは「ミクロスフェア 」もしくは「ナノパーテクィル(nanoparticles)」もしくは「ナノスフェア」も しくは「リポソーム」もしくは「脂質複合体」は、相互に交換可能に使用し得る 。 生体膜の穿孔のための手段 生体膜における微細孔の形成は、種々の状態の当該技術の手段およびその改良 である本明細書中に開示される特定の手段により達成され得る。以下の技術およ び実施例は生体膜の穿孔に関してなされたものであるが、本明細書中で述べた改 善もまた、粘膜もしくは頬膜または植物の外層の穿孔に適用されることを理解す るべきである。 米国特許第4,775,361号においてJacquesらにより、およびLaneら、上述、によ り記載されるレーザー切除の使用は、エキシマーレーザーを用いて角質層を切除 するための手段を確かに提供する。193nmの波長および14nsのパルス幅で、約0.2 4〜2.8μmの角質層が、約70〜480mJ/cm²の放射体曝露で各レーザーパルスにより 除去され得ることが見出された。パルスエネルギーが増加するにつれ、角質層か ら取り除かれる組織が大きい程、この層の完全な穿孔に必要であるパルスはより 少なくなる。熱緩和時間の制限内で、組織切除をもたらす適切な微小破裂を引き 起こすために、角質層により吸収されなければならない放射体曝露のより低い閾 値は、50ミリ秒(ms)時間内で約70mJ/cm²である。換言すれば、合計70mJ/cm²が50 ミリ秒ウインドウ間で送達されなければならない。これは、70mJ/cm²の単一パル スで、または7mJ/cm²の10パルスで、または50ミリ秒時間の間の1.4ワット/cm²の 連続照度で行われ得る。放射体曝露の上限は、下にある組織に損傷を与えること なく角質層を切除する放射体曝露であり、そして光源、光の波長、および当業者 の経験および知識の範囲内にある他の変数から経験的に決定され得る。 「送達」とは、エネルギー適用の状況において、所定量のエネルギーが切除さ れる組織により吸収されることを意味する。193nmのエキシマーレーザー波長で 、本質的に100％の吸収が、最初の１または２μmの角質層組織内で起こる。角質 層が約20μmの厚さであると仮定すると、より長い波長(例えば、670nm)では、入 射光の約５％のみが、この20μm層内に吸収される。このことは、高パワービー ムの約95％が、角質層の下にある組織に通過することを意味し、ここで、著しい 損傷を引き起こすようである。生物活性薬剤を送達する状況において、この用語 は、所望の位置に生物活性薬剤を提供することを意味する。 分析物が抽出されるかあるいは透過性物質が送達される、下にあるおよび隣接 する組織に対して、出血、熱、または他の受容されない損傷を引き起こすことな く、生体膜または他の選択された皮膚、粘膜、あるいは組織層を穿孔するために 必要な程度の大きさのパワーのみを使用することが理想である。 エキシマーレーザー由来のエネルギーより経済的なエネルギーの供給源を使用 することは有益である。遠UV領域の波長で光を発光するエキシマーレーザーは、 例えば、可視およびIR領域(600〜1800nm)にある波長で光を発光するダイオード レーザーより、操作および維持するためにかなり多く費用がかかる。しかし、よ り長い波長で、生体膜は漸増的により透明になり、そして主に、下にある組織に おいて吸収が起こる。 本発明は、局所的に適用する場合に、身体への物質の膜貫通輸送を容易にする か、または分析のために身体内の分析物に接近するために、生体膜の障壁機能を 取り除く迅速かつ最小の外傷を与える方法を容易にする。この方法は、生体膜標 的領域への小面積熱源の接触適用で始まる手順を利用する。 熱源は、ここで記載されるように、いくつかの重要な特性を有さなければなら ない。第１に、熱源は、生体膜との接触が小面積に限定されるようなサイズ、代 表的には、直径約１〜1000μmでなければならない。第２に、それは、周辺の表 面温度から生体膜内の十分量の成分の蒸発温度を超えるまで、接触点における生 体膜の温度を調節し、次いで、周期時間でおよそ周辺の温度にまで回復させ、生 存組織に対して付随する損傷および被験体に対する外傷を最小にする能力を有さ ねばならない。この調節は、電気的に、機械的に、または化学的になされ得る。 さらに、選択された適用について、熱源が、30％を超える水含量を有する組織 に接触して置かれる場合、これらの組織における熱分散が、100℃未満に熱源の 最大温度を限定するに十分であるように、その温度を上昇させるに十分小さな熱 質量および限定されたエネルギー供給源の両方を有する場合、微小穿孔プロセス の固有の深さを限定する特徴が促進され得る。一旦、熱プローブが角質層を通し て表皮のより下の層にまたは貫通して透過されると、この特徴は熱蒸発プロセス を効果的に停止させる。 しかし、生体膜の外層のすぐ下の層の水分を含んだ生存組織層へ、または通過 して十分なエネルギーを送達し続け得る熱プローブを利用する場合、穿孔プロセ スは、選択された深度に身体へ連続し、例えば、皮膚の場合、表皮、真皮を通過 して、そして所望されるならば、下方の皮下層を含む、より深い層を貫通して透 過し得る。システムが、角質層、粘膜、もしくは頬粘膜直下の生存組織へまたは 貫通していくらかの深さになる微細穿孔を作製するように設計される場合の問題 は、主に、隣接組織への損傷および穿孔プロセスの際の被験体の感覚をいかに最 小にするかである。実験的には、本発明者らは、用いられる熱プローブが、直径 数百ミクロンに過ぎないように物理的に規定され、そして支持基盤から数ミリメ ートルまで突き出ている活性な加熱されたプローブチップを有する、固体の電気 的にまたは光学的に加熱されるエレメントである場合、電流の単一パルス、また は複数パルスは、十分な熱エネルギーを組織へまたは貫通して送達し、物理的設 計によって可能な深さ、例えば、支持基盤が構成エレメントとして、組織へまた は貫通して透過の程度を制限する、本質的には、新鮮な穿孔されていない組織を 接触させるために、熱プローブが微細穿孔へ透過し得る深さを制限するように作 用するまで、切除を透過させ得ることを示した。組織と接触させる場合、この熱 プローブの電気的および熱特性が、エネルギーパルスをこのプローブの温度を十 分迅速に調節させれば、この型の深い組織穿孔は、被験体に対して本質的に疼痛 を与えず達成され得る。実験は、必要量の熱エネルギーがおよそ20ミリ秒以内で プローブに送達される場合、この手順は無疼痛であることを示した。逆に、エネ ルギーパルスが、約20ミリ秒を超えて出力されなければならない場合、被験体へ の感覚は、パルス幅が広くなるにつれ、急激にかつ非線形的に増加する。 この型の選択された深さの穿孔を支持する、電気的に加熱されたプローブ設計 は、50〜150ミクロン直径のタングステンワイヤを鋭いキンク(kink)に屈曲させ 、この点で最小の内部半径を有する180度に近い屈曲を形成することにより造ら れ得る。次いで、この微小な「Ｖ」型ワイヤ片は、「Ｖ」の点が、その上に被覆 された銅電極を有する支持片からある程度の距離をおくように取り付けられ得る 。ワイヤがこの支持から離れている距離は、ワイヤが加熱された場合の組織への または組織を貫通する最大透過距離を規定する。タングステン「Ｖ」の各脚部は 、順に電流のパルス回路に接続され得る支持キャリア上の電極の一方に付着され る。電流が適切に制御された様式でワイヤに送達される場合、ワイヤは、所望の 温度に迅速に加熱され、電流の単一パルスまたは複数パルスで熱的切除プロセス をもたらす。プローブの動力学的インピーダンスをモニタリングし、そしてタン グステンエレメントの抵抗対温度の係数を知ることによって、接触点の温度の閉 ループ制御は、容易に樹立され得る。また、プローブの接触点およびいくらかの 距離をおいて配置される第２の電極からの身体を通過するインピーダンスを動力 学的にモニターすることによって、孔の深さは、より深く身体へ浸透するにつれ て、組織の異なるインピーダンス特性に基づいて評価され得る。 この型の選択される深さの穿孔を支持する光学的に加熱されるプローブ設計は 、光ファイバーを採用し、そして固体キャップまたはコーティングからなるチッ プを一方の先端に配置することにより、造られ得る。レーザーダイオードのよう な光源が、ファイバーの他方の先端に結合される。ファイバーに面しているチッ プの側は、光子がファイバーの先端に達し、そしてこの面に衝突する場合、光子 の いくらかが、吸収され、次いでチップの加熱を引き起こすように、光源によって 放出される波長の範囲にわたって、十分高い吸収係数を有さねばならない。この チップ、ファイバー、および供給源構築の特定の設計は、広範に変化し得る。し かし、50〜1000ミクロン直径の全体的な直径を有するファイバーは、今日ではあ りふれた部材である。そして光学的エネルギーを数千ワットまで放出する供給源 は、同様にありふれている。実際の熱プローブを形成するチップは、高融点物質 （例えば、タングステン）から製作され得、ファイバーの先端で円筒孔へのファ イバーの挿入を可能にするように精密に製作することによりファイバーへ付着さ れ得る。チップの遠位の先端が、このチップからの熱拡散を制限し、そして用い られる光学的パルス幅の時間枠内で、チップをファイバーへ付着する支持シリン ダーをバックさせるように製作される場合、このチップに入射する光子は、組織 表面に対して配置される、ファイバー側および接触側の両方において迅速に温度 を上昇させる。組織表面に対するファイバー/チップ構築の位置づけは、直下の 組織が切除されるにつれて、チップ自体は組織中に進むように、いくらかのバネ 張力下で表面に対してチップを保持するように設計された単純な機構を用いて達 成され得る。このことは、熱切除プロセスを、所望される限り組織中へまたは組 織を貫通して連続させることを可能にする。この光学的に加熱されるプローブ設 計のさらなる特徴は、ファイバーによって集められる加熱されたチップからの黒 体放射エネルギーをモニターすることによって、チップ温度の非常に単純な閉ル ープ制御が、もたらされ得ることである。また、先述のように、プローブの接触 点およびいくらかの距離を置いて配置された第２の電極からの身体を貫通するイ ンピーダンスを動力学的にモニターすることにより、孔の深さは、身体へより深 く浸透するにつれて、組織の異なるインピーダンス特性に基づいて決定され得る 。この設計について、パルス幅と感覚との間の関係は、本質的に、先述された電 気的に加熱されたプローブに関して同一である。 インピーダンスは、任意の手段によって作製される孔の深さを決定するために 用いられ得る。これは、選択された深さの孔を作製するための制御系への、入力 として使用され得る。測定されるインピーダンスは、選択された生物における選 択された組織のインピーダンス特性を強調するように選択された周波数で測定さ れた複合インピーダンスであり得る。 本発明のさらなる特徴は、他の透過増強技術と生体膜の外層の穿孔とを組み合 わせることによって得られ得る効率の大きな増加である。この技術は、生体有効 性(bio-effective)であるように及ぶことが必要である内部隙へのまたはこれを 貫通する所望の化合物の有効な送達に対する種々の障壁について機能するように 、目下至適化され得る。特に、裸の、フラグメントされた、カプセル化されたま たは別の薬剤と結合したかのいずれかのDNA化合物を送達する場合、細胞を殺傷 することなく所望の取り込み、続いて治療の実施を可能にするように、生細胞に DNAを取り込ませることが、しばしば所望される。エレクトロポレーション、イ オン導入法、および超音波は、一時的に細胞膜および他の内部組織膜において開 口を形成させ得ることが、当該分野で周知である。角質層もしくは粘膜層、また は植物の細胞壁、そして所望であれば、上皮および真皮、または植物へより深く 、突破させることによって、エレクトロポレーション、イオン導入法、磁場、お よび音波エネルギーは、今や、これらの下にある組織障壁において選択的に作用 するように調整され得るパラメーターとともに用いられ得る。例えば、任意の電 磁気的または音波エネルギー増強手段に関して、増強の特異的作用が、孔の任意 の部分に、例えば、孔の底部に、電極、音波および磁場形成デバイスなどの設計 のような用いられる集束手段の設計によって焦点を合わせるように設計され得る 。あるいは、エンハンサーは、孔全体または孔周囲の領域に、より一般的に焦点 を合わせ得る。エレクトロポレーションの場合では、50〜150ボルトを超えるパ ルスを日常的に用いて角質層または粘膜層をエレクトロポレーションする場合、 我々が提示する環境においては、わずか数ボルトのパルスが、標的化された組織 内の細胞、毛細管または他の膜をエレクトロポレーションするに十分であり得る 。これは、原理的には、生体膜の外表面が一旦開口されると、電極の間に存在す る絶縁層の数が劇的に減少することに起因する。同様に、イオン導入は、これら の穿孔された層を貫通する体液の流れに対する物理的インピーダンスの劇的な減 少に起因して、非常に少ない電流量で微細穿孔を通る、DNAを含む液体媒体の流 れを調節するのに効果的であることが示され得る。 以前は、超音波は、微細穿孔を通してこの障壁を排除することにより、角質層 または粘膜層の穿孔を促進するために用いられたが、本発明者らは、標的組織内 の細胞、毛細管または他の構造を透過可能にするために音波エネルギーを利用す る機会を作り出した。エレクトロポレーションおよびイオン導入の場合における ように、本発明者らは、物質の膜貫通流動における著しい改良をもたらすために 必要とされる音波エネルギーレベルは、角質層または粘膜層がインタクトなまま である場合より、遥かに低いことを実証した。これらの活性な方法の全て、すな わち、エレクトロポレーション、イオン導入、磁場、機械的影響力または超音波 の操作様式は、単独または組み合わせて適用される場合、生体膜の穿孔がもたら された後では、１つの細胞膜が物質の送達のために開口されているようなインビ トロでの適用で代表的に用いられるパラメーターに最も類似する。 熱源を生体膜の表面と接触させて配置すると、周辺温度の開始点から123℃を 超えるピーク温度まで、そしてほぼ周辺の表面温度にもどる一連の１つ以上の温 度調節を通してサイクルされる。微小穿孔プロセスの動物の感覚的知覚を最小に するかまたは取り除くために、これらのパルスは持続期間で限定され、そしてパ ルス間の間隔は、生体膜の生存組織層および最も詳細には、神経分布した組織の 冷却を可能にするのに十分長く、神経分布した組織内で約45℃未満の平均温度を 達成する。これらのパラメーターは、熱プローブと下にある真皮中の神経分布し た組織との間に位置する、ヒト皮膚の生存表皮組織の熱時間定数(およそ30〜80m s)に基づく。パルス熱エネルギーのこの適用の結果は、小さな標的スポット内の 角質層にまたは貫通して、十分なエネルギーが伝導され、この容量の組織の局所 的温度が、角質層内の組織に結合した水含量の気化点より十分に高く上昇される ことである。温度が100℃より上に増加するとき、この局在化されたスポット内 の角質層の水含量（代表的には５％〜15％）は、非常に急速に蒸発および膨張す るように誘導され、この蒸発事象の近傍に位置する角質層内のこれらの角質細胞 の蒸発により駆動される除去を引き起こす。米国特許第4,775,361号は、123℃の 角質層温度が、この温度でこの型のフラッシュ蒸発が起こる閾値を示すことを教 示する。その後の熱エネルギーパルスが適用される場合、微細孔が、角質層を下 って表皮の次の層（淡明層）まで形成されるまで、角質層のさらなる層が取り除 かれる。熱パルスの持続時間を、１未満の表皮の熱時間定数に限定し、そして 任意の熱エネルギーを表皮にまたは貫通して伝導させて、十分に長い十分な時間 の間、散逸させることにより、表皮の生存層の温度の上昇は最小である。これは 、被験体に対していずれの感覚もなく、かつ下にあるおよび周囲の組織に損傷を 与えることなく、微細穿孔プロセス全体が生じることを可能にする。熱プローブ が300℃を超える温度を達成し得る場合、穿孔のいくつかは、組織の直接熱分解 に起因し得る。 本発明は、生物の生体膜に、約１〜1000μm直径の、顕微鏡的な穴（すなわち 、微細孔）を無痛でまたはほとんど感覚を伴わず作製するための方法を包含する 。この方法を首尾良く行うことの鍵は、生体膜と接触して保持される、適切な熱 エネルギー供給源または熱プローブの作製である。適切な熱プローブを製作する ことにおける原理的な技術的難題は、生体膜と所望の接触を有し、しかも十分に 高い周波数で熱変調され得るデバイスを設計することである。 選択された光源により発光される波長で光を吸収するその能力のために選択さ れた適切な光吸収性化合物（例えば、色素または染料あるいは任意の薄いフィル ムまたは物質）と生体膜とを接触させることにより、適切な熱プローブを製作す ることが可能である。この例では、選択された光源は、通常生体膜により吸収さ れない波長で発光するレーザーダイオードであり得る。色素、染料、薄いフィル ムまたは物質の局所層の表面上の小さなスポットに、光源の焦点を合わせること により、標的領域は、それに焦点を合わせた光束の強度を変えることにより温度 調節され得る。角質層に、レーザー源により発光される波長で光を吸収するその 能力により選択された適切な光吸収性化合物（例えば、色素または染料、薄いフ ィルムまたは物質）を最初に局所適用することにより、エキシマーレーザーより 長い波長で発光するレーザー源からのエネルギーを利用することが可能である。 同じ概念が任意の波長で適用され得、そして適切な色素または染料および光学波 長を選択しなければならないのみである。適切な色素およびこの色素の最大吸収 波長はどれであるのか見出すために、任意の参考マニュアルを見る必要があるの みである。１つのこのような参考文献は、Green,The Sigma-Aldrich Handbook o f Stains,Dyes and Indicators ,Aldrich Chemical Company,Inc.Milwaukee,Wisc onsin(1991)である。例えば、フタロシアニン銅(Pigment Blue 15;CPC)は約800n mで吸収する；フタロシアニン銅テトラスルホン酸(Acid Blue 249)は約610nmで 吸収する；そしてインドシアニングリーンは、約775nmで吸収する；そしてクリ プトシアニンは約703nmで吸収する。CPCは、以下の理由のためこの実施態様には 特に良好に適切である：それは、非常に安定でかつ不活性な化合物であり、移植 可能な縫合糸における色素としての使用のために、既にFDAにより許可されてい る；750nm〜950nmの波長で非常に強く吸収し、この波長は、レーザーダイオード およびLEDのような多くの低コストの半導体発光素子と良く一致し、さらに、こ の領域の光学的バンド幅は、同様に、任意の有意な量で皮膚組織により直接吸収 されない；CPCは非常に高い気化点(真空下で＞550C)を有し、そして液相を経る ことなく、固相から気相に直接移行する；CPCは比較的低い熱拡散定数を有し、 それに焦点を合わせた光エネルギーを、「熱スポット」の周囲CPCへの横方向へ の拡散が非常に少なく、焦点において直接その領域のみを選択的に加熱し、それ によって接触熱プローブの空間的規定を補助する。 この開示の目的は、適切な色素、染料、フィルムまたは物質の網羅的なリスト を作成することではない。なぜなら、このようなことは、当業者によって、容易 に入手可能なデータから容易に確かめられ得るからである。 同じことが、任意の所望の特定のパルス光源についてあてはまる。例えば、こ の方法は、パルス光源として、機械的にシャッターを付け、焦点を合わせた白熱 ランプを用いて行われ得る。種々のカタログおよび販売文書は、近UV、可視およ び近IR範囲において動作する多くのレーザーを示している。代表的なレーザーは 、2×10^-8Jのパワー出力、415nmの波長で動作する、Hammamatsu Photonic Syste ms PLP-02モデル；15Jのパワー出力、685nmの波長で動作する、Hammamatsu Phot onic Systems PLP-05モデル；2×10⁶Jのパワー出力、約800〜810nmの波長で動作 する、SDL,Inc.,SDL-3250シリーズパルスレーザー；500mWのパワー出力、約670n mの波長で動作する、SDL,Inc.,SDL-8630モデル；15,000mWのパワー出力、790〜8 30nmの波長で動作する、Uniphase Laser Model AR-081-15000；30mWのパワー出 力、690nmの波長で動作する、Toshiba America Electronic TOLD9150モデル；お よび50mWのパワー、780nmの波長で動作する、LiCONIX，Diolite 800-50モデルで ある。 本発明の目的のために、パルスレーザー光源は、約100nm〜12,000nmの範囲の 広範な波長にわたって放射を発光し得る。エキシマーレーザーは、代表的には、 約100〜400nmの範囲にわたって発光する。約193nm〜350nmの範囲の波長を有する 市販のエキシマーレーザーが現在入手可能である。好ましくは、レーザーダイオ ードは、約380〜1550nmの発光範囲を有する。周波数倍化レーザーダイオードは 、約190〜775nmの発光範囲を有する。約1300nm〜3000nmの範囲のより長い波長は 、レーザーダイオードポンプ光学パラメトリック発振器を用いて利用され得る。 所定量の研究がレーザー技術について行われれば、これらの範囲は時間と共に広 がることが予測される。 任意の光源がレーザー、短アークランプ（例えば、キセノンフラッシュランプ ）、白熱ランプ、発光ダイオード(LED)、日光、または任意の他の供給源由来で あるか否かに拘わらず使用され得るので、送達または吸収されるエネルギーは、 任意の光源として、レーザーから得られる必要はない。従って、電磁的放射を送 達するために使用される特定の器具は、それに関連する波長およびエネルギーほ ど重要ではない。適切な波長（すなわち、約100nm〜約12,000nmの範囲）で必要 なエネルギーを送達し得る任意の適切な器具は、本発明の範囲内にあると考えら れ得る。必須の特徴は、エネルギーが光吸収性化合物により吸収され、その局在 化された熱を引き起こし、続いて、許可された時間枠内に切除される組織に十分 な熱を伝導を引き起こさなければならないことである。 １つの例示的な実施態様において、熱プローブ自体は、微細孔が作製される部 位を覆うのに十分大きい個体の皮膚の選択された領域に接触するように配置され た、好ましくは約5〜1000μmの厚さの、固体の、生物学的に活性でない物質であ る薄層から形成される。化学的化合物の特定の処方物は、光吸収化合物にエネル ギーを提供することについて選択された光源のスペクトルの領域にわたって高い 吸収を示すように選択される。プローブは、例えば、固体の化合物のシートであ り得るか、適切な光吸収化合物で処理されたかまたは被膜されたかまたはそれを 含むフィルムであり得るか、あるいは沈殿物もしくはキャリア中の懸濁物として の皮膚への光吸収化合物の直接貼布であり得る。光吸収熱プローブの形態にかか わらず、いかなる局所的な温度上昇も依然として十分に場所的に定められ、そし て熱損失の主要な態様が皮膚とプローブとの間の接触点を通して生体膜への直 接伝導を好ましく介するように、プローブは十分低い側面熱拡散係数を示さなけ ればならない。 プローブの必要とされる温度調節は、プローブ層へ光源を集束することにより 、およびこの光源の強度を調節することにより達成され得る。照射された領域内 で吸収されたエネルギーが十分に高い場合、プローブ層が加熱される。送達され たエネルギーの量、続いて焦点におけるプローブ層の加熱速度およびピーク温度 の両方が、光源のパルス幅およびピーク電力を変えることにより容易に調節され 得る。この実施態様では、熱プローブを形成する集束入射光エネルギーにより加 熱された少容量のプローブ層であり、実際の穿孔部位より広い範囲にわたって適 用され得るさらなるこのプローブ層の物質は副次的である。550℃より高い温度 までその固相状態を維持する比較的高い融点を有する固相光吸収化合物（例えば 、銅フタロシアニン(CPC)）を用いることにより、熱プローブは急速に数百℃の 温度になり得、そしてなお生体膜と接触したままこの熱エネルギーを角質層へま たは角質層を通して伝える。さらに、この実施態様は、ほとんどのエネルギーが 生体膜組織に通常吸収されない、放出スペクトルを有する光源を選択することを 含む。 一旦、標的化された領域が光吸収性プローブ層をそれに接触するように配置す ると、光源が処置領域の表面と一致するように配されたビームの焦点くびれで活 性化されるとき、熱プローブは形成される。焦点くびれにおける光エネルギー密 度および光吸収化合物内で生じる吸収量は、光源の焦点により規定される小さな スポットの範囲内の光吸収化合物の温度が、数ミリ秒内で123℃より高い温度に なるのに十分であるように設定される。熱プローブの温度が上昇するにつれて、 生体膜へのまたは生体膜を通した伝導はエネルギーをこれらの組織へまたはこれ らの組織を通して送達し、生体膜の局所温度を上昇させる。十分なエネルギーが 生体膜のこの小領域へまたはこの小領域を通して送達されて、局所温度を、これ らの組織内に含まれるいくらかの水および他の気化可能な成分の沸点より高い温 度に上昇させるとき、この物質の急速な蒸発が生じ、この部位の生体膜の任意の 部分を除去し、そして微細孔を形成する。 光源のスイッチをつけたり消したりすることにより、熱プローブの温度は迅速 に調節され得、そしてこれらの組織の選択的な切除が達成され得、これにより、 生体膜の最初の10〜30μmのみを選択的に通過し得る、非常に正確な大きさの穴 が作製され、またはより深く作成され得る。 本実施態様のさらなる特徴は、生体膜または下層の組織により吸収されるエネ ルギーを通常ほとんど有しない光源を選択することにより、および十分に高い開 口数を有するように集束および送達レンズを設計することにより、熱プローブ自 体にたまたま吸収されなかった少量の送達された光が、体内に深く貫通するにつ れて素早く分岐することである。送達された波長でほとんど吸収がないので、光 源から直接生体膜へ送達されるエネルギーは本質的に全くない。ビーム分岐およ び未処置組織中の低レベルの吸収に起因する組織中の連結エネルギーのこの３次 元希釈は、光ビームと組織との間に完全に穏和な相互作用を生じ、それによって なされる損傷はない。 本発明の１つの好ましい実施態様では、レーザーダイオードが、800±30nmの 放出波長を有する光源として使用される。熱プローブは、細かく砕かれた銅フタ ロシアニン(CPC)の沈殿物から形成された0.5cmのスポットを有する接着側で処理 された移植接着テープの局所貼布により形成され得る。CPCは800nmのスペクトル 領域で極度に高い吸収係数（代表的にはレーザーダイオードからの放射エネルギ ーの95％より大きい吸収）を示す。 図１は、このようなレーザーダイオードから個体の生体膜の選択された領域に 光を送達し、そして穿孔プロセスの進行をモニタリングするためのシステム10を 示す。このシステムは、コントローラー18に連結したレーザーダイオード14を備 える。コントローラー18は光のパルスの強度、持続時間、および間隔を制御する 。レーザーダイオードは、単数または複数の採集レンズ26に指向するビーム22を 放出し、このレンズ26が、ミラー30にビームを集束する。次いで、このビームは ミラーにより単数または複数の対物レンズ34に反射され、このレンズ34はビーム を予選択点38に集束する。この予選択点はxyzステージ42の面およびその対物穴4 6と対応し、その結果個体の生体膜の選択された領域が照射され得る。xyzステー ジは、xyzステージの位置が制御され得るようにコントローラーに連結される。 このシステムはまた、モニター器54に連結したCCDカメラ50を備えるモニターシ ステムを備える。CCDカメラは、穿孔プロセスの進行をモニター上で視覚的にモ ニタリングし得るように対物レンズと共焦的に整列される。 本発明の別の例示的な実施態様では、検出フォトダイオードと、切除光源で共 焦的に整列された採集光学とのシステムが提供される。図２は、この実施態様に おいて用いられるセンサーシステム60を示す。このシステムは、光ビーム68を放 出するための光源64を備え、このビーム68は、予選択点76（例えば、個体の皮膚 の表面領域80）にてビームを集束する送達光学システム72に指向される。光が皮 膚と接触する部分が反射され、そして他の光が照射された領域から放出される。 この反射されかつ放出された光の一部はフィルター84を通過し、次いで、採集光 学システム88を通過し、このシステム88は、フォトダイオード92上に光を集束す る。コントローラー96は、レーザーダイオードおよびフォトダイオードの両方に 連結され、これらはそれぞれ、レーザーダイオードの出力を制御し、フォトダイ オードに達する光を検出する。皮膚から放出されたスペクトルの選択された部分 のみがフィルターを通過する。標的化された領域から反射され放出された光の移 動を分析することにより、このシステムは、角質層が破損されたときを検出する 能力を有し、次いで、このフィードバックを用いて光源を制御し、角質層の微細 穿孔が達成された場合に光のパルスを失活させる。この型の活性閉ループフィー ドバックシステムを用いることにより、１個体から次の個体への変動にもかかわ らず、最小パワー要求で、角質層に均一な大きさの微細孔を生じる、自己調節的 な、一般的に適用可能なデバイスが得られる。 別の例示的な実施態様では、冷却デバイスが皮膚に対するシステムの界面に組 み込まれている。図3Aは、その例示的な模式図を示す。このシステム100では、 光源104（コントローラー106に連結している）は光ビーム108を放出し、これは 送達光学システム112を通過してそれにより集束される。このビームは、送達光 学システムにより予選択点116（個体の皮膚120の選択された領域のような）へ集 束される。ペルチェデバイスまたは他の冷却手段のような冷却デバイス124は、 皮膚と接触してその表面を冷却する。冷却デバイス124の好ましい実施態様(図3B )では、集束光ビームが通過して皮膚と接触する中心穴128が存在する。図3Aにつ いて再び言及すれば、熱シンク132がまた冷却デバイスと接触して好ましく配 置される。その中央に光の焦点と一致する小さな穴を有する冷却デバイスを提供 することにより、穿孔が作製される一般的な領域の組織が５℃〜10℃に冷却され 得る。この冷却は、使用者への潜在的な感覚および穿孔部位直下の表皮に対する 付随するあらゆる損傷の可能性を非冷却実施態様から有意に減少させる点で、シ ステムが操作により大きな安全限界を与える。さらに、モニタリング適用のため に、冷却は、間質液の蒸発を最小化し、そしてまた、このような間質液の表面張 力を減少させるような、有利な物理的特性をまた提供し得る。なおさらに、組織 の冷却が、このような冷却された組織における血流の局在化された増大を引き起 こすことが知られているので、これは血液から間質液への分析物の拡散を促進し 、かつ送達されたパーミアント（permeants）の細孔から離れるかまたは細孔の 根底にある組織の中への拡散を促進する。 この方法はまた、他のマイクロ外科技術に適用され得る。ここでは、光吸収化 合物／熱プローブを切除される領域に貼布し、次いで、光源を用いて、選択され た標的部位のプローブの温度を選択的に調節する。これは、生じた蒸発-切除プ ロセスを介して組織に影響する。 本発明のさらなる特徴は、その有用物が通過した後に微細孔を密封することを 援助するために光源を使用することである。特に、内部の分析物のためのモニタ リングの場合、微細孔を作製し、そして間質液のいくらかの量をこの開口部を通 して抽出する。十分な量の間質液を採集した後、光源を、微細孔内の間質液の迅 速なクロッティング(clotting)または凝固を促進するために、低パワーレベルで 再活性化する。孔中の流体の凝固またはクロッティングを強行することによって 、体内のこの開口部は効果的に密封され、従って感染の危険性を減少させる。ま た、微細孔の形成およびその密封の両方のための光源自体の使用は、任意のデバ イスまたは装置による体内への物理的な透過のない、本質的に無菌の手順である 。さらに、光エネルギーにより誘導される熱ショックは、切除部位に偶然に存在 し得るいかなる微生物をも殺傷する。 この光学的滅菌の概念は、プロセスにおけるさらなる工程を包含するように拡 張され得る。ここでは、光源はまず、集束されない様式で適用され、これは、生 じる微細孔の実際のサイズを超える100μm以上に広がる照射された領域を有する 標的領域を覆う。集束されていないビームが適用される領域を選択することによ り、束（flux）密度を切除閾値よりずっと下であるが皮膚の表面を有効に滅菌す るのに十分に高いレベルに対応して減少させ得る。より大きな領域の十分に長い 曝露の後、ビームを滅菌するために、１つの連続的な工程または一連のパルスの いずれかにおいて、このシステムは、次いで鋭く集束された切除態様に配置され 、そして光学微細穿孔プロセスが開始する。 本発明の別の例示的な実施態様は、小さな直径ワイヤのような固体エレメント から所要熱プローブを作製することである。先に記載された実施態様におけるよ うに、熱プローブの接触表面は、許容された所要時間（好ましくは、高温で約１ 〜50ms（オン時）、および低温で少なくとも約1〜50ms（オフ時）の間）内で、 周囲生体膜温度から123℃より高い温度へその温度を調節することができなけれ ばならない。特に、５ms周辺の「オン」時および50msのオフ時の間150℃より高 い温度まで調節できることは、個体にほとんどまたは全く感覚を感じさせない非 常に有効な熱切除を生じる。 固体エレメント熱プローブ接触領域の温度を調節するためのいくつかの方法が 、首尾良く実行され得る。例えば、短い長さのワイヤは、溶接鉄のチップにおい て用いられるオーム加熱エレメントのような、外部加熱エレメントにより所望の 高温まで上昇し得る。図４は、機械的アクチュエーターを有するオーム加熱デバ イス140を示す。オーム加熱デバイスは、固体エレメント熱プローブ148に連結し たオーム熱源144を備える。このオーム熱源はまた、断熱マウント152を介してソ レノイドのような機械的調節デバイス156に連結している。この配置で、固体エ レメントプローブのチップが構造の物理的パラメーター（すなわち、オーム熱源 の温度、固体エレメントの長さおよび直径、固体エレメントを取り囲む空気の温 度、および固体エレメントを構成する材料）により規定されるいくらかの平衡温 度で安定化する定常状態に達し得る。一旦所望の温度に達したら、生物体の生体 膜160の選択された領域の温度の調節を、交互にワイヤのホットチップを生体膜 と接触して配置し（好ましくは、５msオン時）、次いでそれを空気中に引っ込め る（好ましくは、50msオフ時）機械的調節デバイスを介して直接行う。 別の例示的な例（図５）は、コントローラー178に連結した電源174を備えるデ バイス170を示す。電源は、高い抵抗点を示すような構造に形成された固体エレ メント186を備える電流ループ182に連結している。好ましくは、この固体エレメ ントはマウント190上に保持され、そして絶縁体194は電流ループの異なる部を分 離している。よって、温度の所望の調節が、固体エレメントを通る電流を単に調 節することにより達成される。固体エレメントの熱量が適切にサイズ化され、そ して電源に連結する電極により提供される放熱が十分な場合、固体エレメントの 予熱および冷却時間は数ミリセカンドで達成され得る。固体エレメントを生体膜 198の選択された領域と接触させて生体膜を加熱し、選択された切除を達成する 。 図６では、固体エレメント熱プローブで生体膜を穿孔するなお別の例示的な例 を示す。このシステム200では、固体エレメント204は、励磁コイルであるワイヤ コイル208により形成された変調可能交流磁場内に配置され得る。そこに連結し たコントローラー212によって励磁コイル内に交流を励磁することにより、渦電 流が、内部抵抗損を介して直接的に加熱される十分な強度の固体エレメント熱プ ローブ中に誘導され得る。これは、本質的に、ツールのチップを熱処理するか、 あるいは真空管またはフラッシュ管中の電極から除気することを誘導するために 通常用いられる誘導加熱システムの小型バージョンである。誘導加熱法の利点は 、固体エレメント熱プローブ中へ送達されるエネルギーが密に制御され得、そし て熱プローブそれ自体とは電気的に直接接続されていない励磁コイルの電気的制 御を介して容易に変調され得ることである。固体エレメント熱プローブの熱量、 およびプローブのチップと接触した生体膜の熱量が既知であれば、送達された誘 導エネルギーを制御することは、生体膜220との接触点216における温度の正確な 制御をし得る。誘導加熱が達成され得る低周波数では生体膜組織が本質的に非磁 性であるので、適切に選択された周波数が励磁コイル中で用いられる場合、この 交流電磁場は生物体の組織上でなんの効果も有さない。 機械的に制御される接触調整が用いられる場合、さらなる特徴が単純な閉ルー プ制御システムを取り込むことにより具現化され得る。ここでは、プローブチッ プと被検体の皮膚との間の電気インピーダンスがモニタリングされる。この様式 において、プローブの位置は、被検体の皮膚と接触するようにされ得、接触がな されれば抵抗の段階的な減少により示され得、次いで所望の「オン時」の間そこ に保持され、その後引っ込められ得る。音声コイル機構、単純なソレノイド、カ ムクランクまたはベルクランクを有するロータリーシステムなどのような、いく つかの型の線形アクチュエーターが、この形態の閉ループ制御のために適切であ る。利点は、熱除去が進行するにつれて、熱プローブチップの位置が同様に生体 膜中に進み得、所要熱エネルギーの効率的な移行を促進するための良好な接触を 常に確実にすることである。また、皮膚の穿孔のために、角質層および表皮の電 導特性の変化が、穿孔プロセスが完全である洗練された閉ループ検査を提供する ために用いられ得る。すなわち、抵抗が表皮に達したことを示したら、穿孔プロ セスを停止する時期である。同様のインピーダンスの変化が他の層と同様に良好 に透過深度の制御に使用し得る 図７は、このような閉ループインピーダンスモニターの例示的な例を示す。こ のシステム230では、ワイヤ熱プローブ238に連結したオーム熱源234がある。熱 源は、断熱マウント242を通して機械的変調器246にマウントされている。コント ローラー250は、ワイヤおよび皮膚254に連結され、ここでコントローラーは皮膚 の選択された領域258中のインピーダンスの変化を検出し、そして所定のレベル が得られるときにコントローラーは穿孔プロセスを停止する。 水力学的な穿孔手段と同じラインに沿って、マイクロランセットが、形成され た孔を通して薬物のような透過性物質を投与する目的のために、または分析のた めの孔を通して分析物を回収するために、角質層をちょうど貫通するように適合 される。このようなデバイスは、非浸潤性のデバイスおよび／または技術と比較 して「最小浸潤性」であると考えられる。血液を回収するための角質層下を貫通 するマイクロランセットの使用が周知である。このようなデバイスは、Becton-D ickinsonおよびLifescanのような製造者から市販されており、そして貫通の深さ を制御することにより本発明で利用し得る。体液を採集するためのマイクロラン セットデバイスの例としては、Ericksonら、国際公開PCT出願WO 95/10223（1995 年４月20日公開）に言及される。この出願は、皮下組織へ貫通することなく皮膚 の表皮層へまたは表皮層を通して貫通して、血中グルコースレベルなどをモニタ リングするために体液を採集するためのデバイスを示す。 生体膜の穿孔はまた、音波手段を用いて達成され得る。音波穿孔は、光源を用 いる代わりに、音波エネルギーの非常に強固に集束されたビームが切除される角 質層の領域に送達されることを除いて、上述の光学手段の変型である。同レベル のエネルギーが必要である。すなわち、70mJ/cm²/50msの閾値がなお吸収されね ばならない。親出願第08/152,442号（現在米国特許第5,458,140号）および同第0 8/152,174号（現在米国特許第5,445,611号）に記載と同様のパルス集束超音波変 換器を利用して、分析物の経皮サンプリングまたは薬物の経皮送達のために、強 度、相、または周波数あるいはこれらのパラメーターの組み合わせにおいて変調 された音波エネルギーの送達で使用されるのと同様に、切除のために必要なエネ ルギー密度を送達する。これは、角質層を通して薬物を入れるか、または分析の ために体液を表面に引き出すために、同じ変換器の使用を、微細孔を最初に作製 するために用いることを可能にするという利点を有する。 さらに、エレクトロポレーションあるいは電流の短いバーストまたはパルスは 、微細孔を形成するのに十分なエネルギーをもって角質層へ送達され得る。エレ クトロポレーションは生体膜に孔を生じることについて当該分野で公知であり、 そしてエレクトロポレーション装置は市販されている。従って、当業者は、装置 およびその使用のための条件を本明細書中に提供されるガイドラインに従って過 度の実験をすることなく選択し得る。 本発明の方法により角質層で生じた微細孔は、膜貫通的に送達される多様な分 子量の治療的化合物の高流動速度を許容する。さらに、体内へのこれらの非傷害 性の顕微鏡的開口部は、それらの内部濃度を決定するためにアッセイされ得る、 体内の種々の分析物への接近を可能にする。 実施例１ この実施例において、皮膚サンプルを以下のように調製した。表皮膜を、ヒト 屍体全皮膚からKlingmanおよびChristopher，88 Arch ．Dermatol．702（1963） の熱分離法により分離した。この方法は、全厚皮膚の温度60℃への60秒間の曝露 を含み、この時間の後、角質層および表皮（表皮膜）の一部を真皮から静かに引 き剥がした。 実施例２ 実施例１の手順により調製された、熱分離角質層サンプルを、１cm²の切片に 切り分けた。次いで、これらの小さいサンプルをスライドの上に載せそして中央 に６mmの穴を有する感圧性接着剤塗布ディスクを皮膚サンプルの上に適用するこ とにより、これらをガラスのカバースライドに付着させた。次いで、サンプルを 実験的試験のために準備した。いくつかの場合には、中性の緩衝化リン酸溶液ま たは純水中に数時間浸すことにより、皮膚サンプルを水和させた。 これらの未処理の皮膚サンプルの試験として、およそ810、905、1480および15 50ナノメーターで放出するいくつかの異なる赤外レーザーダイオードの出力をサ ンプルに適用した。送達光学システムを、横に25μmの焦点くびれを最終対物が0 .4の開口数を有して生じるように設計した。焦点に送達される全パワーを測定し て、810nmと1480nmのレーザーダイオードについて50と200ミリワットとの間にあ るようにした。このレーザーダイオードは連続波(CW)の様式で操作可能であった 。905nmおよび1550nmのレーザーダイオードを、およそ10から200ナノ秒長の高ピ ークパワーパルスを5000Hzまでの反復速度で産出するように設計した。パルスレ ーザーについては、ピークのパワーレベルを測定して、905nmで45ワットそして1 550nmで3.5ワットであるようにした。 これらの操作条件下では、どのレーザーからも、皮膚サンプルに対する明らか な影響はなかった。標的領域を60秒間連続的に照射し、次いで顕微鏡で検査した 結果、いかなる可視的な影響もなかった。さらにサンプルを、改変されたFranz セル（代表的には、経皮送達系を化学的透過エンハンサーに基づいて試験するた めに用いられる）中に置き、膜の一つの側から他方の側への電導率を、レーザー による照射の前と後の両方において測定し、そして何の変化も示さなかった。４ 人の異なるドナーからの皮膚サンプルにおいて行われたこれらの試験に基づき、 これらの波長において光学的エネルギーの皮膚組織へまたは皮膚組織を通しての カップリングは小さすぎて影響が検出不可能であると結論した。 実施例３ 実施例２の条件下で光エネルギーで照射された場合の生存被験体への潜在的な 感覚を評価するために、６人のボランティアを用いて、各レーザー源の出力を彼 らの指先、前腕および手の甲に適用した。810、905、および1550nmレーザーの場 合には、被験体はレーザーが点けられた時または消された時に感じることができ なかった。1480nレーザーの場合には、70mW CWで操作する1480nmレーザーによる 照射の間にいくらかの感覚があり、そして短時間後には、水吸収バンドの１つに よる1480nm放射の吸収に起因して、小さな水泡が皮膚の下に形成された。明らか に、吸収されたエネルギーの量は、水泡の形成を誘導するのに十分であったが、 角質層の切除を生ずるのには十分ではなかった。また、1480nmの光の吸収は、よ り深く、十分に水和された（85％から90％の水含有率）表皮および真皮の組織に おいて主に起こり、比較的乾燥した（10％から15％の水含有率）角質層の組織に おいては起こらなかった。 実施例４ 天然の状態にある皮膚に対して影響がないことを実証した（実施例３）上で、 一連の化学的化合物を、光エネルギーの吸収、次いでこの吸収されたエネルギー の伝導を介しての角質層の標的組織へまたは標的組織を通しての移動における有 効性について評価した。試験された化合物には、Indiaインク；「SHARPIE」ブラ ンドの消えない黒、青、および赤のマーキングペン；メチレンブルー；フクシン （fuschian）レッド；epolite#67（保護レーザーゴーグルのためのポリカーボネ ートレンズに成型するために開発された吸収化合物）；ヨードチンキ；ヨードポ リビニルピロリドン複合体（「BETADINE」）；銅フタロシアニン；およびプリン ターのインクが含まれる。 実施例２に記載されたCWレーザーダイオードの両方を用いて、陽性の切除結果 が、これら全ての製品を用いた場合に、実施例１に従って調製された熱分離角質 層のインビトロサンプルにおいて観察された。しかし、いくつかの製品は他の製 品よりもより良好な性能を示した。特に、銅フタロシアニン(CPC)およびepolite #67は、最も効果的な製品であった。CPCのよりよい性能についての１つの推定的 な理由としては、500℃よりも高いその高い沸点、およびCPCがその固相をこの温 度まで維持するという事実があげられる。 実施例５ 銅フタロシアニンは、移植可能な縫合における使用に関してすでにFDAにより 認可されており、そしてMerckインデックスにヒト生体適合性に関してやや温和 なそして安定な分子として列挙されているので、採られた次の段階は、健常なヒ トのボランティアの皮膚へのCPCおよび集束光源の局所適用を組合せることであ った。微細に砕粉されたCPCのイソプロピルアルコール中の懸濁液を調製した。 用いられた適用方法は、溶液を振盪し、次いで標的部位に小滴を適用することで あった。アルコールが気化するにつれ、次いで、固相のCPCの微細で均一なコー ティングが皮膚の表面上に残った。 次いで図１に示す装置を、個体の皮膚の選択された領域を参照プレートに対し て配置することにより、その部位に適用した（ここでCPCは局所的に皮膚の上に コートされている）。参照プレートは、中央に４mmの穴を有するおよそ３cm×３ cmの薄いガラス窓からなる。次いで、CPCで被覆された領域が中央の穴の中にく るように配置した。次いで、共焦点のビデオ顕微鏡（図１）を用いて皮膚の表面 に鋭く焦点が合うようにした。ビデオシステムにおいて最も鋭く焦点が合うよう に皮膚を配置することはまた、レーザーシステムの焦点が皮膚の表面に一致する ようにビデオシステムを配置することになった。次いで操縦者は、ビデオモニタ ー上で標的部位における影響を観察しながら、レーザー光のパルスを活性化した 。操縦者は、微細孔の深さが増加するにつれ微細孔におけるレーザースポットの 集束ずれの程度を測定することにより、貫通の程度を視覚的に評価した。これは 、切除された表面を組織の中へ、カメラ/レーザー源の位置を「z」軸に沿って皮 膚の中へ向かって動かすことによって本質的に追跡することにより、操縦者が動 力学的に補正し得る。角質層が表皮まで除去されているところで、穴の底の外見 が顕著に変わり、より湿っぽくそしてより光るようになる。この変化を観察した ら、操縦者はレーザーを脱活性化した。多くの場合、被験体の水和状態ならびに 他の生理学的条件に依存して、間質液の劇的な流出が、この小さな領域にわたっ て角質層の障壁機能が除去されたことに応答して起こった。ビデオシステムを用 いて、この穿孔部位での間質液の利用可能性の視覚的な記録を記録した。 実施例６ CPCを透明な粘着性テープに適用し、次いでこれを個体の皮膚上の選択された 部位に接着させることを除いては、実施例５の手順に従った。結果は実質的に実 施例５の結果と類似していた。 実施例７ 所定の色素混合物および付随する損傷の情報について切除の閾値パラメーター を決定するために、当該分野で周知の方法に従って、屍体の皮膚上で組織学的実 験を行った。皮膚サンプルの一番上の表面を、アルコール中の銅フタロシアニン (CPC)溶液で処理した。アルコールが気化した後、固相CPCの局所層は、皮膚表面 上にわたって平均の厚さ10〜20μmで分布した。図8Aは、レーザー適用前の全厚 皮膚の断面図を示す。ここで、CPC層270、角質層274、および下にある表皮層278 を示す。図8Bは、810nm光の単一パルスが直径80μmの円にエネルギー密度4000J/ cm²で20msのパルス時間適用された後のサンプルを示す。有意の量のCPCが角質層 の表面上に、切除されたクレーター282の中心においてさえも、まだ存在するこ とは注目に値する。実験室測定は、CPC上に入射する光エネルギーのたった約10 ％のみが実際に吸収され、他の90％は反射されるかまたは後方散乱されることを 示すことはまた注目すべきである。従って、所望の加熱を生じ得る色素層に送達 される有効エネルギーフ束（flux）は、約400J/cm²だけである。8Cは、810nm光 の５つのパルスが適用された後のサンプルを示し、ここで角質層障壁は下にある 組織に損傷を与えずに除去された。これらの結果は、「理想の」光学的に調節さ れた熱切除性能を良く表している。図8Dは、50パルスが適用された後のサンプル を示す。損傷を受けた組織286は、切除されなかった組織の炭化および下にある 組織の熱変性に起因して表皮層中に存在した。図8A〜8Cは、脱水、凍結、および 画像化のための調製物のアーチファクトに起因した角質層と下にある表皮層との 間の分離を示す。 実施例８ 熱の切除機構の詳細を試験するために、熱切除法の種々の異なる実施態様を試 行し得る皮膚組織の数学モデルを構築した。このモデルは、表面に局所的に投入 された特定の熱フラックス、およびいくらか距離が離れている表面からの熱の除 去を用いて、層状の半無限(semi-infinite)媒体における温度分布を計算する。 すなわち、対流は、この２者の間で適用される。線対称の時間依存的拡散の方程 式は、ADI法(alternating-direction-implicitmethod)を使用して、円柱状の座 標において解かれる。(注意：一定温度B.C.を低い方の境界に適用し、ｚ＞infと して扱う；そしてゼロ半径の熱フラックスを、最大半径の境界に適用し、ｒ＞in fとして扱う)。層は表面に対して平行であり、そして以下のように定義される： (1)色素；(2)角質層；(3)下層の表皮；および(5)真皮。半無限媒体中の深さおよ び熱の特性、密度(rho)、比熱(c)、および伝導性(k)は、各層について明記され なければならない。 第１に、皮膚上の熱移動係数ｈを、周囲の大気温度、皮膚表面温度、および真 皮の温度によって決定される「定常の」「1-D」温度分布に基づいて計算する。 色素は存在しないと仮定して、皮膚表面上に「ｈ」を提供する。次いで、このプ ログラムによって色素層表面でのこの「ｈ」の使用、または色素表面に所望され る別の「ｈ」の投入が可能になる。次に、「定常の」温度分布を、色素表面での 明記された「ｈ」を用いて、全ての層(色素層を含む)を通して計算する。この温 度分布は、時間依存的な加熱の問題についての初期条件である。これは、「ｍ− ファイル」初期ｍを構成する。次いで、このプログラムは、時間的に進行させ、 計算し、そして各工程の温度領域を提示することによって、時間依存的な温度分 布を解明する。 本明細書中で記載される方法の各実施態様(そのそれぞれについて経験的なデ ータが集められている)が、操作パラメーターの少なくとも１セットについてモ デル化されている。これは角質層の切除がどのようにして正確かつ制御可能な様 式で達成され得るかを示す。シミュレーションの出力を、以下の異なる二つの形 式のグラフにより示す：(1)皮膚の断面図、これは、この図の最上部にプロット された、３つの臨界温度閾値を規定する３本の等温線と共に、異なる組織層を示 す、および(2)2つの異なる温度対時間のプロット、１つは標的部位の直下にある 角質層の中心部の地点についてであり、もう一方は表皮の生存細胞層と角質層 の下面との境界の地点についてである。これらのプロットは、ミクロ熱電対を組 織中へ移植することが可能であるかのように熱パルスを適用すると、各地点での 温度が経時的にどのように変動するかを示す。さらに、このモデルの適用によっ て、この方法が使用され得る範囲内である、パラメーター限界の調査が可能にな り、本方法の実施の２つの重要な局面のために外部の限界を設定し得る。第１に 、本方法を疼痛または所望されない組織の損傷を伴わずに使用し得る範囲内であ る、外延を規定する一般的な場合を示す。 本発明のいくつかの異なる実施態様において記載されるように、与えられた熱 源のいずれについても、以下の点で、被験体の皮膚組織に対する効果が最適でな くなる点が存在する。それは、被験体が疼痛知覚を感知する、または下層の表皮 および／または真皮中の生存細胞が温度を持続する、という点である。これによ って、十分に長期間維持される場合、これらの組織に損傷が与えられる。従って 、最適に加熱した局所銅フタロシアニン(CPC)色素の実施態様を基準線の方法と して用いて試験シミュレーションを行って、異なる皮膚組織層の熱時間定数が、 本方法が疼痛または隣接組織層の損傷を伴わずに用いられ得る領域を本質的にど のように規定するかを確立した。 図９および１０は、皮膚および局所色素層の概略断面図を示す。各図において 、３本の別々の等温線を示す：(1)123℃、この温度で組織中の水分の蒸発が組織 の切除を生じる；(2)70℃、この温度が数秒間維持された場合、生存細胞が損傷 を受ける；および(3)45℃、被験体が疼痛の知覚を感知する平均的な温度。この 疼痛閾値は、いくつかの基本的な生理学の教科書に記載されているが、経験から この閾値はいくらか主観的であることが示されている。実際、同一の個体での反 復試験では、穿孔部位が互いに数ミリメートル以内で異なると、有意に異なる知 覚量を示し得る。これはおそらく穿孔部位に関係した神経末端への近接度による ものである。 グラフ上の寸法は、色素および皮膚の層を規定する平坦な境界と共に、それら の異なる層を示す(mで測定)。含まれる寸法について平均的な意味で、実際の皮 膚組織は、より回旋状の境界を有しているが、このモデルは実際の組織に存在す る熱勾配の良好な近似値を提供する。ここ、およびこれに続く全てのシミュレー ションで用いた、CPC色素層および種々の皮膚層の厚さの寸法は、以下の通りで ある；色素、10m；角質層、30m；下層の表皮、70m；および真皮、100m。 この特定のシミュレーションのためにこのモデルで用いたさらなる条件は、以 下の表に示す： これらのシミュレーションを行う場合、以下の控えめな仮定を課する： １．角質層のある部分が、その温度が含有水分の熱蒸発についての切除閾値温 度を既に超えていることが示され得るが、この事象はモデル化されておらず、そ してこの蒸発によって生じる組織の続く熱エネルギーの損失は、このシミュレー ションに計算に入れていない。これにより、シミュレーションを開始した時点か ら、下層の組織において示されるわずかな温度上昇がもたらされる。 ２．同様に、銅フタロシアニン(CPC)色素層のある部分が蒸発点の550℃に達し たことが示されたとき、この事象はモデル化されていないが、この温度は単にこ のレベルに完全に限定されている。このことによっても、シミュレーションが進 行するにつれて、下層における続くわずかな温度上昇がもたらされる。 これらの単純化をこのモデルにおいて用いたときでさえ、ドナーの組織サンプ ルでの臨床的研究と組織学的研究との両方に基づく、実行の予測値と実行の経験 的観察値との間の相関は、顕著である。図９および１０において注目すべき重要 なデータは、熱パルスが適用される時間の長さ、および等温線によって示される ３つの異なる閾値温度の位置である。 図９では、21ミリ秒のパルス長を用いており、70℃の等温線は、表皮中の角質 層と生存細胞層とを分離する境界をちょうど横切る。これらの条件下でのドナー 皮膚サンプルでのインビトロの研究では、50ミリ秒で送達された熱エネルギーの 50パルスにより、生きている細胞のこの最上層に検出可能な損傷が生じる(図8D を参照のこと)。しかし、インビトロの研究において、これらの同一の操作パラ メーターでの熱エネルギーの５パルスによっては、これらの組織には何らの顕著 な損傷も生じなかったことも示された。少なくとも一過性の意味では、たとえ見 かけの損傷閾値を超え得たとしても、この温度は、実際に細胞に何らかの損傷を 生じさせるには、いくらかの累積的な時間の間維持されなけれなならないことが 理にかなうようである。にもかかわらず、このシミュレーションによって示され る基本的な情報は、熱パルスを400ジュール/cm²の流束密度(flux density)で20 ミリ秒未満、「オン時」に保つ場合、たとえ切除の閾値等温線が角質層中にまた は角質層を通して十分に移動したとしても、下層の表皮内の生存細胞に損傷は生 じない。言い換えれば、「オン時」が適切に短くなるように調節された低流束密 度の熱エネルギー源を使用することにより、角質層の切除は、下層の表皮内の隣 接する細胞にいかなる損傷も与えることなく達成され得る(図8Cを参照のこと)。 このことは、大部分はおそらくこれらの２つの組織層の熱の拡散率が有意に異な ることによる。すなわち、角質層は、約10％から20％しか水分を含まず、熱伝導 率が0.00123J(S＊cm＊K)であり、表皮(0.00421J(S＊cm＊K))よりもはるかに低 い。このことによって、切除が生じる地点に強力な空間的限定を維持しながら、 温度を角質層に蓄積させ得る。 図１０では、図９で概略した損傷の閾値臨界点で開始した大筋で同一のシミュ レーションを、さらに長い時間で行う。加熱されている色素の直径60μmの環の 内で、400ジュール/cm²の同一の流束密度で58ミリ秒間熱パルスをオンにするこ とによって、45℃の疼痛知覚の等温線は、ちょうど、真皮に含まれる皮膚の神経 支配された（innervated）層に入った。さらに、損傷の閾値等温線は、図９で見 られるよりもさらに表皮層へと有意にさらに移動した。このシミュレーションを この方法で行った多くの臨床的研究と関係付けて、モデルの精度の優れた変型が 、このモデルが、熱プローブを個体が感知する前に皮膚に適用し得る「オン時」 期間をほぼ正確に示すという点で、得られる。臨床試験において、制御可能なパ ルス発生器を使用して、皮膚上の銅フタロシアニン(CPC)色素の局所的な層に適 用される一連の光パルスの「オン時」と「オフ時」とを設定した。80ミリ秒の一 定の「オフ時」を維持する一方で、被験体が軽い「疼痛」知覚を訴えるまで「オ ン時」を段階的に増加した。例外なく、この研究に関与した全ての被験体は、45 ミリ秒と60ミリ秒との間の「オン時」で、最初の「疼痛」を訴えたが、これはモ デルによって予測されたものと非常に近似していた。さらに、「疼痛」の知覚に 関して予め述べられていた部位−部位の変わりやすさが、これらの臨床研究にお いて注目された。従って、「疼痛」として訴えられたものは、最初の明確な知覚 が気付かれ得る時点である。１つの部位では、これが痛みとして訴えられ得、一 方、隣接する部位では、同一の被験体は、単に「気づき得る」として訴えられ得 る。 この臨床研究の１つのエレメントは、同じ部位でさえ、熱パルスの不規則なパ ルス列が、被験体の精神生理的神経知覚と共に作用して、知覚された感覚の真性 の減少を引き起こし得るということの理解である。例えば、一連のより短い長さ の熱パルスを用いて、その領域のニューロンを飽和させ、このシナプス接合部で 利用し得る神経伝達物質を瞬時に涸渇させ、それによって「疼痛」のメッセージ を送る能力を制限し得る。次いで、これによって、これらの短いパルスに続く、 より長いパルスが、この順序の最初に適用された場合よりも気づきにくくなるこ とが可能になる。従って、いくつかの任意に生じさせたパルス列で一連の実験を 行い、その結果はこの仮説と一致した。この状況についての類似点は、非常に熱 い浴槽に最初に足を入れると、最初は疼痛を感じるが、熱知覚に対して順応する につれてすぐに耐え得るようになる場合の知覚において見出され得る。 実施例９ 本発明の１つの目的は、隣接する生存組織にいかなる顕著な損傷も与えること なく、無痛で角質層に微細穿孔を達成することである。実施例８および図９〜10 に概略したシミュレーションに記載するように、微細穿孔がこのような無痛かつ 非外傷性の様式で達成され得る、切除の標的スポット内の所定の熱エネルギー束 密度のいずれもについても、境界が存在するようである。インビボおよびインビ トロの研究の両方が、事実その通りであることを示し、そしてこれにより、経験 的方法による、非常によく働くようであるいくつかの操作パラメーターの開発が 可能になった。以下のシミュレーションのセットは、この方法が、これらの特定 のパラメータを使用した場合にどのように働くかを示す。 最初の場合では、10パルスのパルス列(10ミリ秒の「オフ時」で分けられる10 ミリ秒の「オン時」)を、CPCで覆った皮膚に適用する。図１１は、このパルス列 が終了した直後の皮膚組織における最終的な温度分布を示す。見られ得るように 、３つの臨界温度閾値を示す等温線は、角質層の切除が、真皮層神経には知覚が 全くなく、かつ下層の表皮の生存細胞へのまたは生存細胞を通しての損傷の閾値 の交差がほとんど無く達成されたことを示す。前述したように、実際に永久的な 損傷を細胞に与えるためには、表皮細胞は特定の箇所まで加熱されなければなら ないのみならず、ある一定の時間(一般には約５秒間と考えられる)、その温度で 維持されなければならないようである。図１２および図１３は、時間を関数とし た角質層および生存表皮の温度をそれぞれ示し、「オン時」の間の加熱および「 オフ時」の間の冷却が全体で10サイクルであることを示している。行ったインビ ボ研究についてのこのシミュレーションに関して、このシミュレーションに適合 するように設定した系パラメーターを伴う穿孔試みの90％より多くにおいて、角 質層の有効な穿孔は、被験体に疼痛を伴わずに達成され、そして数日後の続く穿 孔部位の顕微鏡検査では、組織への目立った損傷は見られなかったことに留意さ れ たい。ドナーの全層皮膚サンプルで行ったインビトロの研究もまた、モデルの挙 動予測と一致した。 実施例10 インビボの経験的研究とこれらのシミュレーションとの両方を行うにあたり、 皮膚を予冷することによって、疼痛または隣接する組織への損傷が起こる確率を 減少させるための微細穿孔のプロセスの最適化が補助されるようである。実際に 、単純な冷却したプレートを穿孔プロセスの前に皮膚に配置することによって、 これは容易に達成され得る。例えば、穿孔標的部位を囲む直径１cm円に冷却した ペルティエプレートを適用して、このプレートを数秒間約５℃で維持すると、組 織の温度は顕著に低下する。実験室でこの目的のために使用する実験デバイスの 概略図を図３Ａ〜Ｂに示す。図１１と図１４、図１２と図１５、および図１３と 図１６の比較により、実施例９で概略した実行において用いられるものと正確に 同じ10サイクルのパルス列を適用することによって、皮膚組織への温度の浸透ま たは皮膚組織を通しての温度の浸透の制御がどれだけ改善されたかを理解し得る 。さらに、角質層は表皮および真皮に比較して比較的低い温度拡散率および比熱 を有することが有利である。一旦冷却されると、表皮および真皮の高度に水和し た組織は、その温度を上昇させるためにより大きな熱エネルギー投入を要求し、 一方、角質層は、比較的乾燥した構造により、切除の閾値まで迅速に加熱され得 る。 実施例11 一旦、角質層の効果的な無痛の切除および微細穿孔の基礎になるエネルギーを 皮膚組織にまたは皮膚組織を通じて送達する基本的な熱伝導機構が理解されると 、図４〜７に示すホットワイヤ実施態様のような、必要とされる迅速な接触点の 温度変調を達成するためのいくつかの異なる特定の方法が考えられ得る。 本明細書中で記載するように、基本的な実施態様は、オーム加熱エレメント( 図４)(例えば、小さなコードレスのはんだごてのチップ)を使用する。適切なサ イズの比較的非反応性のワイヤがその回りを巻き付け、ワイヤの少量が、ヒータ ーの本体から突き出された状態にある。定電流源で電気を印加する場合、ヒータ ーはある温度に達すると、数秒以内に、周囲の大気への対流損失によって定常状 態に達する。同様に、ワイヤ(この熱システムの一部である)は、定常状態に達し て、その結果、ワイヤのまさにそのチップが、ほぼ任意温度(これらのタイプの 構成エレメントでは約1000℃まで)に上昇し得る。このチップは、所望の大きさ の微細孔を正確に提供するようにサイズ決定され得る。 実験室では、チップから突き出ている約２mmのワイヤを伴う「WAHL」コードレ スはんだごての置き換え可能なチップに据え付けられた、直径80μmのタングス テンワイヤが使用されている。熱電対を用いて、チップの温度はその定常状態で 測定され、そして定電流設定を変化させることによって、700℃を超える定常状 態の温度に容易に達し得ることが留意される。所望の変調を達成するために、低 質量の、高速応答電気機械的アクチュエーターを、ワイヤの位置が200Hzの速度 までで2mmを超えて直線的に移動され得るようチップに連結した。次いで、精密 ステージ上に装置全体を備え付けることによって、この振動しているチップは、 一回10ミリ秒未満の時間のみ皮膚に接触し(「オン時」)、一方、任意に長い期間 の「オフ時」がパルス発生器を適宜にセットすることによって達成され得るよう な様式で、非常に制御可能に皮膚表面と接触し得た。これらのインビボの研究に よって、穿孔を受けている被験体が、ワイヤのチップが皮膚と接触していると知 る前にさえ、穿孔は、実際に達成され得ることが示された。 光学的に加熱された局所CPC色素の実施態様とこの実施態様との性能を比較す るために、以下のシミュレーションを実施例８の手順に従って行った。本質的に 、初期条件を変えるだけで、ホットワイヤの実施態様は同一のシミュレーション コードを用いて行われ得る。ワイヤとの接触は本質的に瞬時に起こるので、CPC 色素層において時間依存的な熱の蓄積はなく、そしてワイヤが皮膚との接触から 物理的に除去される場合、加熱されたCPC色素層での場合のような、表面上にな お残る残熱は存在しない。また、ワイヤそれ自身が切除/微細穿孔についての標 的される領域を規定するので、角質層への適用前に熱エネルギーの横への拡散は あってはならない。「ホットワイヤ」実施態様の比較性能を図１７〜１９に示す 。 実施例12 この実施例では、実施例１０の手順に従って皮膚を予冷した以外は、実施例１ １の手順に従った。同様に、標的部位を予冷することによって、「ホットワイヤ 」実施態様と同様の明確な結果が得られる。「ホットワイヤ」アプローチの予冷 したシミュレーションの結果を、図２０〜２２に示す。 実施例13 本開示の背景の導入で議論したように、Tankovichの'803特許は、一見したと ころ本発明の請求の範囲に類似しているようである。本実施例では、シミュレー ションモデルを、Tankovich '803において明記された操作パラメーター（すなわ ち、１sのパルス幅および40,000,000W/cm²の出力レベル）で設定した。図２３お よび２４は、これらの条件下では、角質層のどの部分も、水分が瞬時に蒸発する 閾値である123Ｃに達せず、従って角質層の切除/微細穿孔が生じないことを示す 。実際、このタイプの高いピーク出力を適用すれば、局所色素層への短時間のパ ルスは、皮膚に影響を及ぼさずに単に皮膚の表面の色素を蒸発させるのみである 。従って、この実施例から、Tankovichの'803に明記される条件は、本発明の請 求の範囲では有効でないことが示される。 実施例14 この実施例では、実施例６の手順に従って皮膚を穿孔した後に得た間質液を採 取して分析し、そのグルコース濃度を決定した。データを４人の糖尿病でない被 験体およびグルコース負荷試験を受けている６人のI型糖尿病の被験体について 得た。被験体の年齢は、27から43歳の範囲であった。研究の目的は、被験体から 十分な間質液(ISF)を無痛的に採取するための方法の有用性を試験して、ISFサン プルのグルコース含量についてのアッセイを可能にし、次いでこれらの濃度を被 験体の全血中に存在するグルコースレベルと比較することであった。 全ての被験体に、血液およびISFのグルコースアッセイの両方を、Miles-Bayer からの「ELITE」システムを使用して行った。10人の被験体全員が同一の測定プ ロトコルを受け、インスリン依存性糖尿病の被験体についてはグルコース負荷お よびインスリン注射について考慮した調整を行った。 研究の基本的な設計は、適度な数のボランティア(このうち何人かは糖尿病で あり、何人かは糖尿病でない)を募集することであり、彼らから、一連のISFと全 血とのサンプルの対を３〜４時間の研究期間を通して３〜５分毎に採取した。血 液およびISFのサンプルを共にグルコースについてアッセイし、そして血中グル コースレベルと間質液との間の統計学的関係を決定した。全血のグルコースレベ ルと比較して、仮説をたてたISFグルコースレベルの時間的な遅れを試験するた めに、研究の被験体をそのグルコースレベルが顕著で劇的な変化を表すように誘 導した。これは、各被験体を試験の開始前の12時間絶食させ、次いで、３つの絶 食した血液およびISFのグルコースレベルのセットで各被験体の基準線グルコー スレベルを確立した後に、被験体にグルコース負荷を与えることによって行った 。基準線レベルを確立した後、被験体に以下のガイドラインに基づいて甘いジュ ースの形態でのグルコース負荷を与えた： ｉ．対照被験体については、グルコース負荷を体重１ポンドあたり0.75グラム のグルコースに基づいて算出した。 ii．インスリン依存性糖尿病の被験体については、グルコース負荷は50グラム のグルコースであった。さらに、グルコース負荷の摂取の直後、糖尿病の被験体 には、速効性インスリンの通常の午前の用量の自己注射を行わせた。糖尿病の被 験体が300mg/dLを上回る絶食時グルコースレベルを示す場合には、最初にインス リンの自己注射を行ってもらい、そして血中グルコースレベルが120mg/dL未満に 低下した後にグルコース負荷を提供した。 募集した各被験体には、まず「インフォームドmコンセント」文書において研 究について完全に説明した。彼らは公式的にこのプログラムに参加する前にこの 文書を理解し、そしてそれに署名することが求められた。受諾に際し、彼らは病 歴についての質問表を完成した。実行した詳細な臨床的手順は以下の通りであっ た： （ａ）被験体は、研究の前夜の午後9:00から絶食し、水のみを摂取した。カフ ェイン、たばこ、果汁はこの期間中許可されなかった。 （ｂ）被験体は、翌日の午前9:00までに試験の施設に到着した。 （ｃ）被験体は、研究手順の間リラックスできるように、リクライニングチェ アに座った。 （ｄ）被験体が到着したときから開始して３〜５分間隔で全血およびISFのサ ンプルの両方を採取し、次の３〜４時間これを続けた。データを採取した期間は 、被験体の血中グルコースレベルがグルコース負荷後に正常な範囲に戻り、そし て安定した時に基づいた。ISFサンプルを、光学穿孔であるISFポンプ法(以下に より詳細に記載)を用いて採取した。各ISFサンプルは、ほぼ５μL容量であり、E LITE試験片(strip)を満たすに十分であることを確実にした。血液サンプルを、 従来の指穿刺ランセット(finger prick lancet)を用いて得た。ISFおよび血液の サンプルの両方を、Miles-BayerからのELITE家庭用血糖値測定器システムでグル コースについて迅速にアッセイした。「真の」血中グルコースレベルの評価値を 改善するために、各指スティックサンプルについて２つの別々のELITEアッセイ を行った。 （ｅ）与えられた個体について全データ採取期間を通して同一部位からのISF の連続した採取を容易にするために、５×５行列の25の微細孔を被験体の上部前 腕部に作製した。各微細孔は直径が50μmと80μmとの間であり、それぞれは300 μm離れていた。中央に６mmの穴を有する直径30mmのテフロンディスクを、感圧 接着剤で被験体の前腕部に接着し、そして6mmの中央の穴が５×５行列の微細孔 にわたって位置するように、設置した。小さな吸引ホースを接続し、穿孔した領 域に軽く減圧(10〜12インチHg)を適用することにより、微細孔を通してISFを体 外へ流出させるように誘導し得る便利な方法がこの接着によって可能になった。 テフロンディスクの最上部に、透明なガラス窓を設置し、これによって操作者が その下の微細穿孔される皮膚を直接目視することが可能になった。５μLのISF滴 が皮膚の表面上に形成された場合、この窓を通してその部位を視覚的にモニタリ ングすることによりこれは容易に確認され得た。この減圧のレベルは、約５ポン ド/インチ²(PSI)の公称圧力勾配を生じた。微細孔が全くなければ、ISFは、軽度 の減圧のみを用いて被験体の身体から採取され得なかった。 （ｆ）最初の３つのサンプルの対を採取した後、被験体に非常に甘くしたオレ ンジジュースの形態でグルコース負荷を与えた。与えたグルコースの量は、糖尿 病でない被験体については体重１ポンドあたり0.75グラムであり、そして糖尿病 の被験体については50グラムであった。糖尿病の被験体にはまた、グルコース負 荷の摂取と同時に、この50グラムレベルのグルコースに基づいて適切に算出した 投与量で、速効性のインスリンの注射(定期的)を自己投与させた。インスリンの 注射を受けたときと注射の最大の効果が現れる時との間の通常の1.5〜2.5時間の 遅れで、糖尿病の被験体は、300mg/dLまでの範囲で血中グルコースレベルが上方 向へ偏位し、次いで、インスリンが効果をもたらすにつれ正常な範囲へ急速に低 下することを示すことが予測された。糖尿病でない被験体は、標準的なグルコー ス耐性試験のプロフィールを示すことが予測され、これは、代表的にはグルコー ス負荷の投与後の45分から90分までに、150mg/dLと220mg/dLとの間で血中グルコ ースレベルがピークに達し、次いで次の１時間程度にわたってその正常な基準線 レベルに急速に低下することを示した。 （ｇ）グルコース負荷の投与、またはグルコース負荷およびインスリン注射の 投与に続き、被験体に、次の３〜４時間の間に５分毎に、ISFおよび指穿刺全血 のサンプルの採取を、同時に行った。３つの連続するサンプル中の血中グルコー スレベルが被験体のグルコースが安定したことを示したときに、サンプリングを 終了した。 これらのデータの試験に際して、いくつかの特徴が明らかであった。特に、EL ITE試験片の特定のバッチのいずれについても、血液について示されたレベルと 比較して、血糖測定器(glucometer)でmg/dLのグルコースで示された出力におい て、明らかなずれが存在する。読みとり値の上昇は、ISF中にヘマトクリットが 存在しないこと、およびISFと全血との間の電解質濃度の正常な差異によると予 測される。この出力におけるずれの基礎となる理由にかかわらず、参照アッセイ との比較によって、真のISFグルコースレベルがELITEシステムによって出された 値と直線的に相関することが決定された。そのスケーリング係数は、ELITE片の いずれの特定のバッチについても一定であった。結果として、ISFグルコースレ ベル値対全血測定値の比較については、一次の直線相関がISFデータに対して以 下のように適用された：ISF_{ク゛ルコース}=0.606＊ISF_ELITE＋19.5。 ISFグルコースレベルを測定するために使用した場合、このELITE血糖測定器の 出力のスケーリングは、全データセットにわたって、血中グルコースレベルを評 価するためにISFの使用に関する誤差項(error terms)を試験することが可能にな る。もちろん、線形スケーリングが全くなくても、ISFグルコース値と血中グル コースレベルとの間の相関は、スケーリングした場合と同一である。 ISFグルコースの題目に関する公開された大多数の文献ならびに予備的なデー タに基づくと、ISFグルコースレベルと指スティックからの全血中に存在するグ ルコースレベルとの間には、15〜20分の遅れが観察されることがもともと予測さ れた。このことは、分析時にデータが示したものではない。特に、各個体のデー タセットを解析して、ISFグルコースレベルと血中グルコースレベルとの間の最 大の相関を達成するために必要とされた時間のずれを決定したとき、被験体のこ のセットについての最悪の場合の時間の遅れはわずか13分であり、そして平均的 な時間の遅れは、わずか6.2分であったことが発見された。数人の被験体は、ほ とんど瞬間的(約１分)な時間的追従を示した。 このデータセットで観察された最小の遅れ量に基づいて、図２５に示すグラフ は、長期の時間スケールで次々に連結した全10個のグルコース負荷試験を示す。 全臨床データセットを全く同じ様式で処理した場合、ISFグルコースレベルと血 中グルコースレベルとの間で高レベルの追従を示す、時間のずれがまったくない データが示される。全データセットを全体的にずらして最良の時間的追従評価値 を見出した場合、ISFグルコースレベルと血中グルコースレベルとの間の相関は 、２分の遅れでｒ＝0.97のｒ値でピークになる。これはｒ＝0.964のずれのない 相関からごく些細に改善されただけである。従って、分析の残りについては、IS F値を時間のずれを課さずに処理する。すなわち、血液およびISFのグルコースレ ベルの各セットを、同時に採取したデータ対として扱う。 ずれのないElite ISF読みとり値をISF中に存在する比例グルコースを反映する ようにスケーリングした後、これらのデータに関する誤差を試験することは可能 であった。これに関して最も単純な方法は、２つのELITE指スティック血中グル コース読みとり値の平均値が実際に絶対的に正しい値であると仮定し、次いでス ケーリング化ISF値をこれらの平均血中グルコース値と単に比較することである 。これらのデータは以下の通りである：標準偏差血液-ISF、13.4mg/dL；ISFの分 散係数、9.7％；２つのELITEの標準偏差、8.3mg/dL；および血液の分散係数(Mil e s)、６％。 これらのデータが示すように、血液に基づく測定値は既に誤差項を含む。実際 、製造業者が公開した性能データは、ELITEシステムが、５％と７％との間の見 かけの分散係数(CV)を有し、これは、血中のグルコースレベルおよびヘマトクリ ット量に依存していることを示している。 ISFグルコースと血中グルコースとの間の差異項をさらに見たものを、図２６ に分散プロットの形で示す。この図では、90％信頼区間の上部および下部の境界 もまた、参考のために示す。たった２つの例外だけで、100mg/dL未満の血中グル コースレベルの範囲内の全てのデータがこの90％信頼区間の誤差バー内に収まっ ていることが認められることは興味深い。このことは、低血糖への傾向が消失す る結果が、糖尿病の使用者にとって顕著に有意であるので、重要である。すなわ ち、それらを高めに予測するよりも40〜120mg/dLでグルコースレベルを低めに予 測することがはるかに良い。 本質的に、ELITEシステムをISFで使用したときの基本的なアッセイ誤差が全血 でのELITEの使用に関連したアッセイ誤差に匹敵すると仮定した場合、血中グル コースからのISFグルコースの偏差は以下のように記載され得る： ISF_偏差＝[(ISF_実測値)²＋(ISF_実測値)²]^1/2 この式を上記の値に適用して、ISF誤差項の評価した「真の」値を求め得る： ISF_実測値=[(ISF_偏差)²−(血液_実測値)²]^1/2 すなわち、式を解くと、 ISF_実測値＝[(13.4)²−(8.3)²]^1/2＝10.5mg/dl 血中グルコースレベルに対するISFの相対偏差のヒストグラムを図27に示す。 生体膜における孔を通る薬物送達 本発明はまた、薬物(現在は経膜的に送達されている薬物を包含する)を、角質 層もしくは他の生体膜における微細孔を通して送達するための方法を包含する。 １つの例示的な実施態様では、送達は、穿孔部位の上のリザーバーに溶液を入れ ることにより達成される。別の例示的な実施態様では、圧力勾配を、送達をさら に増強するために使用する。なお別の例示的な実施態様では、音波エネルギーを 、 送達をさらに増強するための圧力勾配と共にまたは用いずに、使用する。音波エ ネルギーは、伝統的な経皮的パラメーターに従って操作され得るか、または瞬間 的に記載される音響流動効果の利用によって操作され得る。これにより、送達溶 液を穿孔された生体膜に押し込む。 実施例15 本実施例は、局所鎮痛剤であるリドカインの送達のための角質層穿孔の使用を 示す。リドカイン溶液はまた、角質層を横切るその受動的拡散を増強するために 設計された化学的浸透増強処方物を含んでいた。例示的な送達装置300の図面を 図28に示し、ここでは、装置は、薬物含有溶液312を保持するためのリザーバー3 08を囲むハウジング304を備える。ハウジングの上部は、音波エネルギーを提供 し、角質層324中の微細孔320を通して薬物含有溶液の輸送を補助するための超音 波トランスデューサー316を備える。超音波トランスデューサー中のポート328は 、角質層中の微細孔を通して薬物含有溶液の輸送をさらに補助するために、それ に対する圧力の付与を可能にする。送達装置は、個体の皮膚の選択された領域に 対して、それが、少なくとも１つの、そして好ましくは複数の微細孔の上に置か れるように適用される。ハウジングの下部に付着された接着層332は、この装置 を、リザーバー中の薬物含有溶液が微細孔と液体連絡するように、皮膚に接着さ せる。微細孔を通しての薬物の送達は、下にある表皮336および真皮340中への輸 送をもたらす。 ５人の被験体について、超音波とともに穿孔を用いて薬物送達の有効性を試験 した。この実験では、親指と上腕との間で等しい間隔で配置され、約３インチ離 れた被験体の左前腕上の２つの部位を用いた。親指近くの部位を、部位１と呼び 、親指から最も遠い部位を部位２と呼ぶ。部位１は、対照として用い、ここでは 、リドカインおよびエンハンサー溶液を、同じ送達装置300を用いて、しかし任 意の角質層の微細穿孔または音波エネルギーを用いずに適用した。部位２を、１ cmの直径の円内に含まれる格子中で0.8mmの間隔で配置された24の穴で穿孔した 。部位２中の微細孔を実施例６の手順に従って生成した。リドカインおよび低レ ベルの超音波を適用した。超音波の適用を、0.4ボルトのピーク間入力(peak to pe ak input)を用い、65.4kHz基礎周波数を伴う10Hzで生じる1000カウントのバース ト(burst)、即ち、15ミリ秒のバーストの間エネルギー化し、次いで次の85ミリ 秒の間は切られるトランスデューサーを用いたパルス変調信号を用い、バースト 方式(burst mode)にセットされた注文製造のZevex超音波トランスデューサーア センブリを用いて行った。増幅器のトランスデューサーへの測定された出力は、 0.090ワットRMSであった。 リドカインの適用の後、試験部位を横切って30ゲージのワイヤで擦ることによ り感覚測定を行った。実験を両方の部位で行い、部位１では10〜12分間および部 位２では２回の５分間の間隔を、同じ部位に対して連続的に適用した。両方の部 位を、10〜０のスケールを用いるしびれ感について評価した。ここで、10はしび れ感のないことを示し、そして０は試験された被験体により報告されたような完 全なしびれ感を示した。以下の結果の要約は５人の被験体すべてについてである 。 対照部位である部位１は、10〜12分でほとんどまたは全くしびれ感を示さなか った(スケール７〜10)。約20分で、溶液が完全に角質層に浸透するにつれて、い くらかのしびれ感(スケール３)が部位１で観察された。部位１は、リドカイン適 用の終了時にきれいにされた。部位２は、穿孔を含む１cm円中でほぼ完全なしび れ感(スケール０〜１)を示した。この１cm直径の円の外側では、しびれ感は、2. 5cm直径の円では１までほぼ直線的に減少し、2.5cm直径の円の外側ではしびれ感 はなかった。第２回目の付与後の部位２の評価は、約1.2cm直径の全体としてわ ずかにより大きなしびれの円を生じ、しびれ感は、前腕に対して垂直な２〜2.5c mの直径と前腕に対して平行な２〜６cmの直径とを有する不規則な卵形パターン で１まで直線的に減少した。この領域の外側ではしびれ感は認められなかった。 代表的な被験者に対して得られた例示の結果のグラフ表示を図29A〜Cに示す。図 29Aおよび29Bは、それぞれ、５および10分後に(穿孔された)部位２で得られた結 果を示す。図29Cは、部位１(穿孔のない対照)で得られた結果を示す。 経皮流動を増強するための音波エネルギーおよびエンハンサー 音波トランスデューサーにより生成した音波エネルギー領域(field)の物理学 が、音波周波数が他の方法により変調され得、達成される流動速度を改善し得る 方法において利用され得る。本明細書で参考として援用される米国特許第5,445, 611号の図１に示されるように、音波トランスデューサーのエネルギー分布は、 近領域(near field)および遠領域(far field)に分けられ得る。長さNにより特徴 付けられる近領域は、最初のエネルギー最小から最後のエネルギー最大までのゾ ーンである。最後の最大の遠位にあるゾーンが遠領域である。近(N)領域パター ンは、多数の密接な間隔で配置された局所圧力ピークおよび空白(null)が優勢で ある。近領域ゾーンの長さNは、周波数、サイズ、およびトランスデューサー面 の形状、および超音波が通って伝わる媒体中の音の速度の関数である。単一トラ ンスデューサーについては、その通常操作範囲内の強度変動は、線形様式である 以外は、音波エネルギー分布の性質に影響しない。しかし、複数トランスデュー サーを備えたシステムについては、すべてが周波数および振幅の両方において変 調され、個々のトランスデューサーの相対強度は、それが皮膚であるか別の媒体 であるか否かに拘わらず、音波媒体中のエネルギー分布に影響する。 例えば、約１〜20％の範囲内で、適度の量だけ音波エネルギーの周波数を変え ることにより、ピークおよび空白のパターンは、相対的に一定なままであるが、 近領域ゾーンの長さNは周波数に正比例して変化する。周波数の顕著な変化(例え ば、２以上の係数)は、トランスデューサー中に異なるセットの共鳴または振動 モードを生成する可能性が高く、有意にかつ予期不能な異なる近領域エネルギー パターンを生じる。従って、音波周波数における適度な変化を用いて、ピークと 空白の複合パターンは、アコーディオン様様式で圧縮または伸張される。周波数 変調の方向を選択することにより、これらの局所圧力ピークのシフトの方向は制 御され得る。皮膚の表面で音波エネルギーを適用することにより、音波周波数の 選択的変調は、皮膚を通るこれらの局所圧力ピークの動きを、身体の内部に向か って、または身体の表面に向かってのいずれかに制御する。高から低への周波数 変調は、圧力ピークを身体内に駆動し、その一方、低から高への周波数変調は、 圧力ピークを、身体内から皮膚の表面に向かってかつ皮膚を通って身体の外側に 引っ張る。 この適用のための代表的なパラメーターを、例えば、1.27cm直径の音波トラン スデューサーおよび名目上10MHzの操作周波数および水の音響インピーダンスに 類似の音響インピーダンスを仮定すると、1MHzの周波数変調は、角質層の近傍で 近領域エネルギーパターンのピークと空白の約2.5mmの動きを生成する。分析物 の経皮的および/または経粘膜的回収の展望からは、この程度の動きは、角質層 の十分に下の領域、そして表皮、真皮、およびその下のその他の組織さえへの接 近を提供する。任意の所定のトランスデューサーについて、この周波数変調が最 も効果的である周波数の最適範囲が存在し得る。 皮膚を横切る薬物または分析物の流動性はまた、抵抗力(拡散係数)または駆動 力(拡散に対する勾配)のいずれかを変えることにより増加させ得る。流動性は、 いわゆる浸透または化学的エンハンサーの使用により増強され得る。 化学的エンハンサーは、２つの主な成分のカテゴリー、即ち、細胞エンベロー プ混乱性化合物および溶媒、または細胞エンベロープ混乱性化合物と溶媒との両 方を含む二元系から構成される。 細胞エンベロープ混乱性化合物は、局所的薬学的調製物において有用であると して当該技術分野で公知であり、そしてまた皮膚を通じる分析物の回収において 機能する。これらの化合物は、角質層の細胞エンベロープの脂質構造を混乱させ ることにより皮膚浸透を補助すると考えられている。これら化合物の包括的なリ ストは、本明細書中に参考として援用される1982年６月13日に公開された欧州特 許出願第43,738号に記載されている。任意の細胞エンベロープ混乱性化合物が本 発明の目的に有用であると考えられる。 適切な溶媒は、水；プロピレングリコールおよびグリセロールのようなジオー ル；エタノール、プロパノール、および高級アルコールのようなモノアルコール ；DMSO；ジメチルホルムアミド；N,N-ジメチルアセトアミド；2-ピロリドン；N- (2-ヒドロキシエチル)ピロリドン、N-メチルピロリドン、1-ドデシルアザシクロ ヘプタン-2-オンおよびその他のn-置換-アルキル-アザシクロアルキル-2-オン( アゾン)などを含む。 1985年８月27日に発行された、Cooperの米国特許第4,537,776号は、浸透増強 のための特定の二元系の使用を詳述する先行技術および背景情報の優れた要約を 含む。その開示の完全性のため、その中で用いられる情報および用語を本明細書 中に参考として援用する。 同様に、上記で言及した欧州特許出願第43,738号は、親油性薬理学的活性化合 物送達用の細胞エンベロープ混乱性化合物の広範なカテゴリーとともに、溶媒と して選択されたジオールを用いることを教示する。細胞エンベロープ混乱性化合 物およびジオールの開示における詳細さのために、欧州特許出願第43,738号のこ の開示もまた、本明細書中に参考として援用される。 メトクロプラミド浸透を増強するための二元系が、1985年８月21日に公開され た、英国特許出願第GB 2,153,223A号に開示され、そしてC8-32の脂肪族モノカル ボン酸(C18-32の場合不飽和および/または分枝)の一価アルコールエステルまた はC6-24脂肪族モノアルコール(C14-24の場合不飽和および/または分枝)および2- ピロリドン、N-メチルピロリドンなどのようなN-環状化合物からなる。 プロピレングルコールモノラウレートおよびメチルラウレートとともに、ジエ チレングリコールモノエチルまたはモノメチルエーテルからなるエンハンサーの 組合せは、プロゲステロンおよびエストロゲンのようなステロイドの経皮送達を 増強することが、米国特許第4,973,468号に開示されている。グリセロールモノ ラウレートおよびエタノールからなる、薬物の経皮送達のための二重のエンハン サーが、米国特許第4,820,720号に示されている。米国特許第5,006,342号は、エ ステル/エーテルの各脂肪酸/アルコール部分が約８〜22炭素原子である、C₂から C₄アルカンジオールの脂肪酸エステルまたは脂肪アルコールエーテルからなる、 経皮薬物投与のための多くのエンハンサーを列挙している。米国特許第4,863,97 0号は、局所適用のための浸透増強組成物を示し、この組成物は、所定量の、オ レイン酸、オレイルアルコール、およびオレイン酸のグリセロールエステルのよ うな１つ以上の細胞エンベロープ混乱性化合物；C₂またはC₃アルカノールおよび 水のような不活性希釈剤を含む浸透増強ビヒクル中に含まれる活性透過性物質を 含む。 その他の化学的エンハンサーは、二元系に必ずしも関連せず、Herschler、米 国特許第3,551,554号；Herschler、米国特許第3,711,602号；およびHerschler、 米国特許第3,711,606号で教示されるようなDMSOまたはDMSOの水溶液、ならびにC ooper、米国特許第4,557,943号に記載されるようなアゾン(n-置換-アルキルアザ シクロアルキル-2-オン)を含む。 いくつかの化学的エンハンサーシステムは、毒性および皮膚過敏のような負の 副作用を有し得る。米国特許第4,855,298号は、皮膚刺激特性を有する組成物を 含む化学的エンハンサーにより引き起こされる皮膚過敏を、抗刺激効果を提供す るに十分な所定量のグリセリンを用いて低減する組成物を開示する。 角質層の微細穿孔と、化学的エンハンサーの使用をともなう音波エネルギー適 用の組合せは、角質層を通じる分析物回収または浸透送達の改善された速度を生 じ得るので、利用された特定のキャリアビヒクルおよび特に化学的エンハンサー は、このいくつかが上記で述べられそして本明細書中に参考として援用されてい る先行技術ビヒクルの長いリストから選択され得る。当該技術分野で容易に入手 可能であるものを特に詳細に記述しまたは列挙する必要があるとは考えられない 。本発明は、化学的エンハンサー自身の使用に関せず、そして皮膚を通じる薬物 の送達に有用なすべての化学的エンハンサーは、光学的微細穿孔において色素と ともに、かつまた皮膚表面の下からおよび皮膚表面を通じて分析物の測定可能な 回収または皮膚表面を通じる透過性物質または薬物の送達を行うことにおいて音 波エネルギーとともに機能すると考えられる。 実施例16 変調された音波エネルギーおよび化学的エンハンサーを、ヒト死体皮膚試料で の経皮流動を制御する能力について試験した。これらの試験では、表皮膜は、実 施例１の熱分離法によりヒト死体全体皮膚から分離した。表皮膜を切断し、そし て角質層を上部(ドナー)区画または下部(レシーバー)区画のいずれかに面して浸 透セルの二等分の間に配置した。改変されたFranzセルを用いて、米国特許第5,4 45,611号の図２に示されるように表皮を保持した。各Franzセルは、１つ以上の クランプを用いて一緒に保持された上部チャンバーと下部チャンバーからなる。 下部チャンバーは、そこを通じて物質が添加または取り出され得るサンプリング ポートを有する。角質層試料は、上部チャンバーと下部チャンバーとの間に、そ れらが一緒にクランプで固定されるときに保持される。各Franzセルの上部チャ ンバーは改変されて、超音波トランスデューサーを、角質層膜の1cm以内に配置 させるようにする。メチレンブルー溶液を指標分子として用い、角質層の浸透を 評価した。各実験のプロセスおよび結果の視覚による記録を、ビデオカメラおよ びビデオカセットレコーダー(示さず)を用いて日時を記録した磁気テープ形式で 得た。さらに、試料を、吸収分光光度計を用いる測定のために回収し、実験の間 に角質層膜を浸透した色素の量を定量した。使用に適した化学的エンハンサーは 、上記のような広範な範囲の溶媒および/または細胞エンベロープ混乱性化合物 にわたって変動し得る。利用された特定のエンハンサーは、50/30/15/2.5/2.5容 量比のエタノール/グリセロール/水/グルセロールモノオレート/メチルラウレー トであった。音波エネルギーを生成かつ制御するためのシステムは、プログラム 可能な０〜30MHzの任意の波形発生器(Stanford Research Systems Model DS345) 、20ワット０〜30MHz増幅器、および15および25MHzにそれぞれピーク共鳴を有す る２つの非焦点超音波浸漬トランスデューサーを備えていた。同じドナーからの 角質層試料の試験のために６つのセルを同時に調製した。一旦角質層試料を取り 付け、それらを、任意の試験がなされる前に少なくとも６時間の間、蒸留水を用 いて水和させた。 実施例17 化学的エンハンサーなしの音波エネルギーの効果 実施例16で上記したように、熱分離した表皮を、特に他に注記されなければ、 表皮側を上に向け、そして角質層側を下に向けてFranzセル中に置いた。下部チ ャンバーを蒸留水で満たす一方、上部チャンバーを蒸留水中の濃縮メチレンブル ー溶液で満たした。 熱分離された表皮：上部チャンバーをメチレンブルー溶液で満たした直後、セ ルの１つにトランスデューサーを完全に浸漬して音波エネルギーを適用した。こ の配置は、例えば、トランスデューサーを、皮膚のひだの反対側に有すること、 または音波エネルギーを、同様に配置された反射体プレートから反射させられる ようにしてひだの他の側から収集デバイス中に分析物を「押す」ために用いられ ることに相当する。音波エネルギーセッティングは、最初、20ボルトピーク間(P -P)入力波形に等しい強度で、名目上25MHzの操作周波数にセットする。これは、 おおよそ、トランスデューサーに対して１ワットの平均入力電力および同様に、 この特定のトランスデューサーについて製造者の公称値１％の変換効率を仮定す ると、活性領域の0.78cm²表面または0.13ワット/cm²の音波強度にわたって約0.0 1ワットの音波出力電力に相当する。３つの他の対照セルは、それらに適用され る音波エネルギーを有さなかった。５分後に音波エネルギーを遮断した。この間 隔の間に任意のセルで角質層を横切る色素流動の可視的な指標は観察されず、２ mlのレシーバー媒体中、約0.0015％(v/v)より低いレベルの色素溶液を示した。 これらの同じ３つの対照セルおよび１つの実験セルの試験を以下のように継続 した。音波エネルギーの強度は、70ボルトピーク間入力12ワット平均パワー入力 の駆動装置から利用できる最大限の可能な出力、または(0.13ワット/cm²)の音波 出力強度まで増加させた。また、周波数をセットして30MHzから10MHzに変調また は掃引(sweep)した。この20MHzの掃引は１秒あたり10回実施し、即ち、掃引速度 は10Hzであった。これらの入力パワーレベルでは、オーバーヒートを避けるため に音波エネルギートランスデューサーをモニタリングする必要があった。接触熱 電対をトランスデューサーの本体に付与し、そしてパワーのオンとオフをサイク ルさせて42℃以下でトランスデューサーの最大温度を維持した。１分オンおよび １分オフの約50％のデューティサイクルで、約30分のサイクル最大パワーの後、 なおメチレンブルー色素による角質層の肉眼で検出可能な浸透はなかった。 次いで、冷却水ジャケットを音波エネルギートランスデューサーに取り付け、 最大エネルギーレベルでさらなる励起を可能にした。同じ３つの対照セルおよび １つの実験セルを用い、音波エネルギーを、最大パワーで12時間実験セルに付与 した。この時間の間、上部チャンバー中の流体の温度は、インビボの角質層の通 常温度約31℃をほんのわずかに超える、ほんの35℃まで上昇した。上記のように 、付与された音波エネルギーの12時間後、４つのセルすべてにおいて、角質層を 通る色素流動の可視的な証拠がないことは明らかであった。 実施例18 化学的エンハンサーなしの音波エネルギーの効果 穿孔された角質層：６つのセルを、実施例16で上記したように調製した。Fran zセルの上部チャンバーおよび下部チャンバーを保持するクランプを、上部区画 を下部区画から通常シールするために必要な程度よりきつく、そして熱分離され た表皮試料中に穿孔および「ピンホール」を人工的に導入する程度まで締めた。 色素溶液を各セルの上部チャンバーに添加したとき、角質層中に形成された穿孔 を通じる下部チャンバー中への色素漏失の即座の可視的な兆候があった。角質層 が小さな「ピンホール」を有してこのように穿孔された細胞に音波エネルギーを 付与したとき、角質層中のピンホールを通じる流体の輸送における急速な増加が 観察された。指標色素分子の輸送速度は、音波エネルギーが付与されるか否かに 直接関係した。即ち、音波エネルギーの付与は、角質層中のピンホールを通じる 指標分子の即座の(ほぼ0.1秒未満の遅延時間)パルスを引き起こした。指標分子 のこのパルスは、音波エネルギーの遮断に際し即座に止まった(ほぼ0.1秒未満の 遮断遅延)。パルスは上記のように繰り返し得た。 実施例19 音波エネルギーおよび化学的エンハンサーの効果 ２つの異なる化学的エンハンサー製剤を用いた。Chemical Enhancer 1またはC E1は、50/30/15/2.5/2.5容量比のエタノール/グリセロール/水/グリセロールモ ノオレエート/メチルラウレートの混合物であった。これらは、一般に、薬学的 賦形剤としての使用についてFDAにより安全、即ちGRASと見なされる成分である 。化学的エンハンサー2またはCE2は、経皮薬物送達の増強に非常に効果的である ことが示された実験製剤であるが、一般に、長期間の経皮送達適用には刺激的過 ぎると考えられている。CE2は、エタノール/グリセロール/水/ラウラドン(laura done)/メチルラウレートを50/30/15/2.5/2.5の容量比で含んでいた。ラウラドン は、2-ピロリドン-5-カルボン酸(「PCA」)のラウリル(ドデシル)エステルであり 、そしてまたラウリルPCAとも呼ばれる。 ６つのFranzセルを、熱分離された表皮を表皮層を下に設置、即ち、角質層側 を上に向けたことを除いて先(実施例16)のようにセットアップした。水和は、各 試料を一晩蒸留水に曝すことにより確立した。実験を始めるために、６つのすべ てのセル中の下部チャンバー中の蒸留水をメチレンブルー色素溶液で置き換えた 。上部チャンバーを蒸留水で満たし、そしてセルを約30分間観察し、色素の通過 が ないことを確認し、いずれの細胞にもピンホール穿孔のないことを確認した。な にも見いだされなかったとき、上部チャンバー中の蒸留水を４つのセルから取り 除いた。その他の２つのセルは、蒸留水対照として供した。次いで、２つの実験 セルの上部チャンバーをCE1で満たし、そして他の２つの実験セルをCE2で満たし た。 音波エネルギーを、２つのCE2セルの１つに直ちに付与した。25MHzトランスデ ューサーを、0.13ワット/cm²の最大強度で10MHzから30MHzまで0.1秒毎の周波数 掃引(sweeping)で用いた。50％デューテイサイクルで付与された音波エネルギー の10-15分後、色素流動が肉眼で検出された。他の５つのセルでは色素流動は検 出されなかった。 次いで、同じセッティングでCE1を含む２つのセルのうちの１つに音波エネル ギーを付与した。５分以内に上部チャンバー中に色素が出現し始めた。従って、 化学的エンハンサーをともなう音波エネルギーは、角質層を通るマーカー色素の 経皮流動速度を著しく増加し、そして遅延時間を低減した。 実施例20 音波エネルギーおよび化学的エンハンサーの効果 ２つの化学的エンハンサーCE1およびCE2の製剤を、グリセリンを除いて調製し 、そしてこれらのCE1MGおよびCE2MGと呼ぶ新たな製剤を、先のように試験した。 水をグリセリンの代わりに置き換え、その他の成分の比率は変えなかった。３つ のセルを、改変されたFranzセル中に、熱分離された表皮試料の表皮側を、チャ ンバーの上側に向けて調製した。次いで、これらの試料を８時間蒸留水中で水和 させた。水和工程の後、下部チャンバー中の蒸留水を、CE1MGまたはCE2MGのいず れかで置き換え、そして上部チャンバーを色素溶液で満たした。音波エネルギー を、３つのセルの各々に連続的に付与した。 パルス状の、周波数変調された音波エネルギーを10分未満の合計時間付与した とき、角質層試料の浸透性における顕著な増加が観察された。角質層の浸透性は 、化学的エンハンサーおよび音波エネルギーの両方に曝された領域を横切って比 較的均一に変わった。色素が角質層を横切り得た「ピンホール」穿孔は観察され な かった。経皮流動速度は、音波エネルギーをオンまたはオフにすることによりす ぐに制御可能であった。音波エネルギーをオフにすると、皮膚試料を通じて能動 的に輸送される肉眼で観察できる色素がないように、経皮流動速度をすぐに低下 させるように見えた；恐らく、速度は受動的拡散の速度まで減少した。音波エネ ルギーを再びオンにするとすぐに高レベルの流動速度を取り戻した。変調された モードは、変調された速度で経皮流動速度における規則的な脈動増加を提供する ようであった。音波エネルギーを一定の周波数にセットしたとき、この構成の経 皮流動速度における最大の増加は、約27MHzで生じるようであった。 ３つすべての試料を用いて同じ結果が得られ、次いでセルからすべての流体を 取り除き、そして角質層の両側に蒸留水をかけた。次いで、すぐに下部チャンバ ーを蒸留水で満たし、そして上部チャンバーを色素溶液で再び満たした。セルを 30分間観察した。角質層試料中に穴は観察されず、そして下部チャンバー中に大 量の色素は検出されなかった。下部チャンバー中に、先の曝露からの皮膚試料中 に捕獲された色素およびエンハンサーに恐らく起因して少量の色素が肉眼で見え るようになった。さらに12時間後、検出された色素の量はなお非常に少量であっ た。 実施例21 音波エネルギーおよび化学的エンハンサーの効果 穿孔された角質層：実施例16と同じドナーからの熱分離された表皮試料を用い 、表皮側をチャンバーの上側に向けて３つのセルを調製した。試料を８時間水和 させ、次いで下部チャンバー中の蒸留水をCE1MGまたはCE2MGのいずれかで置き換 えた。次いで上部チャンバーを色素溶液で満たした。角質層試料中のピンホール 穿孔は、色素を、角質層試料を通って下にあるエンハンサー含有チャンバー中に 漏失させた。音波エネルギーを付与した。音波エネルギーを付与するとすぐに、 色素分子が急速に孔を通じて押された。上記で示したように、孔を通る色素の急 速な流動は、音波エネルギーの付与と直接にかつ即座に相関していた。 実施例22 音波エネルギーおよび化学的エンハンサーの効果 低コスト音波エネルギートランスデューサーTDK#NB-58S-01(TDK Corp.)を、経 皮流動速度を増強するその能力について試験した。このトランスデューサーのピ ーク応答は、約5.4MHzであると測定され、他の局所ピークが、約７MHz、９MHz、 12.4MHz、および16MHzで生じた。 次いで、このTDKトランスデューサーを、5.4MHzで、CE1MGと組み合わせた経皮 流動速度を増強するその能力について試験した。表皮側を下部チャンバーに向け て３つのセルをセットアップし、次いで皮膚試料を８時間水和させた。色素溶液 を下部チャンバーに置いた。トランスデューサーを、CE1MG中に浸漬した上部チ ャンバー中に置いた。音波エネルギー励起として5.3から5.6MHzに掃引された周 波数を用いると、顕著な量の色素が角質層を通って移動し、そして５分でセルの 回収ウェルに検出された。トランスデューサーが48℃の温度に達する局所加熱が 生じた。音波エネルギーなしのCE1MGを用いる対照では、24時間の曝露は、音波 エネルギーをともなう５分の曝露より少ない色素を回収ウェル中に生成した。 本実施例は、低コストの、低周波数音波エネルギートランスデューサーが、適 切な化学的エンハンサーと組み合わせて用いられるとき、経皮流動速度に著しく 影響し得ることを示す。理論的には、化学的エンハンサーとともに用いたとき、 より高い周波数の音波エネルギーがより多くのエネルギーを角質層中に集中する が、より低い周波数の変調された音波エネルギーは、経皮流動速度を加速し、こ の技術を有用かつ実際的にし得る。 実施例23 ヒト皮膚を横切る分子移動の証明：上記のTDKトランスデューサーおよびCE1MG を用いる試験を、このトランスデューサーの最高の局所共鳴ピークの１つである 約12.4MHzで、12.5から12.8MHzまでの2Hz速度での周波数掃引および0.1W/cm²未 満の音波エネルギー密度を用いで繰り返した。熱分離した表皮の表皮側を下に向 け、色素溶液を下部チャンバーに置き、そしてエンハンサー溶液および音波エネ ルギーを上部チャンバー中に置いた。５分以内に顕著な量の色素が、角質層を横 切って回収ウェル中に移動した。トランスデューサーにおけるオーム加熱は、 5.4MHzで駆動される同じトランスデューサーを用いたときより顕著に少なく、化 学的エンハンサーの温度増加はほんの約33℃であった。 これらの低効率レベルでさえ、CE1MGおよびTDKトランスデューサーからの音波 エネルギーを用いて得た結果は、モニタリング方向で顕著であった。米国特許第 5,445,611号の図3Aおよび3Bは、モニタリング方向で測定された経皮流動速度で ３つの別のセルから得たデータのプロットを示す。５分の時点でさえ、容易に測 定可能な量の色素が、角質層の外側で、化学的エンハンサー中に存在し、これは 表皮側から角質層を通り皮膚試料の「外側」領域までの輸送を示す。 身体から分析物を回収およびモニタリングするための音波エネルギーまたは音 波エネルギー/化学的エンハンサーアプローチの使用を最適化するために、目的 の分析物の量をアッセイする手段が必要である。ユニットが、化学的エンハンサ ーを用いるかまたは用いないで音波エネルギーによって分析物を回収するプロセ スにある間に複数の読み値を得るアッセイシステムは、広範な集団の基礎にわた って標準化し、かつ異なる皮膚特性および流動速度について規準化する必要性を なくする。回収システム中の分析物濃度が増加する時間に２つまたはそれ以上の データ点をプロットすることにより、曲線に適合するアルゴリズムを適用して、 曲線に関連する分析物の回収または流動速度を、平衡が達成される点に対して記 載し、それによって区間(interval)濃度の測定を確立するパラメーターを決定し 得る。この曲線の一般形は、個体により不変であり；パラメーターのみが変化す る。一旦これらのパラメーターが確立されると、この関数の定常状態解法を解く こと(即ち時間は無限大に等しい)、即ち、完全な平衡が確立される場合は、体内 の分析物の濃度を提供する。従って、このアプローチは、皮膚浸透性における個 体の変動に拘わらず、集団のすべてのメンバーについて、測定を、同じ量の時間 で所望の正確さのレベルにすることを可能にする。 いくつかの現存する検出技術が、本出願に適用可能であり、目下存在する。D. A.Christensen、1648 Proceedings of Fiber Optic，Medical and Fluorescent Sensors and Applications 223-26(1992)を参照のこと。１つの方法は、ほぼ平 行な様式で一緒に密接に配置されている一対の光ファイバーの使用を含む。ファ イバーの１つは、これを通って光エネルギーが伝達される供給源ファイバーであ る。他方のファイバーは感光ダイオードに連結された検出ファイバーである。光 が供給源ファイバーを通って伝達されるとき、光エネルギーの一部である減衰波 が、ファイバー表面に存在し、そしてこの光エネルギーの一部が検出ファイバー により収集される。検出ファイバーは、捕獲した減衰波エネルギーを、それを測 定する感光ダイオードに伝達する。このファイバーは、バインダーで処理されて 測定されるべき分析物を引き付けかつ結合する。分析物分子が表面に結合する場 合(分析物グルコースのコンカナバリンAのような固定化レクチンへの、または固 定化抗グルコース抗体への結合のように)、２つのファイバー間の減衰波カップ リングの量は変化し、そして検出ファイバーにより捕獲されそしてダイオードに より測定されるエネルギー量も同様に変化する。短時間にわたって検出された減 衰波エネルギーのいくつかの測定は、平衡曲線を記載するパラメーターの迅速な 測定を支持し、それ故、身体内の分析物濃度の可能な計算を行う。このシステム を用いる５分以内の測定可能なフラックスを示す実験結果(米国特許第5,445,611 号の図3Aおよび3B)は、正確な最後の読み値に対する十分なデータが、５分以内 に採集されることを示唆する。 その最も基礎的な実施態様では、音波エネルギーの付与および分析物の採集に に利用され得るデバイスは、天然または合成材料のいずれかの吸収パッドを備え 、これは、用いられる場合、化学的エンハンサーの、そして皮膚表面からの分析 物を受けるリザーバーとして供される。このパッドまたはリザーバーを、皮膚表 面の選択された領域上に、受動的にまたは、革ひもまたは接着テープのような適 切な固定手段によりに補助されるかのいずれかで、適所に保持される。 音波エネルギートランスデューサーは、パッドまたはリザーバーが皮膚表面と トランスデューサーとの間にあり、そして適切な手段により適所に保持されるよ うに配置される。電源がトランスデューサーに連結され、そしてスイッチ手段ま たは任意の他の適切な機構により活性化される。トランスデューサーは活性化さ れて、周波数、位相または強度が変調された音波エネルギーを送達し、所望によ り、用いられる場合化学的エンハンサーを、リザーバーから皮膚表面を通って送 達し、次いで、皮膚表面からリザーバー中に分析物を収集する。所望の固定され または変化する時間の後、トランスデューサーを不活性化する。今や目的の分析 物を含むパッドまたはリザーバーは取り出され、分析物を、例えば、実験室で利 用する任意の数の従来の化学的分析により、またはポータブルデバイスにより定 量し得る。あるいは、分析物を定量するための機構を、分析物の収集のために用 いるデバイス中に、デバイスの一体部分としてまたは付属物としてのいずれかと して構築され得る。分析物をモニタリングするデバイスは、本明細書に参考とし て援用される米国特許第5,458,140号に記載されている。 実施例24 上記のような穿孔された皮膚表面を通じる試料採集の後、グルコースのような 分析物を検出するための代替法は、酵素手段の使用により達成され得る。いくつ かの酵素的な方法が、生物学的試料中のグルコースの測定のために存在する。１ つの方法は、グルコースオキシダーゼを用いて試料中のグルコースを酸化し、グ ルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させることを包含する。無色の色原体の 存在下で、次いで過酸化水素を、ペルオキシダーゼによって水および発色産物に 転換する。 グルコースオキシダーゼ グルコース グルコノラクトン＋H₂O₂ 2H₂O₂＋色原体 H₂O₂＋発色産物 発色産物の強度は、流体中のグルコースの量に比例する。この色は、従来の吸光 度法または反射率法の使用により測定され得る。既知濃度のグルコースを用いる 校正により、発色の量を用いて、採集した分析物中のグルコースの濃度を決定し 得る。関係を決定するために試験することにより、被験体の血液中のグルコース 濃度を計算し得る。次いで、この情報をフィンガー穿孔からの血中グルコース試 験から得た情報を用いたのと同じ方法で用い得る。結果は５〜10分以内に得られ 得る。 実施例25 グルコース濃度の可視表示または読み出しを用いる任意のシステムは、診断医 または患者にインスリンの投与または他の適切な投薬の必要性を示す。一定のモ ニタリングが所望され、そして矯正動作がほとんど同時にとられる必要がある重 要な看護またはその他の状況では、表示は、適切な様式でのインスリンの投与ま たはその他の投薬の引き金となる適切な信号手段と連結され得る。例えば、外部 または内部刺激に応答して活性化され得る、腹膜またはその他の体腔中に移植さ れるインスリンポンプがある。あるいは、角質層の微細穿孔による可能な増加し た経皮流動速度および本発明で記載されたその他の技術を利用して、グルコース 感知システムからの信号により調整された流動速度の制御を備えたインスリン送 達システムを経皮的に実施し得る。このように、医療要求をモニタリングおよび /または診断するのみならず、矯正動作を同時に提供する、完全な生物医学的制 御システムが利用可能であり得る。 同様の特性の生物医学的制御システムは、正確な電解質バランスを維持するこ と、またはプロスタグランジンのような測定された分析物パラメーターに応答し て鎮痛薬を投与することのようなその他の状況で提供され得る。 実施例26 聞こえる音と同様に、音波は、異なる特性を有する別の媒体に遭遇する場合、 反射、屈折、および吸収を行い得る[D.Bommannanら、9 Pharm.Res．559(1992)] 。反射器またはレンズを用いて、目的の組織中の音波エネルギーの分布を集め得 るかまたはそうでなければ制御し得る。ヒト身体上の多くの位置に対して、肌の ひだ(fold of flesh)がこのシステムを支持することを見出し得る。例えば、耳 たぶは、音波の周波数および強度を変えることにより実現されることと同様の、 方向制御を奏すること(例えば、分析物または浸透物を穿孔された角質層を通し て「押すこと」)を補助するために反射器またはレンズの使用を可能にする便利 な位置にある。 実施例27 複数の音波エネルギートランスデューサーを用いて、穿孔された角質層を通る 経皮流動の方向を、身体内にまたは身体からのいずれかに、選択的に向け得る。 耳たぶのような皮膚のひだは、トランスデューサーをひだのいずれかの側上に位 置させ得る。トランスデューサーは、選択的にまたは段階的な様式でエネルギー を与えられ、所望の方向に経皮流動を増強し得る。トランスデューサーまたは音 響回路のアレイ(array)を構築し、レーダーおよびマイクロ波通信システムにつ いて開発されたものと類似の段階的アレイ概念を用いて、目的の領域内に音波エ ネルギーを向けかつ集め得る。 実施例28 この実施例では、熱分離された表皮試料が、最初、エキシマーレーザー(例え ば、Lambda PhysikのモデルEMG/200；193nm波長、14nsパルス幅)で処理され、本 明細書に参考として援用される米国特許第4,775,361号に記載される手順に従っ て角質層を切除することを除いて、実施例19の手順に従った。 実施例29 この実施例では、熱分離された表皮試料が、最初、1,1'-ジエチル-4,4'-カル ボシアニンヨウ化物(Aldrich、_max=703nm)で処理され、次いで、合計70mJ/cm²/5 0msを送達して色素処理した試料にモデルTOLD9150ダイオードレーザー(Toshiba America Electronic、690nmで30mW)を用いて角質層を切除することを除いて、実 施例19の手順に従った。 実施例30 この実施例では、色素がインドシアニングリーン(Sigmaカタログ番号I-2633；_max =775nm)であり、そしてレーザーがモデルDiolite 800-50(LiCONiX、780nmで5 0mW)であることを除いて、実施例29の手順に従った。 実施例31 この実施例では、色素がメチレンブルーであり、そしてレーザーがモデルSDL- 8630(SDL Inc.；670nmで500mW)であることを除いて、実施例29の手順に従った。 実施例32 この実施例では、色素が浸透エンハンサー、例えば、CE1を含む溶液中に含ま れていることを除いて、実施例29の手順に従った。 実施例33 この実施例では、色素およびエンハンサーを含む溶液が、超音波に曝すことに より補助されて角質層に送達されることを除いて、実施例29の手順に従った。 実施例34 この実施例では、パルス光源が400〜1100nmの広範囲にわたり発光するが、シ ステム中に配置されたバンドパスフィルターを有して約650〜700nmの波長領域に 出力を制限する短アークランプであることを除いて、実施例31の手順に従った。 実施例35 この実施例では、熱分離された表皮試料が、最初、下にある組織に到達するこ となく、角質層中に微細穿孔を生成するように校正されたマイクロランセット(B ecton Dickinson)を用いて穿孔されたことを除いて、実施例19の手順に従った。 実施例36 この実施例では、熱分離された表皮試料が、最初、70-480mJ/cm²/50msの範囲 に集められた音波エネルギーで処理され、角質層を切除することを除いて、実施 例19の手順に従った。 実施例37 この実施例では、角質層が、最初、流体の高圧ジェットを用いて水力学的に穿 孔され、約100μmの直径までの微細穿孔を形成することを除いて、実施例19の手 順に従った。 実施例38 この実施例では、角質層が、最初、電気の短パルスを用いて穿孔され、約100 μm直径までの微細穿孔を形成することを除いて、実施例19の手順に従った。 実施例39 音響学的ストリーミング 治療物質の身体中への送達および/または身体内から外部リザーバー中への生 体膜中に形成された微細穿孔を通る流体の回収における音波エネルギーの新たな 機構および適用がここで記載される。本発明のさらなる局面は、生物の外層下の 生組織のインタクトな細胞（例えば、ヒト皮膚の表皮および真皮）のまわりおよ びその間を流れる流体に対する音響学的ストリーミング(streaming)効果を引き 起こす音波エネルギーの利用である。音響学的ストリーミングは、これによって 音波エネルギーが流体媒体と相互作用し得る十分に実証されたモードである。Ny borg，Physical Acoustics Principles and Methods、265-331頁、Vol II-Part B、Academic Press、1965。音響学的ストリーミング現象の最初の理論的分析は 、Rayleigh(1884、1945)により与えられた。この対象の広範な処理において、Lo nguet-Higgins(1953-1960)は、任意の振動する円筒形表面の近傍に近づく結果と なる二次元の流れに適用可能な結果を生じた。任意の表面に対する三次元近似は 、Nyborg(1958)により開発された。Fairbanksら、1975 Ultrasonics Symposium Proceedings，IEEEカタログ番号75,CHO 994-4SUにより記載されたように、音波 エネルギー、および音響学的ストリーミング現象は、多孔性媒体を通る流体の流 動性の促進において非常に有用であり得、潜在的受動的にまたは圧力勾配のみを 付与した場合の50倍までの流動速度の測定可能な増加を示す。 超音波を利用するすべての以前の経皮送達または抽出努力は、角質層を浸透化 するために設計された音波エネルギーと皮膚組織との間の相互作用の方法に絞ら れていた。関連する相互作用の正確なモードは、角質層中の温度の局所的な上昇 、そして結果として生じる角質細胞間の細胞間腔における脂質ドメインの融解に 専ら起因すると仮定されてきた。Srinivasanら。他の研究者らは、角質層中の構 造のマイクロキャビテーションおよびまたはせん断が、流体がより容易に流れ得 るチャンネルを切り開くことを示唆した。一般に、経皮流動速度の増強のための 音波システムの設計は、身体中に送達される薬物を含むゲル化または液体調製物 の 局所的な適用と組み合わせて用いる場合、被験体に対し「深い加熱」効果を生じ るように設計された現存する治療的超音波ユニットの適用が、身体中への薬物流 動速度における定量化し得る増加を生成し得るという初期の理解に基づいてきた 。この生体膜に微細穿孔を作成する本明細書で教示された方法の意味では、音波 エネルギーの使用は、今や古典的に定義された音移動(sonophoresis)の概念とは 全く新たなおよび異なる意味であると考えられ得る。 Franzセルの角質層(SC)中に存在したかまたは作成された小穴がインビトロ研 究で用いられた米国特許第5,458,140号および同第5,445,611号に述べられた実験 的発見に基づき、穿孔されたSC試料のいずれかの側上の流体リザーバーに適切に 駆動された超音波トランスデューサーが適用された際には、この穿孔された膜を 通じて送液され得る流体の大きな流動速度の「音響学的ストリーミング」事象が 生成され得る。 本明細書で教示された、生物の生体膜に制御された微細穿孔を作成する方法を 用いて、生物中にまたは生物からの流体の誘導に対する音波/流体相互作用の流 体ストリーミングモードの適用が、ここで実際的に探索され得る。例えば、臨床 研究は、400μm平方中の一連の４つの80μm直径の微細穿孔を作成し、そして次 いでこの領域に対して穏和な(Hgの10〜12インチ)の吸引を付与することにより、 平均約１μlの間質液を誘導して、身体を外部チャンバー中に外部収集のために 残し得ることを示した。穿孔部位を取り囲む組織の２〜６mm中に、内側に収束す る同心円状の圧力波を能動的に発生するように構成された、小さな低パワーの音 波トランスデューサーをこのシステムに追加することにより、このISF流動速度 が50％まで増加され得ることが証明された。 皮膚組織における音波エネルギーの直接吸収のいくつかの形態(加熱を生成す るために必要とされるような)を作成する要望から我々自身を解放することによ り、皮膚組織がそれに対して実質的に透明である、即ち、１kHzから500KHzの非 常に低周波数の領域にある音波エネルギーの周波数が決定され得る。試験された 最も低い周波数のいくつかでさえ、有意な音響学的ストリーミング効果が、イン ビボ試験を観察するために顕微鏡を用いることにより観察され得、ここでは被験 体の皮膚が微細穿孔され、そしてISFが誘導されて身体から出て、皮膚の表面に プールされた。音波トランスデューサーにエネルギーを与えることにより、ISF が渦巻く場合、粒子物質の小片がISFとともに運ばれるような、音響学的ストリ ーミングの量の劇的な可視的徴候が示された。示された代表的な動きの大きさは 以下のように記載され得る：皮膚の表面上のISFの３mm直径の円形のプールに対 して、単一の可視粒子は、１秒あたりほぼ３つの完全な軌道を完成しているよう に観察され得た。これは、2.5mm/秒より大きい直線流体速度に等しい。この作用 のすべては、組織中への100mW/cm2より小さい音波パワーレベルで証明された。 皮膚の上部表面、およびそこでの流体の活動を容易に観察し得るが、音波エネ ルギーの皮膚組織層内へのカップリングに応答して、これらの組織層内で動力学 的になにが起こっているのかを評価することはさらにより困難である。このよう な大きな流体速度(例えば2.5mm/Sを超える)が表面上でこのように容易に誘導さ れ得れば、生存真皮組織中に存在する細胞内チャンネルにおいて流体の流れにお けるいくらかの顕著な増加がまた、この音波エネルギー入力に応答して実現され 得ると仮定し得る。現在のところ、低周波数の音波エネルギーが穿孔部位を取り 囲む円中の領域に付与された場合の、所定のセットの微細穿孔を通して回収され たISFにおける増加が定量された。この実験では、穏和な吸引(HG10〜12インチ) にのみ基づくISF回収技術を、全く同じ装置を用いて、しかし音波トランスデュ ーサーをかみ合わせて交替させた。一連の10の２分の回収期間にわたって、５つ が単なる吸引でそして５つが吸引と音波エネルギー活性の両方で、音波供給源を 活性化することにより、ほぼ50％より多いISFが同じ時間期間で回収可能であっ たことを観察した。これらのデータを図30に示す。ISF流動速度におけるこの増 加は、音波エネルギーに起因する試験被験体からの感覚の増加の報告はなく実現 された。この実験に用いた装置を図31〜33に図示する。図31〜33中のトランスデ ューサーアセンブリは、ほぼ８mmの内径および４mmの壁厚を有する、圧電材料の 厚壁シリンダーからなる。シリンダーは、電場が外径および内径の金属被覆加工 された表面を亘って付与される場合、シリンダーの壁の厚さが場の極性に応答し て膨張または収縮するように極性を与えられている。実際には、この構成は、中 央の穴の中に吸引されている組織を急速に圧搾するデバイスを生じ、これらの組 織中に存在する流体に対して内放射状音響学的ストリーミング効果を生じる。こ の内側への音響学的ストリーミングは、穴の中央にある微細穿孔の位置によりIS Fをもたらすように応答し、そこでそれは身体を外部採集に向かわせ得る。 図34A-Bに示される類似のデバイスが構築され、そして試験され、そして類似 の初期結果を生じた。図34A-Bの型では、Zevex，Inc.，Salt Lake City，Utahに より構築された超音波トランスデューサーを、音波ホーン(horn)に付加されたへ ら型伸長部を有するように改変した。４mm穴が、この伸長部の0.5mm厚のへら端 部中に配置された。活性化された場合、原則的な動きは、へらの長さに沿って長 軸方向にあり、本質的に急速な前後の動きを生じる。４mmの穴の配置により引き 起こされる金属へらの物理的摂動は、この点で、非常に活性な、しかし無秩序な 大きな置換挙動を生じる。使用では、被験体の皮膚は、この穴に吸引され、そし て次に音波エネルギーが、図33に図示されるのと類似の様式で皮膚中に伝えられ た。 超音波のこの新たな適用の新規な局面は以下の基礎的な領域に存在する： １．音波エネルギーの機能は、もはや、Langer、Kost、Bommannanおよびその 他により教示されたようなSC障壁膜を透過化することに焦点をあわせる必要はな い。 ２．皮膚組織にほとんど吸収されないかなり低い周波数システムを利用し得、 間質液を含む表皮細胞間の細胞間経路内に所望の流体ストリーミング現象をなお さらに作成し得る。 ３．組織とその中にある流体との相互作用のモードは、音波の文献で、細胞膜 をせん断し、そして受動拡散プロセスを加速し得る古典的な振動性の相互作用と は独特かつ異なるモードとして認識されたいわゆる「ストリーミング」モードで ある。 音波トランスデューサーに付与される幾何学的配置、周波数、パワーおよび変 調を最適化することにより、穿孔された皮膚部位を通る流体流動における有意な 増加が達成され得ることが示された。これらのパラメーターの最適化は、この顕 微鏡的なスケールの環境で流体の流れの関係を支配する非線形を開発するために 設計される。200kHz以下の周波数を用い、任意の検出可能な加熱またはその他の 負の組織相互作用なしに、大きな流体効果が観察され得る。これらの測定可能な 効果を生成するために必要な音波パワーレベルは非常に低く、代表的には、平均 パワーレベルは100ミリワット/cm2以下である。 従って、上記の実施例は、代表的システムであり、診断目的のためおよび浸透 物の経皮送達のために、分析物の採集および定量における超音波または超音波お よび化学的エンハンサーの利用で採用され得る。本発明は、生体膜の穿孔とその 後の音波エネルギーの適正な使用が、特に化学的エンハンサーの使用をともなう 場合に、非侵襲性のまたは最小侵襲性の分析物の経皮的な測定または浸透物の送 達を可能にするという発見に関する。しかしながら、本発明は、特定の例示のみ に制限されない。多くの穿孔技術およびエンハンサーシステムが存在し、そのい くつかは、角質層を通る特定の分析物の検出および回収または浸透物の送達に、 他よりも良好に機能し得る。しかし、本明細書中で呈示された指針内で、最適穿 孔、エンハンサー、または付与される音波エネルギーの最適時間、強度および周 波数、ならびに付与される音波エネルギーの周波数、振幅および位相の調節を得 るための一定の量の実験は、当業者により容易に実施され得る。従って、本発明 は、以下の請求項およびその機能的な等価物によってのみ範囲が制限される。 さらなる進歩および改善 微細穿孔法の進歩および改善は、送達適用について特に適切なように実行され てきたが、それに限定されるものではない。一つの進歩は、上述の微細穿孔技術 のいずれか一つを使用して、特に身体内への薬物または生物活性物質の送達のた めに、皮膚、粘膜、または植物外層を含む生体膜内へ、または生体膜を通過して 選択された深さまで穿孔することである。別の進歩は、生体膜内に形成された微 細穿孔を通しての生物への生物活性物質送達である。さらに別の他の進歩は、微 細穿孔法の前、その間、または後に、薬物または生物活性物質のような物質を皮 膚または粘膜内部層内に、またはそれを通過して送達する場合に、微細穿孔した 皮膚または粘膜内部の層の透過性を増加するために、浸透増強手段を適用するこ とである。 生体膜内に形成される微細穿孔は、選択された深さまで伸長し得る。表皮内に 伸長する微細穿孔は、角質層のみ、生細胞層内の選択された深さ、またはその下 部にある結合組織層にまで貫通し得る。同様に、粘膜内に形成される場合は、微 細穿孔は、上皮層の表層部のみ、または上皮内膜内の選択された深さ、またはそ の下部の固有層およびその下部組織内にまで貫通し得る。微細穿孔の深さは、い ずれの場合においても生体膜の全深さを通して伸長し得る。 選択された深度への微細穿孔法の実例として、角質層下の完全に水和した生細 胞層内へ、またはその細胞層を通して十分なエネルギー送達を継続し得る熱プロ ーブを利用する場合には、穿孔プロセスは、身体内へ選択された深さまで継続し 、表皮、真皮を通して、そして所望ならばその下の皮下層内へ、またはそれを通 して貫通し得る。表皮、真皮、上皮内膜または固有層内の生組織内に、またはそ れを通過してある距離を伸びる微細穿孔が作製されるようにシステムを設計する 場合の懸念は、いかに近接組織への損傷および穿孔プロセスの間の被験者への感 覚（sensation）を最小にするかである。 実験的に、本発明者らは、使用される熱プローブが、固体の電気的にまたは光 学的に加熱されるエレメントであり、直径数百ミクロン以下であって支持基部か ら数ミリメーターまで突出するように物理的に限定された活性な熱プローブチッ プである場合は、電流の単一パルス、または複数パルスが、切除が、その物理的 設計が許容する限りの深度まで、すなわち支持基部が組織内、または組織を通過 する貫通度を限定するまで、貫通するのを可能にするために必要な熱エネルギー を組織内に送達し得ることを提示した。その熱プローブの電気的および熱的特性 が、組織との接触において、エネルギーパルスが、そのプローブの温度を十分に 急速に変調し得る場合には、この型の深部組織穿孔法は、本質的には被験者に無 痛で達成し得る。実験は、熱エネルギー必要量がプローブに約20ミリ秒(20〜50 ミリ秒)未満以内に送達される場合には、手順が無痛であること示した。反対に 、エネルギーパルスが、約20ミリ秒（20〜50ミリ秒）を越えて延長されなければ ならない場合、パルス幅の伸長に伴って、被験者に対する感覚は急速かつ非直線 的に増加する。 同様に、この型の選択された深さの穿孔を支持する電気的に加熱されたプロー ブの設計は、50〜150ミクロン直径のタングステンワイヤを湾曲させて鋭利にね じり、この点において最小内径をもつ180度に近い湾曲を形成することによりな され得る。次いで、ワイヤのこの細密な「V」形部分は、「V」が、銅電極が埋め 込まれた支持部からある一定の長さまで伸長するように備え付けられ得る。支持 体から伸長するワイヤの長さは、ワイヤ加熱時の組織中への最大貫通距離を規定 する。このタングステン「V」の各末端は、電流パルス回路に接続し得る支持キ ャリア上の電極の一つに接着される。電流が適切に制御された様式でワイヤに送 達された場合、ワイヤは、電流の単一パルスまたは複数パルスにおいて熱切除プ ロセスをもたらすための所望の温度まで急速に加熱する。プローブの動力インピ ーダンスの測定およびタングステンエレメントの温度に対する抵抗係数を認知す ることにより、接点の温度の閉ループ制御を容易に確立し得る。また、プローブ 接点および距離を置いて設置された第２の電極から身体を通したインピーダンス の動力学的にモニターすることにより、身体内により深く貫通する場合は、組織 の異なるインピーダンス特性に基づいてプローブの深さを決定し得る。一旦、選 択された生物の選択された組織のインピーダンス特性が日常的に決定されると、 このパラメーターは、穿孔深度の決定に使用され得、そして穿孔深度制御のため の制御システムにおいて使用され得る。 同様に、この型の選択された深さの穿孔を支持する光学的に加熱されたプロー ブの一つの実施態様は、光ファイバーをとって、一端に固体キャップまたはコー ティングからなるチップを配置することにより作製し得る。レーザーダイオード のような光源をファイバーの他端に結合させる。ファイバーに面するチップ面は 、光源が発光する波長範囲にわたって、光量子がファイバー末端に到着して、こ の面に衝突する時に、そのいくつかが吸収されて、その後チップを加熱するのに 十分な吸収係数を有さなければならない。このチップ、ファイバー、および光源 のアセンブリのための特定の設計は、広範に変化し得るが、約50−1000ミクロン の大きな直径を有するファイバーは現在一般的であり、そして数千ワットまでの 光学エネルギーを放射する光源が同様に一般的である。実際の熱プローブを形成 するチップは、タングステンのような高融点物質から作製され得、ファイバー末 端における円柱状口径内へのファイバー挿入を可能とするように機械加工してフ ァイバーに付着させ得る。チップ遠位端が、このチップからの熱拡散を制限し、 そして使用される光パルス幅の時間枠内でチップをファイバーに付着させる支持 円 柱をバックアップするように作製されている場合、このチップ上での光量子事象 は、ファイバー側、および組織表面に対して配置されている接触側の両方の温度 を急速に上昇させる。ファイバー/チップアセンブリの組織表面上における配置 は、チップを表面に対してある一定のバネ張力下で保持し、従ってその下部組織 が切除される際に、チップ自身は組織内に進行するように設計された単純な機構 により達成され得る。これにより熱切除プロセスは、所望の限り、組織中へまた は組織を通して持続させ得る。この光学的に加熱されたプローブの設計のさらな る特徴は、ファイバーにより収集される加熱されたチップからの黒体放射エネル ギーをモニターすることにより、チップ温度の極めて単純な閉ルーブ制御がもた らされ得ることである。また、前述のように、プローブ接点および距離を置いて 設置された第２の電極からの身体を通したインピーダンスの動力学的にモニター することにより、身体内により深く貫通する場合は、組織び異なるインピーダン ス特性に基づいてプローブの深さを見積もり得る。パルス幅とこの設計による感 覚との間の関係は、前述の電気的に加熱したプローブについてと本質的にじ様で ある。 例えば、いくつかのワクチン投与法は、ランゲルハンス細胞もしくは樹状細胞 、またはこの免疫応答に重要なその他の細胞の近くにあるように真皮層内に送達 された場合に、最も効果的であることが知られている。これは、表皮を通過する ように設計された穿孔の深さ、すなわち多くの場合、約180ミクロンから250ミク ロンの深さ、を意味する。 別の例として、いくつかのタンパク質およびペプチドを送達する場合、投与部 位における浸透物質に対する免疫応答を最小化し、そして同時に皮膚組織内のプ ロテアーゼ活性領域を迂回することが望ましい。この場合、皮膚内に300ミクロ ンの深さまで到達するようなさらにより深い孔が望ましい。 あるいは、浸透物質の迅速な初期吸収を最小化し、そしてより長期間に渡る制 御放出を提供するための角質層の障壁機能を保留するために、無傷の角質層の最 小厚の層を残すことが望ましいこともある。 本発明のそのさらなる特徴は、現在では生体膜層の穿孔と、様々な障壁におい て機能するように至適化され、生体効果に必要である望ましい化合物の内部空間 への送達をもたらし得るその他の浸透増強技術とを組み合わせることにより獲得 され得る大きな効率の増大である。特に、裸の、フラグメント化した、被包化し た、またはその他の物質に結合させた核酸化合物を送達する場合、しばしば、所 望の吸収とその後の治療成績を可能とするために、細胞を死滅させることなく生 細胞内に、核酸を持ち込むことを所望する。エレクトロポレーション、イオン導 入、磁場および熱また音波エネルギーの適用は、細胞膜およびその他の内部組織 内に、一時的に開口を形成させ得る。本発明者らが、角質層または粘膜の上皮層 または植物の外層、および所望ならば、表皮および真皮または植物内深部、を突 破する方法を提示したので、今では、エレクトロポレーション、イオン導入、磁 場および熱また音波エネルギーは、下層にあるこれらの組織障壁に選択的に作用 し、細胞、毛細管、または標的組織内の他の膜を透過するように調整し得るパラ メーターと共に使用され得る。エレクトロポレーション、イオン導入、磁場およ び熱または音波エネルギーは以前はこの用途には適用不能であった。 50〜150ボルトを越えるパルスが角質層、粘膜外層、または植物外層を電気穿 孔するために日常的に使用されるエレクトロポレーションの場合は、本発明者ら が提示する環境においては、わずか数ボルトまたはそれ以下のパルスが、標的組 織内の細胞、毛細管、または他の膜を電気穿孔するためにはで十分である。これ は主として、一旦皮膚、粘膜層、または植物外層が開口すると、電極間に存在す る絶縁層の数が劇的に減少することに起因する。 同様に、イオン導入は、これらの穿孔層を通過する液体流に対する物理的イン ピーダンスの劇的減少に起因する極めて少量の電流による微細穿孔を通しての核 酸を含む液体培地の流量の調整のために効果があることが示され得る。 音波エネルギーの場合、古典的には音波エネルギーは角質層または粘膜層の浸 透をこの障壁を排除することにより加速するために使用されてきたのに対して、 音波エネルギーは今では標的組織内の細胞、毛細管、またはその他の膜の浸透化 のために使用され得る。エレクトロポレーション、イオン導入の場合と同様に、 本発明者らは、物質の貫通膜流量において顕著な改善をもたらすのに必要な音波 エネルギーレベルが、皮膚や粘膜層が無傷の場合と比較してかなり低量であるこ とを証明した。その他の浸透増強測定は、微細穿孔部位における浸透圧または物 理的圧力（例えば、微細穿孔を通して生物内に特定の液体流を強要するために浸 透物質レザーバーに軽い気圧を適用する）の変化を含む。 これら全ての活性な方法、すなわちエレクトロポレーション、イオン導入、磁 場または熱または音波エネルギーの操作の態様は、単一でまたは組み合わせで適 用される場合には、皮膚、粘膜層、または植物外層の穿孔実施後、物質の送達の ために単一細胞膜が開口されるインビトロ適用において代表的に使用されるパラ メーターを使用し得る利点を有する。これらのパラメーターの例は、文献におい て周知である。例えば、Sambvrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Ma nual 第二版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989。 本発明の方法によって生体膜内に作製された微細穿孔は、高（および低）分子 量治療用化合物の経皮的、経粘膜的、または経膜的高流量率送達を可能にする。 さらには、身体へのこれらの非外傷性（non-traumatic）顕微鏡用開口は、体内 における様々な分析物への接近を可能とし、これらの分析物は体内濃度測定のた めにアッセイされ得る。 生物活性物質の送達 本発明による別の進歩は、以下のような生物活性物質の送達目的の生体膜の穿 孔法の使用を含む：例えば、タンパク質およびペプチド（例えば、インスリン） を含むポリペプチド；LHRHを含む放出因子；炭水化物（例えば、ヘパリン）；核 酸；ワクチン；および次のような薬理学的に活性な物質、例えば、抗生物質や抗 ウイルス剤のような抗感染剤；鎮痛剤および鎮痛剤の組み合わせ；食欲抑制剤； 抗駆虫剤；抗関節炎剤；抗喘息剤；抗痙撃剤；抗うつ剤；抗糖尿病剤；止痢剤； 抗ヒスタミン剤；抗炎症剤；抗偏頭痛調剤；制吐剤；抗腫瘍剤；抗パーキンソン 氏病薬；止痒剤；抗精神病剤；解熱剤；鎮痙剤；抗コリン剤；交感神経刺激剤； キサンチン誘導体；カリウムおよびカルシウムチャネルブロッカー、ベータブロ ッカー、アルファブロッカーおよび抗不整脈治療剤を含む、心臓血管系調製物； 降圧剤；利尿剤と抗利尿剤；一般冠状動脈、末梢および脳を含む血管拡張剤；中 枢神経系刺激剤；血管収縮剤；鬱血除去剤を含む、咳および感冒用調剤；エスト ラジオール、テストステロン、プロゲステロンのようなホルモン、およびコルチ コステロイドを含むその他のステロイドとその誘導体およびアナログ；睡眠薬； 免疫抑制薬；筋肉弛緩薬；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静薬；および神経 安定薬。本発明による方法により、イオン化および非イオン化薬物両方の送達が 可能であり、高分子量、中分子量、または低分子量薬物もまた送達し得る。 DNAおよび/またはRNAの送達は、ポリペプチド発現の達成、免疫応答の刺激、 または「アンチセンス」核酸、特にアンチセンスRNAの使用によるポリペプチド 発現の抑制のために使用され得る。「ポリペプチド」という用語は、本明細書に おいては、特定のサイズが指定されない限り、特にそのサイズには制限無く使用 され、タンパク質を含む全ての長さのペプチドを含む。発現され得る代表的ポリ ペプチドは、以下から成る群から選択される：オキシトシン、バソプレッシン、 副腎皮質刺激ホルモン、表皮成長因子、プロラクチン、黄体形成ホルモン、放出 ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン様成長因子、イン スリン、エリスロポエチン、レプチンのような肥満タンパク質、ソマトスタチン 、グルカゴン、グルカゴン様インスリン分泌性因子、副甲状腺ホルモン、インタ ーフェロン、ガストリン、インターロイキン−2およびその他のインターロイキ ンおよびリンホカイン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン 、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテン シン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロ シジン、グラミシジン、および合成アナログ、改変体とその薬理学的に活性なフ ラグメント、モノクローナル抗体およびワクチン。この群は限定的であることは 意図されない、発現され得るペプチドまたはタンパク性薬物に対する唯一の限定 は、その機能性の１つである。DNAおよび/またはRNAの送達は、遺伝子治療、ワ クチン接種、および生物内に核酸またはポリペプチドがインビボで投与されるべ き治療状況において有用である。例えば、本明細書中で参考として援用される米 国特許第5,580,859号。 本発明の一つの例示的実施態様は、生体膜の穿孔を含むポリペプチドの長期投 与の獲得、および次いで生体膜内のこの孔を通してのポリペプチドをコードする DNAの送達のための方法であり、これにより組織細胞はDNAを取り込み、少なくと も１カ月、より好ましくは少なくとも６カ月間ポリペプチドを産生する。本発明 の別の例示的実施態様は、生体膜の穿孔を含むポリペプチドの一過性発現の獲得 、および次いで生体膜のこの孔を通してのポリペプチドをコードするRNAまたはD NA送達のための方法であり、これにより組織細胞（例えば、皮膚、粘膜、毛細管 または下部組織）は、RNAまたはDNAを取り込み、約20日未満、通常では約10日未 満、およびしばしば約3〜5日未満の期間ポリペプチドを産生する。RNAまたはDNA を取り込む細胞は、生体膜、下部組織、または毛細管によって到達し得る他の標 的組織の細胞を含み得る。 DNAおよび/またはRNAは、必要に応じてキャリアまたはビヒクル内の裸の核酸 であり得、および/またはミクロスフェア、リポソーム内に含まれ得、および/ま たはトランスフェクション促進タンパク質、微粒子、脂質複合体、ウイルス粒子 、荷電性または中性脂質、炭水化物、リン酸カルシウム、またはその他の沈降剤 、および/または核酸を安定させるための他の物質と結合し得る。核酸は、染色 体内に組み込まれるか、またはプラズミド内、または裸のポリヌクレオチドとし て組み込まれないかのいずれかでウイルスベクター内に含まれ得る。核酸はポリ ペプチドをコードし得、あるいは、例えば、細胞内において選択されたポリペプ チドの翻訳を阻害するためのアンチセンスRNAをコードし得る。核酸がDNAである 場合は、それ自体非複製型であるDNA配列であり得るが、レプリケーターをさら に含むプラズミド内に挿入される。DNAはまた、ヒトにおいて機能的であるCMV IEPプロモーターのような転写プロモーターを含み得る。DNAはまた、DNA転写の ためのポリメラーゼをコードし得る。一つの好ましい実施態様において、DNAは 、ポリペプチドおよびDNA転写用ポリメラーゼのいずれもコードする。このDNAは ポリメラーゼ、またはそれをコードするmRNAと合わせて送達され得、mRNAは細胞 内で翻訳される。本実施態様において、このDNAは、好ましくはプラズミドであ り、そしてポリメラーゼは好ましくは、T7ポリメラーゼのようなファージポリメ ラーゼであり、ここでT7ポリメラーゼ遺伝子はT7プロモーターを含むべきである 。 本方法は、特定のポリペプチドの欠陥、欠損、または変異と関連する疾患を処 置するために使用され得る。本発明の別の局面に従って、本方法は、個体の免疫 法を提供し、ここでこのような個体はヒトまたは動物であり、この個体に対する DNAおよび/またはRNAを送達を含み、ここでDNAおよび/またはRNAは、免疫原に対 する免疫応答を誘導する免疫原性翻訳産物をコードする方法である。本方法は、 体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはその混合を誘導するために使用され得 る。 実施例40 この例示的な実施例は、mRNAの調製および送達を示す。 一般的に、本発明の実施において、mRNAのインビトロでの転写に適切なプラス ミドが、実質的に無制限数のcDNAを用いて当業者によって容易に構築され得るこ とが明らかであるはずである。このようなプラスミドは、選択されるRNAポリメ ラーゼについてのプロモーター、続いて5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、およびポ リアデニル化領域について鋳型を有利に含み得る。これらの5'および3'の非翻訳 領域間には特有の制限部位が、任意の選択されたcDNAのプラスミド中への挿入を 容易にするために存在するべきである。次いで、選択された遺伝子を含むプラス ミドのクローニング後、プラスミドを、ポリアデニル化領域での消化によって直 鎖状にし、そしてインビトロで転写させてmRNA転写物を形成させる。これらの転 写物は、好ましくは、5'キャップを有して提供される。あるいは、5'非翻訳配列 （例えば、EMC）が使用され得、これは、5'キャップを必要としない。 容易に入手可能なSP6クローニングベクター（pSP64T）は、効率的に翻訳され るmRNAである、Xenopusのグロビン遺伝子由来の5'および3'隣接領域を提供する 。開始コドンを含む任意のcDNAをこのプラスミド中に導入し得、そしてmRNAを得 られる鋳型DNAから調製する。この特定のプラスミドを、目的のポリペプチドを コードする選択された任意のcDNAを挿入するために、BglIIで消化し得る。良好 な結果が、直鎖状にし、次いでSP6 RNAポリメラーゼで転写させた場合に、pSP64 Tで得られ得るが、ファージT7 RNAポリメラーゼとともにpSP64TのXenopusのグロ ビン隣接配列を使用することが好ましい。これを、pSP64T由来の約150bpのHindI II／EcoRIフラグメントを精製すること、およびこのフラグメントを直鎖状にし たpIBI131（International Biotechnologies，Inc.，New Haven，Conn.から市販 されている）の約2.9kbのHindIII／EcoRIフラグメントにT4リガーゼを用いて挿 入することによって達成する。得られるプラスミド（pXBG）を、２つのXenopus のグロビン配列間に存在する独特のBglII部位での目的の任意の遺伝子を受容さ せるため、および選択された遺伝子のT7ポリメラーゼでの転写のために適合させ る。 外因性のポリヌクレオチドのインビボでの発現を実証するための便利なマーカ ー遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）である 。pSV2-CAT（ATCC番号37155）の小さなBamHI／HindIIIフラグメントに由来するC AT遺伝子、およびBglII消化したpXBGの両方を、E．coli DNAポリメラーゼのKlen owフラグメントとともにインキュベートして平滑末端を生成させ、次いで、T4 D NAリガーゼを用いて連結させてpSP-CATを形成させた。次いで、このプラスミド をPstIおよびHindIIIで消化し、そして小さなフラグメントはpSP64Tの5'および3 '-グロビン隣接配列間にCAT遺伝子を含む。T7プロモーターを含有するプラスミ ドpIBI131もまたPstIおよびHindIIIで消化し、そして長いフラグメントを精製す る。次いで、このフラグメントをT4 DNAリガーゼを用いてCAT遺伝子を含有する フラグメントに連結して、プラスミドpT7CAT-Anを形成させる。 pT7CAT-AnプラスミドDNAを、当該分野で周知の方法（例えば、米国特許第5,58 0,859号）に従って精製する。次いで、得られる精製されたプラスミドDNAを過剰 のPstIでポリアデニル化領域の下流で直鎖状にし、次いで得られる直鎖状のDNA を精製し、そして米国特許第5,580,589号の実施例５の方法に従ってインビトロ で転写させる。次いで、得られるmRNAを、米国特許第5,580,859号の実施例５の 方法に従って精製する。これは、本発明の送達に十分に純粋である。 精製したmRNAを、微細穿孔手順に従って、個体上の選択した部位を、生物学活 性を最適化するように選択した孔の深さで穿孔すること、およびmRNAが細胞によ って取り込まれる場合、mRNAが皮膚または粘膜を通って内在組織まで通過するよ うに、このような部位へ有効量のmRNAを送達することによって送達する。穿孔し た角質層または粘膜を通過するこの送達を、音波エネルギーを用いて、および／ または実施例15の手順に従う音波エネルギーの使用によって、ならびに／あるい は細胞性の取り込みを増強させるためにエレクトロポレーションで、ならびに／ あるいは皮膚もしくは粘膜中の孔を通じる流れを誘導するための圧力の差を用い て補助し得る。さらに、送達を、体内への孔を通じるmRNAの拡散を増強するため 、または細胞へのmRNAの取り込みを容易にするために、mRNAをキャリア溶液（例 えば、正に荷電した脂質複合体またはリポソーム）中に配置することによって補 助し得る。 実施例41 この実施例は、HIVのgp120タンパク質をコードするmRNAでの個体の免疫化を示 す。mRNAは、gp120の遺伝子（AIDS Research and Reagent Program，National I nstitute of Allergy and Infectious Disease，Rockville，MDからのpIIIenv3- 1）を実施例40のプラスミドpXBGに挿入することを除いて、実施例40の手順に従 って調製する。gp120遺伝子を含むmRNAを、実施例40の手順に従って送達する。 実施例42 この実施例においては、HIVのgp120タンパク質をコードするDNAでの個体の免 疫化を示す。gp120遺伝子を、P．Muzzinら（Correction of Obesity and Diabet es in Genetically Obese Mice by Leptin Gene Therapy，93 Proc．Nat'l Acad ．Sci．USA 14804-14808（1996）；G．Chenら、Disappearance of Body Fat in Normal Rats Induced by Adenovirus-mediated Leptin Gene Therapy，93 Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA 14795-99（1996）、これらは本明細書中で参考として 援用される）の手順に従って組換えアデノウイルスに挿入する。生じるDNAは、 実施例41の手順に従って送達される。 実施例43 本実施例において、HSV-2の糖タンパク質ＤをコードするDNAでgp120タンパク 質をコードするDNAを置換したこと、およびさらに有効量の糖タンパク質Ｄと組 合せたこと除いて、実施例42の手順に従う。 実施例44 本実施例では、肥満タンパク質レプチンをコードする核酸（例えば、ヒトレプ チンまたはラットレプチンcDNA（C．Guoxunら、Disappearance of Body Fat in Normal Rats Induced by Adenovirus-mediated Leptin，93 Proc．Nat'l Acad． Sci．USA 14795-99（1996））、またはマウスレプチンcDNA（P．Muzzinら、Corr ection of Obesity and Diabetes in Genetically Obese Mice by Leptin Gene Therapy，93 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 14804-14808（1996）、これらの両方 は、本明細書中で参考として援用される）を、適切なプラスミドベクター中で送 達する。哺乳動物発現ベクターpEUK-C1（Clonetech，Palo Alto，Calif.）を、 クローニングした遺伝子の一時的な発現のために設計する。このベクターは、pB R322複製起点および細菌中での増殖のためのアンピシリン耐性マーカーを含み、 そしてSV40複製起点、SV40後期プロモーター、ならびに哺乳動物細胞中で選択さ れた遺伝子の複製および発現のためのSV40後期ポリアデニル化シグナルもまた含 む、4.9kbのプラスミドである。独特のXhoI、XbaI、SmaI、SacI、およびBamHI制 限部位のマルチクローニング部位（MCS）を、SV40後期プロモーターとSV40後期 ポリアデニル化シグナルとの間に配置する。MCS中にクローニングしたDNAフラグ メントをSV40後期プロモーターからRNAへ転写させ、そしてクローニングしたフ ラグメント中の最初のATGコドンから翻訳させる。SV40 VPIプロセシングシグナ ルを使用して、クローニングしたDNAの転写物をスプライシングし、そしてポリ アデニル化する。レプチン遺伝子を、当該分野で周知の技術（例えば、J．Sambr ookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第２版、1989）、これは、 本明細書中で参考として援用される）を使用してpEUK-C1のMCSにクローニングす る。生じるプラスミドを、上記の実施例に記載の手順に従って、皮膚または粘膜 の穿孔後にヒトまたは動物の個体に送達する。 実施例45 ヘパリンの送達。ヘパリンは、１時間あたりおよそ1000から5000IUの静脈注入 に等価である基底レベルの維持、5000〜1000IUのヘパリンまたは1500〜6000IUの 低分子量のヘパリンの１日に２回の皮下注射が代表的な臨床的投与量である、有 用な治療用物質である。通常は、ヘパリンは、経皮送達系の良好な候補とは考え られない。なぜなら、この物質の5000〜30000Daの分子量に主に起因する皮膚の 通過に対するその比較的高い抵抗性のためである。本明細書中に開示される微細 穿孔技術を使用して、例えば、微細穿孔が配置されている皮膚表面に付着させた 送達リザーバーから十分な量のヘパリンを投与した場合に、ヘパリンの有意な流 速を容易に達成した。ヘパリン溶液を、約100μmの深さまで穿孔した皮膚に適用 し、これによって、受動的な拡散またはイオントフォレイシス法（約１mA／cm² ）との併用のいずれかを可能にする。これを、下部組織への微細穿孔を通じるヘ パリンの輸送に十分な時間適用する。ヘパリンの送達の証拠を、受動的なおよび イオントフォレイシス法による増強された送達の両方のインビボ部位について顕 微鏡試験によって示されるような、拡大した毛細血管の膨張および透過性によっ て観察した。主な駆動力として受動的な拡散を使用して有意なヘパリンの流れを 示すことに加えて、高度に荷電した化合物であるヘパリンは、活性な制御可能な 流速を可能にするために微細穿孔と電場との組み合わせのための天然の候補であ り、そして同じ数の微細穿孔を通じる可能であるよりも早い流速が、受動的拡散 法を用いて可能である。健常な男性のボランティアの手掌の前腕上の部位が１平 方cmの面積中に36個の微細穿孔のマトリックスを作製することによって調製した 、１つの実験を行った。イオントフォレイシスシステムのためのヘパリンナトリ ウム溶液および陰性電極を含有する小さいリザーバーを、この部位に取り付けた 。陽性電極を、イオントフォレイシスシステムの販売元であるIomedから入手し たヒドロゲル電極を使用して、いくらかの距離をあけて被験体の皮膚に取り付け た。このシステムを１平方cmあたり0.2ミリアンペアで10分間実施した。この期 間の後、この部位の顕微鏡試験によって、毛細血管の血管拡張によってヘパリン の送達の直接の証拠を示した。そして、吸引力を微細穿孔からの間質液のサンプ ルを抽出するために適用した場合、十分な赤血球がこの力のもとで毛細血管を出 て、回収したISFをピンク色に色づける。このことは、この領域における増大し た血管浸透性を示す。さらに、赤血球が凝固するかどうかを見るためにわきに配 置する場合、凝固が起こらないことは、作業中の組織中に存在するヘパリンの抗 凝固効果を示す。 実施例46 インシュリンの送達：インシュリン（健常な個体中に通常存在する多くの化合 物のような）は、例えば、外因性のインシュリンを必要とする糖尿病の個体中で 、規定レベルおよび食事に応答する拍動性のボーラス様式で、ならびに被験体の 活性レベルの両方で維持されなければならないポリペプチドである。現在、この ことは、作用の早い皮下注射および作用の遅い処方物によって達成される。イン シュリンの分子量（代表的には、約6000）のために、伝統的な経皮法または経粘 膜法では、臨床的に有用なレベルでは送達され得ない。しかし、皮膚または粘膜 のバリヤー層を通じて微細穿孔を開くことによって、生存組織中へのインシュリ ンの送達を可能にする明らかな通路が提供される。ここで、これらの組織中に存 在する間質性の液体は、リンパ系および毛細血管のベッドへおよびその中へのイ ンシュリンの拡散（浸透圧的に駆動することを含む）を可能にし、これによって 臨床的に有用な量を送達する。Boehringer-Mannheim Co.から購入した3500IU／m lの組換えヒトインシュリンを含有する濃縮したインシュリン溶液を、４平方cm を覆う手掌の前腕の被験体の皮膚の孔をあけた領域に対してレザーバー中で適用 した。健常な44歳の男性の、糖尿病ではない被験体を、実験の開始の14時間前に 絶食させた。静脈内および指の血液サンプルを、送達期を開始する前および後に 定期的に採取し、そしてグルコース、インシュリン、およびＣ-ペプチドについ てアッセイした。指の血液のグルコースデータは、約４時間後に有意なおよび迅 速な被験体のグルコースレベルの抑制を示し、10分間のサイクルにわたって開始 時の100mg/dlから67mg/dlに低下し、次いで続く10分間で100まで回復し、このこ とから、送達されたインシュリンにかかわり、そしてそれを補う被験体のカウン ター調節システムに起因すると仮説を立てた。44khzおよび0.2ワット／平方cmで の超音波作動の付加を含むこの手順の繰り返しは、送達の開始後30分未満に109m g/dlから78mg/dlに低下する被験体のグルコースレベルによって示されるような 、インシュリンのより迅速な送達を示した。実施例45の場合のように、ヘパリン の送達について、低電流イオントフォレイシスシステムをより大きい流動速度を 容易にし、そして電流を変化させることによってこの流動速度を調節する能力を 提供するために、微細穿孔と組合せ得、これによって組み立てられるべきシステ ムの要求される型についての送達を可能にする。インシュリンを用いた以前の研 究 は、代表的には、比較的高いイオントフォレイシス電流が完全な角質層の強力な バリア特性を克服するために必要とされることを示す。角質層または粘膜の穿孔 により、および必要に応じて標的化される生物学膜中へまたはそれを介してより 深い孔を作製するために穿孔パラメーターを設定することによって、より低い電 流密度が、所望のインシュリン流動速度を生じるために必要とされる。 同様に、荷電していないまたは低く荷電したインシュリン処方物について、微 細穿孔を通る活性な流動性の増強は、音波の場または音波泳動法（sonophoresis ）（これは、組織へのインシュリンの押し込みを補助するために、通常超音波と して記載される周波数を含み得る）を組合せることによってもたらされ得る。音 波の場のさらなる特徴は、組織にわたって血流への所望の吸収が行われ得るより 大きな容積の組織にインシュリンが到達させる、生存可能な組織内の種々の障壁 の浸透性を増強するその能力である。音波エネルギーを調節することは、より深 い組織へまたは貫通する微細穿孔を通る化合物の総流動を調節することにおいて 非常に有効であると示されており、これによってボーラス送達系を開発するため の第２の手段を提供する。 皮下注射として与える場合、インシュリン吸収の実際の経路は、依然としてい くつかの議論の主題である。これが依然として明らかではない理由の１つは、集 団内で、または同じ被験体においてもなお、注射ごとの基準について、実証され る生体利用可能性の広範に変化するレベルである。１つの仮定される経路は、毛 細管を通じて血流に入る直接的な吸収である。このプロセスを増強するための方 法は、表面の穿孔を用いるエレクトロポレーションと組合せることであり、ここ で、エレクトロポレーションは、毛細管の内皮膜の領域中での作用に対して特異 的に最適化されており、これによって、この直接的な吸収を増強するために一時 的に多数の開口部を作製する。以前に記載されているイオン導入法および音波泳 動法を用いる場合、外表面の下のこれらの組織層中のエレクトロポレーションの この型を実行するために必要とされるエレクトロポレーションシステムの総電圧 振幅レベルは、しばしば、生体膜の外部層の大量のインピーダンスの低下に起因 して、インタクトな外表面を通る浸透に必要とされるよりも低い。 実施例47 微粒子の送達：リポソーム、脂質複合体、ナノスフェアを含むミクロスフェア 、PEG沈殿した（PEGellated）化合物（ポリエチレングリコールと混合した化合 物）および薬物送達系の一部としての他の微粒子の使用は、多くの種々の特異的 な適用について十分に開発されている。特に、体の組織中の内因性の成分（例え ば、皮膚、組織、血流またはリンパ中に存在するマクロファージまたは他の細胞 中のプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、または炭水化物分解酵素）によって容易に崩 壊される化合物を扱う場合、生体利用可能性の増大および／または徐放を、これ らの技術の１つを利用することによってしばしば実現し得る。現在、一旦当業者 がこれらの技術の１つを適用すると、処方物を、一般には、ある型の注射を介し て送達する。本発明は、生体膜（例えば、皮膚または粘膜）を通過しかつ選択さ れた深さまで体内に微細穿孔を作製することによって、この型の微粒子が皮膚ま たは粘膜を介して送達されることを可能にする。上記のインシュリンの実施例に 記載されるように、微細穿孔、エレクトロポレーション、イオン導入法、音波エ ネルギー、エンハンサー、および部位の機械的刺激（例えば、圧力または摩擦） を、特定の処方物の送達および／または取り込みを増強するために、任意の組合 せで組合せ得る。いくつかの操作した微粒子の場合において、孔は、特定の生物 学的に活性な領域をバイパスするように、または選択された領域内に粒子を配置 するように設計された最適な深さを有し得る。いくつかの微粒子送達系について 、表面下組織への、またはそれを貫通してそれらが送達された後の粒子へのエネ ルギー入射を、活性な化合物の加速された放出を誘発するために使用し得、これ によって治療用物質の流動速度の外部制御を可能にする。 実施例48 移植可能な分析物のモニタリングのための微粒子：微粒子の別の適用は、治療 薬としてではなく、非侵入的に調べられ得るプローブ化合物のキャリアとして、 例えば、体内の特定の分析物のレベルに関する情報を得るために外部読み取り系 から電磁気照射によって粒子を送達することである。一例は、グルコース特異的 蛍光団化合物を孔性のミクロスフェア中に取り込むことである。これは、周辺組 織中に存在するグルコースレベルに依存し、振幅、波長、または蛍光寿命のいず れかにおいてその蛍光応答を変化させる。蛍光団を700nmから1500nmまでの範囲 の励起波長を用いて活性であるように設計する場合、低コストの赤外光源（例え ば、LEDまたはレーザーダイオード）を使用して、その蛍光応答を刺激する。こ の蛍光応答は、700nmから1500nmまでのこの範囲に同様に存在する。これらの波 長では、皮膚および粘膜組織はほとんど吸収せず、従って、単純な系をこれらの 様式で構築することが可能である。 グルコースは、実験的な寿命の蛍光プローブが開発され、そして光学的な刺激 および検出方法を用いて皮膚を通じて良好に調べられる皮下に挿入されたポリマ ー移植物中に取り込まれる、１つの候補分析物である。これは、単に、微細穿孔 を介する生存組織層への、またはそれを貫通する送達を可能にするために、これ らの実験的移植物の適切な大きさの微粒子への再形成を必要とする。しかし、任 意の分析物を標的化し得、そして送達される微粒子を調べる方法は、光学的なエ ネルギーではなく磁場または電場を介し得る。 実施例49 ワクチンの送達 細菌、ウイルス、トキソイド、または混合ワクチンを、固体、液体、懸濁物、 または必要とされる場合はゲルとして調製する。この処方物は、ペプチド、タン パク質、炭水化物、DNA、RNA、完全な微生物、アジュバント、キャリアなどの任 意の１つまたは組合せを含み得る。個体の選択された部位（皮膚または粘膜）に 、上記の実施例45に記載する手順に従って穿孔し、そしてワクチンを穿孔した部 位に適用する。微細穿孔の深さは、送達されるワクチンの型に依存し得る。この 送達は、エレクトロポレーション、イオン導入法、磁気エネルギーまたは音波エ ネルギー、エンハンサー、および部位の機械的刺激（例えば、圧力または摩擦） で、細胞性の取り込みを増強するための上記の手順、ならびに／あるいはエレク トロポレーション、イオン導入法、磁気エネルギーまたは音波エネルギー、エン ハンサー、および部位の機械的刺激（例えば、圧力または摩擦）の使用に従って 補助され得る。さらなるまたは補強する用量を同じ様式で送達し、個体の免疫を 達成 し得る。 実施例50 テストステロンの送達：市販の入手可能なテストステロンパッチ（TheraTech ，Inc.のAndroderm^Rpatch）を、この浸透の送達に適用する場合、微細穿孔の利 点を評価するための一連の実験において使用した。性機能亢進の男性被験体を２ 日間Androderm治療を受けさせ、その後、一連の静脈血サンプルを、この被験体 の基底レベルのテストステロンが確立するためにその後の24時間まで採取した。 次いで、２つの2.5mgのAndrodermパッチを製造業者に推奨されるように取り付け 、そして静脈血サンプルの同様のセットを採取して、使用された経皮流動増強方 法のみがパッチに含まれる化学的浸透エンハンサーである場合のテストステロン レベルを測定した。洗浄期間のさらに２日後、次いで、２つのAndrodermパッチ を同様に取り付けたが、しかし、取り付けの前に標的部位での皮膚表面に１部位 あたり72個の微細穿孔で穿孔した。各孔は、約80μmの幅、および300μmの長さ の寸法で、そして80から120μmの深さにおよぶ。穿孔した送達位相について、同 様の一連の静脈血サンプルを採取し、テストステロンを測定した。24時間のこれ らの全てによるデータを、「経皮的テストステロン送達に対する微細穿孔の効果 」と名づけた図35に示す。これらのデータの注目すべき特徴は、微細穿孔が存在 する場合に、被験体血液のテストステロンレベルがはるかにより迅速に上昇し、 ４時間を超える穿孔していないサイクル上昇端よりも本質的に優先する。曲線の 傾きおよび曲線の下の面積を見ることによって、本発明者らは、３倍を超える流 速が最初の４時間の間に微細穿孔によって起こったことを計算し得る。 実施例51 アルプロスタジルの送達：アルプロスタジルまたはPGE1は、その血管拡張性挙 動による男性の勃起性機能障害を処置するために治療的に使用されるプロスタグ ランジンである。この薬物についての標準的な送達様式は、陰茎の基部への直接 的な注射であるか、または尿道へ挿入される坐剤を介する。一連の実験を、２人 の健常な男性のボランティアで行った。各被験体は、皮膚の表面から測定した場 合に、およそ100ミクロンの深さの孔を作製する熱の孔パラメーターセットを用 いて、陰茎幹の基部の領域上に12から36個の微細穿孔をあけることによって調製 された１平方cmの部位を有した。濃縮したアルプロスタジルの溶液を、穿孔部位 上に配置した小さいレザーバーパッチ中に配置した。次いで、超音波トランスデ ューサーをレザーバーの上部の置き、そして活性化し、そして被験体の勃起性お よび他の臨床的な応答をビデオテープに記録した。両方の被験体が、陰茎の有意 な量の充血を生じ、適用された用量で70％以上の完全な勃起を達成すると概算し た。さらに、送達された薬物の全身的なレベルに対する頬の潮紅応答を観察した 。送達時間の30分から60分にわたって、両方の被験体は、顔面、首、胸部、およ び腕にまでおよぶ深在性の頬の潮紅を生じた。勃起応答および頬の潮紅の両方が 、薬物（周知の血管拡張因子）の臨床的に活性な量の送達の証拠を提供する。 実施例52 インターフェロンの送達：インターフェロンは、約17〜22,000の分子量のタン パク質であり、これは、種々の疾患状態（たとえば、ウイルス感染（例えば、Ｂ 型肝炎およびＣ型肝炎）、免疫疾患（例えば、多発性硬化症）、およびガン（例 えば、毛様細胞性白血病））を処置するために臨床的に投与される。これらのタ ンパク質の性質に起因して、インターフェロンは、現在は、注射によって投与さ れなければならない。なぜなら、これらは、経口で与えることができず、そして 伝統的な経皮または粘膜を介する送達方法には大きすぎるからである。微細穿孔 技術によるインターフェロンの送達を実証するために、１mlの送達溶液中に溶解 された１mgあたり１億国際単位のインターフェロンの特異的活性を有するインタ ーフェロンを含有する、αインターフェロン溶液の100マイクロリットルのアリ コートを、150〜180μmの深さにまで穿孔した、穿孔された皮膚の１平方cmの領 域に適用する。従って、健常なヒト被験体の大腿上の毛細血管床の不足を生じる 。試行を、インターフェロン溶液の有害な加熱を生じることなく下部組織へまた はそれを貫通して、孔を介するインターフェロンの移動を加速するために、純粋 に受動的な拡散および十分な振幅、周波数、およびその調節でのその領域に対す る音波エネルギーの適用のいずれかを使用して実施する。静脈血採取を、両方の 試 行について種々の時間の間隔で行い、そしてラジオイムノアッセイおよび生体ア ッセイを使用してインターフェロンレベルについてアッセイする。インターフェ ロンを、モニターした４時間にわたって血清中で検出する。音波によって増強さ せた送達実験についてのインターフェロンレベルは、受動的な実験についてより も早く検出される。別の実験において、インターフェロンは、乾燥粉末形態で、 直接、皮膚の穿孔領域の微細穿孔に投与される。インターフェロンは、上記と同 じ技術を使用して血清中で検出される。別の試験において、インターフェロン溶 液は、頬粘膜の穿孔組織に、裏打ちフィルムをともなって、または伴わずに、ゲ ル中に適用される。静脈血を採取し、そしてインターフェロンレベルについてア ッセイする。インターフェロンは、モニターした３時間に渡って血清中で検出さ れる。別の実験において、インターフェロンは、生体侵食性マトリクスを含む錠 剤中に、穿孔された頬粘膜の領域にわたって錠剤の接触を提供する、粘膜接着性 ポリマーマトリックスとともに組み込まれる。インターフェロンは、上記と同じ 技術を使用して血清中で検出される。 実施例53 モルヒネの送達：モルヒネの溶液を、ヒト被験体の手掌側の前腕上の穿孔領域 に適用する。正の圧力勾配を使用して、モルヒネの存在について適切な時間の間 隔で採取した静脈血のアッセイによって決定されるように、体内へのモルヒネの 基底送達速度を提供する。約３〜６ng/mlのモルヒネの基底レベルを達成する。 必要な場合には、さらなる圧力ボーラスを、モルヒネの送達においてスパイクを 生じるように適用する。さらなる圧力ボーラスを、超音波の使用によって１つの 試験において達成する；または圧力スパイクの使用によって別の実験において達 成する。モルヒネの基底レベルが持続的に適用され、必要な場合には定期的にモ ルヒネの送達におけるスパイクを用いるこの型の送達は、慢性および突発的な痛 みを処置することにおいて有用である。 実施例54 植物への疾患耐性DNAの送達：選択したトウモロコシ植物の種子を、微細穿孔 する。種子を、疾患耐性タンパク質をコードするDNAを含む浸透性処方物の溶液 中に入れる。音波エネルギーを必要に応じて用いて、トウモロコシの種子へのDN Aの送達を増強する。種子を発芽させ、そして成熟するまで生長させる。得られ る成熟したトウモロコシ植物の種子は、ここで、疾患耐性遺伝子を有する。 実施例55 植物へのDNAの送達：テンサイの種子を、微細穿孔する。種子を、ヒト成長ホ ルモンをコードするDNAを含む浸透性処方物の溶液中に入れる。エレクトロポレ ーション、イオン導入法、音波エネルギー、エンハンサー、およびこの部位の機 械的な刺激（例えば、圧力）を使用して、種子へのDNAの送達を増強し得る。種 子を発芽させ、そして成熟するまで生長させる。得られる成熟したテンサイ植物 の種子をここで回収し、そして続く精製および臨床的使用のためにヒト成長ホル モンが抽出され得る。 実施例56 蛍光デキストラン粒子（MW約10,000ダルトン）を、約80μmの深さにおよぶ36 個の微細穿孔を形成したヒト被験体の手掌側の前腕上の１平方cmの皮膚を覆うレ ザーバーパッチによって水溶液中に適用した、１つの実験を行った。レザーバー パッチを、５分間放置した。穿孔部位および周辺の領域を、組織中への透過性物 質の浸透を評価するために蛍光ビデオ顕微鏡で画像化した。蛍光は、５分以内の デキストランの有意な浸透が、最も近い微細穿孔から２mmを超えて離れて生じた ことを示した。10分後に使用したビデオアッセイシステムは、さらなる拡散を示 し、その結果、蛍光のフラッシュは孔から10mmに拡大した。この実験は、この技 術が10,000の分子量を有する透過性物質の送達を可能にするという明らかな証拠 を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7105 Ａ６１Ｋ 31/7105 31/711 31/711 31/715 31/715 31/727 31/727 38/00 39/395 38/04 37/02 38/28 37/26 39/395 37/43 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物の選択された部位への浸透性物質の経膜流動速度を増強するための方法 であって、 （a）生体膜を、該選択された部位で、該生体膜において微細穿孔を形成する 手段によって穿孔し、それにより、該生体膜の該浸透性物質の流動に対する障壁 特性を減少させる工程；および （b）該穿孔された選択された部位を、該浸透性物質の有効量を含む組成物と 接触させ、これにより該生物への該浸透性物質の該経膜流動速度が増強される工 程、 の手段により、該浸透性物質に対する該生物の該選択された部位の浸透率を増強 する工程を包含する、方法。 ２．前記生物の前記部位にエンハンサーを適用して、該生物への前記浸透性物質 の前記流動を増加させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記エンハンサーが、音波エネルギーを含む、請求項２に記載の方法。 ４．前記音波エネルギーが、約10Hz〜1000MHzの範囲の周波数で、前記部位に適 用され、ここで該音波エネルギーが、周波数調節、振幅調節、位相調節、および それらの組合せからなる群より選択されるメンバーの手段によって調節される、 請求項３に記載の方法。 ５．前記エンハンサーが電磁場を含む、請求項２に記載の方法。 ６．前記電磁場がイオン導入を含む、請求項５に記載の方法。 ７．前記電磁場が磁場を含む、請求項５に記載の方法。 ８．前記エンハンサーが機械力を含む、請求項２に記載の方法。 ９．前記エンハンサーが化学的エンハンサーを含む、請求項２に記載の方法。 １０．請求項３、４、５、６、７、８、または９に記載の方法のいずれかが、そ れらの任意の組合せに適用されて、前記微細穿孔へ、または該微細穿孔を介して 前記浸透性物質の前記経膜流動速度を増加し得る、請求項２に記載の方法。 １１．前記部位での前記エンハンサーが、前記微細穿孔を囲む組織への前記浸透 性物質の前記流動速度を増加するように適用される、請求項２に記載の方法。 １２．前記エンハンサーが音波エネルギーを含む、請求項１１に記載の方法。 １３．前記音波エネルギーが、約10Hz〜1000MHzの範囲の周波数で、前記部位に 適用され、ここで該音波エネルギーが、周波数調節、振幅調節、位相調節、およ びそれらの組合せからなる群より選択されるメンバーの手段によって調節される 、請求項１２に記載の方法。 １４．前記エンハンサーがエレクトロポレーションを含む、請求項１１に記載の 方法。 １５．前記エンハンサーがイオン導入を含む、請求項１１に記載の方法。 １６．前記エンハンサーが化学的エンハンサーを含む、請求項１１に記載の方法 。 １７．前記エンハンサーが機械力を含む、請求項１１に記載の方法。 １８．前記エンハンサーが電磁場を含む、請求項１１に記載の方法。 １９．前記エンハンサーが、請求項１２、１３、１４、１５、１６、１７、およ び１８に記載の方法のそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１１に記載の方 法。 ２０．請求項１９に記載の方法をさらに含む、請求項１０に記載の方法。 ２１．前記部位における前記生体膜の前記穿孔が、（a）該生体膜の該部位を熱 源と接触させることによって、該生体膜を除去し、その結果微細穿孔が、該生体 膜において該部位で形成される工程；（b）該生体膜を、校正された微小ランセ ットで穿孔し、微細穿孔を形成する工程；（c）該生体膜への音波エネルギービ ームによって、該生体膜を除去する工程；（d）該生体膜を、流動の高圧ジェッ トで水力学的に穿孔して、微細穿孔を形成する工程、および（e）前記生体膜を 、電気の短いパルスで穿孔して、微細穿孔を形成する工程、からなる群より選択 される手段によって達成される、請求項１に記載の方法。 ２２．前記穿孔が、前記部位を、約1000μmにわたって、熱源と接触させて、有 効量の熱エネルギーを、該部位に伝導的に移し、その結果該部位における水およ び他の気化物質のいくつかの温度が、前記生体膜において該部位で選択深度まで 微細穿孔を作製するためにそれらの気化点を越えて上昇されることによって達成 される、請求項２１に記載の方法。 ２３．前記穿孔が、前記部位を、約1000μmにわたって、熱源と接触させて、有 効量の熱エネルギーを、該部位に伝導的に移し、その結果、該部位での組織のい くつかの温度が、熱分解が生じる点まで上昇され、前記生体膜において該部位で 選択深度まで微細穿孔を作製することによって達成される、請求項２１に記載の 方法。 ２４．少なくとも前記部位を、パルス光源の発光範囲を越える十分な吸収を示す 有効量の物質で処理する工程、および該パルス光源から該物質への一連のパルス の出力に焦点をあわせ、その結果、該物質が、前記生体膜へ有効量の熱エネルギ ーを伝導的に移すのに十分加熱されて、温度を上昇し、それにより微細穿孔を作 製する工程を包含する、請求項２１に記載の方法。 ２５．前記パルス光源が、前記生体膜によって有意に吸収されない波長で発する 、請求項２４に記載の方法。 ２６．前記パルス光源が、約630〜1550nmの範囲で発するレーザーダイオードで ある、請求項２５に記載の方法。 ２７．前記パルス光源が、約700〜3000nmの範囲で発するレーザーダイオードポ ンプ光学パラメトリック発振器である、請求項２５に記載の方法。 ２８．前記パルス光源が、アークランプ、白熱ランプ、および発光ダイオードか らなる群より選択されるメンバーである、請求項２５に記載の方法。 ２９．前記生体膜における微細穿孔が、所望の寸法に達しているか否かを決定す るための検出システムを提供する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方 法。 ３０．前記検出システムが、前記部位から反射された光を受け、そして該光を受 けるための検出器に該反射された光を焦点させ、そしてシグナルをコントローラ ーに送るための、光収集手段を含み、ここで、該シグナルは該光の性質を示し、 コントローラーは、予め選択されたシグナルが受信された場合に、該シグナルの 受信および該光源の遮断のために、該検出器および該光源に接続されている、請 求項２９に記載の方法。 ３１．前記検出システムが、前記微細穿孔が形成されるような生物への異なる深 度での生体膜のインピーダンスにおける変化を検出し得る、電気的インピーダン ス測定システムを含む、請求項２９に記載の方法。 ３２．前記部位および隣接する組織を冷却し、その結果該部位および隣接する組 織を冷却状態にする工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。 ３３．前記冷却手段が、Peltierデバイスを含む、請求項３２に記載の方法。 ３４．前記部位を穿孔する前に、少なくとも該部位を光で照射し、その結果該部 位が殺菌される工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。 ３５．前記部位を固体エレメントと接触させ、ここで該固体エレメントが、前記 生体膜へ有効量の熱エネルギーを伝導的に伝達するための熱源として機能して、 温度を上昇させ、それにより微細穿孔を作製する工程を包含する、請求項２１に 記載の方法。 ３６．前記熱源が構築されて、前記部位の温度を、約10ナノ秒〜50ミリ秒内で10 0℃を越えるように調節し、次いで該部位の温度を、約１ミリ秒〜50ミリ秒内で ほぼ周囲温度に戻し、そしてここで温度を上昇しそして周囲温度に戻すサイクル が、前記所望の深度にまで前記生体膜を穿孔するのに有効に１回以上反復される 、請求項３５に記載の方法。 ３７．前記部位のほぼ周囲温度に戻す前記工程が、前記熱源を該部位との接触か ら取り除くことによって行われる、請求項３６に記載の方法。 ３８．前記調節パラメーターが、動物被験体に対する感覚を減少させるように選 択される、請求項３６に記載の方法。 ３９．請求項３５の前記固体エレメントと前記生物との間の電気的インピーダン スを、前記部位および隣接する組織を通してモニターするための手段、および該 固体エレメントの部分を進行させ、その結果、前記穿孔がインピーダンスに付随 する変化を生じ、前記進行手段が該固体エレメントを進行させ、その結果該固体 エレメントが、該固体エレメントの加熱の間、該選択されたインピーダンスが得 られるまで該部位と接触されるための手段を提供する工程をさらに含む、請求項 ３１に記載の方法。 ４０．前記固体エレメントを前記部位との接触から取り除くための手段であって 、ここでモニタリング手段が、該部位の表面の基底にある選択された層を接触す ることに関連するインピーダンスにおける変化を検出し得、そして該取り除く手 段にシグナルを送信して、該固体エレメントを該部位との接触から除き得る手段 をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。 ４１．前記固体エレメントが、オーム加熱エレメントを介して電流を送達するこ とによって加熱される、請求項３５に記載の方法。 ４２．前記固体エレメントが形成され、その結果、それが電気的伝導成分を含み 、そして該固体エレメントの温度が、調節された電流を伝導エレメントを介して 通過させることによって調節される、請求項３５に記載の方法。 ４３．前記固体エレメントが、調節可能な磁場に配置され、ここで磁場の励磁が 、該固体エレメントを加熱するのに十分な渦電流を産生する、請求項３５に記載 の方法。 ４４．前記穿孔が、微細穿孔を形成するように校正された微小ランセットで前記 部位を穿孔することによって達成される、請求項２１に記載の方法。 ４５．前記穿孔が、前記部位に指向される音波エネルギーのビームによって達成 される、請求項２１に記載の方法。 ４６．前記穿孔が、前記生体膜を、液体の高圧ジェットで水力学的に穿孔して、 微細穿孔を形成することによって達成される、請求項２１に記載の方法。 ４７．前記穿孔が、前記生体膜を、電気的に短いパルスで穿孔し、微細穿孔を形 成することによって達成される、請求項２１に記載の方法。 ４８．前記浸透性物質が核酸を含む、請求項１に記載の方法。 ４９．前記核酸がDNAを含む、請求項４８に記載の方法。 ５０．前記核酸がRNAを含む、請求項４８に記載の方法。 ５１．前記生体膜における前記微細穿孔が、１〜30ミクロンの深度の範囲の該生 体膜の外側の層の部分へ伸張する、請求項１に記載の方法。 ５２．前記生体膜における微細穿孔が、10〜200ミクロンの深度の範囲の該生体 膜の外側の層の部分へ伸張する、請求項１に記載の方法。 ５３．前記生体膜における微細穿孔が、100〜5000ミクロンの深度の範囲の該生 体膜の接続組織層の部分へ伸張する、請求項１に記載の方法。 ５４．前記生体膜における微細穿孔が、1000〜10000ミクロンの深度の範囲の該 生体膜の接続組織層の部分を介して伸張する、請求項１に記載の方法。 ５５．前記微細穿孔が、決定された深度へ前記生体膜を透過して、前記選択され た浸透性物質の所望の活性を促進する、請求項１に記載の方法。 ５６．前記浸透性物質がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。 ５７．前記ポリペプチドがタンパク質である、請求項５６に記載の方法。 ５８．前記ポリペプチドがペプチドを含む、請求項５６に記載の方法。 ５９．前記ペプチドがインシュリンを含む、請求項５８に記載の方法。 ６０．前記ペプチドが放出因子を含む、請求項５８に記載の方法。 ６１．前記浸透性物質が炭水化物を含む、請求項１に記載の方法。 ６２．前記炭水化物がヘパリンを含む、請求項６１に記載の方法。 ６３．前記浸透性物質が鎮痛剤を含む、請求項１に記載の方法。 ６４．前記鎮痛剤がオピエートを含む、請求項６３に記載の方法。 ６５．前記浸透性物質がワクチンを含む、請求項１に記載の方法。 ６６．前記浸透性物質がステロイドを含む、請求項１に記載の方法。 ６７．前記浸透性物質がキャリアと結合する、請求項１に記載の方法。 ６８．前記キャリアがリポソームを含む、請求項６７に記載の方法。 ６９．前記キャリアが脂質複合体を含む、請求項６７に記載の方法。 ７０．前記キャリアが微粒子を含む、請求項６７に記載の方法。 ７１．前記キャリアがポリエチレングリコール化合物を含む、請求項６７に記載 の方法。 ７２．請求項６６に記載の方法と組み合わせた、請求項６５に記載の方法。 ７３．前記浸透性物質が、前記生物内に存在する分析物に近接する刺激物へのそ の検出可能な応答を変化させる能力を有する物質を含む、請求項１に記載の方法 。