ES2254359T3 - Cepa viral para el tratamiento oncolitico de canceres. - Google Patents
Cepa viral para el tratamiento oncolitico de canceres.Info
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Abstract
La cepa JS1 del VHS1 según está depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) bajo el número de acceso V01010209, o una cepa de VHS1 derivada de la misma.
Description
Cepa viral para el tratamiento oncolítico de
cánceres.
La presente invención se refiere a cepas de VHS
que no son de laboratorio, con capacidades oncolíticas mejoradas
en comparación con las cepas de virus de laboratorio.
Se ha sugerido o se ha demostrado que los virus
son útiles en una variedad de aplicaciones en biotecnología y
medicina en muchas ocasiones. Cada una es debida a la capacidad
exclusiva de los virus de penetrar en las células con una alta
eficacia. En tales aplicaciones esto va seguido por la expresión y
la replicación de genes del virus y/o la expresión de un gen
heterólogo insertado. Los virus pueden por tanto suministrar y
expresar genes en las células (genes víricos u otros genes) que
pueden ser útiles en, por ejemplo, terapia génica o en el
desarrollo de vacunas, o bien pueden ser útiles para destruir
selectivamente las células mediante replicación lítica o por la
acción de un gen suministrado en, por ejemplo, el cáncer.
Se ha sugerido que el virus del herpes simple
(VHS) es útil como vector para el suministro de genes al sistema
nervioso central y a otros lugares y para el tratamiento oncolítico
del cáncer. En ambas aplicaciones el virus debe estar sin embargo
incapacitado, de tal manera que no sea ya patógeno pero que pueda
todavía penetrar en las células y llevar a cabo la función deseada.
De este modo, para el suministro de genes no tóxicos a las células
diana utilizando VHS, ha resultado obvio que en la mayoría de los
casos debe impedirse/minimizarse la expresión génica temprana
inmediata procedente del virus. Para el tratamiento oncolítico del
cáncer, que puede incluir también el suministro de un(os)
gen(es) que incremente(n) el efecto terapéutico, se
han identificado varias mutaciones del VHS que permiten replicarse
todavía al virus en cultivo o en células que estén en división
activa in vivo (por ejemplo en tumores), pero que impiden una
replicación significativa en tejido normal. Tales mutaciones
incluyen la alteración de los genes que codifican ICP34.5, ICP6 y
timidina quinasa. De éstas, los virus con mutaciones de ICP34.5 o
de ICP34.5 junto con mutaciones de ICP6, por ejemplo, han
demostrado hasta ahora el perfil de seguridad más favorable. Se ha
demostrado que los virus en los que se eliminado solamente ICP34.5
se replican en muchos tipos de células tumorales in vitro y
se replican selectivamente en tumores cerebrales inducidos
artificialmente en ratones, mientras que no lo hacen en el tejido
circundante. Ensayos clínicos en etapas tempranas han demostrado
también su seguridad en el hombre.
Sin embargo, aunque varios virus, incluyendo VHS,
han demostrado ser prometedores para la administración/tera-
pia génica o para el tratamiento oncolítico del cáncer, la mayoría de este trabajo ha utilizado cepas de virus que han sido mantenidas en células en cultivo de tejidos durante muchos años. En las aplicaciones en las que el virus necesita simplemente entrar en las células para suministrar genes, esto puede no resultar problemático ya que el mantenimiento en cultivo celular requiere también que el virus penetre en las células, aunque a menudo en células de un tipo o especie diferente en comparación con las probables células diana para un vector. Sin embargo, en aplicaciones en las que se requieren otras propiedades, la utilización de cepas de virus de laboratorio puede no permitir la utilización de todo el potencial de un virus en una aplicación particular.
pia génica o para el tratamiento oncolítico del cáncer, la mayoría de este trabajo ha utilizado cepas de virus que han sido mantenidas en células en cultivo de tejidos durante muchos años. En las aplicaciones en las que el virus necesita simplemente entrar en las células para suministrar genes, esto puede no resultar problemático ya que el mantenimiento en cultivo celular requiere también que el virus penetre en las células, aunque a menudo en células de un tipo o especie diferente en comparación con las probables células diana para un vector. Sin embargo, en aplicaciones en las que se requieren otras propiedades, la utilización de cepas de virus de laboratorio puede no permitir la utilización de todo el potencial de un virus en una aplicación particular.
El VHS tiene una capacidad exclusiva entre los
virus actualmente en desarrollo como vectores, en el sentido de
que ha evolucionado de manera natural para infectar y permanecer
latente en las neuronas. El VHS ha evolucionado también para ser
transportado muy eficazmente a lo largo de los nervios desde el
lugar de la infección, normalmente en la periferia, hasta el cuerpo
de las células neuronales, normalmente en los ganglios espinales.
Tales capacidades no se requieren en cultivo celular y como tales
capacidades requieren propiedades evolucionadas específicas del
VHS, una adaptación posterior al crecimiento en cultivo puede haber
tenido como resultado la pérdida de capacidades de transporte
axonal óptimamente eficaz. Es probable que los vectores VHS para
la administración de genes al sistema nervioso central o periférico
muestren una eficacia máxima si se han conservado las propiedades
de transporte axonal con una máxima eficacia. En la presente, la
inoculación en un lugar periférico permitiría por tanto un
suministro de genes máximamente eficaz a los cuerpos celulares de
las neuronas periféricas, y la inoculación en el cerebro permitiría
un suministro de genes máximamente eficaz a múltiples lugares
conectados. Puede que los vectores actuales basados en cepas de
laboratorio de VHS no permitan que esto tenga lugar con la máxima
eficacia posible. En efecto, debido a la elevada capacidad del VHS
para ser transportado a lo largo de los nervios, existe
potencialmente una discrepancia particularmente grande entre las
propiedades que se desea conservar y las que probablemente se
conserven en cultivo.
El VHS y otros virus tales como adenovirus o
reovirus tienen también una utilidad potencial en el tratamiento
oncolítico del cáncer. Sin embargo, una vez más los virus en
desarrollo para tales fines han sido previamente mantenidos en
cultivo durante mucho tiempo. Como el tratamiento oncolítico del
cáncer requiere la replicación activa en células tumorales humanas
creciendo a menudo de forma relativamente lenta, se podría esperar
que la adaptación de las cepas de virus de laboratorio al
crecimiento en células cultivadas particulares pudiera haber
reducido la eficacia con la cual podría tener lugar óptimamente tal
replicación lítica en células tumorales humanas, o la infección de
células tumorales humanas.
La presente invención proporciona virus con
capacidades in vivo mejoradas de destrucción lítica de
células tumorales. Se han construido cepas de virus apropiadas para
estos fines basadas en aislados clínicos recientes del virus
apropiado en lugar de en las cepas de laboratorio pasadas de manera
seriada que han sido utilizadas previamente. La presente invención
proporciona por tanto virus con capacidades mejoradas para infectar
células humanas in vivo y con capacidad de
replicación/lítica mejorada en tales células.
Hemos demostrado que dos aislados clínicos del
VHS1 (cepas JS1 y BL1) tienen una replicación incrementada en
algunas líneas de células tumorales humanas en comparación con la
cepa 17+ del VHS1 (una cepa de laboratorio estándar).
Hemos eliminado ICP34.5 de la cepa JS1 aislada
clínicamente y hemos comparado de nuevo el potencial de replicación
en tipos de células tumorales humanas en comparación con VHS1 cepa
17+ (una cepa de laboratorio estándar) en la que se había eliminado
también ICP34.5. Esta cepa (JS1/ICP34.5-) es una cepa modificada
derivada de un aislado clínico y es, por tanto, una cepa no de
laboratorio modificada de la invención.
JS1 en la que se había eliminado ICP34.5
presentaba un crecimiento incrementado en algunas células
tumorales humanas analizadas en comparación con VHS1 cepa 17+ en la
que se había eliminado ICP34.5, esto es una cepa de virus de
laboratorio con la misma modificación. Sin embargo, en comparación
con la cepa de laboratorio derivada de la cepa 17+, las capacidades
de destrucción celular estaban incrementadas con el virus
JS1/ICP34.5- en todas las líneas celulares tumorales
analizadas.
Por tanto, puede considerarse que la utilización
de estas cepas de virus que no son de laboratorio incrementa las
capacidades antitumorales de tales virus y esto ha sido evidente en
todas las líneas de células tumorales analizadas hasta ahora. Esto
tendrá aplicabilidad en el tratamiento del cáncer en pacientes
humanos.
Puede esperarse también una actividad
incrementada adicionalmente si estos virus son utilizados
posteriormente para suministrar genes con actividad antitumoral.
Tales genes incluyen los que codifican activadores de profármacos,
factores supresores de tumores o proapoptóticos, o proteínas
inmunoestimulantes.
Para este fin, nosotros hemos producido un
aislado clínico del VHS1 en el que se ha eliminado ICP34.5 que
expresa GMCSF humano. Este virus está diseñado para incrementar las
respuestas inmunes antitumorales que siguen a una inyección
intratumoral.
La invención proporciona también virus de la
invención que llevan gen/genes heterólogo/heterólogos. El término
gen heterólogo tiene la intención de incluir cualquier gen no
encontrado en el genoma vírico. El gen heterólogo puede ser
cualquier variante alélica de un gen de tipo salvaje, o puede ser
un gen mutante. Los genes heterólogos están preferiblemente unidos
operativamente a una secuencia control que permite la expresión de
dicho gen heterólogo en una célula in vivo. Los virus de la
invención pueden ser utilizados por tanto para suministrar
gen/genes heterólogo/heterólogos a una célula in vivo en la
cual será/serán expresado/expresados. Para la terapia con virus
oncolíticos, tales genes codifican típicamente proteínas capaces de
incrementar las propiedades destructoras de tumores del virus.
Estos genes pueden codificar proteínas que sean citotóxicas por sí
mismas, que sean activadoras de profármacos o que puedan ser capaces
de estimular/incrementar una respuesta inmune antitumo-
ral.
ral.
En todos los casos, genes heterólogos
individuales o múltiples pueden ser llevados por un único
virus.
Por consiguiente, la invención proporciona:
La cepa JS1 del VHS1 según está depositada en la
European Collection of Cell Cultures (ECACC) bajo el número de
acceso V01010209, o una cepa de VHS1 derivada de la misma; una
composición farmacéutica conteniendo tal virus; tal virus para ser
utilizado en el tratamiento del organismo humano o animal; la
utilización de tal virus en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento oncolítico del cáncer y un método para determinar
si un gen incrementa los efectos antitumorales de una cepa de VHS,
que comprende:
- (i)
- la provisión de tal cepa del VHS según se define en la presente;
- (ii)
- la inserción de dicho gen en dicha cepa del VHS y
- (iii)
- la determinación de la capacidad de dicha cepa del VHS oncolítica, modificada, para replicarse en, o destruir, células tumorales en comparación con la capacidad de la cepa precursora proporcionada en la etapa (i).
\newpage
Fig.
1
De arriba hacia abajo, los diagramas muestran:
VHS1 cepa 17+ de laboratorio, cepa clínica BL1, cepa clínica JS1,
17+/ICP34.5-, JS1/ICP34.5-, JS1/ICP34.5-/ICP47-/hGMCSF.
Fig.
2
(1) Crecimiento de 17+, BL1 y JS1. Diagrama de la
izquierda: células U87. Diagrama de la derecha: células LNCaP.
(2) Crecimiento de ICP34.5- 17+ y JS1 en células
tumorales. Diagrama de la izquierda: células LNCaP. Diagrama de la
derecha: células MDA-MB-231.
(3) JS1/34.5- no crece en células no permisivas
para los mutantes ICP34.5 del VHS. Diagrama de la izquierda:
células 3T6 - 17+, JS1. Diagrama de la derecha: células 3T6 - 17+,
JS1 ICP34.5-.
Fig.
3
Líneas celulares tumorales fueron infectadas de
forma ficticia, infectadas con VHS1 cepa 17+/34.5-, o infectadas
con VHS1 cepa JS1/34.5- a la MOI indicada y teñidas con cristal
violeta a puntos de tiempos después de la infección para permitir
la visualización de las células. Cada bloque de fotografías se
refiere a un tipo celular. De arriba hacia abajo, estos son
adenocarcinoma colorrectal HT29, adenocarcinoma de próstata
LNCaP.FGC, adenocarcinoma de mama
MDA-MB-231, melanoma maligno
SK-MEL-28 y astrocitoma
glioblastoma U-87 MG. Los bloques de la izquierda
se refieren a los resultados obtenidos para VHS1 cepa 17+/34.5-.
Los bloques de la derecha se refieren a los resultados obtenidos
para VHS1 cepa JS1/34.5-. Los bloques centrales representan
células infectadas de manera ficticia. En cada bloque, la fila
superior representa un punto de tiempo de 24 horas, la segunda un
punto de tiempo de 48 horas y la tercera un punto de tiempo de 72
horas en cada bloque, la columna de la izquierda representa una
MOI=0,2, la columna central una MOI=0,1 y la columna de la derecha
una MOI=5.
Una cepa de virus de la invención es el virus del
herpes simple 1 (VHS1) cepa JS1 o una cepa derivada de la
misma.
Los derivados tienen preferiblemente al menos un
70% de homología de secuencias con el genoma del VHS1, más
preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al
menos un 90 ó 95%. Más preferiblemente, un derivado tiene al menos
un 70% de identidad de secuencias con el genoma del VHS1, más
preferiblemente al menos un 80% de identidad, incluso más
preferiblemente al menos un 90%, un 95% o un 98% de identidad.
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el
programa BESTFIT que puede ser utilizado para calcular homologías
(utilizado por ejemplo en sus ajustes por defecto) (Devereux y col.,
(1984) Nucleic Acids Research 12:
387-395). Pueden utilizarse los algoritmos de PILEUP
y BLAST para calcular homologías o para alinear secuencias
(típicamente en sus ajustes por defecto), por ejemplo según está
descrito en Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:
290-300; Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol.
215: 403-10.
El programa para realizar los análisis BLAST está
disponible públicamente a través del National Centre for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/).
Este algoritmo implica la identificación en primer lugar de pares
de secuencias con puntuación elevada (HSPs) mediante la
identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia
problema que coincidan o satisfagan una cierta puntuación umbral T
de valor positivo cuando están alineadas con una palabra de la
misma longitud de una secuencia de la base de datos. T es referido
como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Autschul y col.,
1990). Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actúan como
semillas para iniciar búsquedas con el fin de encontrar HSPs que
las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas
direcciones a lo largo de cada secuencia siempre que pueda
incrementarse la puntuación de alineación acumulativa. Las
extensiones de los aciertos de palabras en cada dirección se
detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae en la
cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación
acumulativa llega a cero o por debajo de cero, debido a la
acumulación de una o más alineaciones de residuos que puntúan
negativamente; o cuando se alcanza el final de cada secuencia. Los
parámetros W, T y X del algoritmo de BLAST determinan la
sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST
utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, alineaciones
(B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, Henikoff y Henikoff
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10915-10919) de 50, una expectativa (E) de 10, M=5,
N=4 y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo de BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; ver por ejemplo,
Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 5873-5787. Una medida de similitud
proporcionada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de la
suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de
la probabilidad mediante la cual tendría lugar una coincidencia
entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad.
Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia
si la probabilidad de la suma más pequeña en la comparación de la
primera secuencia con la segunda secuencia es menor de 1
aproximadamente, preferiblemente menor de 0,1 aproximadamente, más
preferiblemente menor de 0,01 aproximadamente y muy preferiblemente
menor de 0,001 aproximadamente.
Un derivado puede tener la secuencia del genoma
de VHS1 modificada por sustituciones de nucleótidos, por ejemplo
de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El genoma del VHS1 o
del VHS2 puede ser modificado alternativamente o adicionalmente por
una o más inserciones y/o deleciones y/o por una extensión en uno o
en ambos extremos.
Las cepas de VHS1 JS1 de la invención son cepas
"no de laboratorio". Pueden ser también referidas como cepas
"clínicas". Una persona con experiencia en la técnica será
capaz de distinguir fácilmente entre una cepa de laboratorio y una
cepa "no de laboratorio" o clínica. A continuación se da una
orientación adicional sobre las propiedades que es probable que
sean presentadas por las cepas de virus.
La distinción clave entre una cepa de laboratorio
y una cepa no de laboratorio es que las cepas de laboratorio
actualmente utilizadas comúnmente han sido mantenidas durante
largos periodos, en algunos casos durante muchos años, en cultivo.
El cultivo de virus tales como VHS implica una técnica conocida
como pase en serie. Para cultivar y mantener virus, células
adecuadas son infectadas con el virus, el virus se replica en la
célula y el virus es posteriormente recogido. Células nuevas son
posteriormente reinfectadas. Este proceso constituye un ciclo de un
pase en serie. Cada uno de tales ciclos puede durar, por ejemplo,
unos cuantos días en el caso del VHS. Según se discutió
anteriormente, tales pases seriados pueden dan lugar a cambios de
las propiedades de la cepa de virus, ya que tiene lugar una
selección por las propiedades que favorecen el crecimiento en
cultivo (por ejemplo, una replicación rápida), en oposición a las
propiedades útiles para aplicaciones prácticas.
Las cepas de virus de la invención son cepas
"no de laboratorio" en el sentido de que derivan de cepas
aisladas recientemente de individuos infectados. Las cepas de la
invención están modificadas en comparación con los aislados
clínicos originales, y pueden haber pasado un tiempo en cultivo,
pero cualquier tiempo pasado en cultivo será comparativamente
corto. Las cepas de la invención son preparadas de tal manera que
conservan sustancialmente las propiedades deseables de los aislados
clínicos originales de los que derivan.
Un virus de la invención es capaz de infectar
eficazmente células humanas diana. Tal virus ha sido aislado
recientemente de un individuo infectado y posteriormente ha sido
sometido a selección por la capacidad deseada de replicación
incrementada en células tumorales y/o en otras células in
vitro y/o in vivo en comparación con las cepas de
laboratorio estándar, o (en el caso de virus neurotróficos tales
como el VHS) por una capacidad incrementada para moverse a lo largo
de los nervios en comparación con las cepas de laboratorio
estándar utilizando un modelo in vivo. Tales virus con
propiedades mejoradas en comparación con las cepas de virus de
laboratorio son los virus de la invención. Los virus identificados
con tales propiedades mejoradas deseadas pueden ser posteriormente
manipulados de tal manera que puedan destruir selectivamente
células tumorales por la mutación del(los) gen(es)
apropiado(s). Estos virus modificados son también virus de
la invención. Alternativamente, pueden aislarse cepas de virus de
un individuo infectado y esperarse mutaciones que sean apropiadas
para la terapia oncolítica. Estos virus modificados son
seleccionados posteriormente por la propiedades mejoradas deseadas
en comparación con las cepas de laboratorio; los virus con tales
propiedades mejoradas proporcionan más virus de la invención.
Una orientación adicional sobre las propiedades
probables de las cepas de virus de la invención se proporciona a
continuación.
Preferiblemente, una cepa de virus de la
invención ha experimentado tres años o menos en cultivo desde el
aislamiento de su cepa precursora clínica no modificada de su
huésped. Más preferiblemente, una cepa de la invención ha
experimentado un año o menos en cultivo, por ejemplo nueve meses o
menos, seis meses o menos, tres meses o menos, dos meses o menos,
un mes o menos, dos semanas o menos o una semana o menos. Por
estas definiciones del tiempo de cultivo, se indica el tiempo pasado
realmente en cultivo. Así, por ejemplo, es una práctica común
congelar cepas de virus para conservarlas. Evidentemente, la
conservación por congelación o de una forma equivalente no cuenta
como mantenimiento de la cepa en cultivo. Por tanto, el tiempo
pasado en congelación o en conservación de otra forma no está
incluido en las definiciones anteriores de tiempo pasado en
cultivo. El tiempo pasado en cultivo es típicamente el tiempo pasado
realmente experimentando pases en serie, esto es, el tiempo
durante el cual puede tener lugar la selección por características
indeseables.
Una cepa de virus de la invención ha
experimentado preferiblemente 10 ciclos o menos de pases seriados
desde el aislamiento de su cepa precursora clínica no modificada de
su huésped.
Preferiblemente, un virus de la invención tiene
mayor capacidad, medida mediante análisis estadísticos estándar,
que una cepa de laboratorio de referencia con modificaciones
equivalentes para realizar ciertas funciones útiles en la
aplicación próxima. Por ejemplo, en el caso de un virus oncolítico
para el tratamiento de tumores, una cepa de virus de la invención
tendrá preferiblemente mayor capacidad que una cepa de laboratorio
de referencia con modificaciones equivalentes para infectar o
replicarse en cualquier célula tumoral, para destruir células
tumorales o para propagarse entre las células de un tejido. Más
preferiblemente, tal mayor capacidad es una mayor capacidad
estadísticamente significativa. Por ejemplo, de acuerdo con la
invención, puede tener hasta 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5 veces, 2
veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces la
capacidad de la cepa de referencia con respecto a la propiedad que
esté siendo analizada.
Preferiblemente, un virus de la invención tiene,
esto es conserva, sustancialmente la capacidad de su cepa
precursora clínica no modificada con respecto a una o más de las
propiedades características de utilidad en la aplicación próxima.
Por ejemplo, en el caso de un virus oncolítico destinado al
tratamiento de tumores, una cepa de virus de la invención tiene
preferiblemente sustancialmente la capacidad de su cepa precursora
clínica no modificada para infectar o replicarse en una célula
tumoral, para destruir células tumorales o para propagarse entre
las células de un
tejido.
tejido.
Preferiblemente, de acuerdo con la invención, un
virus conserva sustancialmente las propiedades de su cepa
precursora clínica no modificada si, en un ensayo cuantitativo,
conserva un 75%, más preferiblemente un 80, 90, 95, 98, 99 ó 100%
de la capacidad de la cepa precursora clínica no modificada con
respecto a la propiedad que esté siendo analizada. Más
preferiblemente, con respecto a la propiedad que esté siendo
analizada, cualquier diferencia entre la cepa precursora clínica no
modificada y la cepa modificada de la invención no será
estadísticamente significativa.
El análisis estadístico de las propiedades
descritas en la presente puede ser llevado a cabo mediante
análisis estándar, por ejemplo, tests t, ANOVA o test de Chi
cuadrado. Típicamente, la significación estadística será medida a
un nivel de p = 0,05 (5%), más preferiblemente p = 0,01, p = 0,001,
p = 0,0001, p = 0,000001.
Los virus de la invención están típicamente
modificados en comparación con sus cepas clínicas precursoras. En
particular, ciertos genes serán típicamente convertidos en no
funcionales y los virus pueden contener también gen(es)
heterólogo(s). Típicamente, los virus de la invención están
atenuados.
Las regiones víricas alteradas para los fines
descritos en la presente pueden estar eliminadas (completamente o
parcialmente), o pueden ser convertidas en no funcionales o
sustituidas por otras secuencias, en particular por una secuencia
génica heteróloga. Pueden hacerse no funcionales uno o más genes y
pueden insertarse uno o más genes heterólogos.
En una realización, los virus de la invención son
virus no de laboratorio, oncolíticos, modificados. Éstos serán
útiles en el tratamiento oncolítico del cáncer. Tales virus infectan
y se replican en células tumorales, destruyendo posteriormente las
células tumorales. Por tanto, tales virus son competentes para la
replicación. Preferiblemente, son competentes para la replicación
selectivamente en células tumorales. Esto significa que se
replican en células tumorales y no en células que no sean
tumorales, o que se replican más eficazmente en células tumorales
que en células no tumorales. La medida de la competencia para la
replicación selectiva puede ser llevada a cabo mediante los ensayos
descritos en la presente para medir la capacidad de replicación y
de destrucción de células tumorales, y también puede ser analizada,
si se desea, mediante las técnicas estadísticas mencionadas en la
presente.
Un virus oncolítico de la invención tiene
preferiblemente mayor capacidad que una cepa de laboratorio de
referencia con las mismas modificaciones para infectar o replicarse
en una célula tumoral, para destruir células tumorales o para
propagarse entre las células de los tejidos. Preferiblemente, esta
capacidad es una capacidad mayor estadísticamente significativa,
según se describe en la presente. Las propiedades de la cepa de
virus con respecto a las células tumorales pueden ser medidas de
cualquier manera conocida en la técnica.
Por ejemplo, la capacidad de un virus para
infectar una célula tumoral puede ser cuantificada midiendo la
dosis de virus requerida para medir un porcentaje dado de células,
por ejemplo un 50% o un 80% de las células. La capacidad para
replicarse en una célula tumoral puede ser medida mediante medidas
del crecimiento tales como las llevadas a cabo en los Ejemplos (ver
la Figura 2), por ejemplo midiendo el crecimiento del virus en las
células durante un periodo de 6, 12, 24, 36, 48 ó 72 horas, o
mayor.
La capacidad un virus para destruir células
tumorales puede ser cuantificada a groso modo a ojo (ver la Figura
3) o puede ser cuantificada más exactamente contando el número de
células vivas que permanecen a lo largo del tiempo para un punto de
tiempo y una MOI dados para un tipo celular dado. Por ejemplo, las
comparaciones pueden ser realizadas a lo largo de 24, 48 ó 72 horas
y utilizando cualquier tipo de célula tumoral conocido. En
particular, pueden utilizarse células de adenocarcinoma colorrectal
HT29, de adenocarcinoma de próstata LNCaP.FGC, de adenocarcinoma de
mama MDA-MB-231, de melanoma maligno
SK-MEL-28 o de astrocitoma
glioblastoma U-87 MG. Puede utilizarse cualquiera de
estos tipos celulares o cualquier combinación de estos tipos
celulares, así como otros tipos de células tumorales. Puede ser
deseable construir para este fin un panel estándar de tipos de
células tumorales. Para contar el número de células vivas que
permanecen en un punto de tiempo dado, puede contarse el número de
células que excluyen al Azul Trypan (esto es, células vivas). La
cuantificación puede llevarse a cabo también mediante la selección
de células activadas por fluorescencia (FACS) o mediante un ensayo
de MTT. La capacidad para destruir células tumorales puede ser
también medida in vivo mediante, por ejemplo, la medida de
la reducción del volumen del tumor producida por un virus
particular.
La capacidad de un virus para propagarse en un
tejido, especialmente en un tejido sólido, puede ser medida
determinando el número de células en lugares conectados con el lugar
de la infección original.
Con el fin de determinar las propiedades de los
virus de la invención, será generalmente deseable utilizar una
cepa de laboratorio estándar de referencia para comparación. La
cepa de laboratorio estándar de referencia es una o más de VHS1
cepa 17+, VHS1 cepa F y VHS1 cepa KOS. La cepa de referencia tendrá
típicamente modificaciones equivalentes a las de la cepa de la
invención que esté siendo analizada. Por tanto, la cepa de
referencia tendrá típicamente modificaciones equivalentes, tales
como deleciones de genes y/o inserciones de genes heterólogos. Por
ejemplo, si los genes que codifican ICP34.5 y ICP47 han sido
convertidos en no funcionales en el virus de la invención, tendrán
que ser también convertidos en no funcionales en la cepa de
referencia. Las modificaciones realizadas en la cepa de referencia
pueden ser idénticas a las realizadas en la cepa de la invención.
Mediante esto se quiere indicar que las alteraciones de genes en la
cepa de referencia estarán en posiciones exactamente equivalentes a
las de la cepa de la invención, por ejemplo las deleciones serán
del mismo tamaño y en el mismo lugar. De manera similar, en estas
realizaciones, los genes heterólogos serán insertados en el mismo
lugar, estarán dirigidos por el mismo promotor, etc. Sin embargo,
no es esencial que se realicen modificaciones idénticas. Lo que es
importante es que el gen de referencia tenga modificaciones
funcionalmente equivalentes, por ejemplo que los mismos genes sean
convertidos en no funcionales y/o se inserte/inserten el/los
mismo/mismos gen o genes heterólogo/heterólogos.
En un virus oncolítico de la invención, se
realizarán en el virus modificaciones adecuadas para conferir al
mismo actividad oncolítica, si no está presente de manera natural, y
preferiblemente para conferir actividad oncolítica selectiva.
Tales mutaciones que permiten una actividad
oncolítica selectiva incluyen mutaciones de los genes que
codifican ICP34.5, ICP6 y/o timidina quinasa (TK), preferiblemente
ICP34.5. Tales mutaciones en el gen que codifica ICP34.5 en cepas
de laboratorio del VHS están descritas en Chou y col., 1990,
Maclean y col., 1991, aunque puede utilizarse cualquier mutación en
la que ICP34.5 no sea funcional.
Por consiguiente, la cepa del VHS es modificada
preferiblemente de tal forma que carezca de uno o más de un gen
que codifique ICP34.5 funcional, un gen que codifique ICP6
funcional, un gen que codifique glicoproteína H funcional, un gen
que codifique timidina quinasa funcional.
Más preferiblemente, el virus carece de un gen
que codifica ICP34.5 funcional.
Pueden realizarse también otras modificaciones.
En particular, el virus puede ser modificado de tal manera que
carezca de un gen de ICP47 funcional. Esto es debido a que ICP47
funciona normalmente bloqueando la presentación del antígeno en
células infectadas con VHS, por lo que su alteración da lugar a un
virus que no confiere a las células tumorales infectadas
propiedades particulares que podrían proteger a tales células
infectadas con VHS del sistema inmune del huésped.
Virus con cualquier otro gen eliminado/mutado que
proporcione propiedades oncolíticas (esto es, la replicación
selectiva en tumores en comparación con el tejido circundante) son
también virus de la invención, ya que los expertos en la técnica
reconocerán que la lista anterior no es exhaustiva y la
identificación de la función de otros genes en cualquiera de los
virus anteriores puede sugerir la construcción de nuevos virus que
son también virus de la
invención.
invención.
El/los gen/genes heterólogo/heterólogos
puede/pueden ser también insertado/insertados en tales virus de la
invención mediante técnicas conocidas en el oficio y/o descritas en
la presente. En un virus oncolítico, el gen heterólogo será
típicamente uno que incremente la capacidad del virus para
contrarrestar tumores. Puede insertarse por tanto cualquier gen que
confiera al virus propiedades antitumorales. En particular, el gen
heterólogo puede un gen capaz de modificar la respuesta inmune a las
células tumorales de una manera beneficiosa, especialmente un
polipéptido inmunoestimulante tal como CD40L, el factor estimulante
de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF),
otra citoquina o quimioquina (por ejemplo, RANTES), B7.1 o B7.2 o
IL12. Alternativamente, el gen heterólogo puede codificar un
activador de un profármaco, tal como nitrorreductasa o citocromo
P450. En este contexto, se prevé el tratamiento combinado de
tumores con el profármaco activado por el activador del profármaco
y un virus de la invención. Alternativamente, el gen heterólogo
puede codificar un supresor de tumores, tal como p53.
Cuando el virus de la invención es un virus del
herpes simple que carece de un gen esencial funcional particular,
por ejemplo un gen que codifica ICP4 o ICP27, el virus de la
invención es propagado en una línea celular que exprese ese gen
esencial. Por ejemplo, cuando el virus carezca de un gen de ICP27
funcional, el virus puede ser propagado en células V27 (Rice y
Knipe, 1990), en células 2-2 (Smith y col., 1992) o
en células B130/2 (Howard y col., 1998). Cuando el virus carezca de
un gen de ICP4 funcional el virus puede ser propagado en una línea
celular que exprese ICP4, por ejemplo en las células E5 (DeLuca y
col., 1985). Cuando el virus carezca de un gen de ICP4 funcional y
de un gen de ICP27 funcional, el virus es propagado en una línea
celular que exprese ICP4 e ICP27 (tal como las células E26;
Samaniego y col., 1995), y cuando el virus carezca adicionalmente
de un gen vmw65 funcional, el virus puede ser propagado en una línea
celular que contenga también un homólogo de vmw65 que no sea del
VHS (por ejemplo del virus del herpes equino, como en Thomas y
col., 1999). Las mutaciones de vmw65 pueden ser también compensadas
parcialmente mediante la inclusión de bisacetamida hexametileno
(HMBA) en el medio utilizado para el crecimiento del virus
(MacFarlane y col., 1992).
Pueden producirse líneas celulares que expresen
ICP27 cotransfectando células de mamífero, por ejemplo células
Vero o BHK, con un vector, preferiblemente un vector plasmídico,
que contenga un gen de ICP27 del VHS funcional capaz de ser
expresado en dichas células, y con un vector, preferiblemente un
vector plasmídico, que codifique un marcador seleccionable, por
ejemplo resistencia a neomicina. Los clones que posean el marcador
seleccionable son posteriormente sometidos a selección
adicionalmente con el fin de determinar qué clones expresan
también ICP27 funcional, por ejemplo sobre la base de su capacidad
para apoyar el crecimiento de las cepas de VHS ICP27-, utilizando
métodos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo,
según está descrito en Rice y Knipe, 1990).
Las líneas celulares que no permiten la reversión
de una cepa de VHS ICP27- mutante a una cepa con ICP27 funcional,
son producidas según se describió anteriormente, asegurando que el
vector que contiene un gen de ICP27 funcional no contenga
secuencias que solapen con (esto es, sean homólogas a) secuencias
que permanecen en el virus mutante ICP27-.
Cuando las cepas de VHS de la invención contengan
modificaciones inactivadoras en otros genes esenciales, por
ejemplo ICP4, las líneas celulares complementarias contendrán un gen
del VHS funcional que complemente al gen esencial modificado de la
misma manera que la descrita para ICP27. Por ejemplo, en el caso de
cepas del VHS que contengan mutaciones en ICP27 y en ICP4, se
utilizará una línea celular que exprese ICP27 e ICP4 (tal como
está descrito en Samaniego y col., 1995 o en Thomas y col., 1999).
Pueden construirse cepas del VHS que expresen otros genes
esenciales de una manera similar a la descrita para ICP27. Aquí de
nuevo, si se asegura que no hay un solapamiento de secuencias entre
el ADN del virus restante y el insertado en la línea celular para
el crecimiento del virus, se minimizará la posibilidad de reversión
del virus a una forma menos discapacitada durante el
crecimiento.
Los diferentes genes víricos referidos pueden ser
convertidos en funcionalmente inactivos mediante varias técnicas
bien conocidas en el oficio. Por ejemplo, pueden ser convertidos en
funcionalmente inactivos mediante deleción(es),
sustitución(es) o inserción(es), preferiblemente por
deleción. Una deleción puede eliminar una porción de los genes o el
gen completo. Por ejemplo, puede realizarse la deleción de
solamente un nucleótido, teniendo como resultado un desplazamiento
del marco. Sin embargo, se produce preferiblemente una deleción
mayor, por ejemplo de al menos un 25%, más preferiblemente de al
menos un 50% de la secuencia codificadora y no codificadora total
(o alternativamente, en términos absolutos, de al menos 10
nucleótidos, más preferiblemente de al menos 100 nucleótidos, muy
preferiblemente de al menos 1000 nucleótidos). Se prefiere
particularmente eliminar el gen completo y alguna de las secuencias
flanqueantes. Una secuencia insertada puede incluir uno o más de
los genes heterólogos descritos a continuación. En el caso del gen
vmw65 no se elimina el gen completo, ya que codifica una proteína
estructural esencial, pero se produce una pequeña mutación
inactivadora que suprime la capacidad de vmw65 para activar los
genes IE transcripcionalmente (por ejemplo, como en Ace y col.,
1989 o en Smiley y col. 1997).
Las mutaciones son producidas en los virus herpes
mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, el ADN genómico del VHS es
transfectado junto con un vector, preferiblemente un vector
plasmídico, que contiene la secuencia mutada flanqueada por
secuencias homólogas del VHS. La secuencia mutada puede contener
una deleción(es), inserción(es) o
sustitución(es), todas las cuales pueden ser construidas
mediante técnicas rutinarias. Las inserciones pueden incluir genes
marcadores seleccionables, por ejemplo lacZ o GFP, para la
selección de los virus recombinantes mediante, por ejemplo, la
actividad \beta-galactosidasa o por
fluorescencia.
Los virus de la invención pueden ser modificados
para que lleven gen/genes heterólogos. El término "gen
heterólogo" incluye cualquier gen. Aunque un gen heterólogo es
típicamente un gen que no está presente en el genoma de un virus
herpes, pueden utilizarse gen/genes del herpes siempre que la
secuencia codificadora no esté unida operativamente a secuencias
control del virus con las que está asociada de forma natural. El
gen heterólogo puede ser cualquier variante alélica de un gen de
tipo salvaje, o puede ser un gen mutante. El término "gen"
tiene la intención de incluir secuencias de ácido nucleico que sean
capaces de ser al menos transcritas. Por tanto, están incluidas
dentro de esta definición secuencias que codifican ARNm, ARNt y
ARNr. Sin embargo, la presente invención tiene que ver con la
expresión de polipéptidos más que con la expresión de ARNt y ARNr.
Las secuencias que codifican ARNm incluirán opcionalmente algunas o
todas las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' transcritas pero no
traducidas de manera natural, o asociadas de otro modo con la
secuencia codificadora traducida. Puede incluir además
opcionalmente las secuencias para el control de la transcripción
asociadas que están asociadas normalmente con las secuencias
transcritas, por ejemplo señales de parada de la transcripción,
lugares de poliadenilación y elementos intensificadores corriente
abajo.
El/los gen/genes heterólogo/heterólogos
puede/pueden ser insertado/insertados en el genoma del virus
mediante recombinación homóloga de cepas de VHS con, por ejemplo,
vectores plasmídicos portadores del/los gen/genes
heterólogo/heterólogos flanqueado/flanqueados por secuencias del
VHS. El/los gen/genes heterólogo/heterólogos puede/pueden ser
introducido/introducidos en un vector plasmídico adecuado que
contenga secuencias del virus del herpes utilizando técnicas de
clonaje bien conocidas en el oficio. El/los gen/genes
heterólogo/heterólogos puede/pueden ser insertado/insertados en el
genoma del virus en cualquier posición, siempre que el virus pueda
seguir propagándose. Se prefiere que el/los gen/genes
heterólogo/heterólogos sea/sean insertado/insertados en un gen
esencial. Los genes heterólogos pueden ser insertados en múltiples
lugares dentro del genoma del virus.
La secuencia transcrita del/los gen/genes
heterólogo/heterólogos está unida preferiblemente de manera
operativa a una secuencia control que permita la expresión del/los
gen/genes heterólogo/heterólogos en células de mamífero,
preferiblemente en una célula tumoral o en una célula del sistema
nervioso. El término "unido de manera operativa" se refiere a
un yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una
relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una
secuencia control "unida de manera operativa" a una secuencia
codificada está ligada de tal manera que se consigue la expresión
de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con la
secuencia control.
La secuencia control contiene un promotor que
permite la expresión del/los gen/genes heterólogo/heterólogos y
una señal para la finalización de la transcripción. El promotor es
seleccionado de entre promotores que son funcionales en células de
mamífero, preferiblemente humanas, del sistema nervioso o en
tumores o en células el sistema inmune. El/los promotor/promotores
puede/pueden derivar de secuencias promotoras de genes
eucarióticos. Por ejemplo, los promotores pueden derivar del genoma
de una célula en la que tiene lugar la expresión del gen
heterólogo, preferiblemente una célula de mamífero, preferiblemente
una célula humana. Con respecto a los promotores eucarióticos,
pueden ser promotores que funcionen de una forma ubicua (tales como
los promotores de la \beta-actina, tubulina) o,
alternativamente, de manera específica de un tejido, tal como el
promotor de la enolasa específica de neuronas (NSE). Pueden ser
también promotores que respondan a estímulos específicos, por
ejemplo promotores que se unan a receptores de hormonas esteroideas.
Pueden utilizarse también promotores víricos, por ejemplo el
promotor de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la
leucemia murina de Moloney (MMLV) u otros promotores de retrovirus,
el promotor de IE de citomegalovirus (CMV) humano o de ratón, o
promotores de genes de virus herpes incluyendo los que dirigen la
expresión de los transcritos asociados a la latencia.
Pueden construirse casetes de expresión y otras
construcciones adecuadas que contengan el/los gen/genes
heterólogo/heterólogos y secuencias control utilizando técnicas de
clonaje rutinarias conocidas por las personas expertas en el
oficio (ver, por ejemplo Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning -
A laboratory manual: Cold Spring Harbor Press).
Puede ser también ventajoso que los promotores
sean inducibles, de tal manera que los niveles de expresión del
gen heterólogo puedan ser regulados durante el tiempo de vida de la
célula. Inducible significa que los niveles de expresión obtenidos
utilizando el promotor pueden ser regulados. Por ejemplo, en una
realización preferida en la que más de un gen heterólogo es
insertado en el genoma del VHS, un promotor comprendería un
promotor sensible a la proteína de fusión represor de tet/activador
transcripcional de VP16 previamente descrita (Gossen y Bujard,
1992, Gossen y col., 1995), y que dirigiera el gen heterólogo cuya
expresión va a ser regulada. El segundo promotor comprendería un
promotor potente (por ejemplo el promotor de IE de CMV) que
dirigiera la expresión de la proteína de fusión represor de
tet/VP16. Por tanto, en este ejemplo, la expresión del primer gen
heterólogo dependería de la presencia o ausencia de
tetraciclina.
Los genes heterólogos codificarán típicamente
polipéptidos de uso terapéutico. En las aplicaciones oncolíticas,
los genes heterólogos pueden codificar proteínas que sean
citotóxicas por sí mismas, pueden codificar enzimas que activen
profármacos o que sean capaces de estimular o incrementar una
respuesta inmune antitumoral.
Los genes heterólogos pueden incluir también
genes marcadores (por ejemplo, que codifiquen
\beta-galactosidasa o la proteína fluorescente
verde u otras proteínas fluorescentes) o genes cuyos productos
regulen la expresión de otros genes (por ejemplo, factores
reguladores de la transcripción, incluyendo la proteína de fusión
represor de tet/activador transcripcional de vmw65, anteriormente
descrita).
Las aplicaciones terapéuticas pueden requerir la
administración de múltiples genes. La expresión de múltiples genes
puede ser ventajosa para el tratamiento de una variedad de
condiciones. Los virus del herpes son excepcionalmente apropiados
ya que no tienen las capacidades de empaquetamiento limitadas de
otros sistemas de vectores víricos. Por tanto, múltiples genes
heterólogos pueden ser acomodados en su genoma. Por ejemplo,
pueden insertarse en el genoma de 2 a 5 genes.
Existen, por ejemplo, al menos dos formas
mediante las cuales puede conseguirse esto. Por ejemplo, más de un
gen heterólogo y las secuencias control asociadas podrían ser
introducidos en una cepa de VHS particular en un único sitio o en
múltiples sitios del genoma del virus. Sería también posible
utilizar pares de promotores (los mismos promotores o diferentes)
colocados en orientaciones opuestas uno de otro, dirigiendo cada
uno de estos promotores la expresión de un gen heterólogo (el mismo
gen heterólogo o un gen heterólogo diferente) según se describió
anterior-
mente.
mente.
Los virus de la invención pueden ser utilizados
en métodos de terapia. En particular, los virus oncolíticos de la
invención pueden ser utilizados en aplicaciones que incluyen el
tratamiento oncolítico del cáncer, por ejemplo mediante inyección
directa intratumoral. Cuando el virus contiene un gen heterólogo
que codifica un activador de un profármaco, puede llevarse a cabo
una terapia adicional con el profármaco. Adicionalmente, el
tratamiento puede ser combinado con la estimulación de una respuesta
inmune mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los virus
de la invención pueden ser utilizados en el tratamiento terapéutico
de cualquier tumor sólido en un mamífero, preferiblemente en un
humano. Por ejemplo, los virus de la invención pueden ser
administrados a un sujeto con carcinoma de próstata, mama, pulmón,
hígado, endometrio, vejiga, colon o cervical; con adenocarcinoma;
con melanoma; con linfoma; con glioma o sarcomas tales como
sarcomas de tejido blando y sarcomas óseos.
Los virus de la invención pueden por tanto ser
utilizados en un paciente, preferiblemente un paciente humano, con
necesidad de tratamiento. Los virus de la invención pueden ser
utilizados para el tratamiento oncolítico del cáncer. El objetivo
del tratamiento terapéutico es mejorar la condición del paciente.
Típicamente, el tratamiento terapéutico utilizando un virus de la
invención aliviará los síntomas de la enfermedad o condición del
paciente que esté siendo tratado. Un método de tratamiento de
acuerdo con la invención comprende por tanto la administración de
una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus de la invención a
un paciente que padezca cáncer.
La administración de un virus oncolítico de la
invención a un paciente que padezca un tumor, destruirá
típicamente las células del tumor, disminuyendo así el tamaño del
tumor y/o impidiendo la propagación de las células malignas del
tumor.
Un método de administración de la terapia implica
la combinación del virus con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los vehículos o diluyentes adecuados incluyen
soluciones salinas isotónicas, por ejemplo solución salina tamponada
con fosfato.
El tratamiento oncolítico y/o la administración
de genes a células con fines terapéuticos pueden por tanto ser
llevados a cabo después de la inyección directa de la composición
con el vector en el tejido diana. La cantidad de virus administrada
en el caso de VHS está en el rango de 10^{4} a 10^{10} ufp,
preferiblemente de 10^{5} a 10^{8} ufp, más preferiblemente de
10^{6} a 10^{8} ufp aproximadamente. Cuando es inyectado para
tratamiento oncolítico, se utilizarán para la inyección típicamente
hasta 500 \mul, típicamente de 1-200 \mul,
preferiblemente de 1-10 \mul de una composición
farmacéutica que conste esencialmente del virus y un vehículo o
diluyente adecuado farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, para
algunas aplicaciones de terapia oncolítica pueden utilizarse
también volúmenes mayores de hasta 10 ml, dependiendo del tumor y
del lugar de inoculación.
Las vías de administración y las dosis descritas
están destinadas a ser únicamente una guía, ya que un técnico
experto será capaz de determinar fácilmente la vía de
administración y la dosis óptimas. La dosis puede ser determinada
de acuerdo con varios parámetros, especialmente de acuerdo con la
edad, el peso y la condición del paciente que va a ser tratado, la
gravedad de la enfermedad o condición y la vía de
administración.
La vía de administración preferida para un
paciente que padezca de cáncer es mediante inyección directa en el
tumor. El virus puede ser también administrado sistémicamente o
mediante inyección en un vaso sanguíneo que irrigue al tumor. La
vía óptima de administración dependerá de la localización y el
tamaño del tumor. La dosis puede ser determinada de acuerdo con
varios parámetros, especialmente de acuerdo con la localización
del tumor, el tamaño del tumor, la edad, el peso y la condición del
paciente que va a ser tratado y la vía de administración.
Se proporcionan también métodos para identificar
cepas clínicas adecuadas para ser modificadas de acuerdo con la
invención. Además, se proporcionan métodos de validación de la
diana. Éstos están relacionados con la identificación de genes
adecuados para ser utilizados en las aplicaciones terapéuticas de
la invención según se describió anteriormente.
Se proporcionan también métodos para la
producción de los virus de la invención.
Se ha demostrado previamente que el virus del
herpes simple de tipo 1 (VHS1) en el que está inactivado el factor
de neurovirulencia ICP34.5, dirige la lisis de células específicas
tumorales en modelos de tumores in vitro e in vivo.
Se ha demostrado también que tales virus son seguros en ensayos
clínicos de Fase I mediante inyección intracerebral directa en
pacientes con glioma en etapas tardías.
El trabajo previo ha utilizado aislados de
laboratorio del VHS1 pasados de manera seriada (virus derivados de
VHS1 cepa 17+ o de VHS1 cepa F) que podría esperarse que estuvieran
atenuados en su capacidad lítica en células tumorales humanas en
comparación con aislados clínicos más recientes.
En un trabajo dirigido a la producción de VHS con
ICP34.5 eliminado con potencial oncolítico y antitumoral
incrementado, hemos eliminado ICP34.5 de un aislado clínico de VHS1
y hemos comparado el potencial replicativo y lítico en varios tipos
de células tumorales humanas en comparación con VHS1 cepa 17+ (una
cepa de laboratorio estándar).
Los virus utilizados estaban basados en VHS1 cepa
17+ (una cepa de laboratorio estándar) o en dos aislados clínicos
derivados de úlceras frías procedentes de individuos con
reactivaciones frecuentes de VHS1. Estas cepas fueron denominadas
BL1 y JS1. ICP34.5 fue eliminado completamente de la cepa 17+ y de
JS1 junto con la inserción de un casete de CMV-GFP.
El JS1 fue también además manipulado mediante la inserción de
GM-CSF humano o de ratón con el fin de sustituir el
gen de ICP34.5. BL1 y JS1 son por tanto aislados clínicos o cepas
"no de laboratorio". Los derivados de JS1 discutidos en la
presente son también cepas "no de laboratorio", esto es cepas
"no de laboratorio" modificadas de la invención.
JS1 y BL1 mostraron un crecimiento incrementado
en algunas células tumorales humanas analizadas, en comparación
con la cepa 17+ de VHS1 en la que se había eliminado ICP34.5,
cuando se analizaron a lo largo de un periodo de 72 horas (Fig. 2).
JS1 fue seleccionado para un estudio posterior y se realizaron en
el mismo las modificaciones anteriormente descritas (ver la Fig. 1
y anteriormente).
Las capacidades líticas (destrucción celular)
estaban incrementadas con el virus derivado de las cepas no de
laboratorio derivadas de JS1 en todas las líneas celulares tumorales
analizadas. Más particularmente, con referencia a la Figura 3, el
virus JS1/34.5-, esto es JS1 en el que se había eliminado ICP34.5
por deleción, mostraba capacidades líticas incrementadas en células
de adenocarcinoma colorrectal HT29, en células de adenocarcinoma
de próstata LNCaP.FGC, en células de adenocarcinoma de mama
MDA-MB-231, en células de melanoma
maligno SK-MEL-28 y en células de
astrocitoma glioblastoma U-87 MG.
Las capacidades líticas fueron también
determinadas en células SK-MEL-28,
MDA-MB-231 y HT29 mediante el
ensayo de exclusión de Azul Trypan de las células infectadas a
varias dosis y tiempos después de la infección con BL1, JS1 en
comparación con la cepa 17+. El Azul Trypan es excluido de las
células vivas y por tanto puede determinarse el número de células
vivas que permanecen en un cultivo mediante este medio. Líneas
celulares tumorales cultivadas en pocillos duplicados de placas de
seis pocillos fueron infectadas durante 24, 48 ó 72 horas a una
MOI de 0,1 ó 1 con 17+, BL1 o JS1 y se contó el número de células
vivas. El porcentaje del número de células vivas en los pocillos
control no infectados equivalentes está mostrado en la Tabla 1.
Por tanto, como en todos los casos son destruidas
más células tumorales con los virus aislados clínicos BL1 y JS1
que con el aislado de laboratorio 17+, para proporcionar una
actividad oncolítica incrementada, es probable que la utilización
de cepas de virus clínicas recientes aumente las capacidades
antitumorales de tales virus modificados para proporcionar una
replicación selectiva en el tumor (por ejemplo mediante la
deleción de ICP34.5) cuando son utilizados en pacientes humanos para
el tratamiento del cáncer.
| Línea celular | Tiempo después | JS1 | 17 | BL1 | |||
| de la infección | MOI=0,1 | MOI=1 | MOI=0,1 | MOI=1 | MOI=0,1 | MOI=1 | |
| porcentaje del número de células vivas en los pocillos control | |||||||
| no infectados | |||||||
| SK-MEL-28 | 24 horas | 41 | 8 | 57,3 | 19 | 43,7 | 6,67 |
| muestras duplicadas | 33,7 | 7 | 62,6 | 19,3 | 39 | 6,33 | |
| 48 horas | 5,51 | 1,9 | 7,4 | 3,7 | 4,5 | 0,8 | |
| 5,05 | 0,8 | 7,1 | 2,6 | 4,8 | 1,1 | ||
| 72 horas | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| MDA-MB-231 | 24 horas | 44,91 | 16,7 | 69,37 | 36,34 | 55,63 | 26,79 |
| 44,02 | 16,96 | 65,8 | 34,55 | 60,45 | 25,27 | ||
| 48 horas | 14,1 | 4,7 | 27,9 | 8,3 | 18 | 6,7 | |
| 13,5 | 3,8 | 27 | 8,5 | 20 | 8,3 | ||
| 72 horas | 0 | 0 | 2,91 | 0,73 | 1,46 | 0 | |
| 0 | 0 | 2,91 | 1,27 | 1,64 | 0 | ||
| HT-29 | 24 horas | 37,53 | 15 | 47,28 | 23,61 | 42,22 | 22,15 |
| 39,24 | 15 | 45,76 | 24,24 | 43,04 | 21,33 | ||
| 48 horas | 13,2 | 2,3 | 29,4 | 4,2 | 18,4 | 4,4 | |
| 14 | 3 | 27,7 | 4,7 | 21,2 | 3,7 | ||
| 72 horas | 0 | 0 | 1,57 | 0 | 1,64 | 0 | |
| 0 | 0 | 1,89 | 0 | 1,57 | 0 |
Puede esperarse también una actividad
incrementada adicional si estos virus son utilizados posteriormente
para administrar genes con actividad antitumoral. Tales genes
incluyen los que codifican activadores de profármacos o proteínas
inmunoestimulantes.
Para este fin, nosotros hemos producido a partir
de JS1 un aislado clínico del VHS1 en el que se ha eliminado
ICP34.5, que expresa GM-CSF humano o de ratón. El
GM-CSF es un potente inmunoestimulante. Este virus
está diseñado para incrementar las respuestas inmunes antitumorales
después de una inyección intratumoral.
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La cepa JS1 del VHS1 ha sido depositada en la
European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury,
Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, el 2 de Enero de 2001 bajo el número
de acceso V01010209.
Claims (13)
1. La cepa JS1 del VHS1 según está depositada en
la European Collection of Cell Cultures (ECACC) bajo el número de
acceso V01010209, o una cepa de VHS1 derivada de la misma.
2. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 1 que está modificada de tal manera que carece de
uno o más de un gen que codifica ICP34.5 funcional, un gen que
codifica ICP6 funcional, un gen que codifica glicoproteína H
funcional y un gen que codifica timidina quinasa funcional.
3. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 2, que carece de un gen que codifica ICP34.5
funcional.
4. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 3, que carece además de un gen de ICP47
funcional.
5. Una cepa del VHS de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que contiene además un gen
heterólogo.
6. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que dicho gen heterólogo es un gen capaz
de modificar las respuestas inmunes.
7. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 6, en la que el gen capaz de modificar las
respuestas inmunes codifica un polipéptido inmunoestimulante u otro
producto génico capaz de modificar las respuestas inmunes, un
activador de un profármaco, un supresor de tumores o un producto
génico proapoptótico.
8. Una cepa del VHS de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que el polipéptido inmunoestimulante es el
factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GMCSF), otra citoquina o
quimioquina, RANTES, B7.1 o B7.2 o IL12, donde el activador del
profármaco es nitrorreductasa o citocromo P450, o donde el supresor
de tumores es p53.
9. Una cepa del VHS1 de acuerdo con la
reivindicación 8 que está modificada de tal manera que carece de
un gen de ICP34.5 funcional y, opcionalmente, de un gen de ICP47
funcional; y contiene además opcionalmente un gen heterólogo que
codifica GMCSF.
10. Una composición farmacéutica que contiene un
virus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
precedentes y un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
11. Una cepa del VHS de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9 para ser utilizada en el tratamiento
del organismo humano o animal.
12. Utilización de una cepa del VHS de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la producción de
un medicamento para el tratamiento oncolítico del cáncer.
13. Un método para determinar si un gen
incrementa los efectos antitumorales de una cepa del VHS, que
comprende:
- (i)
- la provisión de un VHS de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
- (ii)
- la inserción de dicho gen en dicha cepa del VHS y
- (iii)
- la determinación de la capacidad de dicha cepa del VHS oncolítica, modificada, para replicarse en, o destruir, células tumorales en comparación con la capacidad de la cepa precursora proporcionada en la etapa (i).
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