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ES2939644T3 - Vectores de HSV de alta transducción - Google Patents

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ES2939644T3
ES2939644T3 ES17771265T ES17771265T ES2939644T3 ES 2939644 T3 ES2939644 T3 ES 2939644T3 ES 17771265 T ES17771265 T ES 17771265T ES 17771265 T ES17771265 T ES 17771265T ES 2939644 T3 ES2939644 T3 ES 2939644T3
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hsv
icp4
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mckrae
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ES17771265T
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David M Krisky
James B Wechuck
James R Goss
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Periphagen Inc
Original Assignee
Periphagen Inc
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Abstract

En el presente documento se describen vectores del virus del herpes simplex (VHS) defectuosos en la replicación de alta transducción de la cepa McKrae. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores de HSV de alta transducción
ANTECEDENTES
El aporte sistémico de ciertos agentes terapéuticos puede ser problemático para agentes con farmacocinética pobre y/o un riesgo de efectos adversos fuera de los elegidos. La inyección local en sitios elegidos particulares puede requerir técnicas muy invasivas o ser inviable. El aporte de agentes mediante vectores virales permite la capacidad de dirigirse específicamente a poblaciones de células para proporcionar producción y/o aporte locales de agentes.
El documento WO 98/15637 A1 describe cepas de virus del herpes simple, líneas celulares, métodos para su producción y métodos para su uso.
El documento US 5.879.934 A describe cepas de virus del herpes simple para transferencia génica.
Chattopadhyay y cols., Brain, 127(4):929-939 (2004) describe el efecto protector de la transferencia génica de neurotrofina mediada por el virus del herpes simple en la neuropatía por cisplatino.
DeLuca y cols., J Virol., 56(2):558-570 (1985) describe el aislamiento y la caracterización de mutantes de eliminación del virus del herpes simple tipo 1 en el gen que codifica la proteína reguladora inmediata temprana ICP4.
Shepard y DeLuca, J Virol., 65(1):299-307 (1991) describe las actividades de heterodímeros compuestos por subunidades de unión a ADN y con transactivación deficiente de la proteína reguladora del virus del herpes simple ICP4.
Burton y cols., Stem Cells, 19:358-377 (2001) describe múltiples aplicaciones para vectores del virus del herpes simple con replicación defectuosa.
Watson y cols., Virology, 433:528-537 (2012) describe un análisis de secuencia y comparativo del genoma de la cepa McKrae del HSV-1.
Wang y cols., Virus Res., 173:436-440 (2013) describe la neuroinvasividad de la cepa McKrae del HSV-1 en comparación con KOS de HSV-1 después de la inoculación corneal o vaginal en ratones.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona composiciones y métodos para el aporte con vectores virales de agentes a células diana, según se indica en las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante cuyo genoma contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una cepa McKrae del virus del herpes simple variante que tiene un genoma truncado de un tamaño total menor de alrededor de 150.000 pares de bases y que incluye una eliminación de uno o más residuos dentro de un elemento correspondiente a los residuos 126049 a 130014 de SEQ ID NO: 1, según se indica en la reivindicación 2.
En algunas realizaciones, la invención proporciona vectores que comprenden un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor específico de neuronas. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor peptídico relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP).
En algunas realizaciones, el vector comprende un potenciador de citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, el vector comprende una señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (BGH). En algunas realizaciones, los vectores comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona células transducidas con un vector viral de la cepa McKrae del HSV como las descritas en las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vector viral de la cepa McKrae del HSV según se describe en las reivindicaciones adjuntas y un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para propagar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, comprendiendo el método las etapas de: (i) infectar con el vector células que complementan ICP4 cultivadas que contienen ADN que codifica proteína ICP4 del HSV, y (ii) aislar el sobrenadante del cultivo de la etapa (i).
En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de purificación del vector en el sobrenadante mediante cromatografía. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de concentración del vector purificado. En algunas realizaciones, el vector purificado se concentra mediante filtración con flujo tangencial.
En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para preparar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y donde el vector expresa un elemento marcador, comprendiendo el método incubar células transfectadas con:
(a) una primera molécula de ácido nucleico:
(i) que comprende una porción del genoma de la cepa McKrae del HSV pero no codifica una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
(ii) que comprende una primera región de homología (HR1) y una segunda región de homología (HR2), y
(b) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de codifica un elemento marcador, donde la secuencia está flanqueada por una primera región de homología (HR1') y una segunda región de homología (HR2'), donde HR1 es homóloga a HR1' y HR2 es homóloga a HR2', de modo que la secuencia que codifica el elemento marcador en la segunda molécula de ácido nucleico se integre en la primera molécula de ácido nucleico a través de recombinación homóloga.
En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4. En algunas realizaciones, las células complementan ICP4 y al menos otro gen viral. En algunas realizaciones, las células complementan ICP4 y al menos un gen inmediato temprano. En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4, ICP27 y UL55. En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4, ICP22 e ICP47.
En algunas realizaciones, el elemento marcador es un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido es detectable mediante fluorescencia. En algunas realizaciones, el elemento marcador es un péptido fluorescente verde. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de purificación de placas virales que expresan el elemento marcador.
En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para preparar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y donde el vector expresa un agente de interés, comprendiendo el método incubar células transfectadas con:
a) una primera molécula de ácido nucleico:
(i) que comprende una porción del genoma de la cepa McKrae del HSV pero no codifica una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
(ii) que comprende una secuencia que codifica un elemento marcador, donde la secuencia que codifica el elemento marcador está flanqueada por una primera región de homología (HR1) y una segunda región de homología (HR2); y
(b) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un agente de interés, donde la secuencia que codifica el agente de interés está flanqueada por una primera región de homología (HR1') y una segunda región de homología (HR2'), donde HR1 es homóloga a HR1' y HR2 es homóloga a HR2', de modo que la secuencia que codifica el agente de interés se integre en la primera molécula de ácido nucleico a través de recombinación homóloga.
En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4. En algunas realizaciones, las células complementan ICP4 y al menos otro gen viral. En algunas realizaciones, las células complementan ICP4 y al menos un gen inmediato temprano. En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4, ICP27 y UL55. En algunas realizaciones, las células son células que complementan ICP4, ICP22 e ICP47.
En algunas realizaciones, el método comprende una etapa de purificación de placas virales que no expresan el elemento marcador.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores de la cepa McKrae del HSV según la reivindicación 5(c) para el uso en métodos para expresar un polipéptido en un ganglio de la raíz posterior (DRG) de un sujeto, que comprende administrar al sujeto el vector de la cepa McKrae del HSV según se describe en la reivindicación 5(c). En algunas realizaciones, el vector se administra in vivo. En algunas realizaciones, el vector se administra mediante contacto con la piel. En algunas realizaciones, el vector se administra mediante inyección intradérmica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos tienen solo fines ilustrativos, no limitativos.
La Figura 1 representa una gráfica ejemplar que muestra el número de genomas de HSV por ganglios de la raíz posterior (DRG) L4-L6 detectado en un ensayo de qPCR como resultado de diferentes dosis de vector viral con replicación defectuosa inyectado en la almohadilla.
La Figura 2 representa una gráfica ejemplar que muestra el número total de transcritos de carga útil en los DRG L4-L6 a los 5, 14, 47, 77 y 131 días después de la administración con vectores virales de HSV que tienen un promotor HCMV.
La Figura 3 representa una gráfica ejemplar que muestra el número de transcritos de carga útil por genoma en los DRG L4-L6 a los 5, 14, 47, 77 y 131 días después de la administración con vectores virales de HSV que tienen un promotor HCMV.
La Figura 4 representa una gráfica ejemplar que muestra el número de transcritos de GFP por genoma y el número de genomas de HSV-1 por DRG L4-L6 como resultado de administrar vectores virales con diferentes promotores.
La Figura 5 representa una gráfica ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP y los transcritos totales por genoma en los DRG L4-L6 a lo largo de 18 días después de la administración de vectores virales de HSV con promotores específicos para un tejido.
La Figura 6 representa una gráfica ejemplar que muestra el número de transcritos de GFP totales en los DRG L4-L6 a lo largo de 8 semanas después de la administración de vectores virales de HSV con promotores específicos para un tejido.
La Figura 7 representa una gráfica ejemplar que muestra el número total de transcritos de GFP en los DRG L4-L6 a lo largo de 8 semanas después de la administración de vectores virales de HSV con promotores específicos para un tejido.
La Figura 8 representa una gráfica ejemplar que muestra el número total de transcritos de carga útil por genoma en los DRG L4-L6 después de la administración con vectores virales de HSV que tienen un promotor de citomegalovirus humano (HCMV) en comparación con vectores virales de HSV que tienen un promotor de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) quimérico con un potenciador de HCMV.
La Figura 9 representa una secuencia de nucleótidos de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 1) que se identifica como el número de registro JQ730035.1
La Figura 10 representa una secuencia de aminoácidos de ICP4 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 2).
La Figura 11 representa una secuencia de aminoácidos de ICP22 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 3).
La Figura 12 representa una secuencia de aminoácidos de ICP47 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 4).
La Figura 13 representa una secuencia de nucleótidos de ICP4 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 5).
La Figura 14 representa una secuencia de nucleótidos de ICP22 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 6).
La Figura 15 representa una secuencia de nucleótidos ICP47 de la cepa McKrae de HSV ejemplar (SEQ ID NO: 7).
La Figura 16 representa una secuencia de nucleótidos potenciadora de citomegalovirus humano ejemplar (SEQ ID NO: 8).
La Figura 17 representa una secuencia de nucleótidos del péptido relacionado con el gen de la calcitonina ejemplar (SEQ ID NO: 9).
La Figura 18 representa una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina ejemplar (SEQ ID NO: 10).
DEFINICIONES
En esta solicitud, a menos que se aclare de otra forma a partir del contexto, (i) se puede entender que el término "un(a)" significa "al menos uno(a)"; (ii) se puede entender que el término "o" significa "y/o"; (iii) se puede entender que los términos "que comprende" y "que incluye" abarcan componentes o etapas detallados ya se presenten por sí mismos o junto con uno o más componentes o etapas adicionales; y se entiende que (iv) los términos "alrededor de" y "aproximadamente" permiten una variación estándar como se entenderá por los expertos normales en la técnica; y (v) cuando se proporcionen intervalos, se incluyen los puntos finales.
Administración: Según se usa en este documento, el término "administración" se refiere a la administración de una composición a un sujeto o sistema. La administración a un sujeto animal (p. ej., a un ser humano) puede ser mediante cualquier vía apropiada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración puede ser bronquial (incluyendo mediante instilación bronquial), bucal, enteral, interdérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, dentro de un órgano específico (p. ej. intrahepática), mucosa, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo mediante instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y vítrea. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación intermitente. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación continua (p. ej., perfusión) durante al menos un período seleccionado.
Agente: Según se usa en este documento, el término "agente" se refiere a un compuesto o entidad de cualquier clase química incluyendo, por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, moléculas pequeñas, o sus combinaciones. En algunas realizaciones, un agente es o comprende un producto natural que se encuentra en y/o se obtiene de la naturaleza. En algunas realizaciones, un agente es o comprende una o más entidades que están fabricadas por el hombre o que se diseñan, se tratan por ingeniería y/o se producen a través de la acción de la mano del hombre y/o no se encuentran en la naturaleza. Algunas realizaciones particulares de agentes que se pueden utilizar según la presente invención incluyen moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, ácidos nucleicos (p. ej., ARNsi, ARNsh, híbridos de ADN/ARN, oligonucleótidos antisentido, ribocimas), péptidos, miméticos peptídicos, etc.
Mejora: Según se usa en este documento, el término "mejora" se refiere a la prevención, reducción o paliación de un estado, o el perfeccionamiento del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere, la recuperación completa 0 la prevención completa de una enfermedad, un trastorno o una afección.
Animal: Según se usa en este documento, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a seres humanos, de cualquier sexo y en cualquier estadio de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier estadio de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal tratado por ingeniería genética y/o un clon.
Aproximadamente: Según se usa en este documento, el término "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique otra cosa o a menos que sea evidente a partir del contexto (excepto cuando este número supere 100% de un posible valor).
Secuencia característica: Según se usa en este documento, el término "secuencia característica" se refiere a una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos, y por lo tanto puede ser usada por los expertos normales en la técnica para definir a los miembros de la familia.
Terapia combinada: Según se usa en este documento, el término "terapia combinada" se refiere a las situaciones en las que un sujeto se expone simultáneamente a dos o más regímenes terapéuticos (p. ej., dos o más agentes terapéuticos). En algunas realizaciones, dos o más agentes se pueden administrar simultáneamente; en algunas realizaciones, estos agentes se pueden administrar secuencialmente; en algunas realizaciones, estos agentes se administran en regímenes de dosificación solapados.
Composición: Según se usa en este documento, el término "composición" o una "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de dos o más agentes como los descritos en este documento para la coadministración o administración como parte del mismo régimen. No se requiere en todas las realizaciones que la combinación de agentes dé como resultado una mezcla física, esto es, es posible la administración como coagentes separados de cada uno de los componentes de la composición; sin embargo, muchos pacientes o profesionales de este ámbito pueden encontrar ventajoso preparar una composición que sea una mezcla de dos o más de los ingredientes en un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, haciendo posible administrar al mismo tiempo los ingredientes que componen la combinación.
Tratado por ingeniería: Según se usa en este documento, el término "tratado por ingeniería" se refiere al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, un polinucleótido se considera que está " tratado por ingeniería " cuando dos o más secuencias, que no están conectadas entre sí en ese orden en la naturaleza, son manipuladas por la mano del hombre para que estén conectadas directamente entre sí en el polinucleótido tratado por ingeniería. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente divulgación, un polinucleótido tratado por ingeniería comprende que una secuencia reguladora que se encuentra en la naturaleza en asociación operativa con una primera secuencia codificante pero no en asociación operativa con una segunda secuencia codificante se conecte por la mano del hombre de modo que se asocie operativamente con la segunda secuencia codificante. Comparablemente, se considera que una célula o un organismo está "tratado por ingeniería" si se ha manipulado de modo que su información genética se altere (p. ej., se ha introducido nuevo material genético no presente previamente, por ejemplo por transformación, cruce, hibridación somática, transfección, transducción u otro mecanismo, o material genético previamente presente se altera o retira, por ejemplo mediante mutación por sustitución o eliminación, o mediante protocolos de cruce). Como es práctica común y se entiende por los expertos en la técnica, la descendencia de un polinucleótido o célula tratados por ingeniería todavía se denomina "tratada por ingeniería" aunque la manipulación real se realice sobre una entidad anterior.
Expresión: Según se usa en este documento, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes casos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p. ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (p. ej., mediante corte y empalme, edición, formación de protección en 5' y/o formación del extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o una proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o una proteína.
Homología: Según se usa en este documento, el término "homología" se refiere a la relación global entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas poliméricas son "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas poliméricas son "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.
Aislada: Según se usa en este documento, el término "aislada" se refiere a una sustancia y/o entidad que se ha (1) separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se producía inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar de alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, alrededor de 99% o más de alrededor de 99% de los otros componentes con los que estaban asociadas inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, alrededor de 99% o más de alrededor de 99% puros. Según se usa en este documento, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas realizaciones, como se entenderá por los expertos en la técnica, una sustancia todavía se puede considerar "aislada" o incluso "pura", después de haberse combinado con ciertos otros componentes tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (p. ej., tampón, disolvente, agua, etc.); en estas realizaciones, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir estos portadores o excipientes. Por dar solo un ejemplo, en algunas realizaciones, se considera que un polímero biológico tal como un polipéptido o polinucleótido que se presenta en la naturaleza está "aislado" cuando,
a) en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con algunos o la totalidad de los componentes que lo acompañan en su estado natural en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie que la especie que los produce en la naturaleza; c) es expresado por o está de otro modo en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que los produce en la naturaleza. Así, a modo de ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera que es un polipéptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunas realizaciones, se puede considerar que un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación es un polipéptido "aislado" hasta el punto que se ha separado de otros componentes a) con los que está asociado en la naturaleza; y/o
b) con el que estaba asociado cuando se producía inicialmente.
Elemento marcador: Según se usa en este documento, el término "elemento marcador" se refiere a un agente detectable o seleccionable. En algunas realizaciones, un "elemento marcador" es una secuencia de ácido nucleico detectable o seleccionable. En algunas realizaciones, un "elemento marcador" es un producto de expresión (p. ej., ARN o proteína) cuya presencia o ausencia es detectable y/o seleccionable en células. En algunas realizaciones, un producto de expresión es o comprende una enzima. En algunas realizaciones, un producto de expresión es un fluoróforo.
Ácido nucleico: Según se usa en este documento, el término "ácido nucleico" se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que esté incorporado o se pueda incorporar en una cadena oligonucleotídica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o una sustancia que está incorporado o se puede incorporar en una cadena oligonucleotídica a través de un enlace fosfodiéster. Como estará claro a partir del contexto, en algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (p. ej., nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es o comprende ARN; en algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más residuos de ácido nucleico naturales. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más análogos de ácido nucleico. En algunas realizaciones, un análogo de ácido nucleico difiere de un ácido nucleico en que no utiliza un esqueleto de fosfodiéster. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y tienen uniones peptídicas en lugar de uniones fosfodiéster en el esqueleto, se consideran dentro del alcance de la presente divulgación. Alternativamente o adicionalmente, en algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de uniones fosfodiéster. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas realizaciones, un ácido nucleico es, comprende o consiste en uno o más análogos nucleosídicos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5-propinilcitidina, C-5- propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y sus combinaciones). En algunas realizaciones, un ácido nucleico comprende uno o más azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los de ácidos nucleicos naturales. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica que codifica un producto génico funcional tal como ARN o proteína. En algunas realizaciones, un ácido nucleico incluye uno o más intrones. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se preparan mediante uno o más de aislamiento de una fuente natural, síntesis enzimática mediante polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o un sistema recombinante, y síntesis química. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tienen una longitud de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es monocatenario; en algunas realizaciones, un ácido nucleico es bicatenario. En algunas realizaciones un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas realizaciones, un ácido nucleico tienen actividad enzimática.
Paciente: Según se usa en este documento, el término "paciente" se refiere a cualquier organismo al que se administra o se puede administrar una composición proporcionada, p. ej., con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Pacientes típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humados y/o seres humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, un paciente sufre o es sensible a uno o más trastornos o afecciones. En algunas realizaciones, un paciente presenta uno o más síntomas de un trastorno o afección. En algunas realizaciones, un paciente ha sido diagnosticado con uno o más trastornos o afecciones. En algunas realizaciones, el paciente está recibiendo o ha recibido cierta terapia para diagnosticar y/o para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección.
Composición farmacéutica: Según se usa en este documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más portadores farmacéuticamente activos. En algunas realizaciones, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para la administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de alcanzar un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población pertinente. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden formular especialmente para la administración en forma sólida o líquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, p. ej., los dirigidos a la absorción bucal, sublingual y sistémica, emboladas, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, una pomada o un parche o aerosol de liberación controlada aplicado a la piel, los pulmones o la cavidad oral; intravaginalmente o intrarrectalmente, por ejemplo, como un pesario, una crema o una espuma; sublingualmente; ocularmente; transdérmicamente; o nasalmente, pulmonar, y a otras superficies mucosas.
Farmacéuticamente aceptable: Según se usa en este documento, el término "farmacéuticamente aceptable" aplicado al portador, diluyente o excipiente usado para formular una composición según se divulga en este documento significa que el portador, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no perjudicial para su receptor.
Portador farmacéuticamente aceptable: Según se usa en este documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptables, tales como una carga, un diluyente, un excipiente líquido o sólido o un material encapsulante del disolvente, implicado en el soporte o el transporte del compuesto en cuestión desde un órgano, o una porción del cuerpo, a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semillas de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores, tales como hidróxido magnésico e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de pH tamponado; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles atóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Prevenir o prevención : Según se usan en este documento, los términos "prevenir" o "prevención", cuando se usan en relación con la presencia de una enfermedad, un trastorno y/o una afección, se refiere a reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, el trastorno y/o la afección y/o a retrasar el comienzo de una o más características o síntomas de la enfermedad, el trastorno o la afección. La prevención se puede considerar completa cuando el comienzo de una enfermedad, un trastorno o una afección se ha retardado durante un período predefinido.
Sujeto: Según se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero (p. ej., un ser humano, incluyendo en algunas realizaciones formas humanas prenatales). En algunas realizaciones, un sujeto está sufriendo una enfermedad, un trastorno o una afección pertinente. En algunas realizaciones, un sujeto es sensible a una enfermedad, un trastorno o una afección. En algunas realizaciones, un sujeto presenta uno o más síntomas o características de una enfermedad, un trastorno o una afección. En algunas realizaciones, un sujeto no presenta ningún síntoma o característica de una enfermedad, un trastorno o una afección. En algunas realizaciones, un sujeto es alguien con uno o más rasgos característicos de la sensibilidad a o el riesgo de una enfermedad, un trastorno o una afección. En algunas realizaciones, un sujeto es un paciente. En algunas realizaciones, un sujeto es un individuo al que se administra o se ha administrado diagnóstico y/o terapia.
Tratamiento: Según se usa en este documento, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratando") se refiere a cualquier administración de una sustancia que, parcialmente o completamente, alivie, mejore, atenúe, inhiba, retrase el comienzo de, reduzca la gravedad de y/o reduzca la incidencia de uno o más síntomas, rasgos y/o causas de una enfermedad, un trastorno y/o una afección particular (p. ej., neuropatía). Este tratamiento puede ser de un sujeto que no exhiba signos de la enfermedad, el trastorno y/o la afección pertinente y/o de un sujeto que exhiba solo signos iniciales de la enfermedad, el trastorno y/o la afección. Alternativamente o adicionalmente, este tratamiento puede ser de un sujeto que exhiba uno o más signos establecidos de la enfermedad, el trastorno y/o la afección pertinente. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que haya sido diagnosticado con la enfermedad, el trastorno y/o la afección pertinente. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de sensibilidad que están estadísticamente correlacionados con un incremento del riesgo de desarrollar la enfermedad, el trastorno y/o la afección pertinente.
Vector: Según se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha conectado. Un tipo de vector es un "plásmido', que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar a un genoma viral o una porción del mismo. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano, vectores de mamífero episómicos, vectores del virus de herpes simple (HSV)). Otros vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula anfitriona tras la introducción en la célula anfitriona, y de ese modo se replican junto con el genoma anfitrión. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están conectados operativamente. Estos vectores se denominan en este documento "vectores de expresión".
Se pueden usar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación tisular (p. ej., electroporación, lipofección). Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones de los fabricantes o según se efectúa comúnmente en la técnica o según se describe en este documento. Las técnicas y los procedimientos precedentes se pueden realizar generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, p. ej., Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Diversos aspectos de la invención se describen con detalle en las siguientes secciones. El uso de las secciones no significa una limitación de la invención. Cada sección se puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario o esté claro por el contexto que sea disyuntivo.
La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, composiciones que comprenden vectores de HSV y métodos para el uso y la producción de los mismos. En particular, la presente divulgación se refiere a vectores de la cepa McKrae variantes para el aporte de cargas útiles a células neuronales.
Vectores virales y HSV
Los vectores virales se pueden usar para facilitar la transferencia de ácidos nucleicos a células. Vectores virales conocidos incluyen los derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus variolovacunal y baculovirus. Los vectores derivados de virus del herpes simple (HSV), tales como virus del herpes simple 1 (HSV-1) y virus del herpes simple 2 (HSV-2), son particularmente útiles para el aporte de agentes a tejidos elegidos específicamente. Consideraciones para escoger un vector y un sistema de aporte particulares incluyen, por ejemplo, características de las células diana, longevidad deseada de la expresión, virulencia e invasividad del vector; y tamaño del material genético que se vaya a transferir.
Los vectores de HSV-1 pueden alojar típicamente hasta 25 kb de secuencias de ADN extrañas. HSV-1 tiene un genoma de ADN lineal bicatenario de aproximadamente 152 kb que se pueden mantener episómicamente en el núcleo de las células. El virión de HSV-1 está envuelto y tiene aproximadamente 110 nm de diámetro. La infección viral se inicia en células epiteliales de la piel o las membranas mucosas mediante la unión de las glucoproteínas de envuelta virales a restos de sulfato de heparina sobre la membrana plasmática. HSV es particularmente adecuado para el aporte de genes al sistema nervioso y posee un tropismo natural para neuronas sensitivas. El virus puede establecer un estado latente en el que los genomas virales persisten durante la vida del hospedador como un elemento episómico intranuclear. La persistencia prolongada de genomas latentes en ganglios trigéminos humanos sin el desarrollo de pérdida sensorial o daño histológico a los ganglios ejemplifica la eficacia de los mecanismos de latencia. El virus HSV silvestre se puede reactivar desde la latencia bajo la influencia de una variedad de estreses. Sin embargo, los vectores virales recombinantes que se vuelven defectuosos en la replicación retienen la capacidad de establecer un estado inactivo persistente en neuronas y sin embargo son incapaces de replicarse (o reactivarse) en el sistema nervioso.
Los vectores basados en HSV-1 pueden tener uno o más genes de HSV necesarios para la replicación convertidos en afuncionales (p. ej., por eliminación o alteración). Genes de HSV necesarios para la replicación incluyen, por ejemplo, genes inmediatos tempranos tales como ICP4 e ICP27. Según se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores de HSV con replicación defectuosa con ICP4 eliminado o alterado y opcionalmente uno o más de ICP0, ICP22, ICP27 e ICP47 adicionalmente eliminados o alterados. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores de HSV con un gen ICP4 afuncional. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores de HSV con genes ICP4, ICP22 e ICP47 afuncionales. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un vector de HSV con ICP4 eliminado e ICP22 e ICP47 alterados. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un vector de HSV con ICP4 eliminado y la expresión de ICP22 e ICP47 alterada o eliminada. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un vector de HSV con ICP4 eliminado ICP0, ICP22, ICP27 y/o ICP47 no expresados como genes inmediatos tempranos.
Vectores de HSV-1 que tienen genes de HSV eliminados se pueden producir en líneas celulares que expresan la proteína deficiente en trans. Según se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, los vectores de HSV-1 se producen en una línea celular de mamífero. En algunas realizaciones, los vectores de HSV-1 se producen en una línea celular de mamífero del linaje Vero. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4 y opcionalmente uno o más de ICP0, ICP22, ICP27 e ICP47. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4 y al menos un gen inmediato temprano adicional. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP22 e ICP47. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP22 y UL55. En algunas realizaciones, la línea celular expresa ICP4, ICP27 y UL55. En algunas realizaciones, la línea celular comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una señal de poliadenilación del virus símico 40 (SV40 pA). En algunas realizaciones, se producen vectores virales en células Vero 6-5C. En algunas realizaciones, se producen vectores virales en células Vero D.
Cepa McKrae
Se han aislado al menos 17 cepas de HSV-1, incluyendo, pero no limitadas a, McKrae, cepa 17, cepa F, H129, HF10, MacIntyre, cepa HF, ATCC 2011 y KOS (para una revisión, véase Watson y cols., Virology (2012)). Una cepa McKrae se aisló de un paciente con queratitis por herpes simple y posteriormente se sometió a pases en cultivo tisular. Una secuencia del genoma parcial de McKrae se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 1) (número de registro JQ730035).
Se observan diferencias entre cepas en la replicación periférica y la virulencia de HSV-1 después de la inyección en animales. McKrae sufre reactivación espontánea o inducida a una frecuencia superior que otras cepas conocidas y está entre las cepas de HSV-1 más virulentas. McKrae también es más neuroinvasiva que otras cepas conocidas, tales como cepa 17, KOS, F y H129. En un estudio, KOS o McKrae se inyectó en la córnea y el tracto genital de ratones para comparar la patogénesis (Wang y cols. (2013) Virus Res. 173(2):436-440. Se encontró que cada una se replicaba en un grado similar en el epitelio corneal y los ganglios trigéminos; sin embargo, los títulos de McKrae eran más de 100 veces superiores en el tronco encefálico. Tras la inyección intravaginal, McKrae y KOS se replicaban en un grado similar excepto por un pico transitorio en el título de McKrae a los cuatro días. McKrae, pero no KOS, provocaba una inflamación significativa de los genitales externos junto con pérdida de peso en los animales. KOS no se detectaba en tejido neural y McKrae se detectaba raramente.
Según se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, la divulgación proporciona vectores virales de HSV con alteración o eliminación al menos del gen ICP4 que vuelve al HSV defectuoso en la replicación, pero no reduce la neuroinvasividad de HSV. Así, los vectores de HSV son capaces de atravesar el sistema nervioso periférico para alcanzar neuronas del ganglio de la raíz posterior tras la administración a la piel.
Los genes de HSV influyen en las características y el fenotipo virales. Existen al menos 9 genes y varias secuencias no codificantes únicos para la cepa McKrae. Además de los asociados con la patogénesis y reactivaciones de la latencia, tales como RL1, RS1 y RL2, tres genes UL (UL36, UL49A, UL56) y tres genes US (US7, US10 y US11) son únicos para la cepa McKrae. Además de las variaciones génicas, secuencias no codificantes tales como LAT, secuencia 'a' y miARN contienen variaciones únicas para McKrae.
Uno o más de las siguientes secuencias génicas y no codificantes se pueden considerar características de la cepa McKrae. En McKrae, RL1 (ICP34.5) tiene una repetición P-A-T extendida entre los residuos 159 y 160 que da como resultado 8 iteraciones, mientras que otras cepas contienen solo 3-5 iteraciones. Se cree que la repetición P-A-T influye en la localización celular de la proteína ICP34.5. (Mao & Rosenthal, J. Biol. Chem. 277(13):11423-31 (2012). Se cree que ICP34.5 es un factor de neurovirulencia implicado en la replicación viral y la respuesta contra el anfitrión.
La cepa McKrae también contiene un elemento de repetición extendido de seis iteraciones de la repetición interna en tándem STPSTTT (SEQ ID NO: 11) situada dentro de la secuencia codificante de US07 (gI). Adicionalmente, en McKrae, UL 36 contiene un codón de terminación prematuro introducido debido a una eliminación del nucleótido G en una cadena mononucleotídica que codifica el residuo de aminoácido 2453 (nt 72.535) y UL 56 (180 aa) contiene una inserción de un solo par de bases en el nucleótido 115.992 (aminoácido 97). La cepa McKrae también contiene un ORF extendido en US 10 resultante de una inserción de un solo pb en el nucleótido 143.416 y el marco provoca una pérdida de un codón de terminación en McKrae y una secuencia proteínica C-terminal única. McKrae tiene diferencias de aminoácidos en UL49A en los residuos 28 y 51 en comparación con otras cepas. McKrae tiene histidina y treonina en los residuos 28 y 51, respectivamente, mientras que la cepa 17 tiene arginina y treonina y otras cepas (p. ej., KOS) tienen histidina y alanina. Además, la cepa McKrae contiene repeticiones en tándem reducidas encontradas en la junta UL-RL (49 pb en McKrae en oposición a 181 pb en la cepa 17 y KOS) y aproximadamente 330 nucleótidos que faltan inmediatamente después de la repetición de la junta UL-RL. McKrae también contiene una variación única dentro de la ordenación de la repetición directa 2 (DR2) de la secuencia 'a'. En lugar de una serie de repeticiones en tándem no disociadas, las repeticiones DR2 de McKrae están interrumpidas dos veces por secuencias ricas en guanina idénticas.
Una variación importante dentro del intrón LAT entre cepas se debe a diferencias en un elemento repetido (GCACCCCCACTCCCAC) (SEQ ID NO: 12) que varía en el número de iteraciones empezando en el nucleótido 119.482 en la cepa McKrae, conteniendo McKrae 13 repeticiones mientras que las cepas F, H129 y 17 contienen 9 repeticiones y KOS contiene 15 repeticiones. Además, se encuentra una variación de repeticiones en tándem entre cepas que empieza en McKrae en la base 125.520. Elementos repetidos de McKrae incluyen doce iteraciones de CCCCAGCCCTCCCCAG (SEQ ID NO: 13) y ocho iteraciones de CCCCTCGCCCCCTCCCG (SEQ ID NO: 14). La primera unidad repetida es única de otras cepas ya que contiene una transición G-A, y la cepa McKrae contiene tres iteraciones más que cualquier otra cepa. El segundo elemento repetido de la cepa McKrae está colapsado, faltando 188 nucleótidos con relación a todas las otras cepas, y separado de la repetición aguas arriba por una secuencia conservada al 100% de 105 pb que contiene miR-H5.
McKrae contiene además una secuencia codificante única para ICP4 que no se encuentra en otras cepas conocidas. (Watson y cols., Virology (2012)). ICP4 es un regulador de la transcripción inmediato temprano y se ha relacionado con la reactivación. Mientras que otras cepas contienen una región rica en alanina (AASAPDAADALAAA) (SEQ ID NO: 15) entre los residuos 707 y 720, en McKrae la región rica en alanina se reemplaza por un secuencia rica en serina (GPRRSSSSSGVAA) (s Eq ID NO: 16). El bloque de sustituciones rico en serina presente en McKrae es adyacente a la señalización de localización nuclear (NLS) (aminoácido 728-734). Un cambio en la conformación de esta región puede alterar la NLS y a su vez afectar a la localización no solo de ICP4, sino también de otras proteínas virales (p. ej. ICP0, ICP8) que están afectadas por la localización de ICP4 (Knipe y Smith, 1986). Así, está región puede influir en el fenotipo viral en parte al alterar la localización de proteínas al núcleo.
Vector de McKrae con replicación defectuosa
Esqueleto de McKrae
Los genes virales se expresan en una cascada ordenada estrechamente regulada, que empieza con la producción de los genes inmediatos tempranos (IE). Las proteínas IE resultantes, que incluyen las proteínas ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 y ICP47 de células infectadas, son responsables de regular la expresión de genes virales durante fases posteriores del ciclo de replicación. Los virus variantes con replicación defectuosa son defectuosos con respecto a una o más funciones que son esenciales para la replicación del genoma viral y el ensamblaje de partículas virales. Estos virus se pueden propagar en líneas celulares complementarias que expresan el producto o los productos génicos que faltan; sin embargo, en células normales (es decir, no complementarias), los virus expresan productos génicos virales pero no se replican para formar viriones descendientes.
Se pueden crear virus con replicación defectuosa a través de diversos métodos conocidos en la técnica para modificar genes. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos se vuelven diferentes con relación a la secuencia silvestre. En algunas realizaciones, se eliminan uno o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un codón de terminación prematuro. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un gen que codifica un polipéptido truncado. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos crea un gen que codifica un polipéptido no funcional. En algunas realizaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos vuelve a un gen afuncional por alteración. En algunas realizaciones, un gen se altera por eliminación de su promotor.
Según se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina para volver a un virus defectuoso en la replicación. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente y el gen que codifica ICP0 se elimina totalmente o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente y el gen que codifica IC22 se elimina totalmente o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente y el gen que codifica ICP27 se elimina totalmente o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente y el gen que codifica ICP47 se elimina totalmente o parcialmente. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente, sin alterar la expresión de ningún gen inmediato temprano adicional. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina totalmente o parcialmente, y uno o más de otros genes inmediatos tempranos (IE) se alteran. En algunas realizaciones, el gen que codifica ICP4 se elimina e ICP22 e ICP47 se alteran.
Los promotores IE de HSV-1 contienen una o más copias de una secuencia de consenso reguladora específica de IE TAATGARAT (SEQ ID NO: 19) (donde R es una purina). Estos motivos normalmente están situados dentro de unos pocos cientos de pares de bases de las secuencias promotoras IE proximales, pero junto con sus secuencias de flanqueo son entidades funcionales discretas que pueden conferir regulación específica de IE a otros elementos promotores proximales de diferente clase temporal. En algunas realizaciones, los virus con replicación defectuosa se crean al eliminar nucleótidos en una secuencia reguladora específica de IE. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE contiene una eliminación interna. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE contiene una eliminación terminal. En algunas realizaciones, una secuencia reguladora específica de IE se elimina completamente.
Se representa posteriormente un esquema de un vector viral de la cepa McKrae con replicación defectuosa ejemplar. El esquema muestra eliminaciones completas de ambas copias del gen ICP4 viral y un casete de expresión conducido por el promotor inmediato temprano de citomegalovirus humano (HCMV) insertado dentro de ambas copias de los locus de ICP4 eliminados. El casete de expresión contiene una carga útil de interés para la expresión en células diana.
La extensión de la eliminación de ICP4 da como resultado la retirada de las secuencias promotoras aguas arriba de dos genes virales inmediatos tempranos adicionales: ICP22 e ICP47.
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Carga útil
Los vectores virales según la presente divulgación contienen una molécula de ácido nucleico que comprende la carga útil del vector. En algunas realizaciones, una carga útil comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína. En algunas realizaciones, una carga útil comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína. En algunas realizaciones, una carga útil codifica una molécula de ácido nucleico que es reguladora. En algunas realizaciones, una carga útil codifica un polipéptido de ARN interferente pequeño (ARNsi). En algunas realizaciones, una carga útil codifica un polipéptido de un microARN (miARN).
En algunas realizaciones, la carga útil es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que es exógena al tejido o sujeto diana al que se administra el vector. En algunas realizaciones, la carga útil es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que es endógena al tejido o sujeto diana al que se administra el vector. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico está optimizada codónicamente.
Elementos reguladores
Se contempla en este documento la inclusión de secuencias reguladoras, secuencias de control génico, promotores, secuencias no codificantes, intrones o secuencias codificantes no naturales en un ácido nucleico de la presente divulgación. Se contempla además en este documento la inclusión de etiquetas o secuencias de señalización de ácido nucleico, o ácidos nucleicos que codifican etiquetas proteínicas o secuencias de señalización proteínicas. Típicamente, la región codificante está conectada operativamente con uno o más componentes de ácido nucleico reguladores.
Un promotor incluido en un ácido nucleico de la presente divulgación puede usar un promotor específico para un tejido o tipo de célula, un promotor específico para múltiples tejidos o tipos de célula, un promotor específico para un órgano, un promotor específico para múltiples órganos, un promotor sistémico o ubicuo o un promotor casi sistémico. También se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación promotores que tienen expresión estocástica, expresión inducible, expresión condicional u otra expresión discontinua, inconstante o impredecible. Un promotor de la presente divulgación puede incluir cualquiera de las características anteriores u otras características de los promotores conocidas en la técnica.
Ejemplos de promotores conocidos incluyen, pero no se limitan a, promotor de citomegalovirus (CMV) CMV/promotor de globina beta 3 humana promotor de GFAP, promotor de actina beta de pollo (CBA) el promotor de p-glucuronidasa (GUSB) y promotores de ubiquitina tales como los aislados de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana y ubiquitina C humana.
En algunas realizaciones, un promotor es un promotor específico de neuronas ya que es un promotor que tiene expresión específica en neuronas, expresión preferente en neuronas o que típicamente conduce la expresión de una secuencia codificante asociada en neuronas o un subgrupo de neuronas pero no en uno o más de otros tejidos o tipos de células. Ejemplos de estos promotores incluyen péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP), sinapsina I (SYN), proteína cinasa dependiente de calcio/calmodulina II, tubulina alfa I, enolasa específica de neuronas, proteína asociada a los microtúbulos 1B (MAP1B) y promotores de la cadena beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, así como sus derivados. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) o uno de sus derivados.
Otros elementos reguladores pueden adicionalmente estar conectados operativamente a la carga útil, tal como un potenciador y un sitio de poliadenilación. En algunas realizaciones, un potenciador comprende una secuencia de citomegalovirus humano (HCMV). En algunas realizaciones, un sitio de poliadenilación comprende una señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (BGH).
En algunas realizaciones, un promotor es una quimera de uno o más promotores o elementos reguladores encontrados en la naturaleza. En algunas realizaciones, los vectores virales comprenden una carga útil cuya expresión está conducida por un promotor CGRP con una secuencia potenciadora de HCMV.
Preparación de vectores
La presente divulgación se refiere particularmente a vectores virales de la cepa McKrae que tienen replicación defectuosa. En algunas realizaciones, los vectores virales se generan mediante eliminación o alteración de uno o más genes inmediatos tempranos. Los genes virales se pueden eliminar o alterar usando métodos de tecnología recombinante conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un vector viral de la presente divulgación puede volverse defectuoso a la replicación como resultado de un episodio de recombinación homóloga. En algunas realizaciones, los vectores virales con replicación defectuosa se generan mediante la eliminación de un gen ICP4. En algunas realizaciones, los vectores virales con replicación defectuosa se generan mediante la eliminación de un gen ICP4 y la eliminación de un promotor para uno o más de otros genes inmediatos tempranos (p. ej., ICP22 y/o ICP47).
En algunas realizaciones, los vectores virales de la presente divulgación se generan mediante la eliminación de locus que codifican ICP4 a través de recombinación homóloga. En algunas realizaciones, la generación de un vector viral de la presente divulgación incluye una etapa de recombinación homóloga de un primer plásmido con un segundo plásmido. En algunas realizaciones, el primer plásmido contiene secuencias de ácido nucleico homólogas a regiones de un genoma de HSV que son adyacentes a una región de ácido nucleico de un genoma de HSV que está destinado a ser reemplazado. En algunas realizaciones, el segundo plásmido contiene un genoma de HSV, o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el primer plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de interés entre las secuencias de ácido nucleico homólogas. En algunas realizaciones, el gen de interés puede ser una proteína marcadora que sea detectable mediante fluorescencia, quimioluminiscencia u otra propiedad, lo que se puede usar para seleccionar vectores resultantes de una recombinación homóloga satisfactoria.
En algunas realizaciones, un vector viral de la presente divulgación se genera mediante recombinación homóloga de un primer plásmido que contiene una secuencia de ácido nucleico homóloga a regiones aguas arriba del promotor ICP4 incluyendo el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas de HSV, con un segundo plásmido que contiene un genoma de la cepa McKrae del HSV.
En algunas realizaciones, se elabora un vector al reemplazar en primer lugar ambas copias de los locus ICP4 mediante recombinación homóloga usando el plásmido SASB3 y cribar con respecto a placas que expresan proteína fluorescente verde (GFP). En algunas realizaciones, se construye un plásmido al clonar el fragmento Sph I a Afl III (conectado a Sal I) (1928 pb) del genoma de la cepa KOS de HSV-1 (nucleótidos 124485-126413) en pSP72 digerido con Sph I/Sal I seguido por inserción del fragmento Bgl II a BamH I de 695 pb (nucleótidos 131931 a 132626) que contiene regiones aguas arriba del promotor ICP4 incluyendo el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas en los sitios Bgl II a BamH I del plásmido vectorial. En algunas realizaciones, se construye un plásmido al clonar un fragmento HCMV-eGFP en el sitio BamHI de un plásmido como el descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un plásmido como el descrito anteriormente se recombina a continuación en un locus específico de un virus de McKrae silvestre. En algunas realizaciones, el vector resultante se aísla usando una línea celular estable que expresa uno o más genes eliminados o alterados en el genoma de HSV que se requieren para la replicación.
En algunas realizaciones, se elabora un vector al reemplazar en primer lugar ambas copias de los locus ICP4 mediante recombinación homóloga usando el plásmido SDAXB y cribar con respecto a placas que expresan proteína fluorescente verde (GFP). En algunas realizaciones, se construye un plásmido al clonar el fragmento Sph I a Afl III (1928 pb) del genoma de la cepa KOS de HSV-1 (nucleótidos 124346 a 126273 del registro KT899744 ) en pSP72 digerido con Sph I/Afl III para elaborar SDA seguido por el cambio del sitio Afl III por un sitio BamHI (SDAB). Un fragmento de PCR de ADN de BamHI a Bgl II que contiene regiones aguas arriba del promotor ICP4 incluyendo el origen viral (nucleótidos 144933 a 145534 de registro JQ730035) contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas se clonó en el sitio BamHI de SDAB para elaborar SDAXB. En algunas realizaciones, se construye un plásmido al clonar un fragmento HCMV-eGFP en el sitio BamHI de un plásmido como el descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un plásmido como el descrito anteriormente se recombina a continuación en un locus específico de un virus de McKrae silvestre. En algunas realizaciones, el vector resultante se aísla usando una línea celular estable que expresa uno o más genes eliminados o alterados en el genoma de HSV que se requieren para la replicación.
Caracterización de vectores
Los vectores virales según la presente divulgación se pueden caracterizar por secuenciación genómica a fin de determinar si el vector esperado se creaba satisfactoriamente. Cualquier método de secuenciación conocido en la técnica es aceptable con este fin. Métodos de secuenciación incluyen, por ejemplo, secuenciación en nanoporos, secuenciación de moléculas simples en tiempo real (SMRT), secuenciación con nanobolas de ADN (DNB), pirosecuenciación y uso de micromatrices de ADN.
La expresión de una carga útil desde un vector viral se puede detectar mediante cualquier método conocido en la técnica para detectar proteínas o ácidos nucleicos. Métodos para detectar la expresión proteínica incluyen inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), microscopía inmunoelectrónica, inmunoprecipitación de proteínas individuales (IP), inmunoprecipitación de proteínas complejas (Co-IP), inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), inmunoprecipitación de ARN (RIP), inmunoelectroforesis, espectrofotometría y ensayo con ácido bicinconínico (BCA). Métodos para detectar la expresión de ácidos nucleicos incluyen transferencia Southern, transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa y RT-PCR.
En algunas realizaciones, una preparación de vector viral se puede inyectar en uno o más dermatomas correspondientes a una sección de DRG, por ejemplo, los DRG L4, L5 y L6 izquierdos y derechos. Los DRG se retiran se retiran y el ADN se aísla del DRG y se analiza con respecto a copias del genoma vectorial usando un ensayo qPCR que se dirige a una secuencia dentro de HSV-1. En algunas realizaciones, un ensayo de qPCR se dirige a una secuencia dentro del gen de glucoproteína de HSV-1 (Ul-22).
Aplicaciones/ Usos
Los vectores virales según la presente divulgación son útiles para una gran variedad de aplicaciones terapéuticas. En algunas realizaciones, los vectores que se describen en este documento son útiles para aportar una o más cargas útiles a una o más células diana. En algunas realizaciones, las células diana residen en tejidos que están escasamente vascularizados y son difíciles de alcanzar por la circulación sistémica. En algunas realizaciones, las células diana son células sensibles a infección por HSV. En algunas realizaciones, las células diana son particularmente sensibles a infección por la cepa McKrae del HSV. En algunas realizaciones, las células diana son o incluyen una o más células neuronales. En algunas realizaciones, las células diana son células de ganglios de la raíz posterior (DRG).
Terapia génica
Los vectores virales según la presente divulgación son útiles en cualquier contexto en el que se contemple la terapia génica. Por ejemplo, los vectores virales que comprenden un segmento de ácido nucleico heterólogo conectado operativamente a un promotor son útiles para cualquier enfermedad o afección clínica asociada con la reducción o ausencia de la proteína codificada por el segmento de ácido nucleico heterólogo, o cualquier enfermedad o afección clínica que se pueda tratar eficazmente mediante la expresión de la proteína codificada dentro del sujeto. Los vectores virales que contienen un casete de expresión para la síntesis de un agente de ARNi (p. ej., uno o más ARNsi o ARNsh) son útiles para tratar cualquier enfermedad o afección clínica asociada con la sobreexpresión de un trascrito o su proteína codifica en un sujeto, o cualquier enfermedad o afección clínica que se pueda tratar al provocar la reducción de un trascrito o su proteína codificada en un sujeto. Vectores virales que comprenden un casete de expresión para la síntesis de uno o más ARN que se autohibridan o se hibridan entre sí para formar un agente de ARNi dirigido a un trascrito que codifica una citocina se pueden usar para regular respuestas del sistema inmunitario (p. ej., respuestas responsables del rechazo de trasplantes de órganos, alergia, enfermedades autoinmunitarias, inflamación, etc.). Vectores virales que proporcionan una plantilla para la síntesis de uno o más ARN que se autohibridan o hibridan entre sí para formar un agente de ARNi dirigido a un transcrito de un agente infeccioso o dirigido a un trascrito celular cuyo producto codificado es necesario para o contribuye a cualquier aspecto del proceso infeccioso se pueden usar en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Administración
Las composiciones que comprenden vectores virales que se describen en este documento se pueden formular para el aporte mediante cualquier vía adecuada incluyendo, pero no limitada a, parenteral (p. ej., intravenosa), intradérmica, subcutánea, oral (p. ej., inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, rectal y vaginal. Vías de aporte preferidas incluyen la intradérmica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen un vector viral en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Según se usa en este documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos complementarios. En algunas realizaciones, los vectores virales se formulan en glicerol. En algunas realizaciones, los vectores virales se formulan en glicerol aproximadamente al 10% en solución salina tamponada con fosfato.
Es ventajoso formular composiciones en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformizar la dosificación. Forma unitaria de dosificación, según se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se vaya a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un vector viral calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un portador farmacéutico.
La composición farmacéutica se puede administrar en diversos intervalos y a lo largo de diferentes períodos según se requiera, p. ej., una vez por semana durante entre alrededor de 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre alrededor de 3 y 7 semanas, alrededor de 4, 5 o 6 semanas, etc. El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y la cronología requeridas para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitados a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. El tratamiento de un sujeto con un vector viral puede incluir un solo tratamiento o, en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos.
Composiciones
En algunas realizaciones, los agentes activos, es decir, un vector viral de la divulgación y/u otros agentes para ser administrados junto con un vector viral de la divulgación, se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de aporte microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Métodos para la preparación de estas composiciones serán evidentes para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la composición se dirige a tipos de células particulares o a células que están infectadas por un virus.
Terapia combinada
Según la presente divulgación, las composiciones proporcionadas se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes activos y/o modalidades terapéuticas, tales como agentes terapéuticos conocidos y/o agentes biológicamente activos independientemente activos. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más de estos otros agentes activos; en algunas realizaciones, estos otros agentes activos se proporcionan como parte de distintas composiciones. En algunas realizaciones, la terapia combinada implica la administración simultánea de una o más dosis o unidades de dos o más agentes activos y/o modalidades terapéuticas diferentes; en algunas realizaciones, la terapia combinada implica la exposición simultánea a dos o más agentes activos y/o modalidades terapéuticas diferentes, por ejemplo a través de regímenes de dosificación solapados.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen o se administran en combinación con uno o más agentes activos útiles para el tratamiento de la enfermedad, el trastorno y/o la afección pertinente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Ensayo para la determinación de la transducción de DRG
Este Ejemplo muestra un método ejemplar para ensayar la transducción de vectores virales en tejido de ganglios de la raíz posterior (DRG).
Después de la administración intradérmica de un vector viral, los DRG L4, L5 y L6 se extirpan y se someten a turbulencia, con inversión, durante 40 segundos en un tubo Lysing Matrix A (MP Biomedicals) preenfriado con 350 pl de un Reagent DX (Qiagen) al 0,5% en tampón RLT Plus/solución de DTT.
Se aíslan ADN y ARN del homogenado de muestra usando el AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen). La porción aislada de ARN incluye una etapa de tratamiento en columna con ADNasa. El ADN se eluye en 2 x 100 pl de UltraPure Distilled Water (Invitrogen) después de una incubación a temperatura ambiente de 10-15 minutos por elución. El ARN se eluye en 2 x 30 pl de agua libre de ARNasa* después de una incubación a temperatura ambiente de 3 minutos por elución. El ADN se concentra mediante incubación en abierto a 37°C durante la noche.
Se analizan diez (10) pl de ADN concentrado en una reacción de 50 pl con respecto a genomas de vector de HSV mediante un ensayo de qPCR que se dirige a una región en el gen Ul22 (glucoproteína H).
Para análisis de la expresión de ARNm, 8 pl de ARN se someten en primer lugar a transcripción inversa usando the SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen) seguido por tratamiento con ARNasa. El ADNc tratado con ARNasa se puede analizar a continuación mediante cualquiera de un número de ensayos de qPCR que se dirigen bien a un transgén particular (p. ej., transcrito de la carga útil), bien al intrón LAT de 2 kb estable o bien al exón 5' LAT.
Ejemplo 2: Comparación de las capacidades de transducción en nervio de diferentes cepas de HSV
Este ejemplo demuestra que un vector de la cepa McKrae transduce neuronas más eficazmente que un vector de la cepa KOS.
Dos cepas silvestres diferentes de HSV-1 (McKrae y KOS) se prepararon y se inyectaron en la superficie dorsal y plantar de las patas traseras derecha e izquierda de cada una de tres ratas Sprague-Dawley (SD), a 100 gl por inyección. Todos los animales fueron sacrificados cinco días después de la inyección del vector. Durante los procedimientos terminales, se extirparon los ganglios de la raíz posterior (DRG) L4, L5 y L6 izquierdos y derechos, se congelaron a -70°C y se transportaron sobre hielo seco.
Se aisló ADN de los DRG L4-L6 izquierdos de todos los animales en el estudio usando un QlAamp DNA Mini Kit (Qiagen). El ADN de la muestra se analizó con respecto a copias del genoma del vector usando un ensayo de qPCR que se dirige a una secuencia dentro del gen de la glucoproteína H de HSV-1 (UL-22) en un Rotor-Gene Q Real-Time PCR Cycler (Qiagen). Según se muestra en la Tabla 1, la cepa McKrae parece transducir las neuronas significativamente mejor que la cepa KOS. El número medio de copias del genoma detectado en los DRG del grupo KOS era 73, mientras que el del grupo de McKrae era 21.347.
T a b la 1
Conc Conc Genom as Cale Ct DE Ct Cale DF de M uestra Cepa Nom bre Ct (Copias) M edia M edia M edia Total Totales KOS 5alR A1G1 L-DRG 35.27 7.00E+00 35.31 0.06 7.00E+00 20 1.40E+02 5alR A1G1 L-DRG 35.36 6.00E+00
KOS 5alR A2G1 L-DRG 36.10 4.00E+00 36.05 0.07 4.00E+00 20 8.00E+01 5alR A2G1 L-DRG 36.01 4.00E+00
KOS 5alR A3G1 L-DRG 37.15 2.00E+00 37.15 2.00E+00 34.97 <LOQ 5alR A3G1 L-DRG
McK 5alR A4G2 L-DRG 37.31 2.00E+00 36.43 1.25 3.00E+00 40.65 <LOQ 5alR A4G2 L-DRG 35.54 6.00E+00
McK 5alR A5G2 L-DRG 26.73 1.95E+03 26.74 0.01 1.94E+03 32.89 6.38E+04 5alR A5G2 L-DRG 26.74 1.93E+03
McK 5alR A6G2 L-DRG 35.23 7.00E+00 34.79 0.61 9.00E+00 28.57 2.57E+02 5alR A6G2 L-DRG 34.36 1.20E+01
Conc Conc
Cale Ct DE Ct Cale Spk % Nom bre Ct (Copias) M edia M edia M edia (Cop) Recuperación 5aS2 A2G1 L-DRG 36.93 2 37.22 0.42 2 <LOQ
5aS2 A2G1 L-DRG 37.52 2
5aS2 A2G1 L-DRG spk-
25 32.67 38 32.79 0.18 35 25 140%
5aS2 A2G1 L-DRG spk-25 32.92 32
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LOQ: Ct = 36.34
Ejemplo 3: Preparación de Vectores
Este ejemplo describe métodos para preparar y formular vectores ejemplares para terapia génica.
Estructura genética del vector
Se elabora un vector reemplazando en primer lugar ambas copias de los locus de lCP4 mediante recombinación homóloga usando un plásmido y cribando con respecto a placas que expresan elemento marcador. Se construye un plásmido al clonar un fragmento de un genoma de HSV-1 que comprende regiones aguas arriba del promotor ICP4 incluyendo el origen viral contenido dentro de las regiones repetidas invertidas cortas. El plásmido se modifica además al clonar un fragmento del elemento marcador, por ejemplo HCMV-eGFP, en el plásmido. Este plásmido se recombina a continuación en el locus de ICP4 de un virus HSV silvestre. El vector resultante se aísla usando una línea celular Vero estable que expresa ICP4, tal como '6-5C'. Las células Vero 6-5C son células complementarias que expresan ICP4.
A fin de reemplazar el elemento marcador (p. ej., GFP) por un gen de interés (GOI) en el vector descrito anteriormente, se construye un plásmido al clonar HCMV-GOI-pA en el plásmido. Las placas que no expresan el elemento marcador se aíslan y se prueban mediante ELISA con respecto a la expresión de GOI.
Producción de vector crudo
Células Vero que complementan ICP4 se cultivan en matraces de cultivo tisular usando medio completo (DMEM complementado con FBS, HEPES y penicilina-estreptavidina) y se expanden en matraces 6-12xT 175 a una densidad de siembra de 3-4x104 células/cm2. Los matraces de cultivo se incuban a 37°C/7,5% de CO2 durante 3-4 días.
Cuando las células están 1-2 días sobre la confluencia, se infectan con una multiplicidad de infección (MOI) de ~0,1 con una reserva de virus de concentración conocida. La infección se inicia al retirar el sobrenadante de cultivo de cada matraz e infectar con un total de 2,5 ml de medio completo que contiene la cantidad apropiada de una reserva de virus. El virus es adsorbido sobre las monocapas celulares al incubar los cultivos durante 1,5 - 2 horas, remover y hacer girar los matraces cada 15-20 minutos. Después de la etapa de adsorción, se añaden a cada matraz 10 ml adicionales de medio completo y los cultivos se incuban de nuevo a 37°C/7,5% de CO2.
Aproximadamente 48 horas después de iniciar la infección, los matraces se observan al microscopio para confirmar que las células muestran signos de efecto citopatógeno y separación de la superficie del matraz. En ese punto, las células y el sobrenadante se recogen, se reúnen y se centrifugan a ~1500xg durante ~10 min. El sobrenadante se retira de la pella celular y se mantiene separadamente para un procesamiento posterior.
La pella celular se resuspende en 4-5 ml de medio completo, se homogeneiza y a continuación se congela a -80°C. Después de que la suspensión celular se haya congelado durante >20 minutos, se descongela y se centrifuga a ~1500xg durante ~10 min. Este segundo sobrenadante de la pella celular se retira y se combina con el primer sobrenadante recogido.
El sobrenadante reunido se divide en partes alícuotas en tubos de centrifugación. A continuación, el virus se centrifuga a ~40.000xg durante ~30 minutos a 2-8°C a fin de granular el virus. Después de que se complete la etapa de centrifugación, el sobrenadante procedente de los tubos se retira y se descarta. Al día siguiente, las pellas de virus se homogeneizan mediante pipeteado y se reúnen entre sí. A continuación, la reserva de virus resuspendido se divide en partes alícuotas en crioviales típicamente en volúmenes de ~ 120 gl por vial. Se añade medio completo (200-300 gl) a las pellas de virus a fin de cubrirlas con líquido y se almacenan a 2-8°C durante la noche para soltar las partículas virales. Los viales se etiquetan y se congelan a -80°C. Más tarde, un vial congelado se descongela a fin de realizar un ensayo de valoración de placas virales para determinar la concentración de la reserva de virus preparada antes de usar en cualquier estudio in vivo o in vitro.
Fabricación de vector clarificado
Descongelación y expansión de células
Células Vero (p. ej., células Vero 6-5, VeroD) procedentes de un banco celular de trabajo se descongelan 37°C y se transfieren a un tubo cónico y se reúnen. Las células VeroD son células complementarias que expresan o ICP4, ICP27 e UL55. Las células se introducen en viales a aproximadamente 1,0x107 células viables/ml/tubo. Las células se diluyen gradualmente con medio completo y una muestra se retira para obtener recuentos de células viables. Las células se siembran en matraces de cultivo tisular a una densidad de 3,0 - 5,0x104 células/cm2.
Las células se incuban a 37°C, 7,5% de CO2 y se examinan periódicamente mediante microscopía de fases. Las células se someten a pases mientras son subconfluentes. El medio completo se retira, se enjuaga con PBS y las células se disocian. Los matraces se incuban hasta que las células se separan, a continuación se resuspenden en medio completo, se reúnen, se recuentan y se siembran en nuevos matraces a una densidad entre 1,0-4,0x104 células/cm2. Las células se expanden y se deja que se extiendan hasta 1-2 días después de la confluencia antes de la infección.
Infección con vector
Cuando las células alcanzan la confluencia deseada, un matraz modélico se subcultiva y las células se recuentan para estimar el número de células por fábrica celular. Se prepara un inóculo del vector del banco de virus maestro al descongelar el volumen apropiado requerido para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 y diluir la reserva con medio completo hasta el volumen buscado deseado para la infección. Las fabricas celulares se infectan mediante un período de adsorción inicial seguido por incubación durante el primer día de infección en medio completo. Después de aproximadamente 24 horas, el medio de cultivo se retira y se reemplaza por un volumen igual de medio libre se suero. Las fábricas celulares se ponen en la incubadora y la temperatura se reduce hasta 33°C/con 7,5% de CO2. Los cultivos se comprueban diariamente y el porcentaje de efecto citopático se estima mediante inspección visual.
Cosecha viral en crudo y clarificación
La infección se detiene al poner las fábricas celulares en una cabina de bioseguridad y reunir el sobrenadante y el residuo celular en una bolsa estéril. Esta cosecha no clarificada en masa se muestrea con respecto a agentes adventicios. Después del muestreo, el nivel de cloruro sódico de la cosecha se incrementa y a continuación se mezcla. A continuación, la cosecha se divide en partes alícuotas en tubos de centrifugación y el residuo celular se retira mediante centrifugación. El sobrenadante se reúne en una bolsa estéril. Después del pretratamiento de una cápsula filtrante de clarificación con agua estéril, el sobrenadante que contiene virus se bombea a continuación a través de la cápsula filtrante a otra bolsa estéril, seguido por agua estéril para recuperar el virus restante de la cápsula. La bolsa se mezcla y el filtrado se almacena durante la noche a 4°C.
Posteriormente, el filtrado se calienta y se ajusta hasta ~2 mM de MgCl2 mediante la adición de 2 volúmenes de MgCl2 3 mM en agua estéril. El filtrado diluido se mezcla y se trata con una endonucleasa.
Cromatografía en columna de intercambio catiónico
Una columna BPG 400 se rellena con resina de alta eficacia SP, se esteriliza con NaOH 0,5 N y se equilibra con tampón de lavado (PBS pH 7,0) y tampón de separación (NaCl 1 M-PBS pH 7,0) antes de cargar virus tratado con endonucleasa.
La bolsa de procesamiento que contiene el filtrado tratado con endonucleasa se conecta a la entrada usando una soldadora de tubos y el virus se carga en la columna. El flujo pasante se recoge en una bolsa estéril. La etapa de captura del virus es seguida por lavado con PBS hasta que la absorbancia UV vuelve al valor inicial. La bomba se detiene y una bolsa de procesamiento que contiene NaCl 0,45 M-PBS (pH 7,0) se conecta a la entrada. El tubo de salida se transfiere a un recipiente estéril en una cabina de bioseguridad. El tampón se bombea a la columna y, cuando la absorbancia UV empieza a incrementarse bruscamente, la salida de la columna se transfiere a un nuevo recipiente estéril para recoger el virus eluido. La recogida se detiene después de que la absorbancia UV vuelva casi hasta el valor inicial. Esto es la fracción de eluido viral purificada. Una bolsa de procesamiento que contiene tampón de separación se conecta a la entrada y el extremo del tubo de salida se transfiere a una botella estéril para recoger la fracción separada. El tampón se bombea a través de la columna hasta que la absorbancia UV alcanza un máximo y vuelve al valor inicial. El eluido recogido se almacena a 4°C durante la noche.
Filtración con flujo tangencial
El sistema de filtración con flujo tangencial, que usa un cartucho filtrante de fibra hueca de un tamaño de poro de 0,1 micrómetros, se prepara al montar el tubo y el cartucho y esterilizar el sistema mediante tratamiento en autoclave. El sistema se barre con PBS estéril (pH 7,0) y la fracción de eluido viral se añade al depósito del sistema y se equilibra mediante recirculación. Después del equilibrado, la bomba de recogida de permeado se enciende y el filtrado se recoge. El sistema está en marcha hasta que el volumen cargado se reduce hasta aproximadamente 500 ml. El retenido en el depósito se diluye con DPBS (pH 7,0) con diafiltración continua de volumen constante, y el producto del retenido se recupera cuando la conductividad del permeado está dentro del 10% del tampón de diafiltración (DPBS pH 7,0).
Formulación, filtración final y envasado
El retenido recuperado se ajusta hasta 10% del volumen final con glicerol estéril y se mezcla bien antes de filtrar a través de una unidad de filtración de disco de 0,45 pm. El producto se distribuye en crioviales etiquetados para el almacenamiento a < -65°C.
Ejemplo 4: Análisis de la transducción de la cepa McKrae en DRG después de la inyección en la pata
Este ejemplo demuestra que la administración de un vector basado en la cepa McKrae da como resultado la transducción de ganglios de la raíz posterior (DRG) in vivo.
Un vector de HSV-1 con replicación defectuosa según se describe anteriormente se inyectó en la almohadilla de ratas. Según se muestra en la Figura 1, un vector de HSV-1 con replicación defectuosa puede transducir las neuronas de los DRG de un modo dependiente de la dosis (cinco días después de la inyección). Las ordenadas muestran una porción del número total de genomas detectable bajo las condiciones de ensayo e indica que el número de genomas se incrementa con relación a la dosis de vector inyectada.
La Figura 2 muestra el número total de transcritos de una carga útil en DRG a los 5, 14, 47, 77 y 131 días después de la inyección en la almohadilla de un roedor. La Figura 3 muestra los datos procedentes del mismo experimento como número de transcritos de carga útil por genoma. La expresión de la carga útil fue conducida por el promotor de HCMV.
Ejemplo 5: Análisis de la transducción y la expresión de la carga útil con diferentes promotores
Este ejemplo demuestra que se puede obtener un incremento en la expresión génica en DRG usando un promotor específico de neuronas.
Se probaron cuatro promotores diferentes (HCMV, HCMV TAC, NSE y HCMV CGRP) con respecto a la eficacia en el aporte de vectores de HSV-1 a DRG. El vector que comprende un promotor NSE no tenía un potenciador de CMV, solo un promotor específico de neuronas. Según se muestra en la Figura 4, un vector con un promotor HCMV promediaba 29 transcritos por genoma en DRG, mientras que los promotores HCMV TAC, NSE y HCMV CGRP promediaban 176, 327 y 166 transcritos por genoma, respectivamente.
Vectores virales de McKrae que comprenden proteína fluorescente verde (GFP) conectada operativamente a promotores HCMV, NSE o CGRP se inyectaron en la almohadilla de ratas y los transcritos de GFP se midieron en los DRG L4-L6 a lo largo del tiempo. Según se muestra en la Figura 5, los promotores específicos de tejido mejoraban la transcripción en neuronas de DRG entre 5 y 18 días después de la inoculación en la almohadilla.
Adicionalmente, cuando se comparaban tres promotores diferentes (HCMV, HCMVeCGRP y NSE) a lo largo del tiempo (2-8 semanas), los vectores que contenían un promotor bien NSE o bien HCMVeCGRP daban como resultado más transcritos totales en DRG que un vector que contenía un promotor HCMV (véanse las Figuras 6 y 7).
Los transcritos de carga útil se midieron en DRG de ratas que recibían una inyección de vector viral de McKrae que comprendía una carga útil de polipéptido acoplada operativamente con un promotor quimérico CGRP o un promotor HCMV. Según se mide a los 5 y 14 días después de la inyección, el promotor CGRP, que comprendía un potenciador de HCMV aguas arriba del promotor, mostraba números de transcritos superiores de la carga útil de polipéptido por genoma que el promotor HCMV (Figura 8).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante cuyo genoma contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
2. La variante según la reivindicación 1, que tiene un genoma truncado de tamaño total menor de alrededor de 150.000 pares de bases y que incluye una eliminación de uno o más residuos dentro de un elemento correspondiente a los residuos 126049 a 130014 de SEQ ID NO: 1.
3. Un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante cuyo genoma contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. La variante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el vector según la reivindicación 3, donde el gen ICP4 está alterado por eliminación de su promotor.
5. El vector según la reivindicación 3 o la reivindicación 4,
a. donde el vector comprende un promotor específico de neuronas; opcionalmente donde el promotor específico de neuronas es un promotor de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP); y/o
b. donde el vector comprende un potenciador de citomegalovirus humano (HCMV) o una señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (BGH); y/o
c. que comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico.
6. Una célula transducida con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
7. Una composición farmacéutica que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 3-5 y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. Un método para propagar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, comprendiendo el método las etapas de:
(i) infectar con el vector células que complementan ICP4 cultivadas que contienen ADN que codifica la proteína ICP4 de HSV, y
(ii) aislar el sobrenadante del cultivo de la etapa (i).
9. El método según la reivindicación 8, que comprende además una etapa de purificación del vector en el sobrenadante mediante cromatografía; que comprende además opcionalmente una etapa de concentración del vector purificado mediante filtración con flujo tangencial.
10. Un método para preparar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y donde el vector expresa un elemento marcador, comprendiendo el método incubar células transfectadas con:
(a) una primera molécula de ácido nucleico:
(i) que comprende una porción del genoma de la cepa McKrae del HSV pero no codifica una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
(ii) que comprende una primera región de homología (HR1) y una segunda región de homología (HR2), y
(b) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de codifica un elemento marcador, donde la secuencia está flanqueada por una primera región de homología (HR1') y una segunda región de homología (HR2'),
donde HR1 es homologa a HR1' y HR2 es homologa a HR2', de modo que la secuencia que codifica el elemento marcador en la segunda molécula de ácido nucleico se integre en la primera molécula de ácido nucleico a través de recombinación homóloga.
11. El método según la reivindicación 10, donde (a) las células son células que complementan ICP4 o (b) donde el elemento marcador es un polipéptido que opcionalmente es detectable mediante fluorescencia.
12. El método según la reivindicación 11 (a), que comprende además una etapa de purificación de placas virales que expresan el elemento marcador.
13. Un método para preparar un vector que comprende un genoma de la cepa McKrae del virus del herpes simple (HSV) variante, genoma que contiene una alteración o eliminación del gen ICP4 tal que la variante no exprese una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y donde el vector expresa un agente de interés, comprendiendo el método incubar células transfectadas con:
a) una primera molécula de ácido nucleico:
(i) que comprende una porción del genoma de la cepa McKrae del HSV pero no codifica una proteína funcional caracterizada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y
(ii) que comprende una secuencia que codifica un elemento marcador, donde la secuencia que codifica el elemento marcador está flanqueada por una primera región de homología (HR1) y una segunda región de homología (HR2); y
(b) una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un agente de interés, donde la secuencia que codifica el agente de interés está flanqueada por una primera región de homología (HR1') y una segunda región de homología (HR2'),
donde HR1 es homóloga a HR1' y HR2 es homóloga HR2', de modo que la secuencia que codifica el agente de interés se integre en la primera molécula de ácido nucleico a través de recombinación homóloga.
14. El método según la reivindicación 13, donde las células son células que complementan ICP4; que comprende además opcionalmente una etapa de purificación de placas virales que no expresan el elemento marcador.
15. El vector según la reivindicación 5(c), para el uso en un método para expresar un polipéptido en un ganglio de la raíz posterior de un sujeto, que comprende administrar el vector al sujeto; opcionalmente donde
a. el vector se ha de administrar in vivo; o
b. el vector se ha de administrar mediante contacto con la piel; o
c. el vector se ha de administrar mediante inyección intradérmica.
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