ES2244090T3

ES2244090T3 - Curacion de fracturas utilizando analogos de pthrp.

Info

Publication number: ES2244090T3
Application number: ES98951341T
Authority: ES
Inventors: Brian Henry Vickery
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-09-02
Also published as: ATE297754T1; KR100679778B1; PE117399A1; WO1999012561A2; IL134719A0; WO1999012561A9; DE69830591D1; AR015435A1; NZ502970A; PL339449A1; TW552139B; CZ2000862A3; IL134719A; US20020077281A1; NO323740B1; AU9740698A; CA2302255A1; WO1999012561A3; HUP0004560A3; HU226866B1

Abstract

El uso de un análogo polipeptídico del péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) y de sales del mismo, en donde dicho análogo es un truncado N- terminal de 30 a 50 residuos aminoácidos, en donde los residuos aminoacídicos 22-31 de dicho análogo de PTHrP forman una a-hélice anfipática para la preparación de un medicamento para la cicatrización del hueso y reparación de la fractura, en donde la a-hélice anfipática es Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu y Xaa es un residuo aminoácido con carga positiva.

Description

Curación de fracturas utilizando análogos de PTHrP.

Anualmente se producen aproximadamente de 8 a 10 millones de fracturas de hueso en los Estados Unidos, requiriendo hospitalización más de un millón de las mismas. Los costes anuales estimados para el tratamiento de estas fracturas ascienden a veinte mil millones de dólares. Si bien estas cifras son ya de por si significativas, se espera que aumenten debido al envejecimiento de la población general. Aunque diversas terapias son indicadas para la prevención de la pérdida ósea asociada con el envejecimiento, existen pocas terapias indicadas para el tratamiento una vez la fractura se ha producido. La mayoría de éstas requieren la administración local, lo cual no es deseable debido a la complejidad de la administración y al pobre cumplimiento de los pacientes. Por consiguiente, sería deseable disponer de métodos adicionales que facilitaran la cicatrización ósea y la reparación de la fractura.

Se ha descrito recientemente que el tratamiento intermitente con hormona paratiroidea (PTH) mejora la cicatrización de las fracturas en ratas ovariectomizadas, lo que indica que el tratamiento con PTH puede ser potencialmente útil en el tratamiento de las fracturas osteoporóticas postmenopáusicas. (H.W. Kim y cols., Transactions of the 43^{rd} Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, Vol. 22, Sección 1, Resumen 181-31, 9-13 Febrero, 1997; H.W. Kim y cols., Journal of Bone and Mineral Research, Vol. 11, Suplemento 1, página S152, Resumen P248 (Agosto, 1996)). Otros investigadores han descrito que la implantación de una matriz activada con un gen que expresa la proteína morfogenética de hueso 4 y/o un fragmento de PTH (aminoácidos 1 a 34) en el modelo de fractura en rata de defecto segmentado produce la formación de nuevo hueso que rellena el hueco con mayor rapidez que en un control no tratado. (Jianming Fang y cols.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93: 5733-5758, Junio, 1996). Diversos análogos de PTH se han descrito también como útiles para el tratamiento de la osteoporosis (Patentes Estadounidenses Núms. 5,556,940 y 5,559,792). Otros métodos de curación de fracturas incluyen el uso del factor de plaqueta humano 4 (Patente Estadounidense Núm. 5,622,935), benzotiofenos (Patente Estadounidense Núm. 5,502,074) y vitamina D_{3} 24,25(OH)_{2} (Patente Estadounidense Núm. 5,069,905).

El péptido relacionado con PTH (PTHrP), conocido anteriormente como el factor responsable de la hipercalcemia humoral del cáncer, consiste en un péptido de 138-174 aminoácidos (dependiendo del corte y empalme alternativo) que se une al receptor PTH/PTRrP. La secuencia de 34 aminoácidos del N-terminal del PTHrP tiene una homología de secuencia limitada con la de la PTH, pero en determinados casos muestra una actividad similar a la de la PTH. Sin embargo, el PTHrP es en general menos potente y menos anabólico de hueso que la PTH, y no se ha asociado con la cicatrización de las fracturas. La secuencia del hPTHrP (1-34) es la siguiente:

1

Se han descrito diversos análogos y homólogos truncados del PTHrP. Los análogos en los que los residuos aminoacídicos 22-31 de PTHrP(1-34) se reemplazan por una hélice \alpha anfipática (Patente Estadounidense Núm. 5,589,452 y WO 97/07815) y derivados relacionados han sido descritos como útiles para el tratamiento de la osteoporosis. (B.H. Vickery y cols., J. Bone & Mineral Research, 11(12): 1943-1951 (1996); D. Leaffer y cols., Endocrinology, 136(8): 3624-3631 (1995)). Se demostró que los análogos monocíclicos y bicíclicos de PTHrP(1-34) y PTHrP(7-34) se unían fuertemente con el receptor de PTH y estimulaban (o antagonizaban) la actividad adenilciclasa estimulada por PTH en células similares a osteoblasto. (Michael Chorev y cols., Biochemistry, 36: 3293-3299 (1997) y WO 96/40193).

En un aspecto, esta invención proporciona métodos para la cicatrización de hueso y reparación de fracturas que comprenden la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un análogo polipeptídico del péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) y sales del mismo, en el que los residuos aminoacídicos 22-31 forman una hélice \alpha anfipática, preferentemente compuesta por aminoácidos hidrofílicos (Haa) y aminoácidos lipofílicos (Laa) ordenados en la secuencia:

: Haa (Laa Laa Haa Laa)_{2} Laa;

o al uso de dichos compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dichos transtornos.

Cuando se insertan las formas ilustrativas de esta hélice anfipática en la secuencia PTHrP, particularmente en truncados N-terminales del PTHrP humano (residuos 1-32 a 1-38), los polipéptidos resultantes son eficaces en la cicatrización de hueso y reparación de fracturas. La administración sistémica es la forma de administración preferida.

Se presenta a continuación una breve descripción de las figuras:

La Figura 1 muestra la densidad radiográfica semanal de un defecto segmentado de hueso en el modelo de fractura en rata a lo largo del transcurso de cinco semanas de tratamiento con análogos de PTHrP B ó C respecto al control. Se muestra que tras cuatro semanas el crecimiento óseo en los defectos de los animales tratados con los análogos de PTHrP fue mayor que en los animales control. Los análogos de PTHrP B y C son (MAP_{1-10})^{22-31}Ala^{19}hPTHrP(1-34)NH_{2} y (MAP_{1-10})^{22-31}His^{26}hPTHrP(1-34)NH_{2}, respectivamente.

La Figura 2 muestra la relación de densidad radiográfica del hueso segmentado respecto al fémur contralateral (control) en el modelo de fractura de defecto segmentado en rata tras seis semanas de tratamiento con control o análogos de PTHrP B ó C. Las ratas tratadas con los análogos de PTHrP B ó C presentaban una densidad ósea aumentada en relación con las ratas tratadas con control.

La Figura 3 muestra radiografías de alta resolución de defectos óseos en el modelo de fractura de defecto segmentado en rata tras tratamiento durante seis semanas con control (3A) o análogo de PTHrP C (3B). La radiografía demuestra que el defecto del control permanece sin unir mientras que el defecto tratado con análogo de PTHrP C ha cicatrizado.

Las Figuras 4A y 4B muestran la cicatrización de un defecto óseo intermembranoso en conejos tras tratamiento con análogo de PTHrP D (MAP_{1-10})^{22-31}hPTHrP(1-34)NH_{2} en dos dosis diferentes.

La Figura 5 muestra la tasa de unión lograda en el modelo de retraso de cicatrización de fractura inducido por corticosteroides con el análogo de PTHrP D, (MAP_{1-10})^{22-31}hPTHrP(1-34)NH_{2}.

Se presenta a continuación una descripción más detallada de la invención.

Las abreviaturas de una letra y de tres letras para las diversas bases nucleotídicas y aminoácidos comunes son como se recomienda en Pure Appl. Chem. 31: 639-645 (1972) y 40: 277-290 (1974). Las abreviaturas representan aminoácidos L a menos que se designen como D, o D,L. Algunos aminoácidos, tanto naturales como no naturales son aquirales, por ejemplo glicina. Todas las secuencias peptídicas se presentan con el aminoácido N-terminal a la izquierda y el aminoácido C-terminal a la derecha.

Deberá tenerse en cuenta que pueden estar presentes en los análogos de PTHrP empleados en la presente invención aminoácidos tanto naturales como no naturales. Ejemplos de aminoácidos no naturales y sus abreviaturas incluyen homoserina (hSer), homoserina lactona (hSerlac), homocisteína (Hcy), homoarginina (hArg), homocitrulina (Hci), penicilamina (Pen), N\alpha-metilarginina (N-MeArg), norleucina (Nle), norvalina (Nval), norisoleucina (Nile), N-metilisoleucina (N-MeIle), fenilglicina (PhG), t-butilglicina (Tle), hidroxiprolina (Hyp), 3,4-dehidroprolina (\Delta-Pro), piroglutamina (Pyr,Glp), ornitina (Orn), ácido 1-aminoisobutírico (1-Aib), ácido 2-aminoisobutírico (2-Aib), ácido 2-aminobutírico (2-Abu), ácido 4-aminobutírico (4-Abu), ácido 2,4-diaminobutírico (A2bu), ácido \alpha-aminosubérico (Asu), albicina (Abz), \beta-ciclohexilalanina (Cha), 3-(1-naftil)alanina (1-Nal), 3-(2-naftil)alanina (2-Nal), citrulina (Cit), ácido pipecolínico (Pip), 4-clorofenilalanina (4-ClPhe), 4-fluorofenilalanina (4-FPhe), sarcosina (Sar) y ácido 1-aminopropanocarboxílico (1-NCPC). Tanto los aminoácidos naturales como no naturales están disponibles comercialmente a partir de proveedores como NovaBiochem (San Diego, CA, EE.UU.) y Bachem (Torrance, CA, EE.UU.).

Los análogos del polipéptido PTHrP se describen en referencia a su variación de la secuencia nativa del hPTHrP. La representación (MAP_{1-10}) se refiere a la secuencia helicoidal anfipática en particular que se descibre a continuación:

: Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu (SEQ ID NO:2)

la secuencia MAP de diez residuos aminoacídicos.

De este modo, la secuencia representada por (MAP_{1-10})^{22-31}hPTHr(1-34) se refiere a los residuos N-terminales 1-34 del hPTHrP con el segmento entre los residuos 22-31 reemplazado por la secuencia MAP. Dentro de la secuencia MAP pueden identificarse variantes adicionales. De este modo, (MAP_{1-10})^{22-31}His^{26}hPTHrP(1-34) se refiere a los residuos N-terminales de hPTHrP 1-34 con el segmento entre los residuos 22-31 reemplazado por una secuencia MAP en la que existe una histidina en la posición 26 (en lugar de un lisina como en la secuencia MAP estándar).

Se identifican también variantes adicionales de la secuencia natural. (MAP_{1-10})^{22-31}Pro^{32}hPTHrP(1-32) se refiere a los residuos N-terminales 1-32 de hPTHrP, con la secuencia MAP en las posiciones 22-31 y una prolina (que reemplaza la histidina natural) en la posición 32. (MAP_{1-10})^{22-31}D-Orn^{34}lactamah PTHrP(1-34) se refiere a los residuos N-terminales 1-34 de hPTHrP con la secuencia MAP en las posiciones 22-31 y una ornitina en la posición 34, con una lactama formada entre el grupo amino de la cadena lateral de la ornitina y el extremo carboxi. (MAP_{1-10})^{22-31}hSer^{34}hPTHrP(1-34)Thr His Ile Gln NH_{2} se refiere a los residuos N-terminales 1-34 de hPTHrP con la secuencia MAP en las posiciones 22-31, una homoserina en la posición 34 y una secuencia adicional Thr His Ile Gln en las posiciones 35-38, siendo el extremo carboxi una amida primaria.

Los polipéptidos con enlaces ciclados entre los residuos aminoacídicos se identifican con los dos residuos enlazados colocados entre corchetes y precedidos por una "c". En general, los enlaces entre dos residuos se forman entre funciones de la cadena lateral, normalmente en forma de enlaces amida o éster. De este modo, (MAP_{1-10})^{22-31}c[Lys^{13},Asp^{17}]hPTHrP(1-34)hSer^{34} lactona se refiere a los residuos N-terminales de hPTHrP 1-34 con el segmento entre los residuos 22-31 reemplazado por la secuencia MAP, la cadena lateral amino de la lisina en la posición 13 ciclada con la cadena lateral carboxilo del aspartato en la posición 17, y una homoserina adicional en la posición 34 con una lactona formada entre la cadena lateral hidroxilo de la homoserina y el extremo carboxilo. De forma similar, (MAP_{1-10})^{22-31}c[Lys^{13},Asp^{17}]-hPTHrP(1-34) se refiere a los residuos N-terminales de hPTHrP 1-34 con el segmento entre los residuos 22-31 reemplazado por la secuencia MAP, y la cadena lateral amino de la lisina en la posición 13 ciclada con la cadena lateral carboxilo del aspartato en la posición 17.

"Aminoácido hidrofílico (Haa)" se refiere a un aminoácido que posee al menos un grupo funcional hidrofílico además de aquellos requeridos para la formación de enlaces peptídicos, tales como arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina y sus homólogos.

"Aminoácido lipofílico (Laa)" se refiere a un aminoácido no cargado, alifático o aromático, tal como isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, tirosina, valina y sus homólogos.

Para los propósitos de esta invención, alanina se clasifica como "anfifílico", esto es, capaz de actuar como hidrofílico o lipofílico.

Un "análogo polipeptídico de PTHrP" se refiere a un polipéptido que presenta substituciones, deleciones o inserciones aceptadas en el campo respecto a PTHrP o es substancialmente homólogo a PTHrP de modo que el análogo posee una actividad fisiológica similar.

"Un análogo truncado fisiológicamente activo de PTHrP" se refiere a un polipéptido que posee una secuencia que comprende menos del complemento completo de aminoácidos hallado en PTHrP que, sin embargo, produce una respuesta fisiológica similar. Los análogos truncados de PTHrP no es necesario que sean completamente homólogos respecto a PTHrP para producir una respuesta fisiológica similar. Típicamente, los análogos truncados estarán truncados en el extremo C terminal y se hallarán en el intervalo de 30 a 40 residuos, siendo ejemplos representativos preferidos, pero no exclusivos, de este grupo PTHrP(1-32), PTHrP(1-34) y PTHrP(1-38). En general, los análogos serán portadores de substituciones conservadoras de aminoácidos de conformidad con los parámetros aceptados descritos a continuación.

El término "substancialmente homólogo", cuando hace referencia a polipéptidos, indica que el polipéptido en cuestión muestra al menos un 80% de homología, normalmente un 90% de homología, y preferentemente un 95% de homología con el polipéptido de referencia. La homología para polipéptidos se mide normalmente empleando software de análisis de secuencia. (Ver por ejemplo Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, EE.UU.).

"Hélice \alpha anfipática" se refiere a la estructura secundaria mostrada por ciertos polipéptidos en los que los aminoácidos asumen una configuración en hélice \alpha que posee caras opuestas polares y no polares orientadas a lo largo del eje longitudinal de la hélice. Las secuencias helicoidales anfipáticas pueden diseñarse por los expertos en el campo. Las secuencias helicoidales anfipáticas particulares adecuadas para su uso en los métodos de esta invención se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Patente Estadounidense Núm. 5,589,452 o WO 97/07815.

La presente invención se basa en el hallazgo de que ciertos análogos de PTHrP que contienen una hélice \alpha anfipática en las posiciones 22-31 son eficaces en la cicatrización de hueso y en la reparación de fracturas. La hélice \alpha anfipática está compuesta por aminoácidos hidrofílicos (Haa) y aminoácidos lipofílicos (Laa) ordenados en la secuencia:

: Haa (Laa Laa Haa Laa)_{2} Laa

Cuando se insertan formas ilustrativas de esta hélice anfipática en la secuencia PTHrP, en particular en truncados N-terminales de PTHrP humano (residuos 1-32 a 1-38), los polipéptidos resultantes son eficaces en la cicatrización de fracturas y reparación de hueso. A diferencia de la PTH, el PTHrP o sus análogos que no poseen este segmento de hélice anfipática, los análogos utilizados aquí no producen hipercalcemia. Adicionalmente, estos análogos inducen un aumento más rápido de hueso en relación tanto a PTH como a PTHrP.

Se reconocerá que adicionalmente al hecho de contener una hélice anfipática entre las posiciones 22 y 31, pueden realizarse diversas substituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos en la secuencia PTHrP fuera de esta región, preservando al mismo tiempo la estructura tridimensional del polipéptido. Variaciones representativas de la secuencia de PTH y PTHrP que mantienen la actividad fisiológica de los análogos resultantes se descubren en las Patentes Estadounidenses Núms. 5,599,792, 5,556,940, 5,607,915 y 5,589,452, y WO 91/06564, WO 94/02510, WO 95/11697, WO 96/40193 y WO 97/07815. Variantes adicionales que un experto en el campo esperará que mantengan una actividad fisiológica pueden obtenerse siguiendo las técnicas de modelado de estructura de proteínas aceptadas en el campo. Metodologías representativas para obtener dichas variantes se describen entre otros en I. Ladunga y R.F. Smith, Protein Eng., 3: 187-196 (1997) y por M.J. Thompson y R.A. Goldstein, en Proteins, 1: 28-37 (1996).

Las variantes de substitución son aquellas en las que al menos un aminoácido en la secuencia nativa se elimina y un aminoácido diferente se coloca en su lugar en la misma posición. Las substituciones pueden ser únicas, en las que únicamente se reemplaza un aminoácido, o múltiples en las que dos o más aminoácidos son reemplazados en la misma molécula. Se espera en general que se permita cualquier substitución conservadora. De este modo, se espera que un análogo que corresponde a la substitución de un aminoácido hidrofílico por otro aminoácido hidrofílico o un aminoácido hidrofóbico por otro aminoácido hidrofóbico mantenga propiedades de cicatrización de fracturas similares a las de su precursor. Las substituciones incluyen asimismo análogos de PTHrP en los que el residuo C-terminal se presenta como una amida. Pueden realizarse substituciones adicionales en base a aminoácidos que estén o bien cargados o no cargados. Cada uno de estos grupos puede dividirse a su vez en subgrupos para facilitar las substituciones.

Aminoácidos cargados

Residuos ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido 2-aminosubérico

Residuos básicos: lisina, arginina, histidina, ornitina

Aminoácidos no cargados

Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparagina, glutamina, metionina

Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, norleucina, isoleucina

Residuos no polares: cisteína, homocisteína, metionina, prolina

Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina.

Alternativamente, las substituciones de aminoácidos pueden basarse en el principio del bioisosterismo. Tales substituciones bioisostéricas normalmente minimizan cualquier efecto disruptivo de la conformación que pueden producirse a causa de la substitución al azar. La técnica del rastreo con alaninas puede utilizarse para identificar posiciones en las que una substitución isostérica se espera que proporcione variantes que conservan actividad fisiológica. (Ver por ejemplo K.H. Pearce Jr., M.H. Ultsch, R.F. Kelley, A.M. de Vos y J.A. Wells, Biochemistry, 35 (32): 10300-10307 (1996) y B. Li, J.Y. Tom, D. Oare, R. Yen, W.J. Fairbrother, J.A. Wells y B.C. Cunningham, Science, 270: 1657-1660 (1995)). Se muestran en la tabla a continuación aminoácidos isostéricos representativos:

Aminoácido	Aminoácido isostérico
Ala	Ser, Gly
Glu	Gln, Asp
Gln	Asn, Glu
Asp	Asn, Glu
Asn	Ala, Asp
Leu	Met, Ile
Gly	Pro, Ala
Lys	Met, Arg
Ser	Thr, Ala
Val	Ile, Thr
Arg	Lys, Met, Asn
Thr	Ser, Val
Pro	Gly
Ile	Met, Leu, Val
Met	Ile, Leu
Phe	Tyr
Tyr	Phe
Cys	Ser, Ala
Trp	Phe,
His	Asn, Gln

Variantes de deleción son aquellas en las que uno o más aminoácidos en la secuencia aminoacídica nativa han sido eliminados. Normalmente, las variantes de deleción presentarán uno o dos aminoácidos delecionados en una región en particular de la molécula. Es probable que las deleciones se realicen en los extremos de la secuencia, en particular en el extremo carboxilo. De este modo, aunque los fragmentos PTHrP(1-34) son los preferidos, secuencias que están truncadas adicionalmente en el extremo carboxilo también poseen propiedades cicatrizadoras de hueso.

Variantes de inserción o de adición son aquellas con el aminoácido insertado inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en la secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado con el grupo \alpha-carboxi o con el grupo \alpha-amino del aminoácido. Las variantes de inserción o de adición también es habitual que se obtengan en los extremos de la secuencia, más habitualmente en el extremo carboxilo.

De las modificaciones listadas anteriormente de la secuencia nativa, se prefieren las substituciones y las adiciones y deleciones en el extremo carboxilo.

Los análogos del polipéptido PTHrP que son útiles para la cicatrización de fracturas como se describe aquí están descritos de forma general, en parte, en la Patente Estadounidense Núm. 5,589,452 y WO 97/07815. Los análogos adicionales incluyen los análogos cíclicos de hPTHrP(1-32), hPTHrP(1-34) y hPTHrP(1-38) conteniendo en N-terminal una secuencia MAP entre las posiciones 22 y 31, y opcionalmente con residuos en las posiciones 13 y 17 y/o 26 y 30 unidos a través de las funciones de la cadena lateral. Se reconocerá por un experto en el campo que pueden realizarse diversas substituciones en las posiciones 13 y 17 que permitirán la ciclación entre estas dos posiciones.

Los análogos de PTHrP de cualquier especie de mamífero, por ejemplo humano, bovino, porcino o de conejo pueden utilizarse para esta invención, siendo preferido el PTHrP humano. Un experto en el campo reconocerá que las variantes de substitución, deleción e inserción de las formas preferidas enumeradas a continuación, de conformidad con los principios aceptados en el campo descritos anteriormente, se encuentran asimismo dentro del alcance de la invención.

Los aspectos preferidos incluyen el uso de análogos de hPTHrP(1-34) con una secuencia MAP en las posiciones 22-31, en particular aquellos que poseen un aminoácido cargado positivamente en la posición 26, por ejemplo, lisina o histidina. Son formas específicas dentro de esta clase:

\hskip0.1cm

1 and = y

2

\vskip1.000000\baselineskip

Otros aspectos preferidos incluyen el uso de análogos de hPTHrP(1-34) con una secuencia MAP en las posiciones 22-31 y que contienen adicionalmente una estructura mono o bicíclica creada por ciclación entre las funciones de la cadena lateral de los residuos aminoacídicos, en particular entre los residuos 13 y 17, o entre los residuos 26 y 30. Las funciones de la cadena lateral son típicamente grupos amino, hidroxi o carboxilo, y la ciclación se produce a través de la formación de un enlace amida o éster. Los residuos con una función amino en la cadena lateral incluyen lisina y ornitina. Los residuos con funciones carboxilo en la cadena lateral incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Formas específicas dentro de esta clase incluyen:

3

4

Otros análogos de hPTHrP útiles en esta invención son las secuencias N-terminales de entre 30 y 50 residuos, preferentemente de 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37 y 1-38, que poseen la secuencia MAP en los residuos 22-31 y que opcionalmente presentan una o más substituciones en las posiciones 5, 13, 17, 19, 26, 30, 32 ó 34. Formas específicas dentro de este grupo incluyen:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

En general, todos los polipéptidos substancialmente homólogos a las formas específicas descubiertas aquí son útiles para los métodos de la invención. Normalmente, los polipéptidos utilizados en la presente invención serán homólogos a las formas específicas descubiertas aquí al menos en aproximadamente un 50%, preferentemente más de un 80%, y más preferentemente más de un 90%, con mayor preferencia al menos en aproximadamente un 95%. La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para la homología será al menos de aproximadamente 20 aminoácidos, normalmente aproximadamente al menos 24 residuos, típicamente al menos aproximadamente 30 residuos y preferentemente entre 32 y 40 residuos.

Los compuestos de la presente invención pueden obtenerse por métodos descritos en las Patentes Estadounidenses Núms. 5,589,452 y WO 96/40193 y WO 97/07815. Los compuestos se obtienen en general mediante síntesis en fase sólida, síntesis en solución o mediante métodos recombinantes que se desarrollan a través del clonaje y expresión de un gen que codifica el polipéptido de interés, métodos todos ellos conocidos de un experto en el campo. La síntesis en fase sólida es preferida para los análogos de PTHrP truncados de cuarenta aminoácidos o menos. Los análogos con cadenas laterales cicladas se preparan en general uniendo el polipéptido completo protegido a la resina, eliminando los grupos protectores y realizando la ciclación con un agente de acoplamiento adecuado, como por ejemplo hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitris(pirrolidino)fosfonio (PyBOP), justo antes de liberar el polipéptido de la
resina.

Los métodos de tratamiento descubiertos aquí pueden utilizarse para la cicatrización de fracturas óseas y osteotomías, incluyendo tanto fracturas de unión como de no unión. Los tipos de fracturas tratables mediante los métodos de esta invención incluyen tanto las fracturas traumáticas como las osteoporóticas, por ejemplo fracturas de cadera, cuello del fémur, muñeca, vértebras, columna, costillas, esternón, laringe y tráquea, radio/cúbito, tibia, rótula, clavícula, pelvis, húmero, pierna, dedos, cara y tobillo. Otros usos incluyen el facilitar las fusiones de articulaciones, por ejemplo fusiones de la columna, tobillo y pie, codo, cadera y artredosis de la cadera, rodilla y hombro. El tratamiento con los análogos de PTHrP como se describe aquí también está indicado en conjunción con procedimientos artroplásticos (incluyendo artroplastias de revisión) de la cadera, rodilla, hombro/codo, etc. La cicatrización del hueso puede mejorarse asimismo en otras situaciones quirúrgicas, como en cirugía craneal y maxilofacial, cirugía dental y bunionectomía. Se ha demostrado que los análogos de PTHrP aceleran la cicatrización tanto en hueso endocondral (Ejemplos 1 y 2) que procede vía la formación callosa cartilaginosa, así como en hueso intramembranoso (Ejemplo 3), que no requiere la formación callosa intermedia. La cicatrización en hueso intramembranoso es particularmente útil en casos en los que la cicatrización de fracturas se ve retrasada, como por ejemplo en diabéticos, fumadores, pacientes geriátricos, pacientes anémicos, y pacientes sometidos a terapia con corticosteroides (en particular glucocorticoides crónicos), AINES crónicos o inmunosupresora.

La dosis particular de un análogo PTHrP requerida para facilitar la cicatrización de fracturas de conformidad con esta invención dependerá de la gravedad del estado, de la ruta de administración y de factores relacionados que serán evaluados por el personal médico a cargo. Normalmente, la posología se encontrará en el intervalo de 0,01 a 10 \mug/kg de peso corporal por día, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 \mug/kg de peso corporal por día. Para una persona de 50 kg, la dosis diaria de ingrediente activo será de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 \mug, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 \mug. Esta dosis puede administrarse en una composición farmacéutica habitual mediante una única administración, mediante aplicaciones múltiples o mediante liberación controlada, tal como sea necesario para lograr los resultados más eficaces. La dosificación se continuará tanto tiempo como sea conveniente desde el punto de vista médico, que dependerá de la gravedad de la lesión y oscilará de unas pocas semanas a varios meses.

Los análogos de PTHrP pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo oralmente (incluyendo subcutáneo, intramuscular y endovenoso), rectalmente, bucalment (incluyendo sublingual), transdérmalmente, pulmonar e intranasalmente. Se describen sistemas de administración pulmonar y respiratorio típicos en las Patentes Estadounidenses Núms. 5,607,915. La administración nasal de los análogos PTHrP se describe en WO 97/07815. Se incluye asimismo en esta invención la administración sistémica de análogos de PTHrP junto con el tratamiento local con un segundo agente cicatrizador de hueso. Los agentes representativos para dicha administración local incluyen las proteínas morfogenéticas de hueso (BMP-2 y BMP-7), proteínas osteogénicas (OP-1), factores de crecimiento tales como TGF-\beta1 y citoquinas como IFN-\beta. Normalmente, estos agentes se administran localmente en diversos excipientes tales como hidroxiapatita y/o carbonato cálcico y amilopectina. La administración sistémica de análogos de PTHrP puede combinarse también con métodos alternativos de cicatrización de fracturas tales como estimulación mecánica o biofísica, por ejemplo eléctrica o por ultrasonidos.

Los análogos de PTHrP se administrarán típicamente en forma de composiciones farmacéuticas combinadas con un excipiente farmacéuticamente aceptable y no tóxico. Tal y como se ha mencionado anteriormente, dichas composiciones pueden prepararse para la administración parenteral (subcutánea, intramuscular o endovenosa), en particular en forma de suspensiones o soluciones líquidas; para la administración oral o bucal, en particular en forma de comprimidos o cápsulas; para la administración intranasal, en particular en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles; y para administración rectal o transdérmica.

Las formulaciones líquidas para la administración parenteral pueden incluir como excipientes agua estéril o solución salina, alquilenglicoles tales como propilenglicol, polialquilenglicoles como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Pueden emplear tampones ligeramente ácidos en intervalos de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. Los tampones adecuados incluyen acetato, ascorbato y citrato en concentraciones que van de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM. Para la administración oral, la formulación puede potenciarse mediante la adición de sales biliares o acilcarnitinas. Las formulaciones para la administración nasal pueden ser sólidas y pueden contener excipientes, por ejemplo lactosa o dextrano, o pueden ser soluciones acuosas u oleosas para su uso en forma de gotas nasales o pulverizador de dosis medida. Las formulaciones nasales particulares incluyen polvos secos adecuados para inhaladores de polvo seco convencionales (DPIs), soluciones líquidas o suspensiones adecuadas para la nebulización y formulaciones de propelente adecuadas para su uso en inhaladores de dosis medida (MDIs). Para la administración bucal los excipientes típicos incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato magnésico, almidón pregelatinizado y similares.

Cuando se formulan para administración nasal, la absorción a través de la membrana mucosal nasal puede mejorarse mediante ácidos surfactantes, tales como por ejemplo ácido glicocólico, ácido cólico, ácido taurocólico, ácido etocólico, ácido deoxicólico, ácido quenodeoxicólico, ácido dehidrocólico, ácido glicodeoxicólico, ciclodextrinas y similares en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 15 por ciento en peso, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 4 por ciento en peso, más preferentemente un 2 por ciento en peso.

La administración de los compuestos de la presente invención al sujeto durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo durante períodos de una semana a un año, puede efectuarse mediante la administración única de un sistema de liberación controlada que contiene suficiente ingrediente activo para el período de liberación deseado. Pueden utilizarse para este propósito diversos sistemas de liberación controlada, como por ejemplo microcápsulas monolíticas o de tipo reservorio, implantes depot, bombas osmóticas, vesículas, micelas, liposomas, parches transdérmicos, dispositivos iontoforéticos y formas de dosificación en inyectable alternativas. La localización en el lugar en el que la liberación del ingrediente activo es deseada es una característica adicional de algunos dispositivos de liberación controlada, que pueden demostrar ser beneficiosos en el tratamiento de determinados transtornos.

Ejemplos Ejemplos de referencia Formulación en comprimido

Los siguientes ingredientes se mezclan intensamente y se comprimen en comprimidos de una sola ranura.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingrediente	Cantidad por comprimido mg
Compuesto de esta invención	400
Almidón de maíz	50
Croscarmelosa sódica	25
Lactosa	120
Estearato magnésico	5

Formulación en cápsula

Los siguientes ingredientes se mezclan intensamente y se introducen en cápsulas de gelatina dura.

Ingrediente	Cantidad por cápsula mg
Compuesto de esta invención	200
Lactosa, secada en spray	148
Estearato magnésico	2

Formulación en suspensión

Los siguientes ingredientes se mezclan para obtener una suspensión para la administración oral.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingrediente	Cantidad
Compuesto de esta invención	1,0 g
Ácido fumárico	0,5 g
Cloruro sódico	2,0 g
Metilparabén	0,15 g
Propilparabén	0,05 g
Azúcar granulado	25,5 g
Sorbitol (solución al 70%)	12,85 g
Veegum K (Vanderbilt Co)	1,0 g
Aromatizante	0,035 ml
Colorante	0,5 mg
Agua destilada	c.s.p. 100 ml

Formulación en inyectable

Los siguientes ingredientes se mezclan para obtener una formulación en inyectable.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingrediente	Cantidad
Compuesto de esta invención	0,2 g
Solución tampón de acetato sódico, 0,4 M	2,0 ml
HCl (1 N) ó NaOH (1 N)	c.s.p. pH adecuado
Agua (destilada, estéril)	c.s.p. 20 ml

Formulación nasal

Los siguientes ingredientes se mezclan para obtener una suspensión para la administración nasal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingrediente	Cantidad
Análogo PTHrP	20 mg/ml
Ácido cítrico	0,2 mg/ml
Citrato sódico	2,6 mg/ml
Cloruro de benzalconio	0,2 mg/ml
Sorbitol	35 mg/ml
Taurocolato o glicolato sódico	10 mg/ml

Ejemplo 1 Cicatrización de fractura de defectos segmentados con análogos de PTHrP

Se empleó una modificación del modelo en rata de defecto femoral segmentado para demostrar que los análogos de PTHrP facilitan la cicatrización de hueso y la reparación de fracturas. (T.A. Einhorn y cols., J. Bone Joint, 66: 274-279 (1984)).

Se mantuvieron ratas adultas Sprague-Dawley de un peso aproximadamente de 300 gramos en Dieta de Roedores de Laboratorio 5001 (PMI Feeds, St. Louis, MO, EE.UU.) y en agua ad libitum. Todas las ratas recibieron únicamente agua durante 12 horas antes de la cirugía. Los animales se anestesiaron antes de la cirugía mediante inyección IP con ketamina (80 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se administró intramuscularmente una única dosis de procaína-penicilina como profilaxis contra la infección.

Se empleó una aproximación lateral al fémur y se fijó una placa de polietileno de alta densidad pre-perforada a lo largo del córtex anterior del fémur. Durante esta colocación el periostio del fémur se raspó extensivamente. Se creó un defecto segmental no crítico de 1 mm de tamaño en la parte media de la diáfisis femoral. La herida se cerró con suturas de nylon y crómicas.

En el postoperatorio, las ratas se colocaron en jaulas con acceso a gránulos de alimento 48 horas post-operación. Los animales se monitorizaron al menos una vez al día y los animales que mostraron cualquier signo de enfermedad fueron examinados y se les administró terapia adecuada cuando era necesario.

Las ratas se dividieron en grupos como se muestra en la Tabla 1, y se administró subcutáneamente bien un vehículo control (solución salina) o un análogo de PTHrP descrito aquí diariamente empezando a partir del día postoperatorio 1. Se realizaron semanalmente análisis radiográficos. Los animales se sacrificaron a las 6 semanas y se compararon mediante radiografía.

Las ratas sedadas se colocaron en posición prona con las patas de atrás rotadas externamente. Se tomaron radiografías seriadas de cada fémur (que cubrían el fémur y el fémur contralateral) semanalmente empezando en la semana postoperatoria 1. Se incluyó en cada radiografía un fantasma control de aluminio de valores de intensidad conocidos para calibración. Cada radiografía se colocó en un tablero de transiluminación y se tomó una fotografía empleando una cámara digital Kodak DCS 420. Estas imágenes se transfirieron a continuación a un computador Gateway 2000 IBM compatible y se digitalizaron empleando software de análisis (Sigma Scan®). Se trazó el contorno del defecto y la densidad media de la área de la osteotomía se midió en los animales tratados en relación con los animales control. La Figura 1 muestra el aumento en la densidad ósea en la osteotomía en los animales tratados en relación con los animales control a intervalos semanales durante las cinco primeras semanas de tratamiento. La densidad promedio de la osteotomía se comparó también con la densidad promedio del fémur contralateral para cada lectura semanal. La figura 2 muestra la relación de densidad radiográfica tras seis semanas. La comparación de estas densidades óseas mostró que los análogos de PTHrP presentaban un efecto de cicatrización de hueso. Tras el sacrificio (6 semanas) los fémures (experimental y contralateral) se diseccionaron y se despojaron de tejidos blandos. Se tomaron radiografías de grano fino de los fémures en el plano lateral. La osteotomía se consideraba unida cuando existía una continuidad ósea del fémur a lo largo de más del 25% del diámetro de la sección del defecto. La comparación de fémures de animales tratados respecto a animales control mostró que los análogos PTHrP aceleraban la cicatrización de hueso y la reparación de fracturas. La Figura 3 muestra una radiografía representativa de animales control (Fig. 1A) y tratados (Fig. 1B).

TABLA 1

Grupo	Compuesto	Administración	Núm. de animales	Sacrificio
1	Control	subcutánea	10	Seis semanas
2	Análogo	Subcutánea	10	Seis semanas
	PTHrP B
3	Análogo	subcutánea	10	Seis semanas
	PTHrP C

Ejemplo 2 Cicatrización de hueso en el modelo de fractura de defecto cerrada con análogos de PTHrP

El modelo de fractura cerrada utilizado es el modelo Bonnarens/Einhorn. (F. Bonnarens y T.A. Einhorn, J. Orthopaedic Research, 2: 97-101 (1984)). Las ratas utilizadas son como en el Ejemplo 1. En este modelo, una varilla intramedular se coloca retrógada a través del fémur distal mediante una aproximación pararotuliana medial. La artrotomía se cierra seguidamente con suturas no reabsorbibles y la varilla intramedular se deja en el sitio. Se crea seguidamente una fractura transversal cerrada mediante un dispositivo de pinzamiento de tres puntos a medida. Los animales se monitorizan y se realizan análisis radiográficos como en el Ejemplo 1. Los análogos de PTHrP aceleraron la cicatrización de hueso y la reparación de fracturas en este modelo en animales tratados respecto a animales control.

Ejemplo 3 Cicatrización de hueso intramembranoso con análogos de PTHrP

Se anestesiaron de forma general conejos y se sometieron a cirugía para crear cuatro defectos de superficie, uno distal en cada fémur y uno proximal en cada tibia. Se realizó una incisión quirúrgica lateral posterior que medía aproximadamente 3 cm para exponer el cóndilo femoral lateral distal. El hueso proximal a la articulación de la rodilla se expuso subperiostealmente y se realizó un agujero de 5 mm con un taladro, manteniendo la punta del taladro fría con irrigación constante. La herida se irrigó con solución salina normal. El tejido profundo se cerró con una sutura crómica 3-0 corriente seguido del cierre de la capa subticular con una sutura de nylon 3-0 corriente y de tres a cuatro suturas de acero inoxidable interrumpidas. Se realizó una segunda incisión de 3 cm a lo largo de la tibia proximal medial y se realizó un agujero de 5 mm con un taladro en la tibia medial proximal. La herida se cerró como se ha descrito previamente. La totalidad del proceso se repitió en la extremidad contralateral.

Se prepararon soluciones madre de análogo C de PTHrP (MAP_{1-10})^{22-31}His^{26}hPTHrP(1-34)NH_{2}, y análogo D de PTHrP (MAP_{1-10})^{22-31}hPTHrP(1-34)NH_{2} a 800 \mug/ml mediante filtración estéril a través de un filtro de 0,22 micras y se diluyeron en vehículo hasta 20 \mug/ml o hasta 100 \mug/ml justo antes de la administración. El vehículo consistía en manitol 30 mg/ml, sacarosa 30 mg/ml, Tween™ 80 0,12 mg/ml, ácido acético 0,17 mg/ml y acetato sódico trihidrato 2,33 mg/ml. Se administraron análogos de PTHrP a 2 \mug/kg/día o a 10 \mug/kg/día diariamente mediante inyección subcutánea en los animales tratados quirúrgicamente.

Los animales se estudiaron por rayos X semanalmente durante el estudio. Se realizaron mediciones densitométricas empleando un escáner de transiluminación y software MetaMorph™ (Universal Imaging, West Chester, PA). Las radiografías de las extremidades inferiores se realizaron en rotación interna y externa en el día postoperatorio 10 y 21. Los animales se sacrificaron en el día postoperatorio 30. Al final del estudio los animales se sacrificaron por sobredosis de pentobarbital, se recogieron los tejidos de los fémures y tibias izquierdo y derecho y se analizaron mediante análisis histológico por rayos X.

Los animales tratados con los análogos de PTHrP C y D mostraron una formación de hueso intramembranoso acelerada respecto a los animales tratados con vehículo. Los resultados para el análogo de PTHrP D se muestran en las Figuras 4A y 4B para el fémur y la tibia, respectivamente. En el día 21 no había cicatrización completa tanto en los defectos tibiales como femorales en los animales tratados con control, mientras que el 40% de los defectos tibiales y femorales había cicatrizado en el grupo tratado con dosis baja. En el mismo tiempo, el 75% de los defectos tibiales y el 50% de los defectos femorales había cicatrizado en el grupo de dosis elevada. En el momento del sacrificio, el análisis radiográfico de los especímenes confirmó la estimulación de la cicatrización en los animales tratados con análogo de PTHrP, con más del 85% de los defectos tibiales en la dosis elevada llenos con tejido mineralizado, mientras que menos del 10% de los defectos tibiales de los controles estaban llenos en el momento del sacrificio (p < 0,01). De forma similar, se observó un mayor porcentaje de llenado en los defectos femorales tratados con PTHrP que en los defectos femorales tratados con control (p < 0,01).

Ejemplo 4 Estimulación de la cicatrización de hueso en el modelo de osteotomía cubital

El objetivo de este experimento fue demostrar que los análogos de PTHrP pueden aumentar la fuerza biomecánica (Parte I) y la cinética de cicatrización (Parte II) en el contexto de terapia sistémica con corticosteroides en un modelo de osteotomía en conejos.

Se utilizaron en todos los experimentos conejos New Zealand White adultos machos. En la Parte I, diez conejos se dividieron en dos grupos iguales y en la Parte II, veinte conejos se dividieron en dos grupos iguales. Se crearon defectos de tamaño no crítico (1 mm) bilateralmente en cada conejo. Desde dos meses antes de la cirugía hasta seis semanas post-operación, todos los conejos recibieron inyecciones subcutáneas diarias de o bien prednisona (0,15 mg/kg) en agua estéril (grupo experimental) o solución salina estéril (grupo control). Empezando en el primer día postoperatorio, se administraron al grupo experimental inyecciones subcutáneas diarias del análogo PTHrP D (0,01 mg/kg), mientras que el grupo control recibía inyecciones de solución salina normal. En la Parte I, los animales se sacrificaron a las seis semanas tras la creación de la osteotomía. En la Parte II, los animales se sacrificaron una vez que la unión radiográfica se había alcanzado bilateralmente, o en los casos de no unión a las diez semanas tras la operación.

En ambos grupos de experimentos se analizaron las intensidades radiológicas y la zona de cicatrización una semana de cada dos empezando dos semanas (Parte I) o cuatro semanas (Parte II) tras la operación. Se tomaron radiografías seriadas de los miembros anteriores y se digitalizaron, cuantificándose el área de hueso empleando software de análisis de imagen (Sigma Scan Pro). Se empleó la fotodensitometría para cuantificar el contenido mineral del nuevo hueso formado en los puntos de osteotomía y de formación de callo. Tras el sacrificio se tomaron radiografías faxitrón de alta resolución de ambas extremidades en los planos anteroposterior y lateral, lo que permitió el análisis del tamaño y dimensiones del callo de fractura.

Resultados (Parte I)

Nueve de diez extremidades tratadas con análogo PTHrP D alcanzaron unión en seis semanas, mientras únicamente dos de diez lograron unión en los controles tratados con vehículo. Estos resultados se muestran en la Figura 5. A las seis semanas tanto los faxitrones anteroposteriores como laterales mostraron intensidades significativamente aumentadas en los puntos de osteotomía en las extremidades tratadas respecto a las controles. De forma similar, la intensidad de las diáfisis cubitales tanto proximales como distales fue significativamente mayor en las extremidades tratadas. Lateralmente, la intensidad de los callos externos fue también mayor en las extremidades tratadas. Biomecánicamente, la fuerza torsional de las extremidades tratadas fue significativamente mayor que la de las extremidades control tratadas con vehículo, tanto en términos de rigidez como de torsión máxima.

Resultados (Parte II)

A las cuatro semanas, las extremidades tratadasmostraron una intensidad radiográfica mayor que la de las extremidades control en el lugar de la osteotomía (p < 0,01) así como en los callos externos y en las diáfisis cubitales. La área combinada de los callos de las extremidades tratadas fue mayor (p < 0,05) y se observó una tendencia que indicaba que el sitio de la osteotomía disminuía de tamaño. A las seis semanas, la radiografía Aminoácido in vivo demostró una tendencia a una intensidad aumentada en el lugar de la osteotomía de las extremidades tratadas en comparación con las extremidades control, aunque no se observaron diferencias en la intensidad o área de los callos. Radiográficamente, todas las extremidades tratadas con análogos de PTHrP se consideraron como unidas, y todos estos animales se sacrificaron a las seis semanas. A las ocho semanas, cuatro extremidades adicionales (dos animales) alcanzaron la unión radiográfica y se sacrificaron. A las diez semanas el resto de los animales fue sacrificado, puesto que estas extremidades no mostraban progresión radiográfica hacia la cicatrización respecto al período de cuatro semanas precedente por lo que se clasificaron como no uniones. Las extremidades tratadas con análogo de PTHrP mostraron una intensidad radiográfica mayor en el lugar de la osteotomía (p < 0,05), así como la diáfisis del cúbito y la área callosa. La área de la osteotomía fue significativamente menor en las extremidades tratadas con análogo de PTHrP que en las extremidades tratadas con vehículo. De este modo, en este modelo de retraso en la cicatrización inducido con corticosteroides, el tratamiento con análogo de PTHrP resultó en una tasa completa de unión a las seis semanas, mientras que el 75% de las extremidades no tratadas no mostraba tendencia a la unión a las diez semanas.

Claims

1. El uso de un análogo polipeptídico del péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) y de sales del mismo, en donde dicho análogo es un truncado N-terminal de 30 a 50 residuos aminoácidos, en donde los residuos aminoacídicos 22-31 de dicho análogo de PTHrP forman una \alpha-hélice anfipática para la preparación de un medicamento para la cicatrización del hueso y reparación de la fractura, en donde la \alpha-hélice anfipática es

: Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu

: y Xaa es un residuo aminoácido con carga positiva.

2. El uso de la reivindicación, en el que el análogo de PTHrP se administra por vía nasal.

3. El uso de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la administración localizada de un segundo agente cicatrizador de hueso a la fractura.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que la fractura se encuentra en hueso intramembranoso.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que el análogo dePTHrP se administra sistémicamente.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que Xaa es lisina o histidina.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que el análogo de PTHrP es:

7

8. El uso de la reivindicación 1, en el que el análogo de PTHrP posee al menos dos residuos aminoacídicos unidos a través de sus cadenas laterales uno con otro.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que los residuos aminoacídicos unidos se encuentran en las posiciones 13 y 17 ó en las posiciones 26 y 30.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que el residuo aminoacídico en la posición 17 es un ácido aspártico.

11. El método o uso de la reivindicación 12, en el que los análogos de PTHrP son:

8

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el análogo PTHrP es una forma truncada N-terminal de 30 a 50 residuos aminoacídicos opcionalmente substituida en las posiciones 5, 13, 17, 19, 26, 30, 32 y/o 34.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que el análogo de PTHrP es:

9