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ES2242941T3 - Celulas madre indiferenciadas programables de origen monocitario, su obtencion y uso. - Google Patents

Celulas madre indiferenciadas programables de origen monocitario, su obtencion y uso.

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Publication number
ES2242941T3
ES2242941T3 ES03727271T ES03727271T ES2242941T3 ES 2242941 T3 ES2242941 T3 ES 2242941T3 ES 03727271 T ES03727271 T ES 03727271T ES 03727271 T ES03727271 T ES 03727271T ES 2242941 T3 ES2242941 T3 ES 2242941T3
Authority
ES
Spain
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cells
stem cells
programmable
undifferentiated
medium
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES03727271T
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Karl Friedrich Kremer
Fred Fandrich
Maren Ruhnke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Original Assignee
Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=30116586&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2242941(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE10214095A external-priority patent/DE10214095C1/de
Application filed by Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH filed Critical Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2242941T3 publication Critical patent/ES2242941T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
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Abstract

Proceso para la producción de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario humano, CARACTERIZADO PORQUE consiste en: (a) Multiplicar los monocitos de sangre humana aislada en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF, ; (b) Cultivar los monocitos durante o después de la etapa a) con un medio de cultivo que contiene IL-3; y (c) Obtener las células madre humanas adultas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.

Description

Células madre indiferenciadas programables de origen monocitario, su producción y uso.
La invención se refiere a células madre adultas indiferenciadas programables, derivadas de monocitos humanos, así como su producción y su uso para la producción de células y tejidos corporales. Según una forma de realización particularmente preferida de la invención, estas células son células madre humanas autólogas, es decir que la célula de origen monocitario procede del mismo paciente que debe ser tratado con la célula madre producida a partir de la célula de origen o con las células corporales producidas a partir de esta célula madre.
En el estado actual de la técnica, el término "células madre" designa las células que:
(a) tienen capacidad de autorrenovación y
(b) tienen capacidad de formar por lo menos uno y en muchos casos numerosos tipos de células especializadas gracias a su capacidad de división asimétrica (véase Donovan, P.J., Gearhart, J., Nature 414: 92-97 (2001)). El término "pluripotente" designa las células madre que pueden diferenciarse esencialmente en todos los tipos de células posibles del cuerpo humano y animal. Hasta ahora, tales células madre sólo se pueden obtener a partir de tejidos embrionarios o de carcinomas embrionarios (tumor testicular) (véase Donovan, P.J., Gearhart, J., véase más arriba). El uso de células madre embrionarias ha sido objeto de muchos debates públicos, especialmente en Alemania y es considerado extremadamente problemático. Además de la problemática ética y jurídica relacionada con las células madre embrionarias, también el uso terapéutico de tales células se encuentra con dificultades. En la naturaleza, las células madre embrionarias proceden de organismos donadores, que son heterólogas con respecto a los potenciales receptores de las células o tejidos diferenciados (denominados en lo sucesivo células diana o tejidos diana somáticos), desarrollados a partir de estas células. Por tanto, es previsible que tales células diana inicien en los receptores potenciales una respuesta inmunológica inmediata de rechazo.
Las células madre también se pueden aislar de diferentes tejidos de individuos adultos, es decir diferenciados. En el estado actual de la técnica, tales células madre se denominan "células madre adultas multipotentes". Desempeñan un papel en la regeneración de tejidos y en la hemostasis corporal. La diferencia sustancial entre las células madre embrionarias pluripotentes y las células madre adultas multipotentes radica en la cantidad de tejidos diferenciados que se pueden obtener de las respectivas células. La causa de esto es, probablemente, que las células madre pluripotentes proceden de espermatozoides o de células que pueden producir esperma, mientras que las células madre adultas multipotentes proceden del cuerpo o del soma de individuos adultos (véase Donovan, P.J., Gearhart, J., véase más arriba, pág.94), que no son aptas para producir esperma.
Sin embargo, la verdadera problemática en torno a la obtención y el uso de células madre adultas reside en la rareza de estas células. Por ejemplo, en la médula ósea sólo se encuentran células madre en una proporción de 1:10.000, en la sangre periférica, de 1:250.000 y en el hígado en una proporción de 1:100.000. Por lo tanto, la obtención de tales células madre es muy trabajosa y gravosa para el paciente. Por otra parte, hasta ahora no es posible generar grandes cantidades de células, como las que se requieren para la terapia clínica, con gastos aceptables.
A esto se contrapone una demanda constantemente creciente de posibilidades de tratamiento de ingeniería de tejidos para tejidos destruidos o de terapias celulares con el fin de sustituir células epiteliales, musculares, de los músculos cardíacos, del hígado, de islote, nerviosas, neuronas, óseas, de cartílagos, endotelios y adiposas.
En este contexto, es determinante el desarrollo previsible del perfil de edad y enfermedades de la población del mundo occidental, lo que lleva a esperar un cambio drástico en los próximos diez años en el sector de la sanidad de la población de Europa occidental, incluyendo Estados Unidos y Canadá. Sólo en la República Federal de Alemania, el desarrollo demográfico prevé para el año 2015, un aumento de 21% de la población de 45-64 años de edad y de 26% en la franja de edades de más de 65 años. Esto permite suponer un cambio de la estructura de la población de pacientes y de la variedad de enfermedades que necesitarán tratamiento. Previsiblemente, aumentará el número de enfermedades del sistema cardio-vascular (hipertensión, infarto de miocardio), las enfermedades vasculares por ateroesclerosis y afecciones del metabolismo, enfermedades metabólicas como diabetes mellitus, enfermedades metabólicas hepáticas, enfermedades funcionales renales, así como enfermedades del esqueleto óseo y los cartílagos provocadas por degeneración condicionada por la edad y enfermedades degenerativas del cerebro por pérdida de células neuronales y gliales y requerirá conceptos de tratamiento innovadores.
Estos datos explican los inmensos esfuerzos nacionales e internacionales de investigación y desarrollo por parte de especialistas para obtener células madre que puedan ser programadas para actuar como células diferenciadas características de tejidos (hígado, huesos, cartílagos, músculos, piel, etc.).
Por lo tanto, el objeto de la invención es obtener células madre adultas cuya generación no provoque problemas éticos y/o jurídicos, que se puedan obtener rápidamente para su uso en terapias programadas en las cantidades necesarias y con costes de fabricación aceptables y que al ser usadas como "terapéutico celular" no provoquen o sólo provoquen efectos secundarios insignificantes en el paciente tratado en cuanto a rechazo celular e inducción de tumores, especialmente de tumores malignos.
Según la invención, este objeto se resuelve por medio de la preparación de células indiferenciadas programables a partir de monocitos humanos que a continuación se denominan "células madre" para los propósitos de la invención. El término "indiferenciación" es conocido para el experto en la técnica correspondiente, véase por ejemplo Weissman I.L., Cell 100: 157-168, Figura 4, (2000). Significa la restitución de una célula corporal adulta ya especializada (diferenciada) al estado de célula madre, es decir de una célula que a su vez puede ser convertida (programada) en varios tipos de células. Sorprendentemente se ha comprobado que el procedimiento según la invención produce la indiferenciación de monocitos. Las células madre producidas de esta manera pueden ser convertidas (programadas) en numerosas células diana o tejidos diana diferentes, véanse los ejemplos. Las células madre según la invención expresan, además del antígeno de superficie CD14, característico de los monocitos diferenciados, por lo menos uno, preferentemente dos o tres, de los marcadores de pluripotencia típicos CD90, CD117, CD123 y CD135. De manera particularmente preferida, las células madre producidas según la invención expresan tanto el antígeno de superficie CD14 como también los cuatro marcadores de pluripotencia CD90, CD117, CD123 y CD135, véase ejemplo 2, tabla 1. Preferentemente, las células madre humanas de la invención expresan el antígeno de superficie monocito-específico asociado a la membrana CD14 y por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente Más preferentemente, las células madre de la invención expresan un antígeno CD14 en combinación con por lo menos el marcador de pluripotencia CD123 y/o CD135. Menos de 3% y preferentemente menos de 1% de las células madre según la invención expresan el antígeno CD34. Más preferentemente, ninguna de estas células madre de la invención expresan el antígeno CD34.De esta manera, se obtienen por primera vez células madre adultas que en poco tiempo pueden ser reprogramadas en tejidos, preferentemente autólogos.
La generación de las células madre de la invención es absolutamente inofensiva para el paciente y, en caso de utilización autóloga, es comparable a una autotransfusión. La cantidad de células madre necesarias para las opciones terapéuticas habituales (véase más arriba) (10^{8} a 10^{9} células) puede prepararse de manera rentable en los 10 a 14 días posteriores a la extracción de la sangre. Por otra parte, el producto celular previsto para la terapia no provoca problemas inmunológicos, es decir de rechazo en tratamientos autológicos, ya que preferentemente las células y el receptor son genéticamente idénticos.
Asimismo, las células madre de la invención demostraron no ser peligrosas en cuanto a la formación de malignomas en experimentación y cultivos animales, un resultado que sólo se debe al origen monocitario de la célula, de la cual derivan las células madre de la invención.
Las etapas esenciales del procedimiento según la invención para la producción de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario humano comprenden:
(a)
Aislar monocitos de sangre humana;
(b)
Multiplicar los monocitos en un recipiente de cultivo adecuado que contiene un medio de cultivo celular, el cual contiene el factor estimulante de colonias de macrófagos (denominado a continuación, M-CSF) y
(c)
Cultivar los monocitos en presencia de interleucina 3 (IL-3);
(d)
Obtener las células madre humanas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.
De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida del procedimiento se agrega M-CSF y IL-3 simultáneamente al medio de cultivo celular en la etapa b).
Sin embargo, también es posible, solo inicialmente, agregar M-CSF al medio de cultivo celular en la etapa b) con el fin de multiplicar los monocitos y agregar posteriormente IL-3 al medio de cultivo celular.
Finalmente, el proceso de la etapa b) puede desarrollarse de manera tal que, primeramente se multiplican los monocitos en un medio de cultivo celular que solamente contiene M-CSF, luego se separa el medio de las células y, a continuación, se usa un segundo medio de cultivo celular que contiene IL-3.
De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, el medio de cultivo de la etapa b) se separa de las células adheridas en el fondo del recipiente de cultivo y se obtienen las células madre humanas indiferenciadas programables, desprendiendo y aislando las células del fondo.
De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, las células se cultivan además luego en presencia de un compuesto de azufre. El cultivo puede realizarse en una etapa separada del proceso, a continuación de la etapa de cultivo b) descrita más arriba. Sin embargo, también puede llevarse a cabo en la etapa b), agregando también el compuesto de azufre al medio de cultivo, preferentemente al iniciar el cultivo.
Sorprendentemente el proceso de la invención provoca la indiferenciación de los monocitos, con lo cual las células madre adultas resultantes de la indiferenciación expresan, además del antígeno de superficie CD14, típico de los monocitos diferenciados, también por lo menos uno o más, preferentemente todos los marcadores de pluripotencia CD90, CD117, CD123 y CD135 (véase tabla 1). Preferentemente, las células madre de la invención expresan el antígeno de superficie monocito-específico asociado a la membrana CD14 y por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente, las células madre de la invención expresan en antígeno CD14 en combinación con por lo menos el marcador de pluripotencia CD123 y/o CD135. Menos de 3% y preferentemente menos de 1% de las células madre de la invención expresan el antígeno CD34. Con especial preferencia, ninguna de las células madre de la invención expresan el antígeno CD34.
La expresión de los respectivos marcadores (antígenos de superficie) puede probarse con anticuerpos comercializados que tengan especificidad contra los respectivos antígenos que se deben detectar y usando procedimientos de inmunoensayo habituales, véase ejemplo 2.
Dado que durante el proceso de multiplicación e indiferenciación las células se adhieren al fondo del respectivo recipiente de cultivo, es necesario separar las células del medio de cultivo de la etapa b) y desprenderlas del fondo después de terminar la indiferenciación. Según una forma de realización preferida de la invención, se desecha el sobrenadante del cultivo celular antes de desprender las células adheridas al fondo y, a continuación, se realiza preferentemente un lavado de las células adheridas con un medio de cultivo fresco. Después del lavado se agrega nuevamente medio de cultivo fresco sobre las células adheridas en el fondo, y luego se procede a desprenderlas del fondo (véase ejemplo 13).
Según una forma de realización preferida, las células se ponen en contacto con un disolvente orgánico biológicamente aceptable, al final de la etapa c) y antes de la etapa d). El disolvente orgánico, biológicamente aceptable puede ser un alcohol con 1-4 átomos de carbono, prefiriéndose el uso de etanol.
En otra forma de realización, al final de la etapa c) y antes de la etapa d), las células se ponen en contacto con la fase de vapor del disolvente orgánico biológicamente aceptable.
Por otra parte, el desprendimiento también puede llevarse a cabo de manera mecánica, aunque se prefiere un procedimiento desprendimiento enzimático, por ejemplo con tripsina.
Las células madre indiferenciadas programables obtenidas de esta forma, que flotan libremente en el medio pueden ser llevadas directamente al proceso de reprogramación o permanecer algunos días en el medio de cultivo; en este último caso puede agregarse al medio preferentemente una citoquina o LIF (factor inhibidor de leucemia), para evitar la pérdida prematura de la capacidad de programación (véase Donovan, P. J., Gearhart, J., véase más arriba, página 94). Finalmente, las células pueden ser congeladas para ser almacenadas sin perder su capacidad de programación.
Las células madre según la invención se diferencian de las células madre pluripotentes de origen embrionario conocidas hasta ahora y de las células madre adultas conocidas de diferentes tejidos porque, además del antígeno de superficie monocito-específico asociado a la membrana CD-14 tienen por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por CD90, CD117, CD123 y CD135 en su superficie.
Preferentemente, las células madre de la invención expresan el antígeno de superficie monocito-específico asociado a la membrana CD14 y por lo menos un marcador de pluripotencia del grupo formado por CD117, CD123 y CD135. Más preferentemente, las células madre de la invención expresan el antígeno CD14 en combinación con por lo menos el marcador de pluripotencia CD123 y/o CD135. Menos de 3% y preferentemente menos de 1% de las células madre según la invención expresan el antígeno CD34. Con especial preferencia ninguna de estas células madre de la invención expresan el antígeno CD34.
Las células madre producidas de acuerdo con el procedimiento de la invención pueden ser reprogramadas y convertidas en cualesquiera células corporales. En el estado actual de la técnica se conocen procedimientos para reprogramar células madre, véase por ejemplo Weissman I.L., Science 287: 1442-1446 (2000) y Insight Review Articles Nature 414: 92-131 (2001), así como el manual "Methods of Tissue Engineering", Ed. Atala, A., Lanza, R.P., Academic Press, ISBN 0-12-436636-8; Library of Congress, Tarjeta Nº 200188747.
Las células diana y/o tejidos diana somáticos, aislados y diferenciados obtenidos por reprogramación de las células madre según la invención llevan también el marcador CD14 de diferenciación asociado a la membrana de los monocitos.
Además, menos de 3%, preferentemente menos de 1% de estas células diana y/o tejidos diana somáticos según la invención expresan el antígeno CD34. Muy preferentemente, ninguna de estas células o tejidos expresan el antígeno CD34.
Como se muestra en el ejemplo 11, los hepatocitos que derivan de las células madre según la invención expresan el marcador de superficie CD14, típico de los monocitos, mientras que simultáneamente producen la proteína albúmina, característica de los hepatocitos. Los hepatocitos derivados de las células madre según la invención son, por lo tanto, diferenciables de los hepatocitos naturales. De la misma manera, se comprobó el marcador de superficie CD14 asociado a la membrana en células productoras de insulina derivadas de células madre según la invención (ejemplo
9).
En una forma de realización de la invención, las células madre indiferenciadas programables se usan para la producción in vitro de células diana y tejidos diana (véase ejemplos). También son objeto de la presente invención, por lo tanto, las células de tejidos aisladas diferenciadas, que fueron obtenidas por diferenciación (reprogramación) de las células madre según la invención, y que llevan el antígeno de superficie CD14 asociado a la membrana.
Preferentemente, las células madre según la invención se diferencian in vitro de manera sencilla y fiable para dar las células diana deseadas, tales como por ejemplo adipocitos (véase ejemplo 6), células neuronales y gliales (véase ejemplo 3), células endoteliales (véase ejemplo 5), queratinocitos (véase ejemplo 8), hepatocitos (véase ejemplo 7) y células de islote (véase ejemplo 9, Islote de Langerhans), cultivando las células madre en un medio que contiene el sobrenadante del medio de cultivo en el que se han incubado las respectivas células diana y/o fragmentos de las mismas (véase ejemplos 6 a 8). Este sobrenadante se denominará en lo sucesivo, "medio acondicionado por células diana".
Por lo tanto, para diferenciar (reprogramar) las células madre indifereciadas de la invención puede llevarse a cabo el siguiente procedimiento:
a) Triturar tejido que contiene las células diana deseadas o que está formado de las mismas;
b) obtener las células de tejidos (células diana) y/o fragmentos de las mismas;
c) incubar las células diana y/o fragmentos de las mismas en un medio de cultivo apropiado;
d) recoger el sobrenadante del medio de cultivo durante y después de la incubación como medio acondicionado por células diana; y
e) se dejan crecer las células madre en presencia del medio acondicionado por células diana para reprogramar/diferenciar las células madre indiferenciadas.
Los medios de cultivo celulares estándar en las células diana o tejido diana deseados pueden usarse como medio de cultivo (véanse ejemplos). Preferentemente los medios contienen factores de crecimiento, como por ejemplo factor de crecimiento epidérmico.
La incubación de las células diana y/o fragmentos de las mismas ("pellet celular") puede ser de 5 a 15, preferentemente de 10 días. Preferentemente se retira el sobrenadante, es decir, el medio acondicionado por células diana después de 2 a 4 días en cada caso y se reemplaza por un medio fresco. Los sobrenadantes obtenidos de esta forma pueden filtrarse en forma estéril por separado o pueden ser reunidos y almacenados a aproximadamente 20ºC o pueden usarse directamente para programar células madre. Como se ha descrito anteriormente, la programación de las células madre para obtener las células diana deseadas se realiza dejando crecer células madre en presencia del medio acondicionado con las respectivas células diana (véase ejemplos). Preferentemente el medio de crecimiento contiene adicionalmente un factor de crecimiento específico de las células diana, tal como por ejemplo el factor de crecimiento de hepatocitos o el factor de crecimiento de queratinocitos (véase ejemplos).
En una forma de realización de la invención, las células madre indiferenciadas programables según la invención se usan per se para la producción de un compuesto farmacéutico adecuado para la producción in vivo de células diana y tejidos diana.
Tales preparados farmacéuticos pueden contener las células madre según la invención suspendidas en un medio fisiológicamente aceptable. Los medios apropiados son, por ejemplo, PBS (solución salina tampón fosfato) o suero fisiológico con un 20% de solución de albúmina humana y similares.
Estos preparados farmacéuticos contienen células madre indiferenciadas programables vitales según la invención, que tienen en su superficie el marcador CD14 y por lo menos otro de los marcadores multipotentes de células madre CD90, CD117, CD123 y/o CD135, en una cantidad de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50%, preferentemente 60 ó 70%, con especial preferencia 80 ó 90% y muy preferentemente 100%, con respecto al total de células presentes en el preparado, y opcionalmente, otros adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las preparaciones de células madre pueden contener células madre indiferenciadas programables vitales según la invención en su superficie que presentan el marcador de superficie CD14 y por lo menos otro de los marcadores pluripotentes de células madre CD90, CD117, CD123 y/o CD135, en una cantidad de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 ó 59%, preferentemente por lo menos 60%, con respecto al total de células presentes en el preparado; preferentemente, las suspensiones de células están contenidas en un medio de cultivo o transporte tolerable para las células, como por ejemplo PBS o RPMI, etc., o se prefieren preparaciones celulares congeladas en un medio de almacenamiento apropiado como por ejemplo RPMI con 50% solución de albúmina humana y 10% DMSO.
La cantidad de células vitales y por lo tanto la proporción de estas en las composiciones mencionadas anteriormente puede ser determinada ópticamente usando técnicas de exclusión con coloración con azul de triptano, ya que con esta coloración, las células vitales se pueden diferenciar ópticamente de las células no vitales.
Para la aplicación clínica, por regla general, es irrelevante que una parte de las células presentes en el preparado farmacéutico no cumpla los criterios de la invención, correspondientes a las células madre indiferenciadas programables, con la condición de que se encuentre presente una cantidad suficiente de células madre funcionales. Sin embargo, también es posible eliminar las células no indiferenciadas de tales preparados mediante procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica, con los marcadores de superficie típicos de las células indiferenciadas de la invención, para que los preparados contengan las células deseadas en forma esencialmente pura. Un ejemplo de proceso apropiado es el "Immuno magnetic bead sorting", véase Romani y col., J. Immunol. Methods 196: 137-151 (1996).
Además, al ponerse en contacto directo con un conjunto de células de un tipo celular específico, las células madre poseen, in vivo, la capacidad de diferenciarse espontáneamente y convertirse en células de ese tipo. En el estado de la técnica se conocen procedimientos para la producción de tejidos usando células rediferenciables o cuya diferenciación puede cambiarse (ingeniería de tejidos). Por ejemplo, Wang, X. y col. ("Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted adult mouse pancreatic cells" Am. J. Pathol. 158 (2): 571-579 (2001)) demostraron que hasta determinadas células adultas del páncreas del ratón están en condiciones de convertirse en hepatocitos que pueden compensar completamente el defecto metabólico en ratones FAH- (fumaroilacetoacetato hidrolasa) deficientes. Otro ejemplo son los experimentos de Lagasse y col., "Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo", Nature Medicine, 6 (11): 1229-1234 (2000). Los autores han demostrado que células madre hematopoyéticas de la médula ósea están en condiciones de convertirse en hepatocitos que pueden compensar luego el defecto metabólico, después de haber sido transferidas in vivo a ratones FAH-deficientes; véase también el artículo general de Grompe M., "Therapeutic Liver Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Diseases" Hum. Cell, 12: 171-180 (1999).
Entre las formas de aplicación particularmente preferidas para la diferenciación in vivo de las células madre indiferenciadas según la invención se incluyen la inyección, infusión e implantación de células madre en un conjunto de células específico del cuerpo, para lograr que las células madre se diferencien allí por contacto directo con el conjunto de células y se conviertan en este tipo de células. Para la inyección o infusión, las células pueden administrarse en PBS ("solución salina tampón fosfato").
Entre los ejemplos de indicaciones relevantes en este contexto mencionaremos: cirrosis hepática, insuficiencia pancreática, insuficiencia renal aguda o crónica, hipofunciones hormonales, infarto cardíaco, embolia pulmonar, apoplejía cerebral y daños cutáneos.
Por lo tanto, una forma de realización preferida de la invención es el uso de las células madre indiferenciadas programables para la producción de diferentes composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de cirrosis hepática, insuficiencia pancreática, insuficiencia renal aguda o crónica, hipofunciones hormonales, infarto cardíaco, embolia pulmonar, apoplejía cerebral y daños cutáneos.
Existen numerosos trabajos referidos al uso terapéutico de las células diana que se pueden obtener a partir de las células madre según la invención (véase arriba, Science 287: 1442-1446 (2000) y Nature 414: 92-131 (2001)).
Otra aplicación preferida es la inyección de células madre indiferenciadas según la invención en el peritoneo, para que se diferencien allí por influencia de las células circundantes, en células peritoneales. Estas células pueden asumir una función renal en la diálisis peritoneal de pacientes con insuficiencia renal gracias a su membrana semipermeable, y segregar sustancias renales en el peritoneo, desde donde se las elimina a través de la diálisis.
Por lo tanto, también son objeto de la invención las células diana y/o tejidos diana somáticos diferenciados y aislados que se obtienen por reprogramación de las células madre y que se caracterizan por el antígeno CD14 asociado a la membrana, del que se excluyen los monocitos humanos. Estas células diana y/o tejidos diana somáticos contienen preferentemente adipocitos, neuronas y células gliales, células endoteliales, queratinocitos, hepatocitos y células de islote.
Las células también pueden ser introducidas directamente en los órganos que se deben reconstruir. La introducción puede llevarse a cabo por medio de estructuras de matriz que se recubren con capas de correspondientes células diferenciadas o células capaces de diferenciarse. Las estructuras de matriz son, por regla general, biodegradables, de manera que desaparecen del cuerpo cuando las células recién introducidas se incorporan en las células existentes. Desde este punto de vista, por ejemplo, los transplantes celulares, preferentemente autólogos, en forma de células de islote, hepatocitos, adipocitos, células cutáneas, células musculares, de los músculos cardíacos, nerviosas, óseas, endocrinas, etc. deben tenerse en cuenta para la reconstrucción, por ejemplo después de resección quirúrgica parcial de un órgano, para la reparación, por ejemplo después de un trauma o para aplicaciones de apoyo, por ejemplo en caso de falta o deficiencia de la función de un órgano.
Las células madre según la invención y las células diana provenientes de las mismas también pueden usarse para recubrir materiales implantables, a fin de aumentar la biocompatibilidad. Por lo tanto, también son un objeto de la invención, los materiales implantables recubiertos con las células madre indiferenciadas programables o las células diana y/o tejidos diana somáticos. Según una forma de realización de la invención, estos materiales implantables son prótesis. En una forma de realización especialmente preferida, estas prótesis son válvulas cardíacas, prótesis vasculares, prótesis óseas y articulares.
Los materiales implantables también pueden ser vehículos artificiales y/o biológicos que comprenden las células madre indiferenciadas programables o las células diana. A este respecto, los vehículos pueden ser bolsas o cámaras para ser insertadas en el cuerpo humano.
En una forma de realización de la invención, se usa una bolsa de este tipo, que contiene células de islote, que son células somáticas diferenciadas de la invención, para producir una estructura farmacéutica para usar como cámara de entrada artificial de células de islote destinada al suministro de insulina.
Según otra forma de realización de la invención se usa una bolsa o una cámara que contiene adipocitos, que son células somáticas diferenciadas según la invención, para producir un polímero artificial lleno de adipocitos como estructura farmacéutica para reconstruir el pecho después de operaciones y en otras indicaciones de corrección plástica y/o cosmética.
También se pueden usar, in vivo, sistemas de cámara de entrada semipermeables provistos de células endocrinas de orígenes muy diferentes, para el tratamiento de enfermedades endocrinas, metabólicas o hemostáticas. Son ejemplos de tales células endocrinas, aquellas que producen tiroxina, esteroides, ADH, aldosterona, melatonina, serotonina, adrenalina, noradrenalina, TSH, LH, FSH, leptina, colecistoquinina, gastrina, insulina, glucagón, o factores de coagulación.
Por lo tanto, también son un objeto de la invención los materiales implantables que son sistemas de cámara de entrada semipermeables y contienen células diana somáticas diferenciadas aisladas. Estos sistemas de cámara de entrada semipermeables se usan en diferentes formas de realización de la invención para la producción de una estructura farmacéutica destinada al tratamiento in vivo de enfermedades endocrinas, metabólicas o hemostáticas.
Las células diana que se obtienen de las células madre según la invención pueden usarse además como cultivos celulares biorreactores fuera del cuerpo, por ejemplo para llevar a cabo reacciones de desintoxicación. Esta forma de uso es relevante, especialmente en casos de dolencias agudas, por ejemplo como biorreactor de hepatocitos en casos de insuficiencia hepática aguda.
La producción de las estructuras descritas anteriormente y la aplicación del procedimiento terapéutico correspondiente ya ha sido descrito en numerosas ocasiones en el estado de la técnica, véanse p.ej. los artículos generales de Lalan, S., y col. "Tissue engineering and its potential impact on surgery" World J. Surg. 25: 1458-1466 (2001); Nasseri, B.A., y col. "Tissue engineering: an evolving 21st-century science to provide replacement for reconstruction and transplantation" Surgery 130: 781-784 (2001) y Fuchs, J.R., y col., "Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction" Ann. Thorac. Surg. 72: 577-591 (2001).
Finalmente, las células madre pluripotentes de la invención abren un extenso campo para las modificaciones y terapias transgénicas. Según una forma de realización preferida de la invención, las células madre indiferenciadas programables per se o las células diana y/o tejidos diana somáticas que finalmente se diferencian de aquellas, se transfectan con uno o más genes. De esta manera es posible recomponer y/o apoyar o volver a incorporar uno o más genes que son necesarios para el mantenimiento de rendimientos metabólicos en determinados órganos tales como el hígado o los riñones. Por ejemplo, las células madre o los hepatocitos derivados de aquellas pueden ser transfectados con el gen FAH (fumaroilacetoacetato-hidrolasa). En el modelo de ratón FAH-deficiente bastó con la inyección intrasplénica de 1000 hepatocitos donadores FAH-positivos para repoblar completamente el hígado al cabo de 6 a 8 semanas y compensar completamente el defecto metabólico que produce la cirrosis (véase Grompe, M., y col., Nat. Genet. 12: 266 ff. (1996)).
De manera correspondiente, por la transfección de las células madre o las respectivas células diana obtenidas de las células madre por programación (por ejemplo células hematopoyéticas, hepatocitos, células ováricas, células musculares, células nerviosas, neuronas, células gliales, células cartilaginosas u óseas, etc.) con genes resistentes a múltiples drogas posibilita la quimioterapia radical ampliada en casos de enfermedades malignas por la respectiva reconstrucción hematopoyética o se crea la resistencia a la radiación.
A continuación la invención se explica detalladamente:
El material de partida para el procedimiento según la invención son monocitos de sangre humana. Preferentemente se trata de monocitos autólogos, es decir monocitos procedentes de la sangre del mismo paciente que será tratado con las células madre según la invención o las células diana producidas a partir de estas.
Para obtener los monocitos, la sangre puede ser, en primer lugar, dividida en plasma y glóbulos blancos y rojos, después del tratamiento habitual con un anticoagulante de la forma conocida, preferentemente por centrifugación. Después de la centrifugación, el plasma se encuentra en el sobrenadante; debajo se encuentra una capa que contiene la totalidad de los glóbulos blancos. Esta capa también se denomina "linfa cuajada". Debajo se encuentra la fase que contiene los glóbulos rojos (hematocrito).
A continuación se aísla la capa "linfa cuajada" y se separa por ejemplo por centrifugación, según procedimientos conocidos, para la obtención de los monocitos. Según una variante preferida del proceso, la capa "linfa cuajada" se aplica sobre un medio de separación de linfocitos (por ejemplo Ficoll Hypaque) y se centrifuga. La fracción de los monocitos se obtiene de la sangre después de más centrifugación y lavado (véase ejemplo 1).
Entre los ejemplos de procedimientos alternativos para la obtención de monocitos a partir de sangre completa se cuentan los siguientes: "Fluorescence-Activated Cell Sorting" (FACS), "Immunomagnetic Bead Sorting" (véase Romani y col., J. Immunol. Methods 196: 137-151 (1996)) y "Magnetic-Activated Cell Sorting" (MACS) o el denominado método Rosetting (véase Gmelig-Meyling, F., y col., "Simplified procedure for the separation of human T and non-T cells" Vox Sang. 33: 5-8 (1977)).
Según la invención, los monocitos pueden obtenerse de cualquier sangre humana aislada, por lo que la sangre también puede proceder de órganos tales como el bazo, ganglios linfáticos o médula ósea. La obtención de monocitos de órganos se pone en práctica, sobre todo, cuando la separación de los monocitos de la sangre humana, por ejemplo en casos de anemia o leucemia, no es posible o no es posible en suficiente cantidad y en casos de utilización alogénica, cuando en el marco de una extracción multiorgánica se dispone del bazo como fuente para el aislamiento de
monocitos.
Para la producción de una cantidad suficiente de células madre según la invención, primeramente es necesario multiplicar los monocitos. Con este fin pueden usarse medios de crecimiento conocidos, apropiados para monocitos y según la invención; el medio contiene M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos). El M-CSF (también denominado CSF-1) es producido por monocitos, fibroblastos y células endoteliales. La concentración de M-CSF en el medio de cultivo puede ser de 2 a 20 \mug/l de medio de cultivo, preferentemente de 4 a 6 \mug/l y más preferentemente de 5 \mug/l.
El M-CSF se fija en los monocitos, en el receptor cFms específico (también denominado CSF-1R), que se encuentra exclusivamente en la superficie de los monocitos y solamente fija M-CSF. (Sherr C.J., y col., Cell 41 (3):665-676 (1985)). Dado que la interacción específica entre M-CSF y el receptor induce la división de los monocitos, el medio en el que se cultivan los monocitos contiene M-CSF o un análogo del mismo que puede fijarse en el receptor y activarlo. Otros factores de crecimiento como GM-CSF, factor estimulante de colonia de monocitos granulocitos y G-CSF factor estimulante de colonia de granulocitos no son apropiados, ya que por falta de afinidad con el receptor cFms no están en condiciones de inducir la división de los monocitos.
En una forma de realización particularmente preferida del proceso, en la etapa b) se agregan simultáneamente M-CSF e IL-3 al medio de cultivo celular. La concentración de IL-3 en el medio puede ser de 0,2 a 1 \mug/l, preferentemente de 0,3 a 0,5 \mug/l y muy preferentemente de 0,4 \mug IL-3/l.
Sin embargo, también es posible agregar primeramente solamente M-CSF al medio de cultivo en la etapa b), y agregar IL-3 sólo después.
En otra forma de realización el recipiente de cultivo contiene inicialmente un medio de cultivo celular que solamente contiene M-CSF que, después de separar las células, es sustituido por un segundo medio de cultivo celular que contiene IL-3.
Según una forma de realización preferida de la invención, en la etapa b) del proceso, las células se cultivan adicionalmente en presencia de un compuesto de azufre, por ejemplo un compuesto mercapto, que contiene por lo menos un grupo hidrocarburo fijado en el azufre, donde dicho grupo(s) hidrocarburo puede estar sustituido por uno o más grupos funcionales. Los compuestos mercapto se definen como compuestos que presentan por lo menos un grupo mercapto (-SH) unido al grupo hidrocarburo. Usando adicionalmente un compuesto de azufre de este tipo puede aumentar la cantidad de las células madre obtenidas por indiferenciación de las células de origen monocitario que expresan uno o más de los marcadores de células madre CD90, CD117, CD123 y CD135.
Preferentemente, el/los grupo/s funcional/es es/son grupos hidroxilo y/o amino. El compuesto de azufre es más preferentemente 2-mercaptoetanol. Según otra forma de realización preferida el compuesto de azufre es dimetilsulfóxido (DMSO).
La cantidad de compuesto de azufre usado puede ser de aprox. 4 a aprox. 200 \mumol/l, referido al azufre. Se prefiere aprox. 100 \mumol/l.
Cuando se usa 2-mercaptoetanol el medio de cultivo deberá contener aprox. 3 \mul a aprox. 13 \mul, preferentemente aprox. 7 \mul 2-mercaptoetanol/l.
El tratamiento con IL-3 y en caso necesario con el compuesto de azufre puede llevarse a cabo simultáneamente o a continuación de la multiplicación de los monocitos por cultivo con M-CSF, prefiriéndose la multiplicación simultánea y el tratamiento con IL-3 y en caso necesario con un compuesto de azufre. El proceso de multiplicación y diferenciación no deberá tardar más de 10 días, mientras que el tratamiento con IL-3 y en caso necesario con el compuesto de azufre deberá realizarse por lo menos durante 3 y como máximo 10 días, preferentemente durante 6 días.
Por lo tanto, según la invención, en caso de cultivar los monocitos en un medio de cultivo que contiene simultáneamente M-CSF, IL-3 y preferentemente un compuesto mercapto tarda, hasta el desprendimiento de las células del fondo del recipiente de cultivo, por lo menos 3 y como máximo 10 días, preferentemente 5 a 8 días y muy preferentemente 6 días.
Si en una forma de realización preferida, el proceso según la invención se lleva a cabo de manera que los monocitos de la etapa b) se multiplican primeramente en un medio que contiene solamente M-CSF, la multiplicación en dicho medio de cultivo puede tardar por lo menos 2, preferentemente 3 y con especial preferencia 4 días y un máximo de 7 días, y un cultivo posterior en presencia de IL-3 y en caso necesario, de un compuesto mercapto, otros 3 días. En este caso, preferentemente el cultivo en un medio que solamente contiene M-CSF sólo demandará un máximo de 4 días y a continuación se realizará un cultivo en presencia de IL-3 y en caso necesario, de un compuesto mercapto durante 3, 4, 5 ó 6 días.
Para realizar conjuntamente la multiplicación y la indiferenciación, como se describe en los ejemplos 2 y 13, después de ser aislados, los monocitos se llevan a un medio que contiene tanto M-CSF como también IL-3 y preferentemente el compuesto de azufre, especialmente mercaptoetanol o DMSO.
Gracias a sus propiedades adhesivas, los monocitos y las células madre obtenidas a partir de ellos durante el proceso se adhieren al fondo del recipiente de cultivo respectivo. Según una forma de realización preferida de la invención, al final de la etapa c) se separa el medio de cultivo de las células que se encuentran adheridas en el fondo del recipiente de cultivo y se desecha. A continuación se realiza preferentemente un lavado de las células adheridas al fondo con un medio de cultivo y luego se cubren las células con un medio de cultivo fresco (véase ejemplo 13).
El medio de cultivo usado en esta etapa puede ser tanto el medio que se usa para la multiplicación e indiferenciación, descrito más arriba, como un medio de cultivo celular estándar, por ejemplo RPMI.
Según otra forma de realización preferida de la invención, a continuación de la etapa c) y antes de la etapa d), las células se ponen en contacto con un disolvente orgánico biológicamente aceptable, a fin de aumentar la cantidad de células madre que al final del proceso flotan libremente en el medio. La cantidad de disolvente puede ser de 10 \mul a 1 ml. Preferentemente, es un alcohol con 1-4 átomos de carbono, prefiriéndose agregar especialmente etanol. Según otra forma de realización particularmente preferida, las células se ponen en contacto con la fase gaseosa del disolvente orgánico biológicamente aceptable descrito más arriba, preferentemente con vapor de etanol (véase ejemplo 2). El disolvente orgánico, más preferentemente el vapor de etanol, se dejará actuar de 4 a 12 horas, preferentemente de 8 a 10 horas.
Preferentemente, el proceso de la invención se lleva a cabo en recipientes de cultivo cuya superficie ha sido recubierta previamente con suero de ternero fetal (FCS) (véase ejemplo 2). Como alternativa, también puede usarse suero AB humano de donadores masculinos. El recubrimiento con FCS puede realizarse cubriendo la superficie de los recipientes de cultivo con FCS antes de usarlos, y retirando de manera adecuada el FCS no adherido en la superficie después de algunas horas, especialmente de 2 a 12 horas, muy preferentemente de 7 horas.
Si a continuación de la etapa c), opcionalmente después de cambiar el medio de cultivo, se lleva a cabo un tratamiento con disolvente orgánico, las células ya empezarán a desprenderse del fondo en esta etapa del proceso. El resto del desprendimiento puede realizarse mecánicamente, por ejemplo con un raspador de células, espátula o una pipeta (véase ejemplo 13).
Según una forma de realización preferida de proceso, el desprendimiento total se logra aplicando una enzima apropiada, por ejemplo tripsina (véase ejemplo 2). La solución de tripsina (0,1 a 0,025 g/l, preferentemente 0,05 g/l) puede actuar sobre las células durante 210 min a 35-39ºC, preferentemente a 37ºC, en presencia de CO_{2}.
A continuación se bloquea la actividad de la tripsina mediante un proceso estándar y las células madre indiferenciadas programables que ahora flotan libremente pueden ser obtenidas ahora mediante un proceso estándar, por ejemplo por centrifugación y en una forma de realización particular, pueden ser suspendidas después de la etapa d) en un medio de cultivo celular apropiado. Se encuentran ahora a disposición, suspendidas en un medio apropiado, por ejemplo en RPMI 1640 o DMEM, para su inmediata diferenciación en las células diana deseadas. Sin embargo, también pueden permanecer algunos días en el medio. En una forma de realización preferida, cuando las células deben permanecer más de aprox. 48 horas en el estado de células madre indiferenciadas programables en el cultivo, el medio contiene una citoquina o factor-LIF (factor inhibidor de la leucemia), véase Nature 414: 94 (2001, Donovan, P.J., Gearhart, J., véase más arriba). Las células madre pueden ser mantenidas en estado de células madre indiferenciadas programables por lo menos durante 10 días en un medio que contenga dichos factores.
En una forma de realización preferida, las células se suspenden en un medio líquido para un almacenamiento más prolongado y a continuación, se congelan. En el estado de la técnica se conocen protocolos para la congelación de células vivas, véase Griffith M., y col. "Epithelial Cell Culture, Cornea, en Methods of Tissue Engineering", Atala A., Lanza R.P., Academic Press 2002, Cap. 4, páginas 131 a 140. Un medio de suspensión preferido para congelar las células madre según la invención es DMEM que contiene FCS, véase ejemplo 2.
A continuación, la invención se explica y describe más detalladamente por medio de ejemplos.
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La composición de los medios y sustancias usadas que no se define en los ejemplos, se indica a continuación:
1. Solución de penicilina/estreptomicina:
10.000 unidades de penicilina en forma de sal sódica de penicilina G y 1000 \mug estreptomicina en forma de sulfato de estreptomicina por ml solución fisiológica de cloruro sódico (NaCl 0,9%)
2. Tripsina-EDTA
0,5 g tripsina y 0,2 g EDTA (4 Na)/l
3. Insulina
humana, recombinante, preparada en E. coli, aprox. 28 unidades/mg
4. RPMI 1640 (l x, líquido (11875) contiene L-glutamina
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medio 1640, son formulaciones enriquecidas de gran aplicabilidad en células de mamíferos.
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1
2
3 
\hskip0,5cm
Referencia: Moore G.E., y col., J.A.M.A. 19: 519 (1967) 
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5. PBS (Solución salina tamponada con fosfato Dulbecco) véase J. Exp. Med. 98:167 (1954):
Componentes g/l
KCl 0,2
KH_{2}PO_{4} 0,2
NaCl 8,00
Na_{2}PHO_{4} 1,15
6.2-Mercaptoetanol
Calidad para síntesis; Contenido > 98%, densidad 1,115 a 1,116, véase por ejemplo Momo J., y col., J. Am. Chem. Soc. 73: 4961 (1951).
7. Ficoll-Hypaque:
Medio para separación de linfocitos (copolimerizado de sacarosa/epiclorhidrina Mg 400.000; densidad 1,077, ajustado con diatrizoato sódico).
8. Ácido retinoico:
Ácido vitamina A (C_{20}H_{28}O_{2}), 300 \mul en 1,5 ml PBS, correspondiente a 1 mM. Como medio para programar neuronas y células gliales se usan 150 \mul para 10 ml de medio (correspondiente a 10^{-6} M).
9. DMEM
Medio Eagle modificado Dulbecco (alta glucosa) véase Dulbecco, R. y col., Virology 8: 396 (1959); Smith, J.D. y col., Virology 12: 158 (1960); Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6: 2 (1993)).
10. L-glutamina
líquida: 29,2 mg/ml.
11. Colagenasa Tipo II:
Véase Rodbell, M. y col., J. Biol. Chem. 239: 375 (1964).
12. Interleucina 3 (IL-3):
IL-3 humano recombinante de E. coli (Yang Y.C. y col. Cell 47: 10 (1986); contiene 133 radicales aminoácidos que contienen IL-3 maduro y 134 radicales aminoácidos que incluyen la forma metionilo en una relación de aprox. 1:2; masa molar calculada, aprox. 17,5 kD; actividad específica 1 x 10^{3} U/\mug; (R&D, Catálogo Nº 203-IL).
13. Factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).
M-CDF humano recombinante de E. coli; contiene como monómero (18,5 Kd) 135 radicales aminoácidos, incluyendo la metionina N-terminal; se encuentra presente como homodímero con una masa molar de 37 Kd; (SIGMA. Nrº catálogo M 6518).
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14. Anticuerpos:
Los anticuerpos usados en los ejemplos contra los antígenos CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135 se encuentran comercialmente disponibles. Se adquirieron de las siguientes fuentes:
CD14: DAKO, CD14 monoclonal de ratón anti-humano, monocito, clon TÜK4, Código Nr. M 0825, Lote 036 Edición 02.02.01;
CD31: PharMingen International, CD31 monoclonal de ratón anti-rata (PECAM-1), Clon TLD 3A12, Nº Catálogo 22711D, 0,5 mg;
CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, CDw90 de ratón anti-humano, Clon Nº F15-42-1, MCAP90, lote 0699;
CD117: DAKO, CD117 monoclonal de ratón anti-humano, kit-c, clon Nr. 104D2, Código Nº M 7140, Lote 016, Edición 04.05.00;
CD123: Research Diagnostics Inc., Anticuerpos CD123 de ratón anti-humano, Clon 9F5, Catálogo Nº RDI-CD123-9F5;
CD135: Serotec, CD135 de ratón anti-humano, MCA1843, Clon Nº BV10A4H2.
Ejemplo 1 Separación de monocitos de la sangre completa
Para evitar la coagulación de la sangre y para nutrir las células se mezclaron 450 ml de sangre completa en un conjunto de 3 bolsas tipo cámara con 63 ml de una solución estabilizadora que contenía 3,27 g de ácido cítrico, 26,3 g de citrato trisódico, 25,5 g de dextrosa y 22,22 g de dihidroxifosfato de sodio por litro de H_{2}O. El valor pH de la solución era de 5,6-5,8.
Luego se realizó una "fuerte centrifugación" de esta mezcla para separar los componentes de la sangre a 4000 rpm durante 7 minutos a 20ºC. De ello resultó una capa triple de los componentes corpusculares y no corpusculares. Colocando el conjunto de bolsas en una prensa prevista para tal fin, se prensaron los eritrocitos en la bolsa inferior y el plasma en la bolsa superior, permaneciendo la llamada "linfa cuajada" en la bolsa del medio que contenía aproximadamente 50 ml del volumen.
Luego, los 50 ml de "linfa cuajada" recién preparado se dividieron en 2 porciones de 25 ml cada una y se cubrieron con 25 ml de medio de separación Ficoll-Hypaque que previamente había sido trasvasado a dos tubos Falcon de 50 ml.
Esta preparación se centrifugó ininterrumpidamente durante 30 minutos a 2500 rpm. Los eritrocitos y las células muertas aún presentes en la "linfa cuajada" quedaron debajo de la fase Ficoll, mientras que los glóbulos blancos incluyendo los monocitos quedaron separados como interfase blanca sobre el Ficoll.
A continuación se pipeteó cuidadosamente la interfase blanca de los monocitos y se mezcló con l0 ml de solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS).
Luego, esta preparación se centrifugó ininterrumpidamente tres veces durante 10 min. a 1800 rpm, pipeteando el sobrenadante después de cada centrifugación y completando con PBS nuevo.
El sedimento celular acumulado en el fondo del recipiente de centrifugación (tubo Falcon) contenía la fracción celular mononuclear, es decir, los monocitos.
Ejemplo 2 Multiplicación e indiferenciación de los monocitos
Tanto el cultivo y la multiplicación de los monocitos por un lado, como la indiferenciación de las células por otro lado, se realizó en una sola etapa en un medio nutriente de la siguiente composición:
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Medio RPMI 1640 440 ml
Suero fetal de ternero (FCS) 50 ml
Solución de penicilina/estreptomicina 5 ml
2-mercaptoetanol(solución madre) 5 ml
Volumen total 500 ml
El medio nutriente contenía además 2,5 \mug/500 ml de M-CSF y 0,2 \mug/500 ml de interleucina 3 (IL-3).
Los monocitos aislados en el ejemplo 1 se colocaron en 5 cámaras de una placa de 6 pocillos (30 mm de diámetro por pocillo) en una cantidad de aproximadamente 10^{5} células por pocillo y se completaron con 2 ml del medio nutriente indicado con anterioridad cada una. La placa de 6 pocillos había sido llenada previamente con FCS inactivado puro y el FCS se había decantado después de aproximadamente 7 horas, a fin de obtener de esta manera una placa cubierta con FCS. La determinación de la cantidad de células para la dosis exacta por pocillo se realizó por medio de procedimientos conocidos, véase Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation" en Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 4, páginas 55-84.
La placa de 6 pocillos se cubrió con la tapa correspondiente y se mantuvo durante 6 días en una incubadora a 37ºC. Las células se depositaron en el fondo de las cámaras después de 24 horas. Cada dos días se pipeteó el sobrenadante y se llenaron nuevamente las cámaras de la placa de 6 pocillos con 2 ml cada una de medio nutriente fresco.
El sexto día se vertieron 2 ml de etanol al 70% en la sexta cámara de la placa de 6 pocillos que estaba libre, se cerró la placa de nuevo y se dejó en la incubadora otras 10 horas a 37ºC.
Posteriormente se pipeteó 1 ml de una solución de tripsina diluida al 1:10 con PBS en cada una de las cámaras de la placa con pocillos que contenían las células. La placa de pocillos cerrada se dejó en la incubadora durante 5 minutos a 37ºC en 5% de CO_{2}.
Posteriormente se bloqueó la actividad de la tripsina agregando de 2 ml de medio RPMI 1640 en cada uno de los pocillos. Se pipeteó todo el sobrenadante de cada una de las cámaras (1 ml de tripsina + 2 ml de medio), se reunieron en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 1800 rpm. A continuación se desechó el sobrenadante y el precipitado se mezcló con medio RPMI 1640 nuevo (2 ml/10^{5} células).
Esta suspensión celular pudo utilizarse directamente para la diferenciación y obtención de las distintas células diana.
Como alternativa, después de centrifugar las células y descartar el sobrenadante que contenía tripsina las células se mezclaron con DMSO/FCS como medio de congelación y se congelaron con una concentración de 10^{6}/ml.
El medio de congelación contenía 95% de FCS y 5% de DMSO. Aproximadamente 10^{6} células se tomaron en 1 ml del medio y se enfriaron en las siguientes etapas:
30 min. en hielo;
2 horas a -20ºC en cajas prerrefrigeradas de telgopor;
24 horas a -80ºC en telgopor;
conservación en tubos con nitrógeno líquido (N_{2}) a -180ºC.
Para la fenotipización inmunohistoquímica de la población celular generada a partir de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario según el procedimiento anterior se retiraron 10^{5} células y se fijaron como preparado de citospina en portaobjetos para una posterior coloración histoquímica (Watson, P. "A slide centrifuge; an apparatus for concentrating cells in suspension on a microscope slide." J. Lab. Clin. Med., 68: 494-501 (1966)). Tras esto, las células pueden colorearse por medio de la técnica descrita por Cordell, J. L., y col., (para bibliografía, véase más abajo) con el complejo rojo APAAP. La dilución del anticuerpo primario agregado se produjo, siempre que no se indicara lo contrario, en una relación de 1:100 con PBS, empleándose en cada caso 200 \mul de esta concentración de anticuerpos. Como anticuerpos primarios se usaron anticuerpos monoclonales contra los epitopes de antígeno celular enumerados en la tabla 1. La figura 6 muestra preparados de citospina coloreados y la correspondiente comprobación de los marcadores de células madre CD90, CD117, CD123 y CD135.
Bibliografía acerca de la técnica de coloración
Cordell J. L., y col. "Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32: 219-229 (1984).
Bibliografía acerca de los marcadores
CD14
Ferrero E., Goyert S. M. "Nucleotide sequence of the gene encoding the monocyte differentiation antigen, CD14" Nucleic Acids Res. 16: 4173-4173 (1988).
CD31
Newman P. J., Berndt M. C., Gorski J., White J. C. Il, Lyman S., Paddock C., Muller W. A. "PECAM-1(CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily" Science 247: 1219-1222 (1990).
CD90
Seki T., Spurr N., Obata F., Goyert S., Goodfellow P., Silver J. "The human thy-1 gene: structure and chromosomal location" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6657-6661 (1985).
CD117
Yarden Y., Kuang W.-J., Yang-Feng T., Coussels L., Munemitsu S., Dull T. J., Chen E., Schlessinger J., Francke U., Ullrich A. "Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand." EMBO J. 6: 3341-3351 (1987).
CD123
Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A. "Expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors." Cell 66: 165-1174 (1991).
CD135
Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S., Rockwell P., Witte L. Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M., Civin C. I.
"STK-1, the human homolog of Flk-2/Flt-3, is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells."Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 459-463 (1994).
TABLA 1 Expresión de los antígenos de las células madre de la invención
Antígeno Reacción de color
Marcador de células madre
CD90 ++
CD117 +
CD123 ++
CD135 +(+)
Marcador de diferenciación
CD14 (monocitos) +
\begin{minipage}[t]{135mm} La graduación indicada corresponde a la positividad calculada del antígeno que se presenta a partir del día 4 hasta el día 9, luego de cultivar los monocitos en los medios correspondientes especificados y se realiza por comparación microscópica de las respectivas coloraciones de citospina con el control negativo (coloración sin anticuerpos primarios).\end{minipage}
+ clara reacción de color de las células con el anticuerpo primario;
++ fuerte reacción de color de las células con el anticuerpo primario.
Se evaluaron solamente los preparados de citospina que presentaban más del 70% de células vitales con una morfología típica de células madre (véase la figura 6). Menos de 1% de estas células expresan el antígeno CD34.
Ejemplo 3 Producción de neuronas y células gliales a partir de células madre adultas
La preparación de neuronas y células gliales se realizó en placas petri de 100 mm de diámetro. Para preparar las placas petri se vertieron en cada bandeja 5 ml de suero de ternero fetal inactivado puro (FCS), de modo que el fondo quedara cubierto. A las 7 horas se pipeteó la parte de FCS no adherido al fondo de la placa petri. Aproximadamente 10^{6} de las células preparadas de acuerdo con el ejemplo 2 se vertieron en una de las placas petri preparadas y se agregaron 10 ml de medio nutriente de la siguiente composición:
Solución DMEM 440 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50 ml
1-glutamina 5 ml
Solución de penicilina (100 \mu/l)/estreptomicina (100 \mug/l) 5 ml
Volumen total 500 ml
El medio nutriente contenía además ácido retinoico en una cantidad de 1 x 10^{-6} M/500 ml.
La reprogramación/diferenciación de las células madre usadas para obtener neuronas y células gliales se produjo dentro de un período de 10 días, renovando el medio a intervalos de aproximadamente 3 días. Después de este período, gran parte de las células se adhirieron al fondo de la cámara y podían desprenderse en forma análoga -tal como se describió con anterioridad para las células madre- con un tratamiento breve con tripsina.
Ejemplo 4 Comprobación de células neuronales precursoras, neuronas y células gliales
Para una posterior caracterización inmunohistoquímica de las células diana inducidas por células madre indiferenciadas programables, las células madre generadas a partir de monocitos (10^{5} células / tapa de vidrio) se colocaron en vidrios de tapa (20 mm x 20 mm), que se habían colocado en el fondo de las placas de 6 pocillos (30 mm de diámetro por cámara), y se cultivaron con el medio nutriente con 2 ml por placa con pocillos. Tras diferenciar las respectivas células diana, éstas se fijaron de la siguiente manera: tras retirar el medio nutriente (sobrenadante) se produjo la fijación de las células diana cultivadas luego de agregar 2 ml de metanol que se dejó actuar durante 10 minutos. Luego se pipeteó el etanol y las placas con pocillos se lavaron dos veces con PBS (2 ml por vez). Después se colorearon las células mediante la técnica descrita por Cordell, J. L., y col., "Immunoenzymatic labeling monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)", J. Histochem. Citochem. 32: 219-229 (1994) con el complejo rojo APAAP. La dilución del anticuerpo primario agregado se realiza, siempre que no se especifique lo contrario, en una relación de 1:100 con PBS. Luego se pipetearon 200 \mul de esta concentración de anticuerpos en cada uno de los seis
pocillos.
Las células precursoras neuronales se comprobaron por coloración celular con el anticuerpo contra el antígeno S100, véase la imagen central de la figura 1 (x 200).
Las neuronas se comprueban por expresión específica de sinaptofisina MAP2 ("proteína asociada microtubular 2") o neurofilamento 68 con los correspondientes anticuerpos específicos (anticuerpos primarios 1:300 diluidos con PBS), imagen derecha de la figura 1, x 200.
Las células gliales como, por ejemplo, los astrocitos, se comprobaron por detección de GFAP ("proteína asociada fibrilar glial") (anticuerpos primarios 1:200 diluidos con PBS), imagen izquierda de la figura 1, x 200.
La separación de neuronas y células gliales se realizó por medio de anticuerpos específicos contra MAP2 (neuronas) o GFAP (células gliales), por medio de MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) según el procedimiento que se describe, por ejemplo, en Carmiol S., "Cell Isolation and Selection" Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 2, páginas 19-35.
Los tipos celulares que se hicieron visibles por medio de la coloración se indican en la figura 1.
Ejemplo 5 Preparación de células endoteliales de células madre adultas indiferenciadas programables de origen monocitario
Para cultivar células endoteliales se usó una matriz Matrigel© (Beckton y Dickinson, Heidelberg, DE). En este caso se trata de una matriz de fibronectina, laminina y los colágenos I y IV.
La matriz congelada se descongeló lentamente durante un período de 12 horas a 4ºC en el refrigerador. De esta manera se modificó su estado, es decir que la matriz originalmente sólida se volvió esponjosa/líquida. En este estado se aplicó en una placa de 48 pocillos (10 mm de diámetro por cámara) de manera de cubrir el fondo de cada cámara.
Después de la aplicación, la placa se mantuvo durante 30 minutos a temperatura ambiente, hasta que el gel se hubo solidificado sobre el fondo, formando una capa adherente.
Posteriormente, se incubaron sobre Matrigel© aproximadamente 1 X 10^{2} células por pocillo agregando el medio nutriente (tal como se describió en el ejemplo 2).
A los 4-5 días se presentaron las primeras cadenas celulares tubulares que al cabo de 6-8 días se habían desarrollado formando redes celulares tridimensionales. En las células pudieron comprobarse los marcadores endoteliales CD31 y el factor VIII con los anticuerpos primarios específicos (200 \mul, 1:100 diluidos con PBS en cada caso).
En un procedimiento alternativo, se aplicó la matriz fluidificada en una prótesis vascular y luego se cubrió con las células madre adultas indiferenciadas programables de acuerdo con el ejemplo 2. Después de aproximadamente 6 días, se pudo apreciar un pavimento endotelial que revestía la prótesis en forma circular.
Las células endoteliales que se hicieron visibles por coloración con los correspondientes anticuerpos específicos del endotelio (véase más arriba) se muestran en la figura 2. En la imagen central están representadas las células luego de una incubación de 5 días en Matrigel©. Las primeras cadenas tubulares unen cada uno de los grupos celulares. Las células marcadas de color marrón oscuro expresan el antígeno CD31 (x 200 con filtro amarillo). Luego de 8 días se forman progresivamente estructuras reticulares tridimensionales (coloración de antígeno anti-CD31, x 200 con filtro amarillo). A los 12 días, las células neodiferenciadas CD31^{+} que se cultivaron en Matrigel©, conforman un tubo tridimensional similar a un recipiente con estructuras de paredes multicapas que recuerdan morfológicamente a un recipiente. Se aprecia que casi todas las células expresan el antígeno CD31 (coloración CD31, x 400, filtro azul), figura derecha.
Ejemplo 6 Producción de células grasas (adipocitos)
A: Para la programación/diferenciación de las células madre adultas según el ejemplo 2 para obtener células grasas se generó en primer lugar un medio acondicionado. Para ello se prepararon 20 g de un tejido graso autólogo, es decir, de la misma persona donante de cuya sangre provenían también los monocitos, de la siguiente manera:
Primero se trituró el tejido graso en una placa petri y los trozos de tejido triturado se pasaron por un tamiz (diámetro de las aberturas 100 \mum).
La suspensión obtenida de esta manera se pasó luego a una placa petri de 100 mm de diámetro y se agregaron 10 ml de medio DMEM con un contenido de 30 mg de colagenasa tipo II. Para que la colagenasa actuara sobre las células grasas se dejó reposar la preparación aproximadamente 60 minutos a temperatura ambiente (22ºC \pm 2ºC).
A continuación se pasó la mezcla a tubos Falcon de 50 ml y los tubitos se centrifugaron durante 10 minutos a 1800 rpm.
Después de la centrifugación, se desechó el sobrenadante y el pellet de células compuesto por adipositos y células precursoras se tomó en 8 ml de un medio de la siguiente composición y se incubó en placas petri (diámetro 100 mm) durante 10 días a 37ºC en una incubadora:
Solución DMEM 444,5 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50,0 ml
Solución de insulina 0,5 ml
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) 5,0 ml
Volumen total 500,0 ml
La solución de insulina contenía 18 mg de insulina (Sigma 1-0259) disueltos en 2 ml de agua con vinagre (compuesta de 40 ml de H_{2}O y 0,4 ml de ácido acético glacial). La solución se diluye con agua con vinagre en una relación de 1:10.
Durante los 10 días de incubación, se formó el medio acondicionado con células grasas (FCCM) como sobrenadante. El sobrenadante se reemplazó a los 2 - 4 días por medio nutriente nuevo. El FCCM obtenido al cambiar el medio se filtró en condiciones estériles y se almacenó a -20ºC. Luego se colocaron 10 ml del FCCM descrito con anterioridad con aproximadamente 10^{6} células madre de acuerdo con el ejemplo 2, en una placa petri (diámetro 100 mm). Las primeras células precursoras que contienen vacuolas grasas se hicieron visibles a los 4 días (figura 3A). A los 6 días aparecieron adipositos aislados coloreados con rojo Sudán (figuras 3B y C). A los 10 días se produjo la agregación típica y se formaron grumos de estas células, las que en este estadio ya se reconocían macroscópicamente como tejido graso (figura 3D).
Las células grasas visibles por coloración en las figuras 3A-3D se distinguen esencialmente de los controles 3E y 3F: la figura 3E muestra las células monocitarias originales que se cultivaron en el medio nutriente (como se indica en el ejemplo 2) durante 6 días, pero sin el agregado de IL-3 y 2-mercaptoetanol. Luego se agregó el FCCM. Estas células no estaban en condiciones de diferenciarse en células grasas. La figura F muestra células que se cultivaron durante 6 días con un medio completo (de acuerdo con el ejemplo 2), y que luego fueron tratadas con medio nutriente (de acuerdo con el ejemplo 2) en lugar de FCCM durante otros 6 días más. Por lo tanto, el FCCM contiene componentes que se requieren como señalizadores de la diferenciación en células grasas.
El coloreado de las células con rojo Sudán en las figuras 3A, B, C y D se lleva a cabo según la técnica descrita por Patrick Jr., C. W., y col. "Epitelial Cell Culture: Breast", en Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, capítulo 4, páginas 141-149.
B: Además de la fenotipización de las células grasas por coloración con rojo Sudan, se realizó una caracterización biomolecular de las células grasas a nivel del ARNm, a fin de verificar si el programa genético de la célula grasa sufre una correspondiente alteración después de la programación con el medio acondicionador de células grasas y si son comprobables los transcriptos típicos de ácido ribonucleico (ARNm) mensajero, descritos para las células grasas, en las células grasas programadas a partir de monocitos programables. Se amplificaron dos secuencias de ARNm típicas para el metabolismo de las células grasas por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de sondas de ARN aisladas de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario y, en una preparación de ensayo paralela de células grasas programables, a saber "peroxisome proliferative activated receptor gamma" (PPARG)-ARNm, (Tontonoz, P., y col. "Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, lipid-activated transcription factor." Cell 79: 1147-1156 (1994), Código de acceso al Genbank; NM 005037) y "leptina (homólogo de obesidad, ratón)"-mRNA,(Zhang Y., y col. "Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue." Nature 372: 425-432 (1994), Genbank, código de acceso: NM-000320).
El aislamiento del ARN necesario para este fin, la metodología de transcripción inversa y las condiciones de la amplificación por PCR de las secuencias de ARNm deseadas se llevaron a cabo tal como se describen detalladamente en el estado de la técnica, véase para ello Ungefroren H., y col., "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58: 1741-1749 (1998).
Para ello se seleccionaron los correspondientes cebadores preparados para la amplificación por PCR de forma tal que los cebadores "directos" e "inversos" se unieran a las secuencias de ARNm, cuyas áreas homólogas están en el gen cromosómico en dos exones diferentes y están separadas entre sí por un gran intrón. De esta manera se pudo asegurar que el fragmento de amplificación obtenido proviene del ARNm contenido en la célula y no de la secuencia existente en el ADN cromosómico. En particular, para PPAR-\gamma y para leptina se seleccionaron las siguientes secuencias de cebadores:
PPAR-\gamma: "cebador directo"; 265-288 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), "cebador inverso": 487-465 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 487-265 bp = 223 bp, véase la figura 3G. Tal como se desprende de la figura 3G, pueden comprobarse trazas de ARNm PPAR-\gamma específico transcripto ya en la célula madre programable y en la línea celular tumoral HL-60 (de una línea celular de leucemia promieloica humana), pero con una banda de señales significativamente menor que en la propia célula grasa. Por el contrario, la proteína específica de la célula grasa, leptina, sólo puede comprobarse en las células grasas derivadas de las células madre programables a nivel del ARNm por PCR de transcriptasa inversa.
Las células madre programables aplicadas para el control (célula madre programable) y las líneas celulares tumorales humanas HL-60, Panc-1 y WI-38 no transcriben la leptina. Como controles negativos se evaluaron en forma simultánea todas las preparaciones sin el agregado de la transcriptasa inversa (célula grasa/-RT) y sondas de H_{2}O. Comprobando el gen "de servicio" GAPDH en los controles positivos se asegura que se haya realizado en forma reglamentaria cada uno de los pasos de amplificación por PCR en cada una de las preparaciones.
Ejemplo 7 Preparación de células hepáticas (hepatocitos)
A: Para la programación de las células madre indiferenciadas programables de origen monocitario de acuerdo con el ejemplo 2 y convertirlas en células hepáticas se generó en primer lugar un medio acondicionado. Para ello se prepararon 40 g de tejido hepático humano de la siguiente manera:
Primero se lavó el tejido hepático varias veces con PBS, a fin de liberarlo lo más posible de los eritrocitos. Luego se trituró el tejido en una placa petri y se incubó con una solución de disociación durante aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente. La solución de disociación estaba compuesta por 40 ml de PBS (suero fisiológico tamponado con fosfato), 10 ml de una solución de tripsina 1:10 diluida con PBS y 30 mg de colagenasa de tipo II (Rodbel M., y col. J. Biol. Chem. 239: 375 (1964)). Después de incubar durante 45 minutos se pasaron los trozos de tejido por un tamiz (véase el ejemplo 6).
A continuación se pasó la mezcla a un tubo Falcon de 50 ml, se llenó hasta 50 ml con PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 1800 rpm.
Después de centrifugar se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet celular que contenía las células hepáticas nuevamente con 50 ml de PBS y se centrifugó. El sobrenadante obtenido de esta manera se descartó nuevamente y el pellet celular se tomó en 25 ml de un medio de la siguiente composición y se incubó en frascos para cultivo celular (250 ml de volumen) durante 10 días a 37ºC en incubadora:
Medio de crecimiento de células hepáticas LCGM
Medio RPMI 1640 445,0 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50,0 ml
Solución de insulina 0,5 ml
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) 5,0 ml
Volumen total 500,0 ml
El medio nutriente contenía adicionalmente 5 \mug (10 ng/ml) de "factor de crecimiento epidérmico" (Pascall, I.C. y col., J. Mol. Endocrinol. 12: 313 (1994)). La composición de la solución de insulina fue como se describe en el ejemplo 6.
Durante la incubación de 10 días, el medio acondicionado con células hepáticas (LCCM) se convirtió en sobrenadante. El sobrenadante se reemplazó a los 2 - 4 días por un medio nutriente nuevo. El LCCM obtenido al cambiar el medio se filtró en condiciones de estériles (filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum) y se almacenó a -20ºC.
A continuación, 1 X 10^{6} células madre indiferenciadas se cultivaron con 10 ml de un medio de la siguiente composición en una placa petri (\diameter 100 mm) o un frasco de cultivo.
Medio de diferenciación de células hepáticas LCDM
LCCM 100 ml
Solución de insulina (ejemplo 6) 0,1 ml
Factor de crecimiento epidérmico 1 \mug
Factor de crecimiento de hepatocitos 2 \mug
El factor de crecimiento de hepatocitos (Kobayashi, Y. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 7 (1996)) usó con una concentración de 40 ng/ml. Luego de algunos días se pudieron observar alteraciones morfológicas en células planas, poligonales o mono o diploides (figura 4A). A los 10 - 12 días se pudieron identificar los hepatocitos generados a partir de las células madre indiferenciadas por medio de una comprobación inmunohistoquímica del antígeno específico hepático alfa-fetoproteína (Jacobsen, G. K. y col., Am. J. Surg. Pathol. 5: 257-66 (1981)), tal como se indica en las figuras 4B y 4C.
B: Además de la fenotipización de los hepatocitos por comprobación inmunohistoquímica de la alfa-fetoproteína se realizó una caracterización biomolecular de los hepatocitos a nivel del ARNm, a fin de verificar si el programa genético de las células madre luego de la correspondiente programación con el medio acondicionado con células hepáticas usado sufre una correspondiente alteración y si son comprobables como ácido ribonucleico mensajero (ARNm) descrito como típico para las células hepáticas en los hepatocitos provenientes de las células madre de la invención. Para esta finalidad se investigó la presencia de cinco diferentes secuencias de ARNm típicas de los hepatocitos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sondas de ARN aisladas a partir de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario y en una preparación de ensayo paralela de células hepáticas obtenidas por programación de las células madre. En particular, se trataba de ARNm de albúmina de Homo sapiens (Laven, R. M., y col. "The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli." Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114, (1981), código de acceso al Genbank: NM-000477), ARNm de alfa-fetoproteína (Morinaga T., y col. "Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4604-4608 (1983), código de acceso al Genbank: V01514), ARNm de "Human carbamyl phosphatase synthetase I" (Haraguchi, Y., y col. "Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia" Gene 107:335-340 (1991), código de acceso del Genbank D90282), ARNm de "Homo sapiens coagulation factor II" (trombina, F2) (Degen, S. J. y col. "Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding for human protrombin" Biochemistry 22: 2087-2097 (1983), código de acceso al Genbank NM-000506), ARNm de "Homo sapiens coagulation factor VII" (acelerador de conversión de protrombina en suero, F7) (NCBI Annotation Project. Direct Submission, 06-Feb-2002, National Center for Biotechnology Information, NIH, Betesda, MD 20894, EEUU, código de acceso al Genbank XM-027508).
La aislamiento del ARN necesario para ello, la metodología de transcripción inversa y las condiciones de la amplificación por PCR de las secuencias de ARNm deseadas se realizaron tal como se describe detalladamente en el estado de la técnica, véase al respecto Ungefroren H., y col., "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis" Cancer Res. 58: 1741-1749 (1998).
Los correspondientes cebadores para la amplificación por PCR se seleccionaron de forma tal que los cebadores "directos" e "inversos" se unan a las secuencias de ARNm, cuyas áreas homólogas están en el gen cromosómico en dos exones diferentes y están separadas entre sí por medio de un gran intrón. De esta manera pudo asegurarse que el fragmento de amplificación obtenido proviene del ARNm contenido en la célula y no de la secuencia existente en el ADN cromosómico.
Se seleccionaron las secuencias de cebadores indicadas a continuación; los resultados de cada uno de los análisis de PCR se reproducen en la figura 4D. Las células madre indiferenciadas programables de la invención se designan allí como "célula madre programable" y los hepatocitos derivados de ellas por programación, como "hepatocito programable".
Alfa-fetoproteína: cebador "directo" : 1458-1478 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), cebador "inverso" : 1758-1735 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 1758-1458 bp = 391 bp, véase la figura 4D.
Tal como indica la figura 4, se puede programar la célula madre programable, en la que no se pueden comprobar transcriptos específicos de ARNm para alfa-fetoproteína, en un hepatocito (hepatocito programable), que contiene este transcripto de ARNm (banda positiva con un peso molecular de 301 bp). Así se explica también la posibilidad de comprobación inmunohistoquímica de la alfa-fetoproteína, tal como se indica en las figuras 4B y 4C. Los controles positivos, o sea el tejido hepático humano y la línea celular de tumor hepático HepG2, transcriben asimismo el ARNm específico de la alfa-fetoproteína, como lo comprueban las bandas de 301 bp.
Albúmina: cebador "directo": 1450-1473 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), cebador "inverso": 1868-1844 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 1868-1450 bp = 419 bp, véase la figura 4D.
La figura 4D ya muestra trazas de ARNm albúmina-específico transcripto en la célula madre programable, mientras que los hepatocitos obtenidos por programación de las células madre y el tejido hepático normal así como la línea celular tumoral HepG2 -ambos fueron utilizados como control positivo- expresan fuertemente el ARNm, como se aprecia en las marcadas bandas.
Carbamiolfosfatasa-sintetasa I: cebador "directo": 3135-3157 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), "cebador inverso": 4635-4613 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 4635-3135 = 1500 bp, véase la figura 4D.
La carbamoilfosfato sintetasa I es una enzima específica de un hepatocito, que desempeña un papel importante en la metabolización de la urea en el llamado ciclo metálico de la urea. Esta función desintoxicante queda garantizada por medio de los hepatocitos funcionales. Tal como documenta la figura 4D, se pueden apreciar tanto en los hepatocitos generados a partir de células madre programables, como también en los controles positivos (tejido hepático humano y la línea celular tumoral HepG2) las bandas de ARNm específicas (1500 bp) para la carbamoilfosfato-sintetasa I. La expresión algo más débil de la banda de ARNm para los hepatocitos programados se manifiesta a través de la falta de sustrato en la bandeja de cultivo.
Factor de coagulación II: cebador "directo": 1458-1481 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), cebador "inverso": 1901-1877 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 1901-1458 = 444 bp, véase la figura 4D.
Esta proteína, asimismo específica de hepatocitos, puede comprobarse únicamente en los hepatocitos programados y en el control positivo de tejido hepático humano a nivel del ARNm por expresión de bandas a 444 bp, mientras que la célula madre programable no muestra esta banda, es decir, el gen no se transcribe allí, tal como puede apreciarse en la figura 4D.
Factor de coagulación VII: cebador "directo": 725-747 (secuencia genética correspondiente en el exón 1), cebador "inverso": 1289-1268 (secuencia genética correspondiente en el exón 2), de esta manera resulta un fragmento de amplificación de 1289-725 = 565 bp, véase la figura 4D.
Tal como el factor de coagulación II, esta proteína también se transcribe únicamente en hepatocitos programados y en el control positivo (tejido hepático humano) (véanse las bandas a 656 bp), aun cuando es más débil que el factor de coagulación II. Ni la célula madre programable ni el control negativo (H_{2}O) muestran esta banda de ARNm específica.
Glicerinaldehído-deshidrogenasa: Este gen también denominado "housekeeping gene" puede comprobarse en cada célula eucariota y sirve como control de una amplificación por PCR realizada reglamentariamente en todas las sondas, la que se evalúa conjuntamente en forma paralela y se genera con el agregado de una cantidad definida de ARN proveniente de cada una de las sondas celulares.
Como controles negativos se evaluaron simultáneamente las sondas de H_{2}O en todas las preparaciones. Cuando el H_{2}O no está contaminado con ARN, durante la PCR no se produce un producto amplificado y no se puede comprobar ninguna banda (sirve así de contracontrol).
Ejemplo 8 Preparación de células cutáneas (queratinocitos)
Para la programación de las células madre indiferenciadas programables de origen monocitario de acuerdo con el ejemplo 2 y convertirlas en células cutáneas se generó en primer lugar un medio acondicionado. Para ello se prepararon 1-2 cm^{2} de piel entera humana de la siguiente manera:
El material cutáneo se liberó en principio en condiciones estériles del subcutis. El tejido se lavó un total de 10 veces con PBS en un recipiente estéril, agitando vigorosamente. Luego del segundo lavado se liberó nuevamente el tejido de los restos demarcados de tejido conectivo.
Luego se colocó el material cutáneo en una placa petri de 60 mm de diámetro, allí se mezcló con 3 ml de una solución de tripsina 1:10 diluida con PBS y se cortó en pequeños trozos (aproximadamente 0,5 a 1 mm^{3}). Posteriormente se agregaron a la mezcla nuevamente 3 ml de la solución de tripsina 1:100 diluida con PBS y la mezcla se incubó a 37ºC durante 60 minutos agitando intermitentemente.
Después se dejaron sedimentar las partículas más grandes y el sobrenadante que contenía los queratinocitos se desechó y se centrifugó a 800 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante generado ahora se pipeteó y el pellet celular se tomó en 3 ml de un medio de la siguiente composición y se incubó en placas petri (\diameter 100 mm) durante 15 días en incubadora a 37ºC.
Medio de crecimiento de queratinocitos KGM
DMEM 333,5 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50,0 ml
Medio Ham F12 111,0 ml
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 mg/l) 5,0 ml
Solución de insulina (véase el ejemplo 6) 0,5 ml
Volumen total 500,0 ml
El medio nutriente contenía 5 \mug de factor de crecimiento epidérmico (para una especificación exacta, véase el ejemplo 7) y 5 mg de hidrocortisona (Ref. Índice Merck: 12, 4828).
Durante la incubación de 15 días, el medio acondicionado con células de queratinocitos KCCM se convirtió en sobrenadante. El sobrenadante se reemplazó luego de 2-4 días por un medio nutriente nuevo. El KCCM obtenido al cambiar el medio se filtró en condiciones de esterilidad y se almacenó a -20ºC.
1 X 10^{6} células madre indiferenciadas se cultivaron luego con 10 ml de un medio de la siguiente composición en una placa petri (\diameter 100 mm) o un frasco de cultivo.
Medio de diferenciación de queratinocitos KDM
KCCM 100 ml
Solución de insulina (véase el ejemplo 6) 0,5 ml
Factor de crecimiento epidérmico (EGF) 1 \mug
Hidrocortisona 1 mg
Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) 2,5 \mug
El factor de crecimiento de queratinocitos se usó en una concentración de 25 ng/ml, tal como describen Finch y col., Gastroenterology 110: 441 (1996).
Pasados algunos días se pudo observar una modificación morfológica de las células. A los 6 días se pudieron comprobar los antígenos específicos de los queratinocitos, citoqueratina 5 y 6, ambas unidas por el anticuerpo primario utilizado (Exp. Cell. Res. 162: 114 (1986)) (figura 5A). A los 10 días ya se produjo en el cultivo una adherencia entre células individuales claramente mayor, lo que permitía identificar una visible unión de tejido de células confluyentes (figura 5B).
Ejemplo 9 Producción de células productoras de insulina a partir de células madre diferenciadas programadas
La preparación de células productoras de insulina se realizó en frascos de cultivo de un volumen de aproximadamente 250 ml y paredes planas (frascos de cultivo celular T75). Aproximadamente 5 X 10^{6} de las células preparadas de acuerdo con el ejemplo 13 se suspendieron en aproximadamente 5 ml del medio de cultivo indicado a continuación (medio de diferenciación para células productoras de insulina) y tras colocarlas en los frascos se mezclaron con otros 15 ml de medio de cultivo. Para la diferenciación de las células, los frascos se incubaron en incubadora en posición horizontal a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Medio de cultivo (modificado según Rameya V. K. y col., Nature Medicine, 6 (3), 278-282 (2000))
RPMI 1640 445 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50 ml
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) 5 ml
Nicotinamida 620 mg
Glucosa 360 mg
Volumen total 500 ml
El medio nutriente contenía además 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico y 20 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos.
Las células se adhieren al fondo del frasco de cultivo dentro de la primera hora. La diferenciación de las células madre se siguió por medio de la producción de insulina. A tal fin se cambió el medio de cultivo a intervalos de aproximadamente 2 a 3 días, se recogió el respectivo sobrenadante celular y se congeló a -20ºC. Las células adheridas al fondo del frasco de cultivo pudieron desprenderse, tal como se describe en el ejemplo 2, por tripsinación del fondo.
El contenido de insulina de los sobrenadantes recogidos se midió con ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent-assay) contra insulina humana (Bruhn H. D., Fölsch U. R. (eds.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie (1999), página 189) y se comparó con el valor de control del medio. Los resultados reproducidos en la figura 8 muestran que las células alcanzaron el pico máximo de producción de insulina a los 14 días de cultivo. Las cantidades de insulina producidas por las células tratadas en el curso de la diferenciación aumentaron luego de 14 días hasta 3 \muU/ml, mientras que en el medio de control no se pudo detectar insulina humana. Las barras que aparecen en la figura 8 representan determinaciones triples de tres experimentos aislados independientes.
Además de la determinación de la producción de insulina en las células madre desprogramadas diferenciadas productoras de insulina obtenidas según la invención, se determinó la proporción de células productoras de insulina que, incluso tres semanas después de realizada la indiferenciación expresan el antígeno superficial específico de los monocitos CD14. Se demostró que en gran parte (aproximadamente 30 al 40%) de estas células, aún después de tres semanas de la indiferenciación se detectaba el antígeno superficial específico de los monocitos CD14.
Ejemplo 10 Procedimiento alternativo para preparar hepatocitos a partir de células madre indiferenciadas programables
Como alternativa al uso de un medio acondicionado con hepatocitos (LCCM), tal como se describe en el ejemplo 7, la diferenciación de las células madre en hepatocitos se indujo mediante el medio nutriente (Ha) indicado a continuación. La preparación de hepatocitos a partir de células madre se realizó, a su vez, en frascos de cultivo de un volumen de aproximadamente 250 ml y paredes planas (frascos de cultivo celular T75). Aproximadamente 5 X 10^{6} de las células preparadas de acuerdo con el ejemplo 13 se suspendieron en aproximadamente 5 ml del medio de cultivo mejorado indicado a continuación (Ha, medio de diferenciación para hepatocitos) y luego de colocarlas en los frascos se mezclaron con otros 15 ml de medio de cultivo. Para la diferenciación de las células, los frascos se incubaron en posición horizontal en incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Medio de diferenciación para los hepatocitos (Ha) (modificado según Schwarz y col., "Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells", J. Clin. Invest. 10 (109), 1291-1302 (2002)):
RPMI 1640 445 ml
Suero de ternero fetal (FCS) 50 ml
Solución de penicilina (100 U/l)/estreptomicina (100 \mug/l) 5 ml
Volumen total 500 ml
El medio nutriente contenía además, 3 ng/ ml de factor de crecimiento de fibroblastos 4 ("fibroblast growth factor-4", FGF-4).
Las células se adhieren al fondo del recipiente de cultivo dentro de la primera hora. La diferenciación de las células madre se siguió por medio de la producción de albúmina. A tal fin se cambió el medio de cultivo a intervalos de aproximadamente 2 a 3 días, se recogieron los respectivos sobrenadantes celulares y se congeló a -20ºC. Las células que se adhieren al fondo del frasco de cultivo pudieron desprenderse por tripsinación, tal como se describe en el ejemplo 2.
El contenido de albúmina del sobrenadante reunido en los diferentes intervalos se midió por medio de ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent-assay) contra albúmina humana (de acuerdo con el protocolo de la empresa Bethyl Laboratories Inc. y Schwarz y col. a.a.O.) y se comparó con el valor de control del medio. Los resultados reproducidos en la figura 9 muestran que la producción de albúmina de las células durante el período de 14 a 28 días de cultivo permaneció aproximadamente constante. Las mediciones se realizaron en los días 0 (valor de control del medio),los días 14, 21, 28 y 30 con respecto del momento en que se agregó el medio Ha. Los valores calculados en cada caso fueron de aproximadamente 5 ng/ml, 450 ng/ml, 425 ng/ml, 440 ng/ml y 165 ng/ml. Las barras que aparecen en la figura 9 indican determinaciones triples de tres experimentos individuales independientes.
Ejemplo 11 Comprobación de la coexpresión de albúmina y del antígeno específico de monocitos CD14 en los hepatocitos derivados de células madre indiferenciadas
La comprobación de la coexpresión de albúmina y el antígeno específico de los monocitos CD14 en los hepatocitos derivados de células madre indiferenciadas se realizó tanto por coloración doble (A) como por análisis FACS (B).
A) Las células madre de la invención diferenciadas en hepatocitos de acuerdo con el ejemplo 10 se cultivaron en vidrios de tapa de una placa de 6 pocillos y se fijaron con metanol tal como se describe en el ejemplo 4. A continuación se realizó una doble coloración, a fin de comprobar la expresión simultánea del antígeno CD14 (marcador fenotípico de monocitos), por un lado, y de albúmina (marcador específico del hígado), por otro.
Para ello se incubaron primeramente las células tal como se describe en el ejemplo 4 con un anticuerpo primario contra albúmina humana (cobayos contra albúmina humana) en una dilución de 1:50 en PBS. Luego de una fase de lavado, las células se incubaron con un anticuerpo secundario ratón anti-rata, que fija el anticuerpo del cobayo, también en una dilución de 1:50 en PBS durante 45 minutos. A continuación se realizó el proceso de coloración de acuerdo con el ejemplo 4 según el procedimiento de Cordell J. L., y col. (a.a.O.) con el complejo rojo APAAP.
Para la segunda fase de coloración, las células se incubaron con el anticuerpo primario ratón anti-humano-CD14, y luego de una fase de lavado según el ejemplo 4 se colorearon con el kit ABC de estreptavidina de vectastaína (Vector) de acuerdo con el procedimiento de Hsu, S. M., y col. "The use of antiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics" Am. J. Clin. Patol. 75 (6): 816-821 (1981) con el complejo DAB (marrón) (Vector Laboratories).
Finalmente se realizó la contracoloración de núcleo con hemalauna tal como se describe en el ejemplo 4, así como la encapsulación en gelatina de glicerina Kaiser.
Los resultados se reproducen en la figura 10. La figura muestra la expresión del antígeno CD14 con una coloración marrón, que se reduce lentamente a medida que avanza la transformación morfológica de las células en hepatocitos, mientras que la expresión de albúmina aumenta como coloración roja a medida que maduran los hepatocitos. La imagen Nº4 en la figura 10 muestra las células luego de una estimulación de tres semanas con el medio acondicionado con hepatocitos.
B) Paralelamente a la marcación doble, las células madre de la invención diferenciadas en hepatocitos se sometieron a un análisis FACS ("Fluorescence-activated cell sorting").
Primeramente se cosecharon las células madre de la invención diferenciadas en hepatocitos de acuerdo con el ejemplo 10 desprendiéndolas mecánicamente del frasco de cultivo con un raspador de células. Las células se lavaron cuidadosamente con PBS del frasco y se lavaron dos veces en 10 ml de solución de PBS por vez. Para ello, se colocaron las suspensiones de células en la solución de PBS en un tubito de centrifugación de 15 ml y se sedimentaron a 1600 revoluciones por minuto. El sedimento celular resultante se diluyó con PBS de manera tal de que hubiera exactamente 1 x 10^{5} células en 100 \mul de PBS.
A esta suspensión celular se agregaron luego 10 \mul de marcador de anticuerpo anti-CD14 marcado con FITC (BD Pharmingen) o anticuerpo anti-albúmina marcado con FITC (Beckmann) y anticuerpo IgGl-ratón-anti-humano inespecífico marcado con FITC. Luego de un período de incubación de 20 min se volvieron a suspender las células dos veces en 500 \mul de PBS y se sedimentaron durante 5 minutos, cada vez a 1600 revoluciones y por último se aspiraron en 200 \mul de PS. Luego de la resuspensión de las células se midió la fluorescencia con un citómetro de flujo FACScalibur BD de la empresa BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) (véase Bruhn H. D., Fölsch U. R. (eds.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie, 395-403 (1999); y Holzer U. y col., "Differential antigen sensitivity and costimulatory requirements in human t1 and t2 antigen-specific CD4(+) cells with similar TCR avidity" J. Immunol. 170 (3): 1218-1223 (2003)). La evaluación de los resultados se realizó con el programa WinMDI de la empresa Microsoft siguiendo el ejemplo de Marquez M. G., y col. "Flow cytometric analysis of intestinal intra-epithelial lymphocytes in a model of immunodeficiency in Wistar rats." Cytometry 41 (2): 115-122 (2000).
Los resultados del análisis FACS se han vertido en la figura 11. La figura muestra la expresión del antígeno CD14 (línea superior) y el antígeno de albúmina (línea inferior), que se midió en los monocitos indiferenciados (columna izquierda) y en las células madre de la invención diferenciadas de los hepatocitos (columna derecha). En los monocitos indiferenciados pudo comprobarse una fuerte expresión del CD14, pero ninguna de la albúmina, mientras que en los hepatocitos desarrollados a partir de monocitos indiferenciados se pudo comprobar una expresión menor del CD14 y una expresión muy fuerte de la albúmina.
Ejemplo 12 Uso in vivo de células madre indiferenciadas programadas de origen monocitario
Para clarificar en qué medida las células madre programables sufren, in vivo, una diferenciación específica luego de una inyección en el hígado, a través de la vena porta de un animal receptor genéticamente idéntico una diferenciación específica debido a los señalizadores existentes en el hígado, primeramente se trataron hígados de ratas hembra LEW con retrorsina, a fin de inhibir los hepatocitos existentes en el hígado (células parenquimales hepáticas) en su actividad proliferativa (Ref. Lacone, E., y col. "Longterm, near total liver replacement by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with retrorsine" Am. J. Pat. 153: 319-329 (1998)).
A tal fin, las ratas LEW recibieron una inyección por vía intraperitoneal de 30 mg del alcaloide de pirrolicidina retrorsina, dos veces en el curso de 14 días. Luego se realizó una resección del 80% de los hígados pretratados de esta manera, seguida de la administración de 5 x 10^{5} de las células madre programables en 1 ml de PBS en la vena porta de los hígados restantes. Las células madre se obtuvieron de monocitos de ratas macho LEW, tal como se describió en el ejemplo 2. A los 5 días de la administración de las células madre se realizó una biopsia de los hígados para su evaluación histológica y para comprobar los tipos celulares diferenciados de las células madre por medio de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) con sondas específicas de cromosoma Y, tal como se describe detalladamente en Hoebee, B.y col. "Isolation of rat chromosome-specific paint probes by bivariate flow sorting followed by degenerate oligonucleotide primed-PCR." Cytogenet Cell Genet 66: 277-282 (1994).
La figura 7A muestra los hepatocitos positivos de cromosoma Y (puntos rojos en el núcleo celular) derivados de células madre de LEW macho el quinto día posterior a la inyección intraportal de animales receptores hembras pretratados con retrorsina que habían sufrido una resección de 80% del hígado. La extracción selectiva de los mismo hígados el día 25 posterior a la inyección de células madre indica la diferenciación de las células madre en hepatocitos, células endoteliales y epitelios del conducto biliar. En este momento, el tamaño del hígado ya había vuelto a alcanzar su tamaño normal y > 90% de las células presentaban un cromosoma Y. De aquí puede inferirse que las células madre programables singénicas de origen monocitario inyectadas están en condiciones de efectuar in vivo, una recomposición completa del órgano hepático con una función metabólica normal. La figura 7C muestra las respectivas curvas de supervivencia según Kaplan-Meier (n = 4 por grupo), ratas tratadas con células madre versus ratas receptoras no tratadas luego de la aplicación de retrorsina y resección del 80% del hígado.
Los parámetros funcionales de la bilirrubina y el amoníaco (NH_{3}) documentan la función metabólica total de los animales tratados con células madre de larga supervivencia (figuras 7D y 7E).
Ejemplo 13 Reproducción e indiferenciación de los monocitos en frascos de cultivo celular
Se realizó un cultivo y reproducción de monocitos y la indiferenciación de las células en gran escala en frascos de cultivo con el mismo medio nutriente usado para el cultivo en placas con pocillos (véase el ejemplo 2). El medio nutriente contenía 2,5 \mug/500 ml de M-CSF (equivale a 2150 U) y 0,2 \mug/500 ml de interleucina 3 (IL-3).
Los monocitos aislados en el ejemplo 1 se colocaron en el fondo de frascos de cultivo de un volumen de aproximadamente 250 ml y paredes planas (frascos de cultivo celular T75). Se pasaron aproximadamente 10 x 10^{6} células a cada uno de los frascos y se completaron con 20 ml del medio nutriente indicado más arriba. La determinación de la cantidad de células para la dosis exacta por frasco se realizó según procedimientos conocidos, véase Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation" en Methods of Tissue Engineering, Academic Press (2002), capítulo 4, páginas 55-84.
El frasco de cultivo celular se incubó durante 6 días en incubadora a 37ºC. Las células se depositaban a las 24 horas en el fondo del envase. Cada dos días se retiró el sobrenadante y los frascos se llenaron nuevamente con 20 ml de medio nutriente nuevo.
El sexto día se enjuagaron los frascos con 10 ml de PBS cada uno, después de haber pipeteado el medio nutriente. Con este procedimiento se retiraron todas las células que no se habían adherido al fondo de los frascos. Las células que crecieron adheridas al fondo de los frascos se desprendieron con un raspador de células. Las células sueltas se eliminaron de los frascos por lavado con PBS y se reunieron en un tubo Falcon de 50 ml que se centrífugo durante 10 minutos a 1800 rpm. El sobrenadante se desechó y el sedimento se volvió a suspender en medio nuevo RPMI 1640 (2 ml/10^{5} células).
Esta suspensión celular pudo utilizarse directamente para la diferenciación de diversas células diana.
Como alternativa, después de la centrifugación las células se mezclaron con DMSO/FCS como medio de congelación y se congelaron en una concentración de 10^{6}/ml.
El medio de congelación contenía 95% de FCS y 5% de DMSO. Aproximadamente 10^{6} células se tomaron en 1 ml de medio y se enfriaron en las siguientes etapas:
30 minutos sobre hielo;
2 horas a -20ºC en cajas de telgopor prerrefrigeradas;
24 horas a -80ºC en telgopor;
almacenamiento en tubos en nitrógeno líquido (N_{2}) a -180ºC

Claims (43)

1. Proceso para la producción de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario humano, caracterizado porque consiste en:
(a)
Multiplicar los monocitos de sangre humana aislada en un medio de cultivo adecuado que contiene el factor de crecimiento celular M-CSF,;
(b)
Cultivar los monocitos durante o después de la etapa a) con un medio de cultivo que contiene IL-3; y
(c)
Obtener las células madre humanas adultas indiferenciadas programables, separando las células del medio de cultivo.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) se agrega también un compuesto mercapto al medio de cultivo.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque se usa un compuesto mercapto en el que por lo menos un grupo carbono está unido al azufre, y en el que el grupo(s) hidrocarburo puede estar sustituido/s por uno o varios otros grupos funcionales.
4. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque, el compuesto mercapto es 2-mercaptoetanol o dimetilsulfóxido.
5. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a continuación de la etapa b) y antes de la etapa c), las células se ponen en contacto con un disolvente orgánico biológicamente aceptable.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el disolvente orgánico biológicamente aceptable es un alcohol con 1-4 átomos de carbono.
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el alcohol es etanol.
8. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque las células se ponen en contacto con la fase gaseosa del disolvente orgánico biológicamente aceptable.
9. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las células se suspenden en un medio de cultivo celular apropiado a continuación de la etapa c).
10. Proceso de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el medio es RPMI o DMEM.
11. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque el medio contiene una citoquina o LIF.
12. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque las células se suspenden en un medio líquido y a continuación se congelan.
13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el medio es un medio de cultivo celular.
14. Células madre indiferenciadas, programables, de origen monocitario humano caracterizadas por el antígeno de superficie monocitario específico CD14 y al menos un marcador de pluripotencia seleccionado del grupo compuesto por CD117, CD123 y CD135.
15. Composición farmacéutica, que contiene las células madre indiferenciadas, programables de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Uso de las células madre indiferenciadas, programables de acuerdo con la reivindicación 14, para producir células diana y tejidos diana in vitro.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque
a)
se tritura tejido que contiene las células diana deseadas;
b)
se obtienen las células diana y/o fragmentos de las mismas del tejido triturado;
c)
se incuban las células diana y/o fragmentos de las mismas en un medio de cultivo apropiado;
d)
se recolecta el sobrenadante del medio de cultivo durante y después de la incubación como medio acondicionado por células diana; y
e)
se dejan crecer las células madre en presencia del medio acondicionado por células diana para reprogramar/diferenciar las células madre en las células madre deseadas.
18. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 16 ó 17 para la producción de adipocitos, neuronas y células gliales, células endoteliales, queratinocitos, hepatocitos o células de islote.
19. Proceso para la producción de células madre programables indiferenciadas modificadas transgénicamente de origen monocitario humano, caracterizado porque las células producidas según las reivindicaciones 1 a 13 se transfectan con uno o más genes.
20. Células madre de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizadas porque las células madre programables indiferenciadas son modificadas transgénicamente por transfección con uno o más genes.
21. Composición que contiene células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 en un medio adecuado.
22. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la cirrosis hepática.
23. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la insuficiencia pancreática.
24. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la insuficiencia renal aguda y crónica.
25. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de hipofunciones hormonales.
26. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento del infarto cardíaco.
27. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la embolia pulmonar.
28. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de la apoplejía cerebral.
29. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico para el tratamiento de daños cutáneos.
30. Uso de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 para la preparación de un compuesto farmacéutico apropiado para la preparación in vivo de células y tejidos diana.
31. Tejidos diana somáticos y células de tejidos diana somáticos aislados diferenciados, obtenidos por reprogramación de las células madre de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20, caracterizados por el antígeno de superficie CD14 asociado a la membrana.
32. Células y/o tejidos diana somáticas de acuerdo con la reivindicación 31, seleccionados del grupo formado por adipocitos, neuronas y células gliales, células endoteliales, queratinocitos, hepatocitos y células de islote.
33. Células diana y/o tejidos diana somáticas de acuerdo con las reivindicaciones 31 ó 32, caracterizadas porque se transfectan con uno o más genes.
34. Materiales implantables recubiertos con una capa de las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 o las células diana y/o tejidos diana somáticos de acuerdo con las reivindicaciones 31 a 33.
35. Materiales implantados de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizados porque los materiales son prótesis.
36. Materiales implantables de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizados porque las prótesis se seleccionan del grupo formado por válvulas cardíacas, prótesis vasculares, prótesis óseas y de cartílagos.
37. Materiales implantables caracterizados porque son materiales de soporte artificiales y/o biológicos que contienen las células madre indiferenciadas programables de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 20 o las células diana de acuerdo con las reivindicaciones 31 a 33.
38. Materiales implantables de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizados porque los materiales de soporte son bolsas o cámaras para su introducción en el cuerpo humano.
39. Uso de una bolsa o una cámara de acuerdo con la reivindicación 38 que contiene células de islote de acuerdo con la reivindicación 32 para la producción de una estructura farmacéutica adecuada para ser usada como cámara de entrada de células de islote artificial para el suministro de insulina.
40. Uso de una bolsa o una cámara de acuerdo con la reivindicación 38, que contiene adipocitos de acuerdo con la reivindicación 32 para la producción de una estructura farmacéutica que comprende polímeros artificiales llenos de adipocitos, adecuados para reconstruir el pecho después de operaciones y en otras indicaciones de corrección plástica y/o cosmética.
41. Materiales implantables de acuerdo con la reivindicación 34 o 38, caracterizados porque son sistemas de cámara de entrada semipermeables que contienen células diana somáticas, aisladas, diferenciadas de acuerdo con las reivindicaciones 31 ó 32.
42. Uso del sistema de cámara de entrada semipermeable de acuerdo con la reivindicación 41 para la producción de una estructura farmacéutica adecuada para el tratamiento in vivo de enfermedades endocrinas, metabólicas o hemostáticas.
43. Uso de M-CSF y IL-3 caracterizado porque es para la producción de células madre indiferenciadas programables de origen monocitario humano en un medio de cultivo.
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