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WO2013180395A1 - 다능성 줄기세포의 제작, 유지, 증식을 증진하는 대사산물 및 이를 포함하는 조성물과 배양방법 - Google Patents

다능성 줄기세포의 제작, 유지, 증식을 증진하는 대사산물 및 이를 포함하는 조성물과 배양방법 Download PDF

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WO2013180395A1
WO2013180395A1 PCT/KR2013/003655 KR2013003655W WO2013180395A1 WO 2013180395 A1 WO2013180395 A1 WO 2013180395A1 KR 2013003655 W KR2013003655 W KR 2013003655W WO 2013180395 A1 WO2013180395 A1 WO 2013180395A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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cells
stem cells
pluripotent stem
nicotinamide
cell
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/003655
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English (en)
French (fr)
Inventor
조이숙
손명진
손미영
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
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Priority to KR1020130061290A priority patent/KR101656388B1/ko
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/60—Transcription factors
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    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising nicotine amide effective for promoting the differentiation of differentiated cells / somatic cells into pluripotent stem cells, a cell culture comprising the same, and a dedifferentiated pluripotent stem using the same
  • the present invention relates to a cell production method and a method for maintaining and culturing a pluripotent stem cell including the dedifferentiated pluripotent stem cells in an undifferentiated state.
  • the present invention also relates to a composition for improving mitochondrial function involved in cell fate determination of pluripotent stem cells containing nicotinamide and a cell culture comprising the same.
  • Stem cell is a cell that can be differentiated tissue-specifically to have a specific function and form, given the excellent self-proliferative capacity and given a certain environment and conditions while maintaining an undifferentiated state.
  • human pluripotent stem cells including human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, grow indefinitely under appropriate in vitro culture conditions. It is capable of self-renewal, has a characteristic (pluripotent or pluripotency) capable of differentiating into all kinds of cells, and includes embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. It is included in pluripotent stem cells.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • dedifferentiation technology enables the production of stem cells with the same characteristics as human embryonic stem cells using self-somatic cells that can be obtained in a relatively easy manner without causing any special damage to the patient. It is recognized as a technology that can supply the most useful cellular resources.
  • human pluripotent stem cells are co-cultured with feeder cells, such as mouse embryonic fibroblasts (MFEs), or cultured in conditioned media in which the feeder cells are grown. Can be maintained and cultured.
  • feeder cells such as mouse embryonic fibroblasts (MFEs)
  • MFEs mouse embryonic fibroblasts
  • both direct culture in animal feeder cells or culture methods using feeder cell cultures carry the risk that one or more infectious agents, such as viruses, can spread from animal cells to human embryonic stem cells.
  • stem cells may be used to culture cells of other species or media used to culture cells of other species because one of the aims of culturing human embryonic stem cells is ultimately to produce tissue that can be implanted into the human body. It is required that no exposure has been made.
  • the present inventors have found that in order to discover a new pluripotency factor that is effective in maintaining and culturing undifferentiated human pluripotent stem cells and inducing dedifferentiation to produce human pluripotent stem cells from somatic cells.
  • nicotine amide which plays an important role in cell metabolism, is added to the culture medium at an appropriate concentration, it not only dramatically improves the efficiency of inducing differentiation for producing human pluripotent stem cells but also human pluripotent stems.
  • the present invention has been completed by verifying that the cells effectively maintain the undifferentiated state and effectively culture.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing dedifferentiated pluripotent stem cells from differentiated cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for culturing dedifferentiated pluripotent stem cells in an undifferentiated state.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for improving mitochondrial function of pluripotent stem cells containing nicotinamide.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for maintaining pluripotent stem cell undifferentiated state, including nicotinamide.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for culturing to maintain an undifferentiated state of pluripotent stem cells.
  • the present invention when nicotine amide is added to the reverse differentiation induction culture process for producing pluripotent stem cells in human differentiated cells, not only can the efficiency of reverse differentiation induction be enhanced, but also the time required for induction of reverse differentiation is remarkably reduced. Can be reduced. Nicotinamide has been shown to effectively improve the conditions of induction of differentiation by inhibiting senescence induction and oxidative stress and inducing cell proliferation and mitochondrial activity.
  • the present invention contributes to optimizing the manufacturing process of induced pluripotent stem cells from a small amount of patient-specific somatic cells obtained from various sources, thereby drastically improving and commercializing the development of clinically applicable personalized stem cell therapeutics and drug development. It will contribute to speeding up the time.
  • nicotine amide may be an effective culture medium composition for maintaining the undifferentiated state of human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which are representative pluripotent stem cells. Undefined in culture conditions.
  • the present invention is expected to be useful for developing a high efficiency human pluripotent stem cell mass culture system required for the industrialization of human pluripotent stem cells.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the expression of major enzymes in the NAD + (nicotinamide adenine dinucleotide) biosynthesis process in embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • FIG. 1A As a result of microarray analysis, expression of increased enzymes in undifferentiated stem cells was indicated by ⁇ arrow, and decreased enzymes by ⁇ arrow.
  • FIG. 1 b The expression of NAD + biosynthesis-related enzymes in undifferentiated (Un), differentiated (Diff) embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells was expressed by the difference in the number of ⁇ or ⁇ arrows.
  • FIG. 1c Analysis of the expression of major enzymes by real-time polymerase chain reaction (values represent mean values SE), * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, based on t-test).
  • Figure 2 is a result of confirming the effects of nicotinamide and NAD precursor when NAD + synthase inhibitor FK866 treatment in embryonic stem cell culture process.
  • Aa When FK866 and NAD precursors are treated in embryonic stem cells, the result is the measurement of intracellular NAD concentration, and
  • Ab the result of quantifying AP activity under the conditions.
  • Ba cell number was quantified and
  • Bb the degree of apoptosis was quantified (value represents mean value SE), * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, by t-test).
  • Figure 3 is the result of confirming the effect of nicotinamide upon treatment with NAD + synthesis inhibitor FK866 in mTeSR1 chemically defined medium (mTeSR1 CDM) culture conditions.
  • A The results of measurement of intracellular NAD concentrations in embryonic stem cells treated with FK866 and nicotinamide in mTeSR1 culture conditions, and
  • B the quantification of AP activity under those conditions (value represents mean ⁇ SE, * p ⁇ 0.05, by t-test).
  • FIG. 5 is a result showing the efficiency of induction of reverse differentiation of induced pluripotent stem cells with nicotine amide treatment time.
  • FIG. 5A AP staining experiments were performed on day 21 after redistribution to matrigel after addition of 1 mM nicotinamide at the induction of reverse differentiation for the indicated periods. The number of AP-positive colonies is indicated and the values represent mean values ⁇ S.E.
  • FIG. 5B After introduction of the retrodifferentiation factor, the number of viable cells was measured after 4 days of incubation with addition of 1 mM nicotinamide.
  • Figure 6 shows the immunostaining results of stem cell markers Nanog and Tra-1-60 according to nicotine amide treatment according to the progress of reverse differentiation (left).
  • Figure 7 shows the result of quantifying the mRNA expression of the stem cell marker Nanog and the infinite growth regulator TERT by real-time polymerase chain reaction for each differentiation progress, the value represents the mean value ⁇ SE (Control-Control, nicotine amide treatment group) Nam, * p ⁇ 0.05, by t-test).
  • Figure 8 shows the results of quantifying the time required to obtain hiPSCs colonies, the value represents the mean value ⁇ S.E. (Control-Control, nicotinamide treatment group-Nam, ** p ⁇ 0.01, by t-test).
  • FIG. 12 shows the results of confirming the proportion of cells that proliferate using live cell imaging.
  • the image of the stationary cells (red) and the dividing cells (yellow) of the stationary phase at the 12th day of induction of differentiation (up), and the value represents the mean value ⁇ SE (control- Control, nicotinamide treatment group-Nam, size bar 100 ⁇ m, *** p ⁇ 0.001, by t-test).
  • Figure 13 shows the results of staining cell-associated beta galactosidase (Senescent-associated ⁇ -galactosidase, SA- ⁇ -gal) staining.
  • Figure 14 shows the result of measuring reactive oxygen species (ROS, reactive oxygen species).
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 15 shows the results of comparing the degree of protein damage caused by oxidative stress in the control group and the nicotinamide treatment group (Nam) by the time of reverse differentiation progression (above). After correction with the expression level of beta-actin, the degree of damage was quantified with the degree of damage of somatic cells (hFF) as 1, and the value represents the average value S.E. (below). (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, by t-test)
  • Figure 17 shows the results of analysis of the expression of cell aging / death signaling factors by immunostaining.
  • nanog, Tra-1-60, pp53, p53, p27, and p21 were immunostained in the nicotinamide-treated and untreated groups, and the nuclei were stained with DAPI (blue).
  • the protein expression difference of each factor according to the nicotinamide concentration was analyzed by Western blot for each differentiation time.
  • Am-iPS induced pluripotent stem cell line
  • FIG. 22 shows the results of RT-PCR analysis of stem cell marker gene and dedifferentiation factor expression of induced pluripotent stem cell line (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotine amide.
  • Semi-quantitative RT-PCR was performed using transplanted gene-specific PCR primers capable of determining the relative expression between Total, Endo and Retrovirus Expression (Trans) genes.
  • Figure 23 shows the results of analysis of gene insertion in the genome of induced pluripotent stem cell lines (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotine amide.
  • Figure 24 Oct4 and Nanog transcription factor promoters in induced pluripotent stem cell lines (Nam-iPS), H9 human embryonic stem cells (hES) and human fibroblast cells (hFF) derived from human fibroblast cells by addition to nicotinamide
  • Am-iPS induced pluripotent stem cell lines
  • hES H9 human embryonic stem cells
  • hFF human fibroblast cells
  • FIG. 25 shows gene expression profiles of induced pluripotent stem cell lines (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotinamide.
  • Nam-iPS induced pluripotent stem cell lines
  • A Heat map and hierarchical clustering analysis of general gene expression of Nam-iPS, H9 human embryonic stem cells (hES) and human fibroblast cells (hFF), and Pearson correlation were calculated and hierarchical Clustering was performed by the average ligation method. The distance from the comparison between different cell lines was calculated with GeneSpring GX7.3.1 and shown above the tree line. Color bars represent color coded gene expression in log2 size.
  • B Scatter plot comparing gene expression profiles between Nam-iPS, hES and hFF. Stem cell marker genes OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, NANOG, LIN28 and REX1 were indicated.
  • FIG. 26 is a photograph showing the results of RT-PCR showing that trigeminal differentiation ability is preserved through the formation of embryoid bodies of induced pluripotent stem cell lines (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotine amide.
  • Am-iPS induced pluripotent stem cell lines
  • FIG. 27 is an immunocytochemical photograph showing that the germ cell differentiation capacity is preserved through the formation of embryonic bodies of induced pluripotent stem cell lines (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotine amide.
  • Am-iPS induced pluripotent stem cell lines
  • FIG. 28 is a photograph showing teratoma formation for demonstrating in vivo differentiation ability of induced pluripotent stem cell line (Nam-iPS) derived from human fibroblast cells by addition to nicotine amide.
  • Am-iPS induced pluripotent stem cell line
  • FIG. 29 shows the results of culturing human embryonic stem cells when various NAD precursors were added in culture conditions without using feeders.
  • FIG. 30 shows the results of culturing human embryonic stem cells (H9 hES) and human induced pluripotent stem cells (hiPS) under conditions in which nicotine amide was added at various concentrations in culture conditions without using feeder cells.
  • FIG. 31 shows the results of culturing human embryonic stem cells (H9, H1) and human induced pluripotent stem cells (hiPS) when nicotine amide was added at various concentrations in the conditions using the feeder cells and in the culture condition without the feeder cells. It is shown. UM was used for feeder cells, and mTeSR1 CDM was used for feeder cells.
  • a graph showing the relative amounts of AP positive colonies using the AP stained photo (left) and densitometric analysis (right), with mean values ⁇ SE (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, t-test) By).
  • FIG. 34 is a result of confirming that human embryonic stem cells can be maintained in an undifferentiated state when treated with nicotinamide, NAD + precursors Nicotinic acid (NA) and NAD + in a culture medium UM culture condition that is easy to induce differentiation state ( 34a).
  • a of FIG. 34A AP staining photographs of undifferentiated human embryonic stem cell colonies, the lower panel shows the number of AP-positive colonies, and the value represents the mean value ⁇ SE (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, t by -test).
  • B of FIG. 34A It is the result of measuring NAD level.
  • FIG. 34B Low-density assay results.
  • FIG. 35 shows the results of TRA-1-60 staining for long-term culturing in an undifferentiated state of 10 passages or more through addition of 0.1 mM nicotinamide under UM medium conditions.
  • Fig. 36 shows karyotype analysis after long-term passage in nicotine amide-added medium.
  • the present invention provides a composition for promoting reverse differentiation from differentiated cells to pluripotent stem cells, including nicotinamide.
  • nicotinamide (Nicotinamide, Nam, vitamin B3) is one of the water-soluble vitamin and vitamin B complex as an amide of nicotinic acid.
  • Nicotine amide having the molecular formula C 6 H 6 N 2 O exists in vivo as coenzyme-type nicotinamide nucleotides, NAD + and NADP + , and is involved in many oxidation / reduction reactions as coenzymes. Nicotinamide is used as a treatment for chronic alcoholism, angina, and frostbite, and it is found in liver, fish, cereal embryos, yeast, beans, and meat.
  • Nicotinamide is a colorless crystalline powder, like nicotinic acid, is produced from tryptophan and is a vitamin widely distributed in animals and plants.
  • Pellagra a nicotinamide deficiency, causes dermatitis, diarrhea, delirium, and anxiety, leading to death, and excessive ingestion of the liver, ulceration of the liver, and diabetes.
  • NAD + means Nicotinamide Adenine Dinucleotide
  • NADP + means Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phospate.
  • Nicotinic acid (NA) was used as one of the precursors of NAD + .
  • the term "differentiation” refers to a phenomenon in which cells divide and proliferate, and the structure or function of the cell is specialized while the entire individual is growing. In other words, it refers to a process in which cells, tissues, etc. of an organism are transformed into suitable forms and functions to play a role given to each.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells are differentiated into ectoderm, mesoderm, and endoderm cells, and narrowly, hematopoietic stem cells into red blood cells, white blood cells, platelets, and the like.
  • differentiated cell refers to a cell that has undergone the differentiation process and has a certain form and function.
  • the differentiated cells of the present invention are not particularly limited but are preferably somatic cells or progenitor cells. Also preferably cells derived from humans.
  • the term "somatic cells” refers to all cells that have completed differentiation constituting the flora and fauna except germ cells, and has the characteristic that the chromosome maintains 2n.
  • neuroblasts neurovascular stem cells
  • myoblasts progenitor cells for myotubes.
  • pluripotent stem cell in the present invention refers to a pluripotent or totipotent self-renewal capable of differentiating into cells of all tissues of an individual.
  • Stem cells including but not limited to embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells include all-derived pluripotent stem cells, such as humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, and the like. Preferably, they are human-derived pluripotent stem cells. .
  • embryonic stem cell refers to an inner cell mass extracted from an blastocyst embryo immediately before implantation of a fertilized egg into the mother's uterus and cultured in vitro, to differentiate into cells of all tissues of the individual. It refers to a cell having a pluripotent or pluripotent or self-renewal capable of being pluripotent, and in a broad sense, an embryoid derived from embryonic stem cells. bodies).
  • Embryonic stem cells of the present invention include embryonic stem cells of all derived from humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., preferably human embryonic stem cells.
  • induced pluripotent stem cells refers to cells induced to have pluripotent differentiation ability through artificial dedifferentiation from differentiated cells and is also called induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Artificial dedifferentiation process is performed by the use of virus-mediated or non-viral vectors with retroviruses and lentiviruses, introduction of non-virus-mediated dedifferentiation factors using protein and cell extracts, or by stem cell extracts, compounds, etc. Includes reverse differentiation process.
  • Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically, have similar cell shapes, similar gene and protein expression patterns, and pluripotency in vitro and in vivo .
  • Induced pluripotent stem cells of the present invention include all induced pluripotent stem cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., but preferably induced pluripotent stems derived from humans It is a cell.
  • the term "de-differentiation” refers to a process by which differentiated cells can be restored to a state having the potential to differentiate into a new type.
  • the reverse differentiation is used in the present invention with the same meaning as cell reprogramming.
  • This mechanism of cell differentiation means establishing a different set of epigenetic marks after the epigenetics in the nucleus (the DNA state associated with causing a genetic change in function without a change in nucleotide sequence) are deleted. While multicellular organisms differentiate and grow, different cells and tissues acquire different gene expression programs.
  • the term "promoting dedifferentiation” refers to the process of dedifferentiation occurring rapidly or increasing the efficiency of dedifferentiation during dedifferentiation. That is, to enhance the efficiency of dedifferentiation in terms of speed or ratio.
  • the expression of major enzymes of the NAD + biosynthesis process in embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells was analyzed using microarray and real-time polymerase chain reaction (Fig. 1). As a result, it was confirmed that the expression of NAD + biosynthesis-related enzymes was increased in undifferentiated embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, and their expression decreased during differentiation (FIG. 1).
  • FK866 a NAD + synthetase inhibitor
  • mTeSR1-CDM mTeSR1 chemically defined medium
  • composition of the present invention is preferably in the form of a culture medium. Therefore, the composition of the present invention may further include a substance generally included in the cell culture medium, so long as the differentiated cells do not interfere with the reverse differentiation into pluripotent stem cells.
  • the composition for promoting reverse differentiation of the differentiated cells of the present invention into stem cells having pluripotency includes nicotinamide at a concentration that does not harm the survival and function of the cells.
  • the final concentration may include nicotinamide at a concentration of 0.01 or more and 20 mM or less, and more preferably, nicotinamide at a concentration of 0.05 or more and 10 mM or less. Most preferably it may comprise nicotinamide at a concentration of 0.1 to 5 mM (FIG. 4).
  • the composition for promoting reverse differentiation of differentiated cells into pluripotent stem cells may include one or more reverse differentiation inducers.
  • the term "de-differentiation inducer” refers to a substance which induces finally differentiated cells to be differentiated into induced pluripotent stem cells having a new type of differentiation potential.
  • the reverse differentiation inducer may be included without limitation so long as it is a substance that induces reverse differentiation of differentiated cells, and may be selected according to the type of cells to be differentiated.
  • Preferably, but not limited to, further comprises a protein selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 and Rex1 or a nucleic acid molecule encoding these proteins as inducer. More preferably, Oct4 proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins, and Oct4, Sox2, KlF4 and c-Myc proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins.
  • a "nucleic acid molecule encoding a protein” may be in a form operably linked to a promoter to express the protein as it is delivered into a cell, and inserted into a chromosome in a cell to express the protein. It includes a wide range of nucleic acid molecules that can be.
  • a nucleic acid molecule encoding at least one protein selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 and Rex1 as a reverse differentiation inducer is operably linked in an expression vector. It may be delivered into the cell, or may be delivered into the cell in the form of insertion into the chromosome of the host cell.
  • the reverse differentiation factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc expressing nucleic acid molecules were transduced into human fibroblasts via retroviral 1 MOI to induce differentiation.
  • the variation in induction of retrodifferentiation induced by the addition of nicotinamide and other NAD + precursors at different concentrations and time periods was observed.
  • the reverse differentiation induction efficiency increased by about 17 times (FIG. 4).
  • the retrodifferentiation efficiency was positive for the hESC-specific factor Alkaline phosphatase (AP) staining and was calculated by measuring the number of colonies with hESC-like morphology.
  • AP Alkaline phosphatase
  • the result of confirming the reverse differentiation induction efficiency at different concentration conditions is determined that the inverse differentiation induction efficiency is dependent on the nicotinamide concentration. It was confirmed to increase.
  • nicotinamide was similarly treated with 1 (5 days after virus infection, FIG. 5A; condition b), 2 (up to 12 days after 5 days of virus infection, FIG. 5A; condition c), 3 (for 5-7 days) 5A; condition d), 4 days (12 days after virus infection, up to 26 days after infection, FIG. 5A; condition e), the first 5 days immediately after virus infection
  • Fig. 5A it was confirmed that the treatment after 7 days in three different stages improved more effectively the differentiation efficiency
  • Nicotinamide was similarly treated for 1 to 12 days (12 days after virus infection, FIG. 5A; condition f), 2 (up to 19 days after 5 days of virus infection, FIG. 5A; condition g), stage 3 (viral infection) After 12 days to 26 days, when treated in FIG. 5A; condition h), human embryonic stem cell cultures were transferred to a new culture dish after 5 days of culture in a differentiation cell culture medium for the first 12 days immediately after the first stage of viral infection. In the case of additional 7-day culture in the medium) it was confirmed that after the treatment for 14 days in different two stages more effectively enhance the differentiation efficiency (Fig. 5A). 3) When nicotinamide is similarly treated in 19-21 days divided into 1 (19 days after virus infection, FIG.
  • Nicotineamide is also advantageous for promoting cell growth even after dispensing, indicating that it is associated with the efficiency of inducing differentiation.
  • the expression pattern of hESC-specific factors was verified for each time period in order to determine whether nicotine amide can promote kinetics in the reverse differentiation-inducing culture process and shorten the time required for inducing differentiation.
  • the expression of hESC-specific factors appeared earlier compared to the untreated control group when induced differentiation under the nicotinamide treated condition.
  • Fig. 8 it was confirmed that nicotine amide can effectively shorten the time required for induction of reverse differentiation by promoting reverse differentiation kinetics.
  • Fig. 10 induce differentiation-induced culture under nicotine amide treatment conditions at different concentrations and time periods, and by measuring the total cell number nicotine amide cells growth and proliferation in the process of reverse differentiation-induced culture It was confirmed that there is an effect to promote (Fig. 10). It can be seen that the increase in the number of cells was significantly slowed under the conditions in which OSKM was transduced compared to the control without transduction of OSKM. When nicotine amide was treated under the same conditions, the slowing of cell growth was relatively improved (FIG. 10). ). Additionally, cell proliferation mutations during reverse differentiation-induced culture were confirmed by BrdU assay method (FIG. 11) and live-cell imaging (FIG. 12) to confirm cell cycle. It was observed that the treatment was significantly improved in a concentration-dependent manner, wherein the optimal concentration for promoting cell growth was 1 mM (FIGS. 10 and 11).
  • SA- senescent-associated ⁇ -galactosidase
  • OSKM oxidized glutathione
  • SAHF senescence-associated heterochromatic foci
  • the embodiment of the present invention confirmed that nicotine amide affects oxidative stress, mitochondrial activity variation, etc., which is known as another obstacle of induction of dedifferentiation in the process of induction of dedifferentiation, and is increased intracellularly by OSKM transduction. It was found that there is an effect of lowering ROS level (FIG. 14) and protein oxidation level (FIG. 15) and enhancing reduced mitochondrial activity (FIG. 16).
  • nicotinamide contributes to enhancing the efficiency of induction of differentiation by effectively inhibiting cell aging and killing induced by the differentiation process.
  • pluripotent stem cells prepared under conditions treated with nicotinamide maintain hESC-like morphology during continuous culture, expressing hESC-specific factors at levels similar to hESC (FIG. 21). 22), all four transgenes (OSKMs) used to induce differentiation are inserted into the host cell genome (FIG. 23), and the hESC-specific promoters (Oct4, Nanog) methylation with levels similar to hESCs (FIG. 24).
  • Global gene expression patterns were shown (FIG. 25) and verified to have the ability to differentiate into trioderm in vitro (FIGS. 26 and 27) and in vivo (FIG. 28).
  • a method of producing a dedifferentiated pluripotent stem cell from differentiated cells comprising: (a) delivering a dedifferentiation inducer to the differentiated cells; And (b) culturing the differentiated cells in a medium containing the composition according to the present invention.
  • the method for delivering the reverse differentiation inducer of step (a) to the differentiated cells may be any method that provides nucleic acid molecules or proteins to cells commonly used in the art, but is preferably a reverse differentiation inducer. Is injected into a culture of differentiated cells, a method of injecting a reverse differentiation inducer directly into a differentiated cell or differentiated into a virus obtained from a packaging cell transfected with a viral vector into which a gene of a reverse differentiation inducer is inserted. The method can be used to infect cells.
  • the method of directly injecting the reverse differentiation inducer into the differentiated cells may be used by selecting any method known in the art, but is not limited thereto, and may include, but is not limited to, microijection, electroporation, and particles. It may be appropriately selected and applied from a method using a particle bombardment, a direct muscle injection method, an insulator and a transposon.
  • the reverse differentiation inducer may be selected according to the type of cells to be reverse differentiated, but is not limited thereto, preferably Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 and Rex1. It may further comprise any one or more proteins selected from the group consisting of or any one or more nucleic acid molecules encoding these proteins, more preferably may comprise an Oct4 protein or nucleic acid molecules encoding these proteins, Oct4, Sox2 , KlF4 and c-Myc proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins.
  • the packaging cells may be used by selecting a variety of cells known in the art according to the viral vector used, but is not limited thereto, preferably GP2-293 packaging cells can be used.
  • the viral vectors may be retroviruses, for example, human immunodeficiency virus (HIV), Murine leukemia virus (MLV), Avian sarcoma / leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), and Rous sarcoma virus (RSV). and vectors derived from lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes simplex virus, etc., such as mMTV (Mouse mammary tumor virus).
  • mMTV Mae mammary tumor virus
  • the present invention is not limited thereto, and preferably, a retroviral vector may be used, and more preferably, a retroviral vector pMXs may be used.
  • steps (a) and (b) may be performed simultaneously, sequentially or in reverse order, and the method may further comprise separating embryonic stem cell-like colonies from the culture obtained from step (b). have.
  • De-differentiated pluripotent stem cells prepared by the production method may include all in vitro cell cultures obtained by treating the dedifferentiation promoting composition comprising nicotine amide and dedifferentiation inducer to the differentiated cells. have.
  • Cell culture in the present invention may include a variety of cells in the process of reverse differentiation and various proteins and enzymes, transcripts and the like obtained in the process of culturing them and the culture solution containing them.
  • Differentiated cells and pluripotent stem cells of the present invention are as described above.
  • Reverse differentiation from the differentiated cells into pluripotent stem cells promote cell growth and proliferation, inhibit cell death, enhance mitochondrial activity, inhibit aging, or reduce oxidative stress in dedifferentiated cells compared to differentiated cells.
  • P53 signaling may be inhibited, dedifferentiation induction time may be shortened, or dedifferentiation induction efficiency may be enhanced.
  • transduction of the differentiation inducer the cell growth and proliferation is enhanced compared to the cells differentiated from the differentiated pluripotent stem cells cultured in the culture medium containing nicotinamide, cell death It was confirmed that the inhibition, the mitochondrial activity is enhanced, aging is inhibited, oxidative stress is reduced, p53 signaling is inhibited, reverse differentiation induction time is shortened, reverse differentiation induction efficiency is enhanced.
  • the present invention provides a medium composition for maintenance or culture of undifferentiated pluripotent stem cells comprising nicotinamide.
  • the present invention provides a method for culturing dedifferentiated pluripotent stem cells prepared by a method for producing dedifferentiated pluripotent stem cells from differentiated cells of the present invention in a medium containing nicotinamide.
  • a method of culturing the dedifferentiated pluripotent stem cells in an undifferentiated state That is, pluripotent stem cells including the dedifferentiated pluripotent stem cells are continuously cultured in a medium containing nicotinamide to provide an environmental condition for maintaining undifferentiated state and pluripotency.
  • the "undifferentiated state” broadly encompasses all of the states in which the cells are not finally differentiated, specifically, a state in which the pluripotent stem cells of the present invention are no longer differentiated or dedifferentiated from the initial state. Means.
  • the present invention provides a composition for maintaining a pluripotent stem cell undifferentiated state, including nicotinamide.
  • the composition may be a culture medium, the nicotinamide concentration in the composition in the form of a culture medium may be 0.01 mM to 20 mM.
  • the medium composition may further include one or more of the composition of the known CDM, it is possible to improve the composition and efficacy of the CDM by adding nicotinamide.
  • the representative human pluripotent stem cells H9 human embryonic stem cells are cultured using unconditioned medium (UM) which is a culture condition that is easy to induce differentiation and NAD + precursors (L) containing nicotinamide (L).
  • UM unconditioned medium
  • NAD + precursors L
  • NAD + precursors
  • FIG. 29 it was confirmed that induction of differentiation was most effectively suppressed in the UM culture condition treated with nicotinamide and the undifferentiated state was maintained at the level cultured in a conditioned medium (FIG. 29).
  • concentrations effective for maintaining undifferentiated state of human pluripotent stem cells including human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells range from 0.1 to 5 mM concentration (FIG. 30).
  • nicotinamide in one embodiment of the present invention, as a result of analyzing the effects of nicotinamide in two types of undifferentiated human embryonic stem cell lines (H1 and H9) established independently of each other, in the conditions of using or not using MEF feeder cells.
  • H1 and H9 undifferentiated human embryonic stem cell lines
  • nicotinamide-treated culture to investigate whether nicotinamide effective for maintaining undifferentiated state of human pluripotent stem cells also affects cell proliferation of human pluripotent stem cells. It was confirmed that cell growth was significantly increased under the conditions (FIG. 32).
  • the concentration of nicotinamide used in the undifferentiated culture conditions of human pluripotent stem cells preferably includes nicotinamide at a concentration of 0.01 or more and 20 mM or less, and more preferably 0.05 or more and 10 mM or less. Concentrations of nicotinamide may be included. Most preferably it may comprise nicotinamide at a concentration of at least 0.1 and up to 5 mM (FIGS. 29-32).
  • the present invention provides a composition for maintaining or improving mitochondrial function of pluripotent stem cells containing nicotinamide.
  • Mitochondrial function in the present invention includes the metabolic function related to the energy production of mitochondria in the cell, has a feature that is reduced by the aging process of the cell, and is known to be maintained particularly high in undifferentiated or dedifferentiated pluripotent stem cells.
  • the mitochondria function through various ion channels present in the membrane, the mitochondria can be identified through the membrane potential of the mitochondria.
  • the membrane potential ( ⁇ m) of the mitochondria was measured.
  • the mitochondrial membrane potential of human embryonic stem cells was measured by JC-1 staining. After JC-1 staining, the activated mitochondria are stained red, and the inactivated mitochondria are stained green.The higher the value, the more active the mitochondria stained in green / the number of mitochondria stained in green. It means that mitochondria are increased.
  • the action potential of mitochondria was significantly increased (FIG. 33). This suggests that the addition of nicotinamide favorably maintains the undifferentiated state of pluripotent stem cells by enhancing mitochondrial activity.
  • the present invention provides a method for culturing to maintain an undifferentiated state of pluripotent stem cells, comprising culturing cells using a composition for maintaining pluripotent stem cell undifferentiated state, including nicotinamide. to provide.
  • the present invention comprises culturing a cell culture using a composition for maintaining a pluripotent stem cell undifferentiated state, including nicotine amide so as to maintain the pluripotent stem cells in an undifferentiated state. It provides a method of manufacturing.
  • the method for culturing to maintain the undifferentiated state of the pluripotent stem cells and the method for producing a cell culture to maintain the pluripotent stem cells in an undifferentiated state with or without animal serum and feeder cells may be.
  • the culture may be a plurality of serial passage culture.
  • Pluripotent stem cells undifferentiated state and cell culture of the present invention are as described above.
  • human pluripotent stem cells H9 are differentiated in UM culture conditions, but when 0.1 mM nicotinamide is added, they are not differentiated and remain undifferentiated (Fig. 34A), and also cultured at low-density after single cell dissociation. In addition, it was confirmed through AP staining and apoptosis analysis that significantly increased the survival and self-renewal ability of H9 human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which are human pluripotent stem cells (FIG. 34B).
  • the present invention is a pluripotent stem cell;
  • a cell culture comprising a composition for improving mitochondrial function of pluripotent stem cells containing nicotinamide.
  • the present invention includes all in vitro cell cultures obtained by treating pluripotent stem cells with a composition for improving mitochondrial function comprising nicotine amide. This includes various cells in the culturing process and various proteins, enzymes and transcripts obtained in the process of culturing them, and even a culture solution containing the same.
  • Pluripotent stem cells of the present invention are as described above.
  • the present invention comprises the steps of obtaining an embryonic stem cell; And it provides a method for establishing an embryonic stem cell line that can be maintained in an undifferentiated state comprising the step of culturing the embryonic stem cells under the culture conditions comprising the medium composition to obtain an embryonic stem cell line.
  • the embryonic stem cells include embryonic stem cells of all derived from humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., preferably human embryonic stem cells.
  • hESC Human embryonic stem cells
  • H9 NIH Code, WA09; WiCell Research Institute, Madison, WI
  • H1 NIH Code, WA01; WiCell Research Institute
  • hiPSC induced pluripotent stem cells
  • MEF-irradiated MEF mouse embryonic fibroblast
  • Matrigel Matrigel
  • MEF-CM was prepared as ⁇ -irradiated MEF as known (Xu C. Nat Biotechnol 19, 971-974), and MEF-CM added 8 ng / ml bFGF.
  • UM contains 80% DMEM / F12, 20% knockout serum replacement (KSR, Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% non-essential amino acids (NEAA, Invitrogen), 1 mM L-glutamine (Invitrogen), 0.1 mM ⁇ -mercapto ethanol ( ⁇ -mercaptoethanol, Sigma, St. Louis, MO) and 6 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor, Invitrogen).
  • KSR knockout serum replacement
  • NEAA non-essential amino acids
  • NEAA 1 mM L-glutamine
  • ⁇ -mercaptoethanol ⁇ -mercaptoethanol
  • Sigma St. Louis, MO
  • 6 ng / ml bFGF basic fibroblast growth factor
  • hFF Human newborn foreskin fibroblasts (hFF, ATCC, catalog number CRL-2097; American Type Culture Collection, Manassas, VA) in 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen), 1% non-essential amino acids, 1 mM Incubated in DMEM containing L-glutamine and 0.1 mM ⁇ -mercapto ethanol.
  • FBS fetal bovine serum, Invitrogen
  • non-essential amino acids 1 mM Incubated in DMEM containing L-glutamine and 0.1 mM ⁇ -mercapto ethanol.
  • PMXs vectors comprising human cDNAs of OCT4 (POU5F1), SOX2, c-MYC (MYC) and KlF4 as disclosed in the paper, Takahashi, K. et al. (Cell 131, 2007, 861-872) from Addgene Purchased.
  • Package cell line GP2-293 cells were transfected with retroviral vector DNA and VSV-G envelope vector using lipofectamine 2000. Twenty four hours after transfection, the supernatant containing the first virus was recovered and then the medium was replaced, and after 24 hours the supernatant containing the second virus was recovered. The supernatant was sterilized with a 0.45 m pore size filter, centrifuged at 20,000 rpm for 90 minutes and stored at -70 ° C until use.
  • hFFs human foreskin fibroblasts
  • iPSCs iPSCs
  • gelatin-coated 6-well plates were inoculated at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells per well and in the presence of polybrene (6 ⁇ g / ml) Infected.
  • hFFs cells were recovered by trypsin treatment and 5-6 ⁇ 10 4 cells per well in a Matrigel coated 6-well plate for experiments in feeder-free conditions. Re-inoculation at concentration.
  • the efficiency of induction of differentiation was calculated by measuring the number of colonies stained with ALP, an embryonic stem cell marker, in a Matrigel-coated 6-well plate. At this time, each experiment was performed three times.
  • RNA isolated from induced pluripotent stem cell line (Nam-iPS), H9 human embryonic stem cell (hES) and human fibroblast cell line (hFF) derived from human fibroblast cells were extracted using RNA Mini Kit (Qiagen). Cy3 was labeled and hybridized to the Agilent Human Whole Genome 4X44K microarray (single color based) according to the manufacturer's instructions. Hybridization images were scanned using Agilent's DNA microarray scanner and quantified using Feature extraction software (Agilent Technology, Palo Alto, Calif.). All data normalization and selection of fold-change genes were performed using GeneSpringGX 7.3 (Agilent Technology, USA).
  • the mean of the normalization ratios was calculated by dividing the mean value of the normalized signal channel intensity by the mean value of the normalized control channel intensity.
  • GeneSpringGX 7.3 Functional annotations of genes performed in accordance with the Gene Ontology TM Consortium (http://www.geneontology.org/index.shtml) by gene classification include BioCarta (http://www.biocarta.com/), GenMAPP (http: / /www.genmapp.org/), DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), and Medline databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Based.
  • Nicotinamide and related compounds were treated with embryonic stem cells and proteins were isolated after 6 days. NAD cycling enzyme was added to 20 ug protein in each group and reacted for 5 minutes at room temperature, followed by 2-3 hours with the addition of NADH developer. Absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader, and then quantified by dividing by protein amount.
  • AP staining was performed using a commercially available AP kit according to the manufacturer's (Sigma) instructions. Images of AP-positive cells were recorded with the HP Scanjet G4010. In addition, bright field images were obtained by an Olympus microscope (IX51, Olympus, Japan).
  • apoptosis-reducing effect of human pluripotent stem cells by nicotinamide was confirmed by dual apoptosis assay (Biotium, Hayward, CA).
  • Embryonic stem cells or cells in the course of retrodifferentiation were treated with NucView TM 488 Caspase-3 Substrate (green) / Annextin V (red), stained at room temperature for 30 minutes, and washed with PBS.
  • Apoptosis was quantified by counting at least four sections per sample with an Olympus fluorescence microscope (IX51, Olympus) and counting cells stained with green (Caspase-3).
  • Formaldehyde was added to the cell culture solution, and the cells were fixed. Then, the chromatin was awakened to an appropriate size using ultrasonic waves. After immunoprecipitation with antibodies to lysine 4 and 27 of histone 3, DNA was recovered and real-time fusion enzyme chain reaction was performed using primers from the Oct4 and Nanog promoter sites. The antibodies and primers used are shown in Table 3 below.
  • Human fibroblast cells were seeded to a density of about 1 ⁇ 10 5 cells per 6-well culture dish. Inoculated cells were incubated for 26 days under the disclosed culture conditions. To determine cell number, cells were washed with PBS and trypsinized. The cell suspension was mixed with 0.4% (wt / vol) trypan blue solution, and the number of viable cells was measured on the 19th and 26th days using a hemocytometer (Fig. 10). Each experiment was conducted three times.
  • cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of 30 ⁇ M BrdU. After washing with PBS, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes and reacted in 1 N HCl for 15 minutes at room temperature. The sample was washed and reacted with 0.1 M sodium tetraborate for 15 minutes. After washing, the cells were reacted with anti-BrdU antibody in PBS supplemented with 3% BSA for 1 hour, followed by FITC with secondary antibody (Invitrogen) attached for 30 minutes. Nuclei were counterstained with DAPI and then cells were observed using an Olympus microscope.
  • the cell cycle regulators Geminin (green, Geminin-GFP) and Sidity One (red, Cdt1-RFP) expressing virus were introduced for 2 hours under the condition of slowly shaking the cells, and then the promoter was added. Incubate for another hour. Transfer to fresh culture medium and incubate one more night, and then obtain an image under a fluorescence microscope. Photographs were taken at least 4 zones per sample, and the number of dividing cells at a green / red ratio was quantified by counting the stationary cells (red) and dividing cells (green).
  • Example 13 Senescence-associated ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -gal) staining and cell aging associated DNA damage staining
  • the cells were fixed at room temperature for 10 minutes using a fixative solution, and then stained with beta galactosidase solution at room temperature for 15 minutes.
  • the DNA was then stained for 5 minutes with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), and images were obtained by phase contrast and fluorescence microscopy. Aging occurred (green) and the number of cells with damaged DNA (in the form of blue clumps) was counted and quantified against normal cells.
  • CM-H 2 DCFDA 2,7-dichlorodihydrofluresceindiacetat
  • proteins were separated from the control group and nicotinamide treated group (Nam), and then quantified and treated with 2,4-dinitrophenylhydrazine to reveal the carbonyl group. Proteins were separated according to molecular weight using 10% SDS-polyacrylamide gel, and then proteins damaged by oxidative stress were identified using dinitrophenyl antibody. After quantification was corrected by the expression level of beta-actin ( ⁇ -actin), relative damage was quantified by setting the degree of damage of hFFs as 1.
  • JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetraachloro-1,1 ', 3,3'-tetraethylbenz-imidazolocarbocyanine iodide) was stained for 15 minutes at 37 °C. After washing, the degree of fluorescence staining was measured by flow cytometry, and then the relative mitochondrial membrane potential was quantified in a red / green ratio.
  • Each cell was lysed with RIPA buffer containing 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid, 1 mM PMSF and 15 minutes on ice.
  • Protease inhibitors (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) were mixed and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was re-centrifuged for 10 minutes and protein concentration was measured using a BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL).
  • Protein (20 ⁇ g) was isolated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and adsorbed onto polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore Corp, Bedford, Mass.). Membranes were reacted in PBS containing 0.1% Tween-20 and 5% non-fat milk for 2 hours at room temperature and probed with primary antibody diluted with PBS / 0.2% BSA for 1 hour. . After washing, the membrane is reacted with an anti-rabbit with secondary HRP or an anti-mouse antibody with ARP (Amersham, Arlington Heights, IL), and the band is subjected to ECL Visualization with Advance kit (Amersham).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Example 18 Embryoid body differentiation
  • hEBs human embryos
  • DMEM / containing HEB medium with suspension (10% serum replacement) Incubated in F12). After 5 days of growth in suspension, embryos were transferred to gelatin-coated plates and cultured in hEB medium. Under the above conditions, the cells attached to the bottom of the plate were left to differentiate for an additional 15 days while changing the medium as needed.
  • the DNA modification process using sodium bisulfite was carried out using a commercialized kit EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research).
  • EZ DNA Methylation Kit Zymo Research
  • methylated cytosine does not change, whereas unmethylated cytosine is converted to uracil. do. Therefore, when amplified by PCR using primers specific for cytosine and uracil sequences, methylated DNA and unmethylated DNA can be distinguished.
  • the primers used are shown in Table 4 below.
  • PCR reaction mixture was prepared with bisulfite treated DNA 1 ug, dNTP 0.25 mM / l, MgCl 2 1.5 mM / l, primer 50 pM, 1 ⁇ PCR buffer, Taq polymerase (Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2.5 units, to a final 20 ⁇ l.
  • Taq polymerase Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • PCR reaction products were identified on a 1.5% agarose gel and cloned into pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) after gel elution. Methylated and non-methylated sequences were analyzed by sequencing using M13 primer pairs.
  • Nam-iPS induced pluripotent stem cell lines
  • Three cell lines (Nam-iPS1, Nam-iPS2 and Nam-iPS3) were identified.
  • Nam-iPS cell lines were either morphologically or stained with human embryonic stem cell markers (AP) and immunostaining (OCT4, NANOG, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81). was indistinguishable (FIG. 21).
  • Nam-iPS1, Nam-iPS2, and Nam-iPS3 The genomic integration of Nam-iPS1, Nam-iPS2, and Nam-iPS3 was confirmed. Genome DNA was extracted using DNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA), and each PCR amplification reaction was performed using primers (Table 1) capable of specifically amplifying only 300 ng of genome DNA and a transgene. It was. As a result, it was confirmed that the Nam-iPS cell lines were Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 integrated (Fig. 23). At this time, human embryonic stem cell line (H9, hES) and human fibroblast cell line (CRL2097, hFF) were used as a control.
  • the degree of methylation of the promoter region of the stem cell markers Oct4 and Nanog gene of Nam-iPS cell line was confirmed through bisulfite sequencing analysis.
  • Nam-iPS induced pluripotent cell line showed a demethylated pattern similar to the human embryonic stem cell line (H9), the parental hFFs were still methylated (Fig. 24).
  • hES H9 human embryonic stem cells
  • hFF human fibroblast cell lines
  • ectoderm NCAM, PAX6, VIM, OTX1
  • mesoderm cTnT, IGF2, TBX6, RUNX2
  • endoderm AYLASE, HAND1, PECAM, HGF
  • Tuj1 ectoderm
  • Nestin ectoderm
  • desmin mesoderm
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • mesoderm mesoderm
  • Sox17 endoderm
  • FoxA2 endoderm
  • Nam-iPS induced pluripotent stem cell line was injected subcutaneously into dorsal flasks of immunodeficient (SCID) mice. It was. After about 12 weeks, the teratoma was confirmed, and hematoxylin / eosin staining revealed neural rosette (ectoderm), neuronal epithelium (ectoderm), adipocyte (mesoderm), smooth muscle (mesoderm), bone (mesoderm), and cartilage (mesoderm) in teratoma.
  • FIG. 28 myxoid tissue (mesoderm) and gut-like epithelium (endoderm) were observed (FIG. 28).
  • Am-iPS human induced pluripotent stem cell line
  • human pluripotent stem cells were treated with TrypLE reagent (Invitrogen) for 3 minutes and then dissociated into single cells by pipetting. Coated 96-well plates were seeded with 500 cells per well. After 5 days of culture, human pluripotent stem cells began to form colonies, which were fixed in 4% paraformaldehyde and then stained with AP or measured apoptosis levels.
  • TrypLE reagent Invitrogen
  • the present inventors cultured human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells in feeder-free matrigel in MEF-CM or UM. After adding various NAD precursors including nicotinamide in the process, the effects on stem cells were verified by confirming the morphological changes and AP expression patterns, which are human embryonic stem cell specific markers. Human embryonic stem cells cultured in UM for 6 days did not maintain the undifferentiated cell appearance and confirmed that the expression of AP was down-regulated, confirming that the cultured human embryonic stem cells were in the differentiation state (FIG. 29).
  • human embryonic stem cells cultured in UM supplemented with nicotinamide (1 mM) showed undifferentiated human embryonic stem cell morphology compared to other NAD precursors.
  • the size of colonies of human embryonic stem cells It was confirmed that the total number of AP-positive (AP + ) cells increased (Fig. 29).
  • nicotinamide various concentrations of nicotinamide were added to UM to confirm the degree of undifferentiated maintenance of human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which are pluripotent stem cells.
  • Human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells cultured in UM supplemented with 0.1-1 mM nicotinamide preserve the morphology of typical undifferentiated human embryonic stem cells and express positive expression of AP, a human embryonic stem cell specific marker. It was confirmed (Fig. 29).
  • Nicotinamide which is effective in maintaining the differentiation of pluripotent stem cells, human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, was verified under various conditions.
  • CDM culture medium
  • various concentrations of nicotinamide were added to mTeSR1, CDM. The effect was confirmed by the addition.
  • nicotinamide is effective as a medium additive for undifferentiated maintenance in culturing and maintaining various pluripotent cells including human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells.
  • BrdU incorporation experiments were performed to verify the cell proliferation effect of pluripotent stem cells by nicotinamide.
  • Various effects of nicotine amide were added to mTeSR1, which is CDM, to confirm the effect.
  • mTeSR1 which is CDM
  • BrdU incorporation was significantly increased when nicotinamide was added at concentrations of 0.1 mM (1.6 times; FIG. 32) and 1 mM (1.2 times; FIG. 32).
  • the present inventors measured the membrane potential ( ⁇ m) of the mitochondria.
  • the mitochondrial membrane potential of human embryonic stem cells was measured by JC-1 staining.
  • the activated mitochondria are stained red, and the inactivated mitochondria are stained green. The higher the value, the more active the mitochondria stained in green / the number of mitochondria stained in green. It means that mitochondria are increased.
  • the number of activated mitochondria increased significantly (FIG. 33).
  • Example 25 Reprogramming kinetics promoting effect of nicotinamide
  • Nicotinamide was found not only to increase hiPSCs induction efficiency but also to reprogramming kinetics.
  • the expression of stem cell markers Nanog and Tra-1-60 increased by 3 times and 8 times, respectively, compared to the group not treated with (D5) from the 5th day of culture (FIG. 6).
  • MRNA expression of stem cell marker Nanog and endogenous growth regulator TERT also increased sharply from day 7 by nicotine amide treatment (FIG. 7).
  • hiPSCs colonies having clear boundaries generally take more than three weeks, whereas nicotinamide treatment significantly reduces the duration to two weeks (Fig. 8).
  • nicotinamide promotes cell proliferation with or without the introduction of dedifferentiation factors.
  • the number of living healthy cells increased when nicotinamide treatment was increased depending on the concentration of 0.1, 1, and 10 mM (FIG. 10).
  • BrdU was increased when 0.1-1 mM nicotinamide treatment was induced in reverse differentiation. It was confirmed on the 19th day of induction of reverse differentiation that the number of actually dividing cells introduced was significantly increased (FIG. 11).
  • the increase in the percentage of cells proliferating on day 12 of induction of reverse differentiation by 1 mM nicotinamide treatment was confirmed through live cell imaging without fixing the cells (FIG. 12).
  • the proportion of cells stained with cell aging-related beta galactosidase increased by 18.1% on day 19 and 35.2% on day 26 by OSKM, compared to the control group treated with 1 mM nicotinamide. Decreases of 88.1 ⁇ 1.4% and 76.9 ⁇ 2.5%, respectively (FIG. 13A).
  • the number of aged cells was decreased by 76.1 ⁇ 1.4% at 19 days and 30.8 ⁇ 9.0% at 21 days compared to the control group (FIG. 13A).
  • DNA damage associated with cell aging was also reduced by 83.0 ⁇ 0.5% compared to the control by 1 mM nicotinamide treatment (FIG. 13B).
  • human pluripotent stem cells H9 are differentiated in UM culture conditions, but when 0.1 mM nicotinamide is added, they are not differentiated and can be maintained undifferentiated (Fig. 34A), and also cultured at low-density after single-cell dissociation. In addition, it was confirmed through AP staining and apoptosis analysis that significantly increased the survival and self-renewal ability of H9 human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which are human pluripotent stem cells (FIG. 34B).

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Abstract

본 발명에 의하면, 인간 분화세포에서 다능성 줄기세포를 제작하기 위한 역분화 유도 배양과정에 니코틴아마이드를 첨가하면, 역분화 유도 효율을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 역분화 유도에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 니코틴아마이드는 역분화 유도 과정 중에서 발생하는 노화 유도와 산화 스트레스를 억제하고, 세포 증식 및 미토콘드리아 활동 증진 효과를 유도함으로써 역분화 유도 배양조건을 효과적으로 개선하고 있음을 검증하였다. 본 발명은 다양한 소스에서 확보된 적은 양의 환자-특이적 체세포로부터 유도만능줄기세포를 제작과정을 최적화하는데 기여함으로써 임상적용 가능한 개인 맞춤형 줄기세포 세포 치료제 개발 및 신약개발과정을 획기적으로 개선하고, 실용화시기를 앞당기는데 기여할 것이다. 또 다른 양태로써, 본 발명에 의하면, 니코틴아마이드는 대표적인 다능성 줄기세포인 인간 배아줄기세포와 인간 유도만능줄기세포의 미분화 상태 유지에 효과적인 배양 배지 조성물이 될 수 있음을 영양세포 및 혈청을 사용하지 않은 defined 배양조건에서 확인하였다. 본 발명은 인간 다능성 줄기세포의 산업화에 요구되는 고기능 인간 다능성 줄기세포 대량 배양 시스템을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

Description

다능성 줄기세포의 제작, 유지, 증식을 증진하는 대사산물 및 이를 포함하는 조성물과 배양방법
본 발명은 분화된 세포 (differentiated cell)/체세포(somatic cells)의 다능성 줄기세포로의 역분화 촉진에 효과적인 니코틴아마이드를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 세포 배양물, 이를 이용한 역분화된 다능성 줄기세포 제조 방법 및 상기 역분화된 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 유지, 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 니코틴아마이드를 포함하는 다능성 줄기세포의 세포운명결정에 관여하는 미토콘드리아 기능 향상용 조성물과 이를 포함하는 세포배양물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 자가-증식능이 우수하고 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 조직-특이적으로 분화할 수 있는 세포를 총체적으로 의미한다. 대표적으로, 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells)와 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cell)는 적당한 체외 배양조건에서 무한 증식(자가재생산능; self-renewal)을 할 수 있고, 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 특성(다능성 또는 전분화능; pluripotency)을 가지고 있으며, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 등이 다능성 줄기세포에 포함된다. 이러한 특성으로 인해 개체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식 이해 측면에서뿐만 아니라 다양한 질병의 근본적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 그리고 신약 개발 분야에 이르기까지 이를 대상으로 한 연구성과의 활용범위가 지속적으로 확대되고 있다. 다양한 영역에서 인간 다능성 줄기세포을 기반으로 실용화 기술을 개발하기 위한 노력이 급증하고 있는 가운데, 여전히 인간 다능성 줄기세포 제작 및 증식 배양 과정에서의 효율성, 안전성, 및 경제성 측면에서 해결되어야 할 병목요소들이 존재하고 있는 실정이다. 구체적으로는, 미분화 및 분화상태의 줄기세포를 확보하고 이용하는 과정에서 상시적으로 수요를 감당할 수 있는 안정화된 대량 생산 기술을 개발하는 것이 요구되며, 특히, 세포 치료제 개발을 위해서는 임상적으로 적용 가능한 상태에서 세포를 공급할 수 있도록 성능이 우수하고, 효율성이 뛰어난 배양 기술을 확보하는 것이 필수적이다.
분화가 진행된 체세포를 체외 배양과정에서 역분화/리프로그래밍함으로써 자가재생산능 및 전분화능 특성을 가진 유도만능줄기세포(역분화 줄기세포, induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 생산하는 역분화 기술이 일본 교토대 야마나카 교수팀에 의해 세계최초로 2006년 및 2007년에 각각 생쥐세포 및 인간세포에서 성공하였다(Cell, 126: 663-676, 2006; Cell, 131:1-12, 2007). 이후, 상기 기술을 바탕으로 줄기세포 기반 세포 치료제 및 신약개발 실용화를 앞당기기 위한 세계 각국의 기술 개발 경쟁이 치열하게 진행되고 있다(Takahashi et al, Cell, 2007; Yu et al, Science, 2007; Park et al, Cell, 2008).
야마나카 교수팀의 역분화 기술 개발 성공은 환자-체세포로부터 자가 전분화능 줄기세포주를 확립하는 전략을 획기적으로 진화시키는 도약의 발판을 제공하였으며, 인간 배아줄기세포 연구 분야에서 우려되고 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있는 최적의 대안으로 인식되면서 미래 재생의료 기술 개발 분야에 무한한 가능성을 제시하고 있다. 특히, 역분화 기술은 환자에게 특별한 손상을 주지 않고 비교적 손쉬운 방법으로 확보 가능한 자가-체세포를 이용하여 인간 배아줄기세포와 같은 특성의 줄기세포를 제조하는 것을 가능케 함으로써, 환자-맞춤형 줄기세포 치료제 개발의 가장 유용한 세포 자원을 공급할 수 있는 기술로 인정받고 있다.
역분화 기술이 급속히 진화되고 있는 현 추세를 살펴볼 때, 신약개발 및 융합 기술 분야에서의 iPSCs 또는 iPSCs 유래 조직-특이적 분화세포의 적용 범위 및 수요가 무한대로 증가할 것으로 예상된다.
그러나, 분화된 인간 체세포를 다분화능/전분화능 유도만능줄기세포로 리프로그래밍 하기 위하여 배아줄기세포-특이적 전사인자인 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 유전자군을 역분화 유도인자로 사용하여 과발현시키는 현재의 기술은 역분화 유도 효율이 0.01 내지 0.1% 정도로 매우 저조하므로, 세포치료제로 활용하기 위한 수요를 소화하기 위해서는 역분화 유도 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 다양한 역분화 유도인자의 개발과 함께 이들을 역분화 과정에서 실질적으로 활용할 수 있는 후속 기술의 개발이 절실히 요구된다.
일반적으로 인간 다능성 줄기세포는 마우스 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast; MFE) 등과 같은 영양세포(feeder cells)와 공배양하거나 영양세포를 증식시킨 배양액(conditioned media)에 배양함으로써 미분화 상태를 유지하면서 지속적으로 유지 및 배양할 수 있다. 그러나, 동물 영양 세포에서의 직접 배양 또는 영양세포 배양액을 사용하는 배양 방법 모두 바이러스와 같은 1종 이상의 감염원이 동물 세포로부터 인간 배아줄기세포로 전파될 수 있는 위험이 따른다. 인간 배아줄기세포 배양의 목적 중 하나가 궁극적으로 인체에 이식될 수 있는 조직을 생성하는 것이기 때문에 상기와 같은 위험으로 인해 줄기세포는 다른 종의 세포 또는 다른 종의 세포를 배양하는 데 사용되었던 배지에 노출된 적이 없을 것이 요구된다.
인간 다능성 줄기세포에 대한 수요가 급증하고 있음에도 불구하고 미분화 상태의 줄기세포를 유지 및 배양하기 위한 배양 기술 및 방법이 어렵다는 점 때문에 관련 기술 개발의 장애요소로 작용하고 있으며 특히, 세포치료제로 이용하기 위해서는 동물유래 인자를 사용하지 않은 배지의 개발 및 수요에 맞는 대량 배양 시스템의 개발의 매우 중요하다.
최근 동물 영양세포 및 혈청을 이용하지 않고 인간 다능성 줄기세포를 배양하는 방법, 또는 defined factor만을 이용하여 배양하는 방법을 개발하기 위한 노력이 지속적으로 급증하고 있으며, 이에 대한 경제적 부가가치가 높게 인정되고 있는 추세이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 미분화 상태 인간 다능성 줄기세포의 유지, 배양에 효과적이고, 체세포로부터 인간 다능성 줄기세포를 제작하는 역분화 유도에 효과적인 새로운 다능성 인자 (new pluripotency factor)를 발굴하기 위하여 예의 노력한 결과, 세포 대사과정에 중요한 역할을 하는 니코틴아마이드를 배양배지에 적정농도로 첨가하여 사용하는 경우 인간 다능성 줄기세포를 제작하기 위한 역분화 유도 효율을 획기적으로 증진시킬 뿐만 아니라 인간 다능성 줄기세포의 미분화 상태 유지, 배양에도 효과적으로 작용함을 검증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 니코틴아마이드를 포함하는, 분화된 세포에서 다능성 줄기세포로의 역분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 분화된 세포에서 역분화된 다능성 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 역분화된 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 니코틴아마이드를 포함하는 다능성 줄기세포의 미토콘드리아 기능 향상용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포 미분화 상태 유지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지되도록 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 인간 분화세포에서 다능성 줄기세포를 제작하기 위한 역분화 유도 배양과정에 니코틴아마이드를 첨가하면, 역분화 유도 효율을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 역분화 유도에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 니코틴아마이드는 역분화 유도 과정 중에서 발생하는 노화 유도와 산화 스트레스를 억제하고, 세포 증식 및 미토콘드리아 활동 증진 효과를 유도함으로써 역분화 유도 배양조건을 효과적으로 개선하고 있음을 검증하였다. 본 발명은 다양한 소스에서 확보된 적은 양의 환자-특이적 체세포로부터 유도만능줄기세포를 제작과정을 최적화하는데 기여함으로써 임상적용 가능한 개인 맞춤형 줄기세포 세포 치료제 개발 및 신약개발과정을 획기적으로 개선하고, 실용화 시기를 앞당기는데 기여할 것이다. 또 다른 양태로써, 본 발명에 의하면, 니코틴아마이드는 대표적인 다능성 줄기세포인 인간 배아줄기세포와 인간 유도만능줄기세포의 미분화 상태 유지에 효과적인 배양 배지 조성물이 될 수 있음을 영양세포 및 혈청을 사용하지 않은 defined 배양조건에서 확인하였다. 본 발명은 인간 다능성 줄기세포의 산업화에 요구되는 고효율 인간 다능성 줄기세포 대량 배양 시스템을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
도 1은 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide) 생합성과정의 주요 효소들의 발현을 배아줄기세포와 유도만능줄기세포에서 분석한 결과이다. (도 1a) 마이크로어레이 분석결과, 미분화 줄기세포에서 발현 증가된 효소는 ↑ 화살표로, 감소된 효소는 ↓ 화살표로 표시하였다. (도 1b) 미분화 (Un), 분화 (Diff) 배아줄기세포와 유도만능줄기세포에서 NAD+ 생합성 관련 효소들의 발현 증감을 ↑ 또는 ↓ 화살표 갯수의 차이로 표시하였다. (도 1c) 주요 효소의 발현을 실시간 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과이다 (값은 평균값 ± S.E.를 나타내며, * p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 2는 배아줄기세포 배양 과정에서 NAD+ 합성효소 저해제 FK866 처리 시, 니코틴아마이드 및 NAD precursor의 효과를 확인한 결과이다. (Aa) 배아줄기세포에 FK866 및 NAD precursor 처리 시, 세포내 NAD 농도를 측정한 결과이며, (Ab) 그 조건에서 AP 활성을 정량한 결과이다. (Ba) 세포 수를 정량화하고, (Bb) 세포사멸 정도를 정량화하였다 (값은 평균값 ± S.E.를 나타내며, * p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 3은 mTeSR1 chemically defined medium (mTeSR1 CDM) 배양 조건에서 NAD+ 합성 저해제 FK866 처리 시, 니코틴아마이드의 효과를 확인한 결과이다. (A) mTeSR1 배양 조건에서 배아줄기세포에 FK866 및 니코틴아마이드 처리 시, 세포내 NAD 농도를 측정한 결과이며, (B) 그 조건에서 AP 활성을 정량한 결과이다 (값은 평균값 ± S.E.를 나타내며, * p<0.05, t-test에 의함).
도 4는 인간 섬유아체세포로부터 유도만능줄기세포로 역분화 유도 시, 역분화 유도 효율을 영양 배지를 첨가하지 않은 조건에서 확인한 결과이다. (A) 다양한 NAD precursor에 의한 역분화 유도 효율 증가를 확인한 결과이다. (B) 다양한 농도 조건에서의 니코틴아마이드에 의한 역분화 유도 효율 증가를 확인한 결과이다. 위쪽 패널은 유도만능줄기세포 콜로니의 AP 염색 사진이며, 아래쪽 패널은 ES-like 콜로니 수 및 AP-양성 콜로니 수를 표시하였으며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 5는 니코틴아마이드 처리 시간에 따른 유도만능줄기세포의 역분화 유도 효율 향상을 나타낸 결과이다. (도 5a) 표시된 기간만큼 1 mM의 니코틴아마이드를 역분화 유도 시에 첨가 후, 마트리겔에 재분주 후 21일째 되는 날 AP 염색 실험을 수행하였다. AP-양성 콜로니 수를 표시하였으며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다. (도 5b) 역분화 인자를 도입 후, 1 mM의 니코틴아마이드를 첨가하면서 4일간 배양 후 살아있는 세포의 수를 측정하였다. (도 5c) 역분화 인자 도입 후, 마트리겔에 재분주하기 전에 니코틴아마이드를 5일간 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 세포 각각을 같은 세포수로 마트리겔에 재분주하고, 여기에 다시 니코틴아마이드를 21일 동안 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우에 역분화 유도 효율을 AP 염색 실험을 통해 확인하였다. AP-양성 콜로니 수를 표시하였으며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 6은 역분화 진행 시기별 니코틴아마이드 처리에 따른 줄기세포 마커 Nanog와 Tra-1-60의 면역염색반응 결과를 나타낸 것이다 (왼쪽). 면역염색된 덩어리 (클러스터)를 정량화한 도식 (오른쪽)이며 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (대조군 - Control, 니코틴아마이드 처리군 - Nam, 크기 바 = 200 ㎛, *p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 7은 줄기세포마커 Nanog와 무한증식 조절인자 TERT의 mRNA 발현을 역분화 진행 시기별로 실시간 중합효소 연쇄반응으로 정량화한 결과를 나타낸 것으로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (대조군 - Control, 니코틴아마이드 처리군 - Nam, *p<0.05, t-test에 의함).
도 8은 hiPSCs 콜로니를 얻는데 필요한 시간을 정량화한 결과를 나타낸 것으로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (대조군 - Control, 니코틴아마이드 처리군 - Nam, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 9는 니코틴아마이드의 후성유전학적 조절 효과를 확인한 결과이다. 니코틴아마이드 및 NAD precursor를 처리한 각 조건에서, 히스톤 3의 라이신 4번 및 27번 메틸레이션 잔기에 대한 항체로 크로마틴 면역침강법을 수행하고, 전능성 유지인자 Nanog와 Oct4의 프로모터 부분을 실시간 중합효소 연쇄반응으로 증폭하여, 증감을 정량화 하였다. 체세포 (hFF)와 유도만능줄기세포 (hiPS)는 대조군으로 사용하였다. (값은 평균값 ± S.E.를 나타내며, * p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 10은 인간 섬유아체세포로부터 유도만능줄기세포로 역분화 유도 시, 니코틴아마이드 첨가에 의한 세포 성장 효율을 확인한 결과이다. 인간 섬유아체세포 및 역분화 인자 (Oct4(O), Sox2(S), c-Myc(M), Klf4(K))를 형질 도입한 인간 섬유아체세포에 0-10 mM 농도의 니코틴아마이드를 첨가 한 후 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 위쪽 패널: 세포 사진. 아래쪽 패널: 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (크기 바 = 500㎛, *p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 11은 인간 섬유아체세포로부터 유도만능줄기세포로 역분화 유도 시, 니코틴아마이드 첨가에 의한 세포 증식 효율을 확인한 결과이다. 인간 섬유아체세포 및 역분화 인자 (Oct4(O), Sox2(S), c-Myc(M), Klf4(K))를 형질 도입한 인간 섬유아체세포에 0-10 mM 농도의 니코틴아마이드를 첨가 한 후 BrdU incorporation을 이용하여 세포의 증식 비율을 측정하였다. 상부 패널: BrdU+ 세포의 대표 이미지. Bar = 500 ㎛. 하부 패널: BrdU+ 세포의 정량. Well 당 BrdU+ 세포의 상대적 수를 정량하였고 계산된 전체 세포 수의 비율(%)로서 나타내었다. 상기 데이터를 평균 ± SE (n=3)으로 나타내었다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 12는 생세포 이미징 (live cell imaging) 방법을 이용하여 증식하는 세포의 비율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 역분화 유도 12일 째의 정지기의 세포 (빨간색)와 분열하는 세포 (노란색)의 이미지 (위)이며, 분열하는 세포 비율을 정량화한 도식 (아래)으로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (대조군 - Control, 니코틴아마이드 처리군 - Nam, 크기 바 = 100 ㎛, *** p<0.001, t-test에 의함).
도 13은 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈 (Senescent-associated β-galactosidase, SA-β-gal) 염색 결과를 나타낸 것이다. (A) 역분화 유도 26일 째의 세포를 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈로 염색한 후, 줄기세포마커 Nanog와 Tra-1-60을 면역염색하고 (위), 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈가 염색된 세포의 비율을 정량화한 것이다 (아래). (B) 세포노화 연관 DNA 손상 (Senescence-associated heterochromatic foci, SAHF)을 확인한 결과로, 역분화 유도 26일 째의 세포를 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈로 염색한 후, DNA를 다피 (DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 결과이며 (위쪽), 베타 갈락토시데이즈가 염색되고 (초록색) 동시에 DNA (파란색)가 손상된 세포를 정량화하여 나타낸 도식 (아래쪽)으로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (대조군 - Control, 니코틴아마이드 처리군 - Nam, ** p<0.01, *** p<0.001, t-test에 의함).
도 14는 활성산소종 (ROS, reactive oxygen species)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 역분화 유도 19일째 니코틴아마이드 처리군과 비처리군의 활성산소종 형성 정도를 유세포 분석기로 측정 (위쪽) 후 정량화 (아래쪽)한 결과로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다. 과산화수소 (H2O2)는 활성산소종 형성의 비교군으로 사용하였다 (** p<0.01, t-test에 의함).
도 15는 역분화 진행 시기별 대조군과 니코틴아마이드 처리군 (Nam)에서 산화스트레스에 의한 단백질 손상 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다 (위). 베타-액틴의 발현 양으로 보정 후, 체세포 (hFF)의 손상 정도를 1로 하여 손상도를 정량화한 도식으로 값은 평균값 S.E.를 나타낸다 (아래). (*p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함)
도 16은 미토콘드리아 막전위를 측정한 결과로, 역분화 진행 시기별 대조군과 니코틴아마이드 처리군 (Nam)에서 미토콘드리아 막전위를 형광염색하여 (위) 유세포 분석기로 측정한 결과로 (왼쪽 아래) 상대적인 비율을 정량화한 결과 (오른쪽 아래)로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (** p<0.01, *** p<0.001, t-test에 의함).
도 17은 세포노화/사멸 신호전달인자의 발현을 면역염색법으로 분석한 결과이다. 역분화 유도 19일째 니코틴아마이드 처리군과 비처리군에서 Nanog, Tra-1-60, pp53, p53, p27, p21을 면역염색한 결과이고, 핵을 DAPI (파란색)로 염색하였다.
도 18은 세포노화/사멸 신호전달인자의 발현을 웨스턴 블랏법으로 분석한 결과이다. 역분화 시기별 니코틴아마이드 처리군과 비처리군에서 각 인자의 단백질 발현량을 분석하고 (왼쪽), 밴드를 정량화하여 도식화 (오른쪽) 한 결과이다 (값은 평균값 ± S.E.를 나타내며, * p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 19는 니코틴아마이드에 의한 세포 신호 전달 인자의 mRNA 발현 변화를 나타낸 결과이다. 역분화 유도 19일째 니코틴아마이드 처리군과 비처리군의 p53과 p21 mRNA 발현 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응으로 확인하였으며, 베타-액틴 (β-actin)의 발현 양으로 비교 정량화한 도식으로 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (*p<0.05, t-test에 의함).
도 20은 니코틴아마이드 농도에 따른 p53과 p21의 발현을 분석한 결과이다. 니코틴아마이드 농도에 따른 각 인자의 단백질 발현량 차이를 역분화 시기별로 웨스턴 블랏법으로 분석하였다.
도 21은 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 인간 배아줄기세포 마커 발현 특성을 면역 염색법으로 분석한 도면이다 (크기 바=200㎛).
도 22는 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 줄기세포 마커 유전자 및 역분화 인자 발현을 RT-PCR 분석한 결과이다. 전부(Total), 내인성(Endo) 및 레트로바이러스 발현(Trans) 유전자간의 상대적 발현을 결정할 수 있는 이식 유전자-특이적 PCR 프라이머를 사용하여 반-정량 RT-PCR을 수행하였다.
도 23은 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 게놈내 유전자 삽입을 분석한 결과이다.
도 24는 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS), H9 인간 배아줄기세포(hES) 및 인간 섬유아체세포(hFF)에서의 Oct4 및 Nanog 전사인자 프로모터 메틸화 패턴을 분석한 결과를 나타낸다. 각 원의 수평열은 하나의 앰플리콘으로부터의 개별적인 서열을 나타낸다. 빈원 및 검정원은 각각 디메틸화된 CpG 및 메틸화된 CpG를 나타내며, 메틸화된 CpG의 비율을 %로 나타내었다.
도 25는 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 유전자 발현 프로파일을 나타낸 도이다. (A) Nam-iPS, H9 인간 배아줄기세포(hES) 및 인간 섬유아체세포(hFF)의 일반적인 유전자 발현의 히트 맵 및 계층적 군집 분석, 및 피어슨 상호연관 (Pearson correlation)을 계산하였고, 계층적 군집을 평균 연결 방법으로 수행하였다. 다른 세포주 간의 비교를 통한 거리를 GeneSpring GX7.3.1으로 계산하였고 이를 트리 선 위에 나타냈다. 색깔 막대는 log2 크기로 색깔 코드 유전자 발현을 나타낸다. (B) Nam-iPS, hES 및 hFF 간의 유전자 발현 프로파일을 비교한 Scatter plot을 나타낸 도이다. 줄기세포 마커 유전자인 OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, NANOG, LIN28 및 REX1을 표시하였다.
도 26은 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 배아체 형성을 통하여 삼배엽 분화능을 보존하고 있음을 보인 RT-PCR 결과 사진이다.
도 27은 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 배아체 형성을 통하여 삼배엽 분화능을 보존하고 있음을 보인 면역세포화학분석 사진이다.
도 28은 니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 생체내 분화능을 증명하기 위한 테라토마 형성을 나타낸 사진이다.
도 29는 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 다양한 NAD precursor를 첨가한 경우 인간 배아줄기세포 배양 결과를 나타낸 것이다. MEF-CM (conditioned medium) 또는 UM(unconditioned medium)에서 배양된 H9 인간 배아줄기세포의 AP 염색한 사진(왼쪽)과 densitometric analysis를 이용한 AP 양성 콜로니의 상대적인 양을 도시한 그래프(오른쪽)이며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다. Nam, L-Trp, NA, Iso-Nam, 3-ABA, NAD: 0.1 mM, NMN: 10 μM 사용. (* p<0.05, t-test에 의함).
도 30은 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 다양한 농도의 니코틴아마이드를 첨가한 조건에서 인간 배아줄기세포 (H9 hES) 및 인간 유도만능줄기세포 (hiPS)의 배양 결과를 나타낸 것이다. MEF-CM 또는 UM에서 배양된 줄기세포의 AP 염색한 사진(위쪽)과 densitometric analysis를 이용한 AP 양성 콜로니의 상대적인 양을 도시한 그래프(아래쪽)이며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 31은 영양세포를 사용한 조건과 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 다양한 농도 조건의 니코틴아마이드를 첨가한 경우, 인간 배아줄기세포 (H9, H1) 및 인간 유도만능줄기세포 (hiPS)의 배양 결과를 나타낸 것이다. 영양세포를 사용한 조건에서는 UM을 사용하였고, 영양세포를 사용하지 않은 조건에서서는 mTeSR1 CDM을 사용하였다. AP 염색한 사진(왼쪽)과 densitometric analysis를 이용한 AP 양성 콜로니의 상대적인 양을 도시한 그래프(오른쪽)이며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함).
도 32는 니코틴아마이드에 의한 인간 배아줄기세포의 세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과이다. 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 mTeSR1 CDM에 표시한 농도의 니코틴아마이드를 첨가하고, BrdU incorporation을 이용하여 H9 인간 배아줄기세포의 증식 비율을 측정하였다. 상부 패널: BrdU+ 세포의 대표 이미지. Bar = 500 ㎛. 하부 패널: BrdU+ 세포의 정량. 시야 당 BrdU+ 세포의 상대적 수를 정량하였고 계산된 전체 세포 수의 비율로서 나타내었다. 상기 데이터를 평균 ± S.E. (n=3)으로 나타내었다 (** p<0.01,t-test에 의함).
도 33은 니코틴아마이드에 의한 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아 기능 향상 효과를 확인한 결과이다. 영양세포를 사용하지 않는 배양조건에서 mTeSR1 CDM에 표시한 농도의 니코틴아마이드를 첨가하고, JC-1 염색방법을 이용하여 H9 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아의 막 전위(membrane potential)를 측정한 것이다. 활성화된 미토콘드리아는 적색(Red)으로 염색되고, 비활성화된 미토콘드리아는 녹색(Green)으로 염색된다. 상부 패널: JC-1 염색 세포의 대표 이미지. Bar = 20 ㎛. 중간 패널: JC-1 염색의 형광 세기(fluorescence intensity) 프로파일을 도시하였다. 하부 패널: JC-1 염색 후 Red/Green의 비율을 아무 것도 첨가하지 않은 대조군에 대비한 상대적인 값으로 표시하였다. 상기 데이터를 평균 ± S.E. (n=3)으로 나타내었다 (** p<0.01,t-test에 의함).
도 34는 인간 배아줄기세포를 분화 상태가 유도되기 쉬운 배양조건인 UM배지 조건에서 니코틴아마이드, NAD+ precursors인 Nicotinic acid (NA)와 NAD+를 처리했을 때 미분화 상태를 유지할 수 있는지 확인한 결과이다 (도 34a). (도 34a의 A) 미분화 인간 배아줄기세포 콜로니의 AP 염색 사진이며, 아래쪽 패널은 AP-양성 콜로니 수를 표시하였으며, 값은 평균값 ± S.E.를 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01, t-test에 의함). (도 34a의 B) NAD 레벨을 측정한 결과이다. (도 34b) low-density assay 결과이다. 미분화 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 단일 세포 dissociation 후 니코틴아마이드, NA와 NAD+를 처리한 후 AP 염색 (도 34b의 A) 및 세포 사멸 정도(apoptosis level) (도 34b의 B)를 측정하였다.
도 35는 UM 배지 조건하에서 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가를 통해서 10 계대 이상 미분화 상태로 장기 배양이 가능함을 TRA-1-60 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 36은 니코틴아마이드 첨가 배지에서 장기 계대 배양 후, 핵형 분석 결과이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 니코틴아마이드를 포함하는, 분화된 세포에서 다능성 줄기세포로의 역분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 니코틴아마이드(Nicotinamide, Nam, 비타민 B3)란 니코틴산의 아마이드로서 수용성 비타민과 비타민 B 복합체의 하나이다. 분자식 C6H6N2O를 갖는니코틴아마이드는 생체 내에서는 조효소형인 니코틴아마이드 뉴클레오티드, NAD+ 및 NADP+로 존재하며, 조효소로서 많은 산화·환원 반응에 관여한다. 니코틴산아마이드는 만성 알코올 중독·협심증·동상 등의 치료제로 사용되며 간, 어류, 곡류배아, 효모, 두류, 육류에 많이 들어 있다. 니코틴아마이드는 무색 결정성 분말로 니코틴산과 같이 트립토판(Tryptophan)으로부터 생성되며 동·식물에 널리 분포되어 있는 비타민이다. 니코틴아마이드 결핍증인 펠라그라는 피부염, 설사, 정신착란, 불안 등을 일으키고 사망에 이르게까지 하며 또 과다 섭취하였을 경우에는 간에 독성을 나타나게 하고 위궤양이 생기며 당뇨병을 유발시킨다. 상기 NAD+는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 의미하며, NADP+는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 인산(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phospate)을 의미한다. 한편, 본 발명에서는 상기 NAD+의 precursor 중 하나로써, Nicotinic acid(NA)을 사용하였다.
본 발명에서 용어 "분화"란 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 좁게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당된다.
본 발명에서 용어 "분화된 세포"란 상기 분화과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말한다. 본 발명의 분화된 세포는 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 체세포(somatic cell) 또는 전구세포(progenitor cell)이다. 또한, 바람직하게는 인간에게서 유래한 세포이다.
본 발명에서 용어 "체세포"는 생식세포를 제외한 동식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며 염색체가 2n을 유지한다는 특성이 있다.
본 발명에서 용어 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않은 미분화 부모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.
본 발명에서의 용어 "다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"란 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 해당 다능성 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 다능성 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 다능성 줄기세포이다.
본 발명에서의 용어 "배아줄기세포"란, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.
본 발명에서의 용어 "유도만능줄기세포"란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 유도만능줄기세포 (iPSCs: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)이 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 유도만능줄기세포이다.
본 발명에서 용어 "역분화(de-differentiation)"는 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 상태로 복원될 수 있는 프로세스를 의미한다. 또한, 상기 역분화는 본 발명에서 세포 리프로그래밍과 동일한 의미로 사용된다. 이러한 세포의 역분화 기작은 핵 내의 후생유전학(뉴클레오타이드 서열에서의 변화없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득한다.
본 발명에서 용어 "역분화 촉진"이란 역분화가 일어나는 과정에서 역분화의 과정이 빠르게 일어나게 하거나 역분화되는 효율을 증가시키는 것을 말한다. 곧, 역분화의 효율을 속도 또는 비율 면에서 증진한다는 의미를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포에서 NAD+ 생합성과정의 주요 효소들의 발현을 마이크로어레이와 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 분석하였다 (도 1). 그 결과 미분화된 배아줄기세포와 유도만능줄기세포에서 NAD+ 생합성 관련 효소들의 발현이 증가되어 있고, 분화 시 그들의 발현이 감소함을 확인하였다 (도 1).
또한, NAD+ 합성효소 저해제인 FK866 처리 시, 세포내 NAD 농도 감소와 더불어 세포 사멸이 유도되고, 배아줄기세포가 분화됨을 확인하였다 (도 2). 그러나, FK866과 함께 니코틴아마이드 또는 NAD precusor인 Nicotinic acid(NA) 및 NAD 처리 시 FK866에 의한 손상이 회복됨을 확인하였으며 (도 2), 이러한 효과는 mTeSR1 chemically defined medium (mTeSR1-CDM) 배양 조건에서도 동일하게 확인되었다 (도 3).
본 발명의 조성물은 바람직하게는 배양 배지 형태이다. 따라서, 본 발명의 조성물에는 분화된 세포가 다능성 줄기세포로 역분화하는데 방해가 되지 않는 한, 일반적으로 세포 배양 배지에 포함되는 물질이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 분화된 세포를 다능성을 가지는 줄기세포로의 역분화를 촉진하는 조성물은 세포의 생존 및 기능에 해가 되지 않는 농도의 니코틴아마이드를 포함한다. 바람직하게는, 최종 농도 0.01 이상 내지 20 mM 이하의 농도의 니코틴아마이드를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.05 이상 내지 10 mM 이하의 농도의 니코틴아마이드를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는 0.1 내지 5 mM 농도의 니코틴아마이드를 포함할 수 있다 (도 4).
본 발명에서 분화된 세포를 다능성을 가지는 줄기세포로의 역분화를 촉진하는 조성물에는 하나 이상의 역분화 유도인자들이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "역분화 유도인자"란 최종적으로 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 유도만능줄기세포로 역분화 되도록 유도하는 물질이다. 상기 역분화 유도인자는 최종적으로 분화된 세포의 역분화를 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있으며, 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 역분화 유도인자로서 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 Oct4 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "단백질을 코딩하는 핵산분자"는 세포 내에 전달되면 그 자체로 해당 단백질을 발현할 수 있도록 프로모터 등에 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있으며, 또한, 세포 내 염색체에 삽입되어 해당 단백질을 발현할 수 있는 핵산 분자를 폭넓게 포함한다. 예를 들어, 역분화 유도인자로서 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산분자가 발현벡터 안에 작동 가능하게 연결되어 세포 내로 전달될 수도 있으며, 숙주 세포의 염색체 내로 삽입되는 형태로 세포 내로 전달될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 역분화 인자인 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 발현 핵산분자를 레트로바이러스 1 MOI를 통하여 인간 섬유아 체세포(human fibroblasts)에 형질도입하여 역분화를 유도하였다. 또한, 이와 병행하여 서로 다른 농도, 시간대에서 니코틴아마이드와 다른 NAD+ precursor를 첨가함에 따른 역분화 유도 효율 변이를 관찰하였다. 그 결과, 다른 물질과 비교하여, 니코틴아마이드를 첨가했을 때, 약 17배 정도 역분화 유도 효율이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 4). 역분화 효율은 hESC-특이 인자인 Alkaline phosphatase (AP) 염색에서 양성 반응을 나타내며, hESC-like morphology를 가진 콜로니 수를 측정하여 계산하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 역분화 효율 증진에 효과적인 최적의 니코틴아마이드 첨가 농도 범위를 결정하기 위해 서로 다른 농도 조건에서 역분화 유도 효율을 확인한 결과, 니코틴아마이드 농도에 의존적으로 역분화 유도 효율이 증가되는 것을 확인하였다.
구체적으로 니코틴아마이드를 처리하지 않은 대조군에 비해, 각 13배 (0.1 mM), 28배 (1 mM), 16배 (10 mM), 2배 (20 mM) 역분화 유도 효율이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 4).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 니코틴아마이드를 처리하는 시기 및 기간을 최적화 하기위해 다양한 조건하에서 니코틴아마이드를 처리 한 후 역분화 유도 효율의 변화를 확인하였다. 그 결과, 1) 니코틴아마이드를 유사하게 5 내지 7일 동안 1(바이러스 감염 후 5일, 도 5A; 조건 b), 2 (바이러스 감염 5일 후 12일까지, 도 5A; 조건 c), 3 (바이러스 감염 12일 후 19일까지, 도 5A; 조건 d), 4단계 (바이러스 감염 19일 후 26일까지, 도 5A; 조건 e)로 나누어 처리한 경우, 1 단계인 바이러스 감염 직후부터 초기 5일 동안 분화세포 배양배지와 함께 처리한 경우 이후 서로 다른 3단계에서 7일 동안 처리했을 때 보다 가장 효과적으로 역분화 효율을 증진시킴을 확인하였다 (도 5A). 2) 니코틴아마이드를 유사하게 12 내지 14일 동안 1(바이러스 감염 후 12일, 도 5A; 조건 f), 2 (바이러스 감염 5일 후 19일까지, 도 5A; 조건 g), 3 단계(바이러스 감염 12일 후 26일까지, 도 5A; 조건 h)로 나누어 처리한 경우, 1 단계인 바이러스 감염 직후부터 초기 12일 동안 (분화세포 배양배지에서 5일 배양 후 새로운 배양 접시에 옮겨 인간 배아줄기세포 배양배지에서 추가로 7일 배양) 처리한 경우 이후 서로 다른 2단계에서 14일 동안 처리했을 때 보다 가장 효과적으로 역분화 효율을 증진시킴을 확인하였다 (도 5A). 3) 니코틴아마이드를 유사하게 19 내지 21일 동안 1(바이러스 감염 후 19일, 도 5A; 조건 i), 2단계(바이러스 감염 5일 후 26일까지, 도 5A; 조건 j)로 나누어 처리한 경우, 1 단계인 바이러스 감염 직후부터 19일 동안 (분화세포 배양배지에서 5일 배양 후 새로운 배양 접시에 옮겨 인간 배아줄기세포 배양배지에서 추가로 14일 배양) 처리한 경우 감염된 세포를 새로운 배양접시에 옮기고 인간 배아줄기세포 배양배지로 21일 동안 배양하면서 처리한 경우보다 효과적으로 역분화 효율을 증진시킴을 확인하였다 (도 5A). 테스트한 모든 조건에서, 역분화 유도 전체 과정 동안 지속적으로 니코틴아마이드를 처리하였을 때 역분화 유도 효율이 가장 높게 증진됨을 확인하였다 (도 5A, 조건 k, 및 도 5C, d). 결론적으로, 니코틴아마이드를 역분화 초기 과정에 처리하였을 때 역분화 유도 증진효과가 가장 우수하며, 초기 이후 처리에 있어서도 처리한 시간에 의존적으로 역분화 효율을 획기적으로 증진시킬 수 있음을 검증하였다.
초기 처리에 의한 역분화 효율 증진 효과를 좀 더 분석하기위해, 추가적으로, 1) 역분화 인자 도입 후, 마트리겔에 옮겨 재분주하기 전에 니코틴아마이드를 5일간 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 세포 각각을 같은 세포수로 카운팅(counting)하여 마트리겔에 재분주하고, 2) 여기에 다시 니코틴아마이드를 21일 동안 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 나누어 세포 증식 변이에 따른 역분화 유도 효율 변이 연계 가능성을 관찰하였다. 재분주 후, 니코틴아마이드를 첨가하지 않아도, 감염후 초기에 니코틴아마이드를 처리한 세포군에서 처리하지 않은 대조군에 비해 역분화 유도 효율이 증가함을 확인할 수 있었으며 (도 5C : b), 이는 초기 세포 성장 촉진이 역분화 유도 효율을 증진시키는데 유리하게 작용하고 있음을 나타낸다. 또한, 초기에 니코틴아마이드를 첨가하지 않아도, 재분주 후에 니코틴아마이드를 처리한 세포군에서 처리하지 않은 대조군에 비해 역분화 유도 효율이 증가함을 확인할 수 있었으며 (도 5C : c), 이는 초기 뿐만 아니라 재분주 이후에도 니코틴아마이드가 세포 성장 촉진에 유리하게 작용하고 있으며, 이는 역분화 유도 효율과 연계되어 있음을 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서는, 니코틴아마이드가 역분화 유도 배양과정에서의 kinetics 촉진하여 역분화 유도에 소요되는 기간을 단축시킬 수 있는지 확인하기 위해 시간대별로 hESC-특이 인자의 발현양상을 검증하였다. 도 6과 도 7에서 보여지는 바와 같이 니코틴아마이드가 처리된 조건에서 역분화를 유도한 경우 hESC-특이 인자들(Nanog, Tra1-81, TERT)의 발현이 처리하지 않은 대조군에 비해 조기에 출현함을 면역염색법 (도 6)과 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 방법(도 7)을 통해 확인하였고, AP 염색에서 양성인 hESC-like morphology를 가진 콜로니가 니코틴아마이드를 처리한 배양조건에서 처리하지 않은 대조군에 비해 조기에 출현함을 확인함으로써 (도 8), 니코틴아마이드가 역분화 유도 kinetics 촉진하여 역분화 유도에 소요되는 기간을 효과적으로 단축시킬 수 있음을 확인하였다.
이 과정에서 특히, 니코틴아마이드의 후성유전학적 조절 효과도 확인하였다 (도 9). 크로마틴 면역침강법을 이용하여, 전능성 유지인자 Nanog와 Oct4의 프로모터 부분에서 유전자 발현 촉진에 관여하는 히스톤 3의 라이신 4번 잔기의 메틸레이션이 니코틴아마이드에 의해 증가되어 있음을 확인하였고, 유전자 발현 억제에 관여하는 27번 잔기의 메틸레이션은 감소되어 있음을 확인하였다 (도 9).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 서로 다른 농도와 시간대에서 니코틴아마이드를 처리한 조건에서 역분화 유도 배양을 유도하고, 총 세포수를 측정함으로써 니코틴아마이드가 역분화 유도 배양과정에서 세포의 성장과 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 10). OSKM을 transduction하지 않은 대조군에 비해 OSKM을 transduction한 조건하에서 세포수의 증가가 상당히 둔화됨을 확인할 수 있으며, 같은 조건에서 니코틴아마이드를 처리한 경우 이러한 세포성장의 둔화가 상대적으로 향상됨을 확인하였다 (도 10). 추가적으로 역분화 유도 배양 동안 세포증식 변이를 BrdU 어세이 방법 (도 11)과 세포주기를 확인하기 위한 live-cell imaging (도 12)을 통해 확인한 결과 상기 결과와 유사하게 니코틴아마이드를 처리한 경우 세포성장이 처리한 농도에 의존적인 양태로 유의하게 향상됨을 관찰하였으며, 이때 세포성장을 촉진하기 위한 최적 농도는 1 mM임을 확인하였다 (도 10 및 도 11).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 니코틴아마이드가 역분화 유도 과정에서의 장애요소로 알려진 OSKM transduction에 의해 유도되는 노화상태를 개선할 수 있는지 확인하기 위해 노화 마커인 senescent-associated β-galactosidase (SA-β-gal)과 senescence-associated heterochromatic foci (SAHF)를 분석한 결과 니코틴아마이드를 처리한 조건에서 상기 SA-β-gal 활성과 SAHF 형성 이 감소함을 확인하였다 (도 13).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 니코틴아마이드가 역분화 유도 과정에서의 역분화 유도의 또 다른 장애요소로 알려진 산화 스트레스, 미토콘드리아 활동 변이 등에 영향을 주고 있는지를 확인한 결과 OSKM transduction에 의해 세포내 증가된 ROS 레벨 (도 14)과 단백질 산화 수준을 낮추고 (도 15), 감소된 미토콘드리아 활동을 증진시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 16).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 알려진 노화/세포사멸 신호전달인자인 p53, p21, p16의 발현 양태 변이를 관찰하였다. 도 17 (면역염색법), 도 18 (웨스턴블랏), 도 19 (실시간 중합효소 연쇄반응)에서 보인 바와 같이 니코틴아마이드가 처리된 배양조건에서 노화 인자인 p53, p27, p21, p16의 발현이 효과적으로 억제되고 있음을 확인하였고, 이러한 효과는 고농도 (20 mM)의 니코틴아마이드에서는 나타나지 않음을 확인하였다 (도 20). 결론적으로, 니코틴아마이드가 역분화 과정에서 유도되는 세포노화 및 사멸 현상을 효과적으로 억제함으로써 역분화 유도 효율을 증진시키는데 기여하고 있음을 검증하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 니코틴아마이드가 처리한 조건에서 제작된 다능성 줄기세포가 지속적인 배양과정동안 hESC-like morphology를 유지하고, hESC와 유사한 수준으로 hESC-특이 인자를 발현하며 (도 21 내지 도 22), 역분화 유도에 이용한 4가지 transgene (OSKM) 모두 숙주세포 게놈에 삽입 되어 있고 (도 23), hESC와 유사한 수준으로 hESC-특이 프로모터 (Oct4, Nanog) 메틸화 양태 (도 24)와 글로벌 유전자 발현 패턴을 나타내고 (도 25), 생체 외 (도 26 및 도 27) 및 생체 내 (도 28)에서 삼배엽으로 분화되는 능력을 가지고 있음을 검증하였다.
다른 하나의 양태로서, 분화된 세포에서 역분화된 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, (a) 분화된 세포에 역분화 유도인자를 전달하는 단계; 및 (b) 분화된 세포를 본 발명에 따른 상기 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 역분화 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역분화 유도인자를 분화된 세포의 배양액에 투여하는 방법, 역분화 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법 또는 역분화 유도인자의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로 트랜스펙션시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스로 분화된 세포를 감염시키는 것인 방법을 사용할 수 있다.
상기 역분화 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microijection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 역분화 유도인자는 역분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 어느 하나 이상의 핵산분자를 더 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 Oct4 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GP2-293 패키징 세포를 사용할 수 있다.
또한, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retroviruses), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), mMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 렌티바이러스(Lentiviruses), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 pMXs를 사용할 수 있다.
상기 (a) 및 (b)의 단계는 동시, 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있으며, 상기 방법은 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조방법을 통해 제조되는 역분화된 다능성 줄기세포는, 분화된 세포에 니코틴아마이드를 포함하는 상기 역분화 촉진용 조성물과 역분화 유도인자를 처리하여 얻어지는 시험관 내 모든 세포 배양물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 세포 배양물은 역분화 과정에 있는 각종 세포들과 이를 배양하는 과정에서 얻어지는 각종 단백질 및 효소, 전사체들과 이를 함유하는 배양액까지 포함할 수 있다.
본 발명의 분화된 세포 및 다능성 줄기세포는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 분화된 세포에서 다능성 줄기세포로 역분화는, 분화된 세포 대비 역분화된 세포에서 세포성장 및 증식이 증진되거나, 세포사멸이 억제되거나, 미토콘드리아 활성이 증진되거나, 노화 억제되거나, 산화 스트레스 감소되거나, p53 신호전달이 억제되거나, 역분화 유도 시간이 단축되거나, 역분화 유도 효율이 증진되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 역분화 유도인자를 형질도입하고, 니코틴아마이드가 포함된 배양액에서 배양한 역분화된 다능성 줄기세포가 분화된 세포에 대비하여 세포성장 및 증식이 증진되며, 세포사멸이 억제되고, 미토콘드리아 활성이 증진되며, 노화가 억제되고, 산화스트레스가 감소되며, p53 신호전달이 억제되고, 역분화 유도 시간이 단축되며, 역분화 유도 효율이 증진되는 특징을 보이는 것을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 니코틴아마이드를 포함하는 미분화 다능성 줄기세포의 유지 또는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 니코틴아마이드를 포함하는 배지 배양조건에서 세포의 성장과 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 배양 후 총세포수를 측정함으로써 확인하였다 (도 10).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 분화된 세포에서 역분화된 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 의하여 제조된 역분화된 다능성 줄기세포를 니코틴아마이드를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 역분화된 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 역분화된 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성 줄기세포를 계속적으로 니코틴아마이드를 포함하는 배지에서 배양하여 미분화 상태 및 다능성 유지에 유리한 환경조건을 제공한다.
본 발명에서 "미분화 상태"란 폭넓게는 세포가 최종 분화되지 않은 상태를 모두 포함하며, 구체적으로는, 본 발명의 다능성 줄기세포가 처음 상태로부터 더 이상 분화 단계가 진행되지 않거나, 역분화되는 상태를 의미한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포 미분화 상태 유지용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 배양 배지일 수 있으며, 배양 배지 형태의 조성물 내에서 니코틴아마이드 농도는 0.01 mM 내지 20 mM 일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물에는 기 알려진 CDM의 조성물의 1종 이상이 추가로 포함될 수 있으며, 니코틴아마이드를 첨가함으로써 CDM의 조성 및 효능을 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 대표적인 인간 다능성 줄기세포인 H9 인간 배아줄기세포를 분화 상태가 유도되기 쉬운 배양조건인 unconditioned medium (UM)을 이용하여 배양하고 니코틴아마이드를 포함하는 NAD+ precursors (L-tryptophan, Nicotinic acid, NMN, Iso-Nam, 3-ABA)와 NAD+를 처리하는 경우 분화 유도가 억제되고 미분화 상태를 유지할 수 있는지 조사하였다. 도 29에서 나타난 바와 같이 니코틴아마이드를 처리한 UM 배양조건에서 가장 효과적으로 분화 유도가 억제되고 미분화 상태가 conditioned medium(CM)에서 배양한 수준으로 유지됨을 확인하였다 (도 29). 다양한 농도영역에서 니코틴아마이드의 효과를 관찰한 결과 인간 배아줄기세포, 인간 유도만능줄기세포를 포함하는 인간 다능성 줄기세포의 미분화 상태 유지에 효과적인 농도는 0.1 내지 5 mM 농도 범위임을 확인하였다 (도 30).
본 발명의 일 실시예에서는, 서로 독립적으로 확립된 두 종류의 미분화 인간 배아줄기세포주 (H1 과 H9)에서 니코틴아마이드의 효과를 분석한 결과, MEF 영양세포를 이용하거나, 이용하지 않는 모두의 조건에서 또한, 영양세포 및 혈청이 첨가되지 않은 배지조성물이 알려진 chemically-defined 배양조건에서도 0.1 내지 1 mM 농도 범위에서 니코틴아마이드의 첨가가 미분화 상태 유지에 유리하게 작용하고 있음을 확인하였다 (도 31).
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 다능성 줄기세포의 미분화 상태 유지에 효과적인 니코틴아마이드가 인간 다능성 줄기세포의 세포 증식에도 영향을 주는지 조사하기 위해 BrdU 어세이 방법으로 조사한 결과 니코틴아마이드가 처리된 배양조건에서 세포 성장이 유의하게 증가됨을 확인하였다 (도 32).
본 발명에서, 인간 다능성 줄기세포의 미분화 배양 조건에 이용되는 니코틴아마이드의 농도는 바람직하게는 0.01 이상 내지 20 mM 이하의 농도의 니코틴아마이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 0.05 이상 내지 10 mM 이하의 농도의 니코틴아마이드를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는 0.1 이상 내지 5 mM 이하의 농도의 니코틴아마이드를 포함할 수 있다 (도 29 내지 도 32).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 니코틴아마이드를 포함하는 다능성 줄기세포의 미토콘드리아 기능 유지 또는 향상용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 미토콘드리아 기능은 세포 내 미토콘드리아의 에너지 생산 관련 대사기능을 포함하며, 세포 노화 과정에 의하여 감소되는 특징을 가지고, 특히 미분화 또는 역분화된 다능성 줄기세포에서 높게 유지되는 것으로 알려져 있다. 상기 미토콘드리아가 기능은 막에 존재하는 다양한 이온 채널을 통하여 이루어짐에 따라, 미토콘드리아의 막전위를 통하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 니코틴아마이드를 처리한 후 미토콘드리아의 막전위(ΔΨm)를 측정하였다. 인간 배아줄기세포 유지 배양 시, mTeSR1에 다양한 농도의 니코틴아마이드를 첨가한 후, JC-1 염색법을 통해서 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아의 막전위를 측정하였다. JC-1 염색 후 활성화된 미토콘드리아는 적색으로 염색되고, 비활성화된 미토콘드리아는 녹색으로 염색되는데, 적색으로 염색된 미토콘드리아의 수/녹색으로 염색된 미토콘드리아의 수의 비율을 측정함으로써 그 값이 높을수록 활성화된 미토콘드리아가 증가되어 있음을 의미한다. 니코틴아마이드 0.1 mM을 처리한 경우 미토콘드리아의 액션 포텐셜이 유의성 있게 증가함을 확인하였다 (도 33). 이는, 니코틴아마이드의 첨가가 미토콘드리아 활동을 증진함으로써 다능성 줄기세포의 미분화 상태 유지에 유리하게 작용하고 있음을 제시하고 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포 미분화 상태 유지용 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지되도록 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 유지되도록 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포 미분화 상태 유지용 조성물을 이용하여 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양물을 제조하는 방법을 제공한다.
이 때, 상기 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지되도록 배양하는 방법 및 세포 배양물을 제조하는 방법은 동물 혈청 및 영양세포를 이용하거나 또는 이용하지 않는 상태로 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양은 다수의 연속 계대 배양일 수 있다.
본 발명의 다능성 줄기세포, 미분화 상태 및 세포 배양물은 상기에서 설명한 바와 같다.
일반적으로 인간 다능성 줄기세포인 H9는 UM 배양조건에서는 분화되지만, 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가하게 되면 분화되지 않고 미분화를 유지할 수 있으며 (도 34A), 또한, 단일 세포 dissociation 후 low-density로 배양했을 때에도 인간 다능성 줄기세포인 H9 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 생존 및 자가 재생능력을 유의성 있게 증가시킴을 AP 염색 및 세포사멸 분석을 통해서 확인하였다 (도 34B). 또한, UM과 같은 분화 배양조건에서도 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가를 통해서 10 계대 이상 미분화 상태로 장기 배양이 가능함을 TRA-1-60 염색을 통해 확인하였고 (도 35), 이때 장기 계대 배양 이후에도 정상 핵형을 관찰할 수 있었다 (도 36). 이러한 결과는 니코틴아마이드가 세포 및 분자 기작을 조절함으로써 인간 다능성 줄기세포의 미분화 유지 배양 조건을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다능성 줄기세포; 니코틴아마이드를 포함하는 다능성 줄기세포의 미토콘드리아 기능 향상용 조성물을 포함하는 세포 배양물을 제공한다.
본 발명은 다능성 줄기세포에 니코틴아마이드를 포함하는 미토콘드리아 기능 향상용 조성물을 처리하여 얻어지는 시험관 내 모든 세포 배양물을 포함한다. 이는 배양 과정에 있는 각종 세포들과 이를 배양하는 과정에서 얻어지는 각종 단백질 및 효소, 전사체들과 이를 함유하는 배양액까지 포함한다.
본 발명의 다능성 줄기세포는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 배아줄기세포를 수득하는 단계; 및 상기 배아줄기세포를 상기 배지 조성물을 포함하는 배양 조건 하에서 배양하여 배아줄기세포주를 수득하는 단계를 포함하는 미분화 상태로 유지될 수 있는 배아줄기세포주의 확립방법을 제공한다.
이때, 상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 배양
인간 배아줄기세포(hESC) H9 (NIH Code, WA09; WiCell Research Institute, Madison, WI) 및 H1 (NIH Code, WA01; WiCell Research Institute), 및 유도만능줄기세포(hiPSC)를 γ-선을 조사한 MEF (mouse embryonic fibroblast) 또는 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)이 코팅된 배지에서 각각 hESC 배양 배지 (Unconditioned medium; UM) 또는 MEF-CM (conditioned medium) 배지로 배양하였다. 상기 배양된 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 주당 한 번 콜라게네이즈 IV(collagenase IV) (1 mg/㎖; Invitrogen) 또는 디스파제(dispase) (1 mg/㎖; Invitrogen)를 처리하여 계대배양 하였다. MEF-CM은 공지된 바에 따라(Xu C. Nat Biotechnol 19, 971-974) γ-방사선 조사된(γ-irradiated) MEF로 준비하였고, MEF-CM은 8 ng/㎖ bFGF을 추가하였다. UM은 80% DMEM/F12, 20% 넉아웃 혈청 대체제 (knockout serum replacement; KSR, Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% 비필수 아미노산 (non-essential amino acids; NEAA, Invitrogen), 1 mM L-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM β-머캡토 에탄올 (β-mercaptoethanol, Sigma, St. Louis, MO) 및 6 ng/㎖ bFGF (basic fibroblast growth factor, Invitrogen)을 포함한다. 특히, 영양세포 및 혈청 없이 배양하기 위해, 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 mTeSR1 배지 (StemCell Technologies)에서 배양하였다. 인간 신생 표피 섬유아세포 (Human newborn foreskin fibroblasts; hFF, ATCC, catalog number CRL-2097; American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen), 1% 비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-머캡토 에탄올을 포함하는 DMEM에서 배양하였다.
실시예 2. 레트로바이러스 생산 및 hiPSCs의 유도
논문, Takahashi, K. et al.(Cell 131, 2007, 861-872)에 개시된 바와 같은 OCT4(POU5F1), SOX2, c-MYC(MYC) 및 KlF4의 인간 cDNA를 포함하는 pMXs 벡터를 Addgene사로부터 구입하였다. 패키지 세포주 GP2-293 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 레트로바이러스 벡터 DNA 및 VSV-G 외피 벡터로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 24 시간째, 첫 번째 바이러스가 포함된 상등액을 회수한 후 배지를 교환하였고, 24시간 후 두 번째 바이러스가 포함된 상등액을 회수하였다. 상등액을 0.45 m 공극 사이즈 필터로 멸균한 후, 20,000 rpm에서 90분간 원심분리한 후 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
iPSCs의 생성을 위하여 인간 포피섬유아세포(hFFs)를 형질도입하기 6시간 전에 젤라틴이 코팅된 6-웰 플레이트에 각 웰당 1 X 105 세포 농도로 접종하였고, polybrene(6 ㎍/㎖) 존재 하에 바이러스를 감염시켰다. 형질도입 5일 후, hFFs 세포를 트립신으로 처리하여 회수하고, 기저세포가 없는(feeder-free) 조건에서의 실험을 위하여 마트리겔이 코팅된 6-웰 플레이트에 각 웰당 5 내지 6 X 104 세포 농도로 재접종하였다. 10 ng/㎖ 농도의 bFGF가 첨가된 MEF-CM 배지로 교환하였다. 배지는 이틀에 한 번씩 교환하였다. 형질 도입 20일 후, hESC 형태의 콜로니를 획득하여 MEF를 영양세포로 하는 12-웰 플레이트에 옮긴 후, 상기 실시예 1의 hESC 배양 방법을 이용하여 지속적으로 증식 배양하였다.
인간 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 효율을 측정하기 위하여 마트리겔이 코팅된 6-웰 플레이트에서 배아줄기세포 마커인 ALP로 염색된 콜로니의 수를 측정하여 역분화 유도 효율을 계산하였다. 이때, 각 실험은 세 번 실시하였다.
실시예 3. 마이크로어레이 분석
인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS), H9 인간 배아줄기세포(hES) 및 인간 섬유아체세포주(hFF)에서 분리한 전체 RNA를 RNA Mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, Cy3를 표지하였으며, 제조사의 지시에 따라 에질런트 인간 전체 게놈 4X44K 마이크로어레이 (단일 색깔 기반)에 혼성화하였다. 혼성화 이미지를 에질런트사의 DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캔하였고, Feature 추출 소프트웨어를 사용하여 정량하였다 (Agilent Technology, Palo Alto, CA). 모든 데이터 표준화 및 배수-변화 유전자의 선별은 GeneSpringGX 7.3을 사용하여 수행하였다 (Agilent Technology, USA). 표준화 비율의 평균을 표준화된 신호 채널 강도의 평균값을 표준화된 대조군 채널 강도의 평균값으로 나눠서 계산하였다. GeneSpringGX 7.3. 유전자 분류에 의한 Gene OntologyTM Consortium (http://www.geneontology.org/index.shtml)에 따라 수행된 유전자의 기능적 주석은 BioCarta (http://www.biocarta.com/), GenMAPP (http://www.genmapp.org/), DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), 및 Medline databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 수행된 연구에 기반하였다.
실시예 4. RNA 추출, 역전사 및 PCR 분석
RNeasy Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 생성한 세포로부터 전체 RNA를 분리한 후, SuperScript First-strand 합성 시스템 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 역전사하였다. 이후, 반-정량 RT-PCR은 platinum Tag SuperMix 키트(Invitrogen)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 94℃ 3분 후, 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초의 25 내지 30 사이클 후 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
Gene Primer (Forward) Primer (Reverse) Accession No.
Total OCT4 GAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTG(서열번호 1) CAGAGGAAAGGACACTGGTCCC(서열번호 2) NM_002701
Total SOX2 AGAACCCCAAGATGCACAAC(서열번호 3) ATGTAGGTCTGCGAGCTGGT(서열번호 4) NM_003106
Total KLF4 ACCCTGGGTCTTGAGGAAGT(서열번호 5) ACGATCGTCTTCCCCTCTTT(서열번호 6)
Total c-Myc CCTACCCTCTCAACGACAGC(서열번호 7) CTCTGACCTTTTGCCAGGAG(서열번호 8) NM_002467
Endo OCT4 GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG(서열번호 9) CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC(서열번호 10)
Endo SOX2 GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG(서열번호 11) TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG(서열번호 12)
Endo KLF4 AGCCTAAATGATGGTGCTTGGT(서열번호 13) TTGAAAACTTTGGCTTCCTTGTT(서열번호 14)
Endo c-Myc CGGGCGGGCACTTTG(서열번호 15) GGAGAGTCGCGTCCTTGCT(서열번호 16)
hTERT CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA (서열번호 17) GGATGAAGCGGAGTCTGGA(서열번호 18) NM_198255.1
For transgene and genomic integration
Trans OCT4 GAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTG(서열번호 19) CCCTTTTTCTGGAGACTAAATAAA(서열번호 20)
Trans SOX2 GGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTC(서열번호 21) TTATCGTCGACCACTGTGCTGCTG(서열번호 22)
Trans KLF4 ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC(서열번호 23) TTATCGTCGACCACTGTGCTGCTG(서열번호 24)
Trans c-Myc CAACAACCGAAAATGCACCAGCCCCAG(서열번호 25) TTATCGTCGACCACTGTGCTGCTG(서열번호 26)
hESC markers
NANOG CAAAGGCAAACAACCCACTT(서열번호 27) ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC(서열번호 28) NM_024865
Ectoderm lineage markers
NCAM AGGAGACAGAAACGAAGCCA(서열번호 29) GGTGTTGGAAATGCTCTGGT(서열번호 30) NM_000615
PAX6 GCCAGCAACACACCTAGTCA(서열번호 31) TGTGAGGGCTGTGTCTGTTC(서열번호 32) NM_000280
VIM gggacctctacgaggaggag(서열번호 33) cgcattgtcaacatcctgtc(서열번호 34) NM_003380
OTX1 TAACCCTACGCCCTCCTCTTCCTACT(서열번호 35) AAGCAGTCGGCAGAGTTGAAGGCAAG(서열번호 36) NM_014562
Mesoderm lineage markers
cTnT GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA(서열번호 37) GAGGCACCAAGTTGGGCATGAAC(서열번호 38) NM_000364
IGF2 CAGACCCCCAAATTATCGTG(서열번호 39) GCCAAGAAGGTGAGAAGCAC(서열번호 40) NM_000612
TBX6 TACATTCACCCCGACTCTCC(서열번호 41) TGTATGCGGGGTTGGTACTT(서열번호 42) NM_004608
RUNX2 cactcactaccacacctacc(서열번호 43) gtcgccaaacagattcatcc(서열번호 44) NM_001024630
Endoderm lineage markers
HGF gcatcaaatgtcagccctgg(서열번호 45) caacgctgacatggaattcc(서열번호 46) NM_000601
AMYLASE GCTGGGCTCAGTATTCCCCAAAT(서열번호 47) GACGACAATCTCTGACCTGAGTAG(서열번호 48) NM_000699
HAND1 tgcctgagaaagagaaccag(서열번호 49) atggcaggatgaacaaacac(서열번호 50) NM_004821
PECAM ccacatacactccttccacc(서열번호 51) gactacccaaaactacaagcc(서열번호 52) NM_000442
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(서열번호 53) GAAGATGGTGATGGGATTTC(서열번호 54) NM_002046
For bisulfate sequencing
OCT4-1 ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT(서열번호 55) CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC(서열번호 56)
OCT4-2 GGATGTTATTAAGATGAAGATAGTTGG(서열번호 57) CCTAAACTCCCCTTCAAAATCTATT(서열번호 58)
NANOG TGGTTAGGTTGGTTTTAAATTTTTG(서열번호 59) AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA(서열번호 60)
실시예 5: NAD 측정
니코틴아마이드 및 관련 화합물을 배아줄기세포에 처리하고, 6일 후 단백질을 분리하였다. 각 군당 20 ug 단백질에 NAD 사이클링 효소를 첨가하여 실온에서 5분간 반응 시킨 후, NADH 현상액을 첨가하여 2-3 시간 반응하였다. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 후, 단백질 양으로 나누어 정량화 하였다.
실시예 6. AP 염색(Alkaline Phosphatase Staining)
AP 염색은 제조사(Sigma)의 지침에 따라 시판되는 AP 키트를 사용하여 수행하였다. AP-양성 세포의 이미지를 HP Scanjet G4010으로 기록하였다. 또한, 올림푸스 현미경(IX51, Olympus, Japan)으로 명시야상(bight field images)을 얻었다.
실시예 7: 세포사멸 이중 분석 (Dual apoptosis analysis)
니코틴아마이드에 의한 인간 다능성 줄기세포의 세포사멸 감소 효과를 확인하기 위해서 dual apoptosis assay (Biotium, Hayward, CA)를 통해 확인하였다. 배아줄기세포 또는 역분화 과정 중의 세포에 NucView™488 Caspase-3 Substrate (초록색)/Annextin V (빨간색)를 처리하고 실온에서 30분 동안 염색 시킨 후 PBS로 수세하였다. Olympus fluorescence microscope (IX51, Olympus)로 샘플당 최소 4 구역에서 사진을 찍고, 초록색 (Caspase-3)으로 염색된 세포를 세어 세포사멸 정도를 정량화하였다.
실시예 8. 면역세포화학적 방법(Immunocytochemistry)
면역염색법을 위하여 세포를 마트리겔로 코팅된 4-웰 Lab-Tek 챔버 슬라이드(Nunc, Naperville, IL)에 접종하고, 개시된 조건 하에서 5일 동안 배양하였다. 세포를 실온(RT)에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 후 PBS/0.2% BSA를 사용하여 세척하고, 세포를 15분 동안 PBS/0.2% BSA/0.1% 트리톤 X-100에 투과시킨 뒤, 실온에서 1시간 동안 PBS/0.2% BSA에서 4% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 반응시켰다. 세포를 PBS/0.2% BSA로 희석시킨 각각의 1차 항체를 사용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척한 후, 세포를 1시간 동안 실온에서 PBS/0.2% BSA에 있는 2차 항체(Invitrogen)가 부착된 FITC 또는 Alexa594를 사용하여 반응시켰다. 세포를 10 ㎍/㎖ DAPI를 사용하여 대비염색시켰다. 챔버 슬라이드는 올림푸스 현미경 또는 Axiovert 200M 현미경(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)으로 분석하였다. 사용한 항체는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti-p16 4824 Cell Signaling Technology 1:1000
anti-p-p53 (Ser 15) 9286 Cell Signaling Technology 1:500
anti-p-p53 (Ser 315) 2528 Cell Signaling Technology 1:250
anti-p53 sc-126 Santa Cruz Biotechnology 1:2000
anti-p21 sc-397 Santa Cruz Biotechnology 1:4000
anti-p27 2552 Cell Signaling Technology 1:1000
anti-p-ERK 9101 Cell Signaling Technology 1:1000
anti-Cytochrome c 4272 Cell Signaling Technology 1:1000
anti-PARP 9532 Cell Signaling Technology 1:1000
anti--actin 5316 Sigma 1:0000
anti-OCT4 sc-9081 Santa Cruz Biotechnology 1:50
anti-NANOG sc-33759 Santa Cruz Biotechnology 1:200
anti-NANOG AF1997 R&D Systems 1:100
anti-SSEA-3 MAB1434 R&D Systems 1:50
anti-SSEA-4 MAB1435 R&D Systems 1:50
anti-TRA-1-60 MAB4360 Chemicon 1:100
anti-TRA-1-81 MAB4381 Chemicon 1:100
In vitro differentiation
anti-TUJ1 PRB-435P Covance 1:500
anti-NESTIN MAB5326 Chemicon 1:100
anti-FOXA2 07-633 Millipore 1:100
anti-SOX17 MAB1924 R&D 1:50
anti--SMA A5228 Sigma 1:400
anti-DESMIN AB907 Chemicon 1:30
실시예 9. 크로마틴 면역침강법 (Chromatin Immunoprecipitation assay)
세포배양액에 포름알데하이드를 넣어 세포를 고정시킨 후, 초음파를 이용하여 크로마틴을 적당한 크기로 깨어 주었다. 히스톤 3의 라이신 4번과 27번에 대한 항체로 각각 면역침강 시킨 후, DNA를 회수하여 Oct4와 Nanog 프로모터 부위의 프라이머를 이용하여 실시간 융합효소 연쇄반응을 수행하였다. 사용한 항체 및 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
For ChIP
Antibodies Catalog No. Company Dilution
Anti-dimethyl-H3 (Lys4) 07-030 Millipore 1 : 200
Anti-trimethyl-H3 (Lys27) 07-449 Millipore 1 : 200
Gene Primer(Forward) Primer(Reverse)
OCT4 TTGCCAGCCATTATCATTCA(서열번호 61) TATAGAGCTGCTGCGGGATT(서열번호 62)
NANOG GATTTGTGGGCCTGAAGAAA(서열번호 63) GGAAAAAGGGGTTTCCAGAG(서열번호 64)
실시예 10. 성장 효율 시험(Growth efficiency test)
인간 섬유아체세포를 6-웰 배양 접시 당 약 1×105 세포의 밀도가 되도록 접종하였다. 접종된 세포를 개시된 배양 조건하에서 26일 동안 배양하였다. 세포 수를 측정하기 위해, 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리하였다. 상기 세포 부유액을 0.4% (wt/vol) 트리판 블루 용액(trypan blue solution)으로 섞은 다음, 살아 있는 세포 수를 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 19일, 26일째가 되는 날 측정하였다 (도 10). 각 실험을 세 번 실시하였다.
실시예 11. BrdU incorporation
인간 배아줄기세포를 5-브로모(bromo)-2-데옥시우리딘 (deoxyuridine) (BrdU; BD Pharmingen, San Diego) incorporation assays를 위해 4일 동안 마트리겔이 코팅된 4-웰 LabTec 챔버 슬라이드에서 배양하였다.
구체적으로 BrdU incorporation을 위해, 세포를 1시간 동안 37℃에서 30 μM BrdU 존재 하에서 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후에, 상기 세포를 15분 동안 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였으며, 실온에서 15분 동안 1 N HCl에서 반응하였다. 상기 샘플을 세척하고 15분 동안 0.1 M 소듐 테트라보레이트(sodium tetraborate)로 반응하였다. 세척한 후, 상기 세포를 1시간 동안 3% BSA를 보충한 PBS에서 항-BrdU 항체를 사용하여 반응한 후, 30분 동안 2차 항체(Invitrogen)가 부착된 FITC를 사용하여 반응하였다. 핵은 DAPI로 대비 염색한 후에 올림푸스 현미경(Olympus microscope)을 사용하여 세포를 관찰하였다.
실시예 12: 생세포 이미징 (live cell imaging) 세포주기 분석
역분화 유도 12일째에 세포주기 조절인자 제미닌 (초록색, Geminin-GFP)과 시디티원 (빨간색, Cdt1-RFP) 발현 바이러스를 세포를 천천히 흔들어 주는 조건에서 두 시간 동안 도입시키고, 이후 촉진제를 첨가하여 한 시간 더 배양하였다. 새 배양 배지로 갈아주고 하루 밤 더 배양한 후 형광 현미경으로 이미지를 얻었다. 샘플당 최소 4 구역에서 사진을 찍고, 정지기의 세포 (빨간색)와 분열하는 세포 (초록색)의 수를 세어, 초록색/빨간색의 비로 분열하는 세포의 비율을 정량화하였다.
실시예 13: 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈 (Senescent-associated β-galactosidase, SA-β-gal) 염색과 세포노화 연관 DNA 손상 염색
역분화 유도 26일째 세포를 고정용액을 이용하여 실온에서 10분 동안 고정한 후, 베타 갈락토시데이즈 용액으로 실온에서 15분 동안 염색하였다. 이후 DNA를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 5분간 염색한 후, 위상차 및 형광 현미경으로 이미지를 얻었다. 노화가 일어나고 (초록색) 손상된 DNA (파란색 뭉친 점의 형태로 나타남)를 가진 세포의 개수를 세어 정상세포 대비로 정량화 하였다.
실시예 14: 활성산소종 (ROS) 측정
역분화 유도 19일째 세포를 트립신 (trypsin)을 이용하여 단일 세포로 떨어뜨린 후, 5 μM의 CM-H2DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluresceindiacetat)로 37 ℃에서 30 분간 염색하였다. 100 μM 과산화수소 (H2O2)를 처리한 세포를 활성산소종 형성의 양성 비교군으로 사용하였으며, 형광 염색 정도를 유세포 분석기로 측정한 후 정량화 하였다.
실시예 15: 산화스트레스에 의한 단백질 손상 정량
역분화 유도 12, 19, 26일째에 대조군 및 니코틴아마이드 처리군 (Nam)에서 단백질을 분리한 후, 정량하고 2,4-dinitrophenylhydrazine을 처리하여 카보닐기가 드러나도록 하였다. 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 단백질을 분자량에 따라 분리시킨 후, dinitrophenyl 항체를 이용하여 산화스트레스에 의해 손상된 단백질을 확인하였다. 베타-액틴 (β-actin)의 발현 양으로 정량을 보정한 후, hFFs의 손상 정도를 1로 하여 상대적인 손상도를 정량화 하였다.
실시예 16: 미토콘드리아 막전위 측정
역분화 진행 시기별 대조군과 니코틴아마이드 처리군 (Nam)의 세포를 트립신 (trypsin)을 이용하여 단일 세포로 떨어뜨린 후, JC-1 (5,5',6,6'-tetraachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenz-imidazolocarbocyanine iodide) 용액으로 37 ℃에서 15 분간 염색하였다. 수세 후 형광 염색 정도를 유세포 분석기로 측정한 후, 빨간색/초록색 비율로 상대적인 미토콘드리아 막전위를 정량화 하였다.
실시예 17. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
각 세포를 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜릭 산(deoxycholic acid), 1 mM PMSF를 포함하는 RIPA 완충액으로 용해하고 아이스에서 15분 동안 프로테아제 억제제(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 섞어서 4℃에서 10분 동안 20,000 × g로 원심분리하였다. 상청액을 10분 동안 재-원심분리하였고, BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질(20 ㎍)을 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였으며, PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (Millipore Corp, Bedford, MA)으로 흡착시켰다. 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 0.1% 트윈-20 및 5%의 탈지유(non-fat milk)가 포함된 PBS에서 반응시키고, 1시간 동안 PBS/0.2% BSA로 희석된 1차 항체를 사용하여 탐침하였다. 세척한 후, 멤브레인을 2차 HRP가 부착된 항-래빗 (anti-rabbit) 또는 HRP가 부착된 항-마우스(anti-mouse) 항체 (Amersham, Arlington Heights, IL)로 반응하고, 상기 밴드를 ECL Advance kit (Amersham)로 시각화하였다. 밴드를 Image Gauge software (Fuji Photo Film GMBH, D)를 사용하여 밀도를 분석하였고 로딩 대조군(β-actin) 밴드로 표준화하였다. 모든 실험을 3회로 수행하였다. 에러바는 평균의 표준 오차 값을 의미한다(n=3). 사용된 항체를 상기 표 2에 나타내었다.
실시예 18. 배아체 분화(Embryoid body differentiation)
hESC 분화의 잠재성을 측정하기 위하여 인간 배아체(hEBs)를 비-조직 배양 처리 페트리 디쉬(non-tissue culture treated Petri dishes)를 사용하여 부유액이 있는 hEB 배지(10% 혈청 대체제를 포함하는 DMEM/F12)에서 배양하였다. 부유액에서의 성장 5일 후, 배아체를 젤라틴-코팅 플레이트로 옮겨서 hEB 배지에서 배양하였다. 상기와 같은 조건하에서 플레이트의 바닥에 부착된 세포를 필요에 따라 배지를 교환하면서 추가로 15일 동안 분화되도록 방치하였다.
실시예 19. 리프로그래밍 전사인자 프로모터 메틸화 분석
인간 배아줄기세포와 유전자 이입 레트로바이러스를 이용하여 확립된 유도만능줄기세포의 특성을 검증하기 위하여, 인간 배아줄기세포 특이 전사인자인 Oct3/4, Nanog 프로모터 메틸화 상태를 분석하였다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여 인간 배아줄기세포 배지에서 6일간 배양한 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 DNA 추출 키트(Qiagen Genomic DNA purification kit)를 이용하여 추출하였다. Bisulfite 시퀀싱을 3단계로 수행하였다. 1 단계는 아황산수소나트륨(sodium bisulfite)을 이용하여 DNA를 변형시키는 과정이고, 2 단계는 분석하고자 하는 유전자 부위(보통 프로모터 부위)를 PCR로 증폭하는 과정이며, 3 단계는 PCR 산물을 시퀀싱하여 DNA 메틸화 정도를 분석하는 과정이다. 아황산수소나트륨을 이용한 DNA 변형 과정은 상품화된 키트 EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)를 이용하였으며, DNA를 bisulfite로 처리를 할 경우 메틸화되어 있는 시토신은 변하지 않는 반면, 비메틸화되어 있는 시토신은 우라실로 전환된다. 따라서, 시토신과 우라실 염기서열에 특이한 프라이머를 이용하여 각각 PCR로 증폭시킬 경우 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 구분할 수 있게 된다. 사용한 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.
표 4
Gene Primer (Forward) Primer (Reverse) Accession No.
For bisulfate sequencing
bi Oct4-1 ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGT(서열번호 55) CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCC (서열번호 56) NM_002701
bi Oct4-2 GGATGTTATTAAGATGAAGATAGTTGG(서열번호 57) CCTAAACTCCCCTTCAAAATCTATT (서열번호 58) NM_002701
bi Nanog TGGTTAGGTTGGTTTTAAATTTTTG(서열번호 59) AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA (서열번호 60) NM_024865
PCR 반응 혼합액은 bisulfite로 처리한 DNA 1 ㎍, dNTP 0.25 mM/ℓ, MgCl2 1.5 mM/ℓ, 프라이머 50 pM, 1×PCR 버퍼, Taq 폴리머라제(Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2.5 유닛으로서, 최종 20 ㎕가 되게 하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분 시행 후 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 과정을 40주기 시행하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응 생산물을 1.5% 아가로스 젤에서 확인하였으며, 젤 용리 후 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 메틸화 및 비-메틸화 염기서열은 M13 프라이머쌍을 사용하여 시퀀싱하여 분석하였다.
실시예 20: 니코틴아마이드에 의한 인간 유도만능줄기세포의 특성 분석
20-1. 인간 배아줄기세포 마커 발현 확인
니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 줄기세포 특성을 AP 염색 및 면역염색으로 분석하였다. 세개의 세포주 (Nam-iPS1, Nam-iPS2 및 Nam-iPS3)를 확인하였다. 그 결과, Nam-iPS 세포주는 형태적으로나 인간 배아줄기세포 마커의 염색(AP) 및 면역염색(OCT4, NANOG, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81)으로는 구별이 되지 않을 만큼 흡사하였다(도 21). 또한, 표 1의 프라이머를 이용하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행함으로써 Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4 mRNA 발현을 확인한 결과, Nam-iPS 세포주는 Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4 를 total 및 endogenous level에서 인간 배아줄기세포만큼 발현하고 있었으며, 레트로바이러스를 통해 도입된 각 전이유전자의 silencing이 충분이 완료되었음을 확인하였다 (도 22).
20-2 니코틴아마이드에 의한 유도만능줄기세포의 genomic integration 확인
Nam-iPS1, Nam-iPS2 및 Nam-iPS3의 genomic integration을 확인하였다. 지놈 DNA를 DNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 추출하였고, 각 300 ng의 지놈 DNA와 전이유전자만을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 (표 1)를 이용하여 각각의 PCR 증폭반응을 수행하였다. 그 결과, Nam-iPS 세포주는 각각 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 integration 되어 있음을 확인하였다 (도 23). 이때, 인간 배아줄기세포주(H9, hES)와 인간 섬유아체세포주(CRL2097, hFF)를 대조군으로 사용하였다.
20-3. 니코틴아마이드에 의한 유도만능줄기세포의 메틸화 분석
상기 실시예 19의 방법에 따라, Nam-iPS 세포주의 줄기세포 마커 Oct4및 Nanog 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 정도를 bisulfite 시퀀싱 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, Nam-iPS 유도만능세포주는 인간 배아줄기세포주(H9)와 유사한 탈메틸화된 패턴을 보여주었으나, 모세포인 hFFs는 여전히 메틸화가 유지되고 있었다(도 24).
20-4. 니코틴아마이드에 의한 유도만능줄기세포의 유전자 프로파일 분석
니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS), H9 인간 배아줄기세포(hES) 및 인간 섬유아체세포주(hFF)의 유전자 발현 패턴을 조사하기 위해, 상기 실시예 3에서 기술한 방법으로 제조한 각각의 시료를 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 유전자 발현의 변화를 배수 변화 및 2-D 계층 군집화 (2-dimensional hierarchical clustering)를 기반으로 분석하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 계층적 시료 트리 (hierarchical sample tree)는 본 발명자들이 예측한 바와 같이, hES와 Nam-iPS간의 연관성은 높았으며, 반대로 hFF와 Nam-iPS간의 연관성은 상대적으로 낮았다. 이러한 결과는 인간 섬유아체세포로부터 니코틴아마이드를 이용하여 유도만능줄기세포로 역분화가 되면 인간 배아줄기세포와 유사하게 유전자 발현이 조절된다는 것을 시사하는 결과이다. 또한, Nam-iPS, hES 및 hFF 간의 유전자 발현 프로파일을 비교한 Scatter plot을 비교 분석한 결과, hES와 Nam-iPS 사이에는 줄기세포 마커 유전자인 OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, NANOG, LIN28 및 REX1의 발현 양상이 유사하게 유지되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 25).
20-5. 니코틴아마이드에 의한 유도만능줄기세포의 전분화능 확인
니코틴아마이드에 첨가에 의해 인간 섬유아체세포로부터 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)가 줄기세포의 특성인 분화 잠재력을 보유하고 있는지 확인하기 위하여, 각 유도만능줄기세포주로부터 유래된 배아체의 분화능력을 조사하였다. 부유배양한 후, 분화 조건하에서 10일간 젤라틴-코팅된 플레이트에 배아체를 재-부착시킨 후, 삼배엽 분화된 세포에서 특이적으로 발현되는 마커 단백질의 발현을 RT-PCR 및 면역화학염색 방법으로 확인하였다. 표 1의 프라이머를 사용한 RT-PCR을 통해 각 삼배엽 특이적 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 외배엽(NCAM, PAX6, VIM, OTX1), 중배엽(cTnT, IGF2, TBX6, RUNX2) 및 내배엽(AMYLASE, HAND1, PECAM, HGF) 특이적 유전자가 모두 발현되고 있음을 확인하였다(도 26). 또한, 도 27에 나타난 바와 같이 면역세포화학 염색법을 통해 Tuj1(외배엽), Nestin(외배엽), desmin(중배엽), α-SMA(α-smooth muscle actin, 중배엽), Sox17(내배엽) 및 FoxA2(내배엽)에 양성인 세포를 검출하였다 (도 27). 이러한 결과는 니코틴아마이드에 첨가에 의해 유도된 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)가 삼배엽으로 분화할 수 있는 잠재력을 보유하고 있으며, 전분화능이 보존되고 있음을 나타낸다.
또한, 니코틴아마이드에 첨가에 의한 인간 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)의 인 비보에서의 전분화능을 확인하기 위하여, Nam-iPS 유도만능줄기세포주를 면역결핍 (SCID) 생쥐의 dorsal flask에 피하주사하였다. 약 12주 후에 테라토마를 확인할 수 있었으며, Hematoxylin/eosin 염색을 통해 테라토마 내의 neural rosette(외배엽), neuronal epithelium(외배엽), adipocyte(중배엽), smooth muscle(중배엽), bone(중배엽), cartilage(중배엽), myxoid tissue(중배엽) 및 gut-like epithelium(내배엽)을 관찰하였다(도 28). 이는 니코틴아마이드에 첨가에 의한 인간 유도만능줄기세포주(Nam-iPS)가 인 비트로 및 인 비보에서 삼배엽으로 분화할 수 있는 능력을 가짐을 보여준다.
실시예 21: low-density 클로닝 효과 측정
니코틴아마이드에 의한 low-density에서의 인간 다능성 줄기세포의 생존 효과를 확인하기 위해서 인간 다능성 줄기세포를 TrypLE 시약(Invitrogen)으로 3분 처리 후 파이펫팅을 통해서 단일 세포로 dissociation하고, 마트리겔이 코팅된 96-웰 플레이트에 한 웰당 500개의 세포를 접종하였다. 5일 배양 후, 인간 다능성 줄기세포는 콜로니가 형성되기 시작하였고, 이를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정 후 AP 염색을 수행하거나, 세포사멸 레벨을 측정하였다.
실시예 22: 니코틴아마이드에 의한 다능성 줄기세포의 미분화 유지 효과
니코틴아마이드에 의한 다능성 줄기세포의 미분화 유지 효과를 검증하기 위해서, 본 발명자는 MEF-CM 또는 UM에서 영양세포 없이(feeder-free) 마트리겔에서 인간 배아줄기세포와 인간유도만능줄기세포를 배양하는 과정에서 니코틴아마이드를 포함한 다양한 NAD precursor를 첨가한 후, 줄기세포에 미치는 효과를 형태학적인 변화 및 인간 배아줄기세포 특이적 마커인 AP 발현 양상을 확인함으로써 검증하였다. 6일 동안 UM에서 배양된 인간 배아줄기세포는 미분화 상태의 세포모양을 유지하지 못했고 AP의 발현이 하향 조절됨을 확인함으로써 배양된 인간 배아줄기세포가 분화 초기 상태에 있음을 확인하였다(도 29). 특히, 다른 NAD precursor를 첨가한 경우에 비해, 니코틴아마이드 (1 mM)가 첨가된 UM에서 배양된 인간 배아줄기세포는 미분화된 인간 배아줄기세포 형태를 나타내며, 특히 인간 배아줄기세포의 콜로니의 크기가 증가되어 전체적으로 AP-양성(AP+) 세포수가 증가되어 있음을 확인하였다(도 29).
또한, 니코틴아마이드의 농도에 따른 효과를 확인하기 위해 다양한 농도의 니코틴아마이드를 UM에 첨가하여 다능성 줄기세포인 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 미분화 유지 정도를 확인하였다. 0.1-1 mM의 니코틴아마이드가 추가된 UM에서 배양된 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포는 전형적인 미분화 인간 배아줄기세포의 형태를 보존하고 있으며, 인간 배아줄기세포 특이 마커인 AP의 양성 발현을 나타냄을 확인하였다 (도 29). 특히 0.1 mM Nam을 첨가한 경우, 가장 효과적으로 미분화 유지됨 확인 하였으며, CM에서 배양된 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포와 거의 유사한 상태로 미분화 인간 배아줄기세포를 유지함을 확인하였다. 하지만, 저농도 (<0.01 mM) 혹은 고농도 (>5 mM)의 니코틴아마이드의 첨가는 미분화 상태의 다능성 줄기세포를 유지할 수 없음을 확인하였다 (도 30).
다능성 줄기세포인 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 미분화 유지에 효과적인 니코틴아마이드를 다양한 조건에서 그 효과를 검증하였다. 먼저, 영양 세포가 있는 경우 (with feeders), 0.1 mM에서 가장 AP-양성 세포수가 증가됨을 확인하였다 (도 31). 영양세포유래인자 및 동물혈청사용을 배제하고, 배지성분이 알려진 배양액 (CDM)을 이용한 배양 조건을 확보하기 위해, 영양세포를 사용하지 않고 (without feeders), CDM인 mTeSR1에 다양한 농도의 니코틴아마이드를 첨가하여 그 효과를 확인하였다. 그 결과, 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가하면 다양한 인간 배아줄기세포주 (H1 및 H9) 및 인간 유도만능줄기세포주 (hiPS)의 미분화 유지에 효과적임을 확인할 수 있었다 (도 31). 이러한 결과는 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포를 포함하는 다양한 전분화능 세포 배양 및 유지에 니코틴아마이드가 미분화 유지를 위한 배지 첨가물로써 효과가 있음을 시사하는 것이다.
실시예 23: 니코틴아마이드에 의한 다능성 줄기세포의 세포 증식 촉진 및 미토콘드리아 기능 향상 확인
니코틴아마이드에 의한 다능성 줄기세포의 세포 증식 효과를 검증하기 위해 BrdU incorporation 실험을 수행하였다. CDM인 mTeSR1에 다양한 농도의 니코틴아마이드를 첨가하여 그 효과를 확인하였다. mTeSR1에서 배양된 인간 배아줄기세포에 비해 니코틴아마이드 0.1 mM (1.6배; 도 32), 1 mM (1.2배; 도 32) 농도로 첨가한 경우에 BrdU incorporation이 현저히 증가되었다.
또한, 본 발명자들은 미토콘드리아의 막전위(ΔΨm)를 측정하였다. 인간 배아줄기세포 유지 배양 시, mTeSR1에 다양한 농도의 니코틴아마이드를 첨가한 후, JC-1 염색법을 통해서 인간 배아줄기세포의 미토콘드리아의 막전위를 측정하였다. JC-1 염색 후 활성화된 미토콘드리아는 적색으로 염색되고, 비활성화된 미토콘드리아는 녹색으로 염색되는데, 적색으로 염색된 미토콘드리아의 수/녹색으로 염색된 미토콘드리아의 수의 비율을 측정함으로써 그 값이 높을수록 활성화된 미토콘드리아가 증가되어 있음을 의미한다. 니코틴아마이드 0.1 mM을 처리한 경우 활성화된 미토콘드리아의 수가 유의성 있게 증가함을 확인하였다 (도 33).
실시예 24: 니코틴아마이드에 의한 역분화 유도 효율 증가 확인
니코틴아마이드에 의한 인간 섬유아체세포의 리프로그래밍 효율의 변화를 확인하기 위하여, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 역분화 인자 발현 레트로바이러스를 1 MOI로 형질도입하였다. 니코틴아마이드와 다른 NAD precursor를 첨가함에 따른 역분화 유도 효율을 확인하였다. 그 결과, 다른 NAD precursor를 첨가한 경우 보다, 니코틴아마이드를 첨가했을 때, 약 17 배 역분화 유도 효율이 증가함을 AP-양성 콜로니 수의 증가로 확인할 수 있었다 (도 4A). 이러한 니코틴아마이드에 의한 역분화 유도 효율은 니코틴아마이드의 농도에 따라 다르게 증가함을 알 수 있었다. 처리하지 않은 대조군에 비해, 각 13배 (0.1 mM), 28배 (1 mM), 16배 (10 mM), 2배 (20 mM) 역분화 유도 효율이 증가함을 AP+ 콜로니 수의 증가로 확인할 수 있었다 (도 4B).
니코틴아마이드를 처리하는 시기 및 기간에 따른 역분화 유도 효율의 변화를 확인한 결과, 니코틴아마이드를 바이러스 감염 직후 초기에 처리하는 경우 가장 효과적으로 역분화 유도 효율을 증진 시키며, 이후에도 시간에 의존적으로 역분화 효율을 추가로 증진하고 있음을 검증하였다 (도 5).
실시예 25: 니코틴아마이드의 hiPSCs 생성 속도 (Reprogramming kinetics) 촉진 효과
니코틴아마이드는 hiPSCs 유도 효율을 증가시킬 뿐만 아니라 생성 속도 (Reprogramming kinetics) 또한 향상시킴을 확인하였다. 니코틴아마이드 처리시 배양 5일째부터 (D5) 처리하지 않은 군에 비해, 줄기세포마커 Nanog와 Tra-1-60의 발현이 각각 3배, 8배 이상 증가하였다 (도 6). 줄기세포마커 Nanog와 무한증식 조절인자 TERT의 mRNA 발현 역시 니코틴아마이드 처리에 의해 7일부터 급격히 증가하였다 (도 7). 세포가 밀집되면서 명확한 경계를 가지는 hiPSCs 콜로니가 생성되는데까지 일반적으로 3 주 이상의 시간이 소요되는 반면, 니코틴아마이드 처리 시에는 그 기간이 2주 이내로 현저히 감소됨을 확인하였다 (도 8).
실시예 26: 니코틴아마이드의 세포증식 촉진 효과 확인
역분화인자 OSKM도입에 따른 세포 증식 억제 현상은 이미 알려져 있다. 본 발명자는 역분화인자의 도입 유무와 관계없이 니코틴아마이드가 세포의 증식을 촉진함을 확인하였다. 0.1, 1, 10 mM 농도 의존적으로 니코틴아마이드 처리시 살아있는 건강한 세포의 수가 증가함을 19일, 26일째에 확인하였고 (도 10), 특히 역분화 유도시에는 0.1-1 mM 니코틴아마이드 처리시 BrdU가 도입된, 실제 분열하고 있는 세포의 수가 현저히 증가함을 역분화 유도 19일째에 확인하였다 (도 11). 또한, 1 mM 니코틴아마이드 처리에 의해 역분화 유도 12일째에 증식하는 세포의 비율이 증가함을 세포를 고정하지 않고 살아있는 상태 그대로 생세포 이미징 (live cell imaging)을 통하여 확인하였다 (도 12).
실시예 27: 니코틴아마이드의 세포노화 억제 효과 확인
역분화인자 OSKM도입에 의하여 세포노화 연관 베타 갈락토시데이즈에 염색되는 세포의 비율이 19일째 18.1%, 26일째 35.2%로 증가하였고, 1 mM 니코틴아마이드 처리한 경우에는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 88.1 ± 1.4% 및 76.9 ± 2.5%씩 감소하였다 (도 13A). 10 mM 니코틴아마이드를 처리한 경우에도 또한 대조군 대비 19일째 76.1 ± 1.4%, 21일째 30.8 ± 9.0%씩 노화된 세포 수를 감소시킴을 확인하였다 (도 13A). 세포노화와 연관된 DNA 손상 역시 1 mM 니코틴아마이드 처리에 의해 대조군 대비 83.0 ± 0.5% 감소되었다 (도 13B).
실시예 28: 니코틴아마이드의 산화스트레스 억제 효과 확인
산화스트레스에 의한 세포노화 현상은 기존에 보고되어 있으며, 본 발명자는 역분화인자 OSKM도입에 의하여 역분화 유도 19일째에 활성산소종 형성이 증가하며 (도 14), 산화스트레스에 의한 단백질 손상이 증가됨을 확인하였다 (도 15). 1 mM 니코틴아마이드 처리에 의해 활성산소종 형성이 억제될 뿐만 아니라, 손상된 단백질의 양도 감소함을 확인하였다. 또한, 활성산소종이 증가하고 산화스트레스에 의해 단백질이 손상되는 역분화 조건에서는 미토콘드리아의 막전위가 유지되지 못하는 반면, 1 mM 니코틴아마이드 처리시에는 막전위가 유지됨을 확인하였다 (도 16).
실시예 29: 니코틴아마이드의 노화 인자 p53 신호전달 억제 효과 확인
노화 연관 신호전달인자인 p53, p21, p16의 mRNA 및 단백질 발현이 1 mM 니코틴아마이드 처리에 의해 현저히 감소함을 역분화 유도 과정에서 면역염색 (도 17), 웨스턴 블랏 (도 18, 도 20), 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) (도 19) 방법 등을 이용하여 확인하였다.
실시예 30: 니코틴아마이드의 미분화 유지용 배양 첨가물로서의 효과 확인
일반적으로 인간 다능성 줄기세포인 H9는 UM 배양조건에서는 분화되지만, 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가하게 되면 분화되지 않고 미분화를 유지할 수 있으며 (도 34A), 또한 single-cell dissociation 후 low-density로 배양했을 때에도 인간 다능성 줄기세포인 H9 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능줄기세포의 생존 및 자가 재생능력을 유의성 있게 증가시킴을 AP 염색 및 apoptosis 분석을 통해서 확인하였다 (도 34B). 또한 UM과 같은 분화 배양조건에서도 0.1 mM 니코틴아마이드를 첨가를 통해서 10 계대 이상 미분화 상태로 장기 배양이 가능함을 TRA-1-60 염색을 통해 확인하였고 (도 35), 이때 장기 계대 배양 이후에도 정상 핵형을 관찰 할 수 있었다 (도 36). 이러한 결과는 니코틴아마이드가 세포 및 분자 기작을 조절함으로써 인간 다능성 줄기세포의 미분화 유지 배양 조건을 향상시킬 수 있음을 제시할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 니코틴아마이드를 포함하는, 분화된 세포에서 다능성 줄기세포로의 역분화 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분화된 세포는 체세포 또는 전구세포인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 배양 배지인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물 내에 니코틴아마이드의 농도는 0.01 이상 내지 20 mM 이하인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 역분화 유도인자를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 역분화 유도인자는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자인 것인 조성물.
  7. 분화된 세포에서 역분화된 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 분화된 세포에 역분화 유도인자를 전달하는 단계; 및
    (b) 분화된 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 분화된 세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 분화된 세포에서 다능성 줄기세포로 역분화는, 분화된 세포 대비 역분화된 세포에서 세포성장 및 증식이 증진되거나, 세포사멸이 억제되거나, 미토콘드리아 활성이 증진되거나, 노화 억제되거나, 산화 스트레스 감소되거나, p53 신호전달이 억제되거나, 역분화 유도 시간이 단축되거나, 역분화 유도 효율이 증진되는 것인, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계와 (b) 단계는 동시, 순차적 또는 역순으로 수행되는 것인 방법.
  12. 제7항의 방법에 의하여 제조된 역분화된 다능성 줄기세포를 니코틴아마이드를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 역분화된 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 배양하는 방법.
  13. 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포의 미토콘드리아 기능 유지 또는 향상용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 미토콘드리아 기능은 막전위 활성으로 확인 가능한 것인, 조성물.
  15. 니코틴아마이드를 포함하는, 다능성 줄기세포 미분화 상태 유지용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 배양 배지인 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물 내에 니코틴아마이드의 농도는 0.01 mM 이상 내지 20 mM 이하인 조성물.
  18. 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지되도록 배양하는 방법에 있어서, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 동물 혈청 및 영양세포를 이용하거나 또는 이용하지 않는 상태로 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 다능성 줄기세포를 미분화 상태로 유지되도록 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용하여 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양물을 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 배양은 다수의 연속 계대 배양인 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
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