ES2234144T3

ES2234144T3 - Analogos de peptidos inhibidores de la hepatitis c.

Info

Publication number: ES2234144T3
Application number: ES98939997T
Authority: ES
Inventors: Montse Llinas-Brunet; Murray Douglas Bailey; Teddy Halmos; Marc-Andre Poupart; Youla Tsantrizos
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1997-08-11
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-08-10
Also published as: CA2294562A1; PT1012180E; US6143715A; AU757072B2; AU8846698A; EP1012180B1; WO1999007734A2; WO1999007734A3; ATE283865T1; JP2001512744A; IL134233A0; EP1012180A2; DE69827956D1; JP4452401B2; HUP0100100A3; NZ503263A; HUP0100100A2; DE69827956T2; CA2294562C

Abstract

Un compuesto de **fórmula** en la que B es un derivado de acilo de fórmula R11-C(O)- en que R11 es alquilo C1-10 opcionalmente sustituido con carboxilo; o R11 es arilo C6 o C10 o arilalquilo C7-16 opcionalmente sustituido con un alquilo C1-6; R6 es la cadena lateral de Asp o Glu; R5 es la cadena lateral de D-Asp, D-Val o D-Glu; Y es H o alquilo C1-6; R4 es alquilo C1-10; cicloalquilo C3-10; R3 es alquilo C1-10; cicloalquilo C3-10.

Description

Análogos de péptidos inhibidores de la hepatitis C.

Campo del invento

El presente invento se refiere a compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de una infección por el virus de la hepatitis C (HCV). En particular, el presente invento proporciona nuevos péptidos y sus análogos, composiciones farmacéuticas que contienen dichos péptidos, y métodos para usar dichos péptidos en el tratamiento de una infección por HCV.

Antecedentes del invento

El virus de la hepatitis C (HCV) es el agente etiológico principal de la hepatitis no A no B posterior a una transfusión y adquirida en comunidades por todo el mundo. Se estima que más de 100 millones de personas por todo el mundo son infectadas por el virus. Un alto porcentaje de los portadores resultan infectados crónicamente y muchos progresan hasta una enfermedad crónica hepática, la denominada hepatitis C crónica. Este grupo se encuentra a su vez en alto riesgo de con-traer una grave enfermedad hepática tal como la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular y la enfermedad hepática terminal que conduce a la muerte.

El mecanismo mediante el cual el HCV establece la persistencia vírica y causa una alta tasa de enfermedades hepáticas crónicas, no ha sido explicado todavía a fondo. No se conoce cómo el HCV interactúa con el sistema inmunitario de un organismo hospedante y lo evade. Además, los papeles de las respuestas inmunitarias celulares y humorales en la protección frente a una infección y una enfermedad de HCV han de ser todavía demostrados. Se ha informado acerca de inmunoglobulinas adecuadas para la profilaxis de la hepatitis vírica asociada con una transfusión. Sin embargo, el Centro de Control de Enfermedades no recomienda actualmente las inmunoglobulinas para esta finalidad.

La falta de una respuesta inmunitaria protectora eficaz está obstaculizando el desarrollo de una vacuna o de adecuadas medidas de profilaxis posteriores a la exposición, de manera tal que, a corto plazo, las esperanzas están firmemente puestas en las intervenciones antivíricas.

Se han realizado diversos estudios clínicos con la meta de identificar agentes farmacéuticos que sean capaces de tratar eficazmente una infección por HCV en pacientes afligidos con una hepatitis C crónica. Estos estudios han implicado el uso del interferón-alfa, a solas y en combinación con otros agentes antivíricos. Dichos estudios han demostrado que un número sustancial de los participantes en ellos no responden a estas terapias, y entre los que sí responden favorablemente, se encontró que una gran proporción de ellos recaen después de la terminación del tratamiento.

Hasta una época reciente, el interferón (IFN) constituía la única terapia disponible con beneficio demostrado que había sido aprobada a escala clínica para pacientes con hepatitis C crónica. Sin embargo, la tasa de respuestas prolongadas es baja, y un tratamiento con interferón induce también graves efectos colaterales (a saber, retinopatía, tiroiditis, pancreatitis aguda, depresión) que disminuyen la calidad de vida de los pacientes tratados. Recientemente, el interferón en combinación con ribavirina ha sido aprobado para pacientes que no responden al IFN a solas. Sin embargo, los efectos colaterales causados por el IFN no son aliviados con esta terapia combinada.

Por lo tanto, existe una necesidad del desarrollo de eficaces agentes antivíricos para el tratamiento de infecciones causadas por el HCV, que solventen las limitaciones de las terapias farmacéuticas existentes.

El HCV es un virus de ARN de cadena positiva con envoltura de la familia de los Flaviviridae. El genoma del ARN del HCV de una única cadena presenta una longitud de aproximadamente 9.500 nucleótidos y tiene un único cuadro de lectura abierto (ORF, de open reading frame) que codifica una única proteína grande de aproximadamente 3.000 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína es cortada en sitios múltiples por proteasas celulares y víricas para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS, non-structural). En el caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) es efectuada por dos proteasas víricas. La primera de ellas, todavía mal caracterizada, corta en la unión entre NS2 y NS3; la segunda de ellas es una proteasa de serina contenida dentro de la región terminal de N de la NS3 (en lo sucesivo citada como proteasa de NS3) y media en todos los cortes subsiguientes realizados secuencia abajo de la NS3, tanto en cis, en el sitio de corte de NS3-NS4A, como en trans, para restantes sitios de NS4A-NS4B, NSAB-NS5A y NS5A-NS5B. La proteína NS4A manifiesta servir para funciones múltiples, actuando como un cofactor para la proteasa de NS3 y ayudando posiblemente a la localización en membranas de la NS3 y otros componentes de replicasas víricas. La formación de un complejo de la proteína NS3 con NS4 parece ser necesaria para los episodios de tratamiento, intensificando la eficiencia proteolítica en todos los sitios. La proteína NS3 exhibe también actividades de nucleósido-trifosfatasas y de ARN-helicasas. La NS5B es una polimerasa de ARN dependiente de ARN, que está implicada en la replicación del HCV.

Una estrategia general para el desarrollo de agentes antivíricos consiste en desactivar las enzimas codificadas por virus que son esenciales para la replicación de los virus. En este contexto, la solicitud de patente WO 97/06804 describe al enantiómero (-) del compuesto análogo a nucleósido citosina-1,3-oxatiolano (también conocido como 3TC) como activo contra el HCV. Este compuesto, aunque se ha informado como seguro en pruebas clínicas anteriores contra los HIV y HBV, todavía ha de probarse a escala clínica que es activo contra el HCV y su mecanismo de acción contra el virus ha de ser informado todavía.

Intensos esfuerzos para descubrir compuestos que inhiban a la proteasa de NS3 o a la helicasa de ARN del HCV han conducido a las siguientes descripciones:

\bullet: La patente de los EE.UU. 5.633.388 describe carboxamidas sustituidas con radicales heterocíclicos y compuestos análogos a ellas como siendo activas contra el HCV. Estos compuestos están dirigidos contra la actividad de helicasa que presenta la proteína NS3 del virus, pero todavía no se ha informado sobre ensayos clínicos.

\bullet: Se ha informado por Chu y colaboradores (Tet. Lett., (1996), 7.229-7.232) acerca de una fenantreno-quinona como poseedora de actividad contra la proteasa NS3 del HCV in vitro. No se ha informado de ningún desarrollo ulterior sobre este compuesto.

\bullet: Un artículo presentado en la Novena Conferencia Internacional sobre Investigación Antivírica, en Urabandai, Fukyshima, Japón (1996) (Antiviral Research, 30, 1, 1996; A23 (resumen 19)) informa de que ciertos derivados de tiazolidina son inhibidores de la proteasa del HCV.

\bullet: Mori, Biochem. Biophys. Res. Common., vol. 231, nº 3, 1997, páginas 738-742 describe la inhibición de la proteasa NS3 mediante el péptido de escisión GEAGDDIVPC en el extremo terminal de N.

Varios estudios han informado sobre compuestos inhibidores de otras proteasas de serina, tales como la elastasa de leucocitos humanos. Una familia de estos compuestos es informada en el documento de patente PCT WO 95/33764 (Hoechst Marion Roussel, 1995). Los péptidos descritos en esa solicitud son compuestos análogos a péptidos morfolinilcarbonil-benzoil-péptidos que son estructuralmente diferentes de los péptidos del presente invento.

\bullet: El documento WO 98/17679 de Vertex Pharmaceuticals Inc. describe inhibidores de una proteasa de serina, particularmente la proteasa de NS3 del virus de la hepatitis C. Estos inhibidores son compuestos análogos a péptidos basados en el substrato natural NS5A/5B que contiene aldehídos en el extremo terminal de C, \alpha-cetoamidas y cetonas fluoradas.

\bullet: Hoffman LaRoche ha informado también acerca de hexapéptidos que son inhibidores de proteinasas útiles como agentes antivíricos para el tratamiento de una infección por HCV. Estos péptidos contienen un aldehído y un ácido borónico en el extremo terminal de C.

\bullet: Steinkühler y colaboradores, e Ingallinella y colaboradores han publicado acerca de la inhibición del producto NS4A-4B (Biochemistry (1998), 37, 8.899-8.905 y 8.906-8.914). Estos péptidos y compuestos análogos a péptidos fueron publicados después de la fecha de prioridad de la presente solicitud.

Una ventaja del presente invento consiste en que proporciona péptidos que son inhibidores de la proteasa de NS3 del virus de la hepatitis C.

Sumario del invento

Los autores del presente invento hemos investigado sobre péptidos que son potencialmente inhibidores de la proteasa de NS3. El descubrimiento de que el producto de corte en el extremo terminal de N (Ac-D-D-I-V-P-C-OH) de un compuesto análogo a un substrato natural de la proteasa de NS3 era inhibidor nos condujo a los compuestos análogos a péptidos del presente invento.

Se incluyen en el alcance del invento los compuestos de fórmula (I):

1

en la que B es un derivado de acilo de fórmula R_{11}-C(O)- en que R_{11} es alquilo C_{1-10} opcionalmente sustituido con carboxilo; o R_{11} es arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} opcionalmente sustituido con un alquilo C_{1-6};

R_{6} es la cadena lateral de Asp o Glu;

R_{5} es la cadena lateral de D-Asp, D-Val o D-Glu;

Y es H o alquilo C_{1-6};

R_{4} es alquilo C_{1-10}; cicloalquilo C_{3-10};

R_{3} es alquilo C_{1-10}; cicloalquilo C_{3-10};

W es un grupo de fórmula II':

2

en la que X es CH o N; y

R_{2'} es la cadena lateral de prolina y está sustituido con R_{17} en la posición 4 con la estereoquímica mostrada en la fórmula III':

3

en donde R_{17} es arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo opcionalmente dicho arilo o arilalquilo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; estando dicho arilo o arilalquilo opcionalmente condensado con un segundo anillo de 5, 6 ó 7 miembros para formar un sistema cíclico o un heterociclo, estando dicho anillo opcionalmente sustituido con NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo opcionalmente dicho segundo anillo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; R_{17} es OR_{12}, en donde R_{12}, es arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} estando dicho primer arilo o arilalquilo opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-7}, NH_{2}, OH, SH, halo, alcoxi C_{1-6}, carboxilo, carboxi-alquilo (inferior) o un segundo arilo o arilalquilo;

conteniendo opcionalmente dichos primero y segundo arilos o aralquilos al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N;

Q es un grupo de la fórmula:

4

en donde Z es CH o N;

X es O o S;

R_{1} es H, alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{1-6} ambos opcionalmente sustituidos con tio o halo;

y

cuando Z es CH, entonces R_{13} es H; CF_{3}; CF_{2}CF_{3}; CH_{2}-R_{14}; CH(F)-R_{14}, CF_{2}-R_{14}; NR_{14}R_{14'}; S-R_{14}; o CO-NH-R_{14} en donde

R_{14} y R_{14'} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{3-10} cíclico o alquilo C_{1-10} acíclico, o alquenilo C_{3-10} cíclico o alquenilo C_{2-10} acíclico, estando dicho alquilo o alquenilo opcionalmente sustituido con NH_{2}, OH, SH, halo o carboxilo; conteniendo opcionalmente dicho alquilo o alquenilo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; o R_{14} y R_{14'} son independientemente arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior), o está sustituido con un cicloalquilo C_{3-7}, arilo C_{6} o C_{10} o heterociclo adicional; conteniendo opcionalmente dicho arilo o aralquilo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; estando dicho alquilo cíclico, alquenilo cíclico, arilo o arilalquilo opcionalmente condensados con un segundo anillo de 5, 6 ó 7 miembros para formar un sistema cíclico o heterociclo, estando dicho segundo anillo opcionalmente sustituido con NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior), o está sustituido con un cicloalquilo C_{3-7}, arilo C_{6} o C_{10} o heterociclo adicional; conteniendo opcionalmente dicho segundo anillo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; o R_{14} y R_{14'} son independientemente alquilo C_{1-4} que, cuando están unidos junto con el N, forman un anillo de 3 a 6 miembros, que está opcionalmente condensado con un cicloalquilo C_{3-7}, arilo C_{6} o C_{10} o heterociclo adicional;

con la condición de que, cuando Z es CH, entonces R_{13} no es un \alpha-aminoácido o un éster del mismo;

cuando Z es N, entonces R_{13} es H; carboxi; alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxi; CH_{2}-R_{14}; CHR_{14}R_{14'}; CH(F)-R_{14}; O-R_{14}; NR_{14}R_{14'} o S-R_{14} en donde R_{14} y R_{14'} son como se definen anteriormente; o

Q es un grupo de fosfonato de la fórmula:

5

en donde R_{15} y R_{16} son independientemente ariloxi C_{6-20}; y R_{1} es como se define anteriormente.

Se incluye dentro del alcance de este invento una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz contra el virus de la hepatitis C de un compuesto de fórmula I, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables, en mezcla con un medio de soporte o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.

Un importante aspecto del invento implica a un método para tratar una infección causada por el virus de la hepatitis C en un mamífero, por administración al mamífero de una cantidad eficaz contra el virus de la hepatitis C del compuesto de fórmula I, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables, o de una composición como antes se ha descrito.

Otro aspecto importante implica a un método para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C, exponiendo a este virus a una cantidad inhibidora de la proteasa de NS3 del virus de la hepatitis C del compuesto de fórmula I, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables, o de una composición como antes se ha descrito.

Todavía otro aspecto implica a un método para tratar una infección causada por el virus de la hepatitis C en un mamífero, por administración a éste de una cantidad eficaz contra el virus de la hepatitis C de una combinación del compuesto de fórmula I, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables, y de un interferón. Una composición farmacéutica que comprende la combinación en mezcla con un medio de soporte o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable se encuentra también dentro del alcance de este invento.

Descripción detallada del invento

Como se usa en el presente contexto, se aplican las siguientes definiciones, a menos que se señale otra cosa distinta:

Con referencia a los casos en los que se use (R) o (S) para designar la configuración de un radical, p.ej. R_{4} del compuesto de fórmula I, la designación se hace en el contexto del compuesto y no en el contexto del radical a solas.

Los aminoácidos naturales, con excepción de la glicina, contienen un átomo de carbono quiral. A menos que se indique específicamente otra cosa distinta, se prefieren los compuestos que contienen aminoácidos naturales con la configuración L. Sin embargo, los solicitantes consideran que, cuando se especifique, algunos aminoácidos de la fórmula I pueden ser de configuración D o L o pueden ser mezclas de isómeros D y L, inclusive las mezclas racémicas.

La designación "P1, P2, P3, etc." como se usa en el presente contexto, se refiere a la posición de los residuos de aminoácidos comenzando desde el extremo terminal de C de los compuestos análogos a péptidos y extendiéndose hacia el extremo terminal de N (es decir, P1 se refiere a la posición 1 desde el extremo terminal de C; P2 es la segunda posición desde el extremo terminal de C, etc.) (véase Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257, 249-264 (1970)).

Las abreviaturas para los \alpha-aminoácidos se exponen en la Tabla A.

TABLA A

6

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Como se usa en el presente contexto, el término "ácido aminobutírico" se refiere a un compuesto de fórmula:

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8

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Como se usa en el presente contexto, el término "alilglicina" se refiere a un compuesto de fórmula:

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9

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Como se usa en el presente contexto, el término "terc.-butilglicina" se refiere a un compuesto de fórmula:

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10

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El término "residuo", haciendo referencia a un aminoácido o derivado de aminoácido, significa un radical derivado del correspondiente \alpha-aminoácido eliminando el hidroxilo del grupo carboxi y un hidrógeno del grupo \alpha-amino. Por ejemplo, los términos Gln, Ala, Gly, Ile, Arg, Asp, Phe, Ser, Leu, Cys, Asn, Sar y Tyr representan a los "residuos" de L-glutamina, L-alanina, glicina, L-isoleucina, L-arginina, L-ácido aspártico, L-fenilalanina, L-serina, L-leucina, L-cisteína, L-asparagina, sarcosina y L-tirosina, respectivamente.

El término "cadena lateral", haciendo referencia a un aminoácido o residuo de aminoácido, significa un grupo unido al átomo de carbono \alpha del \alpha-aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral grupo R para glicina es hidrógeno, para alanina es metilo, para valina es isopropilo. Para los grupos R o cadenas laterales específicos de los \alpha-aminoácidos se hace referencia al texto de A.L. Lehninger sobre bioquímica (véase el capítulo 4).

El término "halo", como se usa en el presente contexto, significa un radical de halógeno seleccionado entre bromo, cloro, fluoro o yodo.

El término "alquilo C_{1-6}" o "alquilo (inferior)", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa radicales alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen hasta seis átomos de carbono e incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metil-etilo, 1-metil-propilo, 2-metil-propilo, 1,1-dimetil-etilo.

Similarmente, los términos "alquilo C_{1-3}", "alquilo C_{1-4}" y "alquilo C_{1-10}" se usan para designar radicales alquilo que contienen hasta tres, cuatro y diez átomos de carbono, respectivamente.

El término "cicloalquilo C_{3-7}", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono, e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclohexilo y cicloheptilo.

El término "(alquilcicloalquilo) C_{4-10}", como se usa en el presente contexto, significa un radical cicloalquilo que contiene de tres a siete átomos de carbono enlazado a un radical alquilo, conteniendo los radicales enlazados hasta diez átomos de carbono; por ejemplo ciclopropilmetilo, ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo, ciclohexiletilo o ciclohep-
tiletilo.

El término "alquenilo C_{2-10}", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un radical alquilo como se ha definido anteriormente que contiene de 2 a 10 átomos de carbono, y contiene además por lo menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo incluye el alilo.

El término "alquileno C_{3-4}", como se usa en el presente contexto, significa un radical alquilo divalente obtenido por la eliminación de dos átomos de hidrógeno a partir de un hidrocarburo alifático de cadena lineal o ramificada, que contiene de tres a cuatro átomos de carbono e incluye, por ejemplo, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}C
(CH_{3})_{2}- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-.

El término "alcoxi C_{1-6}", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa el radical -O-alquilo C_{1-6} en el que el alquilo es como antes se ha definido, que contiene hasta seis átomos de carbono. El alcoxi incluye metoxi, etoxi, propoxi, 1-metil-etoxi, butoxi y 1,1-dimetil-etoxi. Este último radical es conocido corrientemente como terc.-butoxi.

El término "arilo C_{6} o C_{10}", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa o bien un sistema monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o un sistema cíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono.

El término "arilalquilo C_{7-16}", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un radical arilo como antes se ha definido enlazado a través de un grupo alquilo, en que el alquilo es como se ha definido anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. El arilalquilo incluye, por ejemplo, bencilo y butilfenilo.

El término "carboxi-alquilo (inferior)", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un grupo carboxilo (COOH) enlazado a través de un grupo alquilo (inferior) como antes se ha definido e incluye por ejemplo ácido butírico o los grupos:

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11

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El término "cíclico" o "sistema cíclico", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un radical monovalente obtenido por eliminación de un hidrógeno a partir de un hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, que contiene de tres a siete átomos de carbono, a menos que se indique otra cosa distinta, y que opcionalmente contiene uno o más heteroátomos. El término cíclico o sistema cíclico incluye, por ejemplo, ciclopropano, ciclopentano, ciclohexano, ciclohexeno, decalina, tetralina, indeno y naftaleno.

El término "heterociclilo", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un radical monovalente obtenido por eliminación de un hidrógeno a partir de un heterociclo saturado o insaturado de cinco, seis o siete miembros, que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos de heterociclos apropiados incluyen: pirrolidina, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, tiofeno, diazepina, 1H-imidazol, 1-metil-1H-imidazol, isoxazol, tiazol, 2-metil-tiazol, 2-amino-tiazol, piperidina, 1,4-dioxano, 4-morfolina, piridina, 2-metil-piridina, pirimidina, 4-metil-pirimidina y 2,4-dimetil-pirimidina.

El término "sistema heterocíclico", como se usa en el presente contexto, o bien a solas o en combinación con otro radical, significa un heterociclo como antes se ha definido, condensado con uno o más de otros ciclos, ya se trate de un heterociclo o de cualquier otro tipo de ciclo. Ejemplos de sistemas heterocíclicos apropiados incluyen: tiazolo[4,5-b]-piridina, quinolina o indol.

Realizaciones preferidas

Otro grupo preferido adicional de compuestos es el de los representados por la fórmula I en la que B es preferiblemente un derivado de acilo de fórmula R_{11}C(O)-, en que R_{11} es:

alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C_{1-6} o alcoxi C_{1-6};

cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con carboxilo, MeOC(O), EtOC(O) o BnOC(O);

3-carboxi-propionilo (DAD) o 4-carboxi-butirilo (DAE); o

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12

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Más preferiblemente B es acetilo, 3-carboxi-propionilo, 4-carboxi-butirilo, AcOCH_{2}C(O), Me_{3}COC(O),

13

Todavía más preferiblemente, B es acetilo, 3-carboxi-propionilo (DAD), 4-carboxi-butirilo (DAE), AcOCH_{2}C(O),

14

Lo más preferiblemente, B es acetilo o 4-carboxi-butirilo (DAE). Preferiblemente, B es acetilo.

Preferiblemente, R_{6}, cuando está presente, es la cadena lateral de Asp.

Preferiblemente, R_{5} es la cadena lateral de D-Asp, D-Val o D-Glu.

Más preferiblemente, R_{5} es la cadena lateral de D-Glu.

Preferiblemente, Y es H o alquilo C_{1-3}.

Más preferiblemente, Y es Me.

Alternativamente, de modo más preferible Y es H.

Preferiblemente, R_{4} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Val, ciclohexilglicina (Chg), Tbg, Ile o Leu.

Más preferiblemente, R_{4} es la cadena lateral de Chg o Ile.

Lo más preferiblemente, R_{4} es la cadena lateral de Chg.

Preferiblemente, R_{3} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Ile, Chg, Cha, Val o Glu.

Más preferiblemente, R_{3} es la cadena lateral de Val o Chg.

Lo más preferiblemente, R_{3} es la cadena lateral de Val.

Preferiblemente, W es un grupo de fórmula II:

15

en la que R_{2} es alquilo C_{1-8} o cicloalquilo C_{3-6} opcionalmente sustituido con carboxilo; o bencilo. Más preferiblemente, R_{2} es la cadena lateral de Asp, ácido aminobutírico (Abu) o Val.

W es un grupo de fórmula II':

16

en que, preferiblemente, X es CH o N, y

R_{2'} es la cadena lateral de la prolina (como se muestra en negro) sustituida con R_{17} en la posición 4 con la estereoquímica mostrada en la fórmula III':

17

Preferiblemente, R_{17} es Bn; PhCH_{2}CH_{2}; PhCH_{2}CH_{2}CH_{2}; O-Bn; o-tolilmetoxi; m-tolilmetoxi; p-tolilmetoxi; 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; 1-naftalenilmetoxi; 2-naftalenilmetoxi; (4-terc.-butil)metoxi; (3I-Ph)CH_{2}O; (4Br-Ph)O; (2Br-Ph)O; (3Br-Ph)O; (4I-Ph)O; (3Br-Ph)CH_{2}O; (3,5-Br_{2}-Ph)CH_{2}O;

18

19

Todavía más preferiblemente, R_{17} es Bn; PhCH_{2}CH_{2}; PhCH_{2}CH_{2}CH_{2}; O-Bn; 1-naftiloxi; 2-naftiloxi; 1-naftalenilmetoxi; 2-naftalenilmetoxi;

20

Incluso lo más preferiblemente, R_{17} es O-Bn, 1-naftalenilmetoxi ó 2-naftalenilmetoxi.

Preferiblemente Q es:

21

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en que Z es preferiblemente CH o N.

Preferiblemente, cuando Z es CH:

R_{13} es H; CF_{3}; CF_{2}CF_{3}; CH_{2}-R_{14}; C(O)NH-R_{14}, NR_{14}R_{14'} en que R_{14} y R_{14'} son como se han definido anteriormente, con la condición de que R_{13} no ha de ser un \alpha-aminoácido ni uno de sus ésteres. Más preferiblemente, R_{13} es H; NH-R_{14} o C(O)NH-R_{14}. Lo más preferiblemente, R_{13} es H; o C(O)NH-R_{14}. Preferiblemente, R_{14} es fenilo o arilalquilo C_{7-16}. Más preferiblemente, R_{14} es bencilo o CH(Me)Ph.

Alternativamente, cuando Z es N:

R_{13} es preferiblemente fenilo o arilalquilo C_{7-16},

22

Más preferiblemente, R_{13} es naftilo, NH-CH(Me)Ph, NH-CH(Et)Ph,

23

Lo más preferiblemente, R_{13} es NH-CH(Me)Ph, o

24

Alternativamente, Q es de modo preferible un grupo de fosfonato de la fórmula:

25

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en la que R_{15} y R_{16} son independientemente de modo preferible ariloxi C_{6-12}. Más preferiblemente, R_{15} y R_{16} son cada uno fenoxi.

En todos los anteriores casos, R_{1} es preferiblemente alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con halo. Más preferiblemente, R_{1} es alquilo C_{1-5} o alquenilo C_{1-4} opcionalmente sustituido con fluoro. Lo más preferiblemente, R_{1} es etilo, propilo, isopentilo o alilo.

De acuerdo con una realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de este invento pueden comprender adicionalmente un agente antivírico. Ejemplos de agentes antivíricos incluyen ribavirina y amantadina.

De acuerdo con otra realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de este invento pueden comprender adicionalmente otros inhibidores de la proteasa de HCV.

De acuerdo con todavía otra realización alternativa, las composiciones farmacéuticas de este invento pueden comprender adicionalmente un inhibidor de otras dianas en el ciclo de vida del HCV, tales como helicasa, polimerasa o metaloproteasa.

Las composiciones farmacéuticas de este invento se pueden administrar por vía oral, parenteral o a través de un reservorio implantado. Nosotros preferimos la administración por vía oral o la administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas de este invento pueden contener cualesquiera de los soportes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables y no tóxicos. En algunos casos, el pH de la formulación se puede ajustar con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para intensificar la estabilidad del compuesto formulado o de su forma de suministro. El término parenteral incluye, tal como se usa en el presente contexto, técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intracutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarticulares, intrasinoviales, intraesternales, intratecales e intralesionales.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, en la de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con técnicas conocidas en el sector de la tecnología usando apropiados agentes dispersantes o humectantes (tales como, por ejemplo, Tween 80) y agentes suspendedores.

Las composiciones farmacéuticas de este invento se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral, inclusive, pero sin limitarse a, cápsulas, tabletas, así como suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de las tabletas para uso oral, los soportes que se usan corrientemente incluyen lactosa y almidón de maíz. Se añaden también típicamente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para la administración por vía oral en la forma de una cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran por vía oral suspensiones acuosas, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y suspendedores. Si se desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes y/o saboreantes y/o colorantes.

Otros vehículos o soportes apropiados para las formulaciones y composiciones antes señaladas pueden encontrarse en textos farmacéuticos clásicos, p.ej. en la obra "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995).

Unos niveles de dosificación comprendidos entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, con preferencia entre alrededor de 0,5 y alrededor de 75 mg/kg de peso corporal por día de los compuestos inhibidores de proteasas descritos en el presente texto son útiles en una monoterapia para la prevención y el tratamiento de una enfermedad mediada por el HCV. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de este invento se administrarán entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 veces por día o, alternativamente, en forma de una infusión continua. Dicha administración se puede usar como una terapia crónica o aguda. La cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con los materiales de soporte para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del hospedante tratado y del modo particular de administración. Una preparación típica contendrá entre aproximadamente 5% y aproximadamente 95% de compuesto activo (en peso/peso = p/p). Preferiblemente, tales preparaciones contienen entre aproximadamente 20% y aproximadamente 80% del compuesto activo.

Como lo apreciará un profesional experto, se pueden requerir dosis menores o mayores que las citadas anteriormente. Los específicos regímenes de dosificación y de tratamiento para cualquier paciente particular dependerán de una diversidad de factores, inclusive la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento de administración, el régimen de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de la infección, la disposición del paciente para la infección y el criterio del médico que esté realizando el tratamiento. Generalmente, el tratamiento es iniciado con pequeñas dosificaciones sustancialmente menores que la dosis óptima del péptido. Después de ello, la dosificación es aumentada por pequeños incrementos hasta que se alcance el efecto óptimo dentro de las circunstancias. En general, el compuesto se administra de modo sumamente deseable en un nivel de concentraciones que generalmente proporcionará resultados eficaces antivíricamente sin causar ningún efecto colateral perjudicial o deletéreo.

Cuando las composiciones de este invento comprenden una combinación de un compuesto de fórmula I y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deberán estar presentes en unos niveles de dosificación comprendidos entre aproximadamente 10 y 100%, y más preferiblemente entre alrededor de 10 y 80% de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia.

Cuando estos compuestos o sus sales farmacéuticamente aceptables se formulan conjuntamente con un soporte farmacéuticamente aceptable, la composición resultante se puede administrar in vivo a mamíferos, tales como seres humanos, para inhibir a la proteasa de NS3 del HCV o para tratar o prevenir una infección causada por el virus del HCV. Dicho tratamiento se puede conseguir también usando los compuestos de este invento en combinación con agentes que incluyen, pero no se limitan a: agentes moduladores de la inmunidad, tales como interferones \alpha, \beta o \gamma; otros agentes antivíricos tales como ribavirina, amantadina; otros inhibidores de la proteasa de NS3 del HCV; inhibidores de otras dianas en el ciclo de vida del HCV tales como helicasa, polimerasa, metaloproteasa, o la entrada de ribosomas internos; o combinaciones de éstos. Los agentes adicionales se pueden combinar con los compuestos de este invento para crear una única forma de dosificación. Alternativamente, estos agentes adicionales se pueden administrar por separado a un mamífero como parte de una forma de dosificación múltiple.

Correspondientemente, otra realización de este invento proporciona métodos para inhibir la actividad de la proteasa de NS3 del HCV en mamíferos por administración de un compuesto de la fórmula I, en que los sustituyentes son como se han definido anteriormente.

En una realización preferida, estos métodos son útiles para disminuir la actividad de la proteasa de NS3 del HCV en un mamífero. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de este invento como el componente activo, dichos métodos pueden comprender adicionalmente la operación de administrar a dicho mamífero un agente seleccionado entre un agente modulador de la inmunidad, un agente antivírico, un inhibidor de una proteasa del HCV, o un inhibidor de otras dianas en el ciclo de vida del HCV tales como helicasa, polimerasa o metaloproteasa. Tal agente adicional se puede administrar al mamífero antes de, concurrentemente con, o a continuación de la administración de las composiciones de este invento.

En una realización preferida alternativa, estos métodos son útiles para inhibir la replicación de virus en un mamífero. Dichos métodos son útiles para tratar o prevenir una enfermedad causada por el HCV. Si la composición farmacéutica comprende solamente un compuesto de este invento como el componente activo, dichos métodos pueden comprender adicionalmente la operación de administrar a dicho mamífero un agente seleccionado entre un agente modulador de la inmunidad, un agente antivírico, un inhibidor de una proteasa del HCV, o un inhibidor de otras dianas en el ciclo de vida del HCV. Dicho agente adicional se puede administrar al mamífero antes de, concurrentemente con o a continuación de la administración de la composición de acuerdo con este invento.

Los compuestos que se exponen en el presente texto se pueden usar también como reactivos de laboratorio. Los compuestos de este invento se pueden usar para tratar o prevenir una contaminación por virus de materiales y por lo tanto reducir el riesgo de una infección por virus del personal de laboratorio o médico o de los pacientes que entren en contacto con dichos materiales (p.ej. sangre, tejidos, instrumentos quirúrgicos y prendas de vestir quirúrgicas, instrumentos y prendas de vestir de laboratorios y aparatos y materiales para la recogida de sangre).

Procedimiento Síntesis de los fragmentos P6-P2

Los fragmentos P2-P6 de los compuestos del presente invento se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento que se ilustra en el esquema I (en que PG1 es un grupo protector de carboxilo y PG2 es un grupo protector de amino):

Esquema I

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Brevemente, los P2, P3, P4, P5 y P6 se pueden enlazar por técnicas bien conocidas de acoplamiento de péptidos. Los restos P2, P3, P4, P5 y P6 se pueden enlazar conjuntamente en cualquier orden siempre y cuando el compuesto final corresponda a péptidos de fórmula I. Por ejemplo, P6 puede ser enlazado a P5 para dar P5-P6 que está enlazado a P4-P3-P2; o P6 se puede enlazar a P5-P4-P3 y luego enlazar a un P2 protegido apropiadamente en el extremo terminal de C.

Generalmente, los péptidos son alargados desprotegiendo el grupo \alpha-amino del residuo terminal de N y acoplando el grupo carboxilo sin proteger del siguiente aminoácido apropiadamente protegido en N a través de un enlace peptídico usando los métodos que se han descrito. Este proceso de desprotección y acoplamiento se repite hasta que se obtenga la secuencia deseada. Este acoplamiento se puede realizar con los aminoácidos constituyentes de una manera escalonada, tal como se describe en el Esquema I, o por condensación de fragmentos (de dos o más aminoácidos) o una combinación de ambos procedimientos, o mediante una síntesis de péptidos en fase sólida de acuerdo con el método originalmente descrito en la cita de Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2.149-2.154, cuya divulgación se incorpora a la presente por su referencia.

El acoplamiento entre dos aminoácidos, un aminoácido y un péptido, o dos fragmentos peptídicos se puede llevar a cabo usando procedimientos de acoplamiento clásicos tales como el método de la azida, el método de anhídrido mixto de ácido carbónico y un ácido carboxílico (cloroformiato de isobutilo), el método de una carbodiimida (diciclohexil-carbodiimida, diisopropil-carbodiimida, o una carbodiimida soluble en agua), el método de un éster activo (éster p-nitrofenílico, imido-éster N-hidroxi-succínico), el método del reactivo K de Woodward, el método del carbonil-diimidazol, reactivos con fósforo o métodos de oxidación-reducción. Algunos de estos métodos (especialmente el método de la carbodiimida) se pueden mejorar añadiendo 1-hidroxi-benzotriazol. Estas reacciones de acoplamiento se pueden llevar a cabo o bien en fase de solución (fase líquida) o en fase sólida.

Más explícitamente, la operación de acoplamiento implica el acoplamiento deshidrogenante de un carboxilo libre de un reaccionante con el grupo amino libre del otro reaccionante en la presencia de un agente de acoplamiento para formar un enlace de amida engarzador. Descripciones de dichos agentes de acoplamiento se encuentran en libros de texto generales sobre la química de los péptidos, por ejemplo el de M. Bodanszky, "Peptide Chemistry" 2ª edición revisada, editorial Springer, Berlín, Alemania, (1993). Ejemplos de apropiados agentes de acoplamiento son N,N'-diciclohexil-carbodiimida, 1-hidroxi-benzotriazol en la presencia de N,N'-diciclohexil-carbodiimida o N-etil-N'-[(3-dimetilamino)propil]carbodiimida. Un agente de acoplamiento muy práctico y útil es el hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio comercialmente disponible, o bien por sí solo o en la presencia de 1-hidroxi-benzotriazol. Otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio comercialmente disponible. Todavía otro agente de acoplamiento muy práctico y útil es el hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio comercialmente disponible.

La reacción de acoplamiento se realiza en el seno de un disolvente inerte, p.ej. diclorometano, acetonitrilo o dimetil-formamida. Un exceso de una amina terciaria, p.ej. diisopropil-etil-amina, N-metil-morfolina o N-metil-pirrolidina, se añade para mantener la mezcla de reacción a un pH de aproximadamente 8. La temperatura de reacción fluctúa usualmente entre 0ºC y 50ºC y el tiempo de reacción fluctúa entre 15 min y 24 h.

Cuando se emplea un enfoque de síntesis en fase sólida, el ácido carboxílico terminal de C es unido a un soporte insoluble (usualmente poliestireno). Estos soportes insolubles contienen un grupo que reaccionará con el grupo carboxílico para formar un enlace que es estable frente a las condiciones de alargamiento pero que se desdobla con facilidad más adelante. Ejemplos de éstos son: una cloro- o bromo-metil-resina, una hidroxi-metil-resina y una amino-metil-resina. Muchas de estas resinas se encuentran comercialmente disponibles con el deseado aminoácido terminal de C ya incorporado. Además de los señalados anteriormente, otros métodos de síntesis de péptidos están descritos en las citas de Stewart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2ª edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, coordinadores de edición, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", volúmenes 1, 2, 3, 5 y 9, Academic Press, Nueva York, (1980-1987); Bodansky y colaboradores, "The Practice of Peptide Synthesis", editorial Springer, Nueva York (1984), cuyas divulgaciones se incorporan a la presente por su referencia.

Los grupos funcionales de los aminoácidos constituyentes deben generalmente ser protegidos durante las reacciones de acoplamiento para evitar la formación de enlaces indeseados. Los grupos protectores que se pueden usar se enumeran en las citas de Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, Nueva York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", volumen 3, Academic Press, Nueva York (1981), cuyas divulgaciones se incorporan a la presente por su referencia.

El grupo \alpha-carboxilo del residuo terminal de C es protegido usualmente en forma de un éster (PG1) que puede ser desdoblado para dar el ácido carboxílico. Grupos protectores que se pueden usar incluyen: 1) ésteres de alquilo tales como los de metilo, trimetil-silil-etilo y t-butilo, 2) ésteres de arilalquilo tales como los de bencilo y bencilo sustituido, ó 3) ésteres que se pueden desdoblar por tratamiento con una base débil o con medios reductores débiles tales como los ésteres de tricloroetilo y fenacilo.

El grupo \alpha-amino de cada aminoácido que se ha de acoplar a la cadena de péptido en crecimiento debe de ser protegido (PG2). Puede usarse cualquier grupo protector conocido en el sector de la tecnología. Ejemplos de dichos grupos incluyen:

1) grupos acilo tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo y p-toluenosulfonilo;

2) grupos de carbamatos aromáticos tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benciloxicarbonilos sustituidos, y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc);

3) grupos de carbamatos alifáticos tales como terc.-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo y aliloxicarbonilo;

4) grupos de alquil-carbamatos cíclicos tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo;

5) grupos alquilo tales como trifenilmetilo y bencilo;

6) trialquilsililo tales como trimetilsililo; y

7) grupos que contienen tiol tales como feniltiocarbonilo y ditiasuccinoílo.

El grupo protector de \alpha-amino preferido es o bien Boc o Fmoc. Están comercialmente disponibles para la síntesis de péptidos muchos derivados de aminoácidos apropiadamente protegidos.

El grupo protector de \alpha-amino del residuo de aminoácido que se acaba de añadir es separado antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Cuando se usa el grupo Boc, los métodos a seleccionar son los que usan ácido trifluoroacético, puro o disuelto en diclorometano, o HCl en dioxano o acetato de etilo. La resultante sal de amonio es luego neutralizada o bien antes del acoplamiento o in situ con soluciones de carácter alcalino tales como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano o acetonitrilo o dimetilformamida. Cuando se usa el grupo Fmoc, los reactivos a seleccionar son piperidina o una piperidina sustituida en el seno de dimetilformamida, pero se puede usar cualquier amina secundaria. La desprotección se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 0ºC y la temperatura ambiente (TA).

Cualquiera de los aminoácidos que tengan funcionalidades de cadenas laterales deben de ser protegidos durante la preparación del péptido usando cualesquiera de los grupos antes descritos. Los expertos en el sector de la tecnología apreciarán que la selección y el uso de apropiados grupos protectores para estas funcionalidades de cadenas laterales dependen del aminoácido y de la presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección de tales grupos protectores es importante, puesto que el grupo no debe de ser eliminado durante la desprotección y el acoplamiento del grupo \alpha-amino.

Por ejemplo, cuando se usa Boc como el grupo protector de \alpha-amino, el p-toluenosulfonilo (tosilo) es apropiado para proteger a la cadena lateral amino de aminoácidos tales como Lys y Arg; se pueden usar restos acetamidometilo, bencilo (Bn), o t-butilsulfonilo para proteger a la cadena lateral que contiene sulfuro de la cisteína; se pueden usar éteres de bencilo (Bn) para proteger a las cadenas laterales que contienen hidroxi de serina, treonina o hidroxi-prolina; y se pueden usar ésteres de bencilo para proteger a las cadenas laterales que contienen carboxi de ácido aspártico y ácido glutámico.

Cuando se escoge Fmoc para la protección de \alpha-amino, usualmente son aceptables grupos protectores basados en terc.-butilo. Por ejemplo, se puede usar Boc para lisina y arginina, terc.-butil-éter para serina, treonina e hidroxi-prolina, y éster terc.-butílico para ácido aspártico y ácido glutámico. Se puede usar el resto trifenilmetilo (tritilo) para proteger a la cadena lateral que contiene sulfuro de la cisteína.

Una vez que se ha completado el alargamiento del péptido se elimina la totalidad de los grupos protectores. Cuando se usa una síntesis en fase líquida, los grupos protectores se eliminan de cualquiera de las maneras que sea dictada por la elección de grupos protectores. Estos procesos son bien conocidos por los expertos en el sector de la tecnología.

Cuando se usa una síntesis en fase sólida, el péptido es separado con respecto de la resina simultáneamente con la eliminación de los grupos protectores. Cuando se usa en la síntesis el método de protección con Boc, el tratamiento con HF anhidro que contiene aditivos tales como sulfuro de dimetilo, anisol, tioanisol o p-cresol a 0ºC constituye el método preferido para separar el péptido con respecto de la resina. La separación del péptido se puede conseguir mediante otros reactivos ácidos tales como mezclas de ácido trifluorometanosulfónico y ácido trifluoroacético. Si se usa el método de protección con Fmoc, el grupo Fmoc situado en el extremo terminal de N es separado con los reactivos que se han descrito anteriormente. Los otros grupos protectores y el péptido son separados con respecto de la resina usando una solución de ácido trifluoroacético y diversos aditivos tales como anisol, etc.

Síntesis del grupo de remate B y de restos P6, P5, P4 y P3

Diferentes grupos de remate B se introducen para proteger a P6, P5, P4, a todo el péptido o a cualquier segmento de péptido con un apropiado cloruro de acilo, que o bien está disponible comercialmente o para el que la síntesis es bien conocida en el sector de la tecnología.

Diferentes restos de P6 a P3 están disponibles comercialmente o su síntesis es bien conocida en el sector de la tecnología.

Síntesis de restos P2 1. Síntesis de precursores A) Síntesis de derivados de haloarilmetano

La preparación de una halometil-8-quinolina IId se realizó de acuerdo con el procedimiento de K.N. Campbell y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc., (1946), 68, 1.844.

Esquema II

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Dicho brevemente, el ácido 8-quinolina-carboxílico IIa se convirtió en el correspondiente alcohol IIc por reducción del correspondiente haluro de acilo IIb con un agente reductor tal como hidruro de litio y aluminio. El tratamiento del alcohol IIb con el apropiado hidrácido halogenado da el deseado derivado de halo IId. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo 1.

2. Síntesis de P2

A) La síntesis de una prolina sustituida en posición 4 (en la que R_{17} está unido al anillo a través de un átomo de carbono) (con la estereoquímica que se muestra):

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se realiza como se muestra en el Esquema III de acuerdo con los procedimientos descritos por J. Ezquerra y colaboradores (Tetrahedron, (1993), 38, 8.665-8.678) y C. Pedregal y colaboradores (Tetrahedron Lett., (1994), 35, 2.053-2.056).

Esquema III

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Dicho brevemente, el ácido Boc-piroglutámico se protege como un éster de bencilo. El tratamiento con una base fuerte tal como diisopropil-amiduro de litio, seguido por la adición de un agente alquilante (Br-R_{17} o I-R_{17}) da los deseados compuestos IIIe después de reducción de la amida y desprotección del éster. Una realización específica de este procedimiento se presenta en el Ejemplo 2.

B) La síntesis de una 4(R)-hidroxi-prolina alquilada en O:

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se puede llevar a cabo usando los diferentes procedimientos que se describen seguidamente.

B.1): Cuando R_{12} es arilalquilo, el proceso se puede llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por E.M. Smith y colaboradores (J. Med. Chem. (1988), \underline{31}, 875-885). Dicho brevemente, la Boc-4(R)-hidroxi-prolina comercialmente disponible se trata con una base tal como hidruro de sodio y el alcóxido resultante se hace reaccionar con un agente alquilante (Br-R_{12} o I-R_{12}) para dar los deseados compuestos. Realizaciones específicas de este procedimiento se presentan en los Ejemplos 3 y 4.

B.2): Cuando R_{12} es arilo, los compuestos se pueden preparar por medio de una reacción de Mitsunobu (Mitsunobu (1981), Synthesis, Enero, 1-28; Rano y colaboradores, (1995), Tet. Lett. \underline{36(22)}, 3779-3792; Krchnak y colaboradores, (1995), Tet. Lett. \underline{36(5)}, 62193-6196; Richter y colaboradores, (1994), Tet. Lett. \underline{35(27)}, 4705-4706). Dicho brevemente, el éster metílico de Boc-4(S)-hidroxi-prolina comercialmente disponible se trata con el apropiado aril-alcohol o -tiol en la presencia de trifenil-fosfina y azo-dicarboxilato de dietilo (DEAD) y el éster resultante se hidroliza para dar el ácido. Realizaciones específicas de este procedimiento se presentan en el Ejemplo 5.

Esquema IV

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Alternativamente, la reacción de Mitsunobu se puede realizar en fase sólida (como se muestra en el Esquema IV). El bloque de 96 pocillos del sintetizador Modelo 396 (Advanced ChemTech) es provisto de partes alícuotas del compuesto (IVa) fijado a una resina y se añaden una diversidad de aril- alcoholes o -tioles y apropiados reactivos. Después de la incubación, cada producto (IVb) fijado a una resina se lava, se seca y se separa con respecto de la resina.

B.2.a): Una reacción de Suzuki (Miyaura y colaboradores, (1981), Synth. Comm, \underline{11}, 513; Sato y colaboradores, (1989), Chem. Lett., 1405; Watanabe y colaboradores, (1992), Synlett., 207; Takayuki y colaboradores, (1993), J. Org. Chem. \underline{58}, 2201; Frenette y colaboradores, (1994), Tet. Lett. \underline{35(49)}, 9177-9180; Guiles y colaboradores, (1996), J. Org. Chem. \underline{61}, 5169-5171) se puede usar también para funcionalizar adicionalmente al sustituyente arilo.

C) La síntesis de compuestos de fórmula I en la que Q es

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en la que Z es CH; R_{1} es como antes se ha definido y R_{13} es CF_{3}, CF_{2}CF_{3} o C(O)NH-R_{14}; se realizó como se describe en el Esquema VIII.

La síntesis de los requeridos restos P1 se realizó de la siguiente manera:

i): Para la síntesis de alcoholes trifluorometílicos de la fórmula Vd el procedimiento descrito por J.W. Skiles y colaboradores (J. Med. Chem. (1992), 35, 641-662) se usó como se ilustra:

Esquema V

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en que R_{1} es como se ha definido anteriormente.

Dicho brevemente, una condensación entre el etil-hemiacetal de trifluoro-acetaldehído Va comercialmente disponible y el apropiado nitro-alcano proporciona el correspondiente nitro-alcohol Vb. El grupo nitro fue reducido (preferiblemente con Ra-Ni) y protegido en forma del derivado con Boc Vc para permitir una más fácil purificación del fragmento. El tratamiento de la Boc-amina con HCl anhidro proporciona la sal hidrocloruro Vd.

ii) Para la síntesis de alcoholes pentafluoroetílicos de fórmula VId, se usó el procedimiento descrito por M.R. Angelastro y colaboradores (J. Med. Chem. (1994), 37, 4538-4554) como se ilustra en el Esquema VI:

Esquema VI

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en que R_{1} es como se ha definido anteriormente.

Dicho brevemente, el Boc-aminoácido VIa se convirtió en la amida de Weinreb VIb de acuerdo con el procedimiento descrito por Castro, B. y colaboradores (Synthesis, (1983), 676-678) y se trató con litio-pentafluoroetano. La resultante pentafluoroetil-cetona VIc se redujo y el grupo protector Boc se eliminó con HCl anhidro para dar la sal hidrocloruro del deseado amino-alcohol VId.

iii) Para la síntesis de hidroxi-amidas de fórmula VIIf se usó el procedimiento descrito por Peet y colaboradores (Tet. Lett. (1988), 3433) como se ilustra en el Esquema VII:

Esquema VII

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en que R_{1} es como se ha definido anteriormente.

Dicho brevemente, la condensación entre el glioxilato de etilo VIIa y un nitro-alcano en condiciones básicas proporcionó el correspondiente nitro-alcohol VIIb. El grupo nitro se redujo (preferiblemente con Ra-Ni) y protegió en forma del derivado de Boc VIIc. La saponificación del grupo éster seguida por un acoplamiento clásico con una amina dio la hidroxi-amida VIIe. La eliminación del grupo protector Boc con HCl anhidro proporcionó la sal hidrocloruro de la deseada amino-hidroxi-amida VIIf.

iv) El acoplamiento a P2-P6 se llevó a cabo como se ilustra en el Esquema VIII:

Esquema VIII

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a) El fragmento de P6 a P2 se puede enlazar al grupo amino libre del derivado de amino-alcohol VIIIa como se ha descrito anteriormente en el Esquema I para dar el péptido-alcohol VIIIb.

b) La funcionalidad de alcohol del péptido-alcohol VIIIb es luego oxidada por técnicas y procedimientos bien conocidos y apreciados por una persona que tiene experiencia ordinaria en el sector de la tecnología, tal como la oxidación de Swerm (Tidwell, T.T., Synthesis, (1990), 857-870), o más específicamente la oxidación de Pfitzner-Moffatt (K.E. Pfitzner, y J.G. Moffatt, J. Am. Chem. Soc., (1965), 5670-5678) y el método del peryodinano de Dess-Martin (D.B. Dess o J.C. Martin, (J. Org. Chem. (1983), 48, 4155-4156) para dar los compuestos de fórmula I en la que Q contiene un carbonilo activado.

D) La síntesis de compuestos de fórmula I en la que Q es

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en que Z es N; y R_{13} es NHR_{14}, NR_{14}R_{14'}, CH_{2}-R_{14}, CHR_{14}R_{14'} u O-R_{14}; en que R_{14} y R_{1} son como se han definido anteriormente, se realizó como se describe en el Esquema X.

i): Para la síntesis de los fragmentos P1 que contienen aza, se siguió el procedimiento descrito por A.S. Dutta y colaboradores (J. Chem. Soc. Perkin I, (1975), 1712) como se ilustra:

Esquema IX

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en la que R_{1} y R_{14} son como se han definido anteriormente en esta memoria descriptiva.

Dicho brevemente, la Boc-hidrazina IXa comercialmente disponible se trató con un apropiado aldehído o cetona para proporcionar la correspondiente hidrazona IXb. La hidrazona se redujo (preferentemente con DIBAL) para dar el alquil-carbazato IXc. El tratamiento del alquil-carbazato con isocianatos proporciona el correspondiente fragmento de aza-péptido (IXd, en que z = NH). El tratamiento del alquil-carbazato con cloruros de carbamoílo proporciona el correspondiente fragmento de aza-péptido (IXd, en que z = NR_{14}R_{14'}). El tratamiento del alquil-carbazato con cloroformiatos proporciona el aza-carbonato (IXd, en que z = O), mientras que el tratamiento con cloruros de ácido proporciona los compuestos análogos con carbono (IXd, en que z = CH_{2}).

Alternativamente, el tratamiento del alquil-carbazato con ácidos carboxílicos utilizando condiciones de acoplamiento clásicas proporciona el correspondiente fragmento de aza-péptido (IXd, en que z = CHR_{14'} o CH_{2}). Finalmente, el grupo protector Boc se eliminó con HCl anhidro para dar los correspondientes aza-derivados IXe.

ii) El acoplamiento de P2-P6 se llevó a cabo de acuerdo con el Esquema X:

Esquema X

39

en que z es O, NH, CH_{2}, CHR_{14'} o NR_{14'}.

El fragmento de P6 a P2 puede ser enlazado al grupo amino libre del derivado Xa como se ha descrito anteriormente en el Esquema I para dar los aza-derivados de fórmula I, en la que Z es N.

E) La síntesis de compuestos de fórmula I en la que Q es

40

en la que R_{15} y R_{16} son como se han definido anteriormente, se usó el procedimiento descrito por J. Oleksyszyn y colaboradores (Synthesis, (1979), 985-986) como se ilustra en el Esquema XI:

Esquema XI

41

en que R_{1} es como se ha definido anteriormente en esta memoria.

Dicho brevemente, se realizó una síntesis en dos operaciones del éster difenílico por condensación de un apropiado aldehído XIa, carbamato de bencilo XIb, y fosfito de trifenilo, en la presencia de ácido acético. La eliminación del grupo protector benciloxicarbonilo de XIc usando una mezcla de HBr y AcOH proporcionó la deseada sal hidrobromuro XId.

El fragmento de P6 a P2 puede ser enlazado al grupo amino libre del derivado de fosfonato de fórmula XId como se ha descrito anteriormente en el Esquema I para dar el fosfono-péptido de fórmula I en que Q es un resto de fosfonato.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir el invento con mayor detalle. Estos ejemplos que exponen el mejor modo actualmente considerado para llevar a cabo el invento se destinan a ilustrar y no a limitar el invento.

Ejemplos

El presente invento se ilustra con mayor detalle mediante los siguientes Ejemplos no limitativos.

Las temperaturas se dan en grados Celsius (ºC). Los porcentajes de las soluciones expresan una relación de peso a volumen, y las relaciones de las soluciones expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se señale otra cosa distinta. Los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) se registraron en un espectrómetro Bruker a 400 MHz; los desplazamientos químicos (\delta) se informan en partes por millón. La cromatografía de resolución rápida se llevó a cabo sobre gel de sílice (SiO_{2}) de acuerdo con la técnica de cromatografía de resolución rápida de Still (W.C. Still y colaboradores, J. Org. Chem. (1978), 43, 2923).

Las abreviaturas usadas en los Ejemplos incluyen Bn: bencilo; Boc: terc.-butiloxicarbonilo {Me_{3}COC(O)}; BSA: albúmina de suero bovino; CHAPS: 3-[(3-colamido-propil)-dimetilamonio]-1-propano-sulfonato; DBU: 1,8-diazabiciclo [5.4.0]undec-7-eno; CH_{2}Cl_{2} = DCM: cloruro de metileno; DIAD: azo-dicarboxilato de diisopropilo; DIPEA: diisopropil-etil-amina; DMAP: dimetilamino-piridina; DCC: 1,3-diciclohexil-carbodiimida; DME: 1,2-dimetoxi-etano; DMF: dimetil-formamida; DMSO: dimetil-sulfóxido; DTT: ditiotreitol o treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol; EDTA: ácido etilendiamina-tetraacético; Et: etilo; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etilo; Et_{2}O: dietil-éter; HPLC: cromatografía de líquido de alto rendimiento; MS: espectrometría de masas (MALDI-TOF: Ionización-Desorción por Láser Asistida por Matriz-Tiempo de Vuelo, FAB: Bombardeo con Átomos Rápidos); LAH: hidruro de litio y aluminio; Me: metilo; MeOH: metanol; MES: ácido (2-{N-morfolino}etano-sulfónico); NaHMDS: bis(trimetil-silil)-amiduro de sodio; NMM: N-metil-morfolina; NMP: N-metil-pirrolidina; Pr: propilo; Succ: 4-hidroxi-1,4-dioxo-butilo; PNA: 4-nitro-fenilamino o p-nitro-anilida; TBAF: fluoruro de tetra-n-butil-amonio; TCEP: hidrocloruro de tris(2-carboxi-etil)fosfina; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropil-silano; TLC: cromatografía de capa fina; TMSE: trimetil-silil-etilo; Tris/HCl: hidrocloruro de tris(hidroximetil)-aminometano.

Ejemplo 1 Síntesis de bromometil-8-quinolina (1)

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A un ácido 8-quinolina-carboxílico comercialmente disponible (2,5 g, 14,4 mmol) se le añadió cloruro de tionilo puro (10 ml, 144 mmol). Esta mezcla se calentó a 80ºC durante 1 h antes de que el cloruro de tionilo en exceso fuera separado por destilación a presión reducida. Al sólido de color parduzco resultante se le añadió EtOH absoluto (15 ml), lo que se calentó a 80ºC durante 1 h antes de ser concentrado en vacío. El residuo se repartió entre EtOAc y NaHCO_{3} acuoso saturado, y la fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un aceite de color parduzco (2,8 g). Este material (aproximadamente 14,4 mmol) se añadió gota a gota durante 35 min a una suspensión de LAH (0,76 g, 20,2 mmol)/Et_{2}O que se enfrió a -60ºC. La mezcla de reacción se calentó lentamente a -35ºC durante 1,5 h antes de que la reacción fuese completa. La mezcla de reacción se sofocó con MgSO_{4}.10H_{2}O lentamente en el transcurso de 30 min y luego con THF húmedo. La mezcla se repartió entre Et_{2}O y NaHCO_{3} acuoso al 10%. La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un sólido de color amarillento (2,31 g, 80% en el transcurso de dos etapas) correspondiente al alcohol. El alcohol (2,3 g, 11,44 mmol) se disolvió en una mezcla de AcOH y HBr (20 ml, solución al 30% procedente de Aldrich) y se calentó a 70ºC durante 2,5 h. La mezcla se concentró en vacío hasta sequedad, se repartió entre EtOAc (100 ml) y NaHCO_{3} acuoso saturado, antes de ser secada (sobre MgSO_{4}), filtrada y concentrada para dar el compuesto (1) deseado como un sólido de color parduzco (2,54 g, 100%).

Ejemplo 2 Síntesis de Boc-4(R)-(3-fenil-propil)prolina (2d)

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a) Síntesis del compuesto 2b

A una solución del éster bencílico de ácido Boc-piroglutámico (2a) (preparado como se ha descrito por A.L. Johnson y colaboradores, J. Med. Chem. (1985), 28, 1596-1602) (500 mg, 1,57 mmol) en THF (10 ml) a -78ºC, se le añadió lentamente hexametil-disilil-aziduro de litio (1,72 ml, solución 1 M en THF). Después de haber agitado durante 1 h a -78ºC, se añadió bromuro de cinamilo (278 \mul, 1,88 mmol) y la agitación se continuó durante 2 h adicionales. La mezcla de reacción se sofocó con una solución saturada de cloruro de amonio y se extrajo con dietil-éter (3 x 20 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (sobre MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en columna de resolución rápida (en una mezcla de hexano y acetato de etilo 8:2) para dar el compuesto 2b como un sólido de color blancuzco (367 mg, rendimiento 54%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 7,35-7,19 (m, 10H), 6,43 (d, J= 15 Hz, 1H), 6,11 (ddd, J=15, J'=J''= 8 Hz, 1H), 5,26 (d, J=16 Hz, 1H), 5,17 (d, J=16 Hz, 1H), 4,59 (dd, J=9,5, J'=2 Hz, 1 H), 2,83-2,70 (m, 2H), 2,41-2,34 (m, 1H), 2,22-2,16 (m, 1H), 2,10-2,02 (m, 1H) 1,42 (s, 9 H).

b) Síntesis del compuesto 2c

A -78ºC, se añadió trietil-borohidruro de litio (solución 1 M en THF, 1,01 ml, 1,01 mmol) a una solución del compuesto 2b (367 mg, 0,843 mmol) en THF (5 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de 30 min, la mezcla de reacción se sofocó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 ml) y se calentó a 0ºC. Se añadió H_{2}O_{2} al 30% (5 gotas) y la mezcla se agitó a 0ºC durante 20 min. Los materiales volátiles orgánicos se eliminaron en vacío, y la capa acuosa se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 10 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (sobre MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. A una solución fría (a -78ºC) del residuo y trietil-silano (134 \mul, 0,843 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (3 ml) se le añadió gota a gota trifluoruro de boro-eterato (118 \mul, 0,927 mmol) bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de 30 min se añadieron cantidades adicionales de trietil-silano (134 \mul) y trifluoruro de boro-eterato (118 \mul). Después de haber agitado durante 2 h a -78ºC, la mezcla de reacción se sofocó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 ml) y se extrajo con DCM (3 x 10 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (sobre MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de resolución rápida (en una mezcla de hexano y acetato de etilo 8:2) para dar el compuesto 2c como un aceite incoloro (140 mg, rendimiento 40%). La ^{1}H-NMR (CDCl_{3}) indicó la presencia de dos rotámeros: \delta 7,34-7,22 (m, 10H), 6,38 (d, J=15,5 Hz, 1H), 6,15-6,08 (m, 1H), 5,29-5,07 (m, 2H), 4,44 (d, J=7 Hz, 1/3H), 4,33 (d, J'=7 Hz, 2/3H), 3,76 (dd, J=10,5, J'=8,5 Hz, 2/3H), 3,69 (dd, J=10,5, J'=8,5 Hz, 1/3H), 3,13 (dd, J=9, J'=8,5 Hz, 2/3H), 3,05 (dd, J'=9, J'=8,5 Hz, 1/3H), 2,47-2,40 (m, 1H), 2,35-2,22 (m, 2H), 2,15-1,85 (m, 2H) 1,45 (s, (3,9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H).

c) Síntesis del compuesto 2d

A una solución del compuesto 2c (140 mg, 0,332 mmol) en etanol (4 ml) se le añadió paladio al 10% sobre carbón orgánico (30 mg). La mezcla se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 2 h. El catalizador se eliminó haciendo pasar la mezcla a través de un filtro Millipore: Millex - HV de 0,45 \mum. La solución transparente se concentró para dar el compuesto deseado 2d como un aceite incoloro (115 mg, rendimiento cuantitativo). La ^{1}H-NMR (en DMSO-d_{6}) indicó la presencia de dos rotámeros: \delta 7,28-7,14 (m, 5H), 4,33 (br.s, 1H), 4,06-4,10 (m, 1H), 3,56-3,42 (m, 3H), 2,89-2,79 (m, 1H), 2,53-2,49 (m, 1H, bajo DMSO-d_{6}), 2,24-2,10 (m, 1H), 2,03-1,93 (m, 1H), 1,87-1,75 (m, 1H), 1,62-1,45 (m, 2H) 1,38 (s, (3/9) 9H), 1,33 (s, (6/9) 9H).

Ejemplo 3 Síntesis de Boc-4(R)-(naftalen-1-ilmetoxi)prolina (3)

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Una Boc-4(R)-hidroxi-prolina comercialmente disponible (5,00 g, 21,6 mmol) se disolvió en THF (100 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió en porciones durante 10 minutos hidruro de sodio (dispersión al 60% en un aceite, 1,85 g, 45,4 mmol) y la suspensión se agitó a TA durante 1 h. Luego se añadió 1-(bromometil)naftaleno (8,00 g, 36,2 mmol) (preparado como se ha descrito en E.A. Dixon y colaboradores, Can. J. Chem., (1981), 59, 2629-2641) y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. La mezcla se vertió en agua (300 ml) y se lavó con hexano. La capa acuosa se acidificó con HCl acuoso al 10% y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron (sobre MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de resolución rápida (en una mezcla de hexano, acetato de etilo y ácido acético 49:49:2), para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (4,51 g, rendimiento 56%). La ^{1}H-NMR (en DMSO-d_{6}) indicó la presencia de dos rotámeros: \delta 8,05 (m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,29 (d, J=14 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 4H), 4,96 (m, 2H), 4,26 (s ancho, 1H), 4,12 (dd, J=J=8 Hz, 1H), 3,54-3,42 (m, 2H), 2,45-2,34 (m, 1H), 2,07-1,98 (m, 1H), 1,36 (s, (3/9) 9H), 1,34 (s, (6/9) 9H).

Ejemplo 4 Síntesis de Boc-4(R)-(8-quinolina-metiloxi)prolina (4)

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La Boc-4(R)-hidroxi-prolina (1,96 g, 8,5 mmol) en THF anhidro (20 ml) se añadió a una suspensión de NaH (1,4 g, al 60% en un aceite, 34 mmol) en THF (100 ml). Esta mezcla se agitó durante 30 min antes de que se añadiese bromometil-8-quinolina procedente del Ejemplo 1 (2,54 g, 11,44 mmol) en THF (30 ml). La mezcla se reacción se calentó a 70ºC (durante 5 h) antes de que el NaH en exceso fuera destruido cuidadosamente con THF húmedo. La mezcla de reacción se concentró en vacío y el material resultante se disolvió en EtOAc y H_{2}O. La fase acuosa alcalina se separó y acidificó con HCl acuoso al 10% a pH \sim5, antes de ser extraída con EtOAc (150 ml). La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un aceite de color pardo. La purificación por cromatografía de resolución rápida (eluyente: mezcla de 10% de MeOH y CHCl_{3}) dio el compuesto deseado como un sólido de color amarillo pálido (2,73 g, 86%). La HPLC (97,5%); y la ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) muestran poblaciones de rotámeros en una relación de 6:4, \delta 12-11,4 (bs, 1H), 8,92 (2 x d, J = 4,14 y 4,14 Hz, 1H), 8,38 (2 x d, J = 8,27 y 8,27 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 7,94 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,63-7,54 (m, 2H), 5,14 (2 x s, 2H), 4,32-4,29 (m, 1H), 4,14-4,07 (m, 1H), 3,52-3,44 (m, 2H), 2,43-2,27 (m, 1H), 2,13-2,04 (m, 1H), 1,36 y 1,34
(2 x s, 9H).

Ejemplo 5 Preparación de Boc-4(R)-(7-cloro-quinolina-4-oxo)prolina (5)

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Un éster metílico de Boc-4-(S)-hidroxi-prolina (500 mg, 2,04 mmol) comercialmente disponible y 7-cloro-4-hidroxi-quinolina (440 mg, 2,45 mmol) se dispusieron en THF seco (10 ml) a 0ºC. Se añadió trifenil-fosfina (641 mg, 2,95 mmol) seguida por una lenta adición de DIAD (426 mg, 2,45 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 20 h. Luego la mezcla de reacción se concentró, se recogió en acetato de etilo y extrajo tres veces con HCl 1 N. La fase acuosa se alcalinizó con Na_{2}CO_{3} y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron para dar un aceite de color amarillo. El aceite se purificó por cromatografía de resolución rápida para dar el éster metílico del compuesto (5) como un sólido de color blanco, 498 mg, rendimiento 58%.

Este éster metílico (400 mg, 0,986 mmol) se hidrolizó con hidróxido de sodio acuoso 1 M (1,7 ml, 1,7 mmol) en metanol (4 ml), a 0ºC, durante 3 h. La solución se concentró para eliminar el metanol y se neutralizó con HCl acuoso 1 M. La suspensión se concentró hasta sequedad y se recogió en metanol (20 ml), las sales se separaron por filtración y el material filtrado se concentró para dar el compuesto (5) deseado como un sólido de color blanco, 387 mg, rendimiento cuantitativo.

^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) (mezcla aprox. 1:1 de rotámeros) \delta 8,74 (d, J=5 Hz, 1 H), 8,13-8,09 (m, 1 H), 7,99 y 7,98 (s, 1 H), 7,58 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,02 (d, J = 5 Hz, 1 H), 5,26-5,20 (m, 1 H), 4,10-4,01 (m, 1H), 3,81-3,75 (m, 1 H), 3,59 (dd, J = 12, 10 Hz, 1 H), 2,41-2,31 (m, 2 H), 1,34 y 1,31 (s, 9H).

Ejemplo 6 Procedimiento general para reacciones de acoplamiento realizadas sobre un soporte sólido

La síntesis se realizó en un sintetizador paralelo del Modelo ACT396 procedente de Advanced ChemTech® con el bloque de 96 pocillos. Típicamente, se sintetizaron en paralelo 24 péptidos usando técnicas clásicas en fase sólida. La Fmoc-Nva-resina de Wang de partida y la ácido 1-(Fmoc-amino)-ciclopropano-carboxílico-resina de Wang se prepararon por el método de acoplamiento con DCC y DMAP (Atherton, E; Scheppard, R.C. Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach; IRL Press; Oxford (1989); páginas 131-148). Se obtuvieron otros aminoácido-resinas de Wang a partir de fuentes comerciales.

Cada pocillo se cargó con 100 mg de la resina de partida (aproximadamente 0,05 mmol). Las resinas se lavaron consecutivamente con porciones de 1,5 ml de NMP (1x) y de DMF (3x). El grupo protector Fmoc se eliminó por tratamiento con 1,5 ml de una solución al 25% v/v de piperidina en DMF durante 20 min. Las resinas se lavaron con porciones de 1,5 ml de DMF (4x), MeOH (3x) y DMF (3x). El acoplamiento se realizó en DMF (350 \mul), usando 400 \mul (0,2 mmol) de una solución 0,5 M de una mezcla de Fmoc-aminoácido y HOBt hidrato en DMF, 400 \mul (0,4 mmol) de una solución 0,5 M de DIPEA en DMF y 400 \mul (0,2 mmol) de una solución 0,5 M de TBTU en DMF. Después de haber agitado durante 1 h, los pocillos se vaciaron, las resinas se lavaron con 1,5 ml de DMF y se repitió el acoplamiento una vez más en las mismas condiciones. Luego las resinas se lavaron como antes se ha descrito y el ciclo se repitió con el siguiente aminoácido.

Los grupos de remate se introdujeron de dos maneras:

1. En la forma de un ácido carboxílico usando el protocolo antes descrito (por ejemplo ácido acético), o

2. Como un agente acilante tal como un anhídrido o un cloruro de ácido. El siguiente ejemplo ilustra el remate con anhídrido succínico: Después de la desprotección respecto del Fmoc y del subsiguiente protocolo de lavado, se añadió DMF (350 \mul), seguida por 400 \mul de una solución en DMF de anhídrido succínico (0,5 M, 0,2 mmol) y DIPEA (1,0 M, 0,4 mmol). Las resinas se agitaron durante 2 h y se realizó una operación de reacopla-
miento.

Al final de la síntesis la resina se lavó con porciones de 1,5 ml de DCM (3x), de MeOH (3x), de DCM (3x) y éstas se secaron bajo vacío durante 2 h.

La separación con respecto de la resina y la desprotección concomitante de cadenas laterales se efectuaron mediante la adición de 1,5 ml de una mezcla de TFA, H_{2}O, DTT y TIS (92,5:2,5:2,5:2,5). Después de haber agitado durante 2,5 h, la resina se filtró y se lavó con 1,5 ml de DCM. Los materiales filtrados se combinaron y se concentraron por centrifugación en vacío.

Cada compuesto se purificó mediante HPLC de fase inversa preparativa usando una columna de C18 (de 22 mm por 500 mm). Las fracciones que contenían productos se identificaron por espectrometría de masas MALDI-TOF, se combinaron y se liofilizaron.

Ejemplo 7 Procedimiento general para reacciones de acoplamiento realizadas en solución {véase también R. Knorr y colaboradores, Tetrahedron Letters, (1989), 30, 1927.}

Los reaccionantes, es decir una amina libre (1 eq.) (o su sal hidrocloruro) y el ácido carboxílico libre (1 eq.) se disolvieron en CH_{2}Cl_{2}, CH_{3}CN o DMF. Bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadieron a la solución agitada cuatro equivalentes de N-metil-morfolina y 1,05 equivalentes del agente de acoplamiento. Después de 20 min, se añadió un equivalente del segundo reaccionante, a saber un ácido carboxílico libre. (Reactivos de acoplamiento prácticos y eficientes para esta finalidad son hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio (HOBT) o preferiblemente tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (TBTU) o tetrafluoroborato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HATU). La reacción se vigiló por TLC. Después de haberse completado la reacción, el disolvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc. La solución se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10%, con NaHCO_{3} acuoso saturado y con salmuera. La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. Cuando el residuo había sido purificado, esto se realizó por cromatografía de resolución rápida como antes se ha
definido.

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(Esquema pasa a página siguiente)

Ejemplo 8 Síntesis del segmento: Ac-Chg-Chg-Pro-(4(R)-naftalen-1-ilmetoxi)-OH (8g)

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El compuesto 8a (4,45 g, 11,98 mmol) se disolvió en CH_{3}CN anhidro (60 ml). Se añadieron consecutivamente DBU (2,2 ml, 14,38 mmol) y bromuro de alilo (1,1 ml, 13,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 h a TA. La mezcla se concentró, el aceite resultante se diluyó con EtOAc y con agua y se lavó consecutivamente con agua (2x = 2 veces) y con salmuera (1x = 1 vez). La capa de EtOAc se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó hasta sequedad. El aceite de color amarillo se purificó por cromatografía de resolución rápida (eluyente: mezclas de hexano y EtOAc desde 90:10 hasta 85:15) para proporcionar el producto 8b como un aceite de color amarillo (2 ml, 4,17 g, rendimiento 85%);

MS (FAB) 412 MH^{+}

^{1}H NMR (CDCl_{3}), mezcla de rotámeros aprox. 1:2 \delta (d, J=8Hz, 1H), 7,87 (d, Z= 8Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,55-7,41 (m, 4H), 5,95-5,85 (m, 1H), 5,34-5,21 (m, 2H), 5,03-4,88 (m, 2H), 4,70-4,56 (m, 2H), 4,48 & 4,39 (t, J= 8, 15Hz, 1H), 4,28-4,23 (m, 1H), 3,81-3,55 (m, 2H), 2,46-2,36 (m, 1H), 2,13-2,05 (m, 1H), 1,44 y 1,41 (s, 9H).

El compuesto 8b (2,08 g, 5,05 mmol) se trató durante 30 min a TA con una mezcla de HCl 4 N y dioxano. La evaporación hasta sequedad proporcionó el correspondiente compuesto amina\cdotHCl en forma de un aceite. Se añadieron consecutivamente el amina\cdotHCl 8c se disolvió en DCM anhidro (25 ml), NMM (2,2 ml, 20,22 mmol), Boc-Chg-
OH \cdot H_{2}O (1,53 g, 5,56 mmol) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante una noche, luego se diluyó con EtOAc y se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x), con NaHCO_{3} acuoso saturado (2x), con agua (2x) y con salmuera (1x). La capa de EtOAc se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó hasta sequedad para proporcionar el producto bruto 8d como una espuma de color blanco-amarillento (aproximadamente 2,78 g, rendimiento 100%). MS (FAB) MH^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,03 (d, J=8Hz, 1H), 7,86 (b d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,84 (d, J= 8Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,92-5,85 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,22 (dd, J=1, 10Hz, 1H), 5,17 (d, J= 9Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,91 (d, J= 12Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,27 (m, 2H), 4,16 (b d, J= 11Hz, 1H), 3,71 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2,47-2,41 (m, 1H), 2,08-1,99 (m, 1H), 1,85-1,63 (m, 5H), 1,44-1,40 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,28-1,00 (m, 5H).

El dipéptido bruto 8d (aproximadamente 5,05 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (25 ml) como se ha descrito para el compuesto 8c. La sal hidrocloruro bruta se acopló a Boc-Chg-OH \cdot H_{2}O (1,53 g, 5,55 mmol) con NMM (2,22 ml, 20,22 mmol) y TBTU (1,95 g, 6,07 mmol) en DCM (25 ml) como se ha descrito para el compuesto 8d con el fin de proporcionar el tripéptido bruto en forma de una espuma oleosa de color amarillo. El material bruto se purificó por cromatografía de resolución rápida (eluyente: mezclas de hexano y EtOAc desde 80:20 hasta 75:25) para proporcionar el tripéptido 8e como una espuma de color blanco (2,75 g; rendimiento 79%) en el transcurso de 2 etapas). MS (FAB) 690,5 MH^{+}, ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (d, J=8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,41 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,92-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J=1, 17Hz, 1H), 5,23 (dd, J=1, 10 5Hz, 1H), 5,04 (d, J= 12Hz, 1H), 4,98 (b d, J= 7Hz, 1H), 4,93 (d, J=12Hz, 1H), 4,63-4,58 (m, 4H), 4,29-4,25 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,90-3,84 (m, 1H), 3,72 (dd, J=4, 11Hz, 1H), 2,48-2,40 (m, 1H), 2,07-1,99 (m, 1H), 1,83-1,55 (m, 12H), 1,43 (s, 9H), 1,23-0,89 (m, 10H).

El tripéptido 8e (2,75 g, 3,99 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (20 ml) como se ha descrito para el compuesto 8c. La sal hidrocloruro bruta se disolvió en DCM anhidro (20 ml). Se añadieron consecutivamente NMM (1,75 ml, 15,94 mmol) y anhídrido acético (752 \mul, 7,97 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a TA, y luego se diluyó con EtOAc. La capa orgánica se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x), con NaHCO_{3} acuoso saturado (2x), con agua (2x) y con salmuera (1x), se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó hasta sequedad para proporcionar el tripéptido bruto 8f como una espuma de color blanco (2,48 g, rendimiento 98%). MS (FAB) 632,4 MH^{+1}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (b d, J=8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,83 (d, J'= 8Hz, 1H), 7,58-7,40 (m, 4H), 6,36 (d J= 9Hz, 1H), 6,01 (d, J= 9Hz, 1H), 5,94-5,83 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,25-5,21 (m, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,64-4,57 (m, 4H), 4,30-4,23 (m, 2H), 4,12-4,08 (m, 1H), 3,73 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2,49-2,42 (m, 1H), 2,08-2,01 (m, 1H), 1,99 (s, 3H), 1,85-1,53 (m, 11H), 1,25-0,88 (m, 11H).

El tripéptido bruto 8f (2,48 g, 3,93 mmol) se disolvió en una mezcla anhidra de CH_{3}CN y DCM (20 ml). Se añadieron consecutivamente trifenil-fosfina (53,5 mg, 0,200 mmol) y un catalizador de tetraquis(trifenil-fosfina)-paladio(0) (117,9 mg, 0,102 mmol), seguidos por pirrolidina (353,9 \mul, 4,24 mmol). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 18 h. Posteriormente, el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en EtOAc y ácido cítrico acuoso al 10%, luego se realizaron lavados adicionales dos veces más con ácido cítrico acuoso al 10%, con agua (2x) y con salmuera (1x). La capa orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó. El producto bruto se trituró en una mezcla de Et_{2}O y DCM (85:15) para proporcionar después de filtración el tripéptido 8g como un sólido de color blanco (2,09 g, rendimiento 90%). MS (FAB) 592,4 MH^{+} 614,3 (M+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,08 (d, J= 8Hz, 1H), 7,93 (b d, J= 9Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,57-7,41 (m, 4H), 6,47 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12,5Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12,5Hz, 1H), 4,73 (t, J= 9,5, 19Hz, 1H), 4,44-4,35 (m, 2H), 4,26 (b s, 1H), 4,19 (d, J= 11,5Hz, 1H), 3,75 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2,47 (b dd, J= 5,5, 13,5Hz, 1H), 2,20-2,11 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,88-1,41 (m, 11H), 1,30-0,80 (11H).

Ejemplo 9 Síntesis del segmento: Ac-Chg-Val-Pro(4(R)-naftalen-1-ilmetoxi)-OH (9e)

48

49

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El compuesto 9a (2,89 g, 7,02 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (30 ml) como se ha descrito para el compuesto 8c. La sal hidrocloruro bruta se acopló a Boc-Val-OH (1,53 g, 7,73 mmol) con NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) en DCM (35 ml) durante 3,5 h como se ha descrito para el compuesto 3 con el fin de proporcionar el dipéptido bruto 9b como una espuma oleosa de color marfil (aproximadamente 3,60 g, rendimiento 100%). MS (FAB) 509,3 MH^{-}511,3 MH^{+}533,2 (N+Na)^{+}. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,04 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,56-7,40 (m, 4H), 5,93-5,85 (m, 1H), 5,34-5,28 (m, 1H), 5,24-5,19 (m, 2H), 5,04 (d, J= 12Hz, 1H), 4,92 (d, J= 12Hz, 1H), 4,67-4,60 (m, 3H), 4,31-4,26 (m, 2H), 4,11-4,09 (m, 1H), 3,72 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,07-1,99 (m, 1H), 1,44-1,36 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,01 (d, Z= 7H, 3H), 0,93 (d, J= 7Hz, 3H).

El dipéptido bruto 9b (aproximadamente 7,02 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (30 ml) como se ha descrito para el compuesto 7c. La sal hidrocloruro bruta se acopló a Boc-Chg-OH \cdot H_{2}O (2,13 g, 7,73 mmol) con NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) y TBTU (2,71 g, 8,43 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (35 ml) como se ha descrito para el compuesto 3 con el fin de proporcionar el tripéptido bruto 9c como una espuma de color marfil (aproximadamente 4,6 g, rendimiento 100%). MS (FAB) 648,5 MH^{-} 672 4 (M+Na)'. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,06 (b d, J'= 8Hz, 1H), 7,87 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (b d, J'= 8Hz, 1H), 7,57-7,40 (m, 4H), 6,46 (b d, J= 8,5Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5,23 (dd, J= 1, 10,5Hz, 1H), 5,03 (d, J= 12Hz, 1H), 5,00-4,97 (m, 1H), 4,93 (d, J=, 12Hz, 1H), 4,63-4,59 (m, 4H), 4,29-4,27 (m, 1H), 4,10-4,07 (m, 1H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,75 (dd, J= 5, 11Hz, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,10-1,99 (m, 1H), 1,76-1,57 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,20-0,92 (m, 6H), 1,00 (d, J= 7Hz, 3H), 0,93 (d, J'= 7Hz,
3H).

El tripéptido bruto 9c (aproximadamente 7,02 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (30 ml) como se ha descrito para el compuesto 8c. La sal hidrocloruro bruta se trató adicionalmente con anhídrido acético (1,33 ml, 14,05 mmol) y NMM (3,1 ml, 28,09 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (35 ml) como se ha descrito para el compuesto 8f. El producto bruto se purificó por resolución rápida (eluyente: mezcla de hexano y EtOAc 30:70) para proporcionar el tripéptido protegido acetilado 9d como una espuma de color blanco (3,39 g, rendimiento 81% en el transcurso de 3 etapas). MS (FAB) 590,3 MH^{-}, 592,4 MH^{+} 614,4 (M+Na)^{+}.

^{1}H NMR (CDCl_{3}), principalmente un rotámero, \delta 8,06 (d, J= 8Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 8Hz, 1H), 7,83 (d, J= 8Hz, 1H), 7,58-7,41 (m, 4H), 6,37 (d, J= 9Hz, 1H), 5,97 (d, J= 8,5Hz, 1H), 5,94-5,84 (m, 1H), 5,31 (dd, J= 1, 17Hz, 1H), 5,24 (dd, J= 1, 10,5 Hz, 1H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,66-4,57 (m, 4H), 4,31-4,22 (m, 2H), 4,11-4,05 (m, 1H), 3,73 (dd, J= 4,5, 11Hz, 1H), 2,50-2,43 (m, 1H), 2,09-2,01 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,68-1,55 (m, 5H), 1,15-0,89 (m, 6H), 0,99 (d, J= 7Hz, 3H), 0,91 (d, J= 7Hz, 3H).

El tripéptido acetilado 9d (3,39 g, 5,73 mmol) se desprotegió mediante el catalizador tetraquis(trifenilfosfina)-paladio(0) (172,1 mg, 0,149 mmol) con trifenil-fosfina (78,1 mg, 0,298 mmol) y pirrolidina (516 \mul, 6,19 mmol) en una mezcla 1:1 de CH_{3}CN anhidro y DCM (30 ml) como se ha descrito para el compuesto 8g. El producto bruto en forma de espuma de color amarillo claro se trituró en una mezcla de Et_{2}O y DCM (85:15) para proporcionar después de filtración el tripéptido 9e como un sólido de color blancuzco (3,0 g; rendimiento 95%). MS (FAB) 550,3 MH^{-1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,08 (d, J= 8Hz, 1H), 8,04 (b d, J= 9Hz, 1H), 7,88 (b d, J= 7,5Hz, 1H), 7,82 (d, J= 8Hz, 1H), 7,58-7,37 (m, 5H), 5,05 (d, J= 12Hz, 1H), 4,94 (d, J= 12Hz, 1H), 4,61 (t, J= 9,5, 19,5Hz, 1H), 4,46-4,37 (m, 2H), 4,27 (b s, 1H), 4,17 (d, J= 11Hz, 1H), 3,74 (dd, J= 4, 11Hz, 1H), 2,49 (b dd, J= 7,5, 13Hz, 1H), 2,17-2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,79 (b d, J= 12,5Hz, 1H), 1,62-1,43 (m, 5H), 1,00 (d, J= 7Hz, 3H), 0,90 (d, J =
7Hz, 3H).

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Ejemplo 10 Síntesis del pentapéptido 10h

La síntesis fue hecha como sigue:

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a) Síntesis del compuesto 10b

A una solución de la Boc-4(R)-benciloxiprolina (10a) comercialmente disponible (20,0 g, 62,2 mmol) en acetonitrilo (250 ml) a 0ºC se le añadieron consecutivamente DBU (10,3 ml, 68,87 mmol) y bromuro de alilo (6,0 ml, 69,3 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a TA, luego el acetonitrilo se evaporó y el residuo se disolvió en EtOAc. La mezcla se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x), agua, NaHCO_{3} acuoso saturado, agua (2x) y salmuera. La solución de EtOAc se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró para proporcionar el deseado éster 10b (21,84 g, 60,42 mmol, rendimiento 97%) como un aceite incoloro.

b) Síntesis del compuesto 10c

El éster alílico 10b (21,84 g, 60,42 mmol) se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (453 ml, 1.812,0 mmol) durante 30 min antes de ser concentrada en vacío. El hidrocloruro de amina se sometió a las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo 3. La sal hidrocloruro bruta se combinó con Boc-Val-OH (13,13 g, 60,43 mmol), NMM (26,6 ml, 241,93 mmol) y TBTU (23,3 g, 72,56 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (300 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 h a TA y luego se concentró en vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x), con agua, con NaHCO_{3} acuoso saturado (2x), con agua (2x) y con salmuera. La capa orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró para proporcionar el dipéptido bruto 10c (30,23 g). MS (FAB) 461 (MH^{+}).^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,36-7,28 (m, 5H), 5,91-5,84 (m, 1H), 5,35-5,21 (m, 2H), 5,19 (bs, 1H), 4,66-4,62 (m, 3H), 4,56 (d, J= 11,8 Hz, 1H), 4,49 (d, J= 11,4 Hz, 1H), 4,28-4,24 (m, 2H), 4,04 (bd, J= 11,1 Hz, 1H), 3,70 (dd, J= 4,5, 11,1 Hz, 1H), 2,25-2,42 (m, 1H), 2,08-1,98 (m, 1H), 1,45-1,40 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,01 (d, J= 6,7Hz, 3H), 0,93 (d, J= 6,7Hz, 3H).

c) Síntesis del compuesto 10d

El dipéptido bruto 10c (aproximadamente 60 mmol) se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (453 ml). La sal hidrocloruro bruta se combinó con Boc-Ile-OH (14,0 g, 60,5 mmol), TBTU (23,3 g, 72,6 mmol) y NMM (26,6 ml, 241,9 mmol, 4,0 eq.) en CH_{2}Cl_{2} (300 ml) como se ha descrito para el compuesto 10c a fin de proporcionar el tripéptido bruto 10d. La purificación por cromatografía de resolución rápida (usando una mezcla de EtOAc al 30% en hexano) dio el deseado compuesto 10d (25,61 g, 44,64 mmol, rendimiento 72% a partir del compuesto 10a). MS (FAB) 574 (MH^{+}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,37-7,28 (m, 5H), 6,44 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 5,95-5,84 (m, 1H), 5,35-5,23 (m, 2H), 5,99 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,65-4,47 (m, 3H), 4,56 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,27-4,21 (m, 1H), 4,03 (bd, J= 10,8 Hz, 1H), 3,97-3,88 (m, 1H), 3,71 (dd, J 4,1 Hz, J = 10,8 Hz, 1H), 2,49-2,41 (m, 1H), 2,12-2,00 (m, 2H), 1,85-1,74 (m, 1H), 1,55-1,40 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,16-1,04 (m, 1H), 1,00 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,89-0,82 (m, 6H).

d) Síntesis del compuesto 10e

El tripéptido 10d (25,60 g; 44,62 mmol) se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (durante 30 min) antes de ser concentrado en vacío para dar 22,64 g de la sal hidrocloruro. La sal hidrocloruro (14,97 g, 29,35 mmol) se combinó con Boc-(D)Glu(OTMSE)-OH (10,2 g, 29,35 mmol), TBTU (11,30 g, 35,23 mmol) y NMM (11,30 g, 35,23 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (150 ml) como se ha descrito para el compuesto 10c. El compuesto 10e se obtuvo en forma de una espuma de color blancuzco (23,6 g). MS (FAB) 803,5 (MH'); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,34-7,2S (m, 5H), 6,74 (d, J= 8,26 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 5,93-5,86 (m, 1H), 5,44-5,36 (m, 1H), 5,35-5,22 (m, 2H), 4,64-4,48 (m, 6H), 4,27-4,15 (m, 4H), 4,02 (d, J= 11,13 Hz, 1H), 3,71 (dd, J = 11,13, 4,45 Hz, 2H), 2,49-2,41 (m, 2H), 2,40-2,34 (m, 1H), 2,18-2,00 (m, 3H), 1,96-1,71 (m, 2H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,15-1,04 (m, 1H), 1,02-0,95 (m, 1H), 0,97 (d, 8,27 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 7,00 Hz, 3H), 0,87-0,82 (m, 1H), 0,84 (d, J = 6,67 Hz, 6H), 0,04 (s, 9H).

e) Síntesis del compuesto 10f

El tetrapéptido bruto 10e (aproximadamente 28,91 mmol) se trató durante 30 min con una solución 4 N de HCl en dioxano (150 ml). La sal hidrocloruro bruta se combinó con Boc-Asp(OTMSE)-OH (10,15 g, 30,44 mmol), NMM (12,7 ml, 115,6 mmol) y TBTU (11,14 g, 34,70 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (150 ml) como se ha descrito para el compuesto 10c. El pentapéptido 10f se obtuvo como una espuma de color amarillo claro (aproximadamente 29,5 g). MS (FAB) 1018 (MH'); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,36-7,28 (m, 6H), 6,78 (d, u = 8,90 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 8,58 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 7,94 Hz, 1H), 5,93-5,83 (m, 1H), 5,33-5,21 (m, 2H), 4,62-4,57 (m, 6H), 4,49-4,36 (m, 2H), 4,30 (dd, J = 8,90, 6,35 Hz, 1H), 4,23-4,14 (m, 5H), 3,72 (dd, J= 11,13, 4,77 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 16,85, 6,36 Hz, 1H), 2,79 (dd, J 16,85, 6,36 Hz, 1H), 2,48-2,27 (m, 3H), 2,21-1,94 (m, 5H), 1,46-1,42 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,17-1,07 (m, 1H), 1,00-0,86 (m, 4H), 0,99 (d, Z = 6,68 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,68 Hz, 3H), 0,90 (d, J = 6,67 Hz, 6H), 0,04 (S, 9H), 0,02 (s, 9H).

f) Síntesis del compuesto 10g

El Boc-pentapéptido 10f (aproximadamente 28,91 mmol) se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (150 ml) durante 30 min antes de ser concentrado en vacío. La sal hidrocloruro bruta se disolvió en DMF anhidra (150 ml), seguida por la adición sucesiva de piridina (51,4 ml, 636,2 mmol) y anhídrido acético (51,6 ml, 546,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a TA, luego se vertió en salmuera y se extrajo con EtOAc (3x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (2x), NaHCO_{3} saturado (2x), agua (2x) y salmuera (1x). La capa orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó hasta sequedad. El residuo en forma de aceite/espuma se purificó por cromatografía de resolución rápida (eluyente: mezcla de hexano y EtOAc; 4:6) para proporcionar el pentapéptido acetilado 10g como un sólido amorfo de color blanco (17,56 g, rendimiento 63% a partir del compuesto 10d). MS (FAB) 960,7 (MH') 982,9 (MNa'); H-NMR (CDCl_{3}) \delta 7,72 (d, J = 9,22 Hz, 1H), 7,35-7,28 (m, 6H), 7,12 (d, J= 9,54 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 5,91-5,81 (m, 1H), 5,32-5,22 (m, 2H), 5,20-4,96 (m, 1H), 4,68-4,54 (m, SH), 4,49-4,36 (m, 3H), 4,28-4,20 (m, 3H), 4,19-4,12 (m, 2H), 3,74 (dd, J= 11,76, 5,40 Hz, 2H), 2,93 (dd, J = 17,48, 4,45 Hz, 1H), 2,81 (dd, J = 17,49, 6,36 Hz, 1H), 2,47-2,39 (m, 2H), 2,33-2,24 (m, 1H), 2,14-1,95 (m, 5H), 2,03 (s, 3H), 1,52-1,42 (m, 1H), 1,17-1,07 (m, 1H), 1,02-0,88 (m, 16H), 0,04 (s, 9H), 0,03 (s, 9H).

g) Síntesis del compuesto 10h

El pentapéptido 10g (16,01 g, 16,67 mmol) se suspendió en acetonitrilo anhidro (100 ml) y se trató consecutivamente con trifenil-fosfina (227,4 mg, 0,87 mmol) y un catalizador de tetraquis(trifenil-fosfina)-paladio(O) (501 mg, 0,433 mmol) seguido por pirrolidina (1,5 ml, 18,01 mmol). La mezcla de reacción se agitó mecánicamente durante 4 h a TA y luego se concentró en vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó consecutivamente con ácido cítrico acuoso al 10% (3x), agua (3x) y salmuera (1x). La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se evaporó hasta sequedad. El producto bruto se purificó por cromatografía de resolución rápida (eluyente HOAc al 1%, MeOH al 2,3% en CHCl_{3}) para proporcionar el pentapéptido 10h como un sólido amorfo de color blanco (11,45 g, rendimiento 75%). (MH ), 942 (MNa'), 958 6 (M+K); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,53 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 7,32 Hz, 1H), 7,35-7,28 (m, 5H), 7,22-7,17 (m, 1H), 6,83 (d, 7,31 Hz, 1H), 5,00-4,94 (m, 1H), 4,64-4,61 (m, 2H), 4,53-4,44 (m, 3H), 4,35 (dd, J = 8,26, 6,04 Hz, 1H), 4,28-4,24 (m, 1H), 4,18-4,09 (m, 5H), 3,72 (dd, J 10 81, 4,14 Hz, 1H), 2,87-2,84 (m, 2H), 2,47-2,41 (m, 2H), 2,34-2,24 (m, 1H), 2,16-1,97 (m, 5H), 2,06 (s, 3H), 1,52-1,42 (m, 1H), 1,17-1,08 (m, 1H), 1,01-0,84 (m, 16H), 0,04 (s, 9H), 0,03 (s, 9H).

Ejemplo 11 Síntesis del compuesto 102 (Tabla 1)

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La síntesis se realizó como se muestra seguidamente:

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a) Síntesis del compuesto 11b

Una solución fría (a -78ºC) de yoduro de pentafluoro-etilo comercialmente disponible (6,4 g, 26,02 mmol) en éter seco (16,7 ml) se canuló lentamente (durante 10 min) dentro de una solución a -78ºC de MeLi.LiBr en éter (14,0 ml de una solución 1,5 M en éter, 21,0 mmol). Después de 10 min adicionales a -78ºC se añadió la amida de Weinreb 11a (preparada a partir de Boc-Nva-OH comercialmente disponible de acuerdo con el procedimiento de Castro, B. y colaboradores, Synthesis, (1983), 676-678.) (2,02 g, 7,76 mmol) en éter (5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78ºC y luego a -40ºC durante 15 min. Se añadió luego una solución acuosa saturada de NH_{4}Cl. La mezcla se extrajo 3 veces con EtOAc y el extracto orgánico combinado se lavó con salmuera. La solución de EtOAc se secó finalmente sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró. La pentafluoroetil-cetona bruta se disolvió en una mezcla de THF (38 ml) y MeOH (9,5 ml) y la solución resultante se enfrió a 0ºC para la adición de borohidruro de sodio (323 mg, 8,54 mmol, 1,1 eq.). Después de 15 min., se añadió éter y la mezcla se lavó con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico. La capa acuosa se extrajo 3 veces con éter y la capa orgánica combinada se lavó consecutivamente con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x), agua y salmuera. La solución en éter se secó (sobre Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se cromatografió con resolución rápida usando una mezcla de EtOAc (15%) y hexano (85%) para proporcionar los deseados alcoholes (1,30 g, 4,05 mmol, rendimiento 52% a partir de la amida 11a). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) (mezcla de 2 diastereoisómeros en una relación 1:1). \delta 4,75 (bs, 1/2H), 4,54 (bs, 1/2H), 4,21-4,13 (m, 1H), 3,92 (dd, J= 6,0 Hz, J'= 14,6 Hz, 1H), 1,65-1,29 (m, 4H), 1,45 (m, 9H), 0,98-0,93 (m, 3H).

b) Síntesis del compuesto 11c

El compuesto 11b (96 mg, 0,30 mmol) se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano durante 30 min antes de ser concentrado en vacío. La sal hidrocloruro bruta se disolvió en DMF seca (1 ml). Se añadieron luego consecutivamente el pentapéptido 10h (204 mg, 0,22 mmol), NMM (0,1 ml, 0,91 mmol, 4 eq.) y TBTU (85 mg, 0,26 mmol, 1,2 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a TA, luego se vertió en salmuera y se extrajo 3 veces con EtOAc. El extracto orgánico combinado se lavó consecutivamente con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico (2x), con agua, con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, con agua (2x) y con salmuera. La solución de EtOAc se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de resolución rápida usando una mezcla de EtOAc (de 75 a 80%) y hexano (de 25 a 20%) para proporcionar el deseado compuesto 11c (154 mg, 0,137 mmol, rendimiento 62%). MS (FAB) 1123 (MH^{+}).

c) Síntesis del compuesto 11d

A la mezcla de alcoholes 11c (52 mg, 0,47 mmol) en una solución de DMSO (0,5 ml) y tolueno (0,5 ml) se le añadieron consecutivamente ácido dicloroacético (11,5 ml, 0,139 mmol) y EDAC (89 mg, 0,464 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a TA, se vertió en salmuera (30 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 15 ml). El extracto orgánico combinado se lavó consecutivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado, con agua (2x) y con salmuera. La solución de EtOAc se secó (sobre MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de resolución rápida usando una mezcla de EtOAc (de 75 a 80%) y hexano (de 25 a 20%) para proporcionar la deseada cetona 11d (37 mg, 0,032 mmol, rendimiento 70%). MS (FAB) 1121 (MH^{+}).

d) Síntesis del compuesto 102

La mezcla de la cetona 11d (37 mg, 0,032 mmol) se disolvió en TFA (1 ml) y la solución resultante se agitó durante 1 h a TA. Después de haber eliminado los materiales volátiles en vacío, se obtuvo el deseado péptido (29 mg, 0,031 mmol, 97%). MS (FAB) 921 (MH^{+}), 943 (MNa^{+}). ^{1}H NMR (CDCl_{3} (mezcla de 2 diastereoisómeros en una relación de 1,35:1) d, 8,14 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 8,07-8,02 (m, 2H), 7,80-7,78 (m, 1H), 7,35-7,26 (m, SH), 4,77-4,56 (m, 1H), 4,56-4,38 (m, 5H), 4,34-4,09 (m, 5H), 2,68-2,59 (m, 2H), 2,26-2,15 (m, 3H), 2,02-1,82 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,78-1,28 (m, 6H), 1,07-0,95 (m, 1H), 0,92-0,80 (m, 10H), 0,77-0,68 (m, 8H).

Ejemplo 12 Síntesis del compuesto 205 (Tabla 2)

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El compuesto 205 se preparó de acuerdo con el siguiente esquema:

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a) Síntesis del compuesto 12a

A una solución de Boc-hidrazina (3,0 g, 22,6 mmol) en tolueno (42 ml) se le añadió propionaldehído (1,8 ml, 24,9 mmol). La solución se calentó a 50ºC durante 1 h y luego se agitó a TA durante 24 h. La mezcla se concentró para dar el compuesto 12a como un sólido de color blanco (3,70 g, 95%) que era homogéneo según la HPLC analítica (97,5%). MS (FAB) 173,1 (MH'); ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) d 10,33 (hs, 1H), 7,28 (bs, 1H), 2,19-2,09 (m, 2H), 1,42 y 1,41 (2 x s, 9H), 0,97 (dt, Z = 7,6, 1,6 Hz, 3H).

b) Síntesis del compuesto 12b

A la hidrazona 12a (3,7 g, 21,48 mmol) en THF (80 ml) a -78ºC se añadió DIBAL (31 ml, 47,25 mmol) como una solución 1,5 M en tolueno. La mezcla de reacción se mantuvo a -78ºC durante 2 h y luego a -40ºC durante 2 h. Se añadió la sal de Rochelle (tartrato de potasio y sodio acuoso) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante una noche. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con Et_{2}O (2 x 75 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (sobre Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron en vacío. La purificación por cromatografía de resolución rápida sobre gel de sílice dio el compuesto 12b como un aceite incoloro (3,4 g, 91%). MS (CI-NH_{3}) 175,2 (MH'); H-NMR (DMSO-d_{6}) d 8.10 (bs, 1H), 4,25 (bs, 1H), 2,6 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,45-1,29 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 0,85 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

c) Síntesis del compuesto 12c

La hidrazina 12b (0,20 g, 1,15 mmol) se combinó con (S)-(-)-feniletil-isocianato (0,162 g, 1,15 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (2,4 ml) con DIPEA (0,44 ml, 2,52 mmol) y se agitó a 0ºC durante 1 h, y luego a TA durante 3 h. La mezcla se concentró en vacío para dar un sólido de color blanco que se purificó por cromatografía de resolución rápida para dar el compuesto 12c (0,25 g, 68%). MS (FAB) 322,3 (MH'); ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) d 8,90 y 8,48 (2 x bs, 1H), 7,35-7,23 (m, 5H), 6,84 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 6,50 (bs, 1H), 4,79 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,36 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

d) Síntesis del compuesto 12d

El compuesto 12c (77 mg, 0,24 mmol) se trató con una mezcla de HCl y dioxano 4 N (1,2 ml) durante 20 min antes de ser concentrado en vacío. La sal hidrocloruro se combinó con el pentapéptido 10h (0,20 g, 0,22 mmol), TBTU (85 mg, 0,26 mmol) y diisopropil-etil-amina (0,13 ml, 0,73 mmol) en DMF (2,5 ml) a TA durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc y se lavó consecutivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado, con HCl acuoso al 10% y con salmuera, antes de ser secado (sobre MgSO_{4}), filtrado y concentrado en vacío. La purificación por cromatografía de resolución rápida dio el compuesto 12d como un sólido de color blanco (80 mg, 33%).

e) Síntesis del compuesto 205

El péptido protegido 12d (75 mg, 0,067 mmol) se trató con TFA puro (1,5 ml) durante 1,5 h antes de ser concentrado en vacío. La purificación por HPLC preparativa dio el compuesto 205 como un sólido de color blanco (17 mg, 27%). HPLC (98%); MS (FAB) 923,6 (MH^{+}); HRMS calculado para C_{46}H_{66}N_{8}O_{12} (MH^{+}) 923,48785, encontrado: 923,49097. ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) d 12,5-11,9 (hs, 2H), 10,31 (bs, 1H), 8,26 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 8,26 Hz, 1H), 7,78 (d, J = B.SB Hz, 1H), 7,42-7,26 (m, 10H), 7,20 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 6,86 (bd, 1H), 4,85-4,77 (m, 1H), 4,55 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,50-4,40 (m, 1H), 4,46 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 4,36-4,20 (m, 6H), 3,7S-3,68 (m, 1H), 3,48-3,34 (bs, 1H), 3,18-3,07 (bs, 1H), 2,62 (dd, Z = 16. 5, 5. 7Hz, 1H), 2,44 (dd, J = 16,5, 5,7 Hz, 1H), 2,30, 2,22 (m, 1H), 2,17 (t, J = 7,95 Hz, 2H), 2,06-1,84 (m, 2H), 1,81 (s, 3H), 1,80-1,59 (m, 2H), 1,42-1,30 (m, 6H), 1,06-0,98 (m, 1H), 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 6H), 0,78 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,71 (t, J = 7,0 Hz, 6H).

Ejemplo 13 Síntesis del compuesto 231

El compuesto 231 se preparó de acuerdo con el procedimiento indicado para el compuesto 205 excepto que el isocianato se reemplazó por el correspondiente isocianato preparado a partir de piperonil-amina de la siguiente manera.

A una solución de fosgeno en tolueno (0,2 ml, 0,38 mmol, 4 eq.) y THF (0,7 ml) a 0ºC se le añadió piperonil-amina (12 \mul, 0,095 mmol) en THF (0,7 ml) que contenía diisopropil-etil-amina (53 \mul, 0,30 mmol) gota a gota durante un período de tiempo de 15 min. La mezcla se agitó a 0ºC durante 30 min antes de ser concentrada. El isocianato generado se acopló como se ha descrito para el compuesto 12c. El grupo Boc se eliminó (con HCl 4 N en dioxano) y la sal hidrocloruro del fragmento P1/P1' se acopló de la manera usual con HATU, diisopropil-etil-amina y el pentapéptido 10h (0,10 g, 0,095 mmol) en DMF. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 h y luego a TA durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc y se lavó consecutivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado, con HCl acuoso al 10% y con salmuera antes de ser secado (sobre MgSO_{4}), filtrado y concentrado en vacío. La purificación por cromatografía de resolución rápida dio el deseado péptido protegido (67 mg, 62,5%).

El péptido protegido (63 mg, 0,056 mmol) se trató como para la síntesis del compuesto 12d para dar después de purificación por HPLC preparativa el compuesto 231 en forma de un sólido de color blanco (17 mg, 32%). HPLC (100%); MS (FAB) 953,05 (MH^{+}); HRMS calculado para C_{46}H_{64}N_{8}O_{14} (MH^{+}) 953,46204, encontrado: 953,46680. ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 10,35 (bs, 1H), 8,17 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,40-7,25 (m, 5H), 7,23-7,13 (bs, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,79 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 4,57-4,43 (m, 3H), 4,34-4,18 (m, 6H), 4,13-4,08 (m, 2H), 3,70 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 3,67 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 2,68-2,58 (m, 2H), 2,48-2,42 (m, 1H), 2,34-2,24 (m, 2H), 2,2-2,13 (m, 2H), 2,05-1,94 (m, 1H), 1,94-1,82 (m, 1H), 1,81 (s, 3H), 1,75-1,61 (m, 2H), 1,45-1,30 (m, 3H), 1,03-0,94 (m, 1H), 0,87-0,75 (m, 9H), 0,74-0,67
(m, 6H).

Ejemplo 14 Síntesis del compuesto 232

El compuesto 12b se acopló al apropiado ácido carboxílico (procedente de Maybridge) usando TBTU y diisopropil-etil-amina en DMF de la manera usual. El grupo Boc procedente del fragmento P1/P1' se eliminó (con HCl 4 N en dioxano, durante 30 min) y la correspondiente sal hidrocloruro (0,104 mmol) acoplada al péptido 10h (0,10 g, 0,095 mmol) de la manera usual con HATU (39,5 mg, 0,104 mmol) y diisopropil-etil-amina (0,07 ml, 0,04 mmol) en DMF (0,95 ml) durante 16 h. La mezcla se concentró y el residuo se extrajo en EtOAc y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado, con HCl acuoso al 10% y con salmuera, antes de ser secado (sobre MgSO_{4}), filtrado y concentrado en vacío para dar el péptido protegido (110 mg, 100%). La desprotección final de este péptido se realizó por saponificación. El péptido protegido (0,105 mg, 0,09 mmol) se disolvió en THF (1,3 ml), MeOH (0,7 ml) y H_{2}O (0,7 ml) antes de ser tratado con NaOH acuoso (0,18 ml de una solución 2 N, 0,36 mmol). La mezcla se agitó durante 3,5 h antes de ser concentrada en vacío. El residuo bruto se purificó por HPLC preparativa para dar el compuesto 232 como un sólido de color blanco (33 mg, 36%). HPLC (97%); MS (FAB) 977,4 (MH^{+}), 999,4 (MNa^{+}); HRMS calculado para C_{47}H_{64}N_{10}O_{13} (MH^{+}) 977,47327, encontrado: 977,47620. ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 10,61 (bs, 1H), 8,75 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,02-7,90 (m, 3H), 7,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,60-7,56 (m, 1H), 7,35-7,26 (m, 5H), 4,57-4,43 (m, 4H), 4,42-4,34 (m, 2H), 4,33-4,25 (m, 2H), 4,25-4,17 (m, 2H), 3,70 (dd, J = 10,5, 10,5 Hz, 1H), 3,21-3,10 (m, 2H), 2,96-2,80 (m, 1H), 2,69-2,60 (m, 2H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,35-2,25 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 2H), 2,05-1,90 (m, 2H), 1,88-1,81 (m, 1H), 1,80 (s, 3H), 1,77-1,61 (m, 2H), 1,53-1,40 (m, 2H), 1,39-1,28 (m, 1H), 1,06-0,95 (m, 1H), 0,91-0,81 (m, 7H), 0,79 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,75-0,67 (m, 6H).

Ejemplo 15 Síntesis del compuesto 233

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Síntesis del compuesto 15b

Se disolvió Boc-alanina (15a) (5 g, 26,42 mmol) en DMF anhidra (63 ml) a 0ºC antes de que se añadiesen 3-amino-propionitrilo (1,9 ml, 26,42 mmol) y HOBt (3,5 g, 26,42 mmol). A esta solución se le añadió DCC (26,4 ml, 26,4 mmol, 1,0 M en diclorometano) a través de una jeringa. La mezcla se agitó a 0ºC durante 24 h. La DCU generada se separó por filtración a través de una almohadilla de Celite y se lavó con diclorometano frío. El material filtrado se concentró en vacío y el residuo se volvió a disolver en EtOAc y se lavó con HCl 1 N (acuoso), con NaHCO_{3} saturado y con salmuera saturada. La fase orgánica se secó (sobre Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró en vacío para dar 6,3 g de un sólido de color parduzco pálido. La purificación por cromatografía de resolución rápida usando una mezcla de EtOAc y hexano (7/3) dio el compuesto 15b como un sólido de color blanco. (3.94 g, 62%). HPLC (95%); MS (FAB) 242,1 (MH^{+}), 264,1 (MNa^{+}); ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,10 (bs, 1H), 6,88 (d, J = 7 Hz, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,35-3,2 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,18 (d, J = 7,3 Hz, 2H).

Síntesis del compuesto 15c

A una solución del compuesto 15b (3,92 g, 17,5 mmol) en THF (350 ml) a 0ºC se le añadieron consecutivamente trifenil-fosfina (7,2 g, 35,4 mmol), DEAD (5,5 ml, 35,1 mmol) y trimetilsilil-azida (4,66 ml, 35,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a TA y se dejó en agitación durante 16 h. Luego la mezcla se calentó a 70ºC durante 4 h y se agitó durante 48 h adicionales a TA. La solución se enfrió a 0ºC y se trató con un exceso de solución acuosa al 5,5% de (NH_{4})_{2}Ce(NO_{3})_{6} [con precaución, añadir lentamente gota a gota]. La mezcla bruta se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml) y se lavó con salmuera saturada antes de ser secada (sobre Na_{2}SO_{4}), filtrada y concentrada en vacío. La purificación por cromatografía de resolución rápida entre EtOAc y hexano (6/4) dio el compuesto 15c como un sólido de color blanco. (3,3 g, 76%). MS (FAB) 267,1 (MH^{+}); ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 7,75 (d, J = , 1H), 5,1-5,02 (m, 1H), 4,73 (t, J = 2H), 3,18 (t, J = 2H), 1,49 (d, J = X, 3H), 1,36 (s, 9H).

La desprotección final de las funcionalidades de tetrazol y de éster se realizó por saponificación. El péptido protegido 15d (38 mg, 0,033 mmol) se disolvió en THF (0,5 ml), MeOH (0,25 ml) y H_{2}O (0,25 ml) antes de ser tratado con NaOH acuoso (0,1 ml de una solución 2 N, 0,198 mmol) durante 4 h. La mezcla se concentró en vacío y el producto bruto se purificó por HPLC preparativa para dar después de liofilización el compuesto 233 como un sólido de color blanco (7,5 mg, 255%). HPLC (98%); MS (FAB) 913,5 (M-H^{-}); HRMS calculado para C_{41}H_{62}N_{12}O_{12} (MH^{+}) 915,4688, encontrado: 915,47250. ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 10,32 (bs, 1H), 8,23 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,35-7,27 (m, 5H), 6,99 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 4,56-4,42 (m, 4H), 4,41-4,34 (m, 1H), 4,34-4,17 (m, 5H), 3,70 (dd, J = 10,5, 10,5 Hz, 1H), 3,15 (bm, 1H), 2,67-2,61 (m, 2H), 2,48-2,40 (m, 1H), 2,30-2,23 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 2H), 2,02 -1,92 (m, 2H), 1,87-1,81 (m, 1H), 1,80 (s, 3H), 1,77-1,67 (m, 1H), 1,67-1,57 (m, 1H), 1,51 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,45-1,27 (m, 3H), 1,06-0,94 (m, 1H), 0,87 (dd, J = 6,4, 6,4 Hz, 6H), 0,82 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 0,72-0,62 (m, 6H).

Ejemplo 16 Síntesis del compuesto 107

A Boc-(L)Nvl-OH (0,28 g, 1,28 mmol) se le añadieron bencil-amina (0,163 g, 1,53 mmol), TBTU (0,45 g, 1,41 mmol) y diisopropiletil-amina (0,45 ml, 2,56 mmol) en DMF (10 ml) durante 10 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc (80 ml) y se lavó consecutivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado, HCl acuoso al 10% y salmuera, antes de ser secado (sobre MgSO_{4}), filtrado y concentrado en vacío para dar un sólido de color blanco (0,18 g, 46%) que era homogéneo en un 91% según la HPLC analítica. Este material (37 mg, 0,12 mmol) se trató con una mezcla de HCl 4 N y dioxano (5 ml) durante 30 min antes de ser concentrado en vacío. La sal hidrocloruro (0,12 mmol) se combinó con el pentapéptido 10h (0,10 g, 0,11 mmol), TBTU (39 mg, 0,12 mmol) y diisopropil-etil-amina (0,07 g, 0,38 mmol) en DMF (8 ml) y se agitó durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en EtOAc y se lavó consecutivamente con NaHCO_{3} acuoso saturado, HCl acuoso al 10% y salmuera, antes de ser secado (sobre MgSO_{4}), filtrado y concentrado en vacío para dar un sólido de color blanco (0,12 g, 89%). El péptido se desprotegió con TFA puro (5 ml) durante 1 h, antes de ser concentrado. El compuesto se purificó por HPLC preparativa para dar el compuesto 107 (39 mg, 39%). HPLC (98,5%); FAB MS m/z: 908 (MH^{+}); HRMS calculado para C_{46}H_{65}N_{7}O_{12} (MH^{+}) 908,47693, encontrado: 908,47230; AAA OK; ^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}) \delta 12,5-11,9 (bs, 2H), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 8,02 (m, 3H), 7,79 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,37-7,19 (m, 10H), 4,57-4,39 (m, 3H), 4,33-4,14 (m, 6H), 4,11 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 3,68 (dd, J = 10,8, 4,1 Hz, 1H), 2,63 (dd, J = 16,2, 6,2 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 16,2, 6,2 Hz, 1H), 2,23-2,15 (m, 3H), 2,02-1,85 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,79-1,67 (m, 2H), 1,66-1,48 (m, 2H), 1,40-1,23 (m, 3H), 1,08-0,97 (m, 1H), 0,92-0,81 (m, 11H), 0,73 (t, J = 7,95 Hz, 6H).

Ejemplo 17 Síntesis del compuesto 108

El compuesto 108 se preparó de acuerdo con el procedimiento señalado para el compuesto 107.

HPLC (99,9%); FAB MS m/z: 922 (MH^{+}); HRMS calculado para C_{47}H_{67}N_{7}O_{12} (MH^{+}) 922,49261, encontrado: 922,49560; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) . 12,5-11,9 (bs, 2H), 8,21 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,91 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,79 (8,9 Hz, 1H), 7,36-7,25 (m, 10H), 7,23-7,17 (m, 1H), 4,92-4,83 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,51 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,33-4,25 (m, 2H), 4,24-4,14 (m, 3H), 4,11 (d, J = 11 Hz, 1H), 3,71 (m, 1H), 2,63 (dd, J = 11,0, 4,0 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 11,0, 4,0 Hz, 1H), 2,23-2,14 (m, 3H), 2,04-1,86 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,80-1,66 (m, 2H), 1,62-1,42 (m, 2H), 1,33 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,30-1,17 (m, 2H), 1,07-0,96 (m, 1H), 0,88 (m, 6H), 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 0,73 (t, J = 7,6 Hz, 6H).

Ejemplo 18 Análisis radiométrico de la proteasa de NS3 del HCV recombinante a) Clonación, expresión y purificación de la proteasa tipo 1 de NS3 del HCV recombinante

Se obtuvo el suero de un paciente infectado por HCV mediante una colaboración externa (Bernard Willems MD, Hôpital St-Luc, Montréal, Canadá y Dr. Donald Murphy, Laboratoire de Santé Publique du Québec, Ste-Anne de Bellevue, Canadá). Se construyó un molde de ADNc de plena longitud tratado por ingeniería genética del genoma del HCV a partir de fragmentos de ADN obtenidos mediante una reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR, de reverse transcription-polymerase chain reaction) de un ARN de suero y usando cebadores específicos seleccionados sobre la base de la homología entre otras cepas del genotipo 1b. A partir de la determinación de toda la secuencia genómica, se asignó un genotipo 1b al material aislado de HCV de acuerdo con la clasificación de Simmonds y colaboradores (J. Clin. Microbiol. (1993), 31, 1493-1503). Se mostró que la secuencia de aminoácidos de la región no estructural NS2-NS4B era idéntica en más de 93% al genotipo 1b del HCV (materiales aislados BK, JK y 483) e idéntica en un 88% al genotipo 1a del HCV (material aislado del HCV-1). Se generó por PCR un fragmento de ADN que codificaba el precursor de poliproteína (NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B) y se introdujo en vectores de expresión eucarióticos. Después de una transfección transitoria, se demostró el tratamiento de una poliproteína mediado por la proteasa de NS3 del HCV por la presencia de la proteína NS3 madura usando un análisis por transferencia Western. La proteína NS3 madura no fue observada con expresión de un precursor de poliproteína que contenía la mutación S1165A, que desactiva a la proteasa de NS3, confirmando la funcionalidad de la proteasa de NS3 del HCV.

El fragmento de ADN que codificaba la proteasa de NS3 del HCV recombinante (aminoácidos 1.027 a 1.206) fue clonado en el vector de expresión bacteriana pET11d. La expresión de la proteasa de NS3 en E. coli BL(DE3)pLysS se indujo por incubación con IPTG 1 mM durante 3 h a 22ºC. Una típica fermentación (de 18 l) proporcionó aproximadamente 100 g de una pasta celular húmeda. Las células se volvieron a suspender en un tampón para lisis (3,0 ml/g) que consistía en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, glicerol al 10% (v/v), EDTA 1 mM y NP-40 al 0,01%, y se almacenó a -80ºC. Las células se descongelaron y homogeneizaron a continuación de la adición de DTT 5 mM. Se añadieron luego cloruro de magnesio y DNasa al material homogeneizado en concentraciones finales de 20 mM y 20 \mug/ml, respectivamente. Después de una incubación durante 25 min a 4ºC, el material homogeneizado se trató con ultrasonidos y se centrifugó a 15.000 x g durante 30 min a 4ºC. El pH del material sobrenadante se ajustó luego a 6,5 usando una solución 1 M de fosfato de sodio.

Una etapa adicional de cromatografía con filtración a través de gel se añadió al proceso de purificación de 2 etapas que se ha descrito en el documento de patente mundial WO 95/22985 (incorporado a la presente por su referencia). Dicho brevemente, el material sobrenadante procedente del extracto bacteriano se cargó sobre una columna con SP HiTrap (Pharmacia) previamente equilibrada a un caudal de 2 ml/min en el tampón A (fosfato de sodio 50 mM, pH 6,5, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%). Luego la columna se lavó con el tampón A que contenía NaCl 0,15 M y la proteasa se eluyó aplicando 10 volúmenes de columna de un gradiente lineal de NaCl desde 0,15 hasta 0,3 M. Las fracciones que contenían la proteasa de NS3 se agruparon y se diluyeron hasta una concentración final de NaCl de 0,1 N. La enzima se purificó adicionalmente en una columna con HiTrap Heparin (Pharmacia), equilibrada en el tampón B (fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%). La muestra se cargó a un caudal de 3 ml/min. Luego la columna se lavó con el tampón B que contenía NaCl 0,15 M a un caudal de 1,5 ml/min. Se realizaron lavados en dos etapas en la presencia del tampón B que contenía NaCl 0,3 ó 1 M. La proteasa se recuperó en el material lavado con NaCl 0,3 M, se diluyó a 3 veces con el tampón B, se volvió a aplicar sobre la columna con HiTrap Heparin y se eluyó con el tampón B que contenía NaCl 0,4 M. Finalmente, las fracciones que contenían la proteasa de NS3 se aplicaron sobre una columna con Superdex 75 HiLoad 16/60 (Pharmacia) equilibrada en el tampón B que contenía NaCl 0,3 M. Se estimó que la pureza de la proteasa de NS3 del HCV, obtenida a partir de las fracciones agrupadas era mayor que 95% por un SDS-PAGE seguido por un análisis densitométrico.

La enzima se almacenó a -80ºC y se descongeló sobre hielo, y se diluyó justamente antes de su uso.

Ejemplo 19 Análisis radiométrico de una mezcla de la proteasa de NS3 del HCV recombinante y del péptido cofactor de NS4A

La enzima se clonó, expresó y preparó de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 18. La enzima se almacenó a -80ºC, se descongeló sobre hielo y se diluyó justamente antes de su uso en el tampón de análisis que contenía el péptido cofactor de NS4A.

El substrato usado para el análisis radiométrico de la mezcla de proteasa de NS3 y el péptido cofactor de NS4A, DDIVPC-SMSYTW, es cortado por la enzima entre los residuos de cisteína y de serina. La secuencia DDIVPC-SMSYTW corresponde al sitio de corte natural en NS5A/NS5B en el que el residuo de cisteína en P2 ha sido reemplazado por una prolina. El substrato de péptido DDIVPC-SMSYTW y el trazador biotina-DDIVPC-SMS[^{125}I-Y]TW se incuban con la proteasa de NS3 recombinante y el péptido cofactor de NS4A KKGSVVIVGRIILSGRK (relación molar de enzima a cofactor 1:100) en la ausencia o presencia de inhibidores. La separación del substrato con respecto de los productos se realiza añadiendo glóbulos de agarosa revestidos con avidina a la mezcla de análisis, seguido por filtración. La cantidad del producto SMS[^{125}I-Y]TW encontrado en el material filtrado permite el cálculo del porcentaje de conversión del substrato y del porcentaje de inhibición.

A. Reactivos

El Tris y el Tris-HCl (UltraPure) se obtuvieron de Gibco-BRL. El glicerol (UltraPure), el MES y el BSA se adquirieron de Sigma. El TCEP se obtuvo de Pierce, el DMSO se obtuvo de Aldrich y el NaOH se obtuvo de Anachemia.

Tampón de análisis: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol al 30% (p/v), BSA 1 mg/ml, TCEP 1 mM (el TECP se añadió justamente antes de su uso a partir de una solución de reserva 1 M en agua).

Substrato: DDIVPCSMSYTW, concentración final 25 \muM (a partir de una solución de reserva 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC para evitar la oxidación).

Trazador: Substrato mono-yodado reducido (biotina-DDIVPC-SMS[^{125}I-Y]TW) (concentración final \sim 1 nM).

Proteasa de tipo 1b de NS3 del HCV, concentración final 25 nM (a partir de una solución de reserva en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, NaCl 300 mM, DTT 5 mM, NP-40 al 0,01%).

Péptido cofactor de NS4A: KKGSVVIVGRIILSGRK, concentración final 2,5 \muM (procedente de una solución de reserva 2 mM en DMSO almacenada a -20ºC).

B. Protocolo

El análisis se realizó en una placa de polipropileno de 96 pocillos procedente de Costar. Cada pocillo contenía:

\bullet: 20 \mul de una mezcla de substrato y trazador en tampón de análisis;

\bullet: 10 \mul \pm inhibidor en una mezcla de 20% de DMSO y tampón de análisis;

\bullet: 10 \mul de una mezcla de proteasa 1 b de NS3 y péptido cofactor de NS4 (relación molar 1:100).

Se prepararon también una muestra en vacío (sin inhibidor y sin enzima) y una muestra testigo (sin inhibidor) sobre la misma placa de análisis.

La reacción enzimática se inició por la adición de la solución de enzima y péptido de NS4A, y la mezcla de análisis se incubó durante 40 min a 23ºC mediando suave agitación. Se añadieron diez (10) \mul de NaOH 0,05 N y 10 \mul de MES 1 M, de pH 5,8 para sofocar la reacción enzimática.

Se añadieron veinte (20) \mul de glóbulos de agarosa revestidos con avidina (adquiridos de Pierce) en una placa de filtración de Millipore MADP N65. La mezcla de análisis sofocada se transfirió a la placa de filtración, y se incubó durante 60 min a 23ºC mediando suave agitación.

Las placas se filtraron usando un aparato de filtración en múltiple distribuidor de vacío Millipore MultiScreen Vacuum Manifold Filtration y se transfirieron 40 \mul del material filtrado a una placa opaca de 96 pocillos que contenía 60 \mul de un fluido de escintilación por pocillo.

Los materiales filtrados se recontaron en un instrumento Packard TopCount usando un protocolo de ^{125}I-líquido durante 1 minuto.

El % de inhibición se calculó con la siguiente ecuación:

100-[(cómputo_{inh}-cómputo _{\text{vacío}})/(cómputo_{inh}-cómputo _{\text{vacío}}) \ x \ 100]

Se aplicó un ajuste de curva no lineal con el modelo de Hill a los datos de inhibición y concentración y se calculó la concentración efectiva de 50% (CI_{50}) por el uso de un software de SAS (Statistical Software Systems, SAS Institute, Inc., Cary, N.C.).

Ejemplo 20 Análisis de la especificidad

Se determinó la especificidad de los compuestos frente a una diversidad de proteasas de serina: elastasa de leucocitos humanos, elastasa pancreática porcina y \alpha-quimotripsina pancreática bovina y una proteasa de cisteína: catepsina B de hígado humano. En todos los casos se usó un protocolo con el formato de placas de 96 pocillos usando un substrato colorimétrico de p-nitroanilida (pNA) específico para cada enzima. Cada análisis incluía una pre-incubación a 30ºC de la mezcla de enzima e inhibidor durante 1 h a 30ºC, seguida por adición del substrato e hidrólisis a una conversión \approx30%, como se midió en un lector de microplacas UV Thermomax®. Las concentraciones del substrato se mantuvieron lo más bajas que fuera posible en comparación con K_{M} para reducir la competencia del substrato. Las concentraciones del compuesto variaron entre 300 y 0,06 \muM dependiendo de su potencia. Las condiciones finales para cada análisis fueron como sigue:

Tris-HCl 50 mM, pH 8, Na_{2}SO_{4} 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, Tween-20 al 0,01% con:

[Succ-AAPF-pNA 100 \muM y \alpha-quimotripsina 250 pM],

[Succ-AAA-pNA 133 \muM y elastasa porcina 8 nM],

[Succ-AAV-pNA 133 \muM y elastasa de leucocitos 8 nM], o

[NaHPO_{4} 100 \muM, pH 6, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, TCEP 1 mM, Tween-20 al 0,01%, Z-FR-pNA 30 \muM y catepsina B 5 nM (la enzima de reserva fue activada en un tampón que contenía TCEP 20 mM antes del uso)].

Se resume seguidamente un ejemplo representativo para la elastasa pancreática porcina.

En una placa de 96 pocillos de fondo plano de poliestireno se añadieron usando un manipulador de líquidos Biomek® (de Beckman):

\bullet: 40 \mul del tampón de análisis (Tris-HCl 50 mM, de pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,01 mM);

\bullet: 20 \mul de una solución de enzima (Tris/HCl 50 mM, de pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,01 mM, Tween-20 al 0,02%, elastasa pancreática porcina 40 nM; y

\bullet: 20 \mul de una solución del inhibidor (Tris-HCl 50 mM, de pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,01 mM, Tween-20 al 0,02%, inhibidor 1,5 mM-0,3 \muM, DMSO al 15% v/v).

Después de una pre-incubación durante 60 min a 30ºC, se añadieron a cada pocillo 20 \mul de una solución de substrato (Tris-HCl 50 mM, de pH 8, Na_{2}SO_{4} 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,01 mM, Succ-AAA-pNa 665 \muM) y la mezcla de reacción se incubó adicionalmente a 30ºC durante 60 min, tiempo después del cual se leyó la absorbancia en el lector de placas UV Thermomax®. Se asignaron filas de pocillos para muestras testigos (sin inhibidor) y para muestras en vacío (sin inhibidor y sin enzima).

Las diluciones a 2 veces secuenciales de la solución de inhibidor se realizaron sobre una placa dispuesta por separado mediante el manipulador de líquidos, usando Tris-HCl 50 mM de pH 8, NaCl 50 mM, EDTA 0,01 mM, Tween-20 al 0,02%, DMSO al 15%. Todos los otros análisis de especificidad se realizaron de una manera similar.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:

[1-((UV_{inh}-UV_{\text{vacío}})/(UV_{ctl}-UV_{\text{vacío}}))] \ x \ 100

Un ajuste de curva no lineal con el modelo de Hill se aplicó a los datos de inhibición y concentración, y la concentración efectiva de 50% (CI_{50}) se calculó por el uso de un software de SAS (Statistical Software Systems; SAS Institute, Inc., Cary, N.C.).

Ejemplo 22 Tablas de compuestos

Las siguientes tablas enumeran en lista los valores de IC_{50} de los compuestos representativos del invento.

Se usan las siguientes abreviaturas:

CI_{50}: La concentración requerida para obtener una inhibición del 50% en el análisis radiométrico de la mezcla de proteasa de NS3 y del péptido cofactor de NS4, de acuerdo con el Ejemplo 19.

HLE: La concentración requerida para obtener una inhibición de 50% en el análisis de elastasa de leucocitos humanos; PPE: La concentración requerida para obtener una inhibición del 50% en el análisis de elastasa pancreática porcina; Otros: Los datos sin marcar indican la concentración requerida para obtener una inhibición del 50% en el análisis de \alpha-quimotripsina pancreática bovina; los datos marcados con ** indican la concentración requerida para obtener una inhibición del 50% en el análisis de catepsina B de hígado humano; MS: Datos de espectrometría de masas (MH^{+} a partir de FAB); AAA: Datos de análisis de aminoácidos expresados en % de recuperación de péptidos; Acpr: ácido 1-amino-ciclopropilcarboxílico; Acpe: ácido 1-amino-ciclopentilcarboxílico; Abu: ácido 2-amino-butírico; Chg: ciclohexilglicina (ácido 2-amino-2-ciclohexil-acético); Hyp: 4(R)-hidroxi-prolina; Hyp(4-Bn): 4(R)-benciloxiprolina; Pip: ácido pipecólico (es decir, homoprolilo); Tbg: terc.-butilglicina; Ac: acetilo; Bn: bencilo; O-Bn: benciloxi; DAD: 3-carboxi-propionilo; y DAE: 4-carboxi-butirilo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims

1. Un compuesto de fórmula I:

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R_{6} es la cadena lateral de Asp o Glu;

R_{5} es la cadena lateral de D-Asp, D-Val o D-Glu;

Y es H o alquilo C_{1-6};

R_{4} es alquilo C_{1-10}; cicloalquilo C_{3-10};

R_{3} es alquilo C_{1-10}; cicloalquilo C_{3-10};

W es un grupo de fórmula II':

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en la que X es CH o N; y

66

en donde R_{17} es arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} cada uno opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo opcionalmente dicho arilo o arilalquilo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; estando dicho arilo o arilalquilo opcionalmente condensado con un segundo anillo de 5, 6 ó 7 miembros para formar un sistema cíclico o un heterociclo, estando dicho anillo opcionalmente sustituido con NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo opcionalmente dicho segundo anillo al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N; R_{17} es OR_{12}, en donde R_{12}, es arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} estando dicho primer arilo o arilalquilo opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-7}, NH_{2}, OH, SH, halo, alcoxi C_{1-6}, carboxilo, carboxi-alquilo (inferior) o un segundo arilo o arilalquilo; conteniendo opcionalmente dichos primero y segundo arilos o aralquilos al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en: O, S y N;

Q es un grupo de la fórmula:

67

en donde Z es CH o N;

X es O o S;

y

cuando Z es N, entonces R_{13} ha de ser H; carboxi; alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxi; CH_{2}-R_{14}; CHR_{14}R_{14'}; CH(F)-R_{14}; O-R_{14}; NR_{14}R_{14'} o S-R_{14} en que R_{14} y R_{14'} son como se han definido anteriormente; o

Q es un grupo de fosfonato de la fórmula:

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68

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en la que R_{15} y R_{16} son independientemente ariloxi C_{6-20}; y R_{1} es como se define anteriormente.

2. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en la que Q es un grupo de la fórmula:

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69

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en la que Z es CH o N;

R_{1} es hidrógeno, alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con tiol, o alquenilo C_{1-6};

y

cuando Z es CH, entonces R_{13} ha de ser H; CF_{3}; CF_{2}CF_{3}; CH_{2}-R_{14}; CH(F)-R_{14}, CF_{2}-R_{14}; NR_{14}R_{14'}; S-R_{14}; CHR_{14}R_{14'} o CO-NH-R_{14}, en que

: R_{14} y R_{14'} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{3-10} cíclico o alquilo C_{1-10} acíclico o alquenilo C_{3-10} cíclico o alquenilo C_{2-10} acíclico, estando dichos alquilo o alquenilo opcionalmente sustituidos con NH_{2}, OH, SH, halo o carboxilo; conteniendo dichos alquilo o alquenilo opcionalmente por lo menos un heteroátomo seleccionado independientemente entre el grupo que consta de: O, S y N; o

: R_{14} y R_{14'} son independientemente arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16} opcionalmente sustituido con alquilo C_{1-6}, NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo dichos arilo o arilalquilo opcionalmente por lo menos un heteroátomo seleccionado independientemente entre el grupo que consta de: O, S y N;

: estando dichos alquilo cíclico, alquenilo cíclico, arilo o arilalquilo opcionalmente condensados con un segundo anillo de 5, 6 ó 7 miembros para formar un sistema cíclico o heterociclo, estando dicho segundo anillo opcionalmente sustituido con NH_{2}, OH, SH, halo, carboxilo o carboxi-alquilo (inferior); conteniendo dicho segundo anillo opcionalmente por lo menos un heteroátomo seleccionado independientemente entre el grupo que consta de: O, S y N;

con la condición de que cuando Z es CH, entonces R_{13} no ha de ser un \alpha-aminoácido ni uno de sus ésteres;

cuando Z es N, entonces R_{13} ha de ser H; CH_{3}; NH_{2}; CH_{2}-R_{14}; CH(F)-R_{14}; CHR_{14}R_{14'}; O-R_{14}; NH-R_{14}; NR_{14}R_{14'} o S-R_{14} en que

R_{14} y R_{14'} son como se han definido anteriormente.

3. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es un derivado de acilo de fórmula R_{11}C(O)- en que R_{11} es:

3-carboxi-propionilo (DAD) ó 4-carboxi-butirilo (DAE);

o

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70

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4. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 3, en el que B es acetilo, 3-carboxi-propionilo, 4-carboxi-butirilo, AcOCH_{2}C(O), Me_{3}COC(O),

71

5. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 4, en el que B es acetilo, 3-carboxi-propionilo (DAD), 4-carboxi-butirilo (DAE), AcOCH_{2}C(O),

72

6. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 5, en el que B es acetilo ó 4-carboxi-butirilo (DAE).

7. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 6, en el que B es acetilo.

8. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{6} es la cadena lateral de D-Glu.

9. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{4} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Val, ciclohexilglicina (Chg), Tbg, Ile o Leu.

10. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 9, en el que R_{4} es la cadena lateral de Chg o Ile.

11. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 10, en el que R_{4} es la cadena lateral de Chg.

12. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{3} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Ile, Chg, Cha, Val o Glu.

13. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{3} es la cadena lateral de Val o Chg.

14. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 13, en el que R_{3} es la cadena lateral de Val.

15. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{17} es Bn, PhCH_{2}CH_{2}, PhCH_{2}CH_{2}CH_{2}, O-Bn, o-tolilmetoxi, m-tolilmetoxi, p-tolilmetoxi, 1-naftalenilmetoxi, 2-naftalenilmetoxi, (4-terc.-butil)metoxi, (3I-Ph)CH_{2}O, (4Br-Ph)O, (2Br-Ph)O, (3Br-Ph)O, (4I-Ph)O, (3Br-Ph)CH_{2}O, (3,5-Br_{2}-Ph)CH_{2}O,

73

16. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 15, en el que R_{17} es O-Bn, 1-naftalenilmetoxi, 2-naftalenilmetoxi,

74

75

17. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 15, en el que R_{17} es O-Bn, 1-naftalenilmetoxi ó 2-naftalenilmetoxi.

18. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Q es:

76

en la que Z es preferiblemente CH o N;

cuando Z es CH: R_{13} es H; CF_{3}; CF_{2}CF_{3}; CH_{2}-R_{14}; C(O)NH-R_{14}, NR_{14}R_{14'}, en que R_{14} y R_{14'} son como antes se han definido con la condición de que R_{13} no ha de ser un \alpha-aminoácido ni uno de sus ésteres; y

cuando Z es N: R_{13} es fenilo o arilalquilo C_{7-16},

77

19. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 18, en el que cuando Z es CH: R_{13} es H; NH-R_{14} o C(O)NH-R_{14}; en que R_{14} es fenilo o arilalquio C_{7-16}.

20. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 19, en el que R_{13} es H; o C(O)NH-R_{14}; y R_{14} es bencilo o CH(Me)Ph.

21. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 18, en el que cuando Z es N: R_{13} es naftilo, NH-CH(Me)Ph, NH-CH(Et)Ph,

78

23. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Q es un grupo de fosfonato de la fórmula:

79

en la que R_{15} y R_{16} son independientemente de modo preferible ariloxi C_{6-12}.

24. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R_{15} y R_{16} son cada uno fenoxi.

25. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con halo.

26. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 25, en el que R_{1} es alquilo C_{1-5} o alquenilo C_{1-4} opcionalmente sustituido con fluoro.

27. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 26, en el que R_{1} es etilo, propilo, isopentilo o alilo.

28. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que B es un derivado de acilo de fórmula R_{11}C(O)- en la que R_{11} es: alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con carboxilo, alcanoiloxi C_{1-6} o alcoxi C_{1-6}; cicloalquilo C_{3-7} opcionalmente sustituido con carboxilo, MeOC(O), EtOC(O)) o BnOC(O); 3-carboxi-propionilo (DAD) o 4-carboxi-butirilo (DAE); o

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R_{6} es la cadena lateral de Asp o Glu; R_{5} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: D-Asp, L-Asp, D-Glu, L-Glu, D-Val, L-Val, D-terc.-butilglicina (Tbg) y L-Tbg;

Y es H o alquilo C_{1-3};

R_{4} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Val, ciclohexilglicina (Chg), Tbg, Ile o Leu;

R_{3} es la cadena lateral de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de: Ile, Chg, Cha, Val o Glu;

W es:

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81

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en la que R_{17} es OR_{12} en que R_{12} es un arilo C_{6} o C_{10} o arilalquilo C_{7-16}, estando dichos primeros arilo o arilalquilo opcionalmente sustituidos con alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-7}, NH_{2}, OH, SH, halo, alcoxi C_{1-6}, carboxilo, carboxi-alquilo (inferior) o un segundo arilo o arilalquilo; conteniendo dichos primeros y segundos arilo o arilalquilo opcionalmente por lo menos un heteroátomo seleccionado independientemente entre el grupo que consta de: O, S y N; Q es:

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en que Z es N; y R_{13} es fenilo, arilalquilo C_{7-16},

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y R_{1} es alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{1-6} sustituido opcionalmente con halo.

29. El compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 28, en el que B es acetilo, 3-carboxi-propionilo (DAD), 4-carboxi-butirilo (DAE), AcOCH_{2}C(O),

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R_{6} es la cadena lateral de Asp,

o R_{6} está ausente;

R_{5} es la cadena lateral de D-Glu;

R_{4} es la cadena lateral de Chg;

R_{3} es la cadena lateral de Val;

W es

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en la que R_{17} es Bn; PhCH_{2}CH_{2}, PhCH_{2}CH_{2}CH_{2}, O-Bn, 1-naftil-oxi; 2-naftiloxi; 1-naftalenilmetoxi, 2-naftalenilmetoxi;

86

Q es:

87

en que R_{13} es NH-CH(Me)Ph, o

88

R_{1} es etilo, propilo, isopentilo o alilo.

30. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso como un medicamento.

31. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para el tratamiento de una infección por la hepatitis C en un mamífero, que comprende administrar a éste una cantidad eficaz contra el virus de la hepatitis C del compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1.

32. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz contra el virus de la hepatitis C de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables, en mezcla con un medio de vehículo o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable.

33. Un método in-vitro de inhibir la replicación del virus de la hepatitis C por exposición del virus a una cantidad inhibidora de la proteasa de NS3 del virus de la hepatitis C del compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una de sus sales o ésteres terapéuticamente aceptables.

34. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende un agente modulador de inmunidad adicional seleccionado entre el grupo que consiste en: interferones \alpha, \beta y \delta.

35. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende un agente antivírico adicional seleccionado entre el grupo que consta de: ribavirina y amantadina.

36. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende adicionalmente otros inhibidores de la proteasa de HCV.